JP2022539032A

JP2022539032A - ヒト胸腺細胞形成およびｔ細胞機能を強化するためのｂｃｌ１１ｂ過剰発現

Info

Publication number: JP2022539032A
Application number: JP2021576554A
Authority: JP
Inventors: チンタンパレク; ゲイクルークス; クリストファーシート; アメリモンテル－ハーゲン
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2022-09-07
Also published as: EP3986427A1; WO2020264019A1; KR20220042353A; AU2020301413A1; CA3144640A1; US20220347222A1; CN114828876A

Abstract

T細胞療法を用いて対象を治療する方法が、本明細書において開示される。これらの方法は、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)、多能性幹細胞、または成熟T細胞においてBCL11B発現を増大させて、改変細胞を形成させる段階、ならびにT細胞療法のために治療的有効量の改変細胞を対象に投与する段階を含む。HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞におけるBCL11B発現により、該HSPCおよび/もしくは該多能性幹細胞からのT細胞の生成および/もしくは増殖が増加するか、かつ/または該T細胞の増殖が増加する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2019年6月24日に出願された米国仮特許出願第62/865,835号の恩典を主張する。

政府支援の承認
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたK12-HD052954のもとで、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

分野
本発明は、T細胞療法のためのT細胞集団を作製する方法、およびT細胞療法を用いて対象を治療する方法に関する。

背景
米国では毎年、8000人を超える子供および成人が、いくつかの良性および悪性の血液疾患および遺伝性障害に対する治癒的療法である同種異系造血幹細胞移植(HSCT)を受ける。しかし、重大な継続的課題は、重篤な感染症に起因する著しい罹患率および死亡率、ならびにHSCT後のT細胞免疫の回復が遅く不完全なことに関係した悪性疾患再発であった。同種異系HSCT後のT細胞免疫回復には1～2年かかり、多くの患者は、さらに長い期間にわたるT細胞機能欠陥を示す。T細胞再構成は、移植された成熟ドナーT細胞が増殖して、T細胞受容体(TCR)多様性が限定的なプールを生じることにより、HSCT後の最初の数ヶ月中に起こる。しかし、広範なTCRレパートリーを有する長期T細胞免疫の回復には何ヶ月もかかり、これは、胸腺に移動するドナー造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)からの新しいT細胞の生成(胸腺細胞形成（thymopoiesis）)を経て起こる。

さらに、操作T細胞を用いる免疫療法は、急性白血病およびリンパ腫において有望な寛解率を示しているが、注入されたT細胞の疲弊または持続性の不足が原因となって、多くの場合、疾患が再発する。さらに、腫瘍微小環境において注入T細胞の機能が不十分であるために、固形悪性腫瘍に対する操作T細胞の有効性は極めて限定されている。

概要
T細胞療法のためのT細胞集団を作製する方法、およびT細胞療法を用いて対象を治療する方法が、本明細書において開示される。

いくつかの態様において、T細胞療法を用いて対象を治療する方法が提供される。この方法は、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞を提供する段階、およびHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞におけるBCL11B発現を増大させて、対応する対照細胞と比べてBCL11B発現が増大した改変細胞を作製する段階を含む。BCL11B発現の増大により、対応する対照細胞と比べて、HSPCもしくは多能性幹細胞からのT細胞の生成および/もしくは増殖が増加するか、または成熟T細胞の生成および/もしくは増殖が増加する。T細胞療法のために、治療的有効量の改変細胞が対象に投与される。いくつかのこのような態様において、対象はHSCT患者であり、T細胞療法は、HSCT後の対象における胸腺T細胞再構成を含む。付加的な態様において、対象は癌患者であり、T細胞療法は、癌を治療するためのキメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法または操作T細胞受容体(TCR)T細胞療法である。いくつかのこのような態様において、方法は、対象に改変細胞を投与する前に、CARまたはTCRをコードする異種核酸分子を用いてHSPC、多能性幹細胞、成熟T細胞、または改変細胞に形質導入する段階をさらに含む。

付加的な態様において、ヒト対象向けのT細胞療法のためのT細胞集団を作製する方法が提供される。この方法は、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞を提供する段階、およびHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞におけるBCL11B発現を増大させて、対応する対照細胞と比べてBCL11B発現が増大した改変細胞を形成させる段階を含む。BCL11B発現の増大により、対応する対照細胞と比べて、HSPCもしくは多能性幹細胞からのT細胞の生成および/もしくは増殖が増加するか、または成熟T細胞の増殖が増加して、T細胞療法のためのT細胞集団が形成される。いくつかのこのような態様において、改変細胞は、HSPCおよび/もしくは多能性幹細胞からのT細胞の分化、生成、および/もしくは増殖、または成熟T細胞の増殖に十分な条件下で、(例えば、14日超または30日超の期間)インビトロでインキュベーションされる。いくつかの態様において、T細胞集団は、HSCT後の対象における胸腺T細胞再構成のためにHSCT患者に投与するためのHSPC集団である。付加的な態様において、T細胞集団はCAR T細胞またはTCR T細胞を含み、T細胞療法はCAR T細胞療法またはTCR T細胞療法である。いくつかのこのような態様において、方法は、対象に細胞を投与する前に、CARまたはTCRをコードする異種核酸分子を用いてHSPC、多能性幹細胞、成熟T細胞、または改変細胞に形質導入する段階をさらに含む。

いくつかの態様において、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞におけるBCL11B発現は、BCL11Bをコードする異種核酸を用いてこれらの細胞に形質導入することによって増大される。特定の態様において、これらの細胞は、MNDプロモーターまたはMSCVプロモーターなどのプロモーターに機能的に連結されているBCL11Bをコードする核酸を含むウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターによって形質導入される。いくつかの態様において、改変細胞におけるBCL11B発現は、少なくとも、CD34+ヒト胸腺T細胞前駆体またはCD34-CD4+CD8+ヒト胸腺T細胞前駆体などの陽性対照細胞のBCL11B発現と等しい。特定の態様において、改変細胞は、BCLB11B発現が増大していない対応する対照成熟T細胞におけるBCL11B発現より2～10倍多いBCL11B発現を有する成熟T細胞である。

いくつかの態様において、改変細胞から増殖するT細胞は、対応する対照細胞と比べて、疲弊の遅延を示し、セントラルメモリー免疫表現型が増加し、かつ/またはインターロイキン2産生および/もしくはTNF-α産生が増大している。特定の開示される態様において、セントラルメモリー免疫表現型が増強されているT細胞は、CD45RO+CD62L+CCR7+T細胞であってよく、改変細胞からのT細胞生成および/または増殖は、Notchシグナル伝達に無関係であり得る。

本開示の前述の特徴および利点ならびに他の特徴および利点は、添付図面を参照して次に記載する、いくつかの態様の以下の詳細な説明から、より明らかになるであろう

ヒト胸腺細胞形成の段階を例示する概略図を示す。BM:骨髄；HPC:造血前駆細胞、ISP:未成熟なシングルポジティブ細胞。ヒト胸腺細胞形成時のBCL11BおよびTCF7の発現プロファイルを例示するグラフを示す。ヒト骨髄造血幹細胞および胸腺集団におけるBCL11BおよびTCF7のmRNA発現(RNA-Seqデータ）(平均値、SEM、細胞型1つにつきn＝2の生物学的レプリケート、Thy1をThy4と比較した場合の、両遺伝子についてのFDR補正後のp値<0.05)。FPKM:100万個のリード当たりキロベース当たりの断片。HSC:造血幹細胞(CD34+CD38-)；Thy1:CD34+CD7-CD1a-細胞；Thy2:CD34+CD7-CD1a-細胞；Thy3:CD34+CD7-CD1a+細胞；Thy4:CD4+CD8+細胞。図3A～3FはFACS解析結果およびグラフを示し、BCL11B機能獲得によってヒトHSPCのT細胞系列分化が促進されることを示している。BCL11B-GFP(BCL11B)レンチウイルスまたは対照GFP(対照)レンチウイルスによって形質導入したCD34+臍帯血(CB)HSPCを、人工胸腺オルガノイド(ATO)中で培養した(FACSによって選別したCD34+GFP+細胞2,000～5000個/ATO、インビトロT細胞分化系)。(図3A)CD34+GFP+細胞を選別するためのFACSゲート。(図3B)逐次的な時点における培養物のFACS(CD45+GFP+細胞に予めゲートをかけている。9回の実験から得た代表的データ。各実験は、互いに異なるCBプールを用いて行った)。(図3C)T細胞分化の動態(互いに異なるCBプールを用いてそれぞれ行った9回の実験から得たデータ)。CD3-CD4+CD8+細胞のパーセンテージを例として示している。BCL11B HSPCは、分化が有意に加速されている(p<0.05、BCL11Bを対照と比較)。時間に対する様々な段階の比率のロジットの二次多項回帰(曲線)および様々な段階の比率を求めるための個々のデータポイントを示している。(図3D)運命が決定されたT前駆体(CD7+CD1a+)、CD4+CD8+細胞、およびCD8+SP細胞の細胞数、BCL11B(図3B)を対照(図3C)と比較した場合のp<0.05、平均値、SEM(互いに異なるCBプールを用いてそれぞれ行った、n＝5～6回の実験)。(図3E)成熟ナイーブT細胞表現型(3+TCRαβ+45RA+CCR7+62L+1a-)を示している、BCL11B HSPCから発生するCD8シングルポジティブ(SP)細胞のFACS。(図3F)12週時点のATOのフローサイトメトリー解析(CD45+GFP+細胞に予めゲートをかけている。2回の実験のうちの1つから得た代表的データ。各実験は、互いに異なるCBプールを用いて行った)。図4A～4Cは、FACS解析結果およびグラフを示し、BCL11Bを過剰発現するHSPCに由来するT細胞は、増殖およびセントラルメモリー免疫表現型を有する細胞への分化が促進されることを示している。図2のATO培養物に由来する、6～12週目に選別されたナイーブT細胞を抗CD3/CD28ビーズで刺激し、IL-2の存在下で再培養した(0日目および10日目に刺激した)。(図4A)刺激前にATO培養物から成熟ナイーブT細胞を選別するためのFACS戦略。(図4B)セントラルメモリー免疫表現型(CCR7+CD62L+CD45RO+)を有する細胞の出現率を評価するための、ATO刺激後10日目の(図4B)に示す培養物のフローサイトメトリー解析。平均値およびSEMを示している。BCL11Bを対照と比較した場合のp<0.05。(図4C)抗CD3/CD28ビーズによる刺激後の培養における細胞数。BCL11Bを対照と比較した場合のp<0.001。(図4B)および(図4C)の実験回数はn＝4回。実験1および2ならびに実験3および4を、別々のCBドナープールに由来する細胞をそれぞれ用いて実施した(すなわちCBドナープールの数はn＝2)。図5A～5FはFACS解析結果およびグラフを示し、BCL11B過剰発現によって末梢血T細胞の機能が強化されインビトロでのCAR T細胞の抗癌作用が長くなることを示している。(図5A～5D)ヒト末梢血から単離されたT細胞(PBTC)を、BCL11B(アイソフォーム1)-GFP(BCL11B1)レンチウイルス、BCL11B(アイソフォーム2)-GFP(BCL11B2)レンチウイルス、または対照GFP(対照)レンチウイルスによって形質導入した。GFP+細胞を選別し、図5A～5Dで用いた。(図5A)BCL11B1(B1)細胞、BCL11B2(B2)細胞、対照細胞、および形質導入されていない(UT)細胞におけるアイソフォーム1(B1)、アイソフォーム2(B2)および全BCL11B(B)の発現についてのqPCR。(図5B)サイトカイン産生(PMA刺激)。(図5C～5D)選別した細胞をCD3/CD28で繰り返し刺激した後の(0日目、10日目、および20日目に刺激)、セントラルメモリー免疫表現型(CCR7+CD62L+、上のプロット図、細胞はすべてCD45RO+であった)および疲弊マーカー(下のプロット図)(図5C)ならびに増殖(図5D)についてのFACS。(図5A～5Dにおいて、BCL11B1について2回の独立した実験を、BCL11B2について1回の実験を、それぞれトリプリケートで行い、1つの代表的な実験を示している。各実験は、互いに異なるドナーを用いて実施した)。MOI=10でBCL11Bベクターによって形質導入されたT細胞は、CD3/CD28刺激に応答して増殖しなかった。(図5E～5F)CD19キメラ抗原受容体(CAR)レンチウイルスによって形質導入するか(CD19)またはCD19 CARかつBCL11B1レンチウイルスによって同時形質導入した(CD19-B)30,000個のPBTCを、30,000個のCD19+急性リンパ性白血病(ALL)細胞と(1:1のエフェクター対標的比)で同時培養し、次いで、5日、9日、14日、および20日目に新たなALL細胞で再刺激した(トリプリケートで1回の実験)。ALL細胞数(図5E)ならびに培養5日目および20日目のCD19+ ALLおよびCD3+T細胞についてのFACS(図5F)。誤差棒(図5B、5D、5E):SEM。図6A～6Bは、数学的モデルおよびグラフを示し、BCL11Bを過剰発現する細胞がT細胞分化期間中の複数の細胞状態遷移時に、加速された分化を示すことを示している。BCL11B-GFP(BCL11B)レンチウイルスまたは対照GFP(対照)レンチウイルスによって形質導入された臍帯血(CB)HSPCから作られたATO培養物における増殖速度、死滅速度、および細胞状態遷移速度を数学的にモデル化した。(図6A)数学的モデルに含まれる分化段階、パラメーター(b、d、t、K)、および微分方程式。S1～6:T細胞分化の段階。S1:CD4-CD8-(ダブルネガティブ、DN)、S2:CD4+CD8-CD3-(未成熟シングルポジティブISP)；S3:CD4+CD8+CD3-(初期ダブルポジティブ、CD3-DP)、S4:CD4+CD8+CD3+(後期ダブルポジティブ、CD3+DP)；S5:CD4+CD8-CD3+(CD4シングルポジティブ、CD4SP)；S6:CD4-CD8+CD3+(CD8シングルポジティブ、CD8SP)。BCL11B ATOにおいて上昇することがモデルによって予測される増殖速度および遷移速度を、黒い矢印で示している。K:ATOの最大細胞収容力。(図6B)BCL11B ATOおよび対照ATOでの様々な分化段階における細胞の細胞数についてのモデル化した動態。図7A～7Dは、HSPCにおけるBCL11B過剰発現が、T細胞転写プログラムを急速に誘導し、別の分化系列プログラムを抑制することを示す、図およびグラフである。BCL11B-GFP(BCL11B)レンチウイルスまたは対照GFP(対照)レンチウイルスによって形質導入したCD34+臍帯血(CB)HSPCを、RNA-Seq用に選別した。(図7A)実験スキームを示す図。(図7A～7B)CD34+CD7-CD1a-(Thy1)およびCD34+CD7+CD1a+(Thy3)(図7B)またはBCL11Bノックダウンおよびスクランブル対照(図7C)の発現に基づいて順位付けした遺伝子の中で、BCL11B細胞または対照細胞において上方調節された遺伝子の濃縮。B_up、C_up:共変量としてCBドナーおよび時点(48時間または7日)を含む、BCL11Bと対照についての発現差異多変量解析において、BCL11B細胞または対照細胞においてそれぞれ上方調節された遺伝子(FDR<0.05)。B7_up、C7_up:7日目のATOから選別されたBCL11B細胞または対照細胞において上方調節された遺伝子(FDR<0.05)。NES:正規化したエンリッチメントスコア。FDR:偽発見率で補正されたp値。(図7D)造血において幹細胞/前駆細胞または分化系列の分化に関連していることが公知である遺伝子のサブセットの変化率(図7Cの多変量解析におけるこれらの遺伝子に対するFDRは0.05未満)。正の変化率:BCL11B細胞において上方調節されている。負の変化率:対照細胞において上方調節されている。図8A～8Dは、BCL11BがT細胞系列分化を開始するのに十分な能力を有し、NOTCHシグナル伝達の非存在下で骨髄系分化を阻害できることを示す、FACS解析結果およびグラフを示す。BCL11B-GFP(BCL11B)レンチウイルスまたは対照GFP(対照)レンチウイルスによって形質導入された臍帯血(CB)HSPCを、MS5オルガノイド(NOTCHシグナル伝達なし)またはMS5-DLL1 ATO(NOTCH1シグナル伝達)中で培養した。(図8A)FACS解析(培養20日目)；(図8B)培養物中のT細胞前駆体(CD5+CD7+CD56-)のパーセンテージ；および(図8C)培養物中の骨髄系(CD33+)細胞のパーセンテージ(平均値、SEM、対応のあるt検定、互いに異なるCBプールをそれぞれ用いる3回の実験)。(図8D)培養物から選別したCD5+CD7+細胞における遺伝子発現(qPCR)(12日目、対照MS5について選別したCD45+細胞、0は発現が検出されなかったことを表す。2回の実験のうち1回を示している)。

配列表
添付の配列リストに挙げた核酸配列およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822において定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語およびアミノ酸の3文字コードを用いて示す。各核酸配列の1つの鎖のみを示すが、相補鎖は、提示される鎖を任意に参照することにより含まれると理解される。配列表は、2020年6月23日に作成し「Sequence.txt」(約22KB)と名付けたファイル形態のASCIIテキストファイルとして提出され、このファイルは参照により本明細書に組み入れられる。
SEQ ID NO: 1は、BCL11Bアイソフォーム1のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO: 2は、BCL11Bアイソフォーム1をコードする例示的なヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO: 3は、MNDプロモーターである。
SEQ ID NO: 4は、BCL11Bアイソフォーム2をコードする例示的なヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO: 5は、BCL11Bアイソフォーム2のアミノ酸配列である。

詳細な説明
I 序論
T細胞の分化および機能を強化するための戦略は、次の少なくとも3つの臨床領域において不可欠に必要とされている:1)骨髄移植のような細胞療法によって治療された患者の転帰を良くすること；2)操作されたT細胞を用いる免疫療法の、癌に対する有効性を高めること；および3)免疫療法に適用するために、多能性幹細胞からのT細胞作製を可能にすること。骨髄移植は良性および悪性の血液疾患に対する治癒的治療であるものの、胸腺でのT細胞再構成の遅れに起因する病的状態および死亡は、引き続き、重要な臨床的課題である。操作されたT細胞を用いる免疫療法は、急性白血病およびリンパ腫において有望な寛解率を示しているが、注入されたT細胞の疲弊または持続性の不足が原因となって、多くの場合、疾患が再発する。さらに、腫瘍微小環境において注入T細胞の機能が不十分であるために、固形悪性腫瘍に対する操作T細胞の有効性は極めて限定されている。

HSPCおよび多能性幹細胞は、免疫療法用に簡単に手に入る同種異系T細胞の魅力的供給源である。しかし、これらの前駆細胞から十分な数のT細胞を作製する効率的な技術が無いことが、HSPCおよび多能性幹細胞に由来するT細胞を用いる免疫療法を臨床に移行するにあたっての大きな障害であり続けている。

これらの必要を満たすことを目的として、本明細書において初めて開示されるように、ヒトHSPCにおいてBCL11Bを超生理学に過剰発現させると、成熟した機能的T細胞への分化が加速し、インビトロT細胞分化モデルにおける成熟T細胞の生産が増加する。さらに、BCL11Bを過剰発現するHSPCから生じた成熟T細胞は、対照である過剰発現しないHSPCから生じたT細胞と比べて、機能が強化され、疲弊までの時間が延ばされている。

したがって、宿主細胞(例えばT細胞)におけるBCL11B発現は、少なくとも、1)骨髄移植後の、胸腺でのT細胞再構成の強化および促進；2)癌に対する免疫療法薬として患者に注入される操作T細胞(例えばCAR T細胞)の機能および持続性の強化ならびに疲弊の防止；ならびに3)簡単に手に入る同種異系免疫療法T細胞製品を患者向けにエクスビボで生成するために、十分な生産量の機能的T細胞を多能性幹細胞から生成すること(3番目の用途の場合、BCL11B活性化が、多能性幹細胞からT細胞を生成するためのエクスビボ培養系と合わせて使用される)、のために使用することができる。

転写因子遺伝子BCL11Bのホモ接合性欠失を有するマウスの多系列前駆細胞またはT細胞前駆細胞についての公開されている研究によって、マウスにおけるT細胞の正常な分化および機能にBCL11Bが必要とされることが示されている。しかし、BCL11Bは、マウスHSPCにおけるT細胞遺伝子発現の開始には必要とされず(Li et al, Science 2010)、かつ意外なことには、過剰発現によるBCL11B機能獲得は、マウスHSPCに細胞死をもたらす。さらに、今までのところ、BCL11Bを超生理学的に活性化すると、ヒトまたはマウスの造血前駆細胞の成熟T細胞への分化が促進もしくは加速されるか、またはT細胞の機能が向上することを示す証拠は、報告されていない。

胸腺細胞形成の初期段階にとって不可欠な他の転写因子には、TCF7、GATA3、およびNOTCH1が含まれる。Tcf7およびGata3の機能獲得がSP T細胞へのマウスHSPCの分化を促進するとは報告されていない。さらに、TCF7またはGATA3の過剰発現は、ヒトCB HSPCからのSP TCRαβ+T細胞の生成を増加させない(Van de Walle et al., Nat Commun. 2016；7:11171)。注目すべきことには、GATA3のノックダウンまたはNOTCH1シグナル伝達の阻害は、ヒト胸腺前駆細胞のT細胞分化をそれぞれ低減または抑止するが(Van de Walle et al., Nat Commun. 2016；7:11171； Van de Walle et al., J Exp Med. 2013 Apr 8；210(4):683-97)、これらの遺伝子の機能獲得により、TCRαβ+細胞の生成が阻害される(Van de Walle et al., J Exp Med. 2013 Apr 8；210(4):683-97； Taghon et al., J Immunol. 2001 Oct 15；167(8):4468-75)。非限定的な説明は、胸腺細胞形成時のこれらの遺伝子の発現時期を正確に段階特異的に調節する必要性が、これらの遺伝子が過剰発現された場合のT細胞分化に対する矛盾した影響の原因であり得るというものである。これらの結果から、転写因子機能の機能獲得および機能喪失についての研究に関連する予測不能性が明らかにされ、特にT細胞分化という文脈において、機能獲得による結果は機能喪失についての研究から予測できないことが示される。

II 用語
別段の注記の無い限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishers, 2009；およびMeyers et al. (eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine, published by Wiley-VCH in 16 volumes, 2008；ならびに他の類似参照文献において見出すことができる。

本明細書において使用される場合、文脈において特に別段の指示がない限り、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、単数形と複数形の両方を意味する。例えば、用語「細胞」は、単一の細胞または複数の細胞を含み、句「少なくとも1つの細胞」と等価とみなすことができる。本明細書において使用される場合、用語「含む(comprises)」は「含む(includes)」を意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる任意およびすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびにすべての分子量または分子質量の値は近似値であり、別段の定めがない限り、説明のために提供されることをさらに理解すべきである。本明細書において説明するものと同様または等価な多くの方法および材料を使用することができるが、特定の適切な方法および材料を本明細書において説明する。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図しない。

本開示の様々な態様の再検討を容易にするために、特定の用語についての以下の説明を提供する。

約
文脈において特に指示がない限り、「約」は、基準値のプラス5％またはマイナス5％を意味する。例えば、「約」100は、95～105を意味する。

投与
選択した経路による、対象への組成物の導入。投与は局所的または全身的であることができる。例えば、選択した経路が静脈内である場合、組成物は、対象の静脈に該組成物を導き入れることによって投与される。例示的な投与経路には、経口経路、注射経路(皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、関節内、くも膜下腔内(例えば腰椎穿刺)、および静脈内など)、舌下経路、直腸経路、経皮経路(例えば局所)、鼻腔内経路、膣経路、および吸入経路が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

自己免疫障害
免疫系が内因性抗原に対して免疫応答(例えば、B細胞応答またはT細胞応答)を起こし、結果として組織を損傷する障害。特に、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、移植片対宿主病、およびグレーブス病がそうであるように、例えば、関節リウマチは自己免疫障害である。

B細胞リンパ腫/白血病11Bタンパク質(BCL11B)
ヒトにおいてBCL11B遺伝子にコードされるタンパク質。BCL11Bタンパク質配列の非限定的な例は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられるGenBank番号NP_612808.1、NP_075049.1、NP_001269167.1、およびNP_001269166.1において見出すことができる。

CD34
以前は造血前駆細胞抗原1として公知であった細胞表面抗原であり、MY10は、ヒト造血幹細胞の公知のマーカーである。ヒトCD34遺伝子は、染色体1q32に位置し、長さが26kbであり、8つのエクソンを有する。CD34は、67kDaの膜貫通型糖タンパク質である。CD34は、ヒト造血前駆細胞上で選択的に発現される。CD34の生物学的機能は、依然として不明である。

キメラ抗原受容体(CAR)
T細胞受容体の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインに結合された細胞外抗体由来ターゲティングドメイン(例えばscFv)を有する操作されたT細胞受容体。「キメラ抗原受容体T細胞」は、CARを発現するT細胞であり、CARの抗体由来ターゲティングドメインによって決定される抗原特異性を有する。CARを作製する方法は利用可能である(例えば、Park et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011； Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013； Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013； PCT公報WO2012/079000、WO2013/059593、および米国特許出願公開第2012/0213783号を参照されたい。各文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。

対照
参照標準。いくつかの態様において、対照は、陰性対照、例えば、BCL11Bの発現が増大するように改変されていない細胞または細胞集団である。他の態様において、対照は、陽性対照、例えば、公知のレベルのBCL11B発現を有する細胞である。さらに他の態様において、対照は、過去対照または標準基準値もしくは標準基準値の範囲(例えば、予後もしくは転帰が公知である患者群など以前に試験された対照試料、またはベースライン値もしくは正常値を示す試料群)である。

試験試料と対照の差は、増加または逆に減少であることができる。差は、定性的差または定量的差、例えば統計的有意差であることができる。いくつかの例において、差は、対照と比べて少なくとも約5％、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、少なくとも約250％、少なくとも約300％、少なくとも約350％、少なくとも約400％、または少なくとも約500％の増加または減少である。

発現
核酸配列の転写または翻訳。例えば、遺伝子は、そのDNAがRNAまたはRNA断片へと転写される場合、いくつかの例ではプロセシングされてmRNAになる場合、発現され得る。遺伝子はまた、そのmRNAがアミノ酸配列、例えばタンパク質またはタンパク質断片に翻訳される場合、発現され得る。特定の例において、異種遺伝子は、RNAへと転写される場合、発現される。別の例において、異種遺伝子は、そのRNAがアミノ酸配列に翻訳される場合、発現される。発現の調節には、転写、翻訳、RNAの輸送およびプロセシング、mRNAなどの中間分子の分解を制御すること、または特定のタンパク質分子の産生後に該タンパク質分子の活性化、不活性化、区画化、もしくは分解を行うことが含まれ得る。

発現制御配列
それが機能的に連結されている異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列は、ある核酸配列の転写、および必要に応じて翻訳を該発現制御配列が制御および調節する場合、該核酸配列に機能的に連結されている。したがって、発現制御配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前にある開始コドン(ATG)、イントロンに対するスプライシングシグナル、mRNAの適切な翻訳を可能にするための当該遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、および停止コドンが含まれ得る。用語「制御配列」は、その存在が発現に影響し得る構成要素を少なくとも含むことが意図され、かつその存在が有利である付加的な構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列もまた含み得る。発現制御配列は、プロモーターを含み得る。

プロモーターは、転写を指示するのに十分な最小限の配列である。細胞型特異的、組織特異的、または外部のシグナルまたは作用物質によって誘導可能なプロモーターがプロモーター依存性の遺伝子発現を制御可能にするのに十分であるプロモーターエレメントもまた含まれる；このようなエレメントは、当該遺伝子の5'領域または3'領域に位置してよい。構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる。例えば、細菌系でクローニングする場合、誘導性プロモーター、例えば、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lacハイブリッドプロモーター)などが使用され得る。1つの態様において、哺乳動物細胞系でクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、レトロウイルス末端反復配列；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を使用することができる。組み換えDNAまたは合成技術を用いて作製されたプロモーターもまた、核酸配列の転写を実現するために使用されてよい。

ポリヌクレオチドを、プロモーター配列を含む発現ベクターに挿入することができ、該プロモーター配列は、宿主における挿入された遺伝子配列の効率的な転写を容易にする。典型的には、発現ベクターは、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特異的核酸配列を含む。

発現ベクター
発現させようとするヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含むベクター。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によってまたはインビトロ発現系において供給されてよい。発現ベクターには、当技術分野において公知のあらゆるベクター、例えば、組換えポリヌクレオチドを組み入れるコスミド、プラスミド(例えば、裸のものまたはリポソーム中に含まれるもの)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)が含まれる。

造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)
造血幹細胞は、あらゆる確定された血液リンパ分化系列の子孫を生じる、多分化能であり自己再生する細胞である。さらに、限定的な数のHSPCが、免疫低下対象の、すべての血液細胞型および造血幹細胞を含むそれらの前駆細胞を、細胞再生によって完全に再構成することができる。「前駆細胞」は、定められた細胞系列の子孫(単一系列前駆細胞)または複数の細胞系列の子孫(多系列前駆細胞)を生じる、自己再生しない細胞である。造血幹細胞および前駆細胞の1つの非限定的な具体例は、未成熟T細胞および成熟T細胞を生じる「T細胞前駆細胞」である。HSPCの非限定的なマーカーにはCD34が含まれる。

異種
別の遺伝子供給源に由来すること。ある細胞にとって異種である核酸分子は、該核酸分子が発現される細胞以外の遺伝子供給源に由来した。1つの非限定的な具体例において、BCL11Bなどのタンパク質をコードする異種核酸分子は、哺乳動物細胞などの細胞において発現される。細胞または生物に異種核酸分子を導入するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、パーティクルガンアクセラレーション、および相同組換えを含む、核酸による形質転換である。

新生物、癌、または腫瘍
新生物は、過剰な細胞分裂の結果として生じる、組織または細胞の異常増殖物である。新生物性増殖は、腫瘍をもたらし得る。個体中の腫瘍の量は「腫瘍量」であり、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は「良性」と呼ばれる。周囲組織に浸潤するかもしくは転移できる(または両方)腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。

同じ組織型の腫瘍は、特定の器官に由来する原発腫瘍であり、様々な亜型の腫瘍に分類され得る。例えば、肺癌は、腺癌、小細胞腫瘍、扁平上皮腫瘍、または非小細胞腫瘍に分類することができる。

肉腫(結合組織癌)および癌腫(上皮細胞癌)などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸直腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、およびCNS腫瘍(例えば、神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、メナンギオマ、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫)が含まれる。

血液癌またはリンパ系癌の例には、白血病、例えば急性白血病(例えば、急性リンパ性白血病(T-ALLまたはB-ALLなど)、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、および骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病)、慢性白血病(例えば、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病)、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫(緩徐進行型および高悪性度型)、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、および脊髄形成異常症が含まれる。

核酸分子
RNA、cDNA、ゲノムDNA、および合成型のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに前記の混合ポリマーを含み得る、ポリマー型のヌクレオチド。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型を意味する。本明細書において使用される場合、用語「核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。別段の指定が無い限り、通常、核酸分子は、少なくとも10塩基の長さである。この用語は、一本鎖型および二本鎖型のDNAを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド結合および/または天然に存在しないヌクレオチド結合によって一緒に連結されている、天然に存在するヌクレオチドおよび改変されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。「cDNA」は、mRNAに相補的または同一である、一本鎖型または二本鎖型いずれかのDNAを意味する。「コードする」とは、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の性質であって、定められたヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNA、およびmRNA)または定められたアミノ酸配列のいずれかおよびそれらに起因する生物学的特性を有する、生物学的プロセス中の他のポリマーおよび高分子を合成するための鋳型として働く、固有の性質を意味する。

機能的に連結される
第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的に関係する状態で配置されている場合、該第1の核酸配列は該第2の核酸配列に機能的に連結されている。例えば、MNDプロモーターなどのプロモーターは、該プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、該コード配列に機能的に連結されている。通常、機能的に連結されたDNA配列は、隣接しており、かつ2つのタンパク質コード領域を結合するために必要である場合は、同じリーディングフレーム中にある。

多能性幹細胞
分裂することによって無制限に自己再生する能力を有し、かつ多能性であり、したがって、3種の一次胚葉の細胞(例えば、外胚葉、内胚葉、および中胚葉の細胞)のいずれか1つに、ゆえに、体内の任意の細胞系列に発達する能力を有する、細胞。多能性幹細胞には、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。多能性幹細胞の非限定的なマーカーにはCD326+(EpCAM+)が含まれる。

対象
生きている多細胞性脊椎動物の生物。ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含むカテゴリー。1つの例において、対象はヒトである。

T細胞
免疫応答に不可欠な白血球。T細胞には、CD4+T細胞およびCD8+T細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。CD4+Tリンパ球は、「分化クラスター4」(CD4)として公知であるマーカーを表面に有する免疫細胞である。ヘルパーT細胞としても公知のこれらの細胞は、抗体応答およびキラーT細胞応答を含む免疫応答を統率するのを助ける。別の態様において、CD4+細胞は、調節性T細胞(Treg)である。CD8+T細胞は、「分化クラスター8」(CD8)マーカーを有する。1つの態様において、CD8 T細胞は、細胞障害性Tリンパ球である。T細胞のエフェクター機能は、T細胞の特殊な機能、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性である。成熟T細胞は、CD3+CD4+CD8-またはCD3+CD4-CD8+であるT細胞である。

T細胞療法
T細胞を対象に投与すること、または成熟してT細胞になる細胞を対象に投与することを含む、治療的介入。T細胞療法の非限定的な例には、対象における胸腺T細胞再構成のためのHSPC投与、および対象の癌治療のためのCAR T細胞療法または操作T細胞受容体(TCR)T細胞療法の適用を含む。

治療的有効量
例えば治療のために治療的物質が投与される対象において所望の効果を実現するのに十分な、治療的物質の量。非限定的な例において、これは、移植後のHSCT患者におけるT細胞再構成を向上させる、本明細書において説明するようにBCL11B発現を増大させた成熟T細胞の量であることができる。理想的には、治療的有効量は、実質的な細胞障害作用を対象に引き起こさずに、治療的効果をもたらす。

対象に投与される治療的物質の治療的有効量は、対象に関連するいくつかの因子、例えば、総合的な健康状態、および/もしくは対象の体重、治療される病態の重症度およびタイプ、ならびに/または投与様式に応じて変動する。治療的有効量は、その前またはその後の投与と組み合わせて有効な応答を獲得することに寄与する、分割用量を包含する。例えば、本明細書において説明したようにBCL11B発現を増大させた改変細胞の治療的有効量は、1回の投与(もしくは注入)または数回の投与で、例えば、数日または数週間続く治療コース中に毎日、投与することができる。投与量を変更し、結果として生じる治療応答、例えば向上したT細胞再構成を測定することにより、治療的有効量を決定することができる。

形質導入される
形質導入された細胞とは、分子生物学的技術によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書において使用される場合、「形質導入された」等の用語(例えば、形質転換、トランスフェクション、形質導入、形質転換された、など)は、それらによって核酸分子がそのような細胞に導入され得るあらゆる技術を包含し、ウイルスベクターによる形質導入、プラスミドベクターによる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、およびパーティクルガンアクセラレーションによるDNAの導入を含む。

疾患または病態を治療すること、抑制すること、または予防すること
疾患または病態を「予防すること」とは、疾患または病態の完全な発達を阻止することを意味する。「治療すること」とは、疾患または病態の徴候または症状が発達し始めた後に、該徴候または症状を改善する治療的介入、例えば、腫瘍量の減少または転移のサイズの数の減少を意味する。「改善すること」とは、癌などの疾患または病態の徴候または症状についての数または重症度の低減を意味する。

ベクター
宿主細胞に導入され、それによって、形質転換された宿主細胞をもたらす核酸分子。組換えDNAベクターは、組換えDNAを有するベクターである。ベクターは、宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列、例えば複製起点を含むことができる。ベクターはまた、1つまたは複数の選択マーカー遺伝子および当技術分野において公知である他の遺伝子エレメントも含むことができる。ウイルスベクターは、1種または複数種のウイルスに由来する少なくともいくつかの核酸配列を有する組換え核酸ベクターである。複製能を欠いているウイルスベクターとは、複製に不可欠な遺伝子機能を少なくとも1つ欠いているために、複製に必要とされるウイルスゲノムの1つまたは複数の領域を補完する必要があるベクターである。例えば、典型的な宿主細胞、特に、治療方法の過程でウイルスベクターに感染し得るヒト患者のものにおいて、ウイルスベクターが複製しないようなもの。

十分な条件下
所望の活性を可能にする任意の環境を説明するのに使用される語句。

III BCL11B発現を増大させた改変細胞
本明細書において開示される方法は、増大したBCL11B発現を有するように改変されているHSPC、多能性幹細胞、T細胞(例えば成熟T細胞)、またはそれらの組合せを使用する。BCL11B発現の増大は、任意の適切な手段、例えば、プロモーターに機能的に連結された、BCL11Bをコードするベクター(例えばレンチウイルスベクター)を用いてHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞に形質導入することによって達成される。いくつかの態様において、BCL11B遺伝子は、CRISPR/Cas9またはTALENなどの遺伝子編集技術を用いて、増大されたBCL11B発現および/または調節されたBCL11B発現を可能にするゲノム領域、例えば内因性プロモーターに由来する領域に挿入される。

多能性幹細胞を用いる本明細書において説明される任意の態様において、多能性幹細胞に由来する細胞、例えば、中胚葉系前駆細胞、または多能性幹細胞に由来し成熟してT細胞になる能力がある任意の細胞が、多能性幹細胞の代わりに使用され得る。

別の態様において、BCL11B発現の増大は、例えばCRISPR/Cas9技術を用いることにより、天然BCL11B遺伝子のプロモーターを標的として細胞におけるその発現を増大させる作用物質で、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞を処理することによって達成される。改変細胞におけるBCL11B発現の増大により、BCL11B発現が増大していない対応する対照細胞と比べて、HSPCもしくは多能性幹細胞からのT細胞の生成および/もしくは増殖が増加するか、または成熟T細胞の増殖が増加する。いくつかの態様において、改変細胞は、それを必要とする対象に投与される。

ヒトのB細胞リンパ腫/白血病11Bタンパク質(BCL11B)は、BCL11B遺伝子によってコードされている。理論に拘束されるわけではないが、BCL11Bは、TCF7、NOTCH1、およびGATA3を含む、ヒトの胸腺細胞形成に関与している多数の転写因子のうちの1つである。いくつかの態様において、BCL11B発現を増大させると、HSPCおよび多能性幹細胞の胸腺細胞形成が加速し、HSPCまたは多能性幹細胞からのT細胞、例えば成熟T細胞の生成が増加する。さらに、成熟T細胞においてBCL11B発現を増大させると、成熟T細胞の増殖が増加する。特定の態様において、改変細胞から増殖するT細胞では、対応する対照細胞と比べて、疲弊までの時間が延ばされ、セントラルメモリー免疫表現型が増加し、かつ/またはインターロイキン2産生および/もしくはTNF-α産生が増加している。特定の開示される態様において、セントラルメモリー免疫表現型が増強されたT細胞は、CD45RO+CD62L+CCR7+T細胞であってよい。改変細胞からのT細胞生成および/もしくは増殖は、Notchシグナル伝達とは無関係であり得る。

いくつかの態様において、BCL11B発現を増大させることは、BCL11Bをコードする異種核酸を用いて細胞を形質転換することを含む。いくつかの態様において、これらの細胞は、BCL11Bをコードするベクターによって形質導入される。具体的な非限定的例において、ベクターはレンチウイルスベクターである。

ヒトBCL11Bをコードする例示的な核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられるGENBANKアクセッション番号NM_138576.4およびNM_022898.3に記載されている。

BCL11Bアイソフォーム1タンパク質をコードする例示的な核酸配列を、以下に記載する。

BCL11Bアイソフォーム2タンパク質をコードする例示的な核酸配列を、以下に記載する。

いくつかの態様において、BCL11Bをコードする核酸配列は、SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 4のいずれか1つと少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％同一である。

例示的なヒトBCL11Bタンパク質は、参照により本明細書に組み入れられるGENBANKアクセッション番号NP_612808.1およびNP_075049.1に記載されている。

ヒトBCL11Bアイソフォーム1のアミノ酸配列を、以下に記載する。

ヒトBCL11Bアイソフォーム2のアミノ酸配列を、以下に記載する。

いくつかの態様において、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞において発現されるBCL11Bタンパク質は、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 5のいずれか1つと少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

典型的には、BCL11Bをコードする核酸は、異種プロモーターに機能的に連結されている。形質導入されたHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞が、BCL11B発現が増大していない対応する対照細胞と比べて、BCL11B発現の十分な増大を引き起こして、HSPCもしくは多能性幹細胞からのT細胞の生成および/もしくは増殖を増加させるか、または成熟T細胞の増殖を増加させるように、プロモーターは選択される。

プロモーターは、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の適切なプロモーターであることができる。いくつかの態様において、プロモーターは非ウイルスプロモーターであり、他の態様において、プロモーターはウイルスプロモーターである。BCL11Bをコードする核酸配列に機能的に連結されておりHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞中に導入された場合に十分な発現レベルのBCL11Bをもたらす任意のプロモーターを、使用することができる。該プロモーターは、例えば、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを含み負の制御領域が欠失されdl587revプライマー結合部位が置換された(MND)プロモーター、マウス胚性幹細胞ウイルス(MSCV)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、β-グロビン、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ヒト伸長因子-1α(EF1α)プロモーターであることができる。1つの非限定的な態様において、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞は、MNDプロモーター機能的に連結されているBLC11bコード核酸を含むレンチウイルスベクターによって形質導入される。

開示される態様と共に使用できるプロモーターの配列の非限定的な例を、下記に提供する。

MNDプロモーター

開示される態様において使用できる例示的プロモーターに関する付加的な情報は、その全体が本明細書において参照により開示されるHalene et al., Improved expression in hematopoietic and lymphoid cells in mice after transplantation of bone marrow transduced with a modified retroviral vector, Blood, 1999, 94:3349-3357において見出すことができる。

BCL11Bをコードするポリヌクレオチド配列は、BCL11B配列の挿入または組込みによって操作されたプラスミド、ウイルス、または当技術分野において公知の他の媒介物などの発現ベクター中に挿入することができる。BCL11Bをコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーターおよび任意で付加的な発現制御配列に機能的に連結され得る。1つの態様において、コード配列に機能的に連結される発現制御配列は、コード配列の発現が発現制御配列に相性の良い条件下で達成されるように、連結される。典型的には、発現ベクターは、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含む。任意で、発現ベクターは、他の分子、例えば、非限定的にキメラ抗原受容体または操作T細胞受容体をコードすることができる。

発現ベクターは、任意で、HSVチミジンキナーゼ(HSV-TK)などの自殺遺伝子を含むことができる。このような態様において、T細胞療法がひとたび完了すると、遺伝子操作された細胞の大多数をガンシクロビル(GCV)の投与によって死滅させることができる。HSV-TKはGCVを毒性生成物に変換し、TK+細胞の選択的排除を可能にする。GCVの例示的な使用濃度は、7～21日間、10～100mg/kg/日である。

1つの例において、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ベクター(AAV)などのウイルスベクターである。具体的な非限定的例において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。

外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MuMTV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。1つの態様において、対象がヒトである場合、テナガザル白血病ウイルス(GALV)などのベクターを使用することができる。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスもしくはトリレトロウイルスまたはヒトレンチウイルスもしくは霊長類レンチウイルスの派生物である。

レトロウイルスゲノムは、2つのLTR、キャプシド形成配列、および3つのコード領域(gag、pol、およびenv)を含む。組換えレトロウイルスベクターにおいて、通常、gag、pol、およびenv遺伝子は全部または一部が欠失させられ、関心対象の異種核酸配列、例えばプロモーターに機能的に連結された、BCL11Bをコードする核酸配列に置き換えられている。

組換えレトロウイルスは典型的には不完全であるため、感染性ベクター粒子を生産するには補助を必要とする。この補助は、例えば、末端反復配列(LTR)内の調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子のすべてをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を用いることにより、提供することができる。これらのプラスミドは、パッケージングメカニズムがキャプシド形成のためにRNA転写物を認識することを可能にするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルを欠失しているヘルパー細胞株には、例えば、Ψ2、PA317、およびPA12が含まれるが、それらに限定されるわけではない。あるいは、NIH3T3または他の組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子gag、pol、およびenvをコードするプラスミドによって直接的にトランスフェクトすることができる。これらの細胞株は、ゲノムがパッケージングされていないため、空のビリオンを生産する。パッケージングシグナルは完全であるが構造遺伝子は関心対象の他の遺伝子によって置き換えられているような細胞にレトロウイルスベクターが導入された場合、該ベクターはパッケージングされ、ベクタービリオンが生産され得る。次いで、これらの細胞に、関心対象の遺伝子を含むベクタープラスミドをトランスフェクトする。結果として生じる細胞は、培地にレトロウイルスベクターを放出する。したがって、ウイルス粒子を生産するために、gag、pol、およびenv遺伝子がパッケージング細胞株において同時発現される。

付加的な態様において、BCL11Bをコードする核酸分子は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列(CRISPR)技術を用いて、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞のゲノム中の特異的部位にターゲティングされる。このアプローチでは、カスタマイズ可能な特異性を有する、RNAによって導かれるヌクレアーゼ、例えばCas9を作製する。CRISPR/Casシステムは、生物の系統樹の全体にわたる種において遺伝子編集(特定遺伝子の配列に対する付加、破壊、または変更)および遺伝子調節のために使用することができる(Mali et al., Nature Methods 10:957-963, 2013)。Cas9タンパク質および適切なガイドRNAを細胞中に送達することにより、生物のゲノムを任意の所望の位置で切断することができ、プロモーターに機能的に連結されたBCL11Bコード異種核酸をその部位に挿入することができる。

いくつかの態様において、プロモーターに機能的に連結されたBCL11Bコード核酸は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)技術を用いて、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞の核内の特異的部位にターゲティングされる。特定のゲノム部位をターゲティングする目的でTALENを設計するための方法が利用可能である(例えば、Bogdanove and Voytas, Science. 2011 Sep 30；333(6051):1843-6を参照されたい)。TALENを媒介とした遺伝子ターゲティングは、幹細胞および成熟T細胞において有効である。TALENを用いるゲノム編集は、誘導されターゲティングされた二本鎖DNA切断(DSB)後に、相同組換え修復(HDR)を経る細胞の能力を利用する。この期間中に、ドナーDNA鋳型を細胞に提供して、DSB部位において新しい導入遺伝子を挿入するかまたはDNA配列を欠失させることができる(Cheng et al., Genes Cells. 17:431-8, 2012)。AAVS1、CYBL、CCR5、およびβ-グロビンなどの任意のセーフハーバー座位を標的とするTALENを設計することができる。

いくつかの態様において、プロモーターに機能的に連結されたBCL11Bコード核酸は、非ウイルスベクター(例えばプラスミドベクター)によって細胞に送達される。インビトロおよびインビボで細胞中に非ウイルスベクターを導入するために、エレクトロポレーションを使用することができる。通常、この方法では、高濃度のベクターDNAが宿主細胞の懸濁液に添加され、その混合物が約200～600V/cmの電界にさらされる。エレクトロポレーション後、形質転換細胞は、任意の適切な手段、例えば選択剤を含む適切な培地における増殖に基づいて同定される。エレクトロポレーションはまた、動物またはヒトにおいても効果的に使用されてきた(Lohr et al., Cancer Res. 61:3281-3284, 2001; Nakano et al, Hum Gene Ther. 12:1289-1297, 2001; Kim et al., Gene Ther. 10:1216-1224, 2003; Dean et al. Gene Ther. 10:1608-1615, 2003；およびYoung et al., Gene Ther. 10:1465-1470, 2003を参照されたい)。

BCL11Bをコードするポリヌクレオチドについての別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。1つのコロイド分散系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達媒体として有用である人工膜小胞である。サイズが0.2～4.0ミクロンの範囲である大型単層小胞(LUV)は、大型高分子を含む水性緩衝液をかなりの比率で封入できることが示されている。RNA、DNA、および完全なビリオンを、水性の内部に封入し、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる(Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981)。リポソームが効率的な遺伝子移入媒体であるためには、以下の特徴が存在するべきである:(1)関心対象の核酸を高い効率で封入しつつ、それらの生物活性を損なわないこと;(2)非標的細胞と比較して、優先的かつ実質的に標的細胞に結合すること;(3)小胞の水溶性内容物を標的細胞細胞質に高い効率で送達すること;および(4)遺伝情報を正確かつ効果的に発現すること(Mannino et al., Biotechniques 6:682, 1988)。

通常、リポソーム組成物は、ステロイド、特にコレステロールと通常は組み合わせられた、リン脂質、特に、相転移温度の高いリン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質もまた、使用され得る。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度、および二価陽イオンの存在に応じて変わる。

別のターゲティング送達系は、生分解性かつ生体適合性のポリマー足場の使用である(Jang et al., Expert Rev. Medical Devices 1:127-138, 2004を参照されたい)。これらの足場は、1種または複数種の生分解性ポリマーの混合物を含むことが通常であり、例えば、非限定的に、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(グリコール酸)、もしくはポリ(乳酸-co-グリコリド)(PLGA)コポリマーなどの飽和脂肪族ポリエステル、ポリプロピレンフマラート(PPF)などの不飽和線状ポリエステル、またはポリヒドロキシアルカノアート(PHA)など微生物が生産する脂肪族ポリエステルである(Rezwan et al., Biomaterials 27:3413-3431, 2006; Laurencin et al., Clin. Orthopaed. Rel. Res. 447:221-236を参照されたい)。様々な構成要素の比率を変えることにより、種々の機械的特性を有するポリマー足場が得られる。一般に使用される足場が含むPLAとPGAの比は75:25であるが、この比は、個々の用途に応じて変わってよい。他の一般に使用される足場には、表面生侵食性ポリマー、例えば、トリメリチルイミドグリシン(TMA-gly)もしくはピロメリチルイミドアラニン(PMA-ala)などのポリ(無水物)、または高分子量のポリ(オルガノファスファゼン)(P[PHOS])などのポリ(ホスファゼン)、および生体活性セラミックスが含まれる。これらの足場が徐々に生分解することにより、足場からの薬物または遺伝子の段階的放出が可能になる。したがって、これらのポリマー担体の利点は、足場となるだけでなく、薬物または遺伝子の送達系にもなるということである。この系は、プラスミドDNAの送達に適用可能であり、また、AAVベクターまたはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターおよびトランスポゾンベースのベクターにも適用可能である。

開示されている方法の特定の態様において、改変細胞は、対象に細胞を投与する前に、HSPCおよび/もしくは多能性幹細胞からのT細胞の分化および増殖、または成熟T細胞の増殖に十分な条件下で、インビトロでインキュベーションされる。開示される方法の任意の態様において、改変細胞は、改変後、任意の時点に対象に投与されてよい。特定の態様において、改変細胞は、対象に細胞を投与する前に、そのような条件下で14日より長い期間または30日より長い期間、インビトロでインキュベーションされる。

IV 使用方法
T細胞療法のためにT細胞集団を作製するための方法、およびまたT細胞療法によって対象を治療するための方法が、本明細書において提供される。

いくつかの態様において、ヒト対象向けのT細胞療法のためにT細胞集団を作製するための方法が提供される。この方法は、本明細書において説明されるHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞を提供する段階、および本明細書において説明される該HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞におけるBCL11B発現を増大させて、対応する対照細胞と比べてBCL11B発現を増大させた改変細胞を形成させる段階を含む。BCL11B発現の増大により、対応する対照細胞と比べて、HSPCもしくは多能性幹細胞からのT細胞の生成および/もしくは増殖が増加するか、または成熟T細胞の増殖が増加して、T細胞療法のためのT細胞集団が形成される。いくつかの態様において、HSPCまたは多能性幹細胞からのT細胞の生成の増加は、BCL11B発現が増大していない対照細胞と比べての、インビトロまたはインビボでのT細胞の生成率の増加(例えば、少なくとも50％、例えば、少なくとも75％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、または少なくとも500％)を含む。

別の態様において、改変されたHSPC、多能性幹細胞、もしくは成熟T細胞、または改変されたHSPCもしくは多能性幹細胞の増殖によって生じたT細胞、または成熟T細胞が、T細胞療法のために対象に投与される。BCL11B発現を増大させた改変細胞の対象への投与は、任意の適切な経路、例えば、静脈内、筋肉内、関節内、および/またはくも膜下腔内(腰椎穿刺)投与によって遂行することができる。投与は、局所的または全身的であることができる。例えば、選択された経路が静脈内である場合、組成物は、対象の静脈中に該組成物を導き入れることによって投与される。

いくつかの態様において、改変されたHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞は、該細胞が投与される予定であるまさにその対象から得られた細胞から調製され、したがって自己由来である。改変されたHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞はまた、別の対象に由来する細胞から調製され、同種異系であってもよい。典型的には、ドナーおよびレシピエントは、免疫学的に適合性である。したがって、改変されたHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞は、同種異系であってよい。

いくつかの組織が、本明細書において説明される方法において使用するためのHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞の供給源を提供することができ、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞は、任意の適切な手順を用いてこれらの組織から単離することができる。非限定的な例において、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞は、臍帯血、骨髄、および/または末梢血から単離される。

いくつかの態様において、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞は、適切な選別方法、例えば、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞に特異的な細胞表面マーカーに基づく蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、他の細胞から単離される。HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞のマーカーの解析は、任意の適切な方法(例えば、フローサイトメトリー解析、ウェスタンブロット解析、RT-PCR、インサイチューハイブリダイゼーション、免疫蛍光法、免疫組織化学的検査など)を用いて実施することができる。さらに、HSPCもしくは多能性幹細胞からのT細胞の生成および/もしくは増殖または成熟T細胞の増殖についての解析も、任意の適切な方法を用いて実施してよい。

本明細書において開示されるBCL11B発現を増大させた改変細胞の例示的な使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる:HSCT後の胸腺T細胞再構成を促進すること；HSCT後の胸腺T細胞再構成を向上させるためにHSPCと同時移植することができるT細胞前駆体のエクスビボ生成を増加させること；例えば免疫療法用途のために、CAR T細胞および/もしくはTCR T細胞などの操作T細胞の機能および/もしくは持続性を強化すること、ならびに/または該操作T細胞の疲弊を防止すること；同種異系T細胞免疫療法薬をエクスビボで生産するために、多能性幹細胞からT細胞を生成すること；例えば、免疫療法用途向けの機能的T細胞の生成を可能にするために、CAR形質転換細胞および/もしくはTCR形質転換細胞を作製する間、操作T細胞のエクスビボ増殖を促進すること；例えば、操作T細胞免疫療法薬の有効性を最大化するために、CAR形質転換T細胞および/もしくはTCR形質転換T細胞におけるT細胞サブセット(CD4もしくはCD8)および/もしくはメモリー細胞亜型の出現率を操ること；ならびに/または移植片対宿主病および/もしくは自己免疫障害の治療などのために制御性T細胞を(エクスビボおよび/もしくはインビボで)作製すること。

いくつかの態様において、T細胞療法は、HSCT後のT細胞再構成を含み、この方法は、BCL11B発現を増大させた改変されたHSPC、多能性幹細胞、もしくは成熟T細胞、ならびに/または改変されたHSPCもしくは多能性幹細胞の増殖によって生じたT細胞、および/または成熟T細胞の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。HSCT後の対象におけるT細胞再構成を促進する、これらの細胞の任意の適切な用量を、対象に投与することができる。いくつかの態様において、少なくとも10³/kg、例えば、少なくとも10⁴/kgまたは少なくとも10⁵/kgの改変細胞が、対象に投与される。いくつかの態様において、10⁴/kg～10⁸/kgの改変細胞、例えば、10⁴/kg～10⁷/kg、10⁴/kg～10⁶/kg、または10⁵/kg～10⁷/kgの改変細胞が対象に投与され、例えば、約10⁴/kg、約10⁵/kg、約10⁶/kg、約10⁷/kg、または約10⁸/kgの改変細胞が対象に投与される。方法は、対象におけるT細胞再構成(例えば、HSCT後の指定時間における末梢血中成熟T細胞の濃度に基づいて測定される)を、治療法を行わない場合の応答と比べて、例えば、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも90％、または少なくとも95％向上させる。対象におけるT細胞再構成はまた、末梢血中の成熟T細胞またはTREC(T細胞受容体切除サークル、胸腺細胞形成のマーカー)が特定濃度に達するまでの時間またはT細胞免疫機能を実現するまでの時間(カンジダ(Candida)抗原、破傷風抗原、もしくはウイルス抗原に対するT細胞応答に基づいて測定される)に基づいて測定することができる(Brink MRM van den, Velardi E, Perales M-A. Immune reconstitution following stem cell transplantation. Hematology. 2015 Dec 5；2015(1):215-9)。いくつかの態様において、対象におけるT細胞再構成は、対象に改変細胞を投与してから1年以内に、例えば、9ヶ月以内、6ヶ月以内、または3ヶ月以内に実現される。

いくつかの態様において、T細胞療法は、癌を治療するためのCAR T細胞療法を含み、この方法は、BCL11B発現を増大させた改変されたHSPC、多能性幹細胞、もしくは成熟T細胞、または改変されたHSPCもしくは多能性幹細胞の増殖によって生じたT細胞、または成熟T細胞の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。対象における癌を治療するためのCAR T細胞療法を促進する、これらの細胞の任意の適切な用量を、対象に投与することができる。いくつかの態様において、少なくとも10³/kg、例えば、少なくとも10⁴/kgまたは少なくとも10⁵/kgの改変細胞が、対象に投与される。いくつかの態様において、10⁴/kg～10⁷/kgの改変細胞、例えば、10⁴/kg～10⁶/kgまたは10⁵/kg～10⁷/kgの改変細胞が対象に投与され、例えば、約10⁴/kg、約10⁵/kg、約10⁶/kg、または約10⁷/kgの改変細胞が対象に投与される。この態様において、細胞は、CARを発現するようにさらに改変される。これらのT細胞は、対象において疲弊(例えば、投与後の指定時点における、CARを発現している循環血中T細胞の数に基づいて、またはCARのタイプに固有のアッセイ法、例えば、B細胞抗原を対象とするCAR T細胞の場合はB細胞形成不全の持続期間に基づいて(Maude SL et al. N Engl J Med. 2018 01；378(5):439-48)、明らかにされる)の低減を示し、例えば、BCL11B発現の増大を欠いている対応する対照細胞と比べて、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも90％、または少なくとも95％の低減を示す。

いくつかの態様において、T細胞療法は、癌を治療するためのTCR T細胞療法を含み、この方法は、BCL11B発現を増大させた改変されたHSPC、多能性幹細胞、もしくは成熟T細胞、または改変されたHSPCもしくは多能性幹細胞の増殖によって生じたT細胞、または成熟T細胞の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。対象における癌を治療するためのTCR T細胞療法を促進する、これらの細胞の任意の適切な用量を、対象に投与することができる。いくつかの態様において、少なくとも10³/kg、例えば、少なくとも10⁴/kgまたは少なくとも10⁵/kgの改変細胞が、対象に投与される。いくつかの態様において、10⁴/kg～10⁸/kgの改変細胞、例えば、10⁴/kg～10⁷/kg、10⁴/kg～10⁶/kg、または10⁵/kg～10⁷/kgの改変細胞が対象に投与され、例えば、約10⁴/kg、約10⁵/kg、約10⁶/kg、約10⁷/kg、または約10⁸/kgの改変細胞が対象に投与される。この態様において、細胞は、TCRを発現するようにさらに改変される。これらのT細胞は、対象において疲弊(例えば、投与後の指定時点における、TCRを発現している循環血中T細胞の数に基づいて明らかにされる)の低減を示し、例えば、BCL11B発現の増大を欠いている対応する対照細胞と比べて、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも90％、または少なくとも95％の低減を示す。

いくつかの例において、改変細胞は、自己免疫障害を有するヒト対象である対象に投与され、例えば、関節リウマチは自己免疫障害であり、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、移植片対宿主病、および/またはグレーブス病も同様である。

本明細書において開示される改変細胞は、1種または複数種の付加的な治療薬、例えば、1種または複数種の抗癌剤、抗生物質、および/または癌、感染症、もしくは自己免疫疾患を治療するための免疫治療薬と組み合わせて対象に投与することができる。

以下の実施例が、特定の態様の具体的な特徴を例示するために提供されるが、特許請求の範囲は、例証されるこれらの特徴に限定されるべきではない。

実施例1
BCL11Bの過剰発現は、多系列ヒト造血幹細胞および前駆細胞のT細胞分化を誘導する
本実施例は、インビトロでヒトHSPCおよびT細胞において転写因子BCL11Bを過剰発現することの効果を例示する。

骨髄(BM)から遊走し、ヒト胸腺においてT細胞分化を開始する(胸腺細胞形成)HSPCは、CD34抗原の発現を特徴とすることができ、全胸腺細胞の1％未満を構成し得る。胸腺細胞形成の初期段階は、次の2つのプロセスを特徴とする:T細胞系列遺伝子の発現の誘導(T細胞系列特化)および別の(T以外の)系列になる可能性の消失(T細胞系列決定)。最も初期の胸腺前駆細胞(CD34+CD7-CD1a-、Thy1；図1)は、骨髄赤血球ならびにリンパ系全般(B、T、およびNK)になる潜在能力を有する。次のT細胞系列決定段階は、CD7およびCD1aが順番に上方調節されることならびに別の系列になる能力が徐々に消失することを特徴とし、結果として、CD34+CD7+CD1a+細胞(Thy3)が生成する。結果として生じるこれらの細胞は、完全にT細胞系列に決定された最も初期の公知の前駆細胞であり、その後に、未成熟のシングルポジティブな(ISP、CD3-CD4+CD8-)細胞を生じることができる。さらに、CD34+CD7-CD1a-およびCD34+CD7+CD1a-細胞はT細胞系列遺伝子を発現することから、完全な決定の前に特化が起こり得ることが示唆される。再編成されたTCR(T細胞受容体)β鎖を発現するISP細胞は、プレTCRシグナル伝達によって増殖し、ダブルポジティブ(DP、CD4+CD8+)細胞に分化する(β選択)。「自己」ペプチド/MHC(主要組織適合抗原)複合体に反応性のTCRαβ受容体を発現するDP細胞のみが生き残り(ポジティブ選択)、成熟したシングルポジティブCD3+T細胞(CD4+およびCD8+)に分化する。自己ペプチドに対する高いTCR反応性を有する細胞は、ネガティブ選択によって排除される。

胸腺細胞形成の多くの特徴はヒトとマウスの間で保存されているが、種に関係するいくつかの差異が、胸腺細胞形成の背景にある調節メカニズムに存在する。したがって、この実施例で開示される研究では、ヒトの胸腺細胞形成およびT細胞を研究して、ヒトT細胞の分化および機能をより良くするための臨床的意義があるアプローチを特定した。NOTCH1シグナル伝達は、マウスのT細胞系列決定、およびそれに続く、β選択期間中のDN3段階からDN4段階への分化に必要とされる。対照的に、NOTCHシグナル伝達の低減が、ヒトT細胞系列決定に必要とされる可能性が高く、NOTCH1シグナル伝達は、ヒトβ選択期間中に、増殖には必要とされるが分化には必要とされない可能性が高い。種に関係する差異はまた、多系列造血前駆細胞の分化においてのT細胞転写因子TCF7、GATA3、およびNOTCH1の過剰発現の影響にも認められる。NOTCH1シグナルの非存在下でさえT細胞系列遺伝子を誘導するためにTcf7が十分である可能性が高いマウスとは違って、NOTCH1シグナルの非存在下でのTCF7発現は、ヒト多系列前駆細胞においてはT細胞系列転写プログラムを誘導しない。Gata3過剰発現は、マウス胸腺前駆細胞に細胞死を引き起こす一方で、ヒト胸腺前駆細胞ではDP細胞への決定および分化を促進する。持続的なNOTCH1シグナル伝達は、マウスではTCRαβT細胞の生成を誘導するが、ヒト前駆細胞ではαβ T細胞系列ではなくγδ T細胞系列への細胞転換を招く。ヒトT細胞分化の背景にあるメカニズムと、転写因子の過剰発現がT細胞系列分化に与える影響の、種に関係する差異とを完全に理解できていないことが原因で、ヒトT細胞系列の分化および機能を強化するための方法の開発は遅れてきた。

Bcl11bは、マウスの造血時のその発現がT細胞系列および自然リンパ系列に拘束される転写因子である。Bcl11bノックアウトマウス前駆細胞は、T細胞系列遺伝子を上方調節することができるが、幹細胞、ナチュラルキラー細胞(NK)、および骨髄系の遺伝子を抑制することはできず、系列決定前の分化の停止を示す。T細胞系列決定後にBcl11bが欠失すると、ポジティブ選択およびT細胞機能に障害が生じる。ヒトでは、BCL11Bは骨髄HSPCにおいて発現されない。BCL11B発現は、胸腺中の最も初期のCD34+前駆細胞(CD34+CD7-CD1a-)において最初に誘導され、次いで、T細胞系列決定およびさらにはDP細胞への分化という後続段階に伴って上方調節される。BCL11Bは、ヒトT細胞系列決定において重要な役割を果たし、胸腺細胞形成の初期段階におけるBCL11Bの調節活性は、ヒトとマウスとで異なる。マウスのBcl11bノックアウト(KO)前駆細胞とは異なり、ヒトBCL11Bノックダウン(KD)T細胞前駆体は、幹細胞、NK、および骨髄系の遺伝子を抑制できなかっただけでなく、T細胞系列遺伝子を下方調節した。しかし、所与の転写因子がT細胞分化に必要とされることは、該因子の過剰発現によってT細胞分化が促進されることを必ずしも意味しない。例えば、NOTCH1はT細胞分化に必要とされるが、NOTCH1の過剰発現は、TCRαβ+T細胞生成を阻害する。同様に、GATA3はT細胞系列分化に必要とされるが、GATA3過剰発現は、胸腺の細胞充実性を低下させる。

本発明の研究により、BCL11B過剰発現によってヒト造血前駆細胞の成熟T細胞への分化が促進または加速され、一次T細胞の機能が向上することが始めて示される。BCL11B過剰発現は、成熟T細胞の生成を速め促進することを含めて、ヒトHSPCのT細胞分化を加速させた。多系列HSPCにおけるBCL11Bの初期の転写作用は、複数のT細胞遺伝子の誘導および別の(非T)細胞系列TFの抑制を含んだ。さらに、過剰発現は、NOTCH1シグナル伝達の非存在下でHSPCからT細胞系列分化を開始するのに十分であった。BCL11Bを過剰発現するHSPCから生成した成熟ナイーブT細胞は、CD3/CD28活性化に応答して、促進された増殖およびセントラルメモリー免疫表現型を有する細胞への分化を示した。本発明者らの結果から、HSCT後のT細胞再構成を促進し免疫療法アプローチにおいて操作T細胞の機能を向上させるための有望な戦略としてBCL11B経路活性化を示す、ヒトT細胞分化に関する種特異的TFについての見識が明らかになる。

T細胞におけるBCL11B過剰発現の例示的な使用には、以下が含まれ得る:HSCT後の胸腺T細胞再構成を促進すること；HSCT後の胸腺T細胞再構成を向上させるためにHSPCと同時移植することができるT細胞前駆体のエクスビボ生成を増加させること；免疫療法用途のために、操作T細胞(CAR T細胞および/もしくはTCR T細胞)の機能および持続性を強化することならびに該操作T細胞の疲弊を防止すること；同種異系T細胞免疫療法薬をエクスビボで生産するために、多能性幹細胞から機能的T細胞を生成すること；免疫療法用途向けの機能的T細胞の生成を可能にするために、CAR形質導入細胞およびTCR形質導入細胞を作製する間、操作T細胞のエクスビボ増殖を促進すること；操作T細胞免疫療法薬の有効性を最大化するために、CAR形質導入T細胞もしくはTCR形質導入T細胞におけるT細胞サブセット(CD4もしくはCD8)および/もしくはメモリー細胞亜型の出現率を操ること；ならびに/または移植片対宿主病および/もしくは自己免疫障害の治療などのために制御性T細胞を(エクスビボおよび/もしくはインビボで)作製すること。

結果
胸腺細胞形成時のBCL11BおよびTCF7の発現プロファイルには、ヒトとマウスの間で、種に関係する差異が存在する
マウスでは、Bcl11b発現はDN2a段階の間に誘導され、この時点までにT細胞系列特化ならびにTcf7およびGata3の発現は既に起こっている；その後のBcl11b発現の上方調節の際には、Tcf7発現の変化はほとんど起こらない(Kueh et al., Nat Immunol. 2016；17(8):956-65)。Bcl11bと比べてTcf7上方調節の方が早く開始することは、マウスでのT細胞系列特化においてTcf7には役割があるがBcl11bにはないことと矛盾がない。ヒト胸腺細胞形成時のこれらの転写因子の発現プロファイルを互いと比べて評価するために、本発明の研究では、骨髄由来の造血幹細胞(HSC)ならびにヒト胸腺に由来するCD34+前駆細胞および分化がさらに進んだCD4+CD8+細胞(ダブルポジティブ、DP)の公開されているRNA Seqデータを解析した(Casero et al., Nat Immunol. 2015 Dec；16(12):1282-91)。マウスで報告されている研究結果とは対照的に、ヒトでは、BCL11B発現は最も初期の胸腺前駆細胞において最初に認められ、その後のBCL11B上方調節に伴って、TCF7が同時に上方調節された(図2)。これらのT細胞系列転写因子の相対的発現動態がヒトとマウスとで異なることから、胸腺細胞形成の初期段階の間のT細胞系列特化におけるこれら転写因子の作用が種によって異なることが示唆される。

BCL11B機能獲得により、ヒトHSPCのT細胞系列分化が促進される
BCL11B機能獲得によりヒトHSPCのT細胞系列分化が促進されるかどうかを明らかにするために、インビトロ3次元人工胸腺オルガノイド(ATO)共培養モデルを用いて、多系列CD34+臍帯血(CB)HSPCにおいて過剰発現実験を実施した。NOTCH1リガンドDLL1(MS5-DLL1)を発現するように形質導入されたMS5ストローマ細胞株を含むATOは、ヒトCD34+HSPCからの胸腺細胞形成の一連の段階を効率的に再現する(Seet et al, Nat Methods. 2017 May；14(5):521-30)。対照(GFP)レンチウイルスまたはBCL11BレンチウイルスによってCB CD34+細胞に形質導入した。低い感染多重度(=1)をレンチウイルス形質導入のために使用した。この結果、BCL11Bレンチウイルスによって形質導入された細胞でのBCL11B発現レベルの範囲は、CD34+一次ヒト胸腺細胞で認められるレベルから、CD4+CD8+ヒト胸腺細胞でのレベルの約3倍である。形質導入された(選別されたCD34+Lin-GFP+)細胞を、ATO(BCL11Bまたは対照ATO)において培養した(図3A)。

対照ATOにおいて、7日目にCD7+細胞が認められたが、この初期時点では、初期のT細胞前駆体(CD5+CD7+)への分化は最小限しか観察されなかった。T細胞系列決定に関連する免疫表現型である、CD7およびCD1aを同時発現する細胞(CD7+CD1a+)が、対照ATOにおいて10日目までに出現し(細胞の約15％)、14日目には細胞の約35％を占めた。さらに、CD4+CD8-CD3-細胞(未成熟シングルポジティブ、ISP)は、14日目に対照ATO中の細胞の約25％を占めた。21日目に、対照ATOは、CD4+CD8+細胞の増加(ダブルポジティブ、DP、細胞の約20％)を示し、これらの細胞はCD3を発現しなかった(CD3-DP)。DP細胞は、時間とともに段階的に増加して(28日時点で細胞の約40％)、42日の時点には対照ATOにおける優勢集団になった(細胞の50％超)。分化がいっそう進んだCD3+TCRαβ+DP細胞は28日目に始めて出現し、42日目には対照ATO中の細胞の3分の1または3分の1超を構成した。ATO系におけるCD8シングルポジティブ(SP)分化への傾向が公知であり、これと一致して、CD3+TCRαβ+SP細胞は、大部分はCD8+細胞から構成された。42日目に初めて認められたCD8+SP(細胞の約15％)は、時間とともに増加して、84日目までに対照ATO中の細胞の50％超を占めた(図3B、3F)。

各時点に対照HSPC ATOにおいて観察される様々な細胞型の出現率は、ATO中のCB CD34+細胞について公開されている分化動態と一致していた。対照的に、BCL11B HSPCから作られたATOは、CD8+SP細胞の加速された生成を含む、著しく速いT細胞分化を示した(BCL11B ATOおよび対照ATOにおけるCD8+SPの比率(％)=42日の時点で50％および10％、84日の時点で80％および50％、図3B、3F)。BCL11Bは、HSPCからのT細胞分化の最も初期の段階を誘導した。このことは、7日目に、BCL11B ATO中のCD5+CD7+細胞の出現率が対照ATOと比べて高いことによって示される。さらに、対照ATOとは異なり、CD7+CD1a+細胞は、14日目までにBCL11B ATO中で最も優勢な集団を形成した(細胞の約50％)。21日目に、BCL11B ATOの大部分はDP細胞から構成されていた。この細胞型分布は、対照ATOでは42日目まで認められなかった。CD3+TCRαβ+細胞は、早ければ28日にBCL11B ATO中の細胞のほぼ半分となり、この細胞割合は、同時点に対照ATO中で認められるものより実質的に高かった。全体的に見て、BCL11B ATOでの分化の経時変化曲線は、対照ATOと比べて約1週間左に移動した(対照と比較したBCL11Bの分化の動態についてp<0.05)(図3B～3C)。

BCL11B過剰発現によって、SP T細胞の生産もまた有意に増加した。T細胞系列分化の前段階における細胞型の生産もまた、同時点の対照ATOと比べてBCL11B ATOの方が多かった(図3D)。BCL11B HSPCから発生するSP細胞は、対照HSPCによって生成されるSP細胞の表現型と類似した成熟ナイーブT細胞表現型(CD45RA+CCR7+CD62L+CD1a-)を示した(図3E)。全体的に見て、BCL11B機能獲得は、ヒトHSPCのT細胞系列分化を促進し速めた。

BCL11Bを過剰発現するHSPCに由来するT細胞は、促進された増殖およびセントラルメモリー免疫表現型を有する細胞への分化を示す
T細胞受容体(TCR)経路活性化に対する、BCL11Bを過剰発現するHSPCに由来するT細胞の機能的応答を調査するために、BCL11B ATOまたは対照ATOに由来するナイーブ(CD45RO-)SP T細胞をFACSによって単離した(図4A)。選別したT細胞を抗CD3/CD28ビーズおよびIL-2で刺激した。

対照T細胞とBCL11B T細胞の両方が、T細胞活性化マーカーCD45ROを上方調節した。しかし、対照T細胞は、セントラルメモリー免疫表現型を有する細胞(CCR7+CD62L+)への分化は最小限しか示さなかった(Mahnke et al., Eur J Immunol. 2013 Nov；43(11):2797-809)。対照的に、BCL11B T細胞は、有意に多い細胞生産およびセントラルメモリー免疫表現型を有する細胞への着実な分化を示した(CCR7+CD62L+CD45RO+細胞の平均=30％および4％(BCL11Bおよび対照)、p<0.05)(図4B～4C)。さらに、セントラルメモリー免疫表現型細胞の出現率が多いことと一致して、活性化BCL11B T細胞は、抗CD3/CD28ビーズによる反復刺激に応答して、対照T細胞と比べて持続性が高い増殖を示した(図4C)。全体的に見て、これらの結果は、BCL11Bを過剰発現するHSPCに由来するT細胞におけるTCR機能的応答の強化と一致している。

成熟T細胞におけるBCL11B過剰発現は、刺激に対するT細胞の機能的応答を強化し、かつ繰り返し行われる活性化に応答したそれらの疲弊を緩和する
初期のHSPC段階を含む胸腺細胞形成の全段階でBCL11Bを過剰発現させた場合に起こるT細胞の機能強化を考慮して、本研究では、分化した成熟T細胞においてBCL11Bを過剰発現させるとT細胞機能が強化されるかどうかを調査した。T細胞をヒト末梢血から単離し、BCL11Bレンチウイルスまたは対照レンチウイルスによって形質導入した。形質導入された細胞をPMA/イオノマイシンおよびCD3/CD28で刺激して、サイトカインおよび活性化に対する増殖応答をそれぞれ測定した。BCL11B T細胞は、対照T細胞よりも多くのTNFαおよびIL-2生産を示した。TCR経路シグナル伝達の活性化によって繰り返し刺激されたBCL11B T細胞は、対照T細胞と比べて、より多く持続的な増殖、T細胞疲弊マーカーの少ない発現、およびセントラルメモリー免疫表現型を有する細胞の高い出現率を示した(図5)。感染多重度1または5でBCL11Bベクターによって形質導入したT細胞は、着実な増殖を示したのに対し、MOI=10で形質導入した細胞は増殖に失敗したことから、T細胞増殖に対するBCL11Bの影響はBCL11B発現レベル特異的であることが示される。

抗CD19 CARおよびBCL11Bを同時形質導入されたT細胞は、ALL細胞によって繰り返し刺激された場合に、対照CD19 CAR T細胞よりも持続的な、B-ALL細胞を排除する能力を示した(図5)。要約すれば、BCL11B過剰発現は、刺激に対するT細胞の機能的応答を強化し、かつ繰り返し行われる活性化に応答したそれらの疲弊を緩和した。

BCL11Bを過剰発現する細胞は、T細胞分化期間中の複数の細胞状態遷移時に、加速された分化を示す
所与の分化段階における細胞の出現率および数に関して、対照ATOとBCL11B ATOとの間で観察される差異を決める潜在的因子には、増殖、生存、および/もしくは細胞状態遷移に対するBCL11Bの影響ならびに/または先行段階における細胞の生成に対するBCL11Bの影響が含まれる。これらの因子を解読し、かつT細胞分化のどの段階がBCL11Bによって強化されるかを特定するために、対照細胞およびBCL11B細胞の分化の動力学を数学的にモデル化した。数学的モデルは、増殖速度、遷移速度、死滅速度のパラメーターを含む時間の関数として、T細胞分化の6段階(CD4-CD8-[DN]、ISP、CD3-DP、CD3+DP、CD4SP、およびCD8SP)のそれぞれにおける細胞数を予測する常微分方程式を使用した(図6)。

モデルのパラメーターは、対照ATOの実験データから最初に推定した。胸腺において、SP T細胞は非増殖性である傾向がある。増殖速度は、β選択を受けているDP細胞(CD3-DP)が最も速く、ポジティブ選択を受けている細胞(CD3+DP)が最も遅い。正常な胸腺細胞形成におけるこれらの増殖速度間の関係を反映する制約(b₃>b₂≒0.8b₃>b₁≒0.5b₃>b₄≒0.3b₃；b₅=0；b₆=0；b_1～6:それぞれDN、ISP、CD3-DP、CD3+DP、CD4SP、およびCD8 SPの増殖速度)は、対照ATOにおいて認められる観察された分化動態にモデルがフィットする能力に影響を及ぼさなかった。しかし、これらの増殖制約は、BCL11B ATOの実験データと適合しなかったことから、BCL11B ATOと対照ATOの分化動力学の差異をモデルが捕らえる能力が示された。

次に、各段階のパラメーターを変更して、BCL11B細胞から得たデータにモデル予測をフィットさせることにより、BCL11Bの影響を推測した。モデル化の結果から、DN段階でのBCL11Bの影響だけでは、対照細胞とBCL11B細胞の間で観察された差異を説明するのに不十分であることが予測された(図6)。さらに、BCL11Bは、CD3-DP細胞へのISP細胞の分化およびSP CD8+細胞へのCD3+DP細胞の分化も促進する可能性が非常に高かった(図6)。全体的に見て、これらの結果から、BCL11Bが多系列HSPCのT細胞系列分化を誘導するだけでなくT細胞分化の決定後の段階も速めることが示唆される。

HSPCにおけるBCL11B過剰発現は、T細胞転写プログラムを急速に誘導し、別の分化系列プログラムを抑制する
HSPCにおけるBCL11Bの潜在的な直接的転写効果を明らかにするために、本発明の研究で、BCL11Bレンチウイルスによる形質導入後のHSPCにおける遺伝子発現変化を調査した。BCL11Bレンチウイルスまたは対照レンチウイルスによるHSPCの形質導入後48時間目に選別したCD34+GFP+lin-細胞から抽出したRNAについて全トランスクリプトームプロファイリング(RNA-Seq)を実施した。HSPCは、この48時間の間、レトロネクチンを用いて培養した(NOTCH1リガンドを含まないストローマフリー培養)。短時間だけ培養され(48時間)ストローマにさらされなかった細胞を用いて、分化に付随する間接的な転写の影響を最小限にし、それによって、NOTCH1シグナル伝達の非存在下での遺伝子発現に対するBCL11Bの短時間での影響を明らかにした。さらに、BCL11B HSPCまたは対照HSPCから作られたATOから選別したCD45+GFP+細胞(ATO作製後7日目に選別した細胞)を用いて、RNA-Seqを実施した。ATOから選別した細胞を用いて、NOTCH1シグナル伝達の存在下での遺伝子発現に対するBCL11Bの影響を測定した(図7A)。

BCL11Bは、NOTCH3、IL7R、およびIL2RGを含む、T細胞分化に関連する複数の遺伝子の上方調節を誘導した。T細胞分化とともに上方調節されることが公知の遺伝子(CD3遺伝子、TRAT1、AQP3、CD69、およびICOS)は、対照細胞と比べて増大した発現を、BCL11B細胞において示した。さらに、HSPC遺伝子(BCL11A、TAL1、PROM1、およびFLT3)ならびにGATA1、GATA2、およびIRF8などの骨髄関連遺伝子は、BCL11Bを過剰発現するHSPCにおいて抑制された(図7B～D)。HSPCにおけるBCL11B過剰発現の転写作用は、以前に報告されているBCL11B機能喪失ヒトT細胞分化研究において認められた、BCL11B依存性の遺伝子発現変化との実質的な一致を示した。BCL11Bのこれらの転写作用は、早ければ48時間目に、かつNOTCH1シグナル伝達の非存在下で認められ、これらの作用の多くは、NOTCH1シグナル伝達の存在下でさらに強化された(7日目のATO)(図7B～D)。全体的に見て、これらの結果から、BCL11BがヒトHSPCにおいてT細胞系列転写プログラムを開始し確立するという見解が裏付けられる。

BCL11Bは、NOTCHシグナル伝達の非存在下でヒトHSPCのT細胞分化を開始するために十分な能力を有する
BCL11B過剰発現は、ATOにおけるHSPCからのT細胞分化の初期段階(すなわち、CD5+CD7+細胞の生成)およびDNからISPへの遷移を加速したこと、ならびにBCL11BがヒトHSPCのT細胞系列特化に必要とされることから、本研究では、BCL11BがNOTCH1シグナル伝達の非存在下でヒトHSPCのT細胞分化を誘導するために十分な能力を有するかどうかを調査した。BCL11Bレンチウイルスまたは対照レンチウイルスによって形質導入したCB HSPCを、NOTCH1シグナル伝達の存在下で(MS5-DLL1 ATO)または非存在下で(デルタ様リガンドを欠く、すなわちMS5でできているオルガノイド)培養して、BCL11BがT細胞分化を開始できるかどうかを明らかにした。

対照HSPCのMS5オルガノイド培養物においてT細胞前駆体は生成しなかった(図8A)。対照的に、BCL11B HSPCは、NOTCH1シグナル伝達の非存在下でさえ、初期のT細胞前駆体(CD5+CD7+CD56-CD1a-細胞)を生成した(図8A～8B)。BCL11Bは、MS5オルガノイドにおいて骨髄系細胞分化を抑制した(図8C)。BCL11B細胞のMS5オルガノイド培養物において生成したCD5+CD7+細胞は、T細胞系列遺伝子TCF7、LCK、およびLEF1を発現した(図8D)。しかし、BCL11Bは、NOTCH1シグナル伝達の非存在下でCD7+CD1a+T細胞前駆体にさらに分化させるために十分な能力を有していなかった(図8A)。全体的に見て、これらのデータから、BCL11BはNOTCH1シグナル伝達の非存在下でヒトHSPCのT細胞分化を開始するために十分な能力を有するが、T細胞決定にはNOTCH1からの付加的な調節的インプットを必要とすることが示される。

考察
胸腺細胞形成の初期段階に重要な転写因子であるTcf7、Gata3、またはBcl11bの機能獲得がSP T細胞へのマウスHSPCの分化を促進するとは報告されていない。機能喪失研究によって、マウスHSPCのNKになる潜在能力およびそれによるT細胞系列決定を抑制するためにBcl11bが不可欠であることが示されたが、Tcf7とは違って、Bcl11bはマウスのT細胞系列特化転写因子ではない(Li et al., Science. 2010 Jul 2；329(5987):89-93)。さらに、TCF7、GATA3、またはNOTCH1の過剰発現は、ヒトCB HSPCからのSP TCRαβ+T細胞の生成を増大させない(Van de Walle et al., Nat Commun. 2016；7:11171; De Smedt et al., J Immunology. 2002 Sep 15；169(6):3021-9)。したがって、BCL11Bを過剰発現するHSPCのSP TCRαβ+T細胞への分化が促進されることは、新規な発見である。注目すべきことに、BCL11B機能獲得の研究は、BCL11Bを過剰発現する細胞の細胞死が原因で、マウスHSPCでは不可能であった。本明細書において開示される知見は、マウスにおけるTcf7の作用に似た作用を有する、ヒトにおけるT細胞系列特化転写因子としてのBCL11Bの種特異的役割と一致している。これらの結果から、T細胞生物学の洞察を患者における免疫再構成を向上させるための治療的アプローチに変換することを可能にするために、ヒト胸腺細胞形成の詳細な研究が不可欠的に必要とされることが強調される。

以前のノックダウン研究によって、BCL11BがヒトHSPCのT細胞系列特化および決定に必要とされることが示唆された。しかし、機能喪失研究の結果は、T細胞分化の状況において所与の遺伝子を過剰発現させることの効果を必ずしも予測するものではない。例えば、GATA3のノックダウンまたはNOTCH1シグナル伝達の阻害は、ヒト胸腺前駆細胞のT細胞分化をそれぞれ減退させるかまたは抑止するが(Van de Walle et al., Nat Commun. 2016；7:11171; Van de Walle et al., J Exp Med. 2013 Apr 8；210(4):683-97)、これらの遺伝子の機能獲得により、TCRαβ+細胞の生成が阻害される(Van de Walle et al., J Exp Med. 2013 Apr 8；210(4):683-97; Taghon et al., J Immunol. 2001 Oct 15；167(8):4468-75)。胸腺細胞形成時にこれらの遺伝子の発現のタイミングおよびレベルを正確に段階特異的に調節することの必要性が、これらの遺伝子が過剰発現された際のT細胞分化に対する矛盾した作用の原因であり得る。

レンチウイルスによって形質導入されたHSPCの臨床試験での安全性および形質導入細胞を排除するための自殺スイッチの登場は、レンチウイルスによって改変されたHSPCを変換してHSCT後の免疫再構成を向上させることの実現可能性の後ろ盾となる。注目すべきことには、腫瘍抑制因子であるBCL11Bの過剰発現は、T-ALL細胞の増殖を阻害しそれらのアポトーシスを誘導する。これは、BCL11B機能獲得を含む戦略についての発癌性観点からの安全性を裏付けるデータである。

材料および方法
レンチウイルスベクター
BCL11Bプラスミドのオープンリーディングフレーム(ORF)に由来するPCR増幅したBCL11B cDNA配列(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)をIn-Fusion(登録商標)HDクローニングキット(Clontech, Mountainview, CA)を用いてMNDU3-PGK-GFP発現ベクター中に挿入することにより、組換えBCL11B発現レンチウイルスプラスミドを作製した。TransIT-293トランスフェクション試薬(Mirus, MIR 2700)を用いて、293FTにpsPAX2(Addgene、12260番)プラスミドおよびpMD2.G(Addgene、12259番)プラスミドを同時トランスフェクションすることにより、プラスミドをレンチウイルス粒子中にパッケージングした。BCL11B発現ベクターおよび対応する対照(MNDU3-PGK-GFP)ベクターを超遠心分離(4℃、12000 rpmで4時間)によって濃縮した。

一次組織
匿名の臍帯血(CB)試料をUniversity of California Los AngelesおよびStemcyte(Pasadena, California, USA)から入手し、ドナーからの採血後に廃棄された匿名の白血球除去フィルターをChildren’s Hospital Los Angeles(CHLA)治験審査委員会に承認されたプロトコールに従ってCHLA血液バンクドナーセンターから入手した。細胞を白血球除去フィルターから洗い流し、続いて単核細胞のフィコール分離およびその後のFACS(CD1a、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、CD36、CD45RO、CD235、およびTCRγδについて陰性の細胞)または磁気活性化細胞選別(MACS、Miltenyi Biotec, San Diego, CA)によるT細胞濃縮を行うことによって、末梢血T細胞を該フィルターから取り出した。

CB CD34+細胞および末梢血T細胞の形質導入および培養
磁気活性化細胞選別(MACS、Miltenyi Biotec, San Diego, CA)によってCB CD34+細胞を濃縮した。レトロネクチン(50ng/ml、Clontech)でコーティングした組織培養処理していない48ウェルプレートにおいて(100,000細胞/ウェル)、トロンボポエチン(50ng/ml)、FLT3リガンド(50ng/ml)、幹細胞因子(50ng/ml)、およびl-グルタミン(2mM、Cellgro, Manassas, VA)を含む100マイクロリットルのEX-Vivo 15(Lonza, Walkersville, MD)中で16時間、CD34+CB細胞を培養した。次いで、濃縮したレンチウイルス(感染多重度MOI=1)を2回、24時間の間隔を空けて添加した。レンチウイルスに48時間曝露した後、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてCD34+GFP+CD3-CD4-CD8-CD56-CD19-(CD34+GFP+lin-)細胞を選別し、次いで、RNA-Seqによって解析するか、またはMS5-DLL1(人工胸腺オルガノイド、ATO)もしくはMS5オルガノイド中で培養した。

末梢血T細胞を、Aim V培地(95％AIM V培地、5％ヒト血清AB、25ng/ml IL-2、100,000細胞/ウェル、96ウェルプレートのウェル1つにつき200マイクロリットルの培地)に加えたCD3/CD28ビーズ(2マイクロリットル/ウェル)によって活性化した。活性化後24時間目に、ネクチン(50ng/ml、Clontech)でコーティングした組織培養処理していない48ウェルプレートに細胞を移した(ウェルからウェルへの1:1の移動)。移動後6～24時間目に、濃縮したレンチウイルスを添加した。1(24時間の間隔を空けて2回)または5(1回)のMOIを、単一形質導入実験(BCL11B GFPベクターまたは対照GFPベクター)のために使用した。二重形質導入実験の場合、細胞に、BCL11Bレンチウイルス(MOI=5で1回)およびCD19 CARレンチウイルス(MOI=5で、24時間の間隔を空けて2回)によって同時形質導入するか、またはCD19 CARベクター(対照細胞)によって単一形質導入した。活性化後、細胞を合計7日間培養し(コンフルエントになると培養物を分割し、新鮮なAIM V培地に再度播種した)、次いでFACSによって選別して、後続の実験のためにGFP+生(DAPI-)細胞を単離した。

オルガノイド培養物
選別したCB細胞を150,000個のMS5-DLL1細胞またはMS5細胞と混合してから、遠心分離し、5～10マイクロリットルのPBS+1％FBSに再懸濁し、セルカルチャーインサートに載せ、次いでそれを、T細胞分化培地(94％ RPMI、4％ B27補助成分、1％グルタマックス、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、30μmアスコルビン酸、5ng/ml IL-7、5ng/ml FLT3-リガンド)を入れた6ウェルプレート中で培養して、オルガノイドを作製した(オルガノイド1個/ウェル、培地1ml/ウェル)。培地は、週に2回、新鮮な培地に交換した。オルガノイドは、2400～5000個の選別したCB細胞から作った。各実験で、等しい数のCB細胞を用いてオルガノイドを作った。オルガノイドにおける系列分化をフローサイトメトリーによって解析した。表面抗体で染色した後、細胞を固定し、透過処理し、かつTCRβ発現の解析のためにTCRβ抗体で染色した。表1は、使用したFACS抗体のリストである。

（表１）FACS抗体

T細胞活性化アッセイ法
培養6～12週目にATOから選別された成熟ナイーブGFP+CD8 SP T細胞または形質導入された(GFP+)ヒト末梢血T細胞を、Aim V培地(95％ AIM V培地、5％ヒト血清AB、20～25ng/ml IL-2)に加えたCD3/CD28ビーズによって活性化した。ネガティブ選択FACSアプローチによって、CD8 SP T細胞をATOから単離した(すなわち、CD4、CD1a、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、CD36、CD45RO、CD235、およびTCR γδについて陰性の細胞)。96ウェルプレートのウェル1つにつき200マイクロリットルの培地中で、選別した細胞10,000～20,000個を活性化した。コンフルエントになると培養物を分割し、新鮮なAIM V培地に再度播種した。活性化した培養細胞の免疫表現型をフローサイトメトリーによって解析した。フローサイトメトリー抗体で染色する前に、磁気を用いてCD3/CD28ビーズを除去した。

数学的モデル化
図6の6つの分化段階を経るT細胞の進化を説明する数学的モデルを作った。これは、以下の一般形態の6つの結合された常微分方程式からなる系によって数学的に表される。

各式は、1つの分化段階における細胞の時間変化Pi(t)(細胞数)を、当該段階における細胞の増殖および死滅、ならびに当該段階への分化および当該段階からの分化の観点から説明する。このモデルのパラメーターは、(1)各段階での細胞の増殖速度b_i(1日当たり)、(2)後続の段階への遷移速度t_i,j(1日当たり)、および(3)全段階を通じての細胞の全体的死滅速度d(1日当たり)に対応する。

各段階での細胞増殖は、ATO中での空間的制限および有限のNOTCH1シグナル伝達に起因する全体的な集団サイズおよび成長に対する制約を説明するために収容力Kを用いるロジスティックな増殖プロセスとしてモデル化される。胸腺細胞形成時の段階特異的増殖速度について公開されている知識に基づいて、本研究では、対照細胞についてb₃>b₂≒0.8b₃>b₁≒0.5b₃>b₄≒0.3b₃と仮定した。約6週間後に観察された細胞集団全体の急速な減少は、死滅速度dに時間依存性

を掛けることによってモデル化した。この時間依存性は、臨界期t=40日において

に達し、tが長い時間になると

に近づく増加シグモイド関数としてモデル化した。

対照群を表すモデルパラメーター化から初めて、本発明者らは、BCL11B分化の動力学の典型的特徴を再現できる、モデルパラメーターの最小限の変更点を特定した。

RNA-Seq
FACSによって選別したCD34+GFP+lin-細胞(形質導入後48時間目に選別)またはCD45+GFP+細胞(培養開始後7日目にATOから選別)に対してRNA-Seqを実施した。Arcturus Picopure RNA抽出キットまたはQiagen MIrneasyキット(Valencia, CA)を用いて、選別した細胞からRNAを抽出した。Smart-Seq V4超微量RNA-Seqキット(Clontech)を用いてライブラリーを作製し、次いでIllumina Hiseqを用いてそれらを配列決定した(150bpペアードエンドリード、試料1つ当たり2600万個のペアードエンドリード)。

RNA-SEQデータの生物情報学解析のためにGalaxyサーバー(usegalaxy.org/)を用いた。Trimmomatic(Galaxyバージョン0.38.0)を用いて、シーケンシングリードからNexteraペアードエンドアダプター配列を除去した(Trimmomatic操作の最低品質=2)。次いで、トリミングしたリードを、TopHat(Galaxyバージョン2.1.1)を用いて、ヒトゲノムの偽常染色体領域がマスクされたGRCh38バージョン(GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fna, hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenpath/hg38/bigZips/analysisSet/)に対してアラインした。これらのライブラリーの断片サイズは、本研究で使用されるリード長と比べて短い傾向があるため(150塩基のペアードエンドリード)、TopHatのためのメイトペア間の平均内部距離として、パラメーター値0を使用した。得られたBAMファイルをSamtools(Galaxyバージョン2.0.3)を用いて並び替えた(Li et al., 2009)。次に、HTseq(モード=共通部分(空でない)およびID属性=遺伝子名)(Galaxyバージョン0.9.1)を用いて遺伝子数を計算した。gencode.v31.annotation.gff3.gzアノテーションファイル(gencodegenes.org/human/release_31.html)を、HTseq解析のために使用した。上記のパラメーターは例外として、Trimmomatic(Bolger et al., 2014)解析、TopHat(Kim et al., 2013)解析、およびHT-Seq(Anders et al., 2015)解析には初期設定パラメーター値を使用した。

DESeq2を用いて、BCL11Bと対照についての発現差異解析を行った(誤発見率FDR<0.05)。CBドナーのアイデンティティ(CB1～5)および培養時点(48時間または7日)が、BCL11Bと対照についての多変量解析の共変量であった。CBドナーのアイデンティティ(CB1またはCB5)が、7日目の試料に対するBCL11Bと対照についての解析の共変量であった。

多変量または7日目の発現差異解析においてBCL11B細胞または対照細胞中でそれぞれ上方調節されていた遺伝子は、遺伝子セット濃縮(GSEA v4.0)のための遺伝子セットとして役立った(Subramanian et al., 2005)。これらの遺伝子セットの濃縮を、Thy1およびThy3またはBCL11Bノックダウン細胞および対照shRNA形質導入細胞についてのDEseq2による発現差異解析(Love et al., 2014)において観察された変化率に基づいて順位付けされた遺伝子からなるデータセット間で試験した。公開されているThy1、Thy3、BCL11Bノックダウン、および対照shRNAについてのRNA-Seqデータ(Casero et al., 2015、Ha et al 2017)を、これらの発現差異解析のために使用した。

定量的PCR
Arcturus Picopure RNeasy microキットおよびsuperscript vilo cDNA合成キット(Thermofisher)を製造業者の取扱い説明書に則って用いて、それぞれ、RNAを抽出しcDNAを合成した。以下のTaqManアッセイ法を用いて定量的PCR(qPCR)を実施した:Hs00256257_m1、(BCL11B)、Hs01556515_m1(TCF7)、Hs01062241_m1(CD3E)、Hs01547250_m1(LEF1)、Hs00178427_m1(LCK)、およびHs01060665_g1(ACTB)。

統計学的解析
本発明者らは、時間(単位:週)に対する所与の分化段階における細胞の比率のロジットの二次多項反復測定回帰モデルを作成した。各分化段階について2つのモデルを作成した。すなわち、予測因子として細胞型変数(BCL11Bおよび対照)を含むモデルと、予測因子として細胞型変数を含まないモデル。以下の各分化段階についてモデルを作成した:CD4+CD3-CD8-、CD4+CD8+CD3-、CD3+CD8+CD4-、CD7+CD1a+、およびCD7+CD1a-。所与の分化段階についての2つのモデルをANOVAによって比較して、分化の動態がBCL11B細胞と対照細胞とで異なるかどうかを明らかにした。時間(単位:週)に対するATOで観察されたCD4+CD8+CD3-細胞の比率のロジットの二次多項反復測定回帰を、BCL11B細胞または対照細胞にそれぞれ由来するデータに対して別々に実施して、図3Cに示す分化動態曲線を作成した。

形質転換細胞数の常用対数(log₁₀)に対して、対応のある両側t検定を用いて、BCL11B細胞または対照細胞から作られたATOにおいて生成したCD7+CD1a+細胞、CD4+CD8+細胞、またはCD8SP細胞の細胞数を比較した。臍帯血ドナーからの変化を変量効果として含み、時間および細胞型(BCL11Bおよび対照)変数を固定効果として含む線形混合効果モデルを用いて、T細胞活性化アッセイ法における細胞生産についてBCL11B細胞と対照細胞を比較した。ロジット変換された比率に対して、対応のある両側t検定を用いて、BCL11B細胞および対照細胞から作られたオルガノイド間で、MS5オルガノイドにおけるCD33+細胞の出現率を比較し、かつBCL11B ATOおよび対照ATOに由来するナイーブT細胞から作られた培養物間で、CD45RO+CCR7+CD62L+細胞の出現率を比較した。

本明細書において説明される方法の正確な詳細は、説明される態様の精神から逸脱することなく変更または修正できることが明らかである。本発明者らは、下記の請求項の範囲および精神に含まれるこのような修正および変形をすべて請求する。

Claims

T細胞療法を用いて対象を治療する方法であって、
造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)、多能性幹細胞、または成熟T細胞を提供する段階；
該HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞におけるBCL11B発現を増大させて、対応する対照細胞と比べてBCL11B発現が増大した改変細胞を形成させる段階であって、BCL11B発現の増大により、該対応する対照細胞と比べて、該HSPCもしくは該多能性幹細胞からのT細胞の生成および/もしくは増殖が増加するか、または該成熟T細胞の増殖が増加する、段階；ならびに
T細胞療法のために治療的有効量の該改変細胞を対象に投与する段階
を含む、方法。
対象が造血幹細胞移植(HSCT)患者であり、T細胞療法が、HSCT後の該対象における胸腺T細胞再構成を含む、請求項1記載の方法。
改変細胞がHSCTと共に対象に投与される、請求項2記載の方法。
T細胞療法が、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法であり、
前記方法が、前記細胞を対象に投与する工程の前に、CARをコードする異種核酸分子を用いて、HSPC、多能性幹細胞、成熟T細胞、または改変細胞に形質導入する段階をさらに含む、
請求項1記載の方法。
T細胞療法が、操作T細胞受容体(TCR)T細胞療法であり、
前記方法が、前記細胞を対象に投与する工程の前に、TCRをコードする異種核酸分子を用いて、HSPC、多能性幹細胞、成熟T細胞、または改変細胞に形質導入する段階をさらに含む、
請求項1記載の方法。
前記細胞を対象に投与する工程の前に、HSPCおよび/もしくは多能性幹細胞からのT細胞の分化および増殖、または成熟T細胞の増殖に十分な条件下で、改変細胞をインビトロでインキュベーションする段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
ヒト対象向けのT細胞療法のためにT細胞集団を作製する方法であって、
造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)、多能性幹細胞、または成熟T細胞を提供する段階；
該HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞におけるBCL11B発現を増大させて、対応する対照細胞と比べてBCL11B発現が増大した改変細胞を形成させる段階であって、BCL11B発現の増大により、該対応する対照細胞と比べて、該HSPCもしくは多能性幹細胞からのT細胞の生成および/もしくは増殖が増大するか、または成熟T細胞の増殖が増大して、T細胞療法のためのT細胞集団が形成される、段階
を含む、方法。
HSPCおよび/もしくは多能性幹細胞からのT細胞の分化および増殖、または成熟T細胞の増殖に十分な条件下で、改変細胞をインビトロでインキュベーションして、T細胞療法のためのT細胞集団を形成させる段階をさらに含む、請求項7記載の方法。
HSPCもしくは多能性幹細胞からのT細胞の分化および増殖、または成熟T細胞の増殖に十分な条件下で、14日より長い期間、改変細胞がインビトロでインキュベーションされる、請求項8記載の方法。
HSPCもしくは多能性幹細胞からのT細胞の分化および増殖、または成熟T細胞の増殖に十分な条件下で、30日より長い期間、改変細胞がインビトロでインキュベーションされる、請求項8記載の方法。
対象が造血幹細胞移植(HSCT)患者であり、T細胞療法が、HSCT後の対象における胸腺T細胞再構成を含む、請求項7～10のいずれか一項記載の方法。
T細胞療法が、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法であり、
前記方法が、CARをコードする異種核酸分子を用いて、HSPC、多能性幹細胞、成熟T細胞、または改変細胞に形質導入する段階をさらに含む、
請求項7～10のいずれか一項記載の方法。
T細胞療法が、操作T細胞受容体(TCR)T細胞療法であり、
前記方法が、TCRをコードする異種核酸分子を用いて、HSPC、多能性幹細胞、成熟T細胞、または改変細胞に形質導入する段階をさらに含む、
請求項7～10のいずれか一項記載の方法。
ヒト対象からHSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞を得る段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
改変細胞におけるBCL11B発現レベルが、少なくとも、対照であるCD34+ヒト胸腺T細胞前駆体またはCD34-CD4+CD8+ヒト胸腺T細胞前駆体の発現レベルである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
成熟T細胞におけるBCL11B発現レベルを、対応する対照細胞におけるBCL11B発現レベルと比べて2～10倍に上昇させる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
BCL11B発現を増大させる段階が、BCL11Bをコードする異種核酸を用いて、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞に形質導入することを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
プロモーターに機能的に連結されているBCL11Bをコードする核酸を含むウイルスベクターを用いて、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞に形質導入する段階を含む、請求項17記載の方法。
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項18記載の方法。
プロモーターがMNDプロモーターまたはMSCVプロモーターである、請求項17または請求項18記載の方法。
HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞が、1～10の感染多重度で形質導入される、請求項17～20のいずれか一項記載の方法。
HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞が、1～5の感染多重度で形質導入される、請求項21記載の方法。
HSPCまたは多能性幹細胞におけるBCL11B発現を増大させることによって、BCL11B発現が増大していない対応する対照細胞と比べて、HSPCまたは多能性幹細胞からのT細胞の生産率が高まる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
改変細胞から増殖するT細胞は、BCL11B発現が増大していない対応する対照細胞と比べて、対象において疲弊までの時間が延ばされている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
対象がヒトであり、HSPC、多能性幹細胞、または成熟T細胞が、ヒト細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
改変細胞から増殖するT細胞が、BCL11B発現が増大していない対照細胞と比べて、増加したセントラルメモリー免疫表現型を有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
セントラルメモリー免疫表現型が増加したT細胞が、CD45RO+CD62L+CCR7+T細胞である、請求項26記載の方法。
改変細胞から増殖するT細胞は、BCL11B発現が増大していない対照細胞と比べてインターロイキン2産生および/またはTNF-α産生が増大している、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
改変細胞からのT細胞増殖が、Notchシグナル伝達と無関係である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。