JP2022540652A - 分裂期キナーゼ阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤との同時送達のための治療用構築物 - Google Patents

分裂期キナーゼ阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤との同時送達のための治療用構築物 Download PDF

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Abstract

本明細書において、送達粒子と、少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤と、少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤とを含む治療用構築物が開示される。分裂期キナーゼ阻害剤と、免疫チェックポイント阻害剤と、化学リンカーとを含む治療用構築物も開示される。これらの治療用構築物は、治療効果および免疫効果の両方によって癌死を引き起こし、ポジティブフィードバックループ内で、生き残った癌細胞へのさらに多くの治療薬の標的送達を促進する。それらは、遊離薬物の治療指数を高め、腫瘍内または全身的に使用することができる。この戦略は、広範囲な癌型を治療することができ、特に、毒性の治療薬の癌標的送達のために明らかな受容体のない癌に有用である。TIFF2022540652000013.tif86161

Description

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金R44CA217534の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本開示の分野
本開示は、免疫療法の治療のための組成物および方法に関する。治療用構築物は、分裂期キナーゼ阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤との同時送達に基づいて記載される。これらの治療用構築物は、広範囲な癌治療のための遊離薬物対応物よりも大きな治療指数を有し、および/または優れた適応抗癌免疫を誘発する。
本開示の背景
免疫チェックポイント阻害剤、例えば、PD-L1、PD-1およびCTLA-4に対する抗体は、診療所で有望な結果を示しており、多くの癌型を処置するためにFDAのファストトラック承認を得ている。ただし、免疫チェックポイント遮断に応答する患者は堅調かつ持続的な応答を示し得るが、患者全体のごく一部が応答するに過ぎず、PD-L1発現が高い患者でさえ、応答率は50％未満にとどまる（Reck et al.,NEJM 375（19）:1823-1833,2016（非特許文献1））。さらに、多くの初期応答者は耐性を発現し、最終的に再燃する（Jenkins et al.,Brit J Canc.118:9,2018（非特許文献2））。
一般に、免疫チェックポイント遮断は、それほど重度ではなく、化学療法とは異なる毒性を有するが、免疫療法によって引き起こされる自己免疫障害が懸念される（Tocut et al.,Autoimmunity Rev 17（6）:610-616,2018（非特許文献3））。これらの抗体の全身分布は、異常で制御されない免疫応答を引き起こし、免疫関連有害作用（irAE）をもたらし得る（Reynolds et al.,J Clin Oncol.36（16＿suppl）:3096,2018（非特許文献4））。一般に管理可能であるが、irAEのために治療の中断が発生しており、場合によってはirAEは致命的であり得る。
癌の治療転帰を改善するために、試験では、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた化学療法の使用が検討されている。例えば、1つの臨床試験では、nab-パクリタキセル（アブラキサン）と、転移性TNBCのための遊離薬剤として投与されるPD-L1抗体（アテゾリズマブ）との組合せが検討されている（Schmid et al.,N Engl J Med 379（22）:2108-2021,2018（非特許文献5））。前臨床試験では、ドセタキセルとPD-L1抗体（Xu et al.,Inter J Nanomed.14:17-32,2018（非特許文献6））との、またはドキソルビシンとPD-L1抗体（Emami et al.,Mol Pharm 16（3）:1184-1199,2019（非特許文献7））との同時送達のためのナノ粒子が報告されている。ただし、分裂期キナーゼ阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤との同時送達は、遊離薬剤として報告されてもおらず、粒子上で、または化学リンカーと同時送達されてもいない。
分裂期キナーゼ阻害剤は、細胞周期停止およびアポトーシスを誘導することによって癌細胞を死滅させる単剤効力を有する。分裂期キナーゼ阻害剤は、分裂が速い細胞を死滅させる化学療法薬とは異なり、標的療法と考えられ、化学療法薬よりも癌細胞に特異的であるべきである。
それにも関わらず、PLK1小分子阻害剤などの現在の分裂期キナーゼ阻害剤の主な限界には、固形腫瘍バイオアベイラビリティが低いこと、および他の急速に分裂する細胞、特に造血前駆細胞に対する毒性副作用が含まれる（Gjertsen＆Schoffski,Leukemia 29（1）:11-19,2015（非特許文献8））。PLK1阻害剤は、十分な腫瘍バイオアベイラビリティを達成するために長い半減期を有する必要がある。これは、血液および骨髄中の造血前駆細胞との曝露時間を延ばし、好中球減少症（低好中球）および血小板減少症（低血小板）という用量制限毒性をもたらす（de Braud et al.,Annals of Oncol./EMSO 26（11）:2341-2346,2015（非特許文献9）;Schoffski et al.,Euro J Canc.48（2）:179-186,2012（非特許文献10）;Lin et al.,Brit J Canc.110（10）:2434-2440,2014（非特許文献11）;Frost et al.,Curr Oncol.19（1）:e28-35,2012（非特許文献12））。これにより、非標的細胞を超える癌細胞への分裂期キナーゼ阻害剤の標的送達の必要性が強調される。
さらに、PLK1阻害剤はまた、他のPLKファミリーメンバー、PLK2およびPLK3を阻害し得、毒性副作用をさらにもたらす可能性がある（Raab et al.,Nat.Comm.2:395,2011（非特許文献13））。あらゆるPLK1阻害剤のうち、ボラセルチブ（Boehringer Ingelheim）は、第III相臨床試験に到達し、急性骨髄性白血病（血液癌）についてのみであるものの最も有望であることを示しているが（Gjertsen＆Schoffski,Leukemia 29（1）:11-19,2015（非特許文献14））、第III相試験の結果は、おそらく投与量が不十分であった（例えば、毒性によって制限される）ために有望ではなかった。癌治療のためのPLK1の阻害は、依然として臨床的課題である。
さらに、以前の試験では、PLK1と癌の進行および免疫回避を調節する多くの遺伝子との広範囲な相互作用が解明されており（Zitouni et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 15（7）:433-452,2014（非特許文献15）;Zhang et al.,BMC Cancer 17（1）:861,2017（非特許文献16）;Liu et al.,Translational Oncol.10（1）:22-23,2016（非特許文献17）;Fu＆Wen,Cancers 9（10）,2017（非特許文献18））、これにより、PLK1阻害剤を単独で用いた単独療法が効果的でない場合があることが強調されている。分裂期キナーゼ阻害剤単独もまた、様々なPLK1阻害剤の臨床試験で示されるように、極めて毒性である。
Reck et al.,NEJM 375（19）:1823-1833,2016 Jenkins et al.,Brit J Canc.118:9,2018 Tocut et al.,Autoimmunity Rev 17（6）:610-616,2018 Reynolds et al.,J Clin Oncol.36（16＿suppl）:3096,2018 Schmid et al.,N Engl J Med 379（22）:2108-2021,2018 Xu et al.,Inter J Nanomed.14:17-32,2018 Emami et al.,Mol Pharm 16（3）:1184-1199,2019 Gjertsen＆Schoffski,Leukemia 29（1）:11-19,2015 de Braud et al.,Annals of Oncol./EMSO 26（11）:2341-2346,2015 Schoffski et al.,Euro J Canc.48（2）:179-186,2012 Lin et al.,Brit J Canc.110（10）:2434-2440,2014 Frost et al.,Curr Oncol.19（1）:e28-35,2012 Raab et al.,Nat.Comm.2:395,2011 Gjertsen＆Schoffski,Leukemia 29（1）:11-19,2015 Zitouni et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 15（7）:433-452,2014 Zhang et al.,BMC Cancer 17（1）:861,2017 Liu et al.,Translational Oncol.10（1）:22-23,2016 Fu＆Wen,Cancers 9（10）,2017
本開示の概要
分裂期キナーゼ阻害剤（または有糸分裂阻害剤）とチェックポイント阻害剤との同時送達に基づく新たな治療用構築物の開発が、本明細書において記載される。これらの治療用構築物は、遊離薬物対応物よりも大きな治療指数を有し、広範囲な癌治療に有用である。
癌を治療するためには、応答を改善し、治療効果を改善し、免疫チェックポイント遮断および分裂期キナーゼ阻害剤の毒性を管理する戦略が非常に必要とされる。免疫チェックポイント阻害剤および分裂期キナーゼ阻害剤の単剤（すなわち、治療用構築物）送達は、薬物の全身毒性を低減しながら、治療効果を共局在化させて相乗効果を達成する。
有糸分裂阻害剤および分裂期キナーゼ阻害剤は、細胞周期停止およびアポトーシスを誘導することによって癌細胞を死滅させる単剤効力を有する。
癌細胞が有糸分裂阻害による死を回避する機構は、免疫チェックポイントをアップレギュレートして免疫媒介性の細胞死滅を回避し、ひいては免疫学的に不可視のままにすることである（図1A）。したがって、有糸分裂阻害剤を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせることによって、有糸分裂阻害剤から生き残った細胞を免疫細胞（すなわち、細胞傷害性CD8＋T細胞）によって攻撃して、免疫応答を生じさせることができる（図1B）。
少なくとも1つの有糸分裂阻害剤または分裂期キナーゼ阻害剤と少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤との同時送達のための操作された粒子（治療用構築物）が、本明細書において記載される。本明細書において提供されるデータは、治療用構築物上で免疫チェックポイント阻害剤とともに分裂期キナーゼ阻害剤を送達することによって、効果を改善し、毒性を低減する（例示的な肺転移モデルでは用量を5分の1に減少させることによって）ことができる方法を示す。
操作された粒子上の免疫チェックポイント阻害剤は、T細胞が癌細胞を攻撃することを可能にするだけでなく、生き残った癌細胞へのホーミング標的剤としても機能する。
データはまた、提供される治療用構築物が、癌細胞を死滅させることができるだけでなく、遠位腫瘍の発生（例えば、転移）を遅らせる適応抗腫瘍応答を誘発することもできることを示している。
分裂期キナーゼ阻害剤は、小分子阻害剤、抗体に基づく薬物、またはオリゴヌクレオチド（例えば、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド）のクラスであり得る。
治療用構築物は、例えば、容易に到達可能な腫瘍、例えば、黒色腫、頭頸部癌、乳癌およびリンパ腫に局所投与または腫瘍内投与され得るか、他の癌、例えば、肺癌、肝癌、膵癌、前立腺癌、脳癌、腎癌、血液癌、胃癌、結腸癌、稀な癌および転移性癌のために全身投与され得る。
操作された治療用構築物は、ナノメートル範囲またはマイクロメートル範囲の直径を有することができ、治療剤/アジュバントカーゴを負荷し、それらを標的部位（癌細胞、免疫細胞、細胞外マトリックスなど）に送達し、それらが所望の機能を有することを可能にすることができる任意の材料（例えば、脂質、有機材料、無機材料、ポリマーおよびハイブリッドまたはそれらの組合せ）から作製され得る。
抗腫瘍T細胞レパートリーを増強して治療効果を増強するために、同じ治療用構築物上でアジュバントを任意で同時送達することができる。分裂期キナーゼ阻害剤は、癌細胞を死滅させ、抗原放出をもたらし、アジュバントは、パターン認識受容体を活性化して免疫細胞を刺激する危険シグナルを模倣し、免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍細胞によって免疫細胞に加えられたブレーキを解除する。このように、単剤治療薬は、癌細胞が免疫応答を回避する様々な戦略を克服して、持続的な癌細胞殺傷効果を提供することができる。
任意で、例示的な治療用構築物はまた、それらが標的癌細胞または様々な免疫細胞型（例えば、DC、マクロファージ、単球、T細胞）に優先的に送達される、および/または取り込まれることを可能にする1つまたは複数のホーミング剤（抗体、アプタマー、リガンド、ペプチドなど）を含有する。
本明細書において提供される治療用構築物は、単独で、または限定されることなく、化学療法、手術、標的療法、および放射線療法を含む標準的な治療法と組み合わせて使用され得る。
あるいは、治療用構築物上に/治療用構築物内に、治療活性剤として他の標的治療薬（例えば、他の腫瘍タンパク質を標的とする小分子阻害剤もしくは抗体、または医療用放射性同位体）を直接負荷することができる。
治療用構築物は、局所送達のために、任意で局所製剤またはマイクロニードル製剤に製剤化することができる。
送達システムと、送達システムに結合された、または送達システム内に含有された少なくとも1つの有糸分裂阻害剤または分裂期キナーゼ阻害剤と、送達システムに結合された、または送達システム内に含有された少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤とを含む治療用構築物が、本明細書において提供される。治療用構築物のこの態様の例では、送達システムは、リポソーム、脂質系粒子、ポリマー粒子、無機ナノ粒子もしくは有機ナノ粒子、無機マイクロ粒子もしくは有機マイクロ粒子、またはそれらのハイブリッドを含む。提供される治療用構築物の特定の態様では、水溶液（PBS、Tris緩衝液、水など）中で測定した場合に5nm～999nm（例えば、約80nm～約200nm、約90nm～約130nm、または150nm未満）の流体力学的サイズを有するナノ粒子が使用される。さらに他の例では、治療用構築物は、1ミクロン～1000ミクロンの流体力学的サイズを有するマイクロ粒子である。いくつかの態様では、送達システムは、約5nm～約200nm、約5nm～約90nm、約5nm～約20nm、約30nm～約100nm、約30nm～約80nm、約30nm～約60nm、約40nm～約80nm、約70nm～約90nm、または約5nm、約10nm、約20nm、約30nm、約40nm、約50nm、約60nm、約70nm、約80nm、約90nmもしくは約100nmのサイズを有する。
いくつかの態様では、治療用構築物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの態様では、治療用構築物は、腫瘍特異的抗原を含まない。
免疫チェックポイント阻害剤、分裂期キナーゼ阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤と分裂期キナーゼ阻害剤とを連結する化学リンカーを含む治療用構築物も、本明細書において提供される。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体である。いくつかの態様では、分裂期キナーゼ阻害剤は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体である。いくつかの態様では、治療用構築物は、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、小分子-オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは小分子-小分子コンジュゲートである。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体（例えば、PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3、またはCTLA-4に対するもの）である。いくつかの態様では、分裂期キナーゼ阻害剤は、小分子阻害剤、例えば、PLK1（例えば、GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、ボラセルチブ）、Chk 1キナーゼ（例えば、LY2603618、プレキサセルチブ（prexasertib）、またはAZD7762）、RHAヘリカーゼA（例えば、YK-4-279）、サイクリン依存性キナーゼ1/2（例えば、AZ703）、オーロラキナーゼA（例えば、アリセルチブ）の阻害剤である。いくつかの態様では、分裂期キナーゼ阻害剤は、オリゴヌクレオチド、例えば、分裂期キナーゼ遺伝子に対するsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、PLK1に対するsiRNA、例えば、siPLK1）である。
本明細書において記載される少なくとも1つの治療用構築物を含む組成物も提供される。任意で、そのような組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む。
別の態様は、癌の1つまたは複数の症状を低減するために、癌を有する対象（ヒト対象など）に、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の有効量を投与する工程を含む、癌を処置する方法である。
癌の症状を示す細胞を処置する方法であって、該細胞と、提供される治療薬の治療有効量とを接触させる工程を含む方法も提供される。
癌の症状を示す対象から得られた細胞を処置する方法であって、該細胞と、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の治療有効量とを接触させる工程を含む方法も提供される。
癌の症状を示す対象から得られた細胞を処置する方法であって、細胞と、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の治療有効量とをエクスビボで接触させる工程を含む方法も提供される。
細胞に基づく態様のいずれかでは、細胞は、場合によっては癌細胞であることが企図される。他の例では、細胞は癌細胞ではない。様々な態様では、細胞は免疫細胞である。任意で、細胞に基づく態様のいずれかでは、細胞は、ヒト対象由来であり得るか、別の哺乳動物対象由来であり得る。
さらに別の態様は、過剰増殖性疾患または過剰増殖性病態を有すると診断された対象を処置する方法であって、提供される治療用構築物のうちの少なくとも1つを含む組成物の有効量を対象に投与する工程を含む方法である。
それを必要とする対象（ヒト対象など）において抗癌療法の効果を増強する方法であって、それを必要とする対象に、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の有効量と、少なくとも1つの抗癌剤（例えば、化学療法剤、標的療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤）とを投与する工程を含む方法も提供される。任意で、治療用構築物または組成物と、抗癌療法とは、連続的にまたは同時に投与される。
さらに別の態様は、新生物を有すると診断された対象（ヒト対象など）において放射線療法の効果を増強する方法であって、それを必要とする対象に、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の有効量と、少なくとも1つの放射線療法とを投与する工程を含む方法である。任意で、治療用構築物または組成物と、放射線療法とは、連続的にまたは同時に投与される。
本明細書において使用される場合、抗癌療法の治療効果の文脈では、用語「増強する」は、抗癌療法が本発明の治療用構築物を用いず投与される場合に通常得られる治療効果を超える抗癌療法（例えば、抗癌剤、放射線療法またはチェックポイント免疫療法による治療）の治療効果の増加を指す。「治療効果の増加」は、抗癌療法によって得られる治療効果の加速、および/または強度および/または程度の増加がある場合に現れる。「治療効果の増加」はまた、治療上の利益の有用期間の延長を含む。「治療効果の増加」はまた、本発明によって提供される治療用構築物と同時投与される場合、比較的高い投与量の抗癌療法が単独で投与される場合と同じ利益および/または効果を得るために、比較的低い投与量の抗癌療法が必要とされる場合も現れ得る。増強効果は、必ずしもそうとは限らないが、好ましくは、抗癌療法単独では効果がないか、治療的に効果が低い急性症状の治療をもたらす。本発明の治療用構築物を抗癌療法と同時投与した場合、抗癌療法単独の投与と比較して、治療効果が少なくとも10％増加すると（例えば、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％または少なくとも100％）、増強が達成される。
治療用構築物の活性に関する中心的仮説。（図1A）有糸分裂阻害（例えば、PLK1阻害剤またはsiRNAによる）は、癌を死滅させ、抗原を放出するが、生き残った細胞内のチェックポイント（例えば、PD-L1）発現も増加させ、これにより、生き残った細胞に対する抗癌免疫応答が阻害される。（図1B）有糸分裂阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤とを組み合わせることにより（例えば、治療用構築物上で）、癌の相乗的治療がもたらされる。 非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株（A549およびH460）に対する有糸分裂調節因子PLK1に対するsiRNA（siPLK1）の効果。（図2A）50nM siRNA用量での48時間PLK1 mRNAノックダウン（ハウスキーピング遺伝子として使用されるHPRT）および（図2B）72時間PLK1タンパク質減少。（図2C）30nM siRNA用量での4日間の細胞生存率。（図2D）処理の72時間後のA549におけるG2/M期の細胞周期停止の増加。抗体（セツキシマブ）コンジュゲートNPを使用して、siPLK1（C-siPLK1-NP）またはスクランブルsiRNA対照（C-siSCR-NP）を50nM siRNAで送達した。薬物ベンチマークとして、BI 2536（PLK1阻害剤）を10nMで使用した。独立した2連からの平均±SDとして示されたデータ（10,000事象/試料）;＊＊＊＊P＜0.0001対未処理対照。別段の指定がない限り、「NP」は、Ngamcherdtrakul et al.,Advanced Functional Materials,25（18）:2646-2659,2015および米国特許出願公開第2017/0173169号に記載されているように、架橋PEIおよびPEGで被覆されたメソポーラスシリカナノ粒子を示す。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Aの説明を参照のこと。 siRNAによるPLK1ノックダウンは、PD-L1発現を誘導する。（図3A）HPRTハウスキーピング遺伝子に対して正規化された、PLK1 siRNA（siPLK1）またはスクランブルsiRNA（siSCR）による処理の48時間後のA549（ヒトNSCLC）内のPLK1およびPD-L1のmRNA発現。3連からの平均±SDとして示されたデータ;＊＊＊＊P＜0.0001。（図3B）フローサイトメトリーによって評価した、処理後72時間のA549（図2B）およびLLC-JSP（マウスNSCLC、図3C）のPD-L1表面発現（10,000事象/試料）。マウスsiPLK1配列:GUGGGCGUGGUACCAUCUGUU (SEQ ID NO: 1); ヒトsiPLK1配列:UAUUCAUUCUUCUUGAUCCGG (SEQ ID NO: 2)。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 （A）LLC-JSP細胞の3日間の生存率、（B）フローサイトメトリーによって決定した、500ng/mlのボラセルチブ、アリセルチブ、またはAZD7762による処理後に生き残った細胞のPD-L1発現レベル、および（C）それらの定量に対する分裂期キナーゼ阻害剤の治療効果。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 遊離薬物として投与されたPD-L1阻害剤およびPLK1阻害剤による癌治療の増強。（図5A）C57BL/6マウスの右側腹部に、200KのLLC-JSP細胞を注射した。腫瘍接種後8日目に、マウスを群分けし（n＝7～8）、対照ビヒクル（PBSおよびHCl/生理食塩水）、PLK1阻害剤ボラセルチブ（20mg/kg）、マウスPD-L1抗体（200μg/マウス、BioXCell）、またはPLK1阻害剤とPD-L1抗体との組合せの処置をi.p.投与した。3用量について5日ごとに処置を投与した。（図5B）マウスの腫瘍増殖。（図5C）カプランマイヤー生存曲線。平均±SEMとして示されたデータ;＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001。 マウスNSCLC細胞へのPLK1阻害剤ボラセルチブ（iPLK1-NP）のナノ粒子送達。（図6A）iPLK1-NPの合成の概略図。（図6B）Zetasizerを用いて測定した、NP（阻害剤なし）およびiPLK1-NPの流体力学的サイズ。（図6C）ボラセルチブ（1％DMSO/PBS中）、iPLK1-NP（PBS中）または1％DMSO/PBSを用いて4日間処理したLLC-JSP細胞の生存率。4つの独立した試料からの平均±SDとして示されたデータ;＊＊＊＊P＜0.0001。（図6D）PBSまたはiPLK1-NP（42μg/mlのNP、210ng/mlのボラセルチブ）を用いて3日間処理したLLC-JSP細胞のPD-L1表面発現。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 PLK1阻害剤（iPLK1）とPD-L1抗体との同時送達のためのナノ粒子（p-iPLK1-NP）。（図7A）4重量％のPD-L1抗体および0.5重量％のPLK1阻害剤を含有するp-iPLK1-NPの概略図および（図7B）流体力学的サイズ。（図7C）iPLK1-NPまたはp-iPLK1-NPを用いて処理したLLC-JSP細胞の5日間の細胞生存率。4つの独立した試料からの平均±SDとして示されたデータ;ns-有意ではない。（図7D）2時間および（図7E）2日間にわたり、LLC-JSP細胞を指定した様々な処理とともにインキュベートした後、フローサイトメトリーによって評価したPD-L1表面発現。用量:遊離PD-L1抗体（50μg/ml）、iPLK1-NP（50μg/mlのボラセルチブを含有するNP）およびp-iPLK1-NP（50μg/mlのボラセルチブおよび2μg/mlのPD-L1抗体を含有するNP）。図7Dおよび図7Eの左:代表的なヒストグラム、右:強度中央値（RFU）。独立した2連からの平均±SDとして示されたデータ（10,000事象/試料）;＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001。別段の指定がない限り、負荷率は、本出願全体を通してナノ粒子の重量による。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 p-iPLK1-NPは抗腫瘍免疫効果を誘発する。（図8A）C57BL/6マウスの右側腹部に100KのLLC-JSP細胞を注射し、左側腹部に40Kの細胞を注射した。腫瘍接種後12日目に、マウスの右（局所）腫瘍に対して、生理食塩水、p-NP、iPLK1-NPまたはp-iPLK1-NPの腫瘍内処置を行った。合計3用量について、1用量当たり50μl中、4重量％のPD-L1抗体と0.5重量％のPLK1阻害剤とを含有する0.5mgのNP。（図8B）局所腫瘍増殖。（図8C）個々のマウスの遠位（未処置）腫瘍増殖。（図8D）カプランマイヤー生存曲線。（図8E）マウスに、（図8A）に記載されるように腫瘍を注射し、生理食塩水またはp-iPLK1-NPの処置を投与した。最後の処置の1日後に腫瘍を採取して、フローを用いて腫瘍浸潤リンパ球（TIL）を評価した（50,000事象/試料）。平均±SEMとして示されたデータ;＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 p-iPLK1-NPは、転移性肺腫瘍を担持するマウスの生存を改善する。（図9A）C57BL/6マウスに200KのLLC-JSP細胞を静脈内注射し、肺に腫瘍を作成した。3日後、合計4用量について、生理食塩水、遊離薬物（12.5μgのボラセルチブおよび100μgのPD-L1抗体）またはp-iPLK1-NP（2.5μgのボラセルチブおよび20μgのPD-L1を含有する）の全身処置にマウスを無作為に割り当てた。（図9B）カプランマイヤー生存曲線。＊P＜0.05、＊＊P＜0.01（Log-rank Mantel-Cox検定）。（図9C）最初の処置後のマウスの体重変化。 p-iPLK1-NPの効果はCD8＋T細胞に依存する。C57BL/6マウスに200KのLLC-JSP細胞を静脈内注射した。3日後、生理食塩水、p-iPLK1-NP（i.v.、2.5μgのボラセルチブおよび20μgのPD-L1を含有する）、またはp-iPLK1-NP＋抗CD8（200μg、週2回）を用いてマウスを処置した。（A）カプランマイヤー生存曲線。＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001（Log-rank Mantel-Cox検定）。 p-iPLK1-NPの標的化および処理特異性。（A）p-iPLK1-NPの処理の4日後の4T1細胞のPD-L1発現。細胞（対照およびp-iPLK1-NP処理）を回収し、色素-siRNAを用いてタグ付けしたp-iPLK1-NPと1時間インキュベートした。（B）p-iPLK1-NPの細胞取込み。（C）p-iPLK1-NPを用いて処理したマウス癌細胞（LLC-JSP、4T1、B16-F10）およびマウス骨髄由来樹状細胞（BMDC）の細胞生存率。 図11Aの説明を参照のこと。 図11Aの説明を参照のこと。 PLK1の阻害はSTAT3のリン酸化を減少させる。A549およびH460 NSCLC細胞株内の処理3日後（50nM siRNA）のPLK1、PI3Ka、リン酸化STAT3（Tyr705）、リン酸化AKT（Ser473）およびβ-アクチンのタンパク質発現を示すウエスタンブロット。図12Bは、NPが、PD-L1に対するsiRNA（siPDL1）を送達し、LLC-JSP細胞内でPD-L1タンパク質発現の効果的なノックダウン（フローサイトメトリーによって測定）をもたらすこともできることを示す。PD-L1に対する30nMのsiRNA（siPDL1）、または30nMのスクランブルsiRNA（siSCR）を2重量％のsiRNAで含有するNPを用いて細胞を処理した。処理の72時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによってPD-L1タンパク質発現について評価した。RFU＝相対蛍光単位。 図12Aの説明を参照のこと。 CpGをp-iPLK1-NPに加えると、カプランマイヤー生存曲線によって示されるように、治療上の利益が増大する。C57BL/6マウスの右側腹部に100KのLLC-JSP細胞を注射し、左側腹部に40Kの細胞を注射した。腫瘍接種後12日目に、マウスの右（局所）腫瘍に対して、生理食塩水、p-NP、iPLK1-NP、p-iPLK1-NPまたはp-iPLK1-NP-CpGの腫瘍内処置を行った。50μl中0.5mgのNP（iPLK1 2.5μg、PD-L1抗体20μg、CpG 20μg）を3日ごとに合計3回投与した。 アリセルチブ（オーロラキナーゼA阻害剤）およびPD-L1抗体の抗体-薬物コンジュゲート（ADC）。（A）PD-L1-抗体アリセルチブコンジュゲート（ADC）の合成スキーム。（B）LLC-JSP細胞の生存率に対する等価用量のADC対遊離アリセルチブの治療効果（2日間）。使用前に遊離アリセルチブをDMSOに溶解した。（C）LLC-JSP細胞の生存率に対するPD-L1の効果。 図14Aの説明を参照のこと。 図14Aの説明を参照のこと。 マイクロニードルローラー前処理を用いた場合および用いない場合のブタ皮膚における局所siRNA-NP。マイクロニードルローラーを用いて皮膚を前処理した場合および前処理しない場合の、Aquaphor中のDy677-siSCR-NPの1回の局所適用によって1時間処理したブタ皮膚の蛍光画像。siRNAシグナルを矢印によって示す。Hoechst 33342を用いて、組織の核も染色した。 マイクロニードルローラー前処理を用いた場合および用いない場合のマウスにおける局所siRNA-NP/Tween-Aquaphor。マイクロニードルローラーを用いて皮膚を前処理した場合および前処理しない場合の、Tween/Aquaphor中のDy677-siSCR-NPの一回の局所適用によって1.5時間処理したマウス皮膚の蛍光画像。siRNAシグナルを矢印によって示す。Hoechst 33342を用いて、組織の核も染色した。 マイクロニードルローラーを用いた局所siRNA-NP対注射されたsiRNA-NPのEGFRノックダウン効果。マイクロニードルローラー適用を用いて、Tween/Aquaphor中のsiEGFR-NPもしくはsiSCR-NPによる局所処理を1回行った3日後（A）、または生理食塩水中のsiEGFR-NPもしくはsiSCR-NPの注射を1回行った3日後（B）に、マウスの皮膚を採取した。皮膚組織を固定し、EGFRシグナル定量のために蛍光標識EGFR抗体を用いて染色した。1条件当たり4～8枚の画像（20倍）および1群当たり動物3匹を処理した。 Dy677-siRNAを負荷したNPを含有する、デキストランベースのマイクロニードル。
配列表への参照
本明細書において記載される核酸配列は、37 C.F.R.§1.822において定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準的な略語を使用して示されている。各核酸配列の1つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、適切であれば、態様に含まれると理解される。2020年7月13日またはその付近に作成され、ファイルサイズ1KBの「51127-005WO2＿Sequence＿Listing＿07.13.20＿ST25.txt」と題されたコンピュータ可読テキストファイルは、本出願の配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
SEQ ID NO:1は、マウスsiPLK1配列である:
Figure 2022540652000002
SEQ ID NO:2は、ヒトsiPLK1配列である:
Figure 2022540652000003
SEQ ID NO:3はスクランブルsiSCR配列である:
Figure 2022540652000004
詳細な説明
本明細書において記載される、癌治療のための治療法は、分裂期キナーゼ阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤との同時送達のための操作された粒子または化学リンカーを利用して、癌治療のために同じ細胞内に両クラスの薬物を局在化する治療用構築物を作製する。
提供される治療用構築物を癌細胞に腫瘍内投与または全身投与すると、分裂期キナーゼ阻害剤は癌を細胞周期停止に至らせ、プログラム細胞死をもたらし、生き残った癌細胞の免疫チェックポイント発現（例えば、PD-L1）を増加させる。そのため、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、PD-L1に対する抗体）が、生き残った細胞への構築物の標的送達を増強するとともに、細胞傷害性T細胞が癌を攻撃することを可能にする。
分裂期キナーゼ阻害剤はPD-L1受容体をアップレギュレートすることができるため、この戦略は、広範囲な癌型を処置することができ、普通であれば毒性の治療薬、例えば、分裂期キナーゼ阻害剤の標的送達のための明白な受容体のない癌に特に有用である。
また、癌細胞の死は、腫瘍抗原を放出し、チェックポイント阻害と一緒に、適応免疫を誘発して、癌を攻撃するか、癌の広がりまたは再燃を予防することができる。任意で、アジュバントを治療用構築物に加えて、抗腫瘍免疫応答を増加させることができる。
本発明は、新規発見の癌生物学および免疫学と、遊離薬物対応物と比較して毒性を低減しながら効果を高める新たな薬物候補を作製するための操作された粒子とを利用する。
一定の態様では、送達ビヒクルは、オリゴ負荷およびエンドソーム脱出のために、生体内還元性架橋カチオン性ポリマー、例えばポリエチレンイミン（PEI）で被覆された、薬物負荷用のMSNPコア（例えば、約50nm）と、安定剤、例えば、ナノ粒子凝集を防止し、オリゴカーゴを血液酵素による分解から保護し（Ngamcherdtrakul et al.,Advanced Functional Materials,25（18）:2646-2659,2015）、PEIの電荷を遮蔽し、安全性を高めるポリエチレングリコール（PEG）とを含む。オリゴ（siRNAおよび/またはCpG）は、構築物に最後に負荷され、室温でPBS中で数分間（例えば、5分）混合される。オリゴ（siRNAおよび/またはCpG）は、オリゴ配列に依存しない様式でPEIに静電的に結合し、PEG層の下で酵素分解から保護される（Ngamcherdtrakul et al.,Advanced Functional Materials,25（18）:2646-2659,2015）。得られたナノ粒子（NP）は、MSNPサイズ、PEIおよびPEGの分子量および組成、PEI架橋条件（緩衝能を高め、電荷を低下させるため）、オリゴおよび（任意で）抗体の負荷量に関して、siRNA送達効果のために高度に最適化された（Ngamcherdtrakul et al.,Advanced Functional Materials,25（18）:2646-2659,2015）。siRNA-NPのこの態様は、50nmの剛性MSNPコアサイズ（TEMによる）と、狭いサイズ分布を有する100nmの流体力学的サイズ（ポリマー被覆を有するNP）とを有する。siRNA-NPのこの態様は、13.5重量％のPEI、18.2重量％のPEGからなり、2～4重量％のsiRNAまたは最大10重量％のCpGオリゴを負荷することができる。薬物（例えば、タキサン）は、0.5～3重量％でMSNPコア内に、またはポリマー上に負荷され得る。この段落の値はいずれも、ナノ粒子の重量による。米国特許出願公開第2017/0173169号も参照されたい。
一定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体である。いくつかの態様では、分裂期キナーゼ阻害剤は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体である。いくつかの態様では、治療用構築物は、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート（Wiener,J.et al.Scientific Reports,10,1457,2020）、小分子-オリゴヌクレオチドコンジュゲート（Winkler J.,Therapeutic delivery,4（7）,791-809,2013）、または小分子-小分子コンジュゲートである。
送達システムと、送達システムに結合された、または送達システム内に含有された少なくとも1つの有糸分裂阻害剤または分裂期キナーゼ阻害剤と、送達システムに結合された、または送達システム内に含有された少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤とを含む治療用構築物が、本明細書において提供される。治療用構築物のこの態様の例では、送達システムは、リポソーム、脂質系粒子、ポリマー粒子、無機ナノ粒子もしくは有機ナノ粒子、無機マイクロ粒子もしくは有機マイクロ粒子、またはそれらのハイブリッドを含む。例えば、様々な例では、送達ビヒクルは、フラーレン、エンドヘドラル金属フラーレン、三金属窒化物鋳型エンドヘドラル金属フラーレン、単層カーボンナノチューブおよび多層カーボンナノチューブ、分枝状カーボンナノチューブおよび樹枝状カーボンナノチューブ、金ナノロッド、銀ナノロッド、単層ホウ素/ナイトレートナノチューブおよび多層ホウ素/ナイトレートナノチューブ、カーボンナノチューブピーポッド、カーボンナノホーン、カーボンナノホーンピーポッド、リポソーム、ナノシェル、リン酸カルシウム、デンドリマー、マイクロ粒子、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、ナノロッド、セルロースナノ粒子、ケイ素、シリカマイクロスフェアおよびシリカナノスフェア、ポリマーマイクロスフェアおよびポリマーナノスフェア、シリカシェル、生分解性PLGAマイクロスフェアおよび生分解性PLGAナノスフェア、金ナノ粒子、酸化セリウム粒子、酸化亜鉛粒子、銀ナノ粒子、カーボンナノ粒子、鉄ナノ粒子、ならびに/または修飾ミセルのうちの1つまたは複数を含む。
提供される治療用構築物の態様の例では、分裂期キナーゼ阻害剤および/または免疫チェックポイント阻害剤は、オリゴヌクレオチド（例えば、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体を含む。
治療用構築物の例では、分裂期キナーゼ阻害剤は、ポロ様キナーゼ（PLK）、オーロラキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）1、CDK2、HASPIN、単極紡錘体1キナーゼ（monopolar spindle 1 kinase）（Mps1）、またはNimA関連キナーゼ（NEK）のうちの少なくとも1つの阻害剤を含む。様々な態様では、分裂期キナーゼ阻害剤は、GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、BI6727（ボラセルチブ）、Chk 1キナーゼ阻害剤LY2603618、プレキサセルチブ、AZD7762、AU14022、YK-4-279、またはAZ703のうちの1つまたは複数を含む。
様々な態様では、有糸分裂阻害剤は、エトポシド、ビノレルビン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、エストラムスチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、ドセタキセル、パクリタキセル、およびカバジタキセルのうちの1つまたは複数を含む。
様々な態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3、またはCTLA-4のうちの1つまたは複数に対するsiRNA、阻害剤、または抗体を含む。例として、治療剤は、PD-L1、PD-1、またはCTLA-4に対する抗体から選択される免疫チェックポイント阻害剤である。さらに多くの例では、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ピディリズマブ、またはスパルタリズマブ（PDR001）のうちの少なくとも1つを含む。
本明細書において提供される治療用構築物は、任意で、アジュバントをさらに含んでもよい。提供される治療用構築物とともに使用される例示的なアジュバントが、免疫刺激活性を示すことが特に企図される。例として、提供される治療用構築物の態様では有用なアジュバントは、CpGオリゴヌクレオチド、CpG配列を含むDNA TLRアゴニスト、非CpG DNA TLRアゴニスト、RNA TLRアゴニスト、アルミニウム塩、抗CD40抗体、融合タンパク質、サイトカイン、小分子TLRアゴニスト、油系アジュバントもしくは界面活性剤系アジュバント、リポ多糖、植物抽出物、またはそれらの誘導体のうちの1つまたは複数を含む。具体的な例では、アジュバント化合物は、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、レシキモド、ガーディキモド、ポリIC、ポリICLC、dSLIM、またはEnanDIMを含む。
いくつかの態様では、治療用構築物は、腫瘍特異的抗原を含まない。
本明細書において記載される少なくとも1つの治療用構築物を含む組成物も提供される。任意で、そのような組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む。
別の態様は、癌の1つまたは複数の症状を低減するために、癌を有する対象（ヒト対象など）に、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の有効量を投与する工程を含む、癌を処置する方法である。
癌の症状を示す細胞を処置する方法であって、該細胞と、提供される治療薬の治療有効量とを接触させる工程を含む方法も提供される。
癌の症状を示す対象から得られた細胞を処置する方法であって、該細胞と、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の治療有効量とを接触させる工程を含む方法も提供される。
細胞と、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の治療有効量とをエクスビボで接触させる工程を含む方法も提供される。
細胞に基づく態様のいずれかでは、細胞は、場合によっては癌細胞であることが企図される。他の例では、細胞は癌細胞ではない。様々な態様では、細胞は免疫細胞である。任意で、細胞に基づく態様のいずれかでは、細胞は、ヒト対象由来であり得るか、別の哺乳動物対象由来であり得る。
さらに別の態様は、過剰増殖性疾患または過剰増殖性病態を有すると診断された対象を処置する方法であって、提供される治療用構築物のうちの少なくとも1つを含む組成物の有効量を対象に投与する工程を含む方法である。この態様の様々な例では、過剰増殖性疾患は、癌、前癌、または癌転移のうちの1つまたは複数を含む。これらの方法の例では、過剰増殖性疾患は、黒色腫、肺癌、乳癌、膵癌、脳癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎癌、結腸直腸癌、リンパ腫、結腸癌、または肝癌のうちの1つまたは複数を含む。
対象を処置する提供される方法のいずれかでは、投与は様々な方法によるものであり得ることが企図される。例えば、治療方法の例では、投与工程は、対象の腫瘍への、もしくは対象の腫瘍での注射、対象の腫瘍への、もしくは対象の腫瘍での局所的な注入、対象における全身注射、対象における全身注入、または対象への局所適用のうちの1つまたは複数を含む。他の例では、投与工程は、マイクロニードル適用を含む。
それを必要とする対象（ヒト対象など）において抗癌療法の効果を増強する方法であって、それを必要とする対象に、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の有効量と、少なくとも1つの抗癌剤（例えば、化学療法剤、標的療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤）とを投与する工程を含む方法も提供される。任意で、治療用構築物または組成物と、抗癌療法とは、連続的にまたは同時に投与される。
さらに別の態様は、新生物を有すると診断された対象（ヒト対象など）において放射線療法の効果を増強する方法であって、それを必要とする対象に、提供される治療用構築物、またはそのような治療用構築物を含有する組成物の有効量と、少なくとも1つの放射線療法とを投与する工程を含む方法である。任意で、治療用構築物または組成物と、放射線療法とは、連続的にまたは同時に投与される。
本明細書において記載される治療用構築物と、少なくとも1つの抗癌剤とを含むキットも本明細書において提供される。いくつかの態様では、抗癌剤は、化学療法剤、標的療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤である。
以下、本開示の教示を支援するために、本開示の局面を追加の詳細および選択肢を用いて、以下の通り説明する:（I）治療用構築物;（II）分裂期キナーゼおよびその阻害剤;（III）免疫チェックポイント阻害剤;（IV）任意の追加の成分;（V）送達システム;（VI）抗体;（VII）薬学的組成物および投与製剤;（VIII）例示的な使用方法;（IX）キット;（X）例示的な態様;ならびに（XI）実施例。
（I）治療用構築物
少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤を含む少なくとも2つの活性剤を癌細胞に同時送達する操作された粒子を含む新たなクラスの治療薬（一般に、「治療用構築物」）が、本明細書において記載される。また、免疫チェックポイント阻害剤と、分裂期キナーゼ阻害剤と、この2つ、例えば、本明細書において記載されるもののいずれかなどを接続する化学リンカー（抗体-薬物コンジュゲート）とを含む治療用構築物が、本明細書において開示される。活性剤の比（例えば、免疫チェックポイント阻害剤に対する分裂期キナーゼ阻害剤、または分裂期キナーゼ阻害剤に対する免疫チェックポイント阻害剤）は、例えば、約1～約20（例えば、約2～約8、約4～約6、約2、約4または約6）であり得る。分裂期キナーゼ阻害剤は、治療用構築物の0.01重量％～99.9重量％（例えば、0.01～1重量％、1～5重量％、1～10重量％、1～20重量％、10～30重量％、10～40重量％、10～50重量％、25～75重量％、40～60重量％、50～75重量％、50～80重量％、75～90重量％、75～95重量％または75～99.9）で存在することができ、免疫チェックポイント阻害剤は、0.01重量％～99.9重量％（例えば、0.01～1重量％、1～5重量％、1～10重量％、1～20重量％、10～30重量％、10～40重量％、10～50重量％、25～75重量％、40～60重量％、50～75重量％、50～80重量％、75～90重量％、75～95重量％または75～99.9重量％）で存在することができる。これらの治療用構築物は、効果を達成するために必要な用量を例えば約5分の1に減少させ、用量制限毒性に達することなく、薬物を一緒に投与することを可能にする。それらは、局所（処置）部位および遠位（未処置）部位（例えば、転移）での腫瘍の阻害および発生、ならびに処置された対象の生存を増強する適応免疫を生じさせる。治療用構築物を用いて処置すると、癌はプログラム細胞死を起こすが、生き残った細胞は、PD-L1などの免疫チェックポイント分子を過剰発現する。これにより、普通であれば標的送達のための受容体の顕著な発現を有しない可能性がある残りの癌に対して、フィードフォワード様式で、構築物の標的性の高い送達を行うことが可能になる。また、分裂期キナーゼは、分裂期キナーゼ阻害時にPD-L1などの免疫チェックポイント分子を過剰発現するあらゆる癌に認められるため、治療用構築物は、広範囲な癌型に適用可能である。
いくつかの例では、化学リンカーは、1つもしくは複数のヒドラジン;ジスルフィド;N-スクシンイミジル-4-（2-ピリジルジチオ）ブタノエート;N-スクシンイミジル-4-（2-ピリジルジチオ）-2-スルホブタノエート;パーフルオロフェニル3-（ピリジン-2-イルジスルファニル）プロパノエート;2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-メチル-3-（ピリジン-2-イルジスルファニル）ブタノエート;Gly-Phe-Leu-Gly;Ala-Leu-Ala-Leu;Val-Cit;Phe-Lys;Val-Ala;Ala-Phe-Lys;Phe-Lys;nが1～20である（Gly）n;β-グルクロニドリンカー;マレイミドカプロイル;N-（マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート;4-（4-アセチルフェノキシ）ブタン酸;ジブロモマレイミド;パラアミノ安息香酸;4-ニトロフェノール;酢酸;ギ酸;4-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステル;N-（4-マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド;N-（6-マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド;3-マレイミドプロピオン酸N-スクシンイミジルエステル;N-（3-マレイミドプロピオニルオキシ）スクシンイミド;5-マレイミド吉草酸-NHS;100～10000 Daの分子量を有する直鎖状、分枝状もしくは多腕ポリエチレングリコール;プロパルギル-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル;ピロホスフェート;スクシンイミジル-4-アジドブチレート;4-アジド安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル;tert-ブチル1-（4-ホルミルフェニル）-1-オキソ-5,8,11-トリオキサ-2-アザトリデカン-13-オエート;またはそれらの残基を含み得る。いくつかの態様では、化学リンカーは、N-（マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートまたはその残基（例えば、スルホスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート）を含む。いくつかの態様では、化学リンカーは、100～10000 Daの分子量を有するポリエチレングリコール（例えば、直鎖状ポリエチレングリコール）、またはその残基を含む。
この戦略は多くの重要な特徴を有する。それらは、記憶効果を用いて癌を攻撃するように身体の免疫細胞を訓練および利用し、多くの種類の癌に適用可能であり、容易に到達可能な腫瘍に対しては局所的に、さらに深部の腫瘍および転移性腫瘍に対しては全身的に投与することができるため、効果的であり、必要とされる用量が低い（遊離薬物対応物と対比して）ために安全であり、持続的である。
治療用構築物中の各成分（例えば、有糸分裂阻害剤、分裂期キナーゼ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、送達ビヒクル、または送達ビヒクルの任意の成分）の量は、態様に応じて変化し得ることが理解されるであろう。例として、任意の個々の成分は、治療用構築物の0.001重量％～80重量％、0.01重量％～75重量％、0.5～50重量％、0.5～10重量％、0.5～5重量％、1～10重量％または2～4重量％を構成し得る。
（II）分裂期キナーゼおよびその阻害剤
癌は、制御されない細胞再生を特徴とする。有糸分裂は、一連の複雑な事象が、2つの娘細胞への染色体分離の忠実度を保証する細胞周期の段階である。タキサンおよびビンカアルカロイドを含むいくつかの現在の癌治療は、有糸分裂機構を阻害するように作用する。有糸分裂進行は、タンパク質分解と、分裂期キナーゼによって媒介されるリン酸化事象とによって主に調節される。オーロラキナーゼファミリーのメンバー（例えば、オーロラA、オーロラB、オーロラC）は、中心体分離、紡錘体動態、紡錘体形成チェックポイント、染色体整列および細胞質分裂の調節を介して有糸分裂進行を調節する（Dutertre et al.Oncogene 21:6175,2002;Berdnik et al.Curr.Biol.12:640,2002）。オーロラキナーゼの過剰発現および/または増幅は、結腸および乳房の腫瘍を含むいくつかの腫瘍型では、発癌に関連している（Warner et al.Mol.Cancer Ther.2:589,2003;Bischoff et al.EMBO 17:3062,1998;Sen et al.Cancer Res.94:1320,2002）。さらに、腫瘍細胞内のオーロラキナーゼ阻害は、有糸分裂停止およびアポトーシスをもたらし、これらのキナーゼが、癌治療の重要な標的であることを示唆している（Ditchfield,J.Cell Biol.161:267,2003;Harrington et al.Nat Med 10（3）:262-267,2004）。
分裂期キナーゼ:特定の態様では、分裂期キナーゼには、細胞増殖に不可欠なセリン/スレオニンキナーゼのオーロラファミリーのキナーゼが含まれる（Bischoff＆Plowman,Trends in Cell Biology 9:454-459,1999;Giet＆Prigent,J Cell Science 112:3591-3601,1999;Nigg,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2:21-32,2001;Adams et al.,Trends in Cell Biology 11:49-54,2001）。1997年に発見されて以来、哺乳動物オーロラキナーゼファミリーは、腫瘍発生と密接に関連付けられている。これに関する最も説得力のある証拠は、オーロラAの過剰発現が、齧歯類の線維芽細胞を形質転換することである（Bischoff et al.,EMBO J.17:3052-3065,1998）。したがって、オーロラキナーゼファミリーの阻害剤は、あらゆる腫瘍型の増殖を阻止する可能性を有する。
3つの公知の哺乳動物ファミリーメンバーであるオーロラA（「1」）、B（「2」）およびC（「3」）は、染色体分離、有糸分裂紡錘体機能および細胞質分裂を担う高度に相同なタンパク質である。それらは、このキナーゼドメインが位置するC末端領域では高度に保存されており、N末端ドメインでは配列差を示す（Nat.Rev.Cancer,5:42-49,2005）。オーロラ発現は、休止細胞では低いか検出不能であり、発現および活性は、分裂している細胞では、G2期および有糸分裂期中にピークに達する。哺乳動物細胞では、オーロラに関して提案された基質には、染色体凝縮に関与するタンパク質であるヒストンH3、およびCENP-A、ミオシンII調節軽鎖、タンパク質ホスファターゼ1、TPX2が含まれ、これらはいずれも細胞分裂に必要である。
オーロラBは、後期G2期と終期との間に発現される。オーロラBは、内側セントロメア領域および紡錘体中間帯に位置する。オーロラBは、中期板における染色体の配向を調節し、誤った動原体-微小管相互作用を修正する。オーロラBは、ヒストンH3をリン酸化し、これにより、このヒストンがDNAと相互作用することを可能にする。これは、その後の染色体凝縮にとって重要である。オーロラCは、オーロラBと高い配列相同性を示し、減数分裂において機能を有する。
本明細書において使用される場合、用語「オーロラAキナーゼ」は、有糸分裂進行に関与するセリン/スレオニンキナーゼを指す。オーロラAキナーゼは、AIK、ARK1、AURA、BTAK、STK6、STK7、STK15、AURORA2、MGC34538およびAURKAとしても知られている。TPX-2、XIEg5（ゼノパス属（Xenopus））およびD-TACC（ショウジョウバエ属（Drosophila））を含めて、細胞分裂に何らかの役割を果たす様々な細胞タンパク質は、オーロラAキナーゼ酵素によるリン酸化のための基質である。また、オーロラAキナーゼ酵素は、それ自体、例えばThr288での自己リン酸化のための基質である。場合によっては、オーロラAキナーゼはヒトオーロラAキナーゼである。
特定の態様では、分裂期キナーゼには、ポロ様キナーゼ（「PLK」）が含まれる。ポロ様キナーゼ1（「PLK1」）、ポロ様キナーゼ2（「PLK2」）、ポロ様キナーゼ3（「PLK3」）およびポロ様キナーゼ4（「PLK4」）を含むPLKは、有糸分裂紡錘体の形成および変化、ならびに有糸分裂中のCDK/サイクリン複合体の活性化に関与する（Strebhardt＆Ullrich,Nature Reviews Cancer 6（4）:321,2006）。Plkは腫瘍内で過剰発現し、その過剰発現は、予後不良、および総生存率の低下に関連する。したがって、PLKの阻害剤は、癌薬物療法として開発されてきた。
特定の態様では、分裂期キナーゼには、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ（CDK）が含まれる。CDKは、真核細胞周期事象のタイミングおよび協調の調節因子である（Norbury＆Nurse,Annu.Rev.Biochem.61:441-470,1992;Sher,Science 274:1672-1677,1996）。したがって、CDK、それらの調節因子およびそれらの基質は、多くのヒト癌では、遺伝子変異の標的である（Kamb et al.,Science 264:436-440,1994;Nobori et al.,Nature 368:753-756,1994;Spruck et al.,Nature 370:183-184,1994;Hunter＆Pines,Cell 66:1071-1074,1991;Keyomarsi＆Pardee,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:1112-1116,1993;Wang,Nature 369:669-671,1994）。サイクリン依存性キナーゼファミリーのメンバーには、Cdk2およびCdk4が含まれる。いずれも細胞周期のG1期では活性であり、G1/S期移行への進入を調節する。1つの経路では、これらのキナーゼは、網膜芽細胞腫タンパク質のリン酸化を調節する。基質のリン酸化はE2F転写因子を放出し、E2F転写因子は、次に、S期進入に必要な遺伝子の発現を調節する。したがって、これらのキナーゼの阻害は、S期への細胞進入と、下流の増殖事象とを阻止する。
特定の態様では、分裂期キナーゼには、単極紡錘体1（MPS1）キナーゼが含まれる。TTKとしても知られるMPS1キナーゼは、染色体整列を制御し、紡錘体形成チェックポイント（SAC）の重要な調節因子としての動原体-微小管相互作用の安定性に影響を及ぼす二重セリン/スレオニンキナーゼ（dual serine/threonine kinase）である。SACは、適切な染色体整列および染色体分離に不可欠である。MPS1は、増殖している細胞内にのみ発現され、有糸分裂中にリン酸化されると活性化され、この場合、不可欠なSACタンパク質、例えば、Mad1（有糸分裂停止欠損タンパク質（mitotic arrest deficient protein）1）およびMad2（有糸分裂停止欠損タンパク質2）の適切な動原体動員に必要とされる。MPS1はまた、広範囲のヒト腫瘍内で過剰発現され、腫瘍細胞増殖に必要である。
特定の態様では、分裂期キナーゼには、Nek（（never in mitosis gene a）関連キナーゼ）2が含まれる。Nek2は、中心体に局在し、C-Nap1（ヌクレオソーム集合タンパク質-1）、ルートレチンおよびNlp（ニネイン様タンパク質）を含む基質のリン酸化を介して紡錘体極の構成および分離を調節するセリン/スレオニンキナーゼである。Nek2はまた、その中心体の役割に加えて、クロマチン凝縮および紡錘体チェックポイント制御に関与している。Nek2の発現および活性は、細胞周期依存的に厳密に調節される。発現レベルは、G1では低く、S/G2では増加している。Nek2は、癌細胞では異常に発現される。
特定の態様では、分裂期キナーゼには、Wee1キナーゼが含まれる。Wee1キナーゼは、有糸分裂阻害剤であり、有糸分裂前DNA修復のためのG2細胞周期チェックポイント停止を維持する。Wee1は、進行した肝細胞癌、乳癌、結腸癌、肺癌、セミノーマおよび神経膠芽腫などの癌では過剰発現され、その発現は、マントル細胞リンパ腫では、患者の生存と相関している。
当業者であれば、公的な配列データベースにおいて容易に入手可能な、分裂期キナーゼの代表的な配列を利用する方法を理解するであろう。以下の表は、サンプル配列情報を提供する:
Figure 2022540652000005
分裂期キナーゼ阻害剤:分裂期キナーゼ阻害剤の例には、PLK1（例えば、GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、BI6727またはボラセルチブ）、PLK2、PLK3、PLK4、オーロラキナーゼ1/2（例えば、アリセルチブ）、CDK1/2、CHK1/2（例えば、AZD7762、プレキサセルチブ）、BUB1、BUBR1、MPS1、NEK2、HASPINに対する阻害剤が含まれる（Schmit et al.,Mol Cancer Ther.6（7）:1920-31,2007）。これらの分裂期キナーゼは、小分子阻害剤、オリゴヌクレオチド（例えば、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、および/または抗体を用いて標的とすることができ、いずれも本出願において企図される。
非特異的オーロラA阻害剤には、MLN8054（Millennium Pharmaceuticals、Cambridge,MA;Jones et al.,Proc Am Soc Clin Oncol Annu Meet 25:3577,2007）;MK-0457（VX-680;Harrington et al.,Nat Med 10（3）:262-267,2004）;SU6668（Sugen;Lapenna＆Giordano,Nature Rev Drug Discovery 8:547-566,2009、および補足情報）;およびキナゾリン骨格に基づく阻害剤であるZM447439（Girdler et al.,J.Cell Sci.,119,3664-3675,2006）が含まれる。
特定の態様では、オーロラAキナーゼの選択的阻害剤には、例えば、米国特許第2008/0045501号、米国特許第7,572,784号、国際公開公報第2005/111039号、国際公開公報第2008/021038号、米国特許第7,718,648号、国際公開公報第2008/063525号、米国特許第2008/0167292号、米国特許第8,026,246号、国際公開公報第2010/134965号、米国特許第2010/0310651号、国際公開公報第2011/014248号、米国特許第2011/0039826号および米国特許第2011/0245234号に開示される化合物;ナトリウム4-｛［9-クロロ-7-（2-フルオロ-6-メトキシフェニル）-5H-ピリミド［5,4-（i］［2］ベンズアゼピン-2-イル］アミノ｝-2-メトキシベンゾエート;KW-2449（Kyowa Hakko）、ENMD-2076（ENMD-981693;EntreMed）;ならびにMK-5108（Vertex/Merck）が含まれる。
他のオーロラキナーゼ阻害剤には、Hesperadin（Hauf et al.,J Cell Biol 161（2）:281-294,2003）、AZD1152（キナゾリンプロドラッグ、活性代謝産物はAZD-1152-HQPAである;AstraZeneca、Cambridge,UK;Schellens et al.,J Clin Oncol 24:122s,2006;Yang et al.,Blood 110（6）:2034-2040,2007）、MLN8237（アリセルチブ、オーロラAキナーゼの選択的、競合的および可逆的な小分子阻害剤;Millennium Pharmaceuticals、Cambridge,MA;Gorgun et al.,Blood 115（25）:5202-5213,2010;Friedberg et al.,J Clin Oncol 32（1）:44-50,2014）;CYC-116（Cyclapolin 1;Cyclacel Ltd.、Cambridge,UK;Taylor＆Peters,Curr Opin Cell Biol 20:77-84,2008）;AS-703569（R-763;Rigel Pharmaceuticals,San Francisco,CA）;AT9283（Astex;Howard et al.,J Med Chem 52（2）:379-388,2009）;PHA-739358（3-アミノピラゾール誘導体;Nerviano Medical Sciences;Carpinelli et al.,Mol Cancer Ther 6（12）:3158-3168,2007）;PHA-680632（Soncini et al.,Clin Cancer Res 12（13）:4080-4089,2006）;SNS-314（Sunesis Pharmaceuticals、San Francisco,CA;Lapenna＆Giordano,Nature Reviews Drug Discovery 8:547-566,2009、および補足情報）;およびPF-3814735（Bhattacharya et al.,Am Assoc Canc Res 68（9）Supplement LB-147,2008）が含まれる。Gautschi et al.,Clin.Cancer Res.14（6）:1639-48,2008に概説。国際公開公報第01/21596号には、オーロラ2キナーゼを阻害するキナゾリン誘導体が記載されている。30を超える小分子オーロラキナーゼ阻害剤が、前臨床開発および臨床開発の様々な段階にある（Lapenna＆Giordano Nature Reviews Drug Discovery 8:547-566,2009、および補足情報;Kollareddy et al.,Invest New Drugs 30（6）:2411-2432,2012）。
細胞周期阻害剤JNJ-7706621は、いくつかのサイクリン依存性キナーゼ（CDK）およびオーロラキナーゼの強力な阻害を示し、様々な起源の腫瘍細胞の増殖を選択的に阻止する。JNJ-7706621は、低濃度では細胞の増殖を遅らせ、高濃度では細胞傷害性を誘導する。細胞のJNJ-7706621治療は、細胞周期のG1を通した進行の遅延と、G2-M期における細胞周期の停止とを示した（Emanuel et al.,Cancer Res.65:9038-9046,2005）。
CDKの阻害剤は、例えば、EP1244668、EP1507780、EP153976、EP1590341 EP1615926、国際公開公報第03/63764号、米国特許第6,107,305号、米国特許第6,413,974号、国際公開公報第1999/02162、国際公開公報第2000/12486号、国際公開公報第2000/39101号、国際公開公報第2001/14375号、国際公開公報第2002/10162号、国際公開公報第2002/04429号、国際公開公報第2002/096888号および国際公開公報第2003/7076437号に記載されている。いくつかのアデノシンδ'-三リン酸（ATP）競合性の有機小分子およびペプチドが、癌の潜在的治療のためのCDK阻害剤として文献に報告されている。
また、小分子サイクリン依存性キナーゼ阻害剤が、Glab et al.,FEBS Lett.353:207-211,1994;Kitagawa et al.,Oncogene 8:2425-2432,1993;Losiewicz et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.201:589-595,1994;Carlson et al.,Cancer Res.56:2973-2978,1996;Kelland,Expert Opin.Invest.Drugs 9:2903-2911,2000;Senderowicz,Invest.New Drugs 17:313-320,1999;およびVassilev et al.,PNAS 103（28）:10660-10665,2006に記載されている。特定の態様では、CDK阻害剤には、フラボピリドール（Senderowicz Invest New Drugs 17（3）:313-320,1999）;オロモウシン（Vesely et al.,Eur.J.Biochem.224:771-786,1994）;ロスコビチン（Meijer et al.,Eur.J.Biochem.243:527-536,1997）;CDKi-277（Amgen、Thousand Oaks,CA;Payton et al.,Cancer Res.66:4299-4308,2006）;RO-3306（Vassilev et al.,PNAS 103（28）:10660-10665,2006）;パーバラノールA（Villerbu et al.,Int.J.Cancer 97:761-769,2002）;NU6140（Pennati et al.,Mol.Cancer Ther.4:1328-1337,2005）;s-CR8（Bettayeb et al.,Oncogene 27:5797-5807,2008）;N-＆-N1（GP0210;Greenpharma S.A.S.、Orleans,France;Bettayeb et al.,Mol.Cancer Ther.7:2713-2724,2008）;AZ703（AstraZeneca、Cambridge,UK;Byth et al.,Mol.Cancer Ther.5:655-664,2006）;JNJ-7706621（Johnson＆Johnson、New Brunswick,NJ;Emanuel et al.,Cancer Res.65:9038-9046,2005）;RGB-286199（GPC Biotech AG、Planegg,Germany;Wang et al.,Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.46,Abstr.4428,2005）;およびSNS-032（Sunesis Pharmaceuticals、San Francisco,CA;Choong et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.18:5763-5765,2008;Fan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.18:6236-6239,2008）が含まれ得る。
ポロ様キナーゼ阻害剤には、Scytonemin（Stevenson et al.,Inflamm Res 51:112-114,2002）;Wortmannin（Liu et al.,Chem Biol 12:99-107,2005）;ON-01910（またはON 01910.Na;多標的静脈内細胞周期阻害剤;Onconova Therapeutics Inc.,Newtown,PA;Gumireddy et al.,Cancer Cell 7:275-286,2005）;BI-2536（PLK1のATP競合性阻害剤;Boehringer Ingelheim、Ingelheim,Germany;Steegmaier et al.,Current Biology 17:316-322,2007）;BI 6727（PLKのジヒドロプテリジノン誘導体阻害剤;Boehringer Ingelheim、Ingelheim,Germany;Rudolph et al.,Clin Cancer Res 15（9）:3094-3102,2009;GSK-61364（またはGSK-461364A;PLK1の選択的静脈内チオフェンアミド阻害剤;Laquerre et al.A potent and selective Polo-like kinase 1（Plk1）inhibitor（GSK461364）induces cell cycle arrest and growth inhibition of cancer cell.第98回American Association for Cancer Research Annual Meeting,Los Angeles,CA,April 14-18,2007で発表）;HMN-214（PLK1の経口スチルベン誘導体阻害剤;活性剤HMN-176のプロドラッグ;Nippon Shinyaku Co.Ltd、Kyoto,Japan;Garland et al.,Clin Can Res 12:5182-5189,2006）;ZK-チアゾリジノン（TAL;PLK1のATP競合性阻害剤;Bayer Schering Pharma AG、Berlin,Germany;Santamaria et al.,Mol Biol Cell 18:4024-4036,2007）;NMS-1（経口で利用可能な選択的PLK1阻害剤;Nerviano Medical Sciences、Milano,Italy;Beria et al.Antitumoral activity of pyrazoloquinazoline derivatives as potent oral Plk-1 specific inhibitors.第20回European Organization for Research and Treatment of Cancer-National Cancer Institute-American Association for Cancer Research Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics,Geneva,Switzerland,October 21-24,2008で発表）;CYC-800（ベンズチアゾール-3-オキシド誘導体選択的PLK1阻害剤;Cyclacel Ltd.、Cambridge,UK;McInnes et al.,Curr Top Med Chem 5:181-197,2005）;DAP-81（PLKを標的とするジアミノピリミジン誘導体;Rockefeller University、New York;Peters et al.,Nat Chem Biol 2:618-626,2006）;LC-445（PLK3の特異的非ATP競合性アロステリック阻害剤;Avalon Pharmaceuticals、Germantown,MD;Horrigan et al.A small molecule allosteric inhibitor of Polo-like kinase 3 induces apoptosis and disrupts the integrity of the mitotic spindle apparatus in cancer cells.第20回European Organization for Research and Treatment of Cancer-National Cancer Institute-American Association for Cancer Research Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics,Geneva,Switzerland,October 21-24,2008で発表）;セントリノン（centrinone）（LCR-263）およびセントリノン-B（LCR-323）（PLK4の阻害剤;Wong et al.,Science 348（6239）:1155-1160,2015）が含まれる。Plk阻害剤は、Schoffski The Oncologist 14:559-570,2009に記載されている。
MPS1キナーゼの阻害剤には、NMS-P715（ピラゾロ-キナゾリン;Colombo et al.,Cancer Res 70（24）:10255-10264,2010）;Mps-1-IN-1およびMps1-IN-2（Kwiatkowski et al.,Nat Chem Biol 6（5）:359-368 2010;Mps-1-IN-3（Bakhos et al.,JNCI:Journal of the National Cancer Institute 105（17）:1322-1331,2013）;ならびにMPI-0479605（Tardif et al.,Mol Cancer Ther 10（12）:2267-2275,2011が含まれる。
特定の態様では、分裂期キナーゼ阻害剤には、Nek2のアミノピラジン阻害剤が含まれる（Whelligan et al.,J Med Chem 53:7682-7698,2010）。
Wee1キナーゼの阻害剤には、PD0166285（WEE1の非選択的阻害剤であるピリド-ピリミジン誘導体）;PD0407824（WEE1の選択性の高い阻害剤であるピロロカルバゾール誘導体）;WEE1阻害剤II（ピロロカルバゾール誘導体）;および4-（2-フェニル）-9-ヒドロキシピロロ［3,4-c］-カルバゾール-1,3-（2H,6H）-ジオン（PHCD）が含まれる。De Witt Hamer et al.（2011）Clin Cancer Res;17（13）:4200-4207;Palmer et al.（2006）J Med Chem 49:4896-4911.
用語「［標的タンパク質］の阻害剤」または「［標的タンパク質］阻害剤」は、標的タンパク質と相互作用し、その活性、例えば酵素活性を阻害することができる化合物を表すために使用される。例として、標的キナーゼ酵素活性を阻害することとは、その標的キナーゼが基質ペプチドまたは基質タンパク質をリン酸化する能力を低下させることを意味する。様々な態様では、キナーゼ活性のそのような低下は、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％または少なくとも約90％である。様々な態様では、標的キナーゼのキナーゼ酵素活性（または別の標的の活性）を低下させるために必要とされるキナーゼ阻害剤（または別の阻害剤）の濃度は、約1μM未満、約500nM未満、約100nM未満または約50nM未満である。態様では、標的（標的キナーゼなど）の酵素活性を阻害するために必要とされる濃度は、他のキナーゼ、または同じファミリーの他のタンパク質、もしくは活性を共有する他のタンパク質の酵素活性を阻害するために必要とされる阻害剤の濃度よりも低い。様々な態様では、標的タンパク質の酵素活性を低下させるために必要とされる阻害剤の濃度は、他のタンパク質、特に他の類似のタンパク質（他のキナーゼなど）の酵素活性を低下させるために必要とされる阻害剤の濃度の少なくとも約2分の1、少なくとも約5分の1、少なくとも約10分の1、少なくとも約20分の1、少なくとも約50分の1、少なくとも約100分の1、少なくとも約500分の1または少なくとも約1000分の1である。阻害剤はまた、オリゴヌクレオチド（例えば、siRNA、アンチセンス）を使用して、元のmRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルの少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％または少なくとも約90％だけ、標的タンパク質、または標的タンパク質をコードするmRNAの減少を誘導することができる。
特定の態様では、PLK1などの分裂期キナーゼの阻害は、例えば、リン酸化STAT3または他の免疫抑制経路の減少を介して免疫抑制性腫瘍微小環境を調節し、それによって、抗腫瘍免疫応答に利益をもたらすことができる。
（III）免疫チェックポイント阻害剤
チェックポイント阻害剤療法は、近年開発された形態の癌免疫療法である。この療法は、免疫系の作用を刺激または阻害し、免疫系の攻撃を防ぐために腫瘍が使用し得る、免疫系の重要な調節因子である免疫チェックポイントを標的とする。チェックポイント療法は、阻害性チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させることができる（Pardoll,Nature Revs.Cancer 12（4）:252-264,2012）。免疫チェックポイントを標的とする最初の抗癌薬は、2011年に米国で承認されたCTLA-4遮断薬イピリムマブであった（Cameron et al.,Drugs 71（8）:1093-1104,2011）。また、Wieder et al.,J Allergy Clin Immunol.142（5）:1403-1414,2018も参照されたい。
免疫チェックポイント阻害剤は、免疫系を処置することによって癌を間接的に処置する。免疫チェックポイントの阻害剤は、例えば、チェックポイント分子の発現のダウンレギュレーションによって、またはチェックポイント分子に結合し、正常な受容体/リガンド相互作用を遮断することによって、免疫チェックポイント分子の正常な免疫抑制機能を阻害する。免疫チェックポイント分子は抗原に対する免疫系応答にブレーキをかけるため、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、この免疫抑制効果を低下させ、免疫応答を増強する。免疫チェックポイントに何らかの役割を果たす分子には、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）およびプログラム細胞死1 T細胞受容体（PD-1）が含まれる。
CTLA-4、PD-1およびそれらのリガンドは、T細胞および他の細胞の機能のあらゆる段階にわたって重要な役割を果たす共シグナル伝達分子のCD28-B7ファミリーのメンバーである。PD-1受容体は、活性化T細胞（およびB細胞）の表面に発現され、正常な状況下では、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞の表面に発現されるそのリガンド（PD-L1およびPD-L2）に結合する。この相互作用は、T細胞にシグナルを送り、T細胞を本質的にオフに切り替えるか、T細胞を阻害する。癌細胞は、その表面上でPD-L1の高レベルの発現を促進することによって、このシステムを利用する。これにより、癌細胞は、PD-1経路の制御を獲得し、腫瘍微小環境に入り得る、PD-1を発現するT細胞をオフに切り替え、ひいては抗癌免疫応答を抑制することができる。T細胞の表面上のCTLA-4を標的とするモノクローナル抗体である免疫療法イピリムマブは、黒色腫の治療のために承認されている。プログラム細胞死-1（PD-1）T細胞受容体またはそのリガンド（PD-L1またはPD-L2）を対象とした様々な新たな標的免疫療法も有効であることが証明される可能性がある。追加の免疫チェックポイント標的、例えば、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3（TIM-3）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG-3）、様々なB7リガンド、BTLA、アデノシンA2A受容体（A2AR）なども有効であることが証明される可能性がある。
現在承認されている免疫チェックポイント阻害剤の標的には、CTLA-4、PD-1およびPD-L1が含まれる。PD-1は、PD-L1（PD-1リガンド1またはCD274）と相互作用する膜貫通プログラム細胞死1タンパク質（PDCD1およびCD279とも呼ばれる）である。細胞表面上のPD-L1は、免疫細胞表面上でPD-1に結合し、免疫細胞活性を阻害する。PD-L1の重要な機能は、T細胞活性の調節である（Butte et al.,Immunity 27（11）;111-122,2007;Karwacz et al.,EMBO Mol.Med.3（10:581-592,2011）。細胞表面上のPD-L1の癌媒介性アップレギュレーションは、普通であれば癌細胞を攻撃し得るT細胞を阻害し得ると思われる。PD-1またはPD-L1のいずれかに結合し、したがって相互作用を遮断する抗体は、T細胞が腫瘍を攻撃することを可能にし得る（Syn et al.,The Lancet Oncology 18（12）:e731-e741,2017）。
免疫系では、拒絶と自己寛容との間の重要な均衡は、微調整された一連の共制御性受容体-リガンド相互作用によって維持される。近年、腫瘍免疫寛容の重要なメディエーターとして、プログラム細胞死（PD）-1/PD-1リガンド（PD-L1、B7-H1）経路が注目されている。生理学的条件下では、阻害性PD-1受容体は、T細胞、B細胞およびNK細胞を含む活性化免疫エフェクター細胞上に発現される。抗原提示細胞（APC）上に通常発現されるそのリガンドPD-L1およびPD-L2との相互作用により、炎症過程中の末梢組織内では、免疫エフェクター活性は自己制限される。この阻害系は、ウイルスおよび細菌の細胞内感染の排除中に健康な組織および非感染細胞を保護するための基礎である。ただし、多くのヒト癌は、PD-1リガンドを発現し、ひいては腫瘍微小環境（TME）内で免疫寛容を局所的に誘導し、免疫攻撃から腫瘍細胞が逃れるのを促進することが示されている。腫瘍細胞上のPD-L1の発現を促進する2つの一般的な機構が仮定されている。一部の腫瘍では、異常なシグナル伝達経路がPD-L1発現を構成的にアップレギュレートすることができ、これは「自然免疫耐性」と呼ばれる現象である。他方では、PD-L1の発現は、抗腫瘍免疫応答中にTME内で産生される炎症性サイトカインに応答して生じる適応機構である（「適応免疫耐性」）。PD-L1発現のこれらの機構は相互に排他的ではなく、すなわち、腫瘍細胞上の構成的なPD-L1発現は、インターフェロンγ（IFN-g）などのサイトカインによってさらにアップレギュレートされ得る。
処置前の腫瘍細胞によるPD-L1発現は、抗PD-1単独療法（例えば、ニボルマブ（Bristol-Myers Squibb;OPDIVO（商標））、ペンブロリズマブ（Merck;KEYTRUDA（登録商標））および抗PD-L1療法（例えば、MPDL3280A（Genentech/Roche））に対する応答と高度に相関する。追加のチェックポイント阻害剤には、イピリムマブおよびトレメリムマブ（CTLA-4を標的とする）;アテゾリズマブ（Genentech/Roche;Tecentriq）、アベルマブ（Merck;Bavencio）およびデュルバルマブ（Medimmune/Strazeneca;Imfinzi）（PD-L1を標的とする）;ならびにセミプリマブ（REGN-2810）、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびピディリズマブ（PD-1を標的とする）が含まれる。スパルタリズマブ（PDR001;Novartis）もPD-1阻害剤として開発中である。
癌の治療を含むPD-1遮断治療の方法は、当技術分野において周知である。例えば、国際公開公報第2016/201425号、米国特許第2019/0275705号、Kvistborg et al.（Science Transl Med.6（254）:254ra128,2014）、Zou et al.（Science Transl Med.8（328）:328rv4,2016）、およびSakuishi et al.J Exp Med.207（10）:2187-2194,2010）を参照されたい。
PD-1遮断剤には、癌を処置するために（すなわち、腫瘍細胞の増殖または生存を阻害するために）使用されるものが含まれる。抗体または抗PD-1剤もしくは他のチェックポイント阻害剤を使用して増殖が阻害され得る癌には、典型的には免疫療法に応答性の癌が含まれるが、これまで免疫療法に関連付けられていなかった癌も含まれる。処置のための癌の例には、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部の扁平上皮癌、肝癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫および他の新生物性悪性腫瘍が含まれる。本明細書において記載される処置は、生検または外科的物質中の腫瘍浸潤リンパ球の存在に関連して改善された無病生存期間および総生存率を示す悪性腫瘍、例えば、黒色腫、結腸直腸癌、肝癌、腎癌、胃/食道癌、乳癌、膵癌および卵巣癌に適用可能である。このような癌サブタイプは、Tリンパ球による免疫制御を受けやすいことが知られている。さらに、提供される技術は、PD-1または他のチェックポイント遮断治療を使用して増殖が阻害され得る難治性または再発性の悪性腫瘍を処置するのに有用である。特に、癌には、試験した組織試料中のPD-1および/またはそのリガンドPD-L1および/またはPD-L2の発現上昇を特徴とするもの、例えば、卵巣癌、腎癌、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、肝癌、神経膠芽腫、非小細胞肺癌、胃癌、食道癌および黒色腫が含まれる。癌にはまた、例えば、カポジ肉腫、肝癌、上咽頭癌、リンパ腫、子宮頸癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌および口腔癌と因果関係があることが知られているヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルスクラスA、BおよびC、エプスタイン・バーウイルス、ヒトパピローマウイルスなどのウイルスによる持続感染に関連するものが含まれる。
PD-1/PD-L1経路は、癌治療のための抗体治療薬の開発のための十分に検証された標的である。抗PD-1抗体はまた、慢性ウイルス感染に対して有用であり得る。急性ウイルス感染後に生成されるメモリーCD8＋T細胞は、高度に機能的であり、防御免疫の重要な構成要素を構成する。対照的に、慢性感染は、ウイルス特異的T細胞応答の様々な程度の機能障害（疲弊）を特徴とすることが多く、この欠陥は、宿主が持続性病原体を排除することができない主な理由である。機能性エフェクターT細胞は、感染の初期段階で最初に生成されるが、慢性感染の過程で徐々に機能を失う。Barber et al.（Nature 439:682-687,2006）は、LCMVの実験用株に感染させたマウスが、血液および他の組織内に高レベルのウイルスをもたらす慢性感染を発症することを示した。これらのマウスは、最初は堅牢なT細胞応答を発現したが、最終的にはT細胞疲弊時に感染に屈した。著者らは、慢性感染マウスでは、エフェクターT細胞の数および機能の低下が、PD-1とPD-L1との間の相互作用を遮断する抗体を注射することによって逆転され得ることを見出した。
特定の態様では、免疫チェックポイント分子には、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、CD160、B7-H3（CD276）、BTLA（CD272）、IDO（インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ）、アデノシンA2A受容体（A2AR）およびC10ORF54が含まれる。
用語「免疫チェックポイントタンパク質」または「免疫チェックポイント分子」は、T細胞によって発現され、シグナル（刺激性チェックポイント分子）を強めるか、シグナル（阻害性チェックポイント分子）を弱める分子を指す。免疫チェックポイント分子は、CTLA-4依存性経路およびPD-1依存性経路と同様の免疫チェックポイント経路を構成することが当技術分野において認識されている（例えば、Pardoll,Nature Rev Cancer 12:252-264,2012;Mellman et al.,Nature 480:480-489,2011を参照）。阻害性チェックポイント分子の例には、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、CD277、IDO、KIR、PD-1、LAG-3、TIM-3およびVISTAが挙げられる。アデノシンA2A受容体（A2AR）は、腫瘍微小環境が比較的高レベルのアデノシンを有し、これにより、A2ARの活性化を通じてネガティブ免疫フィードバックループがもたらされるため、癌治療では重要なチェックポイントと考えられている。CD276とも呼ばれるB7-H3は、初めは共刺激分子であると理解されていたが、現在は共阻害性と考えられている。VTCN1とも呼ばれるB7-H4は、腫瘍細胞および腫瘍関連マクロファージによって発現され、腫瘍エスケープに何らかの役割を果たす。BおよびTリンパ球アテニュエーター（BTLA）は、CD272とも呼ばれ、HVEM（ヘルペスウイルス侵入メディエーター）のリガンドである。BTLAの細胞表面発現は、ナイーブ細胞表現型からエフェクター細胞表現型へのヒトCD8＋T細胞の分化中に徐々にダウンレギュレートされるが、腫瘍特異的ヒトCD8＋T細胞は、高レベルのBTLAを発現する。CD152とも呼ばれるCTLA-4は、制御性T（Treg）細胞上で過剰発現され、T細胞増殖を制御するように機能する。IDOは、自然免疫および適応免疫を調節する、トリプトファンからキヌレニンへの代謝経路におけるトリプトファン分解酵素である。IDOは、T細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞を抑制し、Tregおよび骨髄性抑制性細胞を生成および活性化し、腫瘍血管新生を促進することが知られている。別の重要な分子には、トリプトファンからキヌレニンへの代謝経路における重要な酵素であるTDO、トリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼがある（Platten et al.,Front Immunol.5:673,2014）。KIRは、NK細胞上のMHCクラスI分子に対する受容体である。LAG-3は、Tregに対する作用と、CD8＋T細胞に対する直接的な作用とによって免疫応答を抑制するように機能する。PD-1、プログラム細胞死1（PD-1）受容体は、2つのリガンド、PD-L1およびPD-L2を有する。このチェックポイントは、2014年9月にFDAの承認を得た黒色腫薬Keytruda（登録商標）（ペンブロリズマブ、Merck＆Co.、Kenilworth,NJ）の標的である。PD-1を標的とする利点は、腫瘍微小環境内で免疫機能を回復させることができることである。TIM-3は、活性化ヒトCD4＋T細胞上に発現され、Th1サイトカインおよびTh17サイトカインを調節する。TIM-3は、そのリガンドであるガレクチン-9と相互作用すると細胞死を引き起こすことによって、Th1/Tel機能の負の調節因子として作用する。T細胞活性化のVドメインIg抑制因子（VISTA）は、造血細胞上で主に発現されるため、腫瘍内の白血球上のVISTAの一定した発現により、VISTA遮断が広範囲の固形腫瘍にわたって効果的になり得る。
用語「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫阻害性チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物を指す。阻害には、機能の低下および完全な遮断が含まれる。特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を特異的に認識する抗体である。特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ペプチド、抗体、核酸分子および小分子を含む。特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、対象のCD8＋T細胞、特に対象の腫瘍浸潤CD8＋T細胞の増殖、遊走、持続性および/または細胞傷害活性を増強するために投与される。
免疫チェックポイント阻害剤には、CTLA-4、PD-1、PD-L1などのうちの少なくとも1つを（直接的または間接的に）阻害する薬剤が含まれる。本開示の方法で使用するのに適した抗CTLA-4療法剤には、抗CTLA-4抗体、ヒト抗CTLA-4抗体、マウス抗CTLA-4抗体、哺乳動物抗CTLA-4抗体、ヒト化抗CTLA-4抗体、モノクローナル抗CTLA-4抗体、ポリクローナル抗CTLA-4抗体、キメラ抗CTLA-4抗体、イピリムマブ、トレメリムマブ、抗CD28抗体、抗CTLA-4アドネクチン、抗CTLA-4ドメイン抗体、一本鎖抗CTLA-4断片、重鎖抗CTLA-4断片、軽鎖抗CTLA-4断片、共刺激経路を刺激する、CTLA-4の阻害剤、国際公開公報第2001/014424号に開示されている抗体、国際公開公報第2004/035607号に開示されている抗体、米国特許第2005/0201994号に開示されている抗体、およびEP1212422に開示されている抗体が含まれる。追加の抗CTLA-4抗体は、米国特許第5,811,097号、米国特許第5,855,887号、米国特許第6,051,227号、米国特許第6,984,720号、国際公開公報第01/14424号、国際公開公報第00/37504号、米国特許第2002/0039581号および米国特許第2002/086014号に記載されている。本開示の方法で使用され得る他の抗CTLA-4抗体には、例えば、国際公開公報第98/42752号;米国特許第6,682,736号;米国特許第6,207,156号;Hurwitz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95（17）:10067-10071,1998;Camacho et al.,J.Clin.Oncology,22（145）:Abstract No.2505,2004（抗体CP-675206）;Mokyr et al.,Cancer Res 58:5301-5304,1998;米国特許第5,977,318号:米国特許第6,682,736号;米国特許第7,109,003号;および米国特許第7,132,281号に開示されているものが含まれる。
本開示の方法で使用するための好適な抗PD-1療法剤および抗PD-L1療法剤には、抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体、ヒト抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体、マウス抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体、哺乳動物抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体、ヒト化抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体、モノクローナル抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体、ポリクローナル抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体、キメラ抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体が含まれる。特定の態様では、抗PD-1療法剤には、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、MEDI0680（AstraZeneca、Cambridge,UK）およびそれらの組合せが含まれる。特定の態様では、抗PD-L1療法剤には、アテゾリズマブ、BMS-936559（Bristol-Myers Squibb、New York,NY）、デュルバルマブ（MEDI4736）、アベルマブ（MSB0010718C）およびそれらの組合せが含まれる。
好適な抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体は、Topalian et al.（Cancer Cell 27:450-461,2015）に記載されている。
特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、特定の免疫チェックポイント分子を阻害するように設計されたsiRNAなどの修飾リガンドまたはアンチセンス核酸分子を含むことができる。特定の態様では、siRNAは、免疫チェックポイント分子の翻訳を防止し、ひいては該タンパク質の発現を防止する。多くの免疫チェックポイント分子のゲノム配列が公知であることを考慮すると、当業者であれば、好適な阻害性アンチセンス核酸分子を設計するために常用的な方法を使用することができるであろう。
一定の態様では、チェックポイント阻害剤は、siRNA、小分子阻害剤、または癌治療に有益な、免疫チェックポイント分子に対する（免疫チェックポイント分子に特異的な）抗体であり得る。そのような標的には、PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、B7-H3、VISTA、A2ARおよびIDOが含まれる（Khair et al.,Frontiers Immunology,10:453,2019）。
当業者であれば、公開配列データベースにおいて容易に入手可能な、そのような標的の代表的な配列を利用する方法を理解するであろう。以下の表は、サンプル配列情報を提供する:
Figure 2022540652000006
（IV）任意の追加の成分
本明細書において提供される治療用構築物は、分裂期キナーゼ阻害剤および免疫チェックポイント阻害剤に加えて、任意で、1つまたは複数の任意の成分を含有し得るか、1つまたは複数の任意の成分とともに投与され得る。これらの任意の成分には、アジュバント、治療用オリゴヌクレオチド、追加の抗癌剤および標的化部分が含まれる。
アジュバント
本明細書において提供される治療用構築物は、任意で、送達ビヒクル内に含有されるか、そうでなければ送達ビヒクルと結合した少なくとも1つのアジュバント成分を含み得る。治療用構築物の態様は、特定の種類のアジュバントに限定されないが、具体例が本明細書において提供される。
一般に、アジュバントは、ワクチン組成物に混合すると（癌）抗原に対する免疫応答を増加させるか、そうでなければ改変する任意の物質である。抗原に対する免疫応答を増加させるアジュバントの能力は、典型的には、免疫媒介反応の顕著な増加、または疾患症状の低減によって明らかにされる。例えば、体液性免疫の増加は、典型的には、抗原に対して惹起された抗体の力価の顕著な増加によって現れ、T細胞活性の増加は、典型的には、抗原特異的T細胞増殖の増加、標的細胞の死、またはサイトカイン分泌に現れる。アジュバントはまた、例えば、主に体液性応答またはTh2応答を主に細胞性応答またはTh1応答に変化させることによって、免疫応答を変化させ得る。
好適なアジュバントには、TLR結合DNA置換基、例えばCpGオリゴヌクレオチド（例えば、ISS1018;Amplivax;CpG ODN 7909、CpG ODN 1826、CpG ODN D19、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2007、ODN 2395、ODN M362およびSD-101）、CpG配列を含むDNA TLRアゴニスト（例えば、dSLIM）、非CpG DNA TLRアゴニスト（例えば、EnanDIM）、およびカチオン性ペプチドコンジュゲートCpGオリゴヌクレオチド（例えば、IC30、IC31）;RNA TLRアゴニスト（例えば、ポリI:Cおよびポリ-ICLC）;アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウムおよび硫酸アルミニウムカリウム）;抗CD40抗体（例えば、CP-870、893）;サイトカイン、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）;小分子TLRアゴニスト（例えば、イミキモド、レシキモド、ガーディキモドおよび3M-052）;融合タンパク質（例えば、ImuFact IMP321、CyaAおよびONTAK）;油系アジュバントまたは界面活性剤系アジュバント、例えば、MF59、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50VおよびMontanide ISA-51;植物抽出物、例えば、サポニンに由来するQS21スティミュロン（Aquila Biotech、Worcester,Mass.,USA）;マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣物、例えばリポ多糖（例えば、モノホスホリルリピドA、OM-174、OM-197-MP-ECおよびPam3Cys）;キサンテノン誘導体（例えば、バジメザン）;それらの混合物（例えば、AS-15）;ならびに他の独自のアジュバント、例えば、Ribi's Detox、QuilまたはSuperfosが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの免疫学的アジュバント（例えば、樹状細胞に特異的なMF59およびそれらの調製物が、以前に記載されている（Dupuis et al.,Cell Immunol.186（1）:18-27,1998;Allison,Dev Biol Stand.;92:3-11,1998）。また、アジュバントとして、サイトカインを使用してもよい。いくつかのサイトカインは、リンパ系組織への樹状細胞遊走に影響を及ぼし（例えば、TNF-α）、Tリンパ球のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を促進し（例えば、GM-CSF、IL-1およびIL-4）（米国特許第5,849,589号）、免疫アジュバントとして機能する（例えば、IL-12）（Gabrilovich et al.,J Immunother Emphasis Tumor Immunol.（6）:414-418,1996）ことに直接関連している。また、Toll様受容体（TLR）、またはTLRを活性化する薬剤は、アジュバントとして使用されてもよく、「病原体関連分子パターン」（PAMPS）と呼ばれる、多くの微生物に共有される保存されたモチーフを認識するパターン認識受容体（PRR）のファミリーの重要なメンバーである。
いくつかの態様では、アジュバントは、CpGオリゴヌクレオチドを含む。CpG免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、ワクチン設定では、アジュバントの効果を増強することが報告されている。いかなる具体的に機構的な理論にも束縛されるものではないが、CpGオリゴヌクレオチドは、Toll様受容体（TLR）、主にTLR9を介して自然（非適応）免疫系を活性化することによって少なくとも部分的に機能する。CpGによって引き起こされたTLR9活性化は、予防ワクチンおよび治療ワクチンの両方で、ペプチド抗原またはタンパク質抗原、生ウイルスまたは死ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチンおよび多糖コンジュゲートを含む多種多様な抗原に対する抗原特異的な体液性応答および細胞性応答を増強する。さらに重要なことには、CpGによって引き起こされたTLR9活性化は、CD4 T細胞の助けがない場合でも、樹状細胞の成熟および分化を促進し、TH1細胞の活性化を増強し、強力な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を生成する。TLR9刺激によって誘導されるTH1バイアスは、通常TH2バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（IFA）などのワクチンアジュバントの存在下であっても維持される。CpGオリゴヌクレオチドは、製剤化された場合、もしくは他のアジュバントと同時投与された場合、または抗原が比較的弱い場合に強い応答を誘導するために特に必要なマイクロ粒子、ナノ粒子、脂質エマルジョンもしくは同様の製剤などの製剤中で、さらに大きなアジュバント活性を示す。それらはまた、免疫応答を加速し、いくつかの実験では、CpGを含まない完全用量ワクチンに匹敵する抗体応答を得ながら、抗原用量をおよそ2桁減少させることを可能にした（Krieg,Nature Reviews,Drug Discovery,5:471-484,2006）。米国特許第6,406,705号は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのCpGオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバントおよび抗原の併用を記載している。市販のCpG TLR9アゴニストは、Mologen（Berlin,GERMANY）製のdSLIM（double Stem Loop Immunomodulator）である。他のTLR結合分子、例えば、RNA結合TLR 7、RNA結合TLR 8および/またはRNA結合TLR9を使用してもよい。
例えば、バジメザンまたはAsA404（5,6-ジメチルキサンテノン-4-酢酸（DMXAA）としても知られる）などのキサンテノン誘導体もまた、本発明の態様によるアジュバントとして使用され得る。あるいは、そのような誘導体はまた、腫瘍部位で免疫を刺激するために、例えば、全身送達または腫瘍内送達を介して、本発明のワクチンと並行して投与され得る。理論に拘束されるものではないが、そのようなキサンテノン誘導体は、IFN遺伝子ISTING）受容体の刺激因子を介してインターフェロン（IFN）産生を刺激することによって機能すると考えられる（例えば、Conlon et al.,J Immunology,190:5216-5225,2013;およびKim et al.,ACS Chem Biol,8:1396-1401,2013を参照）。有用なアジュバントの他の例には、化学修飾CpG（例えば、CpR、Idera）、ポリ（I:C）（例えば、ポリi:CI2U）、非CpG細菌DNAまたは非CpG細菌RNA、ならびに免疫活性小分子および抗体、例えば、治療的におよび/またはアジュバントとして機能し得るシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、Celebrex（商標）、NCX-4016、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ（sorafinib）、XL-999、CP-547632、パゾパニブ、AZD2171、イピリムマブ、トレメリムマブおよびSC58175が含まれるが、それらに限定されない。本発明の文脈では、有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、過度の実験を用いることなく当業者によって容易に決定され得る。追加のアジュバントには、コロニー刺激因子、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF、サルグラモスチム）が含まれる。
ポリ-ICLCは、平均長約5000ヌクレオチドのポリl鎖およびポリC鎖からなる合成的に調製された二本鎖RNAであり、ポリリジンおよびカルボキシメチルセルロースを加えることによって熱変性と、血清ヌクレアーゼによる加水分解とに対して安定化されている。この化合物は、いずれもPAMPファミリーのメンバーであるTLR3とMDA5のRNAヘリカーゼドメインとを活性化し、DCおよびナチュラルキラー（NK）細胞の活性化、ならびにI型インターフェロン、サイトカインおよびケモカインの「天然混合物」の産生をもたらす。さらに、ポリ-ICLCは、2つのIFN誘導性核酵素系、すなわち、2'5'-OAS、およびPKR（4-6）としても知られるPl/eIF2aキナーゼ、ならびにRIG-IヘリカーゼおよびMDA5によって媒介されるさらに直接的な、広範囲な宿主を標的とする抗感染性効果と、おそらくは抗腫瘍効果とを発揮する。
治療用構築物と結合させることができる免疫学的アジュバントの例には、TLRリガンド、C型レクチン受容体リガンド、NOD様受容体リガンド、RLRリガンドおよびRAGEリガンドが挙げられる。TLRリガンドには、リポ多糖（LPS）およびその誘導体、ならびにモノホスホリルリピドA（MPL）、グリコピラノシルリピドA、PET-リピドAおよび3-O-デサシル-4'-モノホスホリルリピドAを含むがそれらに限定されない、リピドAおよびその誘導体が含まれ得る。具体的な態様では、免疫学的アジュバントはMPLである。別の態様では、免疫学的アジュバントはLPSである。TLRリガンドにはまた、TLR3リガンド（例えば、ポリイノシン-ポリシチジン酸（ポリ（I:C））、TLR7リガンド（例えば、イミキモドおよびレシキモド）およびTLR9リガンドが含まれ得るがそれらに限定されない。
本明細書において使用される場合、用語「TLR結合DNA置換基」は、少なくとも1つのデオキシリボ核酸を含む、toll様受容体（「TLR」）に結合することができる置換基または部分を指す。態様では、TLR結合DNA置換基は核酸である。態様では、TLR結合DNA置換基は、少なくとも1つの核酸類似体を含む。態様では、TLR結合DNA置換基は、代替骨格（例えば、ホスホジエステル誘導体（例えば、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、メチルホスホネート、ボロンホスホネートまたはO-メチルホスホロアミダイト）、ペプチド核酸骨格、LNAまたは結合）を有する少なくとも1つの核酸類似体を含む。態様では、TLR結合DNA置換基はDNAを含む。態様では、TLR結合DNA置換基中のヌクレオチド糖はいずれも、デオキシリボースである（例えば、ヌクレオチドはいずれもDNAである）。態様では、TLR結合DNA置換基は、DNAからなる。態様では、TLR結合DNA置換基は、ホスホジエステルおよびホスホジエステル誘導体（例えば、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、メチルホスホネート、ボロンホスホネート、O-メチルホスホロアミダイトまたはそれらの組合せ）から選択されるヌクレオチド間結合を有するDNAを含むか、そのようなDNAである。態様では、TLR結合DNA置換基は、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートから選択されるヌクレオチド間結合を有するDNAからなる。態様では、TLR結合DNA置換基は、ホスホジエステルおよびホスホロジチオエートから選択される骨格結合を有するDNAを含むか、そのようなDNAである。態様では、TLR結合DNA置換基は、ホスホジエステル骨格結合を含むDNAを含むか、そのようなDNAである。態様では、TLR結合DNA置換基は、ホスホロチオエート骨格結合を含むDNAを含むか、そのようなDNAである。態様では、TLR結合DNA置換基は、ホスホロジチオエート骨格結合を含むDNAを含むか、そのようなDNAである。態様では、TLR結合DNA置換基は、他のTLRよりもTLR9に優先的に結合する。態様では、TLR結合DNA置換基は、TLR9に特異的に結合する。態様では、TLR結合DNA置換基は、TLR3に特異的に結合する。態様では、TLR結合DNA置換基は、TLR7に特異的に結合する。態様では、TLR結合DNA置換基は、TLR8に特異的に結合する。態様では、TLR結合DNA置換基は、細胞サブコンパートメント（例えば、エンドソーム）関連TLR（例えば、TLR3、TLR7、TLR8またはTLR9）に特異的に結合する。態様では、TLR結合DNA置換基は、Gリッチオリゴヌクレオチドを含むか、Gリッチオリゴヌクレオチドである。態様では、TLR結合DNA置換基は、CpGモチーフを含み、ここで、CおよびGはヌクレオチドであり、pは、CおよびGを連結するホスフェートである。態様では、CpGモチーフは非メチル化である。態様では、TLR結合DNA置換基は、クラスA CpGオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）である。態様では、TLR結合DNA置換基は、クラスB CpGオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）である。態様では、TLR結合DNA置換基は、クラスC CpGオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）である。態様では、TLR結合DNA置換基（例えば、TLR9結合DNA置換基）は、A塩基、G塩基、C塩基またはT塩基と、ホスホジエステル結合および/またはホスホジエステル誘導体結合（例えば、ホスホロチオエート結合）とを有するデオキシリボ核酸からなる。
「CpGモチーフ」という語句は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホジエステル誘導体ヌクレオチド間結合を介して3'Gヌクレオチドに連結された5'Cヌクレオチドを指す。態様では、CpGモチーフは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を含む。態様では、CpGモチーフは、ホスホジエステル誘導体ヌクレオチド間結合を含む。
本明細書において使用される場合、用語「クラスA CpG ODN」または「AクラスCpG ODN」または「D型CpG ODN」または「クラスA CpG DNA配列」は、生物学的科学および化学的科学におけるその一般的な意味に従って使用され、5'、3'もしくは両末端にあるポリG配列;CpGモチーフを含む内部回文配列;またはデオキシヌクレオチドを結合する1つもしくは複数のホスホジエステル誘導体のうちの1つまたは複数を含むオリゴデオキシヌクレオチドを含むCpGモチーフを指す。態様では、クラスA CpG ODNは、5'、3'または両末端にあるポリG配列と、CpGモチーフを含む内部回文配列と、デオキシヌクレオチドを結合する1つまたは複数のホスホジエステル誘導体とを含む。態様では、ホスホジエステル誘導体はホスホロチオエートである。クラスA CpG ODNの例には、ODN D19、ODN 1585、ODN 2216およびODN 2336が挙げられる。
用語「クラスB CpG ODN」または「BクラスCpG ODN」または「K型CpG ODN」または「クラスB CpG DNA配列」は、生物学的科学および化学的科学におけるそれらの一般的な意味に従って使用され、CpGモチーフを含む6量体モチーフ;あらゆるデオキシヌクレオチドを結合するホスホジエステル誘導体のうちの1つまたは複数を含むオリゴデオキシヌクレオチドを含むCpGモチーフを指す。態様では、クラスB CpG ODNは、CpGモチーフを含む6量体モチーフ、およびあらゆるデオキシヌクレオチドを結合するホスホジエステル誘導体の1つまたは複数のコピーを含む。態様では、ホスホジエステル誘導体はホスホロチオエートである。態様では、クラスB CpG ODNは、CpGモチーフを含む1つの6量体モチーフを含む。態様では、クラスB CpG ODNは、CpGモチーフを含む6量体モチーフの2つのコピーを含む。態様では、クラスB CpG ODNは、CpGモチーフを含む6量体モチーフの3つのコピーを含む。態様では、クラスB CpG ODNは、CpGモチーフを含む6量体モチーフの4つのコピーを含む。クラスB CpG ODNの例には、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006およびODN 2007が挙げられる。
用語「クラスC CpG ODN」または「CクラスCpG ODN」または「C型CpG DNA配列」は、生物学的科学および化学的科学におけるそれらの一般的な意味に従って使用され、CpGモチーフを含む回文配列と、あらゆるデオキシヌクレオチドを結合するホスホジエステル誘導体（ホスホロチオエート）とを含むオリゴデオキシヌクレオチドを指す。クラスC CpG ODNの例には、ODN 2395およびODN M362が挙げられる。
治療用オリゴヌクレオチド
任意で、提供される治療用構築物は、1つまたは複数の治療用オリゴヌクレオチドを含有し得る。様々なタイプの治療用オリゴヌクレオチドを使用することができ、様々なタイプの治療用オリゴヌクレオチドには、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、DNA、mRNA、sgRNA（CRISPR用）およびCRISPR-cas9エレメントが非網羅的に含まれ得る。換言すれば、特定の遺伝子およびタンパク質の作用または合成を特異的に調節（干渉または増強）することができる限り、ヌクレオチドの任意の鎖を利用することができる。各特定のオリゴヌクレオチドは、単一または複数の標的を有し得る。本発明にとって関心対象の遺伝子/タンパク質標的の例には、免疫チェックポイント（本明細書において他の箇所で説明される）、転写因子、ホスファターゼ、キナーゼなどが挙げられる。具体的な標的には、限定されることなく、STAT3、TGF-β、CD47、NOX1～5、HSP47、XBP1、BCL2、BCL-XL、AKT1、AKT2、AKT3、MYC、HER2、HER3、AR、サバイビン、GRB7、EPS8L1、RRM2、PKN3、EGFR、IRE1-α、VEGF-R1、RTP801、proNGF、ケラチンK6A、LMP2、LMP7、MECL1、HIF1α、フューリン、KSP、eiF-4E、p53、β-カテニン、ApoB、PCSK9、SNALP、CD39、CD73、MIF、VEGF、PIGF、CXCR4、CCR2、PLK1、MTDH、Twist、Lcn2、IL-6、IL-10、p65、および前述の分裂期キナーゼ（例えば、PLK1、PLK2、PLK3、PLK4、CDK1、CDK2、CHK1、CHK2、BUB1、BUBR1、MPS1、NEK2、HASPIN、オーロラA）が含まれる。治療用オリゴヌクレオチドはまた、2つの遺伝子を標的とする2本の鎖を含むことができる（例えば、BCL2およびAKT1に対するsiRNA、ARおよびMYCに対するsiRNA）。それらはまた、免疫応答を同時に増強し、標的遺伝子の発現を調節することができる免疫刺激配列/エレメントを含むことができる。それらは、変異を有する前述の遺伝子を標的とするように設計することもできる。
一定の態様では、治療用構築物は、活性剤として、RNA干渉を媒介するオリゴヌクレオチドを含む。RNA干渉は、二本鎖RNA（dsRNA）によって引き起こされ、dsRNAに相同な遺伝子の転写物をダウンレギュレートすることができる高度に保存された機構である。dsRNAは、ダイサーによって、低分子干渉RNA（siRNA）と呼ばれる21～23ヌクレオチドの短い二本鎖に最初にプロセシングされる。dsRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に組み込まれると、標的mRNAの切断を介して遺伝子サイレンシングを媒介することができる。「siRNA」または「低分子干渉リボ核酸」は、生理学的条件下で相補的領域に沿ってハイブリダイズするリボヌクレオチドの2本の鎖を指す。siRNA分子は、標的遺伝子のmRNAの領域と実質的に同一の二本鎖領域を含む。標的遺伝子の対応する配列と100％の同一性を有する領域が適している。この状態を「完全に相補的」という。ただし、この領域はまた、標的とされるmRNAの領域の長さに応じて、標的遺伝子の対応する領域と比較して1つ、2つまたは3つのミスマッチを含む場合があり、したがって、完全に相補的でない場合がある。特定の標的配列の発現を効果的に阻害するために十分な配列同一性を有するsiRNAを分析および同定する方法は当技術分野において公知である。好適なmRNA標的領域はコード領域であると考えられる。非翻訳領域、例えば、5'-UTR、3'-UTRおよびスプライスジャンクションもまた、それらの領域が、mRNA標的に固有であり、mRNAポリA尾部を対象としていない限り、好適である。
いくつかの態様では、治療用構築物内にカプセル化されたか治療用構築物と結合したsiRNAが、RNA干渉を含む方法およびシステムで利用される。そのような態様は、siRNA分子の特定のサイズまたはタイプに限定されない。標的に相補的なsiRNAの領域の長さは、例えば、15～100ヌクレオチド、18～25ヌクレオチド、20～23ヌクレオチド、または15、16、17もしくは18ヌクレオチド超であり得る。対応する標的領域にミスマッチがある場合、相補的領域の長さは、一般に、幾分長くする必要がある。
一定の態様では、本明細書において開示される治療用構築物を使用するsiRNA送達手法（例えば、治療用構築物上にsiRNAを負荷することによって）を使用して、関心対象の任意の遺伝子の発生を阻害することができることが企図される。具体的な標的には、癌および他の疾患におけるドライバーとして知られる遺伝子の中で、STAT3、TGF-β、CD47、NOX1～5、HSP47、XBP1、BCL2、BCL-XL、AKT1、AKT2、AKT3、MYC、HER2、HER3、AR、サバイビン、GRB7、EPS8L1、RRM2、PKN3、EGFR、IRE1-α、VEGF-R1、RTP801、proNGF、ケラチンK6A、LMP2、LMP7、MECL1、HIF1α、フューリン、KSP、eiF-4E、p53、β-カテニン、ApoB、PCSK9、SNALP、CD39、CD73、MIF、VEGF、PIGF、CXCR4、CCR2、PLK1、MTDH、Twist、Lcn2、IL-6、IL-10、p65、および前述の分裂期キナーゼが含まれるがそれに限定されるわけではない。さらに、siRNAは、野生型遺伝子ではなく、変異体または変異遺伝子を対象とし得ることが特に企図される。
当業者であれば、公開配列データベースにおいて容易に入手可能な、これらの標的の代表的な配列を利用する方法を理解するであろう。以下の表は、サンプル配列情報を提供する:
Figure 2022540652000007
Figure 2022540652000008
Figure 2022540652000009
Figure 2022540652000010
そのような態様は、インビトロおよび/またはインビボでsiRNAの送達プロファイルを評価する特定の様式に限定されない。いくつかの態様では、イメージング剤（例えば、蛍光色素FITC、RITC、Cy（商標）色素、Dylight（登録商標）色素、Alexa Fluor（登録商標）色素またはランタニドプローブ）または放射性トレーサーによってsiRNA分子を標識することにより、器官レベルでのsiRNA分子の生体内分布と細胞内送達プロファイルとの可視化が可能になる。いくつかの態様では、それぞれmRNAレベルおよびタンパク質レベルで標的タンパク質を分析するために、RT-PCRおよびウエスタンブロットが使用される。
一定の態様では、本発明は、RNA干渉によって標的遺伝子を阻害することができるsiRNAを細胞（治療用構築物と結合した）に導入する工程を含む、細胞内の標的遺伝子を阻害する方法であって、siRNAが、互いに相補的な2本のRNA鎖を含み、siRNAが、治療用構築物上に負荷される方法を提供する。いくつかの態様では、siRNAは3'センス鎖でコレステロールによって修飾されている。いくつかの態様では、細胞は、ヒトまたは動物対象（例えば、ウマ、イヌ、ネコ、もしくは他の飼育動物、家畜、または癌を有する他の動物）内にある。
マイクロRNA（miRNA）またはmiRNA模倣物は、3'-UTRエレメントを介してタンパク質コード遺伝子を標的化し、実質的にサイレンシングすることができる短い非コードRNAである。多数の生物学的プロセスに果たすmiRNAの重要な役割が確立されているが、複雑な疾患におけるmiRNA機能の包括的な分析は不足している。miRNAは一次miRNA（pri-miRNA）として最初に転写され、これが次いで、核RNAse DroshaおよびPashaによって切断されて、前駆体-miRNA（pre-miRNA）が得られる。これらの前駆体は、細胞質RNAse IIIダイサーによってさらにプロセシングされて、短い二本鎖miR-miR＊二重鎖を形成し、その一方の鎖（miR）は、次いで、酵素ダイサーおよびアルゴノート（Ago）を含むRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に組み込まれる。成熟型miRNA（約17～約24nt）は、標的遺伝子の3'UTR内に位置する特定の標的部位にRISCを導く。標的部位に結合すると、miRNAは、mRNA分解、翻訳阻害、および/またはプロセシングボディ（Pボディ）への隔離を介して翻訳を抑制する（Eulalio et al.,Cell,132:9-14,2008;Behm-Ansmant et al.,Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.,71:523-530,2006;Chu and Rana,Plos.Biology.,4:e210,2006）。近年の推定では、60％を超えるタンパク質コード遺伝子が、3'-UTR miRNA標的部位を有することが見出されている（Friedman et al.,Genome Res.,19:92-105,2009）。これに関して、miRNAは、初期発生（Reinhart et al.,Nature,403:901-906,2000）、細胞増殖および細胞死（Brennecke et al.,Cell,113（1）:25-36,2003）、アポトーシスおよび脂肪代謝（Xu et al.,Curr.Biol.,13（9）:790-795,2003）、ならびに細胞分化（Chen et al.,Mol.Microbiol.,53843-856,2004;Dostie et al.,RNA-A Publication of the RNA Society,9:180-186,2003）のように多様な過程の重要な調節因子として作用する。さらに、慢性リンパ性白血病（Calin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105:5166-5171,2008）、結腸腺癌（Michael et al.,Mol.Cancer Res.,1:882-891,2003）、バーキットリンパ腫（Metzler et al.,Genes Chromosomes Cancer,39:167-169,2004）、心疾患（Zhao et al.,Cell,129:303-317,2007）およびウイルス感染（Pfeffer et al.,Science,304:734-736,2004）におけるmiRNA発現の試験は、miRNAと多数の疾患との間の重要な関連を示唆している。
これまでに観察されているmiRNAは、約21～約22ヌクレオチド長を有し、それらは、非タンパク質コード遺伝子から転写されるさらに長い前駆体から生じる。Carrington and Ambros（Science,301（5631）:336-338,2003）に概説。前駆体は、自己相補的領域内で互いに折り返す構造を形成する。次いで、それらは、動物ではヌクレアーゼダイサー（または植物ではDCL1）によってプロセシングされる。miRNA分子は、それらの標的との正確なまたは不正確な塩基対形成を介して翻訳を中断する。いくつかの態様では、miRNAは、疾患、例えば癌などを処置するために、対象、例えばヒト患者に、治療的に提供されるか、投与される治療用構築物の成分として使用され得る。あるいは、いくつかの態様では、miRNAに相補的な核酸が、インビボで対象に治療的に投与されるか、インビトロで使用されて、所望の治療用miRNA（例えば、miRNA-142-3p、miRNA-142-3p、miRNA-124またはmiRNA-138）を生じさせ得る。このように、相補的核酸を鋳型として使用して、所望の治療用miRNA（例えば、miRNA-142-3p、miRNA-142-3p、miRNA-124またはmiRNA-138）を作製してもよい。
追加の抗癌剤
「抗癌剤」という語句は、その単純な通常の意味に従って使用され、抗新生物特性または細胞の成長もしくは増殖を阻害する能力を有する組成物（例えば、化合物、薬物、アンタゴニスト、阻害剤、モジュレーター）を指す。いくつかの態様では、抗癌剤は化学療法剤である。いくつかの態様では、抗癌剤は標的療法剤である。いくつかの態様では、抗癌剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの態様では、抗癌剤は、癌を処置する方法において有用性を有する、本明細書において同定される薬剤である。いくつかの態様では、抗癌剤は、癌を処置するために、FDA、または米国以外の国の同様の規制当局によって承認された薬剤である。
抗癌剤の例には、限定されることなく、MEK（例えば、MEK1、MEK2、またはMEK1およびMEK2）阻害剤（例えば、XL518、CI-1040、PD035901、セルメチニブ/AZD6244、GSK1120212/トラメチニブ、GDC-0973、ARRY-162、ARRY-300、AZD8330、PD0325901、U0126、PD98059、TAK-733、PD318088、AS703026、BAY 869766、PD184352、SB239063、BAY 43-9006）;アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、ウラムスチン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファンおよびヘプスルファム（hepsulfam））、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムシチン（lomusitne）、セムスチンおよびストレプトゾシン）ならびにトリアゼン（例えば、デカルバジン）;代謝拮抗物質、例えば、葉酸類似体（例えば、メトトレキセート、ロイコボリン、ラルチトレキセドおよびペメトレキセド）、ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル、フロクスウリジン（floxouridine）、シタラビン、カペシタビンおよびゲムシタビン）およびプリン類似体（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、フルダラビンおよび5-アザチオプリン）;植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル、ドセタキセルおよびホモハリントニン）;トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトテシン誘導体（例えば、イリノテカンおよびトポテカン）、アムサクリンおよびエピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド（VP16）、リン酸エトポシドおよびテニポシド）;抗生物質、例えば、アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよび塩酸フルオロダウノルニシン（fluorodaunorunicin hydrochloride））、ストレプトマイセス（streptomyces）由来抗生物質もしくはその誘導体（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ゲルダナマイシン、プリカマイシンおよび17-N-アリルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン（17-AAG;タネスピマイシン）、クロファジミンおよびβラクタム誘導体;白金系化合物（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）;置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）;メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）;血管新生阻害酵素（例えば、L-アスパラギナーゼおよびアルギニンデイミナーゼ）;PI3K阻害剤（例えば、ワートマニンおよびLY294002）;mTOR阻害剤（例えば、セルトラリン）;DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-アザ-2'-デオキシシチジン）;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アポトーシス遺伝子モジュレーター;アポトーシス調節因子（例えば、デオキシアデノシンおよびトリプトライド）;BCR/ABLアンタゴニスト;bFGF阻害剤;カゼインキナーゼ阻害剤（ICOS）;硝酸ガリウム;ゼラチナーゼ阻害剤;グルタチオン阻害剤（例えば、エタニダゾール）;免疫賦活剤ペプチド;インスリン様増殖因子1受容体阻害剤;白血病阻害因子;マトリライシン阻害剤;マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤;MIF阻害剤;ミスマッチ二本鎖RNA;マイコバクテリア細胞壁抽出物;一酸化窒素モジュレーター;ホスファターゼ阻害剤;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）;プロテインA系免疫モジュレーター;タンパク質キナーゼCモジュレーター;タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤;rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;ras阻害剤;ras-GAP阻害剤;リボザイム;シグナル伝達阻害剤/モジュレーター（例えば、イトラコナゾール）;一本鎖抗原結合タンパク質;幹細胞阻害剤;幹細胞分裂阻害剤;ストロメライシン阻害剤;合成グリコサミノグリカン;テロメラーゼ阻害剤;甲状腺刺激ホルモン;翻訳阻害剤;ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（GnRH）、例えば、ゴセレリンおよびリュープロリド（リュープロレリン）;ステロイド、例えば、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾンおよびデキサメタゾン）;プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸メドロキシプロゲステロン）;抗プロゲストロゲン薬（antiprogestrogen）（例えば、ミフェプリストン）;エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）;抗エストロゲン薬、例えば、アロマターゼ阻害剤（例えば、エキセメスタン、ファドロゾール、レトロゾール、ペントロゾールおよびアナストロゾール）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、タモキシフェン類似体、タモキシフェンメチオジド類似体、パノミフェン類似体およびクロミフェン類似体）;アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）;抗アンドロゲン薬（例えば、フルタミド、フィナステリドおよびビカルタミド）;免疫賦活剤、例えば、レバミソール、インターロイキン（例えば、インターロイキン-2）およびインターフェロン/インターフェロンアゴニスト（例えば、α-インターフェロン）;モノクローナル抗体、例えば、抗CD20モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）、抗HER2モノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブ）、抗CD52モノクローナル抗体、抗CD25モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ）、抗HLA-DRモノクローナル抗体および抗VEGFモノクローナル抗体）;イムノトキシン（例えば、抗CD33モノクローナル抗体-カリチアマイシンコンジュゲート、抗CD22モノクローナル抗体-緑膿菌外毒素コンジュゲートなど）;放射免疫療法剤（例えば、111In、90Yまたは131Iにコンジュゲートされた抗CD20モノクローナル抗体など）;スタチン（例えば、セリバスタチンおよびピタバスタチン）;5-T1B受容体アゴニスト（例えば、5-ノニルオキシトリプタミン）;BRAFキナーゼ阻害剤（例えば、ベムラフェニブおよびダブラフェニブ）;チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、EGFR、HER2、KDR、FLT4、EphB4、およびSrcのうちの1つもしくは複数の阻害剤（例えば、ゲフィチニブ（Iressa（商標））、エルロチニブ（Tarceva（商標））、セツキシマブ（Erbitux（商標））、ラパチニブ（Tykerb（商標））、パニツムマブ（Vectibix（商標））バンデタニブ（Caprelsa（商標））、アファチニブ/BIBW2992、CI-1033/カネルチニブ、ネラチニブ/HKI-272、CP-724714、TAK-285、AST-1306、ARRY334543、AG-1478、ダコミチニブ/PF299804、OSI-420/デスメチルエルロチニブ、AZD8931、ARRY-380、AEE788、ペリチニブ/EKB-569、CUDC-101、WZ8040、WZ4002、WZ3146、AG-490、XL647、PD153035、BMS-599626、ソラフェニブ、イマチニブ（Gleevec（登録商標））、スニチニブならびにダサチニブ;免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗CTLA-4抗体、抗PD1/L1抗体）;PLK1阻害剤（GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、BI6727）、分裂期キナーゼ阻害剤など、またはそれらの混合物（例えば、リュープロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン）が挙げられる。
さらに、本明細書において記載される治療用構築物は、限定されることなく、免疫賦活剤（例えば、Bacille Calmette-Guerin（BCG）、レバミソール、インターロイキン-2、α-インターフェロンなど）、治療用モノクローナル抗体（例えば、抗CD20モノクローナル抗体、抗HER2モノクローナル抗体、抗CD52モノクローナル抗体、抗HLA-DRモノクローナル抗体および抗VEGFモノクローナル抗体）、イムノトキシン（例えば、抗CD33モノクローナル抗体-カリチアマイシンコンジュゲート、抗CD22モノクローナル抗体-緑膿菌外毒素コンジュゲートなど）、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体）および放射免疫療法（例えば、111In、90Yまたは131Iにコンジュゲートされた抗CD20モノクローナル抗体など）を含む従来の免疫療法剤と同時投与され得る。これらの免疫療法剤はまた、それらの治療効果を増強し、毒性を低減し、投与時間を短縮するために、治療用構築物上に直接負荷され得る。
さらなる態様では、本明細書において記載される治療用構築物は、限定されることなく、47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211Atおよび212Biなどの放射性核種を含む従来の放射線療法剤と同時投与され得る。これらの放射線療法剤はまた、治療効果を増強し、毒性を低減し、投与時間を短縮するために治療用構築物上に直接負荷され得る。
標的化部分
1つまたは複数の標的化部分（別名、標的化分子）が、送達ビヒクル内に負荷され得、送達ビヒクルの表面に付着され得、および/または送達ビヒクル内に封入され得る。態様では、標的化部分は、送達ビヒクルの外面に提示される。そのような標的化部分は、全身送達に特に有益であり得る。
例示的な標的分子には、器官、組織、細胞もしくは細胞外マトリックスまたは特定の種類の腫瘍もしくは感染細胞に関連する1つまたは複数の標的に結合するタンパク質、ペプチド、リガンド、核酸、脂質、糖または多糖が含まれる。送達ビヒクルが標的化される特異性の程度は、適切な親和性および特異性を有する標的化分子の選択によって調節され得る。例えば、抗体は非常に特異的である。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、断片、組換えまたは一本鎖であり得、その多くは市販されているか、標準的な技術を使用して容易に得られる。T細胞特異的分子、抗原および腫瘍標的化分子は、治療用構築物の表面に結合させることができる。標的化分子は、粒子の表面に存在する1つまたは複数のPEG鎖の末端にコンジュゲートされ得る。
いくつかの態様では、標的化部分は、悪性細胞（例えば、腫瘍抗原）などの標的細胞上に排他的にまたは高量で存在する細胞または腫瘍マーカーを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片（例えば、一本鎖可変断片）である。治療用構築物を関心対象の細胞および組織に導くために使用され得る好適な標的化分子、ならびに標的分子をナノ粒子にコンジュゲートする方法は、当技術分野において公知である。例えば、
Ruoslahti et al.（Nat.Rev.Cancer,2:83-90,2002）を参照されたい。一定の場合には、治療剤は、癌細胞および免疫細胞の両方に対して毒性であり、最適以下の効果をもたらし得る。したがって、一定の態様では、治療用構築物を標的化部分とコンジュゲートさせて、癌細胞のみへの少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤の送達を富化することができる。例には、非排他的に、癌細胞上に過剰発現されるHER2、EGFR、PD-L1などに対する抗体が挙げられる。いくつかの態様では、治療用構築物を標的化部分とコンジュゲートさせて、免疫細胞のみへの少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤の送達を富化することができる。
標的化分子には、ニューロピリンおよび内皮標的化分子、インテグリン、セレクチン、接着分子、骨標的化分子、例えば、ゾレドロン酸およびアレンドロン酸（例えば、骨に転移した癌を標的とするため）、間質、ならびに線維芽細胞標的化分子も含まれ得る。
いくつかの態様では、標的化部分は、抗原提示細胞（APC）、特に樹状細胞として知られる、APCのサブクラスに対して治療用構築物を標的化する。樹状細胞は、エンドサイトーシスを媒介することができるいくつかの細胞表面受容体を発現する。いくつかの態様では、治療用構築物は、腫瘍抗原をプロセシングするDCの活性を増強する。DCへの標的送達が行われてもよい。全身に分布する抗原提示細胞上の内在化表面分子に対して外因性抗原を標的化すると、粒子の取込みが促進され、治療における主要な律速段階を克服することができる。
樹状細胞標的化分子には、樹状細胞の表面に提示されるエピトープを認識し、それに結合するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはそれらの断片が含まれる。樹状細胞標的化分子にはまた、樹状細胞上の細胞表面受容体に結合するリガンドも含まれる。そのような受容体の1つであるレクチンDEC-205は、インビトロで、およびマウスに使用されて、体液性（抗体に基づく）応答および細胞性（CD8 T細胞）応答の両方を2～4桁増強している（Hawiger et al.,J.Exp.Med.,194（6）:769-79,2001;Bonifaz et al.,J.Exp.Med.,196（12）:1627-38 2002;Bonifaz et al.,J.Exp.Med.,199（6）:815-24,2004）。これらの報告では、抗原が抗DEC205重鎖に融合され、組換え抗体分子が免疫化に使用された。
マンノース特異的レクチン（マンノース受容体）およびIgG Fc受容体を含む様々な他のエンドサイトーシス受容体も、このように標的とされており、抗原提示効率が同様に向上している。標的とされ得る他の好適な受容体には、限定されることなく、DC-SIGN、33D1、SIGLEC-H、DCIR、CD11c、熱ショックタンパク質受容体およびスカベンジャー受容体が含まれる。これらの受容体を発現する免疫細胞への優先的な取込みのために、これらの受容体に対する標的化部分を治療用構築物に付着することができる。例には、高レベルのマンノース受容体を有するマクロファージおよびDCへの標的送達のために治療用構築物上に付着させたマンノースがある。
標的とされ得る他の受容体には、toll様受容体（TLR）が含まれる。TLRは、病原体関連分子パターン（PAMP）を認識し、それに結合する。PAMPは、樹状細胞の表面上のTLRを標的とし、内部でシグナル伝達し、それによって、DC抗原取込み、成熟およびT細胞刺激能力を潜在的に増大させる。粒子表面にコンジュゲートされるか共カプセル化されるPAMPには、非メチル化CpG DNA（細菌性）、二本鎖RNA（ウイルス性）、リポ多糖（細菌性）、ペプチドグリカン（細菌性）、リポアラビノマンニン（lipoarabinomannin）（細菌性）、ザイモサン（酵母）、マイコプラズマリポタンパク質、例えばMALP-2（細菌性）、フラジェリン（細菌性）ポリ（イノシン-シチジル）酸（細菌性）、リポテイコ酸（細菌性）またはイミダゾキノリン（合成）が含まれる。
標的化分子は、当技術分野において公知の様々な方法を使用して送達ビヒクルに共有結合させることができる。好ましい態様では、PEG化またはビオチン-アビジン架橋によって送達ビヒクルに標的化部分を付着させる。
CD40アゴニスト。特定の態様では、標的化部分はCD40を標的とする。該部分は、CD40アゴニストであり得る。細胞表面分子CD40は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、免疫細胞、造血細胞、血管細胞、上皮細胞、および広範囲の腫瘍細胞を含む他の細胞によって広く発現される。癌療法の潜在的な標的として、CD40は、免疫活性化の間接的な効果、および腫瘍に対する直接的な細胞傷害効果の両方を介して腫瘍退縮を媒介し、CD40アゴニストの「2対1」の作用機序をもたらし得る。CD40アゴニストは当技術分野において公知であり、Vonderheide（Clin Cancer Res,13（4）:1083-1088,2007）に概説されている。例示的なアゴニストには、組換えCD40L（組換えヒト三量体）、CD-870、893（完全ヒトIgG2 mAb）、SGN-40（ヒト化IgG1）およびHCD 122（完全ヒトIgG1 mAb）が含まれる。可溶性アゴニストCD40抗体は、T細胞媒介性免疫のマウスモデルでは、CD4＋リンパ球によって提供されるT細胞支援に取って代わることが示されている（Khalil et al.,Update Cancer Ther.,2:61-65,2007）。
インテグリンリガンド。別の態様では、標的化部分は、インテグリンに対するリガンドである。試験では、インテグリンが、腫瘍細胞の表面に過剰発現されるため、腫瘍細胞と正常細胞とを区別するマーカーとして機能し得ることが示されている。特定のインテグリンはまた、細胞外経路を介してTGF-βを活性化する。潜在型TGF-βは、腫瘍細胞から放出された後、腫瘍細胞の表面のインテグリンと結合し、潜在型TGF-βの活性化がもたらされる。腫瘍微小環境内でTGF-β濃度が増加すると、免疫抑制が支援され、制御性T細胞が腫瘍環境に動員される。
RGDペプチドは、二重の機能を果たすことができる。RGDペプチドは、典型的なインテグリン標的化リガンドであるだけでなく（Ruoslahti et al.,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,12:697-715,1996）、APCを活性化する免疫危険シグナル（immune danger signal）としても機能する（Altincicek et al.,Biol Chem.,390,1303-11,2009）。したがって、好ましい態様では、RGDペプチドは、送達ビヒクル内に負荷され、送達ビヒクルの表面に付着され、および/または送達ビヒクル内に封入される。
p53抗原を認識するT細胞受容体。特定の態様では、標的化部分は、ヒトMHCに関連してp53抗原を認識するT細胞受容体（TCR）である。アルファ鎖、ベータ鎖またはガンマ/デルタ鎖から構成されるT細胞受容体（α/β TCRまたはγ/Δ TCR）を含む、細菌細胞、真核細胞または酵母細胞に由来するT細胞受容体組換えタンパク質。
IL-15/IL-15Rα。別の態様では、標的化部分は、IL-15/IL-15Rα複合体である。インターロイキン-15（IL-15）は、特定の受容体サブユニットをIL-2と共有し、したがって、いくつかの重複する作用機序を有するサイトカインである。IL-15は、樹状細胞によって発現され、ナチュラルキラー（NK）細胞の増殖およびプライミングのための重要なシグナルを提供する。したがって、IL-15/IL-15Rα複合体を使用して、例えばナチュラルキラー（NK）細胞に対してナノ微粒子組成物を標的化することができる。
（V）送達システム
本明細書において提供される治療用構築物の態様は、少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤と少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤との同時送達のために使用される送達システムに関して非依存性である。したがって、様々な態様では、送達システムは、任意の種類の公知のまたは開発予定の微粒子送達ビヒクルを使用し得るか、それに基づき得る。これらには、ナノ粒子、フラーレン、エンドヘドラル金属フラーレン、三金属窒化物鋳型エンドヘドラル金属フラーレン、単層カーボンナノチューブおよび多層カーボンナノチューブ、分枝状カーボンナノチューブおよび樹枝状カーボンナノチューブ、金ナノロッド、銀ナノロッド、単層ホウ素/ナイトレートナノチューブおよび多層ホウ素/ナイトレートナノチューブ、リン酸カルシウム粒子、アルミニウム塩粒子、カーボンナノチューブピーポッド、カーボンナノホーン、カーボンナノホーンピーポッド、リポソーム、脂質系ナノ粒子、リポプレックス、ポリマーナノ粒子、ポリプレックス、ナノシェル、デンドリマー、マイクロ粒子、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、ナノロッド、セルロースナノ粒子、ガラスマイクロスフェアおよびガラスナノスフェア、およびポリマーマイクロスフェアおよびポリマーナノスフェア、生分解性PLGAマイクロスフェアおよび生分解性PLGAナノスフェア、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、カーボンナノ粒子、鉄ナノ粒子、多孔質シリカナノ粒子および非多孔質シリカナノ粒子、ならびに修飾ミセルが含まれる。いくつかのクラスの材料からなるハイブリッド粒子も使用することができる。ナノメートルおよびミクロンサイズの粒子を使用することができる。治療剤、アジュバントおよび任意の追加の化合物は、任意の好適な手段によって、例えば、送達システム内に負荷されたか、送達システムの表面に付着されたか、送達システムに結合されたか、送達システム内に封入されたか、送達システム内に含有された送達剤とともに含まれ得る。そのような薬剤は、カプセル化されるか、共有結合されるか、非共有結合され得る（例えば、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用または化合物特異的相互作用（そのような核酸塩基対形成、リガンド-受容体、抗体-抗原、ビオチン-アビジンなど）によって）。
いくつかの態様では、送達システムは、米国特許出願公開第US2017/0172923号および米国特許出願公開第2017/0173169号に記載されているものなどのメソポーラスシリカナノ粒子（MSNP）を含み、そのMSNPは参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様では、メソポーラスナノ粒子（または異なるナノ粒子）の平均粒径は、約5nm～約200nm、約5nm～約90nm、約5nm～約20nm、約30nm～約100nm、約30nm～約80nm、約30nm～約60nm、約40nm～約80nm、約70nm～約90nm、または約5nm、約10nm、約20nm、約30nm、約40nm、約50nm、約60nm、約70nm、約80nm、約90nmもしくは約100nmである。いくつかの態様では、メソポーラスシリカナノ粒子は、カチオン性ポリマーまたは他の化合物で被覆される。カチオン性ポリマーは、任意の適切な手段を使用してナノ粒子の表面に結合し得る。いくつかの態様では、カチオン性ポリマーは、静電相互作用を介してナノ粒子に結合する。カチオン性ポリマーは、正電荷を有する任意のポリマー、例えば、限定されることなく、PEI、ポリアミドアミン、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、キトサン、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド-コ-アクリルアミド）、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド-コ-アクリル酸）、ポリ（L-リジン）、ジエチルアミノエチル-デキストラン、ポリ（N-エチル-ビニルピリジニウムブロミド）、ポリ（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）またはポリ（エチレングリコール）-コ-ポリ（トリメチルアミノエチルメタクリレートクロリド）であり得る。他のカチオン性ポリマーは、当業者には明らかであり、例えば、Polymer Handbook,4th Edition,Edited by:Brandrup,E.H.Immergut,and E.A.Grukle;John Wiley＆Sons,2003）に見出され得る。
カチオン性ポリマーは、直鎖状または分枝状であり得る。いくつかの態様では、カチオン性ポリマーは、約500Da～約25kDaのサイズの範囲であり得、分枝状または直鎖状であり得る。例えば、1.8kDa～10kDaの平均サイズを有する分枝状PEIをナノ粒子コア上に負荷してもよい。カチオン性ポリマーとナノ粒子との比は、所望の結果に応じて変化し得る。カチオン性ポリマーは、ナノ構築物の1～50重量％、例えば、5～40重量％、10～30重量％、20～30重量％、5～15重量％、5～20重量％、5～25重量％、5～30重量％、10～20重量％、10～25重量％または25～40重量％、例えば、約5、約10、約15、約20、約25、約30または約35重量％で存在し得る。いくつかの態様では、カチオン性ポリマーは、10～20重量％で存在する。
いくつかの態様では、カチオン性ポリマーは、ナノ粒子上への被覆前または被覆後に、例えば、切断可能なジスルフィド結合によって架橋される。いくつかの態様では、付着したカチオン性ポリマーは、例えば、DSP（ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］）、DTSSP（3,3'-ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）およびDTBP（ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート）を使用して、ナノ粒子、例えばMSNPに結合した後に架橋される。架橋は、溶液中の遊離カチオン性ポリマーの非存在下または存在下で起こり得る。他の態様では、カチオン性ポリマーは架橋されていない。
安定剤は、例えば、任意の適切な手段によって、MSNP（または異なるナノ粒子）および/またはカチオン性ポリマーにコンジュゲートされ得る。いくつかの態様では、安定剤は、ナノ粒子（例えば、MSNP）上に被覆された架橋カチオン性ポリマーのアミン基または他の反応性基にコンジュゲートされる。例示的な安定剤には、限定されることなく、PEG、デキストラン、ポリシアル酸、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールおよびポリアクリルアミドまたはそれらの組合せが含まれる。
安定剤は、例えば、ナノ粒子、カチオン性ポリマーおよび/または他の成分に付着するための複数の化学反応性基を有し得る。例えば、反応性安定剤、例えばPEG誘導体は、2つの親電子部分、例えば、マイケル受容体および活性化エステルの両方を含むマレイミド-PEG-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Mal-PEG-NHS）を有し得る。本発明の組成物および方法と併せて使用される安定剤、例えばPEGは、一般に、500Da～40kDa、例えば2～10kDaの範囲の分子量を有する。安定剤は、ナノ構築物の1～50重量％、例えば、5～30重量％、10～20重量％、10～25重量％、5～15重量％、5～20重量％、5～25重量％または1～10重量％、例えば、約5、約10、約15、約20、約25、約35、約40または約45重量％で存在し得る。
本明細書において使用される「平均粒径」は、一般に、粒子集団内の粒子の統計的平均粒径（直径）を指す。本質的に球形の粒子の直径とは、物理的直径または流体力学的直径を指し得る。非球形粒子の直径とは、流体力学的直径を優先的に指し得る。本明細書において使用される場合、非球形粒子の直径とは、粒子の表面上の2点間の最大直線距離を指し得る。平均流体力学的粒径は、当技術分野において公知の方法、例えば動的光散乱を使用して測定することができる。
「単分散」および「均一なサイズ分布」は、本明細書において区別なく使用され、全粒子が同じまたはほぼ同じサイズであるナノ粒子集団またはマイクロ粒子集団を表す。本明細書において使用される場合、単分散分布とは、分布の90％がメジアン粒径の15％以内、さらに好ましくはメジアン粒径の10％以内、最も好ましくはメジアン粒径の5％以内にある粒子分布を指す。
本明細書において使用される「ナノ粒子」は、一般に、約5nm～約1ミクロン未満、好ましくは20nm～約1ミクロンの直径を有する粒子を指す。粒子は、任意の形状を有することができる。球形を有するナノ粒子は、一般に、「ナノスフェア」と呼ばれる。本発明は、癌および関連する過剰増殖性障害を治療または予防するように構成された少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤と複合体を形成するための特定のタイプまたは種類のナノ粒子に限定されない。
ナノ粒子の例には、フラーレン（別名C60、C70、C76、C80、C84）、追加の原子、イオンまたはクラスターをそのフラーレンケージの内側に含むエンドヘドラル金属フラーレン（EMI））、三金属窒化物鋳型エンドヘドラル金属フラーレン（炭素ケージ内の三金属窒化物鋳型内に形成された高対称性4原子分子クラスターエンドヘドラルであるTNT EME）、単層カーボンナノチューブおよび多層カーボンナノチューブ、分枝状カーボンナノチューブおよび樹枝状カーボンナノチューブ、金ナノロッド、銀ナノロッド、単層ホウ素/ナイトレートナノチューブおよび多層ホウ素/ナイトレートナノチューブ、カーボンナノチューブピーポッド（内部金属フラーレンおよび/または他の内部化学構造を有するナノチューブ）、カーボンナノホーン、カーボンナノホーンピーポッド、脂質粒子リポソーム、リポプレックス、ポリマーナノ粒子、ポリプレックス、ナノシェル、デンドリマー、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、ナノロッドならびにセルロースナノ粒子が挙げられる。他の例示的なナノ粒子には、ガラスマイクロスフェアおよびガラスナノスフェア、およびポリマーマイクロスフェアおよびポリマーナノスフェア、生分解性PLGAマイクロスフェアおよび生分解性PLGAナノスフェア、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、カーボンナノ粒子ならびに鉄ナノ粒子が含まれる。
いくつかの態様では、ナノ粒子は修飾ミセルである。これらの態様では、修飾ミセルは、疎水性ポリマーブロックを含むように修飾されたポリオールポリマーを含む。本開示において使用される用語「疎水性ポリマーブロック」は、それ自体が疎水性であるポリマーのセグメントを示す。本明細書において使用される用語「ミセル」は、液体中に分散した分子の凝集体を指す。水溶液中の典型的なミセルは、周囲の溶媒と接触している親水性「頭部」領域と凝集体を形成し、ミセル中心に疎水性単一尾部領域を隔離する。いくつかの態様では、頭部領域は、例えば、ポリオールポリマーの表面領域であってよく、尾部領域は、例えば、ポリオールポリマーの疎水性ポリマーブロック領域であってよい。
本発明は、ナノメートルスケールに加えてマイクロメートルスケールの粒子の使用をさらに包含する。マイクロ粒子が使用される場合、それらは比較的小さく、1～50マイクロメートル程度であることが好ましい。説明を容易にするために、本明細書における「ナノ粒子」の使用は、真のナノ粒子（約1nm～約1000nmのサイズ）、マイクロ粒子（例えば、約1マイクロメートル～約50マイクロメートル）、またはその両方を包含する。
ナノ粒子の例には、例として、限定されることなく、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー、共有結合した金属キレートを有するデンドリマー、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープおよび量子ドットが挙げられる。いくつかの態様では、ナノ粒子は、金属ナノ粒子（例えば、金、パラジウム、白金、銀、銅、ニッケル、コバルト、イリジウム、またはそれらの2つ以上の合金のナノ粒子）である。ナノ粒子は、コア-シェルナノ粒子のように、コア、またはコアおよびシェルを含むことができる。いくつかのクラスの材料からなるハイブリッド粒子も使用することができる。
それぞれ送達ビヒクル内に負荷され、送達ビヒクルの表面に付着され、および/または送達ビヒクル内に封入された少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤を含む治療用構築物含有組成物が開示される。ナノ微粒子組成物は、単数または複数の活性剤を溶液中の標的細胞に送達することを超えるいくつかの利点を提供する。例えば、ナノ微粒子組成物は、ナノ粒子上またはナノ粒子内に局所濃度の1つまたは複数の活性剤を提示し、ナノ粒子が標的細胞に遭遇した際の結合活性を増加させる。ナノ微粒子組成物はまた、単数または複数の薬剤の有効な全身半減期および有効性を延ばすように数日間にわたって延長し得る調整可能な放出動態を有する活性剤のデポーとして機能することができる。
典型的には、2つ以上の活性剤（少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤を含む）が、送達ビヒクル内に負荷され、送達ビヒクルの表面に付着され、および/または送達ビヒクル内に封入される。2つ以上の活性剤の各々の相対濃度と、送達ビヒクル上または送達ビヒクル内のそれらの位置とは、標的細胞によって受け取られる好ましい投与量および提示を適合させるために組成物の製造中に操作することができる。2つ以上の活性剤を同じ送達ビヒクル内または同じ送達ビヒクル上に負荷することにより、2つ以上の活性剤を標的細胞または同じ腫瘍微小環境に同時に提示するか、標的細胞に他の所定の順序で提示することが可能になる。
送達ビヒクルは、例えば、ナノリポゲル（nanolipogel）、ポリマー粒子、シリカ粒子、リポソームまたは多層ベシクルであり得る。一定の態様では、微粒子送達ビヒクルは、ナノスケールの組成物、例えば、10nm～約1ミクロン未満である。ただし、いくつかの態様およびいくつかの用途では、粒子は、さらに小さくても大きくてもよい（例えば、マイクロ粒子など）ことが理解されるであろう。本明細書において開示される例示的な治療用構築物はナノ微粒子組成物と呼ばれ得るが、いくつかの態様およびいくつかの用途では、微粒子組成物は、ナノ粒子よりもいくらか大きくてよいことが理解されるであろう。例えば、微粒子組成物は、約1ミクロン～約1000ミクロンであってよい。そのような組成物は、微細粒子組成物と呼ぶことができる。
癌を処置するための態様では、粒子が腫瘍微小環境に到達するのに適したサイズであることが望ましい。特定の態様では、粒子は、増強された透過性および保持（EPR）効果によって腫瘍微小環境および/または腫瘍細胞に到達するのに適したサイズである。EPRとは、特定のサイズの分子（例えば、本明細書において説明される微粒子組成物）が正常組織よりもはるかに多く腫瘍組織に蓄積する傾向がある特性を指す。したがって、癌の治療のための組成物では、送達ビヒクルは、約25nm以上約500nm以下の範囲であることが好ましく、約30nm以上約300nm以下の範囲であることがさらに好ましい。
ナノリポゲル。ナノリポゲルは、活性剤の持続的送達のためにリポソームおよびポリマー系粒子の両方の利点を組み合わせたコア-シェルナノ微粒子である。これらの態様および用途のいくつかでは、ナノリポゲルは、従来のナノ粒子組成物と比較して、巨大分子と分子との組合せについて、増加した負荷効率、増大した持続放出、および改善された治療効果を示すことができる。
典型的には、ナノリポゲルの外側シェルは、カーゴを保護し、生体適合性と、標的化分子による官能基化のための表面とを提供する。外側シェルは、例えば、環境条件または刺激に応答して、所望されるまで露出されないように成分をカプセル化し、単分散の再現性のある粒子集団を作り出し、所望の細胞型への内在化を媒介する。内側コアは、デンドリマーまたは他のポリマーであってよく、外側シェルに対して別個の付加的な機能を有する。例えば、内側シェルは、薬物、ワクチンまたはイメージング剤の二次堆積を可能にし、粒子内への異なる物理化学的特性を有する成分の負荷を増加させ、粒子からの内容物の調整可能な放出を可能にし、エンドソームを破壊することによって、DNA/RNA、薬物および/またはタンパク質の細胞質ゾル利用可能性を増加させ、これらいずれによっても薬物効果、抗原提示、およびトランスフェクション/サイレンシングが増強される
ナノリポゲルは、1つまたは複数のホスト分子を含むポリマーマトリックスコアを有する。ポリマーマトリックスは、好ましくは、ヒドロゲル、例えば、ポリエチレングリコールなどの1つまたは複数のポリ（アルキレンオキシド）セグメントと、ポリ乳酸などの1つまたは複数の脂肪族ポリエステルセグメントとを含む架橋ブロックコポリマーである。1つまたは複数のカーゴ分子は、ポリマーマトリックス内に分散されているか、ポリマーマトリックスに共有結合している。ヒドロゲルコアは、リポソームシェルによって取り囲まれている。
ナノリポゲルは、制御された様式でその後に放出され得る様々な活性剤を組み込むように構築することができる。活性剤は、ヒドロゲルマトリックス内に分散させることができ、リポソームシェル内に分散させることができ、リポソームシェルに共有結合させることができ、およびそれらの組合せが可能である。活性剤は、ナノリポゲル内のこれらの場所の各々に選択的に組み込むことができる。さらに、これらの場所の各々からの活性剤の放出速度は、独立して調整することができる。これらの場所の各々は、サイズおよび疎水性/親水性を含む異なる特性を有するため、これらの場所の各々に独立して組み込まれた化学成分は、サイズおよび組成に関して劇的に異なり得る。例えば、ナノリポゲルに、ポリマーマトリックス内に分散した1つまたは複数の化合物、ならびに少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤を負荷することができる。ナノリポゲルは、化学組成および分子量が大きく異なる薬剤の同時持続放出をもたらすことができる。
ナノリポゲルは、典型的には球形であり、平均粒径は、約50nm～約1000nm、さらに好ましくは約75nm～約300nm、最も好ましくは約90nm～約200nmの範囲である。一定の態様では、ナノリポゲルは、約100nm～約140nmの平均粒径を有する。粒子は非球形であってよい。
ナノリポゲルのリポソームシェル内に存在する脂質の性質に応じて、正、負またはほぼ中性の表面電荷を有するナノリポゲルを調製してもよい。一定の態様では、ナノリポゲルは、ほぼ中性の表面電荷を有する。一定の態様では、ナノリポゲルは、約10mV～約-10mV、さらに好ましくは約5mV～約-5mV、さらに好ましくは約3mV～約-3mV、最も好ましくは約2mV～約-2mVのζ電位を有する。
タンパク質などの疎水性活性剤は、ナノリポゲルの表面に共有結合していてもよいのに対して、親水性活性剤は、ナノリポゲルの表面に共有結合していてもよいか、リポソームシェル内に分散していてもよい。一定の態様では、リポソームシェルは、1つまたは複数のPEG化脂質を含む。これらの場合、1つまたは複数の活性剤は、リポソームシェルの表面上に存在する1つまたは複数のPEG鎖の末端にコンジュゲートされ得る。
別の態様では、脂質は、アビジン部分を含むように修飾され、所望であれば、ビオチン化標的化部分、検出可能な標識、または他の活性剤をそれに結合させることを可能にする。
特定の態様では、1つまたは複数の活性剤は、所望の生理学的場所で活性剤の放出を引き起こすように、周囲pHの変化などの外部の化学的刺激または物理的刺激に応答して切断される結合基を介してナノリポゲルの表面に共有結合している。
コア。ナノリポゲルコアは、ポリマーマトリックスから形成される。マトリックスは、以下にさらに詳細に説明されるように、1つまたは複数のホスト分子を含むことができる。ナノリポゲルコアは、1つまたは複数の活性剤をさらに含み得る。活性剤は、ホスト分子に複合体化されてもよいか、ポリマーマトリックスに分散されてもよいか、それらの組合せであってよい。
ナノリポゲルのポリマーマトリックスは、1つまたは複数のポリマーまたはコポリマーから形成され得る。ポリマーマトリックスの組成および形態を変化させることによって、様々な制御放出特性を達成し、長期間にわたって中程度の一定用量の1つまたは複数の活性剤の送達を可能にすることができる。
ポリマーマトリックスは、非生分解性ポリマーまたは生分解性ポリマーから形成され得る。ただし、好ましくは、ポリマーマトリックスは生分解性である。ポリマーマトリックスは、1日～1年間、さらに好ましくは7日～26週間、さらに好ましくは7日～20週間、最も好ましくは7日～16週間の範囲の期間にわたって分解するように選択され得る。ポリマーの分子量を増加させるために、生分解性架橋剤が使用されてもよく、生分解性架橋剤は、架橋剤の分解後に小さな断片として身体から除去することが可能である。
一般に、合成ポリマーが好ましいが、天然ポリマーを使用してもよい。代表的なポリマーには、ポリ（ヒドロキシ酸）、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）、ポリヒドロキシアルカノエート、例えば、ポリ3-ヒドロキシブチレートまたはポリ4-ヒドロキシブチレート;ポリカプロラクトン;ポリ（オルトエステル）;ポリ無水物;ポリ（ホスファゼン）;ポリ（ラクチド-コ-カプロラクトン）;ポリ（グリコリド-コ-カプロラクトン）;ポリカーボネート、例えばチロシンポリカーボネート;ポリアミド（合成ポリアミドおよび天然ポリアミドを含む）、ポリペプチドおよびポリ（アミノ酸）;ポリエステルアミド;他の生体適合性ポリエステル;ポリ（ジオキサノン）;ポリ（アルキレンアルキレート）;親水性ポリエーテル;ポリウレタン;ポリエーテルエステル;ポリアセタール;ポリシアノアクリレート;ポリシロキサン;ポリ（オキシエチレン）/ポリ（オキシプロピレン）コポリマー;ポリケタール;ポリホスフェート;ポリヒドロキシバレレート;ポリアルキレンオキサレート;ポリアルキレンサクシネート;ポリ（マレイン酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン;ポリ（アルキレンオキシド）、例えばポリエチレングリコール（PEG）;誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース（例えば、メチルセルロース）、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸のポリマー、メタクリル酸、またはエステルを含むそれらのコポリマーもしくは誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）およびポリ（オクタデシルアクリレート）（本明細書においてまとめて「ポリアクリル酸」と呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、コポリマーおよびブレンドが含まれる。
本明細書において使用される場合、「誘導体」には、当業者によって常用的に行われる上記のポリマー骨格への置換、化学基の付加および他の修飾を有するポリマーが含まれる。タンパク質、例えば、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、プロラミン、例えば、ゼイン、ならびに多糖、例えば、アルジネートおよびペクチンを含む天然ポリマーが、ポリマーマトリックスに組み込まれてもよい。様々なポリマーを使用してポリマーマトリックスを形成してもよいが、一般に、得られるポリマーマトリックスはヒドロゲルである。一定の場合には、ポリマーマトリックスが天然ポリマーを含む場合、天然ポリマーは、加水分解によって分解するバイオポリマー、例えばポリヒドロキシアルカノエートである。
ポリマーマトリックスは、任意で1つまたは複数の架橋性ポリマーを含有してもよい。好ましくは、架橋性ポリマーは、1つまたは複数の光重合性基を含み、ナノリポゲル形成後のポリマーマトリックスの架橋を可能にする。好適な光重合性基の例には、ビニル基、アクリレート基、メタクリレート基およびアクリルアミド基が挙げられる。光重合性基は、存在する場合、架橋性ポリマーの骨格内に、架橋性ポリマーの側鎖のうちの1つもしくは複数の中に、架橋性ポリマーの末端のうちの1つもしくは複数に、またはそれらの組合せに組み込まれてもよい。
ポリマーマトリックスは、特定の用途に最適な薬物放出速度を含む特性を有するナノリポゲルを形成するように、様々な分子量を有するポリマーから形成され得る。一般に、ポリマーマトリックスを構成するポリマーは、約500 Da～約50 kDaの範囲の平均分子量を有する。ポリマーマトリックスが非架橋性ポリマーから形成される場合、ポリマーは、典型的には、約1 kDa～約50 kDa、さらに好ましくは約1 kDa～約70 kDa、最も好ましくは約5 kDa～約50 kDaの範囲の平均分子量を有する。ポリマーマトリックスが架橋性ポリマーから形成される場合、ポリマーは、典型的には、約500 Da～約25 kDa、さらに好ましくは約1 kDa～約10 kDa、最も好ましくは約3 kDa～約6 kDaの範囲のさらに低い平均分子量を有する。特定の態様では、ポリマーマトリックスは、約5 kDaの平均分子量を有する架橋性ポリマーから形成される。
いくつかの態様では、ポリマーマトリックスは、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、または1つもしくは複数のポリ（アルキレンオキシド）セグメントを含むブロックコポリマーから形成される。ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーまたはポリ（アルキレンオキシド）ポリマーセグメントは、8～500個の繰返し単位、さらに好ましくは40～300個の繰返し単位、最も好ましくは50～150個の繰返し単位を含み得る。好適なポリ（アルキレンオキシド）には、ポリエチレングリコール（ポリエチレンオキシドまたはPEGとも呼ばれる）、ポリプロピレン1,2-グリコール、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリプロピレン1,3-グリコールおよびそれらのコポリマーが含まれる。
いくつかの態様では、ポリマーマトリックスは、脂肪族ポリエステル、または1つもしくは複数の脂肪族ポリエステルセグメントを含むブロックコポリマーから形成される。好ましくは、ポリエステルまたはポリエステルセグメントは、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（グリコール酸）PGAまたはポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）である。
いくつかの態様では、ポリマーマトリックスは、1つまたは複数のポリ（アルキレンオキシド）セグメントと、1つまたは複数の脂肪族ポリエステルセグメントと、任意で1つまたは複数の光重合性基とを含むブロックコポリマーから形成される。これらの場合、1つまたは複数のポリ（アルキレンオキシド）セグメントは、得られたポリマーマトリックスが好適なヒドロゲルを形成するように、ポリマーに必要な親水性を付与するのに対して、ポリエステルセグメントは、調整可能な疎水性/親水性特性および/または所望のインビボ分解特性を有するポリマーマトリックスを提供する。
ポリエステルセグメントの分解速度、および多くの場合、対応する薬物放出速度は、数日（純粋なPGAの場合）から数ヶ月（純粋なPLAの場合）まで変化させることができ、ポリエステルセグメント内のPLAとPGAとの比を変化させることによって容易に操作することができる。さらに、ポリ（アルキレンオキシド）、例えばPEG、ならびに脂肪族ポリエステル、例えば、PGA、PLAおよびPLGAは、ヒトに使用するのに安全であるとして確立されている。これらの材料は、30年超にわたって、薬物送達システムを含むヒト臨床用途に使用されてきた。
一定の態様では、ポリマーマトリックスは、中心ポリ（アルキレンオキシド）セグメントと、中心ポリ（アルキレンオキシド）セグメントのいずれかの末端に付着した隣接する脂肪族ポリエステルセグメントと、1つまたは複数の光重合性基とを含むトリブロックコポリマーから形成される。好ましくは、中心ポリ（アルキレンオキシド）セグメントはPEGであり、脂肪族ポリエステルセグメントはPGA、PLAまたはPLGAである。
一般に、中心ポリ（アルキレンオキシド）セグメントの平均分子量は、隣接するポリエステルセグメントの平均分子量よりも大きい。一定の態様ではでは、中心ポリ（アルキレンオキシド）セグメントの平均分子量は、隣接するポリエステルセグメントのうちの1つの平均分子量の少なくとも3倍であり、さらに好ましくは、隣接するポリエステルセグメントのうちの1つの平均分子量の少なくとも5倍であり、最も好ましくは、隣接するポリエステルセグメントのうちの1つの平均分子量の少なくとも10倍である。
場合によっては、中心ポリ（アルキレンオキシド）セグメントは、約500 Da～約10,000 Da、さらに好ましくは約1,000 Da～約7,000 Da、最も好ましくは約2,500 Da～約5,000 Daの範囲の平均分子量を有する。特定の態様では、中心ポリ（アルキレンオキシド）セグメントの平均分子量は、約4,000 Daである。典型的には、各隣接するポリエステルセグメントは、約100 Da～約3,500 Da、さらに好ましくは約100 Da～約1,000 Da、最も好ましくは約100 Da～約500 Daの範囲の平均分子量を有する。
天然ポリマーの例には、タンパク質、例えば、アルブミン、コラーゲン、ゼラチンおよびプロラミン、例えばゼイン、ならびに多糖、例えば、アルジネート、セルロース誘導体およびポリヒドロキシアルカノエート、例えばポリヒドロキシブチレートが挙げられる。マイクロ粒子のインビボ安定性は、ポリエチレングリコール（PEG）と共重合したポリ（ラクチド-コ-グリコリド）などのポリマーを使用することによって製造中に調整することができる。PEGが外面に露出している場合、PEGの親水性のためにこれらの材料が循環する時間が増加する可能性がある。
非生分解性ポリマーの例には、エチレンビニルアセテート、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、コポリマーおよびそれらの混合物が挙げられる。
マトリックスはまた、従来のイオンゲル化技術によって製造されたアルジネートなどのゲル型ポリマーから作製することもできる。ポリマーは、水溶液に最初に溶解され、硫酸バリウムまたは何らかの生物活性剤と混合され、次いで、場合によっては液滴を破壊するために窒素ガスの流れを使用する微小液滴形成装置を通して押し出される。ゆっくり撹拌される（約100～170RPM）イオン硬化浴を押出装置の下に配置して、形成される微小液滴を捕捉する。ゲル化が起こるのに十分な時間を可能にするために、マイクロ粒子を浴中で20～30分間インキュベートする。マイクロ粒子サイズは、様々なサイズの押出機を使用するか、窒素ガスまたはポリマー溶液の流量を変化させることによって制御される。キトサンマイクロ粒子は、ポリマーを酸性溶液に溶解し、トリポリホスフェートを用いて架橋することによって調製することができる。カルボキシメチルセルロース（CMC）マイクロ粒子は、ポリマーを酸溶液に溶解し、鉛イオンを用いてマイクロ粒子を沈殿させることによって調製することができる。負に帯電したポリマー（例えば、アルジネート、CMC）の場合、異なる分子量の正に帯電したリガンド（例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン）をイオン結合させることができる。
おそらく最も広く使用されているのは、脂肪族ポリエステル、特に疎水性ポリ（乳酸）（PLA）、比較的親水性のポリ（グリコール酸）PGAおよびそれらのコポリマー、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）である。これらのポリマーの分解速度、および多くの場合、対応する薬物放出速度は、数日（PGA）から数ヶ月（PLA）まで変化し得、PLAとPGAとの比を変化させることによって容易に操作される。第2に、PLGAおよびそのホモポリマーPGAおよびPLAの生理学的適合性は、ヒトに対する安全な使用について確立されている。これらの材料は、薬物送達システムを含む様々なヒト臨床用途では、30年超の歴史を有する。PLGAナノ粒子は、受動的標的化または能動的標的化のいずれかによって薬物動態と標的組織への生体内分布とを改善する様々な方法で製剤化することができる。マイクロ粒子は、数日から数週間にわたって、カプセル化または付着される分子を放出するように設計される。放出持続時間に影響を及ぼす因子には、周囲の培地のpH（PLGAの酸触媒加水分解によるpH5以下での比較的速い放出速度）と、ポリマー組成とが含まれる。脂肪族ポリエステルは疎水性が異なり、これにより、分解速度に影響が及ぼされる。具体的には、疎水性ポリ（乳酸）（PLA）、比較的親水性のポリ（グリコール酸）PGAおよびそれらのコポリマー、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）は、様々な放出速度を有する。これらのポリマーの分解速度、および多くの場合、対応する薬物放出速度は、数日（PGA）から数ヶ月（PLA）まで変化し得、PLAとPGAとの比を変化させることによって容易に操作される。
シェル構成要素。ナノリポゲルは、1つまたは複数の同心脂質単層または脂質二重層から構成されるリポソームシェルを含む。シェルは、1つまたは複数の活性剤、標的化分子またはそれらの組合せをさらに含むことができる。
ナノリポゲルは、1つまたは複数の同心脂質単層または脂質二重層から構成されるリポソームシェルを含む。リポソームシェルの組成は、インビボで1つまたは複数の活性剤の放出速度に影響を及ぼすように変化させてもよい。また、所望であれば、インビボ薬物放出を変化させるために、脂質を共有結合的に架橋してもよい。
脂質シェルは、単一の脂質二重層（単層）またはいくつかの同心脂質二重層（多層）から形成することができる。脂質シェルは、単一の脂質から形成されてもよい。ただし、好ましい態様では、脂質シェルは、複数の脂質の組合せから形成される。脂質は、生理学的pHで中性、アニオン性またはカチオン性であり得る。
好適な中性脂質およびアニオン性脂質には、ステロールおよび脂質、例えば、コレステロール、リン脂質、リゾ脂質、リゾリン脂質およびスフィンゴ脂質が含まれる。中性脂質およびアニオン性脂質には、1,2-ジアシル-グリセロ-3-ホスホコリンを含むホスファチジルコリン（PC）（卵PC、大豆PCなど）;ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（PI）;糖脂質;スフィンゴリン脂質、例えばスフィンゴミエリン;スフィンゴ糖脂質（1-セラミジルグルコシドとしても知られる）、例えば、セラミドガラクトピラノシド、ガングリオシドおよびセレブロシド;脂肪酸、カルボン酸基を含むステロール、例えばコレステロール、またはそれらの誘導体;ならびに1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンまたは1,2-ジオレオリルグリセリルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、1,2-ジヘキサデシルホスホエタノールアミン（DHPE）、1,2-ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、1,2-ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）および1,2-ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）を含む1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンが含まれるが、それらに限定されない。これらの脂質の天然誘導体（例えば、組織由来L.-α.-ホスファチジル:卵黄、心臓、脳、肝臓、大豆）および/または合成誘導体（例えば、飽和および不飽和1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-アシル-2-アシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジヘプタノイル-SN-グリセロ-3-ホスホコリン）も適している。
好適なカチオン性脂質には、TAP脂質とも呼ばれるN-［1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩、例えばメチル硫酸塩が含まれる。好適なTAP脂質には、DOTAP（ジオレオイル-）、DMTAP（ジミリストイル-）、DPTAP（ジパルミトイル-）およびDSTAP（ジステアロイル-）が含まれるが、それらに限定されない。他の好適なカチオン性脂質には、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、1,2-ジアシルオキシ-3-トリメチルアンモニウムプロパン、N-［1-（2,3-ジオロイルオキシ）プロピル］-N,N-ジメチルアミン（DODAP）、1,2-ジアシルオキシ-3-ジメチルアンモニウムプロパン、N-［1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、1,2-ジアルキルオキシ-3-ジメチルアンモニウムプロパン、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、3-［N--（N',N'-ジメチルアミノ-エタン）カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）;2,3-ジオレオイルオキシ-N-（2-（スペルミンカルボキサミド）-エチル）-N,N-ジメチル-1-プロパナム-イニウムトリフルオロ-アセテート（DOSPA）、.β.-アラニルコレステロール、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）、diC14-アミジン、N-tert-ブチル-N'-テトラデシル-3-テトラデシルアミノ-プロピオンアミジン、N-（α-トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル-D-グルタメートクロリド（TMAG）、ジテトラデカノイル-N-（トリメチルアンモニオ-アセチル）ジエタノールアミンクロリド、1,3-ジオレオイルオキシ-2-（6-カルボキシ-スペルミル）-プロピルアミド（DOSPER）、およびN,N,N',N'-テトラメチル-、N'-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2,3-ジオレオイルオキシ-1,4-ブタンジアンモニウムヨージド、1-［2-（アシルオキシ）エチル］2-アルキル（アルケニル）-3-（2-ヒドロキシエチル）-イミダゾリニウムクロリド誘導体、例えば、1-［2-（9（Z）-オクタデセノイルオキシ）エチル］-2-（8（Z）-ヘプタデセニル-3-（2-ヒドロキシエチル）-イミダゾリニウムクロリド（DOTIM）および1-［2-（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］-2-ペンタデシル-3-（2-ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（DPTIM）、ならびに第4級アミン上にヒドロキシアルキル部分を含む2,3-ジアルキルオキシプロピル第4級アンモニウム誘導体、例えば、1,2-ジオレオイル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORI）、1,2-ジオレイルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORIE）、1,2-ジオレイルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシプロピルアンモニウムブロミド（DORIE-HP）、1,2-ジオレイル-オキシ-プロピル-3-ジメチル-ヒドロキシブチルアンモニウムブロミド（DORIE-HB）、1,2-ジオレイルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシペンチルアンモニウムブロミド（DORIE-Hpe）、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、1,2-ジパルミチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DPRIE）および1,2-ジステリルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DSRIE）が含まれる。
他の好適な脂質には、上記の中性脂質、アニオン性脂質およびカチオン性脂質のPEG化誘導体が含まれる。1つまたは複数のPEG化脂質誘導体を脂質シェルに組み込むことにより、その表面にポリエチレングリコール鎖を提示するナノリポゲルを得ることができる。得られたナノリポゲルは、その表面にPEG鎖を欠くナノリポゲルと比較して、インビボでの安定性および循環時間が増加し得る。好適なPEG化脂質の例には、DSPE PEG（2000MW）およびDSPE PEG（5000MW）を含むジステアロイルホスファチジルエタノールアミン-ポリエチレングリコール（DSPE-PEG）、ジパルミトイル-グリセロ-コハク酸ポリエチレングリコール（DPGS-PEG）、ステアリル-ポリエチレングリコールならびにコレステリル-ポリエチレングリコールが挙げられる。
一定の態様では、脂質シェルは、複数の脂質の組合せから形成される。一定の態様では、脂質シェルは、少なくとも3つの脂質の混合物から形成される。特定の態様では、脂質シェルは、ホスファチジルコリン（PC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［アミノ（ポリエチレングリコール）-2000］（DSPE-PEG）およびコレステロールの混合物から形成される。
いくつかの態様では、脂質シェルは、1つまたは複数のPEG化リン脂質と1つまたは複数の追加の脂質またはステロールとの混合物から形成される。一定の場合には、1つまたは複数のPEG化脂質と1つまたは複数の追加の脂質またはステロールとのモル比は、約1:1～約1:6、さらに好ましくは約1:2～約1:6、最も好ましくは約1:3～約1:5の範囲である。特定の態様では、1つまたは複数のPEG化脂質と1つまたは複数の追加の脂質またはステロールとのモル比は、約1:4である。
いくつかの態様では、脂質シェルは、1つまたは複数のリン脂質と1つまたは複数の追加の脂質またはステロールとの混合物から形成される。一定の場合には、1つまたは複数のリン脂質と1つまたは複数の追加の脂質またはステロールとのモル比は、約1:1～約6:1、さらに好ましくは約2:1～約6:1、最も好ましくは約3:1～約5:1の範囲である。特定の態様では、1つまたは複数のリン脂質と1つまたは複数の追加の脂質またはステロールとのモル比は、約4:1である。
好ましい態様では、脂質シェルは、リン脂質、例えばホスファチジルコリン（PC）と、PEG化リン脂質、例えば1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［アミノ（ポリエチレングリコール）-2000］（DSPE-PEG）と、コレステロールとの混合物から形成される。特定の態様では、脂質シェルは、ホスファチジルコリンと、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［アミノ（ポリエチレングリコール）-2000］（DSPE-PEG）と、コレステロールとの3:1:1モル比の混合物から形成される。
ポリマー粒子。送達ビヒクルはまた、ポリマー粒子、例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子であり得る。粒子は、生分解性または非生分解性であり得る。ポリマー粒子を製造するために使用され得る例示的なポリマーは、ナノリポゲルのポリマーマトリックス成分に関して上述されている。
好ましい生分解性ポリマーの例には、乳酸およびグリコール酸などのヒドロキシ酸のポリマー、ならびにPEG、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド-コ-カプロラクトン）、それらのブレンドおよびコポリマーとのコポリマーが挙げられる。好ましい態様では、粒子は、1つまたは複数のポリエステルから構成される。
例えば、粒子は、以下のポリエステル、すなわち、本明細書において「PGA」と呼ばれるグリコール酸単位、および本明細書において総称して「PLA」と呼ばれるポリ-L-乳酸、ポリ-D-乳酸、ポリ-D,L-乳酸、ポリ-L-ラクチド、ポリ-D-ラクチドおよびポリ-D,L-ラクチドなどの乳酸単位、および本明細書において総称して「PCL」と呼ばれるポリ（.ε.-カプロラクトン）などのカプロラクトン単位を含むホモポリマー;および本明細書において総称して「PLGA」と呼ばれる、乳酸:グリコール酸の比を特徴とする、乳酸単位およびグリコール酸単位を含むコポリマー、例えば、様々な形態のポリ（乳酸-コ-グリコール酸）およびポリ（ラクチド-コ-グリコリド）;およびポリアクリレート、ならびにそれらの誘導体のうちの1つまたは複数を含有することができる。例示的なポリマーには、ポリエチレングリコール（PEG）と前述のポリエステルとのコポリマー、例えば、本明細書において総称して「PEG化ポリマー」と呼ばれる様々な形態のPLGA-PEGコポリマーまたはPLA-PEGコポリマーも含まれる。一定の態様では、PEG領域をポリマーと共有結合させて、切断可能なリンカーによって「PEG化ポリマー」を得ることができる。アルジネートポリマーも使用され得る。
いくつかの態様では、粒子は、PLGAから構成される。PLGAは、安全なFDA承認ポリマーである。PLGA粒子は、活性剤を保護することができ（すなわち、カプセル材）、長期放出を促進し、標的化部分を加えるのに適しているため、有利である。
粒子は、ポリマーと標的化部分、検出可能な標識または他の活性剤との間の末端間結合を含む1つまたは複数のポリマーコンジュゲートを含有することができる。例えば、修飾ポリマーはPLGA-PEG-ホスホネートであり得る。別の例では、粒子は、アビジン部分を含むように修飾され、ビオチン化標的化部分、検出可能な標識または他の活性剤をそれに結合させることができる。
好ましい天然ポリマーの例には、タンパク質、例えば、アルブミン、コラーゲン、ゼラチンおよびプロラミン、例えばゼイン、ならびに多糖、例えば、アルジネート、セルロース誘導体およびポリヒドロキシアルカノエート、例えばポリヒドロキシブチレートが挙げられる。粒子のインビボ安定性は、ポリエチレングリコール（PEG）と共重合したポリ（ラクチド-コ-グリコリド）などのポリマーを使用することによって製造中に調整することができる。PEGが外面に露出している場合、PEGの親水性のためにこれらの材料が循環する時間が増加する可能性がある。
非生分解性ポリマーの例には、エチレンビニルアセテート、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、コポリマーおよびそれらの混合物が挙げられる。
ナノリポゲル。ナノリポゲルは、核酸、タンパク質および/または小分子の持続的送達のためにリポソームおよびポリマー系粒子の両方の利点を組み合わせたナノ粒子である。ナノリポゲルは、スフェア、ディスク、ロッド、または異なるアスペクト比を有する他の形状の形態であり得る。ナノスフェアは、比較的大きく、すなわちマイクロ粒子であり得る。ナノリポゲルは、典型的には、遠位負荷によって薬剤をカプセル化することができ、異なる放出速度を促進するように特性が調整可能な合成ポリマーまたは天然ポリマーから形成される。放出速度は、ポリマーと脂質との比を0.05から5.0に、さらに好ましくは0.5から1.5に変化させることによって調節される。
ナノリポゲルは、形成前、形成中または形成後のいずれかに薬剤が負荷され、その後、薬剤の制御放出ビヒクルとして機能するように設計される。ナノリポゲルには、複数の薬剤の制御放出がその後達成されるように、複数の薬剤が負荷され得る。
ナノリポゲルには、少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤が、形成中および/または形成後に、薬剤の存在下でのナノリポゲルの再水和プロセスによって負荷される。例えば、ナノリポゲルには、分裂期キナーゼ阻害剤として機能する分子が負荷され、ナノリポゲルは、その後、形成後に（またはその逆に）1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を組み込んで、両阻害剤を同時送達および放出する。
ポリマーナノ粒子
エマルジョン法。いくつかの態様では、ポリマーナノ粒子は、エマルジョン溶媒蒸発法を使用して調製される。例えば、ポリマー材料を水非混和性有機溶媒に溶解し、薬物溶液、または薬物溶液の組合せと混合する。水非混和性有機溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、および酢酸アシルのうちの1つまたは複数であり得るが、それらに限定されない。薬物は、アセトン、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、およびジメチルスルホキシド（DMSO）のうちの1つまたは複数であるが、それらに限定されない物質に溶解させることができる。次いで、得られた混合物溶液に水溶液を加えて、乳化によってエマルジョン溶液を得る。乳化技術は、プローブ超音波処理、またはホモジナイザーが、それらに限定されない方法による均質化であり得る。ペプチドまたはフルオロフォアまたは薬物は、粒子のポリマーマトリックスの表面と結合されてもよく、粒子のポリマーマトリックス内にカプセル化されてもよく、粒子のポリマーマトリックスによって取り囲まれてもよく、および/または粒子のポリマーマトリックス全体に分布してもよい。
ナノ沈殿法。別の態様では、ポリマーナノ粒子は、ナノ沈殿法またはマイクロ流体デバイスを使用して調製される。ポリマー材料は、水混和性有機溶媒中で薬物、または薬物の組合せと混合される。次いで、得られた混合溶液を水溶液に加えて、ナノ粒子溶液を得る。
例示的な調製方法。粒子は、粒子のポリマー組成を含む基準に基づいて選択され得る様々な方法を使用して様々なポリマーから製造することができ、薬剤は、当技術分野において公知の方法に従って粒子内に負荷されるか、粒子と結合される。例示的な方法を以下に提供する。
溶媒蒸発。この方法では、ポリマーを塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒に溶解する。薬物（可溶性、または微粒子として分散）を溶液に加え、混合物をポリ（ビニルアルコール）などの界面活性剤を含有する水溶液に懸濁する。有機溶媒の大部分が蒸発するまで、得られたエマルジョンを撹拌し、固体粒子を残す。得られた粒子を水で洗浄し、凍結乾燥機内で一晩乾燥させる。この方法によって、異なるサイズ（0.5～1000ミクロン）および形態を有する粒子を得ることができる。この方法は、ポリエステルおよびポリスチレンのような比較的安定なポリマーに有用である。
ただし、ポリ無水物などの不安定なポリマーは、水の存在に起因して製造プロセス中に分解する可能性がある。これらのポリマーについては、完全に無水の有機溶媒中で行われる以下の2つの方法の方が有用である。
ホットメルトマイクロカプセル化。この方法では、まずポリマーを溶融し、次いで固体粒子と混合する。混合物を非混和性溶媒（シリコン油など）に懸濁し、連続的に撹拌しながら、ポリマーの融点よりも5℃高く加熱する。エマルジョンが安定化されたら、ポリマー粒子が固化するまで冷却する。得られた粒子を石油エーテルを用いてデカンテーションすることによって洗浄して、流動性粉末を得る。この方法によって、0.5～1000ミクロンのサイズを有する粒子が得られる。この技術によって調製されたスフェアの外面は、通常、滑らかで高密度である。この手順は、ポリエステルおよびポリ無水物から作製される粒子を調製するために使用される。ただし、この方法は、1,000～50,000の分子量を有するポリマーに限定される。
溶媒除去。この技術は、主にポリ無水物用に設計されている。この方法では、薬物は、塩化メチレンのような揮発性有機溶媒中の選択されたポリマーの溶液に分散または溶解される。この混合物を有機油（例えば、シリコン油）中で撹拌することによって懸濁させて、エマルジョンを形成する。溶媒蒸発とは異なり、この方法は、高融点および様々な分子量を有するポリマーから粒子を作製するために使用され得る。この手順によって、1～300ミクロンの範囲の粒子を得ることができる。この技術によって製造されたスフェアの外部形態は、使用されるポリマーのタイプに大きく依存する。
噴霧乾燥。この方法では、ポリマーは有機溶媒に溶解される。既知量の活性薬物をポリマー溶液に懸濁（不溶性薬物）または共溶解（可溶性薬物）する。次いで、溶液または分散液を噴霧乾燥する。ミニ噴霧乾燥機（Buchi）の典型的なプロセスパラメーターは以下の通りである:ポリマー濃度＝0.04g/mL、入口温度＝-24℃、出口温度＝13～15℃、アスピレーター設定＝15、ポンプ設定＝10mL/分、噴霧流量＝600Nl/時間、およびノズル直径＝0.5mm。1～10ミクロンの範囲のマイクロ粒子が、使用されるポリマーのタイプに依存する形態で得られる。
ヒドロゲル粒子。アルジネートなどのゲル型ポリマーから作製される粒子は、従来のイオンゲル化技術によって製造される。ポリマーは、水溶液に最初に溶解され、硫酸バリウムまたは何らかの生物活性剤と混合され、次いで、場合によっては液滴を破壊するために窒素ガスの流れを使用する微小液滴形成装置を通して押し出される。ゆっくり撹拌される（約100～170RPM）イオン硬化浴を押出装置の下に配置して、形成される微小液滴を捕捉する。ゲル化が起こるのに十分な時間を可能にするために、粒子を浴中で20～30分間インキュベートする。粒径は、様々なサイズの押出機を使用するか、窒素ガスまたはポリマー溶液の流量を変化させることによって制御される。キトサン粒子は、ポリマーを酸性溶液に溶解し、トリポリホスフェートを用いて架橋することによって調製することができる。カルボキシメチルセルロース（CMC）粒子は、ポリマーを酸溶液に溶解し、鉛イオンを用いて粒子を沈殿させることによって調製することができる。負に帯電したポリマー（例えば、アルジネート、CMC）の場合、異なる分子量の正に帯電したリガンド（例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン）をイオン結合させることができる。
他の送達ビヒクル
いくつかの態様では、送達ビヒクルは、リポソームまたは脂質ナノ粒子である。リポソームは、典型的には、ラメラ相脂質二重層から構成される球形ベシクルである。リポソームは、例えば、多層ベシクル（MLV）、小型単層リポソームベシクル（SUV）、大型単層ベシクル（LUV）または渦巻き状ベシクルであり得る。開示されるナノ微粒子組成物の調製に有用なリポソーム、ミセルおよび他の脂質系送達ビヒクルは、当技術分野において公知である。例えば、Torchilin et al.（Adv Drug Delivery Rev,58（14）:1532-55,2006）を参照されたい。多種多様なリポソームおよびエキソソームが本発明とともに使用され得ることが予測される。リポソームは、N-［1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル-スルフェート（DOTAP）またはLipofectamine（商標）を含み得る。いくつかの態様では、例えば、Lu et al.（Cancer Cell,18:185-197,2010）に記載されているように、キトサンを含む送達システムが使用され得る。いくつかの態様では、ナノベクターが、miRNAを対象に送達するために使用され得る。ナノベクターは、例えば、Pramanik et al.（Mol Cancer Ther,10:1470-1480,2011）に記載されている。
送達ビヒクルは、シリカ粒子であってよい。開示されるナノ微粒子組成物の調製に有用な好適なシリカ粒子も当技術分野において公知である。例えば、Barbe et al.（Adv Materials,16（21）:1959-1966,2004）、Ngamcherdtrakul et al.（Adv Func Materials,25:2646-2659,2015）およびArgyo et al.（Chem.Mater.,26（1）:435-451,2014）を参照されたい。例えば、いくつかの態様では、シリコーンナノ粒子（例えば、Bharali et al.PNAS,102（32）:11539-11544,2005に記載されているように）を使用して、少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤を細胞に送達してもよい。体内へのシリカまたはケイ素の溶解度は、粒子が担持する薬剤の持続放出能力を提供する。さらに、生分解性ポリマーまたは生体内還元性架橋剤を使用して、シリカ粒子またはケイ素粒子を修飾して、持続放出能を提供することができる。
（VI）抗体
本明細書において、薬剤（免疫チェックポイント遮断を誘導するために使用される薬剤など）の少なくとも一部は抗体である。抗体は、結合剤の一種であり、例えば、細胞の表面上、または生体試料中の標的リガンドに結合することができる分子である。抗体という用語は、抗体全体およびその機能的（すなわち、顕著かつ特異的な標的結合を維持する）断片の両方を含む。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において区別なく使用され、当業者によって十分に理解されている。これらの用語は、抗原に特異的に結合する1つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質を指す。抗体の1つの形態は、抗体の基本構造単位を含む。この形態は四量体であり、各対が1つの軽鎖および1つの重鎖を有する2対の抗体鎖を含む。各対では、軽鎖可変領域および重鎖可変領域はともに、その抗体によって認識される抗原への結合を担い、定常領域は抗体エフェクター機能を担う。
認識されている免疫グロブリンポリペプチドには、κ軽鎖およびλ軽鎖、ならびにα重鎖、γ重鎖（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、δ重鎖、ε重鎖およびμ重鎖、または他の種の等価物が含まれる。（25kDaまたは214アミノ酸の）全長免疫グロブリン「軽鎖」は、NH2末端に110アミノ酸の可変領域と、COOH末端にκ定常領域またはλ定常領域とを含む。（50kDaまたは446アミノ酸の）全長免疫グロブリン「重鎖」は、同様に、（116アミノ酸の）可変領域と、前述の重鎖定常領域のうちの1つ、例えば（330アミノ酸の）γとを含む。
抗体および免疫グロブリンの特定の態様には、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、Fab断片、Fv断片、scFv断片およびFd断片を含めて、抗原への特異的結合を保持する、抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質が含まれる。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質、蛍光分子または安定な元素同位体などによって、検出可能に標識され得る。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン-アビジン特異的結合対のメンバー）などのような他の部分にさらにコンジュゲートされ得る。Fab'、Fv、F（ab'）2、ならびにそれらの同族抗原への特異的結合を保持する他の抗体断片、およびモノクローナル抗体もこの用語に包含される。
抗体は、例えば、二機能性（すなわち、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17:105,1987）および一本鎖（例えば、Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883,1988;およびBird et al.,Science 242:423-426,1988）を含む様々な他の形態で存在し得る。一般に、Hood et al.（1984）''Immunology'',N.Y.,2nd ed.、およびHunkapiller＆Hood（Nature 323:15-16,1986）を参照されたい。
免疫グロブリン軽鎖可変領域または免疫グロブリン重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」とも呼ばれる3つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域（FR）からなる。フレームワーク領域およびCDRの範囲は正確に定義されている（''Sequences of Proteins of Immunological Interest'' E.Kabat et al.（1991）US Department of Health and Human Servicesを参照）。特定の態様では、抗体アミノ酸配列のナンバリングは、Kabat系に従い得る。様々な軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列が、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成軽鎖および構成重鎖の組み合わされたフレームワーク領域は、CDRを位置決めおよびアライメントするのに役立つ。CDRは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作によって、異なる種に属する抗体可変領域遺伝子および抗体定常領域遺伝子から構築された抗体である。例えば、ウサギモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントが、γ1およびγ3などのヒト定常セグメントに連結され得る。
（VII）薬学的組成物および投与製剤
癌、前癌および他の増殖性疾患の処置に使用するための組成物が、本明細書において提供される。組成物は、少なくとも2つの活性成分/薬剤を含み、そのうち1つは、少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤を阻害する治療活性剤であり、そのうちもう1つは免疫チェックポイント阻害剤である。本明細書において記載されるように、活性剤は、例えば、リポソーム、有機（ナノまたはマイクロ）粒子または無機（ナノまたはマイクロ）粒子などの送達ビヒクル（構築物、操作された構築物）中に送達/送達ビヒクルと結合され得る。本明細書において記載されるように、活性剤は、薬剤を接続する化学リンカーと同時送達され得る（例えば、抗体-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、小分子-オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは小分子-小分子コンジュゲート）。
組成物は、直接的に、例えば、細胞と接触させることによって、または間接的に、例えば、任意の生物学的プロセスの作用によって、細胞に提供され得る。例えば、組成物は、生理学的に許容される担体またはビヒクル中で製剤化され、細胞を取り囲む組織または流体に注入され得る。組成物は、単純な拡散、エンドサイトーシスによって、または任意の能動的もしくは受動的な輸送機構によって細胞膜を通過することができる。
薬学的組成物に製剤化する場合、治療化合物（少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた送達システムなど）を薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」という語句は、一般に生理学的に忍容性であると考えられ、ヒトまたは獣医学的対象に投与した場合に、アレルギー反応または同様の不都合な反応、例えば、胃の不調、めまいなどを典型的には引き起こさない分子実体および組成物を指す。
本明細書において使用される用語「薬学的に許容される誘導体」は、レシピエントに投与すると所望の活性剤またはその活性代謝産物もしくは残基を（直接的または間接的に）提供することができる、所望の活性剤の任意の薬学的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグ、例えばエステルを意味する。そのような誘導体は、過度の実験を用いることなく当業者に認識可能である。それでもなお、Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery,5th Edition,Vol 1:Principles and Practiceの教示を参照されたい。薬学的に許容される誘導体には、塩、溶媒和物、エステル、カルバメートおよびリン酸エステルが含まれる。
処置のための組成物をそのまま使用することが可能であるが、例えば、意図された投与経路および標準的な薬務に関して選択された好適な薬学的賦形剤、薬学的希釈剤、または薬学的担体と混合して、薬学的製剤で投与することが好ましい場合がある。したがって、一局面では、薬学的組成物または薬学的製剤は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および/または担体と組み合わせて、少なくとも1つの活性組成物またはその薬学的に許容される誘導体を含む。賦形剤、希釈剤、および/または担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに顕著に有害ではないという意味で「許容される」。
本明細書において開示される任意の組成物製剤は、研究的、予防的および/または治療的処置のためであるかどうかに関わらず、投与の利益を上回る顕著に有害なアレルギー反応または他の不都合な反応を生じないものを含む任意の他の薬学的に許容される担体を有利に含むことができる。治療的使用のための例示的な薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体は、製薬分野において周知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy.Lippincott Williams＆Wilkins（A.R.,Gennaro edit.2005）およびRemington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990に記載されている。さらに、製剤は、米国FDA Office of Biological Standardsおよび/または他の関連する外国の規制当局によって要求される無菌性、発熱原性、一般的な安全性および純度の基準を満たすように調製することができる。薬学的賦形剤、薬学的希釈剤、および薬学的担体は、意図される投与経路および標準的な薬務に関して選択することができる。
そのような薬学的製剤は、1つまたは複数の好適な賦形剤、希釈剤、および担体を用いて従来の方法で使用するために提供され得る。薬学的に許容される賦形剤は、生物活性材料のための剤形の形成を補助するか可能にし、希釈剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、着色剤、および他の成分を含む。保存剤、安定剤、色素、さらには香味剤が薬学的組成物中に提供され得る。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤および懸濁化剤も使用され得る。賦形剤は、その所望の機能を果たすことに加えて、非毒性であり、摂取時に十分に忍容され、生物活性材料の吸収を妨げない場合、薬学的に許容される。
例示的な一般的に使用される薬学的に許容される担体には、ありとあらゆる増量剤または充填剤、溶媒または共溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE）、保存剤、等張剤、吸収遅延剤、塩、安定剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、EDTA）、ゲル、結合剤、崩壊剤および/または潤滑剤が含まれる。
例示的な緩衝剤には、シトレート緩衝液、スクシネート緩衝液、タータレート緩衝液、フマレート緩衝液、グルコネート緩衝液、オキサレート緩衝液、ラクテート緩衝液、アセテート緩衝液、ホスフェート緩衝液、ヒスチジン緩衝液および/またはトリメチルアミン塩が含まれる。
例示的な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハライド、ヘキサメトニウムクロリド、アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび3-ペンタノールが含まれる。
例示的な等張剤には、3価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールまたはマンニトールを含む多価糖アルコールが含まれる。
例示的な安定剤には、有機糖、多価糖アルコール、ポリエチレングリコール;硫黄含有還元剤、アミノ酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、免疫グロブリン、親水性ポリマーまたは多糖が含まれる。
「治療有効量」または「治療有効用量」は、状態、障害または病態を処置するために対象に投与された場合、そのような状態、障害または病態を達成するのに十分な化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに処置される哺乳動物の年齢、体重、体調および応答性に応じて変化する。正確な用量および配合は、治療の目的に依存し、公知の技術（例えば、Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms（vols.1-3,1992）;Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding（1999）;Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,Gennaro,Editor（2003）、およびPickar,Dosage Calculations（1999）を参照）を使用して当業者によって確認され得る。一定の場合には、「治療有効量」は、所望の活性を例えば、10％、50％または90％調節する、例えば、増加または減少させるのに十分な量または用量を意味するために使用される。一般に、治療有効量は、1つまたは複数の治療剤を含む治療レジメン後に、宿主に臨床的に顕著な病態の改善を引き起こすのに十分である。活性成分の濃度または量は、本明細書において説明されるように、所望の投与量および投与レジメンに依存する。
特定の対象に投与される実際の用量は、標的、体重、癌の病期、癌の種類、以前または同時の治療的介入、対象の特発性疾患、および投与経路を含む物理的因子、生理学的因子および心理学的因子などのパラメーターを考慮して、医師、獣医または研究者によって決定され得る。
この使用に有効な量は、特に転移部位が関与する場合、疾患の重症度およびその位置、ならびに処置される患者の体重および全身状態に依存する。一般に、投与量は、1日当たり治療用構築物0.01mg/kg～100mg/kg宿主体重の範囲であり、1日当たり0.1mg/kg～10mg/kgの投与量、例えば、3～7mg/kgの投与量がさらに一般的に使用される。長期間にわたる維持投与量は、必要に応じて調整され得る。ただし、投与量は、患者の要件、処置される病態の重症度、および使用される化合物に応じて変化させてもよい。例えば、投与量は、特定の患者では、診断された癌の種類および病期を考慮して経験的に決定され得る。本発明の文脈では、患者に投与される用量は、患者に経時的に有益な治療応答をもたらすのに十分であるべきである。用量のサイズはまた、特定の患者に対する特定のベクターまたは形質導入された細胞型の投与に伴ういずれかの有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。特定の状況に対する適切な投与量の決定は、施術者の技能の範囲内にある。一般に、処置は、化合物の最適用量未満の比較的少ない投与量で開始される。その後、状況下で最適な効果に達するまで、投与量を少しずつ増加させる。便宜上、所望であれば、総1日投与量を分割し、1日の間に分割して投与してもよい。
選択された投与量は、所望の治療効果、投与経路、所望の治療期間、および使用される特定の治療用複合体の影響を受け得る。一般に、治療用構築物は、1投与当たり約0.001mg/kg～約100mg/kg（例えば、以下にさらに詳細に説明するように、連日;または週に2回、3回、4回、5回もしくはそれ以上;または月に2回、3回、4回、5回もしくはそれ以上など）の範囲で投与され得る。投与経路は、投与量を決定する際にも考慮することができる。例えば、特定の態様では、治療用構築物は、静脈内経路もしくは腹腔内経路によって0.01mg/kg～100mg/kg（例えば、連日;または週に2回、3回、4回、5回もしくはそれ以上;または月に2回、3回、4回、5回もしくはそれ以上など）の範囲で、または皮下経路（例えば、腫瘍もしくはTMEへの局所注射、または腫瘍もしくはTMEに隣接する局所注射）では0.0001mg/kg～1mg/kg（例えば、連日;または週に2回、3回、4回、5回もしくはそれ以上;または月に2回、3回、4回、5回もしくはそれ以上など）の範囲で投与される。さらに例示的な投与量を以下に説明する。
好適な投与量は、0.01mg/kg～100mg/kg体重/日、週または月の範囲であり得る。例示的な用量は、本明細書において開示される活性化合物（治療用構築物）0.05mg/kg～10.0mg/kgを含み得る。総1日用量は、60分間の経口投与、静脈内投与または他の投与を使用した薬物投与形態の0.05～3.0、0.1～3.0、0.5～3.0、1.0～3.0、1.5～3.0、2.0～3.0、2.5～3.0および0.5～3.0mg/kg/日の総1日用量の投与を含めて、対象に1日に1～3回投与される薬剤0.05mg/kg～30.0mg/kgであり得る。特定の一例では、用量は、例えば、本明細書において開示される化合物を最大92～98％wt/v含む組成物1.5mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kgまたは7.5mg/kgの総1日用量で、対象にQD投与またはBID投与され得る。
追加の有用な用量は、多くの場合、0.1～5μg/kgまたは0.5～1μg/kgの範囲であり得る。他の例では、用量には、1μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg、200μg/kg、0.1～5mg/kgまたは0.5～1mg/kgが含まれ得る。他の例では、用量には、1mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、200mg/kg、400mg/kg、450mg/kgまたはそれ以上が含まれ得る。
本開示の処置材料は、重篤な疾患状態、すなわち、生命を脅かす、または潜在的に生命を脅かす状況で使用され得る。そのような場合、これらの組成物を実質的に過剰に投与することが可能であり、治療医によって望ましいと感じられ得る。
当業者によって理解されるように、特定の投与量は、活性化合物の薬物動態の影響を受ける。投与のために、インビトロアッセイおよび/または動物モデル試験から得られた結果に基づいて、治療有効量（本明細書において用量とも呼ばれる）を最初に推定することができる。そのような情報は、関心対象の対象に対して有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。有用な前臨床試験には、薬力学的分析、毒性分析などが含まれる。
治療有効量は、治療レジメンの経過中に単回用量または複数回用量を投与することによって（例えば、1時間ごと、2時間ごと、3時間ごと、4時間ごと、6時間ごと、9時間ごと、12時間ごと、18時間ごと、連日、隔日、3日ごと、4日ごと、5日ごと、6日ごと、毎週、2週間ごと、3週間ごと、または毎月）達成することができる。
活性剤を含有する化合物の有効量には、所望の治療効果、予防効果および/または生物学的効果を部分的または完全に達成する用量が含まれる。特定の用途に有効な実際の量は、処置される病態と、投与経路とに依存する。ヒトに使用するための有効量は、動物モデルから決定することができる。例えば、ヒトに対する用量は、動物に対して有効であることが判明している局所（例えば、腫瘍内）レベルまたは循環レベルを達成するように製剤化され得る。
組成物は、エタノール、ブピバカイン、クロロプロカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、プロカイン、ロピバカイン、テトラカイン、デスフルラン、イソフルラン、ケタミン、プロポフォール、セボフルラン、コデイン、フェンタニル、ヒドロモルホン、マーカイン、メペリジン、メタドン、モルヒネ、オキシコドン、レミフェンタニル、スフェンタニル、ブトルファノール、ナルブフィン、トラマドール、ベンゾカイン、ジブカイン、塩化エチル、キシロカインおよび/またはフェナゾピリジンを含む1つまたは複数の麻酔薬とともに投与することができる。
癌（例えば、癌転移を含む）を治療または予防することを含む特定の態様では、本明細書において開示される組成物は、化学療法、標的療法、放射線療法、および/または免疫療法などの他の癌治療と組み合わせて使用することができる。本明細書において記載される組成物は、選択された時間枠内、例えば、10分、1時間、3時間、10時間、15時間、24時間もしくは48時間の時間枠内で、または相補的治療が臨床的に関連する治療枠内にある場合に、別の治療と同時にまたは連続して投与することができる。
薬学的組成物は、各投与経路に適切な剤形に製剤化された、非経口（筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内（IV）注射または皮下注射）によるか、点滴によるか、デポーでの投与のためのものであり得る。
いくつかの態様では、組成物は、標的細胞への組成物の送達に有効な量で、例えば、静脈内投与または腹腔内投与によって全身投与される。他の経路には、点滴または粘膜が含まれる。
一定の態様では、組成物は、例えば、処置される部位への直接注射によって局所投与される。いくつかの態様では、組成物は、1つまたは複数の腫瘍または疾患組織に直接注射または投与される。典型的には、局所注射は、全身投与によって達成され得る濃度よりも高い、組成物の局所濃度の増加を引き起こす。いくつかの態様では、組成物は、カテーテルまたはシリンジを使用することによって適切な細胞に局所的に送達される。そのような組成物を細胞に局所的に送達する他の手段には、注入ポンプを使用すること、またはインプラントの直近領域に組成物の持続放出をもたらすことができるポリマーインプラントに組成物を組み込むことが含まれる。
例として、一定の態様では、治療用構築物は、例えば、容易に到達可能な腫瘍、例えば、黒色腫、頭頸部癌、乳癌およびリンパ腫に局所投与されるか、他の癌、例えば、肺癌、肝癌、膵癌、前立腺癌および転移性癌のために全身投与される。
したがって、本明細書において記載される治療用組成物は、ヒト用医薬品または動物用医薬品に使用するための任意の好都合な方法を含む様々な経路によって（単独で、または併用療法の一部として）投与され得る。所望の活性剤の治療有効量は、非経口的、経粘膜的（例えば、経口的、経鼻的または直腸的）、または経皮的に導入される薬学的組成物に製剤化することができる。いくつかの態様では、投与は、例えば、静脈内注射、または細動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与および頭蓋内投与を介した非経口である。投与は、ボーラスとしてであるか、一定期間にわたる連続注入によるものであるか、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、関節内経路、関節滑液嚢内経路、髄腔内経路、経口経路、局所経路または吸入経路によるものであり得る。一定の態様では、例えば、関節に影響を及ぼす炎症状態の治療に関与する態様では、薬学的組成物は、好ましくはシリンジを用いた注射によって滑膜、滑液または関節包に直接投与され得る。投与は、局所的または全身的であり得る。選択は、処置される病態、ならびに投与される活性剤および組成物の影響を受け得る。
注射では、水溶液として、例えば、ハンクス液、リンゲル液または生理食塩水などの緩衝液中で組成物を作製することができる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤などの配合剤を含有することができる。あるいは、組成物は、使用前に好適なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水を用いて構成するために、凍結乾燥形態および/または粉末形態であり得る。
治療用構築物を含む組成物は、非経口注射によって水溶液で投与され得る。注射用製剤は、懸濁液またはエマルジョンの形態であり得、任意で、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および/または担体を含む。そのような注射用組成物は、希釈剤、例えば、滅菌水、様々な緩衝液含有物（例えば、Tris-HCl、アセテート、ホスフェート）、pHおよびイオン強度の緩衝生理食塩水と、任意で、添加剤、例えば、洗浄剤および可溶化剤（例えば、TWEEN（商標）20、TWEEN（商標）80は、ポリソルベート20または80とも呼ばれる）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、および保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）とを含むことができる。非水性の溶媒またはビヒクルの例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油およびトウモロコシ油、ゼラチン、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルがある。注射用製剤を凍結乾燥し、例えば使用直前に再懸濁してもよい。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、組成物に滅菌剤を組み込むことによって、組成物を照射することによって、または組成物を加熱することによって滅菌され得る。
他の態様では、治療用構築物含有組成物は、局所的に、または点滴によって適用される。局所投与は、肺、鼻、口腔（舌下、頬側）、膣または直腸粘膜への適用を含み得る。これらの投与方法は、粘膜輸送要素を用いて送達ビヒクルのシェルまたはコーティングを製剤化することによって行うことができる。組成物は、約5ミクロン未満の空気動力学的直径を有するエアロゾルまたは噴霧乾燥粒子のいずれかとして送達される場合、吸入中に肺上皮内層を横断して血流に移動しながら肺に送達され得る。
限定されることなく、いずれも当業者によく知られているネブライザー、定量吸入器および粉末吸入器を含む、治療用製品の肺送達用に設計された広範囲の機械装置を使用することができる。
粘膜に投与するための製剤は、典型的には、錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液またはエマルジョンに組み込まれ得る噴霧乾燥された薬物粒子である。標準的な薬学的賦形剤は、任意の処方者から入手可能である。
経皮製剤が調製されてもよい。これらは、典型的には、軟膏、ローション、スプレーまたはパッチであり、これらはいずれも標準的な技術を使用して調製され得る。経皮製剤は、浸透促進剤を含むことができる。この方法と組み合わせて、化学的促進剤、ならびにエレクトロポレーションおよびマイクロニードルを含む物理的方法が機能し得る。
マイクロニードル（MN）は、高さが10～2000μm、幅が10～50μmのミクロンサイズの針であり、痛みを最小限に抑えるか全く伴わずに表皮層を通って真皮組織まで直接貫通することができる（Hao et al.,J Biomed Nanotechnol,13（12）:1581-1597,2017）。いくつかのタイプのマイクロニードルを使用することができる。いくつかの態様では、金属系またはプラスチックのマイクロニードルローラーを使用して皮膚表面を物理的に破壊して、適用された局所剤（この場合は治療用構築物）の浸透を促進することができる。いくつかの態様では、分解性および溶解性のマイクロニードルが治療用構築物を含有することができる。マイクロニードルは、皮膚に投与すると、皮膚の層の深部で構築物を溶解および放出することができる。いくつかの態様では、非分解性マイクロニードルを治療用構築物で被覆して、被覆された構築物を皮膚層の深部に送達してもよい。マイクロニードルは、限定されることなく、ポリマー、糖、多糖、ペプチド、タンパク質、金属、無機化合物などを含む多くのクラスの材料から製造することができる（Ye et al.,Adv Drug Deliv Rev,127:106-118,2018）。マイクロニードル技術について当技術分野において公知のあらゆる材料および製造方法が、この治療用構築物の送達を増強するために適用可能である。
治療薬の全身送達または局所送達を容易にする任意の装置もまた、本明細書において提供される治療用構築物に適用可能である。例えば、本明細書において記載される治療用構築物を送達するために、全身毒性を最小限に抑えながら高濃度の細胞毒性剤を肝転移に直接送達する移植化学療法装置である肝動脈注入（HAI）ポンプ（Cohen et al.,The Oncologist,8（6）:553-566,2003）を利用することもできる。いくつかの態様では、治療薬を脳腫瘍に送達するための小径注入カテーテルの配置を含む対流強化送達（CED）（Mehta,A.et al.Neurotherapeutics:the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics,14（2）,358-371,2017）もまた、本明細書において記載される治療用構築物を送達するために利用することができる。
（VIII）例示的な使用方法:
少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤を含む治療用構築物を本明細書において提供することにより、ここで、癌、癌の症状、癌の進行（前癌から癌までを含む）、および癌転移を含む過剰増殖性疾患、過剰増殖性障害または過剰増殖性病態を治療および/または予防する方法が可能になる。過剰増殖性疾患、過剰増殖性障害または過剰増殖性病態の具体例には、癌が挙げられる。いくつかの態様では、癌は、癌を有する対象または個体の免疫系を抑制し得る。いくつかの態様では、本明細書において提供される治療用構築物は、癌媒介性免疫抑制を抑制または逆転させ、悪性腫瘍の免疫認識および排除を可能にすることができる。
本明細書において使用される場合、用語「処置（治療）」または「処置する（治療する）」は、未の対象と比較して、処置された対象に起こる癌の何らかの改善を指す。そのような改善は、癌の悪化または進行の予防（例えば、無増悪生存期間の改善）であり得る。さらに、そのような改善はまた、癌またはその付随する症状の減少または治癒（例えば、腫瘍体積の減少、部分寛解、完全寛解（例えば、6ヶ月、1年、2年、3年、4年もしくは5年またはそれ以上にわたる）、癌の再発もしくは再燃の予防、転移の減少、または腫瘍もしくは病変の数の減少）であり得る。処置される対象の100％について処置が成功しない場合があることが理解されるであろう。ただし、この用語は、当業者（例えば、腫瘍専門医、医師）によって決定されるように処置が成功することを要する。本明細書において使用される場合、用語「予防する」は、本明細書において使用される癌またはそれに付随する症候群の発症を回避することを指す。予防とは、将来のある時間枠内で癌の発症を回避することを指すことが理解されるであろう。該時間枠は、好ましくは、本発明の意味における化合物の投与時に開始し、少なくとも1ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも9ヶ月間、少なくとも1年間、少なくとも2年間、少なくとも5年間、少なくとも10年間、またはさらには対象の残りの生理学的寿命の間続くものとする。処置される対象の100％について予防が成功しない場合があることが理解されるであろう。ただし、この用語は、当業者（例えば、腫瘍専門医、医師）によって決定されるように予防が成功することを要する。予防はまた、例えば、集団内の再発の確率の低下によって測定されるように、寛解後の癌の再発に関連し得る。
開示される組成物は、良性または悪性の癌およびその腫瘍を処置するために使用することができる。処置は、癌細胞を直接標的とし、死滅させることができるか、癌細胞に対する免疫応答を増大させることによって癌細胞を間接的に標的とすることができるか、それらの組合せであり得る。
成熟動物では、通常、ほとんどの器官および組織内で細胞再生と細胞死との間でバランスが維持される。体内の様々な種類の成熟細胞は、所与の寿命を有する。これらの細胞が死滅するにつれて、様々な種類の幹細胞の増殖および分化によって新しい細胞が生成される。正常な状況下では、新しい細胞の生成は、いずれかの特定の種類の細胞の数が一定のままであるように調節される。ただし、時折、正常な増殖制御機構にもはや応答しない細胞が生じる。これらの細胞は、かなりの大きさに増殖し、腫瘍または新生物を生じさせることができる細胞のクローンを生じる。不定に増殖することができず、健康な周囲組織に広範囲に浸潤しない腫瘍は良性である。増殖し続け、次第に浸潤性になる腫瘍は悪性である。癌という用語は、具体的には悪性腫瘍を指す。悪性腫瘍は、制御されない増殖に加えて、転移を示す。このプロセスでは、癌性細胞の小さなクラスターが腫瘍から脱落し、血管またはリンパ管に浸潤し、他の組織に運ばれ、そこで増殖し続ける。このように、ある部位の原発腫瘍が、別の部位に続発性腫瘍を生じさせる可能性がある。
開示される組成物は、対象の腫瘍の増殖を遅延させるか阻害することができ、腫瘍の増殖またはサイズを減少させることができるか、腫瘍を完全に排除することができ、腫瘍の転移を阻害するか減少させることができ、および/または腫瘍の発生または増殖に関連する症状を阻害するか減少させることができる。例えば、いくつかの態様では、組成物は、対象の腫瘍負荷を減少させるか、腫瘍増殖を経時的に遅延させるか予防する。
悪性腫瘍は、腫瘍が由来する組織の胚起源に従って分類され得る。癌腫は、内胚葉組織または外胚葉組織、例えば、皮膚、または内臓および腺の上皮内層から生じる腫瘍である。肉腫は、あまり頻繁に発生しないが、中胚葉結合組織、例えば、骨、脂肪および軟骨に由来する。白血病およびリンパ腫は、骨髄の造血細胞の悪性腫瘍である。白血病は単一細胞として増殖するが、リンパ腫は腫瘍塊として増殖する傾向がある。悪性腫瘍は、身体の多数の器官または組織に現れて癌を確立することがある。
提供される組成物および方法を用いて処置され得る癌の種類には、限定されることなく、多発性骨髄腫などの血管癌、ならびに骨、膀胱、脳、乳房、子宮頸部、結腸、直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃および子宮の腺癌および肉腫を含む固形癌が含まれる。いくつかの態様では、開示される組成物は、複数の癌型を同時に処置するために使用される。組成物はまた、複数の位置で転移または腫瘍を処置するために使用され得る。
投与は、既存の腫瘍の処置に限定されず、個体においてそのような疾患を発症するリスクを予防するか低下させるために、すなわち予防的使用のために、および例えば転移による癌の広がりを減少させるためにも使用され得る。予防的ワクチン接種の潜在的な候補には、癌を発症するリスクが高い、すなわち、特定の種類の癌の個人歴または家族歴を有する個体が含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「癌」は、白血病、リンパ腫、癌腫および肉腫を含む、哺乳動物に見られるあらゆる種類の癌、新生物または悪性腫瘍を指す。本明細書において提供される化合物、薬学的組成物または方法を用いて処置され得る例示的な癌には、リンパ腫、肉腫、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、骨髄腫、甲状腺癌、白血病、前立腺癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ、ER陽性、ER陰性、化学療法抵抗性、Herceptin（登録商標）抵抗性、HER2陽性、ドキソルビシン抵抗性、タモキシフェン抵抗性、乳管癌、小葉癌、原発性、転移性）、卵巣癌、膵癌、肝癌（例えば、肝細胞癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腺癌、肺大細胞癌、小細胞肺癌、カルチノイド、肉腫）、多形神経膠芽腫、神経膠腫、黒色腫、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、神経膠芽腫、卵巣癌、肺癌、扁平上皮癌（例えば、頭部、頸部または食道）、結腸直腸癌、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、B細胞リンパ腫または多発性骨髄腫が含まれる。追加の例には、甲状腺、内分泌系、脳、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、食道、肝臓、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮もしくは髄芽腫の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、多形神経膠芽腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、癌、悪性膵インスリノーマ（malignant pancreatic insulinoma）、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性皮膚病変（premalignant skin lesion）、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌（genitourinary tract cancer）、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、膵内分泌部もしくは膵外分泌部の新生物、甲状腺髄様癌、髄様甲状腺癌、黒色腫、結腸直腸癌、乳頭様甲状腺癌、肝細胞癌、乳頭パジェット病、葉状腫瘍、小葉癌、乳管癌、膵星細胞の癌、肝星細胞の癌、または前立腺癌が挙げられる。本明細書において使用される用語「前癌」は、癌に先行するか癌に進行する病態または増殖を指す。本明細書において使用される用語「癌転移」は、ある器官、または身体の一部から別の器官、または身体の一部への癌細胞または腫瘍の広がりを指す。
用語「白血病」は、血液形成器官の進行性悪性疾患を広く指し、一般に、血液および骨髄内の白血球およびその前駆体の増殖および発達の歪みを特徴とする。白血病は、一般に、（1）急性または慢性の疾患の持続期間および特徴;（2）関与する細胞の種類;骨髄球性（骨髄性）、リンパ性（リンパ向性）または単球性;および（3）血液白血病性または無白血病（亜白血病性）の異常細胞の数の増加または非増加に基づいて臨床的に分類される。本明細書において提供される化合物、薬学的組成物または方法を用いて処置され得る例示的な白血病には、例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人T細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（leukocythemic leukemia）、好塩基球性白血病、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽球性白血病（hemoblastic leukemia）、血芽球細胞性白血病（hemocytoblastic leukemia）、組織球白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（lymphatic leukemia）、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病（lymphocytic leukemia）、リンパ性白血病（lymphogenous leukemia）、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄顆粒球性白血病（myeloid granulocytic leukemia）、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病（Naegeli leukemia）、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病または未分化性細胞白血病が含まれる。
用語「肉腫」は、一般に、胚性結合組織のような物質から構成され、一般に線維性物質または均質な物質に埋め込まれた密集した細胞から構成される腫瘍を指す。本明細書において提供される化合物、薬学的組成物または方法を用いて処置され得る肉腫には、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバネシー肉腫（Abemethy's sarcoma）、脂肪性肉腫、脂肪肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状横紋筋肉腫、緑色肉腫（chloroma sarcoma）、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、B細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、T細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー星細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性骨肉腫、網状赤血球肉腫（reticulocytic sarcoma）、ラウス肉腫、漿液瘤嚢胞性肉腫、滑膜肉腫または毛細管拡張性肉腫（telangiectaltic sarcoma）が含まれる。
用語「黒色腫」は、皮膚および他の器官のメラノサイト系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。本明細書において提供される化合物、薬学的組成物または方法を用いて処置され得る黒色腫には、例えば、末端黒子型黒色腫、無色素性悪性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫（Cloudman's melanoma）、S91黒色腫、ハーディング・パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫（subungal melanoma）または表在拡大型黒色腫が含まれる。
用語「癌腫」は、周囲組織に浸潤し、転移を引き起こす傾向がある、上皮細胞から構成される悪性新生物を指す。本明細書において提供される化合物、薬学的組成物または方法を用いて処置され得る例示的な癌腫には、例えば、髄様甲状腺癌、家族性髄様甲状腺癌、腺房癌、小葉癌、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺腫様癌（carcinoma adenomatosum）、副腎皮質の癌腫、肺胞癌、肺胞上皮癌、基底細胞癌（basal cell carcinoma）、基底細胞癌（carcinoma basocellulare）、類基底細胞癌、基底扁平上皮癌（basosquamous cell carcinoma）、気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性肺癌、脳状癌腫（cerebriform carcinoma）、胆管細胞癌、絨毛癌（chorionic carcinoma）、膠様癌、面皰癌、子宮体癌（corpus carcinoma）、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円筒形癌（cylindrical carcinoma）、円筒細胞癌、腺管癌、乳管癌、硬膜癌（carcinoma durum）、胚性癌腫、髄様癌、類表皮癌（epiermoid carcinoma）、腺様上皮癌（carcinoma epitheliale adenoides）、外向発育癌、潰瘍癌、線維性癌（carcinoma fibrosum）、ゼラチン状癌（gelatiniforni carcinoma）、コロイド腺癌、巨細胞癌（giant cell carcinoma）、巨細胞癌（carcinoma gigantocellulare）、腺癌（glandular carcinoma）、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血液様癌腫（hematoid carcinoma）、肝細胞癌、ハースル細胞癌、ヒアリン癌腫（hyaline carcinoma）、副腎様癌腫、乳児胚性癌腫、上皮内癌（carcinoma in situ）、表皮内癌、上皮内癌（intraepithelial carcinoma）、クロンペシェール癌腫（Krompecher's carcinoma）、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌、レンズ状癌（lenticular carcinoma）、レンズ状癌（carcinoma lenticulare）、脂肪腫性癌腫（lipomatous carcinoma）、小葉癌、リンパ上皮癌、髄様癌（carcinoma medullare）、髄様癌（medullary carcinoma）、黒色癌、モール癌腫（carcinoma molle）、粘液性癌腫、粘液分泌性癌腫（carcinoma muciparum）、粘液細胞癌腫（carcinoma mucocellulare）、粘表皮癌、粘液癌、粘液性癌、粘液腫様癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌腫（carcinoma ossificans）、類骨癌腫（osteoid carcinoma）、乳頭癌、門脈周囲性癌腫（periportal carcinoma）、前浸潤癌、有棘細胞癌、粥状癌腫（pultaceous carcinoma）、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌腫（carcinoma sarcomatodes）、シュナイダー癌腫、硬性癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌腫（solanoid carcinoma）、回転楕円面細胞癌腫、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌（squamous carcinoma）、扁平上皮癌（squamous cell carcinoma）、ストリング癌腫（string carcinoma）、毛細血管拡張性癌腫（carcinoma telangiectaticum）、毛細血管拡張様癌腫（carcinoma telangiectodes）、移行上皮癌、結節癌（carcinoma tuberosum）、管状癌、結節癌（tuberous carcinoma）、疣状癌または絨毛癌（carcinoma villosum）が含まれる。
（IX）キット
特に少なくとも1つの記載された治療用構築物（少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤を含有するか、それらと結合した送達ビヒクルを含む）を含む活性成分は、キットとして提供され得る。キットは、任意で、治療に使用するための1つまたは複数の追加の薬剤とともに、本明細書において記載される1つまたは複数の化合物または複合体（例えば、抗癌剤）を含む（収容する）1つまたは複数の容器を含むことができる。例えば、一部のキットは、ある量の少なくとも1つの追加の抗癌組成物、もしくはある量の少なくとも1つの追加の抗炎症剤、またはその両方を含む。
キット内の任意の活性成分は、事前に測定された投与量で提供され得るが、これは必須ではない。特定のキットが複数の用量を含むことが予測される。
キットはまた、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知を含むことができ、その通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映する。通知は、提供される活性成分が対象に投与され得ることを記載し得る。キットは、キットを使用するための追加の説明書、例えば、投与、関連廃棄物の適切な処分などに関する説明書を含むことができる。説明書は、キット内に提供される印刷された説明書の形態であり得るか、説明書は、キット自体の一部に印刷されてもよい。説明書は、シート、パンフレット、小冊子、CD-ROMまたはコンピュータ可読装置の形態であってよいか、ウェブサイトなどの遠隔地で説明書に対する指示を提供することができる。特定の態様では、キットはまた、キットを効果的に使用するために必要とされる必須の医療用品、例えば、アプリケーター、アンプル、スポンジ、滅菌接着剤ストリップ、Chloraprep、手袋などの一部または全部を含むことができる。本明細書において記載されるキットのいずれかの内容物を変化させてもよい。キットの説明書は、本明細書において記載される臨床的使用および/または治療的使用を実現するために、そのキットに含まれる活性成分の使用を指示する。
開示される発明の態様の実施および/または試験に使用される好適な方法、材料および例は、本明細書において記載されている。そのような方法および材料は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本明細書において記載されるものと同様または同等の他の方法、材料および例を使用することができる。
以下の例示的な態様および実施例は、本開示の特定の態様を実証するために含まれる。当業者は、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書において開示された特定の態様に多くの変更を加えることができ、同様または類似の結果を依然として得ることができることを本開示に照らして認識すべきである。
（X）例示的な態様
1. 送達システムと、
例えば、送達システムに結合されたまたは送達システム内に含有された、少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤と、
例えば、送達システムに結合されたまたは送達システム内に含有された、少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤と
を含む、治療用構築物。
2. 送達システムが、リポソーム、脂質系粒子、ポリマー粒子、無機ナノ粒子もしくは有機ナノ粒子、無機マイクロ粒子もしくは有機マイクロ粒子、またはそれらのハイブリッドを含む、態様1の治療用構築物。
3. 送達ビヒクルが、フラーレン、エンドヘドラル金属フラーレン（endohedral metallofullerene）、三金属窒化物鋳型エンドヘドラル金属フラーレン、単層カーボンナノチューブおよび多層カーボンナノチューブ、分枝状カーボンナノチューブおよび樹枝状カーボンナノチューブ、金ナノロッド、銀ナノロッド、単層ホウ素/ナイトレートナノチューブおよび多層ホウ素/ナイトレートナノチューブ、カーボンナノチューブピーポッド、カーボンナノホーン、カーボンナノホーンピーポッド、リポソーム、ナノシェル、デンドリマー、マイクロ粒子、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、リン酸カルシウム粒子、アルミニウム塩粒子、ナノロッド、セルロースナノ粒子、ケイ素、シリカマイクロスフェアおよびシリカナノスフェア、ポリマーマイクロスフェアおよびポリマーナノスフェア、シリカシェル、生分解性PLGAマイクロスフェアおよび生分解性PLGAナノスフェア、金ナノ粒子、酸化セリウム粒子、酸化亜鉛粒子、銀ナノ粒子、カーボンナノ粒子、鉄ナノ粒子、ならびに/または修飾ミセルのうちの1つまたは複数を含む、態様2の治療用構築物。
4. 送達ビヒクルが、メソポーラスシリカナノ粒子を含む、態様1～3のいずれか一つの治療用構築物。
5. メソポーラスシリカナノ粒子が、約5～約200nmのサイズを有する、態様4の治療用構築物。
6. メソポーラスシリカナノ粒子が、架橋されたポリエチレンイミンおよびポリエチレングリコールで被覆されている、態様4または5の治療用構築物。
7. 分裂期キナーゼ阻害剤および/または免疫チェックポイント阻害剤が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体を含む、態様1～6のいずれか一つの治療用構築物。
8. 少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤が、ポロ様キナーゼ（PLK）、オーロラキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）1、CDK2、HASPIN、単極紡錘体1キナーゼ（Mps1）、またはNimA関連キナーゼ（NEK）の阻害剤である、態様1～7のいずれか一つの治療用構築物。
9. 分裂期キナーゼ阻害剤が、GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、ボラセルチブ、Chk 1キナーゼ阻害剤LY2603618、AU14022、YK-4-279、AZ703、アリセルチブ、プレキサセルチブ（prexasertib）、またはAZD7762のうちの1つまたは複数を含む、態様1～8のいずれか一つの治療用構築物。
10. 分裂期キナーゼ阻害剤が、ボラセルチブである、態様1～9のいずれか一つの治療用構築物。
11. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3、またはCTLA-4のうちの1つまたは複数に対するsiRNA、阻害剤、または抗体を含む、態様1～10のいずれか一つの治療用構築物。
12. 少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1、PD-1、またはCTLA-4に対する抗体から選択される、態様1～11のいずれか一つの治療用構築物。
13. 少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1に対する抗体である、態様1～12のいずれか一つの治療用構築物。
14. 免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、MPDL3280A、イピリムマブ、トレメリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ピディリズマブ、またはスパルタリズマブのうちの少なくとも1つを含む、態様13の治療用構築物。
15. アジュバントをさらに含む、前記態様のいずれか一つの治療用構築物。
16. アジュバントが、CpGオリゴヌクレオチド、CpG配列を含むDNA TLRアゴニスト、非CpG DNA TLRアゴニスト、RNA TLRアゴニスト、アルミニウム塩、抗CD40抗体、融合タンパク質、サイトカイン、小分子TLRアゴニスト、油系アジュバントもしくは界面活性剤系アジュバント、リポ多糖、植物抽出物、またはそれらの誘導体のうちの1つまたは複数を含む、態様15の治療用構築物。
17. アジュバントが、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、レシキモド、ガーディキモド、ポリI:C、ポリICLC、dSLIM、またはEnanDIMを含む、態様15または16の治療用構築物。
18. アジュバントが、CpGオリゴヌクレオチドを含む、態様17の治療用構築物。
19. 5～999nmの流体力学的サイズを有する、態様1～18のいずれか一つの治療用構築物。
20. 1～1000ミクロンの流体力学的サイズを有する、態様1～18のいずれか一つの治療用構築物。
21. 免疫チェックポイント阻害剤、
分裂期キナーゼ阻害剤、および
免疫チェックポイント阻害剤と分裂期キナーゼ阻害剤とを連結する化学リンカー
を含む、治療用構築物。
22. 分裂期キナーゼ阻害剤が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体である、態様21の治療用構築物。
23. 免疫チェックポイント阻害剤が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体である、態様21または22の治療用構築物。
24. 免疫チェックポイント阻害剤が抗体である、態様21～23のいずれか一つの治療用構築物。
25. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3、またはCTLA-4に対する抗体である、態様21～24のいずれか一つの治療用構築物。
26. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1、PD-1、またはCTLA-4に対する抗体である、態様21～25のいずれか一つの治療用構築物。
27. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1に対する抗体である、態様21～26のいずれか一つの治療用構築物。
28. 分裂期キナーゼ阻害剤が、GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、ボラセルチブ、Chk 1キナーゼ阻害剤LY2603618、AU14022、YK-4-279、AZ703、アリセルチブ、プレキサセルチブまたはAZD7762から選択される、態様21～27のいずれか一つの治療用構築物。
29. 分裂期キナーゼ阻害剤がアリセルチブである、態様21～28のいずれか一つの治療用構築物。
30. 化学リンカーが、ヒドラジン;ジスルフィド;N-スクシンイミジル-4-（2-ピリジルジチオ）ブタノエート;N-スクシンイミジル-4-（2-ピリジルジチオ）-2-スルホブタノエート;パーフルオロフェニル3-（ピリジン-2-イルジスルファニル）プロパノエート;2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-メチル-3-（ピリジン-2-イルジスルファニル）ブタノエート;Gly-Phe-Leu-Gly;Ala-Leu-Ala-Leu;Val-Cit;Phe-Lys;Val-Ala;Ala-Phe-Lys;Phe-Lys;nが1～20である（Gly）n;β-グルクロニドリンカー;マレイミドカプロイル;N-（マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート;4-（4-アセチルフェノキシ）ブタン酸;ジブロモマレイミド;パラアミノ安息香酸;4-ニトロフェノール;酢酸;ギ酸;4-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステル;N-（4-マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド;N-（6-マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド;3-マレイミドプロピオン酸N-スクシンイミジルエステル;N-（3-マレイミドプロピオニルオキシ）スクシンイミド;5-マレイミド吉草酸-NHS;100～10000 Daの分子量を有する直鎖状、分枝状もしくは多腕ポリエチレングリコール;プロパルギル-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル;ピロホスフェート;スクシンイミジル-4-アジドブチレート;4-アジド安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル;tert-ブチル1-（4-ホルミルフェニル）-1-オキソ-5,8,11-トリオキサ-2-アザトリデカン-13-オエート;またはそれらの残基のうちの1つまたは複数を含む、態様21～29のいずれか一つの治療用構築物。
31. 化学リンカーが、N-（マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートリンカーまたはその残基を含む、態様21～30のいずれか一つの治療用構築物。
32. 化学リンカーが、スルホスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートを含む、態様21～31のいずれか一つの治療用構築物。
33. 化学リンカーが、100～10000 Daの分子量を有する直鎖状ポリエチレングリコールまたはその残基を含む、態様21～32のいずれか一つの治療用構築物。
34. 免疫チェックポイント阻害剤に対する分裂期キナーゼ阻害剤の比率が、約1～約20である、請求項21～33のいずれか一項記載の治療用構築物。
35. 免疫チェックポイント阻害剤に対する分裂期キナーゼ阻害剤の比率が、約2～約8である、態様34の治療用構築物。
36. 免疫チェックポイント阻害剤に対する分裂期キナーゼ阻害剤の比率が、約4～約6である、態様34または35の治療用構築物。
37. 分裂期キナーゼ阻害剤に対する免疫チェックポイント阻害剤の比率が、約1～約20である、態様21～33のいずれか一つの治療用構築物。
38. 分裂期キナーゼ阻害剤に対する免疫チェックポイント阻害剤の比率が、約2～約8である、態様37の治療用構築物。
39. 分裂期キナーゼ阻害剤に対する免疫チェックポイント阻害剤の比率が、約4～約6である、態様37または38の治療用構築物。
40. 態様1～39のいずれか一つの治療用構築物と、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む、組成物。
41. 癌を有する対象に、態様1～39のいずれか一つの治療用構築物または態様40の組成物の有効量を投与する工程を含む、癌を処置する方法。
42. 対象がヒトである、態様41の方法。
43. 癌の症状を示す細胞を処置する方法であって、
該細胞と、態様1～39のいずれか一つの治療用構築物または態様40の組成物の治療有効量とを接触させる工程
を含む、前記方法。
44. 癌の症状を示す対象から得られた細胞を処置する方法であって、
該細胞と、態様1～39のいずれか一つの治療用構築物または態様40の組成物の治療有効量とを接触させる工程
を含む、前記方法。
45. 癌の症状を示す対象から得られた細胞を処置する方法であって、
細胞と、態様1～39のいずれか一つの治療用構築物または態様40の組成物の治療有効量とをエクスビボで接触させる工程
を含む、前記方法。
46. 細胞が癌細胞である、態様44または45の方法。
47. 細胞が癌細胞ではない、態様44または45の方法。
48. 細胞が免疫細胞である、態様47の方法。
49. 少なくとも1つの処置された細胞を対象に戻すように投与する工程をさらに含む、態様43～48のいずれか一つの方法。
50. 過剰増殖性疾患または過剰増殖性病態を有すると診断された対象を処置する方法であって、
態様40の組成物の有効量を該対象に投与する工程
を含む、前記方法。
51. 過剰増殖性疾患が、癌、前癌、または癌転移のうちの1つまたは複数を含む、態様50の方法。
52. 過剰増殖性疾患が、黒色腫、肺癌、乳癌、膵癌、脳癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎癌、結腸直腸癌、リンパ腫、結腸癌、または肝癌のうちの1つまたは複数を含む、態様51または52の方法。
53. 投与工程が、
対象の腫瘍への、もしくは対象の腫瘍での注射、
対象の腫瘍への、もしくは対象の腫瘍での局所的な注入、
対象における全身注射、
対象における全身注入、
対象による吸入、
対象への経口投与、または
対象への局所適用
のうちの1つまたは複数を含む、態様50～52のいずれか一つの方法。
54. 投与工程が、マイクロニードル適用を含む、態様50～53のいずれか一つの方法。
55. それを必要とする対象において抗癌療法の効果を増強する方法であって、
態様1～39のいずれか一つの治療用構築物または態様40の組成物の有効量と、
少なくとも1つの抗癌剤と
をそれを必要とする対象に投与する工程
を含む、前記方法。
56. 抗癌剤が、化学療法剤、標的療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤である、態様55の方法。
57. 治療用構築物または組成物と抗癌剤とが、連続的にまたは同時に投与される、態様55または56の方法。
58. 新生物を有すると診断された対象において放射線療法の効果を増強、増大、または改善する方法であって、
態様1～39のいずれか一つの治療用構築物または態様40の組成物の有効量と、
少なくとも1つの放射線療法と
をそれを必要とする対象に投与する工程
を含む、前記方法。
59. 治療用構築物または組成物と放射線療法とが、連続的にまたは同時に投与される、態様58の方法。
60. 対象がヒトである、態様49～59のいずれか一つの方法。
61. 態様1～39のいずれか一つの免疫治療用構築物と、
少なくとも1つの抗癌剤と
を含む、キット。
62. 抗癌剤が、化学療法剤、標的療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤である、態様61のキット。
（XI）実施例
実施例1:癌の治療のためのPLK1阻害とPD-L1遮断との組合せ
ポロ様キナーゼ1（PLK1）は、様々な癌に過剰発現され、発癌性を引き起こす重要な分裂期キナーゼである（Liu et al.,Translational Oncology,10（1）:22-32,2016）。以前の試験では、治療戦略としてのPLK1阻害の可能性が示されており、いくつかのPLK1小分子阻害剤が臨床試験に到達している（Gutteridge et al.,Molecular Cancer Therapeutics,15（7）:1427-35,2016）。ただし、単独療法としてのPLK1阻害剤は、不十分な効果、および用量制限毒性のために、臨床試験を越えて進展していない（de Braud et al.Annals of Oncology:Official Journal of ESMO,26（11）:2341-6,2015;Schoffski et al.,European J Cancer,48（2）:179-86,2012;Lin et al.,British J Cancer,110（10）:2434-40,2014;Frost et al.,Current Oncology,19（1）:e28-35,2012）。最も進展したPLK1阻害剤であるボラセルチブ（BI6727）は、急性骨髄性白血病（血液癌）の第III相臨床試験に到達したが（Gjertsen et al.,Leukemia,29（1）:11-9,2015）、最終的には客観的奏効の主要エンドポイントを満たすことができなかった（European Hematology Association Annual Meeting.Ridgefield,Conn.,2016で発表された、Ingelheim,Results of Phase III study of volasertib for the treatment of acute myeloid leukemia）。肺癌では、所与の用量制限毒性（3週間に1回300mg）での応答の欠如のために、第II相臨床試験の早期に、単独療法としてのボラセルチブは打ち切られた（Ellis et al.,Clinical lung cancer,16（6）:457-65,2015）。これらの結果は、PLK1を阻害する完全な可能性を引き出すために、代替の治療戦略が必要であることを示唆している。
PD-L1/PD-1軸を標的とする免疫チェックポイント遮断の近年の出現は、NSCLC患者にとって有望な結果を提供している。腫瘍細胞上のPD-L1発現は、T細胞のPD-1受容体に結合し、それらの機能を抑制することによって腫瘍指向性細胞傷害性CD8＋T細胞活性を阻害する（Ohaegbulam et al.,Trends in Molecular Medicine,21（1）:24-33,2015;Shrimali et al.,Immunotherapy,7（7）:777-92,2015;Zou et al.,Science Translational Medicine,8（328）:328rv4-rv4,2016）。近年、PD-1およびPD-L1のチェックポイント阻害剤（例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブおよびデュルバルマブ）は、第一選択療法（ペンブロリズマブ）または第二選択療法として、NSCLCの治療のためにFDAの承認を受けた（Gettinger,Immunotherapy of advanced non-small cell lung cancer with immune checkpoint inhibition.（Uptodate.com,2018）。ただし、応答する患者は堅調かつ持続的な応答を示し得るが、患者全体のごく一部が応答するに過ぎず、多くの初期応答者が最終的に再燃する（Reck et al.,New England Journal of Medicine,375（19）:1823-33,2016;Malhotra et al.,Translational Lung Cancer Research,6（2）:196-211,2017;Moya-Horno et al.,Therapeutic Advances in Medical Oncology,10:1758834017745012,2018）。さらに、免疫チェックポイントに対する抗体の全身分布は、異常な制御されていない免疫応答を引き起こし、正常組織に損傷を与える免疫関連有害作用（irAE）をもたらし得る（Reynolds et al.,Journal of Clinical Oncology,36（15＿suppl）:3096,2018）。これらの毒性は治療の中断をもたらす可能性があり、場合によっては、irAEは致死的であり得る。したがって、免疫チェックポイント遮断の応答および治療効果を改善するための戦略は非常に興味深い（Kanwal et al.,Cureus,10（9）:e3254-e,2018）。
近年の試験は、複数のヒト癌細胞株では、PD-L1タンパク質存在量が細胞周期進行中に変動し、M期および初期G1期にピークに達することを示した（Zhang et al.,Nature,553（7686）:91-5,2018）。したがって、ノコダゾールまたはタキソールによってM期で停止させた複数のマウス腫瘍由来細胞株では、PD-L1タンパク質存在量の増加が観察された（Zhang et al.,Nature,553（7686）:91-5,2018）。PLK1の減少は、処置後数日間持続し得る強力な有糸分裂停止を誘導した（図2A～図2C、およびMorry et al.,Mol Cancer Ther.2017,16（4）:763-772）。まとめると、これらの観察結果から、PD-L1抗体をPLK1阻害剤などの分裂期キナーゼ阻害剤と組み合わせると、PLK1阻害剤のアポトーシス効果、およびPD-L1チェックポイント遮断によって誘発される抗腫瘍免疫効果のために癌細胞の死滅を増加させることができるという仮説が導かれた。
PLK1およびPD-L1の両方を標的とする組合せ効果を相乗作用させるための、PD-L1抗体にコンジュゲートさせたPLK1阻害剤負荷メソポーラスシリカナノ粒子プラットフォーム（MSNP）の開発が、本明細書において記載されている。ナノ粒子構築物または抗体薬物コンジュゲート（ADC）を利用してこれらの薬剤を同時送達することにより、治療効果を腫瘍に対して効果的に共局在化させ、薬物の全身処置に関連する毒性の懸念を軽減することができる。該構築物はまた、癌に対する適応免疫を誘発する。本発明者らの試験は、送達担体としてMSNPプラットフォームを利用することによって、毒性を増加させることなく既存の治療を増強するための理論的根拠の組合せ戦略を強調している。
材料および方法
細胞株および試薬:A549 NSCLCは、ATCC（CCL-185）から購入し、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI培地中で維持した。ルイス肺癌（LLC）転移性変異体、LLC-JSP細胞および蛍光標識LLC-JSP細胞は、Dr.Don Gibbons lab（MD Anderson Cancer Center）から寄贈され、RPMI＋10％FBS中で培養した。使用した抗体:ヒトPD-L1抗体（eBioscience）、マウスPD-L1（PE、BD Biosciences）、マウスCD3（APC、eBioscience）、マウスCD8a（Pacific Blue、Invitrogen）、マウスCD4（BV711、BD biosciences）、マウスPD-1（PE/Cy7、BioLegend）。Alexa Fluor 488二次抗体は、Life Technologiesから購入した。インビボグレードのマウスPD-L1抗体はBioXcell（BE0101）から購入し、ボラセルチブはSelleckchemから購入した。SiRNA配列:PLK1
Figure 2022540652000011
;スクランブルSCR
Figure 2022540652000012
はDharmaconから購入した。
ナノ粒子の合成および特性評価:本発明者らが以前に報告したように、裸のMSNPを合成した（Ngamcherdtrakul et al.,Advanced Functional Materials,25（18）:2646-59,2015、および米国特許出願公開第2017/0173169号）。PLK1阻害剤の負荷のために、ボラセルチブをDMSOに溶解し、エタノール溶液に希釈し、MSNPのエタノール溶液と混合して、室温で一晩振盪した（350RPM）。翌日、本発明者らの以前の試験に従って（Ngamcherdtrakul et al.,Advanced Functional Materials,25（18）:2646-59,2015;Ngamcherdtrakul et al.,Int J Nanomedicine,13:4015-27,2018）、PEI（Alfa Aesar）およびmal-PEG-NHS（Jenkem）によってナノ粒子を被覆した。PD-L1抗体コンジュゲーションのために、インビボグレードのマウスPD-L1抗体（BioXcell）をPBS pH8と緩衝液交換し（Zebaスピンカラム、Thermo Fisher）、製造業者のプロトコルに従ってTraut試薬（Thermo Fisher）を使用してチオール化した。チオール化抗体を20重量％でNPに加え、4℃で一晩振盪した（300RPM）。特性評価の前に、PBS pH7.2を用いてナノ粒子を洗浄した。ナノ粒子サイズは90nmであり、Malvern Zetasizerを使用して決定した。抗体負荷量は4重量％であり、BCAアッセイによるNP上清のタンパク質定量によって決定した。PLK1阻害剤負荷を定量するために、ナノ粒子をDMSO溶液中で振盪して薬物を放出させ、上清を回収した。上清の吸光度をTecanプレートリーダーを用いて測定して、負荷量が0.5重量％であると決定した。p-iPLK1-NPは、PLK1阻害剤およびPD-L1抗体の両方を負荷したナノ粒子であり、p-NPは、PD-L1抗体を負荷したナノ粒子であり、iPLK1-NPは、PLK1阻害剤を負荷したナノ粒子である。
フローサイトメトリー:細胞（100Kの細胞/ウェル）を6ウェルプレートに一晩播種し、示した処理を用いて翌日処理した。処理後、細胞を回収し、100万個の細胞/試料に分注した後、FACs緩衝液中で洗浄し、染色した。一次抗体および二次抗体を氷上で揺動させながらそれぞれ30分間および1時間染色した。染色後、細胞をFACs緩衝液中で洗浄した後、Guava easyCyte（Millipore Sigma）フローサイトメーターを用いてフロー分析を行った（10,000事象/試料）。腫瘍については、腫瘍を採取し、細かく刻み、1mg/mlのDNAseと30分間インキュベートした後、70umフィルターを通して破砕して、単一細胞懸濁液を得た。RBC溶解緩衝液を細胞と5分間インキュベートし、PBSを用いて洗浄した。100万個の細胞/試料をFc-shieldを用いてブロッキングした後、色素コンジュゲート抗体を用いて30分間染色した（FACs緩衝液中）。次いで、細胞をFACs緩衝液中で洗浄し、Guavaを用いて分析した（50,000事象/試料）。
ウエスタンブロット。細胞を6ウェルプレートに一晩播種し、示した処理を用いて処理した。処理の1日後、細胞培養培地を交換した。処理の3日後、細胞をRIPA緩衝液（50～100μl/ウェル）に溶解した。溶解物を超音波処理し、遠心分離し（15,000RPMで15分間）、上清を回収した。BCAを使用して総タンパク質量を定量した。30μgのタンパク質（1試料当たり）を4X Novex NuPAGE LDS試料緩衝液およびβ-メルカプトエタノールと混合した（10％最終濃度）。試料を95℃で5分間変性させ、電気泳動のためにゲル（NuPAGE）にロードした。次いで、タンパク質をPVDF-FLメンブレン上に転写し、LICORブロッキング緩衝液を用いてブロッキングした。メンブレンを一次抗体と4℃で一晩インキュベートした（PLK1、ホスホ-STAT3（Tyr705）、β-アクチン）。翌日、メンブレンをTBS-Tを用いてすすぎ、IRDyeコンジュゲート二次抗体（LI-COR）を室温で揺動させながら1時間かけて加えた。LI-COR Odyssey CLxイメージングシステムを用いてメンブレンをスキャンした。
処理後の細胞生存率:細胞（1500個/ウェル）を白色平底96ウェルプレートに一晩播種した。翌日、示した処理を用いて細胞を処理し、処理の24時間後に培地を交換した。処置の3～5日後、製造業者の指示に従ってCell Titer Gloアッセイ（Promega）を使用して、細胞生存率を評価した。Tecanプレートリーダーを用いて発光を読み取った。
PLK1遺伝子ノックダウンを評価するためのRT-qPCR:製造業者の指示に従ってGeneJet RNA精製キット（Thermo Fisher Scientific）を用いて、RNAを単離した。EXPRESS One-Step Superscript（商標）qRT-PCR Kit（Invitrogen）を使用して、One-Step qRT-PCRを行った。サイクリング条件:50℃で2分間、95℃で10分間、95℃で15秒間を40サイクル、および60℃で1分間。TAQMAN遺伝子発現プライマーヒトHPRT mRNA（Hs99999909＿m1）、ヒトPLK1 mRNA（Hs00983225＿g1）およびヒトPD-L1（Hs00204257＿m1）を使用した。2-ΔΔC（t）法を使用してデータを分析した。
相乗的腫瘍モデルおよび処置:単一腫瘍側腹部モデルのために、LLC-JSPマウス肺癌細胞（200K）をC57BL/6雌マウス（6週間）の右側腹部に接種した（Charles River NCIコロニー）。腫瘍接種の8日後、マウスに、ボラセルチブ（20mg/kg）および/またはPD-L1抗体（BioXcell製のマウスPD-L1）;10mg/kg）の処置を合計3用量、5日ごとに腹腔内（i.p.）投与した。Vernier Caliperを用いて腫瘍を測定し、V＝0.5×長さ×幅2によって体積を計算した。両側性腫瘍のために、C57BL/6のそれぞれ右側腹部および左側腹部に、100Kおよび40KのLLC-JSP細胞を接種した。接種の12日後、前述の処置を合計3用量、3日ごとに右腫瘍に腫瘍内投与した。単一側腹部腫瘍モデルおよび両側側腹部腫瘍モデルの両方について、総腫瘍負荷が2000mm3を超えた際にマウスを殺処分した。転移性肺腫瘍モデルのために、LLC-JSP（200K）を6週齢のC57BL/6マウスに静脈内（i.v.）注射した。癌細胞注射の3日後、マウスを無作為に群分けし、i.v.生理食塩水、p-iPLK1-NP（25mg/kg NP）、またはi.p.PD-L1抗体（5mg/kg）およびボラセルチブ（1.25mg/kg）を合計4用量用いて3日ごとに処置した。全試験は、オレゴン健康科学大学（OHSU）のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）によって検討および承認された。
統計分析:統計分析にはいずれも、GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software Inc.）を使用した。スチューデントのt検定を用いて、2つの群間の比較を行った。多重比較のためのテューキーの補正とともに二元配置反復測定分散分析を使用して、腫瘍増殖を分析した。log-rank（Mantel-Cox）法を使用して、カプランマイヤー生存曲線を分析した。有意性をp＜0.05に設定した。インビトロデータを平均±SDとして表し、インビボデータを平均±SEMとして表す。
結果
PLK1ノックダウンは、癌細胞内でPD-L1の発現を誘導する:PLK1をノックダウンし（図2A～図2B）、肺癌細胞死をもたらし（図2C）、癌細胞をG2/M増殖停止状態にする（図2D）、ナノ粒子上で送達される、PLK1に対する小分子阻害剤（例えば、BI2536）またはsiRNAなどの分裂期キナーゼ阻害剤（米国特許出願公開第2017/0173169号を参照）。これは、PLK1の阻害またはノックダウンが、乳癌のG2/Mでは細胞周期停止をもたらすという以前の報告と一致する（Morry et al.,Mol Cancer Ther.,16（4）:763-772,2017）。
PLK1ノックダウンは、ヒト（A549、図3A～図3B）およびマウス（LLC-JSP、図3C）の両肺癌細胞株では、PD-L1表面発現の増加をもたらした。図3Aに示すように、PLK1 mRNAの85％ノックダウン（PLK1に対するsiRNAによる）は、対照処理細胞と比較して、A549細胞株ではPD-L1 mRNA発現の2.5倍の増加をもたらした。次いで、これを、siRNA処理の3日後に、A549（図3B）およびLLC-JSP（図3C）肺癌細胞株の表面タンパク質レベルで確認した。
分裂期キナーゼ阻害剤は、癌細胞を死滅させ、PD-L1発現をアップレギュレートする。PLK1ノックダウンがPD-L1アップレギュレーションをもたらすという本発明者らの発見に続いて、本発明者らは、これが一般に分裂期キナーゼの阻害に当てはまるかどうかを決定しようと努めた。マウス肺癌細胞株では、PLK1（ボラセルチブ）、オーロラキナーゼA（アリセルチブ）およびCHK1（AZD7762）に対してスクリーニングされた3つの主要な分裂期キナーゼ阻害剤。図4に示すように、ボラセルチブ、アリセルチブ、またはAZD7762によるLLC-JSP（マウス肺癌細胞株）の処理は、いずれの場合も顕著な細胞死（図4A）と、表面PD-L1レベルのアップレギュレーション（図4B～図4C）とをもたらした。これにより、分裂期キナーゼ阻害（キナーゼクラスに関わらず）とPD-L1アップレギュレーションとの関連が確認された。生き残った細胞では、細胞傷害性T細胞が生き残った癌細胞を攻撃するのを防ぐ免疫チェックポイント分子（例えば、PD-L1、図3A～図3Cおよび図4B～図4C）のレベルが増加している。したがって、有糸分裂阻害剤（例えば、PLK、オーロラキナーゼ、CHK1、CDK1/2、HASPIN、Mps1、NEKの阻害剤）と免疫チェックポイント阻害剤（例えば、PD-L1、PD-1、CTLA-4に対するモノクローナル抗体）とを同じ構築物上で同時送達すると、さらに多くの癌死がもたらされる。
PLK1阻害とPD-L1遮断との組合せはインビボで腫瘍制御を増強する:PLK1減少がPD-L1増加をもたらすという本発明者らの知見に基づいて、本発明者らは、PLK1阻害とPD-L1遮断とがインビボで相乗作用するかどうかを調査しようと努めた。本発明者らは、LLC-JSP細胞株を使用して、免疫適格マウスにおける側腹部腫瘍モデルを開発した（Chen et al.,Nature Communications,5:5241,2014）。腫瘍接種後8日目に樹立された腫瘍（＞60mm3）を、PLK1阻害剤ボラセルチブ（20mg/kg）およびPD-L1モノクローナル抗体（10mg/kg）を合計3用量用いて、5日ごとにi.p.処置した（図5A）。図5Bに示すように、組合せ処置は、単剤投与と比較して腫瘍増殖を有意に減少させた。さらに、この組合せは、マウスの生存期間を有意に延長し（図5C）、本発明者らの仮説を裏付けた。
PLK1阻害剤ボラセルチブのナノ粒子送達（iPLK1-NP）:分裂期キナーゼPLK1が治療標的として有望であるにも関わらず、現在の小分子阻害剤を用いた臨床試験は期待に反するものであった。臨床試験では、PLK1阻害剤（GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、TKM-PLK1およびBI6727）の6つすべてが失敗している。本発明者らは、PLK1阻害剤の毒性を低減し、腫瘍バイオアベイラビリティを改善するために、本発明者らのMSNPプラットフォームが臨床的に利用可能なPLK1阻害剤の効果を改善することができるかどうかを調査した。Morry et al.（Mol Cancer Ther.,16（4）:763-772,2017）は、肺に転移した胸部腫瘍と、同所性肺腫瘍とを含む胸部腫瘍を標的とし、それらにsiRNAを送達するこのMSNPプラットフォームの有望性を実証した。この研究では、本発明者らは、PLK1の最も進歩した阻害剤である小分子阻害剤ボラセルチブを送達するためにプラットフォームを利用した。ポリエチレンイミン（PEI）およびポリエチレングリコール（PEG）を用いて表面修飾する前に、ボラセルチブをメソポーラスシリカ（図6A）上に負荷した。最終ナノ粒子（iPLK1-NPと呼ばれる）サイズは、EPR効果を利用するのに適切な範囲内である90nmであり（図6B）、0.5重量％のPLK1阻害剤ボラセルチブを含有する。図6Cに示すように、ボラセルチブまたはiPLK1-NPによるLLC-JSP細胞の処理は、ビヒクル処理細胞と比較して用量依存的に細胞生存率を有意に低下させた。さらに、iPLK1-NPを用いた処理は、遊離PLK1阻害剤よりも細胞生存率を低下させた（図6C）。PLK1 siRNA（図3A～図3C）および分裂期キナーゼ阻害剤（図4B～図4C）を使用した以前の知見と一致して、iPLK1-NPを用いた処理は、PD-L1細胞表面発現の顕著な増加をもたらした（図6D）。
iPLK1とPD-L1抗体との同時送達のためのナノ粒子（p-iPLK1-NP）:iPLK1-NPは癌細胞を効果的に死滅させ、生き残った細胞のPD-L1を同時にアップレギュレートすることができるため、本発明者らは、これを、PD-L1抗体をiPLK1-NP上にコンジュゲートすることによって、PD-L1＋癌細胞を標的とするための利点として利用することを目指した。この意味で、PD-L1標的iPLK1-NP（p-iPLK1-NPと呼ばれる）の反復投与がPD-L1発現をアップレギュレートし、優れた腫瘍標的化がアポトーシス（PLK1阻害による）および抗腫瘍免疫応答（PD-L1遮断による）の両方を誘導することを可能にするフィードフォワードループを生成することができる。これは、ナノ粒子送達のための明らかな標的/受容体がない腫瘍を処置するのに特に有利であり、最終的には、さらに高い応答率の免疫チェックポイント遮断を可能にし得る。図7Aに示すように、PD-L1抗体をNP上でPEGにコンジュゲートし、BCAアッセイによって抗体量が4重量％であると決定した。構築物の流体力学的サイズは、約90nmであることが図7Bに示されている。LLC-JSP細胞株では、iPLK1-NPと同様に、p-iPLK1-NPによる処理は、細胞生存率を有意に低下させた（図7C）。さらに、p-iPLK1-NPと2時間インキュベートしたLLC-JSP細胞は、25倍の用量で送達された遊離PD-L1抗体と同程度にPD-L1表面受容体を遮断した（図7D）。これは、抗体がナノ粒子とともに送達された際に細胞が経験した高い局所濃度の抗体に起因する可能性がある。iPLK1-NPは、この短い時点では、PD-L1レベルに影響を及ぼさなかった（図7D）。iPLK1-NPを用いて細胞を2日間処理すると、予測通りPD-L1レベルが増加し、PD-L1抗体を含有するナノ粒子（p-iPLK1-NP）を用いて処理すると正常レベル（未処理を参照）まで低下した（図7E）。これは、PLK1阻害によって誘導される、PD-L1受容体のナノ粒子標的化および遮断を実証している。
p-iPLK1-NPの局所送達は局所腫瘍および遠位腫瘍の増殖を減少させる:p-iPLK1-NPの抗腫瘍免疫応答を評価するために、本発明者らは両側側腹部腫瘍モデルを利用した。C57BL/6マウスのそれぞれ右側腹部および左側腹部に、100Kおよび40KのLLC-JSP細胞を注射した。注射後12日目に、右側腹部（局所）腫瘍に、PBS、p-NP、iPLK1-NPまたはp-iPLK1-NP（0.5mgのNP、2.5μgのiPLK1、20μgのPD-L1）を3日ごとに合計3回注射した（図8A）。局所（処置）腫瘍および遠位（未処置）腫瘍の腫瘍増殖をモニタリングした。p-iPLK1-NPによる処置は、単剤（p-NPまたはiPLK1-NP）を含有するナノ粒子と比較して、局所腫瘍の腫瘍増殖を有意に減少させた（図8B）。重要なことに、p-iPLK1-NP処置マウスでは遠位腫瘍の発症の遅延も観察され（図8C）、これは、抗腫瘍免疫応答が生じたことを示している。抗腫瘍免疫効果は、ナノ粒子上のPD-L1のみに由来せず、ナノ粒子上のPD-L1阻害剤およびPLK1阻害剤の両方によってもたらされた（図8C）。さらに、p-iPLK1-NPの処置は、生理食塩水対照または単剤NPと比較して、マウスの生存期間を有意に延長した（図8D）。さらに、別の試験では、図8Aに示すようにマウスに生理食塩水またはp-iPLK1-NPを注射し、最後の処置の1日後に腫瘍を採取して、T細胞浸潤を評価した。図8Eに示すように、p-iPLK1-NPを用いて処置した腫瘍は、有意に高いCD3＋腫瘍浸潤リンパ球（TIL）およびCD8＋腫瘍浸潤リンパ球（TIL）を有したが、CD4＋TILは対照腫瘍と比較して増強されなかった。
p-iPLK1-NPの全身投与は、実験的転移性腫瘍を有するマウスの生存期間を延長する:肺癌に対するp-iPLK1-NPの臨床的可能性を実証するために、本発明者らは、LLC-JSP細胞（200Kの細胞）の静脈内注射によって実験的転移性肺腫瘍モデルを開発した。細胞注射の3日後、図9Aに示すように、マウスを無作為に群分けし、生理食塩水、p-iPLK1-NPまたは遊離薬物（ボラセルチブ＋PD-L1抗体）を合計4用量用いて、3日ごとに処置した。遊離薬物をNP上の量の5倍の用量で投与した。p-iPLK1-NPを用いて処置したマウスは、生理食塩水を用いて処置したマウスよりも有意に長く生存した（図9B）。死亡した各マウスについて、肺腫瘍の存在を視覚的に確認した。データは、p-iPLK1-NPが、腫瘍標的化、および治療効果の共局在化、ならびに適応抗腫瘍免疫の誘発のためのナノ粒子の能力に起因して、5倍の用量で投与された遊離薬物と同程度に効果的であったことを示している。さらに、p-iPLK1-NPによる処置は、いかなる体重減少も引き起こさず、構築物の安全性が実証された（図9C）。治療用構築物の全身適用は、局所送達に適用できない他の癌の処置を可能にする。
p-iPLK1-NPの全身投与はCD8＋T細胞に依存する:C57BL/6マウスに200KのLLC-JSP細胞を静脈内注射した。3日後、生理食塩水、p-iPLK1-NP（i.v.、2.5μgのボラセルチブおよび20μgのPD-L1抗体を含有する）、またはp-iPLK1-NP＋抗CD8（200μg、週2回）を用いてマウスを処置した。図10に示すように、p-iPLK1-NPの効果は、CD8枯渇がp-iPLK1-NPの効果を無効にし、生存期間延長が観察されなかったため、免疫媒介性であった（生理食塩水対p-iPLK1-NP＋抗CD8抗体;p＞0.05＝ns）。免疫媒介性応答は、この特異的ナノ構築物による直接的な薬物効果に取って代わる。
抗PD-L1コンジュゲートNPのフィードフォワード（ポジティブフィードバックループ）送達および特異性。p-iPLK1-NPは、結合および内在化の際にPD-L1レベルを最初に低下させるが（図7D～Eに示すように）、生き残った細胞では、PLK1阻害のシグナル伝達効果のためにPD-L1レベルがアップレギュレートされている（図6D）。これに関連して、調節されていないPD-L1を、その後のp-iPLK1-NPの送達のためのホーミング標的として使用すると、フィードフォワード様式でガン標的化がもたらされる（すなわち、すべての癌が消失するまで処置の用量を増加させるほど、標的化が高度になる）。p-iPLK1-NPのフィードフォワード標的化を調査するために、本発明者らは、低いベースラインPD-L1レベルを発現する4T1マウス癌細胞を使用した。p-iPLK1-NPは、処理の4日後に4T1細胞内のPD-L1のアップレギュレーションをもたらした（図11A）。次いで、本発明者らは、対照（PD-L1が低い）およびp-iPLK1-NP処理4T1細胞（PD-L1がアップレギュレートされている）内のp-iPLK1-NPの細胞取込みを評価した。図11Bに示すように、1時間の曝露後、p-iPLK1-NPは、PD-L1低細胞のほぼ4倍だけPD-L1高細胞によって優先的に取り込まれ、p-iPLK1-NPによる選択性およびフィードフォワード標的化が実証された。本発明者らはまた、p-iPLK1-NPを用いて処理した後の骨髄由来樹状細胞（BMDC）と対比して様々な癌細胞（肺LLC-JSP癌細胞、胸部4T1癌細胞、黒色腫B16-F10癌細胞）の生存率を比較することによって、細胞殺傷選択性を評価した。図11Cに示すように、p-iPLK1-NPは、癌細胞では顕著な細胞殺傷をもたらしたが、抗腫瘍T細胞を発達させるための抗原提示に必要な樹状細胞では、最小限の殺傷をもたらした。また、PLK1などの分裂期キナーゼの阻害（例えばsiRNAによる、図12A）は、STAT3のリン酸化を減少させたため、腫瘍の免疫抑制環境を調節するのに有益であろう。
考察
この実施例では、PLK1ならびに他の分裂期キナーゼであるオーロラキナーゼAおよびCHK1の阻害が、ヒトおよびマウスのNSCLC細胞内で免疫チェックポイントPD-L1発現の増加をもたらすことが示されている。これは、免疫応答の回避が、分裂期キナーゼ阻害を生き延びる癌細胞によって利用される機構であることを示唆している。
以前の試験では、免疫に関するPLK1の役割も示されている。例えば、PLK1は、免疫抑制性微小環境を促進するSTAT3活性化の調節因子であることが示されており（Zhang et al.,Gastroenterology,142（3）:521-30.e3,2012）、本明細書において報告されるように（図12A）、PLK1を阻害すると、NSCLC細胞内でリン酸化STAT3の喪失がもたらされた（Yan et al.,Oncology Letters,16（5）:6801-7,2018）。さらに、PLK1は、MAVSと会合し、I型インターフェロンの誘導ではその活性を負に制御することが見出された（Gringhuis et al.,Nature Immunology,18（2）:225-35,2017;Vitour et al.,J Biological Chemistry,284（33）:21797-809,2009）。興味深いことに、PLK1阻害はまた、抗原提示表面受容体であるMHCクラスIタンパク質をコードするHLA mRNAを顕著に増加させることが示されている（Li et al.,Journal of Oncology,2018:3979527,2018）。これらの試験は、PLK1阻害が、免疫療法を増強するのに有望であり得ることを示唆している。ただし、本発明者らの知る限りでは、これは、PLK1阻害と免疫療法との組合せの効果を報告する最初の試験である。
PLK1阻害は、PD-L1アップレギュレーションを誘導し、PD-L1抗体とPLK1阻害剤との同時送達は、NSCLCについて示されるように治療転帰を顕著に増強する。また、卵巣癌におけるパクリタキセル（Peng et al.,Cancer Research,75（23）:5034-45,2015）、CDK4/6阻害剤（Zhang et al.,Nature,553（7686）:91-5,2018）、および乳癌におけるPARP阻害剤（Jiao et al.,Clin Cancer Res,23（14）:3711-20,2017）を含む他の細胞毒性剤が、PD-L1発現を増加させることが示されている。したがって、これらの薬物がPD-L1チェックポイント遮断と組み合わせて現在臨床研究中であることは理にかなっている（Esteva et al.,The Lancet Oncology,20（3）:e175-e86,2019）。本発明者らの知見はまた、これらおよび他の細胞毒性剤を本発明者らのナノ粒子上のPD-L1免疫チェックポイント遮断と組み合わせて、臨床で効果的な治療を促進し、毒性を低下させることができることを示唆している。
本実施例で提示した研究では、主要な致命的な癌である肺癌に焦点が当てられた（American Cancer Society,Cancer Facts＆Figures.2018）。免疫療法が最も有望である黒色腫のように、肺癌は、宿主免疫系によって認識され得る様々なネオエピトープの発現を促進する変異負荷が高い疾患である（Campbell et al.,Nature Genetics,48（6）:607-16,2016;Rizvi et al.,Science,348（6230）:124-8,2015）。そのため、免疫療法は、肺癌を処置するための有望な手法である。ただし、肺癌患者では、客観的応答率は黒色腫よりもはるかに低い。本明細書において記載される研究は、PLK1阻害をPD-L1遮断と組み合わせると、肺癌に対してどのように優れた応答が達成され得るかを例示する。さらに、PD-L1の増加はPLK1阻害剤に特異的ではないため、現在の免疫チェックポイント遮断剤と相乗作用させるために、PD-L1のアップレギュレーションを誘導する他の細胞毒性剤を探索することができる。加えて、本発明者らのMSNPプラットフォームを用いて治療効果を共局在化することによって、必要な薬物の用量を5分の1に減少させることができる。これは、ナノ粒子が遊離薬物の効果を改善し、全身毒性を減少させることができることを示唆している。免疫チェックポイント遮断を伴う現在の併用療法戦略は有害事象率を増加させ得るため、これは転帰を改善するための鍵である。最後に、MSNPプラットフォームの汎用性のために、標的化抗体（例えばPD-L1）およびPLK1阻害剤に加えて、siRNAを負荷して、癌進行または免疫回避の調節因子として同定された任意の遺伝子を標的とすることもできる。
実施例2:治療用構築物の機能を増強するためのアジュバントオリゴヌクレオチド
抗腫瘍免疫を増強するために、アジュバントオリゴヌクレオチドを組み込むこともできる。例えば、p-iPLK1-NP上へのCpGの組込み（p-iPLK1-NP-CpGと呼ばれる）は、マウス7匹のうち2匹の生存を有意に改善し、マウス1匹は腫瘍を完全に有しなかった（図13）。CpGオリゴデオキシヌクレオチドは、PRR、特にtoll様受容体9（TLR9）を刺激するための損傷関連分子パターン（DAMP）として作用する。これは、抗原提示細胞の活性化およびその後のT細胞のプライミングのための危険シグナルとして機能する。したがって、抗原を放出し（有糸分裂阻害剤による癌殺傷を介して）、CpGアジュバントを送達し、免疫チェックポイントを遮断することによって、この治療薬は、癌細胞が免疫応答を回避する様々な戦略に対処する（Patel＆Minn,Immunity 48（3）:417-433,2018）。
実施例3:アリセルチブとPD-L1抗体との抗体-薬物コンジュゲート（ADC）は、遊離薬物対応物と比較して細胞殺傷を増強する
免疫チェックポイント抗体-分裂期キナーゼ阻害剤ADCは、免疫チェックポイント抗体、MKIおよびリンカーから構成される。抗体は、薬物（MKI）のための担体として機能する。リンカーは、所望のADCの物理化学的特性および薬物動態を得て、薬物遊離を制御するように調整することができる。薬物は、標的細胞の外側または内側に放出され得る。薬物が標的細胞の内側に放出されると、抗体は、細胞内の薬物取込みを増強するための標的化部分としても機能する。薬物対抗体の比率は、1～20の範囲であり得る。理想的な比率（例えば、約2～約8または約4～約6）は、最良の薬物動態および腫瘍蓄積、ならびに最高の抗腫瘍活性をもたらすはずである。
材料および方法。PD-L1-アリセルチブの合成には3工程を含めた。（1）アリセルチブ-PEGコンジュゲーション、（2）PD-L1活性化、および（3）PD-L1-アリセルチブコンジュゲーション。（1）:5mg/mlのアリセルチブ（Selleck Chemicals、USA）のジメチルスルホキシド（DMSO）（Fisher Scientific、USA）溶液0.3mlと、60mg/mlの（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Thermo Scientific、USA）のDMSO溶液50μlおよび60mg/mlのN-ヒドロキシスクシンイミド（Sigma Aldrich、USA）のDMSO溶液27μlとを混合した。その後、40mg/mlのH2N-PEG-SH（MW400）（Nanocs、USA）のDMSO溶液57.8μlを加えた。反応混合物をN2を用いて1分間パージし、次いで、室温で12時間撹拌した。次いで、蒸留水を加えて、アリセルチブ-PEG-SHを沈殿させた。アリセルチブ-PEG-SHを15,000rpm、4℃で10分間遠心分離することによって回収し、蒸留水を用いて3回洗浄した。最終的な清浄なアリセルチブ-PEG-SHを長期保存のために凍結乾燥した（AdVantage 2.0、SP Scientific、USA）。（2）6.76mg/mlのPD-L1（BioXCell、USA）0.147mlと、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.2）0.9mlおよび5mg/mlのスルホスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）（Thermo Fisher、USA）水溶液29μlとを混合した。反応混合物を室温で1時間撹拌した。脱塩カラム（Thermo Fisher、USA）を使用して、純粋なPD-L1-SMCCを回収した。（3）:750μgのPD-L1-SMCCおよび70μgのアリセルチブ-PEG-SHを、PBS（pH7.2）（1ml）、DMSO（50μl）およびプロピレングリコール（50μl）の混合物に溶解した。反応混合物をN2を用いて1分間パージし、次いで、室温で24時間撹拌した。PD-L1-アリセルチブ溶液を脱塩カラムによって回収した後、凍結乾燥した。280nmおよび318nmでのUV吸光度によって、薬物対抗体の比率を決定した。
結果:本発明者らは、FDA承認ADC薬（KadcylaまたはT-DM1）に使用されるN-（マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（MCC）リンカーを使用して、PD-L1抗体-アリセルチブコンジュゲートを調製した。MCCリンカーは切断可能ではないが、抗体-MCCへのコンジュゲーションの前に、-HN-CO-結合を介して短いPEG鎖によってアリセルチブを修飾した（図14A）。このアミド結合は、エンドソームおよびリソソーム内の酸性条件によって加水分解され、アリセルチブをインタクトで放出することができた。短いPEG8（MW400Da）を使用して、アリセルチブの溶解度を高め、抗体-MCCとのコンジュゲーションのためのチオール基を導入した。遊離アリセルチブおよびチオール化アリセルチブを除去するために脱塩カラムを使用した。薬物対抗体の比率（DAR）は、6アリセルチブ分子/抗体であった（UV-Visによって決定）。ADCは、LLC-JSP細胞では遊離アリセルチブよりも顕著に大きい細胞傷害性を有したのに対して（図14B）、遊離PD-L1は、細胞生存率に影響を及ぼさなかった（図14C）。
実施例4:局所製剤、および治療用構築物の適用
本明細書において開示される治療用構築物は、局所製剤に製剤化することができる。当技術分野において公知のいくつかのビヒクル、例えば、Aquaphor（軟膏系）およびCarbopol（ゲル系）を構築物と混合することができる。熱または界面活性剤（例えば、乳化剤としてのポリソルベート80（Tween 80））を使用して、ビヒクルとAIRISEの水性懸濁液とのさらに良好な混合を可能にすることができる。一例として、10重量％のTween-80が、ナノ粒子からのsiRNAの早期漏出を引き起こさないことを確認した。また、2.5重量％のTween-80が、混合物を55°Cに加温した際にsiRNA-NPとAquaphorとの混合を増強するのに十分であることが示された。
浸透を同時に促進する方法、例えば、超音波およびマイクロニードルローラー（例えば、0.5mm～1.5mmの範囲のニードル高さを有するDermaroller（登録商標））を使用することができる。ブタ皮膚（図15）およびマウス（図16）に対して試験した場合、0.5mmという短いニードル高さを有するマイクロニードルを適用すると、局所siRNAナノ粒子製剤の浸透を増強することができる。
図15は、ヒト皮膚と厚さが類似しているブタ皮膚に対して試験した場合、マイクロニードルローラーが、siRNAナノ粒子構築物の浸透を増強することを示している。ブタ皮膚を製剤（Dy677-siSCR-NPのAquaphor溶液）とともに1.5時間インキュベートした（37°C;5％CO2）。1.5時間後、処理領域から皮膚パンチを採取し、標準的な手法を使用して蛍光イメージングのために処理した。マイクロニードルローラーによる皮膚浸透の顕著な増強が観察された。ローラーを用いずsiRNA-NPのAquaphor溶液を投与した場合、siRNAシグナル（矢印）はブタ皮膚の外面に限定されたが、本発明者らは、マイクロニードルの適用前に表皮を越えて真皮層に至るsiRNAシグナル（矢印）を観察した（図15）。
図16は、マイクロニードルローラーが、siRNA-NPの局所送達を増強することを示している。まず、処置の1日前にマウスを剃毛した。Dy677-siSCR-NP（0.72nmol siRNA）を100μLの2.5％Tween-Aquaphorと混合した（適用1回当たり）。処置の直前に、真皮マイクロローラーを背部の片側のみに4方向に一定して適用し、他方の側は前処理しなかった。比較のために、マイクロニードル前処理の有無に関わらず、混合物を剃毛領域（約2cm2の適用領域）に適用した。1.5時間の処理時間後、処理した皮膚試料を採取し、イメージングのために処理した。
図17A～図17Bは、マイクロローラー＋局所siRNAナノ構築物適用の3日後に得られた遺伝子ノックダウンを示す。生理食塩水処置群と対比して、siEGFR-NP群では55％のEGFRノックダウン（＊p＜0.05）（図17A）が観察された。比較すると、siEGFR-NPの1回の皮内注射（0.72nmolの同じsiEGFR用量）は、生理食塩水処置群と対比して40％のEGFRノックダウンをもたらした（図17B）。治療用構築物のマイクロニードル形態。図18に示すように、マイクロニードル製造について、デキストラン、アミロペクチン、PVP、PEG、メチルセルロース、キトサン、または当技術分野において公知の他のポリマーもしくは化合物に基づく溶解性マイクロニードルの使用を検討し、この溶解性マイクロニードルの使用は、無痛の在宅治療を可能にし、高いニードル密度（ニードル100本/1cm2）に起因してAIRISE-02を送達するのに非常に効果的である。例（図18）として、Dy677コンジュゲートsiRNAを負荷したNPを含有するデキストラン溶液（300mg/ml水溶液）をマイクロニードル型枠上に流延した。溶液を遠心分離するか真空にして、型枠を密に充填した。マイクロニードルを空気、デシケーター、真空オーブン、冷蔵庫またはそれらの組合せによって乾燥させ、型枠から取り出した。ニードルの高さは、型板および最適化に応じて300～800ミクロンまで変化させた。siRNA-NPをこれらのニードルアレイに首尾よく負荷し（約0.5nmol siRNA/アレイで）、ニードルはブタ皮膚への適用後5分以内に完全に溶解した。マイクロニードルの成分を変化させることにより、異なる溶解時間を操作することができる。異なる型板を用いて、異なる形状および形態のマイクロニードルパッチを製造することもできる。
当業者によって理解されるように、本明細書において開示される各態様は、その特定の記載された要素、工程、成分または構成要素を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。したがって、用語「含む（include）」または「含む（including）」は、「含む（comprise）、からなる（consist of）、またはから本質的になる（consist essentially of）」を列挙するように解釈されるべきである。移行用語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」は、不特定の要素、工程、成分または構成要素を大量であっても含むがそれらに限定されないこと、および含むことを可能にすることを意味する。移行句「からなる（consisting of）」は、指定されていないいかなる要素、工程、成分または構成要素も排除する。移行句「から本質的になる（consisting essentially of）」は、態様の範囲を、指定された要素、工程、成分または構成要素、および態様に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。重大な影響とは、これに関連して、治療用構築物の生物学的影響（抗癌効果など）の測定可能な減少である。
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表すすべての数字は、いずれの場合も用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメーターは、本発明によって得ることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、かつ通常の丸め技術を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。さらに明確にする必要がある場合、用語「約」は、記載された数値または範囲と組み合わせて使用される際に、当業者によって合理的に与えられる意味を有し、すなわち、記載された値または範囲よりもいくらか大きいかいくらか小さく、記載された値の±20％、記載された値の±19％、記載された値の±18％、記載された値の±17％、記載された値の±16％、記載された値の±15％、記載された値の±14％、記載された値の±13％、記載された値の±12％、記載された値の±11％、記載された値の±10％、記載された値の±9％、記載された値の±8％、記載された値の±7％、記載された値の±6％、記載された値の±5％、記載された値の±4％、記載された値の±3％、記載された値の±2％、または記載された値の±1％の範囲内であることを示す。
本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメーターが近似値であるとしても、特定の実施例に示される数値は、実行可能な程度に正確に報告される。ただし、任意の数値は、それぞれの試験測定値に見出された標準偏差に必然的に起因する特定の誤差を本質的に含む。
本発明を説明する文脈において（特に添付の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「a」、「an」、「the」および同様の指示対象は、本明細書において別段の指定がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内に入る各別個の値を個別に言及する簡略方法として機能することを意図しているに過ぎない。本明細書において別段の指定がない限り、各個々の値は、本明細書において個別に記載されているかのように本明細書に組み入れられる。本明細書において記載されるすべての方法は、本明細書において別段の指定がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書において提供されるいずれかのおよびすべての実施例または例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をさらによく説明することを意図するものであり、他の方法で特許請求される本発明の範囲に対して限定を課すものではない。本明細書中のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていないいずれかの要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書において開示される、本発明の代替的な要素または態様の群分けは、限定として解釈されるべきではない。各群構成要素は、個別に、または群の他の構成要素もしくは本明細書において見出される他の要素と任意に組み合わせて参照および特許請求され得る。便宜および/または特許性の理由から、ある群の1つまたは複数の構成要素が、ある群に包含されるか、ある群から削除され得ることが予測される。そのようないずれかの包含または削除が生じる場合、本明細書は、改変された群を含み、したがって、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記述された説明を満たすと見なされる。
本発明を実施するために本発明者に公知の最良の形態を含めて、本発明の一定の態様が本明細書において記載されている。言うまでもなく、前述の説明を読めば、これらの記載された態様に対する変形例が当業者に明らかになるであろう。本発明者は、当業者がそのような変形例を適切に使用することを予測しており、本発明者らは、本発明が本明細書において具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法が許容する限り、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題のすべての改変および均等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形例における上述の要素の任意の組合せは、本明細書において別段の指定がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
さらに、本明細書全体を通して、特許、印刷刊行物、学術論文および他の文章（本明細書において参照される資料）が多数参照されている。参照される資料の各々は、参照される教示について参照によりその全体が本明細書に個別に組み入れられる。
本明細書において開示される本発明の態様は、本発明の原理の例示であることを理解されたい。使用され得る他の改変は、本発明の範囲内である。このため、限定されることなく例として、本明細書における教示に従って、本発明の代替的な構成が利用され得る。したがって、本発明は、示され記載されたものと正確に同じものに限定されない。
本明細書において示される詳細は、例としてのものであり、本発明の好ましい態様の例示的な説明のためのものに過ぎず、本発明の様々な態様の原理および概念的局面の最も有用で容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されている。これに関連して、本発明の基本的な理解のために必要なものよりも詳細に本発明の構造的詳細を示すことは試みられておらず、図面および/または実施例を用いた説明は、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具現化され得るかを当業者に明らかにする。
本開示において使用される定義および説明は、実施例において明確かつ一義的に変更されない限り、または意味の適用により任意の構成が無意味もしくは本質的に無意味になる場合を除いて、将来の任意の構成を制御することを意味および意図している。定義は、用語の構成がそれを無意味または本質的に無意味にする場合、Webster's Dictionary,3rd Editionまたは当業者に公知の辞書、例えば、Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology（Ed.Anthony Smith,Oxford University Press,Oxford,2004）から解釈されるべきである。

Claims (62)

  1. 少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤と、
    少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤と
    を含む送達システム
    を含む、治療用構築物。
  2. 送達システムが、リポソーム、脂質系粒子、ポリマー粒子、無機ナノ粒子もしくは有機ナノ粒子、無機マイクロ粒子もしくは有機マイクロ粒子、またはそれらのハイブリッドを含む、請求項1記載の治療用構築物。
  3. 送達ビヒクルが、フラーレン、エンドヘドラル金属フラーレン（endohedral metallofullerene）、三金属窒化物鋳型エンドヘドラル金属フラーレン、単層カーボンナノチューブおよび多層カーボンナノチューブ、リン酸カルシウム粒子、アルミニウム塩粒子、分枝状カーボンナノチューブおよび樹枝状カーボンナノチューブ、金ナノロッド、銀ナノロッド、単層ホウ素/ナイトレートナノチューブおよび多層ホウ素/ナイトレートナノチューブ、カーボンナノチューブピーポッド、カーボンナノホーン、カーボンナノホーンピーポッド、リポソーム、ナノシェル、デンドリマー、マイクロ粒子、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、ナノロッド、セルロースナノ粒子、ケイ素、シリカマイクロスフェアおよびシリカナノスフェア、ポリマーマイクロスフェアおよびポリマーナノスフェア、シリカシェル、生分解性PLGAマイクロスフェアおよび生分解性PLGAナノスフェア、金ナノ粒子、酸化セリウム粒子、酸化亜鉛粒子、銀ナノ粒子、カーボンナノ粒子、鉄ナノ粒子、ならびに/または修飾ミセルのうちの1つまたは複数を含む、請求項2記載の治療用構築物。
  4. 送達ビヒクルが、メソポーラスシリカナノ粒子を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の治療用構築物。
  5. メソポーラスシリカナノ粒子が、約5～約200nmの平均粒径を有する、請求項4記載の治療用構築物。
  6. メソポーラスシリカナノ粒子が、架橋されたポリエチレンイミンおよびポリエチレングリコールで被覆されている、請求項4または5記載の治療用構築物。
  7. 少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤および/または免疫チェックポイント阻害剤が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体を含む、請求項1～6のいずれか一項記載の治療用構築物。
  8. 少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤が、ポロ様キナーゼ（PLK）、オーロラキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）1、CDK2、HASPIN、単極紡錘体1キナーゼ（Mps1）、NimA関連キナーゼ（NEK）の阻害剤である、請求項1～7のいずれか一項記載の治療用構築物。
  9. 少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤が、GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、ボラセルチブ、Chk 1キナーゼ阻害剤LY2603618、AU14022、YK-4-279、AZ703、アリセルチブ、プレキサセルチブ（prexasertib）、またはAZD7762のうちの1つまたは複数を含む、請求項1～8のいずれか一項記載の治療用構築物。
  10. 少なくとも1つの分裂期キナーゼ阻害剤が、ボラセルチブを含む、請求項1～9のいずれか一項記載の治療用構築物。
  11. 少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3、またはCTLA-4のうちの1つまたは複数に対するsiRNA、阻害剤、または抗体を含む、請求項1～10のいずれか一項記載の治療用構築物。
  12. 少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1、PD-1、またはCTLA-4に対する抗体である、請求項1～11のいずれか一項記載の治療用構築物。
  13. 少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1に対する抗体である、請求項1～12のいずれか一項記載の治療用構築物。
  14. 少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、MPDL3280A、イピリムマブ、トレメリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ピディリズマブ、またはスパルタリズマブのうちの少なくとも1つを含む、請求項13記載の治療用構築物。
  15. アジュバントをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の治療用構築物。
  16. アジュバントが、CpGオリゴヌクレオチド、CpG配列を含むDNA TLRアゴニスト、非CpG DNA TLRアゴニスト、RNA TLRアゴニスト、アルミニウム塩、抗CD40抗体、融合タンパク質、サイトカイン、小分子TLRアゴニスト、油系アジュバントもしくは界面活性剤系アジュバント、リポ多糖、植物抽出物、またはそれらの誘導体のうちの1つまたは複数を含む、請求項15記載の治療用構築物。
  17. アジュバントが、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、レシキモド、ガーディキモド、ポリI:C、ポリICLC、dSLIM、またはEnanDIMを含む、請求項15または16記載の治療用構築物。
  18. アジュバントが、CpGオリゴヌクレオチドを含む、請求項16記載の治療用構築物。
  19. 5～999nmの流体力学的サイズを有する、請求項1～18のいずれか一項記載の治療用構築物。
  20. 1～1000ミクロンの流体力学的サイズを有する、請求項1～18のいずれか一項記載の治療用構築物。
  21. 免疫チェックポイント阻害剤、
    分裂期キナーゼ阻害剤、および
    免疫チェックポイント阻害剤と分裂期キナーゼ阻害剤とを連結する化学リンカー
    を含む、治療用構築物。
  22. 分裂期キナーゼ阻害剤が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体である、請求項21記載の治療用構築物。
  23. 免疫チェックポイント阻害剤が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または抗体である、請求項21または22記載の治療用構築物。
  24. 免疫チェックポイント阻害剤が抗体である、請求項21～23のいずれか一項記載の治療用構築物。
  25. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1、PD-1、TIM-3、LAG-3、またはCTLA-4に対する抗体である、請求項21～24のいずれか一項記載の治療用構築物。
  26. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1、PD-1、またはCTLA-4に対する抗体である、請求項21～25のいずれか一項記載の治療用構築物。
  27. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-L1に対する抗体である、請求項21～26のいずれか一項記載の治療用構築物。
  28. 分裂期キナーゼ阻害剤が、GSK461364、BI2536、Tak960、NMS-P937、ボラセルチブ、Chk 1キナーゼ阻害剤LY2603618、AU14022、YK-4-279、AZ703、アリセルチブ、プレキサセルチブまたはAZD7762から選択される、請求項21～27のいずれか一項記載の治療用構築物。
  29. 分裂期キナーゼ阻害剤がアリセルチブである、請求項21～28のいずれか一項記載の治療用構築物。
  30. 化学リンカーが、ヒドラジン;ジスルフィド;N-スクシンイミジル-4-（2-ピリジルジチオ）ブタノエート;N-スクシンイミジル-4-（2-ピリジルジチオ）-2-スルホブタノエート;パーフルオロフェニル3-（ピリジン-2-イルジスルファニル）プロパノエート;2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3-メチル-3-（ピリジン-2-イルジスルファニル）ブタノエート;Gly-Phe-Leu-Gly;Ala-Leu-Ala-Leu;Val-Cit;Phe-Lys;Val-Ala;Ala-Phe-Lys;Phe-Lys;nが1～20である（Gly）n;β-グルクロニドリンカー;マレイミドカプロイル;N-（マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート;4-（4-アセチルフェノキシ）ブタン酸;ジブロモマレイミド;パラアミノ安息香酸;4-ニトロフェノール;酢酸;ギ酸;4-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステル;N-（4-マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド;N-（6-マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド;3-マレイミドプロピオン酸N-スクシンイミジルエステル;N-（3-マレイミドプロピオニルオキシ）スクシンイミド;5-マレイミド吉草酸-NHS;100～10000 Daの分子量を有する直鎖状、分枝状もしくは多腕ポリエチレングリコール;プロパルギル-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル;ピロホスフェート;スクシンイミジル-4-アジドブチレート;4-アジド安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル;tert-ブチル1-（4-ホルミルフェニル）-1-オキソ-5,8,11-トリオキサ-2-アザトリデカン-13-オエート;またはそれらの残基のうちの1つまたは複数を含む、請求項21～29のいずれか一項記載の治療用構築物。
  31. 化学リンカーが、N-（マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートリンカーまたはその残基を含む、請求項21～30のいずれか一項記載の治療用構築物。
  32. 化学リンカーが、スルホスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートを含む、請求項21～31のいずれか一項記載の治療用構築物。
  33. 化学リンカーが、100～10000 Daの分子量を有する直鎖状ポリエチレングリコールまたはその残基を含む、請求項21～32のいずれか一項記載の治療用構築物。
  34. 免疫チェックポイント阻害剤に対する分裂期キナーゼ阻害剤の比率が、約1～約20である、請求項21～33のいずれか一項記載の治療用構築物。
  35. 免疫チェックポイント阻害剤に対する分裂期キナーゼ阻害剤の比率が、約2～約8である、請求項34記載の治療用構築物。
  36. 免疫チェックポイント阻害剤に対する分裂期キナーゼ阻害剤の比率が、約4～約6である、請求項34または35記載の治療用構築物。
  37. 分裂期キナーゼ阻害剤に対する免疫チェックポイント阻害剤の比率が、約1～約20である、請求項21～33のいずれか一項記載の治療用構築物。
  38. 分裂期キナーゼ阻害剤に対する免疫チェックポイント阻害剤の比率が、約2～約8である、請求項37記載の治療用構築物。
  39. 分裂期キナーゼ阻害剤に対する免疫チェックポイント阻害剤の比率が、約4～約6である、請求項37または38記載の治療用構築物。
  40. 請求項1～39のいずれか一項記載の治療用構築物と、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む、組成物。
  41. 癌を有する対象に、請求項1～39のいずれか一項記載の治療用構築物または請求項40記載の組成物の有効量を投与する工程を含む、癌を処置する方法。
  42. 対象がヒトである、請求項41記載の方法。
  43. 癌の症状を示す細胞を処置する方法であって、
    該細胞と、請求項1～39のいずれか一項記載の治療用構築物または請求項40記載の組成物の治療有効量とを接触させる工程
    を含む、前記方法。
  44. 癌の症状を示す対象から得られた細胞を処置する方法であって、
    該細胞と、請求項1～39のいずれか一項記載の治療用構築物または請求項40記載の組成物の治療有効量とを接触させる工程
    を含む、前記方法。
  45. 癌の症状を示す対象から得られた細胞を処置する方法であって、
    細胞と、請求項1～39のいずれか一項記載の治療用構築物または請求項40記載の組成物の治療有効量とをエクスビボで接触させる工程
    を含む、前記方法。
  46. 細胞が癌細胞である、請求項44または45記載の方法。
  47. 細胞が癌細胞ではない、請求項44または45記載の方法。
  48. 細胞が免疫細胞である、請求項47記載の方法。
  49. 少なくとも1つの処置された細胞を対象に戻すように投与する工程をさらに含む、請求項41～48のいずれか一項記載の方法。
  50. 過剰増殖性疾患または過剰増殖性病態を有すると診断された対象を処置する方法であって、
    請求項40記載の組成物の有効量を該対象に投与する工程
    を含む、前記方法。
  51. 過剰増殖性疾患が、癌、前癌、または癌転移のうちの1つまたは複数を含む、請求項50記載の方法。
  52. 過剰増殖性疾患が、黒色腫、肺癌、乳癌、膵癌、脳癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎癌、結腸直腸癌、リンパ腫、結腸癌、または肝癌のうちの1つまたは複数を含む、請求項50または51記載の方法。
  53. 投与工程が、
    対象の腫瘍への、もしくは対象の腫瘍での注射、
    対象の腫瘍への、もしくは対象の腫瘍での局所的な注入、
    対象における全身注射、
    対象における全身注入、
    対象による吸入、
    対象への経口投与、または
    対象への局所適用
    のうちの1つまたは複数を含む、請求項50～52のいずれか一項記載の方法。
  54. 投与工程が、マイクロニードル適用を含む、請求項50～53のいずれか一項記載の方法。
  55. それを必要とする対象において抗癌療法の効果を増強する方法であって、
    請求項1～39のいずれか一項記載の治療用構築物または請求項40記載の組成物の有効量と、
    少なくとも1つの抗癌剤と
    をそれを必要とする対象に投与する工程
    を含む、前記方法。
  56. 抗癌剤が、化学療法剤、標的療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤である、請求項55記載の方法。
  57. 治療用構築物または組成物と抗癌療法とが、連続的にまたは同時に投与される、請求項55または56記載の方法。
  58. 新生物を有すると診断された対象において放射線療法の効果を増強、増大、または改善する方法であって、
    請求項1～39のいずれか一項記載の治療用構築物または請求項40記載の組成物の有効量と、
    少なくとも1つの放射線療法と
    をそれを必要とする対象に投与する工程
    を含む、前記方法。
  59. 治療用構築物または組成物と放射線療法とが、連続的にまたは同時に投与される、請求項58記載の方法。
  60. 対象がヒトである、請求項49～59のいずれか一項記載の方法。
  61. 請求項1～39のいずれか一項記載の治療用構築物と、
    少なくとも1つの抗癌剤と
    を含む、キット。
  62. 抗癌剤が、化学療法剤、標的療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤である、請求項61記載のキット。
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