JP2022535798A - ハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム - Google Patents

Abstract

本発明はルミネッセンスのハイパースペクトル検出に関し、特に、放射線源を用いて刺激された固相試料からのルミネッセンスの検出に関する。

Description

本発明はルミネッセンスのハイパースペクトル検出に関し、特に、放射線源を用いて刺激された固相試料からのルミネッセンスの検出に関する。

生物組織の機能はその細胞成分の協調作用の結果である。それらの細胞の各々は、組織学的環境とのその相互作用から生じる特定の表現型を呈し、これらの機構の任意の制御異常（deregulation）は癌のような疾病を生じさせ得る。したがって、単一細胞の特徴を空間的枠組みの中で分析することができることが、組織が正常な状況および疾病状況下でどのように機能するのかを理解するため、ならびに有効な治療法の開発を助けるために不可欠である。

疾病が特定の組織に影響を及ぼす結果は、古典的な組織学的および形態学的評価によって常に気付かれるとは限らない。組織のいくつかの構造および成分は、形態学的には同様に見えるが、それらの分子構成要素に関しては、疾病に関連付けられた制御異常の結果として重要な相違を呈する場合がある。このような場合には、免疫学的方法によって提供されるもののような、多重の、およびより特異的な染色が、それらの相違を識別するために利用される必要がある。このようなものの一例は、調査対象の組織内の免疫細胞の識別である。それらの存在は、疾病状況が組織に影響を及ぼし、病変区域へのそれらの細胞の動員を誘起することから生じ得るか、または、他方で、それらの存在が、疾病が組織に影響を及ぼす主原因になり得る。

どちらの場合にも、それらの細胞の系譜および機能状態の正確な識別が必須であり、特に、小リンパ球の場合には、専門家からの形態学的評価でさえ、それらの細胞の性質、起源、および異質性を解明するには十分でない。マルチパラメータ免疫表現型検査のアプローチのみが細胞浸潤の正確な特徴決定および異質性評価を可能にする。また、組織構成要素のマルチパラメータ情報を獲得することができることと同じほど重要なことは、異なる表現型的に識別された特徴の、組織内で観察される可能な解剖学的変化との関連付けである。それらの変化は当該分野の専門家の直接観察によって識別され得る。

フロー・サイトメトリを用いた単一細胞のマルチパラメータ分析は、細胞懸濁液に適用されたときに正常な状況および疾病状況下における細胞表現型の異質性を解明するために欠かせなくなっていることが分かっている。最新のフロー・サイトメータは多数の同時パラメータを分析することができ、マルチスペクトル・システムの発展およびマス・サイトメトリの出現は、近い将来にそれらの数を押し上げることを約束する。しかし、これらの技術は組織標本に、それらの自然のアーキテクチャを乱すことなく機能することができず、組織の細胞外環境の構成要素を調査する能力を有しない。他方で、細胞形態可視化および空間位置確認（spatial localization）のための標準的な選択であるにもかかわらず、顕微鏡機器は、統計的に有意な数の細胞上の細胞成分の定量的および客観的分析を可能にできず、フロー・サイトメトリのような他の方法論には存在する標準化能力を欠いている。

他のものは、フロー・サイトメータの構成を、レーザを用いて顕微鏡スライド上に固定化された試料を走査し、試料上の蛍光分子を励起し、組織上に存在する分子の表現をピクセルごとに構築するように適応させることによって、これらの課題のうちのいくつかを解決することを試みた（レーザ走査サイトメトリ）。この思想は、後に、分析されるべき同時分子の数を増大させるために蛍光検出の代わりに質量分析を用いるように適応させられた（イメージング・マス・サイトメトリ）。それにもかかわらず、どちらのアプローチも、１度に１つのピクセルずつ生物組織を調査する必要のゆえに、相当に低速である。

したがって、固相試料支持体内に固定化された細胞および／または組織からのマーカのサイズおよび表現に関する定量的データを提供するシステムが必要である。

現在利用可能な最も一般的なアプローチは、従来の顕微鏡検査を用いて複数の単一パラメータ調査を遂行することである。このアプローチは試料（通例、生物の固形組織）のアーキテクチャ構造を維持するが、定量的でなく、複雑な調査のために必要とされるマルチパラメータ次元を欠いている。

代替的に、マルチパラメータ・フロー・サイトメトリが、生物組織に関するマルチパラメータ情報を獲得するために利用され得るが、単一細胞懸濁液を得るために必要とされる組織分離のゆえに空間情報を失うという代償を払う。

フロー・サイトメータの構成を、顕微鏡スライド上に固定化された試料を走査するように適応させることによって、レーザ走査サイトメトリ（Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＬＳＣ）が開発された。それはレーザを用いて試料上の蛍光分子を励起し、組織上に存在する分子の表現をピクセルごとに構築する。この理由のために、および全ての「色」が同時にサンプリングされる、スナップ・ショット・システムであるにもかかわらず、それは非常に速度の遅い方法論である。さらに、この技術は、多重化の点で非常に限定された潜在能力に限定されるにとどまり、３つ～４つの同時パラメータの調査を可能にするのみである。

同様の仕方で、他のものはマス・サイトメトリを、固形組織に対する調査を遂行するように適応させた（イメージング・マス・サイトメトリ（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）－ＩＭＣ）。ＬＳＣとは異なり、ＩＭＣは、組織成分を明らかにし、依然として、高い多重化潜在能力を有するために、蛍光性または発色性複合体の代わりに金属複合体を用いる。それにもかかわらず、ＬＳＣの場合と同様に、試料が単一のピクセル単位で「画像化される」ため、それは、非常に低速の技術であるという同じ欠点に悩まされる。

代替的に、分析されることができる同時マーカの数を増大させるために、マルチスペクトルおよびハイパースペクトル能力が顕微鏡検査ベースのシステムに適用された。データをサンプリングするために２次元センサを用いることで、これらのシステムは複数の空間的位置を同時にサンプリングすることができるが、それにもかかわらず、これらのシステムは、再現可能で定量化可能なデータの代わりに、視覚情報を提供することを意図され、組織の大きい区域を分析するよりも、主として少量の生物物質に関する高分解能情報を提供するように設計される。

本発明は、請求項１に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム、および請求項１５に記載の方法によって、上述の問題のための解決策を提供する。従属請求項において、本発明の好ましい実施形態が定義される。

本発明は、細胞下レベル（subcellular level）の分解能でなく、細胞の分解能をもって組織構造全体に焦点を当てることによって、固相試料支持体上に固定化された生物試料の細胞および組織からマーカのサイズおよび表現に関する定量的データを高速な仕方で獲得するためのシステムおよび方法を提供する。

第１の発明の態様において、本発明は、
１つまたは複数の固相試料を保持するように構成された試料保持器を含む、観察領域と、
観察領域を照射するように構成された少なくとも１つの放射線源と、
少なくとも１つの放射線源による照射時に試料を通して放射された、またはそれによって反射された放射線を集光するように構成された集光要素と、
集光要素によって集光された放射線の波長を選択的に濾波するように構成されたマルチチャネル濾波要素と、
濾波された放射線を受け取り、試料の２次元マップである画像を生成するように構成された画像センサであって、画像センサが放射線検出要素の２次元アレイを含む、画像センサと、
を備える、ハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システムを提供する。

固相試料は、概して、固相試料支持体上に提供される。一実施形態では、試料保持器は、少なくとも１つの固相試料支持体を保持するように構成されており、各支持体は、固定化された試料、好ましくは、生物試料を包含するように適応させられている。支持体は、材料が異なり得、好ましくは、結晶質で光に対して透明であり（例えば、ガラスまたはプラスチック）、ならびに、形状およびサイズが異なり得、好ましくは、長方形形状（例えば、顕微鏡スライド）を有する。

用語「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」は、細胞または組織内に天然に存在する任意の分子を意味するために使用されることになる。用語「タグ」および「分子タグ」は、試料内に天然に存在する特定の成分の存在を明らかにするために試料に添加される任意の物質を意味するために使用されることになる。用語「マーカ」は、天然に、または試料に添加された分子タグの存在に起因して放射線を放射する試料上の任意の成分を定義するために使用されることになり、マーカは、細胞または組織の性質を定めるために用いられる。用語「スペクトル・シグネチャ」は、構造またはピクセルの、その構造またはピクセル内に存在するマーカの固有の組み合わせから生じる固有の放射スペクトルを意味するために使用される。用語「リスト・モード・ファイル」は、生物学的構造のような、関心のある異なる要素に関する情報が記憶され、それらの要素の各々が多列リスト上の列によって表現される、データ・ファイル構造を意味するために使用される。

少なくとも１つの放射線源は、観察領域を照射するように構成されている。それゆえ、試料が観察領域内に存在するときには、放射線は、試料の成分と相互作用し、存在する場合には、試料と組み合わせて用いられている分子タグと相互作用する。この相互作用から、放射線が、試料によって、散乱、蛍光、燐光、化学発光、または選択吸収／透過などの任意のプロセスの結果として放射され得る。試料から放射された放射線は、集光要素を用いて集光され、マルチチャネル濾波要素を通過し、画像センサに到達する。マルチチャネル濾波要素は、スペクトル特性がフィルタに沿って変化し、それゆえ、入ってくる放射線の位置依存濾波を提供するフィルタとして理解されるべきである。

画像センサは放射線検出要素の２次元アレイを含む。放射線検出要素は放射線を受け取り、各放射線検出要素において受け取られた放射線に関連した出力を提供する。その結果、試料の２次元マップである画像が生成される。一実施形態では、画像センサは、電荷結合素子（ｃｈａｒｇｅ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ、ＣＣＤ）、相捕型金属酸化膜半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔａｌ ｏｘｉｄｅ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ、ＣＭＯＳ）、または電子増倍電荷結合素子（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｃｈａｒｇｅ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ、ＥＭＣＣＤ）である。

好ましくは、マルチチャネル濾波要素は、集光要素と画像センサとの間に、それらから離間されて配置されている。特定の実施形態では、システムは、集光要素によって撮像または集光された画像を平面上に投影するように構成された少なくとも１つのレンズをさらに備え、マルチチャネル濾波要素は、画像が投影されるこのような平面に位置付けられており、これにより、画像は濾波要素上に投影され、システムは、マルチチャネル濾波要素によって濾波された上記中間画像を撮像し、それを画像センサに投影するように構成された少なくとも１つの追加のレンズを備える。換言すれば、濾波要素は、第１のレンズが、集光要素と画像センサとの間に形成される中間画像を投影する、まさにその平面上に配置されている（またはそれから若干オフセットしている）。したがって、２つのレンズ、または、同様に、レンズの２つのセットが、この中間画像を形成し、集光するために用いられ得る。

一実施形態では、少なくとも１つの放射線源は、紫外（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ、ＵＶ）、可視（ｖｉｓｉｂｌｅ、ＶＩＳ）、または近赤外（ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ、ＮＩＲ）範囲内、好ましくは、２００ｎｍ～１２００ｎｍの範囲内、より好ましくは、３５０ｎｍ～９５０ｎｍの範囲内の波長を有する放射線を放射するように構成されている。システムは１つまたはいくつかの放射線源を含み得る。一実施形態では、システムは複数の放射線源を含み、各放射線源は、異なる波長間隔内、例えば、５２５ｎｍ～６２５ｎｍの範囲内に含まれる波長の放射線を放射するように構成されている。

一実施形態では、濾波要素は、少なくとも２つの位置の間で可動であるように構成されており、濾波要素の各位置は、画像センサの各放射線検出要素に到達した放射線の波長を選択的に濾波する。好ましい実施形態では、濾波要素は、複数の位置へ可動であるように構成されている。好ましくは、濾波要素の移動は集光要素の視野（ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｖｉｅｗ、ＦＯＶ）の空間次元のうちの１つと平行である。

一実施形態では、濾波要素は連続または半連続線形可変フィルタ（Linear variable filter）である。好ましくは、濾波要素は、２００ｎｍ～１２００ｎｍ、より好ましくは、３５０ｎｍ～９５０ｎｍの放射線波長を濾波するように構成されている。

一実施形態では、観察領域は、上記放射線源の放射線が、集光要素によって集光される前に観察領域を通過するよう、すなわち、透過照明構成に従って、少なくとも１つの放射線源と集光要素との間に介在させられている。

一実施形態では、少なくとも１つの放射線源は、観察領域が、集光要素によって集光される前に放射線源の放射線を反射するよう、すなわち、落射照明構成に従って、集光要素と同じ観察領域の側に配置されている。

一実施形態では、少なくとも１つの放射線源および集光要素は、放射線源からの放射線のビームが、集光要素の光軸に対して０でない角度に向けられるよう、すなわち、暗視野構成に従って、配置されている。

一実施形態では、少なくとも１つの放射線源および集光要素（１０５）は、放射線源からの放射線のビームが集光要素の光軸に沿って向けられるよう、すなわち、明視野構成に従って、配置されている。

好ましい実施形態では、システムは複数の放射線源を備え、各放射線源は所与の波長（Λ）の放射線を提供し、明視野落射照明、暗視野落射照明、明視野透過照明、および暗視野透過照明から選択される異なる照射モード（α）に従って配置されている。

一実施形態では、システムはプロセッサを備える。特定の実施形態では、プロセッサは、コンピュータ（例えば、パーソナル・コンピュータ）の部分である。

一実施形態では、プロセッサは、
－ 試料の複数の波長符号化２次元マップを受け取るステップであって、複数の波長符号化２次元マップが濾波要素の複数の位置に関連付けられており、波長符号化２次元マップが、画像センサによって、それが濾波要素の位置のために受け取った放射線に基づいて生成された画像である、ステップと、
－ 特定の波長に対応する試料の波長符号化２次元マップの部分を組み合わせることによって試料の複数の単色２次元マップを生成するステップと、
－ 複数の単色２次元マップを含むスペクトル・キューブを構築するステップと、
－ スペクトル・キューブ上の試料構造を識別し、それらのスペクトル・シグネチャを獲得するステップと、
－ 獲得されたスペクトル・シグネチャを既知の構造のスペクトル・シグネチャのデータベースと比較し、および／またはスペクトル・シグネチャを分解し、識別された試料構造の各々の内部における各マーカの存在度（abundance）の推定を獲得するステップであって、マーカが、天然に、または試料に添加された分子タグの存在に起因して放射線を放射する試料上の任意の成分であり、これにより、マーカが、細胞または組織の性質を定めるために用いられる、ステップと、
を遂行するように構成されている。

システムがプロセッサを備える代替的な実施形態では、プロセッサは、
－ 試料の複数の波長符号化２次元マップを受け取ることであって、複数の波長符号化２次元マップが濾波要素の複数の位置に関連付けられており、波長符号化２次元マップが、画像センサによって、それが濾波要素の位置のために受け取った放射線に基づいて生成された画像であることと、
－ 特定の波長（λ）に対応する試料の複数の単色２次元マップを、単色２次元マップのピクセルごとに、多変数補間プロセスによって全ての波長符号化２次元マップからこのような特定の波長（λ）における測定された信号を推定することによって、生成することと、
－ 複数の単色２次元マップを含むスペクトル・キューブを構築することと、
－ スペクトル・キューブ上の試料構造を識別し、それらのスペクトル・シグネチャを獲得することと、
－ 獲得されたスペクトル・シグネチャを既知の構造のスペクトル・シグネチャのデータベースと比較し、および／またはスペクトル・シグネチャを分解し、識別された試料構造の各々の内部における各マーカの存在度の推定を獲得することであって、マーカが、天然に、または試料に添加された分子タグの存在に起因して放射線を放射する試料上の任意の成分であり、これにより、マーカが、細胞または組織の性質を定めるために用いられることと、
を行うように構成されている。

一実施形態では、プロセッサは、試料構造のサイズおよび／または形状を獲得するように構成されている。

一実施形態では、プロセッサは、複数の照射波長（Λ）のため、および／または複数の照射モード（α）のために前のステップのうちの任意のものを遂行するように構成されており、各単色２次元マップは、試料が、所与の照射波長（Λ）を用いて、および所与の照射モード（α）で照射されときに特定の波長（λ）で放射された放射線に対応し、スペクトル・キューブを構築するステップは、複数の単色２次元マップを組み合わせることによって遂行される。

一実施形態では、プロセッサは、濾波要素の順次変位と協調させられた試料の複数の波長符号化２次元マップの順次記録を制御するように構成されている。別の実施形態では、システムは、濾波要素の順次変位と協調させられた試料の複数の波長符号化２次元マップの順次記録を制御するように構成された第２のプロセッサを備える。好ましくは、濾波要素は、連続または半連続線形可変フィルタ、より好ましくは、連続線形可変フィルタである。

一実施形態では、システムはデータ記憶のためのメモリを備える。特定の実施形態では、データ記憶のためのメモリは、ハードディスク・ドライブ、ＥＥＰＲＯＭメモリ、または光ディスクなどの、不揮発性コンピュータ・メモリである。

一実施形態では、少なくとも１つの放射線源は、レーザ、発光ダイオード、またはランプである。放射線源は、単色または広帯域放射線を提供するように構成され得る。

一実施形態では、システムは、少なくとも１つの放射線源と観察領域との間に介在させられたバンド・パス・フィルタを備える。有利に、バンド・パス・フィルタは、広帯域放射線源によって放射された特定の放射線波長を選択することを可能にする。

一実施形態では、集光要素は、観察領域の複数の空間的位置からの放射線を同時に撮像するように構成された、レンズ、またはレンズの組み合わせを含む。

一実施形態では、集光要素は、２０よりも低い、好ましくは、１０よりも低い、より好ましくは、２よりも低い拡大率値（magnification factor value）を有する。

一実施形態では、集光要素は、０．２５よりも高い、好ましくは、０．５以上の開口数値を有する。

第２の発明の態様において、本発明は、第１の発明の態様の実施形態のうちの任意のものに係るハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システムを用いて固相試料からデータを獲得するための方法であって、該方法が、
ａ） 試料を提供するステップと、
ｂ） 試料を、試料と相互作用する放射線を用いて照射するステップであって、これにより、試料が放射線を放射する、ステップと、
ｃ） 集光要素を用いて、放射された放射線を撮像するステップと、
ｄ） マルチチャネル濾波要素を用いて、放射された放射線を濾波するステップと、
ｅ） 濾波要素の順次変位と協調して試料の複数の波長符号化２次元マップを順次に記録するステップであって、濾波要素の各位置が、画像センサの各放射線検出要素に到達した放射線の波長を選択的に濾波し、波長符号化２次元マップが、画像センサによって、それが濾波要素の位置ごとに受け取った放射線に基づいて生成される、ステップと、
ｆ） 特定の波長に対応する試料の波長符号化２次元マップの部分を組み合わせることによって試料の複数の単色２次元マップを生成するステップと、
ｇ） 複数の単色２次元マップを含むスペクトル・キューブを構築するステップと、
ｈ） スペクトル・キューブ上の試料構造を識別し、それらのスペクトル・シグネチャを獲得するステップと、
ｉ） 獲得されたスペクトル・シグネチャを既知の構造のスペクトル・シグネチャのデータベースと比較し、および／またはスペクトル・シグネチャを分解し、識別された試料構造の各々の内部における試料の各マーカの存在度の推定を獲得するステップと、
を含む方法を提供する。

本発明の方法によれば、観察領域内に配置された試料が、１つまたはいくつかの放射線源によって放射された放射線を用いて照射される。試料の成分は特定の波長の放射線を選択的に吸収し、通例、異なる波長における放射線を放射し得る。しばしば、試料の内部成分が、直接調査されるために十分なコントラストを欠いていることがあり、このような場合には、コントラストをもたらし、特定の成分の検出を可能にするために、種別特異的タグ（class-specific tags）が試料に添加され得る。これらの成分は、ＤＮＡ、蛋白質、脂質、炭水化物、またはその他のものであり得、複数のタグが、複数の成分を同時に調査するために用いられてもよい。タグのうちの一部は特定の波長の放射線を選択的に吸収し、広帯域放射線源を用いて照射されたときに、吸収された放射線に相補的な波長の放射線を放射し得る（発色タグ）。他のタグは、特定の波長の高エネルギー放射線を用いて照射されたときに、吸収されたものよりも高い波長のスペクトル内の放射線を放射し得る（蛍光タグ）。蛍光または発色タグは、特定の分子のための天然親和性を有する蛍光色素または色原体であり得るか、あるいは親和性分子（例えば、抗体、ＤＮＡレポータ、または文献において知られた他の親和性分子）およびレポータ分子（例えば、色原体または蛍光色素）の組み合わせであり得る。

試料によって放射された放射線は集光要素によって集光される。集光要素によって集光された後に、および画像センサに到達する前に、放射された放射線はマルチチャネル濾波要素を通して向けられる。濾波要素を変位させることで、試料の複数の波長符号化２次元マップが順次に記録され、濾波要素の各位置は、画像センサの各放射線検出要素（または放射線要素のグループ）に到達した放射線の波長を選択的に濾波する。それゆえ、濾波要素の位置ごとに、波長符号化２次元マップが、画像センサによって、それが受け取った放射線に基づいて生成される。一実施形態では、濾波要素は集光要素のＦＯＶの空間次元のうちの１つと平行に移動させられ、全ＦＯＶを通した濾波要素の完全な変位のために必要とされるステップの数は、獲得される波長符号化２次元マップの数を規定する。

複数の波長符号化２次元マップから、試料の複数の単色２次元マップが構築される。一実施形態では、試料の単色２次元マップは、特定の波長に対応する波長符号化２次元マップの部分を組み合わせることによって構築される。それゆえ、試料の複数の単色２次元マップが獲得され、これらの単色２次元マップの各々のものは、試料が所与の放射線源を用いて照射されたときに所与の波長で放射された放射線の情報を有する。獲得された異なる単色２次元マップのセットはスペクトル・キューブを構成する。

画像センサを用いて獲得された画像は複数のピクセルによって形成され、各ピクセルは放射線検出要素の出力に対応する。ピクセルごとに、本方法は不連続放射スペクトルを提供し、特定の波長に対応するスペクトルの点は、該波長に関連付けられた単色２次元マップにおいて見出される。

各不連続放射スペクトルは、通例、いくつかの重なり合う純粋放射スペクトルによって形成され、各純粋放射スペクトルは特定のマーカに対応する。純粋放射スペクトルの重なり合いまたは混合の量は試料内のマーカの空間分布に依存する。

スペクトル・キューブが獲得された後に、試料内に存在する試料構造が、獲得されたスペクトルおよび空間情報に基づいて識別され、特定のスペクトル・シグネチャが、識別された構造ごとに獲得される。その結果、スペクトル・シグネチャおよび空間位置確認に関する情報が、識別されたあらゆる構造のために記憶された、「リスト・モード」ファイルが獲得される。

最後に、各構造のスペクトル・シグネチャは既知のスペクトル・シグネチャのセットと比較され、および／または分解され（分離され（ｕｎｍｉｘｅｄ））、各マーカの存在度の推定がその構造のために獲得される。

すなわち、本実施形態では、単色２次元マップは、特定の波長に対応する波長符号化２次元マップの部分を組み合わせることによって生成される。本方法のステップｆ）の代替的な実施形態では、単色２次元マップは、多変数補間プロセスを利用し、ピクセルごとに、波長符号化２次元マップからの記録に基づいてこのような特定の波長（λ）において受け取られた放射線の推定を獲得することによって生成される。

この多変数補間の算出は、とりわけ、多項式補間、最近隣補間、クリギング、逆距離加重、自然近傍補間、放射基底関数補間、トライリニア補間、トリキュービック補間、スプライン補間などの、文献においてよく知られたいくつかの方法によって遂行され得る。

好ましい実施形態では、多変数補間プロセスはトリキュービック・スプライン補間法である。

特定の実施形態では、ステップｈ）は、空間クラスタリングとも呼ばれる、空間セグメンテーションを用いてスペクトル・キューブ内の構造を識別し、それらの特定のスペクトル・シグネチャを、
試料構造に対応するピクセルの数を決定し、
背景を表すと考えられる区域を識別し、
背景内の区域を決定し、
スペクトルの波長ごとに背景補正信号を次式のように決定することによって獲得する：

ここで、Ｎ_ｓｔおよびＮ_ｂｃｋは、それぞれ、選択された試料構造および背景内のピクセルの数であり、

は、試料構造のピクセルｉにおいて測定された信号であり、

は、背景のピクセルｊにおいて測定された信号であり、Ｓ’_ｓｔは試料構造の背景補正信号である。

有利に、背景補正は、信号強度の微妙な変化を明らかにすることを可能にする。

一実施形態では、ステップｈ）は、試料構造のサイズおよび／または形状を獲得することを含む。

特定の実施形態では、ステップｈ）は、空間クラスタリングとも呼ばれる、空間セグメンテーションを用いてスペクトル・キューブ内の構造を識別し、それらのサイズを、
試料構造に対応するピクセルの数を決定し、
構造のサイズを以下のように決定することによって獲得する：

ここで、Ｎ_ｓｔは、選択された試料構造内のピクセルの数であり、Ｐはピクセルのサイズであり、Ｍはシステムの総合光学倍率（total optical magnification）である。

ステップｉ）の目的は、スペクトル・キューブ内で識別された構造の生物学的性質に関する情報を獲得することである。これは、各構造のスペクトル・シグネチャを既知の生物学的構造のスペクトル・シグネチャのセットと比較することによって達成され得る。加えて、または代替的に、構造のスペクトル・シグネチャが分解され得、調査対象のマーカの各々の相対寄与が獲得され得、複数のマーカの相対寄与は、当該技術分野における専門家の知識に基づいて、または専門家によって以前に構築された割合の参照データベースに基づいて上記構造の性質を識別することを助け得る。

ステップｉ）における試料の各マーカからスペクトル・キューブの各構造への相対寄与の決定は、文献において知られたスペクトル分離方法のうちの任意のものを用いて遂行される。好ましい実施形態では、放射の混合のための線形混合モデルが仮定され、とりわけ、通常最小二乗法（ｏｒｄｉｎａｒｙ ｌｅａｓｔ－ｓｑｕａｒｅ、ＯＬＳ）、重み付き最小二乗法（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ、ＷＬＳ）、一般化線形モデル（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ、ＧＬＭ）、非負最小二乗法（ｎｏｎ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｅａｓｔ－ｓｑｕａｒｅｓ、ＮＮＬＳ）のような、異なる方法が、ＬＭＭ問題を解くために利用され得る。この分離プロセスの結果、複数の画像が試料のマーカごとに獲得される。これらの単色画像は本明細書において「マーカ画像」と称され、試料内の各マーカの存在度を表現することになる。

一実施形態では、ステップｂ）～ｆ）は複数の照射波長（Λ）および／または複数の照射モード（α）のために遂行される。本実施形態では、ステップｆ）において、各単色２次元マップは、試料が所与の照射モード（α）を用いて所与の照射波長（Λ）を用いて照射されたときに、特定の波長（λ）で放射された放射線に対応し、ステップｇ）は、複数の単色２次元マップを組み合わせることによって遂行される。複数の照射波長および／または照射モードは、調節可能な波長および／または選択可能な位置を有する１つの放射線源を用いて、あるいは複数の放射線源を用いて提供され得る。

加えて、特定の実施形態では、スペクトル・キューブは、特定の波長（λ）および所与の照射波長（Λ）の両方に従って複数の単色２次元マップを仕分けて構築される。

一実施形態では、固相試料は、人間、動物、真菌、または植物起源の試料などの、生物試料である。

一実施形態では、固相試料は人間の組織の生検材料である。

一実施形態では、本方法は、少なくとも１種の分子タグを用いて試料を染色するステップを含む。

一実施形態では、染色ステップの際に、少なくとも１種の分子タグは発色性または蛍光性のものである。

一実施形態では、染色ステップの際に、少なくとも１種のタグは、試料の少なくとも１種の成分のための天然親和性を呈する、親和性分子と、色原体または蛍光色素である、レポータ分子との組み合わせである。

一実施形態では、レポータ分子と組み合わせられる親和性分子のうちの少なくとも１種は抗体である。

一実施形態では、染色ステップの際に、少なくとも１種のタグは、試料の少なくとも１種の成分のための天然親和性を有し、同時に、色原体または蛍光色素である、単一種の分子である。

本明細書（請求項、説明、および図面を含む）において説明される全ての特徴、および／または説明される方法の全てのステップは、このような相互排他的な特徴および／またはステップの組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせられることができる。

本発明のこれらおよび他の特性および利点は、単なる一例として与えられ、それに限定されない、本発明の好ましい実施形態から明らかになる本発明の詳細な説明を、図面を参照しつつ考慮して明確に理解されることになるであろう。

本発明に係るハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システムの５つの実施形態を概略的に示す図である。 本発明の一実施形態に係る方法のフローチャートを示す図である。 試料の波長符号化空間マップを獲得するプロセスを概略的に示す図である。

図１－Ａ～図１－Ｅに、本発明に係るハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）が概略的に示されている。

システム（１００）は、１つまたは複数の固相試料を保持するように構成された試料保持器（１１２）を含む、観察領域（１０４）を備える。一実施形態では、試料保持器は、少なくとも１つの固相試料支持体を保持するように構成されており、各支持体は、固定化された試料、好ましくは、生物試料を包含するように適応させられている。これらの固相試料支持体は、材料が異なり得、好ましくは、結晶質で光に対して透明であり（例えば、ガラスまたはプラスチック）、ならびに、形状およびサイズが異なり得、好ましくは、長方形形状（例えば、顕微鏡スライド）を有する。

生物試料は、人間、動物、真菌、または植物起源のものであり得、単独で、または分子タグと組み合わせて用いられ得る。

好ましくは、分子タグが、生物試料の成分を明らかにするために用いられる。分子タグのレポータ部分は、照射されたときに、ルミネッセンスを示すか、または放射線を選択的に吸収し得る。分子タグは、その物理構造のゆえに、または生物試料と組み合わせられたときに、特性放射線スペクトルを呈し得る。

システム（１００）は、観察領域（１０４）内に配置された試料のマーカを照射し、刺激するための１つまたはいくつかの放射線源（１０１、１０２、１０３）を備える。この相互作用から、放射線が、試料によって、散乱、蛍光、燐光、化学発光、または選択吸収／透過などの任意のプロセスの結果として放射され得る。

一実施形態では、観察領域（１０４）内に配置されるべき生物試料は、生物組織、すなわち、生体内の同様の機能を果たす相互接続された細胞およびそれらの細胞外マトリックスの集団である。その生物組織の成分は特定の波長の光を天然に吸収し、通例、異なる波長における放射線を放射し得る。生物組織の成分が、直接調査されるために十分なコントラストを欠いている場合には、コントラストをもたらし、特定の成分の検出を可能にするために、種別特異的タグが試料に添加され得る。これらの成分は、ＤＮＡ、蛋白質、脂質、炭水化物、またはその他のものであり得、複数のタグが、複数の成分を同時に調査するために用いられてもよい。

放射線に応答して、試料の成分、および／または試料と組み合わせて用いられている分子タグは、集光要素（１０５）によって撮像された放射線のスペクトルを放射する。集光された放射線はマルチチャネル濾波要素（１０８）へ向けられ、画像センサ（１０９）へ改めて向けられる。

図１－Ａに示される実施形態は、可視スペクトル内の光を放射する３つの放射線源（１０１、１０２、１０３）を含む。しかし、異なる数の放射線源が用いられてもよい。また、標的試料材料の励起に適した任意の既知の放射線源が用いられ得る。例えば、放射線源（１０１、１０２、１０３）は、レーザ、発光ダイオード（ｌｉｇｈｔ ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｄｉｏｄｅ）（「ＬＥＤ」）、および／またはランプであり得る。レーザまたはＬＥＤは、複数の励起波長または単一の波長を放射するように構成され得る。放射線源（１０１）が放射線の１つを超える波長を生成する場合には、放射線が観察領域（１０４）内の試料に到達する前に任意の不必要な波長を濾波して除去するために、バンド・パス・フィルタ（１０７）が放射線源（１０１）の前方に配置され得る。

図１－Ａの実施形態では、各放射線源（１０１、１０２、１０３）が観察領域（１０４）の全体を同時に照射する（すなわち、広視野照射）。

図１－Ｂに示される実施形態では、集光要素（１０５）が配置されている同じ側から到来し、集光要素（１０５）の光軸に沿って向けられる光のビーム（１０６）を用いて観察領域（１０４）を照射する１つの放射線源（１０１）のみが存在する（明視野落射照明）。図１－Ｃに示される別の実施形態では、放射線源（１０２）が、集光要素（１０５）が配置されている同じ側から到来し、集光要素（１０５）の光軸に対して０でない角度で向けられる光のビーム（１０６）を用いて観察領域（１０４）を照射する（暗視野落射照明）。図１－Ｄに示される別の実施形態では、放射線源（１０３）が、集光要素（１０５）が配置されている側と反対の観察領域の側から到来し、集光要素（１０５）の光軸に沿って向けられる光のビーム（１０６）を用いて観察領域（１０４）を照射する（明視野透過照明）。図１－Ｅに示される別の実施形態では、放射線源（１０３）が、集光要素（１０５）が配置されている側と反対の観察領域の側から到来し、集光要素（１０５）の光軸に対して０でない角度で向けられる光のビーム（１０６）を用いて観察領域（１０４）を照射する（暗視野透過照明）。

それゆえ、図１－Ｂおよび図１－Ｃの実施形態では、放射線源（１０１、１０２）は、集光要素（１０５）と同じ観察領域（１０４）の側に配置されており、これにより、観察領域（１０４）内の試料は、集光要素（１０５）によって集光される前に放射線源（１０１、１０２）の放射線を反射する。図１－Ｄおよび図１－Ｅの実施形態では、観察領域（１０４）は放射線源（１０３）と集光要素（１０５）との間に介在させられており、これにより、放射線源（１０３）からの放射線は、集光要素（１０５）によって集光される前に観察領域（１０４）内の試料を通過する。

図１－Ａに示されるもののような好ましい実施形態では、図１－Ｂ～図１－Ｅに示される上述の撮像幾何のうちの２つ以上がシステム内に共存し得、相補データを獲得するために順次に用いられ得る。

照射された試料によって放射された放射線は集光要素（１０５）によって集光される。好ましい実施形態では、集光要素は、観察領域（１０４）の複数の空間的位置からの放射線を同時に撮像するように構成されている。一実施形態では、集光要素は、レンズ、またはレンズの組み合わせである。

好ましい実施形態では、集光要素は、大きい視野（ＦＯＶ）を達成し、観察領域（１０４）の、および、それゆえ、試料の、より大きい２次元区域に関する情報を獲得するために、低い拡大率（Ｍ）を有する。好ましくは、拡大率値（Ｍ）は２０よりも低く、より好ましくは、１０よりも低く、最も好ましくは、２よりも低い。拡大率を有するシステムの任意の他の要素と組み合わせられた集光要素（１０５）の総合拡大率は、画像センサ（１０９）によるＦＯＶの正確なサンプリング周波数を保証するように選択され得る。ＦＯＶのサンプリング周波数は、生物組織試料内の個々の細胞を区別するために選択され得、小さい細胞内詳細を区別するために選択されるものではない。画像センサ（１０９）は放射線検出要素の２次元アレイを含む。システムの最終拡大率（final magnification factor）は、放射線検出要素のサイズなどの、画像センサの特性に依存し得る。

集光要素（１０５）によって集光された後に、および画像センサ（１０９）に到達する前に、放射線はマルチチャネル濾波要素（１０８）を通して向けられる。マルチチャネル濾波要素（１０８）は、画像センサ（１０９）の各放射線検出要素、または放射線検出要素のグループに到達した放射線を選択的に濾波する。一実施形態では、マルチチャネル濾波要素（１０８）は連続または半連続可変バンドパス・フィルタである。

本実施形態では、マルチチャネル濾波要素は、１つまたは２つの空間次元（ｘ，ｙ）において変位可能となるように構成されており、それゆえ、画像センサ（１０９）が複数の２次元出力を生成することを可能にし、各出力は試料の異なる波長符号化（λ＝λ（ｙ））２次元（ｘ，ｙ）マップを表現する。画像センサ（１０９）によって生成された試料の各波長符号化２次元マップはプロセッサ（１１０）に送信され、および／またはさらなる処理のためにメモリ（１１１）内に記憶され得る。

画像センサ（１０９）は、アレイ内の各放射線検出要素が、試料内の異なる２次元空間的位置から到来する放射線を受け取り、調査対象の試料の空間（ｘ，ｙ）マップである画像を生成する、２次元アレイセンサである。画像センサ（１０９）は、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相捕型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）、電子増倍ＣＣＤ（ＥＭＣＣＤ）、または２次元空間データを獲得するための任意の他の同様のシステムなどの、２次元光検出器アレイセンサであり得る。２次元画像センサは、指定された時間量の間にデータを累積的にサンプリングするためにトリガされ得る。

図２は、本発明の一実施形態に係る方法のフローチャートを示す。タグで染色されていてもよい、試料が観察領域（１０４）内に配置される（２０１）。第１の放射線源（１０１、１０２、１０３）が活性化され（２０２）、濾波要素（１０８）がその初期位置に配置され（２０３）、画像センサ（１０９）が、生物試料の第１の波長符号化２次元マップを表現する第１の画像を記録する（２０４）。次に、濾波要素（１０８）が第２の位置へ移動させられ（２０３）、第２の波長符号化２次元マップが獲得される。このプロセスが、濾波要素（１０８）の最後の位置に到達されるまで継続される。１つを超える照射モード（α）または照射波長（Λ）が用いられる場合には、第２の放射線源（１０１、１０２、１０３）が活性化され（２０２）、濾波要素（１０８）がその初期位置へ移動させられ（２０３）、新たな波長符号化２次元マップに対応する、新たな画像が獲得される。このプロセスが、濾波要素（１０８）の最後の位置に到達されるまで継続され、全ての放射線源のために繰り返される。

プロセッサ（１１０）が生物試料の複数の波長符号化２次元マップ（３０１）を獲得し、特定の波長に対応する波長符号化２次元マップ（３０１）の部分を組み合わせることによって試料の複数の単色２次元マップ（３０４）を構築する（２０５）。これらの単色２次元マップの各々のものは、試料が、所与の照射モード（α）を用いて所与の放射線波長（Λ）を用いて照射されたときに、所与の波長（λ）において放射された放射線に関する空間関連（ｘ，ｙ）情報を有する。これらの複数の単色２次元マップ（３０４）の組み合わせは、２つの空間次元（ｘ，ｙ）および１つのスペクトル次元（α，Λ，λ）を有するスペクトル・キューブ（３０６）に単純化され得る５次元（ｘ，ｙ，λ，Λ，α）データセット（３０５）を構成する。

この例示的な実施形態では、単色２次元マップは、特定の波長に対応する波長符号化２次元マップの部分を組み合わせることによって生成されるが、代替的な実施形態では、単色２次元マップは、多変数補間プロセスを利用し、ピクセルごとに、波長符号化２次元マップからの記録に基づいてこのような特定の波長（λ）において受け取られた放射線の推定を獲得することによって生成される。

プロセッサ（１１０）は、生物試料から生成されたスペクトル・キューブ（３０６）を取得し、意味のある生物試料構造（例えば、細胞）を識別し、それらの構造の各々のスペクトル・シグネチャを獲得するために（２０７）、データ位置の空間セグメンテーション（２０６）を遂行する。次に、プロセッサ（１１０）は各構造のスペクトル・シグネチャを、メモリ（１１１）内に記憶された既知の構造のスペクトルのデータベースと比較する（２０８）。代替的に、またはステップ２０８と同時に、プロセッサ（１１０）は、各マーカから、スペクトル・キューブ内で識別された各構造のスペクトル・シグネチャへの相対寄与を決定することによって、それらの識別された試料構造の各々の内部における各マーカの存在度の推定（２０９）（すなわち、スペクトル分離）を遂行する。識別された構造の性質に関する、および／または各マーカの存在度に関する獲得された情報は、当該技術分野における専門家によって、試料に関する他の関連情報と相関され得る（２１０）。

スペクトル分離を遂行するために必要とされる、放射の混合のための一般に認められているモデルは、放射の存在度の線形結合を仮定する、線形混合モデル（Ｌｉｎｅａｒ Ｍｉｘｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ、ＬＭＭ）である。複数の単色２次元マップはピクセルごとに不連続放射スペクトルを提供し、特定の波長に対応するスペクトルの点は、該波長に対応する単色２次元マップにおいて見出される。

ＬＭＭによれば、不連続放射スペクトルが個々のマーカのスペクトルの線形結合であると仮定される。Ｎ個のピクセルまたは構造から到来するＭ個の励起されたマーカの放射がＬ個の励起波長（Λ）において取得され、Ｌ個の個々の信号（チャネル）を生成する。したがって、各ピクセルまたは構造は、チャネルごとにＭ個のマーカの寄与の合計を包含するＬ個のチャネルのベクトルによって表現される。ＬＭＭは、次式のように、その行列形式で書かれることができる：
Ｙ＝ＡＨ
ここで、Ｙは、検出された強度のＬｘＮ行列であり、Ａは、Ｌ個のスペクトル・チャネルの各々におけるＭ個のマーカの各々の予想される放射を包含する混合のＬｘＭ行列であり、Ｈは構造ごとの現実のマーカ濃度のＭｘＮ行列である。

測定における不確実性も、ノイズをモデル内に含めることによって考慮され得る。通例、２つのノイズモデルが採用される。第１のモデルは加算性ガウス・ノイズ（ホワイト・ノイズ）モデルであり、この場合、上式は次式に変更される：
Ｙ＝ＡＨ＋Ｒ
ここで、Ｒは、０の平均を有する独立で同一の分布に従うガウス変数によって形成された行列である。第２のモデルはポアソン過程を用いて光子放射をモデル化する。

とりわけ、通常最小二乗法（ＯＬＳ）、重み付き最小二乗法（ＷＬＳ）、一般化線形モデル（ＧＬＭ）、非負最小二乗法（ＮＮＬＳ）のような、異なる方法が、ＬＭＭ問題を解き、各マーカの存在度を有する空間マップを獲得するために利用され得、空間マップはプロセッサへ送信され、および／またはさらなる処理のためにメモリ内に記憶され得る。

図３は、生物試料の波長符号化２次元マップを獲得するステップ（Ａ）、および組み合わせられたときに、試料のスペクトル・キューブを構成する（Ｄ）、生物試料の単色２次元マップへのそれらの変換のステップ（Ｂ＆Ｃ）の一実施形態を示す。プロセスは、所与の照射波長（Λ）および所与の照射モード（α）のために濾波要素（１０８）の異なる位置を用いて取得された全ての連続した画像を用い、次に、（ｘ，ｙ，λ）次元空間内で機能する。１つを超える照射波長（Λ）および／または１つを超える照射モード（α）が用いられた場合には、プロセスは画像のセットごとに独立して行われ、画像の各セットは所与の照射波長（Λ）および所与の照射モード（α）に対応する。

各波長符号化２次元マップ（３０１）は、いくつかの連続した個別のステップにおいて濾波要素（１０８）を集光要素のＦＯＶの空間次元のうちの１つ（ｙ）と平行に移動させることによって獲得される（Ａ）。全ＦＯＶ（３０３）を通した濾波要素の完全な変位のために必要とされるステップの数は、取得される画像の数、およびそれゆえ、波長符号化２次元マップの数を規定する。

各波長符号化２次元マップ（３０１）は「ｙ」空間次元に沿って「ｎ」個の帯域に分割される（スライスされる）（Ｂ）。帯域の数「ｎ」は、全ＦＯＶを通したフィルタの１つの帯域の完全な変位のために必要とされるステップの数に対応する。帯域の各々のものは、同じ波長に対応する他の波長符号化２次元マップ（３０１）からの帯域と組み合わせられ、各々のものが特定の波長に対応する、生物試料の単色２次元マップ（３０４）を再現する。単色２次元マップ（３０４）の完全セットはスペクトル・キューブ（３０６）を構成する。図３において、同じ波長に対応する帯域は同じパターンを用いて表現されている。

代替的な実施形態では、単色２次元マップは、多変数補間プロセスを利用し、ピクセルごとに、波長符号化２次元マップからの記録に基づいて特定の波長（λ）において受け取られた放射線の推定を獲得することによって、波長符号化２次元マップから生成される。

以下の条項が本発明に従って本明細書において提供される：
第１項． １つまたは複数の固相試料を保持するように構成された試料保持器を含む、観察領域（１０４）と、
観察領域（１０４）を照射するように構成された少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２、１０３）と、
少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２、１０３）による照射時に試料を通して放射された、またはそれによって反射された放射線を集光するように構成された集光要素（１０５）と、
集光要素（１０５）によって集光された放射線の波長を選択的に濾波するように構成されたマルチチャネル濾波要素（１０８）と、
濾波された放射線を受け取り、試料の２次元マップである画像を生成するように構成された画像センサ（１０９）であって、画像センサ（１０９）が放射線検出要素の２次元アレイを含む、画像センサ（１０９）と、
を備える、ハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第２項． 濾波要素（１０８）が、少なくとも２つの位置の間で可動であるように構成されており、濾波要素（１０８）の各位置が、画像センサ（１０９）の各放射線検出要素に到達した放射線の波長を選択的に濾波する、第１項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第３項． システムがプロセッサ（１１０）をさらに備え、プロセッサ（１１０）が、
－ 試料の複数の波長符号化２次元マップ（３０１）を受け取ることであって、複数の波長符号化２次元マップ（３０１）が濾波要素（１０８）の複数の位置に関連付けられており、波長符号化２次元マップが、画像センサ（１０９）によって、それが濾波要素（１０８）の位置のために受け取った放射線に基づいて生成された画像であることと、
－ 特定の波長（λ）に対応する試料の波長符号化２次元マップ（３０１）の部分を組み合わせることによって試料の複数の単色２次元マップ（３０４）を生成すること（２０５）と、
－ 複数の単色２次元マップ（３０４）を含むスペクトル・キューブ（３０６）を構築することと、
－ スペクトル・キューブ（３０６）上の試料構造を識別し（２０６）、それらのスペクトル・シグネチャを獲得すること（２０７）と、
－ 獲得されたスペクトル・シグネチャを既知の構造のスペクトル・シグネチャのデータベースと比較し（２０８）、および／またはスペクトル・シグネチャを分解し、識別された試料構造の各々の内部における各マーカの存在度の推定を獲得すること（２０９）と、
を行うように構成されている、第２項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第４項． 観察領域（１０４）は、上記放射線源（１０３）の放射線が、集光要素（１０５）によって集光される前に観察領域（１０４）を通過するよう、透過照明構成に従って、少なくとも１つの放射線源（１０３）と集光要素（１０５）との間に介在させられている、第１項から第３項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第５項． 少なくとも１つの放射線源（１０２）、観察領域（１０４）、および集光要素（１０５）が暗視野構成に従って配置されている、第１項から第４項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第６項． 少なくとも１つの放射線源（１０１、１０３）、観察領域（１０４）、および集光要素（１０５）が明視野構成に従って配置されている、第１項から第５項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第７項． 少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２）は、観察領域（１０４）が、集光要素（１０５）によって集光される前に上記放射線源（１０１、１０２）の放射線を反射するよう、落射照明構成に従って、観察領域（１０４）に向けて配向されている、第１項から第６項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第８項． システム（１００）がメモリ（１１１）をさらに備える、第１項から第７項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第９項． システム（１００）が、少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２、１０３）と観察領域（１０４）との間に介在させられた少なくとも１つのバンド・パス・フィルタ（１０７）をさらに備える、第１項から第８項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第１０項． 少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２、１０３）が、レーザ、発光ダイオード、またはランプである、第１項から第９項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第１１項． 集光要素（１０５）が、観察領域の複数の空間的位置からの放射線を同時に撮像するように構成された、レンズ、またはレンズの組み合わせを含む、第１項から第１０項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第１２項． 集光要素（１０５）が、２０よりも低い、好ましくは、１０よりも低い、最も好ましくは、２よりも低い拡大率値（Ｍ）を有し、および／または
集光要素（１０５）が、０．２５よりも高い、好ましくは、０．５以上の開口数値を有する、第１項から第１１項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第１３項． 濾波要素（１０８）が、２００ｎｍ～１２００ｎｍ、好ましくは、３５０ｎｍ～９５０ｎｍの、連続または半連続線形可変フィルタである、第１項から第１２項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。

第１４項． 第１項から第１３項のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）を用いて固相試料からデータを獲得するための方法であって、
ａ） 試料を提供するステップ（２０１）と、
ｂ） 試料を、試料と相互作用する放射線を用いて照射するステップ（２０２）であって、これにより、試料が放射線を放射する、ステップ（２０２）と、
ｃ） 集光要素（１０５）を用いて、放射された放射線を撮像するステップと、
ｄ） マルチチャネル濾波要素（１０８）を用いて、放射された放射線を濾波するステップと、
ｅ） 濾波要素（１０８）の順次変位（２０３）と協調して試料の複数の波長符号化２次元マップ（３０１）を順次に記録するステップ（２０４）であって、濾波要素（１０８）の各位置が、画像センサ（１０９）の各放射線検出要素に到達した放射線の波長（λ）を選択的に濾波し、波長符号化２次元マップが、画像センサ（１０９）によって、それが濾波要素（１０８）の位置ごとに受け取った放射線に基づいて生成される、ステップ（２０４）と、
ｆ） 放射された放射線の特定の波長（λ）に対応する試料の波長符号化２次元マップ（３０１）の部分を組み合わせることによって試料の複数の単色２次元マップ（３０４）を生成するステップ（２０５）と、
ｇ） 複数の単色２次元マップ（３０４）を含むスペクトル・キューブ（３０６）を構築するステップと、
ｈ） スペクトル・キューブ（３０６）上の試料構造を識別し（２０６）、それらのスペクトル・シグネチャを獲得するステップ（２０７）と、
ｉ） 獲得されたスペクトル・シグネチャを既知の構造のスペクトル・シグネチャのデータベースと比較し（２０８）、および／またはスペクトル・シグネチャを分解し、識別された試料構造の各々の内部における各マーカの存在度の推定を獲得するステップ（２０９）と、
を含む方法。

第１５項． ステップｂ）～ｆ）が複数の照射波長（Λ）および／または複数の照射モード（α）のために遂行され、ステップｆ）において、各単色２次元マップ（３０４）は、試料が、所与の照射波長（Λ）を用いて、および所与の照射モード（α）で照射されたときに、特定の波長（λ）で放射された放射線に対応し、ステップｇ）が、複数の単色２次元マップ（３０４）を組み合わせることによって遂行される、第１４項に記載の方法。

Claims (20)

1. １つまたは複数の固相試料を保持するように構成された試料保持器を含む、観察領域（１０４）と、
   前記観察領域（１０４）を照射するように構成された少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２、１０３）と、
   前記少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２、１０３）による照射時に前記試料を通して放射された、または前記試料によって反射された放射線を集光するように構成された集光要素（１０５）であって、前記集光要素（１０５）が２０以下の拡大率値（Ｍ）を有し、０．２５以上の開口数値を有する、集光要素（１０５）と、
   前記集光要素（１０５）によって集光された前記放射線の波長を選択的に濾波するように構成されたマルチチャネル濾波要素（１０８）と、
   前記濾波された放射線を受け取り、前記試料の２次元マップである画像を生成するように構成された画像センサ（１０９）であって、前記画像センサ（１０９）が放射線検出要素の２次元アレイを含む、画像センサ（１０９）と、
   を備える、ハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
2. 前記濾波要素（１０８）が、少なくとも２つの位置の間で可動であるように構成されており、前記濾波要素（１０８）の各位置が、前記画像センサ（１０９）の各放射線検出要素に到達した前記放射線の前記波長を選択的に濾波する、請求項１に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
3. 前記システムがプロセッサ（１１０）をさらに備え、前記プロセッサ（１１０）が、
   － 前記試料の複数の波長符号化２次元マップ（３０１）を受け取ることであって、前記複数の波長符号化２次元マップ（３０１）が前記濾波要素（１０８）の複数の位置に関連付けられており、波長符号化２次元マップが、前記画像センサ（１０９）によって、それが前記濾波要素（１０８）の位置のために受け取った前記放射線に基づいて生成された画像であることと、
   － 特定の波長（λ）に対応する前記試料の前記波長符号化２次元マップ（３０１）の部分を組み合わせることによって前記試料の複数の単色２次元マップ（３０４）を生成すること（２０５）と、
   － 前記複数の単色２次元マップ（３０４）を含むスペクトル・キューブ（３０６）を構築することと、
   － 前記スペクトル・キューブ（３０６）上の試料構造を識別し（２０６）、それらのスペクトル・シグネチャを獲得すること（２０７）と、
   － 前記獲得されたスペクトル・シグネチャを既知の構造のスペクトル・シグネチャのデータベースと比較し（２０８）、および／または前記スペクトル・シグネチャを分解し、前記識別された試料構造の各々の内部における各マーカの存在度の推定を獲得すること（２０９）であって、マーカが、天然に、または前記試料に添加された分子タグの存在に起因して放射線を放射する前記試料上の任意の成分であることと、
   を行うように構成されている、請求項２に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
4. 前記システムがプロセッサ（１１０）をさらに備え、前記プロセッサ（１１０）が、
   － 前記試料の複数の波長符号化２次元マップ（３０１）を受け取ることであって、前記複数の波長符号化２次元マップ（３０１）が前記濾波要素（１０８）の複数の位置に関連付けられており、波長符号化２次元マップが、前記画像センサ（１０９）によって、それが前記濾波要素（１０８）の位置のために受け取った前記放射線に基づいて生成された画像であることと、
   － 特定の波長（λ）に対応する前記試料の複数の単色２次元マップ（３０４）を、多変数補間プロセスを利用し、ピクセルごとに、前記波長符号化２次元マップからの記録に基づいてこのような特定の波長（λ）において受け取られた前記放射線の推定を獲得することによって生成すること（２０５）と、
   － 前記複数の単色２次元マップ（３０４）を含むスペクトル・キューブ（３０６）を構築することと、
   － 前記スペクトル・キューブ（３０６）上の試料構造を識別し（２０６）、それらのスペクトル・シグネチャを獲得すること（２０７）と、
   － 前記獲得されたスペクトル・シグネチャを既知の構造のスペクトル・シグネチャのデータベースと比較し（２０８）、および／または前記スペクトル・シグネチャを分解し、前記識別された試料構造の各々の内部における各マーカの存在度の推定を獲得すること（２０９）であって、マーカが、天然に、または前記試料に添加された分子タグの存在に起因して放射線を放射する前記試料上の任意の成分であることと、
   を行うように構成されている、請求項２に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
5. 前記観察領域（１０４）は、前記放射線源（１０３）の前記放射線が、前記集光要素（１０５）によって集光される前に前記観察領域（１０４）を通過するよう、透過照明構成に従って、少なくとも１つの放射線源（１０３）と前記集光要素（１０５）との間に介在させられている、請求項１から４のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
6. 少なくとも１つの放射線源（１０２）、前記観察領域（１０４）、および前記集光要素（１０５）が暗視野構成に従って配置されている、請求項１から５のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
7. 少なくとも１つの放射線源（１０１、１０３）、前記観察領域（１０４）、および前記集光要素（１０５）が明視野構成に従って配置されている、請求項１から６のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
8. 少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２）は、前記観察領域（１０４）が、前記集光要素（１０５）によって集光される前に前記放射線源（１０１、１０２）の前記放射線を反射するよう、落射照明構成に従って、前記観察領域（１０４）に向けて配向されている、請求項１から７のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
9. 前記システム（１００）がメモリ（１１１）をさらに備える、請求項１から８のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
10. 前記システム（１００）が、少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２、１０３）と前記観察領域（１０４）との間に介在させられた少なくとも１つのバンド・パス・フィルタ（１０７）をさらに備える、請求項１から９のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
11. 少なくとも１つの放射線源（１０１、１０２、１０３）が、レーザ、発光ダイオード、またはランプである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
12. 前記集光要素（１０５）が、前記観察領域の複数の空間的位置からの放射線を同時に撮像するように構成された、レンズ、またはレンズの組み合わせを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
13. 前記集光要素（１０５）が、１０以下、好ましくは、２以下の拡大率値（Ｍ）を有し、および／または
    前記集光要素（１０５）が０．５以上の開口数値を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
14. 前記濾波要素（１０８）が、好ましくは、２００ｎｍ～１２００ｎｍ、より好ましくは、３５０ｎｍ～９５０ｎｍの、連続または半連続線形可変フィルタである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）。
15. 請求項１から１４のいずれか一項に記載のハイパースペクトル定量的イメージング・サイトメトリ・システム（１００）を用いて固相試料からデータを獲得するための方法であって、
    ａ） 固相試料を提供するステップ（２０１）と、
    ｂ） 前記試料を、前記試料と相互作用する放射線を用いて照射するステップ（２０２）であって、これにより、前記試料が放射線を放射する、ステップ（２０２）と、
    ｃ） 前記集光要素（１０５）を用いて、前記放射された放射線を撮像するステップと、
    ｄ） 前記マルチチャネル濾波要素（１０８）を用いて、前記放射された放射線を濾波するステップと、
    ｅ） 前記濾波要素（１０８）の順次変位（２０３）と協調して前記試料の複数の波長符号化２次元マップ（３０１）を順次に記録するステップ（２０４）であって、前記濾波要素（１０８）の各位置が、前記画像センサ（１０９）の各放射線検出要素に到達した前記放射線の前記波長（λ）を選択的に濾波し、波長符号化２次元マップが、前記画像センサ（１０９）によって、それが前記濾波要素（１０８）の位置ごとに受け取った前記放射線に基づいて生成される、ステップ（２０４）と、
    ｆ） 前記試料の前記波長符号化２次元マップ（３０１）に基づいて前記試料の複数の単色２次元マップ（３０４）を生成するステップ（２０５）と、
    ｇ） 前記複数の単色２次元マップ（３０４）を含むスペクトル・キューブ（３０６）を構築するステップと、
    ｈ） 前記スペクトル・キューブ（３０６）上の試料構造を識別し（２０６）、それらのスペクトル・シグネチャを獲得するステップ（２０７）と、
    ｉ） 前記獲得されたスペクトル・シグネチャを既知の構造のスペクトル・シグネチャのデータベースと比較し（２０８）、および／または前記スペクトル・シグネチャを分解し、前記識別された試料構造の各々の内部における各マーカの存在度の推定を獲得するステップ（２０９）であって、マーカが、天然に、または前記試料に添加された分子タグの存在に起因して放射線を放射する前記試料上の任意の成分である、ステップ（２０９）と、
    を含む方法。
16. ステップｂ）～ｆ）が複数の照射波長（Λ）および／または複数の照射モード（α）のために遂行され、ステップｆ）において、各単色２次元マップ（３０４）は、前記試料が、所与の照射波長（Λ）を用いて、および所与の照射モード（α）で照射されたときに、特定の波長（λ）で放射された放射線に対応し、ステップｇ）が、前記複数の単色２次元マップ（３０４）を組み合わせることによって遂行される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記単色２次元マップ（３０４）が、特定の波長（３００）に対応する前記波長符号化２次元マップの部分を組み合わせることによって生成される、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 前記単色２次元マップが、多変数補間プロセスを利用し、ピクセルごとに、前記波長符号化２次元マップからの記録に基づいてこのような特定の波長（λ）において受け取られた前記放射線の推定を獲得することによって生成される、請求項１５または１６に記載の方法。
19. 前記多変数補間プロセスがトリキュービック・スプライン補間法である、請求項１８に記載の方法。
20. ステップａ）において、コントラストをもたらし、特定の成分の検出を可能にするために、種別特異的タグが前記固相試料に添加された（２０１）、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。

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