JP2022539168A - 好中球損傷用ポリマー粒子 - Google Patents

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Abstract

好中球機能の抑制剤としてポリマー粒子を使用した、治療方法、組成物、システム、及びキットが本明細書に提供される。かかる方法には、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患、悪性疾患、及び好中球が関与し得る他の疾患または状態の予防、治療、及び／または緩和方法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリマー粒子は、好中球関連疾患または状態の診断に有用である。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１９年７月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８７０，８７９号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
好中球機能の抑制剤としてポリマー粒子を使用した治療方法、組成物、システム、及びキットが本明細書に提供される。かかる方法には、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患、悪性疾患、及び好中球が関与し得る他の疾患もしくは状態の予防、治療、及び／または改善方法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリマー粒子は、好中球関連疾患または状態の診断に有用である。
好中球に基づく医学的状態は、血管血栓症、炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化症、敗血症、及び急性肺損傷を含む多様な医学的状態を含む。例えば、急性肺損傷（ＡＬＩ）は、肺内皮及び上皮バリアの破壊を特徴とし、肺胞気腔における流体の蓄積をもたらす、急速に進行する炎症性疾患である。血液ガスバリア損傷はガス交換を損ない、肺機能を低下させる。ＡＬＩは、ＡＬＩのより重篤な形態である急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）とともに、米国で年間２０万人の患者に影響を及ぼし、死亡率は約４０％であり、退院後６ヶ月までの死亡率は約５０～６０％である。ＡＬＩ／ＡＲＤＳの死亡率を低下させるために有効な薬理学的介入はない。例えば、ＡＲＤＳ関連肺高血圧を低下させる一酸化窒素、外因性界面活性剤、静脈内プロスタグランジンＥ１、及びグルココルチコイドは、ＡＬＩ／ＡＲＤＳを解消することに何の利点も示されていない。ＡＲＤＳの主な治療は、血液酸素化及びＣＯ２除去のための人工呼吸器の使用を支持し、それによって損傷した肺が治癒することを可能にする。しかし、注意深く使用しないと、人工呼吸で肺にさらなる損傷が生じる可能性がある。したがって、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの管理は、臨床的必要性が満たされていない。
好中球機能の抑制剤としてポリマー粒子を使用した治療方法、組成物、システム、及びキットが本明細書に提供される。かかる方法には、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患、悪性疾患、及び好中球が関与し得る他の疾患または状態の予防、治療、及び／または改善方法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリマー粒子は、好中球関連疾患または状態の診断に有用である。
いくつかの実施形態において、患者の好中球媒介性炎症状態の治療、緩和、または再発防止方法であって、治療有効量の、サリチル酸に加水分解するサリチル酸ポリ無水物エステル（本明細書において「ポリＡ」）粒子、及び薬学的に許容される配合物を患者に投与することを含む方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、ポリＡ粒子は血管標的化粒子（ＶＴＰ）である。他の実施形態において、ポリＡ粒子は非標的化粒子（ｎＴＰ）である。特定の実施形態において、好中球媒介性状態は、血管血栓症、炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化症、敗血症、関節炎、急性肺損傷（ＡＬＩ）、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）から選択される１つ以上の状態である。特定の実施形態において、患者は哺乳動物である。他の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
いくつかの実施形態において、投与は血管内投与である。ある特定の実施形態において、投与は静脈内投与である。さらなる実施形態では、投与は、例えば、Ｘ線画像診断、超音波画像診断、コンピュータ軸断層撮影画像診断、及び／または磁気共鳴画像診断によって誘導される誘導カテーテルを使用する投与である。
いくつかの実施形態において、ポリＡ粒子は、試料の場合、５００～９００ｎｍ以上の寸法を有する微粒子である。他の実施形態において、ポリＡ粒子は、例えば、５００ｎｍ未満の寸法を有するナノ粒子である。ある特定の実施形態において、ポリＡ粒子は、球体である。他の実施形態において、微粒子は微粒子である。特定の実施形態において、球体は滑らかな表面を含む。さらなる実施形態において、ポリＡ粒子は、寸法、形状、及び／または表面形態において異なる多様なポリＡ粒子を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、ポリＡ粒子を含む医薬組成物と、任意選択で、血管血栓症（例えば、静脈血栓塞栓症）、炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化症、感染症（例えば、ウイルス感染症）、敗血症、急性肺損傷性関節炎（ＡＬＩ）及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）と診断された患者に医薬組成物を投与するための指示書とを含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、炎症の兆候を阻害する方法であって、炎症細胞を含む試料にポリＡ粒子を含む組成物を曝露することを含み、当該曝露が炎症の兆候の阻害をもたらす、方法を提供する。ある特定の実施形態において、試料はヒト由来である。特定の実施形態において、ヒトは、血管血栓症、炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化症、敗血症、急性肺損傷性関節炎（ＡＬＩ）、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）と診断される。他の実施形態において、試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、唾液試料、尿試料、滑液試料、軟骨試料、及び組織試料からなる群から選択される試料である。
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのポリＡ粒子を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、ポリＡ粒子は、標的化されたポリＡ粒子である。他の実施形態において、標的化されたポリＡ粒子は、ポリＡ ＶＴＰである。さらなる実施形態において、ポリＡ粒子は、ｎＴＰである。特定の実施形態において、ポリＡ粒子は、生体適合性であり、生分解性である。所与の実施形態において、そのポリＡ粒子は、生物活性分子を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのポリＡ粒子及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体からなる医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、医薬組成物であって、少なくとも１つのポリＡ粒子が、ａ）２０～７０ｋＤＡの平均分子量を有するポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を水に溶解してｐＨ６～７の１重量％のＰＶＡ溶液を生成すること、ｂ）ポリＡをジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解すること、ｃ）＞４０００ｒｐｍでの混合中にＤＣＭ中のポリＡを含む溶液をＰＶＡ溶液に少なくとも１時間かけて添加してエマルジョンを生成すること、ｄ）エマルジョンを遠心分離すること、ｅ）遠心分離ペレットから遠心分離溶液を吸引すること、ｆ）ペレットを脱イオン化水中に再懸濁させて懸濁したポリＡ粒子を生成すること、ｇ）懸濁したポリＡ粒子を洗浄すること、ｈ）洗浄したポリＡ粒子を凍結乾燥すること、及びｉ）凍結乾燥したポリＡ粒子を凍結すること、の１つ以上またはすべてのステップの方法によって作製される、医薬組成物を提供する。他の実施形態において、ポリＡ粒子は、１つ以上の疎水性生物活性化合物または薬物を当該ＤＣＭに溶解したポリＡポリマーに添加することによって、１つ以上の疎水性生物活性化合物または薬物の担体となるように修飾される。さらなる実施形態では、ポリＡ粒子は、親水性生物活性化合物または薬物のうちの１つ以上を、当該ＤＣＭに溶解されたポリＡポリマーに乳化される水相に添加し、１重量％のＰＶＡ水溶液中で薬物－ポリマーエマルジョンを乳化することによって、１つ以上の親水性生物活性化合物または薬物の担体となるように修飾される。
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＬＧＡ粒子及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体からなる医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、医薬組成物であって、少なくとも１つのＰＬＧＡ粒子が、ａ）２０～７０ｋＤＡの平均分子量を有するポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を水に溶解してｐＨ５～６の０．５重量％のＰＶＡ溶液を生成すること、ｂ）ＰＬＧＡを溶解すること（５０：５０ＰＬＧＡ（例えば、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の６．４ｋＤＡの分子量）、ｃ）＞４０００ｒｐｍでの混合中にＤＣＭ中のＰＬＧＡを含む溶液をＰＶＡ溶液に少なくとも１時間かけて添加してエマルジョンを生成すること、ｄ）エマルジョンを遠心分離してより大きな粒子を除去すること、ｅ）上清を遠心分離して約１．５ｕｍ粒子を収集すること、ｆ）遠心分離されたペレットから遠心分離された溶液を吸引すること、ｇ）脱イオン水にペレットを再懸濁させて、懸濁したＰＬＧＡ粒子を溶液中に生成すること、ｈ）当該溶液を瞬間冷凍すること、ｉ）当該ＰＬＧＡ粒子を凍結乾燥すること、及びｊ）当該凍結乾燥されたＰＬＧＡ粒子を凍結すること、の１つ以上またはすべてのステップの方法によって作製される、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、医薬組成物であって、少なくとも１つのポリＡ ＶＴＰ粒子が、ａ）ポリＡ粒子を５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中に懸濁させること、ｂ）粒子をＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ溶液中に５０ｍＭ ＭＥＳ中に懸濁させること、ｃ）１－エチル－３－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液を懸濁させた粒子に添加すること、ｄ）グリセリンをポリＡ粒子を含む溶液に添加すること、ｅ）溶液を遠心分離すること、ｆ）ポリＡ粒子をＰＢＳ中に再懸濁させること、及びｇ）ポリＡ粒子を含む溶液を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ－／－中のビオチン化抗ＩＣＡＭ－１とともにインキュベートすること、の１つ以上またはすべてのステップの方法によって作製される、医薬組成物を提供する。
付属の図面を参照して進む以下の詳細な説明から、本発明の前述の及び他の目的、特徴、ならびに利点がより明白になるであろう。
（Ａ）０及び（Ｂ）１０日間の水中での加水分解後、エマルジョン溶媒蒸発（ＥＳＥ）法により加工したポリＡ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。（Ｃ）は、培地中のＳＡの蛍光強度によって経時的に測定した分解性ポリＡ球体からのサリチル酸（ＳＡ）の放出を示す。 アゴニスト（ＡＤＰ）活性化血小板と比較して、ポリＡ粒子インキュベーション有りまたは無しで、ヒト血小板を静止させることによるＰ－セレクチン発現を示す。ポリＡ非標的化微粒子はヒト血小板を活性化せず、それによって血液適合性を示す。 未処置（ＵＴ）及びリポ多糖（ＬＰＳ）処置（ＡＬＩ）マウスの肺気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）における好中球数及びサイトカイン濃度を示す。ＰＡ＝ポリＡ粒子、ＰＳ＝ポリスチレン粒子。マウス処置をＸ軸上で行う。 微粒子（ＭＰ）を含まない、または感染６時間後もしくは１８時間後にポリＡ ＭＰを含む、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の血中（上）の細菌数、及びＢＡＬＦ中のＴＮＦ－α濃度を示す。 ポリＡ微粒子（ＭＰ）処置なし、または細菌感染６時間後及び１８時間後におけるポリＡ微粒子（ＭＰ）処置有りで、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐａ）感染マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）のＢＡＬＦにおける好中球数を示す。感染２４時間後にＢＡＬＦ試料を採取した。 尾静脈注射２４時間後の肺における抗細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）－１標的化（網掛）及び非標的化ＰＳ ＭＰの蓄積を示す。 Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染のタイミングと比較した、マウス粒子注入及び組織採取のための提案されたタイムラインを示す。 サリチル酸塩に基づくポリＡマイクロスフィアの配合において使用するためのポリマー１～３の構造、及びそれらのＳＡ放出の加水分解を示す。 未処理（ＵＴ）のマクロファージと比較した、２時間または２４時間培養され、次いでポリＡまたはＰＳ ＭＰに曝露された肺胞マクロファージによるＴＮＦ－ａ分泌を示す。 単一のエマルジョン及び溶媒蒸発を使用した、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びポリＡマイクロスフィア粒子の作製を示す。 ＰＬＧＡ及びポリＡマイクロスフィア、ならびにゼータ電位（ｍＶ）を示す。ゼータ電位は、粒子を取り巻く媒体の性質に対する粒子の表面電荷の関数である。この値は、粒子がＷＢＣとどのように相互作用するかに相関する。ポリＡのゼータ電位の値はＰＬＧＡと同様であるが、ポリＡはＡＬＩ／ＡＲＤＳにおいて追加の有益な効果を有する。 Ａ）経時的なポリＡ粒子の分解（時間）、及びＢ）粒子を血漿中でインキュベートすることによって放出されたサリチル酸（ＳＡ）の濃度（濃度＝０．６ｍｇ／ｍＬ）を示す。 リポ多糖（ＬＰＳ）気管注入後の肺炎症のＢＡＬＢ／ｃモデルの注入タイムラインを示す。ＬＰＳは肺に炎症を起こし、好中球浸潤を引き起こす。粒子投与の２時間後、マウスを安楽死させ、肺を洗浄して気腔内の細胞を収集する。上清を、炎症性マーカーの存在について分析する。 ＬＰＳ損傷のない単球及び好中球のＢＡＬＦパーセント、ＬＰＳ損傷後及び処置なしの単球及び好中球のパーセント、ＬＰＳ損傷後及びポリＡ粒子による処置後の単球及び好中球のパーセント、ならびに未処置、ＬＰＳ損傷のみ、及びＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置における総ＢＡＬＦ細胞数を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＬＰＳの肺への注入を介してＡＬＩを有するように誘導した。未処置のマウスは、ＬＰＳを受けなかった。「未処置単球対好中球」に示されるデータは、ＬＰＳ及び粒子処置を受けなかったマウスからのものである。「ＬＰＳ単球対好中球」に示されるデータは、ＬＰＳを投与したマウスに由来し、粒子処置は行わなかった。ＢＡＬＦでは好中球が優勢である。「ＬＰＳ＋Ｐ単球対好中球」に示されるデータは、ＬＰＳを投与し、次いでＬＰＳ１時間後にポリＡ粒子処置を施したマウスからのものである。肺における好中球の数は著しく減少する。棒グラフに細胞総数を表示する。 未損傷／未処置マウス、ＬＰＳ損傷／未処置マウス、及びＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置マウス（ＬＰＳ＋Ｐ）における比較ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＫＣ及びＩＬ－１０濃度を示す。 未損傷／未処置マウス、ＬＰＳ損傷／未処置マウス、及びＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置マウスにおける比較ＭＣＰ－１、アルブミン、ＭＩＰ２及びＩＰ１０濃度を示す。 未処置ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＬＰＳ損傷ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＬＰＳ損傷／ＰＳ－ＣＯＯＨ粒子処置ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＬＰＳ損傷／アスピリン処置ＢＡＬＢ／ｃマウス、及びＬＰＳ損傷／ビヒクル対照処置ＢＡＬＢ／ｃマウスからのＢＡＬＦ試料中の細胞数を、複数の実験にわたって平均して示す。ポリＡ粒子は肺損傷から保護する（ＰＡ＝ポリＡ）。 単一の実験において、未処置マウス、ＬＰＳ損傷マウス、ＬＰＳ損傷／ＰＳ－ＣＯＯＨ粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷／アスピリン処置マウス、及びＬＰＳ損傷／ビヒクル対照処置マウスからのＢＡＬＦ試料中の細胞数を示す。 未処置マウス、ＬＰＳ損傷マウス、ＬＰＳ損傷／ポリスチレン（ＰＳ－ＣＯＯＨ）粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷／アスピリン処置マウス、及びＬＰＳ損傷／ビヒクル対照処置マウスからのＢＡＬＦ上清中のアルブミン濃度及びＩＬ－６濃度を示す。 未処置マウス、ＬＰＳ損傷マウス、ＬＰＳ損傷／ポリスチレン（ＰＳ－ＣＯＯＨ）粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷／アスピリン処置マウス、及びＬＰＳ損傷／ビヒクル対照処置マウスからのＢＡＬＦ上清中のＩＬ－１０及びＫＣ濃度を示す。 未処置マウス、ＬＰＳ損傷マウス、ＬＰＳ損傷／ポリスチレン（ＰＳ－ＣＯＯＨ）粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷、ポリＡ粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷／アスピリン処置マウス、及びＬＰＳ損傷／ビヒクル対照処置マウスからのＢＡＬＦ上清中のＭＣＰ１及びＭＩＰ２濃度を示す。 未処置マウス、ＬＰＳ損傷マウス、ＬＰＳ損傷／ポリスチレン（ＰＳ－ＣＯＯＨ）粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置マウス、ＬＰＳ損傷／アスピリン処置マウス、及びＬＰＳ損傷／ビヒクル対照処置マウスからのＢＡＬＦ上清中のＴＮＦ－α濃度を示す。 粒子処置なしのＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＬＰＳ注入によって引き起こされたＡＬＩ後のＢＡＬＦ試料の収集のための代表的な実験タイムラインを示す。 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの敗血症における、ＬＰＳ損傷（ＡＬＩ）後のＢＡＬＦにおける好中球浸潤対免疫細胞のパーセント及び血液中の好中球総数の比較間隔を示す。 ３０ｍｇ／ｋｇのポリＡ粒子を注入したＬＰＳ注入によって生じたＡＬＩ後のＢＡＬＦ試料の収集の代表的な実験タイムラインを示す。 ＬＰＳ単独、ＬＰＳとポリスチレン（ＰＳ）粒子、ＬＰＳとＰＬＧＡ粒子、及びＬＰＳとポリＡ粒子での処置と比較した、ＢＡＬＦ試料中の免疫細胞のパーセント及び総好中球数の変化に対するＬＰＳ４時間後におけるポリＡ粒子投与の比較影響を示す。 非損傷未処置マウスに類似してＬＰＳ損傷／ＰＳ粒子処置マウス及びＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置マウスにおいて、ＬＰＳ損傷／未処置マウス及びＬＰＳ損傷／ＰＬＧＡ粒子処置マウスと比較して、ＬＰＳ損傷の４時間後に処置を行った場合にポリＡ粒子がＢＡＬＦ試料中のアルブミン濃度を低下させることを示している。ＰＬＧＡ粒子は肺漏出を増加させるが、ポリＡ粒子は、より低いＢＡＬＦアルブミン濃度に反映されるように、ＬＴＰ損傷から肺を保護する。 ＬＰＳ損傷／未処置マウス及びＬＰＳ損傷／ＰＬＧＡ粒子処置Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、ＬＰＳ損傷／ポリＡ粒子処置マウスと比較して、ＬＰＳ損傷の２時間後に処置を行った場合にＢＡＬＦ試料中の総細胞数が最も多いことを示す。ＰＬＧＡ粒子は、総ＢＡＬＦ細胞数に対して利点を有しないが、ポリＡ粒子は、感染の２時間後に投与されたときに、肺を細胞浸潤から保護する。 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、処置なしと、ＰＬＧＡ粒子による処置と、ＬＰＳ損傷の６時間後に処置を行った場合のポリＡ粒子による処置との間に、ＬＰＳ損傷マウスの処置に差異がないことを示す。 マウスＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染、ポリＡ粒子投与、ならびにＢＡＬＦアッセイ及び血液コロニー形成単位（ＣＦＵ）計数のための試料の収集のための、代表的な実験タイムラインを示す。 ポリＡ粒子投与を伴わない、感染６時間後のポリＡ粒子投与あり、及び感染１８時間後のポリＡ粒子投与ありのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染したマウス、ならびに感染していない対照マウスにおける、ＩＬ－６及びＩＬ－１０の比較濃度を示す。炎症のマーカーは、ポリＡ粒子での処置によって低減され、粒子が感染１８時間後に投与されると、より大きな利点がある。 ポリＡ粒子投与を伴わない、感染６時間後のポリＡ粒子投与あり、及び感染１８時間後のポリＡ粒子投与ありのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染したマウス、ならびに感染していない対照マウスにおける、ＫＣ及びＭＩＰ２の比較濃度を示す。炎症のマーカーは、ポリＡ粒子での処置によって低減され、粒子が感染１８時間後に投与されると、より大きな利点がある。 ポリＡ粒子投与を伴わない、感染６時間後のポリＡ粒子投与あり、及び感染１８時間後のポリＡ粒子投与ありのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染したマウス、ならびに感染していない対照マウスにおける、ＭＣＰ－１及びＴＮＦ－αの比較濃度を示す。炎症のマーカーは、ポリＡ粒子での処置によって低減され、粒子が感染１８時間後に投与されると、より大きな利点がある。 ポリＡ粒子投与を伴わない、感染６時間後のポリＡ粒子投与あり、及び感染１８時間後のポリＡ粒子投与ありのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染したマウス、ならびに感染していない対照マウスにおいて感染１８時間後の後の生理食塩水注射ありのマウスにおける、総ＢＡＬＦ細胞数及び総ＢＡＬＦ好中球数の比較を示す。ポリＡ粒子での処置は、好中球の数を減少させ、感染６時間後の投与に比べて感染１８時間後の投与で大きな減少が観察される。 Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染１２時間後、１８時間後、２４時間後、３０時間後、及び３６時間後及び処置なしの、総ＢＡＬＦ細胞数、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０ ｌｏｇ ＢＡＬ ＣＦＵ／ｍＬ数、ならびにＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０ ｌｏｇ血中ＣＦＵ／ｍＬ数の比較を示す。白血球及び細菌は、感染後に肺で増加し、血液中の細菌ＣＦＵ数も増加する。 未処置マウス、静脈内に静脈内ポリＡ粒子を用いて処置したマウス、及び感染１８時間後にアッセイした静脈内生理食塩水を用いて処置したマウスにおける、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０ ｌｏｇ ＢＡＬ ＣＦＵ／ｍＬ数、及び感染２４時間後のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０ ｌｏｇ血中ＣＦＵ／ｍＬ数の比較を示す。ポリＡ粒子は、感染２４時間後にＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０ ｌｏｇ ＢＡＬ ＣＦＵ／ｍＬ数、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０ ｌｏｇ血中ＣＦＵ／ｍＬ数を減少させる。 Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染１０日後までの１日の生存率におけるポリＡ粒子処置の比較利益を示す。マウスをＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染させ、感染１８時間後で。第１のサブセットはポリＡ粒子（「粒子Ａ ｉ．ｖ．」）で処置し、第２のサブセットは処置しなかった。ポリＡ処置サブセットのマウスは、未処置群での生存率が４０％であったのと比較して、６０％の生存率であった。 ポリＡ－アビジン及びポリＡ抗ＩＣＡＭ－１ ＶＴＰのフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。 Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ肺感染に対するポリＡ粒子注入の影響を示す。感染したマウスと生理食塩水対照との間で、６時間もしくは１８時間でのポリＡ注射後、１８時間でのＰＬＧＡ注射後、または１８時間でのポリスチレン注射後、感染２４時間後でのＢＡＬＦ中の全細胞を比較する。 ＢＡＬＦ中のＩｇＭの濃度が、ポリＡ粒子での処置によって感染マウスで低下することを示す。 ポリＡまたはポリスチレン（ＰＳ）粒子の添加有りまたは無しで、３時間または２４時間のＬＰＳ処置に応答して肺胞マクロファージによって産生された（ａ）ＴＮＦ、（ｂ）ＩＬ－６、（ｃ）ＩＬ－１０、及び（ｄ）ＩＰ－１０のＥＬＩＳＡ定量による炎症性サイトカインの比較濃度を示す。 １８時間のポリＡ ＭＰ注射有りまたは無しで、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染マウス（各群についてＮ＝５）の感染後生存を示す。２Ｅ８粒子を各粒子タイプについて各マウスに注入した。
［定義及び方法］
本発明は、特定の代表的な実施形態と併せて説明されるが、本発明はこれらの例示的な実施例に限定されないことが理解される。当業者は、本明細書に記載のものと同様または同等の多くの方法及び材料が、本発明の実施に使用し得ることを認識するであろう。本発明は、説明される方法及び材料に限定されない。
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。分子生物学における共通用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ発行、１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．発行、１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．発行、１９９５（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）に見られる。本明細書に記載されるものに類似または同等の任意の方法、デバイス、及び材料を本発明の実施に使用することができるが、特定の方法、デバイス、及び材料が本明細書に記載される。すべての塩基のサイズまたはアミノ酸のサイズ、及びすべての分子量または分子質量値は、核酸またはポリペプチドに対して与えられるものであり、説明のために提供されることをさらに理解されたい。
別段に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者（複数可）によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似または同等の任意の方法、デバイス、及び材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイス、及び材料がここから記載される。
添付の特許請求の範囲を含む本開示で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうではないと指示しない限り、複数の参照を含み、「少なくとも１つ」及び「１つ以上」と同義に使用される。したがって、「ポリＡ ＭＰ」への言及は、ポリＡ ＭＰの混合物を含む、などである。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、数値が関連するアイテムの基本的な機能が変更されないように、数値の重要ではない修正または変動を表す。
本明細書で使用されるとき、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「ペプチド断片」と同義で使用される。「精製された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチドもしくはペプチド断片は、アミノ酸配列が得られる細胞、組織もしくは無細胞源からの細胞物質または他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成されるときに化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
本明細書で使用される場合、「炎症性疾患」は、炎症反応を伴う疾患または状態を指す。炎症反応は、急性及び／または慢性であり得る。いくつかの実施形態において、慢性炎症は、好中球数及び／または活性の増加を伴う。本明細書に記載のポリＡ粒子で治療され得る非限定的な例示的な炎症性疾患としては、リウマチ性関節炎、若年特発性関節炎、全身性発症若年特発性関節炎、変形性関節症、敗血症、喘息、間質性肺疾患、炎症性腸疾患、全身性硬化症、眼内炎症、グレーブス病、子宮内膜症、全身性硬化症、成人発症スティル病、アミロイドＡアミロイドーシス、リウマチ性多発筋痛症、自然に良くなる傾向のある、圧痕浮腫を伴う血清反応陰性の寛解性対称性滑膜炎（ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｐｉｔｔｉｎｇ ｅｄｅｍａ）、ベーチェット病、ブドウ膜炎、移植片対宿主病、静脈血栓塞栓症、ＡＬＩ／ＡＲＤＳ、及びＴＮＦＲ関連周期性症候群が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「感染症」は、細菌、ウイルス、真菌等の病原体によって引き起こされる疾患または状態を指す。本明細書に記載のポリＡ粒子で治療され得る非限定的な例示的な感染症としては、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、リケッチア感染症、及び寄生虫感染症が挙げられる。いくつかの実施形態において、ウイルス感染症は、例えば、インフルエンザウイルス感染症、コロナウイルス感染症（例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２））、及び呼吸器合胞体ウイルス感染症を含む呼吸器ウイルス感染症である。
本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」は、組織及び他の構成要素等の身体自身の構成要素に対する不適切な免疫応答から生じる疾患または状態を指す。いくつかの実施形態では、好中球数及び活性は、自己免疫疾患において上昇する。本明細書に記載されるポリＡ粒子で治療され得る非限定的な例示的な自己免疫疾患としては、全身性エリスロマトーデス、全身性硬化症、多発性筋炎、巨大細胞動脈炎を含む血管炎症候群、高安静脈炎、凍結グロブリン血症、ミエロペルオキシダーゼに対する抗好中球細胞質抗体関連半月形糸球体腎炎（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ａｎｔｉｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、リウマチ性血管炎、クローン病、再発性多発性軟骨炎、後天性血友病Ａ、及び自己免疫性溶血性貧血が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「好中球媒介性状態または疾患」は、疾患または状態の症状及び／または進行の少なくともいくつかが好中球蓄積及び／または活性によって引き起こされる疾患または状態を指す。非限定的な例示的な好中球媒介性疾患または状態としては、炎症性疾患、悪性疾患（がん及びがん関連疾患を含む）、感染症、及び自己免疫疾患が挙げられる。さらなる非限定的な例示的な好中球媒介性疾患としては、キャッスルマン病、強直性脊椎炎、冠動脈性心疾患、リウマチ性関節炎の心血管疾患、肺動脈高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アトピー性皮膚炎、乾癬、坐骨神経痛、静脈血栓症、ＩＩ型糖尿病、肥満、巨細胞動脈炎、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、非ＳＴ上昇性心筋梗塞、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、視神経脊髄炎、慢性糸球体腎炎、及び高安動脈炎が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「調節する」は、細胞の数及び／または活性を増加または減少させることのいずれかによって変化させることを意味する。「阻害する」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞数及び／または活性を妨害または減少させることを意味する。本明細書で使用される場合、調節される細胞は好中球である。
本明細書で使用される場合、「生物活性」という用語は、生理学的または病態生理学的プロセスに影響を及ぼし得る１つ以上の細胞または細胞外プロセスへの影響（例えば、結合、シグナル伝達等を介して）を示す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用のために、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」及び／または「配合物」という用語は、治療剤とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し、水及び油などの滅菌液体を含むがこれらに限定されない。
「薬学的に許容される塩」または「塩」は、イオン結合を含有する開示される化合物の生成物であり、典型的には、開示される化合物を個体に投与するのに適した酸または塩基のいずれかと反応させることによって生成される。薬学的に許容される塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、及び酒石酸塩を含む酸付加塩、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ等のアルカリ金属カチオン、ＭｇもしくはＣａ等のアルカリ土類金属塩、または有機アミン塩が含まれ得るが、これらに限定されない。
「医薬組成物」は、個体に投与するのに好適な形態のポリＡポリマー粒子を含む配合物である。医薬組成物は、典型的には、その意図される投与経路と適合するように配合される。投与経路の例としては、経口及び非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、局所、経皮、経粘膜、関節内、眼内、及び直腸投与が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、一般に、本明細書に記載されるように予防、低減、または治療される障害または状態の少なくとも１つの症状を改善するために必要な量を意味する。語句「治療有効量」は、それが本開示のポリＡ粒子に関連する際、ポリＡ粒子がそのような治療を必要とするかなりの数の個体に投与される特定の薬理学的応答を提供するポリＡ粒子投薬量を意味する。特定の例において特定の個体に投与される治療有効量のポリＡ粒子は、そのような用量が当業者には治療有効量であると考えられるとしても、本明細書に記載の状態／疾患の治療には必ずしも有効ではないことが強調される。
本明細書で使用される場合、「第２の薬剤」という用語は、本発明によるポリＡ粒子以外の治療剤を指す。ある特定の事例において、第２の剤は抗炎症剤である。
本明細書で使用される場合、「敗血症」という用語は、血液中の有害な微生物の存在を指す。
「同時投与」という用語は、少なくとも２つの薬剤（複数可）（例えば、ポリＡ粒子）または療法を対象に投与することを指す。いくつかの実施形態において、２つ以上の薬剤／療法の同時投与は同時である。他の実施形態において、第１の薬剤／療法は、第２の薬剤／療法の前に投与される。当業者は、使用される様々な薬剤／療法の配合物及び／または投与経路が変化し得ることを理解する。同時投与のための適切な用量は、当業者によって容易に判定され得る。いくつかの実施形態では、薬剤／療法が同時に投与されるとき、それぞれの薬剤／療法は、それらの投与単独に適した用量よりも低い用量で投与される。したがって、同時投与は、薬剤／療法の同時投与が既知の潜在的に有害な（例えば、毒性の）薬剤（複数可）の必要な投薬量を低下させる実施形態において特に望ましい。
「併用療法」という用語は、これらの治療剤の相互作用から有益な効果をもたらすことを意図した特定の治療レジメンの一部としての、抗炎症剤（例えば、ポリＡ粒子）及び少なくとも第２の薬剤の投与を含む。この組み合わせの有益な効果は、治療剤の組み合わせから生じる薬物動態学的または薬力学的相互作用が含まれるが、これらに限定されない。これらの治療剤の組み合わせでの投与は、典型的には、定義された期間（通常、選択された組み合わせに応じて数分、数時間、数日または数週間）にわたって行われる。「併用療法」は、一般的にはそうではないが、偶発的かつ任意に本発明の組み合わせをもたらす別個の単剤療法レジメンの一部としてのこれらの治療剤のうちの２つ以上の投与を包含することを意図し得る。「併用療法」は、順次の方法でのこれらの治療剤の投与、すなわち、各治療剤が異なる時間に投与されること、ならびにこれらの治療剤、またはこれらの治療剤のうちの少なくとも２つが実質的に同時の方法で投与されることを包含するように意図されている。実質的に同時投与は、例えば、各治療剤の固定比率を有する単一のカプセルもしくは注射剤を対象に投与することによって、または治療剤のそれぞれについて複数の単一のカプセルもしくは注射剤で行うことによって達成することができる。各治療剤の連続的または実質的に同時投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、関節内経路、角膜経路、局所経路、及び粘膜組織を介した直接吸収を含むが、これらに限定されない任意の適切な経路によって影響され得る。治療剤は、同じ経路によってまたは異なる経路によって投与することができる。例えば、選択された組み合わせの第１の治療剤は、静脈内注射によって投与されてもよく、一方で、組み合わせの他の治療剤は、経口投与されてもよい。あるいは、例えば、すべての治療剤が経口投与されてもよく、またはすべての治療剤が静脈内注射によって投与されてもよい。治療剤が投与される順序は狭義には重要ではない。「併用療法」はまた、上記の治療剤を、他の生物学的活性成分及び非薬物療法（例えば、手術または放射線治療）とさらに組み合わせて投与することを包含することができる。併用療法が非薬物処置をさらに含む場合、非薬物処置は、治療薬と非薬物処置との組み合わせの相互作用からの有益な効果が達成される限り、任意の適切な時間に実施され得る。例えば、適切な場合において、非薬物処置が治療剤の投与から一時的に、おそらく数日または数週間除かれても、依然として有益な効果が達成される。
本明細書で提供される範囲は、範囲内のすべての値を簡潔にした表現であることが理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０（ならびに、文脈が別途明確に指示しない限り、その分数）からの任意の数、数の組み合わせ、またはサブ範囲を含むと理解される。任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合、その分数（例えば、整数の１０分の１及び１００分の１）を含むと理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的特徴に関連する本明細書に列挙された任意の数の範囲は、別段の指示がない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。
［詳細な説明］
好中球機能の抑制剤としてポリマー粒子を使用した治療方法、組成物、システム、及びキットが本明細書に提供される。かかる方法には、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患、悪性疾患、及び好中球が関与し得る他の疾患または状態の予防、治療、及び／または改善方法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリマー粒子は、好中球関連疾患または状態の診断に有用である。
［ＡＬＩ／ＡＲＤＳ］
多数の複雑な病態がＡＬＩ／ＡＲＤＳにつながる。直接的または間接的な損傷のいずれかがＡＬＩ／ＡＲＤＳを開始し、全体的な死亡率に差異はない。肺マクロファージの活性化を誘導し、肺上皮への損傷が続く肺から始まる病態、例えば、肺炎によって、直接的な肺損傷が生じる。次いで、肺における炎症性事象のカスケードは、肺内皮の炎症及び血液から肺への一次白血球の動員を引き起こし、それによって損傷を伝播させる。間接的な損傷は、肺外の病態、例えば、敗血症または外傷から生じ、疾患は、肺への急速な白血球移動を開始する全身炎症をもたらす。白血球の移動は肺内皮を損傷し、最終的に肺上皮を損傷する。ＡＬＩの主な原因にかかわらず、転帰は損傷した肺胞上皮であり、免疫細胞及びタンパク質が豊富な液体による肺胞の急速な浸潤につながり、肺機能が低下する。
［ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける好中球］
ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける炎症性カスケードは、毛細血管内皮を、循環する血中好中球の迅速な移動を促進する白血球接着分子（ＬＡＭ）を発現するように誘発する。セレクチン、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）－１及び血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）－１を含むＬＡＭは、肺組織中の循環白血球（ＷＢＣ）及び白血球の迅速な移動を促進する。好中球は、ＷＢＣ数の６０％～７０％を占める最も豊富なＷＢＣであり、急性炎症において最も効率的な初期反応を行うものである。したがって、好中球は、ＡＲＤＳ患者由来の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）における一次細胞型であり、疾患の重症度は、ＢＡＬＦ試料中の好中球の濃度と相関する。好中球は、少なくとも２つの方法で損傷を引き起こすＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける炎症の主要な加害者である。第一に、好中球の肺への過剰な移動は、肺の浮腫につながる肺胞－毛細血管バリアの破壊の原因となる。第二に、好中球は肺組織及び肺胞気腔中に蓄積し、常在細胞に影響を与え、肺へのさらなる損傷を引き起こす損傷性の炎症促進因子及びアポトーシス促進因子を放出する。好中球がマイナスに貢献していることを停止することにより、ＡＬＩ／ＡＲＤＳ及び他の炎症性状態の標的治療の機会を提供する。ＬＡＭの発現を遮断または抑制する薬物、例えば、リソフィリン及びタラクトフェリンは、臨床試験において失敗している。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（Ｍａｃ－１）インテグリンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｐ．）ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘導ＡＬＩにおいて重要であるが、ＣＤ１８の遮断は、好中球の肺移動を６０％しか低下させない。
本発明の実施形態の開発の過程で行われた実験では、非標的化及び血管標的化ナノ粒子及び微粒子（ＶＴＰ）（例えば、血管壁上に発現するタンパク質を標的とする抗体またはリガンド（例えば、抗Ｅ－セレクチン抗体、抗ＩＣＡＭ－１抗体、抗ＶＣＡＭ－１抗体等）ならびにセレクチン及びＬＡＭに結合する他のペプチド及び炭水化物と結合した表面を有する粒子）は、ＡＬＩ／ＡＲＤＳ内の炎症組織への好中球蓄積を受動的（すなわち、活性薬学的成分（ＡＰＩ）を含まず）及び急速に遮断することにより、ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおけるそれらの破壊的役割を停止することが発見されている。ヒト血流中のポリスチレン（ＰＳ）ＶＴＰは、平行プレートフローチャンバ内でインビトロで活性化内皮細胞（ＥＣ）の単層への好中球の血管壁接着と相互作用し、それを低減する。セレクチン標的化ポリスチレン（ＰＳ）ＶＴＰは、ＥＣ表面を物理的に覆うことにより好中球接着のほぼ１００％の低減をもたらし、したがって好中球付着を遮断する。高粒子濃度では、好中球接着は、ＥＣ表面が物理的に覆われること、及び遊離ストリーム粒子－細胞相互作用（１０８粒子／ｍｌの血液における非標的非接着性粒子とのＷＢＣ接着の約５５％の低減）の両方によって防止され、ヒト血液中のＰＳ－ＶＴＰが好中球－血管壁接着を変化させ、迅速な介入が望ましいＡＬＩにおける抗炎症療法のための新しい機会を提供することを示す。ＡＬＩのリポ多糖（ＬＰＳ）マウスモデルでは、健常マウスの肺に投与されたＬＰＳは、好中球の肺への迅速な動員を誘導する。ＬＰＳ－ＡＬＩマウスを、３０ｍｇ／ｋｇの尾静脈注射によりＬＰＳ注入１時間後に投与した２μＭのＰＳ微粒子で処置すると、ＬＰＳのみのマウスからの総肺洗浄好中球数が９３％低下して２．９×１０６となる。５００ｎｍのＰＳ－ＶＴＰを受けたＬＰＳ処置マウスは、総ＢＡＬＦ好中球が６．４×１０５まで減少し、ＬＰＳのみのマウスから９８％の減少に等しかった。両方のＰＳ粒子処置群は、未処置（ＬＰＳなし）マウスと統計的に異なっていなかった。両方の粒径は、ＬＰＳ処置マウスにおいて同じレベルの好中球減少を誘導したが、微粒子は、質量ベースの投薬に相当する数で注入された６４倍のナノ粒子を考慮すると、ナノ粒子と比較してより効率的に肺好中球数を減少させた。ＬＰＳ注入のみでは、単球の移動、または粒子注入有りまたは無しでの肺内のマクロファージの絶対数の変化は生じない。本発明の方法、組成物、キット及びシステムは、特定の機構に限定されないが、ポリマー粒子は、炎症を起こした内皮への白血球接着を減少させる物理的相互作用（例えば、白血球接着を破壊する血流の衝突、結合部位についての白血球との競合において炎症を起こした組織中の内皮によって発現されるＬＡＭへの特異的結合、白血球表現型を変化させる粒子貪食／内在化、及び肺及び血液から肝臓への好中球の転移）を通じて、ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける気腔における望ましくない好中球の蓄積に対する治療的利益を達成するように思われる。これらの特徴は、生体活性分子（例えば、適応免疫の細胞に向けられたタンパク質またはペプチド抗原）または薬理学的分子の送達のために構成される、薬物または生体活性化合物担体、すなわちＶＴＣとしてのポリマー粒子の使用とは異なる。したがって、好中球を標的とするポリマー粒子は、血管血栓症、炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化症、敗血症及びＡＬＩ／ＡＲＤＳを含む、好中球媒介性炎症性及び他の状態の以前に知られていない療法を提供する。
本発明は、例えば、好中球の移動を遮断する生分解性、生体適合性のポリＡポリマーから形成されるポリマー粒子を提供する。ポリＡ重合体の非毒性分解産物（すなわち、サリチル酸）は、それ自体が抗炎症性であり、ＡＬＩ／ＡＲＤＳでの治療のためのポリＡ粒子の追加の利点を有する。例えば、ポリＡ粒子は、ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける好中球の肺気道への移動を遮断し、肺損傷をさらに治療するために局所的にサリチル酸を放出するように標的化される。このようにして、炎症部位における局所的な好中球接着が停止され、システムへの影響が最小限に抑えられつつ好中球の肺組織及び気腔への移動が迅速かつ効率的に妨害され、宿主保護応答が維持され、生分解が迅速であることが企図される。間接的な遮断接着またはシグナル伝達分子ではなく、血管内注射後の肺の血管内及び他の組織内の好中球へのポリＡ粒子の直接的な作用は、ＡＬＩ／ＡＲＤＳ、または好中球が血管血栓症、炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化、感染症、及び敗血症などの病因に関与している他の状態の主要な直接的または間接的な原因にかかわらず、ポリＡポリマー粒子が機能することを確実にする。
［ポリＡ微粒子］
図１ｃ及び図８は、「Ｒ」が、低分子量直鎖炭化水素から分枝脂肪族炭化水素までの範囲のリンカーに対応する、ポリＡポリマーの構造を示す。ポリＡポリマー粒子は生体適合性であり（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｍ．Ａ．，Ａ．Ｐｒｕｄｅｎｃｉｏ，Ｍ．Ｅ．Ａｉｃｈｅｌｍａｎｎ－Ｒｅｉｄｙ，Ｋ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ，ａｎｄ Ｋ．Ｅ．Ｕｈｒｉｃｈ．Ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ（ＮＳＡＩＤ）－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｏｌｙ（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ－ｅｓｔｅｒｓ）ｉｎ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００７．４（３）：ｐ．２３３－９、Ｂｒｙｅｒｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｒ．Ａ．Ｊａｒｖｉｓ，Ｊ．Ｌｅｂｏ，．Ｐｒｕｄｅｎｃｉｏ，Ｔ．Ｒ．Ｋｙｒｉａｋｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｋ．Ｕｈｒｉｃｈ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ－ｅｓｔｅｒｓ）ｉｎｔｏ ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｂｉｏｆｉｌｍｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｒｅｉｇｎ－ｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００６．２７（２９）：ｐ．５０３９－４８）、及び乾燥保存条件下で安定である（Ｄｅｒｏｎｄｅ，Ｂ．Ｍ．，Ａ．Ｌ．Ｃａｒｂｏｎｅ ａｎｄ Ｋ．Ｅ．Ｕｈｒｉｃｈ，Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ－ｂａｓｅｄ Ｐｏｌｙ（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ－ｅｓｔｅｒｓ）Ｐｏｌｙｍ Ｄｅｇｒａｄ Ｓｔａｂ，２０１０．９５（９）：ｐ．１７７８－１７８２）。水溶液中に置くと、ポリマーは分解して、その抗炎症性を保持するサリチル酸（ＳＡ）を放出する。いくつかの実施形態では、エマルジョン溶媒蒸発（ＥＳＥ）技術を使用して、リンカーとしてアジピン酸を有するポリＡポリマー、すなわちＲ＝（ＣＨ２）４及びＭＷ約２０ｋＤＡである分解可能な微粒子（図１Ａ）を作製する。（図８）２０ｍｇのポリＡポリマー（Ｍｗ＝約２０ｋＤａ）を２０ｍＬのジクロロメタン（油相）に溶解し、溶液を１重量％のＰＶＡの水溶液（７５ｍｌ、水相）に乳化する。油相をシリンジ針を介してゆっくりと注入し、エマルジョンを最大２時間連続して攪拌し、このことは油滴の硬化を可能にする。得られたポリＡ粒子を、遠心分離によって２回洗浄し、凍結乾燥によって乾燥させる。粒子は使用まで－４０℃で保管する。生成されたポリＡ粒子は、加水分解を受け（図１Ｃ）、サリチル酸（ＳＡ）の持続放出を受ける（図１Ｃ）。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子は、球形である。ある特定の実施形態において、ポリＡ粒子は、直径１００ｎｍ～２ｕｍの範囲である。特定の実施形態において、ポリＡ球は、アジピン酸リンカー（Ｒ＝（ＣＨ２）４）及び約２０ｋＤａの分子量（Ｍｗ）を有するポリマーで、前述の水中油ＥＳＥ法を介して作製される。他の実施形態において、ポリＡ粒子は、形状及び表面形態が非球形であり、及び／または不規則であり、例えば、ロッド、楕円、星、円錐、立方体等を含む。さらなる実施形態において、単回投与におけるポリＡ粒子は、サイズ、形状及び表面形態において均一である。なおさらなる実施形態において、単回投与におけるポリＡ粒子は、サイズ、形状及び表面形態において不均一である。いくつかの実施形態において、加工パラメータ、例えば、乳化速度及び油相ポリマー濃度は、所望の平均ポリＡ粒子サイズ、例えば、２００ｎｍ及び２μｍを達成するように調整される。乾燥した粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を使用して、粒子表面形態、ならびにＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳを使用して決定された粒子サイズ及びゼータ電位（ＺＰ、表面電荷の尺度）を評価する。特定の実施形態において、ポリＡ粒子分解プロファイルは、分光光度計を介して、ｐＨ７．４及び３７℃のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）及び血漿中で決定され（図１Ｃ）、溶液ｐＨの変化は、ポリＡ粒子が分解するにつれて監視される。さらなる実施形態において、ポリＡ粒子の寸法、形態、均一性及び形状は、フローサイトメトリーによって定量化され、インビボ機能性を予測するために、全血（例えば、ヒト全血）のフローからヒト臍静脈内皮細胞に結合する能力について最適化される。
いくつかの実施形態において、ポリＡ粒子とヒト細胞との血液適合性は、インビトロで最適化される。ある特定の実施形態において、血液中のポリＡ粒子毒性の可能性は、血小板活性化及び溶血のアッセイを介して評価され、最適化される。血小板活性化アッセイのために、全血の遠心分離を介して得られた血小板に富む血漿（ＰＲＰ）中で、ポリＡ粒子を１時間インキュベートする。次いで、ポリＡ粒子に曝露したＰＲＰ試料を、抗ＣＤ４１／６１（ＰＥ）及び抗ＣＤ６２Ｐ（ＡＰＣ）で染色し、フローサイトメトリーを介して、Ｐ－セレクチン発現を決定する。安静時血小板上でのＰ－セレクチン発現は最小限であり、血小板上でのＰ－セレクチン発現の高さは活性化の兆候である。溶血アッセイのために、ポリＡ粒子をＰＢＳ緩衝液中で１５、３０、６０、及び１２０分間、単離したヒトＲＢＣと一緒にし、その後、試料を遠心分離して無傷のＲＢＣ及び粒子をペレット化する。ポリＡ粒子インキュベート試料からの上清を、分光光度計を介して、ＲＢＣ溶解の指標としてのヘモグロビン濃度について評価する。非標的化ポリＡ微粒子は、ヒトの血小板を活性化しない（図２）、またはヒトの血液中に配置したときに溶血を誘発しない。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子の要素は、好ましいインビボ生体内分布及び生体適合性のために、健常な対照動物とともに、ヒト疾患及び状態の実験動物モデルにおいて、ポリＡ微粒子の炎症を起こした小静脈への接着の可視化によって最適化される。インビボで炎症を起こした血管壁への付着は、ポリＡ粒子マトリックス内の蛍光標識で検出される。生体内顕微鏡（ＩＶＭ）を使用して、ポリＡ粒子の接着を可視化し、循環する好中球の接着に対するそれらの影響をインビボで評価する。雌雄混合（５０：５０）の健常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用する。対照アッセイにおいて、（１）非炎症マウス（陰性）においてポリＡ粒子が観察され、腸間膜炎症を有するが粒子が注入されていない（すなわち、ビヒクルのみ）マウスにおいて好中球接着が定量化される。炎症を有するマウスにおけるポリＡ粒子を評価する。ポリＡ粒子は、１０，０００部位／μｍ２の抗ＩＣＡＭ－１（ＹＮ１／１．７．４、マウス）抗体を介して標的化される。この抗体密度は、インビボで炎症を起こした血管壁へのマイクロスフィアのしっかりとした停止を媒介するのに十分である。粒子を約１５ｍｇ／ｋｇで滅菌ＰＢＳに注入して、ＡＬＩマウスのＢＡＬＦ中の好中球を減少させるのに十分な、約１．２ｍｇ／ｋｇまたは約４５ｍｇ／ｍ２のヒト等価用量を得る。この用量は、マウスで評価した前臨床用量と一致し、第ＩＩ相ヒト臨床試験では、３５～５０ｍｇ／ｍ２用量のペグ化リポソームドキソルビシンが日常的に用いられている。
腸間膜炎モデルでは、マウスを麻酔し、必要に応じて抗体、粒子、及び追加の麻酔試薬の静脈内注射のために側面尾静脈カテーテルを配置する。マウスを３７℃に加熱した台を備える顕微鏡上に配置し、腸間膜を正中線切開を介してガラスカバースリップに外観化する。血管選択後、好中球が炎症を起こした血管に付着することを遮断された優位な細胞であることを確認するために、好中球は、粒子注入の前に、蛍光Ｌｙ６Ｇ抗体（５μｇのＧｒ－１または１Ａ８）を直接注射することによって、インビボでタグ付けされる。急性炎症は、ＰＢＳ中の２００μｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの１０μＬを局所的に塗布することによって誘発される。ＴＮＦ－α活性化１０分後に粒子を注入する。腸間膜血管は、２５倍油対物レンズの反転蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１ Ｍａｒｉａｎａｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を介して、最大６０分間の粒子及び細胞接着について撮像される。Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ ６ソフトウェアを使用して、１０ｍｓごとに明視野及び緑色の蛍光で画像を連続的に記録する。ポリＡ粒子の接着及び好中球の遮断に関するデータを、粒子注入＜５分後、１０分後、１５分後、及び６０分後に収集する。６０分で、複数の血管を同じ動物内でそれぞれ最大２分間撮像して、観察された粒子の付着を確認し、好中球の遮断が撮像のために選択された単一の血管のアーティファクトではないことを確認する。ＩＶＭ撮像の終わりに、マウスを安楽死させ、肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓などの重要な臓器におけるポリＡ粒子の分布を評価し、炎症を起こしたマウスと炎症を起こしていないマウスとの間で比較する。相対的な総蛍光を評価する全臓器スキャンを、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して得、次いですべての臓器の単一細胞懸濁液を、サイトメトリーを介して分析されるコラゲナーゼ均質化を介して得る。均質化された肝試料を、白血球集団及びサイトカインの変化について評価する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子の要素は、好ましいインビボ血液循環及びクリアランスについて最適化される。健常なマウスにおける動態アッセイを実施し、マウス血液を、ポリＡ粒子注入（例えば、１５ｍｇ／ｋｇ）５分後、１５分後、及び０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、及び２４時間後にサンプリングし、血流からのポリＡ粒子のクリアランス速度を特徴付けるために、粒子数を評価する。ある特定の実施形態において、ポリＡ粒子は、ＩＣＡＭ－１抗体で作製され、ポリＡ粒子の要素は、評価及び比較される。対照マウスは、ＰＢＳのみで処置したマウス、及び非標的化２μｍのポリＡ粒子で処置したマウスを含む。所望の時間に、１０μＬの血液を収集し、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ上のポリＡ粒子について（例えば、蛍光走査によって）走査する。血漿半減期、分布体積、及びクリアランスなどの薬物動態パラメータの値は、２区画モデルに当てはめたデータを用いて、ＰＫＳｏｌｖｅｒを使用して血漿濃度対時間プロファイルのプロットから得る。粒子注入の２４時間後に、マウスを安楽死させ、抽出された重要な臓器において粒子分布及びサイトカインレベルを評価する。重要な臓器の一部は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に供され、ポリＡ粒子の注入に関連する組織損傷／炎症の任意の兆候について、臨床獣医病理学者によって盲目的にスコアリングする。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子の要素は、健康なマウスにおける生体適合性の好ましいプロファイルについて最適化される。上記ポリＡ粒子注入を行い、血球数を測定する。マウスを、粒子注入２分後、３０分後、６０分後に安楽死させるか、またはケージに戻し、粒子注入前のベースラインと比較して７日間にわたって体重及び行動変化を観察する。時点は、粒子が血流から除去されたときに粒子注入１時間後までに好中球数がベースラインに戻るという証拠に基づいて選択される。標的化された時間間隔で、マウスを、採血のための心臓穿刺を介して安楽死させ、重要な臓器を除去する。血液を細胞数（血小板、好中球、単球、及びリンパ球）、ならびにＰＢＳ対照マウスと比較したヘマトクリット及びヘモグロビンレベルについて、血小板活性化及び細胞アポトーシスのレベルとともに測定する。各臓器の重量を記録し、粒子組成を組織ホモジネート中で評価する。組織学は、重要な臓器に損傷または瘢痕があるかどうかを検出するために使用される。炎症の兆候は、サイトカイン発現レベルの測定を介して評価される。本発明の開発過程で行われた実験は、（１）ポリＡ粒子が炎症を起こした血管に結合し、好中球接着を低減すること、及び（２）ポリＡ粒子がマウスにおいて最小限の毒性を示すこと、ＬＰＳ誘発性ＡＬＩを有するマウスの１００％が、ポリＡ粒子注入後少なくとも４８時間生存することを示す。他の実施形態においては、抗ＩＣＡＭ－１でコーティングされたポリＡを使用する。他の実施形態では、例えば、血管内投与、動脈内投与、静脈内投与、カテーテルによる投与、肺動脈カテーテルによる投与、介入放射線学的投与、超音波誘導性投与、ＭＲＩ誘導性投与、外科的誘導性投与、腹腔鏡誘導性投与、気管支鏡誘導性投与、気管内投与、筋肉内投与、皮下投与、経腸投与、直腸投与、吸入投与、腹腔内投与、関節内投与、脊髄内投与、脳室内投与、小疱内投与、実質内投与等を含む、代替的な経路または投与が使用される。他の実施形態において、試料を、ポリＡ ＶＴＰに結合された抗ＩＣＡＭ－１のアイソタイプに対する抗体とともにインキュベートする。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子の要素は、それらの治療上の利益について最適化される。ある特定の実施形態において、ポリＡ粒子の治療的影響は、ＡＲＤＳのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｐ．）ａｅｒｕｇｉｎｏｓａマウスモデルにおいて比較される。グラム陰性菌であるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、入院患者における肺炎の２番目に一般的な原因であり、機械的に換気された患者において６０～９０％の死亡率で肺損傷を引き起こす。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘発性肺損傷のマウスモデルは、ヒトにおけるＡＲＤＳの組織学的及び免疫学的特徴を複製し、ヒトにおけるＡＲＤＳの４６～５１％は、肺細菌感染から生じる。このモデルは、ポリＡ粒子の肺損傷に対する保護効果、及び先天的な保護応答に対する粒子の有害な影響の可能性を評価する。雄雌混合（５０：５０）株のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、及びＡＴＣＣから得られたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０を使用する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子の要素は、好中球血管外移動及びバリア破壊のタイミングについて最適化される。好中球の肺への移動の時間経過は、ポリＡ粒子の非存在下でのマウスにおけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ投与後に評価され、ポリＡ粒子介入のタイミングを導くためのベースラインを確立する。実験例２は、ＢＡＬＦへの好中球移動の動態及び肺損傷の発症に連動した有意な治療上の利益（図５）を達成するために、ポリＡ粒子が注射される「感染後の時間」の重要性を示す。マウスをＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染させ、マウスを安楽死させる時間は、例えば、細菌感染６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３０時間後及び３６時間後でと、変化する。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染４８時間後の生存率が２０％であることを考慮して、３６時間上限を選択し、２４時間での生存率は約７０％である。ＢＡＬＦ、肺組織、及び血液を、細胞含有量、細菌（ＣＦＵ）、及び炎症マーカーについて分析する。白血球数は、ＢＡＬＦ単一細胞懸濁液または血液を蛍光抗体のパネルで染色して異なる細胞集団を識別するフローサイトメトリーを介して得られる。好中球、単球、リンパ球、マクロファージ及び樹状細胞は、ＢＡＬＦ内で染色される。ＥＬＩＳＡを介したＢＡＬＦ上清及び血漿中の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＭＩＰ－２、ＭＣＰ－１、ＩＬ－１７ＫＣ、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－１β）のレベルの変化を比較する。ＢＡＬＦアルブミン及びＩｇＭレベルを定量化して、感染マウスにおける肺胞上皮の完全性を評価する。主な臓器、例えば肺、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓を採取し、細菌ＣＦＵ、白血球、及び炎症性サイトカインについて評価する。すべての観察された細胞数及びサイトカインレベルを、非感染（ビヒクルのみ）マウスにおけるベースラインと比較する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子の要素は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ誘発ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける肺損傷の低減に対するポリＡ粒子投与のタイミングの影響について最適化される。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染マウスにおける肺損傷を改善するポリＡ粒子の能力と、「粒子なし」処置について特徴付けられる損傷の程度とを、ＢＡＬＦ及び肺、血液、及び他の主要な臓器における白血球数、サイトカインレベル、及び細菌ＣＦＵの評価を介して比較する。異なる直径のＶＴＰ（例えば、マウス抗ＩＣＡＭ－１（ＹＮ１／１．７．４）では２００ｎｍ及び２μｍのＶＴＰ）を評価する。この抗体でコーティングされたＰＳ ＶＴＰは、非標的化微粒子とは異なり、ＡＬＩマウスの肺内で最大２４時間保持される（図６）。マウスを（例えば、１５ｍｇ／ｋｇまたは他の用量で）ＶＴＰで処置し、感染６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、及び３０時間後の様々な時間に注射する。粒子の注入間隔にかかわらず、マウスを、間隔後、固定された感染３６時間後に安楽死させる（図７）。抗体標的化されたポリＡ粒子（抗ＩＣＡＭ－１または抗Ｅ－セレクチンまたは抗ＶＣＡＭ－１）が治療的影響を増強する能力を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染マウスにおけるＢＡＬＦ好中球及び血液ＣＦＵを減少させることが示されている１８時間点における非標的化２μｍのポリＡの投与と比較して評価する（実施例２）。ＢＡＬＦ細胞を計数し、ＢＡＬＦ上清中のアルブミン／ＩｇＭレベル、細菌ＣＦＵ、及び炎症性サイトカインのポリＡ注射時間に対する変化を測定する。肺組織を、粒子含有量（すなわち、全臓器スキャン組織学、及び組織ホモジネートによる）、ならびに細菌ＣＦＵ、サイトカイン、及び白血球数について評価する。上皮肥厚、気道上皮壊死、及び肺胞内浮腫についてのＨ＆Ｅ染色肺切片の盲検スコアリングを介した肺損傷の程度を、「無微粒子」対照と比較した異なるＭＰ注入時間について評価する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子の要素は、観察される肺損傷及び細菌の拡散の程度の比較によって、動物を安楽死させる粒子注入後の時間について最適化される。２μｍサイズのポリＡ粒子を、６時間及び１８時間の固定された「感染後の時間」に投与し、ＢＡＬＦ及び主要臓器細胞／サイトカイン／ＣＦＵ／粒子数を、粒子注入の６時間後、１２時間後、１８時間後、及び２４時間後の様々な時間で分析する（すなわち、マウスを安楽死させる）（図７）。肝臓を評価して、多様な要素を有するポリＡ粒子の注射が、ＡＬＩ／ＡＲＤｓマウスにおける好中球及び粒子の蓄積及び肝臓への損傷を促進するかどうかを判定する。肝臓の一部の全臓器スキャンは、粒子の局在の検出に使用される。肝臓の切片を均質化し、粒子、白血球集団、及び炎症関連サイトカインの発現について評価する。肝臓組織／細胞の構造は、Ｈ＆Ｅ染色を介して評価され、ＡＬＩモデルにおける粒子による潜在的な肝臓損傷のさらなる尺度として、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼビリルビン、及びアラニンアミノトランスフェラーゼを含む、安楽死で収集された血液からの血清に対し肝機能検査（ＬＦＴ）が行われる。対照は、粒子処置を行わないＡＬＩ／ＡＲＤｓマウス由来の肝臓、及びビヒクル対照である。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子の組成物は、治療的利益について最適化される。ポリＡ粒子から放出されたＳＡの追加の利点は、ポリＡポリマー分解の速度を非分解ポリマーから数日以内に実質的に分解するポリマーまで変化させることによって、ＢＡＬＦ細胞数及びサイトカインレベルの変化について評価される。図８は、ポリＡポリマーの構造を示し、「Ｒ」は、直鎖炭化水素、例えば、（ＣＨ２）３から分枝脂肪族までの範囲のリンカーに対応し、「ｎ」は、ポリマー反復単位である。Ｒ１及びＲ２アジピン酸リンカーを有するポリＡポリマーから作製された粒子は、それぞれ３日及び２１日で完全に分解する（Ｒｏｓａｒｉｏ－Ｍｅｌｅｎｄｅｚ，Ｒ．，Ｍ．Ａ．Ｏｕｉｍｅｔ，ａｎｄ Ｋ．Ｅ．Ｕｈｒｉｃｈ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙ（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ－ｅｓｔｅｒ）ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔ－ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｏｌｙｍ Ｂｕｌｌ（Ｂｅｒｌ），２０１３．７０（１）：ｐ．３４３－３５１）。Ｒ３リンカーを有する粒子は、２１日間にわたって２１％のＳＡを放出し、３．５ヶ月以内に完全な分解に到達する。ある特定の実施形態において、「Ｒ」及び「ｎ」の両方は、３日（Ｒ１）、７日（Ｒ２）、２１日（Ｒ２－ベースラインポリマー）、及び＞２８日（Ｒ３）で実質的に分解する２μｍ ＶＴＰを配合するためのポリマーを達成するように調節される（Ｐｒｕｄｅｎｃｉｏ，Ａ．，Ｒ．Ｃ．Ｓｃｈｍｅｌｔｚｅｒ，ａｎｄ Ｋ．Ｅ．Ｕｈｒｉｃｈ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌｉｎｋｅｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｎ Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ Ａｃｉｄ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｏｌｙ（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ－ｅｓｔｅｒｓ）．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００５．３８（１６）：ｐ．６８９５－６９０１）。いくつかの実施形態において、ポリＡ粒子分解プロファイルは、血漿中で分解するマイクロスフィアを用いたアッセイを介して決定される。粒子は、肺内で同定された注入された粒子の分画に基づく濃度で血漿に添加される。様々な分解速度のポリＡ粒子を抗ＩＣＡＭ－１抗体に適合させ、感染１８時間後にＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染マウスに注射する。マウスは感染の２４時間後に安楽死させる。血液、ＢＡＬＦ、及び組織を採取し、細胞数、サイトカイン及びタンパク質レベル、ならびに細菌ＣＦＵに対するポリＡ分解速度の影響を測定する。対照は、（１）ＤＭＳＯ（１００ｕｇ／ｇ）中のアスピリン、（２）ＤＭＳＯのみ、（３）非分解性ポリスチレン（ＰＳ）粒子、及び（４）ＳＡの代わりに乳酸を放出する分解性ＰＬＧＡ粒子、で処置した感染マウスである。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子の要素は、好中球食作用（例えば、ロッド形状）について最適化される。原発性血液白血球（例えば、好中球、単球、及びリンパ球）による表面タンパク質発現及びサイトカイン分泌は、ポリＡ粒子への曝露を伴うかまたは伴わないで測定される。マウス全血及び単離された細胞を、例えば、３日及び＞２８日分解性ポリＡ粒子と１時間インキュベートする。粒子をインキュベートした細胞を、フローサイトメトリーを介して分析し、蛍光抗体染色を介して内在化されたポリＡ粒子の量、及びＬＡＭ、例えば、ＣＤ２６Ｌ、ＣＤ１５、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ６６ｂの発現レベルを測定する。さらに、白血球を、アネキシンＶ、カスパーゼ、及びホスファチジルセリンを含むアポトーシスマーカーについて評価する。上清は、貪食後に単離された細胞によって放出される炎症促進因子のためのＥＬＩＳＡを介して特徴付けられる。対照は、ＰＳ粒子及びビヒクル（粒子なし）に曝露された血液／細胞である。粒子処置された単離された一次細胞から得られた上清を使用して、肺から単離されたマクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）を処置し、ＰＳ粒子またはビヒクルのみの対照と比較して、抗炎症性表現型に関連するポリＡ粒子に曝露された好中球（または、単球もしくはリンパ球）から分泌される因子を識別する。炎症性サイトカインのマウス肺マクロファージ発現は、ポリＡと直接インキュベートすると変化しない（図９）。肺マクロファージ及びＤＣを、分散肺消化細胞から単離する。（Ｄｅｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｇ．Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．Ｗ．Ｎｅｗｓｔｅａｄ，Ｘ．Ｚｅｎｇ，Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｒ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ，ａｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｓｔａｎｄｉｆｏｒｄ，Ｓｅｐｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｕｎｇ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＩＲＡＫ－Ｍ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００６．１１６（９）：ｐ．２５３２－４２）。単離されたマクロファージ及びＤＣを、ＬＰＳ（１時間）、またはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（８時間）で培養した後、細胞放出上清にさらに２時間曝露する。対照アッセイは未処置であり、ＬＰＳのみ／Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａマクロファージ及びＤＣである。マクロファージ及びＤＣ上清は、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＰ－１０、ＫＣ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ２、及びＴＮＦ－αを含むＡＬＩ／ＡＲＤＳ内に分泌される因子について評価される。
いくつかの実施形態において、本発明のポリマー粒子は、ポリＡポリマー粒子を含む。他の実施形態において、ポリマー粒子は、ＰＬＧＡポリマー粒子を含む。本発明のポリマー粒子は、ポリＡ、ＰＳまたはＰＬＧＡ粒子に限定されない。特定の実施形態において、ポリマー粒子は、生分解性であり、標的化可能であり、かつ微粒子及び／またはナノ粒子の投与のために構成される追加のポリマーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子は、エマルジョン溶媒蒸発法を使用して生成される。ある特定の実施形態において、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（例えば、平均Ｍｗが２０～７０ｄＤａの８７～９０％加水分解ＰＶＡ）を水に溶解し、ｐＨ６～７の１重量％のＰＶＡ溶液を提供する。ポリＡ（例えば、２０ｍｇのポリＡ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、ＤＣＭ油相中のポリＡを、４０００ｒｐｍ以上で１～２時間以上混合する際にＰＶＡ水相にゆっくりと添加する。次に、生成された粒子を遠心分離し、ＰＶＡ／水溶液を吸引する。ペレットを脱イオン水中に再懸濁させ、洗浄し、液体窒素下で凍結し、凍結乾燥し、－２０℃で保管する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリＡ粒子は、１つ以上の生物活性化合物または薬物の担体となるように修飾される。ある特定の実施形態において、エマルジョン溶媒蒸発（ＥＳＥ）技術を使用して、薬物負荷分解性微粒子、例えば、ポリＡポリマーからのマイクロスフィアを作製する。疎水性化合物及び薬物については、化合物または薬物をジクロロメタン（油相）に溶解させたポリＡポリマー（Ｍｗ＝約２０ｋＤａ）に添加し、溶液を１ｗｔ％のＰＶＡ水溶液に乳化する単一のエマルジョンプロセスを使用する。油相（ポリＡ及び化合物または薬物）はシリンジ針を介してゆっくりと注入され、エマルジョンは最大２時間連続して攪拌され、油滴が硬化することを可能にする。得られたポリＡ粒子を、遠心分離を介して２回洗浄し、凍結乾燥を介して乾燥させる。粒子を使用まで－４０℃で保管する。親水性の薬物には、二重エマルジョンプロセス（水中油中水型）を使用する。化合物または薬物を、ジクロロメタンに溶解したポリＡポリマーに乳化される水相に添加する。次いで、薬物ポリマーエマルジョンを、１重量％のＰＶＡの水溶液中に乳化する。
本明細書に記載の少なくとも１つのポリＡ粒子及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物はまた、１つ以上の他の活性剤を含み得る。本明細書に記載のポリＡ粒子は、注射用剤形、液体分散液、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、凍結乾燥配合物、乾燥粉末、錠剤、カプセル、制御放出配合物、高速溶融配合物、遅延放出配合物、持続放出配合物、脈動放出配合物、即時放出性及び制御放出性混合配合物等を含むが、これらに限定されない、任意の薬学的に許容される剤形で利用することができる。具体的には、本明細書に記載のポリＡ粒子は、（ａ）経口、肺、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、直腸内、眼内、結腸内、非経口、大槽内、膣内、腹腔内、局部、口腔、経鼻、及び局所の投与（例えば、皮膚、粘膜、結膜及び／または局部内投与）のいずれかから選択される投与のために、（ｂ）液体分散体、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、錠剤、小袋及びカプセルのいずれかから選択される剤形に、（ｃ）凍結乾燥配合物、乾燥粉末、高速溶融配合物、制御放出配合物、遅延放出配合物、徐放性配合物、脈動放出配合物、及び即時放出性及び制御放出性混合配合物のいずれかから選択される剤形に、または（ｄ）それらの任意の組み合わせに、配合することができる。
非経口、皮内、または皮下塗布に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素のうちの１つ以上を含むことができる。（１）注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤、（２）ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤、（３）アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、（４）エチレンジアミン四酢酸等のキレート化剤、（５）酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等の緩衝液、及び（５）塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧調整剤。ｐＨは、塩酸もしくは水酸化ナトリウム等の酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作製された複数用量バイアルに封入することができる。
注射剤使用に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または滅菌注射剤もしくは分散液を即時調製するための分散液及び滅菌粉末を含み得る。静脈内投与では、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は無菌であるべきであり、容易な注射可能性が存在する程度まで流体であるべきである。医薬組成物は製造及び保存条件下で安定でなければならず、また、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されるべきである。「安定」という用語は、本明細書で使用される場合、対象への投与に適した状況または状態に留まることを意味する。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば、糖、マンニトールもしくはソルビトール等の多価アルコール、及び塩化ナトリウム等の無機塩を含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
滅菌注射可能な溶液は、所望に応じて、上に列挙される成分の１つまたはその組み合わせを含む適切な溶媒に、適切な量の活性試薬（例えば、ポリＡ粒子）を組み込み、その後で濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本の分散媒、及び任意の他の所望の成分を含有する滅菌ビヒクルに少なくとも１つのポリＡ粒子を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、代表的な調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥を含み、その両方は、ポリＡ粒子及び任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過したその溶液から得る。経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。例えば、ゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療的投与の目的のために、ポリＡ粒子を賦形剤と組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するための流体担体を使用して調製することもでき、ここで、流体担体中の化合物は、経口的に適用され、口の中で回され、吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤、及び／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。
吸入による投与のために、化合物は、好適な推進剤、例えば、好適なデバイスからの二酸化炭素、噴霧された液体、または乾燥粉末等のガスを含有する圧力容器またはディスペンサーからのエアゾールスプレーの形態で送達される。経粘膜または経皮投与のために、浸透されるバリアに適切な浸透剤を配合物に使用する。かかる浸透剤は一般に当該技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与用では、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成することができる。経皮投与のために、活性試薬は、当該技術分野で一般に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに配合される。試薬はまた、直腸送達のための座薬の形態（例えば、カカオバター及び他のグリセリドなどの従来の座薬塩基を用いて）または保持浣腸の形態で調製することができる。
いくつかの実施形態では、ポリＡ粒子は、体からの急速な排出から保護する担体とともに調製される。例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出配合物を使用することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような配合物を調製するための方法は、当業者には明白であろう。材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販のものを得ることもできる。
リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
加えて、ポリＡ粒子の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが挙げられる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーも送達に使用し得る。任意選択で、懸濁液は、化合物の溶解度を増加させ、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする好適な安定剤または薬剤を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、経口組成物または非経口組成物を、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために単位剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）に配合することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療されるべき対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量のポリＡ粒子を含有する。本明細書に記載のポリＡ粒子の投薬単位剤形の仕様は、特定のポリＡ ＶＴＰの特徴及び達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の治療のためにそのような活性剤を調合する技術分野に固有の制限によって左右され、かつそれらに直接依存する。
少なくとも１つのポリＡ粒子を含む医薬組成物は、１つ以上の薬学的賦形剤を含むことができる。かかる賦形剤の例としては、結合剤、充填剤、滑沢剤、懸濁剤、甘味料、香味剤、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、及び他の賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。かかる賦形剤は、当該技術分野で既知である。例示的な賦形剤としては、以下が挙げられる。（１）種々のセルロース及び架橋ポリビニルピロリドン、微結晶性セルロース、例えばＡＶＩＣＥＬ．ＰＨ１０１及びＡＶＩＣＥＬ．ＰＨ１０２、ケイ化微結晶セルロース（ＰｒｏＳｏｌｖ ＳＭＣＣ）、トラガントガム及びゼラチンを含む結合剤、（２）種々のデンプン、乳糖、乳糖一水和物、及び無水乳糖等の充填剤、（３）アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプン、軽く架橋されたポリビニルピロリドン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、及び改質デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及びそれらの混合物などの崩壊剤、（４）圧縮される粉末の流動性に作用する薬剤を含む滑沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、例えばＡＥＲＯＳＩＬ ２００、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、及びシリカゲルが含まれ、（５）コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤、（６）ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、及びその塩類等の保存剤、ブチルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、エチルアルコールもしくはベンジルアルコール等のアルコール、フェノール等のフェノール化合物、または塩化ベンザルコニウム等の四級化合物、（７）微結晶セルロース、ラクトース、第二リン酸カルシウム、サッカライド等の薬学的に許容される不活性な充填剤などの希釈剤、及び／または先のいずれかの混合物、希釈剤の例には、ＡＶＩＣＥＬ ＰＨ１０１及びＡＶＩＣＥＬ．ＰＨ１０２等の微結晶セルロース；ラクトース一水和物、無水ラクトース、及びＰＨＡＲＭＡＴＯＳＥ．ＤＣＬ２１等のラクトース；ＥＭＣＯＭＰＲＥＳＳ等の第二リン酸カルシウム；マンニトール；デンプン；ソルビトール；スクロース；及びグルコースが挙げられ、（８）スクロース、サッカリン、スクロース、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラメート、アスパルテーム、及びアセスルファム等の任意の天然または人工甘味料を含む甘味剤、（９）ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、ＭＡＧＮＡＳＷＥＥＴ（ＭＡＦＣＯの商標）、バブルガム香料、果実香料等の香味剤、ならびに（１０）有機酸及び炭酸塩または重炭酸塩等の発泡性カップルを含む発泡剤。好適な有機酸として、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸、及びアルギン酸ならびに無水物及び酸塩が挙げられる。好適な炭酸塩及び炭酸水素塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸グリシンナトリウム、炭酸Ｌ－リジン、及び炭酸アルギニンが挙げられる。あるいは、発泡性カップルの炭酸水素ナトリウム成分のみが存在し得る。
種々の実施形態では、本明細書に記載の配合物は、実質的に純粋である。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」とは、活性成分（例えば、ポリＡ粒子）が存在する優勢な種であることを意味する（すなわち、モル換算では、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）。一実施形態において、実質的に精製された画分は、活性成分が存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル単位で）を占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０％超を含む。様々な実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％を含むことになる。種々の実施形態において、活性成分は、均質性（汚染物質種は、従来の検出方法によっては組成物中で検出することができない）に精製され、この組成物は、本質的に単一の巨大分子種からなる。
［ポリＡポリマー粒子組成物を含むキット］
本開示は、本明細書に記載のポリＡ粒子のいずれかを含むキットを提供する。かかるキットは、例えば、（１）少なくとも１つのポリＡ粒子、及び（２）溶媒または溶液等の少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含み得る。追加のキット構成要素として、例えば、（１）安定剤、緩衝液等の本明細書で特定される薬学的に許容される賦形剤のいずれか、（２）キット成分を保持及び／または混合するための少なくとも１つの容器、バイアルまたは同様の装置、ならびに（３）送達装置、を含み得る。
ある特定の実施形態において、本発明は、炎症の当該阻害剤（例えば、ポリＡ）を対象に投与するための指示書を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、細胞または組織における炎症を特徴とする状態の治療のために、キットに含まれる組成物を使用するための指示書を提供する（例えば、投薬、投与経路、患者特有の特徴を治療的作用経路と相関させるための治療担当医師向けの決定木を提供する）。ある特定の実施形態において、本発明は、炎症に関連する様々な医学的状態（例えば、ＡＬＩ／ＡＲＤＳ、敗血症、感染症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ）を治療するためにキットに含まれる組成物を使用するための指示書を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、炎症に関連する様々な医療状態、及び／または自己免疫状態を治療するために、キットに含まれる組成物を使用するための指示書を提供する。
［治療方法］
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、ポリＡ粒子の使用を通じて病状を予防または治療する（例えば、１つ以上の症状を緩和する）方法である。本方法は、治療有効量のポリＡ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む。記載のポリＡ粒子は予防的療法にも使用できる。いくつかの実施形態において、ポリＡ粒子は静脈内投与される。治療方法に使用されるポリＡ粒子は、本明細書に記載のポリＡ ＶＴＰもしくはｎＴＰ、またはその薬学的に許容される塩、もしくはそのプロドラッグであり得る。個体または対象は、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、及びウシ、好ましくはヒト対象を含むがこれらに限定されない、任意の動物（飼育動物、家畜、または野生）であり得る。本明細書で使用される場合、患者、個体、及び対象という用語は、互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「治療すること」は、疾患、状態もしくは障害を治療することを目的とする患者の管理及び看護を言い表し、患者における疾患、状態もしくは障害の症状または合併症の発症を予防するため、疾患、状態もしくは障害の症状または合併症を緩和するため、または疾患、状態もしくは障害の存在を排除するために、ポリＡ粒子の投与を含む。より具体的には、「治療すること」は、疾患（障害）状態、疾患進行、疾患原因物質、または他の異常状態の少なくとも１つの有害な症状または影響を逆転、減弱、軽減、最小化、抑制、または停止することを含む。一般に、症状及び／または病態が改善する限り、治療は継続される。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物及び方法は、炎症性疾患、悪性疾患、感染症、自己免疫疾患、及び／または好中球病態生理が関与する他の疾患もしくは状態を予防、治療及び／または改善するために使用される。本明細書に記載されるポリＡ粒子で治療され得る非限定的な例示的な炎症性疾患としては、リウマチ性関節炎、若年特発性関節炎、全身性発症若年特発性関節炎、痛風、変形性関節症、敗血症、喘息、間質性肺疾患、炎症性腸疾患、全身性硬化症、眼内炎症、グレーブス病、子宮内膜症、全身性硬化症、成人発症性静脈疾患、アミロイドＡアミロイドーシス、リウマチ性多筋痛症、自然に良くなる傾向のある、圧痕浮腫を伴う血清反応陰性の寛解性対称性滑膜炎、ベーチェット病、ブドウ膜炎、移植片対宿主病、及びＴＮＦＲ関連周期性症候群が挙げられる。本明細書に記載されるポリＡ粒子で治療され得る悪性疾患としては、がん及びがん関連状態が挙げられる。非限定的な例示的ながんとしては、多発性骨髄腫、白血病、膵臓癌、乳癌、結腸直腸癌、悪液質、黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ腫、胃腸、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、転移腎癌、固形腫瘍、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、膀胱癌、経口癌、骨髄増殖性腫瘍、Ｂ細胞リンパ増殖性疾患、及び形質細胞白血病が挙げられる。非限定的な例示的ながん関連状態としては、非小細胞肺癌関連疲労及びがん関連拒食症が挙げられる。本明細書に記載のポリＡ粒子で治療することができる非限定的な例示的な感染には、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、リケッチア感染、寄生虫感染、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）感染、呼吸器ウイルス感染、脳マラリア、尿路感染、及び髄膜炎菌感染が含まれる。本明細書に記載のポリＡ ＶＴＰで治療され得る非限定的な例示的な自己免疫疾患としては、全身性エリスロマトーデス、全身性硬化症、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎を含む血管炎症候群、高安静脈炎、クリオグロブリン血症、ミエロペルオキシダーゼに対する抗好中球細胞質抗体関連半月形糸球体腎炎、リウマチ性血管炎、クローン病、再発性多発性軟骨炎、後天性血友病Ａ、及び自己免疫性溶血性貧血が挙げられる。本明細書に記載のポリＡ粒子で治療することができるさらなる疾患としては、キャッスルマン病、強直性脊椎炎、冠動脈性心疾患、関節リウマチの心血管疾患、肺動脈性肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アトピー性皮膚炎、乾癬、坐骨神経痛、ＩＩ型糖尿病、肥満、巨細胞性動脈炎、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ＳＴ非上昇型心筋梗塞、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、視神経脊髄炎、慢性糸球体腎炎、及び高安動脈炎が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、開示される化合物またはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグは、他の活性剤と組み合わせて投与され得る。開示されるポリＡ粒子を含む組成物は、例えば、２つ以上のポリＡ粒子を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリＡ粒子を含有する組成物は、炎症性疾患、悪性疾患、感染症、自己免疫疾患、及び／または好中球病態生理が関与する他の疾患もしくは状態を予防、治療、及び／または改善するための１つ以上の追加の薬剤と組み合わせて投与される。
ポリＡ粒子を利用する投薬レジメンは、例えば、対象のタイプ、種、年齢、体重、性別及び病状、治療される状態の重症度、投与経路、対象の腎機能及び肝機能、ならびに使用される特定のポリＡ粒子またはその担体を含む、様々な因子に従って選択される。通常の熟練した医師または獣医師は、病態の進行を予防し、それに対抗し、またはそれを阻止するために必要な組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。一般に、投薬量、すなわち、治療有効量は、１日当たり約１ｎｇ／ｋｇ～約１ｇ／ｋｇ体重、いくつかの実施形態において約１ｕｇ／ｋｇ～約１ｇ／ｋｇ体重、いくつかの実施形態において約１ｕｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、いくつかの実施形態において約１ｕｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
［診断及び検出方法］
本明細書に記載されるポリＡ粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで診断試薬として使用される。本明細書で同定されたポリＡ粒子は、任意の診断、検出、撮像、ハイスループットスクリーニング、または標的検証技術もしくは手順、またはアッセイに使用することができ、ポリＡ粒子を限定なしに使用することができる。
本明細書に記載の抑制性好中球に結合することができるポリＡ粒子は、平面アレイ、ビーズ、及び他のタイプの固体支持体を使用するアッセイを含む、様々なアッセイに使用することができる。本アッセイは、生命科学研究用途、臨床診断用途（例えば、疾患の診断試験、または予防的ヘルスケアのための「ウェルネス」試験）、親和性結合オリゴヌクレオチドヌクレアーゼアッセイ（ＡＬＯＮＡ）、及びユビキチン－プロテアソームシステム（ＵＰＳ）アッセイ、ならびにインビボイメージング用途を含む、様々な状況で使用することができる。いくつかの用途では、記載のポリＡ ＶＴＰを採用する多重アッセイを使用してもよい。
いくつかの実施形態では、ポリＡ粒子は、様々なインビトロ診断方法またはキットに組み込むための感受性のある特異的な試薬として使用される。いくつかの実施形態において、ポリＡ粒子は、いくつかの感染性または他のタイプの疾患検出方法において抗体の代替として使用され、ポリＡ粒子は、検出可能な材料及び固定化または捕捉成分のいずれかまたは両方を含む。これらの実施形態では、キット由来のポリＡ粒子を臨床検体と混合した後、様々なアッセイフォーマットを利用することができる。一実施形態では、ポリＡ粒子はまた、フルオロフォア等の検出可能な標識も含む。他の実施形態において、アッセイ形式は、蛍光クエンチ、ハイブリダイゼーション方法、フローサイトメトリー、質量分析、阻害または競合方法、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ、ＳＰＲ、エバネッセント波法等を含んでよい。いくつかの実施形態において、ポリＡ粒子は、溶液中に含めてキットに提供される。他の実施形態において、キット中のポリＡ粒子は、検体を試験するためのアッセイと併用される固体支持体上に固定される。種々の実施形態において、固体支持体は、目的の１つ以上の標的の検出のために設計される。他の実施形態において、キットは、対象となる標的を抽出するための試薬、ポリＡ粒子を構築するための試薬、洗浄を行うための試薬、検出試薬等をさらに含んでよい。
デバイスの固体表面に付着した１つ以上のポリＡ粒子を有する診断デバイスまたはアッセイデバイス（例えば、カラム、テストストリップまたはバイオチップ）も提供される。ポリＡ粒子は、固体表面と接触している好中球に結合可能であり、デバイスの表面に付着したままのポリＡ粒子－好中球複合体を形成し、それによって標的を捕捉し、標的の検出及び任意選択での定量を可能にするように位置付けられ得る。ポリＡ粒子のアレイ（同じであってもまたは異なっていてもよい）は、そのようなデバイス上に提供されてもよい。
好中球を検出するための一実施形態では、ポリＡ粒子を、好中球に特異的な結合パートナーを含む標識剤と接触させる。特異的結合パートナーは、抗体、抗体断片、合成抗体模倣物、バイオ模倣物、アプタマー、分子インプリントされたリガンド等を含む任意の好適な部分であり得る。特異的結合パートナーは、別の標識剤成分、通常は検出可能な部分もしくは標識にコンジュゲートまたは連結される。
検出可能な部分または標識は、直接的にまたは間接的に検出することができる。一般に、検出可能な任意のレポーター分子は、標識であり得る。標識として、例えば、（ｉ）シグナルを生成することによって直接検出することができるレポーター分子、（ｉｉ）レポーター分子を含有する同族のものへのその後の結合によって間接的に検出することができる特異的な結合ペアメンバー、（ｉｉｉ）質量分析によって検出可能な質量タグ、（ｉｖ）増幅またはライゲーションのための鋳型を提供することができるオリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｖ）例えば、リプレッサータンパク質等のリガンドとして作用することができる特異的なポリヌクレオチド配列または認識配列が挙げられ、後者の２つの事例において、オリゴヌクレオチドプライマーまたはリプレッサータンパク質は、レポーター分子等を有するか、または有することができるであろう。レポーター分子は、触媒、例えば、酵素、触媒をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、色素、蛍光分子、量子ドット、化学発光分子、補酵素、酵素基質、放射性基、小さな有機分子、増幅可能なポリヌクレオチド配列、ラテックスまたは炭素粒子等の粒子、金属ソル、結晶体、リポソーム、細胞等（これらは、色素、触媒、または他の検出可能な基でさらに標識されてもよく、または標識されなくてもよい）；質量分析目的でコンジュゲートされる分子の重量を変化させる質量タグ等であってもよい。標識は、電磁材料または電気化学材料から選択することができる。一実施形態において、検出可能な標識は蛍光色素である。他の標識及び標識スキームは、本明細書の開示に基づいて当業者に明白であろう。
一般的に記載されている本発明は、本発明の特定の態様及び実施形態の例示のためにのみ含まれ、本発明を限定することを意図するものではない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。動物及びヒト研究のためのすべてのプロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭｉｃｈｉｇａｎのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認された。
［実施例１－ポリＡ粒子はＡＬＩ中の好中球肺移動を低減させる］
ポリＡマイクロスフィアを、３０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ誘発ＡＬＩを用いてマウスの尾静脈に注射した。ＬＰＳ投与の１時間後に注入したポリＡ球は、粒子を有しないＡＬＩマウスと比較して、ＢＡＬＦ好中球数を有意に減少させた（図３）。ＤＭＳＯにおけるアスピリンの尾静脈注射は、ＡＬＩマウスにおけるＢＡＬＦ好中球数を減少させず、ＡＬＩにおける好中球肺移動の観察された減少におけるポリＡ ＶＴＰ粒子と好中球との物理的相互作用の有用性を実証した。粒子処置されたＡＬＩマウスは、ＢＡＬＦにおいてより低いアルブミンレベルを有し（図１６）、粒子注入による肺損傷の低減を示した。ＡＬＩマウスのＢＡＬＦに典型的に見られる炎症のマーカーのレベルは、ポリＡ球がＰＳまたはアスピリンと比較して肺における炎症を有意に低減させることを示した（ｐ＜０．０５）。ＴＮＦ－α、ＫＣ（図１５）、及びＭＩＰ２（図１６）のＢＡＬＦ濃度は、ポリＡ処置ＡＬＩマウスにおいて低下したが、ＰＳ球またはアスピリンで処置したマウスについては低下しなかった。
［実施例２－ポリＡ ＭＰは、細菌誘発性ＡＬＩを有するマウスにおける細菌感染を悪化させない］
ポリＡ ＭＰがＡＬＩ／ＡＲＤＳの臨床設定において有用性を有するかどうか、すなわち、ポリＡ ＭＰ療法が、宿主の一次感染をクリアする能力に影響を及ぼすことなく機能するかどうかを決定するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｐ．）ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染したＡＬＩ／ＡＲＤＳのマウスモデルを調査した。マウスを、気管内（ｉ．ｔ．）接種を介してＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染させた。Ｄｉｆｃｏブロスで増殖したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ菌を所望の濃度に希釈した。マウスを、腹腔内経路によってケタミン及びキシラジンで麻酔し、気管を曝露し、３０μｌの接種体（７～８×１０５ＣＦＵ）または生理食塩水を、滅菌２６ゲージ針を介して投与した。感染６時間後または１８時間後のいずれかで、ポリＡ ＭＰを静脈内注射（ＩＶ、尾静脈）し、マウスを感染２４時間後に安楽死させた。感染２４時間後に、血液ＣＦＵは、ポリＡ ＭＰ処置マウスにおいて、６時間及び１８時間の注射点の両方について、未処置マウスよりも有意に低かった（図４）。図５の結果は、１８時間間隔でのポリＡ ＭＰの注射が、２４時間での試料収集時の肺ＢＡＬＦにおける好中球を減少させたことを示す。逆に、６時間間隔でのポリＡ ＭＰ注射のＢＡＬＦにおける好中球数は、未処置感染マウスのものと同じであった。これらのデータは、ポリＡ ＭＰが、一次肺感染を排除する宿主の能力に悪影響を及ぼさないことを示す。ＢＡＬＦ好中球データに沿って、１８時間間隔でのポリＡ ＭＰ処置は、感染の全身的な拡散を防止し、感染２４時間後に血液中にＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの痕跡は見出されない。ポリＡ ＭＰ処置によるＢＡＬＦ中のＴＮＦ－α（図４）、ＩＬ－６、ＫＣ、及びＭＣＰ－１のより低い濃度が観察された（図１６）。総合すると、これらのデータは、粒子注入のタイミングがＡＬＩの処置における効率に重要であることを示す。感染１８時間後の粒子処置及び６時間後の処置での粒子処置についての、２４時間でのより低いＢＡＬＦ好中球数を考慮すると、細菌感染後であるが粒子が注入される前の間隔を伸ばすことが、治療効果の根底にある可能性がある。本発明は、特定の機構（複数可）に限定されないが、最小数の好中球が、細菌の除去を容易にするために最初に肺組織に入り得るが、肺に広範囲にわたる損傷が行われる前に入り得る。その後、ポリＡ ＭＰは、好中球肺移動を停止させ、天然宿主免疫または活性薬学的成分（ＡＰＩ）が一次感染を除去することを可能にしながら、損傷を軽減する。
［実施例３－ＬＰＳ誘発性肺損傷モデルにおける好中球－ポリＡ ＭＰ相互作用方法］
ポリＡ ＭＰ投与が、ＡＬＩのマウスモデルにおいて、肺への好中球浸潤を緩和するかどうかを決定するために、及びポリＡ ＭＰ粒子が、ポリスチレン（ＰＳ）粒子及びビヒクル対照と比較して、治療上の利点を有するかどうかを決定するために、ＡＬＩのＬＰＳ誘発モデルを使用し、総ＢＡＬＦ細胞、ＢＡＬＦ好中球及びマクロファージの％、ならびに炎症性サイトカイン濃度を定量化し、比較した。
［粒子の分解］
血球計算器（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）上の手動計数によって決定される１×１０７個のポリＡ ｎＴＰ粒子をＰＢＳ－／－１０ｍＬ中に懸濁させ、３７℃で回転下に置いた。（図１０）粒子を遠心分離し、上清を連続的に除去して交換した。続いて上清を９６ウェルプレートに加え、蛍光強度を測定した（サリチル酸についてはｅｘ＝３１５ｎｍ、及びｅｍ＝４０８ｎｍ）。各時点での累積蛍光強度を、図１２において分解時間と比較してプロットする（ＭＦＩ＝平均蛍光強度）。
［急性肺損傷（ＡＬＩ）モデル］
雄のＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを吸入イソフルランで麻酔し、５０ｕＬの０．４ｍｇ／ｍＬのＬＰＳを経口気管内に投与して肺炎症を誘発させた。粒子（マウス当たり１００ｕＬ ＰＢＳ中２×１０８個）を、尾静脈カテーテルを介して注入２時間後または６時間後のいずれかで注射した。安楽死及び試料処置の方法は、サイトスピンＢＡＬＦの代わりに、細胞をＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、及びＬｙ６Ｇで染色し、フローサイトメトリーの前に一晩固定して、各試料中の好中球及びマクロファージのパーセントを決定することを除き、Ｐ．Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａモデル（以下）と共有する。
［結果］
ポリＡ ｎＴＰ投与は、ＬＰＳ後の肺における好中球浸潤及び炎症性サイトカインの濃度を低下させ、好中球媒介性炎症性応答の緩和を示す（図１４、１５、及び１６）。ＰＳ及びポリＡ ｎＴＰの両方は、ＬＰＳ後に肺への好中球浸潤を低下させるが、ポリＡ ＭＰのみが肺内の炎症性サイトカインの濃度を低下させる。（図１７、１８、１９、２０、２１、及び２２）。
［実施例４－最適な投与間隔］
肺への好中球流入のタイムラインを特徴付けるために、及び最大治療上の利益のために感染後の最適な注入間隔を特定するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける気管内ＬＰＳ投与のモデルをＢＡＬＦ試料の分析に使用した。（図２３）。好中球の肺胞気腔への流入は、注入２時間後～６時間後の間で最大である。注入２時間後のポリＡ ＭＰ投与間隔は、これらの条件下での動物における好中球浸潤の最大減少をもたらす（図２４、２５、２６、２７、２８、及び２９）（好中球ＮΦ及びマクロファージＭΦ）。
［実施例５－ポリＡ ＭＰ投与の治療的利益］
マウスをＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染させたＡＬＩ／ＡＲＤＳの細菌モデルを用いてポリＡ ＭＰ投与の治療上の利益を同定し、感染６時間後及び１８時間後にポリＡ ＭＰを非経口投与した。
［方法］
＜粒子の調製＞
ポリＡ粒子は、単一のエマルジョン溶媒蒸発（ＥＳＥ）法を使用して調製した。２０ｍｇのポリＡポリマーを２０ｍＬのジクロロメタン中に溶解させた。次に、１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液７５ｍＬを４２５０ｒｐｍでミキサー上に配置した。ポリＡ溶液をＰＶＡ溶液にゆっくりと注入し、２時間混合した。混合後、溶液を約４５分間沈降させ、粒子を除去し、ＤＩ水で３回遠心分離して洗浄した。次いで、粒子を凍結乾燥し、使用まで－４０℃で保管した。走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）及び動的光散乱法（ＤＬＳ）によって粒径を決定し、血球計算器での計数によって粒子濃度を決定した。
＜細菌増殖＞
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養を、一定の振盪下で３７℃でＤｉｆｃｏ栄養ブロス中で一晩増殖させた。６００ｎｍで光吸光度を測定し、次いで、既知のコロニー形成単位（ＣＦＵ）によって生成された標準曲線上に光学密度（ＯＤ）をプロットすることによって、ブロス中の細菌の濃度を決定した。
＜鼻腔内細菌接種＞
マウスにケタミン／キシラジン混合物を腹腔内注射して麻酔し、３０ｕＬの細菌溶液（各鼻孔に１５ｕＬ）を鼻腔内投与して肺感染を誘発した（図３０）。
＜ポリＡ ＶＴＰ注射＞
感染６時間後または１９時間後に、マウスを拘束装置に入れ、カテーテルを尾静脈に挿入した。各マウスは、約３０ｍｇ／ｋｇの用量で、１００ｕＬの注射体積で２×１０８個の粒子を受け取った（図３０）。
＜安楽死及び試料処理＞
感染２４時間後、マウスをＣＯ２過剰摂取によって安楽死させた。安楽死後、胸腔を露出させ、心臓穿刺を用いて血液を採取した。気管を露出させて開き、肺を３ｍＬのＰＢＳ－／－で洗浄して肺胞気腔の細胞を除去した。ＢＡＬＦ試料を遠心分離し、上清をＥＬＩＳＡのために－８０℃で保管して炎症性サイトカインを定量化した。細胞ペレットを５００ｕＬのＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、アリコートをチュルク血液希釈液（Ｔｕｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｌｕｔｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ）で１：１に希釈し、血球計算器（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）により計数した。サイトスピン試料を調製し、単核細胞から好中球を区別するために細胞を染色した。血液試料及びＢＡＬＦ試料を寒天プレート上に配置し、ＣＦＵを決定するために３７℃で一晩成長させた。血液を遠心分離し、血漿試料を収集し、ＥＬＩＳＡ分析のために－８０℃で保管した。
［結果］
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染したが未処置の対照マウスと比較して、６時間及び１８時間でのポリＡ ＭＰ投与は、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＫＣ、ＭＩＰ２、ＭＣＰ１、及びＴＮＦ－αサイトカインの肺濃度を低下させ、ポリＡ ＶＴＰ処置後の肺炎症の低下を示した（図３１、３２及び３３）。感染１８時間後のポリＡ ＭＰ処置は、ＢＡＬＦにおける好中球の数を有意に減少させたが、感染６時間後の投与は減少させなかった（図３４）。感染１８時間後のポリＡ ＭＰ処置は、処置が肺への感染を制限する役割を果たすことを示す血液中の細菌ＣＦＵを低下させた。
［実施例６－ポリＡ ＭＰ投与の治療上の利益］
ポリＡ ＭＰが細菌ＣＦＵ血中数の低減を引き起こすことを確実にするために、実施例５の方法を、生理食塩水静脈内（ＩＶ）対照と並行して１８時間でのポリＡ ＭＰ粒子投与を用いて繰り返した。生理食塩水ではなくポリＡ ＭＰ投与は、感染した対照と比較して血液中のＣＦＵを低下させ、ポリＡ ＭＰが肺への感染を封じ込め、感染の全身的拡散を防止することを示す。
［実施例７－感染後の肺好中球浸潤の時間経過］
感染後の肺への好中球流入の経過を測定するために、感染１２時間後、１８時間後、２４時間後、３０時間後及び３６時間後のＢＡＬＦ細胞数、ＢＡＬＦ Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０の数、ならびに血中Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０の数を測定した。１２～２４時間の間にＢＡＬＦ細胞の顕著な増加が観察され、肺及び血中Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＣＦＵ数の両方が関連して増加した（図３５及び３６）。
［実施例８－感染後の生存に対するポリＡ ＭＰの治療上の利益］
ポリＡ ＭＰ粒子の投与が感染後の生存にプラスの影響を及ぼすかどうかを決定するために、マウスをＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染させ、マウスの半数に、感染１８時間後にポリＡ粒子を与えた。ポリＡ ＭＰは、感染したマウスにおける死亡率を有意に低下させた（図３７）。
［実施例９－ポリＡ粒子のコンジュゲーション］
ポリＡ粒子が、標的化リガンドをコンジュゲートするのに十分なカルボキシル基を表面に含むことを確認するために、１－エチル－３－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）化学を使用して、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎをコンジュゲートし、続いてビオチン化抗ＩＣＡＭ－１を粒子の表面に結合させた。２μｍのポリＡ粒子を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液中に懸濁させ、血球計算器を使用して計数した。２．２×１０９個の粒子を、５０ｍＭのＭＥＳ中の５ｍｇ／ｍＬのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ溶液４００ｕＬ中に懸濁させた。粒子を１５分間回転させ、その後４００ｕＬの７５ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ溶液を添加し、粒子を一晩回転させた。次に、４ｍｇのグリシンを粒子溶液に加えて反応をクエンチし、粒子を１５分間回転させた。次いで、粒子を遠心分離し、ＰＢＳ－／－に再懸濁させた。Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎのコンジュゲーション後、１×１０７個の粒子を、１００ｕＬの２％ＢＳＡを含むＰＢＳ－／－中の５ｍｇ／ｍＬのビオチン化抗ＩＣＡＭ－１中で、１時間回転させてインキュベートした。次に、アビジン粒子をビオチン－ＰＥで染色し、抗ＩＣＡＭ粒子をヤギ抗マウスＩｇＧ－フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で染色した。次いで、粒子をＡｔｔｕｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで測定し、等価可溶性フルオロクロム（ＭＥＳＦ）ビーズのＲ－フィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）及びＦＩＴＣ分子と比較して、粒子表面上のリガンド部位の総数を決定した。図３８は、フローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。ポリＡ－アビジン及びポリＡ抗ＩＣＡＭは、それぞれ３６，８１９部位／ｕｍ２及び４３，２３５部位／ｕｍ２であった。
［等価物］
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の発明を限定するのではなく、あらゆる点において例示的であるとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明よりもむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び均等性の範囲内に入るすべての変更は、その中に包含されることが意図される。
［参照による組み込み］
本明細書に引用されるすべての刊行物、公開された特許文献、及び特許出願は、各個々の刊行物、公開された特許文献、または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (23)

  1. 患者の好中球媒介性状態の治療、緩和、または再発の予防方法であって、治療有効量の、サリチル酸に加水分解するサリチル酸ポリ無水物エステル（ポリＡ）粒子、及び薬学的に許容される担体を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  2. 前記ポリＡ粒子が、血管標的化ポリＡ粒子（ＶＴＰ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ポリＡ粒子が、非標的化粒子（ｎＴＰ）である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記好中球媒介性状態が、血管血栓症、炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化症、感染症、敗血症、急性肺損傷性関節炎（ＡＬＩ）、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）から選択される１つ以上の状態である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記患者が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記投与が血管内投与である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記投与が静脈内投与である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記投与が、ガイドカテーテルを使用して投与することである、請求項７に記載の方法。
  10. 前記ポリＡ粒子が微粒子である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記ポリＡ粒子がナノ粒子である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記ポリＡ粒子が球体である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記球体が滑らかな表面を含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記ポリＡ粒子が、寸法、形状、及び／または表面形態において異なる多様なポリＡ粒子を含む、請求項１に記載の方法。
  15. ポリＡ粒子を含む医薬組成物と、血管血栓症、炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化症、敗血症、急性肺損傷性関節炎（ＡＬＩ）、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）と診断された患者に前記医薬組成物を投与するための指示書とを含む、キット。
  16. 少なくとも１つのポリＡ粒子と、薬学的に許容される担体、及び／または薬学的に許容される配合物と、を含む、医薬組成物。
  17. 前記少なくとも１つのポリＡ粒子が、
    ａ）２０～７０ｋＤＡの平均分子量を有するポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を水に溶解して、ｐＨ６～７の１重量％のＰＶＡ溶液を生成すること、
    ｂ）ジクロロメタン（ＤＣＭ）中にポリＡを溶解させること、
    ｃ）＞４０００ｒｐｍでの混合中に、前記ＤＣＭ中の前記ポリＡを、前記ＰＶＡ溶液に少なくとも１時間にわたって添加して、エマルジョンを生成すること、
    ｄ）前記エマルジョンを遠心分離すること、
    ｅ）遠心分離されたペレットから遠心分離された溶液を吸引すること、
    ｆ）前記ペレットを脱イオン水中に再懸濁させて、懸濁されたポリＡ粒子を生成すること、
    ｇ）前記懸濁されたポリＡ粒子を洗浄すること、
    ｈ）前記洗浄されたポリＡ粒子を凍結乾燥すること、及び
    ｉ）前記凍結乾燥されたポリＡ粒子を凍結すること、の方法によって作製される、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 前記ポリＡ粒子が、前記ＤＣＭ中に溶解した前記ポリＡポリマーに１つ以上の疎水性生物活性化合物または薬物を添加することによって、前記１つ以上の疎水性生物活性化合物または薬物の担体となるように修飾される、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記ポリＡ粒子が、前記ＤＣＭ中に溶解された前記ポリＡポリマー中に乳化される水相に親水性生物活性化合物または薬物のうちの１つ以上を添加し、１重量％のＰＶＡ水溶液中で前記薬物ポリマーエマルジョンを乳化することによって、前記１つ以上の親水性生物活性化合物または薬物の担体となるように修飾される、請求項１７に記載の医薬組成物。
  20. 前記ポリＡ粒子が、標的化ポリＡ粒子である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  21. 前記標的化ポリＡ粒子が、ポリＡ ＶＴＰ粒子である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記ポリＡ ＶＴＰ粒子が、
    ａ）ポリＡ粒子を５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中に懸濁させること、
    ｂ）前記粒子を５０ｍＭ ＭＥＳ中のＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ溶液中に懸濁させること、
    ｃ）前記懸濁された粒子に１－エチル－３－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液を添加すること、
    ｄ）前記ポリＡ粒子を含む前記溶液にグリセリンを添加すること、
    ｅ）前記溶液を遠心分離すること、
    ｆ）前記ポリＡ粒子をＰＢＳ中に再懸濁させること、及び
    ｊ）前記ポリＡ粒子を含む前記溶液を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ－／－中のビオチン化抗ＩＣＡＭ－１とともにインキュベートすること、の方法によって作製される、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 前記ポリＡ粒子が、ポリＡ ｎＴＰ粒子である、請求項１６に記載の医薬組成物。
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