JP2022532675A - α９／α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体の発現系及びその使用方法 - Google Patents
α９／α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体の発現系及びその使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための発現系について記載する。また、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又はアロステリック調節因子を同定するために発現系を使用する方法も記載される。
Description
（発明の分野）
本発明は、α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための発現系、及びその使用方法に関する。
本発明は、α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための発現系、及びその使用方法に関する。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「ＰＲＤ４０２４ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔ」及び２０２０年４月２３日の作成日で、５５，７５０バイトのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ファイル名「ＰＲＤ４０２４ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔ」及び２０２０年４月２３日の作成日で、５５，７５０バイトのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、神経伝達性アセチルコリンに反応する受容体ポリペプチドである。ｎＡＣｈＲｓは、中心孔の周りに対称的に形成されたα（α１～α１０）サブユニット及び非α（β１－β４、ε、γ、及びδ）サブユニットからなる五量体リガンド依存性イオンチャネルである。サブユニットは、サブユニットの組み合わせからなる、ホモマーチャネル又はヘテロマーチャネルのいずれかを形成する。
α９α１０型ｎＡＣｈＲは、α９サブユニット及びα１０サブユニットから形成されるヘテロマー受容体である。α９サブユニット及びα１０サブユニットは、遺伝子相同性に基づくニコチン系のメンバーであるが、ニコチンはα９型ｎＡＣｈＲ及びα９α１０型ｎＡＣｈＲのアンタゴニストである。ｎＡＣｈＲのα９サブユニット及び／又はα１０サブユニットは、内耳の有毛細胞内（Ｅｌｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：７０５～７１５）、精子細胞内（Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｍｅｉｚｅｌ（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：２５９２８～２５９３５）、後根神経節ニューロン細胞内（Ｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１５：１～５）、皮膚ケラチノサイト細胞内（Ａｒｒｅｄｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５９：３２５～３３６）、脳下垂体結節部細胞内（Ｓｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６１：１５０～１５９）、及びリンパ球細胞内（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ７６：２６３～２８０）で発現される。α９α１０型ｎＡＣｈＲｓは、聴覚的処理及び神経障害性疼痛において重要な役割を有することが示唆されている（Ｅｌｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８ （６）３５０１～６）；Ｖｉｎｃｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０３（４７）：１７８８０～４）。
ｎＡＣｈＲの薬理学的特性を研究し、受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定するために、異種発現系が使用されることが多い。しかしながら、哺乳動物細胞株において、ヒトα９α１０含有受容体の機能的発現に成功したという報告は、これまでのところ存在しない（Ｌａｎｓｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６８（５）１４３１～８）。したがって、潜在的な治療法を発見するための調節因子の高スループットスクリーニング用の、ヒトα９α１０型ｎＡＣｈＲの機能的発現を促進する発現系を得ることが望ましい。
一般的な一態様では、哺乳動物細胞におけるα９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための発現系が本明細書で提供される。特定の実施形態では、発現系は、（ｉ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、（ｉｉ）α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、（ｉｉｉ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第３の核酸と、を含む、組換え細胞を含む。
特定の実施形態では、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα９サブユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第３の核酸は、ＣＨＡＴをコード化する。ＣＨＡＴは、例えば、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
特定の実施形態では、組換え細胞は、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１３２Ｄ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＥＭ１００、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第４の核酸を更に含む。特定の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＩＥをコード化する。ＴＭＩＥは、例えば、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１３２Ａをコード化する。ＴＭＥＭ１３２Ａは、例えば、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１３２Ｃをコード化する。ＴＭＥＭ１３２Ｃは、例えば、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１３２Ｄをコード化する。ＴＭＥＭ１３２Ｄは、例えば、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１３２Ｅをコード化する。ＴＭＥＭ１３２Ｅは、例えば、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１００をコード化する。ＴＭＥＭ１００は、例えば、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、第４の核酸は、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａをコード化する。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａは、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
特定の実施形態では、発現系は、（ｉ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、（ｉｉ）α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、（ｉｉｉ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第３の核酸と、を含む、組換え細胞を含み、その組換え細胞は、アセチルコリン（ＡＣｈ）又はメチルリカコニチン（ＭＬＡ）から選択される少なくとも１つの化合物を含む培地中で培養されるものである。
特定の実施形態では、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα９サブユニットは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第３の核酸は、ＴＭＩＥをコード化する。特定の実施形態では、ＴＭＩＥは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、組換え細胞は、ＣＨＡＴ、ＴＭＥＭ１３２Ｄ、ＴＭＥＭ１００、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第４の核酸を更に含む。特定の実施形態では、ＣＨＡＴは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ａは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ｃは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ｄは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ｅは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１００は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＴＮＦＲＳＦ１０Ａは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、組換え細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択することができる。
また、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子を同定する方法も提供される。特定の実施形態では、本方法は、（ａ）本発明の発現系の組換え細胞を、組換え細胞が増殖する条件下で培養する工程と、（ｂ）組換え細胞を薬剤と接触させる工程と、（ｃ）薬剤が、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子であるかどうかを判定する工程と、を含み、薬剤と接触していない組換え細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲの活性と比較して、アゴニスト又はアロステリック調節因子が、α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を増加させ、アンタゴニストが、α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を低下させる。特定の実施形態では、薬剤は、小分子又はペプチドである。
また、α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現を増強することができるタンパク質を同定する方法も提供される。特定の実施形態では、本方法は、（ａ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸、及びα９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸を含む、組換え細胞を培養する工程と、（ｂ）組換え細胞をタンパク質発現ライブラリと接触させる工程と、（ｃ）α９α１０型ｎＡＣｈＲの発現レベルを決定する工程と、を含み、非接触組換え細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲ発現と比較して、α９α１０型ｎＡＣｈＲ発現が増加していることが、そのタンパク質がα９α１０型ｎＡＣｈＲの発現を増強することを示すものである。
また、（ｉ）本発明の発現系と、（ｉｉ）使用説明書と、を含む、キットも提供される。
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を単独でトランスフェクションした、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴとをトランスフェクションした、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＴＭＩＥとをトランスフェクションした、又はα９α１０型ｎＡＣｈＲと、ＣＨＡＴと、ＴＭＩＥとをトランスフェクションした、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の代表的な蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）トレースのグラフを示す。反応は、細胞を２００μＭアセチルコリン（ＡＣｈ）で、１８０秒間処理することによって誘発された。
様々な濃度のＡＣｈで１８０秒間処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＦＬＩＰＲトレースのグラフを示す。α９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴとでコトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示すグラフを示す。
様々な濃度のＡＣｈで１８０秒間処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＦＬＩＰＲトレースのグラフを示す。α９α１０型ｎＡＣｈＲとＴＭＩＥとでコトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示すグラフを示す。
様々な濃度のＡＣｈで１８０秒間処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＦＬＩＰＲトレースのグラフを示す。α９α１０型ｎＡＣｈＲと、ＴＭＩＥと、ＣＨＡＴとでコトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示すグラフを示す。ＡＣｈに対する最大ＦＬＩＰＲ反応をプロットする。
α９α１０型ｎＡＣｈＲの薬理学的特性を示すＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＦＬＩＰＲトレースのグラフを示す。様々な濃度のアンタゴニストの存在下で、２００μＭのＡＣｈで細胞を１８０秒間処理することにより、反応を誘発した。α９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴとでコトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示すグラフを示す。
α９α１０型ｎＡＣｈＲの薬理学的特性を示すＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＦＬＩＰＲトレースのグラフを示す。様々な濃度のアンタゴニストの存在下で、２００μＭのＡＣｈで細胞を１８０秒間処理することにより、反応を誘発した。α９α１０型ｎＡＣｈＲとＴＭＩＥとでコトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示すグラフを示す。
α９α１０型ｎＡＣｈＲの薬理学的特性を示すＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＦＬＩＰＲトレースのグラフを示す。様々な濃度のアンタゴニストの存在下で、２００μＭのＡＣｈで細胞を１８０秒間処理することにより、反応を誘発した。α９α１０型ｎＡＣｈＲと、ＴＭＩＥと、ＣＨＡＴとでコトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示すグラフを示す。
α９α１０とＴＭＩＥとでトランスフェクションされ、アセチルコリン（ＡＣｈ）又はメチルリカコニチン（ＭＬＡ）のいずれかを様々な濃度でインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＦＬＩＰＲトレースのグラフを示したグラフを示す。反応は、細胞を２００μＭのＡＣｈで１８０秒間処理することによって誘発された。
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した特定の実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の接続的な用語「及び／又は」は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用されるとき、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されることはないことを示す。
本明細書で使用するとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。米国特許審査便覧§２１１１．０３を参照されたい。
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
「同一である」又は「○○パーセント同一性」という言い回しは、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈で使用される場合、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及び位置合わせさせた場合に同じである、又は特定のパーセント分の同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列又はサブ配列を指す。
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための配列の最適な位置合わせは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性位置合わせアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと位置合わせしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積位置合わせスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。
ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア、常に０より大きい値である）及びパラメータＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に０より小さい値である）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積位置合わせスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ以上の負のスコアリング残基の位置合わせの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、位置合わせの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するもの）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝３、期待値（Ｅ）＝１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２）を参照）。
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコード化されるポリペプチドが、第２の核酸によりコード化されるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」なる用語は、同義的に、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。また、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分枝鎖であってよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつ非アミノ酸により中断されてもよい。本用語はまた、自然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。介入の例としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識構成成分とのコンジュゲートが挙げられる。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が含まれる。
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
発現系
本発明は、概して、細胞中のα９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための発現系に関する。発現系を使用する方法と、発現系を含むキットを使用する方法も提供される。
本発明は、概して、細胞中のα９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現のための発現系に関する。発現系を使用する方法と、発現系を含むキットを使用する方法も提供される。
本明細書で使用するとき、用語「α９α１０型ｎＡＣｈＲ」及び「アルファ９アルファ１０型ｎＡＣｈＲ」は互換的に使用され、α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体タンパク質、好ましくはヒトα９α１０型ｎＡＣｈＲを指し、これは、コリン作動受容体のタンパク質ファミリーのメンバーである。α９α１０型ｎＡＣｈＲは、アルファ９サブユニット及びアルファ１０サブユニットからなる五量体リガンド依存性イオンチャネルである。アルファ９サブユニットは、遺伝子ＣＨＲＮＡ９（ＮＭ＿０１７５８１）によりコード化され、α１０サブユニットは、遺伝子ＣＨＲＮＡ１０（ＮＭ＿０２０４０２）によりコード化される。一緒に発現すると、サブユニットは会合して、ヘテロマーｎＡＣｈＲを形成する（Ｓｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１（１）：１５０～９）。
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる、転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。
一般的な態様では、本発明は、９α１０ニコチン酸アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第３の核酸と、を含む組換え細胞を含む、発現系に関する。
別の一般的な態様では、本発明は、α９α１０型ニコチン酸アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドをコード化する第３の核酸と、を含む組換え細胞であって、アセチルコリン（Ａｃｈ）、メチルリカコニチン（ＭＬＡ）、コリン、又はニコチンから選択される、少なくとも１つの化合物を含む培地中で培養される組換え細胞を含む発現系に関する。
特定の実施形態では、本発明は、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα９サブユニットをコード化する第１の核酸を含む、組換え細胞を含む、発現系に関する。α９α１０型ｎＡＣｈＲのα９サブユニットは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、本発明は、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸を含む、組換え細胞を含む、発現系に関する。α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上の、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施形態では、本発明は、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドをコード化する第３の核酸を含む、組換え細胞を含む発現系に関する。
ある特定の実施形態では、第３の核酸は、ＣＨＡＴをコード化する。ＣＨＡＴは、例えば、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施形態では、本発明は、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１３２Ｄ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＥＭ１００、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドをコード化する第４の核酸を含む、組換え細胞を含む、発現系に関する。ある特定の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＩＥをコード化する。ＴＭＩＥは、例えば、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１３２Ａをコード化する。ＴＭＥＭ１３２Ａは、例えば、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１３２Ｃをコード化する。ＴＭＥＭ１３２Ｃは、例えば、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１３２Ｄをコード化する。ＴＭＥＭ１３２Ｄは、例えば、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１３２Ｅをコード化する。ＴＭＥＭ１３２Ｅは、例えば、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、第４の核酸は、ＴＭＥＭ１００をコード化する。ＴＭＥＭ１００は、例えば、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、第４の核酸は、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａをコード化する。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａは、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
一般的な態様では、本発明は、組換え細胞を含む発現系に関する。本開示を考慮して、当業者に知られている任意の細胞を、α９α１０型ｎＡＣｈＲの組換え発現に使用することができる。特定の実施形態によると、組換え細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択することができる。
本発明の核酸は、例えば、ベクターに含まれ得る。本開示を鑑みると、当業者に知られている任意のベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターなどを使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えばプラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモータ、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカ、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモータは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモータであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当該技術分野において知られており、本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成法を使用して、本発明の実施形態に従った組換え発現ベクターを生成することができる。
一般的な態様では、本発明は、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子を同定する方法に関する。特定の実施形態では、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子を同定する方法が提供されるが、その方法は、本発明の発現系の組換え細胞を、組換え細胞が増殖する条件下で培養する工程と、組換え細胞を薬剤と接触させる工程と、薬剤が、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子であるかどうかを判定する工程と、を含み、薬剤と接触していない組換え細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲの活性と比較して、アゴニスト又はアロステリック調節因子が、α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を増加させ、アンタゴニストが、α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を低下させる。本明細書で使用するとき、アゴニストは、α９α１０型ｎＡＣｈＲの機能を増強する働きをする分子／化合物／ペプチドを指す。本明細書で使用するとき、陽性アロステリック調節因子とは、受容体を直接活性化させることなく、リガンドに対するα９α１０型ｎＡＣｈＲの反応の効果を増強する分子／化合物／ペプチドを指す。本明細書で使用する場合、用語「増強する」、「増強された」、「増加する」、又は「増加した」がα９α１０型ｎＡＣｈＲ活性に関して使用されるときには、アゴニスト又はアロステリック調節因子が投与されていない細胞において観察される対応するシグナル伝達に対して、受容体を通じたシグナル伝達が増加していることを指す。本明細書で使用するとき、アンタゴニストは、α９α１０型ｎＡＣｈＲの機能を遮断させたり、減少させたり、又は減衰させたりする働きをする分子／化合物／ペプチドを指す。ある特定の実施形態では、薬剤は、小分子又はペプチドである。
一般的な態様では、本発明はまた、α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現を増強することができるペプチドを同定することにも関する。特定の実施形態では、本方法は、α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸、及びα９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸を含む組換え細胞を培養する工程と、組換え細胞をペプチド発現ライブラリと接触させる工程と、α９α１０型ｎＡＣｈＲの発現レベルを決定する工程と、を含み、非接触組換え細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲ発現と比較して、α９α１０型ｎＡＣｈＲ発現が増加していることが、そのペプチドがα９α１０型ｎＡＣｈＲの発現を増強することを示すものである。
本発明の別のある特定の態様は、本発明の発現系と、使用説明書と、を含む、キットに関する。
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
実施形態１は、組換え細胞を含む発現系であって、
（ｉ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、
（ｉｉ）α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、
（ｉｉｉ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第３の核酸と、を含む組換え細胞を含む発現系である。
（ｉ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、
（ｉｉ）α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、
（ｉｉｉ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第３の核酸と、を含む組換え細胞を含む発現系である。
実施形態２は、組換え細胞が哺乳動物細胞である、実施形態１に記載の発現系である。
実施形態３は、哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される、実施形態２に記載の発現系である。
実施形態４は、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα９サブユニットが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の発現系である。
実施形態５は、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の発現系である。
実施形態６は、第３の核酸が、ＣＨＡＴをコード化する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の発現系である。
実施形態７は、ＣＨＡＴが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態６に記載の発現系である。
実施形態８は、組換え細胞が、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１３２Ｄ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＥＭ１００、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第４の核酸を更に含む、実施形態７に記載の発現系である。
実施形態９は、第４の核酸が、ＴＭＩＥをコード化する、実施形態８に記載の発現系である。
実施形態１０は、ＴＭＩＥが、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載の発現系である。
実施形態１１は、ＴＭＥＭ１３２Ａが、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ｃが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ｄが、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ｅが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１００が、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＴＮＦＲＳＦ１０Ａが、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の発現系である。
実施形態１２は、
（ｉ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、
（ｉｉ）α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、
（ｉｉｉ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第３の核酸と、を含む組換え細胞を含み、
その組換え細胞が、アセチルコリン（ＡＣｈ）又はメチルリカコニチン（ＭＬＡ）から選択される少なくとも１つの化合物を含む培地中で培養される、発現系である。
（ｉ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、
（ｉｉ）α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、
（ｉｉｉ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第３の核酸と、を含む組換え細胞を含み、
その組換え細胞が、アセチルコリン（ＡＣｈ）又はメチルリカコニチン（ＭＬＡ）から選択される少なくとも１つの化合物を含む培地中で培養される、発現系である。
実施形態１３は、組換え細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１２に記載の発現系である。
実施形態１４は、哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される、実施形態１３に記載の発現系である。
実施形態１５は、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα９サブユニットが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１２～１４のいずれか１つに記載の発現系である。
実施形態１６は、α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１２～１５のいずれか１つに記載の発現系である。
実施形態１７は、第３の核酸がＴＭＩＥをコード化する、実施形態１２～１６のいずれか１つに記載の発現系である。
実施形態１８は、ＴＭＩＥが、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載の発現系である。
実施形態１９は、組換え細胞が、ＣＨＡＴ、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１３２Ｄ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＥＭ１００、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第４の核酸を更に含む、実施形態１８に記載の発現系である。
実施形態２０は、ＣＨＡＴが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ａが、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ｃが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ｄが、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１３２Ｄが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＭＥＭ１００が、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＴＮＦＲＳＦ１０Ａが、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載の発現系である。
実施形態２１は、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子を同定する方法であって、
ａ．実施形態１～２０のいずれか１つに記載の発現系の組換え細胞を、組換え細胞が増殖する条件下で培養する工程と、
ｂ．組換え細胞を薬剤と接触させる工程と、
ｃ．薬剤が、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子であるかどうかを判定する工程と、を含み、薬剤と接触していない組換え細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲの活性と比較して、アゴニスト又はアロステリック調節因子が、α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を増加させ、アンタゴニストが、α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を低下させる、方法である。
ａ．実施形態１～２０のいずれか１つに記載の発現系の組換え細胞を、組換え細胞が増殖する条件下で培養する工程と、
ｂ．組換え細胞を薬剤と接触させる工程と、
ｃ．薬剤が、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子であるかどうかを判定する工程と、を含み、薬剤と接触していない組換え細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲの活性と比較して、アゴニスト又はアロステリック調節因子が、α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を増加させ、アンタゴニストが、α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を低下させる、方法である。
実施形態２２は、薬剤が、小分子又はペプチドである、実施形態２１に記載の方法である。
実施形態２３は、α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現を増強することができるタンパク質を同定する方法であって、
ａ．α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸、及びα９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸を含む、組換え細胞を培養する工程と、
ｂ．組換え細胞をタンパク質発現ライブラリと接触させる工程と、
ｃ．α９α１０型ｎＡＣｈＲの発現レベルを決定する工程と、を含み、
非接触組換え細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲ発現と比較して、α９α１０型ｎＡＣｈＲ発現が増加していることは、タンパク質がα９α１０型ｎＡＣｈＲの発現を増強することを示す方法である。
ａ．α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸、及びα９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸を含む、組換え細胞を培養する工程と、
ｂ．組換え細胞をタンパク質発現ライブラリと接触させる工程と、
ｃ．α９α１０型ｎＡＣｈＲの発現レベルを決定する工程と、を含み、
非接触組換え細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲ発現と比較して、α９α１０型ｎＡＣｈＲ発現が増加していることは、タンパク質がα９α１０型ｎＡＣｈＲの発現を増強することを示す方法である。
実施形態２４は、（ｉ）実施形態１～２０のいずれか１つに記載の発現系と、（ｉｉ）使用説明書と、を含む、キットである。
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
実施例１．細胞におけるα９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）発現の調節因子を特定するための高スループットスクリーニング。
ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を、１０％のＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクションの前に、細胞を、３８４ウェルの蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイプレートに、約８０～９０％のコンフルエンスで播種した。４時間（ｈｒ）インキュベーション後、細胞のウェルを、ヒトα９α１０型ｎＡＣｈＲと、全てのヒトタンパク質の大部分をコード化するｃＤＮＡライブラリ（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ））からの２０，０００個のクローンのうちの１つとともに、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）製）を用いて、製造者のプロトコルに従って、個別にコトランスフェクションした。２日間のインキュベーション後、細胞をアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で３回洗浄し、カルシウム５色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）社製）及び１．２５ｍＭのプロベネシドを、室温（ＲＴ）で１時間かけて与えた。３回洗浄した後、プレートをＦＬＩＰＲステージに置いた。ベースラインを確立した後、２００μＭのアセチルコリン（ＡＣｈ）を、１８０秒間にわたり、記録をしつつ適用した。
ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を、１０％のＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクションの前に、細胞を、３８４ウェルの蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイプレートに、約８０～９０％のコンフルエンスで播種した。４時間（ｈｒ）インキュベーション後、細胞のウェルを、ヒトα９α１０型ｎＡＣｈＲと、全てのヒトタンパク質の大部分をコード化するｃＤＮＡライブラリ（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ））からの２０，０００個のクローンのうちの１つとともに、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）製）を用いて、製造者のプロトコルに従って、個別にコトランスフェクションした。２日間のインキュベーション後、細胞をアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で３回洗浄し、カルシウム５色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）社製）及び１．２５ｍＭのプロベネシドを、室温（ＲＴ）で１時間かけて与えた。３回洗浄した後、プレートをＦＬＩＰＲステージに置いた。ベースラインを確立した後、２００μＭのアセチルコリン（ＡＣｈ）を、１８０秒間にわたり、記録をしつつ適用した。
これらの実験から、５つのクローンがコトランスフェクションされたα９α１０型ｎＡＣｈＲの機能的発現を可能にしたことが判明した。これらのクローンは、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）（配列番号３）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）（配列番号４）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）（配列番号５）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）（配列番号６）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）（配列番号７）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）（配列番号８）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）（配列番号９）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）（配列番号１０）をコード化した。
α９α１０型ｎＡＣｈＲ発現の調節の特徴を更に明らかにするために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、α９α１０型ｎＡＣｈＲと、ＣＨＡＴ、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１００、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１３２Ｄ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａのそれぞれとを、個別に及び組み合わせてコトランスフェクションした（表２）。α９α１０型ｎＡＣｈＲとＴＭＩＥとで又はα９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴとでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、２００μＭのＡＣｈを適用することで、有意なＦＬＩＰＲ反応を誘発した（図１）。対照的に、α９α１０型ｎＡＣｈＲ及びベクターＤＮＡのトランスフェクションでは、そのような反応の誘発はなかった。更に、ＴＭＩＥ及びＣＨＡＴタンパク質の発現は協同して、α９α１０型ｎＡＣｈＲからの機能反応を増強した（図１）。
実施例２．α９α１０アセチルコリンの様々な濃度に対する、ｎＡＣｈＲの用量反応
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴ、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＴＭＩＥ、又はα９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴとＴＭＩＥとで、実施例１に記載のようにコトランスフェクションした。２日間のインキュベーション後、細胞をアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で３回洗浄し、カルシウム５色素及び１．２５ｍＭのプロベネシドを、室温（ＲＴ）で１時間かけて与えた。３回洗浄した後、プレートをＦＬＩＰＲステージに置いた。ベースラインを確立した後、様々に異なる用量のアセチルコリン（ＡＣｈ）を、１８０秒間にわたり、記録をしつつ適用した。ＡＣｈに対する最大ＦＬＩＰＲ反応をプロットした（図２Ａ～図２Ｃ）。蝸牛有毛細胞又は卵母細胞で発現するα９α１０についての文献（Ｅｌｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）と一致するが、アゴニストＡＣｈは、約２～４μＭのＥＣ５０を有している（表３）。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴ、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＴＭＩＥ、又はα９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴとＴＭＩＥとで、実施例１に記載のようにコトランスフェクションした。２日間のインキュベーション後、細胞をアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で３回洗浄し、カルシウム５色素及び１．２５ｍＭのプロベネシドを、室温（ＲＴ）で１時間かけて与えた。３回洗浄した後、プレートをＦＬＩＰＲステージに置いた。ベースラインを確立した後、様々に異なる用量のアセチルコリン（ＡＣｈ）を、１８０秒間にわたり、記録をしつつ適用した。ＡＣｈに対する最大ＦＬＩＰＲ反応をプロットした（図２Ａ～図２Ｃ）。蝸牛有毛細胞又は卵母細胞で発現するα９α１０についての文献（Ｅｌｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）と一致するが、アゴニストＡＣｈは、約２～４μＭのＥＣ５０を有している（表３）。
実施例３．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲの薬理学的特性評価。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴ、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＴＭＩＥ、又はα９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴとＴＭＩＥとで、実施例１に記載のようにコトランスフェクションした。２日間のインキュベーション後、細胞をアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で３回洗浄し、カルシウム５色素及び１．２５ｍＭのプロベネシドを、室温（ＲＴ）で１時間かけて与えた。３回洗浄した後、プレートをＦＬＩＰＲステージに置いた。ベースラインを確立した後、α９α１０型ｎＡＣｈＲアンタゴニスト（ニコチン、アトロピン、ストリキニーネ、又はメチルリカコニチン（ＭＬＡ））の様々な濃度の存在下で、２００μＭのＡＣｈで、１８０秒間にわたって反応を誘発した。ＡＣｈに対する最大ＦＬＩＰＲ反応をプロットした（図３Ａ～図３Ｃ）。これらの用量反応曲線は、毛髪細胞及び卵母細胞中のα９α１０型ｎＡＣｈＲ（Ｅｌｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）と一致する、ＭＬＡ＞ストリキニーネ＞アトロピン＞ニコチンという効能ランク順を示した（表４）。このプロファイルは、任意の他の既知の受容体とは対照的に、α９α１０型ｎＡＣｈＲに固有のものである（Ｅｌｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴ、α９α１０型ｎＡＣｈＲとＴＭＩＥ、又はα９α１０型ｎＡＣｈＲとＣＨＡＴとＴＭＩＥとで、実施例１に記載のようにコトランスフェクションした。２日間のインキュベーション後、細胞をアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で３回洗浄し、カルシウム５色素及び１．２５ｍＭのプロベネシドを、室温（ＲＴ）で１時間かけて与えた。３回洗浄した後、プレートをＦＬＩＰＲステージに置いた。ベースラインを確立した後、α９α１０型ｎＡＣｈＲアンタゴニスト（ニコチン、アトロピン、ストリキニーネ、又はメチルリカコニチン（ＭＬＡ））の様々な濃度の存在下で、２００μＭのＡＣｈで、１８０秒間にわたって反応を誘発した。ＡＣｈに対する最大ＦＬＩＰＲ反応をプロットした（図３Ａ～図３Ｃ）。これらの用量反応曲線は、毛髪細胞及び卵母細胞中のα９α１０型ｎＡＣｈＲ（Ｅｌｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）と一致する、ＭＬＡ＞ストリキニーネ＞アトロピン＞ニコチンという効能ランク順を示した（表４）。このプロファイルは、任意の他の既知の受容体とは対照的に、α９α１０型ｎＡＣｈＲに固有のものである（Ｅｌｇｏｙｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
実施例４．α９α１０型ｎＡＣｈＲの発現に対する、ＡＣｈ又はＭＬＡによるプレインキュベーションの効果。
ＡＣｈの生合成酵素であるＣＨＡＴがヒットとして同定されることは、ＡＣｈ自体がα９α１０型ｎＡＣｈＲの機能的発現を可能にし得ることを示唆していた。この仮説をテストするために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、α９α１０型ｎＡＣｈＲ及びＴＭＩＥで、実施例１に記載のようにコトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、ＡＣｈ又はＭＬＡのいずれかを様々な濃度でウェルに添加し、細胞を更に２４時間インキュベートした。細胞をアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で３回洗浄し、カルシウム５色素及び１．２５ｍＭのプロベネシドを、室温（ＲＴ）で１時間かけて与えた。３回洗浄した後、プレートをＦＬＩＰＲステージに置いた。次いで、２００μＭのＡＣｈにより１８０秒間にわたり誘発したＦＬＩＰＲ反応を記録した。
ＡＣｈの生合成酵素であるＣＨＡＴがヒットとして同定されることは、ＡＣｈ自体がα９α１０型ｎＡＣｈＲの機能的発現を可能にし得ることを示唆していた。この仮説をテストするために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、α９α１０型ｎＡＣｈＲ及びＴＭＩＥで、実施例１に記載のようにコトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、ＡＣｈ又はＭＬＡのいずれかを様々な濃度でウェルに添加し、細胞を更に２４時間インキュベートした。細胞をアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で３回洗浄し、カルシウム５色素及び１．２５ｍＭのプロベネシドを、室温（ＲＴ）で１時間かけて与えた。３回洗浄した後、プレートをＦＬＩＰＲステージに置いた。次いで、２００μＭのＡＣｈにより１８０秒間にわたり誘発したＦＬＩＰＲ反応を記録した。
ＡＣｈ又はＭＬＡのいずれかで２４時間プレインキュベーションしたところ、ＡＣｈ誘発反応が増強された。ＭＬＡは、このプレインキュベーションにより媒介されるα９α１０反応の発現上昇においてＡＣｈよりも効能があった（図４）。
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
Claims (24)
- 組換え細胞を含む発現系であって、
（ｉ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、
（ｉｉ）α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、
（ｉｉｉ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第３の核酸と、
を含む、組換え細胞を含む、発現系。 - 前記組換え細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１に記載の発現系。
- 前記哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の発現系。
- 前記α９α１０型ｎＡＣｈＲの前記α９サブユニットが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の発現系。
- 前記α９α１０型ｎＡＣｈＲの前記α１０サブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の発現系。
- 前記第３の核酸が、ＣＨＡＴをコード化する、請求項１～５のいずれか一項に記載の発現系。
- 前記ＣＨＡＴが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の発現系。
- 前記組換え細胞が、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１３２Ｄ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＥＭ１００、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第４の核酸を更に含む、請求項７に記載の発現系。
- 前記第４の核酸が、ＴＭＩＥをコード化する、請求項８に記載の発現系。
- 前記ＴＭＩＥが、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の発現系。
- 前記ＴＭＥＭ１３２Ａが、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＭＥＭ１３２Ｃが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＭＥＭ１３２Ｄが、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＭＥＭ１３２Ｅが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＭＥＭ１００が、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦＲＳＦ１０Ａが、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の発現系。
- 組換え細胞を含む発現系であって、
（ｉ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸と、
（ｉｉ）α９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸と、
（ｉｉｉ）コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）、膜貫通型内耳発現タンパク質（ＴＭＩＥ）、膜貫通型タンパク質１３２Ａ（ＴＭＥＭ１３２Ａ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｃ（ＴＭＥＭ１３２Ｃ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｄ（ＴＭＥＭ１３２Ｄ）、膜貫通型タンパク質１３２Ｅ（ＴＭＥＭ１３２Ｅ）、膜貫通型タンパク質１００（ＴＭＥＭ１００）、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第３の核酸と、
を含む、組換え細胞を含み、
前記組換え細胞が、アセチルコリン（ＡＣｈ）又はメチルリカコニチン（ＭＬＡ）から選択される少なくとも１つの化合物を含む培地中で培養される、発現系。 - 前記組換え細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の発現系。
- 前記哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の発現系。
- 前記α９α１０型ｎＡＣｈＲの前記α９サブユニットが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の発現系。
- 前記α９α１０型ｎＡＣｈＲの前記α１０サブユニットが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の発現系。
- 前記第３の核酸が、ＴＭＩＥをコード化する、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の発現系。
- 前記ＴＭＩＥが、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の発現系。
- 前記組換え細胞が、ＣＨＡＴ、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１３２Ｄ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＥＭ１００、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコード化する第４の核酸を更に含む、請求項１８に記載の発現系。
- 前記ＣＨＡＴが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＭＥＭ１３２Ａが、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＭＥＭ１３２Ｃが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＭＥＭ１３２Ｄが、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＭＥＭ１３２Ｄが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＭＥＭ１００が、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦＲＳＦ１０Ａが、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の発現系。
- α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子を同定する方法であって、
（ａ）請求項１～２０のいずれか一項に記載の発現系の組換え細胞を、前記組換え細胞が増殖する条件下で培養する工程と、
（ｂ）前記組換え細胞を薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）前記薬剤が、α９α１０型ｎＡＣｈＲのアゴニスト、アンタゴニスト、又は陽性アロステリック調節因子であるかどうかを判定する工程と、
を含み、
薬剤と接触していない組換え細胞における前記α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性と比較して、アゴニスト又はアロステリック調節因子が前記α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を増加させ、アンタゴニストが前記α９α１０型ｎＡＣｈＲの活性を減少させる、方法。 - 前記薬剤が、小分子又はペプチドである、請求項２１に記載の方法。
- α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現を増強することができるタンパク質を同定する方法であって、
（ａ）α９α１０型ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα９サブユニットをコード化する第１の核酸、及びα９α１０型ｎＡＣｈＲのα１０サブユニットをコード化する第２の核酸を含む組換え細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記組換え細胞をタンパク質発現ライブラリと接触させる工程と、
（ｃ）α９α１０型ｎＡＣｈＲの発現レベルを決定する工程と、
を含み、
非接触組換え細胞におけるα９α１０型ｎＡＣｈＲ発現と比較して、α９α１０型ｎＡＣｈＲ発現が増強していることが、前記タンパク質がα９α１０型ｎＡＣｈＲの発現を増強することを示す、方法。 - 請求項１～２０のいずれか一項に記載の発現系と、（ｉｉ）使用説明書と、を含む、キット。
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