JP2022544369A - ミオ－イノシトール－プロピオネート経路を含む細菌 - Google Patents

ミオ－イノシトール－プロピオネート経路を含む細菌 Download PDF

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Abstract

本発明は、イノシトール-プロピオン酸経路遺伝子セットを含む細菌であって、イノシトール-プロピオン酸経路遺伝子セットが、前記細菌がイノシトールをプロピオン酸又はその塩若しくはエステルに変換することを可能にする、細菌に関する。細菌は、胃腸管においてプロピオン酸の生成を促進し、それによりプロピオン酸の生成から利益を得る状態又は疾患、例えば、代謝疾患、代謝症候群、インスリン抵抗性又はインスリン抵抗性関連状態、特に、脂質異常、2型糖尿病及び内分泌疾患におけるインスリン抵抗性を予防及び/又は治療するためのプロバイオティクス又は栄養補助食品として使用することができる。

Description

本発明は、代謝症候群等の代謝疾患;並びにインスリン抵抗性、又は脂質異常及び2型糖尿病並びに内分泌疾患におけるインスリン抵抗性(例えば、1型糖尿病、クッシング病又はリポジストロフィー症候群を伴う肥満対象)を含むインスリン抵抗性関連状態を予防及び/又は治療する分野に関する。
インスリン抵抗性は、細胞がインスリンに抵抗性であり、高血糖レベルを引き起こす医学的状態である。2型糖尿病を有する患者は、通常、初期段階のインスリン抵抗性を経験し終えているが、この初期段階は多くの場合、診断されないまま経過する。
ミオ-イノシトールの食事性栄養補助は、糖尿病又はインスリン抵抗性のいくつかの動物モデルにおける食後血漿グルコースの低下において効率的であることが分かっている(Ortmeyerら 1993年 Endocrinology 132:646～651頁;Ortmeyerら 1995年 Obesity Research 3:605S～608S頁;Croze及びSoulage 2013年 Biochimie 95:1811～1827頁)。
2型糖尿病を有する対象は、健康な対照と比較して筋生検においてイノシトールホスホグリカンレベルの減少を呈することが示されており、ミオ-イノシトールは、インスリンシグナル伝達経路の推定の下流セカンドメッセンジャーとして提案されている(Kenningtonら 1990年 New England Journal of Medicine 323:373～378頁)。
食事性ミオ-イノシトールは、リン脂質又はフィチン酸(豆類、種子及び堅果類に存在する植物成分)に由来することがあり、リン脂質又はフィチン酸からフィターゼによって食事性ミオ-イノシトールが遊離される。更に、ヒトの身体は、グルコースからミオ-イノシトールを生成することができる。
しかしながら、食事性ミオ-イノシトール栄養補助は、インスリン抵抗性を低減し得ることが公知であるが、このことが起こる機構は未知である。
US2014/0242654 WO 2014/150094 WO 2013032328 A1
Ortmeyerら 1993年 Endocrinology 132:646～651頁 Ortmeyerら 1995年 Obesity Research 3:605S～608S頁 Croze及びSoulage 2013年 Biochimie 95:1811～1827頁 Kenningtonら 1990年 New England Journal of Medicine 323:373～378頁 Buiら 2014年 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64:787～793頁 Hamerら 2008年 Pharmacology & Therapeutics 27:104～119頁 Hosseiniら 2011年 Nutrition Reviews 69:245～258頁 Solankiら BioMed Res. Int. 2013、記事ID 620719 DeFronzo RA、Tobin JD、Andres R 1979年. The American Journal of Physiology. 237 (3):E214～23頁 Muniyappa R、Lee S、Chen H、Quon MJ(2008年1月). American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 294 (1):E15～26頁 Matthews DR、Hosker JP、Rudenski AS、Naylor BA、Treacher DF、Turner RC(1985年). Diabetologia. 28 (7):412～9頁. doi:10.1007/BF00280883. PMID 3899825 A. S. Rudenski、D. R. Matthews、J. C. Levy、R. C. Turner(1991年) Metabolism. 40 (9):908～917頁
代謝疾患、特に、代謝症候群;並びにインスリン抵抗性、又は脂質異常及び2型糖尿病並びに内分泌疾患におけるインスリン抵抗性(例えば、1型糖尿病、クッシング病又はリポジストロフィー症候群を伴う肥満対象)を含むインスリン抵抗性関連状態を予防及び/又は治療するための新しい又は改善された方策を提供することが、本開示の目的である。
本発明者らは、ミオ-イノシトールが、健康な乳児の便から単離された酪酸菌アナエロスティペス・ラムノシボランス(Anaerostipes rhamnosivorans)の炭素及びエネルギー源として働き得ることを発見した(Buiら 2014年 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64:787～793頁)。この細菌は、ミオ-イノシトールを効率的に発酵してプロピオン酸にすることができ、そのクローズドゲノムにおいて完全なイノシトール発酵経路が発見されており、それは場合により、他の任意の細菌に導入することができる。図2A及び図2Bを参照されたい。
食事性ミオ-イノシトール栄養補助は、インスリン抵抗性を低減し得ることが公知である。しかしながら、このことが起こる機構は、本発明が行われる前は未知であった。
本発明者らは、ミオ-イノシトールは、間接的な有益な効果を有することがあり、対象にとって有益なことはミオ-イノシトールそれ自体ではなく、ミオ-イノシトールの代謝変換であると考えた。それゆえ、アナエロスティペス・ラムノシボランスによるブチレート及び特に、プロピオネートの生成は、対象にとって確実に有益であることに留意することは興味深い(例えば、Hamerら 2008年 Pharmacology & Therapeutics 27:104～119頁;Hosseiniら 2011年 Nutrition Reviews 69:245～258頁を参照されたい)。
本発明者らは、生体内原位置でのプロピオン酸及び場合により酪酸生成によるインスリン抵抗性の改善をもたらす直接的又は相乗的効果を提供するための、対象の、本開示による細菌、又は或いはミオ-イノシトール及び本開示による細菌の両方による栄養補助を想定する。
本開示による細菌は、ミオ-イノシトールを効率的に発酵してプロピオネートにすることができる。実験は2回行った。 特定されたイノシトール-プロピオネート経路。 特定されたイノシトール-プロピオネート経路。 様々なアナエロスティペス株がミオ-イノシトールを代謝する性能を示す。 様々なアナエロスティペス株がミオ-イノシトールを代謝する性能を示す。 アナエロスティペス単離物のNCBIゲノム内のイノシトール経路遺伝子の存在。
本開示は、代謝症候群、インスリン抵抗性及び/又はインスリン抵抗性関連状態の予防及び/又は治療における使用のための、イノシトール-プロピオン酸経路をコードする遺伝子セットを含む細菌であって、イノシトール-プロピオン酸経路が、前記細菌がイノシトールをプロピオン酸又はその塩若しくはエステルに変換することを可能にする、細菌に関する。
特に、細菌は、イノシトール代謝及びプロピオン酸合成により、イノシトールをプロピオン酸又はその誘導体に変換することができる。イノシトールは、キロ-イノシトール(chiro-inositol)又はミオ-イノシトール、好ましくはミオ-イノシトールであり得る。好ましい実施形態では、細菌は、更に、酪酸及び/又はブチレート生成菌(酪酸菌)である(すなわち、また、ブチル酸/ブチレート合成経路遺伝子セットを含む)。
任意の理論に束縛されるものではないが、本開示による細菌(又はそれに由来する株)は、ヒトに投与された場合又は十分な量でヒトに摂取された場合、生存可能であり、前記ヒトの胃腸管で少なくとも一過性にコロニー形成すると考えられている。このコロニー形成は、プロピオン酸/プロピオネート(及び/又は酪酸/ブチレート)の生体内原位置でのより多くの生成を可能にする。プロピオン酸の生体内原位置での生成の増大は、本明細書で教示される通り、有益な効果、例えば、代謝症候群等の代謝疾患;並びにインスリン抵抗性、又は脂質異常及び2型糖尿病並びに内分泌疾患におけるインスリン抵抗性(例えば、1型糖尿病、クッシング病又はリポジストロフィー症候群を伴う肥満対象)等のインスリン抵抗性関連合併症等の、状態又は疾患の予防及び/又は治療の基礎となると考えられる。
細菌
第1の態様では、本開示は、イノシトール-プロピオン酸経路をコードする遺伝子セットを含む細菌であって、イノシトール-プロピオン酸経路が、必ずしもではないが、特に、細菌及び/又はその培地が1、2、3、4、5、10体積%を超える酸素を含む気体と接触しないような嫌気的条件下で、前記細菌がイノシトールをプロピオン酸又はその塩若しくはエステルに変換することを可能にする、細菌に関する。細菌株は、必ずしもではないが、好ましくは、単離物、例えば、ヒト腸単離物である。
イノシトール-プロピオン酸経路遺伝子セットは、タンパク質:ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼ、イノソースデヒドラターゼ、エピ-イノシトールヒドロラーゼ、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼ、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼ、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケト-イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼ、3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼ、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ及びアクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfをコードする遺伝子のうちの1つ又は複数(少なくとも2若しくは3つ又は全て)を含み得る。加えて、イノシトール-プロピオン酸経路遺伝子セットは、タンパク質イノソースイソメラーゼ及び/又は酵素ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼの別の複製物をコードする遺伝子がD-キロ-イノシトールのシロ-イノソースへの変換を可能にするので、それを含み得る。
加えて又は或いは、本開示による細菌は、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及び/又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含み得る。
好ましい実施形態では、タンパク質:ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼ、イノソースデヒドラターゼ、エピ-イノシトールヒドロラーゼ、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼ、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼ、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼ及びグリセルアルデヒド-3-ホスフェートケト-イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼ、3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼ、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etf並びにイノソースイソメラーゼのうちの少なくとも1つ(又は少なくとも2若しくは3つ又は全て)は、細菌が(ミオ)イノシトールの非存在下で増殖した場合と比較して、細菌が(ミオ)イノシトールの存在下で増殖した場合、過剰生成され得る(又はそれらをコードする遺伝子は過剰発現され得る)。
本開示の文脈において、細菌において遺伝子がアップレギュレートされているか、又はタンパク質が過剰発現されているかを決定するために使用される(ミオ)イノシトールの量は、前記細菌が(ミオ)イノシトールの非存在下で増殖した場合と比較して、約5mM～約100mM、好ましくは約10mM～約50mM、より好ましくは約15mM～約25mMの範囲内であることがあり、最も好ましくは約20mMである。
一実施形態では、本開示による細菌は、単離された腸内細菌株又はそれに由来する株である場合及び/又はヒトから単離された腸内細菌である場合があり、それは、天然に、本明細書で教示されるイノシトール-プロピオン酸経路遺伝子セットを含み、且つそれは、(ミオ及び/又はキロ)イノシトールをプロピオン酸又はその誘導体に変換することができる。
更なる態様では、本開示による細菌は、2015年6月26日にヴァーヘニンゲン大学(Wageningen University)によってCentraalbureau voor Schimmelcultures(現在はWesterdijk Fungal Biodiversity Instituteと命名された)(Uppsalalaan 8、3584CT Utrecht、オランダに位置する)に寄託された、寄託番号CBS 140182を割り当てられた細菌アナエロスティペス・ラムノシボランス1y2であり得る。また、寄託細菌に由来する任意の細菌株が包含される。
或いは、本開示による細菌は、本明細書で教示されるイノシトール-プロピオン酸経路遺伝子セットをトランスフェクトされており、且つ(ミオ及び/又はキロ)イノシトールをプロピオン酸又はその誘導体に変換することができる細菌であり得る。当業者は、細菌を所望の遺伝子構築物(すなわち、経路遺伝子セット)で形質転換するための方法をよく知っている。
一実施形態では、本開示による細菌は、ファーミキューテス(Firmicutes)門に、好ましくはクロストリジウム(Clostridia)綱(及び/又はクロストリジウム(Clostridiales)目)に、より好ましくはラクノスピラ(Lachnospiraceae)科に、より好ましくはアナエロスティペス(Anaerostipes)属に、更により好ましくはアナエロスティペス・ラムノシボランス種に属する。
一実施形態では、本開示による細菌は、アナエロスティペス・ハドルス(Anaerostipes hadrus)ではない。或いは、本開示による細菌がアナエロスティペス・ハドルスである場合、使用は、本明細書で教示されるインスリン抵抗性又はインスリン抵抗性関連合併症を予防及び/又は治療するための使用である。好ましくは、アナエロスティペス・ハドルスは、基準株DSM3319又は108065に関する。或いは、本開示による細菌は、アナエロスティペス・ブティラティクス(Anaerostipes butyraticus)、好ましくは基準株DSM22094である。
本明細書で以前に示される通り、イノシトール-プロピオン酸経路遺伝子セットは、タンパク質:ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼ、イノソースデヒドラターゼ、エピ-イノシトールヒドロラーゼ、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼ、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼ、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケト-イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼ、3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼ、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ及びアクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfをコードする遺伝子のうちの1つ又は複数を含み得る。加えて、イノシトール-プロピオン酸経路遺伝子セットは、タンパク質イノソースイソメラーゼ及び/又は酵素ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼの別の複製物の各々がD-キロ-イノシトールのシロ-イノソースへの変換を可能にするので、それらをコードする遺伝子を含み得る。
ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号1との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号2との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼに関し得る。遺伝子ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼの機能は、ミオ-イノシトールのシロ-イノソースへの変換において見ることができる。
ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の更なる又は代替の複製物は、配列番号3との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の更なる又は代替の複製物は、配列番号4との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼに関し得る。この遺伝子の機能は、D-キロ-イノシトールから1-ケト-D-キロ-イノシトールへの変換において見ることができる。
イノソースデヒドラターゼをコードする遺伝子は、配列番号5との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、イノソースデヒドラターゼをコードする遺伝子は、配列番号6との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するイノソースデヒドラターゼに関し得る。遺伝子イノソースデヒドラターゼの機能は、シロ-イノソースの3,5/4-トリヒドロキシシクロヘキサ-1,2-ジオンへの変換において見ることができる。
エピ-イノシトールヒドロラーゼをコードする遺伝子は、配列番号7との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、エピ-イノシトールヒドロラーゼをコードする遺伝子は、配列番号8との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するエピ-イノシトールヒドロラーゼに関し得る。遺伝子エピ-イノシトールヒドロラーゼの機能は、3,5/4-トリヒドロキシシクロヘキサ-1,2-ジオンの5-デオキシ-D-グルクロネートへの変換において見ることができる。
5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼをコードする遺伝子は、配列番号9との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼをコードする遺伝子は、配列番号10との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有する5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼに関し得る。遺伝子5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼの機能は、5-デオキシ-D-グルクロネートの2-デオキシ-5-ケト-D-グルコネートへの変換において見ることができる。
5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼをコードする遺伝子は、配列番号11との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼをコードする遺伝子は、配列番号12との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有する5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼに関し得る。遺伝子5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼの機能は、2-デオキシ-5-ケト-D-グルコネートの2-デオキシ-5-ケト-D-グルコネート-6Pへの変換において見ることができる。
5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼをコードする遺伝子は、配列番号13との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼをコードする遺伝子は、配列番号14との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有する5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼに関し得る。遺伝子5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼの機能は、2-デオキシ-5-ケト-D-グルコネート-6Pの3-オキソプロピオネート及びジヒドロキシアセトン(glycerone)ホスフェートへの変換において見ることができる。
グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケト-イソメラーゼをコードする遺伝子は、配列番号15との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケト-イソメラーゼをコードする遺伝子は、配列番号16との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するグリセルアルデヒド-3-ホスフェートケト-イソメラーゼに関し得る。遺伝子グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケト-イソメラーゼの機能は、ジヒドロキシアセトンホスフェートのグリセルアルデヒド-3Pへの変換において見ることができる。
グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号17との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号18との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼに関し得る。遺伝子グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼの機能は、グリセルアルデヒド-3Pの1,3-ビスホスホグリセレート(biphosphoglycerate)への変換において見ることができる。
ホスホグリセレートキナーゼをコードする遺伝子は、配列番号19との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、ホスホグリセレートキナーゼをコードする遺伝子は、配列番号20との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するホスホグリセレートキナーゼに関し得る。遺伝子ホスホグリセレートキナーゼの機能は、1,3-ビスホスホグリセレートの3-ホスホグリセレートへの変換において見ることができる。
ホスホグリセレートムターゼをコードする遺伝子は、配列番号21との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、ホスホグリセレートムターゼをコードする遺伝子は、配列番号22との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するホスホグリセレートムターゼに関し得る。遺伝子ホスホグリセレートムターゼの機能は、3-ホスホグリセレートの2-ホスホエノールピルベートへの変換において見ることができる。
エノラーゼをコードする遺伝子は、配列番号23との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、エノラーゼをコードする遺伝子は、配列番号24との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するエノラーゼに関し得る。遺伝子エノラーゼの機能は、3-ホスホグリセレートの2-ホスホエノールピルベートへの変換において見ることができる。
ピルベートキナーゼをコードする遺伝子は、配列番号47との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、ピルベートキナーゼをコードする遺伝子は、配列番号48との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するピルベートキナーゼに関し得る。遺伝子ピルベートキナーゼの機能は、ホスホエノールピルベートのピルベートへの変換において見ることができる。
ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、配列番号25との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、配列番号26との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼに関し得る。遺伝子ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼの機能は、ピルベートのアセチル-CoA及びCO2/蟻酸への変換において見ることができる。
3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、配列番号27との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、配列番号28との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有する3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼに関し得る。遺伝子3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼの機能は、3-オキソプロピオネートの3-オキソプロピオニル-CoAへの変換及び/又はプロピオニル-CoAのプロピオネートへの変換において見ることができる。
アシル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号29との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、アシル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号30との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するアシル-CoAデヒドロゲナーゼに関し得る。遺伝子アシル-CoAデヒドロゲナーゼの機能は、3-オキソプロピオニル-CoAの3-ヒドロキシプロピオニル-CoAへの変換において見ることができる。
エノイル-CoAヒドラターゼをコードする遺伝子は、配列番号31との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、エノイル-CoAヒドラターゼをコードする遺伝子は、配列番号32との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するエノイル-CoAヒドラターゼに関し得る。遺伝子エノイル-CoAヒドラターゼの機能は、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAのアクリロイル-CoAへの変換において見ることができる。
アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfをコードする遺伝子は、配列番号33との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfをコードする遺伝子の更なる(第2の)又は代替の複製物は、配列番号35との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfをコードする遺伝子の更なる(第3の)又は代替の複製物は、配列番号37との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfをコードする遺伝子は、配列番号34との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するアクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfに関し得る。アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfをコードする遺伝子の更なる(第2の)又は代替の複製物は、配列番号36との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するアクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfに関し得る。アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfをコードする遺伝子の更なる(第3の)又は代替の複製物は、配列番号38との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するアクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfに関し得る。アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfは、AR1Y2_1051及びAR1Y2_1052が、アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ(AR1Y2_1050)の電子受容体として機能する複合体のアルファ及びベータサブユニットである、複合体であり得る。遺伝子アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etfの機能は、アクリロイル-CoAのプロピオニル-CoAへの変換において見ることができる。
イノソースイソメラーゼをコードする遺伝子は、配列番号39との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、イノソースイソメラーゼをコードする遺伝子は、配列番号40との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するイノソースイソメラーゼに関し得る。この遺伝子の機能は、1-ケト-D-キロ-イノシトールからシロ-イノソースへの変換において見ることができる。
ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号41との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、遺伝子ラクテートデヒドロゲナーゼは、配列番号42との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するラクテートデヒドロゲナーゼに関し得る。遺伝子ラクテートデヒドロゲナーゼの機能は、ピルベートのラクテートへの変換において見ることができる。
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号43との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、遺伝子アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号44との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼに関し得る。遺伝子アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの機能は、アセチル-CoAのアセトアルデヒドへの変換において見ることができる。
アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号45との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有し得る。加えて又は或いは、遺伝子アルコールデヒドロゲナーゼは、配列番号46との少なくとも70、80、90、95、99、100%の配列同一性を有するアルコールデヒドロゲナーゼに関し得る。遺伝子アルコールデヒドロゲナーゼの機能は、アセトアルデヒドのエタノールへの変換において見ることができる。
ある特定の実施形態では、本開示による細菌は、マロネート-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(マロン酸セミアルデヒドのアセチル-CoAへの変換に関与する)をコードする遺伝子を含まない。
組成物
本開示は、本開示による細菌と、場合により生理学的に許容できる担体とを含む組成物を更に提供する。生理学的に許容できる担体は、本明細書で教示される細菌を、対象(例えば、ヒト又は動物)による消費まで生存したまま維持するために好適な任意の担体であり得る。例えば、この目的に好適な許容できる担体の非限定的な例には、周知の生理学的又は薬学的担体、緩衝液及び賦形剤のいずれかが含まれる。好適な生理学的又は薬学的担体についての選択は、本明細書で教示される組成物の意図される投与様式(例えば、経口)及び組成物の意図される形態(例えば、飲料、ヨーグルト、粉末、カプセル等)に依存することが理解される。当業者は、本明細書で教示される組成物に好適な生理学的又は薬学的担体をどのように選択するかを知っている。
一実施形態では、本明細書で教示される組成物は、食品組成物、飼料組成物、飼料栄養補助組成物、食品栄養補助組成物又は医薬組成物の形態であり得る。組成物は、好ましくは、ヒトによる消費に好適である。
一実施形態では、組成物は、食品又は食品栄養補助組成物である。食品又は食品栄養補助組成物は、液体、液体飲料(乳飲料及び発酵飲料を含む)、ヨーグルト、チーズ、ゲル、ゼラチン、ゼラチンカプセル、粉末、ペースト、プレス加工錠剤及びゲルキャップからなる群から選択され得る。好適な実施形態では、組成物は、液体、好ましくは液体飲料(例えば、乳飲料)である。食品又は食品栄養補助組成物は、乳製品、好ましくは発酵乳製品、好ましくはヨーグルト又はヨーグルトドリンクであり得る。
一実施形態では、本明細書で教示される組成物は、プロバイオティクス組成物であり得る。そのようなプロバイオティクス組成物は、本明細書で教示される細菌(単離された)又はそれに由来する株を含み得る。一実施形態では、本明細書で教示される組成物は、1つ又は複数の追加の有益な単離された腸内細菌株を更に含む。
一実施形態では、1つ又は複数の追加の有益な単離された腸内細菌株は、ラクトバチルス(Lactobacillus)属及び/若しくはビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属から選択される任意の乳酸菌株、並びに/又はアセチル-CoA経路を介してブチレートを生成する任意のブチレート生成細菌であり得る。
一実施形態では、組成物は、シンバイオティクス組成物であり得る。例えば、本明細書で教示される細菌の効果(例えば、プロピオン酸/プロピオネート及び/若しくは酪酸/ブチレート又はそれらの誘導体の生成)の栄養補助のために、1つ又は複数のプレバイオティクス成分を本明細書で教示される組成物に付加することは有益であり得る。
一実施形態では、1つ又は複数のプレバイオティクス成分は、本明細書で教示される細菌又はそれに由来する株の活性を向上させるため及び/又はそれらの増殖を刺激するために好適な任意のプレバイオティクス成分であり得る。好適なプレバイオティクス成分の非限定的な例には、イヌリン、ペクチン及び難消化性デンプン等の繊維、並びにセロビオース、マルトース、マンノース、サリシン、トレハロース、アミグダリン、アラビノース、メリビオース、ソルビトール、ラムノース及び/又はキシロースが含まれる。
一実施形態では、本明細書で教示される組成物は、(ミオ)イノシトール-リッチ源及び/又は(ミオ)イノシトールを含む。例えば、(ミオ)イノシトール-リッチ源及び/又は(ミオ)イノシトールを本明細書で教示される組成物に付加して、哺乳動物(例えば、ヒト)の胃腸管におけるプロピオン酸/プロピオネート及び/若しくは酪酸/ブチレート又はそれらの誘導体の生成を更に促進することは、有益であり得る。
一実施形態では、本明細書で教示される組成物は、保存中及び/又は胆汁への曝露中及び/又は哺乳動物(例えば、ヒト)の胃腸管の通過中の、本明細書で教示される細菌又はそれに由来する株の生存及び/又は生存率を促進するのに好適な1つ又は複数の成分を含み得る。そのような成分の非限定的な例には、胃の通過を可能にする腸溶性コーティング及び放出制御剤が含まれる。当業者は、本明細書で教示される細菌を、生存し且つ機能的な状態、すなわち、意図される機能を行うことができる状態に維持するために好適な成分をどのように選択するかを知っている。
一実施形態では、本明細書で教示される組成物は、本明細書で教示される組成物の栄養的価値及び/又は治療的価値を更に向上させる1つ又は複数の成分を更に含み得る。例えば、タンパク質、アミノ酸、酵素、鉱物塩、ビタミン類(例えば、チアミンHCl、リボフラビン、ピリドキシンHCl、ナイアシン、イノシトール、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、ビオチン、葉酸、アスコルビン酸、ビタミンB12、p-アミノ安息香酸、ビタミンAアセテート、ビタミンK、ビタミンD、ビタミンE等)、糖類及び複合糖質(例えば、水溶性及び水不溶性単糖類、二糖類及び多糖類)、医薬化合物(例えば、抗生物質)、抗酸化物質、微量元素成分(例えば、コバルト、銅、マンガン、鉄、亜鉛、スズ、ニッケル、クロム、モリブデン、ヨウ素、塩素、ケイ素、バナジウム、セレニウム、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム及びカリウム等の化合物)から選択される1つ又は複数の成分(例えば、栄養成分、獣医学的薬剤又は医薬剤等)を付加することは有益であり得る。当業者は、本明細書で教示される組成物の栄養的及び/又は治療的/医薬的価値を向上するのに好適な方法及び成分に精通している。
本明細書で教示される細菌は、凍結乾燥形態、マイクロカプセル化形態(例えば、Solankiら BioMed Res. Int. 2013、記事ID 620719によって概略される)、又は細菌株の活性及び/若しくは生存率を保存する他の任意の形態で、組成物に組み込まれ得る。
本明細書で教示される組成物は、医薬組成物であり得る。医薬組成物は、栄養補助食品としての使用のためであり得る。医薬組成物は、本明細書で教示される細菌に加えて、医薬担体を通常含む。担体は、好ましくは、不活性担体である。好ましい形態は、意図される投与様式及び(治療)適用に依存する。医薬担体は、本明細書で教示される細菌を、対象の胃腸管へ送達するのに好適な任意の適合性非毒性物質であり得る。例えば、滅菌水又は不活性固体は、薬学的に許容できる補助剤、緩衝剤、分散剤等で通常補完して、担体として使用することができる。本明細書で教示される医薬組成物は、液体形態、例えば本明細書で教示される細菌の安定化細菌懸濁液で、又は固形、例えば本明細書で教示される凍結乾燥細菌の粉末で存在し得る。本明細書で教示される細菌が凍結乾燥される場合、ラクトース、トレハロース又はグリコーゲン等の凍結保護物質を使用してもよい。例えば、経口投与のために、本明細書で教示される細菌は、凍結乾燥細菌を含むカプセル、錠剤及び粉末等の固体剤形で、又はエリキシル剤、シロップ及び懸濁液等の液体剤形で投与され得る。例えば凍結乾燥形態の、本明細書で教示される細菌は、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルカン、炭酸マグネシウム等の不活性成分及び粉末化担体と共に、ゼラチンカプセル等のカプセルに被包され得る。
一実施形態では、本明細書で教示される細菌は、約106～約1015コロニー形成単位(CFU:colony forming unit)に及ぶ量で、本明細書で教示される組成物に含まれ得る。例えば、腸内細菌は、約107CFU～約1014CFU、好ましくは約108CFU～約1013CFU、好ましくは約109CFU～約1012CFU、より好ましくは約1010CFU～約1012CFUの量で組成物に含まれ得る。
本開示の方法及び使用
本開示は、医薬としての使用のため、食品若しくは食品栄養補助食品としての使用のため、又はプロバイオティクス及び/若しくはシンバイオティクスとしての使用のための本明細書で教示される細菌又は本明細書で教示される組成物に関する。
好ましい実施形態では、本開示による使用のための細菌は、細菌と同じ組成物に又は別々の組成物に存在し得る、例えば、約5mM～約100mM、好ましくは約10mM～約50mM、より好ましくは約15mM～約25mMの範囲内を含み、最も好ましくは約20mM(ミオ)イノシトールであるか、又は例えば、約1mg～約1000mg、好ましくは約10mg～約500mg、より好ましくは約15mg～約50mgを含む(ミオ)イノシトールと又は(ミオ)イノシトール源(又はリン脂質若しくはフィチン酸源)と、別々に、連続して又は同時に投与され得る。或いは、イノシトールの量及び/又は投与頻度は、1日当たり0.1～100グラム、又は1日当たり0.5～10グラム若しくは0.5～10グラム若しくは0.1～5グラムが消費されるように、選択される。
本開示は、全般的な胃腸の健康を維持、回復及び/若しくは改善することにおける使用のため、並びに/又は肥満;代謝症候群等の代謝疾患;並びにインスリン抵抗性、若しくは脂質異常及び2型糖尿病並びに内分泌疾患におけるインスリン抵抗性(例えば、1型糖尿病、クッシング病又はリポジストロフィー症候群を伴う肥満対象)等のインスリン抵抗性関連合併症等の、状態若しくは疾患を予防及び/若しくは治療するための、本明細書で教示される細菌又は本明細書で教示される組成物に特に関する。
また、本開示は、それを必要とする対象において、全般的な胃腸の健康を維持、回復及び/若しくは改善するため、並びに/又は肥満;代謝症候群等の代謝疾患;並びにインスリン抵抗性、若しくは脂質異常及び2型糖尿病並びに内分泌疾患におけるインスリン抵抗性(例えば、1型糖尿病、クッシング病又はリポジストロフィー症候群を伴う肥満対象)等のインスリン抵抗性関連合併症等の、状態若しくは疾患を予防及び/若しくは治療するための方法であって、前記対象において本明細書で教示される細菌のレベルを増大する工程を含む方法を対象とする。
前記対象における本明細書で教示される細菌のレベルは、有効量の前記細菌を、前記対象に投与することによって及び/又は前記対象(の胃腸管)において前記細菌のレベルを増大することができる有効量の化合物を投与することによって、増大することができる。
一実施形態では、本明細書で教示される細菌は、果実、豆類、穀類及び堅果類等の(ミオ)イノシトール又は(ミオ)イノシトール源(又はリン脂質若しくはフィチン酸源)に付随して投与され得る。当業者は、過度の負担を伴うことなく、(ミオ)イノシトールリッチ源を容易に特定することができる。
好ましい実施形態では、対象の胃腸管における本明細書で教示される細菌のレベルは、有効量の本明細書で教示される細菌、しかし好ましくはアナエロスティペス・ラムノシボランス1y2及び/又はアナエロスティペス・ラムノシボランス1y2を含む本明細書で教示される組成物を、前記対象に投与することによって増大することができる。
一実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ウシ及びブタからなる群から選択され得る。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
また、本開示は、プロピオン酸を生成するための方法であって、本明細書で教示される細菌を、好適なエネルギー源、例えば、(ミオ)イノシトール及び/又はグルコース/アセテートと、本明細書で教示される細菌がエネルギー源をプロピオン酸に変換することを可能にする条件下で接触させる工程を含む方法に関する。
本明細書で教示される方法は、in vitro法であり得る。
条項
1. 代謝症候群、インスリン抵抗性又はインスリン抵抗性関連状態の予防及び/又は治療における使用のための、遺伝子セットを含む細菌であって、遺伝子セットが、前記細菌がイノシトールをプロピオン酸又はその塩若しくはエステルに変換することを可能にする、使用のための細菌。
2. 遺伝子セットが、タンパク質:ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼ、イノソースデヒドラターゼ、エピ-イノシトールヒドロラーゼ、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼ、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼ、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケトール-イソメラーゼ及びイノソースイソメラーゼのうちの1つ又は複数をコードする遺伝子を含む、条項1に記載の使用のための細菌。
3. タンパク質:ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼ、イノソースデヒドラターゼ、エピ-イノシトールヒドロラーゼ、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼ、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼ、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケトール-イソメラーゼ及びイノソースイソメラーゼをコードする遺伝子のうちの少なくとも1つが、細菌がイノシトールの非存在下で増殖した場合と比較して、細菌がイノシトールの存在下で増殖した場合、過剰発現している、条項1又は2に記載の使用のための細菌。
4. 使用が、インスリン抵抗性又はインスリン抵抗性関連状態の予防及び/又は治療における使用である、条項1から3のいずれか一項に記載の使用のための細菌。
5. インスリン抵抗性関連状態が、脂質異常、2型糖尿病及び内分泌疾患におけるインスリン抵抗性から選択される、条項1から4のいずれか一項に記載の使用のための細菌。
6. ヒト腸内単離細菌である、条項1から5のいずれか一項に記載の使用のための細菌。
7. CBS 140182として寄託されている、条項1から6のいずれか一項に記載の使用のための細菌。
8. 生理学的に許容できる担体を更に含む組成物に含まれる、条項1から7のいずれか一項に記載の使用のための細菌。
9. 組成物が、食品組成物、好ましくは乳製品、より好ましくは発酵乳製品、好ましくはヨーグルト又はヨーグルトドリンクである、条項8に記載の使用のための細菌。
10. 組成物が、好ましくは固体剤形、好ましくはカプセル、錠剤又は粉末の医薬組成物である、条項8に記載の使用のための細菌。
11. 組成物において、凍結乾燥又はマイクロカプセル化形態で存在する、条項8から10のいずれか一項に記載の使用のための細菌。
12. 106～1015コロニー形成単位(CFU)の範囲内の量で存在する、条項1から11のいずれか一項に記載の使用のための細菌。
13. イノシトールと別々に、連続して又は同時に投与される、条項1から12のいずれか一項に記載の使用のための細菌。
14. プロバイオティクスとしての使用のための、条項1から13のいずれか一項に記載の使用のための細菌。
一般定義
「プロバイオティクス」又は「プロバイオティクス製品」という用語は、本明細書で使用される場合、有効量で投与又は摂取されたとき、宿主(例えば、ヒト又は哺乳動物)に健康利益を与える腸内細菌等の微生物を指す。好ましくは、プロバイオティクスは、対象に投与されたときプロバイオティクスが宿主の大腸でコロニー形成することを可能にするために生きているか又は生存可能であるべきである。しかしながら、ある特定の条件下では、また、プロバイオティクスにより生成された物質がプロバイオティクスの有益な効果を宿主に対してまだ発揮する限り、プロバイオティクスは、投与されたとき死滅していてもよい。ほとんどのプロバイオティクス又はプロバイオティクス製品は、ラクトバチルス又はビフィドバクテリウム等の乳酸菌からなる。当業者は、プロバイオティクスの分野をよく知っており、プロバイオティクス活性を有する乳酸菌をどのように選択するかを知っている。
「プレバイオティクス」又は「プレバイオティクス製品」という用語は、本明細書で使用される場合、それらの宿主の健康に寄与する胃腸微生物の増殖及び/又は活性を促進する化合物を一般的に指す。プレバイオティクス又はプレバイオティクス製品は、主に、発酵可能な繊維又は非消化性炭水化物からなる。プロバイオティクスによるこれらの繊維の発酵は、SCFA、特にブチレート等の有益な最終生成物の生成を促進する。当業者は、プレバイオティクスの分野をよく知っており、プレバイオティクス活性を有する成分をどのように選択するかを知っている。
「シンバイオティクス」又は「シンバイオティクス製品」という用語は、本明細書で使用される場合、プロバイオティクスとプレバイオティクス等の胃腸微生物の増殖及び/又は活性を促進する1つ又は複数の化合物とを組み合わせて1つの製品にした、組成物及び/又は栄養補助食品を一般的に指す。シンバイオティクスは、胃腸管におけるプロバイオティクスの生存及びコロニー形成を改善することによって、プロバイオティクスの増殖を選択的に刺激することによって及び/又はその代謝を活性化することによって、宿主に有利に影響を及ぼし、したがって宿主の生活を改善する。当業者は、シンバイオティクスをよく知っており、組み合わせてシンバイオティクスにすることができる成分をどのように選択するかを知っている。
「プロピオン酸」という用語は、本明細書で使用される場合、化学式CH3CH2CO2Hを有するカルボン酸を指す。この用語は、その誘導体、すなわち、プロピオン酸に由来する化合物、及び特にプロピオネート又はプロパノエートとして公知のプロピオン酸の塩及びエステルを含み得る。プロピオン酸塩の非限定的な例は、アンモニウムプロピオネート、カルシウムプロピオネート、マグネシウムプロピオネート、カリウムプロピオネート及びナトリウムプロピオネートである。プロピオン酸エステルの非限定的な例は、エチルプロピオネートである。
「酪酸」(ブタン酸という組織名でも公知)という用語は、本明細書で使用される場合、構造式CH3CH2CH2COOHを有するカルボン酸を指す。この用語は、その誘導体、すなわち、酪酸に由来する化合物を含み、ブチレート又はブタノエートとして公知の酪酸の塩及びエステルを含む。酪酸塩の非限定的な例には、ナトリウムブチレート、カルシウムブチレート、マグネシウムブチレート、マンガンブチレート、コバルトブチレート、バリウムブチレート、リチウムブチレート、亜鉛ブチレート、カリウムブチレート、酪酸第1鉄等が含まれる。酪酸エステル(すなわち、酪酸のエステル)の非限定的な例には、セルロースアセテートブチレート、メチルブチレート、エチルブチレート、ブチルブチレート、ペンチルブチレート等が含まれる。
「ブチレート生成細菌」又は「酪酸生成細菌」又は「酪酸菌」という用語は、本明細書で互換的に使用され、酪酸及び/若しくはブチレート並びに/又は1つ若しくは複数のそれらの誘導体を生成することができる細菌を指す。酪酸及び/又はブチレート並びにそれらの誘導体が哺乳動物消化管において生体内原位置で(又は培養においてin vitroで)生成され得る傑出した経路、すなわち、酪酸/ブチレート合成経路遺伝子セットは、いわゆる「アセチル-CoA経路」である。アセチル-CoA経路は、十分に説明されており、例えば、ラクノスピラ属及びルミノコッカス(Ruminococcaceae)属に属する腸内細菌(合わせて全消化管微生物叢の最高で20%を形成し得る)において特に優勢であることが公知である。アセチル-CoA経路により、酪酸及び/若しくはブチレート並びに/又はそれらの誘導体は、炭水化物発酵を介して単一の細菌種により及び/又は他の生物からの代謝物が酪酸菌の基質として作用する微生物群により形成することができる。従来型アセチル-CoA経路は、ブチリル-CoAトランスフェラーゼ(But:butyryl-CoA transferase)及びブチレートキナーゼ(Buk:butyrate kinase)と呼ばれる2つの重要な酵素(多くの他の酵素の中でも)を含む、酵素カスケードを含む。当業者は、酵素をコードする遺伝子を含む「アセチル-CoA経路」、及び前記経路の機能の根底にある他の要素、並びにこの経路を有する腸内細菌種をよく知っている。
「イノシトール-プロピオン酸(又はプロピオネート)経路遺伝子セット」という用語は、本明細書で使用される場合、(ミオ)イノシトールのプロピオン酸(プロピオネート)又はその誘導体への変換に関与するタンパク質をコードする1セットの遺伝子を指す。本開示の一実施形態では、経路遺伝子セットは、タンパク質:ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼ、イノソースデヒドラターゼ、エピ-イノシトールヒドロラーゼ、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼ、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼ、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケト-イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼ、3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼ、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etf並びに場合によりイノソースイソメラーゼ及び/又はミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼの第2の複製物をコードする遺伝子を含む。
「有益な腸内細菌種」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物(例えば、ヒト)腸に生息し(すなわち、内生であり)、それが存在する哺乳動物の胃腸、代謝及び他の健康に対して有益な効果(例えば、病原性細菌種に対する保護、酪酸及び/又はブチレート並びに誘導体の生成等)を発揮する細菌種を指す。有益な腸内細菌種の非限定的な例には、ラクトバチルス属及びビフィドバクテリウム属の乳酸菌が含まれる。有益な腸内細菌種の他の非限定的な例には、US2014/0242654、WO 2014/150094又はWO 2013032328 A1で開示される細菌株等の、アセチル-CoAを使用して酪酸及び/又はブチレート並びにその誘導体を生成するブチレート生成細菌種が含まれる。病原性細菌種は、哺乳動物(例えば、ヒト)腸に生息し(すなわち、内生であり)、それが存在する哺乳動物の胃腸の健康に対して有害な効果(例えば、感染)を発揮する細菌を指し得る。悪名高い病原性細菌種の非限定的な例は、毒素生成クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)である。
「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書で教示される効果を達成するのに必要な量を指す。例えば、本明細書で教示される細菌の有効量は、ヒトにおいて胃腸の健康を維持、回復及び/若しくは改善するため、(ミオ)イノシトールをプロピオン酸/プロピオネート若しくはそれらの誘導体及び/又は酪酸/ブチレート若しくはそれらの誘導体に変換するため、並びに/又は対象、好ましくは、ヒトにおいて、本明細書で説明される状態若しくは疾患を予防及び/若しくは治療するために有効に有用な量である。これらの状態又は疾患には、肥満;代謝症候群等の代謝疾患;並びにインスリン抵抗性、又は脂質異常及び2型糖尿病並びに内分泌疾患におけるインスリン抵抗性(例えば、1型糖尿病、クッシング病又はリポジストロフィー症候群を伴う肥満対象)等のインスリン抵抗性関連合併症が含まれるが、これらに限定されない。有効量は、当業者によって過度の実験を行わずに容易に決定することができる。
「それに由来する株」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書で教示される寄託株を出発材料として使用することにより得られる株に関する。それに由来する株は、例えば、遺伝子工学、照射、UV光、化学処理の手段により本発明の株に由来し得る変異株であってもよい。或いは、そのような誘導株又は変異株は、当業者に周知の方法を使用して、より迅速な増殖、消化管におけるより優れた生存、イノシトール-プロピオネート変換の向上等の、誘導株への追加の利益をもたらす特定の条件への増殖適合に供された、本明細書で教示される寄託株に由来する株であり得る。誘導体又は変異体は、本明細書で教示される寄託株と機能的に同等であることが好ましい。本明細書で教示される好ましい誘導体又は変異体は、本明細書で教示される寄託株と実質的に同じ活性又は機能を有する、すなわち、(ミオ)イノシトールをプロピオン酸/プロピオネート及び誘導体に変換する能力を有する。誘導体又は変異体は、前記誘導体又は変異体を投与された哺乳動物(例えば、ヒト又は他の哺乳動物)に、寄託株の投与の際の場合と実質的に同じ利益を有利に提供する。また、誘導株又は変異株は、寄託株について本明細書で説明されるのと同じ特徴を有する自発的誘導株又は変異株であり得る。
「消費に好適な」又は「栄養的に許容できる」という用語は、ヒト(及び他の哺乳動物)消費にとって安全であると一般的にみなされる成分又は物質を指す。
「代謝症候群」という用語は、当業者に周知である。本開示内で、この用語は、(公認の)医師により「代謝症候群」と診断された全ての状態を包含する。例えば、患者が以下の特性のうちの少なくとも2つ又は少なくとも3つを有する場合、代謝症候群が診断され得る。
- 胴囲の高値 - 女性は少なくとも35インチ(89センチメートル)、男性は40インチ(102センチメートル)の寸法のウェストライン、
- 高トリグリセリドレベル - 150ミリグラム/デシリットル(mg/dL)若しくは1.7ミリモル/リットル(mmol/L)又はそれよりも高い、血中で見出されるこの種類の脂肪、
- 「善玉」又はHDLコレステロールの低減 - 男性において40mg/dL(1.04mmol/L)未満、又は女性において50mg/dL(1.3mmol/L)未満の高密度リポタンパク質(HDL:high-density lipoprotein)コレステロール、
- 血圧の上昇 - 130/85ミリメートル-マーキュリー(mmHg:millimeters of mercury)又はそれよりも高い値、
- 空腹時血糖の上昇 - 100mg/dL(5.6mmol/L)又はそれよりも高い値。
「インスリン抵抗性」という用語は、当業者に周知である。本開示内で、この用語は、(公認の)医師により「インスリン抵抗性」と診断された全ての状態を包含する。例えば、インスリン抵抗性は、「高インスリン正常血糖クランプ法」である、インスリン抵抗性を決定及び定量するための至適基準によって診断され得る(DeFronzo RA、Tobin JD、Andres R 1979年. The American Journal of Physiology. 237 (3):E214～23頁)。この方法は、低血糖を引き起こすことなくインスリンレベルの増大を補うのに必要なグルコース量を測定する。この手技は約2時間を要することがあり、典型的に以下の工程を含む。末梢静脈を通して、インスリンを、10～120mU/m2/分で注入する。インスリン注入を補うために、グルコース20%を注入して5～5.5mmol/Lの血糖レベルを維持する。グルコース注入速度を、5～10分毎に血糖レベルをチェックすることにより決定する(Muniyappa R、Lee S、Chen H、Quon MJ(2008年1月). American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 294 (1):E15～26頁)。試験の最後の30分間のグルコース注入速度は、インスリン感受性を決定する。高レベル(7.5mg/分又はそれよりも高い)が必要とされる場合、患者はインスリン感受性である。低レベル(4.0mg/分又はそれよりも低い)はインスリン抵抗性を示す。4.0～7.5mg/分のレベルは、決定的ではなく、インスリン抵抗性の初期の徴候である「耐糖能障害」を示唆する。或いは、ホメオスタシスモデル査定(HOMA:homeostatic model assessment)は、至適基準と合理的に相関するので、それはインスリン抵抗性を決定及び定量するために使用される方法である。例えば、Matthews DR、Hosker JP、Rudenski AS、Naylor BA、Treacher DF、Turner RC(1985年). Diabetologia. 28 (7):412～9頁. doi:10.1007/BF00280883. PMID 3899825;及び/又はA. S. Rudenski、D. R. Matthews、J. C. Levy、R. C. Turner(1991年) Metabolism. 40 (9):908～917頁を参照されたい。基準範囲から逸脱するHOMA(-IR)スコアは、インスリン抵抗性を示し得る。或いは、25mU/L又は174pmol/Lを超える空腹時血清インスリンレベルは、インスリン抵抗性を示すと考えることができる。「インスリン抵抗性」という用語は、本明細書で使用される場合、末梢インスリン抵抗性及び/又は肝インスリン抵抗性を指す。「インスリン抵抗性関連状態」(又は合併症)という用語は、脂質異常を指し得る。或いは又は加えて、この用語は、2型糖尿病を指し得る。更に、「インスリン抵抗性関連状態」(又は合併症)という用語は、内分泌疾患におけるインスリン抵抗性(例えば、1型糖尿病、クッシング病又はリポジストロフィー症候群を伴う肥満対象)を指し得る。
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野における一般公差の範囲、例えば、平均値の2標準偏差内を示す。「約」という用語は、示される値から最大で10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%又は0.01%逸脱する値を包含すると理解され得る。
「を含むこと(comprising)」又は「を含むこと(to comprise)」という用語及びそれらの活用形は、本明細書で使用される場合、前記用語がそれらの非限定的な意味で使用されて、この語に続く品目が含まれるが、特に言及されていない品目が除外されないことを意味する状況を指す。また、それは、より限定的な動詞「から本質的になること(to consist essentially of)」及び「からなること(to consist of)」を包含する。
不定冠詞「a」又は「an」による要素についての言及は、文脈が要素のうちのたった1つのみが存在することを明らかに要求しない限り、要素のうちの2つ以上が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「a」又は「an」は、「少なくとも1つ」を通常意味する。
「増大すること」及び「レベルの増大」という用語、並びに「減少すること」及び「レベルの減少」という用語は、有意に増大若しくは有意に減少する能力、又は有意なレベルの増大若しくは有意なレベルの減少を指す。一般的に、レベルが、対照又は参照の対応するレベルよりも、それぞれ、少なくとも5%、例えば、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%高い又は低い場合、レベルは増大又は減少している。或いは、試料中のレベルが対照又は参照のレベルと比較して、統計的に有意に増大又は減少している場合、レベルは、増大又は減少している場合がある。
配列表
Figure 2022544369000001
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Figure 2022544369000025
Figure 2022544369000026
本明細書において開示される配列と配列表で開示される配列との間に不一致があれば、本明細書で開示される配列が好ましい。或いは、配列表の配列を使用してもよい。
実験支援
ミオ-イノシトール-プロピオネート経路を含む細菌
本発明者らは、ミオ-イノシトールは、健康な乳児の便から以前に単離された、本開示による細菌、例えば、アナエロスティペス・ラムノシボランスの炭素及びエネルギー源として働き得ることを発見した(Buiら 2014年 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64:787～793頁)。
図1は、この細菌が、ミオ-イノシトールを効率的に発酵してプロピオネートにすることができることを示す。実験は2回行った。
プロテオミクス
完全なイノシトール発酵経路は、アナエロスティペス・ラムノシボランスのクローズドゲノムにおいて特定されており、したがって、それは任意の選択した細菌に導入することができる。
プロテオミクスのための方法
経路に関与するタンパク質を特定するために、2つの異なる基質で増殖する培養物におけるタンパク質存在量を、液体クロマトグラフィー-質量分析/質量分析により調べた。
アナエロスティペス・ラムノシボランスを、炭素及びエネルギー源として40mMミオ-イノシトールを含有するか又は40mMラムノースを含有する100ml重炭酸塩緩衝培地において4反復で増殖させた。
細胞を対数期において、4℃で20分間の4700gの遠心分離により収集した。細胞ペレットを2回洗浄し、0.5mlの100mM Tris-HCl(pH8)に懸濁した。タンパク質抽出及び消化を、以前に説明される通りに行った(Buiら、2015年)。消化後、試料を分析に際して-20℃に維持した。4μlの試料を、Thermo EASY nanoLC1000による0.5μl/分の流速のアセトニトリル勾配を伴う0.10*250mmのReproSil-Pur 120 C18-AQ 1.9μmビーズ分析カラム(社内で調製した)に注入することにより、試料を分析した。勾配は、50分間での1ml/l蟻酸を伴う水中の9～34%アセトニトリル増大、次いでカラム清浄化工程としての3分間でのアセトニトリル割合80%までの速い増大(20%の水、並びにアセトニトリル及び水の両方中1ml/lの蟻酸を伴う)からなった。マイクロクロス(micro cross)の廃棄線に嵌合させたステンレススチール針を介して、3.5kVのエレクトロスプレイ電位を溶離液に直接適用した。高解像度(60000)のオービトラップ型Q-Exactive HFX(Thermo electron社、San Jose、CA、米国)で、m/z380～1400の全スキャンポジティブモードFTMSスペクトルを測定した。MS及びMSMS AGCターゲットを、それぞれ、3.106、50000に設定するか、又は50ミリ秒(MS)及び25ミリ秒(MSMS)の最大イオン注入時間を使用した。MSスキャンにおける25個の最も豊富な2～5+荷電ピークのHCDフラグメント化(選択幅1.2m/z、24%正規化衝突エネルギー)MSMSスキャンを、データ依存様式で記録した(閾値1.2e5、選択したm/z +/- 10ppmについて15秒間の除外期間)。得られた全てのMSMSスペクトルを有するLCMSランを、最大で2つの切断ミスを伴う「特異的トリプシン/P(Specific Trypsin/P)」消化様式、及びAndromeda検索エンジンについての更なるデフォルト設定(第1検索20ppmペプチドトレランス(tolerance)、主検索4.5ppmトレランス、0.5DaのMSMSフラグメントマッチトレランス、固定改変としてのプロピオンアミド(C)セット)を使用するMaxQuant 1.6.3.4(Coxら、2008年)で分析し、一方で、タンパク質N末端アセチル化及びM酸化について変動性改変を設定し、これは、N及びQの脱アミド化についての非デフォルト設定により完了し、ペプチド当たりの改変の最大数は5であった(Coxら、2011年)。NCBIのアナエロスティペス・ラムノシボランスデータベース(CP040058)を、トリプシン(P00760、ウシ、及びP00761、ブタ)及びヒトケラチン(ケラチンK22E(P35908)、ケラチンK1C9(P35527)、ケラチンK2C1(P04264)及びケラチンK1CI(P35527))のような通常の夾雑物の配列を含有する夾雑物データベースと共に使用した。「ラベルを伴わない定量」及び「ラン間の適合」選択を可能にした。脱アミド化ペプチドがタンパク質定量に使用されることを可能にし、全ての他の定量設定をデフォルトに維持した。
MaxQuant/Andromedaワークフロー出力のフィルタリング及び更なるバイオインフォマティクス分析、並びに特定されたタンパク質存在量の分析を、Perseus 1.6.2.1モジュール(MaxQuant社の一式で入手可能)で行った。1%未満の偽陽性率(FDR:false discovery rate)を有するペプチド及びタンパク質、並びに少なくとも2つの特定されたペプチドであって、そのうちの少なくとも1つが独特であるべきであり、少なくとも1つが非改変であるべきである、ペプチドを伴うタンパク質を受容した。逆ヒット、並びに全てのイノシトール及びラムノース注入について0の正規化標識非含有定量強度(LFQ:label free quantitation intensity)値を示す全ての結果は、MaxQuant結果表から削除した。MaxQuant社から得たタンパク質LFQ MS1強度から、正規対数をとった。0の「ログLFQ」値を5.9の値(最低測定値よりもわずかに低い値)により置換して、理にかなった比率計算を可能にした。Perseusで、2つの試料を、FDRを0.05に設定し、且つS0を1に設定して得られた「LFQ強度」カラムを使用するT検定に適用することにより、イノシトールのラムノースに対する相対タンパク質定量を行った。nLC-MSMSシステム品質を、MaxQuant社結果ファイルを使用してPTXQC(Bielowら、2016年)でチェックした。

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Cox, N. Neuhauser, A. Michalski, R. A. Scheltema, J. V. Olsen and M. Mann (2011). Andromeda: A Peptide Search Engine Integrated into the MaxQuant. Environment.Journal of Proteome Research. 10(4): 1794-1805.
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有益な効果
食事性ミオ-イノシトール栄養補助は、インスリン抵抗性を低減し得ることが公知である。しかしながら、このことが起こる機構は未知である。本発明者らは、ミオ-イノシトールは、間接的な有益な効果を有し得ると考えた。
本発明者らは、宿主にとって有益なことはミオ-イノシトールそれ自体ではなく、むしろミオ-イノシトールの代謝変換であると予想した。それゆえ、アナエロスティペス・ラムノシボランスによるブチレート及び特に、プロピオネートの生成は、患者にとって確実に有益であることに留意することは興味深い(Hamerら 2008年 Pharmacology & Therapeutics 27:104～119頁;Hosseiniら 2011年 Nutrition Reviews 69:245～258頁)。
それゆえ、本開示による細菌、例えば、アナエロスティペス・ラムノシボランス又は或いはミオ-イノシトール及びアナエロスティペス・ラムノシボランスの両方による患者の栄養補助は、追加のプロピオネート及びブチレート生成によりインスリン抵抗性の改善に対して直接的又は相乗的効果を提供する。
治療
患者は、以下の3つの治療アームに従って、以下に示される通りに治療される。
治療1: 6週間、毎日2回、空の栄養補助食品。
治療2: 6週間、毎日2回、本開示による細菌、すなわち、アナエロスティペス・ラムノシボランスの108個の生細胞を含む栄養補助食品。
治療3: 6週間、毎日2回、10mgミオ-イノシトールと組み合わせた、本開示による細菌、すなわち、アナエロスティペス・ラムノシボランスの108個の生細胞を含む栄養補助食品。
Figure 2022544369000027
上記の表で示される推定効果と同様の結果を、より大きな患者コホートで得ることができることが期待される。
他の宿主細菌
別の宿主細菌、すなわち、大腸菌(Escherichia coli)に、本発明による、ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼ、イノソースデヒドラターゼ、エピ-イノシトールヒドロラーゼ、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼ、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼ、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケトール-イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼ、3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼ、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etf及びイノソースイソメラーゼを含む遺伝子セットを標準の方法によりトランスフェクトする。宿主細菌は、嫌気的条件下で(ミオ)イノシトールをプロピオネートに変換することができることが分かる。
Figure 2022544369000028

Claims (13)

  1. 代謝症候群、インスリン抵抗性又はインスリン抵抗性関連状態の予防及び/又は治療における使用のための、細菌がイノシトールをプロピオン酸又はその塩若しくはエステルに変換することを可能にする遺伝子セットを含む細菌であって、前記遺伝子セットが、タンパク質:ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼ、イノソースデヒドラターゼ、エピ-イノシトールヒドロラーゼ、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼ、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼ、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケトール-イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼ、3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼ、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etf及びイノソースイソメラーゼのうちの1つ又は複数をコードする遺伝子を含む、細菌。
  2. タンパク質:ミオ-イノシトール2-デヒドロゲナーゼ、イノソースデヒドラターゼ、エピ-イノシトールヒドロラーゼ、5-デオキシ-グルクロネートイソメラーゼ、5-ケト-2-デオキシグルコノキナーゼ、5-ケト-2-デオキシ-D-グルコネート-6ホスフェートアルドラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートケト-イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルベート-フラボドキシンオキシドレダクターゼ、3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼ、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、エノイル-CoAヒドラターゼ、アクリロイル-CoAデヒドロゲナーゼ/Etf及びイノソースイソメラーゼをコードする遺伝子のうちの少なくとも1つが、前記細菌がイノシトールの非存在下で増殖した場合と比較して、前記細菌がイノシトールの存在下で増殖した場合、過剰発現する、請求項1に記載の細菌。
  3. 前記使用が、インスリン抵抗性又はインスリン抵抗性関連状態の予防及び/又は治療における使用である、請求項1又は2に記載の細菌。
  4. 前記インスリン抵抗性関連状態が、脂質異常、2型糖尿病及び内分泌疾患におけるインスリン抵抗性から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の細菌。
  5. ヒト腸内単離細菌である、請求項1から4のいずれか一項に記載の細菌。
  6. CBS 140182として寄託されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の細菌。
  7. 生理学的に許容できる担体を更に含む組成物に含まれる、請求項1から6のいずれか一項に記載の細菌。
  8. 前記組成物が、食品組成物、好ましくは乳製品、より好ましくは発酵乳製品、好ましくはヨーグルト又はヨーグルトドリンクである、請求項7に記載の細菌。
  9. 前記組成物が、好ましくは固体剤形の医薬組成物、好ましくはカプセル、錠剤又は粉末である、請求項7に記載の細菌。
  10. 前記組成物において、凍結乾燥又はマイクロカプセル化形態で存在する、請求項7から9のいずれか一項に記載の細菌。
  11. 106～1015コロニー形成単位(CFU)の範囲内の量で存在する、請求項1から10のいずれか一項に記載の細菌。
  12. イノシトールと別々に、連続して又は同時に投与される、請求項1から11のいずれか一項に記載の細菌。
  13. プロバイオティクスとしての使用のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の細菌。
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