JP2022540534A - 液体の光学特性評価の方法 - Google Patents

Abstract

光学特性評価システムを用いる液体特性評価の方法を開示する。光学特性評価システムは、光源と光検出器を有する光学素子を備える。光学素子は、光源と光検出器との間において伸びる光路を形成する。光検出器は、可変波長において光量を分解することができる。また、このシステムは、液体容器と、第１容器面に取り付けられる、又は第１容器面と一体的に形成されると共に、内部に対向する第１光結晶とを備える。この方法は、第１容器面と第２容器面の少なくとも一部、すなわち液体を含む内部と第１光結晶が光路を妨げて、且つ内部が第１光結晶より前に光路を妨げる第１伝達スペクトルを記録するステップと、第１容器面と第２容器面の少なくとも一部、すなわち液体を含む内部と第１光結晶が光路を妨げて、且つ第１光結晶が内部より前に光路を妨げる第２伝達スペクトルを記録するステップとを備える。【選択図】 図２

Description

本発明は、液体の光学特性評価に関する。液体は、特性評価のための浮遊粒子を含んでもよい。

例えば飲料水の純度の特性評価において、濁度を測定することは、一般的に、分析の重要な部分を形成する。ＦＴＵのユニット内で測定される濁度は、一般的に、直角に散乱した入射光を測定することにより得られる。一方、この測定は、一般的に、液体を含む粒子の濁度の精密な測定をもたらさない。これは、特に、ナノ－ｏｇマイクロメートルサイズの粒子の場合である。

多くの場合、液体内に浮遊している粒子に関して液体を特性評価することが好ましい。これは、例えば、飲料水の品質、ミルク内のたんぱく質、塗料の性質などを特定することに適している。多くの特性評価の方法がある一方、液体内に浮遊している粒子のサイズ分布を得るための主要な方法は、動的光散乱（ＤＬＳ）である。ＤＬＳは、相対的に小さな粒子と液体内に浮遊しているポリマーのサイズ分布を得るための従来の最も正確な方法の１つを提供する。一方、ＤＬＳ装置は、相対的に高価であり、主要な適用性を制限するように複雑である。また、ＤＬＳ分析方法は、多くの場合、使用者が、分析される液体試料の屈折率を入力することを要求する。多くの場合、これは正確に知られていないと共に、屈折率の推定を要求する。この推定は、得られるサイズ分布における誤差をもたらし得る。また、ＤＬＳ装置は、液体試料が、相対的に広いサイズ分布を有する様々なサイズの粒子を含む場合、相対的に不正確な推定をもたらす。

液体内に浮遊している粒子に関して液体を特性評価する別の方法は、粒子サイズ分光測光法である。この方法は、分光測光法において記録される吸収スペクトルの分析に依存する。この場合、観測された吸収スペクトルは、液体内に浮遊している粒子のサイズ分布と関連し得る。一方、この機器の製造者によれば、著しい不正確さが、ナノメートルサイズの相対的に小さな粒子に対して予想される。これは、小さな粒子の端部において、粒子がレイリー散乱を受けるためである。スペクトル形状は、粒子サイズに応じない。また、スペクトルは、すべて自己類似しているように見える。結果として、粒子サイズスペクトルは、粒子サイズと粒子濃度の両方を独立して定めることができない。また、大きな粒子の端部において、スペクトルは、すべて正確に平坦であり、且つ自己類似しているように見える。さらに、サイズは決められない。基本的に、粒子は、すべての波長にわたって検出器に影を生じる。

様々な光学特性評価の方法がある一方、最適化の必要性が残っている。

第１の態様において、本発明の実施形態は、光学特性評価システムを用いる液体特性評価の方法を提供する。
この光学特性評価システムは、
前記光学特性評価システムは、光源と光検出器を有して、且つ前記光源と前記光検出器との間において伸びる光路を形成する光学素子を備えており、
前記光検出器は、可変波長において光量を分解することができて、
前記光学特性評価システムは、第１容器面と第２容器面を有する液体容器を備えており、
前記第１容器面と前記第２容器面は、前記液体容器の内部の少なくとも一部を形成しており、
前記第１容器面と前記第２容器面の少なくとも一部は、透過していると共に平行であり、
前記光学特性評価システムは、前記第１容器面に取り付けられる、又は前記第１容器面と一体的に形成されると共に、前記内部に対向する第１光結晶を備えており、
前記第１光結晶は、第１平面において形成される第１変調周期を有する第１格子部分を備えており、
前記方法は、
前記第１容器面と前記第２容器面の少なくとも一部、すなわち液体を含む前記内部と前記第１光結晶が前記光路を妨げて、且つ前記内部が前記第１光結晶より前に前記光路を妨げる第１伝達スペクトルを記録するステップと、
前記第１容器面と前記第２容器面の少なくとも一部、すなわち液体を含む前記内部と前記第１光結晶が前記光路を妨げて、且つ前記第１光結晶が前記内部より前に前記光路を妨げる第２伝達スペクトルを記録するステップとを備えることを特徴とする。

請求項１において定められているような第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルを記録するため、従来にない情報の豊富さは、光学特性評価の方法から導かれる。この光学特性評価の方法は、相対的に小さな実際の取り組みにより行われ得る。

第１変調周期を有する光結晶は、第１共振波長帯を生じる。第１共振波長帯は、光結晶が波長に応じて光を反射する方法を示す。一般的に、光結晶は、入射光のエネルギーが光結晶の共振モードのエネルギーに対応するとき、光を反射する。この反射は、光結晶を通過する光の伝達スペクトルにおいて観測され得る。この場合、共振の特徴は観測され得る。この共振の特徴において、光路における入射光の波長は光結晶の特性波長に対応する。伝達スペクトルが、このスペクトルのようにプロットされる場合、すなわち波長に応じてセンサに達する光をプロットするとき、この特徴は共振の谷のようにみえる。一方、データが吸収スペクトル又は減衰スペクトルのようにプロットされるとき、所定の波長で反射される光に対応する共振の特徴は、共振ピークの形で現れる。したがって、共振モードは、等しく、伝達スペクトルにおいて直接、又は吸収スペクトル若しくは減衰スペクトルにおいて観察され得る。

それぞれの共振モードのエネルギーは、光結晶の形状と材料特性に応じる。したがって、光結晶は、光学特性評価システムに対して好ましいエネルギーで、例えば可視スペクトルとＵＶスペクトルで共振モードを示すように調整され得る。この光結晶により、光学特性評価システムは、例えばガラスから形成される液体容器と共に用いることに適している。また、共振モードの少なくとも一部のエネルギーは、入射光の入射角度に応じる。これらの共振モードは、以下において、共振角度モードと呼称される。また、これらの共振角度モードに対して、光が光結晶に当たる角度は、光を反射するときの波長に悪影響を及ぼす。共振角度モードと関連している共振ピークを分析することにより、入射光の入射角度に関する情報が導かれ得る。したがって、この分析により、光が光結晶に当たる前に通過するときのいずれかの屈折率を導くことができる。

第１伝達スペクトルを記録するとき、光は、光結晶に当たる前に第２容器面と液体容器の内部を通過する。したがって、光は、光結晶に達する前に第２容器面と内部のいずれかの液体及び粒子との両方により散乱し得る。この集合的散乱は、共振角度モードと関連している第１伝達スペクトルにおける共振ピークの分析から導かれる。

第２伝達スペクトルを記録するとき、光は、光結晶に当たる前に内部と第２容器面を通過しない。したがって、第２伝達スペクトルにおける共振角度モードと関連している共振ピークの分析により、内部の液体と粒子からの寄与なしで、散乱のための測定値を導くことができる。

特に、第１容器面と第２容器面が平行であり、光結晶の有無に関してだけ異なる実施形態において、光結晶における光の入射角度において、容器の内部の液体と粒子の影響を分離することができる。

結果として、本発明の実施形態により、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルを収集して分析することによって、液体容器の内部の液体と粒子により生じる散乱の測定値を導くことができる。

一般的に、平面波が完全な球形、粒子、又は生体細胞に当たるとき、光の一部は吸収されて、また別の光の一部は散乱される。これらの推移は、様々な粒子サイズのための散乱理論により計算され得る。（ローレンツ－ミーの方法、ローレンツ－ミー－デバイの方法、又はミー散乱として知られている）マクスウェル方程式に対するミーの方法は、均一な球形により電磁平面波の散乱を説明する。この方法は、球状の複数の部分的な波形の無限級数の形をとる。非吸収、部分的吸収、又は完全導電性球により、光散乱を計算することが用いられ得る。

定義に関して、遮光効率（散乱又は吸収）は、粒子の幾何学的断面領域に対する遮光（散乱又は吸収）断面の比率である。散乱異方性は、単一の散乱事象の後において保たれる順方向の量の測定値であり、散乱位相関数の平均の余弦に関して定められる一方、粒子に関する遮光効率は散乱効率と吸収効率の合計として定められる。分光光度計により測定される減衰は、遮光効率と、光路の長さ、濃度、及び１０を底とするオイラー数の対数の数学定数とを掛けることにより計算され得る。

液体容器は、２組の対向するキュベット壁部を形成するキュベットであってもよい。対向する壁部の１組は、第１容器面と第２容器面を備える。キュベットは、正方形の設置面積を形成し得る。２組の対向する壁部の端部は、底壁の端部と共に、正方形の設置面積の外周を形成する。このキュベットは、特に、例えば市販の分光光度計と共に用いるために適切であってもよい。

また、液体容器は、流路の一部を形成する、又は備えてもよい。特性評価される液体は、光路を遮る流路を流れる。液体の流量は、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルを記録する間、０になるように制御され得る。これにより、液体内の粒子成分の変化を特性評価することができる。この変化は、例えば、液体内の粒子の化学反応、液体内の粒子の減衰、又は液体に対する粒子の流れにより起こり得る。これらの推移は、連続した時点、及び「流量伝播」の連続した量において、連続的な複数の組の第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルを記録するステップを追加することにより分析され得る。流量伝播は、光路を遮る第１面と第２面を通過して伝播する液体の流れを示す。

光源は、例えば可視スペクトル、好ましくはＵＶスペクトルにおいて、相対的に平坦なスペクトルを好ましくは有するガスランプのようないかなる種類の広域スペクトル光源であってもよい。この場合、光源は、好ましくは、入射光の強度及び波長の両方を測定できる。また、光源は、相対的に小さい一方、可視光のスペクトルを有する光源の一種であってもよい。好ましい実施形態において、光センサは、第１面に対して８５～９５度、好ましくは８０～１００度の入射光を有する光に対して、光結晶のいずれかの部分を通過する光を検出できる。したがって、光センサは、好ましくは、光路の中心に対して垂直な平面において、光結晶より大きな範囲を有する。また、光路は、上記平面において、より小さな範囲を有する場合、光センサに達する前に光学レンズにより集められ得る。したがって、光センサは、好ましくは、上記平面における２つの方向の拡がりを有する光センサである。

好ましくは、第１光結晶は、オーバーラップする第１レイヤと第２レイヤを備える。第１レイヤは、第１変調周期と第１屈折率を有する。また、第２レイヤは、第１変調周期と第２屈折率を有する。第１屈折率は、第２屈折率より大きい。好ましくは、第１レイヤは内部に対向する。また、第２レイヤは第１容器面に対向する。

本発明の一部の実施形態において、前記方法は、前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルを分析することにより、前記液体のいずれかの粒子からの散乱の定量的測定値を導くステップを備える。

第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルは、光結晶における入射光の角度分布に応じて変化する特性と共に、共振の特徴を備える。上述の請求項１に関する記載のように、第２伝達スペクトルは、内部と液体の前に光路を遮る光結晶により記録されている。したがって、光結晶における入射光の角度分布は、液体内の粒子により生じるいずれかの散乱に応じない。したがって、所定の光源に対する共振の特徴の固有特性の一種、第１容器面と第２容器面、及び光結晶と内部の液体は、第２伝達スペクトルから導かれる。

一方、第１スペクトルは、光結晶に達する前に内部の液体を通過する光と共に記録されている。したがって、光が、例えば光結晶に達する前に液体内の粒子により散乱されるとき、入射光の角度分布は、第１伝達スペクトルの記録と異なる。したがって、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルのそれぞれにおける共振の特徴の特性の比較分析により、液体内の粒子による散乱からの寄与は分離され得る。粒子から分離される散乱の寄与は、例えば飲料水の濁度の測定値を得るような多くの適用において、重要な特性である。

本発明の一部の実施形態において、前記方法は、前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルを比較して分析することを含んで、前記液体内の粒子の平均サイズを導くステップを備える。

特に、液体内の粒子の平均サイズは、粒子がナノメートルレンジの大きさを有する、又は実質的に高度な光学特性評価システムを要求し得るとき、液体内の粒子を特性評価するための既知の光学的方法により得ることが難しい。この難しさは、第１スペクトルと第２スペクトルの比較分析を提供することにより、本発明の実施形態によって克服される。平均サイズは、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルにおける共振モードの分割の比較分析から導かれる。少なくとも１つの共振モードが、光結晶における入射光の角度分布により分かれる。分かれた詳細を観察することにより、液体内の粒子の平均サイズの測定値を導くことができる。特に、液体内の粒子の平均サイズは、例えば、分割共振モードから生じる第１伝達スペクトルにおける分割共振の特徴の最大又は最小の位置を、第２伝達スペクトルにおいて対応する分割共振の特徴の最大又は最小の位置と比較することから導かれ得る。この比較から、粒子の平均サイズは、例えばミー理論又はレイリー散乱理論を用いることにより導かれる。特に、レイリー散乱理論は、相対的に小さな粒子の平均サイズを導くことに有用である。これに関して、レイリー散乱理論を用いる粒子の正確な平均サイズ決定に対して必要な入力が、一般的に、液体内の粒子を特性評価するための既知の光学的方法と共に利用できない、及び／又は著しく高度且つ高価な光学特性評価システムを用いることを要求する、及び／又は決められたサイズ分布の不正確さをもたらす例えば液体の屈折率のようなパラメータの推定を要求することに留意することが有用である。

本発明の一部の実施形態において、前記方法は、前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルを比較して分析することを含んで、前記液体内の粒子のサイズ分布を導くステップを備える。

液体内の粒子のサイズ分布は、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルにおける共振モードの分割の比較分析から導かれる。少なくとも１つの共振モードが、光結晶における入射光の角度分布により分かれる。第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルにおいて分かれた詳細を分析することにより、液体内の粒子のサイズ分布を導くことができる。特に、液体内の粒子のサイズ分布は、例えば、分割共振モードから生じる第１伝達スペクトルにおける分割共振の特徴の幅又は半値全幅（ＦＷＨＭ）を、第２伝達スペクトルにおいて対応する分割共振の特徴の幅又はＦＷＨＭと比較することから導かれ得る。この比較から、液体内の粒子のサイズ分布は、例えばミー理論又はレイリー散乱理論を用いることにより導かれる。特に、レイリー散乱理論は、相対的に小さな粒子のサイズ分布を導くことに有用である。これに関して、レイリー散乱理論を用いる粒子の正確なサイズ分布決定に対して必要な入力が、一般的に、液体内の粒子を特性評価するための既知の光学的方法と共に利用できない、及び／又は著しく高度且つ高価な光学特性評価システムを用いることを要求する、及び／又は決められたサイズ分布の不正確さをもたらす例えば液体の屈折率のようなパラメータの推定を要求することに留意することが有用である。

本発明の一部の実施形態において、第２光結晶は、前記第１容器面に取り付けられる、又は前記第１容器面と一体的に形成されて、前記内部に対向しており、
前記第２光結晶は、第２平面を形成して、第２変調周期を有する第２格子部分を備えており、
前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルは、前記光路における前記第２光結晶の少なくとも一部により記録される。

第３変調周期を有する第２光結晶は、第２の組の共振モードを定める。共振モードのエネルギーは、第２光結晶の大きさと材料に応じて調整され得る。これにより、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルにおいて、第１共振波長帯における共振の特徴と異なる波長に第２共振波長帯を生じる。したがって、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルにおける第２の組の共振の特徴により、第１光結晶から生じる波長の範囲と比べて異なる波長の範囲でみられる共振モードの分割の比較分析ができる。これにより、光が、異なる波長の範囲で粒子から散乱されることを分析できる。散乱に応じる波長は、ミー理論とレイリー散乱理論に対する直接入力であり、例えば液体内の粒子の平均サイズとサイズ分布の正確な決定をもたらし得る。

好ましくは、第２光結晶は、オーバーラップする第３レイヤと第４レイヤを備える。第３レイヤは、第２変調周期と第３屈折率を有する。また、第４レイヤは、第２変調周期と第４屈折率を有する。第３屈折率は、第４屈折率より大きい。好ましくは、第３レイヤは内部に対向する。また、第４レイヤは第１容器面に対向する。

本発明の一部の実施形態において、前記第１光結晶は、前記第２光結晶と隣接する。
これは、第１光結晶と第２光結晶による遮断に対して光路を変化させるための必要性を最小化する、又は軽減する。

本発明の一部の実施形態において、前記第１変調周期は、第１共振波長帯を生じて、
前記第２変調周期は、第２共振波長帯を生じて、
前記第１共振波長帯と前記第２共振波長帯は、オーバーラップしない。
これにより、特定の共振の特徴が属する第１共振帯と第２共振帯の解読の可能性を強める。

好ましくは、前記第１光結晶と前記第２光結晶の両方が、データ取得速度を増加させるため、前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルのそれぞれを記録する間、同時に前記光路にある。

本発明の一部の実施形態において、前記光学素子は、少なくとも第１の方向と第２の方向において、前記液体容器を保持するように構成されている容器レセプタクルを備えており、
前記方法は、
前記第１の方向において、前記液体容器を前記容器レセプタクルに配置して、前記第１伝達スペクトルを記録するように、前記液体容器を前記第１の方向に向けるステップと、
試料容器内の前記液体容器の方向を前記第２の方向に変化させて、前記第２伝達スペクトルを記録するように、前記液体容器を前記第２の方向に向けるステップとを備える。

これにより、上述の方法が、例えば価格を上げ得る自動化技術を必要とすることなく、分光光度計の光路に対して４つの異なる角度で液体容器を受容するように構成されている容器レセプタクルを有する標準的な分光光度計のような相対的に単純な技術手段により行われ得る。

本発明の実施形態は、この実施形態により、光路に対する液体の方向の内の不正確な方向から生じ得る誤りを訂正できるように、第１光結晶と第２光結晶により行われる組み合わせで特に有用であってもよい。

不正確な第１の方向及び／又は第２の方向は、波長から独立して、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルにおける共振の特徴に悪影響を及ぼす。したがって、この場合、第１共振波長帯と第２共振波長帯の共振の特徴は、同様に悪影響を受ける。液体内の粒子は、波長に応じて、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルにおける共振の特徴に悪影響を及ぼし得る。したがって、液体内の粒子は、第１共振波長帯と第２共振波長帯の共振の特徴において、それぞれ異なる影響を有する。したがって、この差の定量的分析により、不正確な第１の方向及び／又は第２の方向から生じる第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルとの間の差に対する寄与を分離できる。

一部の実施形態において、前記光学素子は、少なくとも第１光路と第２光路とを与えるように構成されており、
前記第１伝達スペクトルは、前記第１光路に沿って与えられる光により記録されて、
前記内部と前記第１光結晶は、前記第１光路を妨げて、
前記内部は、前記第１光結晶より前に前記第１光路を妨げて、
前記第２伝達スペクトルは、前記第２光路に沿って与えられる光により記録されて、
前記内部と前記第１光結晶は、前記第２光路を妨げて、
前記第１光結晶は、前記内部より前に前記第２光路を妨げて、
前記液体容器の方向は、前記第１伝達スペクトルを記録するステップと前記第２伝達スペクトルを記録するステップとの間において、変わらない。

これにより、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルを記録する間、液体容器の方向を変える必要なく、相対的に速いデータ取得ができる。第１光路と第２光路は、半透明ミラーを適切に用いることにより、単一の光源と単一の光検出器を有する、好ましくは透明性に応じる光検出器を有することをもたらされる。

一部の実施形態において、上述の方法は、前記第１光結晶が前記光路にない第３伝達スペクトルを記録するステップを備える。

第３伝達スペクトルは、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルから有利に差し引かれる一種のバックグラウンドスペクトルを構成する。これにより、第１光結晶及び／又は第２光結晶との相互作用から生じる第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルにおける特徴を分離できる。

本発明の一部の実施形態において、前記液体容器はまた、前記内部の少なくとも一部を形成する第３容器面と第４容器面を備えており、
前記第３容器面と前記第４容器面の少なくとも一部は、透過していると共に平行であり、
前記第３伝達スペクトルは、前記第３容器面と前記第４容器面の少なくとも一部により記録されて、
前記内部は、前記光路を妨げる。
これにより、第３伝達スペクトルが、光路に対する液体容器を単純に回転させた後、記録され得るため、上述の方法は、実施が特に単純である。

本発明の一部の実施形態において、前記光学素子は、少なくとも第３光路を与えるように構成されており、
前記第３伝達スペクトルは、前記第３光路に沿って与えられる光により記録されて、
前記第３容器面と前記第４容器面は、前記第３光路を妨げる。
これにより、高度の自動化、及び液体容器の方向を変える必要なく、第３伝達スペクトルを得ることができる。

第２の態様において、実施形態は、第１の態様に記載の方法を用いることにより、生物学的物質を備える試料の特性評価の方法を提供する。

第２の態様の一部の実施形態において、生物学的物質は生体細胞を備える。

第２の態様の一部の実施形態において、生体細胞は、酵母細胞及び／又は大腸菌のような細菌性細胞である。

第２の態様の一部の実施形態において、生体細胞は、特性評価の間、活動している。

第２の態様の一部の実施形態において、第１の態様に記載の方法は、細胞の生体試料に定量的散乱分析をできるように用いられる。

第２の態様の一部の実施形態において、特性評価は、少なくとも細胞濃度を決めることを備える。

第２の態様の一部の実施形態において、特性評価は、少なくとも平均細胞サイズを決めることを備える。

第２の態様の一部の実施形態において、特性評価は、少なくとも細胞サイズ分布を決めることを備える。

第２の態様の一部の実施形態において、生物学的物質は、少なくとも第１の種類の細胞と第２の種類の細胞を備える。特性評価は、第２の種類の細胞に対する第１の種類の細胞の濃度、第１及び／又は第２の種類の細胞の平均サイズ、第１及び／又は第２の種類の細胞のサイズ分布、第１及び／又は第２の種類の細胞の濃度の少なくとも１つを決めることを備える。

本発明の実施形態は、添付図面を参照して説明される。
図１は、実施形態の方法において用いるための液体容器を示す。 図２は、実施形態の方法において用いるための液体容器を示す。 図３は、実施形態の方法において用いるための液体容器を示す。 図４は、実施形態の方法において用いるための光結晶を示す。 図５は、実施形態の方法において用いるための光結晶を示す。 図６は、実施形態の方法に従って記録される伝達スペクトルのグラフを示す。 図７は、実施形態の方法に従って記録される伝達スペクトルのグラフを示す。 図８は、実施形態の方法に従って記録される伝達スペクトルのグラフを示す。 図９は、実施形態の方法に従って記録される伝達スペクトルのグラフを示す。 図１０は、実施形態の方法に従って記録される伝達スペクトルのグラフを示す。 図１１は、実施形態の方法に従って記録される伝達スペクトルのグラフを示す。 図１２は、実施形態の方法に従って記録される伝達スペクトルのグラフを示す。 図１３は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図１４は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図１５は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図１６は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図１７は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図１８は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図１９は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２０は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２１は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２２は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２３は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２４は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２５は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２６は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２７は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２８は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図２９は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図３０は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図３１は、シミュレーションデータのグラフを示す。 図３２は、シミュレーションデータのグラフを示す。 図３３は、シミュレーションデータのグラフを示す。 図３４は、シミュレーションデータのグラフを示す。 図３５は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図３６は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図３７は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図３８は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図３９は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図４０は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図４１は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図４２は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図４３は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図４４は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図４５は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。 図４６は、実施形態の方法に従って得られる実験データのグラフを示す。

図１は、液体容器１の内部７の部分を形成する第１容器面３と第２容器面５を備える液体容器１を示す。第１容器面３と第２容器面５は、透明且つ平行な部分９，１１を備えて、壁１２の部分を共に形成する。第１容器面３は光結晶１３を備える。第１容器面３と第２容器面５は、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）のようなポリマーから、又は例えばガラスのような他の透明且つ実質的に硬い材料から形成され得る。液体容器１は、光源と光検出器を備える光学素子（図示せず）と共に用いるためのものである。光は、例えば可視スペクトル、好ましくはＵＶスペクトルにおいて、相対的に平坦なスペクトルを好ましくは有する例えばガスランプのような一種の広域スペクトル光源であってもよい。この場合、光源は、好ましくは、入射光の強度及び波長の両方を測定できる。光センサは、第１面に対して８５～９５度、好ましくは８０～１００度の入射光を有する光に対して、光結晶１３のいずれかの部分を通過する光を検出できる。

光結晶１３は、透明部分９上の第１容器面３に取り付けられている。光結晶１３は、第１容器面３と共に一体的に同様に良好に形成され得る。図４と図５において、光結晶の詳細を明確に示しており、周期長１９により形成される第１変調周期を有する第１格子部分１７を示す。第１格子部分１７は、第１面において伸びて、オーバーラップする第１レイヤ２３と第２レイヤ２５を備える。第１レイヤ２３が第１屈折率を有して、第２レイヤ２５が第２屈折率を有する一方、２つのレイヤ２３，２５は、両方とも、第１変調周期を有する。第１屈折率は、第２屈折率よりも大きい。第１レイヤ２３は、内部７に対向する。第２レイヤ２５は、第１容器面３に対向する。

ある実施形態において、液体容器１は、２組の対向するキュベット壁部を形成するキュベットであってもよい。対向する壁部の１組は、第１容器面３と第２容器面５を備える。キュベットは、正方形の設置面積を形成し得る。２組の対向する壁部の端部は、破線２７により示す底壁の端部と共に、正方形の設置面積の外周を形成する。このキュベットは、特に、例えば市販の分光光度計と共に用いるために適切であってもよい。この場合、図１～３のそれぞれの破線２９は、プラグ（図示せず）により密封され得る開口部を示す。

ある実施形態において、液体容器１は流路の一部を形成する。特性評価される液体は、光路を遮る流路を流れる。図２と図３において、矢印３３により、光路と光の方向を示す。流路は、図１～３において示す平面に対して垂直である。液体の流量は、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルを記録する間、０になるように制御され得る。これにより、液体内の粒子成分の変化を特性評価することができる。この変化は、例えば、液体内の粒子の化学反応、液体内の粒子の減衰、又は液体に対する粒子の流れにより起こり得る。これらの推移は、連続した時点、及び「流量伝播」の連続した量において、連続的な複数の組の第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルを記録するステップを追加することにより分析され得る。流量伝播は、光路を遮る第１面３と第２面５を通過して伝播する液体の流れを示す。

図２は、第１面３と第２面５の方向を示す。内部７と光結晶１３に関連する光路と光の方向は、矢印３３により示す。したがって、図２は、第１容器面３と第２容器面５の一部、すなわち液体を含む内部７と光結晶１３が光路を妨げて、且つ内部７が光結晶１３より前に光路を妨げる第１伝達スペクトルを記録する場面を示す。

図３において、矢印３３により示す光路における光の方向は、図２における光の方向と対向する。したがって、図３は、第１容器面３と第２容器面５の少なくとも一部、すなわち液体を含む内部７と光結晶１３が光路を妨げて、且つ光結晶１３が内部７より前に光路を妨げる第２伝達スペクトルを記録する場面を示す。

また、第３伝達スペクトルは記録され得る。光路が光結晶により妨げられる。液体容器１が、２組の対向するキュベット壁部を形成するキュベットである場合、対向する壁部の１組は、第１容器面３と第２容器面５を備え、対向する壁部の他の組は、光結晶を備えない。第３スペクトルは、第１伝達スペクトル又は第２伝達スペクトルを記録する間、互いの方向に関して９０度ごとに、キュベットに対して光路を回転させる、又は光路に対してキュベットを回転させることにより記録され得る。第３伝達スペクトルにより、吸収スペクトル若しくは減衰スペクトルを記録することができる。減衰スペクトルは、吸収、散乱、及び発光による損失を示す。

図６は、空気３７、純水３９、水４０により６４回希釈されたミルク、水４１により３２回希釈されたミルク、水４３により１６回希釈されたミルク、水４５により８回希釈されたミルク、水４７により４回希釈されたミルク、水４９により２回希釈されたミルク、及び純粋なミルク５０に対して記録される吸収スペクトル又は減衰スペクトルのグラフ３５を示す。図６から分かるように、スペクトルは、導かれるいずれかのサイズ推定の誤差の相対的に大きなマージンをもたらす相対的に小さな波長依存性を示す。図６の吸収スペクトル又は減衰スペクトルは、記録される第３伝達スペクトルから生じる。第３伝達スペクトルは、第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルにおける吸収からいずれかの寄与を取り除くため、対応する第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルから有利に差し引かれる。

図７のグラフは、液体容器１の内部７の純水により記録される第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３のグラフを示す。

図８～１２のグラフは、（図８における）３２回希釈されたミルク、（図９における）１６回希釈されたミルク、（図１０における）８回希釈されたミルク、（図１１における）４回希釈されたミルク、図１２における２回希釈されたミルクにより記録される第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３のグラフを示す。

グラフから明らかなように、光結晶１３は、第１共振波長帯を生じる。図７における第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３のグラフから明らかなように、純水は波長帯を大きく変えない。これは、水が純粋であり、光を大きく散乱させないためである。

図８～１２における第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３のそれぞれのグラフは、観測できる共振の特徴を示す。光路における入射光の波長は、光結晶１３の特性波長に対応する。共振角度モードのエネルギーは、光結晶１３に当たる光の入射角度に従って分かれる。図７～１２において、この分割は、それぞれ観測できて、第１伝達スペクトル５１における三角形５５ａ，５５ｂ、及び第２伝達スペクトル５３における点５７ａ，５７ｂにより示す極値に印付けられている。第１伝達スペクトル５１のグラフにおけるそれぞれの極値５５ａ，５５ｂの位置、及び第２伝達スペクトル５３のグラフにおけるそれぞれの極値５７ａ，５７ｂの位置を比較分析することにより、水又は希釈されたミルク内の粒子の平均サイズとサイズ分布は、上述及び以下に詳細に記載のように、ミー理論とレイリー散乱理論を用いることにより導かれる。また、水又は希釈されたミルク内の粒子により生じる散乱の量の定量的測定値が導かれる。

図１３は、図８～１２に示すような様々な希釈度のミルクにおいて記録される第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３から計算されるいわゆる類似度指数のグラフを示す。図１３において、相対濃度０は純水に対応する一方、相対濃度１は原液、すなわち純粋なミルクの濃度に対応する。

第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３の類似度は、類似度指数のグラフにおいて、第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３がオーバーラップする比率を見つけることにより定量化される。これは、絶対値の変化よりも記録された値の変化の定量化ができるため、それぞれのスペクトルの第１の導関数に基づいて行われる。この計算は、一般的に、以下のようになり、いずれかの特定の実施形態において用いるために制限されない。
それぞれの組の第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルに対して、１次導関数が計算される。
それぞれの組の第１伝達スペクトルと第２伝達スペクトルに対して、計算された１次導関数が第１の導関数曲線と第２の導関数曲線として示される。
所定の波長間隔に対して、第１の導関数曲線と第２の導関数曲線の両方がオーバーラップする領域、すなわち間隔のそれぞれの波長の値に対する最も小さな導関数曲線の領域の合計が計算される。
所定の波長間隔に対して、第１の導関数曲線と第２の導関数曲線の少なくとも一方の共有領域、すなわち間隔のそれぞれの波長の値に対する最も大きな導関数曲線の領域の合計が計算される。
オーバーラップする領域は、所定の波長の間隔の共有領域により分割される。また、所定の波長の間隔に対して、１と０との間の結果の数字を示す。

このように、第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３を比較することにより、どれほどスペクトルが互いに異なるかが定量化される。また、重要なこととして、液体の散乱の量が定量化される。

類似度指数は、６００～６７５ｎｍと６７５～８００ｎｍのスペクトルの２つの間隔６０，６２に対して示す。この間隔は、異なる共振モードがある波長間隔を示す。モードは、入射光の入射角度の分布に応じて異なるように分かれる。共振モードの間の差を観察することにより、入射光の角度分布を決めることができる。また、このことから、光の前方散乱と細胞濃度を決める。この方法は、減衰から分離される（吸収として呼称される）濃度を決め得る。

図１５，１８，２５，２８において、実験的に決まる第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３から対応して計算された類似度指数のグラフ６０，６２を示す。

図１５において、類似度指数のグラフ６０，６２は、１００ｎｍのポリスチレンビード参考試料において記録される第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３から計算されている。

図１８において、類似度指数のグラフ６０，６２は、６００ｎｍのポリスチレンビード参考試料において記録される第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３から計算されている。

図２５において、類似度指数のグラフ６０，６２は、水中に分散している大腸菌細菌性細胞を有する液体試料において記録される第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３から計算されている。図２５の指数のグラフ６０，６２は、図２１～２４に示す第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３から計算されている。細胞の濃度は、図２１における純粋な原液の濃度から変わる。また、同じ溶液は、図２２において水により２倍に希釈されて、図２３において水により４倍に希釈されて、図２４において８倍に希釈されている。さらに、同じ大腸菌細菌性細胞は、図２１～２４のすべてに記録される伝達スペクトルにおいて、測定される。本発明の方法により、細胞の生体試料に定量的散乱分析と濃度分析を行うことができる。

図２８において、指数のグラフ６０，６２は、酵母細胞を有する液体試料において記録されている第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３から計算されている。

図１３，１５，１８，２５，２８における類似度指数のグラフ６０，６２から明らかなように、類似度は、一般的に、相対濃度が増加するにつれて、減少する。これは、より大きな濃度がモードの分割、及び液体内の光の前方散乱を一般的に増加させる方法を示す。適切な機械校正と定量的データ分析のツールを用いることにより、大腸菌細菌性細胞と酵母細胞により実証される粒子の濃度は計算され得る。

図２５，２８は、６００～６７５ｎｍの間隔６０に対して計算される類似度要素と６７５～８００ｎｍの間隔６２に対して計算される類似度要素との間の差として計算される「差」のグラフ６４をさらに備える。これは、サイズ分布及び／又は平均粒子サイズの計算において用いられ得る定量的測定値を与える。

図１４，１６，１９，２６，２９は、すべて、勾配比スペクトルである。いずれかの所定の組の第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３に対して、勾配比は、第１伝達スペクトル５１の極値５５ａの間の第１の勾配と、第２伝達スペクトルの極値５７ａの間の第２の勾配との間の比率として計算される。これは、それぞれの相対濃度に対して繰り替えされる。

第１伝達スペクトル５１の極値５５ａの間の第１の勾配と、第２伝達スペクトル５３の極値５７ａの間の第２の勾配とは、共振モード分割の測定の定量的方法である。勾配比は、第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３との間の共振モード分割における差を示す。粒子の平均サイズ、及び一部の場合のサイズ分布は、第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３における共振モードの分割の比較分析から定量化され得る。

図１４，１６，１９，２６，２９のグラフから明らかなように、勾配比は、一般的に、相対濃度と共に減少する。これは、濃度が増加するにつれて、共振モードが次第に分割することを示す。次第に分割する共振モードは、粒子のより大きな平均サイズ、又はより大きなサイズ分布を示す。

これは、より大きな前方散乱をもたらす粒子のより大きな平均サイズ、又はより大きなサイズ分布、及び共振モードにおける分割をもたらす光結晶１３における入射光３３のより大きな入射角度分布からもたらされる。

図１４，１９，２９の勾配比、及び図１５，１８，２８の類似度指数は、十分に大きな相対濃度に対する一部の定値に向けて飽和するようにみえる。これは、光路３３内の光が光学センサの外側障壁を越えて散乱されることを示し得る。例えば図８，１２の第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３を比較するとき、この検出器の境界を越えて散乱される光の効果がみられる。第１伝達スペクトル５１の極値５５ａ，５５ｂの値は、図１２の相対定期に大きな濃度に対する第２伝達スペクトル５３の極値５７ａ，５７ｂの値よりも小さい。この効果は、図８の相対的に小さな濃度に対する第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３に対してかなり小さい。

一方、図１８における６００ｎｍのポリスチレン粒子の類似度指数に対する値の飽和は、図１５における１００ｎｍのポリスチレン粒子の類似度指数よりも小さい。これは、第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３の分析に基づいて、粒子サイズの差を定量的に示す。

また、類似度指数と勾配比のそれぞれの曲線は、定量的データをもたらす。この定量的データは、比較分析されて、粒子濃度、及び／又は粒子サイズ分布、及び／又は平均粒子サイズの導出をもたらし得る。

図１７は、純水３９、１．５６２５％（６４倍）の体積５９となるように水により希釈される１００ｎｍのポリスチレンビードの原液、３．１２５％（３２倍）の体積６１となるように水により希釈される１００ｎｍのポリスチレンビードの原液、６．２５％（１６倍）の体積６３となるように水により希釈される１００ｎｍのポリスチレンビードの原液、１２．５％（８倍）の体積６５となるように水により希釈される１００ｎｍのポリスチレンビードの原液、２５％（４倍）の体積６７となるように水により希釈される１００ｎｍのポリスチレンビードの原液、５０％（２倍）の体積６９となるように水により希釈される１００ｎｍのポリスチレンビードの原液、及び５１％（１倍）の体積７１となるように水により希釈される１００ｎｍのポリスチレンビードの原液に対して記録される第３伝達スペクトルから導かれて、記録される減衰スペクトルのグラフを示す。

図１７は、入射光の波長に比べて相対的に小さな粒子半径による減衰における波長依存性を示す。

図２０において、対応する減衰スペクトルは、６００ｎｍのポリスチレンビードに対して示す。波長依存性は、存在するにも関わらず、６００ｎｍのポリスチレンビードに対してあまり重要ではない。

大腸菌細菌性細胞と酵母細胞において記録される第３伝達スペクトルから導かれる図２７，３０における減衰スペクトルから明らかなように、それぞれ、小さな特性の特徴が、粒子の濃度が変化するにつれて、減衰スペクトルにおいて生じる。一方、第３伝達スペクトルが行うにつれて記録される減衰スペクトルにより、第１スペクトルと第２スペクトルをそれぞれ比較することによって、散乱の特徴から吸収の特徴を分離できる。

一般的に、平面波が完全な球形、粒子、又は生体細胞に当たるとき、光の一部は吸収されて、また別の光の一部は散乱される。これらの推移は、様々な粒子サイズのための散乱理論により計算され得る。（ローレンツ－ミーの方法、ローレンツ－ミー－デバイの方法、又はミー散乱として知られている）マクスウェル方程式に対するミーの方法は、均一な球形により電磁平面波の散乱を説明する。この方法は、球状の複数の部分的な波形の無限級数の形をとる。非吸収、部分的吸収、又は完全導電性球により、光散乱を計算することが用いられ得る。

定義に関して、遮光効率（散乱又は吸収）は、粒子の幾何学的断面領域に対する遮光（散乱又は吸収）断面の比率である。散乱異方性は、単一の散乱事象の後において保たれる順方向の量の測定値であり、散乱位相関数の平均の余弦に関して定められる一方、粒子に関する遮光効率は散乱効率と吸収効率の合計として定められる。分光光度計により測定される減衰は、遮光効率と、光路の長さ、濃度、及び１０を底とするオイラー数の対数の数学定数とを掛けることにより計算され得る。

図３１～３４において、シミュレーションスペクトルが与えられている。図３１～３４において、シミュレーションスペクトルを生じるために用いられる実装は、Ｗｉｓｃｏｍｂｅｓ ＭＩＥＶ０コードにより与えられる手順に続いて、Ｐｙｔｈｏｎライブラリ「Ｍｉｅｐｙｔｈｏｎ」である。このシミュレーションフレームワークは、所定の直径の球状粒子の遮光効率、散乱効率、後方散乱非対称性、及び散乱非対称性を計算するために用いられる。シミュレーションスペクトルは、水中のポリスチレンビード用である。光学定数は、出願番号４６，３８１１－３８２０（２００７）の「２１．５℃の高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）蒸留水」から得られる。

ポリスチレン粒子は、設備の校正を含んで、散乱を含む過程を理解して、且つ数値化するために参照システムに用いられる。したがって、図３１～３４に示す結果の基礎となる計算は、Ｎ．Ｓｕｌｔａｎｏｖａ，Ｓ．Ｋａｓａｒｏｖａ，Ｉ．ＮｉｋｏｌｏｖによるＡｃｔａ Ｐｈｙｓｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ Ａ １１６，５８５－５８７（２００９）の「光学ポリマーの分散特性」から得られた表形式光学特性により、ポリスチレン粒子に対して行われる。

図３１において、１０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の様々な粒子の直径に対する５７０ｎｍ～８５０ｎｍの間隔の波長に応じて、単一粒子の散乱効率に対するシミュレーション結果を示す。１０～１０００ｎｍの間のすべての粒子の直径に対して、散乱効率が、可視スペクトル内のより小さな波長に比べて入射光のより大きな長さの波長に対して減少することが分かる。一方、１０ｎｍ～１０００ｎｍの異なる直径に対する結果として得られるスペクトルを比べることにより、粒子の直径が１０ｎｍから１０００ｎｍまで増加するとき、粒子の可視範囲における散乱効率は約８桁増加することが分かる。これは、粒子サイズと粒子における入射光の散乱との間のより大きな相互関係を示す。

図３２において、１０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の様々な粒子の直径に対する５７０ｎｍ～８５０ｎｍの間隔の波長に応じて、単一粒子の吸収効率に対するシミュレーション結果を示す。１０～１０００ｎｍの間のすべての粒子の直径に対して、吸収効率が、可視スペクトル内のより小さな波長に比べて入射光のより大きな長さの波長に対して減少することが分かる。１０ｎｍ～１０００ｎｍの直径に対する結果として得られるスペクトルを比べることにより、粒子の吸収効率は約３桁未満増加することが分かる。これは、粒子サイズと粒子の光吸収との間の相互関係よりも大きい粒子サイズと粒子の光散乱との間の相互関係を示す。

図３３において、１０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の様々な粒子の直径に対する５７０ｎｍ～８５０ｎｍの間隔の波長に応じて、遮光効率の合計の散乱比率に対するシミュレーション結果を示す。図３３において、１０～１０００ｎｍの間の直径のすべての粒子に対して、遮光効率の合計に対する散乱効率の比率が、５７０ｎｍ～８５０ｎｍの範囲内のより小さな波長に比べて入射光のより大きな長さの波長に対して減少することが分かる。図３３において、約１０ｎｍの直径の小さな粒子に対して、散乱効率が遮光効率の合計の０％に近いことが分かる。これは、約１００％の粒子によって悪影響を受ける入射光が吸収されることを示す。図３３において、約１００ｎｍの直径の小さな粒子に対して、散乱効率が遮光効率の合計の２０％に近いことが分かる。これは、約２０％の粒子によって悪影響を受ける入射光が散乱して、約８０％の粒子によって悪影響を受ける入射光が吸収されることを示す。図３３において、約６００ｎｍの直径の粒子に対して、散乱効率が遮光効率の合計の８０％に近いことが分かる。これは、８０％に近い粒子によって悪影響を受ける入射光が散乱して、約２０％の粒子によって悪影響を受ける入射光が吸収されることを示す。図３３において、１０００ｎｍの直径の大きな粒子に対して、散乱効率が遮光効率の合計の８０％を上回ることが分かる。これは、８０％を上回る粒子によって悪影響を受ける入射光が散乱して、２０％未満の粒子によって悪影響を受ける入射光が吸収されることを示す。図３３に示すシミュレーション結果は、粒子又は生体細胞を含む同じ試料の散乱特性と吸収特性の両方を数値化することによって、粒子サイズに関する情報、及び可能であればサイズ分布に関する情報が導かれ得ることを示す。

図３４において、１０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の様々な粒子の直径に対する５７０ｎｍ～８５０ｎｍの間隔の波長に応じて、散乱異方性に対するシミュレーション結果を示す。図３４において、１０～１０００ｎｍの間の直径のすべての粒子に対して、散乱異方性が、５７０ｎｍ～８５０ｎｍの範囲内のより小さな波長に比べて入射光のより大きな長さの波長に対して減少することが分かる。図３４において、約１０ｎｍの直径の小さな粒子に対して、散乱異方性が０％に近いことが分かる。これは、約１００％の粒子によって悪影響を受ける入射光が、すべての方向に均一に散乱されること、すなわちレイリー散乱として知られている過程を示す。図３４において、約１００ｎｍの直径の小さな粒子に対して、散乱異方性が約１０％であることが分かる。図３４において、約６００ｎｍの直径の粒子に対して、散乱異方性が８０％を上回ることが分かる。図３４において、１０００ｎｍの直径の大きな粒子に対して、散乱効率が９０％を上回ることが分かる。これは、９０％を上回る悪影響を受けた入射光が、単一の散乱の後、前方に向かい続けることを示す。図３３及び図３４に示すシミュレーション結果は、粒子又は生体細胞を含む同じ試料の散乱特性と吸収特性の両方を測定することによって、サイズに関する情報、及び可能であればサイズ分布に関する情報が導かれ得ることを示す。

図３６は、図２１～２４において示すと共に、大腸菌細菌性細胞の相対濃度に応じて示す第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３のそれぞれから計算されるピーク幅のグラフである。それぞれのスペクトルに対して、第１スペクトル５１のピーク幅６６は、図３５における例示的な第１スペクトル５１の線６８により示す波長の差として計算される。また、第２スペクトル５３のピーク幅７０は、図３５における例示的な第２スペクトル５３の線７２により示す波長の差として計算される。図３６から明らかなように、ピーク幅６６は濃度に応じて第１スペクトル５１に対して変化する一方、ピーク幅７０は濃度に応じて第２スペクトル５３の定値に近くなる。これは、第１伝達スペクトル５１と第２伝達スペクトル５３の比較分析から導かれる濃度依存性の別の実施例を提供する。

材料を通る伝達放射力の減衰は、吸収の合計、すなわち存在する場合、散乱と発光による損失として定められ得る。以下のように、試料物質又は試料物質の成分があまり発光性でないことを仮定する。

ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計は、減衰を測定するために用いられ得る。この機器を用いるため、溶液は、小さなキュベットに配置されて、容器に入れられる。機器は、コンピュータを通して制御される。また、機器は、「ブランク」であるとき、減衰スペクトルとして知られている波長に対して示す減衰を自動的に表示する。

純粋な吸収性試料の場合、減衰は吸収と等しくなる。また、溶液のスペクトルは、溶液内の被検物質の濃度を決めるために有用であり、例えば該当する場合、一部の濃度に対してランベルト・ベールの法則を用いる。

純粋な散乱性試料の場合、（この場合、光学的密度と呼称される）減衰は、散乱による損失を測定する。溶液のスペクトルは、濃度を決めるために有用であり、濃度範囲内で有効な標準的な曲線に基づく。濃度を計算することに加えて、入射波長と同じ桁数の粒子サイズに対して、スペクトルは曲率又は特徴を示し得る。この曲率又は特徴により、平均粒子サイズ、又は一部の場合、粒子分布の定量化を決めることができる。一方、入射波長に関して小さい又は大きな粒子の直径に対して、減衰スペクトルにおけるサイズに応じる曲率又は特徴の欠如により、濃度とサイズ分布の両方に適合することが難しい。Ａｇｉｌｅｎｔ ７０１０と他の粒子サイズの分光測光法機器は、可視範囲よりも大きな波長の範囲、例えば１９０ｎｍ～１１００ｎｍの波長を用いることによって、濃度とサイズ分布の両方を補う。専用機器であっても、両方のパラメータは、よくても、大きな不確実性により決められる。

無視できない量の散乱性媒体と吸収性媒体の両方が試料内に混合されている場合、分光光度計又は同等の光学機器により測定される試料の減衰は、散乱の寄与と吸収の寄与の合計（及び散乱の寄与と吸収の寄与の合計から導かれる任意の２次高濃度現象）に達する。この場合、吸収計算モデル又は散乱計算モデルのいずれかに基づく従来の方法は完全に機能しなくなる。減衰スペクトルにおいて利用できる情報は、吸収による損失と散乱による損失との間において、適切に識別できない。したがって、濃度と粒子サイズは決められない。光の入射波長と比べられる大きな粒子の場合、減衰スペクトルが実質的に平坦であり、測定された吸収減衰値が吸収と散乱の両方からの損失に基づくため、粒子サイズが生体細胞を含む散乱成分として知られていたとしても、濃度は決められない。

これに関して発明の有用性を示すため、図３７～４６は、異なる量のブリリアントブルーの着色剤と散乱性酵母細胞を混合することにより行われる実験からデータを示す。ブリリアントブルーの着色剤は、６２８ｎｍにおける吸収と共に、ほぼ独占的に吸収する。酵母細胞は、可視範囲内の波長よりも著しく大きい光散乱である。

図３７～４６に示すデータは、１つのキュベットの内側に固定されている光結晶と共に、正方形の透明なキュベット内の液体試料の減衰を測定して、本発明の実施形態に記載の第１伝達スペクトル、第２伝達スペクトル、及び第３伝達スペクトルを得るための３つの構造のキュベットを回転させることにより、分光光度計ＵＶ－１８００において記録されている。したがって、３つの持続的に異なるスペクトルは、以下の課題の試料に対して記録されている。
１． 「＿Ｌｉｇｈｔ２」と付けられている記録試料スペクトル。入射光は、光学検出器により最終的に収集されるように、光学フィルタと試料（第２伝達スペクトル５３）を通過する。
２． 「＿Ｌｉｇｈｔ１」と付けられている記録試料スペクトル。入射光は、光学検出器により最終的に収集されるように、光学フィルタと試料（第１伝達スペクトル５１）を通過する。
３． 「＿Ｌｉｇｈｔ０」と付けられている記録試料スペクトル。入射光は、光学検出器により最終的に収集されるように、試料（第３伝達スペクトル５４）を通過する。この記録試料スペクトルは、従来の透明なキュベットを用いて測定されるスペクトルと等しい。

「スペクトルデータセット」としてのこれらの実験的条件の下で、スペクトルデータの収集を参照する。

図３７において、水中に浮遊している酵母細胞において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長に対する減衰スペクトルを示す。「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルは、約０．７５の実質的に平坦なスペクトルを明らかに示す。「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトル形状を比較することにより、酵母細胞が入射光を大きく散乱することを示す差を見ることができる。

図３８において、水中に浮遊している酵母細胞とブリリアントブルーの溶液との１：１の混合物において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長に対する減衰スペクトルを示す。「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルは、減衰の広い背景において、約６２８ｎｍの大きな吸収を明らかに示す。「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトル形状を比較することにより、入射光の散乱を示す一方、図３７よりも非常に小さな範囲の差を見ることができる。

図３９において、水中に浮遊している酵母細胞とブリリアントブルーの溶液との１：３の混合物において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長に対する減衰スペクトルを示す。最大で約０．８を有する「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルは、図３８に示すよりも小さい減衰の広い背景において、約６２８ｎｍの吸収を明らかに示す。「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトル形状を比較することにより、入射光の散乱を示す一方、図３７よりも非常に小さな範囲の差を見ることができる。

図４０において、水中に浮遊している酵母細胞とブリリアントブルーの溶液との１：５の混合物において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長に対する減衰スペクトルを示す。最大で約０．８を有する「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルは、図３８と図３９に示すよりも小さい減衰の広い背景において、約６２８ｎｍの吸収を明らかに示す。「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトル形状を比較することにより、入射光の散乱を示す一方、図３７～３９よりも非常に小さな範囲の差を見ることができる。

図４１において、ブリリアントブルーの溶液において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長に対する減衰スペクトルを示す。最大で約０．８５を有する「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルは、図３８と図３９に示すよりも小さい減衰の広い背景において、約６２８ｎｍの吸収を明らかに示す。「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトル形状を比較することにより、入射光の散乱を示す一方、図３７～４０よりも小さな範囲の差を見ることができる。これは、ブリリアントブルーの着色剤が僅かに光を散乱することを示す。

図４２において、水中に浮遊している酵母細胞において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長と共に、「＿Ｌｉｇｈｔ０」を除いた「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」に対する減衰スペクトルを示す。「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルを除いて、「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトルを比較することにより、試料散乱が定量化され得る。

図４３において、水中に浮遊している酵母細胞とブリリアントブルーの溶液との１：１の混合物において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長と共に、「＿Ｌｉｇｈｔ０」を除いた「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」に対する減衰スペクトルを示す。「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルを除いて、「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトルを比較することにより、試料に存在するブリリアントブルーの着色剤からの吸収による影響を受けることなく、試料散乱が定量化され得る。

図４４において、水中に浮遊している酵母細胞とブリリアントブルーの溶液との１：３の混合物において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長と共に、「＿Ｌｉｇｈｔ０」を除いた「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」に対する減衰スペクトルを示す。「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルを除いた後、「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトルを比較することにより、試料に存在するブリリアントブルーの着色剤からの吸収による影響を受けることなく、試料散乱が定量化され得る。

図４５において、水中に浮遊している酵母細胞とブリリアントブルーの溶液との１：５の混合物において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長と共に、「＿Ｌｉｇｈｔ０」を除いた「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」に対する減衰スペクトルを示す。「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルを除いた後、「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトルを比較することにより、試料に存在するブリリアントブルーの着色剤からの吸収による影響を受けることなく、試料散乱が定量化され得る。

図４６において、ブリリアントブルーの溶液において記録されるスペクトルデータセットに対して、１を単位とする透過率における５５０ｎｍ～８００ｎｍの入射波長と共に、「＿Ｌｉｇｈｔ０」を除いた「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」に対する減衰スペクトルを示す。「＿Ｌｉｇｈｔ０」のスペクトルを除いた後、「＿Ｌｉｇｈｔ２」と「＿Ｌｉｇｈｔ１」のスペクトルを比較することにより、試料に存在するブリリアントブルーの着色剤からの吸収による影響を受けることなく、試料散乱が定量化され得る。散乱におけるスペクトル情報は、ブリリアントブルーの着色剤からの大きな吸収による影響を受けない。

したがって、図３７～４６は、例えばキュベット方式と従来の分光光度計において、本発明を用いることにより、散乱による損失と吸収による損失との間において区別できるスペクトル情報が得られることを示す。適切なデータ処理により、吸収と散乱の光学モデルは、広い範囲の試料に対して、従来の分光光度計において数値化できない濃度とサイズの両方を決めることをもたらすように組み合わされ得る。

図３７～４６におけるデータはまた、この方法が、溶液内の異なる種類の粒子、例えば溶液内の異なる種類の細胞を区別するために用いられ得ることを示す。

Claims (13)

1. 光学特性評価システムを用いる液体特性評価の方法であって、
   前記光学特性評価システムは、光源と光検出器を有して、且つ前記光源と前記光検出器との間において伸びる光路を形成する光学素子を備えており、
   前記光検出器は、可変波長において光量を分解することができて、
   前記光学特性評価システムは、第１容器面と第２容器面を有する液体容器を備えており、
   前記第１容器面と前記第２容器面は、前記液体容器の内部の少なくとも一部を形成しており、
   前記第１容器面と前記第２容器面の少なくとも一部は、透過していると共に平行であり、
   前記光学特性評価システムは、前記第１容器面に取り付けられる、又は前記第１容器面と一体的に形成されると共に、前記内部に対向する第１光結晶を備えており、
   前記第１光結晶は、第１平面において形成される第１変調周期を有する第１格子部分を備えており、
   前記方法は、
   前記第１容器面と前記第２容器面の少なくとも一部、すなわち液体を含む前記内部と前記第１光結晶が前記光路を妨げて、且つ前記内部が前記第１光結晶より前に前記光路を妨げる第１伝達スペクトルを記録するステップと、
   前記第１容器面と前記第２容器面の少なくとも一部、すなわち液体を含む前記内部と前記第１光結晶が前記光路を妨げて、且つ前記第１光結晶が前記内部より前に前記光路を妨げる第２伝達スペクトルを記録するステップとを備えることを特徴とする、方法。
2. 前記方法は、前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルを分析することにより、前記液体のいずれかの粒子からの散乱の定量的測定値を導くステップを備えることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記方法は、前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルを比較して分析することを含んで、前記液体内の粒子の平均サイズを導くステップを備えることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記方法は、前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルを比較して分析することを含んで、前記液体内の粒子のサイズ分布を導くステップを備えることを特徴とする、請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
5. 第２光結晶は、前記第１容器面に取り付けられる、又は前記第１容器面と一体的に形成されて、前記内部に対向しており、
   前記第２光結晶は、第２平面を形成して、第２変調周期を有する第２格子部分を備えており、
   前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルは、前記光路における前記第２光結晶の少なくとも一部により記録されることを特徴とする、請求項１から請求項４のいずれかに記載の方法。
6. 前記第１光結晶は、前記第２光結晶と隣接することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記第１変調周期は、第１共振波長帯を生じて、
   前記第２変調周期は、第２共振波長帯を生じて、
   前記第１共振波長帯と前記第２共振波長帯は、オーバーラップしないことを特徴とする、請求項５又は請求項６に記載の方法。
8. 前記第１光結晶と前記第２光結晶の両方が、前記第１伝達スペクトルと前記第２伝達スペクトルのそれぞれを記録する間、同時に前記光路にあることを特徴とする、請求項５から請求項７のいずれかに記載の方法。
9. 前記光学素子は、少なくとも第１の方向と第２の方向において、前記液体容器を保持するように構成されている容器レセプタクルを備えており、
   前記方法は、
   前記第１の方向において、前記液体容器を前記容器レセプタクルに配置して、前記第１伝達スペクトルを記録するように、前記液体容器を前記第１の方向に向けるステップと、
   試料容器内の前記液体容器の方向を前記第２の方向に変化させて、前記第２伝達スペクトルを記録するように、前記液体容器を前記第２の方向に向けるステップとを備えることを特徴とする、請求項１から請求項８のいずれかに記載の方法。
10. 前記光学素子は、少なくとも第１光路と第２光路とを与えるように構成されており、
    前記第１伝達スペクトルは、前記第１光路に沿って与えられる光により記録されて、
    前記内部と前記第１光結晶は、前記第１光路を妨げて、
    前記内部は、前記第１光結晶より前に前記第１光路を妨げて、
    前記第２伝達スペクトルは、前記第２光路に沿って与えられる光により記録されて、
    前記内部と前記第１光結晶は、前記第２光路を妨げて、
    前記第１光結晶は、前記内部より前に前記第２光路を妨げて、
    前記液体容器の方向は、前記第１伝達スペクトルを記録するステップと前記第２伝達スペクトルを記録するステップとの間において、変わらないことを特徴とする、請求項１から請求項８のいずれかに記載の方法。
11. 前記第１光結晶が前記光路にない第３伝達スペクトルを記録するステップを備える、請求項１から請求項１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記液体容器はまた、前記内部の少なくとも一部を形成する第３容器面と第４容器面を備えており、
    前記第３容器面と前記第４容器面の少なくとも一部は、透過していると共に平行であり、
    前記第３伝達スペクトルは、前記第３容器面と前記第４容器面の少なくとも一部により記録されて、
    前記内部は、前記光路を妨げることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記光学素子は、少なくとも第３光路を与えるように構成されており、
    前記第３伝達スペクトルは、前記第３光路に沿って与えられる光により記録されて、
    前記第３容器面と前記第４容器面は、前記第３光路を妨げることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

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