JP2022540043A - 止血粉末 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１０ｗｔ．％の粒子凝集物を含む止血粉末であって、前記粒子凝集物が１～５００μｍの範囲の直径を有し、共有結合の形成下で血液中のアミン基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求電子性基を担持する求電子性ポリオキサゾリンを含有する求電子性ポリオキサゾリン粒子、及び水の存在下で、求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの間の共有結合の形成下で求電子性ポリオキサゾリンの反応性求電子性基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求核性基を担持する水溶性求核性ポリマーを含有する求核性ポリマー粒子を含む、止血粉末に関する。出血部位に塗布されると、本発明の止血粉末は、ゲルに変わると同時に血液及び周囲組織に存在するタンパク質に結合する。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

［発明の技術分野］
本発明は、少なくとも１０ｗｔ．％の粒子凝集物を含む止血粉末であって、
共有結合の形成下で血液中のアミン基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求電子性基を担持する求電子性ポリオキサゾリンを含有する求電子性ポリオキサゾリン粒子、及び
水の存在下で、求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの間の共有結合の形成下で求電子性ポリオキサゾリンの反応性求電子性基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求核性基を担持する求核性ポリマーを含有する求核性ポリマー粒子
を含む、止血粉末に関する。

本発明の止血粉末が出血部位に塗布されると、粒子凝集物は、急速にゲルを形成すると同時に血液及び周囲組織中に存在するタンパク質に結合し、それにより止血を加速させる。

［発明の背景］
止血は、組織損傷への血栓性応答が生じると同時に、血管系を通して血流を維持する緊密に調節されたプロセスである。止血を維持するには、血管壁、血小板並びに凝固及び線溶系の複雑な相互作用が必要である。止血には、２つの主要な段階：一次（すなわち、細胞性段階）及び二次（すなわち、液性段階）が存在する。

一次止血は、内皮破裂の直後に開始し、血管収縮、血小板接着及び軟質の凝結栓の形成によって特徴付けられる。損傷の発生後、血管平滑筋の一時的な局所収縮が生じ、血流が緩徐になり、血小板の接着及び活性化が促進される。損傷の２０秒以内に、循環するフォン・ヴィレブランド因子が損傷部位の内皮下層に付着し、血小板表面の糖タンパク質に接着する。血小板が損傷表面に接着する際、血小板は、コラーゲンと接触することによって活性化され、循環するフィブリノーゲンに結合する受容体を露出させる。凝結した血小板とフィブリノーゲンの軟質栓が形成される。この止血段階は短期間であり、軟質栓は損傷表面から容易に引き剥がされる可能性がある。

軟質の血小板栓は、二次止血の間に安定化され凝塊を形成する。血管収縮、及び結果として生じる血流の低減は、血小板によって分泌されるセロトニン、プロスタグランジン及びトロンボキサンによって維持され、その一方で凝固カスケードが開始される。凝固カスケードは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換させる、複数の血漿タンパク質、カルシウムイオン及び血液の血小板が関与する一連の依存性反応である。肝臓によって凝固因子が生成され、凝固カスケードが開始されるまで不活性形態で循環する。次いで、カスケードの各ステップが、一連の逐次的且つ依存性の凝固因子の活性化反応によって開始及び完了される。最終ステップでは、トロンビンが、可溶性血漿タンパク質であるフィブリノーゲンを不溶性タンパク質であるフィブリンに変換させると同時に、第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子に変換させる。この因子の変換によってフィブリンが安定化し、フィブリンモノマーの架橋が生じて安定な凝塊が生成される。

外科手術の際、外科手術の成功及び患者のアウトカムを最適化させるために、過剰な失血を伴うことなく外科手術部位の組織に継続的に血液が流れるように、出血と凝血の間の微妙なバランスを維持することが重要である。外科手術中の広く分布する小毛細血管又は小さな細静脈からの継続的な出血によって術野が不明瞭になり、手術時間が長引き、生理学的合併症のリスクが増加し、患者が輸血を伴うリスクに晒される可能性がある。

外科医は、機械的及び熱的技術並びにデバイスだけでなく、薬物療法及び外用剤を含む、出血の制御に対する多くの選択肢を有する。

最も初期の外用止血剤のうちの１種は、ガーゼスポンジの形態のコットンであった。そのような材料は、物理的吸着によって血液及び凝固生成物を濃縮させるが、身体吸収性ではなく、また取り外す際に凝塊が除去され、さらなる出血につながる可能性がある。それ以来、吸収性外用止血剤が開発され、従来の止血方法が無効又は非実用的な場合に有用な補助療法になっている。外用止血剤は、出血部位に直接適用することができ、継続的な間断のない出血を予防することができる。外用剤を使用する止血はまた、「望ましくない」凝血塊などの全身性止血薬の有害作用を回避することができる。さらに、失血の量が予測不可能な外科手技において、外用止血は、失血が最小限である場合は節制して、且つ重度の出血の際はより大量に使用することが可能である。

多くの外用止血剤が外科手術で使用するために現在入手可能である。これらは、２つのカテゴリー：生物学的に活性な様態で凝血カスケードに対して作用機序をもたらすもの、並びに接触活性化及び血小板凝結の促進を通して受動的に作用するものに分けることができる。受動的な外用止血剤として、コラーゲン、セルロース及びゼラチンが挙げられ、一方活性剤として、トロンビン、及びトロンビンが受動的薬剤と組み合わされ、全体的に活性な生成物となる生成物が挙げられる。

米国特許出願公開第２００３／００６４１０９号は、少なくとも１種の再水和補助剤と組み合わせたゼラチンを含む水溶液を用意するステップ；溶液を乾燥させて固体を生成するステップ；固体を粉砕して粉末を生成するステップ；粉末を架橋するステップ；再水和補助剤の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）を除去するステップ；及び架橋ゼラチンを乾燥させて粉末を生成するステップを含む方法によって調製される乾燥止血粉末について記載している。再水和補助剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びデキストランからなる群から選択される少なくとも１種の材料を含んでもよい。

国際公開第２０１０／０５９２８０号は、無水繊維状シートであって、求電子性基又は求核性基を含有する繊維状ポリマーの第１の成分、及び前記シートが生物学的組織と接触している水性媒体に曝露される際、第１の成分と架橋し、生物学的組織に接着性の架橋ヒドロゲルを形成することができる第２の成分を含み、
ａ）第２の成分が、第１の成分の繊維状ポリマーと同じ若しくは異なる骨格構造を有し、第１の成分が求核性基を含有する場合、求電子性基を含有するか、又は第１の成分が求電子性基を含有する場合、求核性基を含有する繊維状ポリマーであり、
ｂ）第２の成分が第１の成分の繊維状ポリマー上のコーティングであり、前記コーティングが、第１の成分が求核性基を含有する場合、求電子性基を含有するか、若しくは第１の成分が求電子性基を含有する場合、求核性基を含有するか、又は
ｃ）第２の成分が、第１の成分の繊維状ポリマーの間隙内に分散及び捕捉された乾燥粉末であり、前記粉末が、第１の成分が求核性基を含有する場合、求電子性基を含有するか、若しくは第１の成分が求電子性基を含有する場合、求核性基を含有する、無水繊維状シートについて記載している。

米国特許出願公開第２０１２／００２１０５８号は、止血組成物を作製するための方法であって、ａ）生体適合性ポリマーの乾燥粒状調製物を用意するステップ；及びｂ）前記乾燥粒状調製物中の顆粒を、トロンビン溶液などの凝固誘導剤の調製物でコーティングするステップを含む方法について記載している。生体適合性ポリマーは、ゼラチン、可溶性コラーゲン、アルブミン、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、フィブリン、カゼイン、フィブロネクチン、エラスチン、ケラチン、ラミニン及びこれらの誘導体又は組合せから選択されてもよい。

米国特許出願公開第２０１３／０３１６９７４号は、約１～約１８の平均アスペクト比を有する粒子を含む、圧縮ＯＲＣ粉末を含む止血材料について記載している。止血材料は、多糖類、カルシウム塩、抗感染剤、止血促進剤、ゼラチン、コラーゲンから選択される添加剤をさらに含んでもよい。

米国特許出願公開第２０１６／０２７１２２８号は、止血組成物であって、
タンパク質、多糖類、生物学的ポリマー、非生物学的ポリマー並びにこれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される粒子状物質形態の止血生体適合性ポリマーであり、５０～７００μｍのメジアン直径範囲を有する粒状粒子として存在する、粒子状物質形態の止血生体適合性ポリマー、
求電子性反応性基を含む１種の親水性架橋剤であり、求電子性反応性基が、組成物が患者の血液に曝露されるまでそれらの反応性を保持し、求電子性反応性基が、患者の血液タンパク質と架橋して封止及び止血特性を有するゲルを形成するように構成される、１種の親水性架橋剤、並びに
１種の親水性架橋剤の求電子性反応性基と反応しない結合剤
を含み、止血組成物がペースト形態である、止血組成物について記載している。

米国特許出願公開第２０１２／０５７６２８号は、生体適合性の架橋ポリマーを生成するためのキットであって、前記キットが求電子的に活性化されたポリオキサゾリン（ＥＬ－ＰＯｘ）を含み、前記ＥＬ－ＰＯＸがｍ個の求電子性基を含み、前記求核性架橋剤がｎ個の求核性基を含み、前記ｍ個の求電子性基が前記ｎ個の求核性基と反応して共有結合を形成することができ、ｍ＞２、ｎ＞２及びｍ＋ｎ＞５であり、前記ｍ個の求電子性基のうちの少なくとも１個がペンダント求電子性基である、キットについて記載している。

国際公開第２０１６／０５６９０１号は、コーティングメッシュ、コーティングフォーム又はコーティング粉末から選択される接着性止血製品であって、前記止血製品が、
少なくとも５ｖｏｌ．％の多孔性を有し、反応性求核性基を含有する求核性ポリマーを含む外面を含む多孔質固体基材、及び
固体基材の少なくとも一部を覆う接着性コーティングであって、前記コーティングが、求電子的に活性化されたポリオキサゾリン（ＥＬ－ＰＯｘ）を含み、前記ＥＬ－ＰＯｘが、平均少なくとも１個の反応性求電子性基を含有するコーティング
を含む、接着性止血製品について記載している。

［発明の概要］
本発明者らは、抗凝固処理された血液に対しても、外科手術中に出血を制御するために好都合に使用することができる止血粉末を開発した。

本発明の止血粉末は、少なくとも１０ｗｔ．％の粒子凝集物を含み、前記粒子凝集物は、１～５００μｍの範囲の直径を有し、
共有結合の形成下で血液中のアミン基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求電子性基を担持する求電子性ポリオキサゾリンを含有する求電子性ポリオキサゾリン粒子、及び
水の存在下で、求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの間の共有結合の形成下で求電子性ポリオキサゾリンの反応性求電子性基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求核性基を担持する水溶性求核性ポリマーを含有する求核性ポリマー粒子
を含む。

出血部位に塗布されると、本発明の止血粉末は、ゲルに変わると同時に血液中及び周囲組織に存在するタンパク質に結合する。止血粉末の優れた出血停止能力は、高活性の凝血の誘導及び組織に接着する強力なゲル化凝血塊の形成に起因する。止血粉末は、出血部位全体に容易に分布することができる。必要であればさらなる粉末が添加されてもよく、これは、これによってゲル化凝血塊の下層に張り付く新たなゲル化凝血塊の層が形成されるためである。

本発明者らは理論に束縛されることを望まないが、止血粉末が血液と接触すると、求電子性ポリオキサゾリンを含有する求電子性ポリオキサゾリン粒子が急速に溶解すると同時に、血液中のタンパク質及び求核性ポリマー粒子中の水溶性求核性ポリマーの反応性求核性基と反応すると考えられる。結果として、ゲル化凝血塊の層が形成される。溶解された求電子性ポリオキサゾリンも、出血部位の周囲組織中のタンパク質と反応し、それにより組織にゲル化凝血塊の層が固着され、出血領域が封止される。

求電子性ポリオキサゾリンと水溶性求核性ポリマーの分子混合物を含む粒子と比べ、本発明の粒子凝集物は、より良好な封止特性をもたらすという利点を提供する。これは、粒子凝集物が血液と接触すると、求電子性ポリオキサゾリンが水溶性求核性ポリマーと比較的緩徐な速度で反応し、それにより求電子性ポリオキサゾリンが、水溶性求核性ポリマーだけでなく、血液及び出血部位の組織中のタンパク質と反応することができることに起因すると考えられる。

求電子性ポリオキサゾリンの粒子及び水溶性求核性ポリマーの粒子からなる粉末混合物と比べ、本発明の粒子凝集物は、より均質な強力なゲルが形成されるという利点を提供する。粒子凝集物が血液中で接触する際、求電子性ポリオキサゾリン及び水溶性求核性ポリマーの非常に均質な分散液が形成され、ポリマー成分がその中で溶解して反応を開始する際に、均質な強力なゲルが形成されると考えられる。

本発明はまた、
（ａ）共有結合の形成下で血液中のアミン基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求電子性基を担持する求電子性ポリオキサゾリンを含有する求電子性ポリオキサゾリン粒子、及び
（ｂ）求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの間の共有結合の形成下で求電子性ポリオキサゾリンの反応性求電子性基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求核性基を担持する水溶性求核性ポリマーを含有する求核性ポリマー粒子
の止血粒子凝集物を調製する方法であって、前記方法が、１００重量部の求電子性ポリオキサゾリン粒子と１０～１０００重量部の求核性ポリマー粒子を非水性造粒液体の存在下で組み合わせるステップを含む、方法を提供する。

本発明者らは、求電子性ポリオキサゾリンが不溶性であり、求核性ポリマーが幾分可溶性である非水性造粒液体を使用することにより、求電子性ポリオキサゾリンと水溶性求核性ポリマーを、その間に最小限の架橋反応を伴い、且つ求電子性ポリオキサゾリンの最小限の分解を伴って単一の粒子へと組み合わせることができることを予想外に発見した。本発明者らは理論に束縛されることを望まないが、求電子性ポリオキサゾリンが不溶性である非水性造粒液体を使用すると、造粒中に、求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの間に架橋反応が生じないことが保証されると考えられる。さらに、この方法で、求電子性ポリオキサゾリンの分解（加水分解）が最小化される。求電子性ポリオキサゾリンとは対照的に、求核性ポリマーの一部は非水性造粒液体に溶解し、それによって求電子性ポリオキサゾリン粒子と求核性ポリマー粒子を一緒に繋ぎ合わせることができる粘性塊が形成される。

三次元の相互接続した間隙空間を含む粘着性繊維状担体構造体、及び
間隙空間内に分散されている本発明の止血粉末
を含む、生体適合性の可撓性止血シートがさらに提供される。

［発明の詳細な説明］
したがって、本発明の第１の態様は、少なくとも１０ｗｔ．％の粒子凝集物を含む止血粉末であって、前記粒子凝集物が１～５００μｍの範囲の直径を有し、
共有結合の形成下で血液中のアミン基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求電子性基を担持する求電子性ポリオキサゾリンを含有する求電子性ポリオキサゾリン粒子、及び
水の存在下で、求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの間の共有結合の形成下で求電子性ポリオキサゾリンの反応性求電子性基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求核性基を担持する水溶性求核性ポリマーを含有する求核性ポリマー粒子
を含む、止血粉末に関する。

本明細書で使用される「粒子凝集物」という用語は、すべてが互いに結合された２種以上の粒子を含む顆粒を指す。

本明細書で使用される「ポリオキサゾリン」という用語は、ポリ（Ｎ－アシルアルキレンイミン）又はポリ（アロイルアルキレンイミン）を指し、さらにＰＯｘと称される。ＰＯｘの例は、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）である。「ポリオキサゾリン」という用語は、ＰＯｘのコポリマーも包含する。

本明細書で使用される「水溶性求核性ポリマー」という用語は、３～７の範囲のｐＨの２０℃の脱塩水に、少なくとも５０ｇ／Ｌの水溶性を有する求核性ポリマーを指す。キトサンが水溶性求核性ポリマーの一例である。キトサンは、ｐＨ＜６の水に水溶性である。様々なｐＨでの求核性ポリマーの水溶性を決定するために、塩酸を使用して脱塩水のｐＨが調整される。

本明細書で使用される「コラーゲン」という用語は、動物の身体における種々の結合組織の細胞外空間内の主な構造タンパク質を指す。コラーゲンは、特徴的な３本のポリペプチド鎖の三重らせんを形成する。石灰化の程度に応じて、コラーゲン組織は強固である（骨）か、又は柔軟である（腱）か、又は強固から柔軟までの勾配を有する（軟骨）かのいずれかでありうる。別段指示されない限り、「コラーゲン」という用語は、ゼラチン以外の変性コラーゲン（例えば、架橋コラーゲン）も包含する。

本明細書で使用される「ゼラチン」という用語は、家畜のウシ、ニワトリ、ブタ及び魚などの動物の皮膚、骨及び結合組織から抽出されるコラーゲンの部分加水分解によって生成される、ペプチドとタンパク質の混合物を指す。加水分解の間に、個々のコラーゲンストランド間の天然の分子結合が、より容易に再構成する形態へと分解される。本明細書で使用される「ゼラチン」という用語は、架橋ゼラチン及び還元架橋ゼラチンなどの変性ゼラチンも包含する。

本明細書で使用される「還元架橋ゼラチン」という用語は、部分的に加水分解された架橋ゼラチンを指す。架橋ゼラチン中のペプチド結合の部分加水分解は、例えばアルカリ処理によって達成することができる。架橋ゼラチンの加水分解により、遊離カルボキシル及び遊離アミン基の密度が増加し、水溶性が増加する。

本明細書で使用される「止血シート」という用語は、別段指示されない限り、損傷組織からの出血を停止させる能力を有するシートを指す。本発明の止血シートは、血液をゲルに変える及び／又は創傷部位を閉じるシールを形成することによって止血を達成してもよい。

繊維状担体構造体に関連して本明細書で使用される「耐水性」という用語は、この構造体が水溶性ではなく、且つ中性のｐＨ条件（ｐＨ７）及び３７℃の温度で水中で崩壊し、コロイド分散液を形成しないことを意味する。

本明細書で使用される「間隙空間」という用語は、繊維状担体構造体内の空隙（「空の」）空間を指す。繊維状担体構造体内の間隙空間は、止血粉末の構造体への導入を可能にする。血液及び他の体液も間隙空間に入ることができ、それにより止血粉末がその止血効果を発揮する及び／又は止血シートへの組織の接着性をもたらすことができる。

本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、別段指示されない限り、架橋タンパク質及び加水分解されたタンパク質も包含する。同様に、別段指示されない限り、ゼラチン又はコラーゲンなどの特定のタンパク質種が言及される場合、そのタンパク質種の加水分解された及び架橋されたバージョンも包含される。

止血粉末の、求電子性ポリオキサゾリン粒子及び求核性ポリマー粒子の粒子凝集物の直径分布は、好適にはＳｔａｉｎｌｅｓｓ Ｓｔｅｅｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｕｎｉｔとの組合せのＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００を使用するレーザー回折によって決定されてもよい。試料分散ユニットにおよそ１２０ｍｌのシクロヘキサンを充填し、ユニットを１８００ｒｐｍの撹拌速度で５～１０分間安定させ、その後バックグラウンド測定（ブランク測定）を行う。試料管を振盪し、２０回水平に回転させる。次に、シクロヘキサンを含有する試料分散ユニットに約５０ｍｇを分散させる。試料を分散ユニットに導入したら、すべての粒子が適正に分散されることを保証するために、試料を１８００ｒｐｍで１分３０秒撹拌し、その後測定を行う。分散された粒子に超音波処理は実施されない。平均粒径は、Ｄ［４，３］、体積加重平均直径（ΣｎｉＤｉ^４）／（ΣｎｉＤｉ^３）として表される。

求電子性ポリオキサゾリン粒子及び求核性ポリマー粒子を含む粒子凝集物の他に、本発明の止血粉末は、他の粒子状物質成分、例えばゲルフォーム又はデンプンなどの生体適合性（バイオ）ポリマーを含有してもよい。好ましくは、止血粉末は、少なくとも３０ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも６０ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも８０ｗｔ．％の粒子凝集物を含有する。

止血粉末中の粒子凝集物は、好ましくは少なくとも１０ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも２５ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも４０ｗｔ．％の求電子性ポリオキサゾリンを含有する。

求核性ポリマーは、好ましくは少なくとも１０ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも１２ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも３０ｗｔ．％の濃度で粒子凝集物に含有される。

求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの組合せは、典型的に粒子凝集物の少なくとも１０ｗｔ．％を構成する。より好ましくは、これら２種のポリマーの組合せは、粒子凝集物の少なくとも５０ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも７５ｗｔ．％を構成する。

求電子性ポリオキサゾリン及び求核性ポリマーの他に、粒子凝集物は、１種又は複数の他の成分、例えば多糖を含有してもよい。利用されてもよい多糖の例として、アミロース、マルトデキストリン、アミロペクチン、デンプン、デキストラン、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ポリ硫酸ペントサン、アルギネート及びこれらの組合せが挙げられる。典型的に、粒子凝集物中の多糖の量は５０ｗｔ．％を超えない。多糖が粒子凝集物に含有される場合、求電子性ポリオキサゾリン、求核性ポリマー及び多糖の組合せは、好ましくは粒子凝集物の少なくとも６０ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも８０ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも９０ｗｔ．％を構成する。

別の有利な実施形態によると、粒子凝集物は、乾燥緩衝系を含有する。好ましくは、緩衝系は、７～１１の範囲、より好ましくは８～１０の範囲の緩衝ｐＨを有する。好ましくは、緩衝系は、少なくとも１０ｍｍｏｌ．ｌ^－１．ｐＨ^－１の緩衝能を有する。より好ましくは、緩衝能は少なくとも２５ｍｍｏｌ．ｌ^－１．ｐＨ^－１であり、最も好ましくは、緩衝能は少なくとも５０ｍｍｏｌ．ｌ^－１．ｐＨ^－１である。粒子凝集物に利用されてもよい生体適合性緩衝系の例として、リン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝剤、ホウ酸ナトリウム十水和物緩衝剤、トリス緩衝タンパク質、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水及び炭酸水素ナトリウム／炭酸塩緩衝剤が挙げられる。

以下で説明されるように、本発明の粒子凝集物は、造粒結合剤、すなわち求電子性ポリオキサゾリン粒子と求核性ポリマー粒子の間の接着をもたらすために造粒中に利用される成分を使用することなく調製されてもよい。したがって、好ましい実施形態では、粒子凝集物は造粒結合剤を含有しない。

本発明の止血粉末は、好ましくは１～２００μｍの範囲の直径を有する粒子凝集物を少なくとも１０ｗｔ．％、より好ましくは１～１００μｍの範囲の直径を有する粒子凝集物を少なくとも１０ｗｔ．％、最も好ましくは１～７５μｍの範囲の直径を有する粒子凝集物を少なくとも１０ｗｔ．％含有する。

止血粉末は、好ましくは１０～１０００μｍの範囲、より好ましくは１５～５００μｍの範囲、最も好ましくは３０～３００μｍの範囲の体積加重平均直径（Ｄ［４，３］、（Σｎ_ｉＤ^４）／（ΣｎｉＤ^３））を有する。

止血粉末中の粒子凝集物は、好ましくは１０～２００μｍの範囲、より好ましくは１５～１００μｍの範囲、最も好ましくは３０～６０μｍの範囲のＤ［４，３］を有する。

粒子凝集物中の求電子性ポリオキサゾリン粒子は、好ましくは１～１００μｍの範囲、より好ましくは５０～５０μｍの範囲、最も好ましくは１０～４０μｍの範囲の体積加重平均直径（Ｄ［４，３］）を有する。

粒子凝集物中の求核性ポリマー粒子は、好ましくは１０～３００μｍの範囲、より好ましくは１５～２００μｍの範囲、最も好ましくは２０～１００μｍの範囲の体積加重平均直径（Ｄ［４，３］）を有する。

求電子性ポリオキサゾリン粒子は、好ましくは少なくとも３０ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも５０ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも８０ｗｔ．％の求電子性ポリオキサゾリンを含有する。

求電子性ポリオキサゾリンは、好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも３００ｇ／Ｌの２０℃の蒸留水への溶解度を有する。

求電子性ポリオキサゾリンは、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ未満、最も好ましくは１ｍｇ／Ｌ未満の２０℃のイソプロピルアルコールへの溶解度を有する。

求電子性ポリオキサゾリンは、好ましくは少なくとも２ｋＤａの分子量を有する。より好ましくは、求電子性ポリオキサゾリンは、５～２００ｋＤａ、最も好ましくは１０～１００ｋＤａの分子量を有する。

本明細書で以前に説明された通り、本発明者らは、求電子性ポリオキサゾリンと水溶性求核性ポリマーを、その間に最小限の架橋反応を伴い、且つ求電子性ポリオキサゾリンの最小限の分解を伴って単一の粒子へと組み合わせる方法を見出した。したがって、本発明の非常に好ましい実施形態では、粒子凝集物中の求電子性ポリオキサゾリンは、２．０未満、より好ましくは１．８未満、最も好ましくは１．５未満の多分散指数（ＰＤＩ）を有する。

求電子性ポリオキサゾリンは、好ましくは少なくとも４個の反応性求電子性基、より好ましくは少なくとも８個の反応性求電子性基、さらにより好ましくは少なくとも１６個の反応性求電子性基、最も好ましくは少なくとも３２個の反応性求電子性基を含有する。

求電子性ポリオキサゾリンは、典型的に平均少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の反応性求電子性基を担持する。

求電子性ポリオキサゾリンは、は、繰り返し単位が以下の式（Ｉ）：
（ＣＨＲ^１）_ｍＮＣＯＲ^２
（式中、Ｒ^２及びＲ^１のそれぞれは、Ｈ、任意選択で置換されたＣ_１～２２アルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアラルキル、任意選択で置換されたアリールから独立的に選択され、ｍは２又は３である）
によって表されるポリオキサゾリンに由来することが好ましい。

好ましくは、式（Ｉ）のＲ^１及びＲ^２は、Ｈ及びＣ_１～８アルキル、さらにより好ましくはＨ及びＣ_１～４アルキルから選択される。Ｒ^１は、最も好ましくはＨである。式（Ｉ）の整数ｍは、好ましくは２に等しい。

好ましい実施形態によると、ポリオキサゾリンはポリマーであり、さらにより好ましくは２－アルキル－２－オキサゾリンのホモポリマーであり、前記２－アルキル－２－オキサゾリンは、２－メチル－２－オキサゾリン、２－エチル－２－オキサゾリン、２－プロピル－２－オキサゾリン、２－ブチル－２－オキサゾリン及びこれらの組合せから選択される。好ましくは、ポリオキサゾリンは、２－プロピル－２－オキサゾリン又は２－エチル－オキサゾリンのホモポリマーである。最も好ましくは、ポリオキサゾリンは、２－エチル－オキサゾリンのホモポリマーである。

特定の好ましい実施形態によると、求電子性ポリオキサゾリンは、少なくとも２０個のオキサゾリン単位、より好ましくは少なくとも３０個のオキサゾリン単位、最も好ましくは少なくとも８０個のオキサゾリン単位を含む。求電子性ポリオキサゾリンは、好ましくはオキサゾリン残基あたり平均少なくとも０．０５個の反応性求電子性基を含む。さらにより好ましくは、求電子性ポリオキサゾリンは、オキサゾリン残基あたり平均少なくとも０．１個の反応性求電子性基を含む。最も好ましくは、求電子性ポリオキサゾリンは、オキサゾリン残基あたり平均０．１２～０．５個の反応性求電子性基を含む。

ポリオキサゾリンは、その側鎖（ペンダント反応性求電子性基）、その末端又は両方に反応性求電子性基を担持してもよい。本発明によって利用される求電子性ポリオキサゾリンは、有利には１個又は複数のペンダント反応性求電子性基を含有する。典型的に、求電子性ポリオキサゾリンは、モノマーあたり０．０３～０．５個のペンダント反応性求電子性基、より好ましくはモノマーあたり０．０４～０．３５個のペンダント反応性求電子性基、さらにより好ましくはモノマーあたり０．０５～０．２５個のペンダント反応性求電子性基を含有する。

好ましい実施形態によると、求電子性ポリオキサゾリンの反応性求電子性基は、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、ホスホン酸エステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、ｐ－ニトロチオフェニルエステル、酸ハロゲン化物基、無水物、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、チオイソシアネート、イソシアノ、エポキシド、活性化ヒドロキシル基、オレフィン、グリシジルエーテル、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、マレイミド（マレイミジル）、エテンスルホニル、イミドエステル、アセトアセテート、ハロアセタール、オルトピリジルジスルフィド、ジヒドロキシフェニル誘導体、ビニル、アクリレート、アクリルアミド、ヨードアセトアミド及びこれらの組合せから選択される。より好ましくは、反応性求電子性基は、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、ホスホン酸エステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、ｐ－ニトロチオフェニルエステル、酸ハロゲン化物基、無水物（ａｎｈｙｉｎｉｄｒｉｄｅｓ）、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、チオイソシアネート、イソシアノ、エポキシド、活性化ヒドロキシル基、グリシジルエーテル、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イミドエステル、ジヒドロキシフェニル誘導体及びこれらの組合せから選択される。さらにより好ましくは、反応性求電子性基は、ハロアセタール、オルトピリジルジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ジヒドロキシフェニル誘導体、ビニル、アクリレート、アクリルアミド、ヨードアセトアミド、スクシンイミジルエステル及びこれらの組合せから選択される。最も好ましくは、反応性求電子性基は、マレイミド、ビニル、アクリレート、アクリルアミド、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル及びこれらの組合せから選択される。

利用されてもよいスクシンイミジルエステルの例として、スクシンイミジルグルタレート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルスクシンアミド、スクシンイミジルカーボネート、ジスクシンイミジルスベレート、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、ビス（２－スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン、３、３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジル－プロピオネート）、スクシンイミジルカルバメート、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート、ジチオビス－スルホスクシンイミジルプロピオネート、ジスルホ－スクシンイミジルタータレート；ビス［２－（スルホ－スクシンイミジルオキシカルボニルオキシエチルスルホン）］、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｃｌｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、ジチオビス－（スクシンイミジルプロピオネート）が挙げられる。

利用されてもよいジヒドロキシフェニル誘導体の例として、ジヒドロキシフェニルアラニン、３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ドパミン、３，４－ジヒドロキシヒドロケイ皮酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｙｄｒｏｃｃｉｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＯＨＡ）、ノルエピネフリン、エピネフリン、及びカテコールが挙げられる。

求核性ポリマー粒子に含有される水溶性求核性ポリマーは、好ましくは３～７の範囲のｐＨの２０℃の脱塩水に、少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌの溶解度を有する。本発明は、求電子性ポリオキサゾリンが血液成分、組織及び／又は求核性ポリマーと反応する際に酸性物質を放出する場合、酸性ｐＨで可溶性である求核性ポリマーを好適に利用することができる。これは、例えば、求電子性ポリオキサゾリンがＮ－ヒドロキシスクシンイミド基を含有する場合に該当する。

求核性ポリマー粒子は、好ましくは少なくとも３０ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも５０ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも８０ｗｔ．％の求核性ポリマーを含有する。

特に好ましい実施形態によると、凝集物粒子に利用される水溶性求核性ポリマーは、水中で比較的緩徐に溶解する。本明細書で以前に説明された通り、求電子性ポリオキサゾリンが水溶性求核性ポリマーと比較的緩徐な速度で反応する際、求電子性ポリオキサゾリンは、血液及び出血部位の組織中のタンパク質とも反応しうると考えられる。比較的緩徐に溶解する水溶性求核性ポリマーを利用することにより、溶解された求電子性ポリオキサゾリンが、血液及び組織中のタンパク質だけでなく、（緩徐な）水溶性求核性ポリマーと反応する機会を有し、それにより強力な均質な封止ゲルが作成される。

高分子量を有する水溶性求核性ポリマーは、水中で比較的緩徐に溶解する傾向がある。したがって、非常に好ましい実施形態では、求核性ポリマー粒子に含有される水溶性求核性ポリマーは、少なくとも３ｋＤａ、より好ましくは少なくとも１０ｋＤａ、最も好ましくは２０～３，０００ｋＤａの分子量を有する。

求核性ポリマーは、好ましくは少なくとも４個の反応性求核性基、より好ましくは少なくとも８個の反応性求核性基、最も好ましくは少なくとも１０個の反応性求核性基を含有する。最も好ましくは、これらの反応性求核性基は、アミン基、最も好ましくは第一級アミン基である。

求核性ポリマー粒子中で好適に使用できる水溶性求核性ポリマーの例として、タンパク質、キトサン、求核性ポリオキサゾリン、求核性ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン及びこれらの組合せが挙げられる。より好ましくは、求核性ポリマーは、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、求核性ポリオキサゾリン及びこれらの組合せから選択される。

特に有利な実施形態によると、本発明によって利用される求核性ポリマー粒子は、凝固プロセスを加速させることによって止血を可能にする。コラーゲンは、凝固カスケードの内因性経路を活性化することができる。コラーゲンは、血小板活性化、凝結及び血栓形成のためのマトリックスとして作用する大きな表面積を有する。ゼラチン粒子は、血流を制限し、凝塊形成のためのマトリックスを提供する能力を有する。したがって、非常に好ましい実施形態では、求核性ポリマーは、ゼラチン、コラーゲン及びこれらの組合せから選択される。最も好ましくは、求核性ポリマーは、ゼラチン、さらにより好ましくは架橋ゼラチンである。

架橋ゼラチンは、好ましくは３０～３，０００ｋＤａの範囲、より好ましくは４００～２，０００ｋＤａの範囲、最も好ましくは５００～１，５００ｋＤａの範囲の分子量を有する。

架橋ゼラチンの第一級アミンの平均含有量は、還元架橋ゼラチン１μｇあたり５×１０^－４～２×１０^－２μｍｏｌ、より好ましくは１．０×１０^－３～１．０×１０^－２μｍｏｌの第一級アミンの範囲である。

別の有利な実施形態によると、求核性ポリマーは、求核性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは、求核性ＰＥＧは、少なくとも３個、より好ましくは少なくとも５個、最も好ましくは８個の反応性求核性基を含有する。

さらなる好ましい実施形態によると、求核性ポリマーはキトサンである。キトサンは、キチン（ポリ－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン）の生分解性の、非毒性の複雑な炭水化物誘導体であり、天然に存在する物質である。キトサンは、キチンの脱アセチル化形態である。本発明によって適用されるキトサンは、好ましくは脱アセチル化度が７０％より高い。本発明によって利用されるキトサンは、少なくとも５ｋＤａ、より好ましくは１０～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。

別の非常に有利な実施形態によると、求核性ポリマーは求核性ポリオキサゾリンである。好ましくは、求核性ポリオキサゾリンは、少なくとも３個、より好ましくは少なくとも５個、最も好ましくは８～２０個の反応性求核性基を含有する。

ゼラチン、コラーゲン及びキトサンなどの天然に存在する求核性バイオポリマーと比べ、求核性ポリオキサゾリン及び求核性ＰＥＧなどの合成求核性ポリマーを使用すると、これらの合成求核性ポリマーを含有する粒子凝集物がより予想可能な（再現性の良い）止血特性を示すという利点がもたらされる。

水溶性求核性ポリマーの反応性求核性基は、好ましくはアミン基、チオール基及びこれらの組合せから選択される。

好ましい実施形態によると、水溶性求核性ポリマーは２個以上のアミン基を含有し、求電子性ポリオキサゾリン中の反応性求電子性基は、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、ホスホン酸エステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、ｐ－ニトロチオフェニルエステル、酸ハロゲン化物基、無水物、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、チオイソシアネート、イソシアノ、エポキシド、活性化ヒドロキシル基、グリシジルエーテル、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イミドエステル、ジヒドロキシフェニル誘導体及びこれらの組合せから選択される。

別の好ましい実施形態によると、水溶性求核性ポリマーは２個以上のチオール基を含有し、求電子性ポリオキサゾリンの反応性求電子性基は、ハロアセタール、オルトピリジルジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ジヒドロキシフェニル誘導体、ビニル、アクリレート、アクリルアミド、ヨードアセトアミド、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジル（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｍｉｄｙｌ）エステル及びこれらの組合せから選択される。より好ましくは、反応性求電子性基は、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ハロアセタール、マレイミド又はジヒドロキシフェニル誘導体及びこれらの組合せから選択される。最も好ましくは、反応性求電子性基は、マレイミド又はジヒドロキシフェニル誘導体及びこれらの組合せから選択される。

特に好ましい実施形態によると、求電子性ポリオキサゾリンによって提供される反応性求電子性基の総数と、求核性ポリマーによって提供される反応性求核性基の総数の間の比は、１：１．５～１．５：１の範囲、より好ましくは１：１．２～１．２：１の範囲、最も好ましくは１：１．１～１．１：１の範囲である。

本発明者らは、粒子凝集物が１～２０ｗｔ．％、より好ましくは２．５～１５ｗｔ．％、最も好ましくは５～１０ｗｔ．％の非反応性非イオン性ポリマーを含有する場合、脾臓及び腎臓などの臓器に対して優れた接着を示す粒子凝集物が得られることを予想外に発見した。この非反応性非イオン性ポリマーは、反応性求電子性基又は反応性求核性基を含有しない。

非常に好ましい実施形態では、凝集された粒子は、非反応性非イオン性ポリマーでコーティングされる。

非反応性非イオン性ポリマーは、好ましくは４０～７０℃の範囲、より好ましくは４５～６５℃の範囲、最も好ましくは５０～６０℃の範囲の融点を有する。ここで、融点は、ポリマーが完全に溶融する温度を指す。

本発明の凝集粒子に好適に適用可能な非反応性非イオン性ポリマーの例として、ポロキサマー、ポリエチレングリコール及びこれらの組合せが挙げられる。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接したポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマーであり、式（Ｉ）

（式中、ａは１０～１１０の整数であり、ｂは２０～６０の整数である）
によって表される。ａが８０でありｂが２７であるとき、このポリマーはポロキサマー１８８として公知である。本発明で有用な他の公知のポロキサマーは、ポロキサマー２３７（ａ＝６４及びｂ＝３７）、ポロキサマー３３８（ａ＝１４１及びｂ＝４４）及びポロキサマー４０７（ａ＝１０１及びｂ＝５６）である。公知であり、本発明で有用でありうるさらなるポロキサマーとして、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８及びポロキサマー３３５が挙げられる。

特に好ましい実施形態によると、非反応性非イオン性ポリマーは、ポロキサマー、さらにより好ましくは２，０００～１８，０００の平均分子質量を有するポロキサマー、最も好ましくは７，０００～１０，０００の平均分子質量を有するポロキサマーである。

粒子凝集物に適用されるポロキサマーは、好ましくは室温で固体である。

別の有利な実施形態では、本発明の止血粉末は生体再吸収性であり、粉末は腹部外科手術で使用することができる。

本発明の別の態様は、
（ａ）共有結合の形成下で血液中のアミン基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求電子性基を担持する求電子性ポリオキサゾリンを含有する求電子性ポリオキサゾリン粒子、及び
（ｂ）求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの間の共有結合の形成下で求電子性ポリオキサゾリンの反応性求電子性基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求核性基を担持する水溶性求核性ポリマーを含有する求核性ポリマー粒子
の止血粒子凝集物を調製する方法であって、前記方法が、１００重量部の求電子性ポリオキサゾリン粒子と１０～１０００重量部の求核性ポリマー粒子を非水性造粒液体の存在下で組み合わせるステップを含む、方法に関する。

本発明の方法で利用される求電子性ポリオキサゾリン粒子は、好ましくは本明細書で以前に記載された求電子性ポリマー粒子と同一である。同様に、利用される求核性ポリマー粒子は、本明細書で以前に記載された求核性ポリマー粒子と同一である。

好ましい実施形態によると、本発明の方法で利用される求電子性ポリオキサゾリン粒子と求核性ポリマー粒子の両方は、水分含有量が２ｗｔ．％未満、より好ましくは１ｗｔ．％未満である。そのような低い水分含有量を達成するために、造粒前にポリマー粒子を乾燥する必要がある場合がある。

求電子性ポリオキサゾリンは、好ましくは１ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは０．２ｍｇ／Ｌ未満、最も好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ未満の２０℃の非水性造粒液体への溶解度を有する。

求核性ポリマーは、好ましくは少なくとも５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは２０～２００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは４０～１５０ｍｇ／Ｌの２０℃の非水性造粒液体への溶解度を有する。

好ましい実施形態では、方法は、１００重量部の求電子性ポリオキサゾリン粒子と、２０～４００重量部、より好ましくは５０～２００重量部の求核性ポリマー粒子を非水性造粒液体の存在下で組み合わせるステップを含む。

本発明の方法で利用される非水性造粒液体の量は、方法で使用される求電子性ポリオキサゾリン粒子と求核性ポリマー粒子を組み合わせた量の０．５～５重量％の範囲であることが好ましい。より好ましくは、利用される非水性造粒液体の量は、求電子性ポリオキサゾリン粒子と求核性ポリマー粒子を組み合わせた量の１～４％、最も好ましくは１．５～３重量％の範囲である。

特に好ましい実施形態によると、方法は、求電子性ポリオキサゾリン粒子を非水性造粒液体で湿潤させるステップ、その後湿潤されたポリオキサゾリン粒子を求核性ポリマー粒子と組み合わせるステップを含む。この特定の実施形態は、粒径及び組成の点で非常に均質な造粒物を生じるという利点をもたらす。

粉末ブレンドの調製に使用される求電子性ポリオキサゾリン粒子は、好ましくは１～１００μｍの範囲、より好ましくは５０～５０μｍの範囲、最も好ましくは１０～４０μｍの範囲の体積加重平均直径（Ｄ［４，３］）を有する。

粉末ブレンドの調製に使用される求核性ポリマー粒子の体積加重平均直径（Ｄ［４，３］）は、好ましくは１０～３００μｍの範囲、より好ましくは１５～２００μｍの範囲、最も好ましくは２０～１００μｍの範囲である。

本発明の方法によって得られる凝集粉末は、好ましくは１２～１０００μｍの範囲、より好ましくは２０～５００μｍの範囲、最も好ましくは３０～３００μｍの範囲の体積加重平均直径（Ｄ［４，３］）を有する。

湿式造粒で利用される非水性造粒液体は、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、ジエチルエーテル、ヘプタン、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、アセトン及びこれらの混合物から選択される有機溶媒を少なくとも６０ｗｔ．％含有する。より好ましくは、非水性造粒液体は、イソプロピルアルコール、エタノール及びこれらの混合物から選択される有機溶媒を少なくとも６０ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも８５ｗｔ．％含有する。さらにより好ましくは、非水性造粒液体は、イソプロピルアルコールを少なくとも６０ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも８５ｗｔ．％含有する。

非水性造粒液体は、好ましくは１ｗｔ．％以下の水、より好ましくは０．１ｗｔ．％以下の水を含有する。

本発明の方法は、造粒結合剤を使用する必要がないという利点をもたらす。したがって、方法の好ましい実施形態では、造粒結合剤は使用されない。特に好ましい実施形態によると、調製方法で使用される材料は、求電子性ポリオキサゾリン粒子、求核性ポリマー粒子及び非水性造粒液体のみである。

本発明の粒子凝集物は、有利には止血シート内に適用され、その止血特性を改善することができる。したがって、本発明のまた別の態様は、
三次元の相互接続した間隙空間を含む粘着性繊維状担体構造体、及び
間隙空間内に分散されている、本明細書で以前に記載された止血粉末
を含む、生体適合性の可撓性止血シートに関する。

特に好ましい実施形態によると、粘着性繊維状担体構造体は耐水性である。

繊維状担体構造体全体に分布される止血粉末中の求電子性ポリオキサゾリンは、シートが、間隙空間に浸透できる血液又は他の水性体液と接触すると急速に溶解する。したがって、シートを創傷部位に貼り付けるとすぐに、一方では求電子性ポリオキサゾリン、他方では求核性ポリマー粒子中の求核性ポリマー、血液タンパク質及び組織の間に急速な共有結合性架橋が生じ、創傷表面を封止して出血を停止させるゲルの形成がもたらされ、さらには止血シートの組織への強力な接着がもたらされる。本発明によって適用されるキトサンは、好ましくは７０％以上の脱アセチル化度を有する。耐水性繊維状担体構造体は、貼付中及び後に機械的強度をもたらし、過剰な膨張を防止する。

求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーは、単一の粒子内に含有されるため、これら２種の反応性成分が止血シート全体に均質に分布できること、輸送及び取扱い時に分離が生じないこと、並びに粒子凝集物が血液と接触する際に、これらの成分が即座に互いに反応できることが保証される。

特に好ましい実施形態によると、本発明の止血シートは生体吸収性である、つまり担体構造体、粒子凝集物及び止血シートの任意の他の成分は、最終的に身体に吸収される。担体構造体及び粒子凝集物の吸収には、典型的にその中に含有されるポリマーの化学分解（例えば、加水分解）が必要である。ヒトの身体による止血シートの完全な生体吸収は、典型的に１～１０週間、好ましくは２～８週間で達成される。

本発明の止血シートは、典型的に０．５～２５ｍｍの非圧縮平均厚さを有する。より好ましくは、非圧縮平均厚さは、１～１０ｍｍの範囲、最も好ましくは１．５～５ｍｍの範囲である。

止血シートの寸法は、好ましくはシートの上部及び下部が、それぞれ少なくとも２ｃｍ^２、より好ましくは少なくとも１０ｃｍ^２、最も好ましくは２５～５０ｃｍ^２の表面積を有するようなものである。典型的に、シートは長方形の形状であり、長さ２５～２００ｍｍ及び幅２５～２００ｍｍである。

止血シートは、好ましくは２００ｍｇ／ｃｍ^３未満、より好ましくは１５０ｍｇ／ｃｍ^３未満、最も好ましくは１０～１００ｍｇ／ｃｍ^３の非圧縮密度を有する。

本発明の止血シートは、好ましくは本質的に無水である。典型的に、止血シートは、５ｗｔ．％以下、より好ましくは２ｗｔ．％以下、最も好ましくは１ｗｔ．％以下の水分含有量を有する。

止血シートの吸水能は、好ましくは少なくとも５０％であり、より好ましくは１００％～８００％の範囲、最も好ましくは２００％～５００％の範囲にある。

本発明の止血シートは、好ましくは滅菌である。

本発明の止血シートにおける繊維状担体構造体の使用は、止血粉末が、この担体構造体全体に困難なく均質に分布できるという利点をもたらす。そのような均質な分布は、例えば発泡担体構造体で達成することははるかに困難である。

繊維状担体構造体の繊維は、好ましくは１～５００μｍ、より好ましくは２～３００μｍ、最も好ましくは５～２００μｍの平均直径を有する。繊維の平均直径は、好適には顕微鏡を使用して決定することができる。

典型的に、繊維状担体構造体の繊維の少なくとも５０ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも８０ｗｔ．％が、１～３００μｍの直径及び少なくとも１ｍｍの長さを有する。

好ましくは、繊維状担体構造体の繊維の少なくとも５０ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも８０ｗｔ．％が、少なくとも１０００のアスペクト比（長さの直径に対する比）を有する。

本発明によって利用される繊維状担体構造体は、好ましくはフェルト構造体、織物構造体又は編物構造体である。最も好ましくは、繊維状担体構造体はフェルト構造体である。ここで、「フェルト構造体」という用語は、繊維にマット加工を施してまとめてプレスし、粘着性材料を形成することによって生成される構造体を指す。

繊維状担体構造体は、ゼラチン、コラーゲン、セルロース、変性セルロース、カルボキシメチルデキストラン、ＰＬＧＡ、ヒアルロン酸ナトリウム／カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、キトサン又はこれらの組合せを含有する繊維を少なくとも５０ｗｔ．％、より好ましくは少なくとも８０ｗｔ．％、最も好ましくは少なくとも９０ｗｔ．％含む。

本発明の実施形態では、繊維状担体構造体は酸化再生セルロースを含まない。

好ましい繊維状担体構造体は、空気透過性が少なくとも０．１Ｌ／分×ｃｍ^２、より好ましくは少なくとも０．５Ｌ／分×ｃｍ^２である開気孔構造を有する。空気透過性は、ＥＮ ＩＳＯ ９２３７：１９９５（繊維－布の空気透過性の決定）によって決定される。

繊維状担体構造体中の繊維は、エレクトロスピニング、エレクトロブローンスピニング、及び高速回転噴霧器スピニングなどの当技術分野で公知の方法によって生成されてもよい。高速回転噴霧器スピニングによる繊維状担体構造体の生成は、米国特許出願公開第２０１５／００１０６１２号に記載される。繊維状担体構造体として、市販の止血繊維状シートを使用することもできる。

止血粉末は、好ましくは繊維状担体構造体の５～９０重量％、より好ましくは１０～８０重量％、さらにより好ましくは２０～７５重量％、最も好ましくは５０～７０重量％の量で本発明の止血シート中に存在する。

本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。

概して、乾燥後の残留水分（すなわち、乾燥粉末、造粒物及び／又は粘着性繊維状担体構造体中の残留水）が明示されない場合は常に、レベルは２．０％ｗ／ｗ未満である。

（ＮＨＳ－ＰＯｘの調製）
２０％ＮＨＳエステル基を含有するＮＨＳ側鎖活性化ポリ［２－（エチル／ヒドロキシ－エチル－アミド－エチル／ＮＨＳ－エステル－エチル－エステル－エチル－アミド－エチル）－２－オキサゾリン］ターポリマー（＝ＥＬ－ＰＯｘ、２０％ＮＨＳ）を、以下のように合成した：
ポリ［２－（エチル／メトキシ－カルボニル－エチル）－２－オキサゾリン］コポリマー（ＤＰ＝＋／－１００）を、６０％ ２－エチル－２－オキサゾリン（ＥｔＯｘ）及び４０％ ２－メトキシカルボニル－エチル－２－オキサゾリン（ＭｅｓｔＯｘ）を使用してＣＲＯＰによって合成した。４０％ ２－メトキシカルボニル－エチル基（^１Ｈ－ＮＭＲ）を含有する統計的コポリマーが得られた。第二に、４０％ ２－メトキシカルボニル－エチル基を含有するポリマーをエタノールアミンと反応させ、４０％ ２－ヒドロキシ－エチル－アミド－エチル基（^１Ｈ－ＮＭＲ）を有するコポリマーを得た。その後、２－ヒドロキシ－エチル－アミド－エチル基の半分を無水コハク酸と反応させ、^１Ｈ－ＮＭＲによって６０％ ２－エチル基、２０％ ２－ヒドロキシ－エチル－アミド－エチル基及び２０％ ２－カルボキシ－エチル－エステル－エチル－アミド－エチル基を有するターポリマーを得た。最後に、２－カルボキシ－エチル－エステル－エチル－アミド－エチル基を、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）によって活性化し、ＥＬ－ＰＯｘ、２０％ＮＨＳを得た。^１Ｈ－ＮＭＲによると、ＮＨＳ－ＰＯｘは２０％ＮＨＳ－エステル基を含有していた。ＮＨＳ－ＰＯｘを２～８℃の間で水中に溶解し（３００ｍＬ中６０ｇ）、マイナス８０℃で３０分間冷却して凍結乾燥した。そのようにして得られた凍結乾燥粉末を、Ｒｏｔａｖａｐ中４０℃で、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定によって決定される水分含有量が０．８％ｗ／ｗ未満になるまで乾燥した。この乾燥（白色）粉末を、ボールミル（Ｒｅｔｃｈ ＭＭ４００）を使用して平均粒径が４０μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまで粉砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

（ＮＨＳ－ＰＯｘ粉末の染色）
２０ｇのＮＨＳ－ＰＯｘ粉末を水に溶解し、高速分散装置（Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ、ＩＫＡ）を使用して５０ｍｇのＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ ＦＣＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した。混合（２分）直後、溶液を－７８℃で凍結し、その後一晩凍結乾燥した。そのようにして得られた凍結乾燥粉末を、Ｒｏｔａｖａｐ中４０℃で、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定によって決定される残留水分含有量が０．８％ｗ／ｗ未満になるまで乾燥した。次に、乾燥（青色）粉末を、ボールミル（Ｒｅｔｃｈ ＭＭ４００）を使用して平均粒径が４０μｍ以下（Ｄ［４，３］）の青色染色ＮＨＳ－ＰＯｘ粉末になるまで粉砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

（ＮＨＳ－ＰＯｘの架橋のＰＤＩ（多分散指数）に対する効果）
２，２’－（エチレンジオキシ）－ビス－（エチルアミン）（ＥＤＥＡ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｗ１４８．２）の８０μｇ／ｍＬ溶液を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）とイソプロパノール（ＩＰＡ）の混合物中、ＥＤＥＡ８０ｍｇを１０ｍＬのＤＣＭ／ＩＰＡ ９５：５（ｖ／ｖ）に溶解することによって調製した。この溶液をＤＣＭ／ＩＰＡ ９５：５（ｖ／ｖ）で１０倍希釈し、ＥＤＥＡ溶液２６．８μＬを、ＮＨＳ基に対して０．０５モル％のアミン基に相当するＤＣＭ／ＩＰＡ ９５：５（ｖ／ｖ）中ＮＨＳ－ＰＯｘの０．５ｇ／ｍＬ溶液１００μＬに添加した。ＥＤＥＡ溶液の添加直後、ボルテックスミキサーを使用して反応混合物を十分に混合した。反応混合物を４０℃で３時間かき混ぜ、すべての揮発物を減圧下で回転蒸発によって除去した。

乾燥試料を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の移動相である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中で再構成した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定した。得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは２．５以上であった。ＥＤＥＡの添加を伴わないＤＣＭ／ＩＰＡ ９５：５（ｖ／ｖ）中ＮＨＳ－ＰＯｘの０．５ｇ／ｍＬ溶液では、同じＳＥＣ手順後に１．５のＰＤＩが得られ、これはＮＨＳ基のわずか０．０５モル％の架橋で、ポリマーのＰＤＩが早くも顕著に増加することを示す。

（ＮＵ－ＰＯｘの調製）
アルキル側鎖にエチル及びアミン基を含有するポリオキサゾリンを、ＥｔＯｘ及びＭｅｓｔＯｘのＣＲＯＰ、並びにそれに続くエチレンジアミンでのメチルエステル側鎖のアミド化によって合成し、ポリ（２－エチル／アミノエチルアミドエチル－２－オキサゾリン）コポリマー（ＮＵ－ＰＯｘ）を得た。^１Ｈ－ＮＭＲによると、ＮＵ－ＰＯｘは１０％ＮＨ_２を含有していた。ＮＵ－ＰＯｘを２～８℃の間で水中に溶解し（３００ｍＬ中６０ｇ）、マイナス８０℃で３０分間冷却して凍結乾燥した。そのようにして得られた凍結乾燥粉末を、Ｒｏｔａｖａｐ中４０℃で、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定によって決定される水分含有量が０．８％ｗ／ｗ未満になるまで乾燥した。この乾燥粉末を、平均粒径が１００μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまで卓上粉砕機で粉砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

（反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ顆粒の調製）
青色又は白色（非染色）ＮＨＳ－ＰＯｘ粉末を、高せん断混合機中で約１～２％ｗ／ｗのＩＰＡを含有する均質な雪状粉末が得られるまで、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で湿潤させた。この後、ＮＵ－ＰＯｘ粉末を添加して混合した。湿潤された青色ＮＨＳ－ＰＯｘ粉末を、１：０．６のモル比でＮＵ－ＰＯｘ粉末と混合し、前記モル比は、ＮＨＳ－ＰＯｘによって提供されるＮＨＳ基の数のＮＵ－ＰＯｘによって提供されるアミン基の数に対する比を指す。湿潤された非染色ＮＨＳ－ＰＯｘ粉末も、ＮＵ－ＰＯｘ粉末と他のモル比（１：０．８；１：１及び１：１．２）で混合した。

混合後、^１Ｈ－ＮＭＲによって決定されるＩＰＡ含有量が０．１％ｗ／ｗ未満になるまで、湿潤造粒物を減圧下で乾燥した。乾燥した造粒物を、ボールミル（Ｒｅｔｃｈ ＭＭ４００）を使用して平均粒径が５０μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまで粉砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

そのようにして得られた造粒物の粒径分布は、およそ９０ｖｏｌ．％＜９０μｍ、５０ｖｏｌ．％＜４５μｍ及び１０ｖｏｌ．％＜１５μｍであった。

^１Ｈ－ＮＭＲ分光法を使用し、ＮＨＳ－ＰＯＸ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物（１：１）を分析した。２５ｍｇの造粒物を、２０分間超音波処理することによってトリフルオロ酢酸（０．２０ｍＬ）に溶解した。造粒物の完全な溶解後、試料を、内部標準としてマレイン酸（２．５ｍｇ／ｍＬ）を含有する重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ_６）（０．８０ｍＬ）で希釈し、ＮＭＲ管に移し、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、造粒物中に存在するＮＨＳ及びアミン基のモル比とともに、ＮＨＳ－ＰＯｘに結合したＮＨＳの量を計算することができる。造粒物中のＮＨＳ－ＰＯｘに結合したＮＨＳの量は、ＮＨＳ－ＰＯｘ出発材料に結合したＮＨＳの量と同等であり、造粒中に崩壊又は架橋が生じないことを示す。

ＮＭＲ試料における全ポリマー回収率、すなわち、ＮＨＳ－ＰＯｘとＮＵ－ＰＯｘの組合せを、既知の量の内部標準（マレイン酸）、並びに異なる濃度のＮＨＳ－ＰＯｘ及びＮＵ－ＰＯｘの記録された^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから作成した検量線を使用して決定した。全ポリマー回収率は９９パーセントと測定され、不溶性の架橋材料が形成されなかったことを示す。

ＮＨＳ－ＰＯＸ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物（１：１）を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。２０ｍｇの造粒物を、無水酢酸（１．００ｍＬ）で５０℃で１時間処理した。次に、メタノール（２．００ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃でさらに１時間撹拌した。アリコート（０．７５ｍＬ）を取り、すべての揮発物を減圧下で除去した。試料を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（２．５０ｍＬ）に溶解した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは１．５以下であり、造粒中に架橋が生じなかったことを示す。このサイズ排除クロマトグラフィー方法の分析検証により、０．０５ｍｏｌ％のレベルのＮＨＳ－ＰＯｘとＮＵ－ＰＯｘの意図的な架橋によってＰＤＩが２．５より高くまで増加したことが示された。

（共凍結乾燥によるＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ混合物の調製）
共凍結乾燥されたＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ粉末を以下の通り調製した：２．４ｇのＮＵ－ＰＯｘを４０ｍＬの氷酢酸に溶解した。ポリマーの完全な溶解後、２．０ｇのＮＨＳ－ＰＯｘを添加し、試料を３０分間超音波処理した。溶液を液体窒素で瞬間凍結し、凍結乾燥した。得られた粘性固体を減圧下（＜１ｋＰａ）でさらに乾燥させ、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。
共凍結乾燥されたＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ試料は、ＮＨＳ－ＰＯｘとＮＵ－ＰＯｘとの間の高い架橋度に起因し、トリフルオロ酢酸にも無水酢酸にも可溶性でないため、^１Ｈ－ＮＭＲ分光法及びサイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができなかった。

（乾式混合によるＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ混合物の調製）
ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ混合物を以下の通り調製した：２ｇのＮＨＳ－ＰＯｘ及び２ｇのＮＵ－ＰＯｘを、タンブル混合によって３０分間乾式混合した。得られた粉末を減圧下（＜１ｋＰａ）で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

^１Ｈ－ＮＭＲ分光法を使用して粉末を分析した。２５ｍｇの粉末を、２０分間超音波処理することによってトリフルオロ酢酸（０．２０ｍＬ）に溶解した。粉末の完全な溶解後、試料を、内部標準としてマレイン酸（２．５ｍｇ／ｍＬ）を含有する重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ_６）（０．８０ｍＬ）で希釈し、ＮＭＲ管に移し、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳの量は、ＮＨＳ－ＰＯｘと比べて９９パーセントと計算された。

ＮＭＲ試料における全ポリマー回収率、すなわち、ＮＨＳ－ＰＯｘとＮＵ－ＰＯｘの組合せを、既知の量の内部標準（マレイン酸）、並びに異なる濃度のＮＨＳ－ＰＯｘ及びＮＵ－ＰＯｘの記録された^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから作成した検量線を使用して決定した。全ポリマー回収率は１０１パーセントと測定され、不溶性の架橋材料が形成されなかったことを示す。

粉末を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。２０ｍｇの粉末を、無水酢酸（１．００ｍＬ）で５０℃で１時間処理した。次に、メタノール（２．００ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃でさらに１時間撹拌した。アリコート（０．７５ｍＬ）を取り、すべての揮発物を減圧下で除去した。試料を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（２．５０ｍＬ）に溶解した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは１．５以下であり、乾式混合中に架橋が生じなかったことを示す。

（ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ（封鎖）顆粒の調製）
凍結乾燥によって以下の粉末を生成した。
〔リン酸塩粉末〕
４２．６６ｇのリン酸ナトリウム二塩基性二水和物及び２６．５６ｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物を１７０ｍＬの超純水に溶解した。完全な溶解後、０．１モルの水酸化ナトリウム水溶液６２ｍＬを添加することにより、ｐＨを７に調整した。溶液を液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。
〔炭酸塩粉末〕
２５．３１ｇの炭酸ナトリウム及び２０．０６ｇの炭酸水素ナトリウムを３５０ｍＬの超純水に溶解することにより、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの１：１モル／モル混合物を調製した。溶液を液体窒素で瞬間凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。
〔ＮＨＳ－ＰＯｘ／クエン酸粉末〕
３．０８ｇのクエン酸を１０ｍＬの超純水に溶解した。溶液を２～８℃の間で冷却した。次に、７．００ｇのＮＨＳ－ＰＯｘを添加し、高速分散装置（Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ、ＩＫＡ）を用いて溶解した。混合（２分）直後、溶液を液体窒素で瞬間凍結し、一晩凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。
〔ＮＵ－ＰＯｘ／炭酸塩粉末〕
次に、炭酸塩を含有するＮＵ－ＰＯｘ粉末を以下の通り生成した：９．６０ｇのＮＵ－ＰＯｘ及び０．８０ｇの炭酸塩粉末を４０ｍＬの超純水に溶解した。溶液を液体窒素を使用して瞬間凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥させ、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ（封鎖）造粒物を以下の通り調製した：６．５０ｇのＮＨＳ－ＰＯｘ／クエン酸粉末及び５．５０ｇのリン酸塩粉末を高せん断混合機中で混合した。均質な混合物を得た後、均質な雪状粉末が形成されるまで、混合を続けながら０．４０ｍＬのＩＰＡをゆっくり添加した。次に、５．４１ｇのＮＵ－ＰＯｘ／炭酸塩粉末を添加し、均質な造粒物が形成された時点で混合を停止した。造粒物を、ＩＰＡ含有量が０．１％ｗ／ｗ未満になるまで減圧下で乾燥した。乾燥した造粒物を、平均粒径が１００μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまでコーヒーグラインダーで摩砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

（反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ／Ｐ１８８顆粒の調製）
上述の反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ顆粒をＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１８８でコーティングした。ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物を、Ｐ１８８粉末とともに高せん断混合機中６５℃で１０分間加熱し、その後周囲条件まで冷却することにより、２．５％ｗ／ｗのＰ１８８でコーティングされた反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物を調製した。コーティング造粒物を、ボールミル（Ｒｅｔｃｈ ＭＭ４００）を使用して平均粒径が４０μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまで粉砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

そのようにして得られた造粒物の粒径分布は、およそ９０ｖｏｌ．％＜８０μｍ、５０ｖｏｌ．％＜４０μｍ及び１０ｖｏｌ．％＜１０μｍであった。

^１Ｈ－ＮＭＲ分光法を使用し、ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ／Ｐ１８８造粒物を分析した。２５ｍｇの粉末を、２０分間超音波処理することによってトリフルオロ酢酸（０．２０ｍＬ）に溶解した。造粒物の完全な溶解後、試料を重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ_６）（０．８０ｍＬ）で希釈し、ＮＭＲ管に移し、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳの量は、ＮＨＳ－ＰＯｘと比べて９８パーセントと計算された。

ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ／Ｐ１８８造粒物を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。２０ｍｇの造粒物を、無水酢酸（１．００ｍＬ）で５０℃で１時間処理した。次に、メタノール（２．００ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃でさらに１時間撹拌した。アリコート（０．７５ｍＬ）を取り、すべての揮発物を減圧下で除去した。試料を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（２．５０ｍＬ）に溶解した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは１．５以下であり、造粒中に架橋が生じなかったことを示す。

（還元架橋ゼラチン（ＲＸＬ）の調製）
還元架橋ゼラチン（ＲＸＬ）を３つの手順に従って調製した：
１２ｇのゼラチン粉末（ジェリータ－ＳＰＯＮ（Ｇｅｌｉｔａ－ＳＰＯＮ）（登録商標）、Ｇｅｌｉｔａ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ）を、４０℃で２時間撹拌することによって０．１モルの水酸化ナトリウム水溶液３５０ｍＬに溶解した。透明な溶液を得た後、混合物を周囲温度まで冷却し、１．０モルの塩酸水溶液３２．５ｍＬを添加することにより、ｐＨを７に調整した。液体窒素を使用して溶液を瞬間凍結し、凍結乾燥させた。次に、粉末をコーヒーグラインダーで摩砕し、減圧下で乾燥させ、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。以下、この還元架橋ゼラチンをＲＸＬ－ＬＳ（低塩分）と呼ぶ。
１２ｇのゼラチン粉末（ジェリータ－ＳＰＯＮ（登録商標）、Ｇｅｌｉｔａ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ）を、４０℃で１０分間撹拌することによって１．０モルの水酸化ナトリウム水溶液３６０ｍＬに溶解した。得られた透明な溶液を周囲温度まで冷却し、濃縮塩酸溶液（３７％ｗ／ｗ）３０ｍＬを添加することにより、ｐＨを７に減少させた。
液体窒素を使用して溶液を瞬間凍結し、凍結乾燥させた。次に、粉末をコーヒーグラインダーで摩砕し、減圧下で乾燥させ、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。以下、この還元架橋ゼラチンをＲＸＬ－ＨＳ（高塩分）と呼ぶ。
１２ｇのゼラチン粉末（ジェリータ－ＳＰＯＮ（登録商標）、Ｇｅｌｉｔａ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ）を、４０℃で２時間撹拌することによって０．１モルの水酸化ナトリウム水溶液３５０ｍＬに溶解した。透明な溶液を得た後、混合物を周囲温度まで冷却し、１．０モルの塩酸水溶液３２．５ｍＬを添加することにより、ｐＨを７に調整した。次いで、４００ｍＬのメタノールを溶液に添加し、溶液を－２０℃の冷凍庫に１６時間入れてＲＸＬの沈殿を生じさせ、液体相をデカントすることによって沈殿を単離した。ＲＸＬを１００ｍＬずつのメタノールで３回洗浄し、その後真空下で乾燥した。粗生成物を２００ｍＬの超純水に溶解し、液体窒素で瞬間凍結して凍結乾燥させた。粉末をコーヒーグラインダーで摩砕し、減圧下で乾燥させ、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。以下、この還元架橋ゼラチンをＲＸＬ（塩分なし）と呼ぶ。

（反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ顆粒（塩分なし、低塩分及び高塩分）の調製）
反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ顆粒を以下の通り調製した：５ｇの青色ＮＨＳ－ＰＯｘ粉末を、高せん断混合機中で約１～２％ｗ／ｗのＩＰＡを含有する均質な雪状粉末が得られるまで、ＩＰＡで湿潤させた。この後、５ｇのＲＸＬ、ＲＸＬ－ＬＳ又はＲＸＬ－ＨＳ粉末を添加して混合した。混合後、^１Ｈ－ＮＭＲによって決定されるＩＰＡ含有量が０．１％ｗ／ｗ未満になるまで、湿潤造粒物を減圧下で乾燥した。乾燥した造粒物を、平均粒径が９０μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまでコーヒーグラインダーで摩砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

そのようにして得られた造粒物の粒径分布は、およそ９０ｖｏｌ．％＜１９０μｍ、５０ｖｏｌ．％＜６０μｍ及び１０ｖｏｌ．％＜１５μｍであった。

ＲＸＬを含有する造粒物を^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析によって分析した。この目的のために、５％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）（１．０ｍＬ）を、２５ｍｇの造粒物に添加した。試料を２０分間超音波処理することにより、ＮＨＳ－ＰＯｘを選択的に抽出した。分散液を０．２２μｍフィルターに通し、ＮＭＲ管に移して^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳ量は、ＮＨＳ－ＰＯｘと比べて９８パーセントと計算された。

ＮＭＲ試料におけるＮＨＳ－ＰＯｘの回収率を、トリメチルシランを内部標準として、並びに異なる濃度のＮＨＳ－ＰＯｘの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから作成した検量線を使用して決定した。全ＮＨＳ－ＰＯｘ回収率は１００パーセントと測定され、不溶性の架橋材料が形成されなかったことを示す。

ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ造粒物を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。このために、^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析に使用された溶液からアリコート（０．１５ｍＬ）を取り出した。この溶液を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１．００ｍＬ）で希釈した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは１．５以下であり、ここでも造粒中に架橋が生じなかったことが示される。

（共凍結乾燥によるＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ混合物の調製）
共凍結乾燥されたＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ粉末を以下の通り調製した：２．５ｇのＲＸＬ粉末を２００ｍＬの超純水に溶解した。酢酸を添加することによってｐＨを４．５に調整し、溶液を４℃に冷却した。次いで、２．５ｇのＮＨＳ－ＰＯｘを添加し、高せん断撹拌によって溶解した。ＮＨＳ－ＰＯｘの完全な溶解直後、溶液を液体窒素で瞬間凍結して凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

共凍結乾燥されたＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ粉末を^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析によって分析した。この目的のために、５％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）（１．０ｍＬ）を２５ｍｇの造粒物に添加した。試料を２０分間超音波処理することにより、ＮＨＳ－ＰＯｘを選択的に抽出した。分散液を０．２２μｍフィルターに通し、ＮＭＲ管に移して^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳの量はＮＨＳ－ＰＯｘと比べて９３パーセントと計算された。

ＮＭＲ試料におけるＮＨＳ－ＰＯｘの回収率を、トリメチルシランを内部標準として、並びに異なる濃度のＮＨＳ－ＰＯｘの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから作成した検量線を使用して決定した。全ＮＨＳ－ＰＯｘ回収率は８１パーセントと測定され、ある程度まで不溶性架橋材料が形成されたことを示す。

ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ粉末をサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析に使用された溶液からアリコート（０．１５ｍＬ）を取り出した。この溶液を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１．００ｍＬ）で希釈した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは３．３であり、両方の成分の共凍結乾燥中に架橋が生じたことが示される。

（乾式混合によるＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ混合物の調製）
ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ混合物を以下の通り調製した：２ｇのＲＸＬ粉末及び２ｇのＮＨＳ－ＰＯｘを、タンブル混合によって３０分間乾式混合した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

粉末を^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析によって分析した。この目的のために、５％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）（１．０ｍＬ）を２５ｍｇの造粒物に添加した。試料を２０分間超音波処理することにより、ＮＨＳ－ＰＯｘを選択的に抽出した。分散液を０．２２μｍフィルターに通し、ＮＭＲ管に移して^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳの量は、ＮＨＳ－ＰＯｘと比べて１００パーセントと計算された。

ＮＭＲ試料におけるＮＨＳ－ＰＯｘの回収率を、トリメチルシランを内部標準として、並びに異なる濃度のＮＨＳ－ＰＯｘの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから作成した検量線を使用して決定した。全ＮＨＳ－ＰＯｘ回収率は１０４パーセントと測定され、不溶性架橋材料が形成されなかったことを示す。

ＮＨＳ－ＰＯＸ／ＲＸＬ粉末をサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。このために、^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析に使用された溶液からアリコート（０．１５ｍＬ）を取り出した。この溶液を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１．００ｍＬ）で希釈した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは１．５以下であり、乾式混合中に架橋が生じなかったことが示される。

（炭酸塩を含有する反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ顆粒の調製）
まず、２５．３１ｇの炭酸ナトリウム及び２０．０６ｇの炭酸水素ナトリウムを３５０ｍＬの超純水に溶解することにより、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの１：１モル／モル混合物を調製した。溶液を液体窒素で瞬間凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ／炭酸塩顆粒を以下の通り調製した：高せん断混合機を使用し、５ｇのＲＸＬ－ＬＳ又はＲＸＬ－ＨＳと０．１７８ｇの炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウムを混合した。次に、約１～２％ｗ／ｗのＩＰＡを含有する５ｇの青色ＮＨＳ－ＰＯｘを添加し、均質な粉末が得られるまで混合した。混合後、^１Ｈ－ＮＭＲによって決定されるＩＰＡ含有量が０．１％ｗ／ｗ未満になるまで、湿潤造粒物を減圧下で乾燥した。乾燥した造粒物を、平均粒径が１００μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまでコーヒーグラインダーで摩砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

（反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＨ２－ＰＥＧ顆粒の調製）
ＮＨＳ－ＰＯｘ（６，９ｇ）を、高せん断混合機中で約１～２％ｗ／ｗのＩＰＡを含有する均質な雪状粉末が得られるまで、ＩＰＡで湿潤させた。次に、８．１ｇのアミン－ＰＥＧ－アミン、２アーム、ＭＷ２ｋ（前Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）を添加した（モル比１：１．１６であり、前記モル比は、ＮＨＳ－ＰＯｘによって提供されるＮＨＳ基の数のＰＥＧ－アミンによって提供されるアミン基の数に対する比を指す）。^１Ｈ－ＮＭＲによって決定されるＩＰＡ含有量が０．１％ｗ／ｗ未満になるまで、形成された造粒物を減圧下で乾燥した。乾燥した造粒物を、平均粒径が１００μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまでコーヒーグラインダーで摩砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

^１Ｈ－ＮＭＲ分光法を使用し、ＮＨＳ－ＰＯＸ／ＮＨ２－ＰＥＧ造粒物を分析した。２５ｍｇの造粒物を、２０分間超音波処理することによってトリフルオロ酢酸（０．２０ｍＬ）に溶解した。造粒物の完全な溶解後、試料を重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ_６）（０．８０ｍＬ）で希釈し、ＮＭＲ管に移し、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳの量は、ＮＨＳ－ＰＯｘと比べて９７パーセントと計算された。

ＮＨＳ－ＰＯＸ／ＮＨ２－ＰＥＧ造粒物を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。２０ｍｇの造粒物を、無水酢酸（１．００ｍＬ）で５０℃で１時間処理した。次に、メタノール（２．００ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃でさらに１時間撹拌した。アリコート（０．７５ｍＬ）を取り、すべての揮発物を減圧下で除去した。試料を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（２．５０ｍＬ）に溶解した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは１．５以下であり、造粒中に架橋が生じなかったことを示す。

（デンプン／ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ顆粒の調製）
凍結乾燥によって以下のデンプン粉末を生成した：
〔ＮＨＳ－ＰＯｘ／デンプン粉末〕
２．７９ｇのデンプン（アリスタ（Ａｒｉｓｔａ）（商標）ＡＨ、ＢＡＲＤ）を、高せん断混合機を使用して５０ｍＬの超純水に分散した。分散液を２～８℃の間で冷却し、０．７１ｇのＮＨＳ－ＰＯｘを添加し、高せん断混合機を用いて溶解した。
ＮＨＳ－ＰＯｘの溶解直後、液体窒素を使用して溶液を瞬間凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。
〔ＮＵ－ＰＯｘ／デンプン粉末〕
１．４５ｇのデンプン（アリスタ（商標）ＡＨ、ＢＡＲＤ）を、高せん断混合機を使用して３０ｍＬの超純水に分散した。次に、０．３６ｇのＮＵ－ＰＯｘを添加して溶解させた。ＮＵ－ＰＯｘの完全な溶解後、液体窒素を使用して分散液を瞬間凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。
〔ＮＵ－ＰＯｘ／デンプン／炭酸ナトリウム粉末〕
２．２５ｇのデンプン（アリスタ（商標）ＡＨ、ＢＡＲＤ）を、高せん断混合機を使用して５０ｍＬの超純水に分散した。次に、０．５８ｇのＮＵ－ＰＯｘ及び０．２５ｇの炭酸ナトリウムを添加して溶解させた。ＮＵ－ＰＯｘの完全な溶解後、液体窒素を使用して分散液を瞬間凍結し、凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

これら３種の粉末から２種の造粒物を調製した。デンプン／ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物を以下の通り調製した：
〔デンプン造粒物１〕
１．４１ｇのＮＨＳ－ＰＯｘ／デンプン粉末、１．６８ｇのＮＵ－ＰＯｘ／デンプン粉末及び０．２０ｍＬのＩＰＡを、乳棒及び乳鉢を使用して混合した。均質な造粒物を得た後、残留ＩＰＡを、ＩＰＡ含有量が０．１％ｗ／ｗ未満になるまで減圧下で除去した。乾燥した造粒物を、平均粒径が１００μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまでコーヒーグラインダーを使用して摩砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。
〔デンプン造粒物２〕
１．２０ｇのＮＨＳ－ＰＯｘ／デンプン粉末、１．４５ｇのＮＵ－ＰＯｘ／デンプン／炭酸ナトリウム粉末３及び０．１５ｍＬのＩＰＡを、乳棒及び乳鉢を使用して混合した。均質な造粒物の形成後、残留ＩＰＡを、ＩＰＡ含有量が０．１％ｗ／ｗ未満になるまで減圧下で除去した。乾燥した造粒物を、平均粒径が１００μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまでコーヒーグラインダーを使用して摩砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

（反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ジェリータ Ｓｐｏｎ顆粒の調製）
０．２％ｗ／ｗ未満の水分含有量を有する事前乾燥されたゼラチン粉末（ジェリータ－ＳＰＯＮ（登録商標）、前Ｇｅｌｉｔａ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ）７．０１ｇを、２０，０００ｒｐｍで動作する高せん断混合機を使用してジクロロメタン（２００ｍＬ）に２０分間分散させた。次に、ＮＨＳ－ＰＯｘ（７．０２ｇ）を添加し、５分間撹拌を続けた。ＮＨＳ－ＰＯｘは溶解しなかった。すべての揮発物を減圧下で懸濁液から除去した。得られた粉末を、平均粒径が９５μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまでコーヒーグラインダーを使用して摩砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止し、減圧下でさらに乾燥させ、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

そのようにして得られた造粒物の粒径分布は、およそ９０ｖｏｌ．％＜１９０μｍ、５０ｖｏｌ．％＜８０μｍ及び１０ｖｏｌ．％＜１５μｍであった。

造粒物を^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析によって分析した。この目的のために、５％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）（１．０ｍＬ）を２５ｍｇの造粒物に添加した。試料を２０分間超音波処理することにより、ＮＨＳ－ＰＯｘを選択的に抽出した。分散液を０．２２μｍフィルターに通し、ＮＭＲ管に移して^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳの量は、ＮＨＳ－ＰＯｘと比べて９７パーセントと計算された。

造粒物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析によってさらに分析した。上述の濾過されたＮＨＳ－ＰＯｘ抽出物のアリコート（０．１５ｍＬ）を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１．００ｍＬ）で希釈した。試料をＳＥＣによってポリ（メチルメタクリレート）標準に対して分析したところ、ＰＤＩは１．４５であり、架橋が生じなかったことを示す。

（反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／キトサン顆粒の調製）
反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／キトサン顆粒を以下の通り調製した：５ｇのＮＨＳ－ＰＯｘ粉末を、高せん断混合機中で約１～２％ｗ／ｗのＩＰＡを含有する均質な雪状粉末が得られるまで、ＩＰＡで湿潤させた。この後、５ｇのキトサン粉末（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｗａｓｅｔａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＤＡＣ度８５％）を添加して混合した。混合後、湿潤造粒物を、^１Ｈ－ＮＭＲによって決定されるＩＰＡ含有量が０．１％ｗ／ｗ未満になるまで減圧下で乾燥した。乾燥した造粒物を、平均粒径が２００μｍ以下（Ｄ［４，３］）になるまでコーヒーグラインダーで摩砕し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

そのようにして得られた造粒物の粒径分布は、およそ９０ｖｏｌ．％＜３５０μｍ、５０ｖｏｌ．％＜１８０μｍ及び１０ｖｏｌ．％＜６０μｍであった。

造粒物を^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析によって分析した。この目的のために、５％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）（１．０ｍＬ）を２５ｍｇの造粒物に添加した。試料を２０分間超音波処理することにより、ＮＨＳ－ＰＯｘを選択的に抽出した。分散液を０．２２μｍフィルターに通し、ＮＭＲ管に移して^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳの量は、ＮＨＳ－ＰＯｘと比べて９５パーセントと計算された。

ＮＭＲ試料におけるＮＨＳ－ＰＯｘの回収率を、トリメチルシランを内部標準として、並びに異なる濃度のＮＨＳ－ＰＯｘの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから作成した検量線を使用して決定した。全ＮＨＳ－ＰＯｘ回収率は１０３パーセントと測定され、不溶性架橋材料が形成されなかったことを示す。

ＮＨＳ－ＰＯＸ／キトサン造粒物を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。このために、^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析に使用された溶液からアリコート（０．１５ｍＬ）を取り出した。この溶液を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１．００ｍＬ）で希釈した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは１．５以下であり、造粒中に架橋が生じなかったことが示される。

（共凍結乾燥によるＮＨＳ－ＰＯｘ／キトサン混合物の調製）
共凍結乾燥されたＮＨＳ－ＰＯｘ／キトサン粉末を以下の通り調製した：２．５ｇのキトサン粉末（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｗａｓｅｔａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＤＡＣ度８５％）を、超純水中０．２％ｖ／ｖの酢酸溶液２００ｍＬに溶解した。酢酸を添加することによってｐＨを４．５に調整し、溶液を４℃に冷却した。次いで、２．５ｇのＮＨＳ－ＰＯｘを添加し、高せん断撹拌によって溶解した。ＮＨＳ－ＰＯｘの完全な溶解直後、溶液を液体窒素で瞬間凍結して凍結乾燥した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

造粒物を^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析によって分析した。この目的のために、５％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）（１．０ｍＬ）を２５ｍｇの造粒物に添加した。試料を２０分間超音波処理することにより、ＮＨＳ－ＰＯｘを選択的に抽出した。分散液を０．２２μｍフィルターに通し、ＮＭＲ管に移して^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳの量は、ＮＨＳ－ＰＯｘと比べて１２パーセントと計算され、架橋及び／又は加水分解が生じたことを暗示する。

ＮＭＲ試料におけるＮＨＳ－ＰＯｘの回収率を、トリメチルシランを内部標準として、並びに異なる濃度のＮＨＳ－ＰＯｘの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから作成した検量線を使用して決定した。全ＮＨＳ－ＰＯｘ回収率は１１パーセントと測定され（ＮＭＲの結果と一致する）、不溶性架橋材料が形成されたことを示す。

ＮＨＳ－ＰＯＸ／キトサン造粒物を、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析に使用された溶液からアリコート（０．１５ｍＬ）を取り出した。この溶液を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１．００ｍＬ）で希釈した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは５．４と決定され、架橋が生じたことを示す。

（乾式混合によるＮＨＳ－ＰＯｘ／キトサン混合物の調製）
ＮＨＳ－ＰＯｘ／キトサン混合物を以下の通り調製した：２ｇのキトサン粉末（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｗａｓｅｔａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＤＡＣ度８５％）及び２ｇのＮＨＳ－ＰＯｘを、タンブル混合によって３０分間乾式混合した。得られた粉末を減圧下で乾燥し、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

粉末を^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析によって分析した。この目的のために、５％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）（１．０ｍＬ）を２５ｍｇの造粒物に添加した。試料を２０分間超音波処理することにより、ＮＨＳ－ＰＯｘを選択的に抽出した。分散液を０．２２μｍフィルターに通し、ＮＭＲ管に移して^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを記録した。得られたスペクトルから、未反応ＮＨＳの量は、ＮＨＳ－ＰＯｘと比べて９９パーセントと計算された。

ＮＭＲ試料におけるＮＨＳ－ＰＯｘの回収率を、トリメチルシランを内部標準として、並びに異なる濃度のＮＨＳ－ＰＯｘの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから作成した検量線を使用して決定した。全ＮＨＳ－ＰＯｘ回収率は９６パーセントと測定され、不溶性架橋材料が形成されなかったことを示す。

ＮＨＳ－ＰＯＸ／キトサン粉末をサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに分析した。このために、^１Ｈ－ＮＭＲ分光分析に使用された溶液からアリコート（０．１５ｍＬ）を取り出した。この溶液を、ＳＥＣ分析の溶離液である５０ｍＭの塩化リチウムを含有するＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１．００ｍＬ）で希釈した。ＳＥＣをポリ（メチルメタクリレート）標準に対して測定し、得られたサイズ排除クロマトグラムからＭ_ｎ、Ｍ_ｗ及びＰＤＩを決定した。ＰＤＩは１．５以下であり、乾式混合中に架橋が生じなかったことが示される。

（粘着性繊維状担体構造体）
本発明による組織接着性シートの調製において繊維状担体構造体として使用するために、以下の市販の止血製品を選択した：
ジェリータ タフト－Ｉｔ（登録商標）：８層の還元架橋ゲルフォーム繊維からなる粘着性繊維状担体構造体。それぞれ約２ｍｍ厚の８つの層は、寸法が５０ｍｍ×７５ｍｍである。ジェリータ タフト－Ｉｔ（登録商標）の水分含有量は、１５％以下である。製品を真空オーブン中４０℃で数時間乾燥させ、水分含有量を２．０％ｗ／ｗ以下（重量測定によって決定される）まで低減させた後、凝集粒子を含浸させた。

（出血実験）
標準化されたｅｘ－ｖｉｖｏ及びｉｎ－ｖｉｖｏブタ出血モデルを使用して止血有効性を評価した。すべてのモデルは、ヘパリンを使用して凝血時間を延長させ、活性化凝固時間（ＡＣＴ）を約２～３倍にした。

〔ｅｘ－ｖｉｖｏモデル〕実際のｉｎ－ｖｉｖｏ環境を可能な限り厳密に模倣するために、屠殺場からのヘパリン処置された新鮮な血液で灌流された新鮮な肝臓を有する、生きたｅｘ－ｖｉｖｏブタモデル。肝臓を灌流機に取り付け、灌流機によって酸素化、血液のｐＨ、温度及び血圧を生体境界内に維持する。２つの肝臓及び１０リットルのヘパリン処置された血液（５０００単位／Ｌ）を屠殺場で収集する。肝臓は氷上で、血液は周囲温度で輸送する。収集後２時間以内に、肝臓を病変について検査し、これを手袋及びシアノアクリレート糊で閉じる。
灌流パラメータ：流量６００ｍｌ／分、圧力１０～１２ｍｍＨｇ、温度３７℃（＋／－１℃）、カルボゲン １分に０．２５リットル
平坦な丸形回転擦過ツールを用いて肝臓表面に円形の出血創傷（直径８ｍｍ）を作成し、パンチされた出血部の深さが常に３ｍｍになるようにゴムアンレーを用いる。
肝臓が適正に灌流されたら（色及び温度を点検する）、以下の手順に従って試料を試験する：試料を適切なサイズ（２．７×２．７ｃｍ）に切断する；カメラをオンにする；カメラで部位数を確認する；８ｍｍの生検をパンチする；生検を切断除去する；ガーゼ（２ｘ）で出血部から血液を除去する；事前に秤量されたガーゼで血液を３０秒間収集する；出血をスコア付けする（２名の研究者によって）；止血粉末を出血部位に注ぎ、ステンレス鋼スパチュラを使用して粉末を均等に分布させる；５分間観察し（接着及び凝固を点検し、スコア付けする）、３０分後に繰り返す。

〔ｉｎ ｖｉｖｏモデル〕麻酔したブタ（家畜ブタ、雄、体重範囲：４０ｋｇ、成体）で標準化組合せ貫通脾臓破裂を引き起こす。脾臓及び他の臓器にアクセスするため、正中線開腹術を行う。メスを使用し、ｎ＝３（Ｓ１．．．Ｓ３）の被膜下標準化病変（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を作製する。止血製品を、事前に湿潤されたガーゼ（食塩水）によって穏やかな圧力で貼り付け、１分間抑える。製品の貼付後、止血までの時間（ＴＴＨ）を評価する。ＴＴＨがゼロに等しい場合、１分の押圧後に止血が既に達成されていることを意味する。

造粒物のスコア付けシステム：凝固
＋＋＋＋ 塗布直後に達成
＋＋＋ 塗布後＜１０秒で達成
＋＋ 塗布後＜３０秒で達成
＋ 塗布後３分以内に達成
－ 達成されず

造粒物のスコア付けシステム：塗布の１０分後の接着
＋＋＋＋ 非常に強力な接着（凝固した造粒物はほとんど除去されない）
＋＋＋ 強力な接着（凝固した造粒物は除去が困難である）
＋＋ 強力な接着（凝固した造粒物は除去可能）
＋ 中等度の接着（凝固した造粒物は容易に除去される）
＋／－ 軽度の接着（凝固した造粒物は血流によって除去される）
－ 達成されず

パッチのスコア付けシステム：凝固
＋＋＋＋ タンポナーデ直後に達成
＋＋＋ タンポナーデ後＜１０秒で達成
＋＋ タンポナーデ後＜３０秒で達成
＋ タンポナーデ後３分以内に達成
＋／－ ３分後に達成、第２のタンポナーデを適用
－ 達成されず

パッチのスコア付けシステム：貼付の１０分後
＋＋＋＋ 非常に強力な接着（除去時にパッチが破損する）
＋＋＋ 強力な接着（除去時にパッチが破損する）
＋＋ 強力な接着（パッチは破損することなく除去可能）
＋ 中等度の接着（パッチは破損することなく除去可能）
＋／－ 軽度の接着（パッチは破損することなく除去可能）
－ 達成されず

［実施例１］
異なる反応性造粒物の止血特性を上述のｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ出血試験で評価した。結果を表１及び表２に要約する。

［実施例２］
担体構造体への粒子凝集物の含浸
機械振盪を使用し、ジェリータ タフト－Ｉｔ（登録商標）パッチ（５０×７５ｍｍ、およそ０．７１ｇ）に青色染色ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ（１：０．６）造粒物を含浸させた。塗料振盪機を使用し（Ｃｏｌｌｏｍｉｘ ＧｍｂＨのＶＩＢＡ ＰＲＯ Ｖ）、粉末（およそ０．７５ｇ）をパッチに導入した。担体構造体を含むアレイのホルダーを機械にクランプした。アレイを垂直に振動させた。

含浸させた試料をＰＭＭＡプレートに置いてオーブンに入れ、そこで試料を異なる熱処理に供した。粉末の固着を評価するために、試料を白色ＰＭＭＡプレート上で２回動かした。青色粉末が放出されない場合、結果を固着したとみなした。結果を表３に示す。

ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物は吸湿性である。周囲温度及び４０％より低い相対湿度（ＲＨ）で、曝露の３０分以内に繊維状担体構造体に再現性よく含浸させることができる。しかし、例えばＲＨ７５％及び２５℃で含浸を行う場合、造粒物は数分以内に粘性になり、再現不可能な不均質な含浸特性がもたらされる。

［実施例３］
止血パッチ（ジェリータ タフト－Ｉｔ（登録商標）；５０×７５ｍｍ、およそ０．７ｇ）に、反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ（１：０．６）造粒物を前述の通り含浸させた。１グラムの造粒物を、実施例２に記載の通りパッチ全体に分布させた。次に、１ｇのシリカを含有するａｌｕ－ａｌｕパウチに止血パッチを装填し、真空封止した。

パッチを２ｃｍ×２ｃｍ片に切断し、ｅｘ ｖｉｖｏ肝臓灌流モデルで三連で試験した。止血までの時間（ＴＴＨ）は０（１分の押圧後）であり、３０分の観察時間の間に再出血は観察されなかった。パッチはまた、高い可撓性及び屈曲特性を有することが見出された。

さらに、パッチをｉｎ ｖｉｖｏブタヘパリン処置モデルで評価した。パッチは、非常に良好な凝固及び接着特性を有することが見出された。活動性出血は、種々の臓器：脾臓、肝臓及び腎臓の切除において効率的に停止された。結果の概要を表３に示す。

［実施例４］
止血パッチ（ジェリータ タフト－Ｉｔ（登録商標）；５０×７５ｍｍ、およそ０．７ｇ）に、ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ／Ｐ１８８ ２．５％を含浸させた。１グラムの造粒物を、実施例２に記載の通りパッチ全体に分布させた。次に、１ｇのシリカを含有するａｌｕ－ａｌｕパウチに止血パッチを装填し、真空封止した。

パッチをｉｎ ｖｉｖｏブタヘパリン処置モデルで評価した。パッチは、非常に良好な凝固及び十分な接着特性を有することが見出された。接着特性が低減したことにより、Ｐ１８８を含まない同一のパッチとは対照的に、パッチを１枚で除去することが可能であった。活動性出血は、種々の臓器：脾臓、肝臓及び腎臓の切除において効率的に停止された。結果の概要を表４に示す。

［実施例５］
ジェリータ タフト－Ｉｔ（登録商標）（５０×７５ｍｍ、およそ０．７ｇ）に、異なる反応性ポリマー粉末を含浸させた。そのようにして得られたパッチの止血特性を、本明細書で以前に記載されたようにｅｘ－ｖｉｖｏ及びｉｎ－ｖｉｖｏブタ出血モデルで試験した。

空気振盪デバイスを使用し、繊維状担体構造体に１．４ｇの粉末を含浸させた。繊維状担体のシートを垂直に振動させた。ロングストローク型エンジン（ＮＴＫ ２５ ＡＬ Ｌ、前Ｎｅｔｔｅｒ Ｖｉｂｒａｔｉｏｎ ＧｍｂＨ）を、６バール、１１Ｈｚ及び３０ｍｍの振幅で操作した。１５秒の４サイクルを使用し、シートに粉末を分散させた。造粒物がシートの全厚にわたって分布された。シート表面全体の分布も均質であった。

７種の異なる反応性造粒物を試験した。これらの造粒物は、水溶性求核性ポリマーとの組合せのＮＨＳ－ＰＯｘを含有していた。これらの造粒物の調製は、本明細書で以前に記載されている。

試験された造粒物を以下に列挙する：
ＮＨＳ－ＰＯｘ／ジェリータ Ｓｐｏｎ
ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ（高塩分）
炭酸塩を含有するＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ（高塩分）
ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＲＸＬ（低塩分）
ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＨ２－ＰＥＧ

試験した繊維状担体構造体と反応性ポリマー粉末の異なる組合せを表５に示す。

ｅｘ－ｖｉｖｏ及びｉｎ－ｖｉｖｏブタ出血モデルにおいて、これらのパッチによって得られた結果を表６に要約する。

［比較例Ａ］
７．０３ｇのＮＨＳ－ＰＯｘを５０ｍＬジクロロメタン（ＤＣＭ）に分散させた。混濁混合物が形成され、ＩＰＡ（４ｍＬ）をゆっくり添加し、透明な溶液を得た。７．００ｇの事前乾燥されたゼラチン（ジェリータ－ＳＰＯＮ（登録商標）、Ｇｅｌｉｔａ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ）を、２０，０００ｒｐｍで動作する高せん断混合機を使用し、ＤＣＭ／ＩＰＡ（１５０ｍＬ／１２ｍＬ）に室温で２０分間分散させた。調製されたＮＨＳ－ＰＯｘ溶液を添加し、分散液を２０，０００ｒｐｍで５分間撹拌した。その後、すべての揮発物を減圧下で除去した。形成された造粒物をコーヒーグラインダーを使用して摩砕し、減圧下で乾燥させ、ａｌｕ－ａｌｕバッグで真空封止した。

造粒物を^１Ｈ－ＮＭＲ分光法及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して分析した。そのように得られた結果により、ＮＨＳ－ＰＯｘがゼラチン／ＮＨＳ－ＰＯｘ造粒物に存在しないことが示され、ＮＨＳ－ＰＯｘとゼラチンとの間に完全な架橋が生じたことが示される。

［実施例６］
実験を行い、止血パッチのｉｎ－ｖｉｖｏでの性能に対する反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物のＮＵ－ＰＯｘ含有量の効果を決定した。

（含浸方法）
止血パッチ（ジェリータ タフト－Ｉｔ（登録商標）；５０×７５ｍｍ、およそ０．７ｇ）に、１：０．１０、１：０．２０及び１：０．４０のモル比でのアセトン造粒によって作製された反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ顆粒を含浸させ、前記モル比は、ＮＨＳ－ＰＯｘによって提供されるＮＨＳ基の数のＮＵ－ＰＯｘによって提供されるアミン基の数に対する比を指す。同じ止血パッチに、反応性ＮＨＳ－ＰＯｘ粉末も含浸させた。

Ｆｉｂｒｏｌｉｎｅ ＳＬ－Ｐｒｅｇ実験室機械を使用し、１グラムの造粒物／粉末をパッチ全体に分布させた。次に、止血パッチを固着させ、乾燥させ、１ｇのシリカを含有するａｌｕ－ａｌｕパウチに装填し、真空封止した。

〔機械〕
Ｆｉｂｒｏｌｉｎｅ ＳＬ－Ｐｒｅｇ実験室機械は、最大２００Ｈｚの周波数で最大４０ｋＶの電圧を最大６０秒間の期間印加することにより、電極間で粒子を動かす。２つの電極プレートは、約５０×４０ｃｍのサイズである。上プレートを接地させる。

以下の標準設定を使用した：４０ｋＶ、１００Ｈｚ、２０秒。

〔アレイ〕
３Ｄ印刷ＰＭＭＡアレイを下電極プレートに取り付けた後、粉末を重力法によってアレイに注入した。掻取りカートン又は金属スパチュラを使用し、アレイに反応性ポリマー粉末を充填した。アレイは５０×７５×４ｍｍであり、２２×３３＝７２６個の正方形ウェル（各ウェルの内のり寸法：２×２×２ｍｍ）を含有していた。７２６個のウェルの合計体積は、およそ５．８ｍＬであった。

〔スペーサ〕
スペーサマスクをアレイの上に配置した。スペーサを使用すると、交番電界に供した際に粒子の上下移動が可能になる。スペーサが使用されない場合、担体への浸透及びそこを通る分布が制限される。タフト－ＩＴの場合、これは３ｍｍのマスクであった。これにより、電極の距離は３＋４ｍｍ＝７ｍｍになる。

ＮＨＳ－ＰＯｘ：ＮＵ－ＰＯｘ造粒物（０、１０、２０及び４０パーセントのＮＵ－ＰＯｘからのアミン基、パーセンテージはＮＨＳ－ＰＯｘによって提供されるＮＨＳ基の数に基づいて計算される）又はＮＨＳ－ＰＯｘ粉末を含有する止血パッチのｉｎ ｖｉｖｏでの性能を、非ヘパリン処置ｉｎ－ｖｉｖｏブタモデルで評価した。試験されたパッチの詳細を表７に示す。

（ｉｎ ｖｉｖｏ試験）
成体雌家畜ブタ（４０～５０ｋｇ）に試験を行った。抗凝固剤は適用しなかった。パッチ性能を脾臓と肝臓の両方で試験した。脾臓又は肝臓の位置を特定し、試験期間の経過とともに必要に応じて表出させ、食塩水で浸したスポンジで覆うことによりそれらの天然の湿度を維持した。

異なる種類の損傷を作成した：
肝臓：擦傷、生検パンチ及び切除傷
脾臓：切除傷

適切にサイズ調整された肝実質の部分を擦過／パンチし、中等度から重度の出血を引き起こした。外科用メス及び１×１ｃｍ２の鋳型によって肝臓の擦傷を作成し、８ｍｍの円形生検パンチを使用して円形パンチを作成した。肝臓及び脾臓の切除傷は、外科用ナイフを使用して作成した。

組織の切除又は乱切の直後にパッチを貼り付けた：
生検パンチ及び擦傷に対して２×２ｃｍ片
切除傷に対して完全な７．５×５ｃｍのパッチ

試験パッチを出血組織に貼り付け、食塩溶液で事前に湿潤されたガーゼを使用して圧迫することによって穏やかにプレスした。タンポナーデは、最初に１０秒間の期間、次に３０秒間の間隔をおき、合計５分間まで適用した。

含浸されていないタフト－ＩＴパッチを基準として使用した（タフト－ＩＴと呼ぶ）。

ｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を表８に要約する。

パッチ１～４は非常に強力な組織接着を示した一方、タフト－ＩＴパッチでは軽度の接着しか観察されなかった。

パッチ１及び２は、貼付後にごくわずかな膨張しか示さなかった。パッチ３～４は、より大きな、しかし依然として許容可能な膨張を示した。

［実施例７］
止血パッチ（ジェリータ タフト－Ｉｔ（登録商標）；５０×７５ｍｍ、およそ０．７ｇ）に、ＮＨＳ－ＰＯｘの溶液、ＮＨＳ－ＰＯｘ粉末、又はＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物のいずれかを含浸させた。使用したＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物は、１：０．２０のモル比でのアセトン造粒によって作製された（実施例８を参照されたい）。

ＮＨＳ－ＰＯｘをイソプロピルアルコールとジクロロメタンの１：１混合物（２００ｇ／Ｌ）に溶解することにより、ＮＨＳ－ＰＯｘを含有する噴霧溶液を調製した。実験室ガラス噴霧器及び加圧空気を使用し、この噴霧溶液５ｍＬを１回の噴霧サイクルでパッチに含浸させた。このようにして送達されたＮＨＳ－ＰＯｘの全量は、パッチあたり１グラムであった。含浸後、パッチを４０℃のオーブン内で２時間乾燥させ、その後乾燥器で２日間保管した後、１ｇのシリカを含有するａｌｕ－ａｌｕパウチに装填して真空封止した。

さらに、実施例８に記載の手順を使用し、１グラムのＮＨＳ－ＰＯｘ粉末又は１グラムのＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物をパッチに含浸させた。

そのように調製されたパッチの性能を、ｅｘ ｖｉｖｏ肝臓灌流モデルで、軽度（＜２０ｍＬ／分）及び重度の出血（＞５０ｍＬ／分）の条件下で三連で試験した。平坦な丸形回転擦過ツールを用いて肝臓表面に円形の出血創傷（直径８ｍｍ）を作成し、パンチされた出血部の深さが常に３ｍｍになるようにゴムアンレーを用いた。結果を表９に示す。

［実施例８］
ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物と止血デンプン粉末（アリスタ（商標）ＡＨ、前ＢＡＲＤ）を混合することによって止血粉末を調製した。使用されたＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物は、アセトン造粒によって１：０．２０のモル比で作製した（実施例８を参照されたい）。

ＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物を、乳棒及び乳鉢で、デンプン粉末とともに８０／２０及び９０／１０ｗ／ｗの比で混合した。

これらの粉末ブレンド、純粋なデンプン粉末及び純粋なＮＨＳ－ＰＯｘ／ＮＵ－ＰＯｘ造粒物のゲル形成能を以下の通り評価した：
試験管に２０ｍｇの粉末試料を装填した
２５０μＬのヘパリン処置されたヒツジ血液を添加し、ボルテックスミキサーを使用して混合物を即座に１０秒間かき混ぜた
２分後、試験管を上下逆に置き、ゲルが形成されたかどうか決定した
ゲルが形成されていた場合、１ｍＬの水をゲルに添加し、３０分後にゲルがインタクトのままであるかどうか決定した。
結果を表１０に示す。

Claims (15)

1. 少なくとも１０ｗｔ．％の粒子凝集物を含む止血粉末であって、前記粒子凝集物が１～５００μｍの範囲の直径を有し、
   （ａ）共有結合の形成下で血液中のアミン基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求電子性基を担持する求電子性ポリオキサゾリンを含有する求電子性ポリオキサゾリン粒子、及び
   （ｂ）水の存在下で、前記求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの間の共有結合の形成下で前記求電子性ポリオキサゾリンの前記反応性求電子性基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求核性基を担持する水溶性求核性ポリマーを含有する求核性ポリマー粒子
   を含む、止血粉末。
2. 前記求核性ポリマーが、タンパク質、キトサン、求核性ポリオキサゾリン、求核性ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン及びこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の止血粉末。
3. 前記求核性ポリマーが、ゼラチン、コラーゲン及びこれらの組合せから選択される、請求項２に記載の止血粉末。
4. 前記求核性ポリマーが、ゼラチン、好ましくは還元架橋ゼラチンである、請求項３に記載の止血粉末。
5. 前記求核性ポリマーが求核性ポリオキサゾリンである、請求項２に記載の止血粉末。
6. 前記求核性ポリマーがキトサンである、請求項２に記載の止血粉末。
7. 前記求電子性ポリオキサゾリンが、少なくとも８個の反応性求電子性基を含有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の止血粉末。
8. 前記求電子性ポリオキサゾリンの前記反応性求電子性基が、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、ホスホン酸エステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、ｐ－ニトロチオフェニルエステル、酸ハロゲン化物基、無水物、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、チオイソシアネート、イソシアノ、エポキシド、活性化ヒドロキシル基、オレフィン、グリシジルエーテル、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、マレイミド（マレイミジル）、エテンスルホニル、イミドエステル、アセトアセテート、ハロアセタール、オルトピリジルジスルフィド、ジヒドロキシフェニル誘導体、ビニル、アクリレート、アクリルアミド、ヨードアセトアミド及びこれらの組合せから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の止血粉末。
9. 前記粒子凝集物が、少なくとも１０ｗｔ．％の前記求電子性ポリオキサゾリン及び少なくとも１０ｗｔ．％の前記求核性ポリマーを含有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の止血粉末。
10. 前記求電子性ポリオキサゾリンと前記求核性ポリマーの組合せが、前記粒子凝集物の少なくとも５０ｗｔ．％を構成する、請求項１～９のいずれか一項に記載の止血粉末。
11. 前記求電子性ポリオキサゾリンによって提供される反応性求電子性基の総数と、前記求核性ポリマーによって提供される反応性求核性基の総数の間の比が１：１．５～１．５：１の範囲である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の止血粉末。
12. （ａ）共有結合の形成下で血液中のアミン基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求電子性基を担持する求電子性ポリオキサゾリンを含有する求電子性ポリオキサゾリン粒子、及び
    （ｂ）前記求電子性ポリオキサゾリンと求核性ポリマーの間の共有結合の形成下で前記求電子性ポリオキサゾリンの前記反応性求電子性基と反応することができる、少なくとも３個の反応性求核性基を担持する水溶性求核性ポリマーを含有する求核性ポリマー粒子
    の止血粒子凝集物を調製する方法であって、前記方法が、１００重量部の前記求電子性ポリオキサゾリン粒子と１０～１０００重量部の前記求核性ポリマー粒子を非水性造粒液体の存在下で組み合わせるステップを含む、方法。
13. 前記非水性造粒液体が、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、ジエチルエーテル、ヘプタン、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、アセトン及びこれらの混合物から選択される有機溶媒を少なくとも６０ｗｔ．％含有する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記求電子性ポリオキサゾリン粒子を前記非水性造粒液体で湿潤させるステップ、その後湿潤された求電子性ポリオキサゾリン粒子を前記求核性ポリマー粒子と組み合わせるステップを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 三次元の相互接続した間隙空間を含む粘着性繊維状担体構造体、及び
    前記間隙空間内に分散されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の止血粉末
    を含む、生体適合性の可撓性止血シート。