JP2022542359A - 人工多能性幹細胞のゲノム安定性およびリプログラミング効率の上昇 - Google Patents
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Abstract
本開示は、上昇した効率およびゲノム安定性を有する人工多能性幹細胞の作製のための方法および組成物に関係する。特有の態様において、人工多能性幹細胞は、特有のタンパク質または遺伝子の阻害、低減または下方制御に続いて体細胞から作製される。幾つかの実施形態において、タンパク質は、ｐ５３結合タンパク質または５３ＢＰ１である。【選択図】図３Ａ
Description
関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる２０１９年７月２２日出願の米国特許出願第６２／８７７，０５２号の優先権を主張するものである。
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる２０１９年７月２２日出願の米国特許出願第６２／８７７，０５２号の優先権を主張するものである。
分野
本発明は、より良好な誘導体化効率に導く、改善されたゲノム安定性を有する人工多能性幹細胞を作製または生成するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、疾患の予防および／または処置のために対象に移植またはグラフティングするのに適していて、かつ基本的研究および薬物テストに有用である、人工多能性幹細胞およびその分化細胞を含む、この方法により生成された細胞を提供する。
本発明は、より良好な誘導体化効率に導く、改善されたゲノム安定性を有する人工多能性幹細胞を作製または生成するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、疾患の予防および／または処置のために対象に移植またはグラフティングするのに適していて、かつ基本的研究および薬物テストに有用である、人工多能性幹細胞およびその分化細胞を含む、この方法により生成された細胞を提供する。
背景
体細胞は、胚形成状態の主要制御因子として作用する４種の転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃＭＹＣ（ＯＳＫＭ）の異所性発現により多能性にリプログラムされ得る（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ， ２００６）。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞と称されるリプログラムされた細胞集団は、無期限に増殖するだけでなく、成体生物体の任意の特化された細胞型に分化する能力が授けられる。これらの特徴は、ｉＰＳ細胞を、インビトロでの疾患モデリングおよび創薬、ならびに患者特有の細胞交換療法の開発に比類なく適するようにする。それでも、リプログラミング因子ＯＳＫＭ、またはｃＭＹＣを含まないＯＳＫの過剰発現は、増加されたレベルのＤＮＡ損傷をもたらす（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。そのような上昇はまた、転写因子の過剰発現を伴わない核移植によるリプログラミングの間にも見られる（Ｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。これらの知見は、ＤＮＡ損傷が一般的なリプログラミング現象であり、複製ストレスに関連し（Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）、ｄｅ ｎｏｖｏのコピー数変化をもたらすこと（Ｇｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）を示す。
体細胞は、胚形成状態の主要制御因子として作用する４種の転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃＭＹＣ（ＯＳＫＭ）の異所性発現により多能性にリプログラムされ得る（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ， ２００６）。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞と称されるリプログラムされた細胞集団は、無期限に増殖するだけでなく、成体生物体の任意の特化された細胞型に分化する能力が授けられる。これらの特徴は、ｉＰＳ細胞を、インビトロでの疾患モデリングおよび創薬、ならびに患者特有の細胞交換療法の開発に比類なく適するようにする。それでも、リプログラミング因子ＯＳＫＭ、またはｃＭＹＣを含まないＯＳＫの過剰発現は、増加されたレベルのＤＮＡ損傷をもたらす（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。そのような上昇はまた、転写因子の過剰発現を伴わない核移植によるリプログラミングの間にも見られる（Ｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。これらの知見は、ＤＮＡ損傷が一般的なリプログラミング現象であり、複製ストレスに関連し（Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）、ｄｅ ｎｏｖｏのコピー数変化をもたらすこと（Ｇｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）を示す。
体細胞リプログラミングは、Ｂｒｃａ１およびＢｒｃａ２（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、ＣｔＩＰ（Ｇｏｍｅｚ－Ｃａｂｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）、Ｒａｄ５１（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、ＦａｎｃＣおよびＦａｎｃＡ（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）、ＦａｎｃＤ２（Ｒａｙａ ｅｔ ａｌ．， ２００９）、ならびにＡｔｍ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）を含む、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復に関連するタンパク質の変異またはノックダウンにより重度に損なわれるため、ゲノム安定性は、ｉＰＳ細胞作製において重要な役割を担う。対照的に、腫瘍サプレッサｐ５３（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９； Ｕｔｉｋａｌ ｅｔ ａｌ．， ２００９ｂ）、ｐ２１（Ｋａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００９）およびＲｂ（Ｋａｒｅｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）のアブレーションは、より効率的なｉＰＳ細胞作製をもたらす。これらの観察は、リプログラミングおよび発癌性形質転換が、ゲノム安定性を維持しかつＤＮＡ損傷に応答して体細胞増殖を制限する、共有の分子工程により左右されることを示唆する。しかし、ＢＲＣＡ１を含む、リプログラミング効率に影響を及ぼすほとんどの因子は、複数の細胞機能を発揮するため、リプログラミングに誘導されるＤＮＡ損傷の原因、損傷のタイプ、およびこの損傷が修復されるメカニズムは、依然としてよく理解されていない。例えばＲａｄ５１は、停止複製フォークをプロセシングする際に鎖交換と独立した機能を有し（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）、ＣｔＩＰは、ＤＮＡ２による停止フォークの削り込みを予防し（Ｐｒｚｅｔｏｃｋａ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、ＢＲＣＡ２は、ＭＲＥ１１による停止フォーク分解を阻害する（Ｓｃｈｌａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。
ＢＲＣＡ１は、多くの細胞内工程に関連づけられているが、その機能の２つの側面が、ゲノム安定性に特に重要と考えられている。第一にＢＲＣＡ１は、ＤＳＢを高い忠実度で修復する相同組換え修復（ＨＤＲ）に必要とされる（Ｍｏｙｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ＢＲＣＡ１は、ＨＤＲまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のどちらかによりＤＳＢを修復するかを決定する初期コミットメントステップを含む、多数の段階でＨＤＲ経路を促進する。このレベルでは、ＢＲＣＡ１は、ＮＨＥＪに耐性がありＨＤＲの重大な中間体として役立つ３’ｓｓＤＮＡオーバーハングにＤＳＢ末端を変換する工程である、ＤＮＡ削り込みを促進することによりＨＤＲを促進する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。依然として不明瞭な分子メカニズムを通して、ＢＲＣＡ１は、ＤＮＡ削り込みを阻害することによりＮＨＥＪを促進するタンパク質である、５３ＢＰ１の活性を無効にすることにより、ＤＳＢ修復をＨＤＲ経路に向ける。第二に、ＢＲＣＡ１はまた、停止ＤＮＡ複製フォークを核酸分解から保護する、明確に異なる経路においても機能する（Ｐａｔｈａｎｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｓｃｈｌａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。興味深いことに、ＢＲＣＡ１のＨＤＲおよび停止フォーク保護（ＳＦＰ）活性は、遺伝学的に分離可能のようであり、ＳＦＰのみの排除が、複製ストレスに応答して染色体不安定性を誘発するのに充分である（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。したがって、ＨＤＲおよびＳＦＰの両方は、ＢＲＣＡ１のゲノム維持機能に寄与し、そのため両者はまた、ＢＲＣＡ１介在性体細胞リプログラミングに関与する可能性がある。
本明細書で示される通り、ｐ５３結合タンパク質または５３ＢＰ１を阻害または低減することは、ＢＲＣＡ１を増加させ、プログラミングの間にＨＤＲが起こることを可能にし、それはゲノム安定性、リプログラミング効率、およびｉＰＳ細胞の品質を促進する。
概要
本開示の実施形態は、幹細胞および組織のエンジニアリングに関係する方法および組成物を包含する。特別な実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞の生成または作製に関する方法および組成物に関係し、特定の実施形態において、これらの人工多能性幹細胞は、組織の形態を含む、分化細胞を生成する条件に供される。人工多能性幹細胞を含む組織は、それを必要とする個体、例えば創傷を有する個体または病状を有する個体など、細胞または組織の修復が有益である全ての個体に提供されてよい。
本開示の実施形態は、幹細胞および組織のエンジニアリングに関係する方法および組成物を包含する。特別な実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞の生成または作製に関する方法および組成物に関係し、特定の実施形態において、これらの人工多能性幹細胞は、組織の形態を含む、分化細胞を生成する条件に供される。人工多能性幹細胞を含む組織は、それを必要とする個体、例えば創傷を有する個体または病状を有する個体など、細胞または組織の修復が有益である全ての個体に提供されてよい。
特定の実施形態において、人工多能性幹細胞は、本明細書に記載される方法により作製され、ここで成体体細胞の１つまたは複数の型が提供され、５３ＢＰ１発現を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する１種または複数の薬剤が体細胞内に導入される。したがって一実施形態は、５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する１種または複数の薬剤をヒト体細胞内に導入すること、およびヒト人工多能性幹細胞を作製する条件下で細胞を培養すること、を含む、ヒト人工多能性幹細胞を作製する方法である。
幾つかの実施形態において、体細胞は、表皮細胞、線維芽細胞、他の上皮起源（乳房、肺、腸）細胞、または血液細胞である。
本開示の特定の実施形態において、体細胞は、本明細書に開示された方法に供するために個体から得られるが、いくつかの例では、体細胞は、商業的に得られる。人工多能性幹細胞またはそれから分化した細胞の作製に供される体細胞は、当該技術分野の任意の適切な手段により個体に送達されてよい。いくつかの例では、本明細書に開示される方法により生成された人工多能性幹細胞、またはそれから分化した細胞は、そこから起源の成体の体細胞が得られた、個体に送達される。しかし特定の実施形態において、人工多能性幹細胞は、そこから体細胞が得られた、個体（複数可）以外の個体に送達される。したがって本開示の幾つかの実施形態において、体細胞は、その個体の自家性であり、幾つかの実施形態において、体細胞は、その個体の同種異系である。
５３ＢＰ１の阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御に用いられる薬剤は、５３ＢＰ１発現の阻害、低減、ノックダウンもしくは下方制御の検出可能なレベルが存在する限り、または多能性細胞の特徴を有する体細胞の顕著な効果が存在する限り、いずれの種類のものであってもよい。具体的実施形態において、薬剤は、核酸、ポリペプチド、ペプチド、低分子、化学物質、エンドヌクレアーゼ、またはその混合物である。薬剤が核酸である場合、薬剤は、５３ＢＰ１ ｍＲＮＡを直接標的にしてよい。具体的実施形態において、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびそれらの組み合わせである。標的とする任意の核酸は、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはプラスミドなどの発現ベクターに存在してよい。
本開示のさらなる実施形態は、開示された方法における使用のための組成物である。そのような組成物は、５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する１種または複数の薬剤を含む組成物およびベクターを包含する。
本開示のさらなる実施形態において、本明細書に開示される方法により生成または作製された人工多能性幹細胞が、提供される。
本開示のさらなる実施形態において、人工多能性幹細胞は、分化細胞を生成する条件に供される。分化細胞は、いずれの種類であってもよく、当業者は、所望の分化細胞をもたらす分化条件をどのように調整するかを認識している。具体的例において、分化細胞は、血液細胞、膵臓細胞、内分泌細胞、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、表皮細胞、有毛細胞、ケラチノサイト、肝細胞、腸上皮細胞、肺胞細胞、造血細胞、内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、コンドロサイト、および骨細胞である。分化はまた、細胞をマウスに注射して、宿主マウスの間質組織により提供される非細胞自律性因子を通し分化を誘導することにより、誘導され得る。
したがって、さらなる実施形態は、（ａ）本明細書に開示される方法を利用して生成または作製されたｉＰＳ細胞の集団を得ること；および（ｂ）ｉＰＳ細胞を分化細胞集団へと分化させるのに効果的な条件で細胞を培養すること、を含む、分化細胞集団を提供する方法である。例えば幾つかの態様において、細胞を培養するステップ（ｂ）は、１種または複数の増殖因子を含む定義された培地中で細胞を培養することを含む。さらなる態様において、実施形態の方法はさらに、血液細胞、膵内分泌細胞、膵臓細胞、内分泌細胞、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、表皮細胞、有毛細胞、ケラチノサイト、肝細胞、腸上皮細胞、肺胞細胞、造血細胞、内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、コンドロサイト、および骨細胞、神経細胞、肥満細胞、膵ベータ細胞、心筋細胞、または肝細胞を含む分化細胞集団を提供する方法として定義される。幾つかの態様において、実施形態による使用のための細胞は、マウス、ラット、またはヒト細胞である。
本開示の幾つかの実施形態において、それ必要とする個体における損傷組織を修復する、またはその個体を処置する方法であって、体細胞に薬剤を導入するステップであって、薬剤が、体細胞において５３ＢＰ１の発現を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する、ステップと、ヒト人工多能性幹細胞を作製または生成する条件下で細胞を培養するステップと；分化細胞を生成する条件に人工多能性幹細胞を供するステップと；それを必要とする個体に分化細胞を送達するステップ、を含む、方法が存在する。幾つかの実施形態において、体細胞は、自家性である。幾つかの実施形態において、体細胞は、同種異系である。特定の例において、分化細胞は、例えば、皮膚組織、筋肉組織、ニューロン、または血液などの組織の形態で個体に送達される。
本開示は、キットも包含する。
本発明を例示する目的で、本発明の特定の実施形態を、図面に表す。しかし本発明は、図面に表された実施形態の正確な配列および手段に限定されない。
詳細な記載
本明細書の開示は、５３ＢＰ１を含む、１種の遺伝子の阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御を利用して体細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する新規の方法を提供する。これらの多能性幹細胞はその後、損傷組織を修復するため、または患者を処置するための分化細胞および組織を作製するために用いることができる。模範的組成物としては、少なくとも、薬剤、阻害性核酸を含むベクター、本明細書に開示される方法を利用して作製された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、これらの人工多能性幹細胞に由来する分化細胞型、およびこれらのｉＰＳ細胞に由来する操作された組織を含む組成物が挙げられる。
本明細書の開示は、５３ＢＰ１を含む、１種の遺伝子の阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御を利用して体細胞から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する新規の方法を提供する。これらの多能性幹細胞はその後、損傷組織を修復するため、または患者を処置するための分化細胞および組織を作製するために用いることができる。模範的組成物としては、少なくとも、薬剤、阻害性核酸を含むベクター、本明細書に開示される方法を利用して作製された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、これらの人工多能性幹細胞に由来する分化細胞型、およびこれらのｉＰＳ細胞に由来する操作された組織を含む組成物が挙げられる。
定義
本明細書で用いられる用語は一般に、本発明の文脈および各用語が用いられる具体的文脈内では当該技術分野の通常の意味を有する。特定の用語が、本発明の方法およびそれらをどのように使用するかについて記載する上で実践者に追加的指導を提供するために以下に、または本明細書の他の箇所に議論される。さらに、同じ事柄が１つより多くの方法で述べられ得ることは、察知されよう。結果的に、代わりの言語および同義語が、本明細書で議論された用語のいずれか１つまたは複数に用いられてよく、用語が本明細書で詳述または議論されているか否かをいずれも特別に重視しない。特定の用語の同義語が、提供される。１つまたは複数の同義語の話は、他の同義語の使用を除外しない。本明細書で議論された任意の用語の例を含む、本明細書のいずれかの箇所の実施例の使用は、例示に過ぎず、本発明またはいずれかの例証された用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に本発明は、好ましい実施形態に限定されない。
本明細書で用いられる用語は一般に、本発明の文脈および各用語が用いられる具体的文脈内では当該技術分野の通常の意味を有する。特定の用語が、本発明の方法およびそれらをどのように使用するかについて記載する上で実践者に追加的指導を提供するために以下に、または本明細書の他の箇所に議論される。さらに、同じ事柄が１つより多くの方法で述べられ得ることは、察知されよう。結果的に、代わりの言語および同義語が、本明細書で議論された用語のいずれか１つまたは複数に用いられてよく、用語が本明細書で詳述または議論されているか否かをいずれも特別に重視しない。特定の用語の同義語が、提供される。１つまたは複数の同義語の話は、他の同義語の使用を除外しない。本明細書で議論された任意の用語の例を含む、本明細書のいずれかの箇所の実施例の使用は、例示に過ぎず、本発明またはいずれかの例証された用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に本発明は、好ましい実施形態に限定されない。
本明細書で用いられる用語「阻害する」、「下方制御する」、「ノックダウンする」および同様のものは、遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質）の発現の低減を指す。
ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと一般に略される本明細書で用いられる用語「人工多能性幹細胞」は、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞または同様のものなどの非多能性細胞、典型的には成体体細胞、または高分化細胞から人工的に作製された人工幹細胞の型を指す。
本明細書で用いられる用語「体細胞」は、生物体の身体を形成する任意の二倍体細胞を指す。
本明細書で用いられる用語「分化」、「細胞分化」および同様のものは、あまり特殊化されていない細胞（即ち、幹細胞）がより明確な形態および／または機能を有するように、より特殊化された細胞もしくは分化された細胞（即ち、膵ベータ細胞）に発達または成熟または分化する工程を指す。
この工程から得られた細胞は、本明細書で「分化細胞」と称され、膵臓細胞、内分泌細胞に加え、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、表皮細胞、有毛細胞、ケラチノサイト、肝細胞、腸上皮細胞、肺胞細胞、造血細胞、内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、コンドロサイト、および骨細胞を包含し得る。
本明細書で用いられる表現「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、互換的に用いられ、そのような名称は全て、子孫を含む。故意または偶然の変異により、子孫の全てが正確に同一のＤＮＡ量を有するとは限らないことも、理解されよう。本来通り形質転換された細胞でスクリーニングされたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が、含まれる。明確に異なる名称を意図する場合には、それは文脈から明らかとなろう。
細胞に関連して、用語「単離された」は、自然環境から（例えば、組織または対象から）単離された細胞を指す。用語「細胞株」は、インビトロで連続的または長期的成長または分裂が可能な細胞の集団を指す。多くの場合、細胞株は、単一の子孫細胞に由来するクローン集団である。さらに、自然発生的な、または誘導された変化がそのようなクローン集団の貯蔵または移送の際に核型において起こり得ることも、当該技術分野で知られている。それゆえ、参照された細胞株に由来する細胞は、先祖細胞または培養物と正確に同一でなくてもよく、参照された細胞株は、そのような変異体を含む。本明細書で用いられる用語「組換え細胞」は、生物活性ポリペプチドの転写またはＲＮＡなどの生物活性核酸の生成をもたらすＤＮＡセグメントなどの外因性ＤＮＡセグメントが導入されている細胞を指す。
本明細書で用いられる「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」は、１または複数を意味し得る。本明細書の特許請求の範囲（複数可）で用いられる、言語「含んでいる」と併せて用いられる場合の言語「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」は、１、または１より多くを意味してもよい。
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことが明確に示される場合、または代替物が互いに排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために用いられるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書で用いられる「別の」は、少なくとも第二の、または追加を意味し得る。
本出願全体を通して、用語「約」は、ある値がデバイス、その値を決定するのに用いられる方法の生来の誤差変動、または試験対象の間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
本開示によれば、分子免疫学、細胞免疫学、薬理学、および微生物学で一般に用いられるものなどの、当該技術の範囲内で数多くのツールおよび技術が存在し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ３ｒｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． （２００５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．： Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎ．Ｊ．； Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． （２００５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．： Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎ．Ｊ．； Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． （２００５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．： Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎ．Ｊ．； Ｃｏｉｃｏ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． （２００５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．： Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎ．Ｊ．； Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． （２００５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．： Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎ．Ｊ．；およびＥｎｎａ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． （２００５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．： Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎ．Ｊ．を参照されたい。
略語
ｉＰＳまたはｉＰＳＣ－ 人工多能性幹（細胞）
ＨＤＲ－ 相同組換え修復
ＳＦＰ－ 停止フォーク保護
ＤＳＢ－ 二本鎖切断
ＮＨＥＪ－ 非相同末端結合
ｗｔ ｃｔｒｌ－ 野生型対照
ＭＥＦ－ マウス胚線維芽細胞
ＩＲ－ 放射線
５３ＢＰ１－ ｐ５３結合タンパク質
ｉＰＳまたはｉＰＳＣ－ 人工多能性幹（細胞）
ＨＤＲ－ 相同組換え修復
ＳＦＰ－ 停止フォーク保護
ＤＳＢ－ 二本鎖切断
ＮＨＥＪ－ 非相同末端結合
ｗｔ ｃｔｒｌ－ 野生型対照
ＭＥＦ－ マウス胚線維芽細胞
ＩＲ－ 放射線
５３ＢＰ１－ ｐ５３結合タンパク質
相同組換えの促進は体細胞リプログラミングにおけるゲノム安定性を促進する
多能性へのリプログラミングは、ＤＮＡ損傷に関連し、相同組換えタンパク質ＢＲＣＡ１の機能を必要とする。ここでは、ＢＲＣＡ１とその結合パートナーＢＡＲＤ１、ＤＮＡトランスロカーゼＳＭＡＲＣＡＬ１、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）因子５３ＢＰ１、ならびにリンタンパク質結合パートナーＡＢＲＡＸＡＳ、ＢＡＣＨ１／ＢＲＩＰ１／ＦＡＮＣＪおよびＣｔＩＰとの物理的および遺伝学的相互作用を利用して、体細胞リプログラミングにおける停止フォーク保護（ＳＦＰ）、停止フォークプロセシングおよび相同組換え修復（ＨＤＲ）の関連性を決定した。驚くべきことに、停止フォーク安定性の傷害は、多能性への転換にとって重要でなく、ＨＤＲのみの欠損が、リプログラミングを損なった。５３ｂｐ１の不活性化を通したＨＤＲの復活は、Ｂｒｃａ１変異体においてリプログラミングを復活させ、野生型線維芽細胞においてｉＰＳ細胞作製の効率を上昇させた。さらに、５３ｂｐ１ヌル細胞は、リプログラミングの間に複製フォーク停止剤であるアフィジコリンおよびトポテカンへの感度を低減したが、両末端（ｔｗｏ－ｅｎｄｅｄ）二本鎖切断を作製する放射線に対しては依然として脆弱であった。これらの結果は、相同組換えによる修復を必要とする、複製により誘導された片末端二本鎖切断が、体細胞リプログラミングの一次的制限であることを実証した。
多能性へのリプログラミングは、ＤＮＡ損傷に関連し、相同組換えタンパク質ＢＲＣＡ１の機能を必要とする。ここでは、ＢＲＣＡ１とその結合パートナーＢＡＲＤ１、ＤＮＡトランスロカーゼＳＭＡＲＣＡＬ１、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）因子５３ＢＰ１、ならびにリンタンパク質結合パートナーＡＢＲＡＸＡＳ、ＢＡＣＨ１／ＢＲＩＰ１／ＦＡＮＣＪおよびＣｔＩＰとの物理的および遺伝学的相互作用を利用して、体細胞リプログラミングにおける停止フォーク保護（ＳＦＰ）、停止フォークプロセシングおよび相同組換え修復（ＨＤＲ）の関連性を決定した。驚くべきことに、停止フォーク安定性の傷害は、多能性への転換にとって重要でなく、ＨＤＲのみの欠損が、リプログラミングを損なった。５３ｂｐ１の不活性化を通したＨＤＲの復活は、Ｂｒｃａ１変異体においてリプログラミングを復活させ、野生型線維芽細胞においてｉＰＳ細胞作製の効率を上昇させた。さらに、５３ｂｐ１ヌル細胞は、リプログラミングの間に複製フォーク停止剤であるアフィジコリンおよびトポテカンへの感度を低減したが、両末端（ｔｗｏ－ｅｎｄｅｄ）二本鎖切断を作製する放射線に対しては依然として脆弱であった。これらの結果は、相同組換えによる修復を必要とする、複製により誘導された片末端二本鎖切断が、体細胞リプログラミングの一次的制限であることを実証した。
Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞は、ＨＤＲを特異的に欠損しているが、Ｂｒｃａ１のＳＦＰ機能は欠損しておらず、極わずかであるがリプログラムする。ＢＲＣＡ１との５３ＢＰ１の遺伝学的相互作用は、両末端二本鎖切断でＤＮＡ修復経路選択のバランスを調節することが知られている。ＲＩＦ１と一緒に、５３ＢＰ１は、ＢＲＣＡ１－ＣｔＩＰへの競合的および拮抗的様式で作用して、切断末端の削り込みを阻害する（Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ－Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。Ｂｒｃａ１変異細胞における５３ｂｐ１の不活性化は、過去の報告と一致して、ＨＤＲ競合をレスキューした（Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。５３ｂｐ１の損失は、複製ストレス、ＤＮＡ損傷、アポトーシスの量を低減し、Ｂｒｃａ１の非存在下でのｉＰＳ細胞作製の効率を完全にレスキューした。
驚くべきことに、５３ｂｐ１の破壊によるリプログラミングの改善が、２種の追加的遺伝子型：他の野生型細胞およびヘテロ接合型Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋変異体における５３ｂｐ１欠損、で認められた。この結果は、対照に比較した５３ｂｐ１－／－マウス線維芽細胞でのｉＰＳ細胞作製の２倍低減を報告した、過去の試験への異論となっている（Ｍａｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。本明細書の結論の強みは、３種の異なる遺伝子型：野生型、Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋およびＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒの全てが５３ｂｐ１の非存在下でより良好にリプログラムする、という５３ｂｐ１損失の結果を検査したことに由来する。ＢＲＣＡ１および５３ＢＰ１は、競合して修復経路選択を決定するため、野生型細胞における５３ｂｐ１の非存在は、ＨＤＲアッセイで示される通りＨＤＲの効率を増強する。
５３ＢＰ１は、非相同末端結合によるＤＳＢ修復の役割に加え、ｐ５３依存的転写の刺激において別の機能を有する。５３ＢＰ１の損失は、ヒト転移性腺癌細胞において、ｐ２１ならびにアポトーシス促進性ターゲットＢＡＸおよびＰＵＭＡ／ＢＢＣ３の誘導を損なうと報告されている（Ｃｕｅｌｌａ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。ｐ５３の損失またはｐ２１の下方制御は、ｉＰＳ細胞作製を改善し、それにより５３ｂｐ１のアブレーションがリプログラミングを増加し得る代替のメカニズムを提供する。しかし別の試験は、５３ｂｐ１－／－マウス胸腺細胞中のｐ５３の正常な安定化およびＩＲに応答したｐ２１の上方制御を示した（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。本明細書で用いた実験系マウス胚線維芽細胞では、５３ｂｐ１－／－細胞における増殖またはアポトーシスの変化は、認められず、ｐ２１の正常な誘導が、電離放射線での処置に応答して５３ｂｐ１変異細胞において見出された。
それゆえ、５３ｂｐ１の非存在下でのリプログラミング効率の改善は、ｐ５３ターゲット誘導の傷害によるものではない。この概念のさらなる裏づけでは、５３ｂｐ１変異細胞におけるリプログラミング効率の上昇は、放射線への耐性を引き起こすｐ５３欠損から予期される通り、片末端ＤＳＢに特異的であり、両末端ＤＳＢの誘導では認められない。
リプログラミングに限定するＤＮＡ損傷の特異的型を決定するために、一連の実験を実行し、それは、片末端ＤＳＢの荷重を増加させる薬物処置または両末端ＤＳＢの蓄積を誘導する放射線を利用した。５３ｂｐ１－／－線維芽細胞は、５３ｂｐ１－／－マウスおよび胚細胞で過去に報告された通り、リプログラミングの間に片末端ＤＳＢの誘導物質に対しそれほど感受性でなかったが、両末端ＤＳＢに対しては依然としてより脆弱であったことが認められた。重要なことに、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ細胞における５３ｂｐ１の損失は、アフィジコリン誘導性およびトポテカン誘導性の両方の片末端ＤＳＢへのそれらの感受性を低減したが、ＩＲが施された場合改善をもたらさなかった。これらの観察はまとめるて、多能性へのリプログラミングの限定因子は、相同組換え修復を必要とする片末端二本鎖切断であることを示した。
腫瘍形成を加速しリプログラミング効率を改善するｐ２１、Ｒｂまたはｐ５３の欠失と対照的に、ＢＲＣＡ１損失の表現型は、反対の効果を有し、それは腫瘍発生を増加させるが、リプログラミングを損なう。両方の表現型は、特異的にＢＲＣＡ１のＨＤＲ機能によるものである。ＨＤＲ欠損を有するマウスは、腫瘍発生傾向があり、一方でＳＦＰ損失は、腫瘍形成への影響を有しない（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）（表２）。 本明細書で用いた系では、ＢＲＣＡ１の、ＳＦＰではなくＨＤＲ機能が、体細胞リプログラミングに必要であることが示された。５３ｂｐ１の損失は、ＨＤＲを復活させ、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ動物の腫瘍発生率を低減し（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００９）、またリプログラミングをレスキューする（表２）。しかし幾つかのＢＲＣＡ１欠損性の癌は、５３ＢＰ１を不活性化し（Ｊａｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）それは処置への感受性を低減する可能性があり、癌におけるＨＤＲ欠損の効果が腫瘍発生のステージに依存し得ることを示唆する。ＨＤＲが腫瘍抑制に必要とされるが腫瘍成長およびリプログラミングも可能にするというこのＢＲＣＡ１パラドックスは、依然として解明されていない。新規な見通しを、ここで提供する：片末端ＤＳＢは、増殖を妨げ分化された状態を安定化するシグナル伝達カスケードを始動することにより、異常な細胞型転換への一次的阻害物質として機能する（Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。この文脈でのＤＮＡ修復経路のバランスは、ゲノム完全性を保護する。
５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する薬剤
多種多様の適切な薬剤が、５３ＢＰ１の阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御のために、用いられ、有効性、毒性、安定性、特異性、半減期などの当該技術分野で認識された基準により導かれてよい。さらに、阻害のメカニズムは、遺伝子レベル（例えば、発現、転写または翻訳と干渉する、またはそれを阻害するなど）またはタンパク質レベル（例えば、結合、競合など）であり得る。
多種多様の適切な薬剤が、５３ＢＰ１の阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御のために、用いられ、有効性、毒性、安定性、特異性、半減期などの当該技術分野で認識された基準により導かれてよい。さらに、阻害のメカニズムは、遺伝子レベル（例えば、発現、転写または翻訳と干渉する、またはそれを阻害するなど）またはタンパク質レベル（例えば、結合、競合など）であり得る。
幾つかの実施形態において、５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する薬剤、即ち阻害性核酸は、他のリプログラミング因子、例えばＯＳＫＭ因子と同じベクター上に存在する。幾つかの実施形態において、５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する薬剤は、他のリプログラミング因子とは別のベクター上に存在する。幾つかの実施形態において、薬剤は、薬剤（複数可）を含む培地中で細胞を培養することにより細胞と接触またはインキュベートされる。
低分子阻害剤
本明細書で用いられる用語「低分子」は、タンパク質または核酸以外の分子を包含し、サイズへの厳密な注意はない。本開示の方法および組成物により用いられ得る低分子の非限定的例としては、低有機分子、ペプチド様分子、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）もしくは無機分子が挙げられる。
本明細書で用いられる用語「低分子」は、タンパク質または核酸以外の分子を包含し、サイズへの厳密な注意はない。本開示の方法および組成物により用いられ得る低分子の非限定的例としては、低有機分子、ペプチド様分子、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）もしくは無機分子が挙げられる。
阻害性タンパク質
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物で用いられる薬剤は、５３ＢＰ１タンパク質の活性を阻害するタンパク質またはペプチドである。１つのそのようなタンパク質は、同定されており、ユビキチン変異体である。Ｃａｎｎｙ， ｅｔ ａｌ． ２０１８を参照されたい。
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物で用いられる薬剤は、５３ＢＰ１タンパク質の活性を阻害するタンパク質またはペプチドである。１つのそのようなタンパク質は、同定されており、ユビキチン変異体である。Ｃａｎｎｙ， ｅｔ ａｌ． ２０１８を参照されたい。
阻害性核酸
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物で用いられる薬剤は、５３ＢＰ１の発現を低減するポリヌクレオチドである。したがって方法は、５３ＢＰ１をコードするヌクレオチド配列（複数可）を特異的に標的とするポリヌクレオチドを導入することを含む。ポリヌクレオチドは、５３ＢＰ１の発現を低減して、低減されたレベルの遺伝子産物（翻訳されたポリペプチド）を産する。ポリヌクレオチドの核酸ターゲットは、５３ＢＰ１の遺伝子または転写産物内のいずれの位置であってもよい。５３ＢＰ１についての配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅで見出すことができ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：７１５８）、コンピュータプログラムと併せて、５３ＢＰ１の発現を低減するポリヌクレオチドを設計するために用いられ得る。
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物で用いられる薬剤は、５３ＢＰ１の発現を低減するポリヌクレオチドである。したがって方法は、５３ＢＰ１をコードするヌクレオチド配列（複数可）を特異的に標的とするポリヌクレオチドを導入することを含む。ポリヌクレオチドは、５３ＢＰ１の発現を低減して、低減されたレベルの遺伝子産物（翻訳されたポリペプチド）を産する。ポリヌクレオチドの核酸ターゲットは、５３ＢＰ１の遺伝子または転写産物内のいずれの位置であってもよい。５３ＢＰ１についての配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅで見出すことができ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：７１５８）、コンピュータプログラムと併せて、５３ＢＰ１の発現を低減するポリヌクレオチドを設計するために用いられ得る。
５３ＢＰ１活性または遺伝子発現を阻害するための幾つもの手段が、開示された方法で用いられ得る。例えば５３ＢＰ１をコードする核酸の少なくとも一部に相補的な核酸分子が、５３ｂｐ１遺伝子発現を阻害するために用いられ得る。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害するために用いられる生物学的工程である。典型的には、内因性ｍＲＮＡに相補的であり、かつ細胞に導入されると標的ｍＲＮＡに結合する短鎖ＲＮＡ分子が、作り出される。標的ｍＲＮＡへの短鎖ＲＮＡ分子の結合は、標的ｍＲＮＡを機能的に不活性化し、時には標的ｍＲＮＡの分解をもたらす。
歴史的に、２つの型の短鎖ＲＮＡ分子が、ＲＮＡｉ適用に用いられてきた。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は典型的には、二本鎖ＲＮＡ分子であり、２０～２５ヌクレオチド長である。細胞にトランスフェクトされると、ｓｉＲＮＡは、それらが細胞内で分解されるまで標的ｍＲＮＡを一過的に阻害する。短鎖ＲＮＡ分子を用いて遺伝子発現を阻害するための他の手段としては、例えば低分子テンポラルＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。
低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ヘアピン構造を作り出す内部ハイブリダイゼーションの領域を含む、典型的には約８０塩基対の長さのＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡ分子は、細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを形成し、ｓｉＲＮＡが順次、遺伝子発現をノックダウンする。ｓｈＲＮＡの利点は、それらが、より長期間の発現または安定な発現のために、つまり標的ｍＲＮＡのより長期間のノックダウンのために、ｓｈＲＮＡをプラスミドベクター中に組み込み、ゲノムＤＮＡに組み入れることができることである。
低分子干渉ＲＮＡは、ｍＲＮＡ分解経路を介して遺伝子サイレンシングし、一方でｓｔＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、内因的にコードされたヘアピン構造前駆体からプロセシングされるおよそ２１または２２ヌクレオチドのＲＮＡであり、翻訳抑制を介して遺伝子サイレンシングするように機能する。例えば、ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ． （２００２）． ＲＮＡ ８（６）：８４２－５０； Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ． （２００４）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８８）：１２８９－９２； Ｈｅ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ． （２００４）． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ５（７）：５２２－３１を参照されたい。
マイクロＲＮＡはまた、５２ＢＰ１を阻害するためにも用いられ得る。マイクロＲＮＡは、結合により標的ｍＲＮＡの転写産物の発現を調節する、平均で２２ヌクレオチドの低分子非コード化ＲＮＡである。それらの標的へのマイクロＲＮＡの結合は、マイクロＲＮＡの２～８位と、翻訳、安定性、局在化に影響を及ぼすｍＲＮＡ成分である標的３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の間の相補性塩基対合により指定される。そのようなマイクロＲＮＡは、５３ｂｐ１の３’ＵＴＲの既知の配列を利用して設計され得る。加えてこのマイクロＲＮＡはまた、安定性の上昇、体内での分解の減少および細胞内取り込み増加などの他の所望の特性を増加させるように修飾され得る。
あるいは二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、哺乳動物においてうまくいくことが近年に示された、様々な生物体で遺伝子発現を干渉する強力な方法である（Ｗｉａｎｎｙ ａｎｄ Ｚｅｒｎｉｃｋａ－Ｇｏｅｔｚ． （２００２）， Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２：７０－７５）。５３ＢＰ１ポリヌクレオチドの配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、細胞に導入され得る。
阻害性核酸は、５３ＢＰ１のｍＲＮＡ内の標的領域に相補的なアンチセンス核酸配列であってよい。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的領域に結合し翻訳を阻害してよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡであってよく、またはリボデオキシヌクレオチドの合成類似体を含んでよい。したがってアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５３ＢＰ１の発現を阻害する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、またはより長いヌクレオチド長であり得る。
エンドヌクレアーゼ
ゲノムＤＮＡの修飾のための方法は、当該技術分野で周知である。用語「ＤＮＡ消化剤」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間の結合（即ち、ホスホジエステル結合）を切断できる薬剤を指す。
ゲノムＤＮＡの修飾のための方法は、当該技術分野で周知である。用語「ＤＮＡ消化剤」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間の結合（即ち、ホスホジエステル結合）を切断できる薬剤を指す。
一実施形態において、ＤＮＡ消化剤は、ヌクレアーゼである。ヌクレアーゼは、核酸を加水分解する酵素である。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼとして分類されてよい。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の内側の核酸の間の結合の加水分解を触媒する酵素群のいずれかである。エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の末端からの単一ヌクレオチドの加水分解を触媒する酵素群のいずれかである。ヌクレアーゼはまた、それらが特異的にＤＮＡを消化するか、またはＲＮＡを消化するかに基づいて分類されてもよい。ＤＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼまたはＤＮａｓｅと称され得、一方でＲＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅと称され得る。幾つかのヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖のどちらかの核酸配列に特異的である。幾つかの酵素は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの両方の特性を有する。加えて幾つかの酵素は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の配列を消化し得る。
５３ＢＰ１は、５３ＢＰ１をコードする遺伝子を標的とする配列特異的エンドヌクレアーゼを利用することにより阻害されてもよい。
エンドヌクレアーゼの非限定的例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮダイマー、ＺＦＮｉｃｋａｓｅ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。メガヌクレアーゼは、大きなＤＮＡ配列（１２塩基対以上）を認識および切断するそれらの能力を特徴とする、エンドヌクレアーゼである。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧおよびＰＩ－Ｓｃｅファミリーのエンドヌクレアーゼを含む任意の適切なメガヌクレアーゼが、本発明の方法で用いられて、宿主ゲノム中で二本鎖切断を作り出してよい。
本明細書に記載される方法および組成物で用いられ得る配列特異的ヌクレアーゼ系の一例としては、ＣＲＩＳＰＲ系が挙げられる（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ， ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ， ４８２， ３３１－３３８ （２０１２）; Ｊｉｎｅｋ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３７， ８１６－８２１ （２０１２）； Ｍａｌｉ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， ８２３－８２６ （２０１３）； Ｃｏｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， ８１９－８２３ （２０１３））。 ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）系は、標的ＤＮＡのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合および配列特異的切断を活用する。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓの組み合わせは、ヌクレアーゼに部位特異性を付与する。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ゲノムＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）部位（ＮＧＧ）の上流の標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的な約２０のヌクレオチドと、一定のＲＮＡ足場領域とを含有する。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質は、ｓｇＲＮＡと、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡとに結合し、ＰＡＭ部位の上流の定義された場所に二本鎖切断を導入する。Ｃａｓ９は、ＨＮＨおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼに相補的な２つの独立したヌクレアーゼドメインを宿し、その２つのドメインのどちらかを変異させることにより、Ｃａｓ９タンパク質は、一本鎖切断を導入するニッカーゼに変換され得る（Ｃｏｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， ８１９－８２３ （２０１３））。具体的には、本開示の方法および組成物が、Ｃａｓ９の一本鎖または二本鎖誘導バージョンと共に、および他の細菌Ｃａｓ９様系などの他のＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼと共に用いられ得ることが、企図される。本明細書に記載される本発明の方法および組成物の配列特異性ヌクレアーゼは、操作され、キメラであり、または生物体から単離されてよい。ヌクレアーゼは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびタンパク質の形態で細胞中に導入され得る。５３ｂｐ１を阻害または下方制御するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の適用は、容易に調整される。
一実施形態において、ＤＮＡ消化剤は、部位特異性ヌクレアーゼであり得る。別の実施形態において、部位特異性ヌクレアーゼは、Ｃａｓファミリーヌクレアーゼであってよい。より具体的実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであってよい。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然由来Ｃａｓタンパク質の機能的誘導体であってよい。
充分に特徴づけられたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に加え、Ｃｐｆ１（ＰｒｅＦｒａｎサブタイプのＣａｓタンパク質１）と呼ばれる新しいＣＲＩＳＰＲ酵素が、近年になり記載された。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠き、Ｔリッチのプロトスペーサ隣接モチーフを利用する、シングルＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。本著者らは、Ｃｐｆ１がＣａｓ９のものと明確に異なる特徴を有する強力なＤＮＡ干渉を介在することを実証した。したがって本開示の一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系は、標的遺伝子内の所望の領域を切断するために用いられ得る。
さらなる実施形態において、ＤＮＡ消化剤は、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬＥＮは、特異的ヌクレアーゼ配列に結合するＴＡＬエフェクタードメインと、標的部位で二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼドメインとで構成される（ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１１０７２２４６号；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２９， １４３－１４８ （２０１１）； Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ３９， ｅ８２ （２０１１））。配列特異性エンドヌクレアーゼは、本質的にモジュラーであってよく、ＤＮＡ結合特異性は、１つまたは複数のモジュールを配列することにより得られる。Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２１， ２８９－２９７ （２００１）。Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６， １５０９－１５１２ （２００９）。
ＺＦＮは、エフェクターエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ）に融合された２つ以上の（例えば、２～８、３～６、６～８、またはより多くの）配列特異性ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガードメイン）で構成され得る。Ｐｏｒｔｅｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３， ９６７－９７３ （２００５)。Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ＵＳＡ， ９３： １１５６－１１６０ （２００７）；米国特許第６，８２４，９７８号；ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９５／０９２３３号およびＷＯ１９９４０１８３１３号。
一実施形態において、ＤＮＡ消化剤は、オメガ、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓからなる群、またはその群から選択される部位特異的ヌクレアーゼである。
本明細書に記載される方法および組成物の配列特異性エンドヌクレアーゼは、操作され、キメラであり、または生物体から単離されてよい。エンドヌクレアーゼは、例えば変異誘発により、特異的ＤＮＡ配列を認識するように操作され得る。Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３８７０－３８７９（２００２）。コンビナトリアルアセンブリは、異なる酵素を形成するタンパク質サブユニットが会合または融合され得る方法である。Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３５５： ４４３－４５８ （２００６）。特定の実施形態において、これらの２つのアプローチ、変異誘発およびコンビナトリアルアセンブリ、を組み合わせて、所望のＤＮＡ認識配列を有する操作されたエンドヌクレアーゼを生成できる。
配列特異性ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、またはｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡなどの配列特異性ヌクレアーゼをコードする核酸の形態で、細胞に導入され得る。核酸は、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのより大きな構築物の一部として、または直接、例えば電気穿孔、脂質小胞、ウイルストランスポータ、マイクロインジェクション、およびバイオリスティクスにより、送達され得る。同様に、１種または複数のトランスジーンを含有する構築物は、核酸を細胞に導入するのに適した任意の方法により送達され得る。
本開示の方法で用いられるシングルガイドＲＮＡ（複数可）は、ゲノム中の所定の切断部位へのＣａｓ－ｓｇＲＮＡ複合体の結合を指向するように設計され得る。一実施形態において、切断部位は、常染色体ドミナント疾患関連遺伝子の領域を含有するフラグメントまたは配列を放出するように選択されてよい。
本開示で用いられるｓｇＲＮＡ（複数可）は、約５～１００の間のヌクレオチド長であってよく、またはより長くてよい（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１ ９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ヌクレオチド長、またはより長く）なり得る。一実施形態において、ｓｇＲＮＡ（複数可）は、約１５～約３０の間のヌクレオチド長（例えば、約１５～２９、１５～２６、１５～２５；１６～３０、１６～２９、１６～２６、１６～２５；または約１８～３０、１８～２９、１８～２６、または１８～２５ヌクレオチド長）。
ｓｇＲＮＡ設計を容易にするために、多くの計算ツールが開発されている。
リボザイム
阻害剤は、５３ＢＰ１遺伝子の発現を阻害するリボザイムであってよい。
阻害剤は、５３ＢＰ１遺伝子の発現を阻害するリボザイムであってよい。
リボザイムを、当該技術分野で公知の方法を利用して、化学合成し構造的に修飾して、それらの安定性および触媒活性を上昇させてもよい。リボザイムをコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知の遺伝子送達メカニズムを介して、宿主細胞に導入され得る。
核酸に基づく発現系
幾つかの実施形態において、５３ＢＰ１を標的とする核酸に基づく薬剤が存在する。具体的実施形態において、核酸剤は、真核細胞での発現のためのベクター上に存在する。
幾つかの実施形態において、５３ＢＰ１を標的とする核酸に基づく薬剤が存在する。具体的実施形態において、核酸剤は、真核細胞での発現のためのベクター上に存在する。
ベクター
用語「ベクター」は、複製され得る細胞の中に導入されるようにその中に核酸配列が挿入され得る、担体核酸分子を指すために用いられる。核酸配列は、「外因性」であり得、それは、その中にベクターが導入される細胞に対しそれが外来物であること、またはその配列が細胞内の配列と相同であるがその配列が通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にあること、を意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、標準の組換え技術によりベクターを構築するための知識を身につけているであろう（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９４参照）。
用語「ベクター」は、複製され得る細胞の中に導入されるようにその中に核酸配列が挿入され得る、担体核酸分子を指すために用いられる。核酸配列は、「外因性」であり得、それは、その中にベクターが導入される細胞に対しそれが外来物であること、またはその配列が細胞内の配列と相同であるがその配列が通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にあること、を意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、標準の組換え技術によりベクターを構築するための知識を身につけているであろう（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９４参照）。
用語「発現ベクター」は、転写され得るＲＮＡをコードする核酸を含む遺伝子構築物の任意の型を指す。幾つかの例において、ＲＮＡ分子はその後、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の例において、これらの配列は、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの生成において、翻訳されない。発現ベクターは、種々の「制御配列」を含有でき、それは、特有の宿主細胞中で動作可能に連結されたコード配列の転写、かつおそらく翻訳に必須の核酸配列を指す。転写および翻訳を左右する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も果たす核酸配列を含有してよく、それを以下に記載する。
本開示のベクターは、当該技術分野で公知の多数のプロモータのいずれかを含んでよく、プロモータは、構成的、調節性または誘導性、細胞型特異性、組織特異性、または種特異性である。転写を指向するのに充分な配列に加え、本発明のプロモータ配列は、転写をモジュレートすることに関与する他の調節エレメント（例えば、エンハンサ、コザック配列およびイントロン）の配列も含み得る。遺伝子の構成的発現を駆動するのに有用な多くのプロモータ／調節配列が、当該技術分野で利用可能であり、例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルスプロモータ）、ＥＦ１ａ（ヒト伸長因子1アルファプロモータ）、ＳＶ４０（サル空胞ウイルス４０プロモータ）、ＰＧＫ（哺乳動物ホスホグリセリンキナーゼプロモータ）、Ｕｂｃ（ヒトユビキチンＣプロモータ）、ヒトベータアクチンプロモータ、げっ歯類ベータアクチンプロモータ、ＣＢｈ（ニワトリベータアクチンプロモータ）、ＣＡＧ（ハイブリッドプロモータはＣＭＶエンハンサ、ニワトリベータアクチンプロモータ、およびウサギベータグロビンスプライスアクセプタを含有する）、ＴＲＥ（テトラサイクリン応答エレメントプロモータ）、Ｈ１（ヒトポリメラーゼＩＩＩ ＲＮＡプロモータ）、Ｕ６（ヒトＵ６核内低分子プロモータ）、および同様のものを含むが、これらに限定されない。さらに、ＲＮＡ、膜貫通型タンパク質、または他のタンパク質の誘導性のおよび組織特異的な発現が、誘導性のまたは組織特異的なプロモータ／調節配列の制御下にそのような分子をコードする核酸を配置することにより遂行され得る。この目的に有用な組織特異性または誘導性プロモータ／調節配列の例としては、ロドプシンプロモータ、ＭＭＴＶ ＬＴＲ誘導性プロモータ、ＳＶ４０後期エンハンサ／プロモータ、シナプシン１プロモータ、ＥＴ肝細胞プロモータ、ＧＳグルタミンシンターゼプロモータおよび多くの他のものが挙げられるが、これらに限定されない。様々な市販のユビキタスおよび組織特異性プロモータは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｍ－ａ－ｌｉｓｔおよびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／で見出され得る。加えて、当該技術分野で周知のプロモータは、金属、グルココルチコイド、テトラサイクリンホルモンおよび同様のものなどの誘導剤に応答して誘導され得、また本発明で使用が企図される。したがって、本開示は、動作可能に連結された所望のタンパク質の配列を駆動できる当該技術分野で公知の任意のプロモータ／調節配列の使用を包含することが、察知されよう。
プロモータおよびエンハンサに加えて、ベクターはさらに、コード配列の効率的翻訳にも必要とされ得る特異的開始シグナルを含み得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接の配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む、外因性翻訳制御シグナルが、提供される必要があり得る。当業者は容易に、これを決定し必須のシグナルを提供できるであろう。開始コドンが、インサート全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは、周知である。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のどちらかであり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサエレメントの包含により増強されてよい。
特定の実施形態において、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子、または多シストロン性伝令を作り出すために用いられる。
ベクターはまた、終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、および複製起点を含む。
それが複製され得る細胞中への導入のために、その中に核酸配列が挿入され得るベクターを構築することは、当業者の熟練の範囲内である。
プラスミドベクター
特定の実施形態において、プラスミドベクターは、宿主細胞を形質転換するための使用に企図される。一般に、宿主細胞と適合性がある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して用いられる。ベクターは通常、複製部位ならびに、形質転換された細胞において表現型選択を提供できるマーキング配列を有する。
特定の実施形態において、プラスミドベクターは、宿主細胞を形質転換するための使用に企図される。一般に、宿主細胞と適合性がある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して用いられる。ベクターは通常、複製部位ならびに、形質転換された細胞において表現型選択を提供できるマーキング配列を有する。
加えて、宿主微生物と適合性があるレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターが、これらの宿主に関連する形質転換ベクターとして用いられ得る。
さらなる有用なプラスミドベクターとしては、ｐＩＮベクター、ならびに後期精製および分離または切断のためのグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質を作製する際の使用のためのｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の適切な融合タンパク質は、ベータガラクトシダーゼ、ユビキチンおよび同様のものを有するものである。
ウイルスベクター
受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞に感染する、または進入する、および宿主細胞ゲノムに組み入れられウイルス遺伝子を安定におよび効率的に発現する特定のウイルスの能力は、それらのウイルスを細胞（例えば、哺乳動物細胞）への外来核酸の転移のための魅力的な候補にした。本明細書に記載される成分は、５３ＢＰ１を標的とするウイルスベクターであり得る。核酸を送達するのに用いられ得るウイルスベクターの非限定的例を、以下に記載する。
受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞に感染する、または進入する、および宿主細胞ゲノムに組み入れられウイルス遺伝子を安定におよび効率的に発現する特定のウイルスの能力は、それらのウイルスを細胞（例えば、哺乳動物細胞）への外来核酸の転移のための魅力的な候補にした。本明細書に記載される成分は、５３ＢＰ１を標的とするウイルスベクターであり得る。核酸を送達するのに用いられ得るウイルスベクターの非限定的例を、以下に記載する。
アデノウイルスベクター
核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡへの組み入れのための低い能力を有することが知られているが、この特色は、これらのベクターにより与えられる遺伝子転移の高い効率により埋め合わされる。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングを支援するため、および（ｂ）その中でクローニングされた組織または細胞特異性構築物を最終的に発現するため、に充分なアデノウイルス配列を含有するそれらの構築物を含むことを意味する。遺伝子構成またはアデノウイルスという３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡの知識は、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片を最大７ｋｂの外来配列で置換することを可能にする。
核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡへの組み入れのための低い能力を有することが知られているが、この特色は、これらのベクターにより与えられる遺伝子転移の高い効率により埋め合わされる。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングを支援するため、および（ｂ）その中でクローニングされた組織または細胞特異性構築物を最終的に発現するため、に充分なアデノウイルス配列を含有するそれらの構築物を含むことを意味する。遺伝子構成またはアデノウイルスという３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡの知識は、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片を最大７ｋｂの外来配列で置換することを可能にする。
ＡＡＶベクター
核酸は、アデノウイルス支援トランスフェクションを利用して細胞中に導入されてよい。増加されたトランスフェクション効率が、アデノウイルス連結系を利用する細胞系で報告されている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、それが高い組み入れ頻度を有するため、およびそれが非分裂細胞に感染でき、したがってそれを、例えば組織培養またはインビボにおいて、哺乳動物細胞への遺伝子送達のために有用にし得るため、本開示の組成物中での使用のための魅力的なベクター系である。ＡＡＶは、感染性のための広範囲の宿主を有する。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号に記載されており、それらの特許はそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
核酸は、アデノウイルス支援トランスフェクションを利用して細胞中に導入されてよい。増加されたトランスフェクション効率が、アデノウイルス連結系を利用する細胞系で報告されている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、それが高い組み入れ頻度を有するため、およびそれが非分裂細胞に感染でき、したがってそれを、例えば組織培養またはインビボにおいて、哺乳動物細胞への遺伝子送達のために有用にし得るため、本開示の組成物中での使用のための魅力的なベクター系である。ＡＡＶは、感染性のための広範囲の宿主を有する。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号に記載されており、それらの特許はそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、遺伝子を宿主ゲノムに組み入れるそれらの能力、多量の外来遺伝子材料を転移する能力、広範囲の種および細胞株に感染する能力、ならびに特別な細胞株にパッケージングされる能力のため、送達ベクターとして有用である。
レトロウイルスは、遺伝子を宿主ゲノムに組み入れるそれらの能力、多量の外来遺伝子材料を転移する能力、広範囲の種および細胞株に感染する能力、ならびに特別な細胞株にパッケージングされる能力のため、送達ベクターとして有用である。
レトロウイルスベクターを構築するために、核酸（例えば、目的の標的核酸を含むもの）は、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損性のウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有するがＬＴＲおよびパッケージング成分を有しないパッケージング細胞株が、構築される。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドが、特別な細胞株に導入されると（例えば、リン酸カルシウム沈殿法により）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子中にパッケージさせ、それはその後、培養培地中に分泌される。組換えレトロウイスルを含有する培地はその後、収集され、場合により濃縮され、遺伝子転移に用いられる。
レンチウイルスは、複合的レトロウイルスであり、それらは、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節または構造的機能を有する他の遺伝子を含有する。レンチウイルスベクターは、当該技術分野で周知である。レンチウイルスの幾つかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原ウイルス遺伝子の減弱を増強することにより作製されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失され、ベクターを生物学的に安全にする。
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染でき、インビボおよびエクスビボの両方で遺伝子転移および核酸配列発現に用いられ得る。例えば、非分裂細胞に感染でき、適切な宿主細胞がパッケージング機能、即ちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加え、ｒｅｖおよびｔａｔを有する２種以上のベクターでトランスフェクトされる、組換えレンチウイルスが、米国特許第５，９９４，１３６号に記載される。特有の細胞型の受容体への標的化のするために、エンベロープタンパク質と抗体または特有のリガンドとの連結により組換えウイルスを標的にしてもよい。例えば、特異的標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子と一緒に、ウイルスベクター中に目的の配列（調節領域を含む）を挿入することにより、ベクターは、直ちに標的特異的になる。
他のウイルスベクター
他のウイルスベクターが、本発明の方法で用いられてもよい。ワクチニアウイルス、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが、用いられてよい。
他のウイルスベクターが、本発明の方法で用いられてもよい。ワクチニアウイルス、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが、用いられてよい。
染色体外ベクター
特定の実施形態において、開示される方法は、染色体外遺伝子エレメントを使用する（例えば、５３ＢＰ１遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼまたは阻害性核酸の発現のため）。例えば、染色体外的に複製するベクター、またはエピソーム的に複製できるるベクターが、用いられ得る。さらなる態様において、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）が、用いられ得る。
特定の実施形態において、開示される方法は、染色体外遺伝子エレメントを使用する（例えば、５３ＢＰ１遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼまたは阻害性核酸の発現のため）。例えば、染色体外的に複製するベクター、またはエピソーム的に複製できるるベクターが、用いられ得る。さらなる態様において、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）が、用いられ得る。
アデノウイルス、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）などの、多数のＤＮＡウイルス、または出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）を含有するプラスミドもまた、哺乳動物細胞中で染色体外的に複製する。これらのエピソームプラスミドは生来、ベクター組み入れに関連する全てのこれらの欠点を有しない。エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）を含むリンパ好性ヘルペスウイルスに基づく系もまた、染色体外的に複製し、体細胞への遺伝子エレメントの送達を支援できる。例えば、エピソームベクターに基づくアプローチは、ＥＢＶに基づく系のエレメントを利用し得る。有用なＥＢＶエレメントは、ＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ－１、またはそれらのバリアントもしくは機能的均等物である。
染色体外ベクターに基づく系の追加的利点は、これらの外因性エレメントが細胞に導入された後やがて消失し、元のエレメントを本質的に含まない自立したｉＰＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化した細胞をもたらし得ることである。
ベクター送達および細胞形質転換
開示される方法での使用のためのオルガネラ、細胞、組織または生物体の形質転換のための核酸送達の適切な方法は、本明細書に記載される通り、または当業者に知られる通り、それにより核酸（例えば、ＤＮＡ）がオルガネラ、細胞、組織または生物体に導入され得る、事実上いずれの方法も包含する。そのような方法としては、ＤＮＡの直接送達がエクスビボトランスフェクション、マイクロインジェクションなどの注入、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストランとそれに続くポリエチレングリコール、直接的な音波負荷、リポソーム介在性トランスフェクション、受容体介在性トランスフェクション、マイクロプロジェクタイル衝撃、シリコンカーバイド繊維との撹拌、アグロバクテリウム介在性形質転換、プロトプラストのＰＥＧ介在性形質転換、脱水／阻害介在性ＤＮＡ取り込み、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらなどの技術の適用を通して、オルガネラ（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）または生物体（複数可）は、安定に、または一過的に形質転換されてよい。
開示される方法での使用のためのオルガネラ、細胞、組織または生物体の形質転換のための核酸送達の適切な方法は、本明細書に記載される通り、または当業者に知られる通り、それにより核酸（例えば、ＤＮＡ）がオルガネラ、細胞、組織または生物体に導入され得る、事実上いずれの方法も包含する。そのような方法としては、ＤＮＡの直接送達がエクスビボトランスフェクション、マイクロインジェクションなどの注入、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストランとそれに続くポリエチレングリコール、直接的な音波負荷、リポソーム介在性トランスフェクション、受容体介在性トランスフェクション、マイクロプロジェクタイル衝撃、シリコンカーバイド繊維との撹拌、アグロバクテリウム介在性形質転換、プロトプラストのＰＥＧ介在性形質転換、脱水／阻害介在性ＤＮＡ取り込み、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらなどの技術の適用を通して、オルガネラ（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）または生物体（複数可）は、安定に、または一過的に形質転換されてよい。
人工多能性幹細胞を作製する方法
本発明の方法は、５３ＢＰ１の阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御により、より効率的に、かつそれらがより安定である人工多能性幹細胞を作製することである。
本発明の方法は、５３ＢＰ１の阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御により、より効率的に、かつそれらがより安定である人工多能性幹細胞を作製することである。
ヒト体細胞は、開示される方法の出発原料である。ヒト体細胞は、個体に対し自家性または個体に対し同種異系であり得る。
特定の実施形態において、人工多能性幹細胞は、成体体細胞の１つまたは複数の型を提供し、かつ５３ＢＰ１発現を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する１種または複数の薬剤を体細胞に導入する、本明細書に記載される方法により作製される。したがって一実施形態は、ヒト体細胞中に５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する１種または複数の薬剤を導入すること、およびヒト人工多能性幹細胞を作製する条件下でこの細胞を培養すること、を含む、ヒト人工多能性幹細胞を作製する方法である。
具体的実施形態において、薬剤は、核酸、ポリペプチド、ペプチド、低分子、化学物質、エンドヌクレアーゼ、またはその混合物である。薬剤が核酸である場合、薬剤は、５３ＢＰ１ ｍＲＮＡを直接標的としてよい。具体的実施形態において、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびそれらの組み合わせである。標的とする任意の核酸は、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはプラスミドなどの発現ベクター上に存在してよい。
幾つかの実施形態において、５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する薬剤、即ち阻害性核酸は、他のリプログラミング因子、例えばＯＳＫＭ因子と同じベクター上に存在する。幾つかの実施形態において、５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する薬剤は、他のリプログラミング因子とは別のベクター上に存在する。幾つかの実施形態において、薬剤は、薬剤（複数可）を含む培地中で細胞を培養することにより細胞に導入される。
幾つかの実施形態において、５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する薬剤は、他のリプログラミング因子と同時に細胞に導入され、即ち薬剤は、リプログラミング工程の開始時に体細胞に導入され、工程の終了まで存在する。
幾つかの実施形態において、５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する薬剤は、一過性であり、即ち５３ＢＰ１の機能は、リプログラミング後にｉＰＳＣに戻る。
改善されたゲノム安定性を有するｉＰＳＣを作製する方法は、実施例７で例証される。
キット
本明細書に記載される組成物のいずれかは、キットに含まれてよい。したがってキットは、適切なコンテナ手段で、本発明に関係する組成物を含む。具体的態様において、キットは、５３ＢＰ１を標的とする１種または複数の薬剤；体細胞；５３ＢＰ１を標的とする１種または複数の薬剤を含む発現ベクター；本明細書に開示される方法により作製された人工多能性細胞；本明細書に開示される方法により作製された人工多能性細胞により作製された組織などを含む。
本明細書に記載される組成物のいずれかは、キットに含まれてよい。したがってキットは、適切なコンテナ手段で、本発明に関係する組成物を含む。具体的態様において、キットは、５３ＢＰ１を標的とする１種または複数の薬剤；体細胞；５３ＢＰ１を標的とする１種または複数の薬剤を含む発現ベクター；本明細書に開示される方法により作製された人工多能性細胞；本明細書に開示される方法により作製された人工多能性細胞により作製された組織などを含む。
キットの成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のどちらかで包装されてよい。キットのコンテナ手段は一般に、その中に成分が配置され得、好ましくは適切に分取され得る、少なくとも１種のバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他のコンテナ手段を含む。キットの中に１つより多くの成分が存在する場合、キットは一般に、その中に追加の成分が別個に配置され得る、第二、第三または他の追加的コンテナも含有する。しかし成分の様々な組み合わせが、バイアルに含まれてよい。本発明のキットはまた典型的に、商業的販売のために厳重に密閉された組成物および任意の他の試薬コンテナを含有するための手段を含む。そのようなコンテナは、その中に所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形されたプラスチックコンテナを含んでよい。
キットの成分が、１種および／または複数の溶液中で提供される場合、溶液は、水性溶液であり、滅菌水性溶液が、特に好ましい。組成物は、シリンジ注射可能な組成物に配合されてもよい。その場合、コンテナ手段は、それ自体がシリンジ、ピペット、および他のそのような同様の装置であってよく、そこから配合物が、身体の感染エリアに適用され、動物に注射され、および／またはキットの他の成分に適用されおよび／もしくは混合されてよい。しかし、キットの成分は、乾燥粉末（複数可）として提供されてよい。試薬および／または成分が、乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加により再構成され得る。溶媒が別のコンテナ手段で提供され得ることも、想定される。
実施例
本発明は、以下の限定的実施例を参照することでより良好に理解されてよく、実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。それらは、本発明の広義の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
本発明は、以下の限定的実施例を参照することでより良好に理解されてよく、実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。それらは、本発明の広義の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
実施例１ － 実施例２～６のための材料および方法
動物育種
Ｂａｒｄ１変異体を作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの遺伝的背景のヘテロ接合型Ｂａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／＋およびＢａｒｄ１Ｓ５６３Ｆ／＋雌（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）を、同じ遺伝子型の雄と繁殖させた。Ｂｒｃａ１Ｓｍａｒｃａｌ１遺伝子型コレクションを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと１２９Ｓｖの混合遺伝的背景のＢｒｃａ１ｔｒ／＋Ｓｍａｒｃａｌ１＋／－動物のインタークロスから作り出した。Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋対立遺伝子は、（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１）に記載されている。Ｓｍａｒｃａｌ１の変異体マウスは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＭＰＣ）から得られた。Ｂｒｃａ１ ５３ｂｐ１の組み合わせの遺伝子型パネルを、５７ＢＬ／６Ｊと１２９Ｓｖの混合遺伝的背景のＢｒｃａ１ｔｒ／＋５３ｂｐ１＋／－雄および雌のインタークロスから作製した。ＡＢＣと称されるＡｂｒａｘａｓ Ｂａｃｈ１ ＣｔＩＰ遺伝子型コレクションでは、Ｆ１トリプルヘテロ接合型Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋動物を作製するために、混合遺伝的背景（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと１２９Ｓｖ）ＡＡＢＢマウスをＣＣに最初に交配させた。Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋のＦ１世代をインタークロスして、ダブルホモ接合型変異体の異なる組み合わせを得た。トリプルホモ接合型ホスホセリン変異体を作製するために、Ｆ２ Ａ＋ＢＢＣＣ雄をＦ２ Ａ＋ＢＢＣＣまたはＡ＋ＢＢＣ＋雌に交配させた。Ａ＋ＢＢＣＣ × Ａ＋ＢＢＣＣ交配から、９つの胚のうち１つが、トリプルホモ接合型変異体であった（予測のメンデル比１／４）。１つの追加的トリプルホモ接合型変異体の胚が、６９の胚を生成したトリプルヘテロ接合型インタークロス（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋ × Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋）から見出された（予測のメンデル比１／６４）。
動物育種
Ｂａｒｄ１変異体を作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの遺伝的背景のヘテロ接合型Ｂａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／＋およびＢａｒｄ１Ｓ５６３Ｆ／＋雌（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）を、同じ遺伝子型の雄と繁殖させた。Ｂｒｃａ１Ｓｍａｒｃａｌ１遺伝子型コレクションを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと１２９Ｓｖの混合遺伝的背景のＢｒｃａ１ｔｒ／＋Ｓｍａｒｃａｌ１＋／－動物のインタークロスから作り出した。Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋対立遺伝子は、（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１）に記載されている。Ｓｍａｒｃａｌ１の変異体マウスは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＭＰＣ）から得られた。Ｂｒｃａ１ ５３ｂｐ１の組み合わせの遺伝子型パネルを、５７ＢＬ／６Ｊと１２９Ｓｖの混合遺伝的背景のＢｒｃａ１ｔｒ／＋５３ｂｐ１＋／－雄および雌のインタークロスから作製した。ＡＢＣと称されるＡｂｒａｘａｓ Ｂａｃｈ１ ＣｔＩＰ遺伝子型コレクションでは、Ｆ１トリプルヘテロ接合型Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋動物を作製するために、混合遺伝的背景（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと１２９Ｓｖ）ＡＡＢＢマウスをＣＣに最初に交配させた。Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋のＦ１世代をインタークロスして、ダブルホモ接合型変異体の異なる組み合わせを得た。トリプルホモ接合型ホスホセリン変異体を作製するために、Ｆ２ Ａ＋ＢＢＣＣ雄をＦ２ Ａ＋ＢＢＣＣまたはＡ＋ＢＢＣ＋雌に交配させた。Ａ＋ＢＢＣＣ × Ａ＋ＢＢＣＣ交配から、９つの胚のうち１つが、トリプルホモ接合型変異体であった（予測のメンデル比１／４）。１つの追加的トリプルホモ接合型変異体の胚が、６９の胚を生成したトリプルヘテロ接合型インタークロス（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋ × Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋）から見出された（予測のメンデル比１／６４）。
線維芽細胞の誘導および遺伝子型判定
リプログラミング用に線維芽細胞を得るために、Ｅ１３．５マウス胚を、上記の交配から採取し、わずかの改良を加えて（Ｄｕｒｋｉｎ，２０１３）でのようにそれらを処理した。単一胚からの細胞をその後、１つの１０ｃｍ皿に播種し、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃Ｓ１１１５０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）およびＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１４０１６３）を補充したＤＭＥＭ ＨＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１０５６９０１０）からなるＭＥＦ培地中で生育させた。細胞を一度、Ｐ１に分割し、リプログラミング実験用に凍結した。全ての遺伝子型判定プライマーの配列を、表１に提供する。
リプログラミング用に線維芽細胞を得るために、Ｅ１３．５マウス胚を、上記の交配から採取し、わずかの改良を加えて（Ｄｕｒｋｉｎ，２０１３）でのようにそれらを処理した。単一胚からの細胞をその後、１つの１０ｃｍ皿に播種し、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃Ｓ１１１５０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）およびＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１４０１６３）を補充したＤＭＥＭ ＨＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１０５６９０１０）からなるＭＥＦ培地中で生育させた。細胞を一度、Ｐ１に分割し、リプログラミング実験用に凍結した。全ての遺伝子型判定プライマーの配列を、表１に提供する。
ウイルス調製および感染
この試験は、Ｔｅｔ－Ｏ－ＦＵＷ－ＯＳＫＭ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃２０３２１）およびＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃２０３４２）からなるドキシサイクリン誘導性レンチウイルス系を利用した。レンチウイルスは、製造業者の使用説明書で概説される通りＪｅｔｐｒｉｍｅトランスフェクション試薬（ＶＷＲ ＃８９１２９－９２２）を用いるプラスミドのトランスフェクションにより、２９３Ｔ細胞で調製した。手短に述べると、Ｔｅｔ－Ｏ－ＦＵＷベクターを、コラーゲンコーティングディッシュに播種された２９３Ｔ細胞中にＤｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ ｐＭＤ２ＶＳＶＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２５９）およびｐｓＰａｘ２（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６０）のエンベロープおよびパッケージングプラスミドと共にトランスフェクトした。１５％ ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃Ｓ１１１５０）およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）を補充した新鮮な抗生物質不含培地ＤＭＥＭ ＨＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１０５６９０１０）を、トランスフェクションの１６～２０時間後に提供した。ウイルス上清を、続く２日のそれぞれで収集し、４℃で最大４日間保持した。感染前に、２回収日の力価（ｔｉｔｅｒ）をプールし、４０μＭセルストレーナ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃０８－７７１－１）で濾過した。
この試験は、Ｔｅｔ－Ｏ－ＦＵＷ－ＯＳＫＭ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃２０３２１）およびＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃２０３４２）からなるドキシサイクリン誘導性レンチウイルス系を利用した。レンチウイルスは、製造業者の使用説明書で概説される通りＪｅｔｐｒｉｍｅトランスフェクション試薬（ＶＷＲ ＃８９１２９－９２２）を用いるプラスミドのトランスフェクションにより、２９３Ｔ細胞で調製した。手短に述べると、Ｔｅｔ－Ｏ－ＦＵＷベクターを、コラーゲンコーティングディッシュに播種された２９３Ｔ細胞中にＤｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ ｐＭＤ２ＶＳＶＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２５９）およびｐｓＰａｘ２（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６０）のエンベロープおよびパッケージングプラスミドと共にトランスフェクトした。１５％ ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃Ｓ１１１５０）およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）を補充した新鮮な抗生物質不含培地ＤＭＥＭ ＨＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１０５６９０１０）を、トランスフェクションの１６～２０時間後に提供した。ウイルス上清を、続く２日のそれぞれで収集し、４℃で最大４日間保持した。感染前に、２回収日の力価（ｔｉｔｅｒ）をプールし、４０μＭセルストレーナ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃０８－７７１－１）で濾過した。
感染のために、前日にＰ１マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を解凍し、１０ｃｍ皿あたり１×１０６細胞を播種した。感染は、間に８～９時間おきながら２ラウンドで進行した。手短に述べると、細胞を、８μｇ／ｍｌプロタミン硫酸塩（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃０２１９４７２９０５）を補充したＯＳＫＭ／ｒｔｔａウイルスミックス（１：１）とインキュベートした。感染ミックスを翌日に除去し、細胞を、新鮮なＭＥＦ培地（１０％ ＦＢＳ Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃Ｓ１１１５０、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９およびＰｅｎＳｔｒｅｐ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１４０１６３を含むＤＭＥＭ ＨＧ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１０５６９０１０）中で回復させた。
リプログラミング
感染の２日後に、細胞を、３日目の形質導入効率評定、５日目の分子分析、１６日目のコロニーピッキングおよび２０日目のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色のために再播種した。各実験において、異なる遺伝子型からの感染した線維芽細胞を、多数の密度で再播種して、最適なリプログラミング効率を可能にした。野生型細胞では、１００～３００細胞／ｍｍ２（２４ウェルディッシュの各ウェルに２０～６０Ｋ）が、多数のｉＰＳ細胞クローンを日常的に作製した。野生型以外では、２４ウェルディッシュの各ウェルあたり２０～６０Ｋはまた、Ｂａｒｄ１点変異体、Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋、およびＳｍａｒｃａｌ１または５３ｂｐ１との全ての組み合わせ変異；Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ、５３ｂｐ１－／－ならびにヘテロ接合型またはホモ接合型Ｓｍａｒｃａｌ１および５３ｂｐ１単一変異体に対し、最適であった。３つの遺伝子型Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１＋／－およびＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－は、６００～８００細胞／ｍｍ２（２４ウェルディッシュの各ウェルに１２０～１６０Ｋ）で播種した。なぜならｉＰＳクローンが野生型に選択された密度で観察されなかったためである。残りのＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ＢＰ１＋／－遺伝子型は、４５０細胞／ｍｍ２（２４ウェルディッシュに９０Ｋ／ウェル）で再播種された。これらのシーディング密度は後に、各遺伝子型のリプログラミング効率を計算するために利用された。ＯＳＫＭリプログラミング因子を、１５％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２８－０２８）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）、ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１１１４００５０）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１４０１６３）、２－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃２１９８５－０２３）および１０ｎｇ／μｌ ＬＩＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃３４－８５２１－８２）を補充したＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２９－０１８）からなるマウス胚幹（ｍＥＳ）細胞培地中で１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ ＃ Ｄ９８９１）により誘導した。形質導入効率を、Ｓｏｘ２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ＃０９－００２４）についての染色によりリプログラミング３日目に決定し、リプログラミング効率の計算に利用した。薬物処置によるリプログラミング実験は、リプログラミングの間に８日間０．２μＭでアフィジコリン（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ０７８１）、１０ｎＭでトポテカン（Ｔｔｐｏｔｅｃａｎ）（Ｓｉｇｍａ ＃Ｔ２７０５）または５μＭでＤＮＡ ＰＫ阻害剤ＮＵ７０２６（Ｔｏｃｒｉｓ ＃ ２８２８）を使用した。
感染の２日後に、細胞を、３日目の形質導入効率評定、５日目の分子分析、１６日目のコロニーピッキングおよび２０日目のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色のために再播種した。各実験において、異なる遺伝子型からの感染した線維芽細胞を、多数の密度で再播種して、最適なリプログラミング効率を可能にした。野生型細胞では、１００～３００細胞／ｍｍ２（２４ウェルディッシュの各ウェルに２０～６０Ｋ）が、多数のｉＰＳ細胞クローンを日常的に作製した。野生型以外では、２４ウェルディッシュの各ウェルあたり２０～６０Ｋはまた、Ｂａｒｄ１点変異体、Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋、およびＳｍａｒｃａｌ１または５３ｂｐ１との全ての組み合わせ変異；Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ、５３ｂｐ１－／－ならびにヘテロ接合型またはホモ接合型Ｓｍａｒｃａｌ１および５３ｂｐ１単一変異体に対し、最適であった。３つの遺伝子型Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１＋／－およびＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－は、６００～８００細胞／ｍｍ２（２４ウェルディッシュの各ウェルに１２０～１６０Ｋ）で播種した。なぜならｉＰＳクローンが野生型に選択された密度で観察されなかったためである。残りのＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ＢＰ１＋／－遺伝子型は、４５０細胞／ｍｍ２（２４ウェルディッシュに９０Ｋ／ウェル）で再播種された。これらのシーディング密度は後に、各遺伝子型のリプログラミング効率を計算するために利用された。ＯＳＫＭリプログラミング因子を、１５％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２８－０２８）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）、ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１１１４００５０）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１４０１６３）、２－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃２１９８５－０２３）および１０ｎｇ／μｌ ＬＩＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃３４－８５２１－８２）を補充したＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２９－０１８）からなるマウス胚幹（ｍＥＳ）細胞培地中で１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ ＃ Ｄ９８９１）により誘導した。形質導入効率を、Ｓｏｘ２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ＃０９－００２４）についての染色によりリプログラミング３日目に決定し、リプログラミング効率の計算に利用した。薬物処置によるリプログラミング実験は、リプログラミングの間に８日間０．２μＭでアフィジコリン（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ０７８１）、１０ｎＭでトポテカン（Ｔｔｐｏｔｅｃａｎ）（Ｓｉｇｍａ ＃Ｔ２７０５）または５μＭでＤＮＡ ＰＫ阻害剤ＮＵ７０２６（Ｔｏｃｒｉｓ ＃ ２８２８）を使用した。
あるいは、両末端ＤＳＢの誘導のために、細胞を、ドキシサイクリン介在性ＯＳＫＭ因子誘導の１日後に、６Ｇｙ ＩＲの１線量に供した。細胞を、リプログラミング１８～２０日目に固定し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＃ＳＫ－５１００）を用いてアルカリホスファターゼについて染色した。リプログラミング効率を、各遺伝子型について最適播種密度でのＳｏｘ２染色により決定される、感染細胞の数あたりのＡＰ陽性コロニーの数を考慮することにより、決定した。アフィジコリン、トポテカンおよびＩＲでの実験の感度スコアを、以下の通り計算した：野生型処置細胞のリプログラミング効率を、上記のとおり決定し、野生型非処置細胞のリプログラミング効率に正規化した。同じ手順を、各変異体遺伝子型に適用した。感度スコアを、処置された変異体（非処置変異体に正規化）に対する処置された野生型（非処置の野生型に正規化）の比率を計算することにより得た。大きなスコアは、高い感度に相当する。
免疫蛍光法、ウェスタンブロットおよびＤＮＡファイバー分析
γＨ２ＡＸ、ホスホＲＰＡ（Ｓ３３）および５３ｂｐ１の検出を、以下の抗体でリプログラミング５日目に実施した：ホスホＲＰＡ２Ｓｅｒ３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ ＰＡ５－３９８０９）；抗ホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ－Ｓｅｒ１３９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＃０５－６３６）；および５３ＢＰ１抗体Ｈ－３００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＃２２７６０）。Ｒａｄ５１の検出では、ｉＰＳ細胞株を１０Ｇｙで照射し、ＩＲの１．５時間後にＲａｄ５１（Ａｂ－１）ウサギｐＡｂ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＃ＰＣ１３０）で染色した。
γＨ２ＡＸ、ホスホＲＰＡ（Ｓ３３）および５３ｂｐ１の検出を、以下の抗体でリプログラミング５日目に実施した：ホスホＲＰＡ２Ｓｅｒ３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ ＰＡ５－３９８０９）；抗ホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ－Ｓｅｒ１３９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＃０５－６３６）；および５３ＢＰ１抗体Ｈ－３００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＃２２７６０）。Ｒａｄ５１の検出では、ｉＰＳ細胞株を１０Ｇｙで照射し、ＩＲの１．５時間後にＲａｄ５１（Ａｂ－１）ウサギｐＡｂ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＃ＰＣ１３０）で染色した。
ウェスタンブロットのために、Ｅ１３．５野生型および５３ｂｐ１変異体ＭＥＦを、８ＧｙのＩＲに供し、処置の６時間後に採取した。溶解を、ＲＩＰＡ緩衝液中で実施し、目的のタンパク質を、以下の抗体、ｐ２１（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ１８８２２４）およびα－チューブリン（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ４０７４）で検出した。
リプログラミングの間のＢｒｃａ１、Ｓｍａｒｃａｌ１および５３ｂｐ１の組み合わせ変異体でのＤＮＡファイバー分析を、Ｔｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００９に記載された通り実施した。手短に述べると、異なる遺伝子型の線維芽細胞を、３０分間２５μＭ ＣｌｄＵとリプログラミング５日目にインキュベートし、加温したＰＢＳで３回洗浄し、さらに３０分間１２５μＭ ＩｄＵとインキュベートした。フォーク停止をその後、２ｍＭヒドロキシ尿素（ＨＵ）での５時間処置により誘導した。ＡＢＣ遺伝子型コレクションおよびＢｒｃａ１ｔｒ／＋遺伝子型については、不死化された非感染線維芽細胞を、ＩｄＵと２０分間インキュベートし、その後、洗浄液およびＣｌｄＵと２０分間インキュベートした。フォーク停止を、２ｍＭ ＨＵで１．５時間誘導した。線維を、スライド上で伸展し、抗ＢｒｄＵ／ＣｌｄＵ（Ｂｉｏｒａｄ ＃ ＯＢＴ００３０）および抗－ＢｒｄＵ／ＩｄＵ（ＢＤ＃３４７５８０）抗体で染色した。撮像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡で１００倍対物レンズを用いて実施し、線維長を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ｃｅｌｌＳｅｎｓ画像および分析ソフトウエアで測定した。代わりの線維アッセイでは、フォーク停止を、１２５μＭ ＩｄＵとの３０分間インキュベートの間の２μＭピリドスタチン（ＰＤＳ）での処置により誘導した。
ＨＲアッセイ
異なる遺伝子型のＨＲ能力を、ｚｓＧＲｅｅｎ修復テンプレートがＨｓｐ９０ゲノム遺伝子座へ標的化されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアッセイで、マウスに誘導した多能性幹（ｉＰＳ）細胞において評価した。この方策は、Ｍａｔｅｏｓ－Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１７に詳細に記載されている。要するに、２００～３００×１０３の指数関数的に生育したｉＰＳ細胞を、製造業者の使用説明書に概説された通りＪｅｔｐｒｉｍｅトランスフェクション試薬（ＶＷＲ ＃８９１２９－９２２）により２００ｎｇ Ｃａｓ９－プロマイシンベクターおよび８００ｎｇ ｚｓＧｒｅｅｎ修復テンプレートで、トランスフェクトした。培地を、２４時間のトランスフェクションのおよそ２０時間後に交換した。Ｃａｓ９トランスフェクション細胞を豊富にするために、プレートを、１μｇ／ｍｌプロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ１１１３８－０３）でおよそ２０時間処置した。ｚｓＧｒｅｅｎのフローサイトメトリーを、プロマイシン選択からの回復３日目に実施した。潜在的に非トランスフェクトの細胞を除外するために、二重対立遺伝子標的化に対する単一対立遺伝子標的化の効率を、比較した。
異なる遺伝子型のＨＲ能力を、ｚｓＧＲｅｅｎ修復テンプレートがＨｓｐ９０ゲノム遺伝子座へ標的化されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアッセイで、マウスに誘導した多能性幹（ｉＰＳ）細胞において評価した。この方策は、Ｍａｔｅｏｓ－Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１７に詳細に記載されている。要するに、２００～３００×１０３の指数関数的に生育したｉＰＳ細胞を、製造業者の使用説明書に概説された通りＪｅｔｐｒｉｍｅトランスフェクション試薬（ＶＷＲ ＃８９１２９－９２２）により２００ｎｇ Ｃａｓ９－プロマイシンベクターおよび８００ｎｇ ｚｓＧｒｅｅｎ修復テンプレートで、トランスフェクトした。培地を、２４時間のトランスフェクションのおよそ２０時間後に交換した。Ｃａｓ９トランスフェクション細胞を豊富にするために、プレートを、１μｇ／ｍｌプロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ１１１３８－０３）でおよそ２０時間処置した。ｚｓＧｒｅｅｎのフローサイトメトリーを、プロマイシン選択からの回復３日目に実施した。潜在的に非トランスフェクトの細胞を除外するために、二重対立遺伝子標的化に対する単一対立遺伝子標的化の効率を、比較した。
増殖およびアポトーシス
増殖を評価するために、リプログラミング２日目の感染した線維芽細胞を、製造業者のプロトコルに概説された通り３７℃で２０分間５μＭ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＳＦＥ増殖色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｃ３４５５４）とインキュベートした。細胞をその後、１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ９８９１）を補充したＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２９－０１８）、１５％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２８－０２８）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）、ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１１１４００５０）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１４０１６３）、２－メルカプロエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃２１９８５－０２３）および１０ｎｇ／μｌ ＬＩＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃３４－８５２１－８２）で構成された新鮮なマウスＥＳ細胞培地に交換した。ＣＳＦＥとのインキュベーションの３日後（リプログラミング５日目）に、細胞を、フローサイトメトリーのために採取した。
増殖を評価するために、リプログラミング２日目の感染した線維芽細胞を、製造業者のプロトコルに概説された通り３７℃で２０分間５μＭ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＳＦＥ増殖色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃Ｃ３４５５４）とインキュベートした。細胞をその後、１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ９８９１）を補充したＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２９－０１８）、１５％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２８－０２８）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）、ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１１１４００５０）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１４０１６３）、２－メルカプロエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃２１９８５－０２３）および１０ｎｇ／μｌ ＬＩＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃３４－８５２１－８２）で構成された新鮮なマウスＥＳ細胞培地に交換した。ＣＳＦＥとのインキュベーションの３日後（リプログラミング５日目）に、細胞を、フローサイトメトリーのために採取した。
アポトーシス分析のために、細胞を、リプログラミング５日目に収集し、製造業者により提供されたプロトコルに従いＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Ｓｉｇｍａ ＃ ＡＰＯＡＦ－２０ＴＳＴ）により、固定せずに染色した。 初期および後期のアポトーシス細胞の数を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）についてフローサイトメトリーにより決定した。初期アポトーシスを、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色のみで標識し、一方で後期アポトーシス細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶおよびＰＩの両方について染色した。
実施例２ － リプログラミングはＢＲＣＴドメインホスホリガンド、Ａｂｒａｘａｓ、Ｂａｃｈ１およびＣｔＩＰとのＢＲＣＡ１の相互作用に依存する
リプログラミングが、２種の病原性Ｂｒｃａ１領域Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒおよびＢｒｃａ１Ｓ１５９８Ｆ／Ｓ１５９８Ｆのどちらかに対してホモ接合型であるマウス線維芽細胞中で重度に損なわれることが、過去に報告された（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。Ｂｒｃａ１ｔｒ対立遺伝子は、ＳＱクラスター領域、ＰＡＬＢ２結合配列、およびＢＲＣＴモチーフを含む、複数の重大なＢＲＣＡ１ドメインが欠如したＣ末端切断型タンパク質をコードする（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１）一方で、Ｂｒｃａ１Ｓ１５９８Ｆのタンパク質産物は、ＢＲＣＴドメインのリン酸結合のクレフトを特異的に破壊するミスセンス変異を有する（Ｓｈａｋｙａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。そのＢＲＣＴリン認識ドメインのおかげで、ＢＲＣＡ１は、ＡＢＲＡＸＡＳ、ＢＡＣＨ１／ＢＲＩＰ１／ＦＡＮＣＪ、およびＣｔＩＰを含む、複数のＤＮＡ修復因子のリン酸化アイソフォームと互いに排他的様式で相互作用し得る（Ｃａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｙｕ， １９９８）。これらのＢＲＣＴリンリガンドのそれぞれとの相互作用は、互いに排他的であるため、ＢＲＣＡ１は、ＢＲＣＡ１機能の様々な局面を媒介すると思われる、複数の明確に異なるインビボタンパク質複合体（例えば、ＢＲＣＡ１複合体Ａ、ＢおよびＣ）を形成し得る。
リプログラミングが、２種の病原性Ｂｒｃａ１領域Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒおよびＢｒｃａ１Ｓ１５９８Ｆ／Ｓ１５９８Ｆのどちらかに対してホモ接合型であるマウス線維芽細胞中で重度に損なわれることが、過去に報告された（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。Ｂｒｃａ１ｔｒ対立遺伝子は、ＳＱクラスター領域、ＰＡＬＢ２結合配列、およびＢＲＣＴモチーフを含む、複数の重大なＢＲＣＡ１ドメインが欠如したＣ末端切断型タンパク質をコードする（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１）一方で、Ｂｒｃａ１Ｓ１５９８Ｆのタンパク質産物は、ＢＲＣＴドメインのリン酸結合のクレフトを特異的に破壊するミスセンス変異を有する（Ｓｈａｋｙａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。そのＢＲＣＴリン認識ドメインのおかげで、ＢＲＣＡ１は、ＡＢＲＡＸＡＳ、ＢＡＣＨ１／ＢＲＩＰ１／ＦＡＮＣＪ、およびＣｔＩＰを含む、複数のＤＮＡ修復因子のリン酸化アイソフォームと互いに排他的様式で相互作用し得る（Ｃａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｙｕ， １９９８）。これらのＢＲＣＴリンリガンドのそれぞれとの相互作用は、互いに排他的であるため、ＢＲＣＡ１は、ＢＲＣＡ１機能の様々な局面を媒介すると思われる、複数の明確に異なるインビボタンパク質複合体（例えば、ＢＲＣＡ１複合体Ａ、ＢおよびＣ）を形成し得る。
ＢＲＣＡ１とＢＲＣＴホスホリガンドの１種または複数との相互作用が、リプログラミングに必要とされるかどうかをテストするために、Ａｂｒａｘａｓ（Ｓ４０４Ａ）、Ｂａｃｈ１（Ｓ９９４Ａ）および／またはＣｔｉｐ（Ｓ３２７）の重大なリン酸化部位におけるセリン－アラニン置換のためにホモ接合型であるマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、検査した（図１Ａ）。Ｂｒｃａ１Ｓ１５９８Ｆ／Ｓ１５９８Ｆ細胞の過去の試験は、ＢＲＣＴリン認識がＨＤＲ（Ｓｈａｋｙａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）およびＳＦＰ（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）の両方に、かつリプログラミング（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）にも必要であることを明らかにした。Ｂｒｃａｌのこれらの機能がＡｂｒａｘａｓ、Ｂａｃｈ１、および／またはＣｔｉｐとの相互作用に依存するかどうかを確かめるために、ホモ接合型ＡＡ、ＢＢ、およびＣＣミスセンス変異の組み合わせを有するＭＥＦおよびｉＰＳ細胞株を、検査した。ＨＤＲ機能を測定するために、Ｒａｄ５１リコンビナーゼの電離放射線誘導性フォーカス（ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｃｕｓ）（ＩＲＩＦ）形成を、１０Ｇｙ放射線照射の１．５時間後に野生型および変異細胞株で免疫蛍光顕微鏡測定により検査した。図１Ｂに示された通り、Ｒａｄ５１ ＩＲＩＦは、二重変異体ＭＥＦ（ＡＡＢＢ、ＢＢＣＣ、およびＡＡＣＣ）と同等のレベルで作製された一方で、ＩＲＩＦ形成は、三重変異体ＡＡＢＢＣＣにおいて重度に損なわれた。Ｃｔｉｐ点変異ＢＢＣＣおよびＡＡＣＣを含む遺伝子型は、より少ない数のＲａｄ５１フォーカスを有したが、その差は有意でなかった（図１Ｂ）。
ＢＢＣＣおよびＡＡＣＣ変異体のＨＤＲ競合をさらに検査するために、マウスゲノム中のＨｓｐ９０遺伝子座を標的としかつＨＤＲのためのｚｓＧｒｅｅｎ含有修復テンプレートを提供する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアッセイを利用した（Ｍａｔｅｏｓ－Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。この実験は、ＨＤＲに関するＢＢＣＣおよびＡＡＣＣの能力が著しく低減し、それがトリプルホモ接合型変異体ＡＡＢＢＣＣにおいて最も重度であることを明らかにした（図１Ｃ）。この差は、明確に異なる蛍光的に明るい集団を形成する、二重対立遺伝子で編集された細胞を考慮した場合に最も明白であった（図１Ｃ）。ＳＦＰ機能を測定するために、ＭＥＦをヒドロキシ尿素（ＨＵ）で処置して、ＤＮＡ複製の停止を誘導し、停止フォークの安定性を、ＤＮＡファイバー分析により評定した。予期された通り、かつＢｒｃａ１Ｓ１５９８Ｆ／Ｓ１５９８Ｆ変異体（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）と同様に、ＨＵ処置ＡＡＢＢＣＣ細胞は、野生型細胞に比べてＣｌｄＵ／ＩｄＵトラック長の比率の著しい低減に示される通り、ＨＵ停止複製フォークを保護できなかった（図１Ｄ）。
リプログラミング効率を評価するために、主要な野生型および変異体ＭＥＦを、ＯＳＫＭ因子をコードするドキシサイクリン誘導性レンチウイルスで感染させ、因子誘導の２０日後に多能性の初期マーカであるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）について染色した。全てのＣｔｉｐホスホセリン点変異体の遺伝子型ＢＢＣＣ、ＡＡＣＣおよびＡＡＢＢＣＣは、対照に比較して少ない数のＡＰ陽性コロニーを有し、この差は、トリプルホモ接合型変異体の場合に最も明白であった（図１Ｅ）。ＡＡＢＢＣＣのリプログラミング効率は、およそ１７倍、急降下し、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒおよびＢｒｃａ１Ｓ１５９８Ｆ／Ｓ１５９８Ｆについて過去に報告された結果を表現型模写した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。リプログラミングの他に、トリプルホモ接合型点変異体は、Ｅ１３．５ ＡＡＢＢＣＣ胚のサイズ低減により示される通り発達においても問題があった（図１Ｆ）。
まとめると、これらのデータは、ＡまたはＢのどちらかとの組み合わせでＢＲＣＡ１複合体Ｃの破壊はＨＤＲの効率を低減し、リプログラミングを損なうことを示した。３種のＢＲＣＡ１複合体Ａ、ＢおよびＣ全ての同時不活性化は、ＨＤＲおよびＳＰＦの両方の破壊をもたらし、これは乏しいリプログラミング表現型をさらに悪化させる。
実施例３ － 停止フォーク保護（ＳＦＰ）の損失はリプログラミング効率に影響を及ぼさない
ＤＮＡ損傷は、ＨＤＲまたはＳＦＰのどちらかの欠陥により作製され得るため、これらの工程のどちらが効率的な体細胞リプログラミングに必要とされるかを決定しようとした。インビボで、ＢＲＣＡ１は、明確に異なるリン酸認識特性を有するＣ末端ＢＲＣＴドメインを宿す関連タンパク質であるＢＡＲＤ１とのヘテロダイマーとして存在する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＳＦＰがリプログラミングに必要とされるかどうかを確かめるために、ＨＤＲ＋ＳＦＰ－表現型を提示する細胞を、１）それらがホモ接合型Ｂａｒｄ１機能分離型（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）変異を担うため、または２）それらがＢｒｃａ１もしくはＢａｒｄ１変異にとってヘテロ接合型であるため、検査した。第一に、Ｂａｒｄ１Ｋ６０７ＡおよびＢａｒｄ１Ｓ５６３ＦがＨＤＲに影響を与えずにＳＦＰを特異的に排除する機能分離型変異であるため、Ｂａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／Ｋ６０７ＡおよびＢｒｃａ１Ｓ１５９８Ｆ／Ｓ１５９８Ｆ細胞は、ＨＤＲ＋ＳＦＰ－表現型を呈する（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）（図２Ａおよび表２）。第二に、ＨＤＲを含む、ＢＲＣＡ１に起因するほとんどの生物学的機能は、腫瘍関連ＢＲＣＡ１変異に対しヘテロ接合型である細胞中で影響を受けないが、近年の研究は、ＳＦＰが特定のＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１病変に対しヘテロ接合型である細胞中で損なわれることを示した。例えば、Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋細胞は、図２Ｂに示される通り、ヒドロキシ尿素で誘導された停止複製フォークを分解から保護できない。加えて、Ｂａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／＋およびＢａｒｄ１Ｓ５６３Ｆ／＋ ＭＥＦもまた、このＨＤＲ＋ＳＦＰ－表現型を提示する（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。
ＤＮＡ損傷は、ＨＤＲまたはＳＦＰのどちらかの欠陥により作製され得るため、これらの工程のどちらが効率的な体細胞リプログラミングに必要とされるかを決定しようとした。インビボで、ＢＲＣＡ１は、明確に異なるリン酸認識特性を有するＣ末端ＢＲＣＴドメインを宿す関連タンパク質であるＢＡＲＤ１とのヘテロダイマーとして存在する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＳＦＰがリプログラミングに必要とされるかどうかを確かめるために、ＨＤＲ＋ＳＦＰ－表現型を提示する細胞を、１）それらがホモ接合型Ｂａｒｄ１機能分離型（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）変異を担うため、または２）それらがＢｒｃａ１もしくはＢａｒｄ１変異にとってヘテロ接合型であるため、検査した。第一に、Ｂａｒｄ１Ｋ６０７ＡおよびＢａｒｄ１Ｓ５６３ＦがＨＤＲに影響を与えずにＳＦＰを特異的に排除する機能分離型変異であるため、Ｂａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／Ｋ６０７ＡおよびＢｒｃａ１Ｓ１５９８Ｆ／Ｓ１５９８Ｆ細胞は、ＨＤＲ＋ＳＦＰ－表現型を呈する（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）（図２Ａおよび表２）。第二に、ＨＤＲを含む、ＢＲＣＡ１に起因するほとんどの生物学的機能は、腫瘍関連ＢＲＣＡ１変異に対しヘテロ接合型である細胞中で影響を受けないが、近年の研究は、ＳＦＰが特定のＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１病変に対しヘテロ接合型である細胞中で損なわれることを示した。例えば、Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋細胞は、図２Ｂに示される通り、ヒドロキシ尿素で誘導された停止複製フォークを分解から保護できない。加えて、Ｂａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／＋およびＢａｒｄ１Ｓ５６３Ｆ／＋ ＭＥＦもまた、このＨＤＲ＋ＳＦＰ－表現型を提示する（Ｂｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。
リプログラミングの間のＤＮＡ損傷によるＳＦＰ欠損の結果を評定するために、γＨ２ＡＸおよびホスホＲＰＡ（Ｓ３３）として知られるホスホＨ２ＡＸ（Ｓ１３９）への核フォーカスの出現を、リプログラミング５日目に定量した。野生型細胞におけるＯＳＫＭ介在性リプログラミングが、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）形成の間接的尺度として役立つ、γＨ２ＡＸフォーカスの数の有意な増加を誘導することが、過去に示されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。類似の数のγＨ２ＡＸフォーカスが、感染なし（図２Ｃ）およびリプログラミングの間（図２Ｄ）のＢｒｃａ１ｔｒ／＋およびＢａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／Ｋ６０７Ａ ＭＥＦにおいて観察され、ＳＦＰの損失がリプログラミングの間に発生するＤＮＡ損傷のレベルに影響を与えないことを示した。複製ストレスの結果として形成するＲＰＡ／ｓｓＤＮＡフィラメントは、ＲＰＡ２ポリペプチドのセリン３３でＡＴＲキナーゼによりリン酸化される（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。図２Ｅに示される通り、Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋およびＢａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／Ｋ６０７Ａ細胞は、野生型細胞に比べてホスホ（Ｓ３３）－ＲＰＡ２フォーカス数の増加を提示せず、ＳＦＰ損失がリプログラミングの間に複製ストレスを悪化しないことを示した（図２Ｅおよび２Ｆ）。リプログラミング５日目のＨＤＲ＋ＳＦＰ－細胞の増殖率は、ＣＦＳＥ滞留により測定されるように、野生型細胞のものと区別がつかず（図２Ｇ）、Ｅ１３．５日目のＨＤＲ＋ＳＦＰ－胚のサイズおよび形態も、正常であった（図２Ｈ）。最も重要なことに、因子誘導後２０日目のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）陽性コロニーの数により測定される、全てのＨＤＲ＋ＳＦＰ－細胞（Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋、Ｂａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／Ｋ６０７Ａ Ｂａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／＋、Ｂａｒｄ１Ｓ５６３Ｆ／＋およびＢａｒｄ１Ｓ５６３／Ｓ５６３Ｆ）のリプログラミング効率は、遺伝子型にかかわらず、野生型細胞のものと区別がつかなかった（図２Ｉおよび図２Ｊ）。したがって、ＳＦＰの損失は、リプログラミングの効率を損なわない。
＊ 確認を要する
＃ 改善されたが完全にレスキューされない
＃ 改善されたが完全にレスキューされない
実施例４ － Ｂｒｃａ１変異細胞におけるフォーク保護の復活はＤＮＡ損傷を低減するがリプログラミング効率を改善しない
リプログラミングがＢｒｃａｌのＨＤＲ機能に依存するかどうかを確かめるために、Ｓｍａｒｃａｌ１ ＤＮＡトランスロカーゼの損失によりＨＤＲ－ＳＦＰ＋表現型を呈するＢｒｃａ１変異細胞を、検査した。ＤＮＡトランスロカーゼのＳＭＡＲＣＡＬ１関係ファミリー（ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＺＲＡＮＢ３、およびＨＴＬＦ）は、テンプレートスイッチングによりフォーク再始動を通常は促進する中間体構造である反転した（後退した、または「チキンフット」）フォークへと、新たに停止された複製フォークをリモデリングするために必要とされる（図３Ａ）。反転したフォークはＢｒｃａ１変異細胞においてＭｒｅ１１依存性フォーク分解の基質として役立つため、Ｓｍａｒｃａｌ１阻害は、これらの細胞においてＳＦＰを特異的にレスキューし得るが、ＨＤＲをレスキューし得ない（Ｔａｇｌｉａｌａｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。したがってＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ細胞は、ＨＤＲ－ＳＦＰ－表現型を提示する一方で、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞は、ＳＦＰに優れているはずである。
リプログラミングがＢｒｃａｌのＨＤＲ機能に依存するかどうかを確かめるために、Ｓｍａｒｃａｌ１ ＤＮＡトランスロカーゼの損失によりＨＤＲ－ＳＦＰ＋表現型を呈するＢｒｃａ１変異細胞を、検査した。ＤＮＡトランスロカーゼのＳＭＡＲＣＡＬ１関係ファミリー（ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＺＲＡＮＢ３、およびＨＴＬＦ）は、テンプレートスイッチングによりフォーク再始動を通常は促進する中間体構造である反転した（後退した、または「チキンフット」）フォークへと、新たに停止された複製フォークをリモデリングするために必要とされる（図３Ａ）。反転したフォークはＢｒｃａ１変異細胞においてＭｒｅ１１依存性フォーク分解の基質として役立つため、Ｓｍａｒｃａｌ１阻害は、これらの細胞においてＳＦＰを特異的にレスキューし得るが、ＨＤＲをレスキューし得ない（Ｔａｇｌｉａｌａｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。したがってＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ細胞は、ＨＤＲ－ＳＦＰ－表現型を提示する一方で、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞は、ＳＦＰに優れているはずである。
ＳＦＰが体細胞リプログラミングの間にＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞内で復活されることを確認するために、ＤＮＡファイバー分析を、フォーク停止を誘導するためにヒドロキシ尿素（ＨＵ）での処置の前にＣｌｄＵおよびＩｄＵで連続的に瞬間標識された細胞を利用して実施した。図３Ｂに示される通り、ＩｄＵ／ＣｌｄＵトラクト長（ｔｒａｃｔ ｌｅｎｇｔｈ）の平均比率は、野生型に比べてＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ細胞で著しく低減し、停止フォークの過剰な分解を示す。しかしＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞のリプログラミングにおいて、ＩｄＵ／ＣｌｄＵ比率は、野生型で観察されたレベルに復活した。Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞のＳＦＰ能力がさらに、ＨＵの代わりに、ゲノムのＧリッチ領域において複製フォークを停止するＧ四重鎖安定化化合物ピリドスタチン（ＰＤＳ）を用いＤＮＡファイバー分析により確立された（図３Ｃ）。リプログラミングの５日目に、γＨ２ＡＸフォーカスの数は、野生型細胞よりもＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ細胞で著しく高く（図３Ｄ）、その差は、非感染ＭＥＦでは軽度であったが（図３Ｅ）、ＯＳＫＭ因子誘導後に悪化した。興味深いことに、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞におけるγＨ２ＡＸフォーカス形成は、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＢよりも有意に低く（図３Ｄ）、ＳＦＰの復活がＢｒｃａｌ変異体においてゲノム安定性を改善することを示した。同様に、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞は、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒに比較して、核ホスホ（Ｓ３３）－ＲＰＡ２フォーカスの組み立てにより測定される、より低レベルの複製ストレスを提示した（図３Ｆ）。リプログラミング５日目で、Ｓｍａｒｃａｌ１－／－細胞は、野生型に類似していたが、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ線維芽細胞は、増殖損傷（図３Ｇ）およびアポトーシスレベルの上昇（図３Ｈ）を提示した。Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－ＭＥＦはＳＦＰについて優れているが（図３Ｂ）、それらはまた、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ細胞のものに匹敵する成長および生存力の欠損も呈した（図３Ｇ、図３Ｈ）。その上、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒおよびＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－胚は両者とも、野生型またはＳｍａｒｃａｌ１－／－のどちらかの胚よりもＥ１３．５日目に有意に小さかった（図３Ｉ）。図３Ｊに示される通り、Ｓｍａｒｃａｌ１－／－細胞は、ＯＳＫＭ介在性リプログラミングを即座に受け、その効率は野生型ＭＥＦと同様である。しかし重要なことに、ＨＤＲ－ＳＦＰ＋表現型を有するＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞は、ｉＰＳ細胞作製において重度の欠陥を提示し（１１倍を超える低減）、それはＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒおよびＡＡＢＢＣＣなどのＨＤＲ－ＳＦＰ－細胞のものと類似していた（図１Ｅ）。これらの結果は、ＨＤＲの損失が、ＳＦＰに優れたＢｒｃａｌ変異細胞においてでさえ、リプログラミングを排除するのに充分であることを示した。
実施例５ － ５３ｂｐｌのアブレーションはＨＤＲ増加によりＢｒｃａｌ欠損をレスキューしリプログラミング効率を復活させる
Ｂｒｃａｌ変異体においてＨＤＲをレスキューするために、ＨＤＲプロフィシェンシーを復旧することが過去に報告された、５３ｂｐｌのアブレーションを利用した（Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）（図３Ａ）。Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ｂｐ１－／－細胞におけるＨＤＲ能力のレスキューを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくＨＤＲアッセイ（Ｍａｔｅｏｓ－Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）で確認し、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ遺伝子型における二重対立遺伝子標的化が２倍低減し、それはＳｍａｒｃａｌ１の損失時に不変のままであったが、５３ｂｐｌの非存在下で復活したことを示した（図３Ｋ）。注目すべきことに、野生型細胞における５３ｂｐｌのアブレーションもまた、ＨＤＲ能力の増強をもたらした（図３Ｋ、図３Ｌ）。興味深いことに、Ｂｒｃａｌ変異細胞における５３ｂｐｌのアブレーションもまた、ＳＦＰ欠陥を部分的にレスキューした（図３Ｂ）。リプログラミング５日目に、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ｂｐ１－／－Ｂ細胞におけるγＨ２ＡＸおよびホスホＲＰＡ（Ｓ３３）の両方のフォーカスの数は、Ｂｒｃａｌｔｒ／ｔｒ変異体よりも有意に低かった（図３Ｄ、３Ｆ）。注目すべきことに、その低減は、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒに比較してＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞において観察されたものより大きく、ＨＤＲ＋ＳＦＰ－遺伝子型がリプログラミングの間にＨＤＲ－ＳＦＰ＋を超える利点を有する可能性を示唆した（図３Ｄ、３Ｆ）。５３ｂｐｌのアブレーションのみでは、増殖、アポトーシスまたは発達への任意の検出可能な効果を有しなかった（図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｉ）。しかし、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ変異体における５３ｂｐ１の損失は、増殖およびアポトーシスの欠陥（図３Ｇ、３Ｈ）、ならびに胚サイズ低減（図３Ｉ）をレスキューした。ＨＤＲを復活させる、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＢ細胞における５３ｂｐ１の除去もまた、リプログラミング欠陥を完全にレスキューした（図３Ｊ）。加えて、５３ｂｐ１の損失は一貫して、ＨＤＲ＋ＳＦＰ＋野生型およびＳＦＰ－欠陥Ｂｒｃａｔｒ／＋細胞においてリプログラミングの有意な増加をもたらした（図３Ｊ、図３Ｍ）。リプログラミングのこの増加は、損なわれたｐ２１シグナル伝達の結果として起こらず（図３Ｏ）、５３ｂｐ１の非存在下でのＨＤＲの能力上昇によるものであった（図３Ｋ、図３Ｌ）。
Ｂｒｃａｌ変異体においてＨＤＲをレスキューするために、ＨＤＲプロフィシェンシーを復旧することが過去に報告された、５３ｂｐｌのアブレーションを利用した（Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）（図３Ａ）。Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ｂｐ１－／－細胞におけるＨＤＲ能力のレスキューを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくＨＤＲアッセイ（Ｍａｔｅｏｓ－Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）で確認し、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ遺伝子型における二重対立遺伝子標的化が２倍低減し、それはＳｍａｒｃａｌ１の損失時に不変のままであったが、５３ｂｐｌの非存在下で復活したことを示した（図３Ｋ）。注目すべきことに、野生型細胞における５３ｂｐｌのアブレーションもまた、ＨＤＲ能力の増強をもたらした（図３Ｋ、図３Ｌ）。興味深いことに、Ｂｒｃａｌ変異細胞における５３ｂｐｌのアブレーションもまた、ＳＦＰ欠陥を部分的にレスキューした（図３Ｂ）。リプログラミング５日目に、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ｂｐ１－／－Ｂ細胞におけるγＨ２ＡＸおよびホスホＲＰＡ（Ｓ３３）の両方のフォーカスの数は、Ｂｒｃａｌｔｒ／ｔｒ変異体よりも有意に低かった（図３Ｄ、３Ｆ）。注目すべきことに、その低減は、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒに比較してＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞において観察されたものより大きく、ＨＤＲ＋ＳＦＰ－遺伝子型がリプログラミングの間にＨＤＲ－ＳＦＰ＋を超える利点を有する可能性を示唆した（図３Ｄ、３Ｆ）。５３ｂｐｌのアブレーションのみでは、増殖、アポトーシスまたは発達への任意の検出可能な効果を有しなかった（図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｉ）。しかし、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ変異体における５３ｂｐ１の損失は、増殖およびアポトーシスの欠陥（図３Ｇ、３Ｈ）、ならびに胚サイズ低減（図３Ｉ）をレスキューした。ＨＤＲを復活させる、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＢ細胞における５３ｂｐ１の除去もまた、リプログラミング欠陥を完全にレスキューした（図３Ｊ）。加えて、５３ｂｐ１の損失は一貫して、ＨＤＲ＋ＳＦＰ＋野生型およびＳＦＰ－欠陥Ｂｒｃａｔｒ／＋細胞においてリプログラミングの有意な増加をもたらした（図３Ｊ、図３Ｍ）。リプログラミングのこの増加は、損なわれたｐ２１シグナル伝達の結果として起こらず（図３Ｏ）、５３ｂｐ１の非存在下でのＨＤＲの能力上昇によるものであった（図３Ｋ、図３Ｌ）。
今まで実施された実験は、ＢＲＣＡ１のＨＤＲ機能が、ＳＦＰにおけるその役割よりむしろ、効率的なリプログラミングに必要とされることを示した。これをさらに調査するために、ＳＦＰ－ＨＤＲ＋に加え、ＳＦＰ－ＨＤＲ－およびＳＦＰ＋ＨＤＲ－変異細胞における５３ｂｐ１フォーカス形成を注視した。３種のＳＦＰ欠損遺伝子型Ｂｒｃａ１ｔｒ／＋、Ｂａｒｄ１Ｋ６０７Ａ／Ｋ６０７ＡおよびＢａｒｄ１Ｓ５６３Ｆ／Ｓ５６３Ｆの全てが、野生型対照のものと類似の割合でリプログラミングの間にＤＮＡ損傷に応答して５３ＢＰ１フォーカスを形成した（図４Ａ）。５３ｂｐ１核内構造体は典型的には複製中のＤＮＡの異常なプロセシングにより生じるため（Ｈａｒｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）、この観察は、ＳＦＰ－細胞をリプログラミングする際に蓄積する高レベルのＤＳＢがＧ２／Ｍ移行の前に分解されることを示唆した。対照的に、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒおよびＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒＳｍａｒｃａｌ１－／－細胞の両方は、対照に比較して４倍を超える数の５３ｂｐ１フォーカスを蓄積し、ＳＦＰのレスキューは、ＨＤＲが傷つけられたままである限り５３ｂｐ１フォーカス形成を低減しないことを実証した（図４Ａ）。５３ｂｐ１フォーカスの数は、リプログラミングを受けるＢｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ＢＰ１＋／－線維芽細胞において降下し、フォーカスは、５３ｂｐ１ヌル遺伝的背景で検出されなかった（図４Ａ）。これらの結果は、５３ｂｐ１フォーカス形成とリプログラミング効率の間の負の相関を示し、５３ＢＰ１介在性ＮＨＥＪによるリプログラミング誘導性ＤＮＡ損傷の修復がｉＰＳ細胞作製を妨害することを示唆した。
実施例６ － ＤＮＡ複製の間に獲得される片末端二本鎖切断はリプログラミングを制限する
リプログラミングの間にリン酸化Ｈ２ＡＸの形態で観察されるＤＮＡ損傷は、包括的なエピジェネティックリモデリング（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、酸化ストレス（Ｊｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、または複製ストレスの上昇（Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）の結果であり得る。ｉＰＳ細胞作製に最も限定的なＤＮＡ損傷の特異的型を決定するために、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、リプログラミングの間にＤＮＡポリメラーゼ阻害剤アフィジコリンで処置し、これはＨＤＲによりプロセシングされた片末端二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導した（Ｒｏｔｈｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。初代細胞に及ぼすアフィジコリンの影響をテストするために、非感染の野生型線維芽細胞を、０．２μＭアフィジコリンと３日間インキュベートし、５３ｂｐ１フォーカスの数の増加に注目した（図４Ｂ）。リプログラミング間の８日間の低濃度のアフィジコリンでの野生型細胞の処置は、この工程の効率を低減した（図４Ｃ）。ＨＤＲ－ＳＦＰ－遺伝子型Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒは、アフィジコリンへの傑出した感受性を呈し、野生型に比べてコロニー数を有意に大きく低減した（図４Ｃ）。興味深いことに、５３ｂｐ１－／－変異体は、アフィジコリンへの感受性がより低く、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ遺伝子型に比較してアフィジコリン処置Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ｂｐ１－／－細胞のリプログラミング効率が改善された（図４Ｃ）。アフィジコリンはリプログラミングの間の片末端ＤＳＢの量（ｂｕｒｄｅｎ）を増加させるため、これらの結果はら、この損傷タイプがＨＤＲによる修復を必要とすることを示した。５３ｂｐ１－／－変異体などの、ＨＤＲの能力が高い細胞は、アフィジコリンへの低減された感受性を有する（図４Ｃ）。
リプログラミングの間にリン酸化Ｈ２ＡＸの形態で観察されるＤＮＡ損傷は、包括的なエピジェネティックリモデリング（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、酸化ストレス（Ｊｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、または複製ストレスの上昇（Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）の結果であり得る。ｉＰＳ細胞作製に最も限定的なＤＮＡ損傷の特異的型を決定するために、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、リプログラミングの間にＤＮＡポリメラーゼ阻害剤アフィジコリンで処置し、これはＨＤＲによりプロセシングされた片末端二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導した（Ｒｏｔｈｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。初代細胞に及ぼすアフィジコリンの影響をテストするために、非感染の野生型線維芽細胞を、０．２μＭアフィジコリンと３日間インキュベートし、５３ｂｐ１フォーカスの数の増加に注目した（図４Ｂ）。リプログラミング間の８日間の低濃度のアフィジコリンでの野生型細胞の処置は、この工程の効率を低減した（図４Ｃ）。ＨＤＲ－ＳＦＰ－遺伝子型Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒは、アフィジコリンへの傑出した感受性を呈し、野生型に比べてコロニー数を有意に大きく低減した（図４Ｃ）。興味深いことに、５３ｂｐ１－／－変異体は、アフィジコリンへの感受性がより低く、Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ遺伝子型に比較してアフィジコリン処置Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ｂｐ１－／－細胞のリプログラミング効率が改善された（図４Ｃ）。アフィジコリンはリプログラミングの間の片末端ＤＳＢの量（ｂｕｒｄｅｎ）を増加させるため、これらの結果はら、この損傷タイプがＨＤＲによる修復を必要とすることを示した。５３ｂｐ１－／－変異体などの、ＨＤＲの能力が高い細胞は、アフィジコリンへの低減された感受性を有する（図４Ｃ）。
片末端二本鎖切断の誘導について異なる化合物をテストするために、リプログラミングを受ける細胞を、トポイソメラーゼＩ阻害剤カンプトテシンの水溶性誘導体であるトポテカンの低濃度で処置した。トポテカンの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼが、一本鎖ニックに遭遇し、ニックは複製の間に片末端二本鎖切断に変換される。野生型細胞は低用量のトポテカンに対しわずかに感受性である一方で、ＨＤＲ欠損遺伝子型Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒは、大きく低減された効率でリプログラムした（図４Ｄ）。この表現型は、５３ｂｐ１を欠いたＢｒｃａｌ変異体（Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ｂｐ１－／－）において改善され、それは、野生型対照のものと類似の、トポテカンへの軽度の感受性を有した（図４Ｄ）。
両末端二本鎖切断は、外因性ＤＮＡ損傷により、内因的にはトポイソメラーゼＩＩの活性または酸化ストレスにより引き起こされ、ＨＤＲまたはＮＨＥＪのどちらかによりプロセシングされ得る。両末端二本鎖切断を誘導するために、６Ｇｙ電離放射線の単回適用を、ドキシサイクリンでのリプログラミング因子誘導の１日後に利用した。アフィジコリンおよびトポテカンと対照的に、放射線は、感受性指数の上昇で認められる通り、５３ｂｐ１－／－変異体におけるｉＰＳ細胞作製の効率を野生型対照よりも大きな度合いで損なった（図４Ｅ）。Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ遺伝子型は、リプログラミングの間のＩＲ適用に高度に感受性であったが、アフィジコリンまたはトポテカンでの処置と異なり、二重Ｂｒｃａ１ｔｒ／ｔｒ５３ｂｐ１－／－変異体の明白なリプログラミング利点はなかった（図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ）。それゆえ、リプログラミングの間の両末端二本鎖切断の荷重の増加は、ＨＤＲが損なわれた遺伝子型だけでなく、ＮＨＥＪ（Xu et al., 2017）の効率がより低い５３ｂｐ１変異体でもｉＰＳ細胞作製を妨害し、それは両方の経路がそのような損傷をプロセシングするのに用いられ得るためである。
５３ＢＰ１－欠損遺伝子型は放射線の非存在下で対照よりも良好にリプログラムするため、両末端ＤＳＢは、ｉＰＳ細胞作製を制限する、ＤＮＡ損傷のリプログラミング誘導型ではない。この観察の確証において、ＤＮＡ－ＰＫの阻害は、リプログラミングの効率に影響を有しない（図４Ｆ）。対照的に、５３ｂｐ１ヌルの遺伝的背景でＨＤＲ能力が増強された細胞は、通常条件だけでなくアフィジコリンまたはトポテカンの存在下でもより効率的にリプログラムし、これは、片末端ＤＳＢの蓄積を誘導する。これらの結果は、ＨＤＲによるプロセシングを必要とする片末端ＤＳＢが、体細胞リプログラミングへの一次的障害であることを示す。
実施例７ － ５３ｂｐ１ ｓｈＲＮＡの使用は体細胞からｉＰＳ細胞へのリプログラミング効率を上昇させた
ｓｈＲＮＡを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅで入手できる、５３ｂｐ１のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｅ ＩＤ：７１５８）を利用して構築する。レンチウイルスベクターを、ｓｈＲＮＡおよびポリメラーゼＩＩＩプロモータを含有して調製する。
ｓｈＲＮＡを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅで入手できる、５３ｂｐ１のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｅ ＩＤ：７１５８）を利用して構築する。レンチウイルスベクターを、ｓｈＲＮＡおよびポリメラーゼＩＩＩプロモータを含有して調製する。
Ｔｅｔ－Ｏ－ＦＵＷ－ＯＳＫＭ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃２０３２１）およびＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃２０３４２）および５３ｂｐ１ ｓｈＲＮＡベクターからなる、ドキシサイクリン誘導性レンチウイルス系を、利用する。レンチウイルスを、製造業者の使用説明書に概説された通りＪｅｔｐｒｉｍｅトランスフェクション試薬（ＶＷＲ ＃８９１２９－９２２）を用いるプラスミドのトランスフェクションにより、２９３Ｔ細胞で調製する。手短に述べると、Ｔｅｔ－Ｏ－ＦＵＷベクターおよびｓｈＲＮＡベクターを、コラーゲンコーティングディッシュに播種された２９３Ｔ細胞中にＤｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ ｐＭＤ２ＶＳＶＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２５９）およびｐｓＰａｘ２（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６０）からのエンベロープおよびパッケージングプラスミドで共にトランスフェクトする。１５％ ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃Ｓ１１１５０）およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）を補充した新鮮な抗生物質不含培地ＤＭＥＭ ＨＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１０５６９０１０）を、トランスフェクションの１６～２０時間後に提供する。ウイルス上清を、後の２日のそれぞれで収集し、４℃で最大４日間保持する。感染前に、２回収日の力価をプールし、４０μＭセルストレーナ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃０８－７７１－１）で濾過する。
感染のために、ヒト体細胞を、前日に１０ｃｍ皿あたり１×１０６細胞で播種する。感染は、間に８～９時間おきながら２ラウンドで進行する。手短に述べると、細胞を、８μｇ／ｍｌプロタミン硫酸塩（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃０２１９４７２９０５）を補充した５３ｂｐ１ ｓｈＲＮＡ／ＯＳＫＭ／ｒｔｔａウイルスミックス（１：１）とインキュベートする。感染ミックスを、翌日に除去し、細胞を、新鮮な培地（１０％ ＦＢＳ Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃Ｓ１１１５０、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９およびＰｅｎＳｔｒｅｐ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１４０１６３を含むＤＭＥＭ ＨＧ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１０５６９０１０）中で回復させる。
感染の２日後に、細胞を、３日目の形質導入効率評定、５日目の分子分析、１６日目のコロニーピッキングおよび２０日目のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色のために再播種する。各実験において、感染した線維芽細胞を、多数の密度で再播種して、最適なリプログラミング効率を可能にする。１００～３００細胞／ｍｍ２（２４ウェルディッシュの各ウェルに２０～６０Ｋ）は、多数のｉＰＳ細胞クローンを日常的に作製する。ＯＳＫＭ／ｓｈＲＮＡリプログラミング因子を、１５％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２８－０２８）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３５０５００７９）、ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１１１４００５０）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １５１４０１６３）、２－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃２１９８５－０２３）および１０ｎｇ／μｌ ＬＩＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃３４－８５２１－８２）を補充したＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０８２９－０１８）からなる細胞培地中で１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ ＃ Ｄ９８９１）で誘導する。形質導入効率を、Ｓｏｘ２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ ＃０９－００２４）についての染色によりリプログラミング３日目に決定し、リプログラミング効率の計算に利用する。
リプログラミング効率を、先に記載された通りであるが５３ｂｐ１ ｓｈＲＮＡレンチウイルスを使用せずにリプログラムされた、対照細胞のリプログラミング効率と比較する。５３ｂｐ１ ｓｈＲＮＡレンチウイルス構築物が用いられた場合の細胞のリプログラミング効率およびゲノム安定性は、対照細胞のものより大きい。
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Ｒｕｉｚ， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｒｅｄｕｃｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６， ８０３６．
Ｓｃｈｌａｃｈｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２０１２）． Ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒｋ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｎｎｅｃｔｓ Ｆａｎｃｏｎｉ ａｎｅｍｉａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｔｏ ＲＡＤ５１－ＢＲＣＡ１／２． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２２， １０６－１１６．
Ｓｃｈｌａｃｈｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＢＲＣＡ２ ｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｔａｌｌｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒｋ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＭＲＥ１１． Ｃｅｌｌ １４５， ５２９－５４２．
Ｓｈａｋｙａ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． ＢＲＣＡ１ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＢＲＣＴ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ， Ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｉｔｓ Ｅ３ Ｌｉｇａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４， ５２５－５２７．
Ｓｕｉ， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｇｒａｆｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ．
Ｔａｇｌｉａｌａｔｅｌａ， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｆｏｒｋ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ＢＲＣＡ１－ ａｎｄ ＢＲＣＡ２－Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＮＦ２－Ｆａｍｉｌｙ Ｆｏｒｋ Ｒｅｍｏｄｅｌｅｒｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６８， ４１４－４３０ ｅ４１８．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ， ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ， （２００６）． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ １２６， ６６３－６７６．
Ｔｅｒｒｅｔ， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ｃｏｈｅｓｉｎ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄｓ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒｋ． Ｎａｔｕｒｅ ４６２， ２３１－２３４．
Ｕｔｉｋａｌ， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ａ ｒｏａｄｂｌｏｃｋ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｉｎｔｏ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４６０， １１４５－１１４８．
Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （２００７）． Ａｂｒａｘａｓ ａｎｄ ＲＡＰ８０ ｆｏｒｍ ａ ＢＲＣＡ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６， １１９４－１１９８．
Ｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ． （２００５）． ５３ＢＰ１ ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｐ５３ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， １００７９－１００８６．
Ｗｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９６）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＲＩＮＧ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｃａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＢＲＣＡ１ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４， ４３０－４４０．
Ｘｕ， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． ５３ＢＰ１ ａｎｄ ＢＲＣＡ１ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐａｔｈｗａｙ ｃｈｏｉｃｅ ｆｏｒ ｓｔａｌｌｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｔａｒｔ． Ｅｌｉｆｅ ６．
Ｙｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｔｈｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ （ＢＲＣＴ） Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＢＲＣＡ１ Ｉｎｔｅｒａｃｔ ｉｎ Ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ＣｔＩＰ， ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＣｔＢＰ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３， ２５３８８－２５３９２．
Ｂｉｌｌｉｎｇ， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｔｈｅ ＢＲＣＴ Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＢＲＣＡ１ ａｎｄ ＢＡＲＤ１ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｓｔａｌｌｅｄ Ｆｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７２， １２７－１３９ ｅ１２８．
Ｂｕｎｔｉｎｇ， ｅｔ ａｌ． （２０１０）． ５３ＢＰ１ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｒｃａ１－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｒｅａｋｓ． Ｃｅｌｌ １４１， ２４３－２５４．
Ｃａｎｎｙ， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ５３ＢＰ１ ｆａｖｏｒｓ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３６， ９５－１０２
Ｃａｎｔｏｒ， ｅｔ ａｌ． （２００１）． ＢＡＣＨ１， ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｗｉｔｈ ＢＲＣＡ１ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｉｔｓ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ １０５， １４９－１６０．
Ｃａｏ， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ５３ＢＰ１ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂｒｃａ１ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３５， ５３４－５４１
Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＢＲＣＡ１， ＢＲＣＡ２， ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ ２， ３１３－３３６．
Ｃｈｉａ， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｓ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９， ２８２－２９１．
Ｃｕｅｌｌａ－Ｍａｒｔｉｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． ５３ＢＰ１ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｐ５３－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｆａｔｅ Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ ｖｉａ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６４， ５１－６４．
Ｄｕｒｋｉｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１３）． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． ． Ｂｉｏ Ｐｒｏｔｏｃ ３．
Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ－Ｄｉａｚ， ｅｔ ａｌ． （２０１３）． Ａ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ５３ＢＰ１－ＲＩＦ１ ａｎｄ ＢＲＣＡ１－ＣｔＩＰ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｐａｔｈｗａｙ ｃｈｏｉｃｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４９， ８７２－８８３．
Ｇｏｍｅｚ－Ｃａｂｅｌｌｏ， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． ＣｔＩＰ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｏｌｅｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｈａｖｅ Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｆｉｔｎｅｓｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８， ４３２－４４５．
Ｇｏｎｚａｌｅｚ， ｅｔ ａｌ． （２０１３）． Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅｓ ｐｌａｙ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｏ ａ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔａｔｅ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ３， ６５１－６６０．
Ｇｏｒｅ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｏｄｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４７１， ６３－６７．
Ｈａｒｒｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ５３ＢＰ１－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＯＰＴ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ Ｇ１ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９３， ９７－１０８．
Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｄｐｐａ２／４ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｏ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２３， ３９６－４１１ ｅ３９８．
Ｈｏｎｇ， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐ５３－ｐ２１ Ｐａｔｈｗａｙ． Ｎａｔｕｒｅ ４６０， １１３２－１１３４．
Ｊａｓｐｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． （２０１３）． Ｌｏｓｓ ｏｆ ５３ＢＰ１ ｃａｕｓｅｓ ＰＡＲＰ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｂｒｃａ１－ｍｕｔａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ３， ６８－８１．
Ｊｉ， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２， ４４－５１．
Ｋａｒｅｔａ， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｒｂ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １６， ３９－５０．
Ｋａｗａｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ｌｉｎｋｉｎｇ ｔｈｅ ｐ５３ ｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ４６０， １１４０－１１４４．
Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ａｔａｘｉａ－ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ （ＡＴＭ） ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４０７， ３２１－３２６．
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Ｓｃｈｌａｃｈｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２０１２）． Ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒｋ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｎｎｅｃｔｓ Ｆａｎｃｏｎｉ ａｎｅｍｉａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｔｏ ＲＡＤ５１－ＢＲＣＡ１／２． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２２， １０６－１１６．
Ｓｃｈｌａｃｈｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＢＲＣＡ２ ｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｔａｌｌｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒｋ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＭＲＥ１１． Ｃｅｌｌ １４５， ５２９－５４２．
Ｓｈａｋｙａ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． ＢＲＣＡ１ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＢＲＣＴ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ， Ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｉｔｓ Ｅ３ Ｌｉｇａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４， ５２５－５２７．
Ｓｕｉ， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｇｒａｆｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ．
Ｔａｇｌｉａｌａｔｅｌａ， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｆｏｒｋ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ＢＲＣＡ１－ ａｎｄ ＢＲＣＡ２－Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＮＦ２－Ｆａｍｉｌｙ Ｆｏｒｋ Ｒｅｍｏｄｅｌｅｒｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６８， ４１４－４３０ ｅ４１８．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ， ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ， （２００６）． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ １２６， ６６３－６７６．
Ｔｅｒｒｅｔ， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ｃｏｈｅｓｉｎ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄｓ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒｋ． Ｎａｔｕｒｅ ４６２， ２３１－２３４．
Ｕｔｉｋａｌ， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ａ ｒｏａｄｂｌｏｃｋ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｉｎｔｏ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４６０， １１４５－１１４８．
Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （２００７）． Ａｂｒａｘａｓ ａｎｄ ＲＡＰ８０ ｆｏｒｍ ａ ＢＲＣＡ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６， １１９４－１１９８．
Ｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ． （２００５）． ５３ＢＰ１ ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｐ５３ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５， １００７９－１００８６．
Ｗｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９６）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＲＩＮＧ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｃａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＢＲＣＡ１ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４， ４３０－４４０．
Ｘｕ， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． ５３ＢＰ１ ａｎｄ ＢＲＣＡ１ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐａｔｈｗａｙ ｃｈｏｉｃｅ ｆｏｒ ｓｔａｌｌｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｔａｒｔ． Ｅｌｉｆｅ ６．
Ｙｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｔｈｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ （ＢＲＣＴ） Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＢＲＣＡ１ Ｉｎｔｅｒａｃｔ ｉｎ Ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ＣｔＩＰ， ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＣｔＢＰ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３， ２５３８８－２５３９２．
Claims (19)
- （ａ）単離されたヒト体細胞内に５３ＢＰ１発現を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する薬剤を導入すること、および（ｂ）ヒト人工多能性幹細胞を作製する条件下でステップａ）で得られた前記細胞を培養すること、を含む、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法。
- 前記体細胞が、表皮細胞、線維芽細胞、血液細胞、乳房上皮細胞、肺上皮細胞、または腸上皮細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記体細胞が、同種異系または自家性である、請求項１に記載の方法。
- ５３ＢＰ１を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する前記薬剤が、阻害性核酸である、請求項１に記載の方法。
- 前記阻害性核酸が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
- 前記阻害性核酸が、発現ベクター中に存在する、請求項４に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、エピソームベクターまたはプラスミドからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
- 前記阻害性核酸が、４種の転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃＭＹＣ（ＯＳＫＭ）をさらに含む発現ベクター上に存在する、請求項４に記載の方法。
- 前記薬剤が、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項１に記載の方法。
- 前記薬剤が、エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮダイマー、ＺＦＮｉｃｋａｓｅ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
- 前記薬剤が、４種の転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃＭＹＣ（ＯＳＫＭ）と同時に前記体細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
- 分化細胞を生成する条件下に前記人工多能性幹細胞を供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- ５３ＢＰ１発現が、前記ヒト人工多能性幹細胞中で回復される、請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法における使用のための、５３ＢＰ１発現を阻害、低減、ノックダウンまたは下方制御する核酸を含む発現ベクター。
- 前記核酸が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１４に記載の発現ベクター。
- 前記ベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、エピソームベクターまたはプラスミドからなる群から選択される、請求項１４に記載の発現ベクター。
- 請求項１５に記載の発現ベクターを含むキット。
- 体細胞と；４種の転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃＭＹＣ（ＯＳＫＭ）を含むベクターと；培地、をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
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