JP2022541767A - ヒト及びイヌｃｔｌａ－４に対するイヌ化抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に対して特異的な配列及び高い結合親和性を有する、イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体を提供する。本発明は、さらに、イヌ及び他のコンパニオンアニマルにおける癌の治療におけるこれらの抗体の使用にも関する。【選択図】図５
Description
関連出願への相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）に基づいて、２０１９年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８７４，２８７号の優先権を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）に基づいて、２０１９年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８７４，２８７号の優先権を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、共刺激又は共阻害シグナル伝達経路に関与するタンパク質（これは、ＣＴＬＡ－４を包含する）に対する抗体に関する。より特定的には、本発明は、さらに、特定の配列を有し且つイヌＣＴＬＡ－４に対する高い結合親和性を有している、ヒトＣＴＬＡ－４に対するイヌ化抗体に関する。本発明は、さらに、イヌの癌の治療における本発明の抗体の使用にも関する。
免疫応答の開始又は終了は、多くの種類の免疫細胞（特に、Ｔリンパ球及び抗原提示細胞（ＡＰＣ））の表面で発現する一連のタンパク質の間の複雑な相互作用によって活性化されるシグナル伝達経路を介して媒介される。共刺激シグナル伝達経路は、免疫応答の発生をもたらし、そして、最も重要にはＴ細胞の表面のＣＤ２８とＡＰＣの表面のＢ７．１（ＣＤ８０としても知られている）及びＢ７．２（ＣＤ８６としても知られている）ファミリーメンバーとの相互作用を介して媒介されることが、示されている。Ｂ７．１及びＢ７．２は、同様の機能を果たすと考えられている。
対照的に、共阻害経路は、免疫応答の阻害又は終結をもたらし、そして、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ－４とＡＰＣ上のＢ７．１／Ｂ７．２タンパク質の間の相互作用を介して媒介されることが示されている。さらなる共阻害シグナル伝達経路は、Ｔ細胞上のプログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）とＡＰＣ上のプログラム細胞死受容体リガンド１又は２（ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２）タンパク質の間の相互作用を介して媒介されることが示されている。さらに、ＰＤ－Ｌ１とＢ７．１の間の相互作用も、Ｔ細胞内に阻害シグナルをもたらす可能性があることも示されている。
Ｂ７．１及びＢ７．２は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである［Ｓｈａｒｐｅ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２：１１６－１２６ （２００２）］。Ｂ７．１は、活性化Ｂ細胞、活性化Ｔ細胞、並びに、マクロファージ及び樹状細胞で発現する［Ｓｗａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｅｕｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２３：２９５－２９８ （１９９３）； Ｒａｚｉ－Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ８９：４２１０－４２１４ （１９９２）］。Ｂ７．２は、樹状細胞、ランゲルハンス細胞及びＢ細胞で構成的に発現する。さらに、Ｂ７．２は、単球で発現し、そして、ＩＦＮ－γ刺激後にアップレギュレーションされる［Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５２０８－５２１９ （１９９４）； Ｉｎａｂａ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８０：１８４９－１８６０ （１９９４）］。
Ｂ７．１及びＢ７．２は、ＣＤ２８とＣＴＬＡ－４に結合して、異なる機能的結果をもたらす［Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ８７：５０３１－５０３５ （１９９０）； Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７３：７２１－７３０（１９９１）； Ａｚｕｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７６－７９ （１９９３）； Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９０９－９１２ （１９９３）］。Ｂ７．１及びＢ７．２のＣＴＬＡ－４への結合は、Ｂ７．１及びＢ７．２のＣＤ２８への結合よりも極めて高い親和性を示す［ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５：３９３－４０２ （１９９７）］。
ＣＤ２８は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであるホモ二量体糖タンパク質である［Ａｒｕｆｆｏ ａｎｄ Ｓｅｅｄ， ＰＮＡＳ， ８４：８５７３－８５７７ （１９８７）］。成熟タンパク質は、カウンター受容体結合に不可欠なヘキサペプチドモチーフＭＹＰＰＰＹを含んでいる１３４アミノ酸残基からなる単一の細胞外可変ドメインを有している［Ｒｉｌｅｙ ａｎｄ Ｊｕｎｅ， Ｂｌｏｏｄ， １０５：１３－２１ （２００５）］。ＣＤ２８の４１アミノ酸の細胞質ドメインは、活性化時にリン酸化され得る４つのチロシン残基を含んでいる［Ｓｈａｒｐｅ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２：１１６－１２６ （２００２）］。ＣＤ２８は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分とＣＤ８＋Ｔ細胞の約５０％で発現する［Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：３８０-３８８ （１９９２）； Ｒｉｌｅｙ ａｎｄ Ｊｕｎｅ， Ｂｌｏｏｄ， １０５：１３－２１ （２００５）］。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ライゲーション後、ＣＤ２８に結合しているＢ７．１／Ｂ７．２は、重要な共刺激シグナルをＴ細胞に提供して、Ｔ細胞の活性化とそれに続く免疫応答の発生を可能にする［Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ８９：２７１－２７５ （１９９２）； Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７：２４６１－２４６６ （１９９１）］。ＣＤ２８シグナルの非存在下では、Ｔ細胞はアポトーシスを起こすか又は無反応状態になることが示されている［Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６５：３０２－３１９ （１９８７）； Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ８４：５４０９－５４１３ （１９８７）； Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４８：１３４９－１３５６ （１９９０）］。ＣＤ２８－Ｂ７．１／Ｂ７．２結合は、活性化に必要なＴＣＲライゲーションの閾値レベル（例えば、抗原－ＭＨＣ複合体の量）を変化させ、ナイーブ細胞を刺激するのに必要な時間を短縮し、Ｔ細胞応答の大きさを高めることができる［Ｓｏｓｋｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １２４：９６－１２３ （２０１４）］。
ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）も、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、そして、単一の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び短い細胞質尾部で構成されている［Ｓｗａｎｓｏｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ； １０１０：１６９－１７７ （２０００）］。さらに、ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８と約３０％のアミノ酸同一性を共有している。ＣＴＬＡ－４は、ナイーブＴ細胞では構成的に発現しないが、ＣＤ２８ライゲーションとＴ細胞活性化の直後に急速にアップレギュレーションされ、最初のＴ細胞活性化後約４８～９６時間でＣＴＬＡ－４の発現レベルがピークになる［Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５７：４７６２－４７７０ （１９９６）； Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：３７９５－３８０１ （１９９２）］。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８よりも極めて高い親和性でＢ７．１及びＢ７．２の両方に結合する［ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８５：３９３－４０２ （１９９７）］。しかしながら、ＣＤ２８結合Ｂ７．１又はＢ７．２の刺激効果とは対照的に、ＣＴＬＡ－４は、免疫応答のダウンモジュレーションに不可欠な抑制性受容体として機能する［Ｗａｌｎｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １：４０５－４１３ （１９９４）； Ｗａｌｎｕｓ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：２５４１－２５５０ （１９９６）； Ｋｒｕｍｍｅｌ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：２５３３－２５４０ （１９９６）］。ＣＴＬＡ－４がその免疫抑制機能を媒介する機序は、ＣＤ２８とＢ７．１／Ｂ７．２の間の相互作用の競合的阻害剤として作用する能力に関連している［「Ｓｗａｎｓｏｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １０１０：１６９－１７７ （２０００）」において概説されている］。免疫ダウンレギュレーションにおけるＣＴＬＡ－４の重要な役割は、ＣＴＬＡ－４欠損マウスで実証されている。そのＣＴＬＡ－４欠損マウスは、複数の臓器へのＴ細胞浸潤を特徴とするリンパ増殖性疾患の発症により３～５週齢で死亡する［Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３：５４１－５４１７ （１９９５）； Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０：９８５－９８８ （１９９５）］。ＣＴＬＡ－４ノックアウトの結果は、ＣＴＬＡ－４／Ｂ７．１／Ｂ７．２トリプルノックアウトマウスでは疾患がないことによって示されるように、ＣＤ２８とそのリガンドであるＢ７．１及びＢ７．２との相互作用に依存することも実証された［Ｍａｎｄｅｌｂｒｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８９：４３５－４４０ （１９９９）］。このことは、ＣＴＬＡ－４ＩｇをＣＴＬＡ－４ノックアウトマウスに繰り返し投与することによってもたらされるリンパ増殖に対する保護によっても確認されている［Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５８：５０９１－５０９４ （１９９７）］。
さらに、ＣＴＬＡ－４の効果を抗体でブロックすると、インビトロ及びインビボでのＴ細胞応答が増強され、抗腫瘍免疫応答が増大することが示されている［Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７１：１７３４－１７３６ （１９９６）］。これらの知見に基づいて、癌を治療するための治療モダリティを提供するために、モノクローナル抗体などのＣＴＬＡ－４ブロッカーの開発が行われた［Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， １００（８）：４７１２－４７１７ （２００３）； Ｐｈａｎ ＧＱ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ，１００（１４）：８３７２－８３７７ （２００３）； Ａｔｔｉａ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ２３（２５）：６０４３－６０５３ （２００５）； Ｃｏｍｉｎ－Ａｎｄｕｉｘ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ６：２２－２２ （２００８）； ＷＯ２００００３７５０４Ａ２； Ｕ．Ｓ．８，０１７，１１４Ｂ２； ＷＯ２０１００９７５９７Ａ１； ＷＯ２０１２１２０１２５Ａ１；及び、Ｂｏｕｔｒｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， １３（８）：４７３－４８６ （２０１６）］。
ＰＤ－１は、免疫調節受容体のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーである。ＰＤ－１は、さらに、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーでもあり、そして、そのリガンドに結合する細胞外可変ドメイン及びシグナル伝達分子に結合する細胞質尾部を含んでいる［「Ｚａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ２５：１１６３－１１７４ （２０１７）」において概説されている］。ＰＤ－１の細胞質尾部は、２つのチロシンベースのシグナル伝達モチーフを含んでいる［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０：３３７－３４７ （２００４）］。ＰＤ－１の発現は、刺激されていないＴ細胞、Ｂ細胞又は骨髄細胞では見られない。しかしながら、ＰＤ－１の発現は、活性化後にこれらの細胞でアップレギュレーションされる［Ｃｈｅｍｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７３：９４５－９５４ （２００４）； Ｐｅｔｒｖａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， ２０３：２２８１－２２９２ （２００６）］。ＰＤ－１は、ＣＴＬＡ－４と最も密接に関連しており、約２４％のアミノ酸同一性を共有している［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３５０：１７－３７ （２０１０）］。ＰＤ－１は、ＡＰＣの表面において発現するＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２に結合すると、Ｔ細胞の活性化を低減させる。これらのリガンドのいずれかがＰＤ－１に結合すると、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した抗原シグナル伝達が負に調節される。今日まで、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２のみがＰＤ－１に対するリガンドとして機能することがわかっている。ＣＴＬＡ－４の場合と同様に、ＰＤ－１ライゲーションは負の免疫調節シグナルを伝達するように見える。ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２によるＰＤ－１のライゲーションは、ＴＣＲを介した増殖及びサイトカイン産生の阻害をもたらす［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３５０：１７－３７ （２０１０）］。ＣＴＬＡ－４欠損動物とは対照的に、ＰＤ－１欠損マウスは、生涯のかなり後のほうで死亡し、そして、自己免疫の兆候を示すが、観察された影響の重症度は、ＣＴＬＡ－４欠損動物が示すほど深刻ではない［Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １１（２）：１４１－１５１ （１９９９）； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９１（５５０２）：３１９－３２２ （２００１）］。ＰＤ－１シグナル伝達経路は現在集中的に研究されているが、これまでの研究は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１相互作用が、ＴＣＲ刺激の下流のシグナルを減少させ、そのことが、サイトカイン分泌の低減及びＴ細胞増殖の機能障害及びＴ細胞による細胞毒性分子の産生の低減をもたらすので、一部の免疫応答の負の調節に関与していることを示唆している［Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９２ （７）：１０２７－１０３４ （２０００）］。
ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）は、１型膜タンパク質であり、そして、ＩｇＶ様細胞外ドメイン及びＩｇＣ様細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン並びにシグナル伝達特性が不明な３０アミノ酸からなる短い細胞質尾部で構成されている。ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ７ファミリーのメンバーとして認識されており、Ｂ７ファミリーのメンバーと約２０％のアミノ酸同一性を共有している。ＰＤ－Ｌ１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞で見られる受容体ＰＤ－１に結合する。ＰＤ－Ｌ１は、共刺激分子Ｂ７．１にも結合するが、ＣＤ８６には結合しない［Ｂｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４５ （１３）：３５６７－３５７２ （２００８）］。Ｂ７．１のＰＤ－Ｌ１に対する親和性は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に対する親和性の中間である。関連分子ＰＤ－Ｌ２は、ＣＤ８０又はＣＤ８６のいずれにも親和性を有さないが、受容体としてＰＤ－１を共有している。ＰＤ－Ｌ１がＴ細胞上のその受容体ＰＤ－１に結合すると、ＴＣＲが介在するＩＬ－２産生とＴ細胞増殖を阻害するシグナルが送達される。ＰＤ－１に結合するＰＤ－Ｌ１は、ナイーブＴ細胞への抗原提示中にリガンド誘導性のＴＣＲダウンモジュレーションにも寄与する。さらに、ＰＤ－Ｌ１がＴ細胞上のＢ７．１に結合すると、Ｔ細胞のアポトーシスが起こる。Ｔ細胞活性化の阻害剤としてのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の役割は、多くの研究で実証されている。これらの知見に基づいて、癌及び感染症を治療するための治療モダリティを提供するために、モノクローナル抗体などのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１ブロッカーの開発が行われた。
イヌＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ－４の結合と活性をブロックするヒト化モノクローナル抗体が開発され、現在、いくつかの異なるタイプの癌のうちの１つと診断されたヒト対象者の治療において使用することが可能である。同様に、イヌＰＤ－１及びＰＤＬ１の結合と活性をブロックするイヌ化モノクローナル抗体も報告されている［Ｕ．Ｓ．９，９４４，７０４Ｂ２、Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２及びＵ．Ｓ．２０１８／０２３７５３５Ａ１；これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。しかしながら、これまで、イヌＣＴＬＡ－４の結合と活性をブロックするイヌ化モノクローナル抗体は報告されていない。
本明細書中における参考文献の引用は、いずれも、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを承認するものと解釈されるべきではない。
Ｓｈａｒｐｅ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２：１１６－１２６ （２００２）
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本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に対して特異的な結合親和性を有し、並びに、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／又はＣＤ８６への結合をブロックする能力を有している、イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体に関する。本発明は、さらに、癌などの疾患及び／又は感染症に起因する疾患の処置におけるそのような抗体の使用にも関する。
従って、本発明は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する、イヌＩｇＧ重鎖及びイヌカッパ又はラムダ軽鎖を含んでいる単離されたイヌ化抗体又は該イヌ化抗体の抗原結合フラグメントを提供する。このタイプの特定の実施形態では、該イヌカッパ又はラムダ軽鎖は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）〔即ち、ＣＤＲ軽１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽２（ＣＤＲＬ２）及びＣＤＲ軽３（ＣＤＲＬ３）〕を含んでおり、及び、該イヌＩｇＧ重鎖は、３つの重鎖ＣＤＲ〔即ち、ＣＤＲ重１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重２（ＣＤＲＨ２）及びＣＤＲ重３（ＣＤＲＨ３）〕を含んでおり、ここで、該６つ全てのＣＤＲは哺乳動物ＣＴＬＡ－４抗体から得られた。本発明のイヌ化抗体及びそのフラグメントの特定の実施形態は、イヌＣＴＬＡ－４に結合し、並びに／又は、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／若しくはＣＤ８６への結合をブロックする。
特定の実施形態において、該イヌ化抗体のＣＤＲＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含んでおり、ＣＤＲＬ２は、配列番号５６を含むアミノ酸配列を含んでおり、及び、ＣＤＲＬ３は、配列番号５８のアミノ酸配列を含んでいる。関連する実施形態では、該イヌ化抗体のＣＤＲＨ１は、配列番号４８のアミノ酸配列を含んでおり、ＣＤＲＨ２は、配列番号５０を含むアミノ酸配列を含んでおり、及び、ＣＤＲＨ３は、配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
特定の実施形態では、該イヌ化抗体のＣＤＲＬ１は、配列番号５３のヌクレオチド配列によってコード化され、ＣＤＲＬ２は、配列番号５５のヌクレオチド配列によってコード化され、及び、ＣＤＲＬ３は、配列番号５７のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該イヌ化抗体のＣＤＲＨ１は、配列番号４７のヌクレオチド配列によってコード化され、ＣＤＲＨ２は、配列番号４９のヌクレオチド配列によってコード化され、及び、ＣＤＲＨ３は、配列番号５１のヌクレオチド配列によってコード化される。
より特定の実施形態では、該イヌ化抗体のＣＤＲＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含んでおり、ＣＤＲＬ２は、配列番号５６を含むアミノ酸配列を含んでおり、及び、ＣＤＲＬ３は、配列番号５８のアミノ酸配列を含んでおり、加えて、該イヌ化抗体のＣＤＲＨ１は、配列番号４８のアミノ酸配列を含んでおり、ＣＤＲＨ２は、配列番号５０を含むアミノ酸配列を含んでおり、及び、ＣＤＲＨ３は、配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
本発明の特定の実施形態では、該イヌ化抗体の重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該重鎖は、配列番号３３のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
さらに他の実施形態では、該イヌ化抗体の重鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該重鎖は、配列番号３５のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該重鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該重鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
さらに他の実施形態では、該イヌ化抗体の重鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該重鎖は、配列番号３７のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該重鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該重鎖は、配列番号３８のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
さらに他の実施形態では、該イヌ化抗体の重鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該重鎖は、配列番号３９のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該重鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該重鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
本発明の特定の実施形態では、該イヌ化抗体の重鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該重鎖は、配列番号５９のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該重鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該重鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
さらに他の実施形態では、該イヌ化抗体の重鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該重鎖は、配列番号６１のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該重鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該重鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
さらに他の実施形態では、該イヌ化抗体の重鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該重鎖は、配列番号６３のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該重鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該重鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
さらに他の実施形態では、該イヌ化抗体の重鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該重鎖は、配列番号６５のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該重鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該重鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる。
特定の実施形態では、該イヌ化抗体のイヌ軽鎖は、カッパ鎖である。代替的な実施形態では、該イヌ軽鎖は、ラムダ鎖である。特定の実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４１のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を含んでいる。
特定の実施形態では、該イヌ化抗体のカッパ軽鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４３のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を含んでいる。
さらに他の実施形態では、該イヌ化抗体のカッパ軽鎖は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいる。より特定の実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４５のヌクレオチド配列によってコード化される。関連する実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４６のアミノ酸配列の保存的変異体内に、配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を含んでいる。さらに他の実施形態では、該カッパ軽鎖は、配列番号４６のアミノ酸配列の機能保存された変異体内に、配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を含んでいる。
本発明はさらに、本発明の任意の軽鎖と本発明の任意の重鎖とを含んでいるイヌ化抗体を提供する。特定の実施形態では、該単離されたイヌ化抗体は、配列番号３６、配列番号６２のアミノ酸配列又は配列番号３６若しくは配列番号６２のアミノ酸配列の保存的変異体内の配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号４６のアミノ酸配列又は配列番号４６のアミノ酸配列の保存的変異体内の配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖、を含んでいる。より特定の実施形態では、単離されたイヌ化抗体は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４６のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖を含んでいる。他の特定の実施形態では、単離されたイヌ化抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖及びを配列番号４６の配列のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖を含んでいる。
他の特定の実施形態では、該単離されたイヌ化抗体は、配列番号４０、配列番号６６のアミノ酸配列又は配列番号４０若しくは配列番号６６のアミノ酸配列の保存的変異体内の配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号４２のアミノ酸配列又は配列番号４２のアミノ酸配列の保存的変異体内の配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖、を含んでいる。より特定の実施形態では、単離されたイヌ化抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖を含んでいる。他の特定の実施形態では、単離されたイヌ化抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖及びを配列番号４２の配列のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖を含んでいる。
本発明は、さらに、本発明のイヌ化抗体の軽鎖のうちのいずれか１つをコード化する単離された核酸を提供する。同様に、本発明は、さらに、本発明のイヌ化抗体の重鎖のうちのいずれか１つをコード化する単離された核酸を提供する。本発明は、さらに、本発明の単離された核酸のうちの１以上を含んでいる発現ベクターを提供する。本発明は、さらに、本発明の１以上の発現ベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。
特定の実施形態では、該抗体は、組換え抗体又はその抗原結合フラグメントである。関連する実施形態では、該可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、可動性リンカーで連結されていて、単鎖抗体を形成している。
特定の実施形態では、該抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである。別の実施形態では、該抗体又は抗原結合フラグメントはＦａｂ’フラグメントである。別の実施形態では、該抗体又は抗原結合フラグメントは、（Ｆａｂ’）２フラグメントである。さらに別の実施形態では、該抗体又は抗原結合フラグメントは、ダイアボディである。特定の実施形態では、該抗体又は抗原結合フラグメントは、ドメイン抗体である。より特定の実施形態では、該抗体又は抗原結合フラグメントは、イヌ化単一ドメイン抗体である。
特定の実施形態では、該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又は抗原結合フラグメントは、処置されているイヌ対象者の免疫応答を増大させる。
従って、本発明は、さらに、本明細書中に開示されているイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又は抗原結合フラグメントをコード化する単離された核酸を提供する。関連する実施形態では、そのような抗体又は抗原結合フラグメントは、イヌ対象者の癌を処置するための薬剤の調製に使用することができる。代替え的に又は組み合わせて、本発明は、診断的使用のための本発明の抗体又は抗体フラグメントのいずれかの使用を提供する。さらに追加の実施形態では、本明細書中に開示されているイヌ化抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかを含んでいるキットが提供される。
さらに追加の実施形態では、本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかをコード化する単離された核酸を含んでいる発現ベクターが提供される。本発明は、さらに、本明細書中に記載されている発現ベクターのいずれかを含んでいる宿主細胞に関する。特定の実施形態では、本発明のこれらの核酸、発現ベクター又はポリペプチドは、抗体を作製する方法において有用である。
本発明は、さらに、本発明のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントを薬学的に許容される担体又は希釈剤と一緒に含んでいる医薬組成物を包含する。さらに、本発明は、免疫細胞の活性を増大させる方法を提供し、ここで、該方法は、それを必要とする対象者に、治療有効量の本発明の該医薬組成物を投与することを含んでいる。特定の実施形態では、該対象者は、イヌである。代替的な実施形態では、該対象者は、ネコである。さらに他の実施形態では、該対象者は、馬である。特定の実施形態では、該方法は、癌の処置に使用される。別の実施形態では、該方法は、感染症又は感染性疾患の処置において使用される。さらに別の実施形態では、本発明のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントは、ワクチンアジュバントとして使用される。
本発明のこれらの態様及び別の態様は、以下の「図面の簡単な説明」及び「詳細な説明」を参照することによって、よりよく理解されるであろう。
略語
本発明の詳細な説明及び実施例を通して、以下の略語が使用される。
本発明の詳細な説明及び実施例を通して、以下の略語が使用される。
定義
本発明をより容易に理解することができるように、特定の技術用語及び科学用語を以下で明確に定義する。本明細書中の別の箇所で明確に定義されていない限り、本明細書中で使用されている他の全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
本発明をより容易に理解することができるように、特定の技術用語及び科学用語を以下で明確に定義する。本明細書中の別の箇所で明確に定義されていない限り、本明細書中で使用されている他の全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
添付されている「特許請求の範囲」を包含する本明細書中で使用されている場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの単語の単数形は、文脈によって別途明瞭に示されていない限り、それらの対応する複数の言及を包含する。
細胞又は受容体に適用される「活性化」は、文脈によって又は明示的に別途示されていない限り、リガンドによる細胞又は受容体の活性化又は処置を意味する。「リガンド」は、天然リガンド及び合成リガンド、例えば、サイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、突然変異タンパク質及び抗体由来の結合性化合物を包含する。「リガンド」は、さらに、小分子、例えば、サイトカインのペプチドミメティック及び抗体のペプチドミメティックも包含する。「活性化」は、内部機構によって調節される細胞活性化及び外部要因又は環境因子によって調節される細胞活性化を意味することができる。
分子の「活性」は、以下のものについて表す又は示すことができる： リガンド若しくは受容体への当該分子の結合、触媒活性； 遺伝子発現又は細胞のシグナル伝達、分化若しくは成熟を刺激する能力； 抗原活性、他の分子の活性の調節など。分子の「活性」は、さらに、以下のものについても示すことができる： 細胞間相互作用（例えば、接着）を調節する若しくは維持することにおける活性、又は、細胞の構造（例えば、細胞膜又は細胞骨格）を維持することにおける活性。「活性」は、さらに、以下のものも意味することができる： 比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］又は［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度など。「活性」は、先天性免疫系又は適応免疫系の成分の調節も示すことができる。
「投与」及び「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、動物（例えば、イヌ実験対象者）、細胞、組織、器官又は生体液に適用される場合、動物（例えば、イヌ対象者）、細胞、組織、器官又は生体液への外因性医薬、治療薬、診断薬又は組成物の接触を示している。細胞の処置は、細胞への試薬の接触及び体液への試薬の接触（ここで、該体液が細胞と接触する）を包含する。
「投与」及び「処置」は、さらに、試薬、診断薬、結合性化合物による、又は、別の細胞による、例えば細胞の、インビトロ処置及びエクスビボ処置も意味する。用語「対象者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、任意の生物を包含し、好ましくは、動物を包含し、より好ましくは、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ又はウマ）包含し、最も好ましくは、イヌを包含する。
「処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療薬（例えば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかを含んでいる組成物）を、その治療薬が治療活性を有する１以上の疾患症状を有している又は疾患に罹患していることが疑われる例えばイヌ対象者又は患者に、内部に又は外部から投与することを意味する。典型的には、該治療薬は、臨床的に測定可能な程度に（１又は複数の）症状の後退を誘導する又は（１又は複数の）症状の進行を阻止することによって、処置される対象者又は集団におけるそのような１以上の疾患症状を軽減する及び／又は改善するのに有効な量で投与される。特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも称される）は、患者（例えば、イヌ、ネコ又はウマ）の疾患の状態、年齢及び体重、並びに、対象者において所望の応答を引き出す当該医薬組成物の能力などの因子に応じて異なり得る。疾患症状が軽減又は改善されたかどうかは、その症状の重症度又は進行状態を評価するために獣医師又は別の熟達した医療提供者によって典型的に使用される任意の臨床測定によって評価することができる。本発明（例えば、処置方法又は製造品）の実施形態は、全ての対象者における（１又は複数の）標的疾患症状を軽減させることにおいて有効であるとは限らないかもしれないが、当技術分野で既知の任意の統計的検定（例えば、スチューデントｔ検定、カイ二乗検定、マン－ホイットニーのＵ検定、クラスカル－ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンキー－タプストラ検定及びウィルコクソン検定）によって決定される、統計的に有意の数の対象者における（１又は複数の）標的疾患症状を軽減するはずである。
「処置」は、ヒト対象者、獣医学対象者（例えば、イヌ）又は研究用対象者に適用される場合、治療的処置並びに研究用途及び診断用途を示している。「処置」は、ヒト対象者、獣医学対象者（例えば、イヌ）若しくは研究用対象者、又は、細胞、組織若しくは器官に適用される場合、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを例えばイヌ若しくは他の動物対象者（例えば、ネコ）、細胞、組織、生理学的区画又は生理学的流体に接触させることを包含する。
用語「免疫応答」は、例えば、癌細胞、病原体に感染した細胞若しくは組織又は侵入する病原体への選択的損傷、それらの破壊又はそれらの哺乳動物身体（例えば、イヌ身体）からの除去をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球及び前記細胞又は肝臓によって産生される可溶性高分子（例えば、抗体、サイトカイン及び補体）の作用を示している。
イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体
本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に結合する単離されたイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント及びそのような抗体又はそのフラグメントの使用を提供する。
本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に結合する単離されたイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント及びそのような抗体又はそのフラグメントの使用を提供する。
本明細書中で使用されている場合、イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体は、哺乳動物ＣＴＬＡ－４に特異的に結合するイヌ化抗体を示している。哺乳動物ＣＴＬＡ－４（特に、イヌＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する抗体は、他の抗原と比較して哺乳動物ＣＴＬＡ－４への優先的な結合を示す抗体であるが、この特異性は、絶対的な結合特異性を必要としない。イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体は、その結合がイヌから得られる生物学的サンプルの中のイヌＣＴＬＡ－４の存在を決定する場合、又は、それがイヌサンプル中の他の関連しないイヌタンパク質の活性を過度に妨げることなく（例えば、診断状況における偽陽性又は治療状況での副作用などの望ましくない結果を生じさせることなく）イヌＣＴＬＡ－４の活性を変化させることができる場合、イヌＣＴＬＡ－４に「特異的」と見なされる。イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体に必要な特異性の程度は、その抗体の意図される用途に依存してよく、いずれにせよ、意図される目的のための使用への適切性によって定義される。意図される方法の抗体又は抗体の抗原結合部位に由来する結合性化合物は、その抗原又はその変異体若しくは突然変異タンパク質に、他の任意のイヌ抗原との親和性と比較して、少なくとも２倍大きい、好ましくは、少なくとも１０倍大きい、さらに好ましくは、少なくとも２０倍大きい、最も好ましくは、少なくとも１００倍大きい親和性で結合する。しかしながら、イヌＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、特に、ネコＣＴＬＡ－４、ウマＣＴＬＡ－４及び／又はヒトＣＴＬＡ４などの密接に関連する抗原と交差反応し得る。
本明細書中で使用されている場合、抗体は、イヌＣＴＬＡ－４の酸配を含んでいるポリペプチドには結合するが、イヌＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列を欠いている別のイヌタンパク質が存在したとしても、そのようなタンパク質のどこにも全く結合しない場合、所与の配列（この場合、イヌＣＴＬＡ－４）を含んでいるポリペプチドに特異的に結合すると言われる。例えば、イヌＣＴＬＡ－４を含んでいるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、イヌＣＴＬＡ－４のＦＬＡＧ（登録商標）タグ付き形態には結合し得るが、別のＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きイヌタンパク質に特異的には結合しない。
本明細書中で使用されている場合、別途示されていない限り、「抗体フラグメント」又は「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合フラグメント、即ち、完全長抗体によって結合される抗原（例えば、イヌＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント（例えば、１以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメント）を示している。抗原結合フラグメントの例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃ－Ｆｖ；ナノボディ、及び、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体。
典型的には、本発明のイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントは、そのイヌＣＴＬＡ－４結合活性がモルベースで表される場合、その活性の少なくとも１０％（その対応する親抗体と比較した場合）を保持している。好ましくは、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、親抗体としてのイヌＣＴＬＡ－４結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％又はそれ以上を保持している。
本発明は、定義されたアミノ酸配列を有する抗体の「保存的変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）」と称される抗体を包含する。本明細書中で使用されている場合、「保存的変異体」は、定義されたアミノ酸配列を有する本発明のイヌ化抗体と比較して、それらのアミノ酸配列中に１、２、３又はそれ以上の保存的アミノ酸置換を有している。本発明は、さらに、定義されたアミノ酸配列を有するイヌ化抗体の「機能保存された変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ）」と称される抗体も包含する。本明細書中で使用されている場合、「機能保存された変異体」は、そのイヌ化抗体のアミノ酸配列と比較して、１つ、２つ、３つ又はそれ以上の非保存的アミノ酸置換を有している。用語「保存的変異体」及び「機能保存された変異体」は、本発明の対応するイヌ化抗体のイヌフレーム内におけるアミノ酸残基の変化に関してのみ使用され、該イヌ化抗体の特定のＣＤＲに関しては使用されない。重要なことに、「保存的変異体」及び／又は「機能保存された変異体」は、定義されたアミノ酸配列を含んでいる本発明の対応するイヌ化抗体の生物学的活性を実質的に変化させない。
「単離された抗体」は、精製状態を示しており、そして、そのような文脈では、当該分子が、別の生物学的分子（例えば、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物）又は別の物質（例えば、細胞デブリ及び増殖培地）を実質的に含んでいないことを意味する。一般に、用語「単離された」は、そのような物質又は水、緩衝剤若しくは塩が本明細書中に記載されている結合性化合物の実験的使用又は治療的使用を実質的に妨げる量で存在していない限り、そのような物質が完全に存在しないこと又は水、緩衝剤若しくは塩が存在しないことを示すことは意図してしない。
各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。従って、一般に、完全な抗体は、２つの結合部位を有している。二機能性抗体又は二重特異性抗体における場合を除いて、２つの結合部位は一般に同一である。
典型的には、重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置している、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含んでいる。該ＣＤＲは、通常、フレームワーク領域に隣接しており、それによって、特定のエピトープへの結合が可能になる。一般に、Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、いずれも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含んでいる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、一般に、以下の定義に従う： Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ．； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， ５ｔｈ ｅｄ．， ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ． ９１－３２４２ （１９９１）； Ｋａｂａｔ， Ａｄｖ． Ｐｒｏｔ． Ｃｈｅｍ． ３２：１－７５ （１９７８）； Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：６６０９－６６１６ （１９７７）； Ｃｈｏｔｈｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７ （１９８７） ｏｒ Ｃｈｏｔｈｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３ （１９８９）。
本明細書中で使用されている場合、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を示している。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（即ち、軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３、並びに、重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）に由来するアミノ酸残基を含んでいる。［配列によって抗体のＣＤＲ領域を定義している「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）」を参照されたい； さらにまた、構造によって抗体のＣＤＲ領域を定義している「Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７ （１９８７）」も参照されたい］。
本明細書中で使用されている場合、用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ＣＤＲ残基として本明細書中で定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を示している。イヌ化抗体のフレームワークは、イヌのフレームの一部を表している。
本明細書中で使用されている場合、用語「イヌ」は、別途示されていない限り、全ての家庭イヌ、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）又はイヌ科イヌ属（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）を包含する。
本明細書中で使用されている場合、用語「ネコ」は、ネコ科（Ｆｅｌｉｄａｅ）の任意のメンバーを示している。イエネコ、純血種及び／又は雑種のコンパニオンネコ並びに野生ネコ又は野良ネコは、全て、ネコである。
本明細書中で使用されている場合、用語「イヌフレーム」は、本明細書中でＣＤＲ残基として定義されている超可変領域残基以外のイヌ抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を示している。イヌ化抗体に関連して、実施形態の大部分において、天然イヌＣＤＲのアミノ酸配列は、両方の鎖内において、対応する異種ＣＤＲ（例えば、マウス抗体由来のＣＤＲ）で置き換えられている。場合により、イヌ抗体の重鎖及び／又は軽鎖は、例えば、以下で論じられているように、イヌ抗体内の異種ＣＤＲの立体配座を保存するため及び／又はＦｃ機能を改変するために、いくつかの異種非ＣＤＲ残基を含有することができる。
イヌＩｇＧには４種の既知のＩｇＧ重鎖サブタイプが存在し、それらは、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄと称される。２種の既知の軽鎖サブタイプは、ラムダ及びカッパと称される。
イヌ免疫細胞の結合及び活性化に加えて、ＣＴＬＡ－４に対するイヌ抗体又はイヌ化抗体は、２つの付加的な下記属性を有するように設計することも可能である：
１． 抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の欠如；及び、
２． プロテインＡクロマトグラフィーに基づくもののような業界標準技術を用いて大規模で容易に精製される。
１． 抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の欠如；及び、
２． プロテインＡクロマトグラフィーに基づくもののような業界標準技術を用いて大規模で容易に精製される。
天然に存在するイヌＩｇＧイソタイプはいずれも、両方の基準は満たさない。例えば、ＩｇＧ－Ｂは、プロテインＡを使用して精製することが可能であるが、高いレベルのＡＤＣＣ活性を有している。他方、ＩｇＧ－Ａは、プロテインＡに弱く結合するが、望ましくないＡＤＣＣ活性を示す。さらに、ＩｇＧ－ＤはＡＤＣＣ活性を示さないが、ＩｇＧ－ＣもＩｇＧ－ＤもプロテインＡカラムで精製できない。（ＩｇＧ－Ｃは、かなりのＡＤＣＣ活性を示す）。本発明は、この難題を、ＣＴＬＡ－４に対して特異的な突然変異イヌＩｇＧ－Ｂ抗体を提供することによって克服する［Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２を参照されたい；これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。これらの抗体は、いずれも、ＡＤＣＣなどのエフェクター機能を欠いており且つ業界標準のプロテインＡクロマトグラフィーを使用して容易に精製することが可能である。
本明細書中で使用されている場合、用語「イヌ化抗体」は、非イヌ供給源に由来する３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含んでいる抗体（例えば、イヌフレーム又は改変されたイヌフレームと一緒の抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体）を示している。改変されたイヌフレームは、１以上のアミノ酸の変化を含んでいる。特定の実施形態では、改変されたイヌフレームは、該イヌ化抗体の有効性をさらに最適化して、例えば、イヌＣＴＬＡ－４へのその結合を増大させ、並びに／又は、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／若しくはイヌＣＤ８６への結合をブロックするその能力を増大させる。
「相同性」は、最適に整列させた場合の２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド配列間の配列類似性を示している。比較される２つの配列の両方におけるある位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンによって占有されている場合、これらの分子はその位置において相同である。相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される相同な位置の数を、比較した位置の総数で除して、１００を乗じたものである。例えば、２つの配列を最適に整列させた場合に２つの配列中の１０の位置のうち６の位置が一致するか又は相同である場合、その２つの配列は６０％相同である。一般に、そのような比較は、２つの配列を最大の相同性パーセントが得られるように整列させた場合に行われる。
本明細書中で使用されている場合、１つのアミノ酸配列は、２番目のアミノ酸配列に対して、その両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合、１００％「同一」である、又は、１００％の「同一性」を示す。従って、あるアミノ酸配列は、２番目のアミノ酸配列に対して、その２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基のうちの５０％が同一である場合、５０％「同一」である。配列の比較は、所与のタンパク質（例えば、比較されるポリペプチドの一部分又はタンパク質）に含まれるアミノ酸残基の連続するブロックにわたって実施される。特定の実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の対応性を異なるように変化させ得る選択された欠失又は挿入を考慮に入れる。
「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドが自然界で見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部分と結合していない、又は、自然界では連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ若しくは合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡ又はそれらの何らかの組合せを意味する。本開示のために、特定のヌクレオチド配列「を含んでいる核酸分子」は無傷の染色体を包含しないことは、理解されるべきである。指定された核酸配列「を含んでいる」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、１０個まで又はさらには２０個まで又はそれ以上の他のタンパク質又はその部分若しくはフラグメントについてのコード配列を含むことができ、又は、記載されている核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含むことができ、及び／又は、ベクター配列を含むことができる。
語句「制御配列」は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列を発現させるのに必要なＤＮＡ配列を示している。原核生物に適切な制御配列には、例えば、プロモーターが含まれ、場合により、オペレーター配列が含まれ、及び、リボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを使用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーター又はエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に作動可能に連結されている；又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接していること、及び、分泌リーダーの場合は、隣接しており且つ読み取り相内にあること、を意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。核酸配列が本明細書中において提供されている場合、それが終止コドンを含み得ることも容易に理解される。しかしながら、終止コドンは交換可能であるため、特定の終止コドンを配列に含ませることは、その配列の必要な部分と見なされるべきではない。
本明細書中で使用されている場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は交換可能に使用され、そして、全てのそのような呼称は、子孫を包含する。従って、語句「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、一次対象者細胞及び継代の数を考慮せずにそれに由来する培養物を包含する。さらにまた、意図的な又は偶発的な突然変異に起因して、必ずしも全ての子孫が正確に同じＤＮＡ内容物を有さないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体子孫は包含される。異なる呼称が意図される場合は、それは、その文脈から明らかになる。
本明細書中で使用されている場合、「生殖細胞系配列」は、再構成されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を示している。再構成されていない免疫グロブリン配列の任意の適切な供給源を使用することができる。ヒト生殖細胞系配列は、例えば、アメリカ国立衛生研究所の関節炎及び筋骨格系／皮膚疾患国立研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ Ｓｋｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のウエブサイト上のＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖細胞系データベースから、入手することができる。マウス生殖細胞系配列は、例えば、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３：Ｄ２５６－Ｄ２６１ （２００５）］に記載されているようにして入手することができる。
代表的なイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体の特性
本発明は、単離されたイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体、及び、疾患の処置（例えば、イヌにおける癌の処置）における該抗体又はその抗原結合フラグメントの使用方法を提供する。イヌＣＴＬＡ－４に結合するイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体の例としては、限定するものではないが、イヌＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄ重鎖並びに／又はイヌカッパ軽鎖を抗ヒトＣＴＬＡ－４ ＣＤＲと一緒に含んでいる抗体などがある。従って、本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に結合し、並びに、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／又はＣＤ８６への結合をブロックするする、単離されたイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明は、単離されたイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体、及び、疾患の処置（例えば、イヌにおける癌の処置）における該抗体又はその抗原結合フラグメントの使用方法を提供する。イヌＣＴＬＡ－４に結合するイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体の例としては、限定するものではないが、イヌＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄ重鎖並びに／又はイヌカッパ軽鎖を抗ヒトＣＴＬＡ－４ ＣＤＲと一緒に含んでいる抗体などがある。従って、本発明は、イヌＣＴＬＡ－４に結合し、並びに、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／又はＣＤ８６への結合をブロックするする、単離されたイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
「保存的に改変された変異体」又は「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸を類似した性質（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格立体配座及び剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを示しており、その結果、当該変更は、多くの場合、そのタンパク質の生物学的活性を変えることなくなされ得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の１つのアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する［例えば、「Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， ｐ．２２４ （４ｔｈ Ｅｄ．； １９８７）」を参照されたい］。加えて、構造的に又は機能的に類似しているアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性がより低い。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントのさまざまな実施形態は、本明細書中に開示されている配列（例えば、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、６０、６２、６４又は６６）を有するポリペプチド鎖又はＣＤＲの領域以外の領域内に最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０又はそれ以上の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチド鎖、を含んでいる。例示的な保存的置換が、表Ａに記載されている。
本発明の抗体の機能保存的変異体も、本発明によって企図される。「機能保存的変異体」は、本明細書中で使用されている場合、抗原親和性及び／又は特異性などの所望の特性を変えることなく１以上のアミノ酸残基が変更されている抗体又はフラグメントを示している。そのような変異体は、限定するものではないが、特定のアミノ酸が表Ａの保存的アミノ酸置換のような類似特性を有するアミノ酸で置き換えられているものを包含する。
核酸
本発明は、さらに、本明細書中で開示されているイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体及びその抗原結合フラグメントの免疫グロブリン鎖をコード化する核酸を包含する。例えば、本発明は、下記表の中に記載されている新規核酸の全てを包含する。
本発明は、さらに、本明細書中で開示されているイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体及びその抗原結合フラグメントの免疫グロブリン鎖をコード化する核酸を包含する。例えば、本発明は、下記表の中に記載されている新規核酸の全てを包含する。
さらにまた、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較を実施した場合に本明細書中で提供されている抗体のイヌフレームのアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは、少なくとも約８０％同一、さらに好ましくは、少なくとも約９０％同一、及び、最も好ましくは、少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるイヌフレームのアミノ酸配列を含んでいる免疫グロブリンポリペプチドをコード化する核酸も本発明に包含され、ここで、該アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大の一致を与えるように選択される。本発明は、さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで比較を実施した場合に参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約７０％類似、好ましくは、少なくとも約８０％類似、さらに好ましくは、少なくとも約９０％類似、及び、最も好ましくは、少なくとも約９５％類似（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）しているアミノ酸配列を含んでいる免疫グロブリンポリペプチドのイヌフレームをコード化する核酸も提供し、ここで、該アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大の一致を与えるように選択され、同様に本発明に包含される。
配列同一性は、２つの配列を最適に整列させた場合に２つのポリペプチドのアミノ酸が等しい位置において同一である程度を示している。配列類似性は、同一の残基及び生化学的に関連する非同一のアミノ酸を包含する。類似した特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸が上記で論じられている。
以下の参考文献は、配列解析のためにしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである： ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ： Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０ （１９９０）； Ｇｉｓｈ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６－２７２ （１９９３）； Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１－１４１（１９９６）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２ （１９９７）； Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９－６５６ （１９９７）； Ｗｏｏｔｔｏｎ， Ｊ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． １７：１４９－１６３ （１９９３）； Ｈａｎｃｏｃｋ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． １０：６７－７０ （１９９４）； ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ： Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ５， ｓｕｐｐｌ． ３． Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ （ｅｄ．）， ｐｐ． ３４５－３５２， （１９７８）； Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｒ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， “Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ５， ｓｕｐｐｌ． ３．“ （１９７８）， Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ （ｅｄ．）， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７８）， Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１９：５５５－５６５ （１９９１）； Ｓｔａｔｅｓ， Ｄ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６－７０（１９９１）； Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９ （１９９２）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６：２９０－３００ （１９９３）； ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ： Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８ （１９９０）； Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７ （１９９３）； Ｄｅｍｂｏ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｐｒｏｂ． ２２：２０２２－２０３９ （１９９４）；及び、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． “Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．” ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｓ． Ｓｕｈａｉ， ｅｄ．）， ｐｐ． １－１４， Ｐｌｅｎｕｍ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９７）。
本発明は、さらに、本発明の単離された核酸を含んでいる発現ベクターも提供し、ここで、該核酸は、宿主細胞を該ベクターでトランスフェクトしたときに宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている。さらにまた、本発明の発現ベクターを含んでいる宿主細胞、及び、本明細書中で開示されている抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法も提供され、ここで、該方法は、該抗体又は抗原結合フラグメントをコード化する発現ベクターを保有する宿主細胞を培地内で培養すること及び該抗原又はその抗原結合フラグメントを宿主細胞又は培地から単離することを含んでいる。
エピトープ結合及び結合親和性
本発明は、さらに、配列番号３６及び／又は配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいるイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体とイヌＣＴＬＡ－４上の同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／又はＣＤ８６への結合を阻害することができる。
本発明は、さらに、配列番号３６及び／又は配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいるイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体とイヌＣＴＬＡ－４上の同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、イヌＣＴＬＡ－４のイヌＣＤ８０及び／又はＣＤ８６への結合を阻害することができる。
該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体は、以下の実施例に記載されているように、組換え的に産生させることができる。本明細書中で開示されている抗体又はフラグメントの発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当分野でよく知られており、そして、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を包含する。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ－２９３細胞及び多くの他の細胞株が包含される。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ及びハムスターの細胞などがある。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有しているかを確認することによって選択される。使用し得る他の細胞株は、昆虫細胞株、例えば、Ｓｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞及び真菌細胞である。当該重鎖又はその抗原結合部分若しくはフラグメント、当該軽鎖及び／又はその抗原結合フラグメントをコード化する組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、その宿主細胞において該抗体の発現を可能にするのに充分な期間、又は、さらに好ましくは、その宿主細胞がその中で増殖する培地の中に抗体の分泌を可能にするのに充分な期間、宿主細胞を培養することによって当該抗体が産生される。
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、その培地から回収することができる。さらに、産生細胞株からの本発明の抗体（又は、それに由来する他の成分）の発現は、多くの既知技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。該ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、欧州特許第０２５６０５５号及び欧州特許第０３２３９９７号並びに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して全体的に又は部分的に考察される。
一般に、特定の細胞株又はトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、その細胞株又はトランスジェニック動物で産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。従って、抗体の特定のグリコシル化パターンは、その抗体を産生させるのに使用される特定の細胞株又はトランスジェニック動物に依存する。しかしながら、本明細書中において提供されている核酸分子によってコード化される又は本明細書において提供されているアミノ酸配列を含んでいる全ての抗体は、その抗体が有し得るグリコシル化パターンに関係なく、本発明を構成する。同様に、特定の実施形態では、非フコシル化Ｎ－グリカンのみを含んでいるグリコシル化パターンを有する抗体は、これらの抗体が典型的にはインビトロ及びインビボの両方でそれらのフコシル化対応物よりも強力な効力を発揮することが示されているので、有利であり得る［例えば、以下のものを参照されたい：Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８： ３４６６－３４７３ （２００３）； 米国特許第６，９４６，２９２号及び米国特許第７，２１４，７７５号］。
本発明は、さらに、本明細書中で開示されているイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体の抗体フラグメントを包含する。該抗体フラグメントには、例えばペプシンによるＩｇＧの酵素的切断によって生成され得る、Ｆ（ａｂ）２フラグメントが包含される。Ｆａｂフラグメントは、例えばジチオトレイトール又はメルカプトエチルアミンでＦ（ａｂ）２を還元することによって、生成させることができる。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によってＶＨ－ＣＨ１鎖に付加されたＶＬ－ＣＬ鎖である。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、２つのジスルフィド架橋によって付加された２つのＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）２分子のＦａｂ部分は、その間にジスルフィド架橋が位置するＦｃ領域の一部分を含んでいる。ＦＶフラグメントは、ＶＬ領域又はＶＨ領域である。
一実施形態では、該抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域、例えば、イヌ定常領域、例えば、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄイヌ重鎖定常領域又はその変異体を含んでいる。別の実施形態では、該抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域、例えば、イヌ軽鎖定常領域、例えば、ラムダ又はカッパイヌ軽鎖領域又はその変異体を含んでいる。例として、及び、限定するものではなく、該イヌ重鎖定常領域は、ＩｇＧ－Ｂに由来することができ［例えば、改変されたＩｇＧ－Ｂ； Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２を参照されたい、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］、及び、該イヌ軽鎖定常領域は、カッパに由来することができる。
抗体工学
本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、その抗体の特性を改善するために、親（即ち、イヌ）モノクローナル抗体の可変ドメイン内のフレームワーク残基を包含するイヌフレームへの改変を含むように操作した。
本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、その抗体の特性を改善するために、親（即ち、イヌ）モノクローナル抗体の可変ドメイン内のフレームワーク残基を包含するイヌフレームへの改変を含むように操作した。
実験的及び診断的用途
本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、さらに、イヌＣＴＬＡ－４タンパク質に関する診断アッセイにおいて、例えば、特定の腫瘍細胞、組織又は血清におけるその発現の検出において、有用であり得る。そのような診断方法は、さまざまな病気（特に、イヌの特定の癌）の診断において有用であり得る。
本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、さらに、イヌＣＴＬＡ－４タンパク質に関する診断アッセイにおいて、例えば、特定の腫瘍細胞、組織又は血清におけるその発現の検出において、有用であり得る。そのような診断方法は、さまざまな病気（特に、イヌの特定の癌）の診断において有用であり得る。
例えば、そのような方法は、以下の段階を含んでいる：
（ａ） 基質（例えば、マイクロタイタープレートウェルの表面、例えば、プラスチック製プレートの表面）をイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントでコーティングする段階；
（ｂ） イヌＣＴＬＡ－４の存在について試験されるサンプルを該基質に適用する段階；
（ｃ） そのプレートを洗浄して、当該サンプル中の未結合の物質を除去する段階；
（ｄ） ＣＴＬＡ－４抗原に対しても特異的である検出可能な標識化抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用する段階；
（ｅ） 該基質を洗浄して、結合していない該標識化抗体を除去する段階；
（ｆ） 該標識化抗体が酵素結合している場合、酵素によって蛍光シグナルに変換される化学物質を適用する段階；及び、
（ｇ） 該標識化抗体の存在を検出する段階。
（ａ） 基質（例えば、マイクロタイタープレートウェルの表面、例えば、プラスチック製プレートの表面）をイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントでコーティングする段階；
（ｂ） イヌＣＴＬＡ－４の存在について試験されるサンプルを該基質に適用する段階；
（ｃ） そのプレートを洗浄して、当該サンプル中の未結合の物質を除去する段階；
（ｄ） ＣＴＬＡ－４抗原に対しても特異的である検出可能な標識化抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用する段階；
（ｅ） 該基質を洗浄して、結合していない該標識化抗体を除去する段階；
（ｆ） 該標識化抗体が酵素結合している場合、酵素によって蛍光シグナルに変換される化学物質を適用する段階；及び、
（ｇ） 該標識化抗体の存在を検出する段階。
さらなる実施形態では、該標識化抗体は、ＡＢＴＳ［例えば、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンズチアゾリン－６－スルホン酸）］又は３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンと反応して検出可能な色の変化を生じるペルオキシダーゼで標識されている。あるいは、該標識化抗体は、シンチラントの存在下でシンチレーションカウンターによって検出することができる検出可能な放射性同位元素（例えば、３Ｈ）で標識されている。本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体は、ウエスタンブロット法又はイムノプロテインブロット法で使用することができる。
そのような方法は、本発明の一部を形成し、そして、例えば、以下を含んでいる：
（ｉ） 結合したイヌＣＴＬＡ－４又はそのフラグメントの存在について試験される膜又は別の固体基質を、本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させること。そのような膜は、非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルの中のイヌＣＴＬＡ－４の存在が試験されるタンパク質が（例えば、該ゲル中で電気泳動分離された後で）移されたニトロセルロース又はビニル系［例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）］膜の形態であることができる。膜に該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを接触させる前に、該膜を、場合により、その膜上の非特異的タンパク質結合部位が結合するように例えば無脂乾燥乳などでブロックする；
（ｉｉ） 未結合のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント及び他の未結合物質を除去するために、該膜を１回以上洗浄すること；及び
（ｉｉｉ） 結合したイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを検出すること。
（ｉ） 結合したイヌＣＴＬＡ－４又はそのフラグメントの存在について試験される膜又は別の固体基質を、本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させること。そのような膜は、非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルの中のイヌＣＴＬＡ－４の存在が試験されるタンパク質が（例えば、該ゲル中で電気泳動分離された後で）移されたニトロセルロース又はビニル系［例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）］膜の形態であることができる。膜に該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを接触させる前に、該膜を、場合により、その膜上の非特異的タンパク質結合部位が結合するように例えば無脂乾燥乳などでブロックする；
（ｉｉ） 未結合のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント及び他の未結合物質を除去するために、該膜を１回以上洗浄すること；及び
（ｉｉｉ） 結合したイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを検出すること。
結合した抗体又は抗原結合フラグメントの検出は、その抗体又は抗原結合フラグメントを検出可能に標識された二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）と結合させ、次いで、その二次抗体の存在を検出することによって、行うことができる。
本明細書中で開示されているイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体及びその抗原結合フラグメントは、さらに、免疫組織化学に使用することができる。そのような方法は、本発明の一部を形成し、そして、例えば、以下を含んでいる：（１）イヌＣＴＬＡ－４の存在について試験される細胞を、本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させること；及び、（２）その細胞の表面上又は内部の当該抗体又はフラグメントを検出すること。該抗体又は抗原結合フラグメント自体が検出可能に標識されている場合は、それは、直接検出することが可能である。あるいは、該抗体又は抗原結合フラグメントに、検出可能に標識された二次抗体を結合させることができ、それを検出する。
本明細書中に開示されている特定のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体及びその抗原結合フラグメントは、さらに、インビボ腫瘍イメージングに使用することもできる。そのような方法は、放射性標識されたイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントをイヌＣＴＬＡ－４の発現に関連する腫瘍の存在について試験されるイヌの体内に注射すること、続いて、当該患者の身体を核イメージングに付して、例えば腫瘍に結合している高濃度の当該抗体又は抗原結合フラグメントを含んでいる場所において、標識された当該抗体又は抗原結合フラグメントの存在を検出すること、を含み得る。
イメージング技術としては、ＳＰＥＣＴイメージング（単一光子放射型コンピュータ断層撮影）又はＰＥＴイメージング（ポジトロン放射型断層撮影）などがある。標識としては、例えば、以下のものなどがある：例えばＳＰＥＣＴイメージングと組み合わせた、ヨウ素－１２３（１２３Ｉ）及びテクネチウム－９９ｍ（９９ｍＴｃ）、又は、例えばＰＥＴイメージングと組み合わせた、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ若しくは１８Ｆ、又は、インジウム－１１１［例えば、「Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ６７：３８５－４４０ （２００５）」を参照されたい］。
医薬組成物及び投与
イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントの医薬組成物又は滅菌組成物を調製するために、そのイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合させる。［例えば、以下のものを参照されたい：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （１９８４）］。
イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントの医薬組成物又は滅菌組成物を調製するために、そのイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合させる。［例えば、以下のものを参照されたい：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （１９８４）］。
治療薬及び診断薬の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液又は懸濁液の形態にある、許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合させることによって、調製することができる［例えば、以下のものを参照されたい：Ｈａｒｄｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； Ｇｅｎｎａｒｏ （２０００） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； Ａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） （１９９３） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹ； Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） （１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹ； Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） （１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹ； Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ （２０００） Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ］。一実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体を酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５～６）の中で適切な濃度に希釈し、そして、張度のためにＮａＣｌ又はスクロースを添加する。安定性を高めるために、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０などの付加的な作用物質を添加することができる。
単独で又は別の作用物質と組み合わせて投与される該抗体組成物の毒性及び治療効果は、例えばＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学手順によって確認することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。特定の態様においては、高い治療指数を示す抗体が望ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、イヌにおける使用のための投与量範囲を設定するのに使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、殆ど又は全く毒性を伴わないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内にある。該投与量は、使用される投与形態及び投与経路に応じてこの範囲内でさまざまであり得る。
投与の方法はさまざまであり得る。適切な投与経路としては、以下の経路などがある：経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮、又は、動脈内。
特定の実施形態では、該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、注射などの侵襲的経路によって投与することができる。本発明のさらなる実施形態では、イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体若しくはその抗原結合フラグメント又はその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内に、又は、吸入、エアロゾル送達によって、投与される。非侵襲的経路（例えば、経口的に；例えば、丸剤、カプセル剤又は錠剤中で）による投与も、本発明の範囲内である。
組成物は、当技術分野で知られている医療機器を用いて投与することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、皮下注射針（これは、例えば、プレフィルドシリンジ又は自己注射器を包含する）による注射によって投与することができる。本明細書中で開示されている医薬組成物は、さらに、無針皮下注射装置（例えば、米国特許：第６，６２０，１３５号；第６，０９６，００２号；第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号又は第４，５９６，５５６号に開示されている装置）を用いて投与することもできる。
本明細書中で開示されている医薬組成物は、注入によって投与することもできる。医薬組成物を投与するためのよく知られているインプラント及びモジュールの例としては、以下のものなどがある： 米国特許第４，４８７，６０３号、これは、薬剤を制御された速度で投与するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示している； 米国特許第４，４４７，２３３号、これは、薬剤を正確な注入速度で送達するための薬剤注入ポンプを開示している； 米国特許第４，４４７，２２４号、これは、持続的な薬剤送達のための可変流量の移植可能な注入装置を開示している； 米国特許第４，４３９，１９６号、これは、マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示している。多くの他のそのようなインプラント、送達システム及びモジュールは、当業者にはよく知られている。
あるいは、例えば、多くの場合、デポー製剤又は持続放出製剤で、免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変又は関節炎の関節の内部に該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体を直接注入することによって、該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体を全身的にではなく局所的に投与することができる。さらに、例えば、免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変又は関節炎の関節を標的とする、標的化薬物送達システムで、例えば、組織特異的抗体で被覆されたリポソームに入れて、当該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体を投与することができる。該リポソームは、罹患組織を標的とし、そして、罹患組織によって選択的に取り込まれる。
投与レジメンは、治療用抗体の血清又は組織代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性及び生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性を包含するいくつかの因子に依存する。好ましくは、該投与レジメンは、同時に望ましくない副作用を最小限に抑えながら、標的疾患部位において改善をもたらすのに充分な治療用抗体を送達する。従って、送達される生物学的製剤の量は、一部には特定の治療用抗体及び処置される状態の重症度に依存する。治療用抗体の適切な用量の選択における指針を入手することが可能である［例えば、以下のものを参照されたい： Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ． Ｌｔｄ， Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ， ＵＫ （１９９６）； Ｋｒｅｓｉｎａ （ｅｄ．） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （１９９１）； Ｂａｃｈ （ｅｄ．） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （１９９３）； Ｂａｅｒｔ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４８：６０１－６０８ （２００３）； Ｍｉｌｇｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４１：１９６６－１９７３ （１９９９）； Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４４：７８３－７９２ （２００１）； Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４２：６１３－６１９ （２０００）； Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４８：２４－３２ （２００３）； Ｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４３：１５９４－１６０２ （２０００）］。
適切な用量の決定は、例えば処置に影響を及ぼすことが当分野で既知である又は推測されるパラメータ又は因子を使用して、獣医によって行われる。一般に、当該投与は、最適用量よりいくぶん低い量から開始し、その後、負の副作用と比較して所望の又は最適の効果が達成されるまで、少しずつ増量する。重要な診断基準としては、症状の診断基準、例えば、炎症又は産生される炎症性サイトカインのレベルの症状の診断基準などがある。
本明細書中で開示されている抗体又はその抗原結合フラグメントは、連続注入によって提供され得るか、又は、例えば、１日１回、週に１～７回、週１回、隔週に１回、月１回、隔月に１回、３ヶ月に１回、半年に１回、年１回などで投与される用量によって提供され得る。用量は、例えば、静脈内、皮下、局所、経口、鼻腔、直腸、筋肉内、脳内、脊髄内に、又は、吸入によって、提供され得る。１週間の総用量は、一般に、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重であり、より一般的には、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上である［例えば、以下のものを参照されたい： Ｙａｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４９：４２７－４３４ （２００３）； Ｈｅｒｏｌｄ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４６：１６９２－１６９８ （２００２）； Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． Ｐｓｙｃｈ． ６７：４５１－４５６ （１９９９）； Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５２：１３３－１４４ （２００３）］。用量は、さらにまた、対象者の血清中における該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体のあらかじめ定められた目標濃度（例えば、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍＬ又はそれ以上）を達成するように提供され得る。別の実施形態では、本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体は、週１回、隔週に１回、「４週間に１回」、月１回、隔月に１回又は３ヶ月に１回に基づいて、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００又は２５００ｍｇ／対象者で、皮下投与又は静脈内投与される。
本明細書中で使用されている場合、「阻害する」又は「処置する」又は「処置」は、障害に関連する症状の発現の先送り及び／又はそのような障害の症状の重症度の軽減を包含する。これらの用語は、さらに、既存の制御されていない又は望ましくない症状を改善すること、付加的な症状を予防すること及びそのような症状の基礎となる原因を改善又は予防することを包含する。従って、これらの用語は、障害、疾患若しくは症状を有している又はそのような障害、疾患若しくは症状を発現する可能性を有している脊椎動物対象者に有益な結果が与えられていることを意味する。
本明細書中で使用されている場合、用語「治療有効量」、「治療有効用量」及び「有効量」は、単独で又は付加的な治療薬と組み合わせて細胞、組織又は対象者に投与された場合に、疾患若しくは状態の１以上の症状における又はそのような疾患若しくは状態の進行における測定可能な改善を生じさせるのに有効な、本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントの量を示している。治療有効用量は、さらに、症状の少なくとも部分的な改善、例えば、関連する医学的状態の処置、治癒、予防若しくは改善又はそのような状態の処置、治癒、予防若しくは改善の速度の増大をもたらすのに充分な結合性化合物の量を示している。単独で投与される個々の活性成分に対して適用される場合、治療有効用量は、その成分単独を示している。組合せに対して適用される場合、治療有効用量は、併用して、連続的に又は同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の合計量を示している。治療薬の有効量は、診断基準又はパラメータの少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の改善をもたらす。有効量は、さらにまた、疾患の重症度を評価するのに主観的基準を用いる場合は、主観的基準の改善ももたらすことができる。
他の併用療法
先に記載したように、該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、１種類以上の別の治療薬（例えば、化学療法薬）と同時投与することができる。該抗体は、該別の治療薬に（免疫複合体として）連結させることができ、又は、該別の治療薬とは別々に投与することができる。後者（別々の投与）の場合、該抗体は、該別の治療薬の前に、後で若しくは同時に投与することが可能であり、又は、別の既知療法と同時投与することができる。
先に記載したように、該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントは、１種類以上の別の治療薬（例えば、化学療法薬）と同時投与することができる。該抗体は、該別の治療薬に（免疫複合体として）連結させることができ、又は、該別の治療薬とは別々に投与することができる。後者（別々の投与）の場合、該抗体は、該別の治療薬の前に、後で若しくは同時に投与することが可能であり、又は、別の既知療法と同時投与することができる。
キット
さらに、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する１種類以上の成分〔これは、限定するものではないが、本明細書中で論じられている抗体又は抗原結合フラグメントを包含する〕（例えば、本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント）を１種類以上の付加的な成分〔これは、限定するものではないが、本明細書中で論じられている薬学的に許容される担体及び／又は化学療法薬を包含する〕と一緒に含んでいるキットが提供される。該結合性組成物及び／又は該化学療法薬は、医薬組成物において、純粋な組成物として製剤することができるか、又は、薬学的に許容される担体と組み合わせて製剤することができる。
さらに、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する１種類以上の成分〔これは、限定するものではないが、本明細書中で論じられている抗体又は抗原結合フラグメントを包含する〕（例えば、本発明のイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント）を１種類以上の付加的な成分〔これは、限定するものではないが、本明細書中で論じられている薬学的に許容される担体及び／又は化学療法薬を包含する〕と一緒に含んでいるキットが提供される。該結合性組成物及び／又は該化学療法薬は、医薬組成物において、純粋な組成物として製剤することができるか、又は、薬学的に許容される担体と組み合わせて製剤することができる。
一実施形態では、該キットは、１つの容器（例えば、無菌のガラス性バイアル又はプラスチック性バイアル）の中の本発明の結合性組成物（例えば、配列番号３６及び配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいる該イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ４抗体又はその医薬組成物）並びに別の容器（例えば、無菌のガラス性バイアル又はプラスチック性バイアル）の中の医薬組成物及び／又は化学療法薬を含んでいる。
別の実施形態では、該キットは、結合性組成物成分（例えば、配列番号３６及び配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいるイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ４－抗体）を薬学的に許容される担体と一緒に含んでいる本発明の組合せを、場合により、一緒に（場合により、医薬組成物において）製剤された１種類以上の治療薬成分と組み合わせて、単一の共通する容器の中に含んでいる。
該キットが対象者への非経口投与用の医薬組成物を含んでいる場合、そのキットは、そのような投与を実施するための装置を含んでいることができる。例えば、該キットは、上記で論じた１以上の皮下注射用針又は他の注射装置を含んでいることができる。該キットは、さらに、そのキットの中の医薬組成物及び投与形態に関する情報を含む添付文書も含んでいることができる。一般に、そのような情報は、ペットの飼い主及び獣医が同封されている医薬組成物及び投与形態を有効かつ安全に使用するのに役立つ。例えば、本発明の組合せに関する以下の情報が添付文書中で提供され得る：薬物動態学、薬力学、臨床試験、効力パラメータ、適応症及び用法、禁忌、警告、注意、有害反応、過量、適切な投与量及び投与、供給方法、適切な保存条件、参考文献、製造業者／配給業者情報、及び、特許情報。
便宜上、本明細書中で開示されている抗体又は特定の結合性薬剤は、キット中で、即ち、診断又は検出アッセイを実施するための指示書と共に所定量の試薬の包装された組合せで、提供され得る。該抗体が酵素で標識されている場合、該キットは、基質及び当該酵素が必要とする補因子（例えば、検出可能な発色団又は発蛍光団を提供する基質前駆体）を含有する。加えて、他の添加物、例えば、安定化剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液）なども含まれる。さまざまな試薬の相対的な量は、当該アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するように広範囲に変えることができる。特に、該試薬は、溶解した際に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含有する、通常は凍結乾燥された、乾燥粉末として提供され得る。
実施例１
抗ＣＴＬＡ－４キメラ抗体の構築
ヒトＣＴＬＡ－４に結合すること及びヒトＣＴＬＡ－４とヒトＣＤ８６の結合をブロックすることの両方が分かっている、ヒトＣＴＬＡ－４に対して産生された従来技術のモノクローナル抗体も、イヌＣＴＬＡ－４に結合して、おそらく、イヌＣＤ８６とイヌＣＴＬＡ－４をブロックし得る可能性があると考えられた。この可能性について試験するために、抗ヒトＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体３Ｂ１０（ＷＯ２０１２１２０１２５に開示されている）の重鎖可変領域に対応する既知ヌクレオチド配列を、改変されたイヌ定常重鎖のヌクレオチド配列（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－３）に融合させて、配列番号１として示されているキメラマウス－イヌ重鎖ヌクレオチド配列を生成させた。抗ヒトＣＴＬＡ－４の軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列をコード化する第２の既知のヌクレオチド配列をイヌ定常カッパ軽鎖ドメインのヌクレオチド配列に融合させて、配列番号３として示されているキメラマウス－イヌ軽鎖ヌクレオチド配列を生成させた。該キメラマウス－イヌ重鎖ヌクレオチド配列によってコード化されるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでおり；及び、該キメラマウス－イヌ軽鎖ヌクレオチド配列によってコード化されるタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでいる。キメラヒト－イヌの重鎖及び軽鎖を、標準的な分子生物学技術を使用して別々の発現プラスミドにクローン化させた。重鎖及び軽鎖遺伝子を含んでいるプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、発現した抗体をプロテインＡを使用してＨＥＫ２９３細胞上清から精製した。
抗ＣＴＬＡ－４キメラ抗体の構築
ヒトＣＴＬＡ－４に結合すること及びヒトＣＴＬＡ－４とヒトＣＤ８６の結合をブロックすることの両方が分かっている、ヒトＣＴＬＡ－４に対して産生された従来技術のモノクローナル抗体も、イヌＣＴＬＡ－４に結合して、おそらく、イヌＣＤ８６とイヌＣＴＬＡ－４をブロックし得る可能性があると考えられた。この可能性について試験するために、抗ヒトＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体３Ｂ１０（ＷＯ２０１２１２０１２５に開示されている）の重鎖可変領域に対応する既知ヌクレオチド配列を、改変されたイヌ定常重鎖のヌクレオチド配列（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－３）に融合させて、配列番号１として示されているキメラマウス－イヌ重鎖ヌクレオチド配列を生成させた。抗ヒトＣＴＬＡ－４の軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列をコード化する第２の既知のヌクレオチド配列をイヌ定常カッパ軽鎖ドメインのヌクレオチド配列に融合させて、配列番号３として示されているキメラマウス－イヌ軽鎖ヌクレオチド配列を生成させた。該キメラマウス－イヌ重鎖ヌクレオチド配列によってコード化されるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでおり；及び、該キメラマウス－イヌ軽鎖ヌクレオチド配列によってコード化されるタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでいる。キメラヒト－イヌの重鎖及び軽鎖を、標準的な分子生物学技術を使用して別々の発現プラスミドにクローン化させた。重鎖及び軽鎖遺伝子を含んでいるプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、発現した抗体をプロテインＡを使用してＨＥＫ２９３細胞上清から精製した。
同様に、ＷＯ２０１２１２０１２５に以前に開示された可変ドメインを含んでいるキメラ抗体８Ｈ５も、それぞれ配列番号５～配列番号８として記載されているＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を含んでいる重鎖と軽鎖の組み合わせによって形成される抗体によって例示されるように構築した。さらに、ＷＯ２００００３７５０４に開示されている可変ドメインを含んでいるキメラ抗体４１１、４１８及び６１１も、それぞれ配列番号９～配列番号２０として記載されている核酸配列及びアミノ酸配列を含んでいる重鎖と軽鎖の組み合わせによって形成される抗体によって例示されるように構築した。Ｕ．Ｓ．８，０１７，１１４Ｂ２に開示されている可変ドメインを含んでいるキメラ抗体１０Ｄ１及び１Ｅ２も、それぞれ配列番号２１～配列番号２８として記載されているヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含んでいる重鎖と軽鎖の組み合わせによって形成される抗体によって例示されるように構築した。さらに、ＷＯ２０１００９７５９７に開示されている可変ドメインを含んでいるキメラ抗体３Ｂ３も、それぞれ配列番号２９～配列番号３２として記載されているヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含んでいる重鎖と軽鎖の組み合わせによって形成される抗体によって例示されるように構築した。該キメラ抗体のアミノ酸配列識別番号が、下記表１に示されている。
実施例２
抗ＣＴＬＡ－４キメラ抗体の反応性
実施例１のキメラ抗体を、Ｅｘｐｉ２９３細胞［ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＮＥＴＩＦＩＣ（登録商標）から得られたＥｘｐｉ２９３発現系］で発現させ、プロテインＡカラムで精製した。次いで、そのキメラ抗体を、以下のように、ＥＬＩＳＡによってイヌＣＴＬＡ－４との反応性について試験した：
１． イムノプレートに２００ｎｇ／ウェルのＣＴＬＡ－４をコーティングし、そのプレートを４℃で一晩インキュベートした；
２． プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含んでいるＰＢＳで３回洗浄した；
３． プレートを、室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした；
４． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
５． 希釈プレートの各列又は行で、抗体を３倍に希釈した；
６． 希釈した抗体をイムノプレートの各列又は行に移し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
７． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
８． プレートの各ウェルに１：２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗イヌＩｇＧ Ｆｃを添加し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
９． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
１０． プレートの各ウェルにＴＭＢ基質を添加し、そのプレートを室温で１０～１５分間インキュベートして、発色させた；
１１． 各ウェルに１００μＬの１．５Ｍリン酸を加えて反応を停止させた；
１２． プレートを５４０ｎｍの参照波長を用いて４５０ｎｍで読み取った。
抗ＣＴＬＡ－４キメラ抗体の反応性
実施例１のキメラ抗体を、Ｅｘｐｉ２９３細胞［ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＮＥＴＩＦＩＣ（登録商標）から得られたＥｘｐｉ２９３発現系］で発現させ、プロテインＡカラムで精製した。次いで、そのキメラ抗体を、以下のように、ＥＬＩＳＡによってイヌＣＴＬＡ－４との反応性について試験した：
１． イムノプレートに２００ｎｇ／ウェルのＣＴＬＡ－４をコーティングし、そのプレートを４℃で一晩インキュベートした；
２． プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含んでいるＰＢＳで３回洗浄した；
３． プレートを、室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした；
４． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
５． 希釈プレートの各列又は行で、抗体を３倍に希釈した；
６． 希釈した抗体をイムノプレートの各列又は行に移し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
７． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
８． プレートの各ウェルに１：２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗イヌＩｇＧ Ｆｃを添加し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
９． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
１０． プレートの各ウェルにＴＭＢ基質を添加し、そのプレートを室温で１０～１５分間インキュベートして、発色させた；
１１． 各ウェルに１００μＬの１．５Ｍリン酸を加えて反応を停止させた；
１２． プレートを５４０ｎｍの参照波長を用いて４５０ｎｍで読み取った。
ＥＬＩＳＡの結果は、図１に示されており、そして、選択された抗体がイヌＣＴＬＡ－４に結合できたことを示している。さらに、３Ｂ１０キメラ抗体は、このグループのキメラ抗体の中で最良の結合剤であることが見出された。
実施例３
イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体３Ｂ１０の構築
３Ｂ１０キメラ抗体がイヌＣＴＬＡ－４に対して最も強い結合親和性を有することを確認したので（図１を参照されたい）、このキメラ抗体の６つのＣＤＲからなるセットを選択してイヌのフレームに加えた。イヌ化のプロセスを実施するために、イヌＩｇＧの重鎖及び軽鎖をコード化するＤＮＡ配列を確認した［Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２を参照されたい；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。該イヌ重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列は、当技術分野で知られており、そして、ＮＣＢＩ遺伝子及びタンパク質データベースを検索することによって得ることができる。イヌＩｇＧの４つの既知ＩｇＧサブタイプが存在し、それらはＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄと称される。イヌ抗体には、カッパ及びラムダと称される２種類の軽鎖が存在する。
イヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体３Ｂ１０の構築
３Ｂ１０キメラ抗体がイヌＣＴＬＡ－４に対して最も強い結合親和性を有することを確認したので（図１を参照されたい）、このキメラ抗体の６つのＣＤＲからなるセットを選択してイヌのフレームに加えた。イヌ化のプロセスを実施するために、イヌＩｇＧの重鎖及び軽鎖をコード化するＤＮＡ配列を確認した［Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２を参照されたい；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。該イヌ重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列は、当技術分野で知られており、そして、ＮＣＢＩ遺伝子及びタンパク質データベースを検索することによって得ることができる。イヌＩｇＧの４つの既知ＩｇＧサブタイプが存在し、それらはＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄと称される。イヌ抗体には、カッパ及びラムダと称される２種類の軽鎖が存在する。
特定のアプローチに拘束されるものではないが、さまざまな組み合わせで混合させてイヌ化抗ヒトＣＴＬＡ－４ｍＡｂを産生させることができるイヌ化重鎖及び軽鎖を産生させる全プロセスは、以下のスキームを包含し得る：
（ｉ） 所望の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂのＨ鎖とＬ鎖のＣＤＲを特定する。そのＣＤＲのアミノ酸配列を適切なＤＮＡ配列に逆翻訳させる；
（ｉｉ） イヌＩｇＧのＨ鎖及びＬ鎖（例えば、Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２に記載されているＩｇＧ－Ｂの改変重鎖及び軽カッパ鎖）に対する適切なＤＮＡ配列を特定する；
（ｉｉｉ） 上記配列のイヌＩｇＧＨ鎖及びＬ鎖ＤＮＡの内因性ＣＤＲをコード化するＤＮＡ配列を特定する；
（ｉｖ） 内因性のイヌＨ鎖及びＬ鎖ＣＤＲをコード化するＤＮＡ配列を所望の抗ヒトＣＴＬＡ－４ＣＤＲをコード化するＤＮＡ配列で置き換える。改変されたイヌＩｇＧ－Ｂを使用した場合、配列番号６９で番号付けされたＤ３１Ａ及びＮ６３Ａでの改変は、Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２号（これは、その全体が本明細書に組み込まれる）において以前に記載されたように、イヌＩｇＧ－Ｂにおいて実施した。さらにまた、場合により、いくつかのイヌフレームアミノ酸残基をコード化するＤＮＡを所望の抗ヒトＣＴＬＡ－４ｍＡｂイヌ領域からの選択されたアミノ酸残基をコード化するＤＮＡに置き換えた。このプロセスは、復帰突然変異と称される。表４及び表５に記載されている、各重鎖に関する４つの変異体の２つのセット及び軽鎖可変領域に関する３つの変異体の１つのセットは、異なる復帰突然変異部位を含むセットの各変異体を用いて開発した；
（ｖ） 段階（ｉｖ）からのＤＮＡを合成し、それを適切な発現プラスミドにクローン化する；
（ｖｉ） 所望のイヌ化Ｈ鎖及びＬ鎖を含んでいるプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする；
（ｖｉｉ） 発現されたイヌ化抗体をＨＥＫ２９３上清から精製する；
（ｖｉｉｉ） 精製されたイヌ化抗体をイヌＣＴＬＡ－４への結合について試験する。
（ｉ） 所望の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂのＨ鎖とＬ鎖のＣＤＲを特定する。そのＣＤＲのアミノ酸配列を適切なＤＮＡ配列に逆翻訳させる；
（ｉｉ） イヌＩｇＧのＨ鎖及びＬ鎖（例えば、Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２に記載されているＩｇＧ－Ｂの改変重鎖及び軽カッパ鎖）に対する適切なＤＮＡ配列を特定する；
（ｉｉｉ） 上記配列のイヌＩｇＧＨ鎖及びＬ鎖ＤＮＡの内因性ＣＤＲをコード化するＤＮＡ配列を特定する；
（ｉｖ） 内因性のイヌＨ鎖及びＬ鎖ＣＤＲをコード化するＤＮＡ配列を所望の抗ヒトＣＴＬＡ－４ＣＤＲをコード化するＤＮＡ配列で置き換える。改変されたイヌＩｇＧ－Ｂを使用した場合、配列番号６９で番号付けされたＤ３１Ａ及びＮ６３Ａでの改変は、Ｕ．Ｓ．１０，１０６，６０７Ｂ２号（これは、その全体が本明細書に組み込まれる）において以前に記載されたように、イヌＩｇＧ－Ｂにおいて実施した。さらにまた、場合により、いくつかのイヌフレームアミノ酸残基をコード化するＤＮＡを所望の抗ヒトＣＴＬＡ－４ｍＡｂイヌ領域からの選択されたアミノ酸残基をコード化するＤＮＡに置き換えた。このプロセスは、復帰突然変異と称される。表４及び表５に記載されている、各重鎖に関する４つの変異体の２つのセット及び軽鎖可変領域に関する３つの変異体の１つのセットは、異なる復帰突然変異部位を含むセットの各変異体を用いて開発した；
（ｖ） 段階（ｉｖ）からのＤＮＡを合成し、それを適切な発現プラスミドにクローン化する；
（ｖｉ） 所望のイヌ化Ｈ鎖及びＬ鎖を含んでいるプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする；
（ｖｉｉ） 発現されたイヌ化抗体をＨＥＫ２９３上清から精製する；
（ｖｉｉｉ） 精製されたイヌ化抗体をイヌＣＴＬＡ－４への結合について試験する。
イヌ化Ｈ鎖及びＬ鎖配列のセットを開発した。その配列番号は、下記表４及び表５に記載されている。
本発明は、上記表４及び表５に記載されているイヌ化重鎖と軽鎖との任意の組み合わせによって形成されたイヌ化抗体を提供する。次いで、その抗体をＥｘｐｉ２９３細胞で発現させ、精製した。図２に示されているＥＬＩＳＡの結果は、３Ｂ１０が首尾よくイヌ化され、その際、３Ｂ１０Ｌ３Ｈ２、３Ｂ１０Ｌ３Ｈ３及び３Ｂ１０Ｌ３Ｈ４が、全て、３Ｂ１０の親マウス－イヌキメラ抗体と同様の緊密な結合活性を有していることを示している。
実施例４
イヌＣＤ８６とＣＴＬＡ－４の相互作用に対するキメラ及びイヌ化抗体３Ｂ１０のブロッキング活性
イヌ化３Ｂ１０抗体がイヌＣＴＬＡ－４に対して親抗体と同じ中和活性を維持していることを確認するために、該イヌ化抗体を、イヌ－ＣＤ－８０とイヌＣＴＬＡ－４の相互作用に対するブロッキング活性について、以下のようにＥＬＩＳＡによって試験した：
１． イムノプレートに２００ｎｇ／ウェルのＣＴＬＡ－４をコーティングし、そのプレートを４℃で一晩インキュベートした；
２． プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含んでいるＰＢＳで３回洗浄した；
３． プレートを、室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした；
４． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
５． 希釈プレートの各列又は行で、抗体を３倍に希釈し、次いで、１００ｎｇ／ウェルのビオチン化ＣＤ－８６を添加し、抗体と混合させた；
６． 希釈された抗体とＣＤ－８６の混合物をイムノプレートの各列又は行に移し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
７． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
８． プレートの各ウェルに、１：２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートしたストレプトアビジンを添加し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
９． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
１０． プレートの各ウェルにＴＭＢ基質を添加し、そのプレートを室温で１０～１５分間インキュベートして、発色させた；
１１． 各ウェルに１００μＬの１．５Ｍリン酸を加えて反応を停止させた；
１２． プレートを５４０ｎｍの参照波長を用いて４５０ｎｍで読み取った。
イヌＣＤ８６とＣＴＬＡ－４の相互作用に対するキメラ及びイヌ化抗体３Ｂ１０のブロッキング活性
イヌ化３Ｂ１０抗体がイヌＣＴＬＡ－４に対して親抗体と同じ中和活性を維持していることを確認するために、該イヌ化抗体を、イヌ－ＣＤ－８０とイヌＣＴＬＡ－４の相互作用に対するブロッキング活性について、以下のようにＥＬＩＳＡによって試験した：
１． イムノプレートに２００ｎｇ／ウェルのＣＴＬＡ－４をコーティングし、そのプレートを４℃で一晩インキュベートした；
２． プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含んでいるＰＢＳで３回洗浄した；
３． プレートを、室温で４５～６０分間、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキングした；
４． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
５． 希釈プレートの各列又は行で、抗体を３倍に希釈し、次いで、１００ｎｇ／ウェルのビオチン化ＣＤ－８６を添加し、抗体と混合させた；
６． 希釈された抗体とＣＤ－８６の混合物をイムノプレートの各列又は行に移し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
７． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
８． プレートの各ウェルに、１：２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートしたストレプトアビジンを添加し、そのプレートを室温で４５～６０分間インキュベートした；
９． プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；
１０． プレートの各ウェルにＴＭＢ基質を添加し、そのプレートを室温で１０～１５分間インキュベートして、発色させた；
１１． 各ウェルに１００μＬの１．５Ｍリン酸を加えて反応を停止させた；
１２． プレートを５４０ｎｍの参照波長を用いて４５０ｎｍで読み取った。
図３に示されているＥＬＩＳＡプレートの結果のプロットは、該イヌ化３Ｂ１０変異体が親３Ｂ１０と同様のブロッキング活性を有していることを示している。
実施例５
キメラ抗体によって活性化されるイヌＰＢＭＣのＩＦＮγ産生
序説：
インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ；ＩＩ型インターフェロンとしても知られている）は、主に、活性化Ｔリンパ球によって産生され、及び、おそらく、ナチュラルキラー細胞によって産生される。この属性は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイでＩＦＮ－γ産生を定量的に試験することにより、Ｔ細胞活性化の指標として広く適用されている。ＣＴＬＡ－４に対する機能的抗体（抗ＣＴＬＡ－４抗体）を特定するために、選択された抗体を、以下のプロトコルを使用して、イヌ末梢血単核細胞でのＩＦＮ－γ産生を刺激するそれらの活性について試験した。
キメラ抗体によって活性化されるイヌＰＢＭＣのＩＦＮγ産生
序説：
インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ；ＩＩ型インターフェロンとしても知られている）は、主に、活性化Ｔリンパ球によって産生され、及び、おそらく、ナチュラルキラー細胞によって産生される。この属性は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイでＩＦＮ－γ産生を定量的に試験することにより、Ｔ細胞活性化の指標として広く適用されている。ＣＴＬＡ－４に対する機能的抗体（抗ＣＴＬＡ－４抗体）を特定するために、選択された抗体を、以下のプロトコルを使用して、イヌ末梢血単核細胞でのＩＦＮ－γ産生を刺激するそれらの活性について試験した。
実験及び結果
イヌ末梢血単核細胞の分離
１． ＥＤＴＡ又はナトリウムヘパリン管に約２０ｍＬの全血を採取した；
２． 血液を５０ｍＬ容ポリスチレン管に移し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で５０：５０に希釈した；
３． １５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－ＰｌａｑｕｅＰｌｕｓを４×５０ｍＬ ＳｅｐＭａｔｅＴＭ管に添加した。次いで、約１０ｍＬの該５０：５０に希釈した血液をゆっくりと、Ｆｉｃｏｌｌを含んでいる各ＳｅｐＭａｔｅＴＭ管の側面に添加した；
４． 管を１２００×ｇで２０分間遠心分離した；
５． 勾配界面から細胞を回収し、その細胞を５０ｍＬ容ポリプロピレン管に移した。４０～４５ｍＬのマークまでＨＢＳＳを添加し、細胞を８００×ｇで１０分間遠心分離した；
６． 上清を廃棄し、細胞を４０～４５ｍＬ ＨＢＳＳに再懸濁させ、管を再度８００×ｇで１０分間遠心分離した；
７． 上清を廃棄し、各管からの細胞を２ｍＬのイヌリンパ球培地で再懸濁させた（細胞を、同じ動物からプールした）；
８． 細胞懸濁液の少量アリコートを取り、０．０４％トリパンブルーと混合させ、細胞数をカウントした；
９． 細胞懸濁液は、使用するまで２－７℃で保存した［しかしながら、使用する２４時間前からは２～７℃で保存しなかった］。
イヌ末梢血単核細胞の分離
１． ＥＤＴＡ又はナトリウムヘパリン管に約２０ｍＬの全血を採取した；
２． 血液を５０ｍＬ容ポリスチレン管に移し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で５０：５０に希釈した；
３． １５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－ＰｌａｑｕｅＰｌｕｓを４×５０ｍＬ ＳｅｐＭａｔｅＴＭ管に添加した。次いで、約１０ｍＬの該５０：５０に希釈した血液をゆっくりと、Ｆｉｃｏｌｌを含んでいる各ＳｅｐＭａｔｅＴＭ管の側面に添加した；
４． 管を１２００×ｇで２０分間遠心分離した；
５． 勾配界面から細胞を回収し、その細胞を５０ｍＬ容ポリプロピレン管に移した。４０～４５ｍＬのマークまでＨＢＳＳを添加し、細胞を８００×ｇで１０分間遠心分離した；
６． 上清を廃棄し、細胞を４０～４５ｍＬ ＨＢＳＳに再懸濁させ、管を再度８００×ｇで１０分間遠心分離した；
７． 上清を廃棄し、各管からの細胞を２ｍＬのイヌリンパ球培地で再懸濁させた（細胞を、同じ動物からプールした）；
８． 細胞懸濁液の少量アリコートを取り、０．０４％トリパンブルーと混合させ、細胞数をカウントした；
９． 細胞懸濁液は、使用するまで２－７℃で保存した［しかしながら、使用する２４時間前からは２～７℃で保存しなかった］。
イヌ末梢血単核細胞に関する細胞増殖アッセイ
１． 抗体をイヌリンパ球培地［ＬＯＮＺＡから購入したＲＰＭＩ培地（カタログ番号１２－１６７Ｑ）、又は、同等のもの］内で希釈して、最終濃度を４０μｇ／ｍＬとし（調製は１６０μｇ／ｍＬ）、０．２μｍシリンジフィルターを使用して滅菌した。抗体を滅菌希釈プレートで２倍希釈し、置いておいた；
２． 細胞をイヌリンパ球培地内で２．５×１０６細胞／ｍＬに希釈し、９６ウェル組織培養プレート全体のウェルあたり１００μＬを分注した；
３． Ｃｏｎ Ａをイヌリンパ球培地内で希釈して、最終濃度を２５０ｎｇ／ｍＬとし（調製は１０００ｎｇ／ｍＬ）、０．２μｍシリンジフィルターを使用して滅菌し、５０μＬを全てのウェルに加えた。（注： 細胞のみ対照用の８つのウェルの１つの列及び細胞＋ｍＡｂのみ対照用のウェルには、Ｃｏｎ Ａを加えなかった）；
４． ウェルあたり１００μＬのイヌリンパ球培地を細胞のみのウェルに添加し、５０μＬの培地をＣｏｎ Ａ対照ウェル（ｍＡｂ処理なしのＣｏｎ Ａ＋細胞）を含む列に添加した；
５． ５０μＬの希釈ｍＡｂを複製ウェルに添加した；
６． プレートを、加湿インキュベーター内で、３６±２℃、４．０－６．０％ＣＯ２で、６８～１２４時間インキュベートした。
１． 抗体をイヌリンパ球培地［ＬＯＮＺＡから購入したＲＰＭＩ培地（カタログ番号１２－１６７Ｑ）、又は、同等のもの］内で希釈して、最終濃度を４０μｇ／ｍＬとし（調製は１６０μｇ／ｍＬ）、０．２μｍシリンジフィルターを使用して滅菌した。抗体を滅菌希釈プレートで２倍希釈し、置いておいた；
２． 細胞をイヌリンパ球培地内で２．５×１０６細胞／ｍＬに希釈し、９６ウェル組織培養プレート全体のウェルあたり１００μＬを分注した；
３． Ｃｏｎ Ａをイヌリンパ球培地内で希釈して、最終濃度を２５０ｎｇ／ｍＬとし（調製は１０００ｎｇ／ｍＬ）、０．２μｍシリンジフィルターを使用して滅菌し、５０μＬを全てのウェルに加えた。（注： 細胞のみ対照用の８つのウェルの１つの列及び細胞＋ｍＡｂのみ対照用のウェルには、Ｃｏｎ Ａを加えなかった）；
４． ウェルあたり１００μＬのイヌリンパ球培地を細胞のみのウェルに添加し、５０μＬの培地をＣｏｎ Ａ対照ウェル（ｍＡｂ処理なしのＣｏｎ Ａ＋細胞）を含む列に添加した；
５． ５０μＬの希釈ｍＡｂを複製ウェルに添加した；
６． プレートを、加湿インキュベーター内で、３６±２℃、４．０－６．０％ＣＯ２で、６８～１２４時間インキュベートした。
ＩＦＮγＥＬＩＳＡ
１． ６８～１２４時間のインキュベーション後、プレートを８００×ｇで１０分間遠心分離した；
２． 各ウェル及びプール複製から上清を収集した。これらのサンプルは、後で使用するために－５０℃以下で凍結することができるか、又は、すぐに試験することができる；
３． 必要に応じて上清サンプルを適切に希釈し、Ｃａｎｉｎｅ ＩＦＮ－γ ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭＥＬＩＳＡキット［Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号ＣＡＩＦ００］の指示に従ってＩＦＮ－γＥＬＩＳＡを実施した。
１． ６８～１２４時間のインキュベーション後、プレートを８００×ｇで１０分間遠心分離した；
２． 各ウェル及びプール複製から上清を収集した。これらのサンプルは、後で使用するために－５０℃以下で凍結することができるか、又は、すぐに試験することができる；
３． 必要に応じて上清サンプルを適切に希釈し、Ｃａｎｉｎｅ ＩＦＮ－γ ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭＥＬＩＳＡキット［Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号ＣＡＩＦ００］の指示に従ってＩＦＮ－γＥＬＩＳＡを実施した。
図４に示されている結果は、試験したキメラ抗体（特に、３Ｂ１０、４１１及び６１１）が、イヌＴ細胞を有意に活性化してＩＦＮ－γを産生させたことを示している。
実施例６
イヌ化３Ｂ１０抗体のエピトープマッピング
イヌＣＴＬＡ－４（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１００３１０６；配列番号６８）上のイヌ化抗体３Ｂ１０Ｌ３Ｈ２の結合エピトープを化学的架橋及び質量分析によってマッピングした。結果は、該抗体が、アミノ酸Ｒ３３、Ｒ３８、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｒ８３、Ｔ８７、Ｙ９０、Ｋ９３及びＹ９８を含んでいる抗原ＣＴＬＡ－４上の２つの別々の線形領域に結合することを示している（図５を参照されたい）。図５では、該イヌ化抗体３Ｂ１０Ｌ３Ｈ２が結合するＣＴＬＡ－４の非隣接エピトープに関するアミノ酸残基が、２つの線形部分（それぞれ、アミノ酸残基３０～５０及びアミノ酸残基８０～１００）で構成されていることが示されている。
イヌ化３Ｂ１０抗体のエピトープマッピング
イヌＣＴＬＡ－４（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１００３１０６；配列番号６８）上のイヌ化抗体３Ｂ１０Ｌ３Ｈ２の結合エピトープを化学的架橋及び質量分析によってマッピングした。結果は、該抗体が、アミノ酸Ｒ３３、Ｒ３８、Ｓ４２、Ｔ４５、Ｒ８３、Ｔ８７、Ｙ９０、Ｋ９３及びＹ９８を含んでいる抗原ＣＴＬＡ－４上の２つの別々の線形領域に結合することを示している（図５を参照されたい）。図５では、該イヌ化抗体３Ｂ１０Ｌ３Ｈ２が結合するＣＴＬＡ－４の非隣接エピトープに関するアミノ酸残基が、２つの線形部分（それぞれ、アミノ酸残基３０～５０及びアミノ酸残基８０～１００）で構成されていることが示されている。
上記ヌクレオチド配列の全てにおいて、可変領域は太字で示されており、対応するアミノ酸配列においては、可変領域に関する配列は太字で示されており、及び、ＣＤＲは下線が引かれており且つ太字で示されている。
Claims (13)
- イヌＣＴＬＡ－４に特異的に結合する、イヌＩｇＧ重鎖及びイヌカッパ軽鎖を含んでいる単離されたイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントであって；ここで、該イヌカッパ軽鎖は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）〔ＣＤＲ軽１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽２（ＣＤＲＬ２）及びＣＤＲ軽３（ＣＤＲＬ３）〕を含んでおり；及び、該イヌＩｇＧ重鎖は、３つの重鎖ＣＤＲ〔ＣＤＲ重１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重２（ＣＤＲＨ２）及びＣＤＲ重３（ＣＤＲＨ３）〕を含んでおり；
（ａ） ここで、ＣＤＲＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含んでおり；
（ｂ） ここで、ＣＤＲＬ２は、配列番号５６を含んでいるアミノ酸配列を含んでおり；
（ｃ） ここで、ＣＤＲＬ３は、配列番号５８のアミノ酸配列を含んでおり；
（ｄ） ここで、ＣＤＲＨ１は、配列番号４８のアミノ酸配列を含んでおり；
（ｅ） ここで、ＣＤＲＨ２は、配列番号５０のアミノ酸配列を含んでおり；及び、
（ｆ） ここで、ＣＤＲＨ３は、配列番号５２のアミノ酸配列を含んでいる；
前記単離されたイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記イヌＩｇＧ重鎖が、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、請求項１に記載の単離されたイヌ化抗体。
- 前記カッパ軽鎖が、配列番号４２、配列番号４４及び配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、請求項１又は２に記載の単離されたイヌ化抗体。
- 前記イヌＩｇＧ重鎖が配列番号３６のアミノ酸配列を含んでおり、及び、前記イヌカッパ軽鎖が配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいる、請求項１に記載の単離されたイヌ化抗体。
- 前記イヌＩｇＧ重鎖が配列番号６２のアミノ酸配列を含んでおり、及び、前記イヌカッパ軽鎖が配列番号４６のアミノ酸配列を含んでいる、請求項１に記載の単離されたイヌ化抗体。
- 請求項１、２、３、４又は５に記載のイヌ化抗体のイヌカッパ軽鎖をコード化する、単離された核酸。
- 請求項１、２、３、４又は５に記載のイヌ化抗体のイヌＩｇＧ重鎖をコード化する、単離された核酸。
- 請求項６又は７に記載の単離された核酸を含んでいる、発現ベクター。
- 請求項８に記載の１以上の発現ベクターを含んでいる、宿主細胞。
- 請求項１、２、３、４又は５に記載の抗体及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含んでいる、医薬組成物。
- 免疫細胞の活性を増大させる方法であって、それを必要とする対象者に、治療有効量の請求項１０に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記方法が、
（ｉ） 癌を処置するために；
（ｉｉ） 感染症又は感染性疾患を処置するために；又は、
（ｉｉｉ） ワクチンアジュバントとして；
使用される、請求項１１に記載の方法。 - ＣＴＬＡ－４に特異的に結合するイヌ化抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する方法であって、
ａ． 核酸が発現される条件下、請求項９に記載の宿主細胞を培地中で培養し、それにより、軽鎖及び重鎖可変領域を含んでいるポリペプチドを生成させること；及び、
ｂ． 前記宿主細胞又は培地から前記ポリペプチドを回収すること；
を含んでいる、前記方法。
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