JP2022535673A - 熱を用いたプロテーゼのコーティング法 - Google Patents
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Abstract
Description
実施例1-1.光を用いてコーティングしたプロテーゼの製造(比較例)
光開始剤としての0.055Mのベンゾフェノン(benzophenone)、及び架橋剤としての2.5mMのジペンタエリスリトールペンタ(又はヘキサ)アクリレート(dipentaerythritol penta(or hexa)acrylate)をアセトン(acetone)又はエタノール(ethanol)溶媒に溶解して開始剤溶液を作製した。その後、シリコン乳房プロテーゼ(Mentor, 125cc)を前記開始剤溶液に十分に浸かるように1分間浸漬し、次いで乾燥させた。架橋剤としての5.0mMのエチレングリコールジメタクリレート(ethylene glycol dimethacrylate; EGDMA)、及び単量体としての0.25Mのメタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(methacryloyloxyethyl phosphorylcholine; MPC)を蒸留水に溶解して重合溶液を作製した。前記重合溶液に開始剤を吸着させたプロテーゼを浸漬し、その後ラジカル重合反応によりプロテーゼがコーティングされるように、18.4cmの距離で紫外線(UV)を10分間照射した。前述したようにコーティングしたプロテーゼは、以後の分析に用いる前に、超音波で10分間、1回の処理を施して洗浄することにより、余分の反応物を除去した。前記超音波を用いる洗浄方法は一般に用いられる洗浄方法に比べて多少強力な方法であるが、生体内移植後の動きなどによるコーティングの剥離などを模倣するために、このように多少強力な洗浄方法を用いた。
熱開始剤としての0.1Mの過酸化ベンゾイル(benzoyl peroxide)、及び架橋剤としてのMPCに対して0.5mol%のジペンタエリスリトールペンタ(又はヘキサ)アクリレート(dipentaerythritol penta(or hexa)acrylate)を1:1の比率のMC及びアセトン混合溶媒に溶解して開始剤溶液を作製した。その後、シリコン乳房プロテーゼ(Mentor, 125cc)を前記開始剤溶液に十分に浸かるように1分間浸漬し、次いで乾燥させた。架橋剤としてのMPCに対して1mol%のエチレングリコールジメタクリレート(ethylene glycol dimethacrylate; EGDMA)、及び単量体としての0.25Mのメタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(methacryloyloxyethyl phosphorylcholine; MPC)を蒸留水に溶解して重合溶液を作製した。前記重合溶液に開始剤を吸着させたプロテーゼを十分に浸かるように浸漬し、その後ラジカル重合反応によりプロテーゼがコーティングされるように、予熱したオイルバス(oil bath)を用いて92℃で90分間又は70℃で16時間加熱した。前述したようにコーティングしたプロテーゼは、以後の分析に用いる前に、超音波で10分間、1回の処理を施して洗浄することにより、余分の反応物を除去した。前記超音波を用いる洗浄方法は、一般に用いられる洗浄方法に比べて多少強力な方法であるが、生体内移植後の動きなどによるコーティングの剥離などを模倣するために、このように多少強力な洗浄方法を用いた。
プロテーゼのコーティングした表面性質を分析するために、プロテーゼの表面と同じ化学的構造であるポリジメチルシロキサン(Polydimethylsiloxane; PDMS)で構成されたSylgard(登録商標) 184シリコンディスク(Dow Corning)を硬化させて作製し、その後直径15mmの円形ディスクにして準備し、実施例1と同様にコーティングした。
架橋したPMPCでコーティングしていないディスク(Noncoated)、光を用いて架橋したPMPCでコーティングしたディスク(UV coated)、及び熱を用いて架橋したPMPCでコーティングしたディスク(Heat coated)の表面の親水性変化を水接触角の測定により確認した。
光を用いて架橋したPMPCでコーティングしたディスク(UV coated)、及び熱を用いて架橋したPMPCでコーティングしたディスク(Heat coated)の3次元的な形状によるコーティング効果の違いを水接触角により確認した。
実施例2-1により確認された水接触角の変化、すなわち親水性の程度の変化がホスホリルコリン基の導入によるものであることを確認するために、XPSを用いた表面元素分析を行った。その結果を図3に示す。
架橋したPMPCでコーティングしていないプロテーゼ(Noncoated)、光を用いて架橋したPMPCでコーティングしたプロテーゼ(UV coated)、及び熱を用いて架橋したPMPCでコーティングしたプロテーゼ(Heat coated)の機械的強度の変化を万能材料試験機により確認した。5kNのロードセル(load cell)を用いて、5mm/minの速度でプロテーゼを上から押したときに発生する荷重を測定した。
架橋したPMPCでコーティングしていないディスク(Noncoated)、光を用いて架橋したPMPCでコーティングしたディスク(UV coated)、及び熱を用いて架橋したPMPCでコーティングしたディスク(Heat coated)の表面のタンパク質吸着防止特性をBCAアッセイにより確認した。前記タンパク質としては、BSA(bovine serum albumin)とBPF(bovine plasma fibrinogen)を用いた。コーティングしていないディスク、光を用いてコーティングしたディスク、及び熱を用いてコーティングしたディスクをそれぞれ4.5mg/mlの濃度のBSA又は0.3mg/mlの濃度のBPFと37℃で1時間インキュベートし、その後各条件でPDMSを清浄なDPBS緩衝液により37℃、200rpmで1分間ずつ2回処理して軽く洗浄した。次に、表面に吸着したタンパク質の量を定量するために、BCAアッセイを行った。具体的には、Thermo Scientific社のBCAキットを用いて、キットに含まれる試料A、試料B及び試料Cをそれぞれ25:24:1の体積比で混合してアッセイ溶液を作製した。前述したように洗浄した各PDMSを新鮮なDPBS緩衝液に浸漬し、緩衝液と同量のアッセイ溶液を添加して60℃で1時間インキュベートし、その後570nmで吸光度を測定することにより、表面に吸着したタンパク質の量を測定した。その結果を図6及び図7に示す。
被膜拘縮(capsular contracture)が線維芽細胞の過剰増殖及びそれによるコラーゲン形成などと密接に関係していることに着目し、架橋したPMPCでコーティングしていないディスク(Noncoated)、光を用いて架橋したPMPCでコーティングしたディスク(UV coated)、及び熱を用いて架橋したPMPCでコーティングしたディスク(Heat coated)に線維芽細胞NIH3T3細胞を培養して細胞吸着の程度を確認した。前記NIH3T3細胞は、5%の二酸化炭素を含有し、37℃で10%のFBSを含むDMEM培地に培養した。それぞれに直径1.5cmのPDMS当たり30,000個の細胞を分注し、5%の二酸化炭素を含有させて37℃で40時間培養し、その後新鮮なDMEM培地(10%のFBSを含有)で軽く洗浄してCCKアッセイを行った。CCK溶液は同仁堂社の製品を用いた。洗浄した各PDMSを新鮮なDMEM培地(10%のFBSを含有)に浸漬して培地体積の10%に相当する量のCCK溶液を添加し、その後5%の二酸化炭素を含有させて37℃で4時間インキュベートし、450nmで吸光度を測定することにより、表面に吸着した細胞の相対的な量を測定した。その結果を図8に示す。
架橋したPMPCでコーティングしていないプロテーゼ(Noncoated)と、熱を用いて架橋したPMPCでコーティングしたプロテーゼ(Heat coated)をグループ毎にそれぞれ4個ずつ準備し、エタノール消毒後に豚の皮筋層(panniculus carnosus muscle)の下方に挿入した。8週間(2カ月)後に、挿入したプロテーゼの周囲に形成された被膜を採取し、組織病理学的観察を行った。
生体内の被膜拘縮抑制活性を確認するために、挿入したプロテーゼの上下の被膜を採取し、次いでH&E(hematoxylin and eosin stain)染色を施して顕微鏡で被膜の厚さを観察した。被膜の厚さは、各被膜を3部分に分けて1部分当たり3回ずつ測定した。その結果を図9に示す。
細胞充実度(cellularity)は、プロテーゼの周辺組織を採取し、その後H&E染色を施して、リンパ球(lymphocytes)、形質細胞(plasma cells)、マクロファージ(macrophages)、巨細胞(giant cells)などの各炎症関連細胞のスコア(score)の合計で測定し、血管分布(vascularity)は、血管新生指標であるCD34にIHC(immunohistochemistry)染色を施して血管の数を測定した。その結果を図10に示す。
免疫組織化学(immunohistochemistry; IHC)染色を施して、炎症関連サイトカインであるTGF-β(transforming growth factor beta)、骨髄球系細胞の顆粒に存在する酵素であるMPO(myeloperoxidase)、及び筋線維芽細胞の標識であるα-SMA(alpha smooth muscle actin)の発現の程度を測定した。その結果を図11に示す。
実施例6と同様に、架橋したPMPCでコーティングしていないプロテーゼ(Noncoated)と、熱を用いて架橋したPMPCでコーティングしたプロテーゼ(Heat coated)をグループ毎にそれぞれ4個ずつ準備し、エタノール消毒後に豚の皮筋層(panniculus carnosus muscle)の下方に挿入した。24週間(6カ月)後に、挿入したプロテーゼの周囲に形成された被膜を採取し、組織病理学的観察を行った。
生体内の被膜拘縮抑制活性を確認するために、挿入したプロテーゼの上下の被膜を採取し、次いでH&E(hematoxylin and eosin stain)染色を施して顕微鏡で被膜の厚さを観察した。被膜の厚さは、各被膜を3部分に分けて1部分当たり3回ずつ測定した。その結果を図12に示す。
細胞充実度(cellularity)は、プロテーゼの周辺組織を採取し、その後H&E染色を施して、リンパ球(lymphocytes)、形質細胞(plasma cells)、マクロファージ(macrophages)、巨細胞(giant cells)などの各炎症関連細胞のスコア(score)の合計で測定し、血管分布(vascularity)は、血管新生指標であるCD34にIHC染色を施して血管の数を測定した。その結果を図13に示す。
IHC染色を施して、炎症関連サイトカインであるTGF-β(transforming growth factor beta)、骨髄球系細胞の顆粒に存在する酵素であるMPO(myeloperoxidase)、及び筋線維芽細胞の標識であるα-SMA(alpha smooth muscle actin)の発現の程度を測定した。その結果を図14に示す。
Claims (9)
- 熱開始剤をプロテーゼに吸着させるステップと、
熱開始剤を吸着させたプロテーゼに、アクリレート基を有する両性イオン単量体及び架橋剤を含む溶液を加え、その後加熱するステップとを含む、プロテーゼのコーティング法。 - 前記熱開始剤は、過酸化ベンゾイル(benzoyl peroxide; BPO)、過酸化ラウロイル(lauroyl peroxide)、tert-ブチルヒドロペルオキシド(tert-butyl hydroperoxide)、クメンヒドロペルオキシド(cumene hydroperoxide; CHP)、ジ-tert-ブチルペルオキシド(di-tert-butyl peroxide; DTBP)、過酸化ジクミル(dicumyl peroxide; DCP)、アゾビスイソブチロニトリル(azobisisobutyronitrile; AIBN)、ペルオキソ二硫酸カリウム(potassium persulfate; KPS)、ペルオキソ二硫酸アンモニウム(ammonium persulfate; APS)、VA-044、V-50、VA-057、VA-061、VA-086、V-501、V-70、V-65、V-601、V-59、V-40及びVAm-110からなる群から選択されるいずれかである、請求項1に記載のプロテーゼのコーティング法。
- 前記熱開始剤は、アクリレート基を有する両性イオン単量体に対して10~50mol%の量で用いる、請求項1に記載のプロテーゼのコーティング法。
- 前記プロテーゼは、ポリジメチルシロキサン系(polydimethylsiloxane; PDMS)、ヒドロキシアパタイト(hydroxylapatite; HA)、ポリ乳酸系(polylactic acid; PLA)、ポリグリコール酸系(polyglycolic acid; PGA)、ポリテトラフルオロエチレン系(polytetrafluoroethylene; PTFE)、ポリエチレンテレフタレート系(polyethylene terephthalate; PET)、ポリプロピレン系(polypropylene)、ポリアミド系(polyamide)、ポリアセタール系(polyacetal)、ポリエステル系(polyester)及びポリメチルメタクリレート系(polymethyl metacrylate)からなる群から選択されるいずれかの表面材質を有するものである、請求項1に記載のプロテーゼのコーティング法。
- 前記アクリレートを有する両性イオン単量体は、ホスホリルコリン(phosphorylcholine; PC)、スルホベタイン(sulfobetine; SB)及びカルボキシベタイン(carboxybetaine; CB)からなる群から選択される少なくとも1つを含むアクリレート系単量体である、請求項1に記載のプロテーゼのコーティング法。
- 前記アクリレート基を有する両性イオン単量体は、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(methacryloyloxyethyl phosphorylcohline; MPC)、アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(acryloyloxyethyl phosphorylcholine; APC)、スルホベタインメタクリレート(sulfobetaine methacrylate)、スルホベタインアクリレート(sulfobetaine acrylate)、カルボキシベタインメタクリレート(carboxybetaine methacrylate)及びカルボキシベタインアクリレート(carboxybetaine acrylate)からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項1に記載のプロテーゼのコーティング法。
- 前記架橋剤は、ジペンタエリスリトールペンタアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、アリルメタクリレート、アセトアセトキシエチルメタクリレート、イソシアナトエチルメタクリレート、イソブチルメタクリレート、ノルマルブチルメタクリレート及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかである、請求項1に記載のプロテーゼのコーティング法。
- 前記加熱は、60~100℃で行うものである、請求項1に記載のプロテーゼのコーティング法。
- 前記加熱は、1~18時間行うものである、請求項1に記載のプロテーゼのコーティング法。
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