JP2022540665A - 機能化されたナノ粒子および細菌感染症の治療におけるその使用 - Google Patents

機能化されたナノ粒子および細菌感染症の治療におけるその使用 Download PDF

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Abstract

機能化されたナノ粒子を用いて細菌感染症を治療するための組成物、方法、およびキットが提供される。伝統的な抗生物質に高度に耐容性である細菌細胞の亜集団である生残細胞の存在のために、不応性感染症は、多くの場合、治療が困難である。生残細胞は休眠状態であり、このことは、増殖中の細胞を死滅させるように設計されている多くの抗生物質に対する生残細胞の感受性を低くしている。単独での、または１つ以上の抗生物質との組み合わせでのナノ粒子の投与は、生残細胞の根絶において、ならびにグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を含む広範囲の細菌種についての感染症の治療に、高度に効果的であることが見出された。そのような治療は、プランクトン性細菌の根絶だけでなく、バイオフィルム中の細菌の根絶にも有効であった。

Description

抗生物質は、現代の臨床医学の主力である。しかしながら、細菌は、その最初の臨床使用の数年以内に、天然および合成の両方の抗生物質に対する耐性を発達させる（Ｗａｌｓｈ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １：６５－７０）。抗生物質耐性の現在のメカニズムは、外膜透過性の変化による取り込みの減少、排出ポンプタンパク質の活性化による抗生物質の排泄、抗生物質の酵素修飾、抗生物質標的の修飾、およびバイオフィルムなどの細菌生理学を含む（ｖａｎ Ｈｏｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２：２０３）。
合衆国および欧州だけで、毎年５０，０００人を上回る人々が耐性感染症のために死亡している（Ｔｈｅ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ｔａｃｋｌｉｎｇ ａ ｃｒｉｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｗｅａｌｔｈ ｏｆ ｎａｔｉｏｎｓ（２０１４）、ａｍｒ－ｒｅｖｉｅｗ．ｏｒｇ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌ）。病院における滞在の長さは抗生物質耐性感染症によって長くなり、これらの同じ感染症が、多くの場合、病院において得られる。抗生物質耐性感染症の経済的影響は、合衆国だけで１年当たり５０億ＵＳドル～２４０億ＵＳドルであると見積もられている（Ｈａｌｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２：４３０－４３５）。しかしながら、製薬会社の薬物パイプラインは、抗生物質耐性の進化に追いついていない。２００４年には、世界の１５大製薬会社によって開発中のすべての薬物のうち１．５％のみが抗生物質であった（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｃｏａｓｔ，”Ｔｈｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｗｈｙ ｉｔ ｉｓ ｍｏｒｅ ｓｅｒｉｏｕｓ ｔｈａｎ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｓｕｇｇｅｓｔ．”（２０１２），ｒｅｓｅａｒｃｈｇａｔｅ．ｎｅｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／２９１４１３４５４）。我々が直面しなければならない新たな現実は、製薬会社が現在新たな抗生物質の発見のために一列に並んでいないことである。我々の既存の抗生物質を守るためのストラテジーは、現在の薬物の活性を増強し、耐性を最小化し、直接的にブロックさえする化合物である、抗生物質アジュバントの使用を通じてのものである（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６（１２）：４６２９－４６３４，Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｂｅｌｌｏ（２０１７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２７（１８）：４２２１－４２２８）。別のストラテジーは、抗毒性薬剤の使用である。これらの薬剤は、細菌増殖経路を残しながらヒト疾患を促進する毒性因子の病原体を解除することによって、抗生物質耐性を回避することができる（Ｄｉｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１６（７）：４５７－４７１）。
表面に付着した細菌細胞は、互いに凝集して、バイオフィルムを形成し得る。バイオフィルムを成長させている細菌は、抗菌剤に対する耐容性の増加を示し得、実質的に除去するか低減させることは非常に困難である。バイオフィルム細菌は、生きているが培養できない（ＶＢＮＣ）状態および生残状態の２つの休眠表現型を有する。休眠表現型（ＶＢＮＣおよび生残）は、細菌が、その遺伝的に同一の系統の残りの部分にとって致命的である条件で生存することを可能にする。一旦バイオフィルム中にあると、それらは免疫系を回避することができる。したがって、バイオフィルムの主な役割の１つは、免疫系からそれらを遮蔽することによって、生残およびＶＢＮＣのための保護的生息地を提供することである（Ｌｅｗｉｓ（２０１０）Ｍｉｃｒｏｂｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）５（１０）：４２９－４３７）。バイオフィルムの別の特性は、プランクトン性細胞よりも抗菌剤に対して耐性であるその能力である（Ｓｐｏｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３（２３）：６７４６－６７５１）。したがって、抗生物質耐性感染症を治療するための改善されたアプローチの、進行中の満たされていない要求が存在する。
ナノ粒子を用いて細菌感染症を治療するための組成物、方法、およびキットが提供される。伝統的な抗生物質に高度に耐容性である細菌細胞の亜集団である生残細胞の存在のために、不応性感染症は、多くの場合、治療が困難である。生残細胞は休眠状態であり、このことは、増殖中の細胞を死滅させるように設計されている多くの抗生物質に対する生残菌の感受性を低くしている。感染症を治療するための１つ以上の抗生物質との組み合わせでのナノ粒子の投与は、生残細胞の根絶において高度に効果的であり、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を含む広範囲の細菌種についてバイオフィルム中のプランクトン性細菌ならびに細菌の両方に対して有効である。特に、本明細書に記載されるナノ粒子を含む製剤は、抗生物質の効果を増強するため、ならびに細菌の毒性を低減するために有用である。
一態様では、アニオン性部分および細胞透過性ペプチドで機能化された長さ１０ｎｍ未満のサイズを有するナノ粒子であって、アニオン性部分および細胞透過性ペプチドが、ナノ粒子の外表面に付着されている、ナノ粒子が提供される。
例示的な細胞透過性ペプチドとしては、ＨＩＶ－Ｔａｔ、ペネトラチン、トランスポータン、オクタアルギニン、ノナアルギニン、アンテナペディア、ＴＰ１０、ブホリンＩＩ、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ－ＦＧＦ、Ｋｕ７０、メリチン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ－１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ－７、ＣＡＤＹ、ＧＡＬＡ、ｐＨＬＩＰ、ＫＡＬＡ、Ｒ７Ｗ、およびＨＮ－１が挙げられるが、これらに限定されず、これらは容易にナノ粒子を形質膜を横断して輸送することができる。
アニオン性部分は、例えば、カルボキシレート官能基、ホスフェート官能基、またはサルフェート官能基を含み得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーをさらに含み、ここで、ＰＥＧポリマーは、ナノ粒子の外表面に付着されている。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーは、アニオン性部分で機能化されている。例えば、ＰＥＧポリマーは、酸部分で機能化され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーは、カルボキシレート基（例えば、ＰＥＧカルボン酸（ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）、ヒドロキシルＰＥＧカルボン酸、ＰＥＧ酢酸、ＰＥＧグルタル酸、ＰＥＧコハク酸、ＰＥＧグルタルアミド酸、ＰＥＧスクシンアミド酸）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーは、チオール基およびアニオン性部分で機能化されている（例えば、チオール－カルボキシルポリエチレングリコール（ＣＯＯＨ－ＰＥＧ－ＳＨ））。他の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、アミン基などのカチオン性部分で機能化されているか（ＰＥＧ－ＮＨ２）、またはヒドロキシル基などの中性部分で機能化されている（ＰＥＧ－ＯＨ）。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンニトール、Ｄ－アラビノース、またはＤ－キシロースを含むがこれらに限定されないＤ－炭水化物でさらに機能化されている。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、Ｄ－グルタミン酸、Ｄ－ロイシン、Ｄ－メチオニン、Ｄ－チロシンおよびＤ－トリプトファンを含むがこれらに限定されないＤ－アミノ酸でさらに機能化されている。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、ＣｒｃＺ ＲＮＡ配列またはＣｒｃＺ Ａリッチモチーフ配列を含む核酸でさらに機能化されている。特定の実施形態では、ＣｒｃＺ ＲＮＡ配列は、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに対する少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意の同一性パーセント、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列、またはそのＲＮＡ等価物を含む。特定の実施形態では、ＣｒｃＺ Ａリッチモチーフ配列は、ａ）ＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡ（配列番号２）、ｂ）ＣＡＡＴＡＡＧＡＡ、ｃ）ＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡ（配列番号３）、ｄ）ＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡ（配列番号４）、ｅ）ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡ（配列番号５）、ｆ）ＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡ（配列番号６）、ｇ）ＡＡＣＡＡＣＡＡ、ｈ）ＡＡＡＡＡＣＡＡ、またはｉ）ａ）～ｉ）のＲＮＡ等価物を含む。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、バイオフィルム中に存在する生残細胞または細菌に対する殺菌活性を有する抗菌剤をさらに含み、ここで、抗菌剤は、ナノ粒子の外表面に付着されている。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、機能化剤（例えば、細胞透過性ペプチド、ＣｒｃＺ ＲＮＡを含む核酸、抗菌剤）をナノ粒子の外表面に接続するリンカーをさらに含む。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、長さ約１ｎｍ～約５００ｎｍの範囲（長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、または５００ｎｍなどのこの範囲内の任意の長さを含む）のサイズである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、長さ１０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、長さ約１～約２ｎｍである。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、金属、セラミック、グラファイト、グラフェン、または他の炭素系材料、シリカ、またはホウ素を含む。例えば、ナノ粒子は、金、銀、白金、チタン、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、スズ、ニッケル、銅、アルミニウム、またはそれらの酸化物、炭化物、窒化物、もしくはそれらの合金のうちの１つ以上を含むがこれらに限定されない金属を含み得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ヒト細胞と生体適合性である。
別の態様では、本明細書に記載されるナノ粒子を含む組成物が提供される。特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む。
特定の実施形態では、組成物は、抗生物質をさらに含む。例示的な抗生物質としては、フルオロキノロン、アミノグリコシド、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、マクロライド、スルホンアミド、カルバペネム、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、リンコサミド、モノバクタム、およびオキサゾリジノンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、抗生物質は、フルオロキノロン、例えば、オフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、もしくはフィナフロキサシン、またはそれらの誘導体を含み得る。
別の態様では、対象における感染症を治療する方法であって、治療有効量の機能化されたナノ粒子を含む組成物を、対象に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の少なくとも１つの抗生物質を、ナノ粒子を含む組成物と組み合わせて投与することをさらに含む。
例示的な抗生物質としては、フルオロキノロン、アミノグリコシド、ペニシリン、テタサイクリン、セファロスポリン、マクロライド、スルホンアミド、カルバペネム、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、リンコサミド、モノバクタム、およびオキサゾリジノンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、抗生物質は、フルオロキノロン、例えば、オフロキサシンまたはその誘導体を含み得る。
別の態様では、対象における感染症を治療する方法であって、治療有効量のナノ粒子を治療有効量の抗生物質と組み合わせて対象に投与することを含む、方法が提供される。
特定の実施形態では、対象は、慢性感染症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、耳感染症、皮膚感染症、肺感染症、慢性化膿性中耳炎（ＣＳＭＯ）、嚢胞性線維症に関連する感染症、結核、または創傷における感染症を含むが、これらに限定されない感染症を有する。いくつかの実施形態では、感染症は、対象における細菌バイオフィルムの形成に関連する。特定の実施形態では、感染症は、１つ以上の抗生物質に対して耐性である病原性細菌を含む。いくつかの実施形態では、対象は、感染症の除去に成功していない１つ以上の抗生物質を用いて感染症を以前に治療されている。別の実施形態では、感染症は、嚢胞性線維症を有する対象における感染症（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）である。
特定の実施形態では、治療は、すべてのまたは大部分のバイオフィルム細菌およびプランクトン性細菌を根絶する。いくつかの実施形態では、治療は、例えば、バイオフィルム中にあり得るか、またはマクロファージによって内在化され得る、すべてのまたは大部分の生残細胞を根絶する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療によって根絶される生残細胞は、多剤耐容性生残細胞である。治療は、グラム陰性またはグラム陽性のいずれかの細菌を含む生残細胞（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ生残細胞を含むがこれに限定されない）を根絶し得る。
特定の実施形態では、複数サイクルの治療が対象に投与される。例えば、本明細書に記載されるナノ粒子は、単独で、または抗生物質との組み合わせで、断続的に、または１日投薬レジメンに従ってのいずれかで投与され得る。
ナノ粒子を含む組成物は、任意の好適な投与様式によって投与され得る。例えば、組成物は、静脈内に、皮下に、吸入によって、または局所的に投与され得る。あるいは、組成物は、感染組織の部位に局所的に投与され得る。例えば、耳感染症について、ナノ粒子を含む組成物は、外耳道内に局所的に投与され得る。
別の実施形態では、バイオフィルム中の細菌を根絶する方法であって、バイオフィルムを、有効量の機能化されたナノ粒子を含む組成物と接触させることを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、バイオフィルムを、有効量の少なくとも１つの抗生物質と接触させることをさらに含む。本明細書に記載される方法は、例えば、医療デバイス、個人衛生用品、トイレタリー、化粧品、消毒剤、洗浄液上、または水処理もしくは分配システム中のバイオフィルム中の細菌を根絶するために使用され得る。
別の実施形態では、休眠細菌を根絶する方法であって、休眠細菌を、有効量の機能化されたナノ粒子を含む組成物と接触させることを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、休眠細菌を、有効量の少なくとも１つの抗生物質と接触させることをさらに含む。休眠細菌は、例えば、バイオフィルム中、液体培養物中、または無生物表面上に存在し得る。
別の実施形態では、細菌におけるＳＯＳシグナル伝達またはＲｅｃＡ活性を阻害する方法であって、細菌を、有効量の機能化されたナノ粒子を含む組成物と接触させることを含む方法が提供される。
別の態様では、本明細書に記載されるナノ粒子と、細菌感染症を治療するための説明書とを含む、キットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、オロキサシンまたはその誘導体などのフルオロキノロンを含むがこれらに限定されない抗生物質をさらに含む。
本発明は、添付の図面と併せて読む場合に、以下の詳細な説明から最もよく理解される。特許または出願ファイルは、カラーで制作された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払いに際して当局によって提供される。一般的な実施によれば、図面の様々な特徴は、縮尺どおりでないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小される。図面には、以下の図が含まれる。
オフロキサシンはＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムを根絶することができない。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ野生型ＰＡ０１から形成されたバイオフィルム（Ａ５９５／ＯＤ６００）の耳病原性株（ＰＡ ＣＳＯＭ）との比較を示す。ＰＡ０１およびＰＡ ＣＳＯＭからの総細胞増殖（ＯＤ６００）によって正規化された、９６ウェルマイクロタイタープレートに付着したクリスタルバイオレット染色バイオフィルムの量（Ａ５９５）を示す。４８時間のインキュベーション後、バイオフィルム細胞外マトリックスの産生を、クリスタルバイオレット染色（Ａ５９５）によって測定した。各ウェルからの６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）を測定して、総細胞増殖を決定した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝５）。 オフロキサシンによるＰＡ０１バイオフィルムの根絶を示す。処理後、４８時間のインキュベーション後の回収プレートからの光学密度（ＯＤ）を、分光光度計を使用して６５０ｎｍで測定した（ＯＤ６５０）。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝３）。 オフロキサシンによるＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムの根絶を示す。処理後、４８時間のインキュベーション後の回収プレートからの光学密度（ＯＤ）を、分光光度計を使用して６５０ｎｍで測定した（ＯＤ６５０）。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝３）。 オフロキサシン処理後の生残細胞蘇生を示す代表的なペトリ皿を示す。ＬＢ寒天プレートに回収培地をスポットし、４８時間インキュベートした。値は、オフロキサシンの濃度（μｇ／ｍＬ）を指す。オフロキサシンの最大濃度（３０００ｕｇ／ｍｌ）に対して感受性でないＰＡ ＣＳＯＭと比較して、ＰＡＯ１のＭＢＥＣ＝７５０ｕｇ／ｍｌ。示すように、統計的比較を両側ｔ検定を使用して行った。＊＊＊ｐ≦０．００１である。 生残細胞の画分の増加は、オフロキサシンに対するバイオフィルムの耐容性を促進する。対数期培養物における生存生残細胞の感受性を示す。オフロキサシンは、対数期における生残細胞蘇生後に感受性を示した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝３）。 生残細胞の画分の増加は、オフロキサシンに対するバイオフィルムの耐容性を促進する。対数期培養物におけるＰＡＯ１とＰＡ ＣＳＯＭとの間の生残細胞画分の比較を示す。対数期の細胞を、オフロキサシン（１００μｇ／ｍＬ）で２４時間処理し、次いでコロニー計数のためにプレーティングした。生残画分を、対応する未処理対照（ＰＢＳ）において測定したものと比較しての、オフロキサシン処理後の生存細菌の数の比として計算した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝３）。示すように、統計学的比較を両側ｔ検定を使用して行った。＊＊＊＊ｐ≦０．０００１および＊＊ｐ≦０．０１である。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、バイオフィルム形成に関連する薬物不応性状態を克服する。２４時間の、オフロキサシン、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ、およびそれらの組み合わせによる、４８時間齢のＰＡ０１バイオフィルムの処理後の生残細胞蘇生を示す代表的なペトリ皿を示す。バイオフィルム細胞を、薬物を含まない新鮮な培地中で回復させ（４８時間）、次いで、５μＬを、寒天を含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス上にプレーティングした。各条件について、ペトリ皿上の３つのスポットは、３回の独立した実験からの回収培地である（ｎ＝３）。オフロキサシン（５または１０ｕｇ／ｍｌ）と組み合わせたＡｕＮＣ＠ＣＰＰでは、ＰＡＯ１の増殖は見られない。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、バイオフィルム形成に関連する薬物不応性状態を克服する。２４時間の、オフロキサシン、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ、およびそれらの組み合わせによる、４８時間齢のＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムの処理後の生残細胞蘇生を示す代表的なペトリ皿を示す。バイオフィルム細胞を、薬物を含まない新鮮な培地中で回復させ（４８時間）、次いで、５μＬを、寒天を含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス上にプレーティングした。各条件について、ペトリ皿上の３つのスポットは、３回の独立した実験からの回収培地である（ｎ＝３）。オフロキサシン（５または１０ｕｇ／ｍｌ）と組み合わせたＡｕＮＣ＠ＣＰＰでは、ＰＡ ＣＳＯＭの増殖は見られない。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの経口投与は全身毒性を引き起こさない。実験設計の模式図を示す。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの経口投与は全身毒性を引き起こさない。Ｈ＆Ｅ染色による臓器の代表的な組織学的顕微鏡写真を示す。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１日１０ｍｇ／ｋｇの用量での毎日の経口胃管栄養法の後に、組織の組織学的構造に対する明らかな形態変化は存在しなかった。組織試料を、処置後３５日で収集した。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの経口投与は全身毒性を引き起こさない。Ｈ＆Ｅ染色による臓器の代表的な組織学的顕微鏡写真を示す。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１日１０ｍｇ／ｋｇの用量での毎日の経口胃管栄養法の後に、組織の組織学的構造に対する明らかな形態変化は存在しなかった。組織試料を、処置後３５日で収集した。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの経口投与は全身毒性を引き起こさない。Ｈ＆Ｅ染色による臓器の代表的な組織学的顕微鏡写真を示す。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１日１０ｍｇ／ｋｇの用量での毎日の経口胃管栄養法の後に、組織の組織学的構造に対する明らかな形態変化は存在しなかった。組織試料を、処置後３５日で収集した。 Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標）Ｏｔｉｃ＋ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、ＣＳＯＭを模倣する慢性Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ耳感染症のマウスモデルにおいて、Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標）Ｏｔｉｃ単独よりも優れた抗菌活性を有する。実験設計の模式図を示す。 Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標）Ｏｔｉｃ＋ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、ＣＳＯＭを模倣する慢性Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ耳感染症のマウスモデルにおいて、Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標）Ｏｔｉｃ単独よりも優れた抗菌活性を有する。以下の処置の終了１４日後の、中耳滲出液からの１ミリリットル当たりの細菌の数（ＣＦＵ／ｍＬ）の比較：プラセボ対照（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）、ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃ（２４μｇのオフロキサシン）、および組み合わせ（２４μｇのオフロキサシン＋２９６μｇのＡｕＮＣ＠ＣＰＰ）を示す。各マウスからのＣＦＵ／ｍＬを個々の点としてプロットし、エラーバーは、実験群内のＣＦＵ／ｍＬの偏差を表す。Φは、技術的制約に起因して中耳滲出液をサンプリングすることができなかったことを示す。ＰＢＳ対照群とオフロキサシン群との間に差は存在しなかった。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ＋ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃの組み合わせは、処置の１４日後に細菌の５ｌｏｇの低減に導いた。示すように、統計的比較を両側ｔ検定を使用して行った。＊ｐ≦０．０５および有意でない（Ｎ．Ｓ．）。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ作用のメカニズムを示す。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの存在下でのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム内の生残細胞の過感作の根底にある分子メカニズムを描写する。 Ｃａｌｇａｒｙ ｂｉｏｆｉｌｍ ｄｅｖｉｃｅを使用した、予め形成されたバイオフィルムへ向けての、オフロキサシン、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ、およびそれらの組み合わせの根絶能力を評価するためのフローチャートを示す（スキームは、Ｅｍｅｒｙ Ｐｈａｒｍａ，ｅｍｅｒｙｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｂｉｏｆｉｌｍ－ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ／から適合させた）。（１～２）細菌培養物を調製し、９６ウェルマイクロプレート中に分注する。（３）ペグ蓋を細菌培養物に入れ、インキュベートして、バイオフィルムを生成する。（４）ペグ蓋を穏やかにすすいで、プランクトン性細菌を除去し、段階希釈した試験溶液を新たな９６ウェルマイクロプレート中に分注する。（５）バイオフィルム中に覆われたペグを試験溶液中でインキュベートする。（６）ペグ蓋を再び穏やかにすすいで、プランクトン性細菌を除去し、回収培地を含有する新たな９６ウェルマイクロプレートに入れる。次いで、ペグ蓋を超音波処理して、バイオフィルムを回収培地中に取り出す。（７）超音波処理後、ペグ蓋を通常の９６ウェルマイクロプレート蓋に置き換え、回収培地を含有するプレートをインキュベートする。インキュベーション後、分光光度計でＯＤ６５０吸光度を読み取る。０．１未満のＯＤ６５０のウェルは、バイオフィルム根絶の証拠である。（８）ＬＢ寒天上にプレーティングしたスポットを使用して、バイオフィルム根絶を確認する。 対数期培養物における生残細胞蘇生に対するフロキサシン感受性を評価するためのフローチャートを示す。（１）３０００μｇ／ｍＬのオフロキサシンでのＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムの処理後の生存生残細胞を新鮮な培地中に置き換え、３７℃でインキュベートし、２２５ｒ．ｐ．ｍ．で通気した。（２）対数期の細胞（ＯＤ６００＝０．３）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはオフロキサシン（１００μｇ／ｍＬ）のいずれかで２４時間処理した。（３）処理後、細胞をプレーティングして、１ミリリットル当たりの細菌の数（ＣＦＵ／ｍＬ）を決定した。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ単独によるＰＡ０１バイオフィルムの根絶を示す。処理後、４８時間のインキュベーション後の回収プレートからの光学密度（ＯＤ）を分光光度計を使用して６５０ｎｍで測定した（ＯＤ６５０）。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝３）。 操作された金ナノクラスター（ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ）の合成を示す。ａ）調製されたままのＡｕＮＣ＠ＣＰＰのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトル、ｂ）ＤＬＳ測定による直径、ｃ）ＤＬＳ測定による表面チャージである。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの細胞傷害性効果を示す。Ａ５４９細胞をＡｕＮＣ＠ＣＰＰで２４時間処理し、細胞生存率をＭＴＴアッセイによって決定した。３２００μｇ／ｍＬのＡｕＮＣ＠ＣＰＰに曝露した細胞は、９０％超の生存細胞を示す。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す（ｎ＝４）。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１０ｍｇ／ｋｇの用量での経口胃管栄養法後の健常マウスにおける体重の進展を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１４日間毎日１０ｍｇ／ｋｇで処置し、３５日目の健常マウスの体重変化を、雄性マウスにおいて評価した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１０ｍｇ／ｋｇの用量での経口胃管栄養法後の健常マウスにおける体重の進展を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１４日間毎日１０ｍｇ／ｋｇで処置し、３５日目の健常マウスの体重変化を、雌性マウスにおいて評価した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１０ｍｇ／ｋｇの用量での経口胃管栄養法後の健常マウスにおける体重の進展を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１４日間毎日１０ｍｇ／ｋｇで処置し、３５日目の健常マウスの体重変化を、胸腺を含む臓器において評価した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１０ｍｇ／ｋｇの用量での経口胃管栄養法後の健常マウスにおける体重の進展を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１４日間毎日１０ｍｇ／ｋｇで処置し、３５日目の健常マウスの体重変化を、腎臓を含む臓器において評価した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１０ｍｇ／ｋｇの用量での経口胃管栄養法後の健常マウスにおける体重の進展を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１４日間毎日１０ｍｇ／ｋｇで処置し、３５日目の健常マウスの体重変化を、心臓を含む臓器において評価した。＊は、対照（ＰＢＳ）に対する処置試料のＰＢＳに対する統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１０ｍｇ／ｋｇの用量での経口胃管栄養法後の健常マウスにおける体重の進展を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１４日間毎日１０ｍｇ／ｋｇで処置し、３５日目の健常マウスの体重変化を、脾臓を含む臓器において評価した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１０ｍｇ／ｋｇの用量での経口胃管栄養法後の健常マウスにおける体重の進展を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１４日間毎日１０ｍｇ／ｋｇで処置し、３５日目の健常マウスの体重変化を、肝臓を含む臓器において評価した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰおよびＰＢＳでの１４日間の１０ｍｇ／ｋｇの用量での経口胃管栄養法後の健常マウスにおける体重の進展を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１４日間毎日１０ｍｇ／ｋｇで処置し、３５日目の健常マウスの体重変化を、精巣を含む臓器において評価した。データを、平均±ｓ．ｄ．として示す。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、生残細胞の抗生物質感受性を回復させる。オフロキサシン、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ（８００μｇ／ｍＬ）および組み合わせのバイオフィルム根絶能力の比較を示す。処理後に４８時間のインキュベーション後の回収プレートから光学密度（ＯＤ）（６５０ｎｍ）が測定された。組み合わせは、ＣＦ患者からのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの生残細胞を根絶した。すべてのデータ（ｎ＝３）を示す。＜０．１のＯＤ６５０のウェルは、バイオフィルム根絶の証拠である。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、生残細胞の抗生物質感受性を回復させる。ヒト肺胞細胞は、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ濃度への曝露に際して生存率の変化を示さなかった。 ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの非存在下および存在下での静止期プランクトン性ＰＡの細胞内オフロキサシン（ＯＦＬ）含有量を示す。Ｙ軸は、未処理の静止期プランクトン性ＰＡを上回る、蛍光増加のパーセンテージ（％）として表現されるＯＦＬ取り込みを示す。データは、３回の実験の平均値を表す。 インビトロ試験を通じて得られた生残細胞根絶の証拠を示す。生残細胞を、オフロキサシン単独で処理した結果を示す。 インビトロ試験を通じて得られた生残細胞根絶の証拠を示す。生残細胞を、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ単独で処理した結果を示す。 インビトロ試験を通じて得られた生残細胞根絶の証拠を示す。生残細胞を、ＯＦＬとＡｕＮＣ＠ＣＰＰとの組み合わせで処理した結果を示す。 インビトロ試験を通じて得られた生残細胞根絶の証拠を示す。ＡｕＮＣの添加が、オフロキサシンの有効性を増強し、ＰＡバイオフィルムおよび静止期後期プランクトン性細胞の両方の根絶をもたらすことを示す。最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）を示す。３回の実験、実験当たり６つの複製物からのデータの平均を示す。挿入図は、４８時間のインキュベーション後にコロニーを形成した生存生残細胞のＬＢ寒天プレートを示す。 ２４時間のＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＮＨ２およびＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＯＨの処理後に、Ｃａｌｇａｒｙ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｄｅｖｉｃｅ（ＣＢＤ）によって決定したＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムの生存率を示す。処理後、４８時間のインキュベーション後の回収プレートからの光学密度（ＯＤ）を６５０ｎｍで測定した。≦０．１のＯＤ６５０のウェルは、バイオフィルム根絶の証拠である。写真は、ＬＢ寒天プレート上にプレーティングしたスポットを示し、画像上の値は、μｇ／ｍＬでのＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＮＨ２およびＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＯＨの濃度を表す。両方のＡｕＮＣの最小Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）値は、１ｍｇ／ｍＬである。すべてのデータは、３つの複製物の平均±ＳＤを表す。 ＳＡ ＣＳＯＭバイオフィルム根絶におけるＡｕＮＣ＠ＣＰＰの有効性の実証を示す。市販のフルオロキノロン（オフロキサシン、ＯＦＬ）は、３０００ｕｇ／ｍｌで入手可能である。これは、ＣＳＯＭ ＳＡからのＳＡ臨床分離株のバイオフィルムを根絶することができない。ＡＵＮＣ＠ＣＰＰと組み合わせて、ＯＦＬは、ＳＡバイオフィルムの根絶に有効である。 ２４時間のＡｕＮＣ＠ＣＰＰによる４８時間齢のＰＡ０１およびＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムの処理後の生残細胞蘇生を示す代表的なペトリ皿を示す。バイオフィルム細胞を、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰを含まない新鮮な培地中で回復させ（４８時間）、次いで、５μＬを、寒天を含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス上にプレーティングした。ペトリ皿上の３つのスポットは、３回の独立した実験からの回収培地である（ｎ＝３）。ＰＡ０１およびＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムに対するＡｕＮＣ＠ＣＰＰのＭＢＥＣは、それぞれ１６００および３２００ｕｇ／ｍｌである。 ２４時間のＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＮＨ２およびＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＯＨの処理後にＣａｌｇａｒｙ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｄｅｖｉｃｅ（ＣＢＤ）によって決定したＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムの生存率を示す。処理後、４８時間のインキュベーション後の回収プレートからの光学密度（ＯＤ）を６５０ｎｍで測定した≦０．１のＯＤ６５０のウェルは、バイオフィルム根絶の証拠である。写真は、ＬＢ寒天プレート上にプレーティングしたスポットを示し、画像上の値は、μｇ／ｍＬでのＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＮＨ２およびＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＯＨの濃度を表す。両方のＡｕＮＣの最小Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）値は、１ｍｇ／ｍＬである。すべてのデータは、３つの複製物の平均±ＳＤを表す。 細胞透過性ペプチド単独ではバイオフィルムを根絶することができず、ＡｕＮＣの全体がバイオフィルム根絶のために必要とされた。写真は、ＬＢ寒天プレート上にプレーティングしたスポットを示し、画像上の値は、μｇ／ｍＬでの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の濃度を表す。ＣＰＰは、４０００μｇ／ｍＬまでの濃度でバイオフィルム根絶を少しも示さなかった。各スポットは、独立した実験（ｎ＝３）を表す。
機能化されたナノ粒子を含む組成物および細菌感染症の治療においてそれを使用する方法が提供される。特に、機能化されたナノ粒子は、従来の抗生物質治療に応答性でない細菌バイオフィルムの産生に関連する慢性感染症を治療するために有用である。理論に拘束されるものではないが、バイオフィルム中の細菌は、抗生物質での治療に対してより耐性である傾向がある。これは、部分的には、バイオフィルム細胞外マトリックスおよび細胞の外層が、内部の細菌細胞を保護するためである。加えて、バイオフィルム中の多くの細菌細胞は、休眠表現型を取り、代謝的に非活動性になり、これは、有効であるために代謝される必要がある抗生物質に対するそれらの感受性を低くする（例えば、ペニシリンは、細胞死を引き起こすために、活動性細菌細胞における細胞壁リモデリングを必要とする）。非増殖のまたは極めて遅い増殖の生理学的状態に入っており、その結果、抗菌薬に対して耐性になったバイオフィルム中の休眠細胞は、免疫系または抗菌剤によって他の活動性細菌細胞が根絶された後に生き残るその能力のために、本明細書において「生残細胞」と称される。生残細胞は、従来の抗生物質治療を用いてそれを根絶することの困難性のために、多くの場合、慢性感染症と関連する。本明細書に記載される方法は、バイオフィルム中の生残細胞を抗生物質治療に対してより感受性にする、慢性感染症の治療のために特に有用である。
機能化されたナノ粒子を含む本発明の組成物、および細菌感染症の治療においてそれを使用する方法を説明する前に、本発明は記載される特定の方法または組成物に限定されるものではなく、それ自体がもちろん変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語が単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、制限することが意図されないことも理解されたい。なぜなら、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるからである。
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの間に介在する値もまた、具体的に開示されていることが理解される。任意の記載値または記載された範囲内の間に介在する値と、任意の他の記載値またはその記載された範囲内の間に介在する値との間の、それぞれより小さい範囲が、本発明に包含される。これらの小さい範囲の上限および下限は、独立して範囲に含まれていても、除外されていてもよく、いずれか、どちらでもない、または両方の限定が小さい範囲に含まれている各範囲も、記載されている範囲の中で任意の具体的に除外されている限定に従うことを条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限定の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれかまたは両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。
別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験に使用することができるが、ここでは、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および材料を説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本開示は、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先されることを理解されたい。
本開示を読むことで当業者に明らかになるように、本明細書に記載および例示される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離され得るか、またはそれと組み合わされ得る別個の構成要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順序、または論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ（細菌細胞）」への言及は、複数のかかる細菌細胞を含み、「ｔｈｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ナノ粒子）」への言及は、当業者に既知の１つ以上のナノ粒子およびその等価物への言及を含む、などである。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前に専らそれらの開示のために提供されている。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明を理由に、そのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。
「ナノ粒子」という用語は、長さ約１ｎｍ～約５００ｎｍの範囲のサイズを有する、有機、無機、またはハイブリッドのナノ粒子を指す。ナノ粒子は、５００ｎｍ以下（２５０ｎｍ以下、または２００ｎｍ以下、または１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下、または５０ｎｍ以下、または４０ｎｍ以下、または３０ｎｍ以下、または２５ｎｍ以下、または２０ｎｍ以下、または１５ｎｍ以下、または１０ｎｍ以下、または５ｎｍ以下、または４ｎｍ以下、または３ｎｍ以下、または２ｎｍ以下、または１ｎｍ以下を含む）の寸法を有し得る。いくつかの場合では、ナノ粒子は、２ｎｍ以下の寸法を有する。
「生残細胞」という用語は、それを抗菌薬に対して感受性を低くするかまたは耐性にする、非増殖（すなわち、休眠）のまたは極めて遅い増殖の生理学的状態に入っている細胞を指す。そのような細胞は、プランクトン性細菌細胞が免疫系または抗菌剤を用いる従来の治療によって根絶された後に「生き残り」得る。生残細胞は一般にバイオフィルム中に見出される。
本明細書で使用される場合、「抗菌剤」という用語は、「抗生物質」という用語と互換的であり、増殖に対する殺菌または静菌効果を有することができる任意の薬剤を指す。抗生物質としては、β－ラクタム抗生物質、アミノグリコシド、アミノシクリトール、キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、リンコサミド、糖ペプチド、リポペプチド、ポリペプチド抗生物質、スルホンアミド、トリメトプリム、クロラムフェニコール、イソニアジド、ニトロイミダゾール、リファンピシン、ニトロフラン、メテナミン、およびムピロシンが挙げられるが、これらに限定されない。
「抗菌効果」という用語は、細菌の死滅、またはその増殖および／もしくは繁殖の阻害もしくは停止を意味する。
本明細書で使用される場合、「排出ポンプ」という用語は、エネルギー依存性または非依存性様式で、細胞の細胞質またはペリプラズムから基質分子を輸送または搬出するタンパク質アセンブリを指す。本明細書で使用される場合、「排出ポンプ活性」という用語は、基質分子（抗菌剤を含む）の細胞外への搬出を担うメカニズムを指す。本明細書で使用される場合、「排出ポンプ阻害剤」という用語は、基質（抗菌剤を含む）を輸送または搬出する排出ポンプの能力を妨害する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「ＣｒｃＺ」という用語は、ＣｒｃＺのすべての形態を包含し、また、例えば、生物学的活性（例えば、細菌バイオフィルム形成の破壊または妨害）を保持する１つ以上のそのＣｒｃＺ Ａリッチモチーフ、バリアント、アナログ、および誘導体を含む、生物学的に活性な断片を含む。
ＣｒｃＺ ＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、ＣｒｃＺ発現細菌の任意の種に由来する分子を指す。分子は、物理的に細菌に由来する必要はなく、合成または組換えで産生され得る。いくつかのＣｒｃＺ核酸配列が知られている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのＣｒｃＺ（配列番号１）およびＣｒｃＺ Ａリッチモチーフ（配列番号２～６）の代表的な配列を、配列表に示す。これらの配列、またはそれらに対する少なくとも約８０～１００％の配列同一性（それらに対するこの範囲内の任意の同一性パーセント、例えば８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を含む）を有する配列を含む、そのバリアントのうちのいずれかを使用して、本明細書に記載されるように、細菌感染を治療症するための機能化されたナノ粒子を構築することができる。
「断片」によって、インタクトな全長配列および構造の一部のみからなる分子が意図される。核酸について、断片は、核酸の５’欠失、３’欠失、および／または内部欠失を含み得る。特定の核酸の活性断片は、一般に、全長分子の少なくとも約５～１６個の連続したヌクレオチドを含むが、問題の断片が生物学的活性（例えば、細菌感染症を根絶する能力）を保持しているという条件で、全長分子の少なくとも約８～２０個の連続したヌクレオチドを含み得、全長分子の少なくとも約２０～５０個またはそれ以上の連続したヌクレオチド、または５個のヌクレオチドと全長配列との間の任意の整数を含み得る。タンパク質またはペプチドについて、断片は、ポリペプチドのＣ末端欠失、Ｎ末端欠失、および／または内部欠失を含み得る。特定のタンパク質またはペプチドの活性断片は、一般に、全長分子の少なくとも約５～１４個の連続したアミノ酸残基を含むが、問題の断片が生物学的活性（例えば、細菌感染症を根絶する能力）を保持しているという条件で、全長分子の少なくとも約１５～２５個の連続したアミノ酸残基を含み得、全長分子の少なくとも約２０～５０個またはそれ以上の連続したアミノ酸残基、または５個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数を含み得る。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、（１）感染もしくは再感染の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））、または（２）目的の感染性疾患の症状の低減もしくは排除（治療（ｔｈｅｒａｐｙ））のいずれかを指す。
ナノ粒子の「治療有効用量または量」によって、本明細書に記載されるように、単独でまたは抗生物質との組み合わせで投与されたときに、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌によって引き起こされる任意の感染症を含む、感染症からの回復の改善などの正の治療応答をもたらす量が意図される。さらに、治療有効用量または量は、バイオフィルム中のプランクトン性細菌ならびに細菌を含む、生残細胞ならびに他の細菌細胞を根絶し得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、治療される状態の重症度、使用される特定の１つまたは複数の薬物、投与様式などに応じて、対象によって異なる。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、本明細書において提供される情報に基づいて、日常的な実験を使用して、当業者によって決定され得る。
「薬学的に許容される賦形剤または担体」は、任意選択で本発明の組成物に含まれ得、患者に重大な有害毒性学的作用を引き起こさない賦形剤を指す。
「薬学的に許容される塩」としては、アミノ酸塩、無機酸で調製された塩（例えば、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化物、および硝酸塩）、または前述のいずれかの対応する無機酸形態から調製された塩（例えば、塩酸塩）など、または有機酸で調製された塩（例えば、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、パラ－トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩、サリチル酸塩およびステアリン酸塩）、ならびにエストレート、グルセプテートおよびラクトビオネート塩が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、薬学的に許容されるカチオンを含有する塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウム（置換アンモニウムを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
「実質的に精製された」は、一般に、物質が、その中にそれが存在する試料の大多数の割合を占めるような、物質（化合物、ナノ粒子、核酸、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、またはポリペプチド）などの構成要素の単離を指す。典型的には、試料において、実質的に精製された構成要素は、試料の５０％、好ましくは８０％～８５％、より好ましくは９０％～９５％を占める。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、および密度に従った沈降を含む。
ポリペプチドを指す場合、「単離された」によって、示される分子が、それとともに分子が天然に見出される生物全体から分離しているもしくはそれと別個になっているか、または同じタイプの他の生物学的巨大分子の実質的な非存在下で存在することが意味される。ポリヌクレオチドに関して「単離された」という用語は、天然に通常それに付随している配列を（全体的または部分的に）欠く核酸分子、またはそれが天然に存在するようであるがそれに付随する異種配列を有する配列、または染色体から切り離された分子である。
「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、そのために診断、治療、または療法が所望される任意の脊椎動物対象、特にヒトを指す。「脊椎動物対象」によって、ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーおよび他の類人猿、ならびにサル種などの非ヒト霊長類を含む）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、飼育哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類を含む）、鳥類（ニワトリ、七面鳥、および他の家禽鳥、アヒル、ガチョウなどの飼育鳥、野鳥および狩猟鳥を含む）などを含むがこれらに限定されない脊索動物亜門の任意のメンバーが意味される。この用語は特定の年齢を示すものではない。したがって、成体個体および新生個体の両方がカバーされることが意図される。
「生体適合性」は、レシピエントに対して一般に無毒であり、対象に対して重大な有害作用を少しも引き起こさない材料およびその任意の代謝産物または分解産物を一般に指す。
「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド分子間の同一性パーセントを指す。２つの核酸、または２つのポリペプチド配列は、配列が、分子の規定された長さにわたって、少なくとも約５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％ ８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約９５％ ９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書で使用される場合、実質的に相同は、特定された配列に対する完全な同一性を示す配列も指す。
一般に、「同一性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。同一性パーセントは、配列を整列させ、２つの整列させた配列間の正確な一致数を数え、短い方の配列の長さで割り、結果に１００を掛けることによる、２つの分子間の配列情報の直接比較によって決定することができる。容易に利用可能なコンピュータプログラム、例えば、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３ ３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣのＡＬＩＧＮ、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（これは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ ４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムをペプチド分析のために適応させている）を分析の補助のために使用することができる。。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから利用可能）、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらはまた、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｒｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存する）で利用可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、上記で言及されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトパラメータを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性パーセントは、デフォルトのスコアリングテーブルおよび６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いてＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｒｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定することができる。
本発明の文脈で同一性パーセントを確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによって著作権保護され、Ｊｏｈｎ Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配布される、ＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージの使用である。この一式のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いることができ、ここで、デフォルトパラメータがスコアリングテーブルに使用される（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップエクステンションペナルティ１、およびギャップ６）。生成されたデータから、「一致」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを計算するための他の好適なプログラムは、一般に当該技術分野で既知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いて使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを使用して使用することができる：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は容易に入手可能である。
あるいは、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）での消化、および消化された断片のサイズ決定によって、相同性を決定することができる。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定のシステムについて定義されるようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において特定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（上記）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｏｎ（上記）を参照されたい。
核酸分子を説明するために本明細書で使用される場合、「組換え」は、その起源または操作のために、それが天然に付随しているポリヌクレオチドの全部または一部に付随していない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般に、目的の遺伝子は、以下にさらに記載されるように、クローニングされ、次いで形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下で、外来遺伝子を発現して、タンパク質を産生する。
「由来する」という用語は、分子の元来の供給源を特定するために本明細書において使用されるが、それによって分子が作製される方法（これは、例えば、化学合成または組換え手段によるものであり得る）を限定することを意味するものではない。
指定された配列に「由来する」ポリヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する、すなわち、それと同一であるかまたはそれに相補的である、およそ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０～１２ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５～２０ヌクレオチドの連続した配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。由来するポリヌクレオチドは、必ずしも目的のヌクレオチド配列に物理的に由来せず、ポリヌクレオチドが由来する領域（複数可）における塩基の配列によって提供される情報に基づく、化学合成、複製、逆転写、または転写を含むがこれらに限定されない任意の方法で生成され得る。したがって、それは、元来のポリヌクレオチドのセンス方向またはアンチセンス方向のいずれかを表し得る。
「親水性ポリマー」という用語は、水に溶解する、水を吸収する、または水と容易に混合する特性を有し、少なくとも２００から８，０００またはそれ以上までの分子量を構成する繰り返し単位を含む材料を指す。親水性ポリマーとしては、ナノ粒子を可溶化するために使用され得る、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ならび他の材料が挙げられるが、これらに限定されない。この目的のための材料としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレン、ポリメチレングリコール、ポリトリメチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリリジン（ＤまたはＬ）および誘導体、ならびにポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマーおよびコポリマーが挙げられる。親水性ポリマーは、直鎖状または多重分岐状であり得、マルチアームブロックコポリマーを含み得る。親水性ポリマーは、十分な数がナノ粒子に付着すると、ナノ粒子を可溶性にする。
方法
機能化されたナノ粒子を含む組成物および細菌感染症の治療においてそれを使用する方法が提供される。特に、機能化されたナノ粒子は、従来の抗生物質治療に応答性でない細菌バイオフィルムの産生に関連する慢性感染症を治療するために有用である。理論に拘束されるものではないが、バイオフィルム中の細菌は、抗生物質での治療に対してより耐性である傾向がある。これは、部分的には、バイオフィルム細胞外マトリックスおよび細胞の外層が、内部の細菌細胞を保護するためである。加えて、バイオフィルム中の多くの細菌細胞は、休眠表現型を取り、代謝的に非活動性となり、これは、有効であるために代謝される必要がある抗生物質に対するそれらの感受性を低くする（例えば、ペニシリンは、細胞死を引き起こすために、活動性細菌細胞における細胞壁リモデリングを必要とする）。非増殖のまたは極めて遅い増殖の生理学的状態に入っており、その結果、抗菌薬に対して耐性になったバイオフィルム中の休眠細胞は、免疫系および抗菌剤によって他の活動性細菌細胞が根絶された後に生き残るその能力のために、本明細書において「生残細胞」と称される。生残細胞は、従来の抗生物質治療を用いてそれらを根絶することの困難性のために、多くの場合、慢性感染症と関連する。本明細書に記載される方法は、バイオフィルム中の生残細胞を抗生物質治療に対してより感受性にする、慢性感染症の治療のために特に有用である。
細菌感染症の治療のための機能化されたナノ粒子
ナノ粒子は、細菌の根絶におけるナノ粒子の有効性および／または送達を増強する、ポリマー（例えば、ＰＥＧ化ナノ粒子）、細胞形質導入ペプチド（例えば、ＴＡＴ）、抗菌剤、および／または細菌ＲＮＡ（例えば、ＣｒｃＺ）を含む１つ以上の薬剤で機能化され得る。機能化されたナノ粒子は、長さ約１ｎｍ～約５００ｎｍの範囲のサイズを有する有機、無機、またはハイブリッドのナノ粒子であり得る。ナノ粒子は、５００ｎｍ以下（２５０ｎｍ以下、または２００ｎｍ以下、または１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下、または５０ｎｍ以下、または４０ｎｍ以下、または３０ｎｍ以下、または２５ｎｍ以下、または２０ｎｍ以下、または１５ｎｍ以下、または１０ｎｍ以下、または５ｎｍ以下、または４ｎｍ以下、または３ｎｍ以下、または２ｎｍ以下、または１ｎｍ以下を含む）の寸法を有し得る。いくつかの場合では、ナノ粒子は、２ｎｍ以下の寸法を有する。
ナノ粒子は典型的には形状が球状であるが、他の形状を有するナノ粒子も使用され得る。例えば、ナノ粒子は、限定されないが、楕円体、桿体、円錐体、立方体、立方体状（例えば、直方体）、角錐体、または不規則形状などのような形状を有し得る。特定の例では、異なる形状のナノ粒子の組み合わせが、組成物中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、形状が実質的に球状であり、したがって、球の直径として測定される寸法を有し得る。例えば、ナノ粒子は、５００ｎｍ以下（２５０ｎｍ以下、または２００ｎｍ以下、または１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下、または５０ｎｍ以下、または４０ｎｍ以下、または３０ｎｍ以下、または２５ｎｍ以下、または２０ｎｍ以下、または１５ｎｍ以下、または１０ｎｍ以下、または５ｎｍ以下、または４ｎｍ以下、または３ｎｍ以下、または２ｎｍ以下、または１ｎｍ以下を含む）の平均直径を有し得る。いくつかの例では、実質的に球状のナノ粒子は、２ｎｍ以下の平均直径を有する。
ナノ粒子は、例えば、金属、セラミック、炭素系ナノ材料、ケイ素もしくはシリカ、ホウ素、ポリマー、脂質、またはタンパク質を含み得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ケイ素の酸化物、アルミニウム、遷移金属（例えば、チタン、ジルコニウムなど）、アルミノケイ酸塩、窒化ホウ素、またはそれらの組み合わせから構成される。ナノ粒子において使用され得る例示的な材料としては、二酸化ケイ素（例えば、シリカ）、二酸化チタン、ケイ素－アルミニウム－オキシド、酸化アルミニウム、および酸化鉄が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、金、銀、白金、チタン、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、スズ、ニッケル、銅、アルミニウム、またはそれらの酸化物、炭化物、窒化物、もしくはそれらの合金のうちの１つ以上を含むがこれらに限定されない金属を含む。いくつかの例では、ナノ粒子は、限定されないが、珪藻土、カルシウムヒドロキシアパタイトなどのような他の無機材料から構成される。ナノ粒子はまた、限定されないが、ポリラクチド、ポリ乳酸、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリ（イソブテン）、ポリ（イソプレン）、ポリ（４－メチル－１－ペンテン）、ポリプロピレン、エチレン－プロピレンコポリマー、およびエチレンプロピレン－ヘキサジエンコポリマー）、エチレン－酢酸ビニルコポリマー、ならびにスチレンポリマー（例えば、ポリ（スチレン）、ポリ（２－メチルスチレン）、スチレン－アクリロニトリルコポリマー、およびスチレン－２，２，３，３，－テトラフルオロ－プロピルメタクリレートコポリマー）などの疎水性ポリマーから構成され得る。ナノ粒子はまた、タンパク質（アルブミン、シルク、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、トウモロコシゼイン、およびダイズタンパク質ベースのナノ粒子を含むが、これらに限定されない）、または多糖ベースのポリマー（キトサン、ヒアルロン酸、アルギネート、グルカン、デキストラン、およびシクロデキストリンベースのナノ粒子を含むがこれらに限定されない）などの天然ポリマーから構成され得る。炭素系ナノ粒子としては、カーボンナノチューブ、グラファイト、グラフェン、フラーレン、およびナノダイヤモンドが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記材料の組み合わせもまた、ナノ粒子に含まれ得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ヒト細胞と生体適合性である。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子の外表面は、アニオン性部分で機能化されている。アニオン性部分としては、例えば、カルボキシレート官能基、ホスフェート官能基、またはサルフェート官能基が挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子の外表面は、ナノ粒子を可溶化するように、親水性ポリマーで機能化されている。この目的のために使用され得る例示的なポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレン、ポリメチレングリコール、ポリトリメチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリリジン（ＤまたはＬ）および誘導体、ならびにポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマーおよびコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。親水性ポリマーは、直鎖状または多重分岐状であり得、マルチアームブロックコポリマーを含み得る。親水性ポリマーは、十分な数がナノ粒子に付着すると、ナノ粒子を可溶性にする。さらに、ポリマーはまた、タンパク質吸着からナノ粒子を保護し、ナノ粒子に対する免疫学的反応を低減し得、これは、血流におけるその安定性の延長に役立つ。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子の外表面は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで機能化されている（すなわち、ＰＥＧ化ナノ粒子）。ＰＥＧポリマーは、分岐状または非分岐状であり得る。いくつかの場合では、ＰＥＧポリマーは、１０００Ｄａ以上、例えば、１５００Ｄａ以上（２０００Ｄａ以上、または３０００Ｄａ以上、または４０００Ｄａ以上、または５０００Ｄａ以上、または６０００Ｄａ以上、または７０００Ｄａ以上、または８０００Ｄａ以上、または９０００Ｄａ以上、または１０，０００Ｄａ以上、または１５，０００Ｄａ以上、または２０，０００Ｄａ以上を含む）の平均分子量を有する。特定の例では、ＰＥＧポリマーは、２０００Ｄａの平均分子量を有する。特定の例では、ＰＥＧポリマーは、２０００Ｄａの平均分子量を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーは、アニオン性部分で機能化されている。例えば、ＰＥＧポリマーは、酸部分で機能化され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーは、カルボキシレート基を含む（例えば、ＰＥＧカルボン酸（ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）、ヒドロキシルＰＥＧカルボン酸、ＰＥＧ酢酸、ＰＥＧグルタル酸、ＰＥＧコハク酸、ＰＥＧグルタルアミド酸、ＰＥＧスクシンアミド酸）。他の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、アミン基などのカチオン性部分で（ＰＥＧ－ＮＨ２）、またはヒドロキシル基などの中性部分で（ＰＥＧ－ＯＨ）機能化されている。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンニトール、Ｄ－アラビノース、またはＤ－キシロースを含むがこれらに限定されないＤ－炭水化物をさらに含み、ここで、Ｄ－炭水化物は、ナノ粒子の外表面に付着されている。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、Ｄ－グルタミン酸、Ｄ－ロイシン、Ｄ－メチオニン、Ｄ－チロシン、およびＤ－トリプトファンを含むがこれらに限定されないＤ－アミノ酸をさらに含み、ここで、Ｄ－アミノ酸は、ナノ粒子の外表面に付着されている。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、細胞中への侵入を促進するために、内在化配列、タンパク質形質導入ドメイン、または細胞透過性ペプチドに連結される。使用され得る細胞透過性ペプチドとしては、ＨＩＶ－Ｔａｔ、ペネトラチン、トランスポータン、オクタアルギニン、ノナアルギニン、アンテナペディア、ＴＰ１０、ブホリンＩＩ、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ－ＦＧＦ、Ｋｕ７０、メリチン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ－１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ－７、ＣＡＤＹ、ＧＡＬＡ、ｐＨＬＩＰ、ＫＡＬＡ、Ｒ７Ｗ、およびＨＮ－１が挙げられるが、これらに限定されず、これらは容易にナノ粒子を形質膜を横断して輸送することができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）“Ｃｅｌｌ ｅｎｔｒｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔａｌｅｓ ｏｆ ｔａｉｌｓ ｗａｇｇｉｎｇ ｄｏｇｓ，”，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２（印刷中）、Ｆｏｎｓｅｃａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１（１１）：９５３－６４、Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８５（５４３３）：１５６９－７２、Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３０）：１８１８８－１８１９３、Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（９）：２４３８－２４４、およびＹｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２（１５）：４１８６－４１９０を参照されたい）。
特定の実施形態では、ナノ粒子は、ＣｒｃＺ ＲＮＡ配列またはその生物学的に活性な断片（例えば、生物学的活性（例えば、細菌バイオフィルム形成の破壊または妨害）を保持する１つ以上のそのＣｒｃＺ Ａリッチモチーフ、またはバリアント、アナログ、もしくは誘導体を含む）を含む核酸で機能化されている。ＣｒｃＺ ＲＮＡ配列は、ＣｒｃＺを発現する任意の細菌種に由来し得る。いくつかのＣｒｃＺ核酸配列が知られている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのＣｒｃＺ（配列番号１）およびＣｒｃＺ Ａリッチモチーフ（配列番号２～６）の代表的な配列を、配列表に示す。これらの配列、またはそれらに対する少なくとも約８０～１００％の配列同一性（それらに対するこの範囲内の任意の同一性パーセント、例えば８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を含む）を有する配列を含む、そのバリアントのうちのいずれかを使用して、本明細書に記載されるように、細菌感染症を治療するための機能化されたナノ粒子を構築することができる。
コンジュゲーション
ナノ粒子の表面機能化は、当該技術分野において既知の任意の方法によって行われ得る。ナノ粒子の機能化は、薬剤（例えば、ＰＥＧ、ＣｒｃＺ、細胞透過性ペプチド、アニオン性部分、および／または他の薬剤もしくは部分）の、ナノ粒子の外表面上の分子へのコンジュゲーションを含む。官能基を導入して、薬剤の付着を促進するために、表面コーティングがナノ粒子に適用され得る。例えば、チオール、カルボキシル、アミン、アルデヒド、ヒドロキシル、またはアジド基、ＰＥＧ、デキストラン、ストレプトアビジン、またはマレイミド、およびバイオコンジュゲーションを促進する化合物を含む表面コーティングを有する金ナノ粒子が、いくつかの企業から市販されている（例えば、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、およびＣｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）、およびＮａｎｏｃｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ））。薬剤は、直接的に、またはリンカーを通して間接的にナノ粒子にコンジュゲートされ得る。例示的なリンカーとしては、チオＣ６リンカー（チオヘキシル）、ＰＥＧポリマー、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、およびヒドラジド化合物が挙げられるが、これらに限定されない。バイオコンジュゲーション技術の考察については、例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｎａｒａｉｎ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ、２０１４）、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１３）、およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ｓ．Ｍａｒｋ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１１）、Ａｖｖａｋｕｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（１）：１１－２０．、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７（２）：２３８－２５０、Ｓｉｖａｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ Ｍａｔｅｒ．７（１）、ｖａｎ Ｖｕｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．９：ｅ２０１４０２００１、Ｍａｓｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ １３：１－１５、Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（７）：ｅ０１２９６８１、Ｆｒｅｉｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２ Ｐｔ Ａ）：１４２－１５２（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
様々なコンジュゲーション方法および化学を使用して、薬剤をナノ粒子にコンジュゲートすることができる。様々なゼロレングス、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性架橋試薬を使用することができる。ゼロレングス架橋試薬は、外因的材料の導入なしに２つの内因的化学基の直接コンジュゲーションを含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する薬剤は、このカテゴリーに属する。別の例は、カルボジイミド、クロロギ酸エチル、ウッドワード試薬Ｋ（２－エチル－５－フェニルイソオキサゾリウム－３’－スルホネート）、およびカルボニルジイミダゾールなどの、カルボキシルおよび一級アミノ基の縮合を誘導して、アミド結合を形成する試薬である。ホモおよびヘテロ二官能性試薬は、一般に、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的基と反応性であり得る、それぞれ、２つの同一のまたは２つの非同一の部位を含有する。
好適なアミノ反応性基としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、イソシアネート、アシルハライド、アリールアジド、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルデヒド、およびスルホニルクロリドが挙げられるが、これらに限定されない。好適なスルフヒドリル反応性基としては、マレイミド、アルキルハライド、ピリジルジスルフィド、およびチオフタルイミドが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、水および有機溶媒の両方に可溶性のカルボジイミドが、カルボキシル反応性試薬として使用される。これらの化合物は、遊離カルボキシル基と反応し、シュードウレアを形成し、次いでこれは利用可能なアミンにカップリングし得、アミド結合をもたらす。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ホモ二官能性架橋剤を使用してナノ粒子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ホモ二官能性架橋剤は、一級アミンと反応性である。一級アミンと反応性であるホモ二官能性架橋剤としては、ＮＨＳエステル、イミドエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルハライド、アリールアジド、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルデヒド、およびスルホニルクロリドが挙げられる。ホモ二官能性ＮＨＳエステルの非限定的な例としては、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタータレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルトレート（スルホ－ＤＳＴ）、ビス－２－（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス－２－（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（スルホ－ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－ＥＧＳ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート（ＤＳＰ）、およびジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（スルホ－ＤＳＰ）が挙げられる。ホモ二官能性イミドエステルの非限定的な例としては、ジメチルマロンイミデート（ＤＭＭ）、ジメチルスクシンイミデート（ＤＭＳＣ）、ジメチルアジプイミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメルイミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）、ジメチル－３，３’－オキシジプロピオンイミデート（ＤＯＤＰ）、ジメチル－３，３’－（メチレンジオキシ）ジプロピオンイミデート（ＤＭＤＰ）、ジメチル－，３’－（ジメチレンジオキシ）ジプロピオンイミデート（ＤＤＤＰ）、ジメチル－３，３’－（テトラメチレンジオキシ）ジプロピオンイミデート（ＤＴＤＰ）、およびジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）が挙げられる。
ホモ二官能性イソチオシアネートの非限定的な例としては、ｐ－フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）、および４，４’－ジイソチオシアノ－２，２’－ジスルホン酸スチルベン（ＤＩＤＳ）が挙げられる。ホモ二官能性イソシアネートの非限定的な例としては、キシレン－ジイソシアネート、トルエン－２，４－ジイソシアネート、トルエン－２－イソシアネート－４－イソチオシアネート、３－メトキシジフェニルメタン－４，４’－ジイソシアネート、２，２’－ジカルボキシ－４，４’－アゾフェニルジイソシアネート、およびヘキサメチレンジイソシアネートが挙げられる。ホモ二官能性アリールハライドの非限定的な例としては、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、および４，４’－ジフルオロ－３，３’－ジニトロフェニル－スルホンが挙げられる。ホモ二官能性脂肪族アルデヒド試薬の非限定的な例としては、グリオキサール、マロンジアルデヒド、およびグルタルアルデヒドが挙げられる。ホモ二官能性アシル化試薬の非限定的な例としては、ジカルボン酸のニトロフェニルエステルが挙げられる。ホモ二官能性芳香族スルホニルクロリドの非限定的な例としては、フェノール－２，４－ジスルホニルクロリド、およびアルファ－ナフトール－２，４－ジスルホニルクロリドが挙げられる。追加のアミノ反応性ホモ二官能性試薬の非限定的な例としては、アミンと反応してビスカルバメートを与えるエリスリトールビスカルボネートが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ホモ二官能性架橋剤は、遊離スルフヒドリル基と反応性である。遊離スルフヒドリル基と反応性のホモ二官能性架橋剤としては、例えば、マレイミド、ピリジルジスルフィド、およびアルキルハライドが挙げられる。ホモ二官能性マレイミドの非限定的な例としては、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、Ｎ，Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’－（１，２－フェニレン）ビスマレイミド、アゾフェニルジマレイミド、およびビス（Ｎ－マレイミドメチル）エーテルが挙げられる。ホモ二官能性ピリジルジスルフィドの非限定的な例としては、１，４－ジ－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミドブタン（ＤＰＤＰＢ）が挙げられる。ホモ二官能性アルキルハライドの非限定的な例としては、２，２’－ジカルボキシ－４，４’－ジヨードアセトアミドアゾベンゼン、α，α’－ジヨード－ｐ－キシレンスルホン酸、α，α’－ジブロモ－ｐ－キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’－ビス（ｂ－ブロモエチル）ベンジルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジ（ブロモアセチルフェニルヒドラジン）、および１，２－ジ（ブロモアセチルアミノ－３－フェニルプロパンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ヘテロ二官能性試薬を使用してナノ粒子にコンジュゲートされる。好適なヘテロ二官能性試薬としては、ピリジルジスルフィド部分を含むアミノ反応性試薬、マレイミド部分を含むアミノ反応性試薬、アルキルハライド部分を含むアミノ反応性試薬、およびアルキルジハライド部分を含むアミノ反応性試薬が挙げられる。
ピリジルジスルフィド部分およびアミノ反応性ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性試薬の非限定的な例としては、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノエート（スルホ－ＬＣＳＰＤＰ）、４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、およびスルホスクシンイミジル６－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミドヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ＳＭＰＴ）が挙げられる。
マレイミド部分およびアミノ反応性ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性試薬の非限定的な例としては、スクシンイミジルマレイミジルアセテート（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル３－マレイミジルプロピオネート（ＢＭＰＳ）、Ｎ－ガンマ－マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）Ｎ－ガンマ－マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル６－マレイミジルヘキサノエート（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル３－マレイミジルベンゾエート（ＳＭＢ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢＳ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチリシクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびスルホスクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ－ＳＭＰＢ）が挙げられる。
アルキルハライド部分およびアミノ反応性ＮＨＳエステルを含むヘテロ二官能性試薬の非限定的な例としては、Ｎ－スクシンイミジル－（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル－（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ－ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル－６－（ヨードアセチル）アミノヘキサノエート（ＳＩＡＸ）、スクシンイミジル－６－（６－（（（ヨードアセチル）－アミノ）ヘキサノイルアミノ）ヘキサノエート（ＳＩＡＸＸ）、スクシンイミジル－６－（（（４－（ヨードアセチル）－アミノ）メチル）－シクロヘキサン－１－カルボニル）アミ－ノヘキサノエート（ＳＩＡＣＸ）、およびスクシンイミジル－４－（（ヨードアセチル）－アミノ）メチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＩＡＣ）が挙げられる。
アミノ反応性ＮＨＳエステルおよびアルキルジハライド部分を含むヘテロ二官能性試薬の非限定的な例は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル２，３－ジブロモプロピオネート（ＳＤＢＰ）である。アルキルハライド部分およびアミノ反応性ｐ－ニトロフェニルエステル部分を含むヘテロ二官能性試薬の非限定的な例としては、ｐ－ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）が挙げられる。
別の例では、３－ＴｈｉｏＣ６リンカーを使用して、薬剤をチオール基で機能化して、ナノ粒子または他の薬剤への付着を促進し得る。例えば、３－ＴｈｉｏＣ６リンカーを使用して、ＣｒｃＺ ＲＮＡ配列またはＣｒｃＺ Ａリッチモチーフ配列を含む核酸の３’末端にチオール基を付加し得る。遊離チオールは、マレイミド化合物を付着するための、またはジスルフィド結合を通したコンジュゲーションのための反応性官能基として使用され得る。
別のバイオコンジュゲーション法は、クリックケミストリーを使用する。クリックケミストリー反応としては、Ｈｕｉｓｇｅｎ １，３－双極子環化付加銅触媒反応（Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ ６７：３０５７－６４）、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応などの環化付加反応、求核置換反応（特に、エポキシおよびアジリジン化合物のような小さなひずみ環に対する）、尿素化合物の形成を含む反応、ならびにチオール－エン反応におけるアルキンなどの炭素－炭素二重結合を含む反応が挙げられる。例えば、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ４０：３００４－３１、Ｅｖａｎｓ，２００７，Ａｕｓｔ Ｊ Ｃｈｅｍ ６０：３８４－９５、Ｍｉｌｌｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）５（１）：８７－９５）、Ｌａｌｌａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２９（１）：１－３４、Ｇｒｅｇｏｒｉｔｚａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．９７（Ｐｔ Ｂ）：４３８－４５３、Ｍｕｓｕｍｅｃｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２２（１７）：２０２２－２０５０、ＭｃＫａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２１（９）：１０７５－１１０１、Ｕｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０（１）：３４－４１、Ｐａｓｉｎｉ（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １８（８）：９５１２－９５３０、およびＷａｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１７（１１）：１０９２－１１１６（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
医薬組成物
本明細書に記載される機能化されたナノ粒子は、任意選択で１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に製剤化され得る。例示的な賦形剤としては、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。注射用組成物に好適な賦形剤としては、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、および界面活性剤が挙げられる。炭水化物、例えば、糖、誘導体化糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖、および／または糖ポリマーが賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば、単糖、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど；二糖、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；およびアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなどが挙げられる。賦形剤としてはまた、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、およびこれらの組み合わせなどの無機塩または緩衝剤が挙げられ得る。
組成物はまた、微生物増殖を防止または阻止するための抗菌剤を含み得る。抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
抗酸化剤は、同様に、組成物中に存在し得る。抗酸化剤は、酸化を防止するために使用され、それによって、ナノ粒子または調製物の他の構成要素の劣化を防止する。本発明における使用に好適な抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
界面活性剤は、賦形剤として存在し得る。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート、例えば、「Ｔｗｅｅｎ ２０」および「Ｔｗｅｅｎ ８０」、ならびにプルロニック（登録商標）、例えば、Ｆ６８およびＦ８８（ＢＡＳＦ、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；ソルビタンエステル；脂質、例えば、リン脂質、例えば、レシチンおよび他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（好ましくはリポソーム形態ではないが）、脂肪酸および脂肪エステル；ステロイド、例えば、コレステロール；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；ならびに亜鉛および他のそのような好適なカチオンが挙げられる。
酸または塩基は、組成物中に賦形剤として存在し得る。使用され得る酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、カリウムフマメレート、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられるが、これらに限定されない。
組成物中のナノ粒子の量（例えば、薬物送達システム中に含有される場合）は、いくつかの因子に応じて変動するが、組成物が単位剤形または容器（例えば、バイアル）中にあるときには最適に治療有効用量である。治療有効用量は、いずれの量が臨床的に所望されるエンドポイントをもたらすかを決定するための、漸増量の組成物の投与の繰り返しによって実験的に決定することができる。
組成物中の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の性質および機能、ならびに組成物の特定の必要性に応じて変動する。典型的には、任意の個々の賦形剤の最適な量は、日常的な実験を通じて、すなわち、変動する量の賦形剤（低から高の範囲）を含有する組成物を調製し、安定性および他のパラメータを検査し、次いで、重大な有害作用なしに最適な性能が達成される範囲を決定することによって決定される。しかしながら、一般に、賦形剤（複数可）は、約１重量％～約９９重量％、好ましくは約５重量％～約９８重量％、より好ましくは約１５重量％～約９５重量％の賦形剤の量で組成物中に存在し、３０重量％未満の濃度が最も好ましい。これらの前述の医薬賦形剤は、他の賦形剤とともに、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、ｔｈｅ”Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）、およびＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００に記載されている。
組成物は、すべてのタイプの製剤、特に、注射のために適合させられたもの、例えば、使用前に溶媒を用いて再構成され得る粉末または凍結乾燥物、ならびに、注射の準備ができている溶液または懸濁液、使用前にビヒクルと組み合わせるための乾燥不溶性組成物、および投与前の希釈のためのエマルジョンおよび液体濃縮物を包含する。注射前に固体組成物を再構成するための好適な希釈剤の例としては、注射用静菌水、水中５％デキストロース、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、生理食塩水、無菌水、脱イオン水、およびこれらの組み合わせが挙げられる。液体医薬組成物に関して、溶液および懸濁液が想定される。追加の好ましい組成物としては、経口、眼、または局所送達のための組成物が挙げられる。
本明細書における医薬調製物はまた、意図される送達および使用の様式に応じて、シリンジ、移植デバイスなどに収容され得る。好ましくは、ナノ粒子を含む組成物は、単位剤形であり、これは、事前に測定されたかまたは事前に包装された形態の、単回用量に適切な組成物の量を意味する。
本明細書における組成物は、任意選択で、１つ以上の追加の薬剤、例えば、抗生物質、アジュバント、免疫刺激剤、ワクチン、および／または感染症について対象を治療するために使用される他の医薬を含み得る。配合された調製物には、ナノ粒子および感染症を治療するための１つ以上の他の薬剤、例えば、限定されないが、広域スペクトル、殺菌性または静菌性抗生物質を含む抗生物質、例えば、ペニシリン（ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、プロカインペニシリン、ベンザチンペニシリン、ｖｅｅｔｉｄｓ（Ｐｅｎ－Ｖｅｅ－Ｋ）、ピペラシリン、ピプラシル、ｐｆｉｚｅｒｐｅｎ、テモシリン、ネガバン、チカルシリン、およびＴｉｃａｒを含む）；ペニシリンの組み合わせ（例えば、アモキシシリン／クラブラン酸塩、オーグメンチン、アンピシリン／スルバクタム、ユナシン、ピペラシリン／タゾバクタム、ゾシン、チカルシリン／クラブラン酸塩、およびチメンチン）；テタサイクリン（例えば、クロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、エラバサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オマダサイクリン、オキシテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、サレサイクリン、テトラサイクリン、およびチゲサイクリン）；セファロスポリン（例えば、セファセトリル（ｃｅｆａｃｅｔｒｉｌｅ）（セファセトリル（ｃｅｐｈａｃｅｔｒｉｌｅ））、セファドロキシル（ｃｅｆａｄｒｏｘｉｌ）（セファドロキシル（ｃｅｆａｄｒｏｘｙｌ）；ｄｕｒｉｃｅｆ）、セファレキシン（ｃｅｆａｌｅｘｉｎ）（セファレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ）；ｋｅｆｌｅｘ）、セファログリシン（ｃｅｆａｌｏｇｌｙｃｉｎ）（セファログリシン（ｃｅｐｈａｌｏｇｌｙｃｉｎ））、セファロニウム（ｃｅｆａｌｏｎｉｕｍ）（セファロニウム（ｃｅｐｈａｌｏｎｉｕｍ））、セファロリジン（ｃｅｆａｌｏｒｉｄｉｎｅ）（セファロラジン（ｃｅｐｈａｌｏｒａｄｉｎｅ））、セファロチン（ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）（セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ）；ｋｅｆｌｉｎ）、セファピリン（ｃｅｆａｐｉｒｉｎ）（セファピリン（ｃｅｐｈａｐｉｒｉｎ）；ｃｅｆａｄｒｙｌ）、セファトリジン、セファザフル、セファゼドン、セファゾリン（ｃｅｆａｚｏｌｉｎ）（セファゾリン（ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）；ａｎｃｅｆ、ｋｅｆｚｏｌ）、セフラジン（ｃｅｆｒａｄｉｎｅ）（セフラジン（ｃｅｐｈｒａｄｉｎｅ）；ｖｅｌｏｓｅｆ）、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル（ｃｅｃｌｏｒ、ｄｉｓｔａｃｌｏｒ、ｋｅｆｌｏｒ、ｒａｎｉｃｌｏｒ）、セフォニシド（ｍｏｎｏｃｉｄ）、セフプロジル（セフプロキシル；ｃｅｆｚｉｌ）、セフロキシム（ｚｅｆｕ、ｚｉｎｎａｔ、ｚｉｎａｃｅｆ、ｃｅｆｔｉｎ、ｂｉｏｆｕｒｏｋｓｙｍ、ｘｏｒｉｍａｘ）、セフゾナム、ロラカルベフ（ｌｏｒａｂｉｄ）セフブペラゾン、セフメタゾール（ｚｅｆａｚｏｎｅ）、セフミノクス、セフォテタン（ｃｅｆｏｔａｎ）、セフォキシチン（ｍｅｆｏｘｉｎ）、セフォチアム（ｐａｎｓｐｏｒｉｎ）、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル（ｓｅｆｄｉｎ、ｚｉｎｉｒ、ｏｍｎｉｃｅｆ、ｋｅｆｎｉｒ）、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム（ｆｉｘｘ、ｚｉｆｉ、ｓｕｐｒａｘ）、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム（ｃｌａｆｏｒａｎ）、セフォベシン（ｃｏｎｖｅｎｉａ）、セフピミゾール、セフポドキシム（ｖａｎｔｉｎ、ｐｅｃｅｆ、ｓｉｍｐｌｉｃｅｆ）、セフテラム、ｃｅｆｔａｍｅｒｅ（ｅｎｓｈｏｒｔ）、セフチブテン（ｃｅｄａｘ）、セフチオフル（ｎａｘｃｅｌ、ｅｘｃｅｎｅｌ）、セフチオレン、セフチゾキシム（ｃｅｆｉｚｏｘ）、セフトリアキソン（ｒｏｃｅｐｈｉｎ）、セフォペラゾン（ｃｅｆｏｂｉｄ）、セフタジジム（ｍｅｅｚａｔ、ｆｏｒｔｕｍ、ｆｏｒｔａｚ）、ラタモキセフ（ｍｏｘａｌａｃｔａｍ）、セフクリジン、セフェピム（ｍａｘｉｐｉｍｅ）、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム（ｃｅｆｒｏｍ）、セフキノム、フロモキセフ、セフトビプロール、セフタロリン、セフトロザン、セファロラム、セファパロール、セフカネル、セフェドロロール、セフェムピドン、セフェトリゾール、セフィビトリル、セフマチレン、セフメピジウム、セフォキサゾール、セフロチル、セフスミド、セフチオキシド、セフラセチム、およびニトロセフィン）；キノロン／／フルオロキノロン（例えば、フルメキン（Ｆｌｕｂａｃｔｉｎ）、オキソリン酸（Ｕｒｏｘｉｎ）、ロソクサシン（Ｅｒａｄａｃｉｌ）、シノキサシン（Ｃｉｎｏｂａｃ）、ナリジクス酸（ＮｅｇＧａｍ、Ｗｉｎｔｏｍｙｌｏｎ）、ピロミド酸（Ｐａｎａｃｉｄ）、ピペミド酸（Ｄｏｌｃｏｌ）、シプロフロキサシン（Ｚｏｘａｎ、Ｃｉｐｒｏｂａｙ、Ｃｉｐｒｏ、Ｃｉｐｒｏｘｉｎ）、フレロキサシン（Ｍｅｇａｌｏｎｅ、Ｒｏｑｕｉｎｏｌ）、ロメフロキサシン（Ｍａｘａｑｕｉｎ）、ナジフロキサシン（Ａｃｕａｔｉｍ、Ｎａｄｏｘｉｎ、Ｎａｄｉｘａ）、ノルフロキサシン（Ｌｅｘｉｎｏｒ、Ｎｏｒｏｘｉｎ、Ｑｕｉｎａｂｉｃ、Ｊａｎａｃｉｎ）、オフロキサシン（Ｆｌｏｘｉｎ、Ｏｘａｌｄｉｎ、Ｔａｒｉｖｉｄ）、ペフロキサシン（Ｐｅｆｌａｃｉｎｅ）、ルフロキサシン（Ｕｒｏｆｌｏｘ）、エノキサシン（Ｅｎｒｏｘｉｌ、Ｐｅｎｅｔｒｅｘ）、バロフロキサシン（Ｂａｌｏｘｉｎ）、グレパフロキサシン（Ｒａｘａｒ）、レボフロキサシン（Ｃｒａｖｉｔ、Ｌｅｖａｑｕｉｎ）、パズフロキサシン（Ｐａｓｉｌ、Ｐａｚｕｃｒｏｓｓ）、スパルフロキサシン（Ｚａｇａｍ）、テマフロキサシン（Ｏｍｎｉｆｌｏｘ）、トスフロキサシン（Ｏｚｅｘ、Ｔｏｓａｃｉｎ）、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン（Ｚｉｇａｔ、Ｔｅｑｕｉｎ、Ｚｙｍａｒ－ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、モキシフロキサシン（Ａｖｅｌｏｘ、Ｖｉｇａｍｏｘ）、シタフロキサシン（Ｇｒａｃｅｖｉｔ）、プルリフロキサシン（Ｑｕｉｓｎｏｎ）、ベシフロキサシン（Ｂｅｓｉｖａｎｃｅ）、デラフロキサシン（Ｂａｘｄｅｌａ）、ゲミフロキサシン（Ｆａｃｔｉｖｅ）およびトロバフロキサシン（Ｔｒｏｖａｎ）、オゼノキサシン、ダノフロキサシン（Ａｄｖｏｃｉｎ、Ａｄｖｏｃｉｄ）、ジフロキサシン（Ｄｉｃｕｒａｌ、Ｖｅｔｅｑｕｉｎｏｎ）、エンロフロキサシン（Ｂａｙｔｒｉｌ）、イバフロキサシン（Ｉｂａｆｌｉｎ）、マルボフロキサシン（Ｍａｒｂｏｃｙｌ、Ｚｅｎｅｑｕｉｎ）、オルビフロキサシン（Ｏｒｂａｘ、Ｖｉｃｔａｓ）、およびサラフロキサシン（Ｆｌｏｘａｓｏｌ、Ｓａｒａｆｌｏｘ、Ｓａｒａｆｉｎ）；マクロライド（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンＡ、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン／酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）／タイロシン（ｔｙｌｏｃｉｎｅ）、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、セスロマイシン、ソリスロマイシン、タクロリムス、ピメクロリムス、シロリムス、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、およびクルエンタレン）；スルホンアミド（例えば、スルホンアミド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファフラゾール（スルフィソキサゾール）、スルフィソミジン（スルファイソジミジン）、スルファメトキサゾール、スルファモキソール、スルファニトラン、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリダジン、スルファメトキシジアジン、スルファドキシン、スルファメトピラジン、およびテレフチル）；アミノグリコシド（例えば、カナマイシンＡ、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、Ｃ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）、ストレプトマイシン、プラゾマイシン、アミキン、ガラマイシン、カントレックス、ネオフラジン、ネトロマイシン、ネブシン、ｈｕｍａｔｉｎ、スペクチノマイシン（Ｂｓ）、およびトロビシン）；カルバペネム（例えば、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、テビペネム、ラズペネム（ＰＺ－６０１）、レナペネム、トモペネム、およびチエナマイシン（ｔｈｉｅｎｐｅｎｅｍ））；アンサマイシン（例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、およびキシファクサン）；カルバセフェム（例えば、ロラカルベフおよびｌｏｒａｂｉｄ）；カルバペネム（例えば、エルタペネム、ｉｎｖａｎｚ、ドリペネム、ドリバックス、イミペネム／シラスタチン、プリマキシン、メロペネム、およびｍｅｒｒｅｍ）；糖ペプチド（例えば、テイコプラニン、タゴシッド、バンコマイシン、ｖａｎｃｏｃｉｎ、テラバンシン、ヴィバティブ、ダルババンシン、ｄａｌｖａｎｃｅ、オリタバンシン、およびｏｒｂａｃｔｉｖ）；リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、クレオシン、リンコマイシン、およびリンコシン）；リポペプチド（例えば、ダプトマイシンおよびキュビシン）；マクロライド（例えば、アジスロマイシン、ジスロマック、ｓｕｍａｍｅｄ、ｘｉｔｈｒｏｎｅ、クラリスロマイシン、ｂｉａｘｉｎ、ジリスロマイシン、ｄｙｎａｂａｃ、エリスロマイシン、ｅｒｙｔｈｏｃｉｎ、ｅｒｙｔｈｒｏｐｅｄ、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、ｔａｏ、テリスロマイシン、ｋｅｔｅｋ、スピラマイシン、およびｒｏｖａｍｙｃｉｎｅ）；モノバクタム（例えば、アズトレオナムおよびａｚａｃｔａｍ）；ニトロフラン（例えば、フラゾリドン、ｆｕｒｏｘｏｎｅ、ニトロフラントイン、ｍａｃｒｏｄａｎｔｉｎ、およびｍａｃｒｏｂｉｄ）；オキサゾリジノン（例えば、リネゾリド、ｚｙｖｏｘ、ｖｒｓａ、ｐｏｓｉｚｏｌｉｄ、ｒａｄｅｚｏｌｉｄ、およびｔｏｒｅｚｏｌｉｄ）；ポリペプチド（例えば、バシトラシン、コリスチン、コリマイシンＳ（ｃｏｌｙ－ｍｙｃｉｎ－Ｓ）、およびポリミキシンＢ）；マイコバクテリアに対する薬物（例えば、クロファジミン、ｌａｍｐｒｅｎｅ、ｄａｐｓｏｎｅ、ａｖｌｏｓｕｌｆｏｎ、カプレオマイシン、ｃａｐａｓｔａｔ、サイクロセリン、ｓｅｒｏｍｙｃｉｎ、エタンブトール、ｍｙａｍｂｕｔｏｌ、エチオナミド、ｔｒｅｃａｔｏｒ、イソニアジド、Ｉ．Ｎ．Ｈ．、ピラジナミド、ａｌｄｉｎａｍｉｄｅ、リファンピシン、ｒｉｆａｄｉｎ、ｒｉｍａｃｔａｎｅ、リファブチン、ｍｙｃｏｂｕｔｉｎ、リファペンチン、ｐｒｉｆｔｉｎ、およびストレプトマイシン）；および他の抗生物質（例えば、アルスフェナミン、ｓａｌｖａｒｓａｎ、クロラムフェニコール、ｃｈｌｏｒｏｍｙｃｅｔｉｎ、ホスホマイシン、ｍｏｎｕｒｏｌ、ｍｏｎｕｒｉｌ、フシジン酸、ｆｕｃｉｄｉｎ、メトロニダゾール、ｆｌａｇｙｌ、ムピロシン、ｂａｃｔｒｏｂａｎ、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ｓｙｎｅｒｃｉｄ、チアンフェニコール、チゲサイクリン、ｔｉｇａｃｙｌ、チニダゾール、ｔｉｎｄａｍａｘ、ｆａｓｉｇｙｎ、トリメトプリム、ｐｒｏｌｏｐｒｉｍ、およびｔｒｉｍｐｅｘ）；アジュバント（アルミニウム塩（アラム）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどを含む）；水中油型エマルジョン製剤；（サポニンアジュバント；フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２）、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；細菌ＡＤＰ－リボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ））の無毒化変異体；ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド；ならびに他の免疫刺激分子；および細菌および感染性疾患に対するワクチン（細菌抗原性タンパク質または弱毒化もしくは死細菌を含む任意のワクチン、および任意選択で、細菌に対する免疫応答をブーストするためのアジュバント、例え

ば、結核、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型、コレラ、腸チフス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、などに対するワクチンを含む）が含まれ得る。
あるいは、そのような薬剤は、ナノ粒子を含む組成物とは別個の組成物中に含有され得、ナノ粒子を含む組成物と同時に、その前、またはその後に同時投与され得る。
投与
本明細書に記載されるナノ粒子を含む組成物を用いる治療の少なくとも１つの治療有効サイクルが、細菌感染症の治療のために対象に投与される。本明細書に記載される方法によって治療され得る細菌感染症としては、グラム陰性細菌、例えば、限定されないが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ（例えば、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ（例えば、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ），およびＹｅｒｓｉｎｉａ（例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、ならびにグラム陽性細菌、例えば、限定されないが、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目、以下を含む：Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｉ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｉ ｃｅｒｅｕｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目、以下を含む：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ，およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）、以下を含む：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｚｙｍｏｐｈｉｌｕｓ，およびＳｐｏｒｏｍｕｓａ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、以下を含む：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ，およびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘによって引き起こされる細菌感染症が挙げられる。
ナノ粒子の「治療有効用量または量」によって、本明細書に記載されるように、単独でまたは抗生物質との組み合わせで投与されたときに、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌によって引き起こされる任意の感染症を含む、感染症からの回復の改善などの正の治療応答をもたらす量が意図される。さらに、治療有効用量または量は、生残細胞ならびに他の細菌細胞（バイオフィルム中のプランクトン性細菌および細菌を含む）を根絶し得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、治療される状態の重症度、ナノ粒子の特定のタイプおよびその機能化、組み合わせて用いられる他の抗菌性薬剤または薬物、投与様式などに応じて、対象によって変動する。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、本明細書において提供される情報に基づいて、日常的な実験を使用して、当業者によって決定され得る。
特定の実施形態では、ナノ粒子、ならびに／あるいは抗生物質、アジュバント、免疫刺激剤、ワクチン、および／または感染症を治療するための他の薬物、または他の医薬などの１つ以上の他の治療剤を含む、複数の治療有効用量の組成物が投与される。ナノ粒子を含む組成物は、典型的には（必ずしもそうではないが）、経口で、注射を介して（皮下、静脈内、もしくは筋肉内に）、注入によって、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）または局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）に投与される。動脈内、血管内、肺、病変内、実質内、直腸、経皮、経粘膜、髄腔内、眼内、腹腔内などのような追加の投与様式もまた企図される。
本発明による調製物はまた、局所治療に好適である。例えば、ナノ粒子を含む組成物は、感染組織の部位に直接的に投与され得る。特定の調製物および適切な投与方法を選択して、ナノ粒子を、生残細胞が典型的に存在し、根絶を必要とする、慢性感染症の部位および細菌バイオフィルムの部位に標的化することができる。
医薬調製物は、投与直前に液体溶液または懸濁液の形態であり得るが、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、カプセル、粉末、ゲル、マトリックス、坐薬などのような別の形態も取り得る。ナノ粒子および／または他の薬剤を含む医薬組成物は、当該技術分野で既知の任意の医学的に許容される方法に従って、同じまたは異なる投与経路を使用して投与され得る。
別の実施形態では、ナノ粒子および／または他の薬剤を含む医薬組成物は、例えば、感染症を予防するために、予防的に投与される。このような予防的使用は、免疫不全である対象、免疫抑制剤を用いて治療された患者、または感染症を発症しがちにする遺伝的素因もしくは疾患（例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、がん、糖尿病、または嚢胞性線維症）を有する患者にとって特に価値がある。
別の実施形態では、ナノ粒子および／または抗生物質、および／または他の薬剤を含む医薬組成物は、徐放性製剤、または徐放性デバイスを使用して投与される製剤中にある。そのようなデバイスは、当該技術分野で周知であり、例えば、非徐放性医薬組成物について徐放性効果を達成するように、様々な用量で連続した定常状態様式で経時的な薬物送達を提供することができる、経皮パッチ、およびミニチュア植え込み型ポンプを含む。
当業者は、ナノ粒子が有効に治療することができる条件を理解する。投与される実際の用量は、対象の年齢、体重、および全身状態、ならびに治療される状態の重症度、医療従事者の判断、および投与されるコンジュゲートに応じて変動する。治療有効量は、当業者によって決定され得、各々の特定の場合の特定の要件に調整される。
特定の実施形態では、複数の治療有効用量のナノ粒子を含む組成物は、１日投薬レジメンに従って、または断続的に投与される。例えば、治療有効用量は、１週間に１日、１週間に２日、１週間に３日、１週間に４日、または１週間に５日などで投与され得る。「断続的」投与によって、治療有効用量が、例えば、１日おき、２日ごと、３日ごと、１週間に１回、１週間おきなどで投与され得ることが意図される。例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子を含む組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８．．．１０．．．１５．．．２４週間などのような長期間にわたって、１週１回、１週２回、または１週３回で投与される。「１週２回」または「１週間に２回」によって、２つの治療有効用量の問題の薬剤が、対象に、投与の最初の週の１日目に開始する７日の期間内に、用量間の最小７２時間、および用量間の最大９６時間で投与されることが意図される。「１週３回」または「１週間に３回」によって、３つの治療有効用量が、対象に、７日の期間内に、用量間の最小４８時間、および用量間の最大７２時間を可能にするように投与されることが意図される。本発明の目的のために、このタイプの投薬は、「断続的」療法と称される。本発明の方法によれば、対象は、所望の治療応答が達成されるまで、１以上の毎週のサイクルの間、断続的療法（すなわち、１週１回、１週２回、または１週３回の治療有効用量の投与）を受け得る。薬剤は、本明細書中以下に示される任意の許容される投与経路によって投与され得る。投与される量は、ナノ粒子の効力およびその機能化のタイプ、所望される効果の規模、および投与経路に依存する。
ナノ粒子（再び、好ましくは医薬調製物の一部として提供される）は、単独で、または１つ以上の他の治療剤、例えば、広域スペクトル、殺菌性または静菌性抗生物質を含む抗生物質、例えば、ペニシリン（ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、プロカインペニシリン、ベンザチンペニシリン、ｖｅｅｔｉｄｓ（Ｐｅｎ－Ｖｅｅ－Ｋ）、ピペラシリン、ピプラシル、ｐｆｉｚｅｒｐｅｎ、テモシリン、ネガバン、チカルシリン、およびＴｉｃａｒを含む）；ペニシリンの組み合わせ（例えば、アモキシシリン／クラブラン酸塩、オーグメンチン、アンピシリン／スルバクタム、ユナシン、ピペラシリン／タゾバクタム、ゾシン、チカルシリン／クラブラン酸塩、およびチメンチン）；テタサイクリン（例えば、クロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、エラバサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オマダサイクリン、オキシテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、サレサイクリン、テトラサイクリン、およびチゲサイクリン）；セファロスポリン（例えば、セファセトリル（ｃｅｆａｃｅｔｒｉｌｅ）（セファセトリル（ｃｅｐｈａｃｅｔｒｉｌｅ））、セファドロキシル（ｃｅｆａｄｒｏｘｉｌ）（セファドロキシル（ｃｅｆａｄｒｏｘｙｌ）；ｄｕｒｉｃｅｆ）、セファレキシン（ｃｅｆａｌｅｘｉｎ）（セファレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ）；ｋｅｆｌｅｘ）、セファログリシン（ｃｅｆａｌｏｇｌｙｃｉｎ）（セファログリシン（ｃｅｐｈａｌｏｇｌｙｃｉｎ））、セファロニウム（ｃｅｆａｌｏｎｉｕｍ）（セファロニウム（ｃｅｐｈａｌｏｎｉｕｍ））、セファロリジン（ｃｅｆａｌｏｒｉｄｉｎｅ）（セファロラジン（ｃｅｐｈａｌｏｒａｄｉｎｅ））、セファロチン（ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）（セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ）；ｋｅｆｌｉｎ）、セファピリン（ｃｅｆａｐｉｒｉｎ）（セファピリン（ｃｅｐｈａｐｉｒｉｎ）；ｃｅｆａｄｒｙｌ）、セファトリジン、セファザフル、セファゼドン、セファゾリン（ｃｅｆａｚｏｌｉｎ）（セファゾリン（ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）；ａｎｃｅｆ、ｋｅｆｚｏｌ）、セフラジン（ｃｅｆｒａｄｉｎｅ）（セフラジン（ｃｅｐｈｒａｄｉｎｅ）；ｖｅｌｏｓｅｆ）、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル（ｃｅｃｌｏｒ、ｄｉｓｔａｃｌｏｒ、ｋｅｆｌｏｒ、ｒａｎｉｃｌｏｒ）、セフォニシド（ｍｏｎｏｃｉｄ）、セフプロジル（セフプロキシル；ｃｅｆｚｉｌ）、セフロキシム（ｚｅｆｕ、ｚｉｎｎａｔ、ｚｉｎａｃｅｆ、ｃｅｆｔｉｎ、ｂｉｏｆｕｒｏｋｓｙｍ、ｘｏｒｉｍａｘ）、セフゾナム、ロラカルベフ（ｌｏｒａｂｉｄ）セフブペラゾン、セフメタゾール（ｚｅｆａｚｏｎｅ）、セフミノクス、セフォテタン（ｃｅｆｏｔａｎ）、セフォキシチン（ｍｅｆｏｘｉｎ）、セフォチアム（ｐａｎｓｐｏｒｉｎ）、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル（ｓｅｆｄｉｎ、ｚｉｎｉｒ、ｏｍｎｉｃｅｆ、ｋｅｆｎｉｒ）、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム（ｆｉｘｘ、ｚｉｆｉ、ｓｕｐｒａｘ）、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム（ｃｌａｆｏｒａｎ）、セフォベシン（ｃｏｎｖｅｎｉａ）、セフピミゾール、セフポドキシム（ｖａｎｔｉｎ、ｐｅｃｅｆ、ｓｉｍｐｌｉｃｅｆ）、セフテラム、ｃｅｆｔａｍｅｒｅ（ｅｎｓｈｏｒｔ）、セフチブテン（ｃｅｄａｘ）、セフチオフル（ｎａｘｃｅｌ、ｅｘｃｅｎｅｌ）、セフチオレン、セフチゾキシム（ｃｅｆｉｚｏｘ）、セフトリアキソン（ｒｏｃｅｐｈｉｎ）、セフォペラゾン（ｃｅｆｏｂｉｄ）、セフタジジム（ｍｅｅｚａｔ、ｆｏｒｔｕｍ、ｆｏｒｔａｚ）、ラタモキセフ（ｍｏｘａｌａｃｔａｍ）、セフクリジン、セフェピム（ｍａｘｉｐｉｍｅ）、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム（ｃｅｆｒｏｍ）、セフキノム、フロモキセフ、セフトビプロール、セフタロリン、セフトロザン、セファロラム、セファパロール、セフカネル、セフェドロロール、セフェムピドン、セフェトリゾール、セフィビトリル、セフマチレン、セフメピジウム、セフォキサゾール、セフロチル、セフスミド、セフチオキシド、セフラセチム、およびニトロセフィン）；キノロン／／フルオロキノロン（例えば、フルメキン（Ｆｌｕｂａｃｔｉｎ）、オキソリン酸（Ｕｒｏｘｉｎ）、ロソクサシン（Ｅｒａｄａｃｉｌ）、シノキサシン（Ｃｉｎｏｂａｃ）、ナリジクス酸（ＮｅｇＧａｍ、Ｗｉｎｔｏｍｙｌｏｎ）、ピロミド酸（Ｐａｎａｃｉｄ）、ピペミド酸（Ｄｏｌｃｏｌ）、シプロフロキサシン（Ｚｏｘａｎ、Ｃｉｐｒｏｂａｙ、Ｃｉｐｒｏ、Ｃｉｐｒｏｘｉｎ）、フレロキサシン（Ｍｅｇａｌｏｎｅ、Ｒｏｑｕｉｎｏｌ）、ロメフロキサシン（Ｍａｘａｑｕｉｎ）、ナジフロキサシン（Ａｃｕａｔｉｍ、Ｎａｄｏｘｉｎ、Ｎａｄｉｘａ）、ノルフロキサシン（Ｌｅｘｉｎｏｒ、Ｎｏｒｏｘｉｎ、Ｑｕｉｎａｂｉｃ、Ｊａｎａｃｉｎ）、オフロキサシン（Ｆｌｏｘｉｎ、Ｏｘａｌｄｉｎ、Ｔａｒｉｖｉｄ）、ペフロキサシン（Ｐｅｆｌａｃｉｎｅ）、ルフロキサシン（Ｕｒｏｆｌｏｘ）、エノキサシン（Ｅｎｒｏｘｉｌ、Ｐｅｎｅｔｒｅｘ）、バロフロキサシン（Ｂａｌｏｘｉｎ）、グレパフロキサシン（Ｒａｘａｒ）、レボフロキサシン（Ｃｒａｖｉｔ、Ｌｅｖａｑｕｉｎ）、パズフロキサシン（Ｐａｓｉｌ、Ｐａｚｕｃｒｏｓｓ）、スパルフロキサシン（Ｚａｇａｍ）、テマフロキサシン（Ｏｍｎｉｆｌｏｘ）、トスフロキサシン（Ｏｚｅｘ、Ｔｏｓａｃｉｎ）、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン（Ｚｉｇａｔ、Ｔｅｑｕｉｎ、Ｚｙｍａｒ－ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、モキシフロキサシン（Ａｖｅｌｏｘ、Ｖｉｇａｍｏｘ）、シタフロキサシン（Ｇｒａｃｅｖｉｔ）、プルリフロキサシン（Ｑｕｉｓｎｏｎ）、ベシフロキサシン（Ｂｅｓｉｖａｎｃｅ）、デラフロキサシン（Ｂａｘｄｅｌａ）、ゲミフロキサシン（Ｆａｃｔｉｖｅ）およびトロバフロキサシン（Ｔｒｏｖａｎ）、オゼノキサシン、ダノフロキサシン（Ａｄｖｏｃｉｎ、Ａｄｖｏｃｉｄ）、ジフロキサシン（Ｄｉｃｕｒａｌ、Ｖｅｔｅｑｕｉｎｏｎ）、エンロフロキサシン（Ｂａｙｔｒｉｌ）、イバフロキサシン（Ｉｂａｆｌｉｎ）、マルボフロキサシン（Ｍａｒｂｏｃｙｌ、Ｚｅｎｅｑｕｉｎ）、オルビフロキサシン（Ｏｒｂａｘ、Ｖｉｃｔａｓ）、およびサラフロキサシン（Ｆｌｏｘａｓｏｌ、Ｓａｒａｆｌｏｘ、Ｓａｒａｆｉｎ）；マクロライド（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンＡ、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン／酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）／タイロシン（ｔｙｌｏｃｉｎｅ）、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、セスロマイシン、ソリスロマイシン、タクロリムス、ピメクロリムス、シロリムス、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、およびクルエンタレン）；スルホンアミド（例えば、スルホンアミド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファフラゾール（スルフィソキサゾール）、スルフィソミジン（スルファイソジミジン）、スルファメトキサゾール、スルファモキソール、スルファニトラン、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリダジン、スルファメトキシジアジン、スルファドキシン、スルファメトピラジン、およびテレフチル）；アミノグリコシド（例えば、カナマイシンＡ、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、Ｃ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）、ストレプトマイシン、プラゾマイシン、アミキン、ガラマイシン、カントレックス、ネオフラジン、ネトロマイシン、ネブシン、ｈｕｍａｔｉｎ、スペクチノマイシン（Ｂｓ）、およびトロビシン）；カルバペネム（例えば、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、テビペネム、ラズペネム（ＰＺ－６０１）、レナペネム、トモペネム、およびチエナマイシン（ｔｈｉｅｎｐｅｎｅｍ））；アンサマイシン（例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、およびキシファクサン）；カルバセフェム（例えば、ロラカルベフおよびｌｏｒａｂｉｄ）；カルバペネム（例えば、エルタペネム、ｉｎｖａｎｚ、ドリペネム、ドリバックス、イミペネム／シラスタチン、プリマキシン、メロペネム、およびｍｅｒｒｅｍ）；糖ペプチド（例えば、テイコプラニン、タゴシッド、バンコマイシン、ｖａｎｃｏｃｉｎ、テラバンシン、ヴィバティブ、ダルババンシン、ｄａｌｖａｎｃｅ、オリタバンシン、およびｏｒｂａｃｔｉｖ）；リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、クレオシン、リンコマイシン、およびリンコシン）；リポペプチド（例えば、ダプトマイシンおよびキュビシン）；マクロライド（例えば、アジスロマイシン、ジスロマック、ｓｕｍａｍｅｄ、ｘｉｔｈｒｏｎｅ、クラリスロマイシン、ｂｉａｘｉｎ、ジリスロマイシン、ｄｙｎａｂａｃ、エリスロマイシン、ｅｒｙｔｈｏｃｉｎ、ｅｒｙｔｈｒｏｐｅｄ、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、ｔａｏ、テリスロマイシン、ｋｅｔｅｋ、スピラマイシン、およびｒｏｖａｍｙｃｉｎｅ）；モノバクタム（例えば、アズトレオナムおよびａｚａｃｔａｍ）；ニトロフラン（例えば、フラゾリドン、ｆｕｒｏｘｏｎｅ、ニトロフラントイン、ｍａｃｒｏｄａｎｔｉｎ、およびｍａｃｒｏｂｉｄ）；オキサゾリジノン（例えば、リネゾリド、ｚｙｖｏｘ、ｖｒｓａ、ｐｏｓｉｚｏｌｉｄ、ｒａｄｅｚｏｌｉｄ、およびｔｏｒｅｚｏｌｉｄ）；ポリペプチド（例えば、バシトラシン、コリスチン、コリマイシンＳ（ｃｏｌｙ－ｍｙｃｉｎ－Ｓ）、およびポリミキシンＢ）；マイコバクテリアに対する薬物（例えば、クロファジミン、ｌａｍｐｒｅｎｅ、ｄａｐｓｏｎｅ、ａｖｌｏｓｕｌｆｏｎ、カプレオマイシン、ｃａｐａｓｔａｔ、サイクロセリン、ｓｅｒｏｍｙｃｉｎ、エタンブトール、ｍｙａｍｂｕｔｏｌ、エチオナミド、ｔｒｅｃａｔｏｒ、イソニアジド、Ｉ．Ｎ．Ｈ．、ピラジナミド、ａｌｄｉｎａｍｉｄｅ、リファンピシン、ｒｉｆａｄｉｎ、ｒｉｍａｃｔａｎｅ、リファブチン、ｍｙｃｏｂｕｔｉｎ、リファペンチン、ｐｒｉｆｔｉｎ、およびストレプトマイシン）；および他の抗生物質（例えば、アルスフェナミン、ｓａｌｖａｒｓａｎ、クロラムフェニコール、ｃｈｌｏｒｏｍｙｃｅｔｉｎ、ホスホマイシン、ｍｏｎｕｒｏｌ、ｍｏｎｕｒｉｌ、フシジン酸、ｆｕｃｉｄｉｎ、メトロニダゾール、ｆｌａｇｙｌ、ムピロシン、ｂａｃｔｒｏｂａｎ、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ｓｙｎｅｒｃｉｄ、チアンフェニコール、チゲサイクリン、ｔｉｇａｃｙｌ、チニダゾール、ｔｉｎｄａｍａｘ、ｆａｓｉｇｙｎ、トリメトプリム、ｐｒｏｌｏｐｒｉｍ、およびｔｒｉｍｐｅｘ）；アジュバント（アルミニウム塩（アラム）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどを含む）；水中油型エマルジョン製剤；（サポニンアジュバント；フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；細菌ＡＤＰ－リボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ））の無毒化変異体；ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド；ならびに他の免疫刺激分子；およびワクチン、例えば、結核、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型、コレラ、腸チフス、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するワクチン、および細菌に対する免疫応答をブーストするための細菌抗原性タンパク質または弱毒化もしくは死細菌を含む他のワクチン、または臨床医の判断、患者の必要性などに応じて様々な投薬スケジュール

に従って特定の状態または疾患を治療するために使用される他の医薬を含むがこれらに限定されない感染症を治療するための他の薬剤との組み合わせで投与され得る。特定の投薬スケジュールは、当業者によって既知であるか、または日常的な方法を使用して実験的に決定され得る。例示的な投薬スケジュールとしては、１日に５回、１日に４回、１日に３回、１日２回、１日１回、１週３回、１週２回、１週１回、１月２回、１月１回、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい組成物は、１日に１回以下の投薬を必要とするものである。
ナノ粒子は、他の薬剤の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。他の薬剤と同時に提供される場合、ナノ粒子は、同じまたは異なる組成物中で提供され得る。したがって、ナノ粒子および１つ以上の他の薬剤は、同時療法によって個体に提示され得る。「同時療法」によって、物質の組み合わせの治療効果が、療法を受けている対象において引き起こされるような対象への投与が意図される。例えば、同時療法は、特定の投薬レジメンに従って、組み合わせで治療有効用量を含む、ナノ粒子を含む医薬組成物の用量と、少なくとも１つの他の薬剤（例えば、感染症を治療するための別の薬物）を含む医薬組成物の用量とを投与することによって達成され得る。同様に、ナノ粒子および１つ以上の他の治療剤は、少なくとも１つの治療用量で投与され得る。これらの物質の組み合わせの治療効果が、療法を受けている対象において引き起こされる限り、別個の医薬組成物の投与は、同時にまたは異なる時点で（すなわち、順次、いずれかの順序で、同じ日に、または異なる日に）行われ得る。
キット
キットは、機能化されたナノ粒子を含む本明細書に記載される組成物、またはそのような組成物を調製するための試薬、および、任意選択で、細菌感染症を治療するための１つ以上の抗生物質の、１つ以上の容器を含み得る。組成物は、液体形態であり得るか、または凍結乾燥され得る。組成物のための好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む様々な材料から形成され得る。容器は、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む容器をさらに含み得る。それはまた、緩衝液、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジまたは他の送達デバイスなどの他の薬学的に許容される製剤化溶液を含む、エンドユーザーに有用な他の材料を含有し得る。キットはまた、機能化されたナノ粒子が予め充填された送達デバイスを提供し得る。
上記の構成要素に加えて、主題のキットは、（特定の実施形態では）主題の方法を実施するための説明書（すなわち、本明細書に記載されるようにナノ粒子を用いて細菌感染症を治療するための説明書）をさらに含み得る。これらの説明書は、様々な形態で主題のキット内に存在し得、そのうちの１つ以上が、キット内に存在し得る。これらの説明書が存在し得る１つの形態は、例えば、情報が印刷される１枚または複数枚の紙などの好適な媒体または基板上、キットのパッケージ中、添付文書などの中の印刷情報としてである。これらの説明書のさらに別の形態は、それに情報が記録されているコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、ＤＶＤ、ブルーレイ、フラッシュドライブなどである。存在し得る、これらの説明書のさらに別の形態は、隔たったサイトで情報にアクセスするために、インターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。
本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がなされ得ることは当業者に明白である。
実験
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製および使用方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が行われるすべてまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に対する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別様に示されない限り、部とは重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
本明細書で引用されるすべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、本発明の実施のための好ましいモードを含むように、本発明者によって見出されるか、または提供される特定の実施形態に関して説明されている。当業者は、本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態で多数の修正および変更を行うことができることを理解されたい。例えば、コドン冗長性によって、タンパク質配列に影響を与えることなく、基礎となるＤＮＡ配列の変更を行うことができる。生物学的機能的等価性を考慮することによって、種類または量において生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造の変更を行うことができる。かかる修正はすべて、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
実施例１
操作された金ナノクラスターはバイオフィルム形成に関連する薬物不応性状態を克服する
生残細胞を標的とする課題は、細胞傷害に対するその異なる応答および改善された修復メカニズムによって強調される。殺菌性抗生物質は、一般に、活性酸素種（ＲＯＳ）、特にヒドロキシルラジカル（ＨＯ●）を誘導し、細胞死に導く１２、１３。しかしながら、生残細胞は、ＨＯ●ラジカルを産生しないことによって、ＲＯＳストレスに応答する。代わりに、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性は、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２ ●－）を過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に変換し、これは最終的に、カタラーゼによって水（Ｈ２Ｏ）に変換される１４。抗生物質がこの防御の最前線をバイパスすると、ＤＮＡ修復メカニズムは、生残細胞が生存することを可能にする１５。本発明者らは、生残細胞における損傷ＤＮＡの修復を有効にブロックし、同時に、Ｈ２Ｏ２の触媒分解からのＨＯ●ラジカル産生を増加させることができる材料は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム関連生残細胞に対する従来の抗生物質の活性を回復させるかまたは強化すると仮定した。
ここで、本発明者らは、ケア抗生物質の標準である３０００μｇ／ｍＬのＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃと比較して、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの臨床分離株のインビトロバイオフィルムを治療する新規の操作された金ナノクラスター（ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ）の能力を実証し、そしてＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム慢性疾患の検証されたインビボモデルを使用した。この方法を使用した生残細胞の標的化の成功は、多くの慢性バイオフィルム感染性疾患を根絶する能力を増加させ、一般に使用される抗生物質の耐性プロファイルを回復させ、抗菌薬耐性の発達の可能性を低減させる。
オフロキサシンは耳病原性Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのインビトロバイオフィルムを根絶することができない
局所投与を通じて高い抗生物質の濃度を送達することは、バイオフィルム中の問題の細菌病原体を治療するために提唱される治療ストラテジーである１６。この仮説を検証するために、本発明者らは、抗生物質感受性野生型参照株ＰＡ０１およびＣＳＯＭ患者から単離された臨床耳病原性株（ＰＡ ＣＳＯＭ）を含むＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの２つの株を使用した。バイオフィルムをフルオロキノロンでチャレンジした。なぜなら、それは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって引き起こされる感染症を治療するために一般に使用されており、ＣＳＯＭにおけるケアの現在の標準であり１７～１９、増殖中の細胞および非増殖細胞の両方を死滅させることにおいて有効な唯一の利用可能な抗生物質であり２０、それは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム中に拡散することに制限を有しないからである２１。細菌バイオフィルム（高密度細胞クラスターおよび粘着性バイオフィルムマトリックス）の拡散バリアが、フルオロキノロン攻撃に対する防御において些細な役割を果たすことを実証するために、まず、ＰＡ ＣＳＯＭおよびＰＡ０１のバイオフィルム形成能力を比較した。正規化されたバイオフィルムマトリックス値（５９５ｎｍにおけるクリスタルバイオレット染色バイオフィルム吸光度、Ａ５９５／総細胞増殖、６００ｎｍにおける光学密度、ＯＤ６００）によってバイオフィルム形成能力を定量化した。本発明者らは、ＰＡ０１が最も高いバイオフィルム産生体であることを見出した（図１Ａ）。ＰＡ０１およびＰＡ ＣＳＯＭに対するオフロキサシンの最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、それぞれ１．６～３．３μｇ／ｍＬおよび５２．５～１００μｇ／ｍＬであった。オフロキサシンに対するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのインビトロ耐性は、ＭＩＣ＞８μｇ／ｍＬとして定義されており（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１２，２５，５４５－５８２）、このことは、ＰＡ ＣＳＯＭがフルオロキノロン耐性株であることを示唆する。
次いで、４８時間齢のＰＡ０１およびＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムに対するＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃの最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）を、市販のＭＢＥＣ Ａｓｓａｙ（登録商標）（Ｉｎｎｖｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を使用して決定した。この新たな技術は、バイオフィルム細菌に対する抗菌療法の臨床的失敗および臨床的成功を予測するために有用である２２、２３。このアッセイにおいて、インキュベートした回収培地が、６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６５０）≦０．１を有するか、またはＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）寒天プレート上にスポットされたときに細菌の再増殖を有しない場合に、ＭＢＥＣが特定される（図７）。本発明者らの結果は、オフロキサシンが、４８時間齢のＰＡ０１バイオフィルムに対して、７５０μｇ／ｍＬのＭＢＥＣを有する（ＯＤ６５０≦０．１）ことを示す（図１Ｂ）。 この知見は、２４時間齢のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株（ＡＴＣＣ ２７８５３）バイオフィルムに対する６４０μｇ／ｍＬのＭＢＥＣを報告したＭａｓａｄｅｈのものと一致する２４。ＰＡ０１についての結果とは逆に、市販調製物（ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃ）中の濃度である３０００μｇ／ｍＬのオフロキサシンでの処理後に、４８時間齢のＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムの根絶は得られなかった。試験したすべての濃度からのインキュベートした回収培地は、ＯＤ６５０＞０．１を示した（図１Ｃ）。４８時間齢のＰＡ０１およびＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムに対するオフロキサシンのＭＢＥＣを確認するために、回収培地をＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）寒天プレート上にスポットし、３７℃で４８時間インキュベートした。写真（図１Ｄ）に示すように、３０００μｇ／ｍＬのオフロキサシンで処理した４８時間齢のＰＡ ＣＳＯＭの回復後の細菌増殖と比較して、４８時間齢のＰＡ０１バイオフィルムの７５０μｇ／ｍＬのオフロキサシンでの処理は生存細胞を残さなかった。ＰＡ ＣＳＯＭは、ＰＡＯ１よりも定量的に少ないバイオフィルムを産生したが、それは、オフロキサシンに対する最も高い耐容性を有した。ＰＡＯ１が、ＰＡ ＣＳＯＭよりも多くのバイオフィルムを産生したが、それでもオロキサシンに対してずっと高い感受性を有したことを考慮して、本発明者らは、バイオフィルムの拡散バリアは、フルオロキノロンに対する防御において些細な役割を果たすと結論付けた。本発明者らは、本発明者らが後に精査するように、生残細胞の画分が、フルオロキノロンに対する耐容性を調節する重要なパラメータであると仮定した。注目すべきことに、持続性化膿性分泌物を有するＣＳＯＭ患者の耳漏におけるオフロキサシンの最大濃度は、ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃの局所投与後３０分で３８８．８～２８４９．８μｇ／ｍＬの範囲であった２５。高い局所レベルのオフロキサシン（≧４×ＰＡ ＣＳＯＭのＭＩＣ）は、フルオロキノロン耐性Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ集団のすべてを死滅させる。ＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムに対するオロキサシンのインビトロ殺菌活性は、ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃが、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのこの臨床耳病原性株に感染した耳漏からの生残細胞を根絶せず、患者を再発の継続しているリスクに置いたままにすることを示唆する。本発明者らの結果は、局所投与による高濃度のオフロキサシンの送達は、問題の細菌バイオフィルムを治療するための有効なストラテジーではないことを強調している。
生残細胞の画分の増加はオフロキサシンに対するバイオフィルム耐容性を促進する
オフロキサシンが≧１００μｇ／ｍＬで使用される場合、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムの生存は、排出ポンプの存在などの薬物耐性メカニズムに依存しない２６。ＰＡ ＣＳＯＭが、３０００μｇ／ｍＬで使用した場合にオフロキサシンに対して耐性でないことを示すために、生存生残細胞のプランクトン性対数期培養物を、１００μｇ／ｍＬのオフロキサシンでチャレンジした（図８）。本発明者らは、オフロキサシン処理の後、１ミリリットル当たりの細菌の数（ＣＦＵ／ｍＬ）が３ｌｏｇ１０減少することを見出した（図２）。この結果は、増殖が再開されると、ＰＡ ＣＳＯＭの生残細胞は、オフロキサシンに対して感受性である生存子孫を生じさせることを示唆する。ＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルム形成に関連する薬物不応性状態は、抗生物質に対する耐性ではなく、耐容性によって媒介される。
生残細胞の高い画分が、３０００μｇ／ｍＬのオフロキサシンがＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムを根絶することができない主な理由であるという本発明者らの仮説を確認するために、ＰＡ ＣＳＯＭおよびＰＡ０１の生残細胞形成能力を比較した。本発明者らは、ＰＡ０１の対数培養物が、総細菌集団の０．０００５％に等しい生残細胞の小さな画分を産生することを見出し（図２）、これは、以前に報告されたものと類似している２７。これと比較すると、ＰＡ ＣＳＯＭの対数培養物は、０．０７％に等しい生残細胞の大きな画分を産生した（ＰＡ０１と比較して１４０倍の増加）（図２）。臨床分離株における生残細胞の画分の増加は、オフロキサシンに対する耐容性を促進する。
高レベルの生残細胞を産生するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株（高生残変異体と称する）は、嚢胞性線維症患者における抗生物質治療の過程で選択されることが示されている２８。ＣＳＯＭが一般に複数のコースの局所フルオロキノロン治療によって治療されることを考慮して、本発明者らは、同じパラメータによって評価したＰＡ ＣＳＯＭが、同じプロセスによって選択された高生残変異体でありそうであると結論付ける。
ＡｕＮＣ＠ＣＰＰはバイオフィルム形成に関連する薬物不応性状態を克服する
上記で実証されるように、４８時間齢のＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムは、市販の調製物（ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃ）における濃度である３０００μｇ／ｍＬのオフロキサシンに対して耐容性であった。このことは、粘膜ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃ濃度が局所投与後に検出不可能から６０２μｇ／ｍＬまでの範囲である２５ＣＳＯＭ患者における中耳粘膜において適切な濃度を達成することの治療上の課題を強調する２９。その結果、本発明者らは、オフロキサシンのＭＢＥＣを臨床的に達成可能な範囲に低下させることができるナノ材料を開発するアプローチを設計する必要があった。本発明者らは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ 配列番号７）－（β－アラ）３－シス－アミドおよびチオール化ポリエチレングリコールをカルボキシル末端（溶液中ならびに生物システム中でＡｕＮＣ＠ＣＰＰに良好な安定性を付与する効率的な保護リガンド）とともに含む金ナノクラスター（ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ）を操作した。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルは、ＵＶから可視への単調な減少を示したが、５２０ｎｍでの表面プラズモン共鳴ピークはなく、超微粒子（コア径≦２ｎｍ）の形成を示す３０（図９Ａ）。
オフロキサシンの最小殺菌濃度（ＭＢＣ）（薬物の除去後に細菌増殖をもたらさなかった最低濃度として定義される）は、感受性株Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ ２７８５３）に対して５μｇ／ｍＬとして報告されている２４。注目すべきことに、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ単独で、４８時間齢のＰＡ０１バイオフィルムに対して１６００μｇ／ｍＬのＭＢＥＣを示す（ＯＤ６５０≦０．１）（図１０）。本発明者らは、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰが、４８時間齢のＰＡ０１およびＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムに対するオフロキサシンのＭＢＥＣを、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３に対してそれぞれ１ｘＭＢＣおよび２ｘＭＢＣに等しい濃度のオフロキサシンまで低下させることを実証した。写真（図３）に示すように、４８時間齢のＰＡ ＣＳＯＭバイオフィルムの、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ（８００μｇ／ｍＬ）単独、３０００μｇ／ｍＬでのオフロキサシン、およびＡｕＮＣ＠ＣＰＰ＋５μｇ／ｍＬのオフロキサシンの組み合わせでの処理は、バイオフィルムおよび関連する生残細胞を根絶しなかった。驚くことに、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰと１０μｇ／ｍＬのオフロキサシンとの組み合わせは、生存細胞を残さない（ＭＢＥＣの＞３００倍の低減）。同様に、４８時間齢のＰＡ０１バイオフィルムの、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ＋５μｇ／ｍＬのオフロキサシンでの処理は、生存細胞を残さない（ＭＢＥＣの１５０倍の低減）。総合すると、これらの知見は、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰが、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムおよび関連する生残細胞に対するオフロキサシンの活性を回復させるかまたは強化することを強調し、このことは、合成ナノテクノロジーを利用することによって、既存の薬物についてさえも、得られるものが多く存在することを示す。
生体適合性評価
インビボに移る前に、細胞傷害性は、インビボでの治療用化合物の有害作用の可能性を評価する上で重要な因子である。本発明者らは、業界標準のＭＴＴ生存率アッセイを使用して、腺がんヒト肺胞基底上皮細胞（Ａ５４９細胞）に対するＡｕＮＣ＠ＣＰＰの細胞傷害性を試験した。本発明者らは、細胞が、３２００μｇ／ｍＬのＡｕＮＣ＠ＣＰＰへの直接曝露に際して９０％超の生存率を示すことを見出した（図１１）。さらに、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの経口投与は、１４日間の１日１０ｍｇ／ｋｇ（または１０００μｇ／ｍＬ）の用量での経口胃管栄養法による投与の後３５日までの健常マウスにおいて示されるように、全身毒性についての、または胃腸疾病の誘導における懸念ではなさそうである。体重減少における統計学的有意性は、ＰＢＳ（対照）とＡｕＮＣ＠ＣＰＰとの間、または異性間で見られなかった（図１２）。加えて、観察の間に糞便形態の顕著な変化は存在しなかった。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、血液学的なまたは肝臓および腎臓の機能の有意な変化を促さない（表２および３）。ほぼすべての臓器対体重比に変化は存在しなかった（図４Ｃ～４Ｈ）。心臓対体重比は、雄性処置ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ群において有意に増加した（図４Ｅ）。本発明者らは、これを毒性であるとはみなさなかった。なぜなら、それは病理組織学的データを裏付けないからである３１。
ＰＢＳ（対照）および処置ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ群の臓器の切片の光学顕微鏡検査は、正常な組織学およびいかなる肉眼所見病変も存在しないことを示した（図４）。毒性がより高い用量で生じるか否か、または有害作用の限界が存在しないかどうかを決定するためには、漸増する曝露時間および用量のさらなる研究が必要である。
抗シュードモナス療法Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標）Ｏｔｉｃ＋ＡｕＮＣ＠ＣＰＰはＣＳＯＭのマウスモデルにおいてＦｌｏｘｉｎ（登録商標）Ｏｔｉｃ単独よりも優れている
この治療アジュバントの臨床的関連性を決定するために、Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標）Ｏｔｉｃのインビボ効力を、Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標）Ｏｔｉｃ＋ＡｕＮＣ＠ＣＰＰのものと比較した。本発明者らは、３１００万の症例の発生および＞３億の患者数の、発展途上国における小児の聴力損失の主な原因としてのその重大な世界的負担を考慮して、ＣＳＯＭをＰ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム関連感染症のインビボモデルとして選択した３２、３３、３４。ＣＳＯＭには現在治癒がなく、末期の疾患は手術で終了し、これは資源が、多くの場合、限られているかまたは存在しない場合に利用可能でない３５。本発明者らは、最近、潜在的な治療薬を試験するためのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＣＳＯＭのマウスモデルを開発および検証した。本発明者らのインビボ研究の最初のエンドポイントは、処置停止の１４日後の中耳の滲出液からの細菌コロニーのレベルであった。処置レジメンを、診療所において既に処方されているものを模倣するように選択した。処置を、ＣＳＯＭを作製するために接種を行った１４日後に開始した。８μＬの液滴を１４日間連続で１日に２回外耳道内に入れた。インビボ研究のために使用したＡｕＮＣ＠ＣＰＰ濃度は、ＰＡ０１バイオフィルムに対するＭＢＥＣ（１６００μｇ／ｍＬ）よりも５．４倍低いので、プラセボ対照群（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）、ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃ（２４μｇのオフロキサシン）、および組み合わせ（２４μｇのオフロキサシン＋２９６μｇのＡｕＮＣ＠ＣＰＰ）を含む、３つの腕を用いた優位性研究を行った。ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃの投与は、処置停止の１４日後の中耳滲出液における生存カウントを減少させた（図５および表１）。しかしながら、このモデルにおいてＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃで処置したマウスとプラセボ対照（ＰＢＳ）で処置したマウスとの間に注目すべき差は観察されず、このことは、ケアの現在の標準は、一旦治療が停止されると、臨床的利益を維持しなかったことを示唆する。ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）ＯｔｉｃとＡｕＮＣ＠ＣＰＰとの組み合わせは、ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃ単独と比較して、生存数の有意な減少（２．５４±０．５１対７．６９±０．２６ ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍＬおよびｐ＜０．０５）（５ｌｏｇを上回る低減の利益）に導いた（図５および表１）。この結果は、ナノテクノロジーがバイオフィルム形成に関連する薬物不応性状態を克服するために提供する刺激的な機会を示す。一言で言えば、これらの知見は、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ＋フルオロキノロンの組み合わせが、慢性バイオフィルム感染症を有効に治療する新たな方法に導き得ることを示す。最大インビボ効力のための最適な用量およびスケジュールを決定するために、さらなる研究が計画されている。
ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ作用のメカニズム
Ｐ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム中に包埋された細菌細胞は、ｐＨ値が４．５に近い高度に酸性のニッチを産生する。本発明者らのデータは、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰが酸性のｐＨ４．５で、Ｈ２Ｏ２のＨＯ●への分解を触媒し、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の酸化をもたらして、青色溶液を生じさせる、ペルオキシダーゼ様活性を示すことを実証する（図６Ａ）。ＤＮＡ損傷に対する細菌応答（ＳＯＳ応答として知られる）は、（ｉ）ＲｅｃＡタンパク質活性化、（ｉｉ）ＬｅｘＡリプレッサーの自己触媒切断、および（ｉｉｉ）ＤＮＡの修復に必要とされるＳＯＳ遺伝子の抑制解除の３段階で生じる３６。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰがＤＮＡ修復をブロックすることを示すために、本発明者らは、まず、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰがＲｅｃＡタンパク質活性化を阻害する能力を評価した。ＡＴＰａｓｅ活性をモニターすることは、ＲｅｃＡ阻害薬物のインビトロスクリーニングのための方法として使用され得る３７、３８。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、ＲｅｃＡ ＡＴＰ加水分解活性を阻害することができる。
考察
破壊または分散は、バイオフィルム疾患のための一般的に追求される治療ストラテジーである３９～４１。バイオフィルムの分散は、インビボで負の帰結を有し得る。いずれのストラテジーも、分散された細胞を標的とすることができる活性剤と慎重に協調される必要がある。分散されたバイオフィルム細胞は、バイオフィルムからプランクトン性ライフスタイルへの移行における異なる段階を表し、プランクトン性の非バイオフィルム細胞と比較して、マクロファージに対して高度に毒性である４２。このアプローチにおける臨床的リスクの注意は、可動性バイオフィルム細菌のインビボ分散が、マウス創傷モデルにおいて抗生物質療法の非存在下で致命的な敗血症を引き起こすことが示されていることである４３。さらに、その表現型をバイオフィルムからの離脱後数日間または数週間保持する生残細胞が直接的に対処されなければ、慢性感染症サイクルは継続する４４、４５。したがって、抗生物質による死滅を強化するためのバイオフィルムの分散を含む臨床使用アプローチは、制御不能な感染症のリスクを増加させ、患者を重篤な後遺症にさらし得る。
本発明者らは、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰがこの治療チャレンジの潜在的な解決であることを実証する。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、ペルオキシダーゼ様活性を活用して、ＳＯＤ活性によって生残細胞において産生されるＨ２Ｏ２の触媒分解を通じてＨＯ●産生を増強する。ＨＯ●ラジカルの産生の増加の他に、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰはまた、ＲｅｃＡ ＡＴＰａｓｅ活性およびＲｅｃＡのＬｅｘＡ切断活性の阻害を通じてＤＮＡ修復をブロックする。したがって、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、生存のためにＳＯＳ応答を必要とする細菌を標的とする相乗ＤＮＡ損傷剤に広く有益であり得、これは、他の細菌に適用可能であり得る死滅の一般原理である。ＦＤＡが承認したフルオロキノロン（モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、オフロキサシン、およびフィナフロキサシンを含む）のいずれがＡｕＮＣ＠ＣＰＰと一緒に同時投与するための最良のものとして作用するか否かは未だ規定されていない。
現在の抗生物質危機の別の態様は、より高い最小阻止濃度（ＭＩＣ）によって特徴付けられる薬物耐性である。最近、ＲｅｃＡは、複数の抗生物質のＭＩＣを低下させるための重要な標的として検証されている４６。例えば、ＲｅｃＡが欠損しているＥ．ｃｏｌｉ株は、野生型と比較して、マイトマイシンＣ、レボフロキサシン、およびノボビオシンに対する感受性の増加（ＭＩＣの４～３２倍の低減）を示す４６。さらに、ＲｅｃＡノックアウト株は、野生型と比較して、複数の抗生物質に対する変異率のより大きな低減を示した４６。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、ＲｅｃＡ阻害剤であるので、耐性細菌に対する抗生物質のＭＩＣを低下させるために開拓される可能性を有しているか、または複数の抗生物質に対する獲得薬物耐性を遅延させることができそうである。このように、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの使用は、抗菌剤耐性に対するアプローチにおける最前線のアジュバントとしての可能性を有する。
方法
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の合成
Ａｃ－（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ 配列番号７）－（β－アラ）－（β－アラ）－（β－アラ）－シス－ＣＯＮＨ２（ＣＰＰ）を、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＮｏｖａＰＥＧ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂上での標準的なフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって０．２５ｍｍｏｌスケールでＡＢＩ ４３３Ａ自動ペプチド合成装置を使用して合成した。反応を、１当量のＨＴＢＵおよびＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅおよび２当量のＤＩＥＡで触媒した４倍過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸を利用して実施した。カップリング時間は１時間であった。すべてのアミノ酸残基を機械的にカップリングした後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅおよび無水酢酸を添加することによって、アセチル基をＮ末端に手動でカップリングし、室温で１時間振盪した。ペプチジル樹脂を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄し、次いで、乾燥させた。ペプチジル樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／フェノール／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／水（９２．５：２．５：２．５：２．５）で３時間処理した。切断カクテル溶液を蒸発によって除去し、ペプチドを冷ジエチルエーテルによって沈殿させた。ペプチドを、Ｗａｔｅｒｓシステムを使用して逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製した。分子量を、Ｖｏｙａｇｅｒ－ＤＥ ＲＰ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ機器を使用してＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって決定した。
ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの合成
新鮮に調製したＨＡｕＣｌ４の水溶液（２０ｍＭ、１ｍＬ）およびチオールチオカルボキシポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ－ＣＯＯＨ、１８ｍｇ、２ｍＬ）およびＣＰＰ（１８ｍｇ、２ｍＬ）を水（１３．４ｍＬ）中で混合した。その後、ＮａＯＨ水溶液（１Ｍ、１．２ｍＬ）を混合物に添加した。４３ｍｇのＮａＢＨ４を２ｍＬのＮａＯＨ溶液（１Ｍ）に溶解し、続いて８ｍＬの超純水を添加することによって、新鮮に調製したＮａＢＨ４溶液（１１２ｍＭ）を得た。その後、０．４ｍＬのＮａＢＨ４溶液を添加し、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰを２４時間後に収集した。合成後、溶液をＭｉｌｌｉ－Ｑ水（非コンジュゲートチオールＰＥＧ－ＣＯＯＨおよびＣＰＰを除去するために８時間ごとに変えた）に対して２日間透析した（透析膜、ＭＷＣＯ＝１０００）。得られたＡｕＮＣ＠ＣＰＰを凍結乾燥し、さらなる使用の前に完全に乾燥させた。ＵＶ－ｖｉｓ（紫外可視）吸収測定を、吸光度計（ｓｐｅｃｔｒａｍＭａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用して実施した。
細菌株、増殖培地、および条件
抗生物質感受性野生型参照株ＰＡ０１およびＣＳＯＭ患者から単離された臨床耳病原性株（ＰＡ ＣＳＯＭ）を含むＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの２つの株を使用した。すべての実験において、細菌細胞を、１０ｍＬのＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中３７℃で培養し、５０ｍＬチューブプラスチック（ポリプロピレン）中２２５ｐ．ｒ．ｍで通気した。指数期培養物を以下のように調製した。静止一晩培養物をＬＢ中で１：１，０００希釈し、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）＝０．３に達するまで、２２５ｒ．ｐ．ｍ．の通気で３７℃でインキュベートした。
バイオフィルム形成の定量化
バイオフィルムを以下のように調製した。各々ＰＡ０１およびＰＡ ＣＳＯＭの静止一晩培養物を、１５０μｌのＬＢ培地を含有する９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に接種した。接種したプレートを２４時間振盪することなく３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、増殖を、マイクロプレートリーダー（ｓｐｅｃｔｒａｍＭａｘ Ｍ２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用して６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）として確認し、その後、各ウェルからＬＢを除去し、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすいで、プランクトン性細胞を除去した。クリスタルバイオレット（ＣＶ）溶液（０．１％、ｗ／ｖ）をアプライし、マイクロタイタープレートを室温で１０分間インキュベートし、続いてＰＢＳ洗浄して、過剰のＣＶを除去した。１０％酢酸を各ウェルに添加して、ＣＶ染色を抽出した。マイクロプレートリーダーを使用して、ＣＶ染色の吸光度を５９５ｎｍで読み取った（Ａ５９５）。結果を、総細胞増殖（ＯＤ６００）に対するＣＶ染色（バイオフィルムマトリックス、Ａ５９５）の比として分析した。
生残性アッセイ
ＰＡ０１およびＰＡ ＣＳＯＭ培養物を振盪しながら３７℃でインキュベートした。各株からの１ｍＬの培養物を、０．３のＯＤ６００に達したときにアリコートに分けた。培養物を穏やかにすすいで、ＬＢ培地を除去し、１ｍＬのＰＢＳに置き換えた。オフロキサシン（１００μｇ／ｍＬ）を培養フラスコ（対照フラスコを除いて）に添加した。２４時間のインキュベーション後、オフロキサシンを除去し、１ミリリットル当たりのコロニー形成単位の数（ＣＦＵ／ｍＬ）を決定した。生残細胞のすべてが再増殖することを確実にするために、細菌細胞を４８時間インキュベートすることが重要である。生残細胞の画分を、対照フラスコのＣＦＵ／ｍＬに対するオフロキサシン処理後のＣＦＵ／ｍＬの比として計算した。
バイオフィルム根絶アッセイ
ＰＡ０１またはＰＡ ＣＳＯＭのいずれかの一晩培養物を、新鮮なＬＢ培地中で１：１，０００希釈し、１ウェルあたり１５０μＬの希釈液を、９６ウェルを有するＭＢＥＣ Ａｓｓａｙ（登録商標）Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｏｃｕｌａｔｏｒ中に添加した。バイオフィルムを、振盪することなく４８時間、ペグ蓋中に発達させた。ペグ蓋を穏やかにすすいで、プランクトン性細菌を除去し、ＰＢＳ中の試験溶液の段階希釈液を含有する９６ウェルを有する新たなＭＢＥＣ Ａｓｓａｙ（登録商標）Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｏｃｕｌａｔｏｒ中でインキュベートした。これらの９６ウェルを有するＭＢＥＣ Ａｓｓａｙ（登録商標）Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｏｃｕｌａｔｏｒを２４時間インキュベートした。次いで、ペグ蓋を洗浄し、新鮮な培地（回収培地）を含有する９６ウェルを有する新たなＭＢＥＣ Ａｓｓａｙ（登録商標）Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｏｃｕｌａｔｏｒ中で１５分間超音波処理した。４８時間のインキュベーション後、６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６５０）を、マイクロプレートリーダー（ｓｐｅｃｔｒａｍＭａｘ Ｍ２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用して読み取った。０．１未満のＯＤ６５０のウェルは、バイオフィルム根絶の証拠である。ＭＢＥＣ値を、バイオフィルムを根絶する（ＯＤ６５０＞０．１）薬物の最低濃度として定義した。ＭＢＥＣを確認するために、５μＬの回収培地を、ＬＢ寒天プレート上にスポットし、３７℃で４８時間振盪することなくインキュベートした。
細胞培養およびインビトロ細胞傷害性アッセイ
ヒト肺腺がん細胞株（Ａ５４９）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリンを補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で維持した。細胞を、増殖のために３７℃で加湿した５％ＣＯ２中でインキュベートした。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰによって誘導される細胞傷害性を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって精査した。Ａ５４９細胞（２×１０４／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）を、９６ウェルプレート中に播種した。２４時間後、細胞培養物を、０μｇ／ｍＬ～３２００μｇ／ｍＬの範囲の濃度のＡｕＮＣ＠ＣＰＰ（ＡｕＮＣ＠ＣＰＰをＤＭＥＭ中に分散させた）に曝露した。２４時間のインキュベーション後、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰを含有する培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮な細胞培養培地とともにさらに２４時間インキュベートした。次いで、２０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で加湿した５％ＣＯ２中で４時間インキュベートした。培地を慎重に除去し、２００μｇ／Ｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加して、ホルマザン結晶を溶解した。ホルマザンの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して５９５ｎｍで読み取った。ブランク溶液（０μｇ／ｍＬのＡｕＮＣ＠ＣＰＰ）を試験し、細胞傷害性は観察可能でなかった。３回の独立した実験および４つの複製物を行った。結果を、生存率（未処理対照の％）の平均±標準偏差（ＳＤ）として分析した。
インビボ毒性評価
すべての動物の作業は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ’ｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅによって承認された。１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）から購入し、１２時間の暗／明サイクルで維持された部屋で食物および水が自由提供される標準的なガイドラインに従ってＳｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物資源施設において収容した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの雌性（各群ｎ＝４）および雄性（各群ｎ＝３）を、対照（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）およびＡｕＮＣ＠ＣＰＰの２つの群に分けた。処置を、１４日間１日１０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１０００ｍｇ／ｍＬ）の用量で経口胃管栄養法によって投与した。３５日間の研究の間、動物の体重を２日ごとに測定した。処置後３５日目に、マウスを屠殺した。血液および臓器を収集した。すべての臓器を保存し、１０％中性ホルマリン緩衝液中で固定し、パラフィン包埋に処理し、光学顕微鏡を使用する病理学分析のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。食道、胃、心臓、腎臓、脾臓、膵臓、胸腺、小腸、結腸、膀胱、精巣、および卵巣を含む組織の顕微鏡分析（組織病理学）を、潜在的な組織学的変化について実施した。臓器対体重比（相対的臓器重量、ＲＯＷ）の結果を、剖検日における動物の体重（ｇ）に対する臓器重量（ｍｇ）の比として分析した。ＲＯＷのために、以下の臓器、胸腺、脾臓、心臓、腎臓、肝臓および精巣を検査した。血液試料を毒性分析に供した。下大静脈血液収集を屠殺時に行った。血液のうち１５０μｌを血液学分析のためにＫ２ＥＤＴＡチューブに入れ、残りの血液試料を血清抽出のために１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れた。肝臓および腎機能試験のために、血液を遠心分離して、細胞画分を除去することによって、血清を分離した。
インビボ効力試験
潜在的な治療薬を試験するためのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＣＳＯＭの検証マウスモデルを使用した。簡潔に述べると、ＰＡ０１を振盪しながら３７℃でインキュベートした。３０時間のインキュベーション後、静止期培養物をＦＬＯＸＩＮ（登録商標）Ｏｔｉｃ（オフロキサシンの最終濃度＝５μｇ／ｍＬ）で４時間処理して、生残細胞を選択した。局部鼓膜穿孔を作製した後、生残細胞（５μＬ、１．６×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を中耳腔中に接種し、回復するまで同側の耳を上にしてマウスを休ませる。感染症を１４日間発達させ、その後、抗生物質療法を開始した。すべての療法を、８μＬの滴下を１４日間連続で１日に２回外耳道内に入れることによって送達した。療法の成績は、処置停止の１４日後の中耳の滲出液からの細菌コロニー（ＣＦＵ／ｍＬ）の測定値であった。
ＡｕＮＣ＠ＣＰＰによる過酸化水素の分解を介したヒドロキシルラジカルの産生
ＡｕＮＣ＠ＣＰＰによって触媒される過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の分解からのヒドロキシルラジカルによるペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の酸化を実施した。ヒドロキシルラジカルは、ＴＭＢを、６５２ｎｍに吸収ピークを有する酸化ＴＭＢ（Ｏｘ－ＴＭＢ）に酸化することができる。したがって、ヒドロキシルラジカルのレベルを、６５２ｎｍにおける吸光度を測定することによって間接的に決定することができる。５０μＬの様々な濃度のＡｕＮＣ＠ＣＰＰを、０．２ｍＭのＴＭＢおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２（３０％溶液）を含有する４５０μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４および７．０）中に添加した。混合溶液を室温で３０分間インキュベートし、青色生成物の吸光度をマイクロプレートリーダー（ｓｐｅｃｔｒａｍＭａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用して６５２ｎｍで読み取った。
ＲｅｃＡ ＡＴＰ加水分解（ＡＴＰａｓｅ）アッセイ
ＲｅｃＡ ＡＴＰａｓｅ活性を、共役分光光度酵素アッセイを使用して測定した。野生型ＲｅｃＡ（３μＭ）を、ＡＰＴａｓｅ測定の前に５分間、ＡＴＰおよび５μｍのポリ（ｄＴ）とともにプレインキュベートした。反応物は、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＯＡｃ（ｐＨ７．５、８０％カチオン）、１０ｍＭのＭｇＯＡｃ、２ｍＭのＡＴＰ、３ｍＭのグルタミン酸カリウム、５％ｗ／ｖのグリセロール、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３ｍＭのＰＥＰ、３０Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ、３０Ｕ／ｍＬの乳酸デヒドロゲナーゼ、４．５ｍＭのＮＡＤＨ、および５μＭのポリ（ｄＴ）を含有した。ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への変換を、マイクロプレートリーダー（ｓｐｅｃｔｒａｍＭａｘ Ｍ２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用して３８０ｎｍでモニターした。１．２１ｍＭ－１ｃｍ－１のＮＡＤＨ消衰係数を使用して、ＡＴＰ加水分解の速度を計算した。
統計分析
データを、平均±標準偏差として示す。有意性の場合、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの対応がない（独立した）Ｔ検定を使用して検査して、いずれの群が互いに有意差があるかを示した。
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４６．Ｍｏ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＳＯＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｎｄｅｒ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．ＭＳｐｈｅｒｅ １，ｅ００１６３－００１１６（２０１６）．
実施例２
ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは嚢胞性線維症患者からのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの生残細胞の抗生物質感受性を回復させる
オフロキサシン、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ（８００μｇ／ｍＬ）、またはオフロキサシンとＡｕＮＣ＠ＣＰＰとの組み合わせのバイオフィルム根絶能力を、嚢胞性線維症（ＣＦ）患者からのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して試験した（図１３Ａ～１３Ｂ）。処理後、光学密度（ＯＤ）を、４８時間のインキュベーション後の回収プレートから測定した（６５０ｎｍ）。ナノ粒子処理は、嚢胞性線維症に関連するシュードモナスの治療において機能し、このことは、任意の慢性バイオフィルム感染症に対するその有用性を強調する。
実施例３
ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは排出ポンプ阻害を通じて作用しないことの実証
カチオン性疎水性機能化金ナノ粒子に基づくフルオロキノロンのための現在のナノアジュバントは、排出ポンプ阻害剤として作用する。本発明者らのＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、生残細胞中への細胞内送達を増強するようにＣＰＰと共有結合した、アニオン性親水性機能化金ナノ粒子である。排出ポンプ阻害剤の作用メカニズムは、細胞内抗生物質濃度の増加をもたらす競合的阻害を通じてのものである。以前に記載された分光蛍光測定法（定量限界２４ｎｇ／ｍＬ）を使用して、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰの非存在下および存在下でのＯＦＬ（１０μｇ／ｍＬ）との３０分間のインキュベーション後の静止期プランクトン性ＰＡ集団における細胞内ＯＦＬ濃度を評価した（４５）。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ＋ＯＦＬの同時投与は、ＯＦＬの細胞内濃度を有意には増加させなかった。このことは、本発明者らの併用療法の相乗作用は、排出ポンプ阻害剤として作用するＡｕＮＣ＠ＣＰＰの能力に起因し得ないことを示唆する（図１４）。理論によって拘束されることは望まないが、もっともらしいメカニズムは、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰが、ＲＯＳ媒介性ＯＦＬ致死性のエンハンサーとして、および細菌ＤＮＡの修復の阻害の両方で作用するというものである。
実施例４
インビトロ効力の実証
ＯＦＬ、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ、およびそれらの組み合わせの、インビトロでのバイオフィルムおよび静止期プランクトン性ＰＡ（染色体にコードされた発光ＰＡ０１）の両方に対する根絶潜在力を試験した。ＰＡ０１のバイオフィルム（１０日齢）を、市販のＣａｌｇａｒｙ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｄｅｖｉｃｅ（９６ウェルプレート）／最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）アッセイプレート中で増殖させた（４６）。使用済みの培地を除去し、バイオフィルムをＯＦＬ、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ、およびそれらの組み合わせの段階希釈液で処理し、２４時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、バイオフィルムを超音波処理を用いて破壊し、濁度測定のために回収培地中でインキュベートした。６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６５０）が２４時間後に０．１未満であった場合に、ウェルを、バイオフィルムを根絶したとみなした。予想どおり、ＯＦＬおよびＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、それぞれ７５０および１６００μｇ／ｍＬのＭＢＥＣで、ＰＡバイオフィルムに対する効果を少ししか有しなかった（図１５Ａ～１５Ｄ）。ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ＋ＯＦＬの組み合わせは、バイオフィルム内の生残細胞の根絶をもたらした（ＯＤ６５０＜０．１）。中耳粘膜におけるＯＦＬの臨床的に達成可能な濃度であるこのような低いＭＢＥＣ（９３．７５μｇ／ｍＬのＯＦＬ）について、ＰＡバイオフィルムの除去は前例がない（４７）。重要なことに、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰ（１６０００μｇ／ｍＬ）＋ＯＦＬ（７５０μｇ／ｍＬ）の組み合わせは、静止期プランクトン性ＰＡの培養物を有効に無菌化することができた。２４時間の処理後に、ＯＦＬ（ＣＦＵ＝１０３）およびＡｕＮＣ＠ＣＰＰ（ＣＦＵ＝１０６）と比較して、残存するＣＦＵは存在しなかった（９９．９９％の死滅）。バイオフィルムおよび静止期プランクトン性ＰＡの根絶は、ＯＦＬ療法と組み合わせた本発明者らのＡｕＮＣ＠ＣＰＰが、インビボでＰＡ ＣＳＯＭを根絶することができたことを示す。
実施例５
単独療法としてのＡｕＮＣ
ＯＦＬおよびＡｕＮＣ＠ＣＰＰは相乗作用でより良好に機能したが、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰはまた、十分に高い濃度で投与した場合に単独で有効であった。Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルムの生存率を、２４時間のＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＮＨ２またはＡｕＮＣ＠ＰＥＧ－ＯＨでの処理後に決定した（図１６）。処理後、４８時間のインキュベーション後の回収プレートからの光学密度（ＯＤ）を６５０ｎｍで測定した。≦０．１のＯＤ６５０のウェルは、バイオフィルム根絶の証拠を与えた。両方のＡｕＮＣの最小Ｅ．ｃｏｌｉバイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）値は、１ｍｇ／ｍＬである。
実施例６
グラム陽性細菌のバイオフィルム根絶におけるＡｕＮＣ＠ＣＰＰの有効性
３０００μｇ／ｍｌの濃度のオフロキサシン（ＯＦＬ）は単独でＣＳＯＭ ＳＡからのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）臨床分離株のバイオフィルムを根絶することができなかった。しかしながら、ＡＵＮＣ＠ＣＰＰと組み合わせたＯＦＬは、ＳＡバイオフィルムの根絶において有効であった（図１７）。これらの結果は、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰが、グラム陰性細菌（ＰＡ）だけでなく、グラム陽性細菌（ＳＡ）のバイオフィルムにも機能することを示す。
実施例７
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａのメロペネム耐性株の根絶におけるＡｕＮＣ＠ＣＰＰの有効性
本発明者らは、ＭＩＣ＞２００およびＭＢＣ＞２００のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａのメロペネム耐性株を取り、ＡｕＮＣ＠ＣＰＰと組み合わせてメロペネムで処理した場合に、ＭＩＣを１μｇ／ｍｌに、ＭＢＣを２μｇ／ｍｌに下げることによって、その耐性を克服した（表６を参照されたい）。これは、バイオフィルムにおける抗菌剤耐性だけでなく、敗血症および他の急性感染症を含めた抗菌剤耐性もまた一般に治療するＡｕＮＣ＠ＣＰＰの能力を強調する。
Figure 2022540665000007
ＡｕＮＣ＠ＣＰＰは、カルボン酸機能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）でコーティングされている。

Claims (52)

  1. アニオン性部分および細胞透過性ペプチドで機能化された、長さ１０ｎｍ未満のサイズを有するナノ粒子であって、
    前記アニオン性部分および前記細胞透過性ペプチドが、前記ナノ粒子の外表面に付着されている、ナノ粒子。
  2. 前記細胞透過性ペプチドが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）細胞透過性ペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子。
  3. 前記ＴＡＴ細胞透過性ペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のナノ粒子。
  4. 前記アニオン性部分が、カルボキシレート官能基、ホスフェート官能基、またはサルフェート官能基を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  5. ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーをさらに含み、前記ＰＥＧポリマーが、前記ナノ粒子の前記外表面に付着されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  6. 前記ＰＥＧポリマーが、前記アニオン性部分で機能化されている、請求項５に記載のナノ粒子。
  7. 前記ＰＥＧポリマーが、ポリエチレングリコールカルボン酸（ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）またはチオール－カルボキシルポリエチレングリコール（ＣＯＯＨ－ＰＥＧ－ＳＨ）である、請求項６に記載のナノ粒子。
  8. バイオフィルム中に存在する生残細胞または細菌に対する殺菌活性を有する抗菌剤をさらに含み、前記抗菌剤が、前記ナノ粒子の前記外表面に付着されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  9. 前記抗菌剤が、Ｄ－炭水化物、Ｄ－アミノ酸、またはＣｒｃＺ ＲＮＡ配列もしくはＣｒｃＺ Ａリッチモチーフ配列を含む核酸である、請求項８に記載のナノ粒子。
  10. 前記ＣｒｃＺ ＲＮＡ配列が、
    ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号１の前記配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記ナノ粒子が生残細胞を抗生物質に対して感受性にすることができる、ヌクレオチド配列、または
    ｃ）ａ）もしくはｂ）のＲＮＡ等価物
    を含む、請求項９に記載のナノ粒子。
  11. 前記ＣｒｃＺ Ａリッチモチーフ配列が、
    ａ）ＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡ（配列番号２）、
    ｂ）ＣＡＡＴＡＡＧＡＡ、
    ｃ）ＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡ（配列番号３）、
    ｄ）ＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡ（配列番号４）、
    ｅ）ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡ（配列番号５）、
    ｆ）ＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡ（配列番号６）、
    ｇ）ＡＡＣＡＡＣＡＡ、
    ｈ）ＡＡＡＡＡＣＡＡ、または
    ｉ）ａ）～ｉ）のＲＮＡ等価物
    を含む、請求項９に記載のナノ粒子。
  12. 前記ナノ粒子が、前記抗菌剤または前記細胞透過性ペプチドを前記ナノ粒子の前記外表面に接続するリンカーをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  13. 前記ナノ粒子が、長さ約１ｎｍ～約５ｎｍの範囲のサイズである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  14. 前記ナノ粒子が、長さ約１～約２ｎｍである、請求項１３に記載のナノ粒子。
  15. 前記ナノ粒子が、ヒト細胞と生体適合性である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  16. 前記ナノ粒子が、金属、セラミック、グラファイトもしくは他の炭素系材料、またはシリカを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  17. 前記金属が、金、銀、白金、チタン、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、スズ、ニッケル、銅、アルミニウム、またはそれらの酸化物、炭化物、窒化物、もしくはそれらの合金のうちの１つ以上を含む、請求項１６に記載のナノ粒子。
  18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、感染症を治療するための組成物。
  19. 薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. 抗生物質をさらに含む、請求項１８または１９に記載の組成物。
  21. 前記抗生物質が、フルオロキノロン、アミノグリコシド、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、マクロライド、スルホンアミド、カルバペネム、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、リンコサミド、モノバクタム、およびオキサゾリジノンからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記フルオロキノロンが、オフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、およびフィナフロキサシンからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
  23. 対象における感染症を治療する方法であって、
    治療有効量の請求項１８～２２のいずれか一項に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
  24. 治療有効量の少なくとも１つの抗生物質を、前記組成物と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記対象が、慢性感染症を有する、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記感染症が、耳感染症、皮膚感染症、または肺感染症である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記感染症が、前記対象における細菌バイオフィルムの形成に関連する、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記バイオフィルムが、前記対象における創傷におけるものである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記感染症が、１つ以上の抗生物質に対して耐性である病原性細菌を含む、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記対象が、感染症の除去に成功していない１つ以上の抗生物質を用いて感染症を以前に治療されている、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記治療が、すべてのまたは大部分のバイオフィルム細菌およびプランクトン性細菌を根絶する、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記治療が、すべてのまたは大部分の生残細胞を根絶する、請求項２３～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記生残細胞が、バイオフィルム中にあるか、またはマクロファージによって内在化されている、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記生残細胞が、多剤耐容性生残細胞である、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記生残細胞が、グラム陰性細胞またはグラム陽性細胞を含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記生残細胞が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 複数サイクルの治療が前記対象に投与される、請求項２３～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記組成物が、静脈内に、皮下に、吸入によって、または局所的に投与される、請求項２３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記組成物が、感染組織の部位に局所的に投与される、請求項２３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記感染症が、耳感染症であり、前記組成物が、外耳道内に局所的に投与される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記感染症が、嚢胞性線維症を有する対象におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染症である、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  42. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のナノ粒子と、細菌感染症を治療するための説明書とを含む、キット。
  43. 抗生物質をさらに含む、請求項４２に記載のキット。
  44. 前記抗生物質が、フルオロキノロン、アミノグリコシド、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、マクロライド、スルホンアミド、カルバペネム、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、リンコサミド、モノバクタム、およびオキサゾリジノンからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記フルオロキノロンが、オフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、およびフィナフロキサシンからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. バイオフィルム中の細菌を根絶する方法であって、前記バイオフィルムを、有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させることを含む、方法。
  47. 前記バイオフィルムを、有効量の少なくとも１つの抗生物質と接触させることをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記バイオフィルムが、医療デバイス、個人衛生用品、トイレタリー、化粧品、消毒剤、洗浄液上、または水処理もしくは分配システム中にある、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 休眠細菌を根絶する方法であって、
    前記休眠細菌を、有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させることを含む、方法。
  50. 前記休眠細菌を、有効量の少なくとも１つの抗生物質と接触させることをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記休眠細菌が、バイオフィルム中、液体培養物中、または無生物表面上にある、請求項４９または５０に記載の方法。
  52. 細菌におけるＳＯＳシグナル伝達またはＲｅｃＡ活性を阻害する方法であって、
    細菌を、有効量の請求項１～１７のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させることを含む、方法。
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