JP2022542228A - バニリンの高効率生成のための改変宿主細胞 - Google Patents

バニリンの高効率生成のための改変宿主細胞 Download PDF

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Abstract

バニリン及び／又はグルコバニリンの改善された生成のための遺伝子改変宿主細胞、組成物、及び方法が本明細書に提供される。本明細書に記載の宿主細胞、組成物、及び方法は、バニリン及び／又はグルコバニリン及び一方若しくは両方から合成若しくは生合成可能である任意の化合物の異種生成における効率的経路を提供する。

Description

発明の分野
[0001] 本開示は、バニリン及び／又はグルコバニリン及び一方若しくは両方から合成若しくは生合成可能である任意の化合物を生成するための特定の遺伝子改変、それを含む宿主細胞、及びそれらの使用方法に関する。
背景
[0001] バニリンは、世界で最大の香料成分である。バニラ香料成分供給のわずか約１％が、バニラオーキッドからのバニラ抽出物から得られる。「天然」バニリンについては、強い需要、不十分な供給、及び高価格が認められる。「天然」バニリンの代替的な低コストの大量供給源であれば、香味剤市場にとっての有利な付加価値となる。酵母による糖の発酵を通じて新規に生成されたバニリンは、現在市販の代替物よりも低コストで「天然」バニリンを生成する潜在性を有する。
[0002] グルコース以外の前駆物質を含む天然前駆物質からの生物変換により「天然」バニリンを生成するために用いられているいくつかの手法がある。１つの経路が、特定植物の特定部分において大量に見出されるフェルラ酸の生物変換である。中間体としてバニリンを生成する経路によりフェルラ酸を異化する微生物が同定されている。これらの微生物は、バニリンの不要な副生成物へのさらなる異化を低減するように改変することで、バニリン生成を最適化することができる(Gallage et al.,Molecular Plant,8:40-57(2015))。類似手法では、より対費用効果の高い基質のオイゲノールが、微生物により、フェルラ酸、さらにはバニリンに異化され得る(Gallage et al.)。
[0003] グルコースをバニリンに天然に変換し得る微生物は未知である(Gallage et al.)。１９９８年、グルコースからバニリンへの酵素的経路が開発されたが、それは、天然に生成された代謝産物３－デヒドロシキメートをバニリンに、３つのさらなる酵素ステップ：１．）プロトカテク酸（３，４－ジヒドロキシ安息香酸）を生成するための脱水、２．）３－ヒドロキシル基のＯ－メチル化、及び３．）カルボン酸のアルデヒドへの還元で変換する(Li and Frost,J.Am.Chem.Soc.,120:10545-10546(1998))。このプロセスは、大腸菌(E.Coli)における３－ＤＨＳデヒドラターゼ（ＡｒｏＺ）及びカテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）を触媒する異種酵素の発現によりバニリン酸を生成すること（ステップ１及び２）により実証された。真菌から精製された芳香族カルボン酸レダクターゼ（ＡＣＡＲ）を使用する酵素的変換を用いることで、インビトロでバニリン酸がバニリンに変換された。
[0004] Hansenらは、単一の組換え生物、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)における、この生物におけるＡＣＡＲ酵素を活性化するのに必要であることが同定された異種ＰＰＴａｓｅと組み合わせて上記酵素を発現することによる、グルコースからのバニリンの新規生合成を示した(Hansen et al.,Appl.Environ.Microbiol.75:2765-2774(2009))。さらに、彼らは、有毒なバニリン生成物を毒性がはるかにより低いグルコバニリンに変換する、ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼを発現させた。
[0005] 酵母におけるバニリン生合成の効率を改善するため、いくつかの他の改変が報告されている。グルコバニリンの力価を改善するため、Hansenらは、天然レダクターゼ（即ちＡＤＨ６）の欠失を通じて内因性レダクターゼ活性を低下させ、バニリンのバニリルアルコールへの変換を減少させることが重要であることを示した。望ましくない異性体の（３－ＯＨでなく４－ＯＨのメチル化により生成される）イソバニリンに対する炭素の減少を緩和するため、ヒト変異体Ｈｓ．ＣＯＭＴが酵素進化における開始点として使用された（米国特許出願公開第２０１４／０２４５４９６号；国際公開第２０１５／１２１３７９号）。正しいバニリン異性体に対して高度に特異的である突然変異体が得られた。ＰＣＡへのフラックスを増加させ、シキミ酸経路代謝産物へのフラックスを減少させるため、Ａｒｏ１の突然変異体バージョンが作製され、Ｅドメイン内に突然変異を有し、且つシキミ酸を作るための基質として３－ＤＨＳを用いるこの反応の活性を低下させる突然変異体ＡＲＯＭとしてアノテートされた。
[0006] さらに、「天然」バニリンの低コストで大量の供給源を提供し得る遺伝子改変であれば、香味剤市場への多大な付加価値となる。
発明の概要
[0007] バニリン及び／又はグルコバニリンの改善された生成のための遺伝子改変宿主細胞、組成物、及び方法が本明細書に提供される。これらの組成物及び方法は、一部に、バニリン及び／又はグルコバニリンを生成するように遺伝子改変されている宿主細胞内での脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼの相同体（即ちＨＦＤ１）、及びその相同体を含む特定の遺伝子産物の欠失に基づく。操作に関する任意の特定の理論に拘束されることを意図しないが、本明細書中の例は、ＨＦＤ１がバニリンをあまり望ましくないバニリン酸に変換する能力がある酵素をコードすることを示す。ＨＦＤ１の欠失により、この反応が低減又は除去される。
[0008] 一態様では、バニリン又はグルコバニリンを生成するための遺伝子改変宿主細胞及びその使用方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、バニリン又はグルコバニリンを生成する能力がある遺伝子改変宿主細胞であって、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼの相同体（ＨＦＤ１）の欠失を有する場合の遺伝子改変宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、さらにバニリン又はグルコバニリンを生成するのに十分な酵素を発現する。有用な酵素が本明細書に記載される。
[0009] 別の態様では、バニリン又はグルコバニリンを生成するための方法であって、本発明の宿主細胞の集団を、バニリン又はグルコバニリンの作製に適した条件下、炭素源を有する培地中で培養し、培養液を得ることと；バニリン又はグルコバニリンを培養液から回収することと、を含む方法が本明細書に提供される。
[0010] さらなる態様では、本明細書に提供される方法により生成されるバニリンが本明細書に提供される。特定の実施形態では、本明細書に提供されるバニリンは、約－１４．７～約－１２．８のＰｅｅ Ｄｅｅベレムナイト（ＰＤＢ）標準からのバルクδ１３Ｃ偏差、約－１５０～約－１２４パーミルの標準平均海水（ＳＭＯＷ）標準からのバルクδ２Ｈ偏差、及び／又は約１２．９～約１４．１ｄｐｍ／ｇの１４Ｃ活性を有する。
[0011]指定された株改変のため、２４時間インキュベートされた、開始濃度が１ｇ／Ｌのバニリンを有する液体培地中のバニリン並びに分解生成物のバニリルアルコール及びバニリン酸の力価（ｇ／Ｌ）を提示する。 [0012]バニリンを生成する株Ｙ４２６８８及び改善された誘導体Ｙ４３１８８の５日発酵期間内の累積収率（重量％；バニリン＋バニリルアルコール）及び累積生産性（ｇ／Ｌ／時間；バニリン＋バニリルアルコール）を提示する。累積は、０時間から指定時間にかけての間隔における値を示す。 [0013]スクロース、グルコース、又はフルクトースからバニリン酸、バニリン、フェルラ酸、オイゲノール、及びクルクミンを生成するための経路を提示する。 [0014]ＰＤＢからの‰偏差として表される、複数の原料から誘導されたバニリンにおけるバルクδ１３Ｃデータと、ＳＭＯＷからの‰偏差として表される、バニリンにおけるバルクδ２Ｈデータの比較を提示する。図４では、以下の記号が使用される：クミン（■）、オイゲノール（●）、フェルラ酸（元の米，◆）、フェルラ酸（元のトウモロコシ，▲）、グアヤコール（□）、リグニン（○）、バニラビーン（◇）、グルコース（元のトウモロコシ，△）、スクロース（元のサトウキビ，ｘ）。
実施形態の詳細な説明
用語法
[0015] 本明細書で用いられるとき、「約」という用語は、当業者によって決定されるような値についての合理的範囲を指す。特定の実施形態では、約という用語は、±１，±２、又は±３標準偏差を指す。特定の実施形態では、約という用語は、±５％、±１０％、±２０％、又は±２５％を指す。特定の実施形態では、約という用語は、±０．１、±０．２、又は±０．３対数単位、例えばｐＨ単位を指す。
[0016] 本明細書で用いられるとき、用語「異種」は、通常は天然に見出されないものを指す。用語「異種ヌクレオチド配列」は、通常は天然における所与の細胞内で見出されないヌクレオチド配列を指す。そのようなことから、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞に対して外来性である（即ち、細胞に対して「外因性」である）；（ｂ）宿主細胞内で天然に見出される（即ち「内因性」）が、細胞内で非天然量（即ち、宿主細胞内に天然に見出される量よりも多い量又は少ない量）で存在する；又は（ｃ）宿主細胞内で天然に見出されるが、その天然遺伝子座の外部に位置づけられることがある。
[0017] 他方、用語「天然」又は「内因性」は、分子に関連して本明細書で用いられるとき、特定の酵素及び核酸では、それらの由来元であるか又は天然に見出される生物内で発現される分子を示す。天然酵素又はポリヌクレオチドの発現が組換え微生物において改変されてもよいことは理解される。特定の実施形態では、コドン最適化遺伝子は、天然酵素を発現する。
[0018] 本明細書で用いられるとき、「異種核酸発現カセット」という用語は、宿主細胞内でコード配列を発現するのに十分な１つ以上の調節エレメントに作動可能に連結されたコード配列を含む核酸配列を指す。調節エレメントの非限定例として、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、及びポリＡシグナルが挙げられる。
[0019] 本明細書で用いられるとき、遺伝子名は、典型的には、例えばＨＦＤ１のように、大文字及びイタリック体にされる。タンパク質名は、典型的には、例えばＨｆｄ１又はＨｆｄ１ｐのように、最初が大文字化され、イタリック体にされない。しかし、タンパク質という用語が示される場合、そのタンパク質が意図される。例えば、当業者は、「ＨＦＤ１タンパク質」がＨｆｄ１ｐを指すことが意図されることを理解するであろう。
[0020] 本明細書で用いられるとき、「脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼの相同体」及び「ＨＦＤ１」又は「Ｈｆｄ１」という用語は、コード核酸と、４－ヒドロキシベンズアルデヒドを４－ヒドロキシベンゾエートにユビキノン同化において変換する能力及び／又はヘキサデセナールをヘキサデセン酸にスフィンゴシン１－リン酸異化において変換する能力があるユビキノン及びスフィンゴ脂質代謝に関与するデヒドロゲナーゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、１．２．１．３である。特定の実施形態では、その配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０１３８２８又は出芽酵母(S.cerevisiae)ＹＭＲ１１０Ｃに準じる。
[0021] 本明細書で用いられるとき、「ＮＡＤＰＨ依存性中鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」及び「ＡＤＨ６」又は「Ａｄｈ６」という用語は、コード核酸及びアルコールデヒドロゲナーゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、１．１．１．２である。特定の実施形態では、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＣＡＡ９０８３６又は出芽酵母(S.cerevisiae)ＹＭＲ３１８Ｃに準じる。
[0022] 本明細書で用いられるとき、「３－メチルブタナールレダクターゼ」及び「ＮＡＤＰＨ依存性メチルグリオキサールレダクターゼ」及び「ＧＲＥ２」又は「Ｇｒｅ２」という用語は、コード核酸及び３－メチルブタナールレダクターゼ及びＮＡＤＰＨ依存性メチルグリオキサールレダクターゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、１．１．１．２６５又は１．１．１．２８３である。特定の実施形態では、その配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０１４４９０又は出芽酵母(S.cerevisiae)ＹＯＬ１５１Ｗに準じる。
[0023] 本明細書で用いられるとき、「ＹＧＬ０３９Ｗ」という用語は、コード核酸及びアルデヒドレダクターゼを指す。その分類名は、ＹＧＬ０３９Ｗである。特定の実施形態では、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照Ｚ７２５６１に準じる。
[0024] 本明細書で用いられるとき、「ジヒドロ葉酸レダクターゼ」及び「ＤＨＦＲ」という用語は、コード核酸及びジヒドロ葉酸レダクターゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、１．５．１．３である。特定の実施形態では、ＤＨＦＲは、ムス・ムスクルス(Mus musculus)に由来する。特定の実施形態では、ＤＨＦＲ配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０３４１７９に準じる。
[0025] 本明細書で用いられるとき、「３－デヒドロキネートシンターゼ」及び「ＡｒｏＢ」という用語は、コード核酸及び３－デヒドロキネートシンターゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、４．２．３．４である。特定の実施形態では、ＡｒｏＢは、大腸菌(E.Coli)に由来する。特定の実施形態では、ＡｒｏＢ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０７６３９に準じる。
[0026] 本明細書で用いられるとき、「３－デヒドロキネートデヒドラターゼ」及び「ＡｒｏＤ」という用語は、コード核酸及び３－デヒドロキネートデヒドラターゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、４．２．１．１０である。特定の実施形態では、ＡｒｏＤは、大腸菌(E.Coli)に由来する。特定の実施形態では、ＡｒｏＤ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０５１９４に準じる。
[0027] 本明細書で用いられるとき、「ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトネートアルドラーゼ，Ｔｙｒ感受性」及び「ＡｒｏＦ」という用語は、コード核酸及びホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトネートアルドラーゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、２．５．１．５４である。特定の実施形態では、ＡｒｏＦは、大腸菌(E.Coli)に由来する。特定の実施形態では、ＡｒｏＦ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ００８８８に準じる。特定の実施形態では、ＡｒｏＦは、フィードバック耐性である(J.Bacteriol.November 1990 172:6581-6584)。
[0028] 本明細書で用いられるとき、「３－デヒドロシキメートデヒドラターゼ」及び「ＡｒｏＺ」という用語は、コード核酸及び３－デヒドロシキメートデヒドラターゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、４．２．１．１１８である。特定の実施形態では、ＡｒｏＺは、ポドスポラ・パウシセタ(Podospora pauciseta)に由来する。特定の実施形態では、ＡｒｏＺ配列は、Hansen et al.,Appl Environ Microbiol.2009(May)75(9):2765-74に準じる。
[0029] 本明細書で用いられるとき、「ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」及び「ＰＰＴＡＳＥ」という用語は、コード核酸及びホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、２．７．８．７である。特定の実施形態では、ＰＰＴＡＳＥは、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)に由来する。特定の実施形態では、ＰＰＴＡＳＥ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ８ＮＰ４５に準じる。
[0030] 本明細書で用いられるとき、「芳香族カルボン酸レダクターゼ」及び「ＡＣＡＲ」という用語は、コード核酸及び芳香族カルボン酸レダクターゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、１．２，１．３０である。特定の実施形態では、ＡＣＡＲは、ノカルジア・イオウェンシス(Nocardia iowensis)に由来する。特定の実施形態では、ＡＣＡＲ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ６ＲＫＢ１に準じる。
[0031] 本明細書で用いられるとき、「オイゲノールアルコールオキシダーゼ」及び「ＥＡＯ」という用語は、コード核酸及びオイゲノールアルコールオキシダーゼを指す。特定の実施形態では、ＥＡＯは、ロドコッカス・ジョスティイ(Rhodococcus jostii)に由来する。特定の実施形態では、ＥＡＯ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ０ＳＢＫ１に準じる。
[0032] 本明細書で用いられるとき、「ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ」及び「ＵＧＴ」という用語は、コード核酸及びＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを指す。特定の実施形態では、そのＥＣ番号は、２．４．１．１２６である。特定の実施形態では、ＵＧＴは、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来する。特定の実施形態では、ＵＧＴは、シロイヌナズナ(A.thaliana)ＵＧＴ７２Ｅ２である。特定の実施形態では、ＵＧＴ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＬＶＲ１に準じる。
[0033] 本明細書で用いられるとき、「親細胞」という用語は、改変宿主細胞に操作された１つ以上の特定の遺伝子改変、例えば、バニリン経路の酵素の異種発現、グルコバニリン経路の酵素の異種発現；又はＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、ＡｒｏＦ、ＡｒｏＺ、ＰＰＴＡＳＥ、若しくはＡＣＡＲの異種発現；又はＨＦＤ１、ＡＤＨ６、ＧＲＥ２、若しくはＹＧＬ０３９Ｗの欠失からなる群から選択される１つ以上の改変を含まないこと以外は、本明細書で開示される遺伝子改変宿主細胞と同一の遺伝的背景を有する細胞を指す。
[0034] 本明細書で用いられるとき、「天然に存在する」という用語は、天然に見出されるものを指す。例えば、天然供給源から単離可能な生物中に存在し、且つ実験室内でヒトによって意図的に改変されていない遺伝子産物は、天然に存在する遺伝子産物である。逆に、本明細書で用いられるとき、用語「非天然に存在する」は、天然に見出されないが、ヒト介入により作出されるものを指す。特定の実施形態では、天然に存在するゲノム配列が、本明細書に提供される生物における使用のため、改変される、例えばコドン最適化される。
[0035] 用語「培地」は、培養培地及び／又は発酵培地を指す。
[0036] 用語「発酵組成物」は、遺伝子改変宿主細胞及び遺伝子改変宿主細胞によって生成される生成物又は代謝産物を含む組成物を指す。発酵組成物の例が、細胞、水相、及び遺伝子改変宿主細胞から生成される化合物を含む、容器（例えば、フラスコ、プレート、又は発酵槽）の全内容物でありうる全細胞培養液である。
[0037] 本明細書で用いられるとき、「生成」という用語は、一般に本明細書に提供される遺伝子改変宿主細胞によって生成されるバニリン又はその誘導体の量を指す。誘導体は、グルコバニリン、バニリルアルコール、及び／又はバニリン酸を含み得る。いくつかの実施形態では、生成は、宿主細胞によるバニリン又はグルコバニリンの収率として表される。他の実施形態では、生成は、バニリン又はグルコバニリンの生成における宿主細胞の生産性として表される。
[0038] 本明細書で用いられるとき、「生産性」という用語は、宿主細胞が時間をかけて（時間あたり）（体積による）培養された発酵培養液の量あたり（重量による）生成されたバニリン又はグルコバニリンの量として表される、宿主細胞によるバニリン又はその誘導体の生成を指す。誘導体は、グルコバニリン、バニリルアルコール、及び／又はバニリン酸を含み得る。
[0039] 本明細書で用いられるとき、「収率」という用語は、重量による、宿主細胞によって消費された炭素源の量あたり生成されたバニリン又はグルコバニリンの量として表される、宿主細胞によるバニリン又はその誘導体の生成を指す。誘導体は、グルコバニリン、バニリルアルコール、及び／又はバニリン酸を含み得る。
[0040] 本明細書で用いられるとき、「力価」という用語は、培地の体積あたり生成されたバニリン又はグルコバニリン又は他の誘導体の量として表される、宿主細胞によるバニリン又はその誘導体の生成を指す。誘導体は、グルコバニリン、バニリルアルコール、及び／又はバニリン酸を含み得る。
[0041] 本明細書で用いられるとき、化合物（例えば、バニリン酸、又は他の化合物）の「検出不能レベル」という用語は、化合物を測定するための標準技術により測定及び／又は分析されるには低すぎる化合物のレベルを意味する。例えば、この用語は、当該技術分野で公知の典型的な分析方法により検出可能でない化合物のレベルを含む。
[0042] 「バニリン」という用語は、バニリンの任意の立体異性体を含む、化合物バニリンを指す。バニリンの化学名は、４－ヒドロキシ－３－メトキシベンズアルデヒドである。特定の実施形態では、該用語は、以下の構造：
Figure 2022542228000002
 に従う化合物を指す。
[0043] 「バニリルアルコール」という用語は、バニリルアルコールの任意の立体異性体を含む、化合物バニリルアルコールを指す。バニリルアルコールの化学名は、４－（ヒドロキシメチル）－２－メトキシフェノールである。特定の実施形態では、該用語は、以下の構造：
Figure 2022542228000003
 に従う化合物を指す。
[0044] 「バニリン酸」という用語は、バニリン酸の任意の立体異性体を含む、化合物バニリン酸を指す。バニリン酸の化学名は、４－ヒドロキシ－３－メトキシ安息香酸である。特定の実施形態では、該用語は、以下の構造：
Figure 2022542228000004
 に従う化合物を指す。
[0045] 「グルコバニリン」という用語は、グルコバニリンの任意の立体異性体を含む、化合物グルコバニリンを指す。グルコバニリンの化学名は、３－メトキシ－４－［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－３，４，５－トリヒドロキシ－６－（ヒドロキシメチル）オキサン－２－イル］オキシベンズアルデヒドである。特定の実施形態では、該用語は、以下の構造：
Figure 2022542228000005
 に従う化合物を指す。
[0046] 「プロトカテク酸」という用語は、プロトカテク酸の任意の立体異性体を含む、化合物プロトカテク酸を指す。プロトカテク酸の化学名は、３，４－ジヒドロキシ安息香酸である。特定の実施形態では、該用語は、以下の構造：
Figure 2022542228000006
 に従う化合物を指す。
[0047] 本明細書で用いられるとき、用語「変異体」は、具体的に列挙される「参照」ポリペプチド（例えば野生型配列）と、アミノ酸挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換の分だけ異なるポリペプチドを指すが、参照ポリペプチドに対して実質的に類似する活性を保持する。いくつかの実施形態では、変異体は、組換えＤＮＡ技術、又は突然変異誘発により作出される。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、その参照ポリペプチドと、一方の塩基残基ともう一方との（即ち、ＡｒｇとＬｙｓとの）置換、一方の疎水性残基ともう一方との（即ち、ＬｅｕとＩｌｅとの）置換、又は一方の芳香族残基ともう一方との（即ち、ＰｈｅとＴｙｒとの）置換などの分だけ異なる。いくつかの実施形態では、変異体は、参照配列との実質的な構造的類似性をもたらす保存的置換が得られる場合の類似体を含む。かかる保存的置換の例として、限定はされないが、グルタミン酸のアスパラギン酸に対するものとその逆；グルタミンのアスパラギンに対するものとその逆；セリンのトレオニンに対するものとその逆；リジンのアルギニンに対するものとその逆；又はイソロイシン、バリン若しくはロイシンのいずれかの互いに対するものが挙げられる。
[0048] 本明細書で用いられるとき、用語「配列同一性」又は「パーセント同一性」は、２つ以上の核酸又はタンパク質配列との関連では、同じである、又は特定の百分率で同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列若しくは部分配列を指す。例えば、配列は、比較ウインドウにわたる最大対応について比較及び整列されるときの参照配列に対する特定領域、又は配列比較アルゴリズムを用いて若しくはマニュアルアライメント及び目視検査により測定されるときの指定領域にわたり、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはより高い同一性のパーセント同一性を有しうる。例えば、同一性のパーセントは、配列内での同一ヌクレオチド（又はアミノ酸残基）の数を、全ヌクレオチド（又はアミノ酸残基）の長さから任意のギャップの長さを引いたもので除した比を計算することにより決定される。
[0049] 便宜上、２つの配列間の同一性の程度は、当該技術分野で公知のコンピュータプログラム及び数学的アルゴリズムを用いて確認されうる。パーセント配列同一性を計算するかかるアルゴリズムは、一般に比較領域にわたる配列ギャップ及びミスマッチを説明する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680), ＡＬＩＧＮ (Myers et al., (1988) CABIOS, 4: 11-17), ＦＡＳＴＡ (Pearson et al., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 63-98) 及びギャップＢＬＡＳＴ (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402)のように配列を比較し、整列するプログラムは、この目的にとって有用である。ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０ (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)は、配列分析プログラムＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、及びＴＢＬＡＳＴＸに関連して用いるため、国立生体情報センター(National Center for Biological Information) (NCBI)を含むいくつかのソースから、またインターネット上で入手可能である。追加的情報は、NCBIウェブサイトで見出すことができる。
[0050] 特定の実施形態では、配列アライメント及びパーセント同一性の計算は、ＢＬＡＳＴプログラムを用い、その標準のデフォルトパラメータを用いて決定することができる。ヌクレオチド配列アライメント及び配列同一性の計算においては、ＢＬＡＳＴＮプログラムが、そのデフォルトパラメータ（ギャップオープニングペナルティ＝５、ギャップエクステンションペナルティ＝２、核酸マッチ(Nucleic match)＝２、核酸ミスマッチ(Nucleic mismatch)＝－３、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝１１、クエリ範囲における最大マッチ＝０）とともに用いられる。ポリペプチド配列アライメント及び配列同一性の計算においては、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、そのデフォルトパラメータ（アライメントマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：イグジステンス(Existence)＝１１、エクステンション(Extension)＝１；コンポジショナルアジャストメント(Compositional adjustment)＝コンディショナルコンポジショナルスコア(Conditional compositional score)、マトリックスアジャストメント(matrix adjustment)；期待値＝１０．０；ワードサイズ＝６；クエリ範囲における最大マッチ＝０）とともに用いられる。或いは、以下のプログラム及びパラメータ：Clone Manager Suite、バージョン５のAlign Plusソフトウェア(Sci-Ed Software)；ＤＮＡ比較：グローバル比較、標準線形スコアリングマトリックス、ミスマッチペナルティ＝２、オープンギャップペナルティ＝４、エクステンドギャップペナルティ＝１．アミノ酸比較：グローバル比較、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスが用いられ得る。本明細書に記載の実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰプログラムを用い、それらのデフォルトパラメータを用いて計算される。本明細書に記載の実施形態では、２つ以上の配列の配列アライメントが、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて、提案されたデフォルトパラメータ（デアライン(Dealign)インプット配列：なし；Ｍｂｅｄ－ｌｉｋｅクラスタリングガイドツリー：あり；Ｍｂｅｄ－ｌｉｋｅクラスタリングイタレーション：あり；組み合わされたイタレーションの数：デフォルト（０）；最大ガイドツリーイタレーション：デフォルト；最大ＨＭＭイタレーション：デフォルト；オーダー：インプット）を用いて実施される。
核酸、発現カセット、及び宿主細胞
[0051] 一態様では、バニリン及び／又はグルコバニリンの生成にとって有用な１つ以上の酵素を発現する核酸、発現ベクター、及び宿主細胞が本明細書に提供される。別の態様では、遺伝子における、バニリン及び／又はグルコバニリンの生成にとって有用である１つ以上の欠失を含む宿主細胞が本明細書に提供される。さらなる態様では、１つ以上の欠失を含み、１つ以上の酵素をさらに含む宿主細胞が本明細書に提供される。酵素及び欠失は、本明細書中で詳述される。特定の実施形態では、宿主細胞は、培養培地中で炭素源からバニリン及び／又はグルコバニリンを生成し得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、親株と比較して改善された収率及び／又は生産性を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、親株と比較して、副生物、中間体、及び／又は副生成物、例えばバニリン酸を提供する。例示的な副生物、中間体、及び／又は副生成物として、バニリン酸、バニリルアルコール、グルコバニリン酸、グルコバニリルアルコール、及びプロトカテクアルデヒドが挙げられる。
[0052] 特定の実施形態では、本明細書中の実施形態に従う宿主細胞は、親株と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、又は少なくとも２５％より多い全バニリン又はグルコバニリンを生成する。特定の実施形態では、本明細書中の実施形態に従う宿主細胞は、親株と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％より多い全バニリンを生成する。特定の実施形態では、本明細書中の実施形態に従う宿主細胞は、親株と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％より多い全グルコバニリンを生成する。特定の実施形態では、本明細書中の実施形態に従う宿主細胞は、親株と比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍より少ないバニリン酸を生成する。特定の実施形態では、パーセント増加は、バニリン又はグルコバニリン力価（ｇ／Ｌ）に関連する。特定の実施形態では、パーセント増加は、バニリン又はグルコバニリン収率（重量％）に関連する。特定の実施形態では、パーセント増加は、バニリン又はグルコバニリン生産性（ｇ／Ｌ／時間）に関連する。特定の実施形態では、パーセント増加は、生成されたバニリン又はグルコバニリン全質量（ｇ）に関連する。当業者は、生成された全バニリン及び／又はグルコバニリンが、本明細書中の実施例及び図面に示される通り、生成された実化合物とバニリン及び／又はグルコバニリンから生成された任意の下流化合物との合計として測定可能であることを理解するであろう。特定の実施形態では、本明細書中の実施形態に従う宿主細胞は、親株と比較して、増加したバニリン及び／又はグルコバニリンを生成し、且つより少ないバニリン酸を生成する。
[0053] 有利な実施形態では、宿主細胞は、バニリン及び／又はグルコバニリンを作る能力がある、個別に又は一緒に用いられる１つ以上の酵素的経路を含む。
[0054] 一態様では、ＨＦＤ１の欠失を含む宿主細胞が本明細書に提供される。下の例に記載される通り、ＨＦＤ１は、バニリンをバニリン酸に変換する能力がある酵素Ｈｆｄ１をコードする。バニリン酸は、宿主細胞に対して潜在的に有毒であり、最終生成物中に望ましくない不純物が生じることから、望ましくない発酵副生成物である。さらに、バニリン酸の蓄積は、精製をより困難なものにする。さらに、バニリンのバニリン酸への逆反応は、バニリン酸とバニリンとの間に浪費回路を導入し得る。バニリン酸のバニリンへの各々の正反応は、細胞性ＡＴＰ及びＮＡＤＰＨにおいて高コストであり、次いで後続するバニリンのバニリン酸への逆変換によって消費されることになる。特定の実施形態では、宿主細胞は、出芽酵母(S.cerevisiae)である。下の例に記載される通り、Ｈｆｄ１は、出芽酵母(S.cerevisiae)内でバニリンをバニリン酸に変換することに関与する主要な既知の酵素である。出芽酵母(S.cerevisiae)以外の宿主細胞では、ＨＦＤ１の相同体が欠失される。好ましくは、ＨＦＤ１のすべてのコピーが欠失される。例えば、ＨＦＤ１の１つのコピーを有する一倍体細胞では、そのコピーは欠失される。ＨＦＤ１の２つのコピーを有する二倍体細胞では、両方のコピーは欠失される。ＨＦＤ１の複数のコピーを有する任意の細胞では、各コピーは好ましくは欠失される。ＨＦＤ１遺伝子は、当業者にとって明白な任意の技術により欠失され得る。有用な技術は、相同組換え及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくものを含む。
[0055] さらなる実施形態では、上記宿主細胞は、バニリン及び／又はグルコバニリンの生成にとって有用である１つ以上の欠失及び／又は１つ以上の発現遺伝子をさらに含む。
[0056] 特定の実施形態では、宿主細胞は、ＡＤＨ６の欠失をさらに含む。出芽酵母(S.cerevisiae)以外の宿主細胞では、ＡＤＨ６の相同体が欠失される。好ましくは、ＡＤＨ６のすべてのコピーが欠失される。例えば、ＡＤＨ６の１つのコピーを有する一倍体細胞では、そのコピーは欠失される。ＡＤＨ６の２つのコピーを有する二倍体細胞では、両方のコピーは欠失される。ＡＤＨ６の複数のコピーを有する任意の細胞では、各コピーは好ましくは欠失される。ＡＤＨ６遺伝子は、当業者にとって明白な任意の技術により欠失され得る。有用な技術は、相同組換え及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくものを含む。
[0057] 特定の実施形態では、宿主細胞は、ＧＲＥ２の欠失をさらに含む。出芽酵母(S.cerevisiae)以外の宿主細胞では、ＧＲＥ２の相同体が欠失される。好ましくは、ＧＲＥ２のすべてのコピーが欠失される。例えば、ＧＲＥ２の１つのコピーを有する一倍体細胞では、そのコピーは欠失される。ＧＲＥ２の２つのコピーを有する二倍体細胞では、両方のコピーは欠失される。ＧＲＥ２の複数のコピーを有する任意の細胞では、各コピーは好ましくは欠失される。ＧＲＥ２遺伝子は、当業者にとって明白な任意の技術により欠失され得る。有用な技術は、相同組換え及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくものを含む。
[0058] 特定の実施形態では、宿主細胞は、ＹＧＬ０３９Ｗの欠失をさらに含む。出芽酵母(S.cerevisiae)以外の宿主細胞では、ＹＧＬ０３９Ｗの相同体が欠失される。好ましくは、ＹＧＬ０３９Ｗのすべてのコピーが欠失される。例えば、ＹＧＬ０３９Ｗの１つのコピーを有する一倍体細胞では、そのコピーは欠失される。ＹＧＬ０３９Ｗの２つのコピーを有する二倍体細胞では、両方のコピーは欠失される。ＹＧＬ０３９Ｗの複数のコピーを有する任意の細胞では、各コピーは好ましくは欠失される。ＹＧＬ０３９Ｗ遺伝子は、当業者にとって明白な任意の技術により欠失され得る。有用な技術は、相同組換え及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくものを含む。
[0059] 特定の実施形態では、宿主細胞は、バニリン又はグルコバニリンの生成にとって有用な経路の酵素をさらに含む。かかる経路酵素は、以前に記載されており、Hansen et al.,Appl.Environ.Microbiol.(2009)75(9):2765-2774；米国特許第６，３７２，４６１Ｂ１号；米国特許第１０，０６６，２５２Ｂ１号；米国特許第１０，２０８，２９３Ｂ２号（それらの各々はそれら全体が参照により援用される）に記載のものが含まれる。
[0060] 特定の実施形態では、宿主細胞は、３－デヒドロキネートシンターゼ、又はＡｒｏＢをさらに含む。有用なＡｒｏＢ遺伝子及び酵素は公知である。有用なＡｒｏＢポリペプチドも公知である。有用なＡｒｏＢ遺伝子及び酵素は、大腸菌(E.Coli)のものを含む。例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０７６３９に見出すことができる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(E.Coli)ＡｒｏＢをさらに発現又は過剰発現する。
[0061] 特定の実施形態では、宿主細胞は、３－デヒドロキネートデヒドラターゼ、又はＡｒｏＤをさらに含む。有用なＡｒｏＤ遺伝子及び酵素は公知である。有用なＡｒｏＤポリペプチドも公知である。有用なＡｒｏＤ遺伝子及び酵素は、大腸菌(E.Coli)のものを含む。例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０５１９４に見出すことができる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(E.Coli)ＡｒｏＤをさらに発現又は過剰発現する。
[0062] 特定の実施形態では、宿主細胞は、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトネートアルドラーゼ，Ｔｙｒ感受性、又はＡｒｏＦをさらに含む。有用なＡｒｏＦ遺伝子及び酵素は公知である。有用なＡｒｏＢポリペプチドも公知である。有用なＡｒｏＦ遺伝子及び酵素は、大腸菌(E.Coli)のものを含む。例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ００８８８に見出すことができる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(E.Coli)ＡｒｏＦをさらに発現又は過剰発現する。特定の実施形態では、ＡｒｏＦは、フィードバック耐性である（J.Bacteriol.November 1990 172:6581-6584、その全体が参照により援用される）。
[0063] 特定の実施形態では、宿主細胞は、３－デヒドロシキメートデヒドラターゼ、又はＡｒｏＺをさらに含む。有用なＡｒｏＺ遺伝子及び酵素は公知である。有用な３ＤＳＤポリペプチドも公知である。有用なＡｒｏＺ遺伝子及び酵素は、ポドスポラ・パウシセタ(Podospora pauciseta)、トウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)、ロドコッカス・ジョスティイ(Rhodococcus jostii)、アシネトバクター種(Acinetobacter sp.)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)及びアカパンカビ(neurospora crassa)のものを含む。例として、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＤ６０５９９、ＸＰ＿００１９０５３６９．１、ＸＰ＿７６１５６０．１、ＡＢＧ９３１９１．１、ＡＡＣ３７１５９．１、及びＸＭ＿００１３９２４６４に見出すことができる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ポドスポラ・パウシセタ(Podospora pauciseta)ＡｒｏＺをさらに発現又は過剰発現する。
[0064] 特定の実施形態では、宿主細胞は、ＡＣＡＲをさらに含む。有用なＡＣＡＲ遺伝子及び酵素は公知である。有用なＡＣＡＲポリペプチドも公知である。有用なＡＣＡＲ遺伝子及び酵素は、ノカルジア種(Nocardia sp.)のものを含む。例として、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ４９５６９７に見出すことができる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ノカルジア・イオウェンシス(Nocardia iowensis)ＡＣＡＲをさらに発現又は過剰発現する。
[0065] 特定の実施形態では、宿主細胞は、ＰＰＴＡＳＥをさらに含む。有用なＰＰＴＡＳＥ遺伝子及び酵素は公知である。有用なＰＰＴＡＳＥポリペプチドも公知である。有用なＰＰＴＡＳＥ遺伝子及び酵素は、大腸菌(E.Coli)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、及びノカルジア・ファルシニカ(Nocardia farcinica)のものを含む。例として、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿６０１１８６、ＢＡＡ３５２２４、及びＹＰ＿１２０２６６に見出すことができる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)ＰＰＴＡＳＥをさらに発現又は過剰発現する。
[0066] 過剰発現は、当業者にとって明白な任意の技術に従い得る。特定の実施形態では、該遺伝子は、宿主細胞において有用なプロモーターから過剰発現される。特定の実施形態では、該遺伝子は、出芽酵母(S.cerevisiae)プロモーターから過剰発現される。特定の実施形態では、該プロモーターは、ｐＰＧＫ１、ｐＴＤＨ３、ｐＥＮＯ２、ｐＡＤＨ１、ｐＴＰＩ１、ｐＴＥＦ１、ｐＴＥＦ２、ｐＴＥＦ３、ｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ２、ｐＧＡＬ７、ｐＧＡＬ１０、ＧＡＬ１、ｐＲＰＬ３、ｐＲＰＬ１５Ａ、ｐＲＰＬ４、ｐＲＰＬ８Ｂ、ｐＳＳＡ１、ｐＳＳＢ１、ｐＣＵＰ１、ｐＴＰＳ１、ｐＨＸＴ７、ｐＡＤＨ２、ｐＣＹＣ１、及びｐＰＤＡ１からなる群から選択される。特定の実施形態では、該遺伝子は、ＧＡＬプロモーターから過剰発現される。特定の実施形態では、該遺伝子は、ｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ２、ｐＧＡＬ７、ｐＧＡＬ１０、及びそれらの変異体からなる群から選択されるプロモーターから過剰発現される。
[0067] 特定の実施形態では、宿主細胞における異種プロモーターの１つ、一部、又は全部は、誘導性である。誘導性プロモーター系は、当業者によって認識されたものであり得る。特定の実施形態では、該プロモーターは、マルトースにより誘導性である。有利な実施形態では、宿主細胞は、マルトースにより誘導性であるＧＡＬレギュロンを含む。マルトースによりさらに抑制又は誘導されるＧａｌレギュロンの例が、ＰＣＴ出願公開の国際公開第２０１５／０２０６４９号、国際公開第２０１６／２１０３４３号、及び国際公開第２０１６２１０３５０号（それらの各々はその全体が参照により援用される）に記載されている。特定の実施形態では、マルトーススイッチ可能株(switchable strain)は、ｐＭＡＬ３２などのマルトース応答性プロモーターの制御下でＧＡＬ８０のコピーを染色体的に組み込むことにより、非スイッチ可能株の上部に構築される。特定の実施形態では、ＧＡＬ８０遺伝子産物は、例えばさらに制御し易くするため、温度感受性について突然変異される。特定の実施形態では、ＧＡＬ８０遺伝子産物は、温度感受性ポリペプチドに融合される。特定の実施形態では、ＧＡＬ８０遺伝子産物は、温度感受性ＤＨＦＲポリペプチド又は断片に融合される。スイッチ可能株を生成するスイッチ可能なファルネセンについてのさらなる説明は、米国特許出願公開第２０１６／０１７７３４１号及びＰＣＴ出願公開の国際公開第２０１６／２１０３５０号（それらの各々はその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
[0068] 上記のポリペプチド及び核酸の各々の場合、宿主細胞は、それらの変異体を含み得る。特定の実施形態では、該変異体は、関連ポリペプチドに対して、最大で１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つのアミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態では、該変異体は、参照ポリペプチドに対して、最大で１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つの保存的アミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸のいずれかは、宿主細胞のため、最適化、例えばコドン最適化され得る。変異体及び最適化は、以下に詳述される。
[0069] 特定の実施形態では、追加の酵素は、上で特に指定がない限り、天然である。天然酵素は、コドン最適化核酸から発現され得る。有利な実施形態では、追加の酵素は、異種である。特定の実施形態では、２つ以上の酵素が、１つのポリペプチド中で組み合わせ可能である。
細胞株
[0070] 本明細書に提供される組成物及び方法にとって有用な宿主細胞は、古細菌、原核細胞、又は真核細胞を含む。
[0071] 好適な原核宿主は、限定はされないが、種々のグラム陽性、グラム陰性、又はグラム不定細菌のいずれかを含む。例として、限定はされないが、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属、アナベナ(Anabaena)属、アナシスティス(Anacystis)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、アゾバクター(Azobacter)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クロマチウム(Chromatium)属、クロストリジウム(Clostridium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エシェリキア(Escherichia)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、メソリゾビウム(Mesorhizobium)属、メチロバクテリウム(Methylobacterium)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、フォルミディウム(Phormidium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、ロドスピリラム(Rhodospirillum)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、サルモネラ(Salmonella)属、セネデスムス(Scenedesmus)属、セラチア(Serratia)属、シゲラ(Shigella)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ストレプロマイセス(Strepromyces)属、シネココッカス(Synnecoccus)属、及びザイモモナス(Zymomonas)属に属する細胞が挙げられる。原核生物株の例として、限定はされないが、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefacines)、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)、クロストリジウム・ベイエリンキイ(Clostridium beigerinckii)、エンテロバクター・サカザキ(Enterobacter sakazakii)、大腸菌(Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、メソリゾビウムロティ(Mesorhizobium loti)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・メバロニイ(Pseudomonas mevalonii)、シュードモナス・プディカ(Pseudomonas pudica)、ロドバクター・カプスラータ(Rhodobacter capsulatus)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドスピリラム・ラブラム(Rhodospirillum rubrum)、サルモネラ菌(Salmonella enterica)、チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、ソンネ菌(Shigella sonnei)、及び黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)が挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)細胞である。
[0072] 好適な古細菌宿主は、限定はされないが、アエロピルム(Aeropyrum)属、アーケオグロブス(Archaeoglobus)属、ハロバクテリウム(Halobacterium)属、メタノコッカス(Methanococcus)属、メタノバクテリウム(Methanobacterium)属、パイロコッカス(Pyrococcus)属、スルホロブス(Sulfolobus)属、及びサーモプラズマ(Thermoplasma)属に属する細胞を含む。古細菌株の例として、限定はされないが、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)、ハロバクテリウム種(Halobacterium sp.)、メタノコックス・ヤンナスキイ(Methanococcus jannaschii)、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、サーモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)、サーモプラズマ・ボルカニウム(Thermoplasma volcanium)、パイロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、パイロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi)、及びアエロパイラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)が挙げられる。
[0073] 好適な真核生物宿主は、限定はされないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、本方法において有用な酵母は、微生物保管所（例えば、IFO、ATCCなど）に寄託されている酵母を含み、特に、アシクロコニジウム(Aciculoconidium)属、アムブロシオジマ(Ambrosiozyma)属、アルスロアスカス(Arthroascus)属、アルキシオジマ(Arxiozyma)属、アシュビア(Ashbya)属、バブジェビア(Babjevia)属、ベンシングトニア(Bensingtonia)属、ボトリオアスカス(Botryoascus)属、ボツリオザイマ(Botryozyma)属、ブレタノマイセス(Brettanomyces)属、ブレラ(Bullera)属、ブレロマイセス(Bulleromyces)属、カンジダ(Candida)属、シテロマイセス(Citeromyces)属、クラビスポラ(Clavispora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、シストフィロバシディウム(Cystofilobasidium)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、デッカラ(Dekkara)属、ディポダスコプシス(Dipodascopsis)属、ディポダスカス(Dipodascus)属、エニエラ(Eeniella)属、エンドマイコプセラ(Endomycopsella)属、エレマスカス(Eremascus)属、エレモテシウム(Eremothecium)属、エリスロバシディウム(Erythrobasidium)属、フェロマイセス(Fellomyces)属、フィロバシディウム(Filobasidium)属、ガラクトミセス(Galactomyces)属、ゲオトリクム(Geotrichum)属、ガイラーモンデラ(Guilliermondella)属、ハンセニアスポラ(Hanseniaspora)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ハセガワエア(Hasegawaea)属、ホルターマニア(Holtermannia)属、ホルモアスカス(Hormoascus)属、ハイフォピキア(Hyphopichia)属、イッサトチェンキア(Issatchenkia)属、クロエケラ(Kloeckera)属、クロエケラスポラ(Kloeckeraspora)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、コンドア(Kondoa)属、クライシア(Kuraishia)属、クルツマノマイセス(Kurtzmanomyces)属、ロイコスポリジウム(Leucosporidium)属、リポマイセス(Lipomyces)属、ロッデロマイセス(Lodderomyces)属、マラセジア(Malassezia)属、メチニコビア(Metschnikowia)属、ムラキア(Mrakia)属、ミキソザイマ(Myxozyma)属、ナドソニア(Nadsonia)属、ナカザワエワ(Nakazawaea)属、ネマトスポラ(Nematospora)属、オガタエア(Ogataea)属、オースポリディウム(Oosporidium)属、パキソレン(Pachysolen)属、ファチコスポラ(Phachytichospora)属、ファフィア(Phaffia)属、ピキア(Pichia)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、サッカロマイコーデス(Saccharomycodes)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、サイトエラ(Saitoella)属、サカグチア(Sakaguchia)属、サターノスポラ(Saturnospora)属、シゾブラストスポリオン(Schizoblastosporion)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、シュワンニオマイセス(Schwanniomyces)属、スポリジオボルス(Sporidiobolus)属、スポロボロマイセス(Sporobolomyces)属、スポロパキデルミア(Sporopachydermia)属、ステファノアスカス(Stephanoascus)属、ステリグマトマイセス(Sterigmatomyces)属、ステリグマトスポリジウム(Sterigmatosporidium)属、シンビオタフリナ(Symbiotaphrina)属、シンポディオマイセス(Sympodiomyces)属、シンポディオマイコプシス(Sympodiomycopsis)属、トルラスポラ(Torulaspora)属、トリコスポリエラ(Trichosporiella)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、トリゴノプシス(Trigonopsis)属、ツチヤエア(Tsuchiyaea)属、ウデニオマイセス(Udeniomyces)属、ワルトマイセス(Waltomyces)属、ヴィッカーハミア(Wickerhamia)属、ヴィッケルハミエラ(Wickerhamiella)属、ウィリオプシス(Williopsis)属、ヤマダザイマ(Yamadazyma)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ジゴアスカス(Zygoascus)属、チゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)属、ザイゴウィリオプシス(Zygowilliopsis)属、及びザイゴザイマ(Zygozyma)属に属する。
[0074] いくつかの実施形態では、宿主微生物は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、デッケラ・ブルクセレンシス(Dekkera bruxellensis)、クリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)（以前は、サッカロマイセス・ラクティス(Saccharomyces lactis)と称された）、クルベロマイセス・マルキシアヌス(Kluveromyces marxianus)、アルクスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)、又はハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)（現在、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)として公知）である。いくつかの実施形態では、宿主微生物は、カンジダ(Candida)属、例えば、カンジダ・リポリチカ(Candida lipolytica)、カンジダ・ギリエルモンディ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、又はトルラ酵母(Candida utilis)の株である。
[0075] 特定の実施形態では、宿主微生物は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)である。いくつかの実施形態では、宿主は、パン酵母、ＣＥＮ ＰＫ、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、ＣＢＳ７９６１、ＣＢＳ７９６２、ＣＢＳ７９６３、ＣＢＳ７９６４、ＩＺ－１９０４、ＴＡ、ＢＧ－１、ＣＲ－１、ＳＡ－１、Ｍ－２６、Ｙ－９０４、ＰＥ－２、ＰＥ－５、ＶＲ－１、ＢＲ－１、ＢＲ－２、ＭＥ－２、ＶＲ－２、ＭＡ－３、ＭＡ－４、ＣＡＴ－１、ＣＢ－１、ＮＲ－１、ＢＴ－１、及びＡＬ－１からなる群から選択される出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株である。いくつかの実施形態では、宿主微生物は、ＰＥ－２、ＣＡＴ－１、ＶＲ－１、ＢＧ－１、ＣＲ－１、及びＳＡ－１からなる群から選択される出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株である。特定の実施形態では、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株は、ＰＥ－２である。別の特定の実施形態では、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株は、ＣＡＴ－１である。別の特定の実施形態では、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株は、ＢＧ－１である。
[0076] いくつかの実施形態では、宿主微生物は、工業的発酵に適した微生物である。特定の実施形態では、微生物は、工業的発酵環境の認められたストレス条件である、高い溶媒濃度、高温、高圧、拡大された基質利用、栄養制限、糖及び塩に起因する浸透圧ストレス、酸性度、亜硫酸及び細菌汚染、又はそれらの組み合わせの下で生存するように条件づけられる。
バニリン又はグルコバニリンを生成する方法
[0077] 別の態様では、バニリン又はグルコバニリンを生成するための方法であって、（ａ）バニリン又はグルコバニリンを生成する能力がある本明細書に記載の遺伝子改変宿主細胞のいずれかの集団を、炭素源を有する培地中、バニリン又はグルコバニリン化合物の作製に適した条件下で培養するステップと；（ｂ）前記バニリン又はグルコバニリン化合物を培地から回収するステップと、を含む方法が本明細書に提供される。当業者は、生成された化合物の量が、該化合物自体の量、又はより好ましくは該化合物及び該化合物の誘導体の量を測定することにより評価可能であることを理解するであろう。例えば、生成されたバニリンの量は、生成されたバニリン、バニリルアルコール、グルコバニリン、及びグルコバニリルアルコールの総量から評価可能である。
[0078] いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、遺伝子改変宿主細胞の１つ以上の改変を含まない親細胞、又は１つ以上の改変のサブセットのみを含む親細胞と比べて増量のバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール若しくはグルコバニリルアルコールなどを生成するが、それ以外では遺伝的に同一である。いくつかの実施形態では、増量は、例えば、収量、生成、及び／又は生産性において、ｇ／Ｌ細胞培養物、ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量で、細胞培養物の単位体積あたりを基準に、単位乾燥細胞重量あたりを基準に、単位時間あたりで細胞培養物の単位体積あたりを基準に、又は単位時間あたりで単位乾燥細胞重量あたりを基準に測定されるとき、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であるか、又は１００％を超える。
[0079] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを、発酵培地１リットルあたり約０．２５グラムより多い増加したレベルで生成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを、発酵培地１リットルあたり約０．５グラムより多い増加したレベルで生成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを、発酵培地１リットルあたり約０．７５グラムより多い増加したレベルで生成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを、発酵培地１リットルあたり約１グラムより多い増加したレベルで生成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを、発酵培地１リットルあたり約５グラムより多い増加したレベルで生成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを、発酵培地１リットルあたり約１０グラムより多い増加したレベルで生成する。いくつかの実施形態では、バニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどは、細胞培養物１リットルあたり、約１０～約５０グラム、約１０～約１５グラム、約１５グラム超、約２０グラム超、約２５グラム超、又は約３０グラム超の量で生成される。
[0080] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、約５０ｍｇ超／ｇ乾燥細胞重量の上昇レベルのバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを生成する。いくつかのかかる実施形態では、バニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどは、約５０～約１５００ｍｇ、約１００ｍｇ超、約１５０ｍｇ超、約２００ｍｇ超、約２５０ｍｇ超、約５００ｍｇ超、約７５０ｍｇ超、又は約１０００ｍｇ超／ｇ乾燥細胞重量の量で生成される。
[0081] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞培養物の単位体積あたりを基準に、親細胞によって生成されるバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどのレベルよりも、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、又はそれ以上高い、上昇レベルのバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを生成する。
[0082] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単位乾燥細胞重量あたりを基準に、親細胞によって生成されるバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどのレベルより、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、又はそれ以上高い、上昇レベルのバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを生成する。
[0083] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単位時間あたりで細胞培養物の単位体積あたりを基準に、親細胞によって生成されるバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどのレベルより、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、又はそれ以上高い、上昇レベルのバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどを生成する。
[0084] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単位時間あたりで単位乾燥細胞重量あたりを基準に、親細胞によって生成されるバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどのレベルより、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、又はそれ以上高い、上昇レベルのバニリン若しくはグルコバニリン、又はその誘導体、例えばバニリルアルコール又はグルコバニリルアルコールなどのその誘導体を生成する。
[0085] 大部分の実施形態では、宿主細胞による増加したレベルのバニリン又はグルコバニリンの生成は、誘導化合物の存在又は抑制化合物の不在により誘導性である。かかる宿主細胞は、誘導化合物の不在下又は抑制化合物の存在下で容易に操作され得る。次に、誘導化合物が添加されるか又は抑制化合物が減少することで、宿主細胞による増加したレベルのバニリン又はグルコバニリンの生成が誘導される。他の実施形態では、宿主細胞による増加したレベルのバニリン又はグルコバニリンの生成は、培養条件、例えば、成長温度、培地成分などを変更することにより誘導可能である。特定の実施形態では、バニリンを生成する酵素は、細胞の増殖相の間、マルトースにより抑制され、バニリンを生成する酵素は、発酵の発現相の間、発現される。有用なプロモーター及び技術は、米国特許出願公開第２０１８／０１７１３４１Ａ１号（その全体が参照により援用される）に記載されている。
[0086] 特定の実施形態では、本明細書における方法により生成される、バニリン又はグルコバニリン、又は両方が本明細書に提供される。特定の実施形態では、標準と比較して特有の同位体特性を有するバニリンが本明細書に提供される。特定の実施形態では、標準と比較して特有の炭素同位体特性を有するバニリンが本明細書に提供される。炭素同位体特性は、標準技術、例えば本明細書中の実施例に記載のものに従って測定される。標準は、当業者により好適とみなされた任意の標準であり得る。特定の実施形態では、標準は、１４Ｃ活性の測定用のシュウ酸である。特定の実施形態では、１４Ｃ活性は、石油由来バニリン（０に近づくＣのｄｐｍ／ｇ）と植物供給源由来のものとを区別するために使用され得る、炭素の崩壊／分／ｇ（Ｃのｄｐｍ／ｇ）として報告され、典型的にはＣの１５～１６ｄｐｍ／ｇをもたらす。特定の実施形態では、約１２．９～約１４．１ｄｐｍ／ｇの１４Ｃ活性を有するバニリンが本明細書に提供される。特定の実施形態では、約１２．９ｄｐｍ／ｇの１４Ｃ活性を有するバニリンが本明細書に提供される。特定の実施形態では、約１４．１ｄｐｍ／ｇの１４Ｃ活性を有するバニリンが本明細書に提供される。特定の実施形態では、炭素同位体比は、‰＝［（Ｒｓａｍｐｌｅ／Ｒｓｔａｎｄａｒｄ）－１］×１０３として表され、ここでＲ＝１３Ｃ／１２Ｃは、Ｐｅｅ Ｄｅｅベレムナイト（ＰＤＢ）標準と対比して表される。特定の実施形態では、約－１４．８～約－１２．８パーミル（‰）のＰＤＢ標準からのバルクδ１３Ｃ偏差を有するバニリンが本明細書に提供される。特定の実施形態では、約－１２．８パーミル（‰）のＰＤＢ標準からのバルクδ１３Ｃ偏差を有するバニリンが本明細書に提供される。特定の実施形態では、約－１４．８パーミル（‰）のＰＤＢ標準からのバルクδ１３Ｃ偏差を有するバニリンが本明細書に提供される。水素同位体特性は、標準技術、例えば本明細書中の実施例に記載のものに従って測定される。水素同位体標準は、当業者により好適とみなされた任意の標準であり得る。特定の実施形態では、標準が標準平均海水（ＳＭＯＷ）であることが本明細書に提供される。特定の実施形態では、水素同位体比は、‰＝［（Ｒｓａｍｐｌｅ／Ｒｓｔａｎｄａｒｄ）－１］×１０３として表され、ここでＲ＝２Ｈ／１Ｈは、標準平均海水（ＳＭＯＷ）標準と対比して表される。特定の実施形態では、約－１５０～約－１２４パーミル（‰）のＳＭＯＷ標準からのバルクδ２Ｈ偏差を有するバニリンが本明細書に提供される。特定の実施形態では、約－１５０パーミル（‰）のＳＭＯＷ標準からのバルクδ２Ｈ偏差を有するバニリンが本明細書に提供される。特定の実施形態では、約－１２４パーミル（‰）のＳＭＯＷ標準からのバルクδ２Ｈ偏差を有するバニリンが本明細書に提供される。
培養培地及び条件
[0087] 微生物培養物の維持及び増殖のための材料及び方法は、微生物学又は発酵科学の当業者にとって周知である（例えば、Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw Hill, New York, 1986を参照）。適切な培養培地、ｐＨ、温度、及び好気性、微好気性、又は嫌気性条件に対する要件に対して、宿主細胞、発酵、及びプロセスの具体的要件に応じて検討がなされる必要がある。
[0088] 本明細書に提供されるバニリン又はグルコバニリンを生成する方法は、限定はされないが、細胞培養プレート、マイクロタイタープレート、フラスコ、又は発酵槽を含む好適な容器内の好適な培養培地中で実施されてもよい。さらに、方法は、微生物産物の工業生産を支持するため、当該技術分野で公知の発酵の任意の規模で実施されうる。撹拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、バブル発酵槽、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む任意の好適な発酵槽が用いられてもよい。宿主細胞として出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いる特定の実施形態では、Kosaric, et al, in Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sixth Edition, Volume 12, pages 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Weinheim, Germanyで詳述の通り、株は発酵槽内で増殖されうる。
[0089] いくつかの実施形態では、培養培地は、バニリン又はグルコバニリンを生成する能力がある遺伝子改変微生物が存続しうる、即ち増殖及び生存度を維持しうるような任意の培養培地である。いくつかの実施形態では、培養培地は、同化可能な炭素源、窒素源及びリン酸源を含む水性培地である。かかる培地はまた、適切な塩、ミネラル、金属及び他の栄養素を含みうる。いくつかの実施形態では、炭素源及び必須細胞栄養素の一部又は全ては、発酵培地に増加的又は継続的に添加される。特定の実施形態では、必須栄養素のサブセットが過剰に維持される一方で、少数、例えば１つ又は２つの必要な栄養分は、例えば炭素源をバイオマスに変換する細胞の代謝又は呼吸機能に基づく所定の細胞増殖曲線に応じて、増殖細胞による効率的同化に要求されるほぼ最小レベルで維持される。
[0090] 微生物を培養するための好適な条件及び好適な培地は、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、好適な培地は、例えば、インデューサー（例えば、遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にあるとき）、リプレッサー（例えば、遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列が抑制可能なプロモーターの制御下にあるとき）、又は選択剤（例えば、遺伝子改変を含む微生物について選択するための抗生物質）などの１つ以上の追加的な作用物質が添加される。
[0091] いくつかの実施形態では、炭素源は、単糖（単糖類）、二糖、多糖、非発酵性炭素源、又はそれらの１つ以上の組み合わせである。好適な単糖の非限定例として、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、リボース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な二糖の非限定例として、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な多糖の非限定例として、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な非発酵性炭素源の非限定例として、酢酸塩、エタノール及びグリセロールが挙げられる。
[0092] 培養培地中の炭素源、例えばグルコースの濃度は、細胞増殖を促進しても、使用微生物の増殖を抑制するほどに高い必要がない。典型的には、培養は、増殖及びバイオマスの所望されるレベルを達成するためのレベルで添加されている炭素源、例えばグルコースを用いて実施される。他の実施形態では、培養培地中の炭素源、例えばグルコースの濃度は、約１ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約２ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約５ｇ／Ｌより大きい。さらに、培養培地中の炭素源、例えばグルコースの濃度は、典型的には約１００ｇ／Ｌより少ない、好ましくは約５０ｇ／Ｌより少ない、またより好ましくは約２０ｇ／Ｌより少ない。培養成分濃度に関しては、初期及び／又は進行中の両成分濃度を指すことは注目されるべきである。場合によっては、培養中、培養培地において炭素源を枯渇させておくことが望ましいことがある。
[0093] 好適な培養培地中で使用可能である同化可能な窒素の供給源として、限定はされないが、単純な窒素源、有機窒素源及び複合窒素源が挙げられる。かかる窒素源は、無水アンモニア、アンモニウム塩、並びに動物、野菜及び／又は微生物起源の物質を含む。好適な窒素源として、限定はされないが、タンパク質加水分解物、微生物バイオマス加水分解物、ペプトン、酵母抽出物、硫酸アンモニウム、尿素、及びアミノ酸が挙げられる。典型的には、培地中の窒素源の濃度は、約０．１ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約１．０ｇ／Ｌより大きい。しかし、窒素源の培養培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。結果として、培養培地中の窒素源の濃度は、約２０ｇ／Ｌより小さい、好ましくは約１０ｇ／Ｌより小さい、またより好ましくは約５ｇ／Ｌより小さい。さらに、場合によっては、培養中、培養培地において窒素源を枯渇させておくことが望ましいことがある。
[0094] 有効な培養培地は、無機塩類、ビタミン、微量金属又は増殖プロモーターなどの他の化合物を含有しうる。かかる他の化合物はまた、有効な培地中の炭素源、窒素源又はミネラル源の中に存在しうる、又は専ら培地に添加されうる。
[0095] 培養培地はまた、好適なリン酸源を含有しうる。かかるリン酸源は、無機及び有機双方のリン酸源を含む。好ましいリン酸源として、限定はされないが、一塩基性又は二塩基性のリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム、リン酸アンモニウム並びにそれらの混合物などのリン酸塩が挙げられる。典型的には、培養培地中のリン酸塩の濃度は、約１．０ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約２．０ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約５．０ｇ／Ｌより大きい。しかし、リン酸塩の培養培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。したがって、培地中のリン酸塩の濃度は、典型的には約２０ｇ／Ｌより小さい、好ましくは約１５ｇ／Ｌより小さい、またより好ましくは約１０ｇ／Ｌより小さい。
[0096] 培地は、好適な硫黄源も含有し得る。好ましい硫黄源として、限定はされないが、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、及び硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）などの硫酸塩とそれらの混合物が挙げられる。典型的には、培養培地中の硫酸塩の濃度は、約１．０ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約３．０ｇ／Ｌより大きい、より好ましくは約１０．０ｇ／Ｌより大きい。しかし、特定濃度を超えると、硫酸塩の培地への添加は、微生物の成長にとって有利でない。したがって、培地中の硫酸塩の濃度は、典型的には約５０ｇ／Ｌより小さい、好ましくは約３０ｇ／Ｌより小さい、より好ましくは約２０ｇ／Ｌより小さい。
[0097] 好適な培養培地はまた、マグネシウムの供給源を、好ましくは生理学的に許容できる塩、例えば硫酸マグネシウム七水和物の形態で含みうるが、類似量のマグネシウムに寄与する濃度の他のマグネシウム源が使用可能である。典型的には、培養培地中のマグネシウムの濃度は、約０．５ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約１．０ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約２．０ｇ／Ｌより大きい。しかし、マグネシウムの培養培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。したがって、培養培地中のマグネシウムの濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌより少ない、好ましくは約５ｇ／Ｌより少ない、またより好ましくは約３ｇ／Ｌより少ない。さらに、場合によっては、培養中、培養培地においてマグネシウム源を枯渇させておくことが望ましいことがある。
[0098] いくつかの実施形態では、培養培地はまた、生物学的に許容できるキレート剤、例えばクエン酸三ナトリウムの二水和物を含みうる。かかる例では、培養培地中のキレート剤の濃度は、約０．２ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約０．５ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約１ｇ／Ｌより大きい。しかし、キレート剤の培養培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。したがって、培養培地中のキレート剤の濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌより少ない、好ましくは約５ｇ／Ｌより少ない、またより好ましくは約２ｇ／Ｌより少ない。
[0099] 培養培地はまた、最初に、培地の所望されるｐＨを維持するための生物学的に許容できる酸又は塩基を含みうる。生物学的に許容できる酸として、限定はされないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸及びそれらの混合物が挙げられる。生物学的に許容できる塩基として、限定はされないが、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及びそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、使用塩基は、水酸化アンモニウムである。
[00100] 培養培地はまた、生物学的に許容できるカルシウム源、例えば限定はされないが、塩化カルシウムを含みうる。典型的には、培養培地中のカルシウム源、例えば塩化カルシウム二水和物の濃度は、約５ｍｇ／Ｌ～約２０００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌの範囲内、またより好ましくは約５０ｍｇ／Ｌ～約５００ｍｇ／Ｌの範囲内である。
[00101] 培養培地はまた、塩化ナトリウムを含みうる。典型的には、培養培地中の塩化ナトリウムの濃度は、約０．１ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの範囲内、またより好ましくは約２ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの範囲内である。
[00102] いくつかの実施形態では、培養培地はまた、微量金属を含みうる。かかる微量金属は、便宜上、培養培地の残りとは別に調製可能である保存液としての培養培地に添加されうる。典型的には、培養培地に添加されるかかる微量金属溶液の量は、約１ｍＬ／Ｌより多い、好ましくは約５ｍＬ／Ｌより多い、またより好ましくは約１０ｍＬ／Ｌより多い。しかし、微量金属の培養培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。したがって、培養培地に添加されるかかる微量金属溶液の量は、典型的には約１００ｍＬ／Ｌより少ない、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌより少ない、またより好ましくは約３０ｍＬ／Ｌより少ない。微量金属を保存液に添加することに加えて、個別成分が別々に添加可能であり、各々が微量金属溶液の上記範囲によって指定される成分の量に依存せずに対応する範囲内にありうることは注目されるべきである。
[00103] 培養培地は、他のビタミン、例えば、パントテン酸、ビオチン、カルシウム、パントテン酸、イノシトール、ピリドキシン－ＨＣｌ、及びチアミン－ＨＣｌを含みうる。かかるビタミンは、便宜上、培養培地の残りとは別に調製可能である保存液としての培養培地に添加されうる。しかし、ビタミンの培養培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。
[00104] 本明細書に記載の発酵方法は、限定はされないが、バッチ、フェドバッチ、細胞リサイクル、連続式及び半連続式を含む、通常の培養方法で実施されうる。いくつかの実施形態では、発酵は、フェドバッチモードで実施される。かかる場合、培地の成分の一部が培養中に、発酵の生成段階中に枯渇される。いくつかの実施形態では、例えば生成段階の開始時に、培養物に比較的高濃度のかかる成分が添加されてもよく、それにより、添加が必要になるまでの期間、増殖及び／又はバニリン又はグルコバニリンの生成が支持される。培養全体を通じて、これら成分は、好ましい範囲で、培養によりレベルが枯渇すると添加を行うことにより、維持される。培養培地中の成分のレベルは、例えば、培地を定期的にサンプリングし、濃度についてアッセイすることにより、監視されうる。或いは、一旦標準的な培養手順が開発されると、培養全体を通じて、特定の時点での既知のレベルに対応する時間間隔で添加がなされうる。当業者によって理解されるであろうが、栄養素の消費の速度は、培養中、培地の細胞密度が増加するにつれて増加する。さらに、外来微生物の培養培地への導入を回避するため、当該技術分野で公知の通り、無菌添加方法を用いて添加が実施される。さらに、培養中、少量の抗発泡剤が添加されてもよい。
[00105] 培養培地の温度は、遺伝子改変細胞の増殖及び／又はバニリン若しくはグルコバニリンの生成に適した任意の温度であり得る。例えば、培養培地への接種材料の接種前、培養培地は、約２０℃～約４５℃の範囲内の温度にされ、その温度で維持され得、好ましくは約２５℃～約４０℃の範囲内の温度にされ得る。特定の実施形態では、該細胞は、真核生物、例えば酵母であり、且つ温度は、約２８℃～約３４℃の範囲内である。特定の実施形態では、該細胞は、原核生物、例えば細菌であり、且つ温度は、約３５℃～約４０℃の範囲内、例えば３７℃である。
[00106] 培養培地のｐＨは、酸又は塩基の培地への添加により制御され得る。ｐＨを制御するためにアンモニアが使用されるような場合、それは便宜的には培養培地中の窒素源としても役立つ。好ましくは、ｐＨは、約３．０～約８．０、より好ましくは約３．５～約７．０で維持される。特定の実施形態では、該細胞は、真核生物、例えば酵母であり、且つｐＨは、好ましくは約４．０～約６．５である。特定の実施形態では、該細胞は、原核生物、例えば細菌であり、且つｐＨは、約６．５～約７．５、例えば約７．０である。
[00107] いくつかの実施形態では、培養中、培養培地の炭素源濃度、例えばグルコース、フルクトース又はスクロース濃度が監視される。培養培地の炭素源濃度は、上清、例えば培養培地の無細胞成分中のグルコース濃度を監視するために使用可能である、公知の技術を用いて、例えばグルコースオキシダーゼ酵素試験又は高圧液体クロマトグラフィーを用いて監視されうる。炭素源濃度は、典型的には細胞増殖阻害が生じるレベル以下で維持される。炭素源としてのグルコースにおいて、かかる濃度は生物間で変動してもよいが、細胞増殖阻害は、約６０ｇ／Ｌより大きいグルコース濃度で生じ、試験により容易に判定可能である。したがって、グルコース、フルクトース又はスクロースが炭素源として用いられるとき、グルコース、フルクトース又はスクロースは、好ましくは発酵槽に供され、検出限界以下で維持される。或いは、培養培地中のグルコース濃度は、約１ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約２ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの範囲内、またさらにより好ましくは約５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌの範囲内で維持される。炭素源濃度は、例えば炭素源溶液の添加により、所望されるレベル内で維持されうるが、培養培地の炭素源濃度を一定分量の元の培養培地の添加により維持することが許容可能であり、且つ好ましいことがある。一定分量の元の培養培地の使用は、培地中の他の栄養素（例えば、窒素源及びリン酸源）の濃度が同時に維持可能であることから、望ましいことがある。同様に、微量金属濃度は、一定分量の微量金属溶液の添加により、培養培地中で維持されうる。
[00108] 他の好適な発酵培地及び方法は、例えば国際公開第２０１６／１９６３２１号に記載されている。
発酵組成物
[00109] 別の態様では、本明細書に記載の遺伝子改変宿主細胞、並びに遺伝子改変宿主細胞から生成されたバニリン及び／又はグルコバニリンを含む発酵組成物が本明細書に提供される。発酵組成物は、培地をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、発酵組成物は、遺伝子改変宿主細胞を含み、バニリン又はグルコバニリンをさらに含む。特定の実施形態では、本明細書に提供される発酵組成物は、遺伝子改変宿主細胞から生成されたバニリン及び／又はグルコバニリンの主成分としてバニリンを含む。特定の実施形態では、本明細書に提供される発酵組成物は、遺伝子改変宿主細胞から生成されたバニリン及び／又はグルコバニリンの主成分としてグルコバニリンを含む。
バニリン及び／又はグルコバニリンの回収
[00110] 一旦バニリン又はグルコバニリンが宿主細胞によって生成されると、後の使用のため、それは当該技術分野で公知の任意の好適な分離及び精製方法を用いて回収又は単離されてもよい。いくつかの実施形態では、バニリン又はグルコバニリンを含む清澄化された水相は、遠心分離又は濾過により発酵物から分離される。特定の実施形態では、凝集剤及び凝固剤が、清澄化された水相、例えば清澄化された水相に添加される。
[00111] これらの細胞内で生成されるバニリン又はグルコバニリンは、培養上清中に存在し、及び／又は宿主細胞と会合されてもよい。バニリン又はグルコバニリンの一部が宿主細胞と会合される場合の実施形態では、バニリン又はグルコバニリンの回収は、バニリン及び／又はグルコバニリンの細胞からの放出を改善する方法を含んでもよい。いくつかの実施形態では、これは、細胞を熱水又は緩衝液処理で、界面活性剤の存在下又は不在下、及び添加される緩衝液又は塩の存在下又は不在下で洗浄する形態をとり得る。いくつかの実施形態では、温度は、バニリン及び／又はグルコバニリンを放出するのに適するとみなされた任意の温度である。いくつかの実施形態では、温度は、４０～９５℃；又は６０～９０℃；又は７５～８５℃の範囲内である。いくつかの実施形態では、温度は、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃である。いくつかの実施形態では、バニリン及び／又はグルコバニリンの宿主細胞からの放出を増強するため、物理的又は化学的細胞破壊が用いられる。代替的及び／又は結果的に、培養培地中のバニリン又はグルコバニリンは、限定はされないが、溶媒抽出、膜清澄化、膜濃縮、吸着、クロマトグラフィー、蒸発、化学的誘導体化、結晶化、及び乾燥を含む単離単位操作を用いて回収可能である。
遺伝子改変細胞を作製する方法
[00112] さらに、上記改変の１つ以上、例えば、１つ以上の異種核酸及び／又は例えばバニリン又はグルコバニリン化合物における生合成経路酵素を含むように遺伝子操作された宿主細胞を作製するための方法が本明細書に提供される。宿主細胞内での異種酵素の発現は、酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、宿主細胞内での発現を可能にする調節エレメントの制御下で、宿主細胞内に導入することにより達成されうる。いくつかの実施形態では、核酸は、染色体外プラスミドである。他の実施形態では、核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込みことが可能な染色体組込みベクターである。他の実施形態では、核酸は、相同性を介してヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込み可能である二本鎖ＤＮＡの線状片である。
[00113] これらタンパク質をコードする核酸は、限定されない当業者に公知の任意の方法により宿主細胞に導入されうる（例えば、Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292-3; Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385; Goeddel et al. eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc. , CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel et al. , eds. , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照）。例示的技術として、限定はされないが、スフェロプラスティング、エレクトロポレーション、ＰＥＧ１０００媒介形質転換、及び酢酸リチウム若しくは塩化リチウム媒介形質転換が挙げられる。
[00114] 宿主細胞内での酵素の量は、酵素をコードする遺伝子の転写を改変することにより変更されることがある。これは、例えば酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を改変することにより（例えば、ヌクレオチド配列を含むより高い若しくはより低いコピー数の発現ベクターを用いることにより、又はヌクレオチド配列の追加的コピーを宿主細胞のゲノムに導入することにより、又は宿主細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を欠失させる若しくは破壊することにより）、オペロンのポリシストロニックｍＲＮＡ上のコード配列の順序を変化させる、又はオペロンを崩壊させて、各々がそれ自身の調節エレメントを有する個別遺伝子にすることより、又はヌクレオチド配列が作動可能に連結される対象のプロモーター若しくはオペレーターの強さを増加させることにより、達成されうる。代替的に又追加的に、宿主細胞内の酵素のコピー数は、酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳のレベルを改変することにより変更されてもよい。これは、例えば、ｍＲＮＡの安定性を改変する、リボソーム結合部位の配列を改変する、リボソーム結合部位と酵素コード配列の開始コドンとの間の距離若しくは配列を改変する、酵素コード領域の開始コドンの５’側「の上流に」位置する若しくはそれに隣接する全シストロン間領域を改変する、ヘアピン及び特定化された配列を用いてｍＲＮＡ転写物の３’末端を安定化する、酵素のコドン使用を改変する、酵素の生合成に用いられる希少コドンｔＲＮＡの発現を変更する、及び／又は例えば酵素の安定性をそのコード配列の突然変異によって増加させることにより、達成可能である。
[00115] 宿主細胞内の酵素の活性は、例えば限定はされないが、宿主細胞内での溶解度の増加若しくは減少を呈する酵素の改変形態を発現させる、酵素の活性の阻害をもたらすドメインが欠如した酵素の変更形態を発現させる、基質に対してより高い若しくはより低いＫｃａｔ又はより低い若しくはより高いＫｍを有する酵素の改変形態を発現させる、又は経路内の別の分子によるフィードバック若しくはフィードフォワード調節により多かれ少なかれ影響を受ける酵素の変更形態を発現させるようないくつかの方法において変更されうる。
[00116] いくつかの実施形態では、宿主細胞を遺伝的に改変するために用いられる核酸は、形質転換宿主細胞の選択において、また外来ＤＮＡを維持するため、宿主細胞に対して選択圧をかけることにおいて有用な１つ以上の選択可能マーカーを含む。
[00117] いくつかの実施形態では、選択可能マーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの実例として、限定はされないが、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１－Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲ、及びＳＨ ＢＬＥ遺伝子産物が挙げられる。大腸菌(E. coli)由来のＢＬＡ遺伝子産物は、βラクタム抗生物質（例えば、狭スペクトルセファロスポリン、セファマイシン、及びカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、及びセフォペラゾン）とテモシリンを除くすべての抗グラム陰性細菌ペニシリンに耐性を付与し；Ｓ．ノウルセイ(S. noursei)由来のＮＡＴ１遺伝子産物は、ノウルセオトリシンに耐性を付与し；Ｓ．ビリドクロモゲネス(S. viridochromogenes)Ｔｕ９４由来のＰＡＴ遺伝子産物は、バイアロフォス(bialophos)に耐性を付与し；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来のＡＵＲ１－Ｃ遺伝子産物は、オーレオバシジン(Auerobasidin)Ａ（ＡｂＡ）に耐性を付与し；ＰＤＲ４遺伝子産物は、セルレニンに耐性を付与し；ＳＭＲ１遺伝子産物は、スルホメツロンメチルに耐性を付与し；Ｔｎ９トランスポゾン由来のＣＡＴ遺伝子産物は、クロラムフェニコールに耐性を付与し；マウスｄｈｆｒ遺伝子産物は、メトトレキサートに耐性を付与し；クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonia)のＨＰＨ遺伝子産物は、ハイグロマイシンＢに耐性を付与し；大腸菌(E. coli)のＤＳＤＡ遺伝子産物は、唯一の窒素源としてＤ－セリンを有するプレート上で細胞が増殖することを可能にし；Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子は、Ｇ４１８に耐性を付与し；またストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス(Streptoalloteichus hindustanus)由来のＳＨ ＢＬＥ遺伝子産物は、ゼオシン（ブレオマイシン）に耐性を付与する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性マーカーは、本明細書に開示される遺伝子改変宿主細胞が単離された後、欠失される。
[00118] いくつかの実施形態では、選択可能マーカーは、遺伝子改変微生物において要求性（例えば栄養要求性）を救出する。かかる実施形態では、親微生物は、アミノ酸又はヌクレオチド生合成経路内で機能する１つ以上の遺伝子産物中に機能的破壊を含み、しかも非機能的な場合、親細胞を１つ以上の栄養素の添加を伴わない培地中で増殖できなくする。かかる遺伝子産物として、限定はされないが、酵母中のＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、及びＵＲＡ３遺伝子産物が挙げられる。次に、要求性表現型は、親細胞を、破壊された遺伝子産物の機能的コピーをコードする発現ベクター又は染色体組み込み構築物で形質変換することにより救出可能であり、作製された遺伝子改変宿主細胞は、親細胞の要求性表現型の喪失に基づいて選択可能である。選択可能マーカーとしてのＵＲＡ３、ＴＲＰ１、及びＬＹＳ２遺伝子の利用は、ポジティブ及びネガティブ選択の双方が可能であることから、顕著な利点を有する。ポジティブ選択は、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、及びＬＹＳ２突然変異の要求性相補性により実施される一方で、ネガティブ選択は、原栄養性株の増殖を阻止するが、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、及びＬＹＳ２突然変異体各々の増殖を可能にする特異的阻害剤、即ち、５－フルオロ－オロト酸（ＦＯＡ）、５－フルオロアントラニル酸、及びアミノアジピン酸（ａＡＡ）の各々に基づく。他の実施形態では、選択可能マーカーは、公知の選択方法により同定可能な他の非致死的欠損又は表現型を救出する。
[00119] 本開示の方法、組成物及び生物において有用な特異的な遺伝子及びタンパク質が本明細書に記載されるが、かかる遺伝子に対する絶対的同一性が必要でないことは理解されるであろう。例えば、ポリペプチド又は酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子又はポリヌクレオチドにおける変化が実施され、活性についてスクリーニングされうる。典型的には、かかる改変は、保存的突然変異及びサイレント突然変異を含む。かかる改変又は突然変異されたポリヌクレオチド及びポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて、機能的酵素の発現についてスクリーニングされうる。
[00120] 遺伝暗号の固有の縮重に起因し、かかる酵素をコードするポリヌクレオチドをクローン化及び発現するため、実質的に同じか又は機能的に等価なポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドもまた使用可能である。
[00121] 当業者によって理解されるであろうが、特定の宿主内で、コード配列を改変し、その発現を増強することは有利でありうる。遺伝暗号は、６４の可能なコドンにより冗長であるが、大部分の生物は、典型的にはこれらコドンのサブセットを用いる。ある種において最も多く利用されるコドンは、最適コドンと称され、大して頻繁には利用されないコドンは、希少又は低使用コドンとして分類される。宿主の好ましいコドン使用を反映させるため、時として「コドン最適化」又は「種コドンバイアスの制御」と称されるプロセスにおいて、コドンは置換可能である。他の宿主細胞におけるコドン最適化は、コドン使用表を用いて容易に判定されうる、又は市販のソフトウェア、例えばIntegrated DNA Technologies製のCodonOp (www.idtdna.com/CodonOptfrom)を用いて実施されうる。
[00122] 特定の原核生物又は真核生物宿主によって好まれるコドンを有する最適化されたコード配列（Murray et al., 1989, Nucl Acids Res. 17: 477-508）が調製されることで、例えば、翻訳の速度を増加させることができる、又は望ましい特性、例えば非最適化配列から生成された転写物と比べると延長された半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を作製することができる。宿主の好ましさを反映させるため、翻訳停止コドンについても改変されうる。例えば、出芽酵母(S. cerevisiae)及び哺乳類における典型的な停止コドンは各々、ＵＡＡ及びＵＧＡである。単子葉植物における典型的な停止コドンはＵＧＡである一方、昆虫及び大腸菌(E. coli)は、一般に停止コドンとしてＵＡＡを用いる(Dalphin et al., 1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8)。
[00123] 当業者は、遺伝暗号の縮重性に起因し、ヌクレオチド配列が異なる種々のＤＮＡ分子が、本開示の所与の酵素をコードするように使用可能であることを理解するであろう。上記の生合成酵素をコードする天然ＤＮＡ配列は、あくまで本開示の実施形態を例示するために本明細書で参照され、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ分子を含む。同様の様式で、ポリペプチドは、典型的には、所望される活性の欠損又は有意な欠損を伴わずに、そのアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を許容しうる。本開示は、改変又は変異ポリペプチドが参照ポリペプチドの酵素的同化又は異化活性を有する限り、本明細書に記載の特定のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するようなポリペプチドを含む。さらに、本明細書に示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、あくまで本開示の実施形態を例示する。
[00124] さらに、本明細書に提供される組成物及び方法にとって有用な酵素の相同体は、本開示によって包含される。いくつかの実施形態では、２つのタンパク質（又はタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するとき、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列のパーセント同一性を判定するため、配列は、最適な比較を目的として整列される（例えば、最適な整列化のため、第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップが導入可能であり、非相同性配列は比較を目的として無視されうる）。一実施形態では、比較を目的として整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、典型的には少なくとも４０％、より典型的には少なくとも５０％、さらにより典型的には少なくとも６０％、またさらにより典型的には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、アミノ酸残基又はヌクレオチドは、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチドで比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められるとき、分子はその位置で同一である（本明細書で用いられるとき、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」に等しい）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列化を意図して導入される必要がある、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一位置の数の関数である。
[00125] 「相同性」がタンパク質又はペプチドに関連して用いられるとき、同一でない残基位置が保存的アミノ酸置換により異なることが多いことが理解される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似的化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を伴う側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させることがない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、パーセント配列同一性又は相同性の程度は、置換の保存的性質について訂正するように上方に調整されてもよい。この調整を設けるための手段は、当業者に周知である（例えば、Pearson W. R., 1994, Methods in Mol Biol 25: 365-89を参照）。
[00126] 以下の６群：１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）は各々、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を有する。
[00127] パーセント配列同一性とも称される、ポリペプチドにおける配列相同性は、典型的には配列分析ソフトウェアを用いて計測される。分子配列を異なる生物からの多数の配列を有するデータベースと比較する典型的な使用アルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴである。多数の異なる生物からの配列を有するデータベースを探索するとき、アミノ酸配列を比較することは典型的である。
[00128] さらに、前述の酵素をコードする遺伝子のいずれか（又は本明細書に記載の任意のその他（又はその発現を制御若しくは調節する調節エレメントのいずれか））は、当業者にとって公知である遺伝子／タンパク質工学技術、例えば定向進化又は合理的突然変異誘発により最適化されてもよい。かかる作用により、当業者は、酵素を酵母における発現及び活性について最適化することが可能になる。
[00129] さらに、これらの酵素をコードする遺伝子は、他の真菌及び細菌種から同定可能であり、この経路の調節を意図して発現されうる。限定はされないが、サッカロマイセス属菌（Saccharomyces spp.）、例えば、出芽酵母(S. cerevisiae)及びＳ．ウバルム(S. uvarum)、クルイベロマイセス属菌(Kluyveromyces spp.)、例えば、Ｋ．サーモトレランス(K. thermotolerans)、Ｋ．ラクティス(K. lactis)、及びＫ．マルシアヌス(K. marxianus)、ピチア属菌(Pichia spp.)、ハンゼヌラ属菌(Hansenula spp.)、例えば、Ｈ．ポリモルファ(H. polymorpha)、カンジダ属菌(Candida spp.)、トリコスポロン属菌(Trichosporon spp.)、ヤマダジマ属菌(Yamadazyma spp.)、例えば、Y.属菌スティピティス(Y.spp.stipitis)、トルラスポラ・プレトリエンシス(Torulaspora pretoriensis)、イサチェンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis)、シゾサッカロミセス属菌(Schizosaccharomyces spp.)、例えば、分裂酵母(S. pombe)、クリプトコッカス属菌(Cryptococcus spp.)、アスペルギルス属菌(Aspergillus spp.)、ニューロスポラ属菌(Neurospora spp.)、又はウスチラゴ属菌(Ustilago spp.)を含む種々の生物は、これらの酵素の供給源として役立ちうる。嫌気性真菌からの遺伝子の供給源として、限定はされないが、ピロミセス属菌(Piromyces spp.)、オルピノミセス属菌(Orpinomyces spp.)、又はネオカリマスティクス属菌(Neocallimastix spp.)が挙げられる。有用な原核生物酵素の供給源として、限定はされないが、大腸菌（Escherichia coli）、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、バチルス属菌(Bacillus spp.)、クロストリジウム属菌(Clostridium spp.)、コリネバクテリウム属菌(Corynebacterium spp.)、シュードモナス属菌(Pseudomonas spp.)、ラクトコッカス属菌(Lactococcus spp.)、エンテロバクター属菌(Enterobacter spp.)、及びサルモネラ属菌(Salmonella spp.)が挙げられる。
[00130] 追加的な相同性遺伝子及び相同性酵素を同定するため、当業者に公知の技術が好適であることがある。一般に、類似遺伝子及び／又は類似酵素は、機能分析により同定可能であり、機能的類似性を有することになる。類似遺伝子及び類似酵素を同定するため、当業者に公知の技術が好適であることがある。例えば、相同的又は類似的なＵＤＰ糖転移酵素、又は任意の生合成経路の遺伝子、タンパク質、若しくは酵素を同定するため、技術として、限定はされないが、目的の遺伝子／酵素の公表された配列に基づくプライマーを用いるＰＣＲにより、又は目的の遺伝子の中の保存された領域を増幅するように設計された縮重プライマーを用いる縮重ＰＣＲにより遺伝子をクローン化することを含んでもよい。さらに、当業者は、機能的相同性又は類似性を有する相同的若しくは類似的な遺伝子、タンパク質、又は酵素を同定するための技術を用いることができる。技術としては、酵素の触媒活性について、（例えば、本明細書又はKiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970に記載のような）前記活性に対するインビトロ酵素アッセイを通じて、細胞又は細胞培養物を試験し、次いで前記活性を有する酵素を精製により単離し、エドマン分解、類似の核酸配列に対するＰＣＲプライマーの設計、前記ＤＮＡ配列のＰＣＲによる増幅、及び前記核酸配列のクローニングなどの技術を通じて酵素のタンパク質配列を決定することを含む。相同若しくは類似遺伝子及び／又は相同若しくは類似酵素、類似遺伝子及び／又は類似酵素若しくはタンパク質を同定するため、技術としては、候補遺伝子若しくは酵素に関するデータと、BRENDA、KEGG、若しくはMetaCYCなどのデータベースとの比較も含む。候補遺伝子若しくは酵素は、本明細書中の教示内容に従い、上記データベース内で同定されてもよい。
実施例
実施例１．酵母形質転換方法
[00131] 最適化された酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）形質転換における標準分子生物学技術により、各ＤＮＡ構築物を出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)（ＣＥＮ．ＰＫ２）に組み込む。つまり、３０℃、振盪（２００ｒｐｍ）下の酵母抽出物ペプトングルコース（ＹＰＤ）培地中で細胞を一晩増殖させ、１００ｍＬのＹＰＤで０．１のＯＤ６００まで希釈し、０．６～０．８のＯＤ６００まで増殖させる。各形質転換において、５ｍＬの培養物を遠心分離により収集し、５ｍＬの滅菌水で洗浄し、再び遠心沈殿し、１ｍＬの１００ｍＭ ＬｉＡｃに再懸濁し、マイクロ遠心チューブに移す。細胞を３０秒間遠心沈殿させ（１３，０００×ｇ）、上清を除去し、そして、２４０μＬの５０％ＰＥＧ、３６μＬの１Ｍ ＬｉＡｃ、１０μＬの煮沸したサケ精子ＤＮＡ、及び７４μＬのドナーＤＮＡからなる形質転換混合物に細胞を再懸濁する。４２℃で４０分間の熱ショック後、細胞をＹＰＤ培地で一晩回収してから、選択培地上に蒔く。ＤＮＡ組み込みは、組み込み体に特異的なプライマーを用いるコロニーＰＣＲにより確認する。
実施例２：天然酵母酵素Ｈｆｄ１によるバニリンのバニリン酸への変換の除去による発酵培養液中のバニリン酸濃度の減少
バニリンデヒドロゲナーゼとしてのＨｆｄ１の同定
[00132] 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)が、バニリンのより低い毒性のバニリルアルコールへの変換を可能にする内因性酵素活性を有することは広く知られている。バニリンをバニリン酸に変換可能な酵素は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)中でまだ報告されていない。この活性に関与する天然酵母酵素を同定するため、バニリンのバニリルアルコールへの還元に関与するいくつかの遺伝子が既に除去された酵母株Ｙ３３６５３を用い、その後、アルデヒドデヒドロゲナーゼとして同定されている各酵母遺伝子をノックアウトした。例えば、図１に示す通り、これらの酵素の活性は低下した。これらのノックアウト株を、４％スクロースを含有する液体培地中で７２時間培養した。次に、培養物を遠心沈殿させ、上清を除去した。次に、同じ体積の、今度は０．７５ｇ／Ｌのバニリンを含有する４％スクロース液体培地に細胞を再懸濁した。細胞を、９６ウェルプレート内、３０℃及び１０００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に、上清をＵＰＬＣによりアッセイし、培養液中のバニリン、バニリルアルコール及びバニリン酸の濃度を測定した。試験したこれらの株の中で、Ｙ３３６５３Δｈｆｄ１は、検出不能なバニリン酸を生成した。図１を参照されたい。この結果は、Ｈｆｄ１が出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)中でのバニリンのバニリン酸への変換に関与する唯一の酵素であることを明示する。
Ｙ３３６５３中のアルデヒドデヒドロゲナーゼのノックアウト
[00133] アルデヒドデヒドロゲナーゼノックアウト株を、親株Ｙ３３６５１から、標的遺伝子のオープンリーディングフレームへのハイグロマイシン耐性マーカーの組み込みにより構築した。形質転換カセットは、ノックアウト標的遺伝子に直に隣接する領域に対して４０ｂｐの相同性を有するプライマーを有する鋳型としてのＲ２１（配列番号２）を使用し、ＨｙｇＡのＰＣＲ増幅により作製した。プライマーを表１に示す。
Figure 2022542228000007
培地及び培養条件
[00134] 各株を、単一コロニーから、３６０μＬのＢＳＭ２．０（８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．１５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、０．０５７５のＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、０．００３２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４、０．００３２のＭｎＣｌ２ ＊４Ｈ２Ｏ、０．００４７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ、０．００４８ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇ／ＬのＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、０．０２９ｇ／ＬのＣａＣｌ２ ＊２Ｈ２Ｏ、０．１１７ｇ／ＬのＥＤＴＡ、０．０００６ｇ／Ｌのビオチン、０．００２４ｇ／Ｌのｐ－アミノ安息香酸、０．０１２ｇ／Ｌのニコチン酸、０．０３ｇ／Ｌのミオイノシトール、０．０１２ｇ／Ｌのピリドジン(pyridozine)ＨＣｌ、０．０１２ｇ／ＬのチアミンＨＣｌ ０．０１２ｇ／Ｌのパントテン酸カルシウム、６ｇ／Ｌのコハク酸）４％スクロースを含有する９６ウェルプレートに接種した。プレートを３０度及び１０００ｒｐｍで３日間培養した。次に、これらのプレートを遠心沈殿させ、１ｇ／Ｌのバニリンを添加したＢＳＭ２．０ ４％スクロースに再懸濁し、３０度で２４時間培養した。
ＵＰＬＣアッセイ条件
生成されたバニリンの量を定量するため、サンプルを、ダイオードアレイ検出器を有するAgilent Vanquish（商標）Flex Binary UHPLC System上で以下のプログラムにより分析した：
移動相（Ａ）：水中、１．４％硫酸ｖ／ｖ
移動相（Ｂ）：１００％アセトニトリル
勾配は次の通りである［勾配時間，（分）移動相Ａ，（％）］：［（０．００，８８），（０．０５，８８），（１．２５，８５），（２．２５，８３），（３．０，８２），（３．５，８８），（４．０，８８）］。流速は１ｍＬ／分であった
バニリンを生成する出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)株中のＨＦＤ１を欠失させることによるバニリン生成における改善
[00135] ＨＦＤ１の欠失が、天然Ｈｆｄ１酵素によるバニリンのバニリン酸への逆変換を低減することによる、発酵由来バニリンを作製するための改善されたプロセスをもたらすことを確立するため、下記の発酵プロセスにおける、天然ＨＦＤ１遺伝子を有する（Ｙ４２６８８）及び有しない（Ｙ４３１８８）バニリン生成株について試験した。サンプルを２４時間ごとに採取し、バニリンを濃縮し、バニリルアルコールを測定した。ＨＦＤ１の欠失により、７％の０～３日収率における増加及び１２％の０～３日生産性における増加がもたらされた（図２）。
Ｙ４３１８８を作製するための株構築
Ｙ４３１８８
[00136] Ｙ４３１８８をＹ４２６８８から１回の組み込みにより作製した。ＭＳ１３５８０２（配列番号１）は、得られる株中の遺伝子の欠失をもたらすＨＦＤ１オープンリーディングフレームの上流及び下流領域に対して相同性を有する。以下に図示する。
Figure 2022542228000008
Ｙ４２６８８／Ｙ４３１８８－のための発酵培地及び条件
[00137] 寒天プレート上で増殖する酵母コロニーを使用し、４％スクロース、２％マルトース、５ｇ／Ｌのリジンを含有する６０ｍＬのＢＳＭ２．０を有する５００ｍＬのバッフル付きシードフラスコに接種し、振盪機内、２８℃、２００ＲＰＭで２１時間増殖させた。次に、６０ｍＬのシードフラスコ培養物を、上記の２４０ｍＬのＭＦ培地を有する０．５Ｌの製造発酵槽（ＭＦＡ）に接種した。発酵槽への栄養フィードは、１００ｇ／Ｌの純粋なスクロース原料であった。初期パルスは、５ｇ／Ｌ／時間の速度で２ｇのＴＲＳ／Ｌであった。次に、発酵槽のフィード速度を、溶解酸素中の増加によって示される、炭素に対する培養要求に基づくアルゴリズムを用いて調整した。発酵は、溶解酸素が０％に達するまで、３０℃の一定温度及び（水酸化アンモニウム添加により制御される）５．０の一定ｐＨで好気的に実行した。次に、撹拌を制御し、発酵の残りにおいて１５ミリモルのＯ２／Ｌ／時間の酸素利用率を維持した。培養物を必要に応じて除去し、溢流を防止した。塩、微量金属及びビタミンも毎日添加した。発酵培地に、最初に０．１ｍＬのＬ－６１消泡剤を添加し、その後は必要に応じて添加した。生成されたバニリン及び細胞によって消費された全糖の量を毎日監視し、これら２つの値の比（即ち、糖からの生成物収率）を各々の２４時間期間内に判定した。発酵槽は５日間実行した。
バニリンＹ４２６８８／Ｙ４３１８８－の定量化
[00138] 生成されたバニリンの量を定量するため、サンプルを、ダイオードアレイ検出器を有するAgilent Vanquish（商標）Flex Binary UHPLC System上で以下のプログラムにより分析した：
[00139] 移動相（Ａ）：水中、１．４％硫酸ｖ／ｖ
[00140] 移動相（Ｂ）：１００％アセトニトリル
[00141] 勾配は次の通りである［勾配時間，（分）移動相Ａ，（％）］：［（０．００，８８），（０．０５，８８），（１．２５，８５），（２．２５，８３），（３．０，８２），（３．５，８８），（４．０，８８）］。流速は１ｍＬ／分であった。
実施例３：操作された微生物中でのスクロース又はグルコースからのバニリンの生合成
[00142] ３－デヒドロシキメートの仲介を介したグルコースからのバニリン生合成は、発酵培養液中にバニリンを蓄積するため、大腸菌(E.Coli)(Kunjapur et al.,J.Am.Chem.Soc.2014,136:11644-11654)又は酵母(Hansen et al.,Appl.Environ.Microbiol.200975:2765-2774)中に設ける経路により得ることができる。単離されたバニリンサンプルを生成するための原料として、サトウキビ由来のスクロース又はトウモロコシ由来のグルコースを使用した。
[00143] 同位体分析用のサンプル調製及び計装は、公表された方法に基づいて実施した(Culp & Noakes,J.Agric.Food Chem.1990,38,1249-1255;Culp & Noakes J.Agric.Food Chem.1992,40,1892-1897)。１４Ｃ活性は、石油由来バニリン（０に近づくＣのｄｐｍ／ｇ）と植物供給源由来のものとを区別するために使用され得る、炭素の崩壊／分／ｇ（Ｃのｄｐｍ／ｇ）として報告され、典型的にはＣの１５～１６ｄｐｍ／ｇをもたらす。１３Ｃ／１２Ｃの安定同位体比を‰＝［（Ｒｓａｍｐｌｅ／Ｒｓｔａｎｄａｒｄ）－１］×１０３として表し、ここでＲ＝１３Ｃ／１２Ｃは、炭素放射性同位体におけるＰｅｅ Ｄｅｅベレムナイト（ＰＤＢ）標準と対比して表される。２Ｈ／１Ｈの安定同位体比は、‰＝［（Ｒｓａｍｐｌｅ／Ｒｓｔａｎｄａｒｄ）－１］×１０３として表し、ここでＲ＝２Ｈ／１Ｈは、水素放射性同位体における標準平均海水（ＳＭＯＷ）標準と対比して表される。
[00144] バニリンは、スクロース又はグルコースからの発酵により、３－デヒドロシキメートを３ステップでの芳香族アミノ酸生合成から抜き取ることにより生成した(Li and Frost,J.Am.Chem.Soc.1998 120:10545-10546)。サトウキビからのスクロース及びトウモロコシからのグルコースは、大量に利用可能であり、微生物成長及び天然香料成分製造における最低コストの炭素源の一部を表す。スクロースは、共通の中間体フルクトース６－リン酸を通じて解糖に入る（図３）。表２に示す通り、グルコースの元のトウモロコシ又はスクロースの元のサトウキビに遡った発酵由来バニリンの各々は、Ｃの１２．９ｄｐｍ／ｇ又はＣの１４．０～１４．１ｄｐｍ／ｇの１４Ｃデータを有した。これらの測定値は、光合成中のＣＯ２取り込みにおけるＣの１５～１６ｄｐｍ／ｇの大気安定状態と一致し、バニリン中の炭素を最近収集した植物供給源まで遡ることが可能であることが示される。このデータ単独ではバニリンサンプルを天然物として立証することができないが、それが石油由来であるという可能性は少なくとも除外される。
Figure 2022542228000009
[00145] 表２は、いくつかの天然及び人工供給源から得られたバニリンにおけるバルクδ１３Ｃデータ及びδ２Ｈ値を提示する。発酵を介して、グルコースの元のトウモロコシ又はスクロースの元のサトウキビから誘導されたバニリンにおける炭素同位体比は、ＰＤＢと比較して－１４．８‰～－１２．８‰であると測定された。トウモロコシ及びサトウキビが光合成（Ｃ４）中のハッチ－スラックＣＯ２固定に従うと仮定すると、両サンプルにおけるＰＤＢからの測定された‰偏差は、想定された範囲内である(Culp & Noakes,J.Agric.Food Chem.1990,38,1249-1255)。フェルラ酸の元の米糠の生物変換によって得られるバニリンは、ＰＤＢからの－３７．３‰～－３５．４‰偏差を有する天然香料成分として伝統的に認められている。米は、集団内のＰＤＢからの‰偏差の極限範囲内に位置づけられる、光合成（Ｃ３）中のカルビンＣＯ２固定に従う(Culp & Noakes,Agric.Food Chem.1990,38,1249-1255)。Geissler及び同僚らによって開示された通り、フェルラ酸がＣ４植物における期待値と一致するトウモロコシから誘導されるとき、偏差は－１９．９‰から－１９．０‰に変化する(Geissler et al.Flavour Frag.J.2017,32,228-2)。クルクミン、オイゲノール、リグニン及びグアヤコールにおけるＰＤＢからのバルクδ１３Ｃ‰偏差は、大して差がなくなり、バルクδ２Ｈ値とのクラスタリングを必要とする。グルコースの元のトウモロコシから誘導されたバニリンにおける水素同位体比は、ＳＭＯＷと比較して－１３２‰であると測定された。スクロースの元のサトウキビに由来するバニリンにおける水素同位体における測定値は、ＳＭＯＷと比較して－１５０‰～－１２４‰の範囲であった。発酵を介してスクロース又はグルコースから誘導されたバニリンは、バニリンに接近するための他の既知の経路からの特有のクラスターにおける水素同位体比データ結果と相まって、以前の報告から特有の炭素同位体比をもたらす（図４）。クルクミン、オイゲノール及びリグニンが天然供給源から誘導され得る一方で、グアヤコールは、主に石油から誘導される。クルクミンのバニリンへの生物変換が天然香料成分における基準に適合する一方で、オイゲノールから誘導されたバニリンは、該成分を生成するために用いられるプロセスに依存している(Gallage et al.Mol.Plant 2015,8,40-57.)。他方、リグニンを変換するためのプロセス及びグアヤコールにおける供給源は、天然と考えられない。いずれかの原料から誘導されたバニリンにより、大量のバニリンの生産及び人工バニラ香料としての販売をもたらす。バニラ・プラニフォリア(Vanilla planifolia)又はバニラ・タヒテンシス(Vanilla tahitensis)の抽出物からのバニリンの単離は、－２１．８‰～－２０．２‰のバルクδ１３Ｃ‰偏差をもたらす。これは、ＣＡＭ植物の特有の特徴である光合成中のカルビン及びハッチ－スラックＣＯ２固定の組み合わせを示すバニラオーキッドに起因し得る(Geissler et al.Flavour Frag.J.2017,32,228-237)。
[00146] 香料成分バニリンは、合成、生合成又は生物変換方法の動員により、いくつかの原料から誘導可能である。複数のバニリンサンプルにおけるバルクδ１３Ｃ及びδ２Ｈ値は、３－デヒドロシキメートの仲介を介したスクロース又はグルコースからの生合成を別として以前に公表されている(Culp & Noakes,J.Agric.Food Chem.1992,40,1892-1897;Geissler et al.Flavour Frag.J.2017,32,228-237)。この例は、２つのＣ４植物から誘導されたスクロースからのバニリンの生合成が－１４．７～－１２．８の特有の位置に存在するバルクδ１３Ｃ偏差を有する一方で、バルクδ２Ｈ値が他のバニリンサンプルにおけるデータと比較すると重複することを示す。
[00147] 本明細書中に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、あたかも各個別の出版物又は特許出願が参照により援用されることが具体的且つ個別に示されたように、参照により本明細書中に援用される。前述の発明が、理解を明確にする目的で図面及び実施例によりある程度詳述されているが、本発明の教示内容に照らして、特定の変更及び改変が、それらに対して、貼付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく設けられてよいことは、当業者に容易に理解されるであろう。
配列番号１
長さ：１０８１
タイプ：
生物：出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)
他の情報：ＭＳ１３５８０２配列
Figure 2022542228000010
 配列番号２
長さ：１９１２
タイプ：
生物：人工配列
他の情報：Ｒ２１配列
Figure 2022542228000011

Claims (37)

  1. ＨＦＤ１の欠失を含む、バニリン又はグルコバニリンを生成する能力がある遺伝子改変宿主細胞。
  2. Ｈｆｄ１を発現しない、請求項１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  3. ＡＤＨ６の欠失をさらに含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  4. ＧＲＥ２の欠失をさらに含む．請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  5. ＹＧＬ０３９Ｗの欠失をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  6. ＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、及びＡｒｏＺを発現する１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  7. ＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、ＡｒｏＦ、及びＡｒｏＺを発現する１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  8. 大腸菌(E.Coli)ＡｒｏＢ、大腸菌(E.Coli)ＡｒｏＤ、大腸菌(E.Coli)ＡｒｏＦ、及びポドスポラ・パウシセタ(Podospora pauciseta)ＡｒｏＺを発現する１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  9. ＰＰＴＡＳＥ及びＡＣＡＲを発現する１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  10. コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)ＰＰＴＡＳＥ及びノカルジア・イオウェンシス(Nocardia iowensis)ＡＣＡＲを発現する１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  11. ＥＡＯを発現する１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  12. ロドコッカス・ジョスティイ(Rhodococcus jostii)ＥＡＯを発現する１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  13. ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を発現する１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  14. シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ＵＧＴを発現する１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  15. 各異種遺伝子が誘導性プロモーターから発現される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  16. 各異種遺伝子がＧＡＬプロモーターから発現される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  17. 各異種遺伝子がＧＡＬプロモーターから発現され、ＧＡＬ８０遺伝子がＭＡＬプロモーターから発現される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  18. 細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、及び植物細胞から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  19. 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  20. 前記バニリンがバニリン又はグルコバニリンである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  21. 前記バニリンがグルコバニリンである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  22. ピーク累積収率又は生産性、又は両方において、親株と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、又は２０％の増加をもたらす、請求項１～２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
  23. バニリン又は１つ以上のグルコバニリンを生成するための方法であって、
    （ａ）請求項１～２５のいずれか一項に記載の宿主細胞の集団を、炭素源を有する培地中、バニリン又は１つ以上のグルコバニリンの作製に適した条件下で培養し、培養液を得るステップと；
    （ｂ）前記バニリン又は１つ以上のグルコバニリンを前記培養液から回収するステップと、
    を含む方法。
  24. 請求項２５に記載の方法によって生成されるバニリン又はグルコバニリン。
  25. 約－１４．８～約－１２．８パーミルのＰＤＢ標準からのバルクδ１３Ｃ偏差；及び／又は約－１５０～約－１２４パーミルのＳＭＯＷ標準からのバルクδ２Ｈ偏差；及び／又は約１２．９～約１４．１ｄｐｍ／ｇの１４Ｃ活性を有するバニリン。
  26. 約－１２．８のパーミルのＰＤＢ標準からのバルクδ１３Ｃ偏差を有する、請求項２５に記載のバニリン。
  27. 約－１４．８パーミルのＰＤＢ標準からのバルクδ１３Ｃ偏差を有する、請求項２５に記載のバニリン。
  28. 約－１５０～約－１２４パーミルのＳＭＯＷ標準からのバルクδ２Ｈ偏差を有するバニリン。
  29. 約－１５０パーミルのＳＭＯＷ標準からのバルクδ２Ｈ偏差を有する、請求項２８に記載のバニリン。
  30. 約－１２４パーミルのＳＭＯＷ標準からのバルクδ２Ｈ偏差を有する、請求項２８に記載のバニリン。
  31. 約１２．９～約１４．１ｄｐｍ／ｇの１４Ｃ活性を有するバニリン。
  32. 約１２．９ｄｐｍ／ｇの１４Ｃ活性を有する、請求項３１に記載のバニリン。
  33. 約１４．１ｄｐｍ／ｇの１４Ｃ活性を有する、請求項３１に記載のバニリン。
  34. 前記バルクδ１３Ｃ偏差及び前記バルクδ２Ｈ偏差を有する、請求項２５～３３のいずれか一項に記載のバニリン。
  35. 前記バルクδ１３Ｃ偏差及び前記１４Ｃ活性を有する、請求項２５～３３のいずれか一項に記載のバニリン。
  36. 前記バルクδ２Ｈ偏差及び前記１４Ｃ活性を有する、請求項２５～３３のいずれか一項に記載のバニリン。
  37. 前記バルクδ１３Ｃ偏差、前記バルクδ２Ｈ偏差、及び前記１４Ｃ活性を有する、請求項２５～３３のいずれか一項に記載のバニリン。
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