JP2022543619A - アッセイ干渉物質を検出し、ダイナミックレンジを増大させる方法 - Google Patents

アッセイ干渉物質を検出し、ダイナミックレンジを増大させる方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出するキット及び方法、並びにイムノアッセイのダイナミックレンジを拡大し、フック効果を低減するキット及び方法を提供する。キット及び方法は、異なる２つの検出可能な標識を備えた２つのコンジュゲートを使用し、それらの少なくとも１つは、式（Ｉ）の化学発光化合物である。TIFF2022543619000100.tif32170

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月７日出願の米国仮特許出願第６２／８８３，９２２号及び２０１９年８月７日出願の同第６２／８８３，９１９号の利益を主張し、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
過去数十年間、イムノアッセイは、蛍光、化学ルミネセンス、又は分析対象物質に応答してシグナルを生成する他の手段を使用して行われてきた。イムノアッセイは、典型的に、抗原を含むと疑われる試料を固体支持体、例えばマイクロ粒子に付着している第１の抗体を含む試薬と組み合わせて、反応混合物を形成するものである。抗原は、試料中に存在する場合、第１の抗体に特異的に結合する。検出可能な標識が付着している第２の抗体を含むコンジュゲートが、反応混合物に導入され、先に述べたように固体支持体に付着している第１の抗体に特異的に結合している抗原に特異的に結合する。そのようなアッセイは、サンドイッチイムノアッセイ又はイムノメトリックアッセイと呼ばれる。次いで、結合していないコンジュゲートが反応混合物から典型的に洗浄ステップを行うことによって除去された後に、検出可能な標識に起因し得るシグナルは測定される。反応混合物の総体積に由来するシグナルが測定され、次いで較正曲線と比較して、試料中に存在する抗原の濃度を確立する。
いくつかの異なるタイプのイムノアッセイが、誤った又は誤解を招くような結果を導く干渉物質の存在に苦慮する。イムノアッセイにおいて分析対象物質と試薬抗体の間の反応に干渉し得る物質としては、例えば、化学的相違点を有するが抗体と交差反応する構造的類似点を有する化合物、異好性抗体、ヒト抗動物抗体、自己分析対象物質抗体、リウマトイド因子、及び他のタンパク質が挙げられる。脂肪血症、交差反応性、及び分析前変動又は機器反応が原因である外因性干渉も、イムノアッセイ干渉を起こす要因になっていることがある。干渉物質は、反応における干渉の部位に応じて１つ以上のアッセイ系中の分析対象物質濃度を誤って高く又は誤って低くすることがある。イムノアッセイによって測定される広範囲の分析対象物質（例えば、ホルモン、バイオマーカー、薬物、心筋トロポニン、及び微生物血清）は、イムノアッセイ干渉によって影響されることがある。
コンジュゲート抗体を導入する前に結合していない分析対象物質試料を除去する洗浄ステップを含むイムノアッセイは、一般に「２ステップアッセイ」と呼ばれる。抗体でコーティングされたマイクロ粒子に、中間の洗浄ステップなしにコンジュゲート抗体及び分析対象物質を一緒に導入するイムノアッセイは、一般に「１ステップ」アッセイと呼ばれる。１ステップフォーマットも２ステップフォーマットも限定されたアッセイダイナミックレンジを示すことがあり、したがって、一部の試料は希釈して再試験を必要とする。「フック効果」又は「阻止帯現象」は、圧倒的な量の抗原が「１ステップアッセイ」フォーマットで存在するときイムノアッセイにおいて観察される値が誤って低いという現象である。フック効果は、イムノアッセイにおいて不十分な捕捉抗体及び検出抗体によって引き起こされ、アッセイダイナミックレンジが限定される。
試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出し、イムノアッセイのフック効果を低減しながらダイナミックレンジを増大させるシステム、キット、及び方法が求められている状態のままである。
（発明の簡単な要旨）
本開示は、ａ）分析対象物質を特異的に結合する第１の特異的結合メンバーに付着している第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、（ｂ）試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を特異的に結合する第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲート、（ｃ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質に同時に又は競合的に結合する、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバー、並びに任意選択的に（ｄ）分析対象物質の検出に干渉する物質に特異的に結合する、固体支持体に付着している第４の特異的結合メンバーを含むキットであって、第１及び第２の検出可能な標識の少なくとも１つが、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
Figure 2022543619000002
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］
を含む、キットを提供する。
本開示は、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出する方法も提供する。一態様では、方法は、（ａ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を上記のキットのいずれか１つと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合、（ｉｉ）分析対象物質の検出に干渉する物質の第３の特異的結合メンバーへの特異的結合、又は分析対象物質の検出に干渉する物質の固体支持体表面への非特異的結合、（ｉｉｉ）第１のコンジュゲートの分析対象物質への結合、（ｉｖ）第２のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合、及び任意選択的に（ｖ）第４の特異的結合メンバーの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合；（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質の存在を検出するステップを含む。
別の態様では、方法は、（ａ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を上記のキットのいずれか１つと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合及び分析対象物質の分析対象物質の検出に干渉する物質への結合による分析対象物質－干渉物質複合体の形成、（ｉｉ）第１のコンジュゲートの分析対象物質への結合、並びに（ｉｖ）第２のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質又は分析対象物質－干渉物質複合体への結合、並びに任意選択的に（ｖ）第４の特異的結合メンバーの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合；（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質の存在を検出するステップを含む。
さらなる態様では、方法は、（ａ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を上記のキットのいずれか１つと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合、（ｉｉ）第１のコンジュゲートの分析対象物質への結合及び第１のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合、並びに（ｉｖ）第２のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合、並びに任意選択的に（ｖ）第４の特異的結合メンバーの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合；（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質の存在を検出するステップを含む。
別の態様では、方法は、（ａ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を上記のキットのいずれか１つと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合、（ｉｉ）分析対象物質の検出に干渉する物質の固体支持体表面への特異的又は非特異的結合、（ｉｉｉ）第１のコンジュゲートの分析対象物質への結合及び分析対象物質の検出に干渉する物質の第１のコンジュゲートへの特異的又は非特異的結合、それによる検出に利用可能な第１のコンジュゲートの量の増加、（ｉｖ）第２のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合、並びに（ｖ）第４の特異的結合メンバーの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合；（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質の存在を検出するステップを含む。
本開示は、（ａ）ビオチン分子及びそれに付着している第１の検出可能な標識を含む第１の特異的結合メンバーであって、分析対象物質を特異的に結合する第１の特異的結合メンバー、（ｂ）分析対象物質に特異的に結合する第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含むコンジュゲート、（ｃ）第１の特異的結合メンバーに付着しているビオチン分子及び試料中の分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子に結合するストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体を含むキットであって、第１及び第２の検出可能な標識の少なくとも１つが、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
Figure 2022543619000003
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］を含む、キットも提供する。上記のキットを使用して、試料中の分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子を検出する方法も提供される。この方法は、（ａ）干渉するビオチン分子が存在しない場合に、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に結合している第１の検出可能な標識の標準シグナル強度（Ｒ値）を確立するステップ、（ｂ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子を両方含むと疑われる試料をキットと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第１の特異的結合メンバーへの結合による第１の複合体の形成、（ｉｉ）コンジュゲートの第１の特異的結合メンバーに結合している分析対象物質への結合による免疫複合体の形成、並びに（ｉｉｉ）ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体の第１の特異的結合メンバーに付着しているビオチン分子及び試料中の分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子への結合；（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、（ｄ）第２の検出可能な標識のシグナル強度に対する補正を行うステップ、並びに（ｅ）試料中の分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子の存在を検出するステップを含む。
（ａ）分析対象物質を結合する第１の特異的結合メンバーに付着している第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、（ｂ）第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲートであって、第２の特異的結合メンバーは、第１の特異的結合メンバーと同一の分析対象物質を結合し、分析対象物質に対する第１の特異的結合メンバーの結合親和性が、第２の特異的結合メンバーの結合親和性より大きい、第２のコンジュゲート、及び（ｃ）第１又は第２の特異的結合メンバーと同時に分析対象物質に結合することができる、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバーを含むキットであって、第１及び第２の検出可能な標識の少なくとも１つが、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
Figure 2022543619000004
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］を含む、キットも提供される。
本開示は、イムノアッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、（ａ）分析対象物質を含むと疑われる試験試料を上記のキットと接触させるステップであって、分析対象物質が、第３の特異的結合メンバーに結合する、ステップ、（ｂ）第３の特異的結合メンバーに結合していない分析対象物質を洗浄することによって除去するステップ、（ｃ）第１のコンジュゲートを分析対象物質に結合させ、第２のコンジュゲートを分析対象物質に結合させるステップであって、第１及び第２のコンジュゲートが分析対象物質に同時には結合しない、ステップ、（ｄ）分析対象物質に結合していない第１及び第２のコンジュゲートを洗浄することによって除去するステップ、（ｅ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量するステップ、並びに（ｆ）フラグ値に基づいて第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識のシグナル強度を比較することによって、分析対象物質の濃度を決定し、それによってイムノアッセイのダイナミックレンジが拡大されるステップを含む方法も提供する。
本開示は、（ａ）分析対象物質を結合する第１の特異的結合メンバー及び第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、（ｂ）第２の特異的結合メンバー及び第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲートであって、（ｉ）第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーは同一であり又は異なり、（ｉｉ）第１及び第２の検出可能な標識は異なる、第２のコンジュゲート、（ｃ）第１又は第２の特異的結合メンバーと同時に分析対象物質に結合することができる、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバーを含むキットであって、第１及び第２の検出可能な標識の少なくとも１つが、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
Figure 2022543619000005
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］を含む、キットを提供する。
本開示は、イムノアッセイのフック効果を低減し、ダイナミックレンジを拡大する方法であって、（ａ）分析対象物質を含むと疑われる試験試料を上記のキットと接触させるステップであって、分析対象物質が、第３の特異的結合メンバーに結合し、第１のコンジュゲートが、分析対象物質に結合する、ステップ、（ｂ）結合していない分析対象物質及び結合していない第１のコンジュゲートをいずれも洗浄することによって除去するステップ、（ｃ）第２のコンジュゲートを分析対象物質に結合させるステップであって、第１及び第２のコンジュゲートが分析対象物質に同時には結合しない、ステップ、（ｄ）結合していない第２のコンジュゲートをいずれも洗浄することによって除去するステップ、（ｅ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量するステップ、並びに（ｆ）フラグ値に基づいて分析対象物質の濃度を決定し、それによってイムノアッセイのフック効果が低減され、ダイナミックレンジが拡大されるステップを含む方法をさらに提供する。
第１のチャネルが低ゲイン／低減された増幅に設定され、第２のチャネルが標準高ゲインに設定された２チャネルの検出を伴う光電子増倍管（ＰＭＴ）をさらに含む上記のキット及び／又は方法も提供され、その結果、アッセイダイナミックレンジが増大し、１つのＰＭＴチャネルと比較して何桁も大きくなる。
実施例６８に記載されているＴｇ／抗Ｔｇコンビネーションアッセイで測定されたチログロブリン（Ｔｇ）の濃度を示すグラフである。化学発光性シグナルを相対的発光単位（ＲＬＵ）として測定した。 実施例６８に記載されているＴｇ／抗Ｔｇコンビネーションアッセイで測定された抗Ｔｇ抗体の濃度を示すグラフである。化学発光性シグナルを相対的発光単位（ＲＬＵ）として測定した。 実施例６９に記載されているＴｎＩ／抗ＴｎＩコンビネーションアッセイで測定したトロポニン（ＴｎＩ）の濃度を示すグラフである。化学発光性シグナルを相対的発光単位（ＲＬＵ）として測定した。 実施例６９に記載されているＴｎＩ／抗ＴｎＩコンビネーションアッセイで測定した抗ＴｎＩ抗体の濃度を示すグラフである。化学発光性シグナルを相対的発光単位（ＲＬＵ）として測定した。 ブルーチャネルシグナルレベルが、これらのそれぞれのグリーンチャネルレベルの３．８倍に増加し得ることを示すグラフであり、干渉抗体の存在を成功裏に裏付ける補正された、ブルーチャネルトロポニンシグナルを生成している。化学発光性シグナルを相対的発光単位（ＲＬＵ）として測定した。 ビオチンを含まない元のデータ並びにビオチン干渉実験からの補正されたシグナルを含む、実施例７１に記載されているＮＧＡＬアッセイから得た用量反応曲線のグラフである。 シングルチャネルシステムとデュアルチャネルシステムの両方においてビオチンの存在下で行われた実施例７１に記載されているＮＧＡＬアッセイから得たデータを示すグラフである。二重チャネルシステムでは、ＮＧＡＬに対して補正されたシグナルがプロットされ、ビオチン濃度に関わらず一定のままである。 実施例７２に記載されているイムノアッセイの結果を表すグラフである。 実施例７３に記載されているイムノアッセイの結果を表すグラフである。 実施例７４に記載されているような両方のチャネルにおけるＴＳＨ較正曲線を示すグラフである。 実施例７４に記載されているような両方のチャネルにおける正規化されたＴＳＨシグナルを示すグラフである。 分析対象物質の検出干渉の２つの異なるシナリオの略図である。
本開示は、イムノアッセイ結果に干渉する物質が、分析対象物質を結合する第１の特異的結合メンバー及び試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を結合する第２の特異的結合メンバーを同時に利用することによって検出され得るという発見に基づいている。分析対象物質及び干渉物質のそれぞれ第１及び第２の特異的結合メンバーへの結合は、異なるシグナルを発するマルチコンジュゲートを使用して可視化され得る。この目的のために、本開示は、硬質なジアミンリンカーを介してリンクされたアクリジニウム部分とフルオロフォアを含む化学発光化合物を含むコンジュゲートを使用する。アクリジニウム部分の化学発光誘発時に、光出力は、付着しているフルオロフォアの発光波長にシフトされ得る。
本開示は、２ステップイムノアッセイなどのアッセイのダイナミックレンジが、アッセイ内で高親和性抗体及び低親和性抗体を同時に利用することによって広げられ得るという発見にも基づいている。高親和性及び低親和性抗体への分析対象物質結合は、異なるシグナルを発するマルチコンジュゲートを使用して可視化され得る。次いで、別個の２つの較正曲線が作成され得る。この目的のために、本開示は、硬質なジアミンリンカーを介してリンクされたアクリジニウム部分とフルオロフォアを含む化学発光化合物を含むコンジュゲートを使用する。アクリジニウム部分の化学発光誘発時に、光出力は、付着しているフルオロフォアの発光波長にシフトされ得る。異なるフルオロフォアを使用する単一のアッセイにおけるマルチコンジュゲートの使用は、単一試験において１試料から２つ以上の分析対象物質の検出を可能にすることができ、インビトロ診断薬に特に有用なことがある。さらに、１ステップアッセイフォーマットでは、「フック効果」は、第１のコンジュゲートと異なる検出可能な標識（例えば、異なるカラー標識）を含む第２の抗体コンジュゲートを導入して、フック効果の発現を示して、解消され得る。
定義
特定の官能基及び化学用語の定義について、より詳細に以下に記載する。本開示では、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ、ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、第７５版、表紙裏に従って特定され、特定の官能基は、その中に記載されているように一般に定義される。さらに、有機化学の一般原則、並びに特定の官能部分及び反応性については、Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ社、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、２００６年；Ｓｍｉｔｈ， Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第７版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１３年；Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１８年；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９８７年に記載されており、これらのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に組み込む。
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、１～１６個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１６アルキル）、例えば１～１４個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）、１～１２個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１２アルキル）、１～１０個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、１～８個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ８アルキル）、１～６個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、又は１～４個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ４アルキル）を含む直鎖又は分枝状の飽和炭化水素鎖を意味する。アルキルの代表例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、及びｎ－ドデシルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アルケニル」は、２～１６個の炭素原子及び少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を含む直鎖又は分枝状の炭化水素鎖を指す。アルケニルの代表例としては、エテニル、２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、３－ブテニル、４－ペンテニル、５－ヘキセニル、２－ヘプテニル、２－メチル－１－ヘプテニル、及び３－デセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アルキニル」は、２～１６個の炭素原子及び少なくとも１個の炭素－炭素三重結合を含む直鎖又は分枝状の炭化水素鎖を指す。アルキニルの代表例としては、エチニル、プロピニル、及びブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アルキレン」は、１～１０個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）、例えば１～６個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）の直鎖又は分枝鎖の炭化水素に由来する２価基を指す。アルキレンの代表例としては、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、及び－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシ」は、酸素原子を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるアルキル基を指す。アルコキシの代表例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２－プロポキシ、ブトキシ及びｔｅｒｔ－ブトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アリール」は、フェニル基、又は二環式又は三環式の芳香族縮合環系を指す。二環式縮合環系は、親分子部分に付属し、１つのフェニル基に縮合しているフェニル基によって例示される。三環式縮合環系は、親分子部分に付属し、他の２つのフェニル基に縮合しているフェニル基によって例示される。二環式アリールの代表例としては、ナフチルが挙げられるが、これに限定されない。三環式アリールの代表例としては、アントラセニル及びフェナントレニル（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅｙｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アリールオキシ」は、酸素原子を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるアリール基を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「アリールアルキル」は、本明細書に定義されるアルキル基を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるアリール基を指す。アリールアルキルの代表例としては、フェニルメチル（すなわち、ベンジル）及びフェニルエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、３～１０個の炭素原子及び０個のヘテロ原子を含む飽和炭素環式環系を指す。シクロアルキルは、単環式、二環式、架橋、縮合、又はスピロ環式とすることができる。シクロアルキルの代表例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、アダマンチル、ビシクロ［１．１．１］ペンタニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル、及びビシクロ［５．２．０］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルケニル」は、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を含み、好ましくは１環当たり５～１０個の炭素原子を有する非芳香族単環式又は多環式の炭素環式環系を意味する。例示的な単環式シクロアルケニル環としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、及びビシクロ［２．２．１］ヘプテニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキルアルキル」は、本明細書に定義されるアルキレン基を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるシクロアルキル基を指す。シクロアルキルアルキルの代表例としては、シクロヘキシルメチルが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ジアミンリンカー」は、各端部にアミン官能基（－ＮＨ－又は－ＮＲ－）を有するリンカー部分を指す。ジアミンリンカーは、線状、分枝状、又は環式とすることができる。
本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ハロアルキル」は、１個以上の水素原子がハロゲンによって置き換えられている、本明細書に定義されるアルキル基を意味する。例えば、１、２、３、４、５、６、７若しくは８個の水素原子がハロゲンによって置き換えられてもよく、又はすべての水素原子がハロゲンによって置き換えられてもよい。ハロアルキルの代表例としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、２－フルオロエチル、２，２－ジフルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、ペルフルオロエチル、２－フルオロ－２－メチルプロピル、及び３，３，３－トリフルオロプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ハロアルコキシ」は、本明細書に定義される少なくとも１つのハロアルキル基が酸素原子を通して親分子部分に付属していることを意味する。ハロアルコキシの代表例としては、トリフロオロメトキシが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアルキル」は、少なくとも１個の炭素原子が例えばＮ、Ｏ、Ｐ、又はＳなどのヘテロ原子で置き換えられた、本明細書に定義されるアルキル基を指す。ヘテロアルキルの代表例としては、アルキルエーテル、第二級及び第三級アルキルアミン、アミド、並びにアルキルスルフィドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアルキレン」は、少なくとも１個の炭素原子が例えばＮ、Ｏ、Ｐ、又はＳなどのヘテロ原子で置き換えられた、本明細書に定義されるアルキレン基を指す。ヘテロアルキレン基の代表例としては、ポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシド鎖、ポリエチレンイミン基などが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」は、芳香族単環式環又は芳香族二環式環系又は芳香族三環式環系を指す。芳香族単環式環は、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立に選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子）を含む５又は６員環である。５員芳香族単環式環は２個の二重結合を有し、６員芳香族単環式環は３個の二重結合を有する。二環式ヘテロアリール基は、本明細書に定義される単環式アリール基又は本明細書に定義される単環式ヘテロアリール基に縮合している単環式ヘテロアリール環によって例示される。三環式ヘテロアリール基は、本明細書に定義される単環式アリール基又は本明細書に定義される単環式ヘテロアリール基から独立に選択される２つの環に縮合している単環式ヘテロアリール環によって例示される。単環式ヘテロアリールの代表例としては、ピリジニル（ピリジン－２－イル、ピリジン－３－イル、ピリジン－４－イルを含む）、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ベンゾピラゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チエニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、１，２，４－トリアジニル、及び１，３，５－トリアジニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリールの代表例としては、ベンゾイミダゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、クロメニル、イミダゾピリジン、イミダゾチアゾリル、インダゾリル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、プリニル、ピリドイミダゾリル、キナゾリニル、キノリニル、キノキサリニル、チアゾロピリジニル、チアゾロピリミジニル、チエノピロリル、及びチエノチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリールの代表例としては、ジベンゾフラニル及びジベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式ヘテロアリールは、環内に含まれている任意の炭素原子又は任意の窒素原子を通して親分子部分に連結されている。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書に定義されるアルキレン基を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるヘテロアリール基を指す。ヘテロアリールアルキルの代表例としては、フル－３－イルメチル、１Ｈ－イミダゾール－２－イルメチル、１Ｈ－イミダゾール－４－イルメチル、１－（ピリジン－４－イル）エチル、ピリジン－３－イルメチル、６－クロロピリジン－３－イルメチル、ピリジン－４－イルメチル、（６－（トリフルオロメチル）ピリジン－３－イル）メチル、（６－（シアノ）ピリジン－３－イル）メチル、（２－（シアノ）ピリジン－４－イル）メチル、（５－（シアノ）ピリジン－２－イル）メチル、（２－（クロロ）ピリジン－４－イル）メチル、ピリミジン－５－イルメチル、２－（ピリミジン－２－イル）プロピル、チエン－２－イルメチル、及びチエン－３－イルメチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ環」又は「ヘテロ環式の」は、単環式ヘテロ環、二環式ヘテロ環、又は三環式ヘテロ環を意味する。単環式ヘテロ環は、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む３、４、５、６、７、又は８員環である。３又は４員環は、０又は１個の二重結合、並びにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含む。５員環は、０又は１個の二重結合、並びにＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１、２又は３個のヘテロ原子を含む。６員環は、０、１又は２個の二重結合、並びにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１、２、又は３個のヘテロ原子を含む。７及び８員環は、０、１、２、又は３個の二重結合、並びにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１、２、又は３個のヘテロ原子を含む。単環式ヘテロ環の代表例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３－ジオキサニル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオラニル、１，３－ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキセタニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、１，２－チアジナニル、１，３－チアジナニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、及びトリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロ環は、フェニル基に縮合している単環式ヘテロ環、又は単環式シクロアルキルに縮合している単環式ヘテロ環、又は単環式シクロアルケニルに縮合している単環式ヘテロ環、又は単環式ヘテロ環に縮合している単環式ヘテロ環、又はスピロヘテロ環基、あるいは環の非隣接の２個の原子が１、２、３、若しくは４個の炭素原子のアルキレン架橋又は２、３、若しくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋によってリンクされている架橋単環式ヘテロ環系である。二環式ヘテロ環の代表例としては、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３－ジヒドロベンゾフラニル、２，３－ジヒドロベンゾチエニル、２，３－ジヒドロイソキノリン、２－アザスピロ［３．３］ヘプタン－２－イル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－イルを含む）、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル、及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロ環は、フェニル基に縮合している二環式ヘテロ環、又は単環式シクロアルキルに縮合している二環式ヘテロ環、又は単環式シクロアルケニルに縮合している二環式ヘテロ環、又は単環式ヘテロ環に縮合している二環式ヘテロ環、あるいは二環式環の非隣接の２個の原子が１、２、３、若しくは４個の炭素原子のアルキレン架橋又は２、３、若しくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋によってリンクされている二環式ヘテロ環によって例示される。三環式ヘテロ環の例としては、オクタヒドロ－２，５－エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ－２Ｈ－２，５－メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ－アダマンタン（１－アザトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン）、及びオキサ－アダマンタン（２－オキサトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン）が挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式ヘテロ環は、環内に含まれている任意の炭素原子又は任意の窒素原子を通して親分子部分に連結されている。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロシクリルアルキル」は、本明細書に定義されるアルキレン基を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を指す。ヘテロシクリルアルキルの代表例としては、ピペリジン－４－イルメチル、ピペラジン－１－イルメチル、３－メチル－１－ピロリジン－１－イルブチル、（１Ｒ）－３－メチル－１－ピロリジン－１－イルブチル、（１Ｓ）－３－メチル－１－ピロリジン－１－イルブチル、及び３－モルホリノプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシ」は、－ＯＨ基を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシアルキル」は、少なくとも１つのヒドロキシ基で置換されている、本明細書に定義されるアルキル基を指す。ヒドロキシアルキルの代表例としては、ヒドロキシメチル、２－ヒドロキシエチル、３－ヒドロキシプロピル、２，３－ジヒドロキシプロピル、２，３－ジヒドロキシペンチル、４－ヒドロキシブチル、２－エチル－４－ヒドロキシヘプチル、３，４－ジヒドロキシブチル、及び５－ヒドロキシペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
場合によって、基（例えば、アルキル、アルコキシ、又はシクロアルキル）中の炭素原子の数は、接頭辞「Ｃｘ～Ｃｙ－」（ここで、ｘは基中の炭素原子の最小数であり、ｙは基中の炭素原子の最大数である）によって示される。したがって、例えば「Ｃ１～Ｃ３－アルキル」は、１～３個の炭素原子を含むアルキル基を指す。
用語「置換基」は、指示された基の原子に置換されている基を指す。
基又は部分が置換され得るとき、用語「置換された」は、「置換された」を使用する表現において指示された基の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、又は６個；一部の実施形態では、１、２、又は３個；他の実施形態では、１又は２個）の水素が、記載された指示基の選択されたもの又は当業者に公知である好適な基（例えば、以下に記載される基の１つ以上）で置き換えられ得ることを示す。置換基としては、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、ケトン、アミド、カルバメート、ホスホリル、セレニル、及びアシルが挙げられるが、これらに限定されない。
キット
本開示は、（ａ）分析対象物質を特異的に結合する第１の特異的結合メンバーに付着している第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、（ｂ）試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を特異的に結合する第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲート、（ｃ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質に同時に又は競合的に結合する、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバー、並びに任意選択的に（ｄ）分析対象物質の検出に干渉する物質に特異的に結合する、固体支持体に付着している第４の特異的結合メンバーを含むキットを提供する。
（ａ）ビオチン分子及びそれに付着している第１の検出可能な標識を含む第１の特異的結合メンバーであって、分析対象物質を特異的に結合する第１の特異的結合メンバー、（ｂ）分析対象物質に特異的に結合する第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含むコンジュゲート、並びに（ｃ）第１の特異的結合メンバーに付着しているビオチン分子及び試料中の分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子に結合するストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体を含むキットも提供される。
本開示は、（ａ）分析対象物質を結合する第１の特異的結合メンバーに付着している第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、（ｂ）第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲートであって、第２の特異的結合メンバーは、第１の特異的結合メンバーと同一の分析対象物質を結合し、分析対象物質に対する第１の特異的結合メンバーの結合親和性が、第２の特異的結合メンバーの結合親和性より大きい、第２のコンジュゲート、及び（ｃ）第１又は第２の特異的結合メンバーと同時に分析対象物質に結合することができる、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバーを含むキットをさらに提供する。
（ａ）分析対象物質を結合する第１の特異的結合メンバー及び第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、（ｂ）第２の特異的結合メンバー及び第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲートであって、（ｉ）第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーは同一であり又は異なり、（ｉｉ）第１及び第２の検出可能な標識は異なる、第２のコンジュゲート、並びに（ｃ）第１又は第２の特異的結合メンバーと同時に分析対象物質に結合することができる、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバーを含むキットも提供される。
キットに関連して以下に記載される成分は、本明細書に記載される方法においても有用であると認識される。
ある特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載されるアッセイ、例えばマイクロ粒子アッセイ又はポイントオブケアデバイスにおける使用のためのアッセイによって試験試料を分析対象物質についてアッセイするための指示書を含むことができる。指示書は、紙の形又はディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどコンピュータ可読の形とすることができる。あるいは又はさらに、キットは、較正物質若しくは対照、例えば精製され、任意選択的に凍結乾燥された分析対象物質（又はその断片）、及び／又はアッセイを行うための少なくとも１つの容器（例えば、１つ以上の分析対象物質結合分子で以前にコーティングすることができるチューブ、マイクロタイタープレート又はストリップ）、及び／又はアッセイ緩衝剤若しくは洗浄緩衝剤などの緩衝剤を含むことができ、そのどちらか１つでも、濃縮溶液、検出可能な標識（例えば、化学発光標識）のためのトリガー溶液、又は停止液として用意することができる。理想的には、キットは、アッセイを行うのに必要なすべての成分、すなわち試薬、標準品、緩衝剤、希釈剤などを含む。指示書は、分析対象物質を定量するための検量線又は参照標準を作成するための指示書も含むことができる。
コンジュゲート
一部の実施形態では、本明細書に記載されるキット及び方法は、分析対象物質を特異的に結合する第１の特異的結合メンバーに付着している第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、及び第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、第２の特異的結合メンバーは、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を特異的に結合する。本明細書に記載されるキット及び方法は、分析対象物質と、一部の実施形態では分析対象物質の検出に干渉する物質とに同時に結合することができる、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバーも含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるキット及び方法は、分析対象物質の検出に干渉する物質に特異的に結合する、固体支持体に付着している第４の特異的結合メンバーを任意選択的に含むことができる。キットを使用して、試料中の分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子を検出する実施形態では、第１の特異的結合メンバーは、ビオチン分子及びそれに付着している第１の検出可能な標識を含み、分析対象物質を特異的に結合し、コンジュゲートは、分析対象物質に特異的に結合する第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含む。
用語「特異的結合相手」、「特異的結合メンバー」、及び「結合メンバー」は、本明細書で同義に使用され、異なる２個以上の分子のうちの１個を、他の分子の実質的に低い認識に比べて特異的に認識するもう１個の分子を指す。「特異的に結合する」又は「結合特異性」とは、結合メンバーが、試料の分析対象物質分子と他の成分又は汚染物質を区別するのに十分な特異性を有する分析対象物質分子を結合することを意味する。当業者によって理解されているように、適切な特異的結合メンバーは、分析される分析対象物質によって決定される。一実施形態では、固体支持体は、望ましくは、その表面に固定化された、目的の分析対象物質に結合する特異的結合メンバーを多数（例えば、２以上、５０以上、１００以上、１，０００以上、又は５，０００以上）含む。本明細書で論じられるように、固体支持体と試料の十分なインキュベーション時間後に、試料中に存在する１つ以上の目的の分析対象物質は、望ましくは、固体支持体の表面に固定化された特異的結合メンバーを介して固体支持体の表面に捕捉される。本明細書で使用される場合、用語「固定化」は、結合メンバーと固体支持体の表面との安定な結合を指す。
多種多様な標的分子のための結合メンバーが公知であり、又は公知の技法を使用して容易に見出す若しくは開発することができる。例えば、標的分析対象物質がタンパク質であるとき、結合メンバーとしては、タンパク質、特に抗体又はそれらの断片（例えば、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、組換え抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科の動物に由来する可変重鎖ドメイン（「ＶＨＨ」；「ＶＨＨ断片」とも呼ばれる）（ＶＨＨ及びそれらを作製する方法については、Ｇｏｔｔｌｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、１４：７７－８５（２００９）に記載されている）、組換えＶＨＨ単一ドメイン抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）、抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、及び上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片、全長ポリクローナル又はモノクローナル抗体、抗体様断片など、他のタンパク質、例えば受容体タンパク質、タンパク質Ａ、又はタンパク質Ｃを挙げることができる。分析対象物質がステロイド、ビリン、レチノイド、又は脂質などの低分子である実施形態では、第１及び／又は第２の結合メンバーは、足場タンパク質（例えば、リポカリン）又は受容体とすることができる。場合によって、タンパク質分析対象物質のための結合メンバーは、ペプチドとすることができる。例えば、標的分析対象物質が酵素であるとき、好適な結合メンバーとしては、ペプチド、低分子などとすることができる酵素基質及び／又は酵素阻害薬を挙げることができる。場合によって、標的分析対象物質がリン酸化種であるとき、結合メンバーはホスフェート結合剤を含むことができる。例えば、ホスフェート結合剤は、金属イオン親和性媒体を含むことができる（例えば、米国特許第７，０７０，９２１号及び米国特許出願公開第２００６／０１２１５４４号を参照のこと）。他の実施形態では、結合メンバーは、ビタミン、栄養物、栄養代謝物、医薬（例えば、抗生物質）、又は乱用薬物とすることができる。
ある特定の場合では、特異的結合メンバーは、アプタマー、例えば米国特許第５，２７０，１６３号；同第５，４７５，０９６号；同第５，５６７，５８８号；同第５，５９５，８７７号；同第５，６３７，４５９号；同第５，６８３，８６７号；及び同第５，７０５，３３７号に記載されているものとすることができる。本明細書で使用される場合、用語「アプタマー」は、とりわけ高い親和性及び特異性を有する低分子、タンパク質、及びペプチドを含めて、前選択された標的に結合することができる核酸又はペプチド分子を指す。核酸アプタマー（例えば、一本鎖ＤＮＡ分子又は一本鎖ＲＮＡ分子）は、任意の標的分子を実質的に捕捉するために開発され得る。アプタマーは、より低い結合親和性のアプタマーが選択され得るが、典型的には非常に高い親和性で標的分子を高特異的、立体構造依存的に結合する。アプタマーは、標的分析対象物質分子を非常にわずかな構造的差異、例えばメチル又はヒドロキシル基の有無に基づいて識別することができ、ある特定のアプタマーは、Ｄ－とＬ－のエナンチオマー及びジアステレオマーを識別することができる。アプタマーは、薬物、金属イオン、及び有機染料、ペプチド、ビオチン、並びにタンパク質を含めて低分子標的を結合することができる。アプタマーは、ビオチン化、フルオレセイン標識後、並びにガラス表面及びミクロスフェアに付着しているとき機能活性を保持することができる。
核酸アプタマーは、オリゴヌクレオチドであり、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、又は修飾オリゴデオキシヌクレオチド若しくはオリゴリボヌクレオチドとすることができる。「修飾」オリゴデオキシヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドは、共有結合で修飾された塩基及び／又は糖を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドとしては、糖が３’位のヒドロキシル基以外及び５’位のホスフェート基以外の低分子量有機基に共有結合しているヌクレオチドが挙げられる。こうした修飾ヌクレオチドとしては、２’置換糖、例えば２’－Ｏ－メチル；２－Ｏ－アルキル；２－Ｏ－アリル；２’－Ｓ－アルキル；２’－Ｓ－アリル；２’－フルオロ－；２’－ハロ又は２－アジド－リボース、炭素環式糖類似体、アノマー糖；エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、及びセドヘプツロースも挙げることができる。
ペプチドアプタマーは、タンパク質相互作用に干渉するように設計され得る。ペプチドアプタマーは、可変ペプチドループが付着され、それによってアプタマーの立体構造を制約するタンパク質足場をベースにすることができる。場合によって、ペプチドアプタマーの足場部分は、細菌チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）に由来する。
分析対象物質が炭水化物であるとき、好適な結合メンバーとしては、例えば抗体、レクチン、及びセレクチンが挙げられる。当業者によって理解されているように、目的の分析対象物質と特異的に結合することができる分子であればいずれも、結合メンバーとして潜在的に使用することができる。
ある特定の実施形態では、好適な分析対象物質／結合メンバー複合体としては、抗体／抗原、抗原／抗体、受容体／リガンド、リガンド／受容体、タンパク質／核酸、酵素／基質及び／又は阻害物質、炭水化物（糖タンパク質及び糖脂質を含む）／レクチン及び／又はセレクチン、タンパク質／タンパク質、タンパク質／低分子などを挙げることができるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、特異的結合メンバーは、リンケージを介して固体支持体に付着され得る。それは、結合メンバーの支持体への付着を促進する、支持体及び／又は結合メンバーの任意の部分、機能化、又は修飾を含むことができる。結合メンバーと支持体とのリンケージは、１つ以上の化学的若しくは物理的（例えば、ファンデルワールス力、水素結合、静電的相互作用、疎水性／親水性相互作用などを介した非特異的付着）結合及び／又はそのような結合をもたらす化学的スペーサーを含むことができる。ある特定の実施形態は、タンパク質又はポリペプチドである結合メンバーを利用し、多数の技法を使用して、ポリペプチドを多種多様な固体支持体に付着させることができる（例えば、米国特許第５，６２０，８５０号；及びＨｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．、２３：１２８（１９９０）を参照のこと）。
一部の実施形態では、分析対象物質分子と結合メンバーとの結合親和性は、非特異的に結合している分子又は粒子を除去する洗浄ステップを含めてアッセイの条件下で結合された状態のままであるのに十分な程度であるべきである。場合によって、例えばある特定の生体分子の検出において、分析対象物質分子のその相補的結合メンバーへの結合定数は、少なくとも約１０４～約１０６Ｍ－１、少なくとも約１０５～約１０９Ｍ－１、少なくとも約１０７～約１０９Ｍ－１、約１０９Ｍ－１超、又はそれ以上とすることができる。
ある特定の実施形態では、第１のコンジュゲートは、分析対象物質を特異的に結合する第１の特異的結合メンバー及び第１の検出可能な標識を含み、第２のコンジュゲートは、第２の特異的結合メンバー及び第２の検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、第２の特異的結合メンバーは、以下にさらに記載するように試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を特異的に結合する。そのような実施形態では、第２の特異的結合メンバーは、分析対象物質の存在下で分析対象物質の検出に干渉する物質に優先的に結合することができる。特異的結合メンバーは、他よりも特定の結合相手に結合することを好む傾向を示すとき結合相手（例えば、分析対象物質又は分析対象物質検出に干渉する物質）に「優先的に結合する」。
他の実施形態では、第２の特異的結合メンバーは、異なる親和性を有するが第１の特異的結合メンバーと同一の分析対象物質を結合する。この点で、分析対象物質に対する第１の特異的結合メンバーの結合親和性は、第２の特異的結合メンバーの結合親和性より大きい。一部の実施形態では、分析対象物質に対する第１の特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーの結合親和性における差は、約３倍～約５倍、約５倍～約１００倍、約５倍～約１０倍、約５倍～約２５倍、約２５倍～約５０倍、又は約５０倍～約１００倍に及ぶ。理想的には、分析対象物質に対する第１の特異的結合メンバーの結合親和性は、第２の特異的結合メンバーの結合親和性より約３倍、約５倍、約１０倍、約２５倍、約５０倍、又は約１００倍大きい。
第１及び第２の特異的結合メンバーは、それぞれ第１及び第２の検出可能な標識に直接的又は間接的に付着され得る。一部の実施形態では、第１及び第２の特異的結合メンバーは同一であるが、異なる検出可能な標識を含む。他の実施形態では、第１及び第２の検出可能な標識は異なる。どちらにしても、第１及び第２の検出可能な標識は、理想的には異なる。一部の実施形態では、第３の特異的結合メンバーも、本明細書に記載される検出可能な標識を含むことができる。本明細書で使用される場合、用語「検出可能な標識」及び「標識」は、視覚的又は機器的手段によって検出可能なシグナルを生成することができる部分を指す。検出可能な標識は、例えばクロマゲン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、放射性化合物などシグナル生成物質とすることができる。一実施形態では、第１及び第２の検出可能な標識の少なくとも１つは、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
Figure 2022543619000006
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］を含む。
Ｘ基は、－ＮＨ－又はジアミンリンカーである。一部の実施形態では、Ｘは－ＮＨ－である。一部の実施形態では、Ｘはジアミンリンカーである。一部の実施形態では、ジアミンリンカーは、式－ＮＲ’－Ｌ’－ＮＲ’’－を有することができ、式中、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ、水素及びメチルから独立に選択され、Ｌ’は、アルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、及びシクロアルケニレンから選択される。一部の実施形態では、ジアミンリンカーは、環式ジアミンリンカー（例えば、単環式又は二環式のジアミンリンカー）とすることができる。一部の実施形態では、ジアミンリンカーは、硬質なジアミンリンカーとすることができる。例示的な硬質なジアミンリンカーとしては、以下が挙げられる。
Figure 2022543619000007
一部の実施形態では、Ｘは、
Figure 2022543619000008
 から選択される。
一部の実施形態では、Ｘは、
Figure 2022543619000009
 である。
Ｙ基は、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在しない。
一部の実施形態では、Ｙは窒素であり、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａである。一部の実施形態では、Ａはアリールである。一部の実施形態では、Ａはフェニルである。一部の実施形態では、Ａは非置換である又はＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、及びアミノから選択される１、２、３、４、若しくは５個の置換基で置換されている。一部の実施形態では、Ａは、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、及びアミノから選択される１個の置換基で置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ａは、Ｃ１～Ｃ４アルキルから選択される１個の置換基で置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ａは、１個のメチル基で置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ａはｐ－トリルである。
Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２は－ＣＯＯＺである。一部の実施形態では、Ｚは、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから選択される。一部の実施形態では、Ｚは水素である。
一部の実施形態では、Ｑは－ＣＯ－である。一部の実施形態では、Ｑは－ＳＯ２－である。
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択される。一部の実施形態では、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立にＣ１～Ｃ４－アルキレンである。一部の実施形態では、Ｌ１は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。一部の実施形態では、Ｌ２は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
一部の実施形態では、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ水素である。
一部の実施形態では、化合物は、式（Ｉａ）の化合物、
Figure 2022543619000010
 又はその塩であり、式中、Ｒはそれぞれ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルからなる群から独立に選択され、ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である。
一部の実施形態では、ｍは、１又は２である。一部の実施形態では、ｍは１である。一部の実施形態では、ｍは１であり、ＲはＣ１～Ｃ４アルキルである。一部の実施形態では、ｍは１であり、Ｒはメチルである。一部の実施形態では、ｎは３である。
一部の実施形態では、化合物は、式（Ｉｂ）の化合物、又はその塩である。
Figure 2022543619000011
本明細書における式（Ｉ）の化合物への言及はいずれも、はっきりと記載されていようといまいと式（Ｉａ）又は式（Ｉｂ）の化合物への言及でもあると解釈されるべきである。
一部の実施形態では、式（Ｉ）、式（Ｉａ）、又は式（Ｉｂ）の化合物のいずれにおいても、フルオロフォアは、フルオレセイン、ローダミン、ホウ素－ジピロメテン、シアニン、オキサジン、チアジン、クマリン、ナフタルイミド、ロドール、ナフタレン、スクアライン、ポルフィリン、フラビン、及びランタニド系染料から選択される。
好適なフルオロフォアとしては、ＱＵＡＳＡＲ（登録商標）染料（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、フルオレセイン及びフルオレセイン染料（例えば、フルオレセインイソチオシアナート又はＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシ－フルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン（例えば、ＦＡＭ）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル染料、オキソノール染料、フィコエリトリン、エリトロシン、エオシン、ローダミン染料（例えば、カルボキシテトラメチルローダミン又はＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、リッサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン又はＴＭＲ）、クマリン及びクマリン染料（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン及びアミノメチルクマリン又はＡＭＣＡ）、オレゴングリーン染料（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４）、テキサスレッド、テキサスレッド－Ｘ、スペクトルレッド（商標）、スペクトルグリーン（商標）、シアニン染料（例えば、Ｃｙ－３（商標）、Ｃｙ－５（商標）、Ｃｙ－３．５（商標）、Ｃｙ－５．５（商標））、アレクサフルオル染料（例えば、アレクサフルオル３５０、アレクサフルオル４８８、アレクサフルオル５３２、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル５６８、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６６０及びアレクサフルオル６８０）、ＢＯＤＩＰＹ染料（例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５）、ＩＲ染料（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ ７００、ＩＲＤ ８００）などが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる他の好適な蛍光染料並びに蛍光染料をプローブなどのオリゴヌクレオチドにリンクさせる又は組み込む方法の例は、ＲＰ Ｈａｕｇｌａｎｄ、「Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．社、Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．（１９９２年６月））で見ることができる。蛍光染料及び標識キットは、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．社（Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．）、及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．社（Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）から市販されている。
当業者が理解するように、フルオロフォアは、フルオロフォアにある１つの反応性部分と分子の残部にある１つの反応性部分の２つの反応性部分の反応を経由して分子に付着され得る。例えば、多くの市販フルオロフォアは、反応性官能基、例えばカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、又はスクシンイミジル、ペンタフルオロフェニル若しくはテトラフルオロフェニルエステルなどのエステルで入手可能である。フルオロフォアは、分子の残部上の官能基と反応する反応性基を含むように選択され得る。例えば、フルオロフォアイソチオシアネート又はフルオロフォアスクシンイミジルエステルは、アミン基と反応することができる。本明細書に開示される分子を記載するときに使用される用語「フルオロフォア」は、蛍光部分自体と、蛍光部分を分子の残部に連結させる働きをする任意のリンキング原子を両方含むことが理解される。
一部の実施形態では、フルオロフォアは、
Figure 2022543619000012
Figure 2022543619000013
Figure 2022543619000014
から選択される。
本明細書に記載される化合物について、基及びその置換基は、選択及び置換によって、例えば転位、環化、脱離などによる変化を自発的には受けない安定な化合物が生じるように、原子及び置換基の許容原子価に従って選択され得る。
化合物は、不斉又はキラル中心が存在する立体異性体として存在することができる。立体異性体は、キラル炭素原子の周りの置換基の立体配置に応じて「Ｒ」又は「Ｓ」である。本明細書で用語「Ｒ」及び「Ｓ」は、ＩＵＰＡＣ １９７４ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｉｎ Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ．、１９７６、４５：１３－３０に定義される立体配置である。本開示は、様々な立体異性体及びそれらの混合物を考慮し、これらは、本発明の範囲内に具体的に含まれる。立体異性体は、エナンチオマー及びジアステレオマー及びエナンチオマー又はジアステレオマーの混合物を含む。化合物の個々の立体異性体は、不斉又はキラル中心を含む市販の出発物質から合成することによって、又はラセミ混合物の調製後、当業者に周知の分割方法を行うことによって調製され得る。これらの分割方法は、（１）Ｆｕｒｎｉｓｓ、Ｈａｎｎａｆｏｒｄ、Ｓｍｉｔｈ、及びＴａｔｃｈｅｌｌ、「Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第５版（１９８９）、Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ社、Ｅｓｓｅｘ ＣＭ２０ ２ＪＥ， Ｅｎｇｌａｎｄに記載されているように、エナンチオマーの混合物のキラル補助物への付着、得られたジアステレオマー混合物の再結晶若しくはクロマトグラフィーによる分離、及び補助物からの光学純粋な生成物の任意選択な遊離、又は（２）光学エナンチオマーの混合物のキラルクロマトグラフ用カラムによる直接分離、又は（３）分別再結晶方法によって例示される。
化合物は互変異性形及び幾何異性体を有することができ、これらはまた本発明の態様を構成することを理解すべきである。
本開示は、１個以上の原子が自然界に通常見られる原子質量又は質量数と異なる原子質量又は質量数を有する原子によって置き換えられていること以外は、式（Ｉ）で記載されているものと同一である同位体標識化合物も含む。本発明の化合物に含まれるのに適している同位体の例は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素、例えばそれぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌであるが、これらに限定されない。より重い同位体、例えば重水素、すなわち２Ｈによる置換は、代謝安定性の向上、例えばインビボ半減期の増大から生じるいくつかの利点をもたらすことができ、したがって一部の状況では好ましいことがある。化合物は、医用画像処理及びポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）研究のためにポジトロン放出同位体を組み入れ、受容体の分布を決定することができる。式（Ｉ）の化合物に組み入れることができる好適なポジトロン放出同位体は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、及び１８Ｆである。式（Ｉ）の同位体標識化合物は、一般に、当業者に公知の従来の技法又は非同位体標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用する添付の実施例に記載されているものと類似している方法によって調製され得る。
本明細書に開示される化合物は、塩の形をとることができる。塩は、化合物の最終の単離及び精製時に、又は別々に、例えば化合物の塩基性基（例えば、アミノ基）を好適な酸と反応させることによって、若しくは化合物の酸性基（例えば、カルボン酸基）を好適な塩基と反応させることによって調製され得る。
酸塩は、化合物の最終の単離及び精製時に、又は別々に、化合物の好適な基、例えばアミノ基を好適な酸と反応させることによって調製され得る。例えば、化合物は、メタノールや水などこれらに限定されないが好適な溶媒に溶解され、少なくとも１当量の酸、例えば塩酸で処理され得る。得られた塩は沈殿し、減圧下における濾過及び乾燥によって単離され得る。あるいは、溶媒及び過剰の酸を減圧下で除去して、塩を得ることができる。代表的な塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、イセチオン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルタミン酸塩、パラ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などが挙げられる。化合物のアミノ基は、またメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ラウリル、ミリスチル、ステアリルなどのアルキルクロリド、ブロミド及びヨージドで四級化され得る。
塩基性付加塩は、開示された化合物の最終の単離及び精製時に、カルボキシル基と好適な塩基、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、若しくはアルミニウムなどの金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、又は炭酸水素塩、又は有機第一級、第二級、若しくは第三級アミンの反応により調製され得る。第四級アミン塩、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルフェネチルアミン、１－エフェナミン及びＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジンなどに由来するものが調製され得る。
式（Ｉ）の化合物は、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、１９９８， ６３（１６）， ５６３６－５６３９によって記載されている化合物カルボキシプロピルスルホプロピル－アクリジニウム（ＣＰＳＰ－アクリジニウム、９－［Ｎ－トシル－Ｎ－（３－カルボキシプロピル）］－１０－（３－スルホプロピル）アクリジニウムカルボキサミド）を出発物とするスキーム１に例示されるものを含めて様々な方法によって合成され得る。
Figure 2022543619000015
当業者は、スキーム１が特定の置換基（例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｘ、及びＹ基）を有するいくつかの化合物の合成を例示するが、対応する位置に他の基を有する化合物が同様にして調製され得ることを理解する。
合成経路の反応条件、試薬及び順序の適切な操作、反応条件と適合性があるはずがない任意の化学官能性の保護、並びに方法の反応順序で好適な点における脱保護を含めて、ルーチンの実験法は、本開示の範囲に含まれる。好適な保護基及びそのような好適な保護基を使用して異なる置換基を保護及び脱保護する方法は、当業者に周知である。それらの例は、ＰＧＭ Ｗｕｔｓ及びＴＷ Ｇｒｅｅｎｅ、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ ｂｏｏｋ ｔｉｔｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （第４版）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ＮＹ（２００６）に見ることができ、これは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。本開示の化合物の合成は、本明細書に記載される合成スキーム及び具体例に記載されているものと類似している方法によって実施され得る。
開示された化合物の光学活性形が必要とされるとき、（例えば、好適な反応ステップの不斉誘導によって調製された）光学活性出発物質を使用する本明細書に記載される手順の１つを実施することによって、又は標準手順（クロマトグラフ分離、再結晶又は酵素分割など）を使用する化合物若しくは中間体の立体異性体の混合物の分割によって得ることができる。
同様に、化合物の純粋な幾何異性体が必要とされるとき、純粋な幾何異性体を出発物質として使用する上記の手順の１つを実施することによって、又はクロマトグラフ分離などの標準手順を使用する化合物若しくは中間体の幾何異性体の混合物の分割によって得ることができる。
記載されている合成スキーム及び具体例は例示であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に定義されると理解され得る。合成法及び具体例のすべての代替、修正、及び均等形態は、特許請求の範囲に含まれる。
したがって、当業者には、本明細書に記載される第１及び第２のコンジュゲートが式（ＩＩ）
Figure 2022543619000016
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１は、アルキレン及びヘテロアルキレンから選択され、Ｌ３は、リンカーであり、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、結合メンバーは、標的分析対象物質に結合することができる分子であり、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］
であることが明らかである。
Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ａ、Ｌ１、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ基、及びフルオロフォアは、式（Ｉ）について以上に記載されているものと同一である。式（Ｉ）の化合物について以上に記載されている任意の基又は基の組合せは、式（ＩＩ）の化合物にも含まれ得る。
式（ＩＩ）の化合物では、Ｌ３はリンカーである。多種多様なリンカーは、式（ＩＩ）の化合物において使用され得る。一部の実施形態では、リンカーは共有結合とすることができる。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃ１～Ｃ４０アルキレンリンカーなどのアルキレンリンカー、例えばＣ１～Ｃ３０、Ｃ１～Ｃ２０、Ｃ１～Ｃ１２、Ｃ１～Ｃ１０、Ｃ１～Ｃ８、Ｃ１～Ｃ６、又はＣ１～Ｃ４アルキレンリンカーとすることができる。例えば、リンカーは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、又はＣ４０アルキレンリンカーとすることができる。
一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコールリンカーなどヘテロアルキレンリンカーとすることができる。そのようなリンカーは、式－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－ＣＨ２ＣＨ２－を有することができ、式中、ｎ１は１～２０の整数である。例えば、一部の実施形態では、ｎ１は、１～２０、１～１８、１～１６、１～１４、１～１２、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、又は１～４の整数である。一部の実施形態では、ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｅ部分を含むことができ、ここで、Ｅは、２つの反応性基間の反応の生成物である。例えば、Ｅ基は、アミド、エステル、カルバメート、トリアゾール、スルホンアミド、ホスホルアミド、ホスフェート、又はスルフェートとすることができる。
目的の分析対象物質
用語「分析対象物質」、「標的分析対象物質」、及び「目的の分析対象物質」は、本明細書で同義に使用され、特定のアッセイで測定される分子、化合物、又は物質を指す。当業者によって理解されているように、結合メンバー（例えば、第１の特異的結合メンバー、第２の特異的結合メンバー、第３の特異的結合メンバー、及び／又は第４の特異的結合メンバー）によって特異的に結合され得る任意の分析対象物質は、本開示のキット及び方法を使用して検出され、任意選択的に定量され得る。
一部の実施形態では、分析対象物質は生体分子とすることができる。生体分子の非限定的な例としては、タンパク質、脂質、及び炭水化物などの高分子が挙げられる。ある特定の場合では、分析対象物質としては、ホルモン、抗体、増殖因子、サイトカイン、酵素、受容体（例えば、神経、ホルモン、栄養物、及び細胞表面受容体）又はそれらのリガンド、がんマーカー（例えば、ＰＳＡ、ＴＮＦ－アルファ）、心筋梗塞のマーカー（例えば、トロポニン、クレアチンキナーゼなど）、毒素、薬物（例えば、嗜癖薬物）、代謝作用剤（例えば、ビタミン）などが挙げられる。タンパク質分析対象物質の非限定的な実施形態としては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質断片、タンパク質複合体、融合タンパク質、組換えタンパク質、ホスホタンパク質、糖タンパク質、又はリポタンパク質が挙げられる。
ある特定の実施形態では、分析対象物質は、翻訳後修飾タンパク質（例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化タンパク質）とすることができ、（後述する）対応する結合メンバーは、翻訳後修飾に特異的な抗体とすることができる。修飾タンパク質は、固体支持体に固定化された第１の結合メンバーに結合され得る。その第１の結合メンバーは、修飾タンパク質に結合するが、未修飾タンパク質に結合しない。
一部の実施形態では、分析対象物質は、例えば、循環腫瘍細胞、病原性細菌細胞、又は真菌細胞などの細胞とすることができる。他の実施形態では、分析対象物質は、ウイルス（例えば、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、フィロウイルス（Ｅｂｏｌａ）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）、又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））とすることができる。
本開示に従って分析され得る分析対象物質の非限定的な一覧には、サイログロブリン、プロラクチン、Ａβ４２アミロイドベータ－タンパク質、フェチュイン－Ａ、タウ、セクレトグラニンＩＩ、プリオンタンパク質、アルファ－シヌクレイン、タウタンパク質、ニューロフィラメント軽鎖、パーキン、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１、ＤＪ－１、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、変異型ＡＴＰ１３Ａ２、アポＨ、セルロプラスミン、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベータ－１アルファ（ＰＧＣ－１α）、トランスチレチン、ビタミンＤ結合タンパク質、アポトーシス促進キナーゼＲ（ＰＫＲ）及びそのリン酸化ＰＫＲ（ｐＰＫＲ）、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ－１２ｐ４０、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ－８、Ｄｋｋ－３（精液）、ｐ１４エンドカン断片、血清、ＡＣＥ２、ＣＤ２５に対する自己抗体、ｈＴＥＲＴ、ＣＡＩ２５（ＭＵＣ １６）、ＶＥＧＦ、ｓＩＬ－２、オステオポンチン、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、アルファ－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン、アルブミン尿、微量アルブミン尿、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、腎傷害分子－１（ＫＩＭ－１）、肝臓型脂肪酸結合タンパク質（Ｌ－ＦＡＢＰ）、ＬＭＰ１、ＢＡＲＦ１、ＩＬ－８、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＩ、ＥＧＲＦ、ＦＧＦ１９、ＦＲＳ２、ＧＲＥＢ１、ＬＺＴＳ１、アルファ－アミラーゼ、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、チオレドキシン、ベータ－２ミクログロブリン、腫瘍壊死因子－アルファ受容体、ＣＡ１５－３、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、Ｔ細胞リンパ腫浸潤転移１（ＴＩＡＭ１）、Ｎ－カドヘリン、ＥＣ３９、アンフィレギュリン、ｄＵＴＰアーゼ、分泌ゲルゾリン（ｐＧＳＮ）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、チモシンβｌ５、インスリン、血漿Ｃ－ペプチド、グリコシル化ヘモグロビン（ＨＢＡ１ｃ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＡＲＨＧＤＩＢ（Ｒｈｏ ＧＤＰ－解離阻害物質２）、ＣＦＬ１（コフィリン－１）、ＰＦＮ１（プロフィリン－１）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＰ）、Ｓ１００Ａ１１（タンパク質Ｓ１００－Ａ１１）、ＰＲＤＸ６（ペルオキシレドキシン－６）、ＨＳＰＥ１（１０ｋＤａ熱ショックタンパク質、ミトコンドリアｌ）、ＬＹＺ（リゾチームＣ前駆体）、ＧＰＩ（グルコース－６リン酸イソメラーゼ）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ（ヒストンＨ２Ａタイプ２－Ａ）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）、ＨＳＰＧ２（基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体）、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（ガレクチン－３－結合タンパク質前駆体）、ＣＴＳＤ（カテプシンＤ前駆体）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ前駆体）、ＩＱＧＡＰ１（Ｒａｓ ＧＴＰアーゼ活性化様タンパク質ＩＱＧＡＰ１）、ＣＰ（セルロプラスミン前駆体）、及びＩＧＬＣ２（ＩＧＬＣ１タンパク質）、ＰＣＤＧＦ／ＧＰ８８、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ４、ＩＧＦ－ＩＲ、ｐ２７（ｋｉｐ１）、Ａｋｔ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＨＩＰ、Ｇｒｂ２、Ｇａｂ２、ＰＤＫ－１（３－ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ－１）、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ｍＴＯＲ、ＭＩＧ－６（ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害物質１）、Ｓ６Ｋ、ｓｒｃ、ＫＲＡＳ、ＭＥＫマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１、ｃＭＹＣ、ＴＯＰＯ ＩＩトポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩアルファ １７０ｋＤａ、ＦＲＡＰ１、ＮＲＧ１、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＧＲ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＥＤＤ４－１、Ｆオキソ３Ａ、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、ＰＸＮ、ＥＬＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＡＲ、ＥＰＨＢ２、ＫＬＦ６、ＡＮＸＡ７、ＮＫＸ３－１、ＰＩＴＸ２、ＭＫＩ６７、ＰＨＬＰＰ、アディポネクチン（ＡＤＩＰＯＱ）、フィブリノゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、レプチン（ＬＥＰ）、終末糖化産物特異的受容体（ＡＧＥＲ又はＲＡＧＥ）、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質（ＡＨＳＧ）、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、ＣＤ１４分子（ＣＤ１４）、フェリチン（ＦＴＨ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インターロイキン２受容体、アルファ（ＩＬ２ＲＡ）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）及びＶｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＩＬ１α、ＴＮＦα、核周囲型抗好中球細胞質抗体（ｐ－ＡＮＣＡ）、ラクトフェリン、カルプロテクチン、ウィルムス腫瘍－１タンパク質、アクアポリン－１、ＭＬＬ３、ＡＭＢＰ、ＶＤＡＣ１、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）エンテロトキシン（易熱性エキソトキシン、耐熱性エンテロトキシン）、インフルエンザＨＡ抗原、破傷風毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、志賀毒素様毒素Ｉ、志賀毒素様毒素ＩＩ、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ及びＢ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、Ｓ１００Ｂ、ニューロフィラメント軽鎖ポリペプチド（ＮＦ－Ｌ）、タウ、ｐタウ、アミロイドベータ４０及び４２、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｎ末端（ＮＴ）－プロホルモンＢＮＰ（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）、ＣＡ１９－９、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ｓＦｌｔ－１、オピオイド、タクロリムス、ビタミンＫ欠乏によって誘発されるタンパク質－ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）などが含まれる。
分析対象物質の他の例としては、乱用薬物（例えば、コカイン）、タンパク質バイオマーカー（ヌクレオリン、核内因子－κＢ必須モジュレーター（ＮＥＭＯ）、ＣＤ－３０、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＭＵＣ１グリコフォーム、免疫グロブリンμ重鎖（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンＥ、αｖβ３インテグリン、α－トロンビン、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＮＦ－κＢ、Ｅ２Ｆ転写因子、ＨＥＲ３、プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質、テネイシンＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、胃がん細胞、及びＨＧＣ－２７を含むがこれらに限定されない）；細胞（非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん細胞、（ＤＬＤ－１）、Ｈ２３肺腺癌細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞（ＨＬ６０）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）細胞、ＮＣＩＨ６９、ヒト膠芽腫細胞、Ｕ１１８－ＭＧ、ＰＣ－３細胞、ＨＥＲ－２過剰発現ヒト乳がん細胞、ＳＫ－ＢＲ－３、及び膵がん細胞（Ｍｉａ－ＰａＣａ－２）を含むがこれらに限定されない）；並びに感染病原体（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、シゲラ・ディゼンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラＯ８（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｏ８）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）を含むがこれらに限定されない）が挙げられる。
干渉物質
以上に論じたように、一部の実施形態では、開示されたキット及び方法は、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出するのに有用である。そのような実施形態では、第２の特異的結合メンバーは、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を特異的に結合する。イムノアッセイにおける分析対象物質検出及びその結果の解釈に干渉する物質（本明細書で「干渉物質」、「交差反応物」、又は「インターフェアランス」とも呼ばれる）は、当技術分野において公知である。一般に、干渉物質又は交差反応物は、試料中の測定可能な分析対象物質濃度を変更する物質又は抗体結合を変更する物質に類別され得る（Ｔａｔｅ， Ｊ．及びＧ． Ｗａｒｄ、Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．、２５（２）：１０５－１２０（２００４））。測定可能な分析対象物質濃度を変更するインターフェアランス又は交差反応物としては、ホルモン結合タンパク質、分析前因子（例えば、抗凝固薬、試料貯蔵）、及び自己分析対象物質抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ホルモン結合グロブリンは、分析対象物質からのそれらの除去又は分析対象物質のブロッキングによって、試料中の測定可能な分析対象物質濃度を変更することができる。例えば、ステロイドは、性ホルモン結合グロブリン又はコルチゾールに結合し、遊離の分析対象物質の濃度を低下させることができる（Ｓｌａａｔｓら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．、３３：３００－３０２（１９８７）；Ｍａｓｔｅｒｓ， Ａ．Ｍ．及びＨａｈｎｅｌ Ｒ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．， ３５：９７９－８４（１９８９）；並びにＶｉｎｉｎｇ， Ｒ．Ｆ．、Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．、２：３９－４９（１９８１））。イムノアッセイに干渉する分析前因子としては、血清中に存在するカチオン（例えば、Ｍｇ２＋又はＣａ２＋）の、抗原立体構造及び測定可能な分析対象物質濃度を変化させる薬物又はタンパク質への結合が挙げられるが、これに限定されない。試料のタイプも、分析対象物質濃度に影響を及ぼすことができ、リチウムヘパリン、ＥＤＴＡ、及びフッ化ナトリウム／シュウ酸カリウム又は抗凝固薬を含まないチューブに集められた試料の結果に差がある。さらに、不適切な試料のタイプ及び検体処理又は貯蔵は、試料の特性を時間をかけて変化させ、結果に影響を及ぼすことができる。自己抗体は、例えば、マクロ－酵素（クレアチンキナーゼ、アミラーゼ）、甲状腺ホルモン（Ｓｙｍｏｎｓ Ｒ．Ｇ．、Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｒｅｖ．、１０：４４－４９（１９８９）；Ｄｅｓｐｒｅｓ， Ｎ．及びＧｒａｎｔ， Ａ．Ｍ．、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．、４４（３）：４４０－５４（１９９８）；及びＳａｋａｔａら、Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．、１０３（４）：５７９－８９（１９８５））、サイログロブリン（Ｄｅｓｐｒｅｓ及びＧｒａｎｔ、上記）、インスリン（Ｓａｐｉｎ， Ｒ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３５（５）：３６５－７（１９９７））；及びＣａｓｅｓｎｏｖｅｓら、Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３５ （Ｐｔ ６）：７６８－７４（１９９８））、プロラクチン（Ｇｌｅｚｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｏｘｆ）．、５７（１）：１３５－９（２００２））、及びテストステロン（Ｋｕｗａｈａｒａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．、８３（１）：１４－６（１９９８））などのいくつかの分析対象物質のための非イムノアッセイでもイムノアッセイ方法でも干渉を引き起こすことがある。
抗体結合を変更するインターフェアランス又は交差反応物としては、異好性抗体、ヒト抗動物抗体、及び高用量フック効果が挙げられるが、これらに限定されない。異好性抗体は、異なる化学組成の不均一で、はっきりと定義されていない抗原に対して多反応性であり、一般に低親和性及び弱結合性を示す自然抗体及び自己抗体を含む（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ Ｓ．Ｓ．、Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｊ．、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．、３２５（１－２）：１－１５（２００２）；及びＢｏｕｖｅｔら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５４（１－２）：１９９－２０１（２００１））。異好性抗体は、抗原に結合し、分析対象物質濃度に影響を及ぼすこと、又はその鏡像構造のために抗原の結合を模倣することによって、イムノアッセイにおける抗体への抗原結合に影響を及ぼすことができる。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を含めてヒト抗動物抗体（ＨＡＡＡ）は、特異的動物免疫原ホールＩｇＧ又はＩｇＭ免疫グロブリンに対して産生された高親和性の特異的ポリクローナル抗体である（Ｋｒｉｃｋａ Ｌ．Ｊ．、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．、４５：９４２－５６（１９９９））。ＨＡＡＡは、単一化学組成の抗原と強力な結合性を示し、同一種の試薬抗体と交差反応して、誤ったシグナルを生成することによって試験抗原と競合するように高力価で産生される。分析対象物質濃度範囲が大きいイムノメトリックアッセイ（ＩＭＡ）システム（例えば、フェリチン、成長ホルモン、ｈＣＧ、プロラクチン、及びサイログロブリン）では、抗原－抗体反応は、抗原過剰状態に入ることがあり、その結果、偽陰性の結果をもたらすことがあり（Ｒｙａｌｌら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２７：３０８－３１５（１９８２）；Ｏｈａｓｈｉら、Ｈｏｒｍ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ．、２５：３９３－４（１９９３）；Ｓｔｕｒｇｅｏｎら、Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３５：４６０－９１（１９９８）；Ｓｔ－Ｊｅａｎら、Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、４４：３０５－９（１９９６）；並びにＤｅｍｅｒｓ， Ｌ．Ｍ．及びＳｐｅｎｃｅｒ， Ｃ．Ａ．、Ｔｈｙｒｏｉｄ、１３：５７－６７（２００３））、誤診を潜在的に導く。特に、捕捉及び検出抗体が両方同時に加えられる２サイトイムノアッセイでは、遊離の分析対象物質及び標識抗体に結合している分析対象物質は、限定数の抗体－結合部位を求めて競合し、より高い分析対象物質濃度の存在下では、固相に結合している標識を増加させるより減少させる（当技術分野で「高用量フック効果」と呼ばれる）。
開示されたキット及び方法は、例えばサイログロブリン（Ｔｇ）イムノアッセイにおいて使用され得る。サイログロブリン（Ｔｇ）は、６６０ｋＤａのホモダイマー糖タンパク質である。それは、甲状腺における最大発現タンパク質であり、正常及び悪性の甲状腺濾胞細胞の両方に存在する。Ｔｇは、チロキシン及びトリヨードチロニンの合成のためのタンパク質足場として、並びにチロキシン、トリヨードチロニンと、ヨウ素の両方のための貯蔵タンパク質として働く。それは、分化甲状腺がん患者の術後管理のための腫瘍マーカーであると特定された。甲状腺摘除術及び放射性ヨードアブレーション後のＴｇレベルの上昇は、再発癌を強く示唆する。Ｔｇイムノアッセイにおける干渉には、典型的に分化甲状腺がん患者の最大３０％に存在する内因性Ｔｇ抗体自己抗体（ＴｇＡｂ）が関わっている（Ｈｊｉｙｉａｎｎａｋｉｓら、Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、１１：２４０－４（１９９９））。
他の実施形態では、開示された方法及びキットを使用して、プロラクチンのイムノアッセイにおける干渉物質又は交差反応物を検出することができる。当技術分野では、プロラクチンイムノアッセイを使用して、男性及び女性の不妊並びに下垂体機能不全の診断、男性及び女性の生殖腺障害のモニタリング、並びに無月経及び乳汁漏出の管理を助ける。抗プロラクチン自己抗体がマクロプロラクチン（ｍａｃｒｏ－ＰＲＬ）の形で存在すると、下垂体疾患なしで高プロラクチン血症を引き起こすことがあり、不必要な医学的又は外科的処置手技を招くことがある（Ｇｌｅｚｅｒら、Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、５７：１３５－９（２００２））。マクロ－ＰＲＬ（「ビッグビッグプロラクチン」と呼ぶこともある）は、主に、プロラクチン（ＰＲＬ）とＰＲＬ分子の特異的エピトープに対して作られるＩｇＧ抗体との巨大分子複合体である（Ｆａｈｉｅ－Ｗｉｌｓｏｎ， Ｍ．Ｎ．、Ａｈｌｑｕｉｓｔ， Ｊ．Ａ．、Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、５８， ６８３－５（２００３））。「ビッグプロラクチン」は、プロラクチンのダイマーの形である。マクロプロラクチン及びビッグプロラクチンは共に、それらのバイオアベイラビリティの低下のために、一般に生物学的に不活性であるとみなされる。したがって、イムノアッセイにおけるビッグプロラクチン及びマクロプロラクチンの検出は、偽陽性の結果を表す（Ｌｉｐｐｉ， Ｇ．及びＰｌｅｂａｎｉ， Ｍ．、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｌａｂ． Ｍｅｄ．、５４（４）：５１９－５２２（２０１６）；Ｓｕｌｉｍａｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９（９）：１５０４－１５０９（２００３）；並びにＶａｉｓｈｙａら、Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｎｆｅｒｔｉｌ．、１１（３）：１６１－１６７（２０１０））。現在、プロラクチンシグナルは、イムノアッセイを介して測定され、臨床医は、高い結果が（患者病歴、妊娠期間、及び他の因子に基づいて）高プロラクチン血症を真に表し、又はマクロプロラクチン／ビッグプロラクチン干渉の結果であるかどうか解釈しなければならない。マクロプロラクチン／ビッグプロラクチン干渉の疑いがある場合、患者試料を手動でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で処置して、より大きい種を沈殿させ、次に遠心分離を行う（オフライン前処置）。ＰＥＧ処置が完了すると、処置後の試料の上澄みを再試験する。次いで、第２のプロラクチンを第１のプロラクチンと比較し、第１と第２の結果の比を使用して、マクロプロラクチン／ビッグプロラクチン干渉が存在するかどうかを決定する。したがって、開示されたキット及び方法は、マクロプロラクチン／ビッグプロラクチン干渉物質の存在のより信頼性が高く迅速な評価を提供する。
一部の実施形態では、干渉物質はビオチン分子とすることができる。例えば、「キャプチャーオンザフライ」イムノアッセイフォーマットにおいて、捕捉抗体は、典型的にビオチンで標識されており、検出抗体は、典型的にレポーター基（例えば、アクリジニウム）で標識されている。分析対象物質と反応させた後、免疫複合体は、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロ粒子を使用して捕らえられる。対象において、すでに高レベルのビオチンが血流中に存在する場合、遊離のビオチンもストレプトアビジンでコーティングされたマイクロ粒子に結合し、免疫複合体による結合をブロックするので、マイクロ粒子によって捕捉される免疫複合体の量が損なわれ得る。したがって、偽陰性及び／又は低減されたシグナルが生じ得る。
固体支持体は、目的の分析対象物質が試料中に存在する場合それが、固体支持体の表面に固定化された第３の特異的結合メンバー、及び第１のコンジュゲート（例えば、本明細書に開示される式（ＩＩ）のコンジュゲート）、又は一部の実施形態では、第１及び第２のコンジュゲートに結合する条件下で試料と接触される。一部の実施形態では、分析対象物質の検出に干渉する物質が試料中に存在する場合それは、固体支持体の表面に固定化された第３の特異的結合メンバー、及び第２のコンジュゲート（例えば、本明細書に開示される式（ＩＩ）のコンジュゲート）に結合する。第３の特異的結合メンバーは、分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質に同時に結合し得る。しかし、単一の第３の特異的結合メンバーは、分析対象物質又は干渉物質を結合し得る。言い換えれば、分析対象物質及び干渉物質は、同一の単一の特異的結合メンバーに結合し得ない。固体支持体に固定化された複数の第３の特異的結合メンバーのなかには、分析対象物質に結合する第３の特異的結合メンバーもあれば、干渉物質に結合するものもあると認識される。
他の実施形態では、分析対象物質の検出に干渉する物質が試料中に存在する場合それは、分析対象物質を直接的に結合することができ、それによって第１のコンジュゲートが分析対象物質に到達し、それを結合することを妨げる。そのような場合、分析対象物質は、第３の特異的結合メンバー及び分析対象物質の検出に干渉する物質に結合しており、第１のコンジュゲートは、分析対象物質に結合し、第２のコンジュゲートは、分析対象物質の検出に干渉する物質に結合する。さらに別の構成で、分析対象物質は、第３の特異的結合メンバーに結合することができ、分析対象物質の検出に干渉する物質は、第４の特異的結合メンバーに結合し、第１のコンジュゲートは、分析対象物質に結合し、第２のコンジュゲートは、分析対象物質の検出に干渉する物質に結合する。他の実施形態では、干渉物質は、分析対象物質が固体支持体に固定化された第３の特異的結合メンバー（例えば、捕捉抗体）に結合することを妨げることができる。あるいは、干渉物質は、分析対象物質又は第１のコンジュゲートに結合することができ、それによって第１のコンジュゲートが捕捉された分析対象物質に結合することを妨げる。他の実施形態では、干渉物質は、分析対象物質に結合し、検出されたシグナルが増加する（例えば、第１のコンジュゲートが分析対象物質ではなく粒子に結合する）ように競合アッセイフォーマットを混乱させることがあり、分析対象物質濃度の人為的な増加を示す。分析対象物質干渉のシナリオは、図８に概略的に示される。
固体支持体
ある特定の実施形態では、開示されたキットは、第３の特異的結合メンバー、及び任意選択的に固体支持体に付着している又は固定化された第４の特異的結合メンバーを含む。用語「固相」及び「固体支持体」は、本明細書で同義に使用され、１つ以上の特異的結合メンバーを付着する及び／又は引き付け、固定化するために使用することができる任意の材料を指す。例えば、特異的結合メンバーは、本明細書に開示される式（ＩＩ）のコンジュゲートとすることができる。平面基材又はビーズの形をしたポリマー材料で作製された固体支持体を含むが、これに限定されない当技術分野において公知である任意の固体支持体は、本明細書に記載されるキット及び方法で使用することができる。好適な固体支持体の例としては、電極、試験管、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、マイクロ－又はマルチ－ウェルプレートのウェル、ゲル、コロイド、生体細胞、シート、及びチップが挙げられる。一部の実施形態では、固体支持体は、２個以上の空間的に分離された電極を含む。ある特定の実施形態では、固体支持体は、粒子、例えばマイクロ粒子とすることができる。用語「ビーズ」及び「粒子」は、本明細書で同義に使用され、実質的に球状の固体支持体を指す。用語「マイクロ粒子」及び「マイクロビーズ」は、本明細書で同義に使用され、例えば検出モジュールの一連のウェルなど一連のウェルに居る又は定着することを可能にするマイクロビーズ又はマイクロ粒子を指す。マイクロ粒子又はマイクロビーズは、目的の分析対象物質に結合する少なくとも１つの特異的結合メンバーを含むことができ、その特異的結合メンバーは、検出可能な標識を含んでもよく、又は含まなくてもよい。
一部の実施形態では、マイクロ粒子は、約０．１ｎｍ～約１０ミクロン、約５０ｎｍ～約５ミクロン、約１００ｎｍ～約１ミクロン、約０．１ｎｍ～約７００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１０ミクロン、約５００ｎｍ～約５ミクロン、約５００ｎｍ～約３ミクロン、約１００ｎｍ～７００ｎｍ、又は約５００ｎｍ～７００ｎｍとすることができる。例えば、マイクロ粒子は、約４～６ミクロン、約２～３ミクロン、又は約０．５～１．５ミクロンとすることができる。約５００ｎｍ未満の粒子は、「ナノ粒子」と呼ばれ得る。したがって、マイクロ粒子は、任意選択的に約０．１ｎｍ～約５００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、又は約５００ｎｍのナノ粒子とすることができる。
ある特定の実施形態では、固体支持体は、磁性ビーズ又は磁性粒子とすることができる。磁性ビーズ／粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性又は強磁性流体とすることができる。例示的な強磁性材料としては、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｄｙ、ＣｒＯ２、ＭｎＡｓ、ＭｎＢｉ、ＥｕＯ、ＮｉＯ／Ｆｅが挙げられる。フェリ磁性材料の例としては、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、Ｆｅ３Ｏ４（又はＦｅＯ．Ｆｅ２Ｏ３）が挙げられる。ビーズは、磁性の固体コア部分が１層以上の非磁性層によって取り囲まれていることがある。あるいは、磁性部分は、非磁性コアの周りの層とすることができる。結合メンバーが固定化されている固体支持体は、乾燥した又は液体の形で貯蔵され得る。磁性ビーズは、試料を結合メンバーが固定化されている磁性ビーズと接触させる前又は後に磁場にかけることができる。
固体支持体は、当技術分野において公知であるいずれか好適な方法を使用して、分析対象物質を含むと疑われる試料と接触され得る。本明細書で使用される場合、用語「接触させること」は、そこに固定化された特異的結合メンバーを試料中の目的の分析対象物質に、結合メンバーに特異的な目的の分析対象物質が試料中に存在する場合に結合相互作用が生じるように十分にぴったりと近づける任意のタイプの組合せ作用を指す。接触させることは、試料をマイクロ粒子と組み合わせること、又は分析対象物質のすぐ近くにマイクロ粒子を導入することによって標的分析対象物質を結合メンバーを含むマイクロ粒子に曝露することを含めて、様々な方式で達成され得る。接触させることは、必要に応じて何度繰り返してよい。
一実施形態では、固体支持体と試料体積との接触は、特異的結合メンバーと分析対象物質又は干渉物質との結合相互作用が生じるようにするのに十分な時間維持される（すなわち、インキュベートされる）。この点に関して、例えば、試料体積は、固体支持体上で少なくとも３０秒間及び最大で１０分間インキュベートされ得る。例えば、試料は、固体支持体と共に約１、２、３、４、５、６、７、８、又は９分間インキュベートされ得る。別の実施形態では、試料は、マイクロ粒子と共に約２分間インキュベートされ得る。さらに、インキュベートすることは、例えば、アルブミン（例えば、ＢＳＡ）、非イオン性洗浄剤（Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ）など、特異的結合相互作用を促進する結合緩衝剤中で行われ得る。特異的結合メンバーの結合親和性及び／又は特異性は、アッセイにおいて、結合緩衝剤を変えることによって操作され得る又は変更され得る。一部の実施形態では、結合親和性及び／又は特異性は、結合緩衝剤を変えることによって増加され得る又は低下され得る。例えば、温度及び塩濃度など結合相互作用の他の条件は、経験的に決定することができ、又は製造業者の指示書に基づくことができる。例えば、接触させることは、室温（２１℃～２８℃、例えば、２３℃～２５℃）、３７℃、又は４℃で実施され得る。
ある特定の実施形態では、固体支持体は、検出時における偽陽性シグナル又はシグナルの消失を導くことがある、アッセイ時における非捕捉成分（例えば、分析対象物質分子、結合メンバー）の結合表面への非特異的付着を無くす又は最小限に抑えることができる保護、ブロッキング、又は不動態化層も含むことができる。ある特定の実施形態では不動態化層を形成するために利用され得る材料の例としては、タンパク質の非特異的結合を忌避するポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）；天然タンパク質（例えば、血清アルブミン及びカゼイン）；界面活性剤（例えば、双性イオン界面活性剤、スルホベタイン）；天然長鎖脂質；ポリマーブラシ、及びサケ精子ＤＮＡなどの核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
試料
用語「試料」、「試験試料」、及び「生体試料」は、本明細書で同義に使用され、目的の分析対象物質を含む又は含むと疑われる流体試料を指す。場合によって、試料は、液体、流動性の粒子固体、又は固体粒子の流体懸濁液を含むことができる。ある特定の実施形態では、試料は、液体試料又は固体試料の液体抽出物とすることができる。場合によって、試料は、本明細書に記載される分析より前に処理され得る。例えば、試料は、分析より前にその供給源から分離され得る又は精製され得る。しかし、ある特定の実施形態では、分析対象物質を含む未処理試料は、直接アッセイされ得る。試料は、いずれか好適な供給源に由来し得る。例えば、試料供給源は、合成（例えば、実験室で生成）、環境（例えば、空気、土壌、流体試料、例えば、水供給物など）、動物（例えば、哺乳類）、植物、又はそれらの任意の組合せとすることができる。特定の例では、試料は、人体物質（例えば、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、汗、痰、精液、粘液、涙液、リンパ液、羊水、間質液、肺洗浄、脳脊髄液、糞便、組織、又は器官）である。組織としては、骨格筋組織、肝組織、肺組織、腎組織、心筋組織、脳組織、骨髄、頸部組織、皮膚などを挙げることができるが、これらに限定されない。ある特定の場合では、試料の供給源は、組織崩壊／細胞溶解によって可溶化され得る生検試料などの器官又は組織とすることができる。
場合によって、流体試料は、アッセイにおいて使用前に希釈され得る。例えば、分析対象物質分子の供給源がヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態では、流体は、適切な溶媒（例えば、ＰＢＳ緩衝剤などの緩衝剤）で希釈され得る。流体試料は、使用前に約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍、又はそれ以上希釈され得る。
場合によって、上記のように、試料は、分析前処理を受けることができる。分析前処理は、非特異的タンパク質除去及び／又は効果的ではあるが安価で実行可能な混合機能性などの追加の機能性をもたらすことができる。分析前処理の一般方法は、当技術分野において公知である動電トラッピング、ＡＣ動電、表面弾性波、等速度電気泳動、誘電泳動、電気泳動、又は他の予濃縮技法の使用を含むことができる。場合によって、流体試料は、アッセイにおける使用より前に濃縮され得る。例えば、試料がヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態では、流体は、沈殿、蒸発、濾過、遠心、又はそれらの組合せによって濃縮され得る。流体試料は、使用より前に約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍、又はそれ以上濃縮され得る。
干渉物質を検出する方法
本開示は、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出する方法を提供する。一態様では、方法は、（ａ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を上記のキットのいずれか１つと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合、（ｉｉ）分析対象物質の検出に干渉する物質の第３の特異的結合メンバーへの特異的結合、又は分析対象物質の検出に干渉する物質の固体支持体表面への非特異的結合、（ｉｉｉ）第１のコンジュゲートの分析対象物質への結合、（ｉｖ）第２のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合、及び任意選択的に（ｖ）第４の特異的結合メンバーの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合；（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質の存在を検出するステップを含む。
別の態様では、方法は、（ａ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を上記のキットのいずれか１つと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合及び分析対象物質の分析対象物質の検出に干渉する物質への結合による分析対象物質－干渉物質複合体の形成、（ｉｉ）第１のコンジュゲートの分析対象物質への結合、並びに（ｉｖ）第２のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質又は分析対象物質－干渉物質複合体への結合、並びに任意選択的に（ｖ）第４の特異的結合メンバーの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合；（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質の存在を検出するステップを含む。
別の態様では、方法は、（ａ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を上記のキットのいずれか１つと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合、（ｉｉ）第１のコンジュゲートの分析対象物質への結合及び第１のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合、並びに（ｉｖ）第２のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合、並びに任意選択的に（ｖ）第４の特異的結合メンバーの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合；（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質の存在を検出するステップを含む。
別の態様では、方法は、（ａ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を上記のキットのいずれか１つと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの特異的又は非特異的結合、（ｉｉ）分析対象物質の検出に干渉する物質の固体支持体表面への特異的又は非特異的結合、（ｉｉｉ）第１のコンジュゲートの分析対象物質への結合及び分析対象物質の検出に干渉する物質の第１のコンジュゲートへの特異的又は非特異的結合、それによる検出に利用可能な第１のコンジュゲートの量の増加、（ｉｖ）第２のコンジュゲートの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合、並びに（ｖ）第４の特異的結合メンバーの分析対象物質の検出に干渉する物質への結合；（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質の存在を検出するステップを含む。
以上に論じたように、干渉物質がビオチン分子である実施形態では、干渉するビオチン分子を検出する方法は、（ａ）干渉するビオチン分子が存在しない場合に、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に結合している第１の検出可能な標識の標準シグナル強度（Ｒ値）を確立するステップ、（ｂ）分析対象物質及び分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子を両方含むと疑われる試料を上記キットと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：（ｉ）分析対象物質の第１の特異的結合メンバーへの結合による第１の複合体の形成、（ｉｉ）コンジュゲートの第１の特異的結合メンバーに結合している分析対象物質への結合による免疫複合体の形成、並びに（ｉｉｉ）ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体の第１の特異的結合メンバーに付着しているビオチン分子及び試料中の分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子への結合；（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、（ｄ）第２の検出可能な標識のシグナル強度に対する補正を行うステップ、並びに（ｅ）試料中の分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子の存在を検出するステップを含む。
開示されたキットと関連させて以上に記載された特異的結合メンバー、コンジュゲート、干渉物質、キット、分析対象物質、及びそれらの成分の説明は、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出する方法にも適用可能である。
一部の実施形態では、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート（例えば、本明細書に開示される式（ＩＩ）の第１及び第２のコンジュゲート）は、同一の反応混合物中の試験試料と接触され得る。しかし、他の実施形態では、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートは、異なる反応混合物中の試験試料と接触され得る。ある特定の実施形態では、第１及び第２の結合メンバーは、第１及び第２のコンジュゲートの一部分である検出抗体として使用される。この点に関しては、第１及び第２のコンジュゲートは、識別可能な分光学的特性（例えば、異なる波長の化学発光シグナル）を有する異なる検出可能な標識を含む。第１及び第２の特異的結合メンバーから生じたシグナルは、それらの分光学的特性に基づいて別々に測定され得る。ある特定の実施形態では、第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識のシグナル強度を比較することは、第１の検出可能な標識のシグナル強度と第２の検出可能な標識のシグナル強度の比を決定するステップを含む。
干渉物質がビオチンであるとき、方法は、まず干渉するビオチン分子が存在しない場合に、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に結合している第１の検出可能な標識の標準シグナル強度（「Ｒ値」と呼ばれる）を確立するステップを含む。Ｒ値が試料において検出された第１の検出可能な標識に由来するシグナルと等しい場合、試料は、ビオチン干渉物質を含まないと認識される。第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度の検出後に、干渉するビオチンの量は、第２の検出可能な標識のシグナル強度に対する補正を行うことによって決まる。そのようなシグナルの補正は、例えば、第２の検出可能な標識のシグナル強度にＲ値と第１の検出可能な標識のシグナル強度との比を掛けることによって達成され得る。
ダイナミックレンジを拡大し、フック効果を低減する方法
本開示は、イムノアッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、（ａ）分析対象物質を含むと疑われる試験試料を上記キットと接触させるステップであって、分析対象物質が、第３の特異的結合メンバーに結合する、ステップ、（ｂ）第３の特異的結合メンバーに結合していない分析対象物質を洗浄することによって除去するステップ、（ｃ）第１のコンジュゲートを分析対象物質に結合させ、第２のコンジュゲートを分析対象物質に結合させるステップであって、第１及び第２のコンジュゲートが分析対象物質に同時には結合しない、ステップ、（ｄ）分析対象物質に結合していない第１及び第２のコンジュゲートを洗浄することによって除去するステップ、（ｅ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を測定するステップ、並びに（ｆ）フラグ値に基づいて第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識のシグナル強度を比較することによって、分析対象物質の濃度を決定し、それによってイムノアッセイのダイナミックレンジが拡大されるステップを含む方法も提供する。
本開示は、フック効果を低減し、イムノアッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、（ａ）分析対象物質を含むと疑われる試験試料を上記のキットと接触させるステップであって、分析対象物質が、第３の特異的結合メンバーに結合し、第１のコンジュゲートが、分析対象物質に結合する、ステップ、（ｂ）結合していない分析対象物質及び結合していない第１のコンジュゲートをいずれも洗浄することによって除去するステップ、（ｃ）第２のコンジュゲートを分析対象物質に結合させるステップであって、第１及び第２のコンジュゲートが分析対象物質に同時には結合しない、ステップ、（ｄ）結合していない第２のコンジュゲートをいずれも洗浄することによって除去するステップ、（ｅ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を測定するステップ、並びに（ｆ）フラグ値に基づいて分析対象物質の濃度を決定し、それによってイムノアッセイのフック効果が低減され、ダイナミックレンジが拡大されるステップを含む方法も提供する。
開示されたキットと関連させて以上に記載された特異的結合メンバー、コンジュゲート、キット、分析対象物質、及びそれらの成分の説明は、イムノアッセイのダイナミックレンジを拡大し、フック効果を低減する方法にも適用可能である。
一般に、本明細書に記載されるダイナミックレンジを拡大するアッセイ及び方法は、サンドイッチアッセイにおいて３つの特異的結合メンバーを利用して、１ステップアッセイにおける「フック効果」を無くし、又は２ステップアッセイにおける線状アッセイダイナミックレンジを拡大することを必要とする。３つの特異的結合メンバーのうち２つは、検出のために使用されるが、それらの分析対象物質に対する相対的結合親和性は、例えば本明細書にさらに記載されるように異なることがあり、第１及び第２の特異的結合メンバーは、独立に分析対象物質を介して第３の特異的結合メンバーに結合する。一部の実施形態では、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲート（例えば、本明細書に開示される式（ＩＩ）の第１及び第２のコンジュゲート）は、同一の反応混合物中の試験試料と接触され得る。しかし、他の実施形態では、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートは、異なる反応混合物中の試験試料と接触され得る。どちらにしても、第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートは、約１００倍未満異なる所定のモル量で存在することが理想的である。一部の実施形態では、第１の分析対象物質結合分子及び第２の分析対象物質結合分子は、約１００倍未満（例えば、約１０倍～約１００倍、約１０倍～約５０倍、約６０倍～約１００倍、約２５倍、約５０倍、又は約７５倍）異なる所定のモル量で存在する。一部の実施形態では、アッセイのダイナミックレンジは、３桁以上（例えば、４、５、６、７、８、９、１０桁以上）を含む。
１ステップアッセイに関して、ある特定の実施形態では、第１及び第２の結合メンバーは、第１及び第２のコンジュゲートの一部分である検出抗体として使用される。この点に関して、第１及び第２のコンジュゲートは、識別可能な分光学的特性（例えば、異なる波長の化学発光シグナル）を有する異なる検出可能な標識を含む。第１及び第２の分析対象物質結合分子から生じたシグナルは、それらの分光学的特性に基づいて別々に測定され得る。第１及び第２の分析対象物質結合分子から得られたシグナルは、濃度決定のための較正曲線の正確な区分を選択するために指標としても使用され得る。この点に関して、第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識のシグナル強度を測定することは、分析対象物質濃度の所定の範囲にわたって較正アッセイを行うステップを含むことができ、方法は、フラグ値を確立するステップをさらに含む。フラグ値は、第１のコンジュゲートに由来する較正曲線の上行部分と下行部分を分離する変曲点であり、くぼみがマイナスからプラスに変化する。
１ステップアッセイでは、試験試料中の第２の検出可能な標識のシグナル強度がフラグ値以上であるとき、第１の検出可能な標識のシグナル強度に由来する較正曲線の下行部分を使用して、分析対象物質濃度が決定される。あるいは、試験試料中の第２の検出可能な標識のシグナル強度がフラグ値未満であるとき、第１の検出可能な標識のシグナル強度に由来する較正曲線の上行部分を使用して、分析対象物質濃度が決定される。２ステップアッセイでは、第２の検出可能な標識のシグナル強度がフラグ値未満であるとき、第１の検出可能な標識のシグナル強度に由来する較正曲線を使用して、分析対象物質濃度が決定される。あるいは、第２の検出可能な標識のシグナル強度がフラグ値より高いとき、第２の検出可能な標識のシグナル強度に由来する較正曲線を使用して、分析対象物質濃度が決定される。
分析対象物質分析
試料中に存在する目的の分析対象物質の量は、当技術分野において公知であるいずれか好適な方法を使用して決定（例えば、定量）され得る。以上に論じたように、第１及び第２の検出可能な標識から生じたシグナルは、それらの分光学的特性に基づいて別々に定量及び分析を行うことができる。他の実施形態では、第１及び第２の検出可能な標識から生じたシグナルは、第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識のシグナル強度を比較することによって（例えば、第１の検出可能な標識のシグナル強度と第２の検出可能な標識のシグナル強度の比を決定することによって）、定量及び分析を行うことができる。
本明細書で論じられるように、第１及び第２のコンジュゲートの少なくとも１つは、硬質なジアミンリンカーを介してリンクされたアクリジニウム部分とフルオロフォアを含む化合物で検出可能に標識されている。したがって、アクリジニウム部分の化学発光誘発時に、光出力は、付着しているフルオロフォアの発光波長にシフトされ得る。均一化学発光アッセイにおける検出可能な標識としてのアクリジニウム化合物の使用は、例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、１６：１３２４－１３２８（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、４：２３１３－２３１７（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ，、１４：３９１７－３９２１（２００４）；及びＡｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ．、５：３７７９－３７８２（２００３））に記載されている。一実施形態では、アクリジニウム部分の化学発光誘発は、検出ステップより前に、過酸化水素を生体試料に添加するものである。過酸化水素は、上記コンジュゲートを含む特異的結合メンバーの添加の前に、それと同時に、又はその後に、生体試料に提供され得る又は供給され得る。過酸化水素の供給源は、過酸化水素を含むことが公知である１つ以上の緩衝剤又は他の溶液とすることができる。この点に関して、過酸化水素の溶液を生体試料に添加するだけでよい。
それぞれの特異的結合メンバーに由来する蛍光又は化学発光シグナルは、光電子増倍管（ＰＭＴ）、光ダイオードアレイ、又は電荷結合素子カメラに限定されないがこれらを含めて、当技術分野において公知であるいずれか好適なデバイスを使用して、可視化及び区別を行うことができる。一部の実施形態では、これらのデバイスに、１波長ごとに区別することができるフィルターを装着することができる。例えば、２チャネルの検出を伴う光電子増倍管は、異なるカラーの化学発光磁性マイクロ粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）コンジュゲートを使用するマルチプレックスアッセイに利用され得る。そのような２チャネルシステムは、単色のＣＭＩＡ検出のダイナミックレンジも広げることができる。ＰＭＴの１つを低ゲイン／低減された増幅に設定することによって、又は例えば光の約９９％をブロックする減光フィルターを挿入し、第２のＰＭＴを標準高ゲインにしておくことによって、単一光子検出感度は、１つだけのＰＭＴと比較して何桁も大きい組み合わされたダイナミックレンジをカバーすることができる。
一部の実施形態では、実質的に正確に決定され得る試料中の分析対象物質の濃度は、約５０００ｆＭ未満（フェムトモル濃度）、約３０００ｆＭ未満、約２０００ｆＭ未満、約１０００ｆＭ未満、約５００ｆＭ未満、約３００ｆＭ未満、約２００ｆＭ未満、約１００ｆＭ未満、約５０ｆＭ未満、約２５ｆＭ未満、約１０ｆＭ未満、約５ｆＭ未満、約２ｆＭ未満、約１ｆＭ未満、約５００ａＭ未満（アトモル濃度）、約１００ａＭ未満、約１０ａＭ未満、約５ａＭ未満、約１ａＭ未満、約０．１ａＭ未満、約５００ｚＭ未満（ゼプトモル濃度）、約１００ｚＭ未満、約１０ｚＭ未満、約５ｚＭ未満、約１ｚＭ未満、約０．１ｚＭ未満、又はそれ以下である。例えば、実質的に正確に決定され得る試料中の分析対象物質の濃度は、約５０００ｆＭ～約０．１ｆＭ、約３０００ｆＭ～約０．１ｆＭ、約１０００ｆＭ～約０．１ｆＭ、約１０００ｆＭ～約０．１ｚＭ、約１００ｆＭ～約１ｚＭ、約１００ａＭ～約０．１ｚＭ、又は上記の値のうちの２つのいずれかによって定義される範囲である。
一部の実施形態では、下方の検出限界（例えば、溶液状態で決定され得る分析対象物質の最低濃度）は、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、約１ｆＭ、約５００ａＭ（アトモル濃度）、約１００ａＭ、約５０ａＭ、約１０ａＭ、約５ａＭ、約１ａＭ、約０．１ａＭ、約５００ｚＭ（ゼプトモル濃度）、約１００ｚＭ、約５０ｚＭ、約１０ｚＭ、約５ｚＭ、約１ｚＭ、約０．１ｚＭ以下である。
上方の検出限界（例えば、溶液状態で決定され得る分析対象物質の上方濃度）は、少なくとも約１００ｆＭ、少なくとも約１０００ｆＭ、少なくとも約１０ｐＭ（ピコモル濃度）、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１０ｎＭ（ナノモル濃度）、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１０００ｎＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１０００μＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１０００ｍＭ、又はそれ以上とすることができる。
場合によって、試料中の分析対象物質の存在及び／又は濃度は、通常約１時間未満、例えば４５分、３０分、１５分、１０分、５分、１分、又は３０秒で迅速に検出され得る。
特定の機器用のキット及び方法の改変
本明細書に記載される概念、キット、及び方法は、任意の手動、自動化又は半自動化システムを含めて任意のシステム又は機器で実行され得る。理想的に、方法は、自動化又は半自動化システムを使用して行われる。開示された方法を実施するための例示的な改変及びシステムを以下に記載する。
本明細書に記載されるキット（又はその成分）、及び試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出する方法は、（固体支持体が電極又はマイクロ粒子を含むものを含めて）様々な自動化及び半自動化システムにおける使用向けに改変され得る。例示的な自動化及び半自動化システムについては、例えば米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載されており、例えばＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， Ｉｌｌ．）によってＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）として市販されている。本明細書に記載されるキット（又はその成分）及び方法は、例えば１ステップ、ディレイ１ステップ、２ステップ、競合、直接、及び間接フォーマット（及びそれらの組合せ）など様々なアッセイフォーマットにおける使用向けにも改変され得る。直接フォーマット（例えば、直接ＥＬＩＳＡ）では、分析対象物質（例えば、抗原）が固体支持体（例えば、マルチウェルプレート）に固定化されている。次いで、分析対象物質は、検出可能な標識（例えば、酵素）に直接コンジュゲートしている抗体で検出される。間接フォーマット（例えば、及び間接ＥＬＩＳＡ）は、２ステップ方法を使用して、分析対象物質（例えば、抗原）を固体支持体に吸着させ、分析対象物質を検出するものである。最初に、非標識一次抗体が特異的分析対象物質に結合する。次に、一次抗体の宿主種に対して作られた二次抗体にコンジュゲートしている検出可能な標識（例えば、酵素）が適用される。
自動化又は半自動化システムを非自動化システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した差の一部としては、捕捉特異的結合メンバー（例えば、本明細書に記載される第３の特異的結合メンバー）が付着されている（サンドイッチ形成及び分析対象物質反応性に影響を及ぼすことがある）基材、並びに捕捉、検出、及び／又はいずれか任意選択の洗浄ステップの長さ及びタイミングが挙げられる。ＥＬＩＳＡなどの非自動化フォーマットでは、試料と捕捉試薬のインキュベーション時間が比較的長く（例えば、約２時間）必要とされ得るが、自動化又は半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）では、比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）の場合約１８分）とすることができる。同様に、ＥＬＩＳＡなどの非自動化フォーマットは、検出特異的結合メンバー（例えば、本明細書に記載される第１及び第２のコンジュゲートのそれぞれ第１及び第２の検出可能な標識）を比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）インキュベートすることがあるが、自動化又は半自動化フォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標））は、比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）の場合約４分）とすることができる。
開示された方法と関連させて使用され得る、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手可能な他のプラットフォームとしては、ＡＸＳＹＭ（登録商標）、ＩＭＸ（登録商標）（例えば、米国特許第５，２９４，４０４号を参照のこと）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）、及びＱＵＡＮＴＵＭ（商標）ＩＩ、並びに他のプラットフォームが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本明細書に記載されるアッセイ、キット、及びキット構成要素は、他のフォーマットにおいて、例えば電気化学的又は他のハンドヘルド若しくはポイントオブケアアッセイシステムで利用され得る。本開示は、例えば、サンドイッチアッセイを行う市販のＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（Ｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）電気化学的アッセイシステムに適用可能である。シングルユースの試験デバイスにおける免疫センサー及びそれらの製造及び操作方法については、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、並びに米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、同第２００４／００１８５７７号、同第２００５／００５４０７８号、及び同第２００６／０１６０１６４号に記載されている。
特に、アッセイのＩ－ＳＴＡＴ（登録商標）システムへの改変に関して、以下の構成が有用であり得る。微細加工シリコンチップは、一対の金電流測定作用電極、及び銀－塩化銀参照電極を用いて製造される。作用電極の１つにおいて、固定化された高親和性捕捉分析対象物質結合分子を有するポリスチレンビーズ（直径０．２ｍｍ）は、電極にパターン形成されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに接着されている。固定化された低親和性捕捉分析対象物質結合分子は、第２の電極に接着されている。このチップは、アッセイに適した流体フォーマットのＩ－ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジに組み立てられる。カートリッジの試料保持チャンバの壁の一部分に、アルカリホスファターゼ（又は他の標識）で標識されている検出分析対象物質結合分子を含む層が存在する。カートリッジの流体パウチ内に、ｐ－アミノフェノールホスフェートを含む水性試薬がある。
操作中に、分析対象物質を含む試料が、試験カートリッジの保持チャンバに添加され、カートリッジがＩ－ＳＴＡＴ（登録商標）読み取り装置に挿入される。検出特異的結合メンバー（例えば、第１又は第２のコンジュゲートのそれぞれ第１又は第２の特異的結合メンバー）が試料に溶解した後、カートリッジ内のポンプ構成要素が、試料を、チップを含む導管に押し込む。この場合、それは、捕捉特異的結合メンバー（例えば、本明細書に記載される第３の特異的結合メンバー）、分析対象物質、及び標識された検出特異的結合メンバーの間でサンドイッチの形成を促進するように往復される。アッセイの最後から２番目のステップでは、流体は、パウチから押し出され、導管に押し込まれて、試料をチップから洗い落とし、廃棄物チャンバに洗い流す。アッセイの最終ステップで、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ－アミノフェノールホスフェートと反応して、ホスフェート基を切断し、遊離されたｐ－アミノフェノールが作用電極において電気化学酸化されることが可能になる。測定された電流に基づいて、リーダーが、組込みアルゴリズム及び工場で決定された較正曲線によって試料中の分析対象物質の量を計算することができる。
本明細書に記載される方法及びキットは、他の試薬を含むことができ、特定のアッセイを実施する追加のステップを必要とすることがある。例えば、様々な緩衝剤は、例えば洗浄するためにコンジュゲート希釈剤及び／又は較正希釈剤として利用されるように容易に調製され得る又は最適化され得る。例示的なコンジュゲート希釈剤は、いくつかのキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， Ｉｌｌ．）で利用され、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッカー、抗菌剤、及び洗浄剤を含むＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）コンジュゲート希釈剤である。例示的な較正希釈剤は、いくつかのキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， Ｉｌｌ．）で利用されるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ヒト較正希釈剤であり、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッカー、及び抗菌剤を含む緩衝剤を含む。さらに、米国特許第８，４４５，１９９号、同第９，２０７，２４６号、及び同第９，９６４，５３７号に記載されているように、シグナル生成は、例えばＩ－ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジフォーマットで、シグナル増幅装置として検出可能な標識又は検出特異的結合メンバーにリンクされている核酸配列を使用して改良され得る。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）デバイスなどのマイクロ流体デバイスを使用して行われ得る。例えば、国際出願第２００７／１３６３８６号、同第２００９／１１１４３１号、同第２０１０／０４０２２７号、同第２０１１／１３７５３３号、同第２０１３／０６６４４１号、同第２０１４／０６２５５１号、同第２０１４／０６６７０４号、及び米国特許第８，２８７，８０８号に記載されているものなど当技術分野において公知であるいずれか好適なマイクロ流体デバイスを使用して、本明細書に記載される方法を行うことができる。ある特定の場合に、デバイスは、分析対象物質分析が分析対象物質を含む又は含むと疑われる試料の小滴で実施され得るラボオンチップデバイスとすることができる。
上記のデバイスの多くが、目的の分析対象物質の１分子の検出を可能にする。目的の１つ以上の分析対象物質の１分子検出を可能にする、当技術分野において公知である他のデバイス及びシステムも、本明細書に記載される方法で使用され得る。そのようなデバイス及びシステムとしては、例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ ＳＩＭＯＡ（商標）（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）技術、Ｓｉｎｇｕｌｅｘの１分子カウント（ＳＭＣ（商標））技術（Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ、例えば米国特許第９，２３９，２８４号を参照のこと）、並びに例えば米国特許出願公開第２０１７／０１５３２４８号及び同第２０１８／００１７５５２号に記載されているデバイスが挙げられる。
一般に、本キット及び方法は、任意の目的、例えば、様々な用途の中でもとりわけ、患者の治療的／予防的処置の有効性を診断する、予後判定する、又は評価する目的に利用され得る。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、言うまでもなく、その範囲を限定するものと解釈すべきでない。
［実施例１］
Figure 2022543619000017
１．０ｇ（１．７ミリモル）のＣＰＳＰ－アクリジニウム（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、６３巻、５６３６～５６３９頁）を、２５ｍＬの塩化メチレン（ＤＣＭ）中の２ｍＬの［ＣＯＣｌ］２（２３ミリモル）で処理し、これに続いて５μＬのジメチルホルムアミドを添加した。スラリーを室温で２時間撹拌し、黄色の溶液を得た。この後、揮発性成分を、真空下、回転式エバポレーターで反応物から除去して、二酸クロリドを黄色の粘着性泡状物質として得た。残渣をＤＣＭ（２５ｍＬ）に再溶解した。フッ化水素カリウムの飽和水性溶液（１５ｍＬ）を調製し、ＤＣＭ溶液に加えた。２相系を２時間激しく撹拌した。この後、反応物の上側の水相をピペットで除去し、下側のＤＣＭ層を回転式エバポレーターで、真空下で蒸発させた。生成した黄色の固体を水（約２５ｍＬ）に懸濁させ、Ｂｕｃｈｎｅｒ漏斗を介して濾過した。固体を少ない分量の冷水（約６５ｍＬ）で洗浄した。収量１．０８ｇの黄色の固体。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ２８Ｈ２８ＦＮ２Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：５８７．１３；分子量：５８７．６６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値５８７．３９。
［実施例２］
Figure 2022543619000018
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた２５ｍＬ丸底フラスコに、０．１ｇ（０．１７ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（１０ｍＬ）を投入し、次いで０．１４ｇ（１．７ｍｍｏｌ）のピペラジンを黄色のスラリーに一度に加えると、透明な溶液が生じた。反応物を室温で５．５日間撹拌した。この後、乳状の白色スラリーを得た。反応物を真空下で蒸発乾固し、固体を水（５ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）及び１Ｎ ＨＣｌ（２ｍＬ）に溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、生成した溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡを使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を、回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．１６３ｇの黄色のガラス状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３２Ｈ３７Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６５３．２１；分子量：６５３．７９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６５３．３３。
［実施例３］
Figure 2022543619000019
実施例２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．１ｇ（０．１７ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（５ｍＬ）及び０．０５７ｍＬ（０．８５ｍｍｏｌ）のエチレンジアミン（ＥＤＡ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．０２７ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３０Ｈ３５Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６２７．１９４２；分子量：６２７．７５１０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６２７．４３。
［実施例４］
Figure 2022543619000020
実施例２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０２６ｇ（０．０４４ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（５ｍＬ）及び０．１ｍＬ（０．４５ｍｍｏｌ）の４，７，１０－トリオキサ－１，１３－トリデカンジアミンを利用して、表題化合物を調製した。収量０．０１８ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３８Ｈ５１Ｎ４Ｏ１０Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７８７．３０４１；分子量：７８７．９６１８。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７８７．５３。
［実施例５］
Figure 2022543619000021
実施例２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０３ｇ（０．０５１ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（１ｍＬ）及び０．１ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）の１，８－ビス（メチルアミノ）－３，６－ジオキサオクタンを利用して、表題化合物を調製した。収量０．０１６ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３６Ｈ４７Ｎ４Ｏ９Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７４３．２７７９；分子量：７４３．９０９２。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７４３．３９。
［実施例６］
Figure 2022543619000022
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．３４ｍＬ、２ｍｍｏｌ）を投入し、次いで（１Ｓ，４Ｓ）－（＋）－２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタンジヒドロブロミド（０．１４ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応物を室温で２日間撹拌した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００８４ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３３Ｈ３７Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６６５．２０９８；分子量：６６５．７９８９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６６５．２０。
［実施例７］
Figure 2022543619000023
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を投入し、次いで（ｃｉｓ－ラセミ０－ｔｅｒｔ－ブチルヘキサヒドロピロロ［３，４－ｃ］ピロール－２（１Ｈ）－カルボキシレート（０．０５５ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を黄色のスラリーに一度に加えた。反応物を室温で１８時間撹拌した。窒素流を使用して、反応物を蒸発乾固し、次いで少量のＭｅＯＨに溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．０２０５ｇの黄色のフィルム状物質（Ｂｏｃ保護されたアミン中間体）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３９Ｈ４７Ｎ４Ｏ９Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７７９．２７７９；分子量：７７９．９４１３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７７９．１６。
磁気撹拌棒を備えた４ｍＬバイアルに、Ｂｏｃ保護したアミン中間体及びＤＣＭ（０．５ｍＬ）を投入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．５ｍＬ）を加え、混合物をＲＴで１時間撹拌した。窒素流を使用して、反応物を終夜蒸発乾固した。粗生成物を少量のＭｅＯＨに溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．０１７５ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３４Ｈ３９Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６７９．２２５５；分子量：６７９．８２５５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６７９．２４。
［実施例８］
Figure 2022543619000024
実施例７の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、５－Ｂｏｃ－オクタヒドロ－ピロロ［３，４－ｃ］ピリジン（０．０１ｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（アミンカップリングに０．５ｍＬ及び脱保護ステップに０．５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（アミンカップリング用、０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）、及びＴＦＡ（Ｂｏｃ脱保護用、０．５ｍＬ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００７４ｇの黄色のフィルム状物質（Ｂｏｃ保護されたアミン中間体）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４０Ｈ４９Ｎ４Ｏ９Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７９３．２９３５；分子量：７９３．９６７９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７９３．２０。
収量０．００７７ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３５Ｈ４１Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６９３．２４１１；分子量：６９３．８５２１。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６９３．２０。
［実施例９］
Figure 2022543619000025
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を投入した。ｔｒａｎｓ－１，２－ジアミノシクロヘキサンを黄色のスラリーに一度に加えた。反応物を室温で１８時間撹拌した。窒素流を使用して反応物を蒸発乾固し、次いで少量のＭｅＯＨに溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．０１０ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３４Ｈ４１Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６８１．２４１１；分子量：６８１．８４１４。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６８１．２７。
［実施例１０］
Figure 2022543619000026
実施例９の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）及び（＋－）－ｔｒａｎｓ－１，２－ジアミノシクロヘキサン（０．０２９ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．０１５４ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３４Ｈ４１Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６８１．２４１１；分子量：６８１．８４１４。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６８１．３４。
［実施例１１］
Figure 2022543619000027
実施例９の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）及び（Ｓ，Ｓ）－（＋）－ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，２－シクロヘキサンジアミン（０．０３７ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００５６ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３６Ｈ４５Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７０９．２７２４；分子量：７０９．８９４６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７０９．２７。
［実施例１２］
Figure 2022543619000028
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．００５ｇ（０．００６５ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）及び０．０１ｇ（０．０２１ｍｍｏｌ）の（５）６－カルボキシフルオレセイン－ＮＨＳエステルの混合物を投入し、これに続いてＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で２．５日間撹拌した。数滴の水を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。反応物をＭｅＯＨ（２ｍＬ）で希釈し、２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍスチールカラムを使用して、逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空下３０℃で除去し、高真空で（１ｍｍＨｇ）２時間にわたり乾燥させた。収量：０．００１２ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０１１．２５７６；分子量：１０１２．０８８７。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０１１．３９。
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．０１２ｇの上記ステップの生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びピリジン（（０．５ｍＬ、０．６２ｍｍｏｌ）を投入した。次いで、ペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸塩（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を混合物に一度に加え、反応物を室温で１時間撹拌した。揮発性成分を真空下で混合物から除去し、残渣を１：１エーテル－ヘキサンで５×粉砕し、トレース揮発性成分を高真空で（１ｍｍＨｇ）で２時間にわたり除去した。収量０．００８ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物、Ｒ＝－Ｏ－ペンタフルオロフェニル）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５９Ｈ４６Ｆ５Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１１７７．２４１７；分子量：１１７８．１３７０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１７７．２１。次の反応及びコンジュゲーション用に生成物を２つの等しい部分に分割した。
最後のステップからの０．００４ｇのペンタフルオロフェニルエステル生成物をＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解した。次いで、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中アジド－ｄＰＥＧ３－アミン（０．１ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。揮発性成分を、窒素流の下で１８時間にわたり反応混合物から除去した。反応混合物をＭｅＯＨ（１ｍＬ）及び水（１ｍＬ）で希釈し、２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍスチールカラムで溶出させることにより、逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空下３０℃で除去し、高真空で（１ｍｍＨｇ）１８時間にわたり乾燥させた。収量０．００７ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物、Ｒ＝－Ｏ－ＰＥＧ－アジド）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６１Ｈ６３Ｎ８Ｏ１５Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１２１１．３８４９；分子量：１２１２．３２７０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２１１．４７。
［実施例１３］
Figure 2022543619000029
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０３９ｇ（０．０４９ｍｍｏｌ）の実施例３の生成物、ＤＭＦ（２．０ｍＬ）、０．０２８ｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の（５）６－カルボキシフルオレセイン－ＮＨＳエステル及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）の混合物を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００８ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５１Ｈ４５Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：９８５．２４１９；分子量：９８６．０５１５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９８５．４９。
［実施例１４］
Figure 2022543619000030
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０３ｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００１８ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０１１．２５７６；分子量：１０１２．０８８７。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０１１．３８。
［実施例１５］
Figure 2022543619000031
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０３ｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）の６－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（６－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００２９ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０１１．２５７６；分子量：１０１２．０８８７。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０１１．４５。
［実施例１６］
Figure 2022543619000032
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０１１ｇ（０．０２１ｍｍｏｌ）の（５）６－ＴＡＭＲＡ－ＮＨＳエステル及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）の混合物を利用して表題化合物を調製した。個々の生成物異性体を精製中に分離した。収量、画分９から異性体Ａ：０．００２ｇの紫色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５７Ｈ５７Ｎ６Ｏ１１Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０６５．３５２１；分子量：１０６６．２２５５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６５．５５（弱）；Ｍ＋＋５３３．４５（強）。
収量、画分１０から異性体Ｂ：０．００２ｇ紫フィルム状物質を生成（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５７Ｈ５７Ｎ６Ｏ１１Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０６５．３５２１；分子量：１０６６．２２５５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６５．４８（弱）；Ｍ＋＋５３３．４５（強）。
［実施例１７］
Figure 2022543619000033
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１ｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）の実施例４の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０１４ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の６－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（６－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから調製）及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００５ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５９Ｈ６１Ｎ４Ｏ１６Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１１４５．３５１８；分子量：１１４６．２６２３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１４５．３０。
［実施例１８］
Figure 2022543619000034
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００４９ｇ（０．００５７ｍｍｏｌ）の実施例５の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０１ｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）のローダミンＢ－ＰＦＰエステル（ローダミンＢ及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから調製）及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を利用して表題化合物を調製した。収量０．００１６ｇの紫色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６４Ｈ７５Ｎ６Ｏ１１Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１１６７．４９；分子量：１１６８．４５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１６７．６１。
［実施例１９］
Figure 2022543619000035
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００４２ｇ（０．００５４ｍｍｏｌ）の実施例６の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００４８ｇのオレンジ色の黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５４Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０２３．２５７６；分子量：１０２４．０９９４。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０２３．２２。
［実施例２０］
Figure 2022543619000036
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００４５ｇ（０．００５ｍｍｏｌ）の実施例７の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００３３ｇのオレンジ色－黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５５Ｈ４９Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０３７．２７３２；分子量：１０３８．１２６０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０３７．１８。
［実施例２１］
Figure 2022543619000037
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００３８ｇ（０．００４２ｍｍｏｌ）の実施例８の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００２３ｇのオレンジ色－黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５４Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０５１．２８８９；分子量：１０５２．１５２６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０５１．３０。
［実施例２２］
Figure 2022543619000038
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００５ｇ（０．００６３ｍｍｏｌ）の実施例９の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００４２ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５５Ｈ５１Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０３９．２８８９；分子量：１０４０．１４１９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０３９．２９。
［実施例２３］
Figure 2022543619000039
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して０．００５７ｇ（０．００７２ｍｍｏｌ）の実施例１０の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００２４ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５５Ｈ５１Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０３９．２８８９；分子量：１０４０．１４１９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０３９．２１。
［実施例２４］
Figure 2022543619000040
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して０．００３ｇ（０．００３６ｍｍｏｌ）の実施例１１の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．０００６ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５７Ｈ５５Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０６７．３２；分子量：１０６８．２０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６７．１４。
［実施例２５］
Figure 2022543619000041
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００６ｇ（０．００８ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）のローダミンＢ－ＰＦＰエステル（ローダミンＢ及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから調製）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００３１ｇの紫色のフィルム状物質を（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６０Ｈ６５Ｎ６Ｏ９Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０７７．４２；分子量：１０７８．３３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０７７．５１。
［実施例２６］
Figure 2022543619000042
ＣＰ－アクリジンメチルエステル（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、６３巻、５６３６～５６３９頁）（０．０１２ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）及び５－（ヨードアセトアミド）フルオレセイン（０．０１５ｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）を、窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコ内で混合した。溶媒なしで、フラスコを油浴内で、１６０～１７０℃で１５分間加熱した。この後ＬＣＭＳは、構成成分として、出発材料が両方とも並びに表題化合物が存在する複合混合物を示した。反応物をＤＭＦ／ＭｅＯＨ／水（それぞれ約０．５ｍＬ）中に溶解させ、２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍスチールカラムを使用して、逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ギ酸で使用した。揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空下３０℃で除去し、高真空で（１ｍｍＨｇ）２４時間にわたり乾燥させた。収量０．０００７ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４８Ｈ３８Ｎ３Ｏ１１Ｓ＋に対する計算値：正確な質量：８６４．２２２２；分子量：８６４．８９３３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値８６４．４３。
［実施例２７］
Figure 2022543619000043
実施例２６の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１２ｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）のＣＰ－アクリジニウムメチルエステル及び０．００６ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）の６－（ヨードアセトアミド）フルオレセインを利用して、表題化合物を調製した。収量０．００１１ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４８Ｈ３８Ｎ３Ｏ１１Ｓ＋に対する計算値：正確な質量：８６４．２２２２；分子量：８６４．８９３３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値８６４．５１。
［実施例２８］
Figure 2022543619000044
上記化合物は、
Figure 2022543619000045
 から調製した。
ＳＰＣＮ（０．０４８ｇ）、（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００３年、５巻（２１号）、３７７９頁）を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した。０．１２８ｍＬのＤＩＥＡを加え、これに続いてＰｙＡＯＰ（０．０３２ｇ）を加えた。反応物を周辺温度で５分間撹拌した（予備活性化）。０．０３２ｇの５－アセトアミドアミノフルオレセイン（５－ＡＡＦ）（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９２年、４巻（４号）、８７９～８４頁）を１ｍＬのＤＭＦ及び０．０６４ｍＬのＤＩＥＡに溶解した。５－ＡＡＦ溶液をＳＰＣＮ溶液に加えた。１８時間後、反応物を３ｍＬの水で処理した。溶液をＹＭＣ ＯＤＳ－ＡＱカラム（４０×１００）に直接注入することにより、溶液をＨＰＬＣで精製した。４５ｍＬ／分で、５～４０％アセトニトリルの勾配で７０分間にわたり溶出した（移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡ）。生成物を含有する画分を凍結し、凍結乾燥した。収量０．０２６ｇ（表題化合物）。ＭＳは表題化合物と一致する。
［実施例２９］
Figure 2022543619000046
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１ｇの実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、０．００５ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）のＢＯＤＩＰＹ（商標）４９３／５０３ＮＨＳエステル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。反応物を終夜撹拌した。収量０．００２１ｇの赤色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４８Ｈ５４ＢＦ２Ｎ６Ｏ８Ｓ２＋に対する計算値；正確な質量：９５５．３５００；分子量：９５５．９２０３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９５５．３８。
［実施例３０］
Figure 2022543619000047
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１４ｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、０．００５ｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）のＢＤＰ５５８／５６８ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。反応物を終夜撹拌した。収量０．００３３ｇの紫色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４８Ｈ４８ＢＦ２Ｎ６Ｏ８Ｓ３＋に対する計算値；正確な質量：９８１．２７５１；分子量：９８１．９３２３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９８１．３３。
［実施例３１］
Figure 2022543619000048
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０３ｇ（０．０３９ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．０１ｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）のＢＤＰ ＦＬ ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）及びＤＩＥＡ（０．０２ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。反応物を終夜撹拌した。収量０．００２６ｇの赤色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４６Ｈ５０ＢＦ２Ｎ６Ｏ８Ｓ２＋に対する計算値；正確な質量：９２７．３１８７；分子量：９２７．８６６３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９２７．５２。
［実施例３２］
Figure 2022543619000049
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０３ｇ（０．０３９ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．０１４ｇ（０．０２７ｍｍｏｌ）のＢＤＰ ＴＲ ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）及びＤＩＥＡ（０．０２ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。反応物を終夜撹拌した。収量０．０１９ｇの青色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ５０ＢＦ２Ｎ６Ｏ９Ｓ３＋に対する計算値；正確な質量：１０５９．２８５７；分子量：１０６０．００２３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０５９．２６。
［実施例３３］
Figure 2022543619000050
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００５ｇ（０．００６９ｍｍｏｌ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２カルボン酸、０．００２９ｇのＨＢＴＵ（０．００７６ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を投入した。反応物を室温で１５分間撹拌してから、実施例２の生成物（０．０１５ｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＳＯ溶液（０．５ｍＬ）を加えた。反応物を終夜撹拌した。粗製の反応混合物をＭｅＯＨ及び水で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００２５ｇの赤色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６２Ｈ６４Ｎ６Ｏ１５Ｓ４に対する計算値：正確な質量：１２６０．３３１２；分子量：１２６１．４６１０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２６２．４２。
［実施例３４］
Figure 2022543619000051
実施例３３の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１２ｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）、０．００５ｇ（０．００５９ｍｍｏｌ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８カルボン酸、０．００２５ｇ（０．００６６ｍｍｏｌ）のＨＢＴＵ、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００２ｇの赤色のフィルム状物質（表題化合物５（６）－混合異性体）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ４８Ｎ６Ｏ１７Ｓ４に対する計算値；正確な質量：１１６８．１９５９；分子量：１１６９．２３２０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１６９．２８。
［実施例３５］
Figure 2022543619000052
実施例３３の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００８５ｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）、０．００５ｇ（０．００５ｍｍｏｌ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８カルボン酸、０．００２１ｇ（０．００５５ｍｍｏｌ）のＨＢＴＵ、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００２５ｇの紫色のフィルム状物質（表題化合物５（６）－混合異性体）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６５Ｈ６４Ｎ６Ｏ１７Ｓ４に対する計算値；正確な質量：１３２８．３２１１；分子量：１３２９．４９２０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１３３０．２４。
［実施例３６］
Figure 2022543619000053
磁気撹拌棒を備えた２０ｍＬ反応バイアルに、０．０７５ｇ（０．１７ｍｍｏｌ）のメチル－４－カルボキシ－ケイ素ローダミン（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１８年、５７巻、２４３６～２４４０頁）及び水性ＨＣｌ（１ｍＬ、６Ｍ）を投入した。内容物を９０℃に１時間加熱した。混合物を室温に冷却してから、４：１のＣＨＣｌ３：メタノール溶媒混合物で希釈した。有機層を水で洗浄し、次いでブラインで洗浄してから、硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を真空下で除去した。粗製の固体をＭｅＯＨ及び水に溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空下３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．０５４ｇの青色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ２６Ｈ２９Ｎ２Ｏ２Ｓｉ＋に対する計算値；正確な質量：４２９．１９９３；分子量：４２９．６１４５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値４２９．１９。
［実施例３７］
Figure 2022543619000054
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０２５ｇ（０．０３３ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．００９ｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の４－カルボキシ－ＳｉＲ－ＰＦＰエステル（実施例３７及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート）及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００４ｇの青色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５８Ｈ６４Ｎ６Ｏ８Ｓ２Ｓｉ２＋に対する計算値；正確な質量：１０６４．３９８５；分子量：１０６５．３８７９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６４．４４（弱）；Ｍ＋＋５３２．４６（強）。
［実施例３８］
Figure 2022543619000055
磁気撹拌棒を備えた２０ｍＬ反応バイアルに、０．３１５ｇ（０．８４ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン及び発煙硫酸（５ｍＬ、３０％遊離ＳＯ３ベース）を投入し、９０℃に１時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、次いで氷を含有するビーカーに慎重に加えてから、ＫＣｌ（１ｇ）を加えると、黄色の沈殿物が生じた。固体を濾過し、冷水及びアセトンで洗浄し、高真空下で１８時間乾燥させた。固体はさらに精製せずに次のステップで使用した。収量０．２５０ｇの黄色の固体。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ２１Ｈ１１Ｏ１３Ｓ２－に対する計算値；正確な質量：５３４．９６４７；分子量：５３５．４２６５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値５３４．９３。
［実施例３９］
Figure 2022543619000056
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００９ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、０．００９ｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の５－カルボキシ－４’，５’－ジスルホフルオレセイン－ＰＦＰエステル（実施例３８及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート）及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００７ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ５３Ｈ４５Ｎ４Ｏ１９Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：１１６９．１５６６；分子量：１１７０．１９２５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１６９．９９。
［実施例４０］
Figure 2022543619000057
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．０１３ｇ（０．０４ｍｍｏｌ）のフルオレセイン、０．０１４ｇのＨＢＴＵ（０．０３７ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を投入した。反応物を４５℃で６０分間撹拌した。次いで、溶液を室温に冷却してから、実施例２の生成物（０．０４ｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＳＯ溶液（０．５ｍＬ）を加えた。反応物を終夜撹拌した。粗製の反応混合物をＭｅＯＨ及び水で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００２ｇの赤色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５２Ｈ４７Ｎ４Ｏ１１Ｓ２＋に対する計算値；正確な質量：９６７．２６７７；分子量：９６８．０８４５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９６７．３２（弱）；Ｍ＋＋４８４．３８（強）。
［実施例４１］
Figure 2022543619000058
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１５ｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）のローダミン１９－ＮＨＳエステル（ローダミン１９及びＴＳＴＵ）及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００２ｇの赤色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５８Ｈ６２Ｎ６Ｏ９Ｓ２ ２＋に対する計算値；正確な質量：１０５０．４００９；分子量：１０５１．２８５９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０４９．３１（弱）；Ｍ＋＋５２５．４６（強）。
［実施例４２］
Figure 2022543619000059
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００６５ｇ（０．００８５ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．４ｍＬ）、０．００２ｇ（０．００３ｍｍｏｌ）のＡｔｔｏ ７００ ＮＨＳ－エステル、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００３ｇの緑色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６２Ｈ７０Ｎ７Ｏ１２Ｓ３＋に対する計算値；正確な質量：１２００．４２３９；分子量：１２０１．４５８５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２００．５６（弱）；Ｍ＋＋６００．９２（強）。
［実施例４３］
Figure 2022543619000060
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた２０ｍＬ反応バイアルに、０．２ｇ（０．３０ｍｍｏｌ）のＩＲ７８０ヨウ化物、ＤＭＦ（２ｍＬ）、及びメチルアミンのＴＨＦ（３ｍＬ、２Ｍ）中溶液を投入した。これを８０℃に１時間加熱し、この間溶液の色が緑色から青色に変わった。反応混合物を室温に冷却してから、生成物をジエチルエーテル中で粉砕した。生成物はさらに精製せずに次のステップで使用した。収量：０．１６０ｇの青色の粉末。ＭＳ（Ｍ＋）：化学式に対する計算値：Ｃ３７Ｈ４８Ｎ３＋；正確な質量：５３４．３８４３；分子量：５３４．８１１５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値５３４．３７。
［実施例４４］
Figure 2022543619000061
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた２０ｍＬ反応バイアルに、０．０２５ｇ（０．０３８ｍｍｏｌ）の実施例４３の生成物、ＤＣＭ（１０ｍＬ）、及び０．０３３ｇ（０．１１４ｍｍｏｌ）のトリホスゲンを投入した。反応混合物を氷浴内で０℃に冷却してから、０．３ｍＬのＤＩＥＡを加えた。撹拌を１時間継続してから、溶媒を真空下で除去した。次いで、粗材料に、０．０４０ｇ（０．０５２ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を投入した。反応混合物を室温で３６時間撹拌した。粗製の反応混合物をＭｅＯＨ及び水で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００４ｇの緑色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ７０Ｈ８３Ｎ７Ｏ８Ｓ２ ２＋に対する計算値；正確な質量：１２１３．５７３４；分子量：１２１４．５９３９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２１２．５０（弱）；Ｍ＋＋６０７．０５（強）。
［実施例４５］
Figure 2022543619000062
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１６５ｇ（０．０２１ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）のルシファーイエローＶＳ二リチウム塩、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００９ｇの黄色の粉末。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ５２Ｈ４９Ｎ６Ｏ１７Ｓ５ －に対する計算値；正確な質量：１１８９．１７６３；分子量：１１９０．２８９５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１８９．４２。
［実施例４６］
Figure 2022543619000063
磁気撹拌棒を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．１１０ｇ（０．３０ｍｍｏｌ）のルシファーイエロー無水物、０．１２３ｇ（１．６５ｍｍｏｌ）のグリシン、及び酢酸ナトリウム（３ｍＬ、１Ｍ）の水溶液を投入した。混合物を９０℃に加熱し、終夜撹拌した。粗製の反応混合物をＭｅＯＨ及び水で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．１２０ｇの黄色の粉末。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ１４Ｈ９Ｎ２Ｏ１０Ｓ２に対する計算値；正確な質量：４２８．９７０４；分子量：４２９．３５０５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値４２９．０５。
［実施例４７］
Figure 2022543619000064
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０８５ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．０４０ｇ（０．０７６ｍｍｏｌ）の実施例４６の生成物－ＮＨＳエステル（実施例４６及びＴＳＴＵ）及びＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．０１８ｇの黄色の粉末。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ４６Ｈ４３Ｎ６Ｏ１６Ｓ４－に対する計算値、正確な質量：１０６３．１６２４、分子量：１０６４．１１６５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６３．２４。
［実施例４８］
Figure 2022543619000065
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．０１３ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）の実施例４７の生成物、０．００５５ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）のＴＳＴＵ、ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を投入した。ミックスを室温で１時間撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．０５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．００８ｍｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ５０Ｈ４６Ｎ７Ｏ１８Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１１６０．１７８８；分子量：１１６１．１８９５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１６０．２８。
［実施例４９］
Figure 2022543619000066
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００６ｇ（０．００５２ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０２０ｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）のアミノ－ｄＰＥＧ（登録商標）４－ｔ－ブチルエステル、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を投入した。混合物を１時間撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。精製した材料を、撹拌棒を備えた４ｍＬ反応バイアルに移し、１ｍＬのＤＣＭ及び１ｍＬのＴＦＡに溶解した。混合物を１時間撹拌してから、溶媒を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。さらなる精製は必要なかった。収量：０．００８８ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ５７Ｈ６４Ｎ７Ｏ２１Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１３１０．３０４４；分子量：１３１１．４０７５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１３１０．８２。
［実施例５０］
Figure 2022543619000067
実施例４８の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００８８ｇ（０．００６７ｍｍｏｌ）の実施例４９の生成物、０．００３ｇ（０．０１０ｍｍｏｌ）のＴＳＴＵ、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。精製及び蒸発後、１０％の材料を加水分解して、カルボン酸形態に戻した。収量：０．００６ｇ。ＭＳ（－）：Ｃ６１Ｈ６７Ｎ８Ｏ２３Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１４０７．３２０７；分子量：１４０８．４８０５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１４０８．５０。
［実施例５１］
Figure 2022543619000068
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００７ｇ（０．００７２ｍｍｏｌ）の実施例２９の生成物、０．００２６ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ、０．００３６ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を投入した。反応物を終夜撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．０５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．００２５ｇ。ＭＳ（＋）：Ｃ５２Ｈ５６ＢＦ２Ｎ７Ｏ１３Ｓ３に対する計算値；正確な質量：１１３１．３１５９；分子量：１１３２．０４２８。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ－Ｆ）＋１１１２．２０。
［実施例５２］
Figure 2022543619000069
実施例５１の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００９ｇ（０．００８５ｍｍｏｌ）の実施例３２の生成物、０．００２６ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ、０．００３６ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００１３ｇ。ＭＳ（＋）：Ｃ５７Ｈ５２ＢＦ２Ｎ７Ｏ１４Ｓ４に対する計算値；正確な質量：１２３５．２５１６；分子量：１２３６．１２４８。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ－Ｆ）＋１２１６．４０。
［実施例５３］
Figure 2022543619000070
撹拌棒及び窒素入口を備えた１００ｍＬ ＲＢフラスコに、プロパルギルトリフレート（Ｊ．Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．、１９７７年、４２巻、３１０９～３１１３頁）（２０．９８ｍｍｏｌ）及びＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を投入した。この溶液に、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルピリジン（６．９６ｍＬ、３１．４５ｍｍｏｌ）を加え、これに続いてアクリジン（Ｊ．Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．、１９９８年、６３巻、５６３６～５６３９頁）（１．００ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。１０％～９０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏの勾配法を使用して、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製した。所望の画分を収集し、プールし、凍結し、凍結乾燥させて、１．２１３ｇの表題化合物を黄色の固体として生成した（定量的収量）。収量：１．２１３ｇの黄色の固体。ＭＳ（＋）：Ｃ２９Ｈ２７Ｎ２Ｏ５Ｓ＋に対する計算値；正確な質量：５１５．６；分子量：５１５．６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ）＋５１４．８５。
［実施例５４］
Figure 2022543619000071
撹拌棒及び窒素入口を備えた５０ｍＬ Ｒｂフラスコに、実施例５３の生成物（０．０１４ｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）、５－アジドフルオレセイン（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４巻、１７４２８～１７４３１頁）（０．０１０ｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ：Ｈ２Ｏ（２ｍＬ、１：１）の溶液を投入した。この混合物に、銅（ＩＩ）硫酸塩（０．００１ｇ、０．００１ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１００μＬ）中溶液を加え、これに続いてアスコルビン酸ナトリウム（０．００１ｇ、０．００５ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１００μＬ）中溶液を加え、１８時間撹拌した。混合物を、１０％～９０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏの勾配法を使用して精製した逆相ＨＰＬＣで精製した。所望の画分を収集し、凍結し、凍結乾燥して、１４ｍｇの表題化合物を生成した（５８％）。収量：０．０１４ｇ。ＭＳ（＋）：Ｃ４９Ｈ３９Ｎ５Ｏ１１Ｓ＋に対する計算値；正確な質量：８８８．２３；分子量：８８８．９２。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ）＋８８８．４６。
［実施例５５］
Figure 2022543619000072
撹拌棒及び窒素入口を備えた２５ｍＬ ＲＢフラスコに、ＣＰＳＰ（０．０２０ｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０１４ｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．００５ｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を投入した。この混合物に、ＤＩＥＡ（０．０３０ｍＬ、０．１７１ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。この混合物に、４’－アミノメチルフルオレセイン（米国特許第４，５１０，２５１号、１９８５年）（０．０３４ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）を加え、１８時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。１０％～９０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏの勾配法を使用して、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製した。所望の画分を収集し、凍結し、凍結乾燥させて、０．０１０ｇの表題化合物を黄色－オレンジ色の固体を生成した（３２％）。収量：０．０１０ｇの黄色－オレンジ色の固体。ＭＳ（＋）：Ｃ４９Ｈ４１Ｎ３Ｏ１２Ｓ２ ＋に対する計算値；正確な質量：９２７．２１；分子量：９２８．００。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ）＋９２８．５０。
［実施例５６］
Figure 2022543619000073
撹拌棒及び窒素入口を備えた２５ｍＬ ＲＢフラスコに、ＣＰＳＰ（０．０５０ｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０３６ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）、及びＨＯＢｔ（０．０１３ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を投入した。この混合物に、ＤＩＥＡ（０．０７４ｍＬ、０．４２８ｍｍｏｌ）を加え、反応物を３０分間撹拌した。この混合物に、５－アミノメチルフルオレセイン（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１９９２年、３巻、４３０～４３１頁）（０．０３４ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）を加え、１８時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。１０％～９０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏの勾配法を使用して、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製した。所望の画分を収集し、凍結乾燥して、０．０２７ｇの表題化合物を黄色－オレンジ色の固体を生成した（３４％）。収量：０．０２７ｇの黄色の－オレンジ色の固体。ＭＳ（＋）：Ｃ４９Ｈ４１Ｎ３Ｏ１２Ｓ２ ＋に対する計算値；正確な質量：９２７．２１；分子量：９２８．００。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ＋Ｈ）＋９２９．４５。
［実施例５７］
Figure 2022543619000074
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００７ｇ（０．００７２ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、０．００３ｇ（０．００３ｍｍｏｌ）のＤＴＢＴＡ－Ｅｕ３＋（Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００６年、４巻、４０８８～４０９６頁）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を投入した。反応物を終夜撹拌してから、少量のＡＣＮ／Ｈ２Ｏ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．０５ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００２ｇの薄黄色の粉末。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ７２Ｈ６５ＣｌＥｕＮ１３Ｏ１５Ｓ２ ４＋に対する計算値；正確な質量：１６０３．３０４３；分子量：１６０３．９１９８。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１６０４．６５。
［実施例５８］
Figure 2022543619000075
実施例４９の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１１ｇ（０．００９５ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０４５ｇ（０．０９０ｍｍｏｌ）のアミノ－ｄＰＥＧ（登録商標）８－ｔ－ブチルエステル、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００６ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ６５Ｈ８１Ｎ７Ｏ２５Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１４８７．４１６５；分子量：１４８８．６２７０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１４８７．７１。
［実施例５９］
Figure 2022543619000076
実施例４８の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００６ｇ（０．００６７ｍｍｏｌ）の実施例５８の生成物、０．００２ｇ（０．００６７ｍｍｏｌ）のＴＳＴＵ、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０３ｍＬ、０．１７ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００４ｇＭＳ（－）：Ｃ６９Ｈ８４Ｎ８Ｏ２７Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１５８４．４３２９；分子量：１５８５．７０００。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１５８４．７５。
［実施例６０］
Figure 2022543619000077
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００６ｇ（０．００５２ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０２５ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の３－アジド－１－プロパンアミン、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を投入した。混合物を１時間撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．００３ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ４９Ｈ５０Ｎ１０Ｏ１５Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：１１４５．２２６７；分子量：１１４６．２２６５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１４５．６３。
［実施例６１］
Figure 2022543619000078
実施例６０の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００６ｇ（０．００５２ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０３０ｇ（０．０７６ｍｍｏｌ）のアジド－ｄＰＥＧ（登録商標）７－アミン、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００４ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ６２Ｈ７６Ｎ１０Ｏ２２Ｓ４に対する計算値；正確な質量：１４４０．４０１８；分子量：１４４１．５７８０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１４４０．８２。
［実施例６２］
Figure 2022543619000079
実施例６０の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００７５ｇ（０．００６５ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０２０ｇ（０．０７６ｍｍｏｌ）のＭＰＳ－ＥＤＡ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００２ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ５５Ｈ５４Ｎ９Ｏ１８Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：１２５６．２４７５；分子量：１２５７．３２２５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２５６．５３
［実施例６３］
Figure 2022543619000080
実施例６０の調製に対して概説されている類似の手順を使用して０．００６ｇ（０．００５２ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．００５ｇ（０．００６７ｍｍｏｌ）の２－（６－アミノヘキサンアミド）－チロキシン（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１９９７年、８巻、１３３～１４５頁）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００５ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ６７Ｈ６５Ｉ３Ｎ８Ｏ２０Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：１８１０．０３３２；分子量：１８１１．２４６４。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１８１０．５９（弱）；Ｍ２－９０４．９９（強）。
［実施例６４］
Figure 2022543619000081
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００４ｇ（０．００２５ｍｍｏｌ）の実施例５９の生成物、０．００８２ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）のチロキシン、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を投入した。混合物を１時間撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．００２ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ８０Ｈ９０Ｉ３Ｎ８Ｏ２８Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：２１１９．１８８７；分子量：２１２０．５８２０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値Ｍ２－１０５９．８２
［実施例６５］
Figure 2022543619000082
実施例５０（０．００１８ｇ、０．００１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中溶液を、ビオチン－ｄＰＥＧ７－ＮＨ２（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎカタログ＃１０８２６、０．０３０ｇ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中で処理することにより表題化合物を調製した。反応物を室温で１時間撹拌した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、生成した溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。リコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）をＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収率０．００２４ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ８３Ｈ１１２Ｎ１１Ｏ２９Ｓ５ －に対する計算値；正確な質量：１８８６．６２３６；分子量：１８８８．１６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１８８７．５９。
［実施例６６］
化学発光データ
可視波長帯における全化学発光スペクトルの測定のためのプロトコル。装置：Ａｎｄｏｒ Ｓｈａｍｒｏｃｋ ３０３ｉ画像分光器、５０ライン／ｍｍでの刻線格子、６００ｎｍブレーズ、ＭｇＦ２コーティングしたアルミニウム、１００μｍ入射スリット。Ａｎｄｏｒ ｉＸｏｎＥＭ＋５１２×５１２ＣＣＤカメラ、モデルＤＵ－８９７Ｅ－ＣＳＯ－＃ＢＶ、５５０ｎｍＡＲコーティングした裏面照射型センサー。ＣＣＤ検出器チップは、１６μｍ２ピクセルを有する、電子増倍読出し付きＥ２Ｖ Ｔｅｃｈ ＣＣＤ９７。熱電冷却は－７０℃までであった。最大感受性のために、チップの大部分の範囲をカバーする、垂直線に沿ったピクセル（カラム）ビニング（スリットの画像）を選択した。分光器のソフトウエアを使用して、Ａｒ－Ｈｇペンランプのいくつかの水銀ラインにより、検出波長を較正し、検出器において得たスペクトル分散はおよそ１ｎｍ／ピクセルであった。統合は５秒であった。これは普通、化学発光の約５の減衰寿命である。ソフトウエア：Ａｎｄｏｒ Ｓｏｌｉｓ ｆｏｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｘ３９６４、バージョン４．３。試薬：Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガー溶液、６Ｅ２３－６５と洗剤、酸性、及び過酸化水素；Ａｒｃｈｉｔｅｃｔトリガー溶液、６Ｃ５５－６０と洗剤及び塩基。方法：Ｈｉ－Ｔｅｃｈ Ｒａｐｉｄ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ、モデルＳＦＡ－１１を使用して、ユーザーマニュアルに従い、チャンバ内で、２０ｍｓ未満の溶液を混合した。ホットキーによりソフトウエアデータ収集をトリガーし、２本の２．５ｍＬシリンジを手作業で押して、キュベット内で５０：５０の混合を達成した。統合の開始から混合までの遅延は０．５秒未満であると予測された。２ｍｍの経路長をもたらすようにキュベットを方向づけた。蛍光体ごとに適当な波長においてＵＶ吸光度により決定される場合、試料は通常５００ナノモル濃度で試験した。
複数波長での化学発光の照度計プレートリーダー測定に対するプロトコル。装置：Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０マイクロプレートリーダー；オプティカルフィルター、Ｓｅｍｒｏｃｋ Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｅ シングル－バンドバンドパス、多層誘電体、４４２／４６ｎｍ、５３１／４６ｎｍ；ホワイト９６ウェルプレート、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ Ｉ、Ｔｈｅｒｍｏ ６９０５。ソフトウエア：Ｍｉｋｒｏｗｉｎ ２０００ｖ．４．４１。試薬：Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガー溶液、６Ｅ２３－６５と洗剤、酸、及び過酸化水素；Ａｒｃｈｉｔｅｃｔトリガー溶液、６Ｃ５５－６０と洗剤及び塩基。Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガー溶液中の５０μＬの試験化合物を９６ウェルプレートのウェル内に配置し、各波長測定に対して別個のウェルに充填した。方法：蛍光体ごとの適当な波長における吸光度により決定される場合、試料は通常２０～２００ｐＭ濃度で試験した。照度計において、適当な波長のオプティカルフィルターを読出し用に選択した。７５μＬのＡｒｃｈｉｔｅｃｔトリガー溶液を検出直前に各ウェルに注入した。０．１秒間隔で１０秒にわたり、光カウント数を光電子増倍管により測定した。読み取り値は三重反復で測定した。上記アッセイの結果は表１に提示されている。
Figure 2022543619000083
Figure 2022543619000084
［実施例６７］
アセトアミドリンカー及びフルオレセインの単離した５カルボキシ異性体及び６カルボキシ異性体を使用して、蛍光体結合点及びリンカー長を試験した。図１に示されているデータにより、シフトした発光は、蛍光体結合点により決定され、この蛍光体結合点は、２つの種又は種の凝集の全体的方向性に違いをもたらすことができ、短いリンカー構成において発光をシフトさせる能力を変化させたことが実証されている。
フルオレセインの５及び６カルボキシ異性体を、ピペラジンリンカーを使用してさらに試験した。データは図２に示されている。シフトした発光は１００％付近の効率で観察されたが、強度の差異が５異性体部分と６異性体部分の間で観察された。強度の差異は、化学発光、若しくは好ましくない方向性を促進し、おそらくクエンチ若しくは非放射性減衰経路をもたらす化学反応の障害、又は吸光度／発光プロファイルの変化をもたらす化合物の凝集に起因し得る。これらの結果は、蛍光体結合点の選択がシフトした発光に対する重要な要素であることを表している。
５／６カルボキシローダミン染料混合物と２カルボキシローダミン染料の両方を使用して、発光効率について蛍光体結合点及びリンカー長も試験した。データは図３に示されている。５／６カルボキシローダミンは効率的なシフトした発光を示した一方で、２カルボキシローダミンは、大部分の状況で効率的なシフトした発光を示したが、リンカーの種類に応じて一部の相違があった。例えば、２－カルボキシローダミンＢはジメチル－ＰＥＧ（２）－ジアミンリンカーを介してアクリジニウムに結合した場合、効率的な安定した、シフトした発光を示したが、同じ２－カルボキシローダミンＢはピペラジン連結を介してアクリジニウムに結合した場合、測定間隔内でアクリドンの発光レベルの増加を示した。これらの知見は、構造体は利用したトリガー条件下で安定し得ないことを示唆している。対照的に、２カルボキシローダミン６Ｇは、シフトした発光が９０％のみで、１０％の青色光が観察されたが、ピペラジン連結を介してアクリジニウムに結合した場合、安定したシフトした発光を生成するようにみえた。
カルボキシプロピルスルホプロピルアクリジニウムの、スルホプロピル部分とカルボキシプロピル部分の間で蛍光体の位置を変化させて、開始剤結合点について試験した。カルボキシプロピル基への結合は、蛍光体をアクリジニウム／アクリドン分子の脱離基上に位置づける。したがって、トリガーすると、蛍光体は生成したアクリドン部分から解離する。２つのフルオレセイン化合物を、キサンテン環結合点又はフェニル環結合点を介してアクリジニウムに結合させて、２つの異なる分子の方向性を試験した。４４２ｎｍ及び５３１ｎｍフィルターを装着した照度計で発光を測定した。データは図４に示されている。カルボキシプロピル開始剤の結合を用いて調製したフルオレセイン化合物は、シフトした発光を示すことができず、アクリジニウム対照と類似の波長光を生成した。好ましいピペラジン連結でのカルボキシプロピルの修飾も試したが、アクリジニウム対照と類似の発光をもたらした。図４は、調製したカルボキシプロピル化合物の選択に対して、各フィルターチャネルにおける光の出力及び分布が、アクリジニウム対照化合物のものと合致したことを示している。
様々な長さ及び剛性のジアミンリンカーを使用して、リンカーの種類及びリンカー長を試験した。剛性リンカーは、開始剤及び受容体を、シフトした発光に対して好ましい方向性に保持することができる一方、より長いリンカーは好ましい方向性へと曲げる及び巻き付けるための柔軟性を有し得る。データは図５に示されている。シフトした発光は化合物のそれぞれに対して１００％付近の効率で観察された。しかし強度の差異がエチレンジアミンリンカーに対して観察された。強度の差異は、化学発光、又は好ましくない方向性を促進し、おそらくクエンチ又は非放射性減衰経路をもたらす化学反応の障害に起因し得る。これらのデータは、リンカーの選択がシフトした発光に対して重要な要素であり得ることを例示している。
本実施例は、いくつかの構造的要素が、シフトした波長発光を有する化学発光性アクリジニウム化合物を開発する上で重要であることを実証している。トリガー条件に対する蛍光体の安定性は有意な重要性を持つ。例えば、シアニン及びケイ素ローダミン染料のアクリジニウムへの連結は、短いシフトした発光、これに続くアクリドン発光をもたらし、これは、マトリックスをトリガーする上で起こり得る構造体の不安定さを示している。水溶性は、イムノアッセイなど、水性ベースでの使用に機能するために必要とされる別の要素である。全体として、リンカー長、蛍光体結合点、及び開始剤結合の選択は、シフトした発光を促進する。理論により限定されることを望むことなく、これら３つの基準は互いに対する蛍光体及び開始剤の方向性、したがってシフトした発光の効率を決定するようにみえる。
［実施例６８］
ＨＩＶ ｐ２４ｍＡｂ－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート。乾燥粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成することにより、実施例４８の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、吸光度を３７０ｎｍで読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇのＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを、３５μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加え、５μＬのスパイキング緩衝液（７．５％ＣＨＡＰＳを含む２５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ８）を使用してｐＨを調節して、別個の反応容器内で最終反応ｐＨ７．５及び最終ＣＨＡＰＳ濃度０．５％を達成した。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比６、９、又は１２を達成するように、実施例４８の化合物のストック溶液をそれぞれ反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、終夜およそ２０時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上で、ＨＰＬＣにより、上澄み液中に残留するタンパク質を精製した。流速１ｍＬ／分を使用し、溶出液をフォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍでモニターした。タンパク質及び実施例４８の標識濃度をＵＶ－Ｖｉｓ（それぞれ２８０及び３７０ｎｍ）で決定した。ＨＩＶ ｍＡｂのモル濃度に対して実施例４８のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に対する標識を決定した。最終ＩＲ値２．０、２．５、及び３．０を、１：６、１：９、１：１２のモルインプット比に対してそれぞれ達成した。タンパク質コンジュゲートは、使用時まで、光から保護しながら２～８℃で貯蔵した。
補正したＡ２８０濃度（Ａ２８０吸光度から、アクリジニウムのＡ２８０寄与率を引いたもの）をアクリジニウムのＡ３７０吸光度で割ることにより、タンパク質組込み比に対する標識を決定した。タンパク質コンジュゲートは、使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例６９］
抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で再構成することにより、実施例４８の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、吸光度を３７０ｎｍで読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇの抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂを３５μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加え、５μＬのスパイキング緩衝液（７．５％ＣＨＡＰＳを含む２５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ８）を使用してｐＨを調節して、最終反応ｐＨ７．５及び最終ＣＨＡＰＳ濃度０．５％を達成した。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比８．５を達成するように、実施例４８の化合物のストック溶液を加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、５時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上で、ＨＰＬＣにより、上澄み液中に残留するタンパク質を精製した。流速１ｍＬ／分を使用し、溶出液をフォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍでモニターした。タンパク質及び実施例４８の標識濃度を、ＵＶ－Ｖｉｓ（それぞれ２８０及び３７０ｎｍ）で決定した。ＨＩＶ ｍＡｂモル濃度に対して実施例４８のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に対する標識を決定した。最終ＩＲ値２．６を、１：８．５モルのインプット比に対して達成した。タンパク質コンジュゲートは、使用時まで、光から保護しながら２～８℃で貯蔵した。
［実施例７０］
抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂ－アクリジニウム－フルオレセインコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で乾燥重量５ｍｇ／ｍＬに再構成することにより実施例１２の活性エステル化合物のストック溶液を調製した。
別個の反応容器内で、およそ２ｍｇの抗ヒトＩｇＧ抗体をおよそ８９０μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ８．０に加えた。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比３、５、又は７を達成するように、実施例１２溶液の活性エステルを各反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、終夜、およそ１６時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラムを使用して、上澄み液中に残留するタンパク質を脱塩した。７０ｎｇ／ｍＬコンジュゲートを、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガー及びトリガーに加えることにより、トリガー可能なカウント数を、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０照度計で測定した。タンパク質コンジュゲートは、使用時まで光から保護しながら２～８℃で貯蔵した。
［実施例７１］
ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂ－アクリジニウム－フルオレセインコンジュゲート。乾燥粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成することにより、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－ＮＨＳ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ Ａ１３４）の１０ｍｇ／ｍＬストック溶液を調製した。ｚｅｂａスピンカラムを使用して、ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを脱塩し、抗体濃度をＵＶ－Ｖｉｓ吸光度２８０ｎｍで決定した。反応容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比８を達成するように、ＤＢＣＯ溶液を加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、終夜（およそ２０時間）静的にインキュベートした。生成した溶液をＨＰＬＣで精製した。ＤＢＣＯ抗体濃度をＵＶ－Ｖｉｓ吸光度２８０ｎｍで再度決定した。実施例１２のアジド化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中乾燥重量３．２μＭで調製した。ＤＢＣＯ抗体を、５０μＬの実施例１２アジド溶液を含む５０μＬのＤＢＣＯ抗体溶液と共に、反応容器内で、光から保護しながら終夜（２０時間）室温でインキュベートすることにより、実施例１２アジドと反応させた。ＨＩＶ ｍＡｂのモル濃度に対して実施例１２のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に対する標識を決定した。最終ＩＲ値およそ２．０を達成した。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７２］
ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂ－アクリジニウム－ＢＯＤＩＰＹ４９３コンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で再構成することによって、実施例５１の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．０ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、吸光度を３７０ｎｍで読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇのＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを別個の反応容器内のおよそ４０μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えた。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比５、１０、又は１５を達成するように、実施例５１の化合物のストック溶液を各反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、終夜、およそ１６時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上で、ＨＰＬＣにより上澄み液中に残留するタンパク質を精製した。流速１ｍＬ／分を使用して、溶出液をフォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍでモニターした。タンパク質及び実施例５１標識濃度をＵＶ－Ｖｉｓ（それぞれ２８０及び３７０ｎｍ）で決定した。ＨＩＶ ｍＡｂのモル濃度に対して実施例５１のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に対する標識を決定した。溶解性コンジュゲート凝集物は、ＩＲ値８．８、７．９、及び８．４をそれぞれ１：５、１：１０、１：１５モルインプット比に対して生成し、調査したインプット比を有するＩＲに対する飽和点を表している。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７３］
ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂ－アクリジニウム－ＢＯＤＩＰＹ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ （ＴＲ）コンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で再構成することにより、実施例５２の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、３７０ｎｍで吸光度を読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇのＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを、別個の反応容器内のおよそ７．５μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液に加えた。容器を光から保護し、実施例５２の化合物のストック溶液を各反応容器に加えていずれかの１：１０のモルインプット比を達成した。実施例５２の化合物の可溶化を助けるため、量を３０％の反応容量まで増加させながら、ＤＭＳＯを加えた。最終反応容量は２５μＬであった。反応容器を軽くボルテックスし、次いで光から保護しながら、終夜、およそ１６時間、静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上でＨＰＬＣにより上澄み液中に残留するタンパク質を精製した。流速１ｍＬ／分を使用して、溶出液をフォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍでモニターした。溶解性凝集物が観察され、さらなる試験のために単離した。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７４］
ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂ－ＰＥＧ－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で再構成することにより、実施例５０の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、３７０ｎｍで吸光度を読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇのＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを、３５μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加え、５μＬのスパイキング緩衝液（７．５％ＣＨＡＰＳを含む２５０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ８）を使用してｐＨを調節して、最終反応ｐＨ７．５及び最終ＣＨＡＰＳ濃度０．５％を達成した。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比２０を達成するように、実施例５０のストック溶液からの化合物を反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、終夜、およそ１６時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、上澄み液中に残留するタンパク質を、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上で、ＨＰＬＣにより精製した。流速１ｍＬ／分を使用し、フォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍで溶出液をモニターした。タンパク質及び実施例５０標識濃度をＵＶ－Ｖｉｓ（それぞれ２８０及び３７０ｎｍ）で決定した。ＨＩＶ ｍＡｂのモル濃度に対して実施例５０のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に値する標識を決定した。１：２０モルインプット比に対して、最終ＩＲ値４．０を達成した。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７５］
抗ヒトＩｇＧ ＭＡＢ－ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４アクリジニウムコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で９．３ｍｇ／ｍＬに再構成することにより、ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４活性エステル（実施例５０）のストック溶液を調製した。
およそ１ｍｇの抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂを、５０ｍＭリン酸カリウム１５０ｍＭ塩化カリウムｐＨ８．０に対して、０．２Ｌ／ｍＬの比で透析した。透析後、光から保護された反応容器内で、０．７ｍｇの抗体を、シクロデキストリン（反応物中３０％）を含有する６０μＬのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０に加えた。ｍＡｂのモルに対してモルインプット比１０を達成するように、ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４アクリジニウム溶液を反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスし、光から保護しながら、終夜、およそ２２時間静的にインキュベートした。反応容器を遠心分離して不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＧ３０００カラム上でＳＥＣ－ＨＰＬＣを介して残留する上澄み液を精製した。ＵＶ－ＶＩＳを介してコンジュゲートＩＲを決定し、Ａ２８０及びＡ３７０を測定した。タンパク質コンジュゲートは２～８℃で貯蔵した。
［実施例７６］
抗ＴＳＨＭＡＢ－ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４アクリジニウムコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で９．３ｍｇ／ｍＬに再構成することにより、ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４活性エステル（実施例５０）のストック溶液を調製した。
およそ３ｍｇの抗ＴＳＨ ｍＡｂをＺｅｂａ脱塩カラム上でリン酸緩衝液ｐＨ８．０へと脱塩した。脱塩後、光から保護された反応容器内で、２．６ｍｇの抗体をシクロデキストリン（反応物中３０％）、ｐＨ８．０を含有する２００μＬのリン酸緩衝液に加えた。ｍＡｂのモルに対してモルインプット比７．５を達成するように、ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４アクリジニウム溶液を反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、光から保護しながら、終夜およそ１８時間静的にインキュベートした。反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００カラム上でＳＥＣを介して、残留する上澄み液を精製した。ＵＶ－ＶＩＳを介してコンジュゲートＩＲを決定し、Ａ２８０及びＡ３７０を測定した。タンパク質コンジュゲートは２～８℃で貯蔵した。
［実施例７７］
抗ＮＧＡＬ ｍＡｂビオチン－アクリジニウム－ルシファーイエロー（ＬＹ）。ＤＭＳＯ中で乾燥粉末を乾燥重量１０ｍｇ／ｍＬへと別々に再構成することにより、ビオチン活性エステル（購入したもの）及びアクリジニウムルシファーイエロー（実施例４８）のストック溶液を調製した。
およそ２００μｇの抗ＮＧＡＬ ＩｇＧ抗体をおよそ１００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ８．０に加えた。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対して５倍のモルインプット比を達成するように、ビオチンの活性エステル溶液を加えた。反応容器を軽くボルテックスし、次いで、光から保護しながら、終夜、およそ１６時間静的にインキュベートした。次いで、溶液を脱塩カラム（Ｚｅｂａスピン脱塩カラム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ製）に充填した。吸収スペクトルをＡ２８０ｎｍで測定することにより、標識した抗体の濃度を決定した。Ａ２８０に対する吸光係数は１．４５／ｍｇ／ｍＬであった。次いで、精製したタンパク質を、１：０．５のモル比（ｍＡｂ：アクリジニウム－ＬＹ）で、アクリジニウム－ルシファーイエローの活性エステルともう１６時間反応させた。標識に使用したアクリジニウム－ＬＹの量は、故意に低く保持した。未反応のアクリジニウム－ＬＹを別の脱塩カラムで除去することが好ましいが、生成物はさらに精製せずに使用することもできる。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７８］
本実施例は、本開示によるプロラクチンを検出するためのイムノアッセイにおいてマクロプロラクチン干渉物質を検出する方法を実証する。
本開示は、識別されたリポーターコンジュゲート（発光波長又は時間分解発光）の使用について記載しており、プロラクチンを標的とするものもあり、マクロプロラクチン／大プロラクチン（干渉分子）を標的とするものもある。干渉分子を標的とするコンジュゲートは、抗ヒトＩｇＧ、抗マクロプロラクチンＡｂ、又はプロラクチンの存在下でマクロプロラクチンと優先的に結合する任意の他の構造体であってよい。捕捉剤（抗プロラクチン抗体又は他の捕捉剤をコーティングした固形担体）は、試料中のプロラクチンとマクロプロラクチンの両方を捕捉する。次いで、これら２つのコンジュゲートを添加し、発光は、発光波長（例えば複数の、フィルターを通した光電子増倍管（ＰＭＴ）構成又は電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ）又は時間分解発光を識別することが可能な検出システムを介して読み取る。マクロプロラクチンの存在は、マクロプロラクチンコンジュゲートの応答に対する閾値又はプロラクチンコンジュゲートとマクロプロラクチンコンジュゲート応答との比のいずれかを使用して決定される。
この目的を達成するために、抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂ－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲートを調製することができる。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で再構成することにより、アクリジニウム－ルシファーイエローの活性エステルのストック溶液を調製する。ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製する。Ｃａｒｙ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、吸光度を３７０ｎｍで読み取ることにより濃度を決定する。
およそ０．３ｍｇの抗ヒトＩｇＧｍＡｂを３５μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加える。５μＬのスパイキング緩衝液（２５０ｍＭ ＰＢＳと７．５％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８）を使用して、ｐＨを調節して、最終反応物ｐＨ７．５及び最終ＣＨＡＰＳ濃度０．５％を達成した。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比８．０を達成するように、標識ストック溶液を加える。反応容器を軽くボルテックスし、次いで、光から保護しながら５時間静的にインキュベートする。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上でＨＰＬＣにより上澄み液中に残留するタンパク質を精製する。流速１ｍＬ／分を使用し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍで溶出液をモニターする。タンパク質及び標識濃度をＵＶ－Ｖｉｓ（それぞれ２８０及び３７０ｎｍ）で決定する。抗ヒト ＩｇＧ ｍＡｂのモル濃度に対してアクリジニウム－ルシファーのモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に対する標識を決定する。タンパク質コンジュゲートは２～８℃で貯蔵し、使用時まで光から保護する。
干渉検出に対するプロラクチン及びマクロプロラクチンコンビネーションアッセイを次いで実施する。具体的には、マクロプロラクチン検出用の抗マクロプロラクチンｍＡｂ－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート及びプロラクチン検出用の抗プロラクチンｍＡｂ－アクリジニウムコンジュゲート（５０ｎｇ／ｍＬ）を、リン酸緩衝液及びタンパク質（魚及びウシ）安定剤を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）プロラクチンコンジュゲート希釈剤中で希釈することにより、プロラクチン及びマクロプロラクチン検出キットを組み立てる。実験用コンジュゲートのビンを市販のＡｂｂｏｔｔプロラクチンマイクロ粒子（Ａｂｂｏｔｔリスト番号７Ｋ７６）と対にする。アッセイ試験は、２チャネル光学機器構成で改変したＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動化イムノアッセイ分析器で実施する。簡単に説明すると、デュアル光電子増倍管（ＰＭＴ）集合体を構築し、５００ｎｍにおいて波長カットオフを有するダイクロイックミラーを使用して、垂直ＰＭＴに低い波長光（ブルー）を反射させ、その一方でより高い波長光（グリーン）は、鏡を介して第２のＰＭＴに反射させる。それぞれのＰＭＴに到達する前に、所望の光をさらにフィルターにかけるために、ダイクロイックミラーの後に適当なフィルターを配置する。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）装置のハードウエアを使用して、反射した（ブルー）ＰＭＴからの出力を読み取り、その一方で別個のカウンターモジュール及びラップトップコンピュータインターフェイスを使用して、インライン（グリーン）ＰＭＴからのシグナルをコンパイルする。特注のＩＤＬコードを使用して、インラインＰＭＴからのシグナルを自動的にプロセスする。
アッセイ試験は、ＣＭＩＡ技術を使用して２ステップイムノアッセイを実施する市販のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プロラクチンアッセイファイルを使用して実施する。簡単に説明すると、試料、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ、アッセイ希釈剤、及びマイクロ粒子を第１ステップで合わせる。試料中に存在するプロラクチン及びマクロプロラクチンは抗プロラクチンコーティングしたマイクロ粒子に結合する。洗浄後、アクリジニウム標識したコンジュゲートが加えられ、マイクロ粒子に捕捉されたプロラクチン及びマクロプロラクチンに結合する。もう１つの洗浄サイクル後、プレトリガー及びトリガー溶液を反応混合物に加えて、化学発光性シグナルを誘発し、これを相対的光単位（ＲＬＵ）として測定する。
干渉試験を実施し、この試験では、公知の量のプロラクチンを含有するヒト血漿を、０ｎｇ／ｍＬから予め決定した上側の範囲まで増加するレベルのマクロプロラクチンを加える。両方のデータチャネルで生成されたシグナルを処理及び分析する。マクロプロラクチン干渉の存在は、マクロプロラクチンコンジュゲート応答に対する閾値及びプロラクチンコンジュゲート応答とマクロプロラクチンコンジュゲート応答との比の両方を使用することにより決定される。結果はポリエチレングリコール沈殿法で検証される。
［実施例７９］
この実施例は、本開示によるチログロブリン（Ｔｇ）検出イムノアッセイにおいて抗チログロブリン抗体干渉物質を検出する方法を実証する。
抗Ｔｇ抗体の存在下でのＴｇのイムノアッセイ検出は重要である。これは、多くのＴｇアッセイがＴｇＡｂ－複合体を形成したＴｇを認識することに失敗し、したがって、Ｔｇの真の濃度を低く見積もっているからである。この干渉は間違いなく、サンドイッチフォーマットＴｇイムノアッセイの臨床的有用性が直面している主要な問題である（Ｆｅｌｄｔ－Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ、Ｕ及びＲａｓｍｕｓｓｅｎ、Ｋ．、Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ．、８巻：５７１～５７６頁（１９８５年）；及びＳｃｈａａｄｔら、Ｔｈｙｒｏｉｄ、５巻（３号）：１６５～１７０頁（１９９５年））。抗Ｔｇ抗体は、甲状腺癌患者の３０～６０％の症例において検出されており、問題が比較的広範囲に及ぶことを実証している。抗Ｔｇ抗体の定量的評価は潜在的抗Ｔｇ Ａｂ 干渉を同定するためのＴｇのすべての測定と共に推奨されている（Ｈａｕｇｅｎら、Ｔｈｙｒｏｉｄ、２６巻（１号）：１～１３３頁（２０１６年）；及びＰｅｒｒｏｓら、Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、８１巻（ｓ１）：１～１２２頁（２０１４年））。
識別されたリポーターコンジュゲート（発光波長又は時間分解発光）を使用して、本開示によるＴｇ／抗Ｔｇコンビネーションアッセイ（Ｔｇ ｃｏｍｂｏ）を作り出すことができる。アッセイフォーマットは、抗Ｔｇコンジュゲートと対になった、Ｔｇコーティングしたマイクロ粒子及び識別された抗ヒトＩｇＧ抗体コンジュゲートを含む。試料からのＴｇは、抗Ｔｇコンジュゲートの結合に対してＴｇマイクロ粒子と競合する（競合アッセイ）一方、抗ヒトＩｇＧコンジュゲートは、Ｔｇマイクロ粒子で捕捉された試料からの抗Ｔｇ抗体と結合し、これを検出する（サンドイッチフォーマット）。発光は、発光波長（例えば、複数の、フィルターを通した光電子増倍管（ＰＭＴ）構成又は電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ）又は時間分解発光を識別することが可能な検出システムを介して読み取られる。Ｔｇ ｃｏｍｂｏアッセイは、予測のために２つの別個のアッセイを実施する必要性を排除する。
この目的を達成するために、２つのコンジュゲート、すなわちＴｇ検出用の抗Ｔｇ ｍＡｂ－アクリジニウムコンジュゲート及び抗Ｔｇ抗体検出用の抗ヒトＩｇＧｍＡｂ－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート（実施例７５に記載の通り、最終４０ｎｇ／ｍＬ）を作製し、両方ともＭＥＳ緩衝液及びタンパク質（ウシ）安定剤を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）抗Ｔｇコンジュゲート希釈剤中で希釈することにより、Ｔｇ ｃｏｍｂｏ検出キットを組み立てた。実験用コンジュゲートのビンを市販のＡｂｂｏｔｔ抗Ｔｇマイクロ粒子（Ａｂｂｏｔｔリスト番号２Ｋ４６）と対にした。２チャネル光学機器構成で改変されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）自動化イムノアッセイ分析器でアッセイ試験を実施した。簡単に説明すると、デュアル光電子増倍管（ＰＭＴ）集合体を構築し、５００ｎｍにおいて波長カットオフを有するダイクロイックミラーを使用して、垂直ＰＭＴに低い波長光（ブルー）を反射させ、その一方でより高い波長光（グリーン）は、鏡を介して第２のＰＭＴに反射させた。それぞれのＰＭＴに到達する前に、所望の光をさらにフィルターにかけるために、ダイクロイックミラーの後に適当なフィルターを配置した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）装置のハードウエアを使用して、反射した（ブルー）ＰＭＴからの出力を読み取り、その一方で別個のカウンターモジュール及びラップトップコンピュータインターフェイスを使用して、インライン（グリーン）ＰＭＴからのシグナルをコンパイルした。インラインＰＭＴからのシグナルを自動的にプロセスするための特注のコンピュータプログラム（ＩＤＬコード）を開発した。
１ステップ／２ステップを合わせたフォーマットで、ＣＭＩＡ技術を使用して、アッセイ試験を実施した。簡単に説明すると、試料、アッセイ希釈剤、マイクロ粒子及び抗ＴｇｍＡｂコンジュゲートを合わせ、インキュベートし、これに続いて洗浄ステップ及び第２のコンジュゲートインキュベーションステップを行った。洗浄サイクル後、プレトリガー及びトリガー溶液を反応混合物に加えて、化学発光性シグナルを誘発し、これらのシグナルを相対的な発光単位（ＲＬＵ）として測定した。
干渉試験を実施し、この試験において、ヒト血漿の４種の試料を混合し、すべての４種が３００ｎｇ／ｍＬのＴｇを含有するようにし、その一方で抗Ｔｇ抗体は、０、１００、２００、及び４００ＩＵ／ｍＬのレベルで加えた。両方のデータチャネルで生成されたシグナルを処理及び分析し、結果が図１Ａ及び１Ｂに示されている。抗Ｔｇ抗体干渉の存在は、抗Ｔｇ抗体コンジュゲート応答に対する閾値及び抗Ｔｇ抗体コンジュゲート応答とＴｇコンジュゲート応答との比の両方を使用することにより決定した。
［実施例８０］
本実施例は、第２の色チャネルで検出及び定量化された抗トロポニン抗体濃度情報を使用して、干渉性抗トロポニン抗体の存在により引き起こされるバイアスを補正して、トロポニンを検出及び定量化する能力を実証する。
市販のＡｂｂｏｔｔトロポニンアッセイは、抗トロポニン捕捉抗体でコーティングしたマイクロ粒子からなり、これらマイクロ粒子は、アクリジニウム標識した、第２の抗トロポニン抗体－コンジュゲートでその後検出されるトロポニン分子を捕捉する。患者試料がヒト免疫系で作られた抗トロポニン抗体も含有する場合、これらの抗体はまたトロポニンに結合し、アッセイにおけるトロポニンの捕捉及び／又は検出を遮断し、人為的に低下させられたトロポニンシグナルをもたらす。
ここで、第３の抗トロポニンヒトキメラの抗体を試料に混合し（ヒト自己抗体応答を模倣するため）、ルシファーイエロー結合したアクリジニウムコンジュゲートで標識した抗ヒト抗体からなるグリーンチャネルコンジュゲートを構築した（実施例７５）。増加するレベルのヒトキメラ抗トロポニン抗体（０、３、１０、３０、１００、３００、１０００、２０００、及び１０，０００ｎｇ／ｍＬ）を含有するように、トロポニンＣａｌｉｂｒａｔｏｒ Ｅ（１０ｎｇ／ｍＬ）の９種の１００μＬ試料を混合した。混合した試料は、２ステップアッセイとしてＡｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）装置でアッセイし、このアッセイでは、マイクロ粒子、試料、及びＳＴＡＴトロポニンコンジュゲート（ブルーチャネル）を混合し、１８分間インキュベートした。洗浄ステップ後、結合した複合体を有するマイクロ粒子を第２のコンジュゲート（２００ｎｇ／ｍＬ、グリーンのチャネル）と共に４分間インキュベートした。もう１回の洗浄サイクル後、プレトリガー及びトリガーを加えて、化学発光性反応を促進した。ダイクロイックミラー（５００ｎｍカットオフ）で分離したグリーン及びブルーシグナルを、２つのＰＭＴで検出した。ブルーシグナルの減少（バイアス）とグリーンチャネルの増加（干渉物質濃度レベル）との間の相関関係は傾き約３．８の直線であると決定された。図２Ａ～２Ｃに示されている通り、ブルーチャネルシグナルレベルは、干渉抗体の存在を成功裏に裏付ける補正された、ブルーチャネルトロポニンシグナルを生成し、これらのそれぞれのグリーンチャネルレベルの３．８倍に増加し得る。
本実施例は、試料の干渉／交差反応において数学的に排除するデュアルチャネル検出及びデュアルチャネル較正の有用性を実証している。
［実施例８１］
デュアルチャネルアッセイ系を使用して、ビオチン干渉を検出及び補正することができる。
「キャプチャーオンザフライ」のイムノアッセイフォーマットでは、捕捉抗体はビオチンで標識し、検出抗体はレポーター基（例えばアクリジニウム）で標識する。分析対象物質との反応後、ストレプトアビジンコーティングしたマイクロ粒子を使用して、免疫複合体を引き込む。患者の血流中にすでに高レベルのビオチンが存在する場合、遊離ビオチンもまたストレプトアビジンコーティングしたマイクロ粒子に結合し、免疫複合体を遮断するので、マイクロ粒子により捕捉される免疫複合体の量に支障をきたす恐れがある。これにより、シグナルは低減し、偽陰性となる。
この現象に対処するため、デュアル標識（ビオチン及びレポーター基、標識２）を有する捕捉抗体を生成する。検出抗体は異なるレポーター基（標識１）で標識される。分析対象物質を含有する試料は、水溶液中で捕捉抗体及び検出抗体と反応して、免疫複合体を形成する。次いで、免疫複合体はストレプトアビジンマイクロ粒子により捕捉される。洗浄ステップ後、検出抗体（標識１）及び捕捉抗体（標識２）から放出されるシグナルをチャネル１及びチャネル２でそれぞれ同時に測定する。ビオチン干渉の不在下で、捕捉抗体シグナル（チャネル２）は、純粋に引き込み効率により決定されるので、分析対象物質濃度に関わらず一定のままである。検出抗体（チャネル１）からのシグナルは分析対象物質濃度を反映する。ビオチン干渉が存在する場合、両チャネルからのシグナルは、すべての分析対象物質の濃度に対して低減する。しかし、チャネル２からのシグナルを使用して、ビオチン干渉のバイアス作用に対してチャネル１からのシグナルを補正することができる。
上記システムを使用して、高い過剰レベルのビオチンの存在下で、好中球ゼラチナーゼに伴うリポカリン（ＮＧＡＬ）を検出する実験を実施した。第１の実験に対して、以下の試薬を使用した：ビオチン及びルシファーイエロー－アクリジニウムで標識した抗ＮＧＡＬ ｍＡｂ Ａ（捕捉抗体）、アクリジニウムで標識した抗ＮＧＡＬ ｍＡｂ Ｂ（検出抗体）、及びストレプトアビジンコーティングしたマイクロ粒子（Ｍ２７０）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。捕捉抗体及び検出抗体はＮＧＡＬに同時に結合し、免疫複合体を形成することができる。様々な濃度のＮＧＡＬを捕捉抗体と検出抗体の両方を含有する混合物に加え、短いインキュベーション後、ストレプトアビジンコーティングしたマイクロ粒子を溶液に加えて、捕捉抗体及び免疫複合体を引き込んだ。次いで、洗浄ステップを導入して、未結合の抗体及び分析対象物質を除去した。最後に、捕捉抗体（チャネル２）、及び検出抗体（チャネル１）からのシグナルを同時に測定した。２μｇ／ｍｌのビオチンを各試料に導入するというわずかな修正を行い、同じ実験を繰り返した。結果は表２及び３、及び図３に示されている。
Figure 2022543619000085
Figure 2022543619000086
２μｇ／ｍｌのビオチンの存在下で、チャネル１及びチャネル２の両方からのシグナルは有意に減少した（表３と表２を比較）。しかし、補正率を使用した場合、補正率（４番目の列）をチャネル１のシグナル（２番目の列）に掛けることにより、チャネル１からのシグナルは補正することができる。各試料に対する補正率は、対照シグナル（表１の太字の値）のそれぞれ対応するチャネル２シグナル（３番目の列）に対する比から計算した。
以下の試薬、すなわち、ビオチンで標識した抗ＮＧＡＬ ｍＡｂ Ａ（捕捉抗体１）、ビオチン及びルシファーイエロー－アクリジニウムで標識した抗ＮＧＡＬ ｍＡｂ Ａ（捕捉抗体２）、アクリジニウムで標識した抗ＮＧＡＬ ｍＡｂ Ｂ（検出抗体）、及びストレプトアビジンコーティングしたマイクロ粒子（Ｍ２７０）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して第２の実験を実施した。シングル及びデュアルチャネルシステムを評価した。シングルチャネルシステムに対して、１００μＬの７０ｎＭ ＮＧＡＬを、捕捉抗体１と検出抗体の両方を含有する９００μＬの混合物に加え、５つの試料カップにアリコートした。様々な量のビオチンを試料カップに加えた（最終ビオチン濃度は１０ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲）。短いインキュベーション後、ストレプトアビジンコーティングしたマイクロ粒子を反応混合物に加え、これに続いて洗浄ステップにより未結合のビオチン、抗体、及び分析対象物質を除去した。最後に、検出抗体（チャネル１）からのシグナルを測定した。
デュアルチャネルシステムに対して、１００μＬの７０ｎＭ ＮＧＡＬを、９００μＬの抗体混合物（捕捉抗体２と検出抗体の両方を含有する）に加え、５つの試料カップにアリコートした。シングルチャネルに対して使用した同じ量のビオチンを試料カップに再度加え、これに続いて同等のインキュベーション及び洗浄ステップを行った。捕捉抗体２（チャネル２）と検出抗体（チャネル１）の両方からのシグナルを同時に測定した。
シングルチャネルシステムとデュアルチャネルシステムの両方に対する結果が表４及び図４に示されている。表４は一連の試料から測定されたシグナルを示しているが、測定は、シングルチャネルとデュアルチャネルの両方の検出構成を使用して、ＮＧＡＬ濃度を一定に保ち、ただし様々な量のビオチンの存在下で行われた。
Figure 2022543619000087
シングルチャネルシステムでは、過剰の量のビオチンはアッセイシグナルを有意に低減させた（表４、２番目の列）。デュアルチャネルシステムでは、過剰の量のビオチンはまたアッセイシグナルを有意に低減させたが（表４、３番目の列）、チャネル２を使用して、補正率を生成することができ（表４、４番目の列）、補正されたチャネル１（表４、最後の列）は、ビオチンの干渉にもかかわらず真のＮＧＡＬシグナルレベルを回復することができた。
［実施例８２］
本実施例は、２ステップイムノアッセイのダイナミックレンジを拡大する方法について記載する。
この２ステップ免疫サンドイッチアッセイフォーマットでは、標的分析対象物質は抗体をコーティングしたマイクロ粒子で最初に捕捉され、未結合の分析対象物質を除去した後、次いで（ｉ）標的分析対象物質に異なる親和性を有する、（ｉｉ）はっきりと異なる標識で構築されている、及び（ｉｉｉ）異なる濃度で存在する、２種の抗体コンジュゲートで検出される。図５に示されている通り、標的分析対象物質に対してより高い親和性を有するコンジュゲート（コンジュゲート１）は、非特異性結合を最小化するために比較的低い濃度で存在する。コンジュゲート１により放出されるシグナルはチャネル１で測定され、反応液中の利用可能なコンジュゲートのすべてが分析対象物質に結合すると、高い分析対象物質濃度において水平状態に達する。対照的に、コンジュゲート２／チャネル２（より低い親和性、高濃度）からのシグナルは低い分析対象物質濃度では比較的平坦であるが、高い分析対象物質濃度において良い用量反応性を有する。組み合わせて使用すると、コンジュゲート１及び２は、より幅広いダイナミックレンジをカバーするアッセイを可能にする。公知の分析対象物質濃度から構築された区分的較正曲線は、チャネル１からの第１のセグメント（太字で示されている）、境界を線引きするフラグ、及びチャネル２からの第２のセグメント（太字で示されている）を含む。
［実施例８３］
本実施例は、本開示による、より広いダイナミックレンジを有する、改変されたワンステップイムノアッセイフォーマットについて記載する。
ここでは、１種の捕捉抗体及び１種の検出抗体が使用されるが、検出抗体は、２種のはっきりと異なる標識（標識１又は標識２）を含む２種の亜集団で構成される。第１のアッセイステップでは、分析対象物質、マイクロ粒子、及び標識１を有するコンジュゲート（コンジュゲート１）を一緒に反応させる。インキュベーション及び洗浄ステップ後、標識２のタグを付けた同じ検出抗体（コンジュゲート２）を加える。第２のインキュベーション及び洗浄ステップ後、図６に示されているように、チャネル１（コンジュゲート１の検出用）及びチャネル２（コンジュゲート２の検出用）からのシグナルを同時に読み取る。チャネル１からのシグナルを使用して、一連の公知の分析対象物質濃度から較正曲線を生成する。チャネル２からのシグナルは、所与の測定結果に対して較正曲線の上昇セクション又は下行セクションを参照すべきかどうか示すフラグシグナルとして使用する。例えば、チャネル２からのシグナルが指定されたフラグ値より低い場合、チャネル１からのシグナルを、較正曲線の上昇セクションと比較して、分析対象物質濃度を決定する。チャネル２からのシグナルがフラグ値より高い場合には、較正曲線の下行セクションを使用して分析対象物質濃度を決定すべきである。フラグ値はチャネル２から測定され、チャネル１の較正曲線における屈曲点に対応すると定義される。
デュアル－カラーＴＳＨアッセイを実施して、この手法の実現可能性を実証した。０ｐＭ対照を含めて、３５１ｎＭから１．３ｐＭまでの２倍段階希釈で２０種のＴＳＨ試料を調製した。ＴＳＨアッセイキットは以下の試薬、すなわち、ＴＳＨ捕捉抗体－コーティングしたマイクロ粒子、ＴＳＨＡｂ－アクリジニウム（コンジュゲート１）、ＴＳＨＡｂ－アクリジニウム－ルシファーイエロー（コンジュゲート２）、及びアッセイに特異的な希釈剤（ＡＳＤ）を含む。コンジュゲート１及びコンジュゲート２は異なる標識を有する同じ抗体である。アッセイでは、２５μＬのマイクロ粒子、１５０μＬの試料、７０μＬのＡＳＤ、及び５０μＬのコンジュゲート１を混合し、８分間インキュベートした。洗浄ステップ後、５０μＬのコンジュゲート２をこの反応チャンバに加え、４分間インキュベートした。第２の洗浄ステップ後、プレトリガー及びトリガー溶液をこの反応チャンバに加えた。ダイクロイックミラーを組み込んだデュアル－チャネル検出システムを使用して、コンジュゲート１及びコンジュゲート２からのシグナルを分離し、収集した。図７Ａは両チャネルのＴＳＨ較正曲線を示している。図７Ｂは、それぞれの曲線形状のより明白な表示のために正規化されたシグナルを示している。チャネル１シグナルは１．４ｎＭ（ＴＳＨ）においてそのピーク値に到達した一方、チャネル２シグナルは、約２０ｎＭにおいて水平状態に達するまで継続して増大した。フラグ値を特定し、３９，０００カウント数で固定した。未知の試料を試験する場合、チャネル２からのＲＬＵが３９，０００未満の場合、分析対象物質濃度は、チャネル１からの曲線の上昇セクションを使用して決定すべきである。チャネル２からのシグナルが３９，０００より高い場合、分析対象物質濃度は、チャネル１からの曲線の下行セクションを使用して決定すべきである。較正曲線の形状はそれぞれ試薬の濃度に依存する。試薬レベルを調節した場合、屈曲点は、より高い又はより低いＴＳＨ濃度へとシフトさせることができる。
刊行物、特許出願、及び特許を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれていると個々に及び具体的に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれており、その全体が本明細書で記載されている。
「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」という用語並びに類似の指示対象の使用は、本明細書で他に指摘されていない限り又は文脈において明確に矛盾しない限り、本発明を記載する文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）単数と複数の両方を網羅すると解釈されるものとする。「少なくとも１つ」という用語、これに続く１つ以上の項目のリスト（例えば、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）の使用は、本明細書で他に指摘されていない限り又は文脈において明確に矛盾しない限り、列挙された項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）、又は列挙された項目の２つ以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する」という用語は、別途明示されていない限り、制限のない用語（すなわち、「これらに限定されないが、～を含む」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書で他に指摘されていない限り、範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に指す簡単な方法として機能することを単に意図するものであり、別個の各値は、本明細書でまるで個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれている。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書で他に指摘されていない限り又はさもなければ文脈において明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に提供されているいずれか及びすべての例、又は例示的言語（例えば、「例えば」）の使用は、単に本発明をより良く解明することを意図するもので、特に特許請求されていない限り、本発明の範囲に対する制限を提示するものではない。明細書におけるいかなる言語も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必要不可欠であると指摘するものと解釈されるべきではない。
本発明を実行するために、発明者らが知る最も良いモードを含む本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。それら好ましい実施形態の変化形は、前述の説明を読むことで当業者に明らかとなり得る。発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変化形を利用することを予想し、発明者らは、本発明が具体的に本明細書に記載されている方法とは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用可能な法律で許可されている、本明細書に付随する特許請求の範囲に列挙された主題のすべての修飾及び同等物を含む。さらに、すべての起こり得るその変化形における上に記載された要素の任意の組合せは、本明細書で他に指摘されていない限り又は他の文脈において明確に矛盾しない限り、本発明に包含される。

Claims (52)

  1. （ａ）分析対象物質を特異的に結合する第１の特異的結合メンバーに付着している第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、
    （ｂ）試料中の前記分析対象物質の検出に干渉する物質を特異的に結合する第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲート、
    （ｃ）前記分析対象物質及び前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質に同時に又は競合的に結合する、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバー、並びに任意選択的に
    （ｄ）前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質に特異的に結合する、前記固体支持体に付着している第４の特異的結合メンバー
    を含むキットであって、前記第１及び第２の検出可能な標識の少なくとも１つが、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
    Figure 2022543619000088
     ［式中、
    Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、
    Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、
    Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は、－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、
    Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、
    Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、
    Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、
    Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、
    Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、
    Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、
    それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］
    を含む、キット。
  2. 第２の特異的結合メンバーが、分析対象物質の存在下で分析対象物質の検出に干渉する物質に優先的に結合する、請求項１に記載のキット。
  3. 分析対象物質が抗原であり、前記分析対象物質の検出に干渉する物質が、試料中の前記抗原に結合する自己抗体である、請求項１又は２に記載のキット。
  4. 分析対象物質の検出に干渉する物質が、ビオチンである、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
  5. （ａ）ビオチン分子及びそれに付着している第１の検出可能な標識を含む第１の特異的結合メンバーであって、分析対象物質を特異的に結合する第１の特異的結合メンバー、
    （ｂ）前記分析対象物質に特異的に結合する第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含むコンジュゲート、並びに
    （ｃ）前記第１の特異的結合メンバーに付着している前記ビオチン分子及び試料中の前記分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子に結合するストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体
    を含むキットであって、前記第１及び第２の検出可能な標識の少なくとも１つが、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
    Figure 2022543619000089
     ［式中、
    Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、
    Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、
    Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、
    Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、
    Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、
    Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、
    Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、
    Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、
    Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、
    それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］
    を含む、キット。
  6. （ａ）分析対象物質を結合する第１の特異的結合メンバーに付着している第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、
    （ｂ）第２の特異的結合メンバーに付着している第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲートであって、前記第２の特異的結合メンバーは、前記第１の特異的結合メンバーと同一の分析対象物質を結合し、前記分析対象物質に対する前記第１の特異的結合メンバーの結合親和性が、前記第２の特異的結合メンバーの結合親和性より大きい、第２のコンジュゲート、及び
    （ｃ）前記第１又は第２の特異的結合メンバーと同時に前記分析対象物質に結合することができる、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバー
    を含むキットであって、前記第１及び第２の検出可能な標識の少なくとも１つが、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
    Figure 2022543619000090
     ［式中、
    Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、
    Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、
    Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、
    Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、
    Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、
    Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、
    Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、
    Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、
    Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、
    それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］
    を含む、キット。
  7. 分析対象物質に対する第１の特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーの結合親和性における差が、約５倍～約１００倍である、請求項６に記載のキット。
  8. 請求項６又は７に記載のキットを使用する、２ステップサンドイッチイムノアッセイ。
  9. （ａ）分析対象物質を結合する第１の特異的結合メンバー及び第１の検出可能な標識を含む第１のコンジュゲート、
    （ｂ）第２の特異的結合メンバー及び第２の検出可能な標識を含む第２のコンジュゲートであって、（ｉ）前記第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバーが同一であり又は異なり、（ｉｉ）前記第１及び第２の検出可能な標識が異なる、第２のコンジュゲート、
    （ｃ）前記第１又は第２の特異的結合メンバーと同時に前記分析対象物質に結合することができる、固体支持体に付着している第３の特異的結合メンバー
    を含むキットであって、前記第１及び第２の検出可能な標識の少なくとも１つが、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
    Figure 2022543619000091
     ［式中、
    Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、
    Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、
    Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、
    Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、
    Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、
    Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、
    Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、
    Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、
    Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、
    それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］
    を含む、キット。
  10. 式（Ｉ）の化合物におけるＸが、
    Figure 2022543619000092
     から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載のキット。
  11. 式（Ｉ）の化合物におけるＸが、
    Figure 2022543619000093
     である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキット。
  12. 式（Ｉ）の化合物におけるＹが、窒素である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のキット。
  13. 式（Ｉ）の化合物におけるＡが、非置換である又はＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから選択される１、２、３、４、若しくは５個の置換基で置換されているアリールである、請求項１２に記載のキット。
  14. 式（Ｉ）の化合物におけるＱが、－ＳＯ２－である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のキット。
  15. 式（Ｉ）の化合物におけるＲ２が、－ＣＯＯＺである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のキット。
  16. 式（Ｉ）の化合物におけるＺが、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載のキット。
  17. 式（Ｉ）の化合物におけるＬ１及びＬ２がそれぞれ独立にＣ１～Ｃ４－アルキレンである、請求項１～１６のいずれか一項に記載のキット。
  18. Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈがそれぞれ水素である、請求項１～１７のいずれか一項に記載のキット。
  19. 化合物が、式（Ｉａ）
    Figure 2022543619000094
     ［式中、
    Ｒはそれぞれ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルからなる群から独立に選択され、
    ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
    ｎは、１、２、３、４、５、又は６である。］
    を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載のキット。
  20. 式（Ｉａ）の化合物におけるｍが１であり、Ｒが、Ｃ１～Ｃ４アルキルである、請求項１９に記載のキット。
  21. 式（Ｉａ）の化合物におけるｍが１であり、Ｒがメチルである、請求項１９又は２０に記載のキット。
  22. 式（Ｉａ）の化合物におけるｎが３である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載のキット。
  23. 化合物が、式（Ｉｂ）
    Figure 2022543619000095
     を有する、請求項１９～２２のいずれか一項に記載のキット。
  24. 第１及び第２のコンジュゲートが、式（ＩＩ）
    Figure 2022543619000096
     ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１は、アルキレン及びヘテロアルキレンから選択され、Ｌ３は、リンカーであり、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］
    である、請求項１～２３のいずれか一項に記載のキット。
  25. フルオロフォアが、フルオレセイン、ローダミン、ホウ素－ジピロメテン、シアニン、オキサジン、チアジン、クマリン、ナフタルイミド、ロドール、ナフタレン、スクアライン、ポルフィリン、フラビン、及びランタニド系染料から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載のキット。
  26. フルオロフォアが、
    Figure 2022543619000097
    Figure 2022543619000098
    Figure 2022543619000099
    から選択される、請求項１～２５のいずれか一項に記載のキット。
  27. 第１、第２、第３、及び／又は第４の特異的結合メンバーが、抗体又はその抗原結合性断片である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のキット。
  28. 第１及び第２の特異的結合メンバーが、それぞれ第１及び第２の検出可能な標識に直接付着している、請求項１～２７のいずれか一項に記載のキット。
  29. 固体支持体が、粒子、マイクロ粒子、ビーズ、電極、及びマルチウェルプレートから選択される、請求項１～２８のいずれか一項に記載のキット。
  30. 固体支持体が、２個以上の空間的に分離された電極を含む、請求項２９に記載のキット。
  31. 第１及び第２の検出可能な標識が異なる、請求項１～３０のいずれか一項に記載のキット。
  32. 試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出する方法であって、
    （ａ）分析対象物質及び前記分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を請求項１～４のいずれか一項に記載のキットと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：
    （ｉ）前記分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合、
    （ｉｉ）前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質の前記第３の特異的結合メンバーへの特異的結合、又は前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質の固体支持体表面への非特異的結合、
    （ｉｉｉ）第１のコンジュゲートの前記分析対象物質への結合、
    （ｉｖ）第２のコンジュゲートの前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質への結合、及び任意選択的に
    （ｖ）第４の特異的結合メンバーの前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質への結合；
    （ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに
    （ｃ）前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質の存在を検出するステップ
    を含む方法。
  33. 試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出する方法であって、
    （ａ）分析対象物質及び前記分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を請求項１～４のいずれか一項に記載のキットと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：
    （ｉ）前記分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合及び前記分析対象物質の分析対象物質の検出に干渉する前記物質への結合による分析対象物質－干渉物質複合体の形成、
    （ｉｉ）第１のコンジュゲートの前記分析対象物質への結合、並びに
    （ｉｖ）第２のコンジュゲートの前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質又は前記分析対象物質－干渉物質複合体への結合、並びに任意選択的に
    （ｖ）第４の特異的結合メンバーの前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質への結合；
    （ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに
    （ｃ）前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、前記試料中の前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質の存在を検出するステップ
    を含む方法。
  34. 試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出する方法であって、
    （ａ）分析対象物質及び前記分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を請求項１～４のいずれか一項に記載のキットと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：
    （ｉ）前記分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合、
    （ｉｉ）第１のコンジュゲートの前記分析対象物質への結合及び第１のコンジュゲートの前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質への結合、並びに
    （ｉｖ）第２のコンジュゲートの前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質への結合、並びに任意選択的に
    （ｖ）第４の特異的結合メンバーの前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質への結合；
    （ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに
    （ｃ）前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、前記試料中の前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質の存在を検出するステップ
    を含む方法。
  35. 試料中の分析対象物質の検出に干渉する物質を検出する方法であって、
    （ａ）分析対象物質及び前記分析対象物質の検出に干渉する物質を含むと疑われる試料を請求項１～４のいずれか一項に記載のキットと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：
    （ｉ）前記分析対象物質の第３の特異的結合メンバーへの結合、
    （ｉｉ）前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質の固体支持体表面への特異的又は非特異的結合、
    （ｉｉｉ）第１のコンジュゲートの前記分析対象物質への結合及び前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質の第１のコンジュゲートへの特異的又は非特異的結合、それによる検出に利用可能な第１のコンジュゲートの量の増加、
    （ｉｖ）第２のコンジュゲートの前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質への結合、並びに
    （ｖ）第４の特異的結合メンバーの前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質への結合；
    （ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、並びに
    （ｃ）前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識のシグナル強度を定量及び分析することによって、前記試料中の前記分析対象物質の検出に干渉する前記物質の存在を検出するステップ
    を含む方法。
  36. 請求項５に記載のキットを使用して、試料中の分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子を検出する方法であって、
    （ａ）干渉するビオチン分子が存在しない場合に、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に結合している第１の検出可能な標識の標準シグナル強度（Ｒ値）を確立するステップ、
    （ｂ）分析対象物質及び前記分析対象物質の検出に干渉するビオチン分子を両方含むと疑われる試料を請求項５に記載のキットと、下記を可能にする条件下で接触させるステップ：
    （ｉ）前記分析対象物質の第１の特異的結合メンバーへの結合による第１の複合体の形成、
    （ｉｉ）コンジュゲートの前記第１の特異的結合メンバーに結合している前記分析対象物質への結合による免疫複合体の形成、並びに
    （ｉｉｉ）前記ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体の前記第１の特異的結合メンバーに付着しているビオチン分子及び試料中の前記分析対象物質の検出に干渉する前記ビオチン分子への結合；
    （ｃ）前記第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を検出するステップ、
    （ｄ）前記第２の検出可能な標識のシグナル強度に対する補正を行うステップ、並びに
    （ｅ）前記試料中の前記分析対象物質の検出に干渉する前記ビオチン分子の存在を検出するステップ
    を含む方法。
  37. １ステップ、ディレイ１ステップ、２ステップ、競合、直接、間接、及びそれらの組合せから選択されるアッセイフォーマットを含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 第１の検出可能な標識と第２の検出可能な標識のシグナル強度の比較が、前記第１の検出可能な標識のシグナル強度と前記第２の検出可能な標識のシグナル強度の比を決定するステップを含む、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. イムノアッセイのダイナミックレンジを拡大する方法であって、
    （ａ）分析対象物質を含むと疑われる試験試料を請求項６～８のいずれか一項に記載のキットと接触させるステップであって、前記分析対象物質が、第３の特異的結合メンバーに結合する、ステップ、
    （ｂ）前記第３の特異的結合メンバーに結合していない分析対象物質を洗浄することによって除去するステップ、
    （ｃ）第１のコンジュゲートを前記分析対象物質に結合させ、第２のコンジュゲートを前記分析対象物質に結合させるステップであって、前記第１及び第２のコンジュゲートが前記分析対象物質に同時には結合しない、ステップ、
    （ｄ）前記分析対象物質に結合していない第１及び第２のコンジュゲートを洗浄することによって除去するステップ、
    （ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を測定するステップ、並びに
    （ｃ）フラグ値に基づいて前記第１の検出可能な標識と前記第２の検出可能な標識のシグナル強度を比較することによって、前記分析対象物質の濃度を決定し、それによって前記イムノアッセイのダイナミックレンジが拡大されるステップ
    を含む方法。
  40. アッセイのダイナミックレンジが、３桁以上を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートが、約１００倍未満異なる所定のモル量で存在する、請求項３９又は４０に記載の方法。
  42. 第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度の測定が、分析対象物質濃度の所定の範囲にわたって較正アッセイを行うステップを含み、方法が、フラグ値を確立するステップをさらに含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 試験試料中の第２の検出可能な標識のシグナル強度が、
    （ａ）フラグ値未満であるとき、第１の検出可能な標識のシグナル強度に由来する較正曲線を使用して、分析対象物質濃度が決定され、又は
    （ｂ）フラグ値より高いとき、前記第２の検出可能な標識のシグナル強度に由来する較正曲線を使用して、分析対象物質濃度が決定される、
    請求項４２に記載の方法。
  44. ２ステップアッセイである、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. イムノアッセイのフック効果を低減し、ダイナミックレンジを拡大する方法であって、
    （ａ）分析対象物質を含むと疑われる試験試料を請求項９に記載のキットと接触させるステップであって、前記分析対象物質が、第３の特異的結合メンバーに結合し、第１のコンジュゲートが、前記分析対象物質に結合する、ステップ、
    （ｂ）結合していない分析対象物質及び結合していない第１のコンジュゲートをいずれも洗浄することによって除去するステップ、
    （ｃ）第２のコンジュゲートを前記分析対象物質に結合させるステップであって、前記第１及び第２のコンジュゲートが前記分析対象物質に同時には結合しない、ステップ、
    （ｄ）結合していない第２のコンジュゲートをいずれも洗浄することによって除去するステップ、
    （ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のシグナル強度を測定するステップ、並びに
    （ｃ）フラグ値に基づいて前記分析対象物質の濃度を決定し、それによって前記イムノアッセイのフック効果が低減され、ダイナミックレンジが拡大されるステップ
    を含む方法。
  46. 試験試料中の第２の検出可能な標識のシグナル強度が、
    （ａ）フラグ値以上であるとき、第１の検出可能な標識のシグナル強度に由来する較正曲線の下行部分を使用して、分析対象物質濃度が決定され、又は
    （ｂ）フラグ値未満であるとき、前記第１の検出可能な標識のシグナル強度に由来する較正曲線の上行部分を使用して、分析対象物質濃度が決定される、
    請求項４５に記載の方法。
  47. １ステップアッセイである、請求項４５又は４６に記載の方法。
  48. アッセイのダイナミックレンジが、３桁以上を含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートが、約１００倍未満異なる所定のモル量で存在する、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートを、同一の反応混合物中で試料と接触させる、請求項３２～３５及び３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 第１のコンジュゲート及び第２のコンジュゲートを、異なる反応混合物中で試料と接触させる、請求項３２～３５及び３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 自動化又は半自動化システムを使用して行われる、請求項３２～５１のいずれか一項に記載の方法。
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