JP2022533589A - Ｃｒｉｓｐｒタンパク質をコードする合成自己複製ｒｎａベクターおよびその使用 - Google Patents

Abstract

ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする合成された非感染性自己複製ＲＮＡベクターを提供する。各自己複製ＲＮＡベクターは、アルファウイルス由来の複数の非構造複製複合体タンパク質をコードする配列、およびＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を含む。合成自己複製ＲＮＡベクターを少なくとも１つの対応するガイドＲＮＡとともに細胞に遺伝子導入するゲノム編集のための方法もまた、提供される。

Description

関連出願
本願は、２０１９年５月１３日が出願日である米国仮特許出願第６２／８４７，０３２号の優先権の利益を主張し、その内容は全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年５月１３日に作成されたＡＳＣＩＩコピーはP19-084_WO-PCT_SL.txtという名前であり、サイズは７７，５２４バイトである。

分野
本開示は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする合成自己複製ＲＮＡベクターに関し、合成自己複製ＲＮＡベクターは、ゲノム編集方法のために対応するガイドＲＮＡとともに細胞に遺伝子導入され得る。

ゲノム編集ツールとしてのクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの最近の発展により、真核生物のゲノム改変のための部位特異的エンドヌクレアーゼの設計がかつてないほどに容易かつ単純になった。ＣＲＩＳＰＲを真核細胞に送達するために、多くの送達系が開発されている。しかし、レンチウイルス、レトロウイルスおよびプラスミドの系は、ＣＲＩＳＰＲコード配列が宿主細胞ゲノムに組み込まれるリスクを有する。したがって、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の頑強な発現を与え、ゲノム組込みのリスクを回避するＣＲＩＳＰＲ遺伝子送達系が必要とされている。

本開示の様々な態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡベクターが提供される。

本開示のある態様は、アルファウイルス由来の複数の非構造複製複合体タンパク質をコードする配列、およびＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を含む自己複製ＲＮＡベクターを提供する。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型Ｃａｓ１２タンパク質、ＶＩ型Ｃａｓ１３タンパク質、ＣａｓＸタンパク質またはＣａｓＹタンパク質であり得る。ある実施態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ Ｃａｓ９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ１２、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｃａｓ１２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｃａｓ１３ａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃａｓ１３ａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ． Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３、またはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃａｓ１３ｄであり得る。特定の反復において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である。

いくつかの状況において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が触媒活性の変化、標的部位特異性の改善および／またはオフターゲット効果の低下を有するように、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換を含み得る。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は二本鎖切断活性を有し得、二本鎖配列の一方の鎖を切断し得、またはあらゆる切断活性を持たない場合がある。

ＣＲＩＳＰＲタンパク質はまた、少なくとも１つの異種ドメインに連結してい得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナルに連結してい得る。ＣＲＩＳＰＲタンパク質はまた、少なくとも１つの蛍光タンパク質、少なくとも１つのクロマチン調節モチーフ、少なくとも１つのエピジェネティック修飾ドメイン、少なくとも１つの転写制御ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合ドメイン、またはそれらの組合せに連結してい得る。

アルファウイルス由来の複数の非構造複製複合体タンパク質をコードする自己複製ＲＮＡベクターの配列は、アウラウイルス、Ｂａｂａｎｋｉウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、バギークリークウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレイズ(Everglades)ウイルス、フォートモーガン(Fort Morgan)ウイルス、ゲタウイルス、ハイランドＪ(Highlands J)ウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、マヤロウイルス、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇウイルス、ムカンボウイルス、Ｎｄｕｍｕウイルス、ピクスナウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、Ｓａｇｉｙａｍａウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス、シンドビスウイルス、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、またはワタロアウイルスに由来し得る。これらの様々な配列およびその誘導体は公知であり、科学文献において見出され得、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施態様において、複数の非構造複製複合体タンパク質をコードする配列は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来する。例えば、Yoshioka et al. (Cell Stem Cell 13, 246-254, August 1, 2013)および／またはPetrakova et al. (J. Virology; vol. 72, no. 12, June 2005, p. 7597-7608)を参照、これらはそれぞれ参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。自己複製ＲＮＡベクターは、選択可能なマーカーをコードする配列および／またはインターフェロン応答阻害剤をコードする配列をさらに含み得る。

本開示の別の態様は、上述の自己複製ＲＮＡベクター、および自己複製ＲＮＡベクターによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計された少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む複合体を提供する。

本開示はまた、本明細書に開示されている自己複製ＲＮＡベクターを含む真核細胞または細胞株を提供する。

本開示のさらなる態様は、自己複製ＲＮＡベクターをコードするプラスミドベクターを包含する。

本開示のさらなる別の態様は、標的ゲノム編集のための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示されている自己複製ＲＮＡベクターのうち１つ、および自己複製ＲＮＡベクターによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計された少なくとも１つのガイドＲＮＡを真核細胞に導入することを含む。

本開示の他の態様および反復は、以下でより詳細に説明される。

本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図を含む。カラーの図を含むこの特許または特許出願の公報の写しは、請求および必要な手数料の納付により官庁によって提供される。

図１Ａは、Ｓｉｍｐｌｉｃｏｎ^（商標）クローニングベクターおよび本明細書に記載の各ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡの構造を示す模式図を示す。

図１Ｂは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動を示す。レーン１：ＲＮＡマーカー（２００～６０００塩基）；レーン２：ｅＳｐＣａｓ９ ＲＮＡ；レーン３：ｅＳｐ－Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ；レーン４：Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ。

図１Ｃは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９を遺伝子導入した細胞におけるＧＦＰ（ＴａｇＧＦＰ２）発現の画像を示す。１日目にＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡおよびＢ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡをＨＦＦに共導入し、２日目にＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡により撮影した。

図１Ｄは、Ｃａｓ９タンパク質のウエスタンブロットを示す。レーン１：対照；レーン２：ｅＳｐＣａｓ９；レーン３および４：ｅＳｐＣａｓ９－ＧＦＰ２；レーン５および６：Ｃａｓ９－ＧＦＰ２。

図２Ａは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２、およびＫ－Ｒａｓを標的とした１種または２種の合成ｇＲＮＡをＨＦＦに同時または連続的に共導入した後の２日目のＧＦＰ発現の画像を示す。

図２Ｂは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡおよびｇＲＮＡの共導入または連続的な遺伝子導入後のゲノム編集の効率を示す。共導入（同時）のために３日目、連続的な遺伝子導入のために４日目、および６日目（ピューロマイシン選択の完了後）に細胞を回収した。インデルをＧｕｉｄｅ－ｉＴ変異検出キットを用いて検出した。＋／－はリゾルバーゼ処理を示す。切断効率（％）をゲルの画像の下に示す。

図２Ｃは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２および１種のＫ－Ｒａｓ ｇＲＮＡ（２５ｎＭ）の連続的な遺伝子導入後の２日目のヒトｉＰＳＣ細胞株のＧＦＰ発現の画像を示す。

図２Ｄは、図２Ｃに示したヒトｉＰＳＣにおけるゲノム編集の効率を示す。細胞を５日目（ｇＲＮＡ遺伝子導入の３日後）および７日目（ピューロマイシン選択の完了後）に回収した。インデルをＧｕｉｄｅ－ｉＴ変異検出キットを用いて検出した。＋／－はリゾルバーゼ処理を示す。切断効率（％）をゲルの画像の下に示す。

図３Ａは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９（Ｓ－Ｃａｓ９）およびＢ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡを遺伝子導入し、またはレンチウイルスＣａｓ９（ＬＶ－Ｃａｓ９）を感染させ、次いでそれぞれピューロマイシン（０．８μｇ／ｍＬ）またはブラストサイジン（４μｇ／ｍＬ）で７日間選択したＨＦＦにおけるゲノム編集の効率を示す。７日目に細胞を継代し、９日目に１種のＫ－ＲａｓまたはＥＭＸ－１ ｓｇＲＮＡを遺伝子導入した。１１日目に細胞を回収し、ゲノム編集について解析した。＋／－はリゾルバーゼ処理を示す。％は切断効率を示す。

図３Ｂは、Ｃａｓ９プラスミドおよびＫ－Ｒａｓ ｇＲＮＡプラスミドを共導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２ ＲＮＡ、Ｂ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡおよび１種のＫ－Ｒａｓ－ｇＲＮＡを共導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の４日目のＧＦＰ発現のＧｕａｖａフローサイトメトリー分析を示す。

図３Ｃは、図３Ｂに記載の細胞におけるゲノム編集の効率を示す。＋／－はリゾルバーゼ処理を示す。％は切断効率を示す。

図４Ａは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２を遺伝子導入した後の１ヶ月間のピューロマイシン選択、および１種のＫ－Ｒａｓ ｓｇＲＮＡを共導入した後のゲノム編集によって作製したＨＦＦ細胞におけるＧｕａｖａフローサイトメトリーで分析したＧＦＰ発現を示す。

図４Ｂは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２を遺伝子導入した後の１ヶ月間のピューロマイシン選択、および１種のＥＭＸ－１ ｓｇＲＮＡを共導入した後のゲノム編集によって作製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧｕａｖａフローサイトメトリーで分析したＧＦＰ発現を示す。

図４Ｃは、ＶＥＥ－ｅＳｐＣａｓ９、ＶＥＥ－ｅＳｐＣａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２、またはＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２、および１種のＥＭＸ－１ ｇＲＮＡを連続的に遺伝子導入したＨＦＦにおけるゲノム編集を比較している。５日目に細胞を回収し、ゲノム編集について解析した。

図４Ｄは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２またはＶＥＥ－ｅＳｐＣａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２、Ｂ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡ、および１種のＥＭＸ－１ ｇＲＮＡを連続的に遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるゲノム編集を比較している。４日目に細胞を回収し、ゲノム編集について解析した。

図５Ａは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－ＴａｇＧＦＰ２およびＶＥＥ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－ＴａｇＲＦＰを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、それぞれ１日目および３日目のＧＦＰまたはＲＦＰ発現の画像を示す。

図５Ｂは、１４日目のピューロマイシン選択後のＧＦＰまたはＲＦＰ発現の画像を示す。また、ＧＦＰ発現をＧｕａｖａフローサイトメトリーで解析した。

図５Ｃは、１日目にＶＥＥ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－ＴａｇＧＦＰ２、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－ＴａｇＲＦＰまたはＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２、２日目にＥＭＸ－１ ｓｇＲＮＡ－１、９またはその両方を連続的に遺伝子導入したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるゲノム編集を比較している。５日目に細胞を回収し、ゲノム編集について解析した。

図５Ｄは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－ＴａｇＧＦＰ２、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－ＴａｇＲＦＰまたはＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２を発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株におけるゲノム編集を比較している。各細胞株に、１日目にＥＭＸ－１ ｓｇＲＮＡ－１および／または－９を遺伝子導入した。４日目に細胞を回収し、ゲノム編集について解析した。

図６Ａは、図に示されるプールされたＵ２ＯＳまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣａｓ９の切断によるＲａｂ１１－ＢａｍＨＩオリゴの挿入を示す。Ｕ２ＯＳ細胞またはＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、１日目にＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２またはＶＥＥ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－ＧＦＰ２、２日目にｓｇＲＮＡおよびＲａｂ１１－ＢａｍＨＩオリゴを連続的に遺伝子導入した。５日目に細胞を回収し、ＢａｍＨＩの挿入について解析した。ゲルの画像は、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２（左）またはＶＥＥ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ－ＧＦＰ２（右）の切断部位におけるＲａｂ－１１－ＢａｍＨＩオリゴの挿入によって生じたＢａｍＨＩの消化を示す。

図６Ｂは、単離されたクローンにおけるＣａｓ９の切断部でのＲａｂ１１－ＢａｍＨＩオリゴの挿入を示す。Ｕ２ＯＳまたはヒトｉＰＳＣに、１日目にＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＧＦＰ２、２日目にｓｇＲＮＡおよびＲａｂ１１－ＢａｍＨＩオリゴを連続的に遺伝子導入した。細胞をピューロマイシンによって選択し、クローンを解析のために単離した。ゲルの画像は、ＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２の切断部位におけるＲａｂ－１１－ＢａｍＨＩオリゴの挿入によって生じたＢａｍＨＩの消化を示す。

図６Ｃは、Ｃａｓ９の切断部位におけるＧＦＰ断片の挿入を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、１日目にＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＲＦＰ、２日目にＧＡＰＤＨ位置のｓｇＲＮＡおよびＧＦＰ断片を連続的に遺伝子導入した。５日目にＧＦＰ発現を撮影した。

本開示は、ウイルス構造タンパク質をコードする配列が除去され、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列に置換されたアルファウイルスに基づく合成された非感染性自己複製ＲＮＡベクターを提供する。自己複製ＲＮＡベクターは、５’キャップおよびポリ（Ａ）テールを有する細胞性ｍＲＮＡを模倣した一本鎖ＲＮＡである。特定の実施態様において、自己複製ＲＮＡベクターはＤＮＡ中間体を利用せず、結果としてＣＲＩＳＰＲ配列のゲノム組込みのリスクがない。自己複製ＲＮＡベクターは、複数の細胞世代にわたるＣＲＩＳＰＲタンパク質の頑強な発現を可能にする。対応するガイドＲＮＡの細胞への共導入は、標的ゲノム編集を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ発現のレベルは、希釈および分解のために時間とともに低下する。本明細書において、自己複製ＲＮＡベクターを用いてゲノム編集のためにＣＲＩＳＰＲタンパク質を対応するガイドＲＮＡとともに細胞に導入する方法が提供される。

（Ｉ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするＲＮＡベクター
本開示のある態様は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする合成自己複製ＲＮＡベクターを提供する。自己複製ＲＮＡベクターは、複数の細胞世代にわたるＲＮＡベクターの複製および異種タンパク質配列（例えば少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質）の翻訳を確実にする配列を含む。自己複製ＲＮＡベクターは、複数の複製複合体タンパク質をコードするが、ウイルス構造遺伝子が除去され、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列に置換されている改変されたアルファウイルスに基づく。したがって、細胞への侵入により、ＲＮＡはウイルス複製複合体タンパク質およびＣＲＩＳＰＲタンパク質の翻訳のための鋳型として機能する。ウイルス複製複合体タンパク質は複製複合体を形成し、細胞の細胞質中でのＲＮＡベクターのさらなる複製を可能にする。複製されたＲＮＡは細胞性ＤＮＡと再結合できないため、ＣＲＩＳＰＲ配列が細胞のゲノムに組み込まれるリスクはない。

（ａ）合成自己複製ＲＮＡ
合成自己複製ＲＮＡ（またはレプリコン）は、コードされたタンパク質の翻訳およびＲＮＡベクターの複製に必要なすべての配列要素を含む。特にレプリコンは、非構造レプリカーゼ遺伝子が維持され、（感染粒子の作成に必要な）構造遺伝子が除去されている改変されたアルファウイルスに基づく。様々な実施態様において、改変されたアルファウイルスは、アウラウイルス、Ｂａｂａｎｋｉウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、バギークリークウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレイズウイルス、フォートモーガンウイルス、ゲタウイルス、ハイランドＪウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、マヤロウイルス、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇウイルス、ムカンボウイルス、Ｎｄｕｍｕウイルス、ピクスナウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、Ｓａｇｉｙａｍａウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス、シンドビスウイルス、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、またはワタロアウイルスに由来し得る。これらの様々な配列およびその誘導体は公知であり、科学文献において見出され得、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施態様において、合成自己複製ＲＮＡは、構造遺伝子が除去されている改変されたベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスに基づく。例えば、Yoshioka et al. (Cell Stem Cell 13, 246-254, August 1, 2013)および／またはPetrakova et al. (J. Virology; vol. 72, no. 12, June 2005, p. 7597-7608)を参照、これらはそれぞれ参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

自己複製ＲＮＡは、複数の非構造複製複合体タンパク質をコードする配列を含む。特定の実施態様において、合成自己複製ＲＮＡは、４つの非構造複製複合体タンパク質（すなわち、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードし得る。非構造複製複合体タンパク質は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされ得る。

自己複製ＲＮＡベクターは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列をさらに含み、これは以下のセクション（Ｉ）（ｂ）に詳述されている。

一般に、自己複製ＲＮＡベクターは、５’キャップ、５’末端の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびに３’末端の３’ＵＴＲおよびポリＡテールを含む。自己複製ＲＮＡベクターは一般に、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列の上流にプロモーターを含む。上流のプロモーターは、２６Ｓサブゲノムプロモーターであり得る。

いくつかの実施態様において、自己複製ＲＮＡベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカーをコードする配列および／またはインターフェロン応答の阻害剤をコードする配列をさらに含み得る。適切な選択可能なマーカーの限定されない例には、ピューロマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ(hydromycin B)、およびブラストサイジンＳ(blastidinin S)などが含まれる。適切なインターフェロン応答阻害剤の例には、限定されないが、ワクシニアウイルスタンパク質Ｅ３Ｌ、ワクシニアウイルスタンパク質Ｂ１８Ｒ、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ１、またはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス核タンパク質が含まれる。

様々なタンパク質コード配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチドをコードする配列によって分離され得る。適切な２Ａペプチドの限定されない例には、ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２ＡペプチドまたはＴ２Ａ、口蹄疫ウイルス２ＡペプチドまたはＦ２Ａ、ウマ鼻炎Ａウイルス２ＡペプチドまたはＥ２Ａ、およびブタテッショウウイルス－１ ２ＡペプチドまたはＰ２Ａが含まれる。

特定の実施態様において、自己複製ＲＮＡベクターは、改変されたベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスに基づき得、５’から３’までに、５’キャップ、５’ＵＴＲ、ＶＥＥ由来の４つの非構造レプリカーゼをコードする配列、プロモーター、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、任意でＩＲＥＳ、任意でＥ３Ｌタンパク質をコードする配列、任意でＩＲＥＳ、任意で選択可能なマーカーをコードする配列、アルファウイルス３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含み得る（図１Ａ参照）。

（ｂ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質
自己複製ＲＮＡベクターはまた、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を含む。侵入する核酸に対する適応免疫を与えるＣＲＩＳＰＲタンパク質は、様々な細菌および古細菌中に存在する。様々な実施態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型Ｃａｓ１２（以前はＣｐｆ１と呼ばれていた）タンパク質、ＶＩ型Ｃａｓ１３（以前はＣ２ｃｄと呼ばれていた）タンパク質、ＣａｓＸタンパク質またはＣａｓＹタンパク質であり得る。

ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｐ．、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐｐ．、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｓｐｐ．、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｓｐｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｓｐｐ．、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｓｐｐ．、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐｐ．、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｓｐｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐｐ．、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｓｐｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓｐｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐｐ．、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｓｐｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｓｐｐ．、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐｐ．、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｓｐｐ．、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｓｐｐ．、またはＷｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｐｐ由来であり得る。これらの様々なＣＲＩＳＰＲタンパク質配列およびその誘導体は公知であり、科学文献において見出され得、これは参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ Ｃａｓ９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ１２、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｃａｓ１２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２ａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉｉ Ｃａｓ１３ａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃａｓ１３ａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ． Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃａｓ１３ｄ、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣａｓＸ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ ＣａｓＸ、またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ ＣａｓＹであり得る。特定の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である。

ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、野生型または天然に存在するタンパク質であり得る。野生型ＣＲＩＳＰＲタンパク質は一般に２つのヌクレアーゼドメインを含み（例えばＣａｓ９タンパク質はＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む）、これらはそれぞれ二本鎖配列の一方の鎖を切断する。ＣＲＩＳＰＲタンパク質はまた、ガイドＲＮＡ（例えばＲＥＣ１、ＲＥＣ２）またはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖（例えばＲＥＣ３）と相互作用するドメイン、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と相互作用するドメイン（すなわちＰＡＭ相互作用ドメイン）を含む。

あるいは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、活性、特異性および／または安定性が変化するように改変または設計され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１以上の改変／変異（すなわち、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失および／または挿入）を含むように設計され得る。改変されたＣＲＩＳＰＲタンパク質は、触媒（ヌクレアーゼ）活性の変化、標的部位特異性の改善、オフターゲット効果の低下、ＰＡＭ特異性の変化、および安定性の上昇などを有し得る。

様々な実施態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼ（すなわち、二本鎖ヌクレオチド配列の両方の鎖を切断するか、または一本鎖ヌクレオチド配列を切断する）であり得る。他の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、二本鎖配列の一方の鎖を切断するニッカーゼであり得る。ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のヌクレアーゼドメインの１つの不活性化により設計され得る。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えばｎＣａｓ９）を生成するために、Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣドメインがＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａおよび／またはＤ９８６Ａなどの変異によって不活性化され得、またはＣａｓ９タンパク質のＨＮＨドメインがＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａおよび／またはＮ８６３Ａなどの変異によって不活性化され得る（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、ＳｐｙＣａｓ９のナンバリングシステムを参照）。他のＣＲＩＳＰＲタンパク質における同等の変異は、ニッカーゼを生成し得る（例えばｎＣａｓ１２）。両方のヌクレアーゼドメインの不活性化は、切断活性を持たないＣＲＩＳＰＲタンパク質（すなわち触媒能のないタンパク質またはヌクレアーゼ不活性型タンパク質、例えばｄＣａｓ９およびｄＣａｓ１２など）を生成する。

ＣＲＩＳＰＲタンパク質はまた、標的特異性の改善、忠実度の改善、ＰＡＭ特異性の変化、オフターゲット効果の低下および／または安定性の上昇を有するように１以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入によって設計され得る。標的特異性を改善し、忠実度を改善し、かつ／またはオフターゲット効果を低下させる１以上の変異の限定されない例には、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａおよび／またはＤ１１３５Ｅが含まれる（ＳｐｙＣａｓ９のナンバリングシステムを参照）。

ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするＲＮＡベクター配列は、目的の真核細胞中でのタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化され得る。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとして、または商業的供給源から利用できる。特定の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、ヒト細胞における効率的な発現のためにコドン最適化され得る。

任意の異種ドメイン
いくつかの実施態様において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、少なくとも１つの異種ドメインを含むように設計され得る（すなわち、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１以上の異種ドメインに連結され得る）。異種ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、細胞透過性ドメイン、マーカードメイン（例えば蛍光タンパク質）、クロマチン調節モチーフ、エピジェネティック修飾ドメイン（例えば、デアミナーゼドメインおよびヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインなど）、転写制御ドメイン、ＲＮＡアプタマー結合ドメイン、または非ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメインであり得る。２以上の異種ドメインがＣＲＩＳＰＲタンパク質と融合している場合、２以上の異種ドメインは同じであってもよく、または異なっていてもよい。１以上の異種ドメインは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質にそのＮ末端、Ｃ末端、内部位置またはそれらの組合せにおいて連結され得る。連結は化学結合を介して直接的であり得、または１以上のリンカーを介して間接的であり得る。適切なリンカーは当分野で公知である。ある実施態様において、連結は２Ａペプチド配列を介してなされ得る。

いくつかの実施態様において、１以上の異種ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。核局在化シグナルの限定されない例には、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号６）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号７）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号８）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号９）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１０）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１１）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１２）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１３）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１４）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１５）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１６）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１７）、およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１８）が含まれる。

他の実施態様において、１以上の異種ドメインは、細胞透過性ドメインであり得る。適切な細胞透過性ドメインの例には、限定されないが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２２）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号２４）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号２５）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号２６）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２７）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２８）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号２９）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３０）が含まれる。

代替の実施態様において、１以上の異種ドメインはマーカードメインであり得る。マーカードメインは蛍光タンパク質および精製タグまたはエピトープタグを含む。適切な蛍光タンパク質には限定されないが、緑色蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えばＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えばｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）およびオレンジ蛍光タンパク質（例えばｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）またはこれらの組合せが含まれる。蛍光タンパク質は、１以上の蛍光タンパク質の縦列反復（例えばＳｕｎｔａｇ）を含み得る。適切な精製タグまたはエピトープタグの限定されない例には、６ｘＨｉｓ、ＦＬＡＧ^{（登録商標）}、ＨＡ、ＧＳＴ、ＭｙｃおよびＳＡＭなどが含まれる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の検出または濃縮を容易にする異種融合物の限定されない例には、ストレプトアビジン（Kipriyanov et al., Human Antibodies, 1995, 6(3):93-101.）、アビジン（Airenne et al., Biomolecular Engineering, 1999, 16(1-4):87-92）、単量体型のアビジン（Laitinen et al., Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(6):4010-4014）、組換え体産生時にビオチン化を促進するペプチドタグ（Cull et al., Methods in Enzymology, 2000, 326:430-440）が含まれる。

さらなる他の実施態様において、１以上の異種ドメインは、クロマチン調節モチーフ（ＣＭＭ）であり得る。ＣＭＭの限定されない例には、高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質（例えば、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＨＭＧＢ３、ＨＭＧＮ１、ＨＭＧＮ２、ＨＭＧＮ３ａ、ＨＭＧＮ３ｂ、ＨＭＧＮ４およびＨＭＧＮ５タンパク質）に由来するヌクレオソーム相互作用ペプチド、ヒストンＨ１バリアント（例えば、ヒストンＨ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４、Ｈ１．５、Ｈ１．６、Ｈ１．７、Ｈ１．８、Ｈ１．９およびＨ．１．１０）の中央球状ドメイン(central globular domain)、またはクロマチンリモデリング複合体（例えば、米国特許出願第１６／０３１，８１９号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、ＳＷＩ／ＳＮＦ（SWItch/Sucrose Non-Fermentable）、ＩＳＷＩ（Imitation SWItch）、ＣＨＤ（Chromodomain-Helicase-DNA binding）、Ｍｉ－２／ＮｕＲＤ（Nucleosome Remodeling and Deacetylase）、ＩＮＯ８０、ＳＷＲ１、およびＲＳＣ複合体）のＤＮＡ結合ドメインが含まれる。適切なＣＭＭはまた、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼまたはウイルスタンパク質に由来し得る。ＣＭＭの供給源は様々であり得る。ＣＭＭは、ヒト、動物（すなわち脊椎動物および無脊椎動物）、植物、藻類または酵母由来であり得る。

さらなる他の実施態様において、１以上の異種ドメインは、エピジェネティック修飾ドメインであり得る。適切なエピジェネティック修飾ドメインの限定されない例には、ＤＮＡ脱アミノ化（例えば、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えばシトシンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ＤＮＡアミノ化、ＤＮＡ酸化活性、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性（例えば、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００由来のＨＡＴドメイン）、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性、ヒストンキナーゼ活性、ヒストンホスファターゼ活性、ヒストンユビキチンリガーゼ活性、ヒストン脱ユビキチン化活性、ヒストンアデニル化活性、ヒストン脱アデニル化活性、ヒストンＳＵＭＯ化活性、ヒストン脱ＳＵＭＯ化活性、ヒストンリボシル化活性、ヒストン脱リボシル化(deribosylation)活性、ヒストンミリストイル化活性、ヒストン脱ミリストイル化(demyristoylation)活性、ヒストンシトルリン化活性、ヒストンアルキル化活性、ヒストン脱アルキル化活性、またはヒストン酸化活性を有するエピジェネティック修飾ドメインが含まれる。特定の実施態様において、エピジェネティック修飾ドメインは、シチジンデアミナーゼ活性、アデノシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み得る。

他の実施態様において、１以上の異種ドメインは、転写制御ドメイン（すなわち、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメイン）であり得る。適切な転写活性化ドメインには、限定されないが、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４（すなわち、ＶＰ１６の４つのタンデムコピー）、ＶＰ１６０（すなわち、ＶＰ１６の１０個のタンデムコピー）、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン（ｐ６５）、エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）ドメイン、ＶＰＲ（すなわち、ＶＰ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）、ｐ３００依存性転写活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、Ｓｍａｄ４活性化ドメイン（ＳＡＤ）、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメイン、またはこれらの組合せが含まれる。適切な転写抑制ドメインの限定されない例には、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制ドメイン、Ｍｘｉ抑制ドメイン、誘導性ｃＡＭＰ初期抑制因子(inducible cAMP early repressor)（ＩＣＥＲ）ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチ抑制ドメイン、Ｓｐ１様抑制因子、Ｅ（ｓｐｌ）抑制因子、ＩκＢ抑制因子、Ｓｉｎ３抑制因子、メチル化ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）抑制因子、またはこれらの組合せが含まれる。転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインは、Ｃａｓ９タンパク質に遺伝的に融合され得るか、または非共有結合性のタンパク質－タンパク質、タンパク質－ＲＮＡ、またはタンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して結合され得る。

さらなる実施態様において、１以上の異種ドメインは、ＲＮＡアプタマー結合ドメインであり得る（Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583-588; Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339-50）。適切なＲＮＡアプタマータンパク質ドメインの例には、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７バクテリオファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、ＭｕバクテリオファージＣｏｍタンパク質、ラムダバクテリオファージＮ２２タンパク質、ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）、脆弱Ｘ精神遅滞症候群関連タンパク質１（ＦＸＲ１）、バクテリオファージ（ＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ－β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、およびＶＫなど）に由来するタンパク質、それらの断片、またはそれらの誘導体が含まれる。

さらなる他の実施態様において、１以上の異種ドメインは非ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメインであり得る。適切なヌクレアーゼドメインは、あらゆるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから取得され得る。ヌクレアーゼドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの限定されない例は、限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼドメインはＩＩ－Ｓ型制限エンドヌクレアーゼに由来し得る。ＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼは通常、認識／結合部位から数塩基対離れた部位でＤＮＡを切断し、そのようなものとして、分離可能な結合および切断ドメインを有する。これらの酵素は一般に、一時的に会合して二量体を形成し、ＤＮＡの各鎖をねじれた位置で切断する単量体である。適切なＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼの限定されない例には、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩおよびＳａｐＩが含まれる。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であり得る。ＩＩ－Ｓ型ヌクレアーゼドメインは２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量体化を促進するように改変され得る。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは特定のアミノ酸残基を変異させることによって改変され得る。限定されない例として、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基が改変のための標的である。特定の実施態様において、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌおよび／またはＮ４９６Ｄ変異を含む第１のＦｏｋＩハーフドメイン、ならびにＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋおよび／またはＨ５３７Ｒ変異を含む第２のＦｏｋＩハーフドメインを含み得る。

（ＩＩ）自己複製ＲＮＡベクターおよびガイドＲＮＡを含む複合体
本開示の別の態様は、セクション（Ｉ）に上述されている自己複製ＲＮＡベクターのいずれかおよび少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む複合体を包含し、ここでガイドＲＮＡは自己複製ＲＮＡベクターによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計される。

ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲタンパク質および目的の核酸における標的配列と相互作用し、ＣＲＩＳＰＲタンパク質を標的配列に誘導する。標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接していることを除いて配列の制限を有しない。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、種々のＰＡＭ配列を認識し得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列には、５’－ＮＧＧ、５’－ＮＧＧＮＧ、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ、および５－ＮＮＮＮＲＹＡＣが含まれ、Ｃａｓ１２タンパク質のＰＡＭ配列には、５’－ＴＴＮおよび５’－ＴＴＴＶが含まれ、ここでＮは任意のヌクレオチドとして定義され、ＲはＧまたはＡのいずれかとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義され、ＹはＣまたはＴのいずれかとして定義され、ＶはＡ、ＣまたはＧとして定義される。一般に、Ｃａｓ９ ＰＡＭは標的配列の３’に位置し、Ｃａｓ１２ ＰＡＭは標的配列の５’に位置する。

ガイドＲＮＡは、特定のＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計される。一般に、ガイドＲＮＡは、（ｉ）標的配列とハイブリダイズするガイド配列を５’末端に含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用するトランス作用ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。各ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡガイド配列は異なっている（すなわち配列特異的である）。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、特定のＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計されたガイドＲＮＡにおいて一般に同一である。

ｃｒＲＮＡガイド配列は、目的の配列における標的配列（すなわちプロトスペーサー）とハイブリダイズするように設計される。一般に、ｃｒＲＮＡと標的配列との間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である。特定の実施態様において、相補性は完全（すなわち１００％）である。様々な実施態様において、ｃｒＲＮＡガイド配列の長さは、約１５ヌクレオチド～約２５ヌクレオチドの範囲であり得る。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり得る。特定の実施態様において、ｃｒＲＮＡは、約１９、２０または２１ヌクレオチド長である。ある実施態様において、ｃｒＲＮＡガイド配列は、２０ヌクレオチドの長さを有する。

ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用する少なくとも１つのステムループ構造を形成する反復配列、および一般に一本鎖のままである３’配列を含む。各ループおよびステムの長さは様々であり得る。例えば、ループは約３～約１０ヌクレオチド長の範囲であり得、ステムは約６～約２０塩基対長の範囲であり得る。ステムは、１～約１０ヌクレオチドの１以上のバルジを含み得る。一本鎖の３’領域の長さは様々であり得る。ガイドＲＮＡにおけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列は一般に、野生型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの配列に基づく。野生型配列は、二次構造の形成を促進すること、二次構造の安定性を上昇させること、および真核細胞における発現を促進することなどのために改変され得る。例えば、１以上のヌクレオチドの変更がガイドＲＮＡコード配列に導入され得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約５０ヌクレオチド～約３００ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。様々な実施態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、約５０～約９０ヌクレオチド、約９０～約１１０ヌクレオチド、約１１０～約１３０ヌクレオチド、約１３０～約１５０ヌクレオチド、約１５０～約１７０ヌクレオチド、約１７０～約２００ヌクレオチド、約２００～約２５０ヌクレオチド、または約２５０～約３００ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。

いくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは単一分子（例えば、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または１種のｓｇＲＮＡ）であり得、ｃｒＲＮＡ配列はｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結されている。いくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは、２つの別個の分子（例えば２種のｇＲＮＡ）であり得る。第１の分子は第２の分子の５’末端と塩基対形成できる３’配列（約６～約２０ヌクレオチドを含む）を含むｃｒＲＮＡを含み、第２の分子は第１の分子の３’末端と塩基対形成できる５’配列（約６～約２０ヌクレオチドを含む）を含むｔｒａｃｒＲＮＡを含む。

いくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１以上のアプタマー配列を含むように改変され得る（Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583-588; Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339-50）。適切なアプタマー配列には、ＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ、ＳＬＢＰ、ＦＸＲ１、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ－β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、ＶＫ、それらの断片、またはそれらの誘導体から選択されるアプタマータンパク質に結合するアプタマー配列が含まれる。当業者は、アプタマー配列の長さが様々であり得ることを認識している。

他の実施態様において、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含み得る。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えばＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｈａｌｏ ｔａｇまたは適切な蛍光色素）、検出タグ（例えばビオチンおよびジゴキシゲニンなど）、量子ドットまたは金粒子であり得る。

ガイドＲＮＡは、標準的なリボヌクレオチドおよび／または改変されたリボヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは、標準的なデオキシリボヌクレオチドまたは改変されたデオキシリボヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡが酵素的に（すなわちインビボまたはインビトロで）合成されるある実施態様において、ガイドＲＮＡは一般に標準的なリボヌクレオチドを含む。ガイドＲＮＡが化学的に合成されるある実施態様において、ガイドＲＮＡは、標準的または改変されたリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。改変されたリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、塩基修飾（例えば、プソイドウリジン、２－チオウリジンおよびＮ６－メチルアデノシンなど）および／または糖修飾（例えば、２’－Ｏ－メチ、２’－フルオロ、２’－アミノ、およびロックド核酸（ＬＮＡ）など）を含む。ガイドＲＮＡの骨格はまた、ホスホロチオエート結合、ボラノリン酸結合、またはペプチド核酸を含むように改変され得る。

（ＩＩＩ）真核細胞
本開示の別の態様は、セクション（Ｉ）に上述されている自己複製ＲＮＡベクターのいずれか１つを含む真核細胞または細胞株を含む。すなわち、真核細胞または細胞株は、自己複製ＲＮＡベクターのうち１つを遺伝子導入されている。いくつかの実施態様において、真核細胞または細胞株は、ＲＮＡベクターによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計された少なくとも１つのガイドＲＮＡをさらに含み得る。

真核細胞または細胞株は、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物であり得る。適切な真核細胞の例は、以下のセクション（Ｖ）（ｃ）に詳述されている。真核細胞は、インビトロ、エクスビボまたはインビボであり得る。

（ＩＶ）自己複製ＲＮＡをコードするプラスミドベクター
本開示のさらなる態様は、セクション（Ｉ）に上述されている自己複製ＲＮＡをコードするプラスミドベクターを提供する。特に、プラスミドベクターは、アルファウイルス由来の非構造複製複合体タンパク質をコードする配列、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、ならびに追加のウイルス配列（５’ＵＴＲ、サブゲノムプロモーターおよび３’ＵＴＲなど）、任意で選択可能なマーカー配列、任意でインターフェロン阻害剤配列、任意でＩＲＥＳなどを含む。

一般に、自己複製ＲＮＡをコードするプラスミドベクターは、ＤＮＡベクターである。自己複製ＲＮＡをコードする配列は、インビトロでのＲＮＡ合成のためにファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列に動作可能に連結されてい得る。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーター配列、またはＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーター配列の変種であり得る。プロモーター配列は野生型であり得、またはより効率的もしくは効果的な発現のために改変されてい得る。プラスミドベクターは、少なくとも１つの転写終結配列、ならびに細菌細胞における増殖のための少なくとも１つの複製起点および／または選択可能なマーカー配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）をさらに含み得る。プラスミドベクターは、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、またはそれらのバリアントに由来し得る。ベクターおよびその使用に関するさらなる情報が、"Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3^rd edition, 2001に見出され得る。

自己複製ＲＮＡのインビトロでの合成に際し、標準的な手順または市販のキットを用いてＲＮＡが精製され得、５’キャッピングされ得、ポリアデニル化され得る。

（Ｖ）ゲノム編集のための方法
本開示のさらなる態様は、真核細胞におけるゲノム編集のための方法を包含する。一般に、本方法は、セクション（Ｉ）に上述されている自己複製ＲＮＡベクターのいずれか１つ、およびＲＮＡベクターによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計された少なくとも１つのガイドＲＮＡを、目的の真核細胞に導入することを含む。本方法はまた、上記のセクション（ＩＩ）において特定されている複合体を真核生物に導入することを含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドＲＮＡを含む。

ＣＲＩＳＰＲタンパク質がヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を含むある実施態様において、ゲノム編集は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの挿入を含み得る。いくつかの反復において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムが目的の配列の標的部位に二本鎖切断を導入し、細胞のＤＮＡ修復プロセスによる二本鎖切断の修復が少なくとも１つのヌクレオチド変化（すなわちインデル）を導入することによって配列を不活性化する（すなわち遺伝子ノックアウト）ように、ヌクレアーゼ活性を含む１つのＣＲＩＳＰＲシステムまたはニッカーゼ活性を含む２つのＣＲＩＳＰＲシステムを真核細胞に導入し、ドナーポリヌクレオチドを導入しないことを含む。他の反復において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムが目的の配列の標的部位に二本鎖切断を導入し、細胞のＤＮＡ修復プロセスによる二本鎖切断の修復によりドナーポリヌクレオチドにおける配列が目的の配列の標的部位において挿入または交換されるように（すなわち遺伝子修正または遺伝子ノックイン）、ヌクレアーゼ活性を含むＣＲＩＳＰＲシステムまたはニッカーゼ活性を含む２つのＣＲＩＳＰＲシステムならびにドナーポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含む。

ＣＲＩＳＰＲタンパク質がエピジェネティック修飾活性または転写制御活性を含むある実施態様において、ゲノム編集は、標的部位またはその付近の少なくとも１つのヌクレオチドの変換（すなわち塩基編集）、標的部位またはその付近の少なくとも１つのヌクレオチドの修飾、標的部位またはその付近の少なくとも１つのヒストンタンパク質の修飾、および／または染色体配列における標的部位またはその付近の転写の変化を含み得る。

（ａ）細胞への導入
上述のように、本方法は、セクション（Ｉ）において上述されている少なくとも１つの自己複製ＲＮＡベクター、ＲＮＡベクターによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計された少なくとも１つのガイドＲＮＡ、および任意でドナーポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含む。これらの分子は、多様な手段によって目的の細胞に導入され得る。

例えば、自己複製ＲＮＡベクター、ガイドＲＮＡおよび任意のドナーポリヌクレオチドは、目的の細胞に遺伝子導入され得る。適切な遺伝子導入方法には、ヌクレオフェクション(nucleofection)（またはエレクトロポレーション）、リン酸カルシウム介在性遺伝子導入、カチオン性ポリマー遺伝子導入（例えば、ＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルス形質導入、ビロソーム遺伝子導入、ビリオン遺伝子導入、リポソーム遺伝子導入、カチオン性リポソーム遺伝子導入、免疫リポソーム遺伝子導入、非リポソーム脂質遺伝子導入、デンドリマー遺伝子導入、熱ショック遺伝子導入、マグネトフェクション、リポフェクション、遺伝子銃送達、インペールフェクション(impalefection)、ソノポレーション、光学遺伝子導入、および専売薬によって増強される核酸の取り込みが含まれる。遺伝子導入方法は当分野で周知である（例えば、"Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001参照）。他の実施態様において、分子はマイクロインジェクション法によって細胞に導入され得る。例えば、分子は目的の細胞の細胞質または核に注入され得る。細胞に導入された各分子の量は様々であり得るが、当業者は適切な量を決定する手段に精通している。

様々な分子が細胞に同時または連続的に導入され得る。例えば、自己複製ＲＮＡベクターおよびガイドＲＮＡは同時に導入され得る。あるいは、一方が最初に細胞に導入され得、他方がその後に導入され得る。

一般に、細胞は細胞増殖および／または維持に適した条件下で維持される。適切な細胞培養条件は当分野で周知であり、例えば、Santiago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809-5814; Moehle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104:3055-3060; Urnov et al., Nature, 2005, 435:646-651;およびLombardo et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298-1306に記載されている。当業者は、細胞を培養する方法が当分野で公知であり、細胞種に依存して様々であり得ることを認識している。あらゆる場合において、特定の細胞種のための最良の技術を決定するために通常の最適化が用いられ得る。

（ｂ）任意のドナーポリヌクレオチド
ＣＲＩＳＰＲタンパク質がヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を含むある実施態様において、本方法はさらに、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み得る。ドナーポリヌクレオチドは一本鎖もしくは二本鎖であり得、直鎖状もしくは環状であり得、かつ／またはＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。いくつかの実施態様において、ドナーポリヌクレオチドはベクター（例えばプラスミドベクター）であり得る。

ドナーポリヌクレオチドは少なくとも１つのドナー配列を含む。いくつかの態様において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、内在性または天然染色体配列の改変されたバージョンであり得る。例えば、ドナー配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムによって標的とされた配列またはその付近における染色体配列の一部と本質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチド交換を含む。したがって、天然配列への組込みまたは天然配列との交換により、標的染色体位置における配列は少なくとも１つのヌクレオチド交換を含む。例えば、この交換は、１以上のヌクレオチドの挿入、１以上のヌクレオチドの欠失、１以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組合せであり得る。改変された配列の「遺伝子修正」の組込みの結果として、細胞は標的染色体配列から改変された遺伝子産物を産生し得る。

他の態様において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は外来性配列であり得る。本明細書において、「外来性」配列は、細胞に対して天然でない配列、または細胞のゲノムにおけるその配列の天然の位置が異なった位置にある配列を指す。例えば、外来性配列はタンパク質をコードする配列を含み得、これはゲノムへの組込みにより細胞が組み込まれた配列によってコードされたタンパク質を発現できるように、外来性プロモーター制御配列に動作可能に連結され得る。あるいは、外来性配列は、その発現が内在性プロモーター制御配列によって調節されるように染色体配列に組み込まれ得る。他の反復において、外来性配列は、転写制御配列、別の発現制御配列およびＲＮＡをコードする配列などであり得る。上述のように、外来性配列の染色体配列への組み込みは「ノックイン」と呼ばれる。

当業者に認識され得るように、ドナー配列の長さは様々であり得る。例えば、ドナー配列は、数ヌクレオチドから数百ヌクレオチド、数百ヌクレオチドから数十万ヌクレオチドまでの長さにおいて様々であり得る。

通常、ドナーポリヌクレオチドにおけるドナー配列は上流配列および下流配列に隣接しており、これらの配列はＣＲＩＳＰＲシステムによって標的とされる配列のそれぞれ上流および下流に位置する配列と実質的な配列同一性を有する。これらの配列類似性のために、ドナーポリヌクレオチドの上流配列および下流配列は、ドナー配列が染色体配列に組み込まれ得る（または、染色体配列と交換され得る）ように、ドナーポリヌクレオチドと標的染色体配列との間の相同組換えを可能にする。

本明細書において、上流配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムによって標的とされる配列の上流の染色体配列と実質的な配列同一性を有する核酸配列を指す。同様に、下流配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムによって標的とされる配列の下流の染色体配列と実質的な配列同一性を有する核酸配列を指す。本明細書において、語句「実質的な配列同一性」は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。したがって、ドナーポリヌクレオチドにおける上流配列および下流配列は、標的配列の上流の配列または下流の配列との約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。例示的な実施態様において、ドナーポリヌクレオチドにおける上流配列および下流配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムによって標的とされる配列の上流または下流の染色体配列との約９５％または１００％の配列同一性を有し得る。

いくつかの実施態様において、上流配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムによって標的とされる配列のすぐ上流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有する。他の実施態様において、上流配列は、標的配列から約百（１００）ヌクレオチド以内の上流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有する。したがって、例えば、上流配列は、標的配列から約１～約２０、約２１～約４０、約４１～約６０、約６１～約８０、または約８１～約１００ヌクレオチド上流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有し得る。いくつかの実施態様において、下流配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムによって標的とされる配列のすぐ下流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有する。他の実施態様において、下流配列は、標的配列から約百（１００）ヌクレオチド以内の下流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有する。したがって、例えば、下流配列は、標的配列から約１～約２０、約２１～約４０、約４１～約６０、約６１～約８０、または約８１～約１００ヌクレオチド下流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有し得る。

各上流配列または下流配列は、約２０ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施態様において、上流配列および下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００ヌクレオチドを含み得る。具体的な実施態様において、上流配列および下流配列は約５０～約１５００ヌクレオチド長であり得る。

（ｃ）細胞種
多様な真核細胞が本明細書で開示される方法における使用に適している。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞または単細胞真核生物であり得る。いくつかの実施態様において、細胞は、特定の組織から直接単離された初代細胞であり得る。他の実施態様において、細胞は、細胞株細胞であり得る。さらなる他の実施態様において、細胞は１つの細胞胚であり得る。例えば、非ヒト哺乳類胚は、ラット、ハムスター、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマおよび霊長類胚を含む。さらなる他の実施態様において、細胞は幹細胞（胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎生幹細胞、成体幹細胞、および人工多能性幹細胞など）であり得る。ある実施態様において、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、ＷＯ２００３／０４６１４１（これはその全体が本明細書に組み込まれる）またはChung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2:113-117)に開示される技術によって作製された幹細胞を含み得る。様々な実施態様において、細胞はインビトロ（例えば培養物中）、エクスビボ（すなわち生体から単離された組織内）またはインビボ（すなわち生体内）であり得る。例示的な実施態様において、細胞は哺乳類細胞または哺乳類細胞株である。特定の実施態様において、細胞はヒト細胞またはヒト細胞株である。

適切な哺乳類細胞または細胞株の限定されない例には、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；ヒトＵ２－ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ－４３１細胞およびヒトＫ５６２細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、ヒト初代線維芽細胞、ヒト包皮線維芽細胞、マウス胚性線維芽３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウス黒色腫Ｂ１６細胞；マウス筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚性間葉Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２細胞；マウスがんＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳腺ＥＭＴ６細胞；マウス肝がんＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ－１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ－５Ｆ細胞；マウス黒色腫Ｘ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ－１細胞；ラット膠芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽腫Ｂ３５細胞；ラット肝がん細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ ３Ａ細胞；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ－４０形質転換線維芽（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ－７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ－７６）細胞が含まれる。哺乳類細胞株の広範なリストが、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)のカタログに見出され得る。

（ＶＩ）応用
本明細書において開示される組成物および方法は、多様な治療応用、診断応用、産業的応用および研究応用において使用され得る。いくつかの実施態様において、本開示は、遺伝子の機能をモデル化および／または研究し、目的の遺伝子状態もしくはエピジェネティック状態を研究し、または様々な疾患もしくは障害に関与する生化学的経路を研究するために、細胞、動物または植物中の目的の任意の染色体配列を改変するのに使用され得る。例えば、疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物が作製され得、ここで疾患または障害に関連する１以上の核酸配列の発現が変化している。疾患モデルは、生物に対する変異の効果を研究し、疾患の発生および／または進行を研究し、疾患に対する薬学的に活性な化合物の効果を研究し、かつ／または潜在的な遺伝子治療戦略の効力を評価するために使用され得る。

他の実施態様において、組成物および方法は、効率的で費用効率の高い機能的なゲノムスクリーニング（これは特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子の機能およびどのような遺伝子発現の変化が生物学的プロセスに影響を与え得るかを調べるために使用され得る）を実行するため、または細胞表現型と組み合わせたゲノム遺伝子座の飽和変異導入法もしくはディープスキャニング変異導入法(deep scanning mutagenesis)を実行するために使用され得る。例えば、飽和変異導入法またはディープスキャニング変異導入法は、遺伝子発現、薬剤耐性および疾患の回復に必要な機能的要素の重要な最小限の特徴および別々の脆弱性を決定するために使用され得る。

さらなる実施態様において、本明細書で開示される組成物および方法は、疾患または障害の存在を立証し、かつ／または処置の選択肢を決定するために使用される診断テストのために使用され得る。適切な診断テストの例には、がん細胞における特定の変異（例えば、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２などにおける特定の変異）の検出、特定の疾患に関連する特定の変異（例えば、トリヌクレオチド反復、鎌状赤血球症に関連するβグロビン内の変異、特定のＳＮＰなど）の検出、肝炎の検出、およびウイルス（例えばジカウイルス）の検出などが含まれる。

さらなる実施態様において、本明細書で開示される組成物および方法は、特定の疾患または障害に関連する遺伝子変異を修正するため（例えば、鎌状赤血球症またはサラセミアに関連するグロビン遺伝子の変異を修正するため、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）に関連するアデノシンデアミナーゼ遺伝子の変異を修正するため、ハンチントン病の疾患原因遺伝子であるＨＴＴの発現を低下させるため、または網膜色素変性症の処置のためにロドプシン遺伝子の変異を修正するため）に使用され得る。このような改変は、エクスビボの細胞において行われ得る。

さらなる他の実施態様において、本明細書で開示される組成物および方法は、形質が改善し、または環境ストレスに対する抵抗性が増大した作物を作製するために使用され得る。本開示はまた、形質が改善した家畜または生産動物(production animal)を作製するために使用され得る。例えば、ブタは、生物医学的モデルとして（特に再生医療または異種移植において）魅力的な多くの特徴を有する。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において、以下の用語は他に明記されない限り、これらに帰する意味を有する。

本開示またはその好ましい実施態様の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「前記」は１以上の要素が存在することを意味することが意図されている。用語「含む」、「包含する」および「有する」は包含的であり、記載された要素以外のさらなる要素が存在し得ることを意味することが意図されている。

用語「約」は、数値ｘに関して使用される場合、例えばｘ±５％を意味する。

本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、特定の水素結合を介した塩基対形成による二本鎖核酸の関連性を指す。塩基対形成は、標準的なワトソン・クリック塩基対形成であり得る（例えば、５’－ＡＧＴＣ－３’は相補的配列３’－ＴＣＡＧ－５’と対形成する）。塩基対形成はまた、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合であり得る。相補性は通常、二本鎖領域に関して測定されるため、例えばオーバーハングは除外される。二本鎖領域の２つの鎖の間の相補性は部分的であり得、いくつか（例えば７０％）の塩基のみが相補的である場合、割合（例えば７０％）として表現され得る。相補的でない塩基は「ミスマッチ」している。二本鎖領域の全ての塩基が相補的である場合、相補性は完全（すなわち１００％）であり得る。

本明細書において、用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」または「Ｃａｓ９システム」は、Ｃａｓ９タンパク質（すなわち、ヌクレアーゼ、ニッカーゼまたは触媒不活性型タンパク質）およびガイドＲＮＡを含む複合体を指す。

本明細書における用語「内在性配列」は、細胞に対して天然である染色体配列を指す。

本明細書における用語「外来性」は細胞に対して天然でない配列、または細胞のゲノムにおけるその配列の天然の位置が異なる染色体位置にある染色体配列を指す。

遺伝子またはポリヌクレオチドに関する用語「発現」は、遺伝子またはポリヌクレオチドの転写、および必要に応じてｍＲＮＡ転写物のタンパク質またはポリペプチドへの翻訳を指す。したがって、文脈から明らかであるように、タンパク質またはポリペプチドの発現は、オープンリーディングフレームの転写および／または翻訳に起因する。

本明細書において、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）および遺伝子産物の生成を制御するあらゆるＤＮＡ領域を指し、これはそのような制御配列がコード配列および／または転写される配列に隣接しているか否かによらない。したがって、遺伝子には、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位など）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座調節領域が含まれる。

用語「異種」は、目的の細胞に対して内在性または天然でない実体を指す。例えば、異種タンパク質は外来性の供給源に由来している、または元々由来していたタンパク質（外因的に導入された核酸配列など）を指す。いくつかの例において、異種タンパク質は目的の細胞によって正常に生成されない。

用語「ニッカーゼ」は、二本鎖核酸配列の一方の鎖を切断する（すなわち、二本鎖配列に切れ目を入れる）酵素を指す。例えば、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼは、ニッカーゼとして機能して二本鎖配列の一方の鎖のみを切断するように変異および／または欠失によって改変され得る。

本明細書において、用語「ヌクレアーゼ」は、二本鎖核酸配列の両方の鎖を切断するか、または一本鎖核酸配列を切断する酵素を指す。

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかにおける、直鎖状構造または環状構造のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的において、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものとして解釈されるべきではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えばホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同一の塩基対形成の特異性を有する（すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対形成する）。

用語「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジンおよびウリジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチド類似体であり得る。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は天然に存在するヌクレオチド（たとえば、イノシン、プソイドウリジンなど）または天然に存在しないヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖部分または塩基部分における修飾の限定されない例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、ヒドロキシ基、メチル基、ホスホリル基およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素原子および窒素原子の他の原子への置換（たとえば、７－デアザプリン）が含まれる。また、ヌクレオチド類似体には、ジデオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびモルフォリノが含まれる。

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。

用語「標的配列」および「標的部位」は互換的に使用され、ＣＲＩＳＰＲシステムが標的とする目的の核酸（例えば、染色体ＤＮＡまたは細胞ＲＮＡ）中の特定の配列、およびＣＲＩＳＰＲシステムが核酸または核酸に関連するタンパク質を改変する部位を指す。

核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定する技術は当分野で公知である。通常、このような技術には、遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされているアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することが含まれる。ゲノム配列もまた、この様式で決定および比較され得る。一般に、同一性は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれヌクレオチドとヌクレオチドとの正確な一致またはアミノ酸とアミノ酸との正確な一致を指す。２以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、その割合同一性を決定することによって比較され得る。２つの配列の割合同一性は、核酸配列であるかアミノ酸配列であるかによらず、２つのアラインされた配列間の正確な一致の数をより短い配列の長さで割り、１００を乗じたものである。核酸配列のための近似アライメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって標準化されたスコア化マトリックスを用いることによって、アミノ酸配列に適用され得る。配列の割合同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」の実用的用途におけるGenetics Computer Group (Madison, Wis.)によって提供されている。配列間の割合同一性または類似性を計算するのに適した他のプログラムは当分野で一般的に知られており、例えば、別のアライメントプログラムは初期設定パラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の初期設定パラメータを用いて使用され得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ソーティング方法＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細はＧｅｎＢａｎｋのウェブサイト上に見出され得る。

本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更が上述の細胞および方法において行われ得るため、上記の記載および以下で与えられる実施例に含まれるあらゆる事項は、限定的な意味ではなく説明として解釈されるべきであることが意図される。

以下の実施例は、本開示の特定の態様を説明する。

実施例１．自己複製Ｃａｓ９ ＲＮＡベクターの作製
Ｃａｓ９をコードするポリシストロニックな合成自己複製ＲＮＡを、構造遺伝子が除去された改変されたベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス（すなわち、Ｓｉｍｐｌｉｃｏｎ^（商標）クローニングベクターＥ３Ｌ；MilliporeSigma）に基づいて作製した。Ｃａｓ９－Ｔ２Ａ－ＴａｇＧＦＰ２、ｅＳｐＣａｓ９－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ２およびｅＳｐＣａｓ９のｃＤＮＡを、それぞれｐＶＡＶ－Ｃａｓ９－２Ａ－ＧＦＰプラスミド（野生型ＳｐＣａｓ９をコードしている）、ＣＭＶ－ｅＳｐＣａｓ９－２Ａ－ＧＦＰプラスミドおよびＳｐＣａｓ９－ブラストサイジンＬｅｎｔｉプラスミドを鋳型として用いてＰＣＲにより増幅した。ｅＳｐＣａｓ９は、切断効率を低下させることなくオンターゲットの忠実度を増強するように改変された野生型ＳｐＣａｓ９の改変されたバージョンである（Slaymaker et al., Science. 2016, 351(6268):84-8）。次いで、各ｃＤＮＡをＳｉｍｐｌｉｃｏｎ^（商標）ベクターのＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングし、それぞれＴ７－ＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２（配列番号３１）、Ｔ７－ＶＥＥ－ｅＳｐＣａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２（配列番号３２）およびＴ７－ＶＥＥ－ｅＳｐＣａｓ９（配列番号３３）と名付けた。各ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡの模式図を図１Ａに示す。

ＲＮＡ合成のために、各ＶＥＥ－Ｃａｓ９プラスミドおよびＢ１８Ｒ－Ｅ３ＬプラスミドをそれぞれＭｌｕＩ消化およびＢａｍＨＩ消化によって直線化し、ＲＮＡ合成のための鋳型を作成した。ＲＮＡ合成および５’キャッピングを、ＣｌｅａｎＣａｐ^{（登録商標）}Ｒｅａｇｅｎｔ ＡＧ（Trilink）の存在下でＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ－Ｔ７（Promega）キットを用いて３７℃で２時間行った。Ｂ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡ合成のために、約１５０塩基の追加のポリ（Ａ）テールをポリ（Ａ）ポリメラーゼ（CELLSCRIPT）によって３７℃で３０分間付加した。精製および２．５Ｍ酢酸アンモニウムでの沈殿後、ＲＮＡを１μｇ／μｌの濃度でＲＮＡ保存溶液（Ambion）に再懸濁し、－８０℃で保存した。ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分析した（図１Ｂ）。ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡのバンドは、最小限の分解されたバンドを伴って予測されたサイズ（約１５ｋｂ）において最も強い強度を示した。

実施例２．自己複製Ｃａｓ９ ＲＮＡの遺伝子導入
これらのＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡを、ＲＮＡの遺伝子導入および複製によって生じるインターフェロン（ＩＦＮ）応答を阻害するＢ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡとともに細胞に共導入した。

ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞を、遺伝子導入の日に３０～６０％の培養密度となるように遺伝子導入の１日前に継代した。各ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡを、リポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ遺伝子導入試薬（Thermofisher）を用いてＢ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡとともに１：１の比率（６ウェルプレートの１ウェルについて各１マイクログラム）で細胞に共導入した。

図１Ｃに示されるように、Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２およびｅＳｐＣａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２を遺伝子導入した細胞においてＴａｇＧＦＰ２（ＧＦＰ）発現が観察され、各Ｃａｓ９タンパク質の発現をウエスタンブロッティングによって確認した（図１Ｄ）。これらのデータは、自己複製ＲＮＡ技術がヒト細胞においてＣａｓ９の発現を可能にすることを示している。

実施例３．非組み込みのＣａｓ９ゲノム編集
次に、ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡを化学合成されたｇＲＮＡと組み合わせて用いて標的ゲノム編集を調べた。Ｋ－ＲａｓおよびＥＭＸ－１を標的とする市販の２種の合成ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体）および１種の単一の合成ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、Thermofisher Scientificから購入した。Ｋ－ＲａｓおよびＥＭＸ－１標的のためのＰＡＭ配列（下線）を含むｃｒＲＮＡの配列は、それぞれ５’－ＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ（配列番号３４）および５’－ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧ（配列番号３５）である。

最初に、ＨＦＦ細胞にＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２、Ｂ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡ（上述）を１種のｇＲＮＡまたは２種のｇＲＮＡのいずれかとともに共導入した。遺伝子導入の２～６日後に細胞を回収し、Ｇｕｉｄｅ－ｉＴ変異検出キット（Clontech）を用いてインデルを検出した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ^（商標）イメージングシステムを用いて、ＤＮＡの切断効率を算出した。ＫＲａｓ遺伝子（３４０ｂｐ）およびＥＭＸ－１遺伝子（４１０ｂｐ）の標的領域を、それぞれ５’－ＧＡＴＡＣＡＣＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＣＴＧ（配列番号３６）／５’－ＧＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＣＣ（配列番号３７）および５’－ＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＣＣＣＣＡ（配列番号：３８）／５’－ＧＴＣＣＣＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣ（配列番号３９）のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。

図２Ａに示されるように、１種または２種のｇＲＮＡを用いてＧＦＰ発現が観察されたが、２種のｇＲＮＡを遺伝子導入した細胞ではＧＦＰ発現が低下していた。３日目（遺伝子導入の２日後）には、１種のｓｇＲＮＡを遺伝子導入した細胞では１５％を超える切断が観察されたが、２種のｇＲＮＡを遺伝子導入した細胞では切断は検出されなかった（図２Ｂ）。Ｃａｓ９陰性細胞を除去するためにピューロマイシン選択を行い、１種のｓｇＲＮＡを遺伝子導入した細胞では切断の効率が上昇したが、２種のｇＲＮＡを遺伝子導入した細胞では切断は未だ検出されなかった（図２Ｂ、６日目）。

編集の効率を上昇させるために、細胞にＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡおよびｇＲＮＡを連続的に遺伝子導入した。この実験では、１日目にＶＥＥ－Ｃａｓ９およびＢ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡを共導入し、２日目にリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ遺伝子導入試薬（Thermofisher）を用いてｇＲＮＡを遺伝子導入した。図２Ｂに示されるように、１種または２種のいずれかのｇＲＮＡを用いた連続的な遺伝子導入により、４日目（ｇＲＮＡ遺伝子導入の２日後）により高いゲノム編集の効率が得られ、ピューロマイシン選択後（６日目）にさらなる効率の上昇が得られた。２つの異なる量のｇＲＮＡ（２５ｎＭおよび５０ｎＭ）を試験したが、有意な差は観察されなかった（図２Ｂ）。

次に、ＶＥＥ－Ｃａｓ９ゲノム編集を、１種のｓｇＲＮＡを用いた連続的な遺伝子導入法によりヒトｉＰＳＣ細胞株において試験した。Ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ－１ ｉＰＳＣまたはＰＢＭＣ－ｉＰＳＣ（ＣＤ３４＋臍帯血ｉＰＳＣ）を、ラミニンでコーティングされたウェル上でｍＴｅＳＲＴＭ－１培養液（Stemcell Technologies）の存在下において培養した。ｉＰＳＣ細胞を上述のように遺伝子導入した。両方のヒトｉＰＳＣ細胞株においてＧＦＰ発現が得られ（図２Ｃ）、ゲノム編集の効率は両方の細胞株において１６～３２％の範囲であった（図２Ｄ）。

実施例４．自己複製Ｃａｓ９ ＲＮＡと他の発現系との比較
ゲノム編集の効率を、ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡとレンチウイルスＣａｓ９との間で比較した。レンチウイルスベクターはブラストサイジン選択マーカーを有する。したがって、レンチウイルスＣａｓ９（ＬＶ－Ｃａｓ９）（ＭＯＩ＝３）またはＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２（Ｓ－Ｃａｓ９）をＨＦＦに導入し、次いで細胞をそれぞれブラストサイジン（４μｇ／ｍＬ）またはピューロマイシン（０．８μｇ／ｍＬ）で１週間選択した。選択後、両細胞を、翌日の１種のｓｇＲＮＡの遺伝子導入のために継代した。両方のＣａｓ９発現法により、Ｋ－Ｒａｓ標的（それぞれ３５％および３６％）およびＥＭＸ－１標的（それぞれ４７％および４０％）において類似のゲノム編集効率が観察された（図３Ａ）。

次に、ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡを、Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２をコードするプラスミドＣａｓ９と比較した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドＣａｓ９、およびＫ－Ｒａｓ－ｇＲＮＡをコードするプラスミド（すべてＤＮＡ成分）を共導入し、またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２、Ｂ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡおよび１種のＫ－Ｒａｓ ｓｇＲＮＡ（すべてＲＮＡ成分）を共導入した。図３Ｂに示されるように、すべてＤＮＡの成分またはすべてＲＮＡの成分の遺伝子導入は、類似の割合のＧＦＰ陽性細胞（６５～７４％）をもたらした。ゲノム編集の効率もまた、２つの方法で類似（２０～２９％）していた（図３Ｃ）。これらのデータは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡによるゲノム編集が、レンチウイルスおよびプラスミドＣａｓ９発現ツールによって与えられるゲノム編集と同等であることを示している。

実施例５．自己複製Ｃａｓｓ９ ＲＮＡの長期的な発現
ＶＥＥ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２ ＲＮＡおよびＢ１８Ｒ－Ｅ３Ｌ ＲＮＡをＨＦＦ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞のいずれかに共導入し、細胞をＢ１８Ｒタンパク質の存在下においてピューロマイシン選択下で維持した。１ヶ月および４回の細胞継代後、ＨＦＦ細胞に１種のＫ－Ｒａｓ ｓｇＲＮＡを共導入した。図４Ａに示されるように、約４０％のＨＦＦ細胞がＧＦＰ陽性であり、約１０％のゲノム編集効率が得られた。１ヶ月および８回の細胞継代後、ＨＥＫ２９３Ｔに１種のＥＭＸ－１ ｓｇＲＮＡを共導入した。約８１％のＨＥＫ２９３Ｔ細胞がＧＦＰ陽性であり、ゲノム編集効率は約２６％であったことが見出された（図４Ｂ）。これらのデータは、ＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡが、宿主細胞ゲノムを操作することなくＣａｓ９を発現する細胞株を作製することを可能にし、前記細胞株が標的ゲノム編集に利用可能であることを示唆している。

実施例１で調製した３つのＶＥＥ－Ｃａｓ９ ＲＮＡベクターについて、ゲノム編集の効率を比較した。図４Ｃおよび図４Ｄに示されるように、ＨＦＦおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ｅＳｐＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２およびＣａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２によって類似のゲノム編集効率が得られた（例えば、ＨＦＦでは５～１２％、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では２０～２６％）。

実施例６．自己複製Ｄ１０Ａ－Ｃａｓ９ ＲＮＡによるゲノム編集
Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異は、二本鎖切断の代わりに一本鎖切断をもたらす。したがって、より少ないオフターゲット切断を伴うゲノム編集を行うと考えられ、正確なゲノム編集のために有用であると考えられる。自己複製ＲＮＡを有するＤ１０Ａ－Ｃａｓ９の利用可能性を調べるために、Ｄ１０Ａ点変異を有するＣａｓ９の新規のコンストラクトを作成した。図５Ａは、２９３Ｔ細胞におけるＤ１０Ａ－Ｃａｓ９－ＴａｇＧＦＰ２およびＤ１０Ａ－Ｃａｓ９－ＴａｇＲＦＰの１日目および３日目の発現を示しており、Ｃａｓ９を発現する細胞株（２９３Ｔ）が作製された（図５Ｂ）。Ｄ１０Ａ－Ｃａｓ９の利用可能性を試験するために、ＥＭＸ１遺伝子座における２種類のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－１および９）を遺伝子導入し、二本鎖切断を作成した。図５Ｃに示されるように、Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａ変異体を発現する細胞に２種類のｓｇＲＮＡを遺伝子導入した場合にはゲノム編集が観察されたが、１種類のｓｇＲＮＡを遺伝子導入した場合にはゲノム編集は観察されなかった。Ｄ１０Ａ－Ｃａｓ９細胞株において同じ結果が観察された（図５Ｄ）。これらのデータは、自己複製Ｄ１０Ａ－Ｃａｓ９が正確なゲノム編集のために利用可能であることを示している。

実施例７．自己複製Ｃａｓ９ ＲＮＡによるＤＮＡオリゴおよびＧＦＰ ＤＮＡ断片の挿入
次に、Ｃａｓ９切断部位におけるＤＮＡ挿入について試験した。最初に、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を有するＤＮＡオリゴ（ＢａｍＨＩオリゴ）をＲａｂ１１遺伝子座に挿入した。１日目に自己複製Ｃａｓ９またはＤ１０Ａ－Ｃａｓ９を遺伝子導入し、次いでＢａｍＨＩオリゴをｓｇＲＮＡとともに共導入した。細胞をｓｇＲＮＡの遺伝子導入の３日後に解析のために回収し、またはクローンをピューロマイシン選択後に単離した。図６Ａに示されるように、Ｒａｂ１１Ａ遺伝子座におけるＰＣＲ産物のＢａｍＨＩ消化により、Ｃａｓ９およびＤ１０Ａ－Ｃａｓ９で切断した試料の両方においてＢａｍＨＩオリゴの挿入が観察された。細胞クローンを単離し、ＢａｍＨＩオリゴの挿入を確認した。図６Ｂに示されるように、ｉＰＳＣの６クローン中４クローンおよびＵ２ＯＳ細胞の１１クローン中８クローンにおいてＢａｍＨＩオリゴが検出された。次に、ＧＡＰＤＨ遺伝子座にＴａｇＧＦＰ２断片を挿入した。１日目にＨＥＫ２９３細胞に自己複製Ｃａｓ９－ＴａｇＲＦＰを遺伝子導入し、次いで２日目にＰＣＲで増幅したＧＦＰ断片およびｓｇＲＮＡを共導入した。ｓｇＲＮＡの遺伝子導入の３日後にＧＦＰ陽性細胞が観察された（図６Ｃ）。これらのデータは、自己複製Ｃａｓ９がゲノム編集のＤＮＡ挿入のために機能することを示唆している。

Claims (23)

1. アルファウイルス由来の複数の非構造複製複合体タンパク質をコードする配列およびＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を含む、自己複製ＲＮＡベクター。
2. ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型Ｃａｓ１２タンパク質、ＶＩ型Ｃａｓ１３タンパク質、ＣａｓＸタンパク質、またはＣａｓＹタンパク質である、請求項１記載の自己複製ＲＮＡベクター。
3. ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ Ｃａｓ９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ Ｃａｓ９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ１２、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｃａｓ１２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｃａｓ１３ａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃａｓ１３ａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ． Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３、またはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃａｓ１３ｄである、請求項１または２に記載の自己複製ＲＮＡベクター。
4. ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である、請求項３記載の自己複製ＲＮＡベクター。
5. ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列が、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が触媒活性の変化、標的部位特異性の改善および／またはオフターゲット効果の低下を有するように、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換を含む、請求項１～４のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター。
6. ＣＲＩＳＰＲタンパク質がヌクレアーゼもしくはニッカーゼであるか、または切断活性を持たない、請求項１～５のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター。
7. ＣＲＩＳＰＲタンパク質が少なくとも１つの核局在化シグナルに連結している、請求項１～６のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター。
8. ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、少なくとも１つの蛍光タンパク質、少なくとも１つのクロマチン調節モチーフ、少なくとも１つの機能性ドメイン、またはそれらの組合せに連結している、請求項１～７のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター。
9. 少なくとも１つの機能性ドメインが、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインである、請求項８記載の自己複製ＲＮＡベクター。
10. ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～９のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター。
11. アルファウイルスが、アウラウイルス、Ｂａｂａｎｋｉウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、バギークリークウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレイズ(Everglades)ウイルス、フォートモーガン(Fort Morgan)ウイルス、ゲタウイルス、ハイランドＪ(Highlands J)ウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、マヤロウイルス、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇウイルス、ムカンボウイルス、Ｎｄｕｍｕウイルス、ピクスナウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、Ｓａｇｉｙａｍａウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス、シンドビスウイルス、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、またはワタロアウイルスである、請求項１～１０のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター。
12. アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスである、請求項１１記載の自己複製ＲＮＡベクター。
13. ベクターが、少なくとも１つの選択可能なマーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１～１２のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター。
14. ベクターが、Ｅ３Ｌタンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項１～１３のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター。
15. ベクターが、改変されたベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスに基づき、５’から３’までに、５’キャップ、５’ＵＴＲ、ＶＥＥウイルス由来の４つの非構造複製複合体タンパク質をコードする複数の非構造複製複合体タンパク質をコードする配列、プロモーター、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、任意でＩＲＥＳ、任意でＥ３Ｌタンパク質をコードする配列、任意でＩＲＥＳ、任意で選択可能なマーカーをコードする配列、アルファウイルス３’ＵＴＲ、およびポリＡテールを含む、請求項１～１４のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター。
16. 請求項１～１５のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター、および自己複製ＲＮＡベクターによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計された少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む複合体。
17. 請求項１～１５のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクターを含む、真核細胞または細胞株。
18. 自己複製ＲＮＡベクターによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計された少なくとも１つのガイドＲＮＡをさらに含む、請求項１７記載の真核細胞または細胞株。
19. 請求項１～１４のいずれかに特定されている自己複製ＲＮＡベクターをコードするプラスミドベクター。
20. インビトロでの転写のためのＴ７またはＳＰ６プロモーターをさらに含む、請求項１６記載のプラスミドベクター。
21. 請求項１～１５のいずれかに記載の自己複製ＲＮＡベクター、および自己複製ＲＮＡベクターによってコードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成するように設計された少なくとも１つのガイドＲＮＡを真核細胞に導入することを含む、標的ゲノム編集のための方法。
22. 少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む、請求項２１記載の方法。
23. 真核細胞がヒト細胞である、請求項２１または２２に記載の方法。

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