JP2022531390A - チーズおよびヨーグルト様組成物ならびに関連する方法 - Google Patents

Abstract

チーズおよびヨーグルト組成物、ならびに１種または複数の組換えタンパク質を使用してそれらを作製する方法が、本明細書に提供される。一部の態様では、チーズ組成物が本明細書に記載されている。チーズ組成物は、凝固したコロイドを含むことができ、凝固したコロイドは、ミセル形態で会合したアルファカゼインタンパク質およびカッパーカゼインタンパク質を含む。アルファカゼインタンパク質およびカッパーカゼインタンパク質のうち少なくとも一方が組換えにより産生されてよく；チーズ組成物は、ベータカゼインタンパク質を含有しなくてよい。

Description

相互参照
本出願は、２０１９年５月２日に出願された米国特許仮出願第６２／８４２，４６９号に基づく利益を主張し、その全体を参照により本明細書に援用する。

発明の背景
クリーンフード（ｃｌｅａｎ ｆｏｏｄ）スペースは、植物ベースの食品および細胞ベースの食品の両方で構成される。細胞ベースの食品は、屠殺して作られた肉に取って代わる、筋肉および脂肪細胞の培養、ならびに組換え動物タンパク質を発現させて乳製品および卵等の他の動物製品に取って代わる、生物工学により作られた生物の培養を含む大きく包括的な用語である。現在の動物食品生産の効率の悪さおよび持続不可能性から、動物タンパク質の代用供給源を見出す必要が生じる。

チーズは、世界的に３番目に持続不可能な動物製品であり（製品１ｋｇ当たりの温室効果ガス排出を測定する場合）、乳製品のチーズの消費は、この１０年間、市場に導入された植物ベースの代替物によって減速されていない。それどころか、モッツァレラチーズ消費は、米国および発展途上市場において前年比で伸びている。現在のチーズ代替物は、それらのカゼインタンパク質が欠如していることにより、乳製品のチーズの機能性、栄養および食味に匹敵しない。

このスペースにおける全企業が現在のところ共有している共通の特質の１つは、ペースおよび手頃なコストで調製することの困難性である。組換えタンパク質産生は、非常に費用と時間がかかる可能性がある。これは部分的には、タンパク質精製の下流コストが、全体的なタンパク質産生処理コストの最大８０％に達し得ることと、タンパク質収率の低下が、産物の純度に依存して７０％もの大きさとなり得ることが原因である。

発明の要旨
本開示の追加的な態様および利点は、当業者であれば、本開示の単なる説明的な実施形態が示され記載されている次の詳細な説明から、容易に明らかとなるであろう。了解される通り、本開示は、他の実施形態および異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明らかな点で修正が可能であり、これらは全て、本開示から逸脱することはない。したがって、図面および記載は、制限的ではなく説明的な性質のものとして考慮されるべきである。

一部の態様では、チーズ組成物が本明細書に記載されている。チーズ組成物は、凝固したコロイドを含むことができ、凝固したコロイドは、ミセル形態で会合したアルファカゼインタンパク質およびカッパーカゼインタンパク質を含む。アルファカゼインタンパク質およびカッパーカゼインタンパク質のうち少なくとも一方が組換えにより産生されてよく；チーズ組成物は、ベータカゼインタンパク質を含有しなくてよい。

一部の実施形態では、組換えにより産生されたカゼインは、細菌宿主細胞から産生され得る。

一部の実施形態では、アルファおよびカッパーカゼインタンパク質は両方共に、組換えにより産生される。

一部の実施形態では、組換えにより産生されたアルファおよびカッパーカゼインタンパク質は、１つまたは複数の細菌宿主細胞から産生される。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質は、ネイティブアルファカゼインと比較して、翻訳後修飾が完全にないかまたは実質的に低減されていてよい。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質は、ネイティブアルファカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかまたは実質的に低減されていてよい。

一部の実施形態では、カッパーカゼインタンパク質は、ネイティブカッパーカゼインと比較して、翻訳後修飾が完全にないかまたは実質的に低減されていてよい。

一部の実施形態では、カッパーカゼインタンパク質は、ネイティブカッパーカゼインと比較して、グリコシル化が完全にないかまたは実質的に低減されていてよい。

一部の実施形態では、カッパーカゼインタンパク質は、ネイティブカッパーカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかまたは実質的に低減されていてよい。

一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、乳酸球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．６８０３ならびにＥ．ｃｏｌｉからなる群から選択され得る。

一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、組換えにより産生されたカゼインタンパク質を分泌する。

一部の実施形態では、細菌宿主は、組換えにより産生されたカゼインタンパク質を細胞内に保持する。

一部の実施形態では、細菌宿主細胞における組換えにより産生されたタンパク質の産生は、誘導性プロモーターによって調節され得る。

一部の実施形態では、細菌宿主細胞における組換えにより産生されたタンパク質の産生は、構成的プロモーターによって調節され得る。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質のカッパーカゼインタンパク質に対する比は、約１：１～約１５：１の間であり得る。一部の実施形態では、比は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１または１５：１であり得る。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質は、アルファｓ１またはアルファｓ２であり得る。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質は、配列番号１～２６または少なくとも８０％配列相同性を有するバリアントから選択されるタンパク質配列によってコードされ得る。

一部の実施形態では、カッパーカゼインタンパク質は、配列番号２７～４０または少なくとも８０％配列相同性を有するバリアントから選択されるタンパク質配列によってコードされ得る。

一部の実施形態では、チーズ組成物は、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍの間または約１００ｎｍ～約５００ｎｍの間のサイズのミセル形態の集団を含む。

一部の実施形態では、集団のミセル形態の一部は、１００ｎｍ未満または約１０ｎｍ～１００ｎｍの間のサイズであり得る。

一部の実施形態では、チーズは、カルシウム塩、クエン酸塩およびリン酸塩からなる群から選択される少なくとも１種の塩を含むことができる。一部の実施形態では、チーズは、いかなる追加的な乳製品由来のタンパク質も欠いている。

一部の実施形態では、チーズは、いかなる動物由来の乳製品タンパク質も欠いている。

一部の実施形態では、チーズは、約０％～約５０％の間の脂肪含量を有し、脂肪は、植物ベースの供給源に由来することができる。

一部の実施形態では、チーズは、約０％～約１０％の間の糖含量を有し、糖は、植物ベースの供給源に由来することができる。

一部の実施形態では、チーズは、加熱されると、溶けることおよび褐変することが可能となり得る。

一部の実施形態では、チーズは、パスタ・フィラータ様チーズ、パニール、クリームチーズおよびカッテージチーズからなる群から選択され得る。

一部の実施形態では、チーズは、モッツァレラであり得る。

一部の実施形態では、チーズは、チェダー、スイス、ブリー、カマンベール、フェタ、ハルーミ（ｈａｌｌｏｕｍｉ）、ゴーダ、エダム、チェダー、マンチェゴ、スイス、コルビー、ミュンスター、ブルーチーズまたはパルメザンからなる群から選択される熟成したまたは成熟したチーズであり得る。

一部の実施形態では、チーズの水分保持は、４０～６５％であり得る。

一部の実施形態では、チーズのテクスチャー（ｔｅｘｔｕｒｅ）は、動物由来の乳製品のチーズに匹敵し得る。

一部の実施形態では、チーズの硬度は、動物由来の乳製品のチーズに匹敵し得る。

一部の態様では、食用組成物を産生する方法が本明細書に記載されている。食用組成物を産生するための方法は、アルファカゼインタンパク質およびカッパーカゼインタンパク質が液体コロイドにおいてミセル形態を形成する条件下で、組換えアルファカゼインタンパク質、組換えカッパーカゼインタンパク質および少なくとも１種の塩を組み合わせるステップであって、ミセル形態が、ベータカゼインタンパク質を含まない、ステップと、液体コロイドを第１の条件に供して、凝固物を形成するステップとを含むことができる。

一部の実施形態では、第１の条件は、酸の添加または微生物による液体コロイドの酸性化であり得る。

一部の実施形態では、本方法は、凝固物を熱水処置に供し、必要に応じて伸展して、フィラータ型チーズを形成するステップをさらに含む。

一部の実施形態では、本方法は、凝固物をレンネット処理剤（ｒｅｎｎｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）に供して、レンネット処理された（ｒｅｎｎｅｔｔｅｄ）カードを形成するステップをさらに含む。

一部の実施形態では、レンネット処理剤は、微小生物に由来するキモシン酵素であり得る。

一部の実施形態では、本方法は、レンネット処理されたカードを熟成および成熟させて、チーズ様組成物を形成するステップをさらに含む。

一部の実施形態では、本方法は、レンネット処理されたカードを熱水処置に供し、必要に応じて伸展して、フィラータ型チーズを形成するステップをさらに含む。

一部の実施形態では、食用組成物は、ベータカゼインタンパク質を含まない。

一部の実施形態では、食用組成物は、いかなる追加的な乳製品由来のタンパク質も含まない。

一部の実施形態では、食用組成物は、いかなる動物由来の乳製品タンパク質も含まない。

一部の実施形態では、組換えにより産生されたアルファおよびカッパーカゼインタンパク質は、１つまたは複数の細菌宿主細胞から産生される。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質は、ネイティブアルファカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかまたは実質的に低減されていてよい。

一部の実施形態では、カッパーカゼインタンパク質は、ネイティブカッパーカゼインと比較して、グリコシル化が完全にないかまたは実質的に低減されていてよい。

一部の実施形態では、カッパーカゼインタンパク質は、ネイティブカッパーカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかまたは実質的に低減されていてよい。

一部の実施形態では、本方法は、翻訳後修飾をモジュレートする酵素によるアルファカゼインタンパク質および／またはカッパーカゼインの処置を含まない。

一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．６８０３ならびにＥ．ｃｏｌｉからなる群から選択され得る。

一部の実施形態では、１つまたは複数の細菌宿主細胞は、組換えにより産生されたアルファカゼインタンパク質およびカッパーカゼインタンパク質を分泌する。

一部の実施形態では、１つまたは複数の細菌宿主細胞は、組換えにより産生されたアルファカゼインタンパク質およびカッパーカゼインタンパク質を保持する。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質およびカッパーカゼインタンパク質の一方または両方の産生は、誘導性プロモーターによって調節され得る。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質およびカッパーカゼインタンパク質の一方または両方の産生は、構成的プロモーターによって調節され得る。

一部の実施形態では、ミセル形態におけるアルファカゼインタンパク質のカッパーカゼインタンパク質に対する比は、約１：１～約１５：１の間であり得る。

一部の実施形態では、比は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１または１５：１であり得る。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質は、アルファｓ１またはアルファｓ２であり得る。

一部の実施形態では、アルファカゼインタンパク質は、配列番号１～２６または少なくとも８０％配列相同性を有するバリアントから選択されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。

一部の実施形態では、カッパーカゼインタンパク質は、配列番号２７～４０または少なくとも８０％配列相同性を有するバリアントから選択されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。

一部の実施形態では、液体コロイドは、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍの間または約１００ｎｍ～約５００ｎｍの間のサイズのミセル形態の集団を含む。

一部の実施形態では、集団のミセル形態の一部は、１００ｎｍ未満または約１０ｎｍ～１００ｎｍの間のサイズであり得る。

一部の実施形態では、液体コロイドにおける塩は、カルシウム塩であり得る。

一部の実施形態では、液体コロイドを形成するステップは、リン酸塩および／またはクエン酸塩の添加をさらに含む。

レンネット処理凝固時間が、１分～６時間であり得る、請求項３３に記載の方法。

一部の態様では、液体コロイドミセル組成物が本明細書に記載されている。液体コロイドは、ミセル形態を含むことができ、ミセル形態は、組換えアルファカゼインタンパク質、組換えカッパーカゼインタンパク質および少なくとも１種の塩を含み、アルファカゼインタンパク質、カッパーカゼインタンパク質またはこれらの組合せは、翻訳後修飾が完全にないかまたは実質的に低減されている。

一部の実施形態では、（ａ）アルファカゼインタンパク質は、ネイティブアルファカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかもしくは実質的に低減されていてよい、または（ｂ）カッパーカゼインタンパク質は、ネイティブカッパーカゼインと比較して、グリコシル化が完全にないかもしくは実質的に低下されていてよい、または（ｃ）カッパーカゼインタンパク質は、ネイティブカッパーカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかもしくは実質的に低減されていてよい、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）をまとめて含む。

一部の実施形態では、ミセル形態は、ベータカゼインタンパク質を含まない。

一部の実施形態では、ヨーグルト組成物は、本明細書に記載されている方法を使用して形成され得る。ヨーグルトは、本明細書に記載されている液体コロイドを使用して形成され得る。本方法は、液体コロイドを加熱し、次いで冷却するステップと、微生物により液体コロイドを酸性化するステップとを含むことができる。微生物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、乳酸桿菌またはビフィズス菌のうち１種または複数を含むことができる。

一部の実施形態では、ヨーグルト組成物は、本明細書に記載されている方法によって形成され得、αカゼインタンパク質は、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ウマまたはラクダαカゼインタンパク質のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、ヨーグルト組成物は、本明細書に記載されている方法によって形成され得、κカゼインタンパク質は、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ウマまたはラクダκカゼインタンパク質のアミノ酸配列を含む。

一部の態様では、濃縮物が、少なくとも１種の組換えカゼインタンパク質を含み、第１の成長培地が、少なくとも１種の組換えカゼインタンパク質を発現および分泌する組換え微生物の成長の支持に適合性であり得、第１の成長培地が、非乳製品非動物由来のセラム（ｓｅｒｕｍ）を含む、第１の成長培地の濃縮物と、少なくとも１種の乳酸菌種とを含む組成物であって、少なくとも１種の乳酸菌種の成長に適合性であり得る組成物が本明細書に提供され得る。

一部の実施形態では、非乳製品非動物由来のセラムを含む第１の成長培地を含む組成物であって、第１の成長培地が、少なくとも１種の組換えカゼインタンパク質を発現および分泌する組換え微生物の成長の支持に適合性であり得、第１の成長培地の濃縮物が、少なくとも１種の乳酸菌種の成長およびチーズ様稠度の形成に適合性であり得る、組成物が本明細書に提供され得る。

一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１種の組換えカゼインタンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１種の組換えカゼインタンパク質は、アルファカゼイン、ベータカゼインおよびカッパーカゼインからなる群から選択され得る。

一部の実施形態では、組成物は、２種の組換えカゼインタンパク質を含む。

一部の実施形態では、第１の成長培地の濃縮物は、ミセルを含み、ミセルは、少なくとも１種の組換えカゼインタンパク質を含む。

一部の実施形態では、組換え微生物は、グラム陽性細菌であり得る。

一部の実施形態では、乳酸菌の種は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．であり得る。

一部の実施形態では、第１の成長培地は、定常期近傍までのまたは定常期までの組換え微生物の成長を支持することが可能となり得る。

一部の態様では、発酵された乳製品様製品が本明細書に記載され得る。発酵された乳製品様製品は、ハードチーズ、ソフトチーズ、カードチーズ、チーズスプレッドおよびヨーグルトから選択される製品であり得る。

一部の態様では、発酵された乳製品様製品を作製するための方法であって、非乳製品非動物由来のセラムにおいて組換えカゼインタンパク質を発現する組換え微生物を成長させるステップであって、カゼインタンパク質が、セラム中に分泌され得る、ステップと、セラムから微生物を除去するステップと、セラムを少なくとも１種の乳酸菌種と組み合わせるステップとを含み、それによって、インキュベーション期間後に、セラムおよび少なくとも１種の乳酸菌種の組合せが、発酵された乳製品様製品を創出する、方法が本明細書に記載され得る。

一部の実施形態では、セラムは、乳酸菌の添加に先立ち濃縮され得る。

一部の実施形態では、組換え微生物は、グラム陽性細菌であり得る。

一部の実施形態では、組換え微生物は、酵母であり得る。

一部の実施形態では、組換え微生物は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．であり得る。

一部の実施形態では、成長させるステップは、定常期近傍までまたは定常期まで組換え微生物を成長させるステップを含む。

一部の実施形態では、発酵された乳製品様製品は、ハードチーズ、ソフトチーズ、カードチーズ、チーズスプレッドおよびヨーグルトからなる群から選択され得る。
参照による援用

本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれていると特にかつ個々に指し示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の新規特色は、添付の特許請求の範囲に詳細に示されている。本発明の特色および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用されている説明的な実施形態を示す次の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより得られるであろう。

図１は、産生プロセスの基礎技術の図である。

図２は、チーズ産生のための例示的なプロトコールを図解する。

図３は、発現系を図解する。

図４Ａは、ヨーグルト様ゲルおよびカードを示す。

図４Ｂは、細菌スターター培養物を使用した微小生物による酸性化により、ミセルカゼイン液体コロイド（ラクトースを補充）（左）および無脂肪乳（右）から作製されたカードを図解する。堅く、カット可能であり、かつ粘着性のカードが、両方の事例において作製された。左下：細菌スターター培養物を使用した微小生物による酸性化により、脱臭（ｄｅｆｌａｖｏｕｒｅｄ）ヤシ油で乳化されたミセル液体コロイド（ラクトースを補充）から作製されたカードの例。

図４Ｃは、細菌スターター培養物対クエン酸を使用して微小生物カゼイン液体コロイド対無脂肪乳から作製されたモッツァレラ様チーズに関する、チーズおよびカードの堅さ（応力緩和検査において使用されるｇで表す力）および緩和を図解する。

図５Ａは、モッツァレラチーズのテクスチャープロファイルおよび硬度／堅さ（ｇで表す力）を図解する。

図５Ｂは、３点識別（ｔｒｉａｎｇｌｅ）検査テイスティングのための、「ピザ」の上で溶けて盛り付られた、ミセルカゼインから作製されたモッツァレラの試料を図解する。

図６は、様々な塩条件においてアルファカゼイン、ベータカゼインおよびカッパーカゼインを使用して誘導されたカゼインミセル（黒色）およびサブミセル（ｓｕｂｍｉｃｅｌｌｅ）（灰色）の平均ミセル直径（ｎｍ単位）を図解する。検出されたミセル（黒色）およびサブミセル（灰色）ピークの相対的強度比率を、弧の（ａｒｃｈ）サイズ／角度として表す。

図７Ａは、様々な塩条件においてアルファカゼイン、ベータカゼインおよびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルで構成される液体ミルク様コロイドを図解する。

図７Ｂは、クエン酸による酸性化（上段）および組換えキモシンによるレンネット処理凝固（中段）に供された液体ミルク様コロイドを示し、これらは、乳製品カードを生じた（下段、Ｘにおいて、データは収集されなかった）。試料ＢおよびＦは、酸性化およびレンネット処理の際に沈殿し、ウェルの底にカードを形成した。他の全試料は、酸性化の際に懸濁液中に留まり、全体にわたってカードを形成した。次に、カードを熱水に浸漬し、伸展してパスタ・フィラータチーズボールとした。

図８は、様々な塩条件においてアルファカゼインおよびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセル（黒色）およびサブミセル（灰色）の平均ミセル直径（ｎｍ単位）を示す。検出されたミセル（黒色）およびサブミセル（灰色）ピークの相対的強度比率を、弧のサイズ／角度として表す。

図９Ａは、アルファカゼインおよびカッパーカゼインからアセンブルされたカゼインミセルの液体ミルク様コロイドから作製されたチーズの硬度（加えられたｇで表す力）を示す。カゼイン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃａｓｅｉｎａｔｅ）（混合ミルクカゼインの供給源）を対照として使用した。エラーバーは、３回繰り返した試料における標準偏差を表す。

図９Ｂは、アルファカゼインおよびカッパーカゼインからアセンブルされたカゼインミセルの液体ミルク様コロイドから作製されたチーズの写真を示す（３回繰り返した）。

図１０は、クエン酸による酸性化（上段）および組換えキモシンによるレンネット処理凝固に供された、様々な塩条件において低リン酸化アルファカゼイン（酵素により脱リン酸化された）およびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルの液体ミルク様コロイドを示し、これらは、乳製品カードを生じた（下段、Ｘにおいて、カードは、チーズ作製のために既に使用された）。試料Ｆは、酸性化およびレンネット処理の際に沈殿し、ウェルの底にカードを形成した。他の全試料は、酸性化の際に懸濁液中に留まり、全体にわたってカードを形成した。次に、カードを熱水に浸漬し、伸展してパスタ・フィラータチーズボールとした。

図１１は、様々な塩条件において低リン酸化アルファカゼイン（酵素により脱リン酸化された）およびカッパーカゼインからアセンブルされたカゼインミセルの液体ミルク様コロイドから作製されたチーズの写真を示す。

図１２は、ミルク様タンパク質濃度（２．８％総カゼイン、３．２％総カゼイン）で、塩条件において低リン酸化（酵素により脱リン酸化された）アルファカゼインおよびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセル（黒色）およびサブミセル（灰色）の平均ミセル直径（ｎｍ単位）を示す。検出されたミセル（黒色）およびサブミセル（灰色）ピークの相対的強度比率を、弧のサイズ／角度として表す。

図１３は、アルファカゼインおよび脱グリコシル化カッパーカゼイン、またはアルファカゼインおよびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルで構成される液体ミルク様コロイドを示す。アルファカゼインが一定に保たれる一方で、カッパーカゼインは、２倍および３倍に増加される。

図１４は、アルファカゼインおよび脱グリコシル化カッパーカゼイン、またはアルファカゼインおよびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルの平均ミセル直径（ｎｍ単位）を示す。アルファカゼインが一定に保たれる一方で、カッパーカゼインは、２倍および３倍に増加される。エラーバーは、３回繰り返した試料における標準偏差を表す。

図１５は、アルファカゼインおよび脱グリコシル化カッパーカゼイン、またはアルファカゼインおよびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルで構成される液体コロイドの酸性化およびレンネット処理から作製されたカードを示す。アルファカゼインが一定に保たれる一方で、カッパーカゼインは、２倍および３倍に増加される。凝集物を形成した左上試料を除いて、形成された全カードは、形を崩さずにひっくり返すのに十分なほど強かった。

図１６は、アルファカゼインおよび脱グリコシル化カッパーカゼイン、またはアルファカゼインおよびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルのカードから作製されたチーズの湿重量における収量（ｗｅｔ ｙｉｅｌｄ）（ｍｇ単位）を示す。アルファカゼインが一定に保たれる一方で、カッパーカゼインは、２倍および３倍に増加される。チーズ（モッツァレラ）は、カードを熱水に浸漬し、伸展し、チーズボールに成形することにより作製された。

図１７は、低リン酸化アルファカゼイン（酵素により脱リン酸化された）および脱グリコシル化カッパーカゼイン、または低リン酸化アルファカゼイン（酵素により脱リン酸化された）およびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルの平均ミセル直径（ｎｍ単位）を示す。アルファカゼインが一定に保たれる一方で、カッパーカゼインは、２倍に増加される。エラーバーは、３回繰り返した試料における標準偏差を表す。

図１８は、組換えアルファ－Ｓ１－カゼイン（脱リン酸化された）およびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルの平均ミセル直径（ｎｍ単位）を示す。アルファ－Ｓ１－カゼインが一定に保たれる一方で、カッパーカゼインは、２倍に増加される。エラーバーは、３回繰り返した試料における標準偏差を表す。

図１９は、組換えアルファ－Ｓ１－カゼイン（脱リン酸化された）およびカッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルのカードから作製されたチーズの湿重量における収量（ｍｇ単位）を示す。アルファカゼインが一定に保たれる一方で、カッパーカゼインは、２倍に増加される。チーズ（モッツァレラ）は、カードを熱水に浸漬し、伸展し、チーズボールに成形することにより作製された。

図２０は、組換えアルファ－Ｓ１－カゼイン（脱リン酸化された）および脱グリコシル化カッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルの平均ミセル直径（ｎｍ単位）を示す。アルファ－Ｓ１－カゼインが一定に保たれる一方で、カッパーカゼインは、２倍に増加される。エラーバーは、３回繰り返した試料における標準偏差を表す。

図２１は、組換えアルファ－Ｓ１－カゼイン（脱リン酸化された）および脱グリコシル化カッパーカゼインを使用して誘導された、カゼインミセルのカードから作製されたチーズの湿重量における収量（ｍｇ単位）を示す。アルファカゼインが一定に保たれる一方で、カッパーカゼインは、２倍に増加される。チーズ（モッツァレラ）は、カードを熱水に浸漬し、伸展し、チーズボールに成形することにより作製された。

本発明の様々な実施形態が、本明細書に示され記載されてきたが、当業者には、そのような実施形態が、単なる例として提供されていることが明らかとなるであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変種、変化および置換に気付くことができる。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替を用いることができることを理解されたい。

酪農業は、３千３百億ドルの価値があるが、組換え乳製品タンパク質を使用して、クリーンな乳製品の解決策（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）について研究が行われる必要がある。乳製品のチーズおよびヨーグルトは、１グラム当たりに必要とされる資源の観点から、非効率的な乳製品であるため、また、植物ベースの成分のみから正確に再現することが最も困難な乳製品であるため、組換えチーズおよび組換えヨーグルトの方法および組成物が本明細書に提示されている。

乳製品のチーズまたはヨーグルトにその特有の特徴を与える構成成分は、ミルクにおいてミセルを形成するカゼインタンパク質である。ミセルは、コロイド中心において不溶性リン酸カルシウムと相互作用する４種のカゼインタンパク質（アルファ－ｓ１－カゼイン、アルファ－ｓ２－カゼイン、ベータカゼインおよびカッパーカゼイン）で構成されるタンパク質コロイドである。ミルクにキモシンが添加されると、ミルクにおけるミセルは、互いに引き合う。これによりカードが形成され、次いでカードが使用されて、全チーズの９９％を作製する。本開示は、組換えアルファおよびカッパーカゼインを使用して、ベータカゼインを添加せずに、ミセルおよびその後のチーズを生成することができるという発見に基づく。ヨーグルトの場合、ヨーグルト産生に公知の細菌のスターター培養物を使用して、液体コロイドを含むミセルの酸性化を行うことができる。本開示は、組換えアルファおよびカッパーカゼインを使用して、ベータカゼインを添加せずに生成することができるミセルおよびその後のヨーグルトについても記載する。

組換えアルファカゼインおよびカッパーカゼインは、微小生物、例えば、グラム陽性細菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓならびにグラム陰性モデル生物Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌において発現され得る。このような組換えタンパク質を植物ベースの培地（ミネラル、脂肪、糖およびビタミン）と組み合わせて、動物由来の乳製品のチーズと同様の挙動、臭い、食味、外見および感触のチーズを作製することができる。組換えチーズは、ｉ）ラクトース、ｉｉ）コレステロール、ｉｉｉ）飽和脂肪（それが食味および食感に影響を与える程度に依存する）およびｉｖ）ホエータンパク質（多くの場合、チーズ製造業者は、チーズ作製プロセスにおいてカゼインカードからホエーを完全に除去することができない）を有しなくてよい。

方法は、少ない精製および下流処理を要求し得る、組換えタンパク質を産生するステップを含むことができる。細菌（標的タンパク質を発現している）は、チーズ産生において使用され得る富栄養成長培地において成長させることができる。成長培地または「セラム」は、タンパク質が欠乏していてよい（タンパク質は、操作された細菌系統によって培地中に発現されることになるため）、上で言及されている植物ベースの溶液であり得る。

一部の実施形態では、本方法は、細菌宿主細胞において組換えタンパク質を、そのようなタンパク質が細胞から周囲の培地中に分泌されるように産生するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、細菌宿主細胞において組換えタンパク質を、そのようなタンパク質が細胞内に存在するように産生するステップを含む。次に、組換えタンパク質を単離、精製または部分的に精製し、ミセル、液体コロイド、凝固したコロイド、カードおよびチーズを作製するための方法において使用することができる。

発酵プロセスは、発酵による典型的な組換えタンパク質発現に重要となり得るパラメーターである、ボディマス（ｂｏｄｙ ｍａｓｓ）に対して高いタンパク質収量のために最適化することができる。ｐＨは、発現されるタンパク質の等電点を通過することがないように、発酵を通して制御および／または維持することができる。感受性が高いカゼイン挙動が原因で、これを行う場合がある。

一部の実施形態では、最適な力価に達した後に、遺伝子改変された細菌をスピンダウン（ｓｐｕｎ ｏｕｔ）し、上清を採取することができ、これは、チーズ作製ブロスにするための下流（ｄｏｗｎ）処理する１または２ステップを伴うことができる。チーズ作製ブロスのための主要ステップは、ミルクに見出される濃度と同様のタンパク質濃度に達するように溶液を濃縮することができる。このステージによって、カゼインミセルを形成することができた。濃縮後に、中温性または好熱性チーズ作製スターター培養物を添加して、最適なキモシン活性に適正なｐＨ（ネイティブミセルにとってｐＨ５．８～６．０、これは異なるミセルにとっては異なる可能性があるであろう）に達するまで、溶液を発酵させることができる。次に、キモシンを添加してカード形成を誘導することができ、次いで、カードをチーズに作製することができる。図１は、産生プロセスの基礎技術の図である。

用語「約」は、本明細書で使用される場合、１または１を超える標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大１０％、最大５％または最大１％の範囲を意味することができる。例えば、約は、所与の値の最大±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％を意味することができる。

用語「乳製品タンパク質」は、本明細書で使用される場合、ミルク中に見出されるタンパク質に由来するアミノ酸配列（そのバリアントを含む）を有するタンパク質を意味する。

用語「動物由来の」乳製品タンパク質は、本明細書で使用される場合、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ヒト、バイソン、バッファロー、ラクダおよびウマを含むがこれらに限定されない、ミルク産生生物から得られるおよび／または単離されるタンパク質等、ミルクに由来するタンパク質を意味する。「動物由来のカゼインタンパク質」は、ミルク産生生物から得られるおよび／または単離されるカゼインタンパク質を意味する。

用語「組換え乳製品タンパク質」は、本明細書で使用される場合、ミルク中に見出されるタンパク質に由来するアミノ酸配列（そのバリアントを含む）を有する、異種または組換え生物において発現されたタンパク質を意味する。「組換えカゼインタンパク質」は、組換え生物によってまたは異種宿主細胞において産生されたカゼインを意味する。
組成物および組成物を作製する方法

本明細書におけるチーズ組成物は、ミセル形態で会合した１種または複数の組換えタンパク質を含む凝固したコロイドを含む。ミセル形態は、液体懸濁液またはコロイド形態で存在することができる。タンパク質、脂肪、糖、ミネラル、ビタミンを含むがこれらに限定されない、他の構成成分をミセルに（例えば、液体コロイド中のミセルに）添加することができる。１種または複数の組換えカゼインタンパク質により形成されたミセルを含有する液体コロイドは、酸性化条件および必要に応じて、カード形成のためのプロテアーゼ等の凝固剤で処置することができる。その後、１種または複数の組換えタンパク質を含むカードを次いで処置して、チーズまたはチーズ様組成物を生成することができる。ヨーグルト形成の場合、１種または複数の組換えカゼインタンパク質により形成されたミセルを含有する液体コロイドは、細菌スターター培養物による酸性化等の酸性化条件で処置することができる。
Ｉ．ミセルおよび液体コロイド

哺乳動物ミルクにおいて、カゼインタンパク質（アルファ－ｓ１－カゼイン、アルファ－ｓ２－カゼイン、ベータカゼインおよびカッパーカゼイン、およびガンマカゼインと呼ばれるベータカゼインの切断形態）ならびにリン酸カルシウムおよびクエン酸塩は、カゼインミセルと呼ばれる大きいコロイド粒子を形成する。カゼインミセルの主要な機能は、カゼイン分子に流動性を提供し、リン酸塩およびカルシウムを可溶化することである。

絶対的構造決定に干渉するカゼインミセルの大きいサイズが原因で、ミセル形成の様々に異なるモデルが提唱された。モデルは、３種のカテゴリー：コート・コアモデル、サブユニットまたはサブミセルモデル、および内部構造モデルへと分類することができる。

本明細書に記載されている通り、カゼインミセルは、組換えにより産生されたカゼインタンパク質等、単離されたカゼインタンパク質により形成され得る。組換えカゼインから形成されたミセルは、アルファ－ｓ１－カゼインおよび／もしくはアルファ－ｓ２－カゼイン等のいずれかのアルファカゼイン、ベータカゼインならびに／またはカッパーカゼインを含むことができる。一部の事例では、ミセルは、アルファカゼインおよびカッパーカゼインを含む。一部の事例では、ミセルは、アルファカゼインおよびカッパーカゼインを含み、いかなるベータカゼインタンパク質も含有しない。

一部の事例では、ミセルは、アルファ（アルファ－Ｓ１またはアルファ－Ｓ２）およびカッパーカゼインタンパク質、またはベータおよびカッパーカゼインタンパク質等、２種のカゼインを含む。ミセルにおけるアルファまたはβ－カゼインタンパク質のκ－カゼインタンパク質に対する比は、約２：１～１０：１または約１：１～１５：１であり得る。ミセルは、約２～６ｍＬ／ｇを占有することができ、カゼインミセルは、１０～４００ｎｍまたは１０～５００ｎｍの平均直径を有することができる。

安定したミセルを形成する２種のカゼインタンパク質を同時発現させることができる。これは、溶媒の正確な塩含量（カルシウム、リン酸塩、カリウム、クエン酸塩等）の形態での操作および適応、ならびに場合によっては、カゼインタンパク質の操作を必要とし得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載されているミセルは、液体溶液中に形成されたミセルを含む。一部の実施形態では、カゼイン含有ミセルは、液体コロイド中に存在し、ミセルは分散状態を維持し、液体溶液から沈降しない。一部の事例では、液体コロイドは、カゼイン含有ミセル、ならびにタンパク質の凝集物および／または単量体形態等のカゼインの他の形態を含む。

アルファカゼイン（αカゼイン）：一部の実施形態では、本明細書における液体コロイドは、アルファカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドにおけるアルファカゼインは、アルファＳ１カゼインであり得る。液体コロイドにおけるアルファカゼインは、アルファＳ２カゼインであり得る。液体コロイドにおけるアルファカゼインは、アルファＳ１およびＳ２カゼインの組合せであり得る。液体コロイドにおけるアルファカゼインは、カゼインの０％～１００％を構成することができる。一部の実例では、液体コロイドは、アルファカゼインのみを使用して、特に、アルファＳ１カゼインのみを使用して産生することができる。あるいは、一部の事例では、液体コロイドは、いかなるアルファカゼインも用いずに産生することができる。一部の事例では、アルファカゼインは、液体コロイドにおけるカゼインの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を構成する。液体コロイドにおけるアルファカゼインは、０％～１００％アルファＳ１カゼイン、アルファＳ２カゼインまたはこれらの組合せを含むことができる。

一部の事例では、液体コロイドにおけるカゼインは、５０％アルファＳ１カゼイン～１００％アルファＳ１カゼインを含む。一部の事例では、液体コロイドは、アルファカゼインタンパク質を含み、総カゼインは、１００％アルファＳ１カゼインを含む。一部の事例では、液体コロイドは、アルファカゼインタンパク質を含み、総カゼインは、少なくとも５０％アルファＳ１カゼインを含む。液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質は、５０％アルファＳ１カゼイン～７０％アルファＳ１カゼイン、５０％アルファＳ１カゼイン～９０％アルファＳ１カゼイン、５０％アルファＳ１カゼイン～１００％アルファＳ１カゼイン、７０％アルファＳ１カゼイン～９０％アルファＳ１カゼイン、７０％アルファＳ１カゼイン～１００％アルファＳ１カゼインまたは９０％アルファＳ１カゼイン～１００％アルファＳ１カゼインを含むことができる。液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質は、約５０％アルファＳ１カゼイン、７０％アルファＳ１カゼイン、９０％アルファＳ１カゼインまたは１００％アルファＳ１カゼインを含むことができる。

一部の実施形態では、液体コロイドにおけるアルファカゼインは、アルファＳ２カゼインである。一部の事例では、液体コロイドにおけるカゼインは、５０％アルファＳ２カゼイン～１００％アルファＳ２カゼインを含む。一部の事例では、液体コロイドは、アルファカゼインタンパク質を含み、総カゼインは、１００％アルファＳ２カゼインを含む。一部の事例では、液体コロイドは、アルファカゼインタンパク質を含み、総カゼインは、少なくとも５０％アルファＳ２カゼインを含む。液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質は、５０％アルファＳ２カゼイン～７０％アルファＳ２カゼイン、５０％アルファＳ２カゼイン～９０％アルファＳ２カゼイン、５０％アルファＳ２カゼイン～１００％アルファＳ２カゼイン、７０％アルファＳ２カゼイン～９０％アルファＳ２カゼイン、７０％アルファＳ２カゼイン～１００％アルファＳ２カゼインまたは９０％アルファＳ２カゼイン～１００％アルファＳ２カゼインを含むことができる。液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質は、５０％アルファＳ２カゼイン、７０％アルファＳ２カゼイン、９０％アルファＳ２カゼインまたは１００％アルファＳ２カゼインを含むことができる。

一部の実施形態では、液体コロイドにおけるアルファカゼインは、アルファＳ１カゼインおよびアルファＳ２カゼインの混合物である。そのような液体コロイドにおけるアルファカゼインは、例えば、それぞれ１％アルファＳ２カゼイン～９９％アルファＳ２カゼインおよび９９％アルファＳ１カゼイン～１％アルファＳ１カゼインを含むことができる。一部の実施形態では、液体コロイドにおけるアルファカゼインは、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０または９０：１０の比のアルファＳ１カゼインおよびアルファＳ２カゼインの混合物である。一部の事例では、液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質は、アルファＳ２カゼインを含まない。一部の事例では、液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質は、アルファＳ１カゼインを含まない。一部の事例では、液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質は、アルファＳ２カゼインを含まない。

本明細書における液体コロイドのタンパク質含量は、３０％～９０％または５０％～９５％アルファカゼインタンパク質を含むことができる。一部の事例では、液体コロイドのタンパク質含量は、少なくとも３０％アルファカゼインタンパク質を含むことができる。一部の事例では、液体コロイドのタンパク質含量は、少なくとも５０％アルファカゼインタンパク質を含むことができる。一部の事例では、液体コロイドのタンパク質含量は、少なくとも９０％または少なくとも９５％アルファカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、３０％～３５％、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～５５％、３０％～７０％、３０％～７５％、３０％～８０％、３０％～８５％、３０％～９０％、３５％～４０％、３５％～５０％、３５％～５５％、３５％～７０％、３５％～７５％、３５％～８０％、３５％～８５％、３５％～９０％、４０％～５０％、４０％～５５％、４０％～７０％、４０％～７５％、４０％～８０％、４０％～８５％、４０％～９０％、５０％～５５％、５０％～７０％、５０％～７５％、５０％～８０％、５０％～８５％、５０％～９０％、５５％～７０％、５５％～７５％、５５％～８０％、５５％～８５％、５５％～９０％、７０％～７５％、７０％～８０％、７０％～８５％、７０％～９０％、７５％～８０％、７５％～８５％、７５％～９０％、８０％～８５％、８０％～９０％、８５％～９０％または９０～９５％アルファカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％アルファカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、少なくとも３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％アルファカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、多くても４０％、５０％、５５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％アルファカゼインタンパク質を含むことができる。

アルファカゼインタンパク質（Ｓ１および／またはＳ２カゼインの両方を含む）は、組換えによって産生することができる。一部の事例では、液体コロイドは、組換えにより産生されたアルファカゼインタンパク質のみを含むことができる。ある特定の事例では、液体コロイドは、組換えにより産生されたアルファカゼインタンパク質のみを実質的に含むことができる。例えば、アルファカゼインタンパク質は、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％組換えアルファカゼインであり得る。あるいは、液体コロイドは、組換えにより産生されたアルファカゼインタンパク質および動物由来のアルファカゼインタンパク質の混合物を含むことができる。

アルファカゼインの発現に使用される宿主生物に依存して、アルファカゼインタンパク質は、動物由来のアルファカゼインタンパク質とは異なるグリコシル化またはリン酸化パターン（翻訳後修飾）を有することができる。一部の事例では、アルファカゼインタンパク質は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を全く含まない。一部の事例では、アルファカゼインタンパク質は、実質的に低下されたＰＴＭを含む。本明細書で使用される場合、実質的に低下されたＰＴＭは、動物由来のアルファカゼインタンパク質におけるＰＴＭの量と比較した、ＰＴＭの１種または複数の型の少なくとも５０％低下を意味する。例えば、アルファカゼインタンパク質は、動物由来のアルファカゼインと比較して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％少なく翻訳後修飾されていてよい。あるいは、アルファカゼインタンパク質は、動物由来のアルファカゼインＰＴＭに匹敵するＰＴＭを含むことができる。

アルファカゼインタンパク質におけるＰＴＭは、化学的にまたは酵素により修飾されていてよい。一部の事例では、アルファカゼインタンパク質は、化学的なまたは酵素による処置なしでは、ＰＴＭが実質的に低下されているまたはこれを全く含まない。液体コロイドは、ＰＴＭが低下されたまたはこれが全くないアルファカゼインタンパク質を使用して生成することができ、ＰＴＭの欠如は、組換えタンパク質がＰＴＭを欠いている組換え産生によるアルファカゼインタンパク質の産生等、タンパク質の化学的なまたは酵素による処置によるものではない。

アルファカゼインタンパク質におけるリン酸化は、化学的にまたは酵素により修飾されていてよい。一部の事例では、アルファカゼインタンパク質は、化学的なまたは酵素による処置なしでは、リン酸化が実質的に低下されているまたはこれを全く含まない。例えば、アルファカゼインタンパク質は、動物由来のアルファカゼインと比較して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％少なくリン酸化されていてよい。液体コロイドは、リン酸化が低下されたまたはこれが全くないアルファカゼインタンパク質を使用して生成することができ、リン酸化の欠如は、組換え産生が、リン酸化が低下されたまたはこれが全くないアルファカゼインタンパク質を提供する場合等、化学的なまたは酵素による処置によるものではない。

ベータカゼイン（βカゼイン）：一部の実施形態では、本明細書における液体コロイドは、動物由来のミセル（または動物由来の液体コロイド）と比較して、有意に少ない量のベータカゼインタンパク質を含む。本明細書に記載されている液体コロイドは、１０％未満のベータカゼインタンパク質を含むように生成することができる。本明細書における液体コロイドのタンパク質含量は、１０％、８％、５％、３％、２％、１％または０．５％未満のベータカゼインタンパク質を含むことができる。好まれる実施形態では、本明細書に記載されている液体コロイドは、いかなるベータカゼインタンパク質も含まない。

カッパーカゼイン（κカゼイン）：一部の実施形態では、本明細書における液体コロイドは、カッパーカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、０％～１００％カッパーカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、少なくとも１％カッパーカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、１００％または多くても５０％または多くても３０％カッパーカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドは、１％～５％、１％～７％、１％～１０％、１％～１２％、１％～１５％、１％～１８％、１％～２０％、１％～２５％、１％～３０％、５％～７％、５％～１０％、５％～１２％、５％～１５％、５％～１８％、５％～２０％、５％～２５％、５％～３０％、７％～１０％、７％～１２％、７％～１５％、７％～１８％、７％～２０％、７％～２５％、７％～３０％、１０％～１２％、１０％～１５％、１０％～１８％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～３０％、１２％～１５％、１２％～１８％、１２％～２０％、１２％～２５％、１２％～３０％、１５％～１８％、１５％～２０％、１５％～２５％、１５％～３０％、１８％～２０％、１８％～２５％、１８％～３０％、２０％～２５％、２０％～３０％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０～４５％または４５％～５０％カッパーカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、１％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％カッパーカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、少なくとも１％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％カッパーカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、多くても５％、７％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％カッパーカゼインタンパク質を含むことができる。一部の実例では、液体コロイドは、カッパーカゼインのみを使用して産生することができる。あるいは、一部の事例では、液体コロイドは、いかなるカッパーカゼインも用いずに産生することができる。

カッパーカゼインタンパク質は、組換えによって産生することができる。一部の事例では、液体コロイドは、組換えにより産生されたカッパーカゼインタンパク質のみを含むことができる。ある特定の事例では、液体コロイドは、組換えにより産生されたカッパーカゼインタンパク質のみを実質的に含むことができる。一部の事例では、カッパーカゼインタンパク質は、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％組換えカッパーカゼインであり得る。あるいは、液体コロイドは、組換えにより産生されたカッパーカゼインタンパク質および動物由来のカッパーカゼインタンパク質の混合物を含むことができる。

カッパーカゼインの発現に使用される宿主生物に依存して、カッパーカゼインタンパク質は、動物由来のカッパーカゼインタンパク質とは異なるグリコシル化またはリン酸化パターン等、翻訳後修飾を有することができる。一部の事例では、本明細書における組成物におけるカッパーカゼインタンパク質は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を全く含まない。一部の事例では、カッパーカゼインタンパク質は、実質的に低下されたＰＴＭを含む。本明細書で使用される場合、実質的に低下されたＰＴＭは、動物由来のカッパーカゼインタンパク質におけるＰＴＭの量と比較した、ＰＴＭの１種または複数の型の少なくとも５０％低下を意味する。例えば、カッパーカゼインタンパク質は、動物由来のカッパーカゼインと比較して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％少なく翻訳後修飾され得る。あるいは、カッパーカゼインタンパク質は、動物由来のカッパーカゼインＰＴＭに匹敵するＰＴＭを含むことができる。

カッパーカゼインタンパク質におけるＰＴＭは、化学的にまたは酵素により修飾されていてよい。一部の事例では、カッパーカゼインタンパク質は、化学的なまたは酵素による処置なしでは、ＰＴＭが実質的に低下されているまたはこれを全く含まない。液体コロイドは、ＰＴＭが低下されたまたはこれが全くないカッパーカゼインタンパク質を使用して生成することができ、ＰＴＭの欠如または低下は、カッパーカゼインタンパク質が翻訳後修飾されないまたはＰＴＭのレベルが実質的に低下される宿主における組換えカッパータンパク質の産生による等、化学的なまたは酵素による処置によるものではない。

カッパーカゼインタンパク質におけるグリコシル化は、化学的にまたは酵素により修飾されていてよい。一部の事例では、カッパーカゼインタンパク質は、化学的なまたは酵素による処置なしでは、グリコシル化が実質的に低下されているまたはこれを全く含まない。例えば、カッパーカゼインタンパク質は、動物由来のカッパーカゼインと比較して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％少なくグリコシル化されていてよい。液体コロイドは、グリコシル化が低下されたまたはこれが全くないカッパーカゼインタンパク質を使用して生成することができ、グリコシル化の欠如は、組換え産生後の化学的なまたは酵素による処置によるものではない。

カッパーカゼインタンパク質におけるリン酸化は、化学的にまたは酵素により修飾されていてよい。一部の事例では、カッパーカゼインタンパク質は、化学的なまたは酵素による処置なしでは、リン酸化が実質的に低下されているまたはこれを全く含まない。例えば、カッパーカゼインタンパク質は、動物由来のカッパーカゼインと比較して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％少なくリン酸化されていてよい。液体コロイドは、リン酸化が低下されたまたはこれが全くないカッパーカゼインタンパク質を使用して生成することができ、リン酸化の欠如は、カッパーカゼインタンパク質が翻訳後修飾されないまたはＰＴＭのレベルが実質的に低下される宿主における組換えカッパータンパク質の産生による等、化学的なまたは酵素による処置によるものではない。

液体コロイドのタンパク質含量は、約５％カッパーおよび約９５％アルファカゼインタンパク質から約５０％カッパーおよび約５０％アルファカゼインタンパク質を含むことができる。液体コロイドのタンパク質含量は、約６％カッパーおよび約９４％アルファ、約５％カッパーおよび約９５％アルファ、約７％カッパーおよび約９３％アルファ、約１０％カッパーおよび約９０％アルファ、約１２％カッパーおよび約８８％アルファ、約１５％カッパーおよび約８５％アルファ、約１７％カッパーおよび約８３％アルファ、約２０％カッパーおよび約８０％アルファ、約２５％カッパーおよび約７５％アルファ、約３０％カッパーおよび約７０％アルファカゼインタンパク質、約３５％カッパーおよび約６５％アルファ、約４０％カッパーおよび約６０％アルファ、約４５％カッパーおよび約５５％アルファまたは約５０％カッパーおよび約５０％アルファを含むことができる。

液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質のカッパーカゼインタンパク質に対する比は、約１：１～約１５：１であり得る。液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質のカッパーカゼインタンパク質に対する比は、１：１、２：１～４：１、２：１～６：１、２：１～８：１、２：１～１０：１、２：１～１２：１、２：１～１４：１、２：１～１５：１、４：１～６：１、４：１～８：１、４：１～１０：１、４：１～１２：１、４：１～１４：１、４：１～１５：１、６：１～８：１、６：１～１０：１、６：１～１２：１、６：１～１４：１、６：１～１５：１、８：１～１０：１、８：１～１２：１、８：１～１４：１、８：１～１５：１、１０：１～１２：１、１０：１～１４：１、１０：１～１５：１、１２：１～１４：１、１２：１～１５：１または１４：１～１５：１であり得る。液体コロイドにおけるアルファカゼインタンパク質のカッパーカゼインタンパク質に対する比は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１または１５：１であり得る。

一部の実施形態では、液体コロイドは、アルファおよびカッパーカゼインタンパク質を含み、ベータカゼインを含まず、その上、アルファカゼイン、カッパーカゼイン、またはアルファおよびカッパーカゼインの両方は、翻訳後修飾を欠いている。例えば、液体コロイドは、リン酸化を欠いているもしくはこれが実質的に低下されたアルファカゼイン（動物由来のミルク由来のアルファカゼインと比較して）およびカッパーカゼインを含む、またはリン酸化を欠いているもしくはこれが実質的に低下されたアルファカゼイン（動物由来のミルク由来のアルファカゼインと比較して）およびグリコシル化もしくはリン酸化、もしくはグリコシル化およびリン酸化の両方を欠いているもしくはこれが実質的に低下されたカッパーカゼイン（動物由来のミルク由来のカッパーカゼインと比較して）を含む。一部の事例では、液体コロイドは、アルファカゼインを含み、カッパーカゼインを含み、カッパーカゼインは、グリコシル化もしくはリン酸化またはグリコシル化およびリン酸化の両方を欠如しているまたはこれが実質的に低下されている（動物由来のミルク由来のカッパーカゼインと比較して）。一部の事例では、液体コロイドは、細菌宿主細胞において組換えによって産生され、１種または複数のＰＴＭを欠いているまたはこれが実質的に低下されている、アルファカゼイン、カッパーカゼインまたはその両方を含む。

一部の実施形態では、本明細書における液体コロイド（およびそれから作製された製品）は、アルファおよびカッパーカゼインタンパク質以外のいかなる乳製品タンパク質も含まない。一部の事例では、本明細書における液体コロイド（およびそれから作製された製品）は、いかなるホエータンパク質も含まない。一部の実施形態では、本明細書における液体コロイド（およびそれから作製された製品）は、いかなる動物由来の乳製品タンパク質も含まない。

液体コロイドにおけるミセル等のミセル直径は、本明細書において、約１０ｎｍ～約５００ｎｍであり得る。本明細書におけるミセル直径は、少なくとも１０ｎｍであり得る。本明細書におけるミセル直径は、多くても５００ｎｍであり得る。本明細書におけるミセル直径は、１０ｎｍ～２０ｎｍ、１０ｎｍ～５０ｎｍ、１０ｎｍ～１００ｎｍ、１０ｎｍ～１５０ｎｍ、１０ｎｍ～２００ｎｍ、１０ｎｍ～２５０ｎｍ、１０ｎｍ～３００ｎｍ、１０ｎｍ～３５０ｎｍ、１０ｎｍ～４００ｎｍ、１０ｎｍ～４５０ｎｍ、１０ｎｍ～５００ｎｍ、２０ｎｍ～５０ｎｍ、２０ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～１５０ｎｍ、２０ｎｍ～２００ｎｍ、２０ｎｍ～２５０ｎｍ、２０ｎｍ～３００ｎｍ、２０ｎｍ～３５０ｎｍ、２０ｎｍ～４００ｎｍ、２０ｎｍ～４５０ｎｍ、２０ｎｍ～５００ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、５０ｎｍ～１５０ｎｍ、５０ｎｍ～２００ｎｍ、５０ｎｍ～２５０ｎｍ、５０ｎｍ～３００ｎｍ、５０ｎｍ～３５０ｎｍ、５０ｎｍ～４００ｎｍ、５０ｎｍ～４５０ｎｍ、５０ｎｍ～５００ｎｍ、１００ｎｍ～１５０ｎｍ、１００ｎｍ～２００ｎｍ、１００ｎｍ～２５０ｎｍ、１００ｎｍ～３００ｎｍ、１００ｎｍ～３５０ｎｍ、１００ｎｍ～４００ｎｍ、１００ｎｍ～４５０ｎｍ、１００ｎｍ～５００ｎｍ、１５０ｎｍ～２００ｎｍ、１５０ｎｍ～２５０ｎｍ、１５０ｎｍ～３００ｎｍ、１５０ｎｍ～３５０ｎｍ、１５０ｎｍ～４００ｎｍ、１５０ｎｍ～４５０ｎｍ、１５０ｎｍ～５００ｎｍ、２００ｎｍ～２５０ｎｍ、２００ｎｍ～３００ｎｍ、２００ｎｍ～３５０ｎｍ、２００ｎｍ～４００ｎｍ、２００ｎｍ～４５０ｎｍ、２００ｎｍ～５００ｎｍ、２５０ｎｍ～３００ｎｍ、２５０ｎｍ～３５０ｎｍ、２５０ｎｍ～４００ｎｍ、２５０ｎｍ～４５０ｎｍ、２５０ｎｍ～５００ｎｍ、３００ｎｍ～３５０ｎｍ、３００ｎｍ～４００ｎｍ、３００ｎｍ～４５０ｎｍ、３００ｎｍ～５００ｎｍ、３５０ｎｍ～４００ｎｍ、３５０ｎｍ～４５０ｎｍ、３５０ｎｍ～５００ｎｍ、４００ｎｍ～４５０ｎｍ、４００ｎｍ～５００ｎｍまたは４５０ｎｍ～５００ｎｍであり得る。本明細書におけるミセル直径は、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍまたは約５００ｎｍであり得る。本明細書におけるミセル直径は、少なくとも１０ｎｍ、２０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍまたは４５０ｎｍであり得る。本明細書におけるミセル直径は、多くても２０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍまたは５００ｎｍであり得る。

塩：液体コロイドにおけるカゼイン混合物は、本明細書の他の箇所に記載されているアルファ、ベータおよび／またはカッパーカゼインタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、液体コロイドは、アルファカゼインおよびカッパーカゼインを含むが、ベータカゼインを含まない。本明細書における液体コロイドにおけるミセル形成は、カゼイン混合物を含む溶液への様々な塩の添加を含むことができる。カゼイン混合物に添加され得る塩は、カルシウム塩、亜リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）塩、クエン酸塩、カリウム塩、ナトリウム塩および／または塩化物塩を含むことができる。一部の事例では、塩は、ミセル内に含まれる。一部の事例では、ある比率の塩がミセル中に含まれ、別の比率（ｐｏｒｔｉｏｎ）の塩が溶液中（例えば、ミセルの「外側」）に存在するように、塩は液体コロイドに含まれる。

カゼインミセルを含有する液体コロイドは、カルシウム塩を含むことができる。カルシウム塩は、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、それらの等価物および／またはそれらの組合せから選択することができる。液体コロイドにおけるカルシウム塩の濃度は、約１０ｍＭ～約５５ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるカルシウム塩の濃度は、少なくとも１０ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるカルシウム塩の濃度は、多くても５０ｍＭであり得る。一部の実施形態では、液体コロイドにおけるカルシウム塩の濃度は、２８ｍＭもしくは２８ｍＭ以下であり得る、または５５ｍＭもしくは５５ｍＭ以下であり得る。液体コロイドにおけるカルシウム塩の濃度は、１０ｍＭ～１５ｍＭ、１０ｍＭ～２０ｍＭ、１０ｍＭ～２５ｍＭ、１０ｍＭ～３０ｍＭ、１０ｍＭ～３５ｍＭ、１０ｍＭ～４０ｍＭ、１０ｍＭ～４５ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、１０ｍＭ～５５ｍＭ、１５ｍＭ～２０ｍＭ、１５ｍＭ～２５ｍＭ、１５ｍＭ～３０ｍＭ、１５ｍＭ～３５ｍＭ、１５ｍＭ～４０ｍＭ、１５ｍＭ～４５ｍＭ、１５ｍＭ～５０ｍＭ、１５ｍＭ～５５ｍＭ、２０ｍＭ～２５ｍＭ、２０ｍＭ～３０ｍＭ、２０ｍＭ～３５ｍＭ、２０ｍＭ～４０ｍＭ、２０ｍＭ～４５ｍＭ、２０ｍＭ～５０ｍＭ、２０ｍＭ～５５ｍＭ、２５ｍＭ～３０ｍＭ、２５ｍＭ～３５ｍＭ、２５ｍＭ～４０ｍＭ、２５ｍＭ～４５ｍＭ、２５ｍＭ～５０ｍＭ、２５ｍＭ～５５ｍＭ、３０ｍＭ～３５ｍＭ、３０ｍＭ～４０ｍＭ、３０ｍＭ～４５ｍＭ、３０ｍＭ～５０ｍＭ、３０ｍＭ～５５ｍＭ、３５ｍＭ～４０ｍＭ、３５ｍＭ～４５ｍＭ、３５ｍＭ～５０ｍＭ、３５ｍＭ～５５ｍＭ、４０ｍＭ～４５ｍＭ、４０ｍＭ～５０ｍＭ、４０ｍＭ～５５ｍＭ、４５ｍＭ～５０ｍＭ、４５ｍＭ～５５ｍＭまたは５０ｍＭ～５５ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるカルシウム塩の濃度は、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭまたは５５ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるカルシウム塩の濃度は、少なくとも１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭまたは５０ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるカルシウム塩の濃度は、多くても１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭまたは５５ｍＭであり得る。

カゼインミセルを含有する液体コロイドは、リン酸塩を含むことができる。リン酸塩は、リン酸（二水素）一ナトリウム、リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸三ナトリウム、リン酸（二水素）一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸三カリウム等のオルトリン酸塩；ピロリン酸二ナトリウムまたは二カリウム、ピロリン酸三ナトリウムまたは三カリウム、ピロリン酸四ナトリウムまたは四カリウム等のピロリン酸塩；トリポリリン酸ペント（ｐｅｎｔ）ナトリウムまたはカリウム、テトラポリリン酸ナトリウムまたはカリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムまたはカリウム等のポリリン酸塩から選択することができる。液体コロイドにおけるリン酸塩の濃度は、約８ｍＭ～約４５ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるリン酸塩の濃度は、少なくとも８ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるリン酸塩の濃度は、多くても２５ｍＭまたは多くても３０ｍＭまたは多くても４０ｍＭまたは多くても４５ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるリン酸塩の濃度は、８ｍＭ～１０ｍＭ、８ｍＭ～１５ｍＭ、８ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～２５ｍＭ、８ｍＭ～３０ｍＭ、８ｍＭ～３５ｍＭ、８ｍＭ～４０ｍＭ、８ｍＭ～４５ｍＭ、１０ｍＭ～１５ｍＭ、１０ｍＭ～２０ｍＭ、１０ｍＭ～２５ｍＭ、１０ｍＭ～３０ｍＭ、１０ｍＭ～３５ｍＭ、１０ｍＭ～４０ｍＭ、１０ｍＭ～４５ｍＭ、１５ｍＭ～２０ｍＭ、１５ｍＭ～２５ｍＭ、１５ｍＭ～３０ｍＭ、１５ｍＭ～３５ｍＭ、１５ｍＭ～４０ｍＭ、１５ｍＭ～４５ｍＭ、２０ｍＭ～２５ｍＭ、２０ｍＭ～３０ｍＭ、２０ｍＭ～３５ｍＭ、２０ｍＭ～４０ｍＭ、２０ｍＭ～４５ｍＭ、２５ｍＭ～３０ｍＭ、２５ｍＭ～３５ｍＭ、２５ｍＭ～４０ｍＭ、２５ｍＭ～４５ｍＭ、３０ｍＭ～３５ｍＭ、３０ｍＭ～４０ｍＭ、３０ｍＭ～４５ｍＭ、３５ｍＭ～４０ｍＭ、３５ｍＭ～４５ｍＭまたは４０ｍＭ～４５ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるリン酸塩の濃度は、約８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭまたは４５ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるリン酸塩の濃度は、少なくとも８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭまたは４０ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるリン酸塩の濃度は、多くても１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭまたは４５ｍＭであり得る。

カゼインミセルを含有する液体コロイドは、クエン酸塩を含むことができる。クエン酸塩は、クエン酸カルシウム、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウムまたはそれらの等価物から選択することができる。液体コロイドにおけるクエン酸塩の濃度は、約２ｍＭ～約２０ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるクエン酸塩の濃度は、少なくとも２ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるクエン酸塩の濃度は、多くても１５ｍＭまたは多くても２０ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるクエン酸塩の濃度は、２ｍＭ～４ｍＭ、２ｍＭ～６ｍＭ、２ｍＭ～８ｍＭ、２ｍＭ～１０ｍＭ、２ｍＭ～１２ｍＭ、２ｍＭ～１４ｍＭ、２ｍＭ～１６ｍＭ、２ｍＭ～１８ｍＭ、２ｍＭ～２０ｍＭ、４ｍＭ～６ｍＭ、４ｍＭ～８ｍＭ、４ｍＭ～１０ｍＭ、４ｍＭ～１２ｍＭ、４ｍＭ～１４ｍＭ、４ｍＭ～１６ｍＭ、４ｍＭ～１８ｍＭ、４ｍＭ～２０ｍＭ、６ｍＭ～８ｍＭ、６ｍＭ～１０ｍＭ、６ｍＭ～１２ｍＭ、６ｍＭ～１４ｍＭ、６ｍＭ～１６ｍＭ、６ｍＭ～１８ｍＭ、６ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～１０ｍＭ、８ｍＭ～１２ｍＭ、８ｍＭ～１４ｍＭ、８ｍＭ～１６ｍＭ、８ｍＭ～１８ｍＭ、８ｍＭ～２０ｍＭ、１０ｍＭ～１２ｍＭ、１０ｍＭ～１４ｍＭ、１０ｍＭ～１６ｍＭ、１０ｍＭ～１８ｍＭ、１０ｍＭ～２０ｍＭ、１２ｍＭ～１４ｍＭ、１２ｍＭ～１６ｍＭ、１２ｍＭ～１８ｍＭ、１２ｍＭ～２０ｍＭ、１４ｍＭ～１６ｍＭ、１４ｍＭ～１８ｍＭ、１４ｍＭ～２０ｍＭ、１６ｍＭ～１８ｍＭ、１６ｍＭ～２０ｍＭまたは１８ｍＭ～２０ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるクエン酸塩の濃度は、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭまたは２０ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるクエン酸塩の濃度は、少なくとも２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭまたは１８ｍＭであり得る。液体コロイドにおけるクエン酸塩の濃度は、多くても４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭまたは２０ｍＭであり得る。

カゼインミセルを含有する液体コロイドは、塩の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、液体コロイドは、カルシウム塩、リン酸塩およびクエン酸塩を含む。一部の事例では、液体コロイドにおけるカルシウム塩、リン酸塩およびクエン酸塩の比は、３：２：１～約６：４：１であり得る。液体コロイドにおけるカルシウム塩、リン酸塩およびクエン酸塩の比は、約３：１：１、３：２：１、３：３：１、４：２：１、４：３：１、４：４：１、５：２：１、５：２：２、５：３：１、５：４：１、５：５：１、５：３：２、５：４：２、６：１：１、６：２：１、６：３：１または６：４：１であり得る。

液体コロイドにおけるミセル形成は、水等の溶媒におけるカゼインタンパク質の可溶化を要求する場合がある。塩は、溶媒におけるカゼインタンパク質の可溶化の後に添加することができる。あるいは、塩およびカゼインタンパク質は、同時に溶液に添加することができる。塩は、ミセル形成において２回以上添加することができる。例えば、カルシウム塩、リン酸塩およびクエン酸塩は、規則的な間隔でまたは連続的な滴定プロセスにおいて添加し、所望の品質のミセル液体コロイドが生成されるまで、カゼインタンパク質を含む溶液において混合することができる。一例では、塩は、コロイドが所望の吸光度に達するまで、規則的な間隔で添加することができる。ミセル形成プロセスにおいて異なる時間に異なる塩を添加することができる。例えば、カルシウム塩は、リン酸塩およびクエン酸塩の添加前に添加することができる、またはクエン酸塩は、カルシウム塩およびリン酸塩の添加前に添加することができる、またはリン酸塩は、カルシウム塩およびクエン酸塩の添加前に添加することができる。

その後に液体コロイドがミルク様となり、カードおよび／またはチーズまたはヨーグルト形成に使用されるように、追加的な構成成分を液体コロイドに添加することができる。一部の実施形態では、脂肪が、液体コロイドに添加される。一部の事例では、脂肪は、動物由来の脂肪を本質的に含まなくてよい。本明細書で使用されている脂肪は、キャノーラ油、ヒマワリ油、ヤシ油またはそれらの組合せ等、植物ベースの脂肪を含むことができる。脂肪の濃度は、液体コロイドにおける約０％～約５％であり得る。脂肪の濃度は、少なくとも０．５％または約１％であり得る。脂肪の濃度は、多くても５％であり得る。脂肪の濃度は、約０％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％または５％であり得る。脂肪の濃度は、０～０．５％、０．５％～１％、１％～３％、１％～４％または１％～５％であり得る。脂肪の濃度は、多くても２％、３％、４％または５％であり得る。

本明細書に記載されている液体コロイドは、糖をさらに含むことができる。本明細書で使用されている糖は、植物ベースの二糖（ｄｉｓｓａｃｈａｒｉｄｅ）および／またはオリゴ糖を含むことができる。糖の例は、スクロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、アルロース（ａｌｌｕｌｏｓｅ）、タガトース、キシロースおよびアラビノースを含む。

追加的な構成成分を有する液体コロイドは、３０℃～４５℃の温度で異なる構成成分を混合することにより生成することができる。例えば、１種または複数の組換えタンパク質（アルファおよびカッパーカゼインの組合せ等）を有する液体コロイドは、約３０℃、３２℃、３５℃、３７℃、４０℃、４２℃または４５℃の温度で、脂肪および／または糖と混合することができる。
ＩＩ．カード／チーズ、ヨーグルト形成および構成成分

アルファおよびカッパーカゼインのミセル等のミセルは、液体コロイドに存在することができ、ミセルの実質的部分は、液体中で懸濁状態を維持する。一部の実施形態では、液体コロイドが処置されて、凝固したコロイドを形成する。一部の事例では、処置は、凝固したコロイドを生成するための、酸を添加するまたは微生物により酸性化することによる等、液体コロイドのｐＨの低下である。

最終チーズ製品において、脂肪の濃度が、約０％～約５０％の間、典型的には０％超となるように、凝固したコロイドまたはカードの生成のため、液体コロイドに脂肪を添加することができる。例えば、液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％である。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、１％～５０％の間であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、少なくとも１％であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、多くても５０％であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、１％～５％、１％～１０％、１％～１５％、１％～２０％、１％～２５％、１％～３０％、１％～３５％、１％～４０％、１％～４５％、１％～５０％、５％～１０％、５％～１５％、５％～２０％、５％～２５％、５％～３０％、５％～３５％、５％～４０％、５％～４５％、５％～５０％、１０％～１５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～３０％、１０％～３５％、１０％～４０％、１０％～４５％、１０％～５０％、１５％～２０％、１５％～２５％、１５％～３０％、１５％～３５％、１５％～４０％、１５％～４５％、１５％～５０％、２０％～２５％、２０％～３０％、２０％～３５％、２０％～４０％、２０％～４５％、２０％～５０％、２５％～３０％、２５％～３５％、２５％～４０％、２５％～４５％、２５％～５０％、３０％～３５％、３０％～４０％、３０％～４５％、３０％～５０％、３５％～４０％、３５％～４５％、３５％～５０％、４０％～４５％、４０％～５０％または４５％～５０％であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ／ヨーグルト製品における脂肪の濃度は、多くても１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％であり得る。

超音波処理または高圧ホモジナイゼーションプロセスを使用して、脂肪を乳化させて、液体コロイド（例えば、アルファおよびカッパーカゼインならびに塩により形成されたミセルを含む）にすることができる。ダイズレシチンまたはキサンタンガム等の乳化剤を使用して、安定したエマルションを保証することができる。

凝固したコロイドは、約４～約６の最終ｐＨで生成することができる。凝固したコロイドは、約４～約６のｐＨで生成することができる。凝固したコロイドは、少なくとも４の最終ｐＨで生成することができる。凝固したコロイドは、多くても６の最終ｐＨで生成することができる。凝固したコロイドは、４～４．５、４～５、４～５．１、４～５．２、４～５．５、４～６、４．５～５、４．５～５．１、４．５～５．２、４．５～５．５、４．５～６、５～５．１、５～５．２、５～５．５、５～６、５．１～５．２、５．１～５．５、５．１～６、５．２～５．５、５．２～６または５．５～６の最終ｐＨで生成することができる。凝固したコロイドは、約４、約４．５、約５、約５．１、約５．２、約５．５または約６の最終ｐＨで生成することができる。凝固したコロイドは、少なくとも４、４．５、５、５．１、５．２または５．５の最終ｐＨで生成することができる。凝固したコロイドは、多くても４．５、５、５．１、５．２、５．５または６の最終ｐＨで生成することができる。液体コロイドのｐＨを低下させ、本明細書に記載されている最終ｐＨまたは最終ｐＨ範囲を達成するための処置は、クエン酸、乳酸または酢（酢酸）等の酸の添加を含むことができる。液体コロイドのｐＨを低下させ、本明細書に記載されている最終ｐＨまたは最終ｐＨ範囲を達成するための処置は、乳酸菌等の酸性化微生物の添加を含むことができる。例示的な酸性化微生物は、乳酸球菌、連鎖球菌、乳酸桿菌およびこれらの混合物を含む。一部の事例では、酸および酸性化微生物の両方が、液体コロイドに添加されて、凝固したコロイドを創出する。一部の事例では、熟成および成熟化微生物（細菌または真菌等）も、このステップで添加される。

一部の事例では、酸性化の後に、レンネット処理剤を添加して、レンネット処理されたカード（凝固したカードマトリックス）を形成することができ、次いでこれを使用して、チーズを作製することができる。ミルクおよび同様に本明細書に記載されている液体コロイド等の液体コロイドにおけるミセルは、コロイド懸濁液において安定しており互いに反発する。レンネット処理剤または凝乳酵素の存在下で、また、酸性化されると、ミセルは、不安定化され互いに引き合い、よって、凝固する。レンネット処理剤または凝乳酵素の存在下で、架橋され凝固されたカードマトリックスが形成される。カード形成に使用されるレンネット処理剤は、キモシン、ペプシンＡ、ムコルペプシン（ｍｕｃｏｒｐｅｐｓｉｎ）、エンドチアペプシン（ｅｎｔｈｏｔｈｉａｐｅｐｓｉｎ）またはそれらの等価物を含むことができる。レンネット処理剤は、植物、乳製品または組換えに由来することができる。

一部の実施形態では、レンネット処理されたカードがさらに処置されて、チーズまたはチーズ様製品を創出する。モッツァレラ製品等、一部の事例では、レンネット処理されたカードを加熱し、伸展することができる。他の実施形態では、例えば、ブリー、カマンベール、フェタ、ハルーミ、ゴーダ、エダム、チェダー、マンチェゴ、スイス、コルビー、ミュンスター、ブルーチーズまたはパルメザン型チーズまたはチーズ様製品のために、レンネット処理されたカードは熟成される。

一部の実施形態では、凝固したコロイドまたはレンネット処理されたカードは、例えば、モッツァレラ型チーズのために、チーズの形成のために熱水で処置することができる。熱水処置は、約５０℃～約９０℃の温度で行うことができる。熱水処置は、少なくとも５５℃の温度で行うことができる。熱水処置は、多くても７５℃の温度で行うことができる。熱水処置は、５０℃～５５℃、５５℃～６０℃、５５℃～６５℃、５５℃～７０℃、５５℃～７５℃、６０℃～６５℃、６０℃～７０℃、６０℃～７５℃、６５℃～７０℃、６５℃～７５℃、７０℃～７５℃、７５℃～８０℃、８０℃～８５℃または８５℃～９０℃の温度で行うことができる。熱水処置は、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃または約９０℃の温度で行うことができる。熱水処置は、少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃または８５℃の温度で行うことができる。熱水処置は、多くても５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃または９０℃の温度で行うことができる。一部の事例では、熱水処置後に、製品は伸展されて、チーズとなる。一部の事例では、チーズは、モッツァレラ様チーズである。

本明細書に記載されている方法を使用して形成されたチーズ組成物は、いかなる動物由来の構成成分も含まなくてよい。本明細書に記載されている方法を使用して形成されたチーズ組成物は、動物由来の乳製品タンパク質等、いかなる動物由来の乳製品ベースの構成成分も含まなくてよい。本明細書に記載されている方法を使用して形成されたチーズ組成物は、いかなるホエータンパク質も含まなくてよい。本明細書に記載されている方法を使用して形成されたチーズ組成物は、いかなるベータカゼインタンパク質も含まなくてよい。本明細書に記載されているチーズ組成物は、モッツァレラチーズ等のパスタ・フィラータ様チーズであり得る。パニール、クリームチーズまたはカッテージチーズ等のソフトチーズも、本明細書に記載されている方法を使用して形成することができる。ブリー、カマンベール、フェタ、ハルーミ、ゴーダ、エダム、チェダー、マンチェゴ、スイス、コルビー、ミュンスター、ブルーチーズおよびパルメザン等、熟成され成熟化されたチーズ等の他の型のチーズも、本明細書に記載されている方法を使用して形成することができる。

本明細書に記載されている方法によって作製されたチーズのテクスチャーは、動物のミルクから作製されたチーズ等、動物由来の乳製品由来のタンパク質を使用して作製された同様の型のチーズのテクスチャーに匹敵し得る。チーズのテクスチャーは、訓練された一団のヒト対象またはテクスチャー分析機器等の機械を使用して検査することができる。

本明細書に記載されている方法によって作製されたチーズの食味は、動物由来の乳製品タンパク質を使用して作製された同様の型のチーズに匹敵し得る。チーズの食味は、訓練された一団のヒト対象を使用して検査することができる。

本明細書に記載されているチーズ組成物は、動物由来の乳製品タンパク質を使用して作製された同様の型のチーズに匹敵する褐変能力を有することができる。本明細書に記載されているチーズ組成物は、動物由来の乳製品タンパク質を使用して作製された同様の型のチーズに匹敵する溶ける能力を有することができる。

一部の実施形態では、液体コロイドは、ヨーグルト形成に使用することができる。一部の事例では、ヨーグルト産生のため、液体コロイドを加熱処置することができる。加熱処置は、約７５℃、８０℃、８５℃、８７℃、９０℃、９２℃、９５℃または１００℃の温度での液体コロイドの処置を含むことができる。加熱処置に続いて、液体コロイドの冷却ステップが行われてよい。

一部の事例では、例えば、ヨーグルト産生において、細菌培養物をスターター培養物として使用することができる。ヨーグルト産生に使用されるスターター細菌培養物は、当技術分野で公知のいずれかの細菌培養物であり得る。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、他の乳酸菌およびビフィズス菌の種、細菌等、ヨーグルト生成のために公知の細菌を培養し、１種または複数の組換えタンパク質を含む液体コロイドに添加することができる。細菌スターター培養物は、液体コロイドの酸性化に使用することができる。液体コロイドの酸性化は、コロイドの所望の稠度が達成されるまで続けることができる。例えば、細菌による酸性化は、液体コロイドにとって所望の稠度に達するまで続けることができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、ヨーグルト様稠度を有する凝固された液体コロイドの形成をもたらすことができる。

ヨーグルト産生における液体コロイドの細菌による酸性化は、３０℃～５５℃の間の温度で行うことができる。一部の事例では、液体コロイドの細菌による酸性化は、少なくとも３０℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、多くても５５℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、３０℃～３５℃、３０℃～４０℃、３０℃～４５℃、３０℃～５０℃、３０℃～５５℃、３５℃～４０℃、３５℃～４５℃、３５℃～５０℃、３５℃～５５℃、４０℃～４５℃、４０℃～５０℃、４０℃～５５℃、４５℃～５０℃、４５℃～５５℃または５０℃～５５℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、約３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃または５５℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、少なくとも３０℃、３５℃、４０℃、４５℃または５０℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、多くても３５℃、４０℃、４５℃、５０℃または５５℃の温度で行うことができる。一部の事例では、細菌による酸性化は、３０℃～５５℃の間の温度で、少なくとも１時間行うことができる。一部の事例では、細菌による酸性化は、３０℃～５５℃の間の温度で、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間または少なくとも１２時間行うことができる。一部の事例では、細菌による酸性化は、３０℃～５５℃の間の温度で、多くても１時間行うことができる。一部の事例では、細菌による酸性化は、３０℃～５５℃の間の温度で、多くても２時間、多くても３時間、多くても４時間、多くても５時間、多くても６時間、多くても８時間、多くても１０時間または多くても１２時間行うことができる。

あるいは、細菌による酸性化は、１５℃～３０℃の間のより低い温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、少なくとも１５℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、多くても３０℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、１５℃～１７℃、１５℃～２０℃、１５℃～２２℃、１５℃～２５℃、１５℃～２７℃、１５℃～３０℃、１７℃～２０℃、１７℃～２２℃、１７℃～２５℃、１７℃～２７℃、１７℃～３０℃、２０℃～２２℃、２０℃～２５℃、２０℃～２７℃、２０℃～３０℃、２２℃～２５℃、２２℃～２７℃、２２℃～３０℃、２５℃～２７℃、２５℃～３０℃または２７℃～３０℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、約１５℃、１７℃、２０℃、２２℃、２５℃、２７℃または３０℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、少なくとも１５℃、１７℃、２０℃、２２℃、２５℃または２７℃の温度で行うことができる。液体コロイドの細菌による酸性化は、多くても１７℃、２０℃、２２℃、２５℃、２７℃または３０℃の温度で行うことができる。一部の事例では、細菌による酸性化は、１５℃～３０℃の間の温度で、少なくとも１０時間行うことができる。一部の事例では、細菌による酸性化は、１５℃～３０℃の間の温度で、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２２時間または少なくとも２４時間行うことができる。一部の事例では、細菌による酸性化は、１５℃～３０℃の間の温度で、多くても２４時間行うことができる。一部の事例では、細菌による酸性化は、１５℃～３０℃の間の温度で、多くても１２時間、多くても１４時間、多くても１６時間、多くても１８時間、多くても２０時間、多くても２２時間または多くても２４時間行うことができる。

チーズ形成と同様に、ヨーグルト形成のための凝固された液体コロイドは、糖、脂肪、安定剤および調味料等、他の構成成分を含むことができる。

液体コロイドから作製されたヨーグルト製品における脂肪の濃度は、０％～１２％であり得る。液体コロイドから作製されたヨーグルト製品は、１％未満の脂肪を含むことができる、または一部の事例では、脂肪を全く含まなくてよい。液体コロイドから作製されたヨーグルト製品における脂肪の濃度は、多くても１２％であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、１％～２％、１％～５％、１％～７％、１％～１０％、１％～１２％、２％～５％、２％～７％、２％～１０％、２％～１２％、５％～７％、５％～１０％、５％～１２％、７％～１０％、７％～１２％または１０％～１２％であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、約１％、２％、５％、７％、１０％または１２％であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、少なくとも１％、２％、５％、７％または１０％であり得る。液体コロイドから作製されたチーズ製品における脂肪の濃度は、多くても２％、５％、７％、１０％または１２％であり得る。超音波処理または高圧ホモジナイゼーションプロセスを使用して、脂肪を乳化させて、液体コロイド（例えば、アルファおよびカッパーカゼインならびに塩により形成されたミセルを含む）にすることができる。ダイズレシチンまたはキサンタンガム等の乳化剤を使用して、安定したエマルションを保証することができる。

本明細書に記載されている方法によって作製されたヨーグルトのテクスチャーは、動物のミルクから作製されたヨーグルト等、動物由来の乳製品由来のタンパク質を使用して作製された同様の型のヨーグルトのテクスチャーに匹敵し得る。ヨーグルトのテクスチャーは、訓練された一団のヒト対象またはテクスチャー分析機器等の機械を使用して検査することができる。

本明細書に記載されている方法によって作製されたヨーグルトの食味は、動物由来の乳製品タンパク質を使用して作製された同様の型のヨーグルトに匹敵し得る。ヨーグルトの食味は、訓練された一団のヒト対象を使用して検査することができる。
組換え発現

チーズ組成物の形成において使用される１種または複数のタンパク質は、組換えによって産生することができる。一部の事例では、アルファＳ１、アルファＳ２およびカッパーカゼインは、組換えによって産生される。

アルファＳ１および／またはＳ２カゼインは、いずれかの種に由来するアミノ酸配列を有することができる。例えば、組換えアルファカゼインは、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ウマまたはラクダアルファカゼインのアミノ酸配列を有することができる。アルファカゼインヌクレオチド配列は、産生効率増加のためにコドン最適化することができる。例示的なアルファカゼインタンパク質配列を下の表１に提示する。組換えアルファカゼインは、アルファカゼインの天然に存在しないバリアントであり得る。そのようなバリアントは、ネイティブアルファカゼイン配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸挿入、欠失または置換を含むことができる。

そのようなバリアントは、配列番号１～２６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有することができる。用語「配列同一性」は、アミノ酸配列の文脈で本明細書で使用される場合、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後に、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮することなく、選択された配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的での整列は、当業者の技術範囲内にある様々な仕方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公開されているコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大の整列の達成に必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む、整列の測定に適切なパラメーターを決定することができる。

カッパーカゼインは、いずれかの種に由来するアミノ酸配列を有することができる。例えば、組換えカッパーカゼインは、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ウマまたはラクダカッパーカゼインのアミノ酸配列を有することができる。カッパーカゼインヌクレオチド配列は、産生効率増加のためにコドン最適化することができる。例示的なカッパーカゼインアミノ酸配列を下の表１に提示する。組換えカッパーカゼインは、カッパーカゼインの天然に存在しないバリアントであり得る。そのようなバリアントは、ネイティブカッパー配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸挿入、欠失または置換を含むことができる。

そのようなバリアントは、配列番号２７～４０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有することができる。

組換えアルファまたはカッパーカゼインは、宿主細胞において組換えにより発現される。本明細書で使用される場合、「宿主」または「宿主細胞」は、所望の産物を産生するように選択または遺伝子改変されたいずれかのタンパク質産生宿主を表示する。例示的な宿主は、糸状真菌等の真菌、ならびに細菌、酵母、植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む。一部の事例では、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の細菌宿主細胞を使用して、アルファおよび／またはカッパーカゼインタンパク質を産生することができる。他の宿主細胞は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍならびにＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．６８０３等が挙げられるがこれらに限定されない、細菌宿主を含む。

アルファおよびカッパーカゼインは、同じ宿主細胞において産生することができる。あるいは、アルファおよびカッパーカゼインは、異なる宿主細胞において産生することができる。標的タンパク質の発現は、発現ベクター、プラスミド、宿主ゲノムに組み込まれた核酸、または他の手段によって提供され得る。例えば、発現のためのベクターは、（ａ）プロモーターエレメント、（ｂ）シグナルペプチド、（ｃ）異種カゼイン配列および（ｄ）ターミネーターエレメントを含むことができる。一部の事例では、本明細書に記載されている１種または複数の発現ベクターは、ベータカゼインのタンパク質配列（配列番号４１～４２）を含まない。

カゼインの発現に使用することができる発現ベクターは、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を有する発現カセットを含有する発現ベクターを含む。一部の実施形態では、シグナルペプチド（ｃ）は、ベクターに含まれている必要はない。一部の事例では、シグナルペプチドは、カゼインタンパク質のネイティブシグナル配列の一部であり得る、例えば、タンパク質は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９または４１中に太字で示される通り、ネイティブシグナル配列を含むことができる。一部の事例では、ベクターは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９または４１に例示されるタンパク質配列を含む。一部の事例では、ベクターは、異種シグナル配列と共に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０に例示される成熟タンパク質配列を含むことができる。一般に、発現カセットは、同族宿主微生物のゲノム中に組み込まれる場合、または宿主細胞内に維持されるプラスミドもしくは他の複製ベクターに存在する場合、導入遺伝子の転写を媒介するように設計される。

宿主微生物への形質転換に先立つベクターの増幅に役立つように、複製起点（ｅ）がベクターに含有されていてよい。発現ベクターで安定に形質転換された微生物の選択に役立つように、ベクターは、選択マーカー（ｆ）を含むこともできる。発現ベクターは、宿主微生物への形質転換に先立つ発現ベクターの直鎖化を可能にする制限酵素部位（ｇ）を含有して、宿主ゲノムへの発現ベクターの安定した組込みを容易にすることもできる。一部の実施形態では、発現ベクターは、エレメント（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のいずれかのサブセットを含有してもよい、またはエレメント（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のいずれも含まなくてよい。当業者にとって公知の他の発現エレメントおよびベクターエレメントは、本明細書に記載されているエレメントと組み合わせてまたはこれに代えて使用することができる。

グラム陽性細菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）を使用して、培地中に標的タンパク質を分泌させることができ、グラム陰性細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等）を使用して、ペリプラズムまたは培地中に標的タンパク質を分泌させることができる。一部の実施形態では、発現された、細菌により発現されたタンパク質は、いかなる翻訳後修飾（ＰＴＭ）も有しなくてよく、これは、タンパク質がグリコシル化されていないおよび／またはリン酸化されていなくてよいことを意味する。

標的カゼインタンパク質は、ナイシン誘導性発現系（ＰｎｉｓＡプロモーターによって調節）、乳酸塩誘導性発現系（Ｐ１７０プロモーターによって調節）または他の同様の誘導性の系と、構成的に発現される系（Ｐ ｓｅｃＡプロモーターによって調節）の両方において、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおいて発現および産生され得、これらは両方共に、ベクターｐＮＺ８１４９（ｌａｃＦ遺伝子補充／レスキュー原理）を使用したＮＺ３９００等の食品グレード選択系統に存在する。機能的タンパク質の分泌は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓによって分泌される主要なＳｅｃ依存性タンパク質であるＵｓｐ４５のシグナルペプチド（ＳＰ（ｕｓｐ４５））によって可能となり得る。例えば、アルファ－Ｓ１－カゼインおよびカッパーカゼインは、合成オペロンを使用して、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおいて同時発現または個々に発現され得、遺伝子の順序は、図３に示す通り、カッパーカゼイン－アルファＳ１カゼインである。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ設計

Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓとは異なり、タンパク質発現に干渉し得る、複数の細胞内および細胞外プロテアーゼを有する。一部の実施形態では、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ系統は、細胞内および／または細胞外プロテアーゼの種類および量を低下させるように修飾され、例えば、それぞれ７（ＫＯ７）および８（ＷＢ８００Ｎ）種のプロテアーゼの欠失を有する系統を使用することができる。

組換えタンパク質分泌を駆動するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのａｍｙＱ、アルファ－アミラーゼのシグナルペプチドを使用することができる。その上、ネイティブカゼインシグナルペプチド配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて異種に発現させることができる。各カゼインタンパク質は、それ自身のシグナルペプチド配列を有し、系において使用することができる。シグナルタンパク質は、カゼインタンパク質と相互に（ｃｒｏｓｓ）組み合わせることができる。ｐＨＴ０１ベクターは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける誘導性タンパク質発現のための形質転換および発現シャトルとして使用することができる。ベクターは、ｌａｃオペレーターの付加によって効率的に制御可能な（ＩＰＴＧ誘導性）プロモーターへと変換された、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｇｒｏＥＳ－ｇｒｏＥＬオペロンに先行する強いσ^Ａ依存性プロモーターに基づく。ｐＨＴ０１は、アンピシリン抵抗性をＥ．ｃｏｌｉに、クロラムフェニコール抵抗性をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにもたらす、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓシャトルベクターである。

タグ付けされていないバージョンおよびタグ付けされたバージョンのカゼインを発現させることができ、ＨｉｓもしくはＳｔｒｅｐＩＩタグ配列等の小型のペプチドタグ、またはＧＳＴ、ＭＢＰもしくはＳＵＭＯ等の融合タンパク質は、分泌シグナルペプチドなしでカゼインに対してＮまたはＣ末端に置かれる。カッパー、アルファ－Ｓ１およびアルファＳ２カゼインの二次構造を考慮すると、タグ付けは、カッパーカゼインのＮ末端において破壊性が低くなり得る、アルファ－Ｓ１カゼインは、両末端においてタグ付けされる可能性が高くなり得る。しかし、他のタグを使用してもよい。
表１：配列

実施形態

次の説明的な実施例は、本明細書に記載されている組成物および方法の実施形態を代表するものであり、決して限定を意図するものではない。
（実施例１）
ナイシン誘導性の系（ＮＩＣＥ）によるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにおけるカゼインタンパク質の発現
構築物の設計、クローニングおよび形質転換

ウシカッパーカゼイン（バリアントＢ）およびウシアルファ－Ｓ１－カゼイン（バリアントＣ）タンパク質コード配列（ネイティブシグナルペプチドなし）を、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにおける発現のためにコドン最適化し、ナイシン誘導性プロモーター下での２種のタンパク質の同時発現および分泌のために合成オペロンを構築した。ネイティブに分泌する乳酸球菌タンパク質Ｕｓｐ４５由来のシグナルペプチド配列を使用して、タンパク質分泌を駆動した。次に、制限消化適合性部位を介してＥ．ｃｏｌｉカスタムベクターに合成オペロンをクローニングし、サンガー配列決定により、それが制限酵素消化およびライゲーションによりナイシン誘導性ｐＮＺ８１４９ベクターにサブクローニングされたか確認した。ベクターを電気穿孔により適合性Ｌ．ｌａｃｔｉｓ系統ＮＺ３９００に形質転換し、ラクトースを補充した完全限定培地（ＣＤＭ）を選択に使用した。コロニーＰＣＲにより陽性クローンを確認し、３個の陽性クローンをタンパク質発現誘導および解析のために前に進めた。
タンパク質発現および解析

３０℃で液体培養において個々のコロニーを育成し、ナイシンによりタンパク質産生を２．５時間誘導した（対照試料は誘導させずに置いた）。次に、細胞を遠心分離によって採取し、ＴＣＡ沈殿された上清および溶解された細胞ペレットを、クーマシーゲル染色（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）および化学発光（カッパーカゼインおよびアルファ－Ｓ１－カゼイン、ＬＳＢｉｏ一次抗体に対するウエスタンブロット）によって解析した。クーマシー染色されたタンパク質ゲルおよびウエスタンブロットによって、検査された形質転換体においてＬ．ｌａｃｔｉｓにおけるカッパーカゼイン発現を検出した。
（実施例２）
ｐＨ誘導性の系によるＬ．ｌａｃｔｉｓにおける発現

上述の構築と同様に、ナイシンプロモーターをＬ．ｌａｃｔｉｓのためのｐＨ／乳酸塩誘導性プロモーターであるＰ１７０プロモーターに置き換えて、アルファ、ベータおよびカッパーカゼインのためにカゼインタンパク質構築物を創出した。これらの構築物のそれぞれは、分泌シグナルペプチドを含有した。

ウエスタンブロットにおいて、分泌後にＬ．ｌａｃｔｉｓにおいてアルファ－Ｓ１およびカッパーカゼインの両方が検出された。アルファ－Ｓ１－カゼインについて、タンパク質産物は細胞内に蓄積した。アルファ－Ｓ１－カゼインの分泌が不十分であった一方で、カッパーカゼインは、産生されたタンパク質のほぼ完全な分泌を示した。
（実施例３）
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける発現
構築物の設計、クローニングおよび形質転換

Ｃ末端にＨｉｓタグ付けされた、ウシアルファ－Ｓ１－カゼイン（バリアントＣ）タンパク質コード配列（ネイティブシグナルペプチドなし）を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける発現のためにコドン最適化した。組換えタンパク質の効率的な分泌について報告された、ａｍｙＱ、アルファ－アミラーゼＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのコドン最適化されたシグナルペプチドありおよびなしで、構築物を創出した。形質転換および発現ＩＰＴＧ誘導性ベクターｐＨＴ０１へのＧｉｂｓｏｎクローニングにより、Ｅ．ｃｏｌｉにより構築物をクローニングし、サンガー配列決定により確認した。ｐＨＴ０１は、アンピシリン抵抗性をＥ．ｃｏｌｉに、クロラムフェニコール抵抗性をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにもたらす、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓシャトルベクターである。陽性クローンは、化学的にコンピテントなＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００Ｎにさらに形質転換した。コロニーＰＣＲにより陽性クローンを確認し、３個の陽性クローンをタンパク質発現誘導および解析のために前に進めた。
タンパク質発現および解析

３７℃で液体培養において個々のコロニーを育成し、ＩＰＴＧによりタンパク質産生を１時間、２時間および６時間誘導した（対照試料は誘導させずに置いた）。次に、細胞を遠心分離によって採取し、ＴＣＡ沈殿された上清および溶解された細胞ペレットを、クーマシーゲル染色（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）および化学発光（Ｈｉｓタグおよびアルファ－Ｓ１－カゼインに対するウエスタンブロット）によって解析した。

ウエスタンブロッティングは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるアルファ－Ｓ１－カゼインの発現を示した。
（実施例４）
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現
構築物の設計、クローニングおよび形質転換

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのためにコドン最適化されたウシアルファ－Ｓ１－カゼイン（バリアントＣ）タンパク質コード配列（ネイティブシグナルペプチドなし）を、ＩＰＴＧ誘導性の市販のｐＥＴベクターにクローニングした。タンパク質コード配列のみがオープンリーディングフレーム内に残されるような仕方で、ＤＮＡ断片およびベクターのＧｉｂｓｏｎ反応によりクローニングを行った。Ｇｉｂｓｏｎ反応物をコンピテント細胞に形質転換し、サンガー配列決定によって確認した。次に、ベクターを化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞またはその派生体（例えば、ＢＬ２１－ｐＬｙｓＳ）に形質転換し、いくつかの単一コロニーを発現についてスクリーニングした。
タンパク質発現、解析および精製

３７Ｃで液体培養において個々のコロニーを育成し、ＩＰＴＧによりタンパク質産生を４時間誘導した。次に、細胞を遠心分離によって採取し、溶解された細胞ペレットを、クーマシーゲル染色（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）および化学発光（アルファ－Ｓ１－カゼインに対するウエスタンブロット）によって解析した。タンパク質精製のため、不溶性画分を遠心分離によって除去し、次いで硫酸アンモニウムで室温にて可溶性画分を沈殿させ、遠心分離によってペレットにした。ペレットを尿素に再懸濁し、続いてリン酸二ナトリウムに対して透析した。不溶性タンパク質を遠心分離によって除去し、エタノールおよび酢酸アンモニウムによる沈殿と続く遠心分離によって、残っている夾雑物を除去した。遠心分離濾過ユニットを使用して、結果として生じるアルファ－Ｓ１－カゼイン溶液を濃縮し、次いでリン酸二ナトリウムに対して透析した。精製された産物を、上の説明と同様に、クーマシー染色されたゲルにおいて解析した。

アルファ－Ｓ１－カゼインを、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞内に発現させ、クーマシー染色されたタンパク質ゲルにおける検出および精製に成功した。
（実施例５）
ミセルカゼインを使用したチーズ作製プロセス

本実施例では、パスタ・フィラータチーズ様材料は、ミセルカゼイン粉末から作製した。ミセルカゼインは典型的に、産業界では、カゼインミセルを単離するためのスキムミルクの限外濾過と、カゼインミセルを粉末化するための噴霧乾燥技法によって得られる。水および糖と混合されたミセルカゼインは、細菌発酵または酸添加およびレンネット（キモシン）によるチーズ作製プロセスにおいて、ミルクと同様に作用し、特にモッツァレラ様チーズとなるミルク様チーズをもたらした（図４Ａ）。

同様の仕方で、ミセルカゼイン（Ｍｉｌｋ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ Ｇｌｏｂａｌから購入）を使用して、多数の方法によりモッツァレラ様材料を作製した：１４ｇ～２８ｇミセルカゼイン粉末、１０００ｍｌ水、レンネットおよびクエン酸によるモッツァレラ様チーズ；１４ｇ～２８ｇミセルカゼイン粉末、１０００ｍｌ水、クエン酸だけによるモッツァレラ様チーズ；１４ｇ～２８ｇミセルカゼイン粉末、１０００ｍｌ水、２０～５５ｇ植物ベースの糖、レンネットおよび乳酸菌によるモッツァレラ様チーズ；１４ｇ～２８ｇミセルカゼイン粉末、安定したエマルション（乳化剤ありおよびなし）における１～４％植物ベースの脂肪、２０～５５ｇ植物ベースの糖、レンネットおよびクエン酸によるモッツァレラ様チーズ；１４ｇ～２８ｇミセルカゼイン粉末、安定したエマルション（乳化剤ありおよびなし）における１～４％植物ベースの脂肪、２０～５５ｇ植物ベースの糖、クエン酸のみによるモッツァレラ様チーズ；１４ｇ～２８ｇミセルカゼイン粉末、安定したエマルション（乳化剤ありおよびなし）における１～４％植物ベースの脂肪、２０～５５ｇ植物ベースの糖、レンネットおよび乳酸菌によるモッツァレラ様チーズ。

別の実施例では、ラクトース（５％）を補充したミセルカゼイン液体コロイド（２．８％）を、対照としての無脂肪乳と並行して、中温性細菌スターター培養物を使用して酸性化した。ミセルカゼインコロイドおよびミルクは、レンネット処理剤が添加されるとｐＨほぼ５．７まで酸性化され、酸性化されたコロイドは、カードが沈降するまでそのままにして置いた（図４Ｂ）。次に、チーズクロスを通してカードの水気を切り、熱水に浸漬し、伸展してモッツァレラ様チーズボールにした。試料の堅さのテクスチャー分析機器評価を図４Ｃに示す（３回複製した試料における平均と標準偏差）。
（実施例６）
ミセルカゼインを使用して作製されたモッツァレラ様チーズの処方および特性

本実施例では、ミセルカゼイン（３．３％最終ｗ／ｖ）、ダイズレシチン（０．１％最終ｗ／ｖ）、溶けたヤシ油（１％最終ｗ／ｖ）および溶けたマーガリン（１％最終ｗ／ｖ）を一体にブレンドして、ペーストにした。ペーストを４０℃ミリＱ水と混合し、取り込むように撹拌し、その後、マルトース（２．５％最終ｗ／ｖ）をその中に混合した。脂肪が取り込まれるまで、高剪断（ｓｈｅｅｒ）ミキサーでブレンドを混合した。液体を３３℃まで冷却し、激しく撹拌しつつクエン酸溶液（０．１５％最終ｗ／ｖ）を添加し、その後、レンネット溶液（０．００３６％最終ｖ／ｖ）をその中に混合し、混合物を１５～３０分間静置した。チーズクロスで裏打ちしたふるいに入れてカードの水気を切り、熱水（＞６０℃）に浸し、数回伸展しては折り畳み、その後、モッツァレラ様ボールに成形した。

作製されたモッツァレラ様チーズのテクスチャープロファイルを、応力緩和検査を使用してテクスチャー分析機器ＴＸ．ＴＡにおいて探索し、２％脂肪の店で買ったミルクから作製されたモッツァレラと比較した。図５Ａは、上述の処方におけるミセルカゼインから作製されたモッツァレラ様チーズのテクスチャープロファイルが、２％ミルクから作製されたモッツァレラのテクスチャーに非常に密接にマッチすることを示す。

図５Ｂに示す通り、店で買った新鮮なモッツァレラに対する３点識別検査において、ミセルカゼインから作製されたモッツァレラ様チーズを、「ピザ」（ソースなしで、少量のチェリートマト、バジルおよびオリーブ油ありの、自家製のクラスト）の上に溶かして評定した。３点識別検査において、テイスターは、３個の試料を与えられ、そのうち２個は同じものであり、１個は異なる。テイスターは、全３個をテイスティングし、その中から異質な（ｏｄｄ）試料を特定することを求められる。正確な推察のオッズは、３につき１（３３．３３％）であるため、正確な応答の比率がそれよりも有意に大きい場合、２種の試料の間に識別可能な差があると結論することができる。正確な応答の比率が、３３．３３％よりも有意に大きくない場合、２種の試料の間に識別可能な差がないと結論することができる。

試料は、ランダムな順序でテイスターに提示されており、テイスターの半数は、２個のミセルカゼインモッツァレラピザおよび１個の店で買ったモッツァレラピザを受け取り、残りの半数は、その逆を受け取る。試料は、３桁コードのみによって特定された。

１９名のテイスターのうち、６名が、異質な１個を正確に特定しており、正確な応答の比率が３１．６％であったことを意味する。この結果は、ピザの上に溶かした場合、ミセルカゼインモッツァレラ様チーズおよび店で買ったモッツァレラチーズの間に有意差が特定されなかったことを示唆する。
（実施例６）
アルファ、ベータおよびカッパーカゼインを使用したカゼインミセル／液体コロイド再構成

アルファカゼイン、ベータカゼインおよびカッパーカゼイン画分を、凍結乾燥した粉末としてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

ミセル／液体コロイド形成実験において使用されるタンパク質の量は、１．４％（カゼインについて０．５×ミルク濃度）、２．８％（カゼインについて１×ミルク濃度）または３．２％（総タンパク質について１×ミルク濃度、ｗ／ｖ）であった。他に記述がなければ、全３種のカゼインによる実験のため、総タンパク質の１５％（質量で）がカッパーカゼインであり、総タンパク質の３０％がベータカゼインであり、総タンパク質の５５％はアルファカゼインであった。これにより、表２に示す条件毎に次の量が得られる。
表２：タンパク質濃度

アルファカゼイン、ベータカゼインおよびカッパーカゼインを水に逐次添加し、完全に溶解されるまで撹拌した。一部の実験では、混合物はまた、室温で一晩インキュベートした。
塩添加によるミセル誘導

アルファ、ベータおよびカッパーカゼインを、一連の塩組合せに晒してミセルを誘導し、カルシウム、リン酸塩およびクエン酸塩の比は、３：２：１または６：４：１に維持し、カルシウム濃度は、１．４％総カゼインのために１４～２４ｍＭであった。結果として生じる溶液は、ＤＬＳ、吸光度およびチーズ作製を使用して評定した。
表３： １．４％総タンパク質濃度のための最終塩濃度（ｍＭ）

濾過した（２２０ｎｍ）カルシウム（他に断りがない場合はＣａＣｌ２）、リン酸塩（他に断りがない場合はＫ２ＨＰＯ４）およびクエン酸塩（他に断りがない場合はクエン酸Ｋ３）を、表３の最終濃度となるように、固定された添加スケジュールにわたり５回の添加においてカゼイン溶液中に滴定した。１回目の添加はカルシウムのほんの一部を、他の添加は等しい割合の全３種の塩を含んだ。
動的光散乱（ＤＬＳ）機器を使用した粒子サイズ測定

より優れた測定精度をもたらすために、試料は一般に、濾過した（２２０ｎｍ）ミリＱ水において０．１４％（または１．４ｍｇ／ｍＬ）またはそれ未満の濃度に希釈した。Ｅｎｔｅｇｒｉｓ ＮｉｃｏｍｐまたはＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｅｉｚｅｒ機器のいずれかを使用して、試料を測定した。Ｎｉｃｏｍｐにおいて、９０°の検出角度で３回複製物を測定し、Ｎｉｃｏｍｐ解析ソフトウェアを使用してデータを解析した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒにおいて、１７３°の検出角度で３回複製物を測定し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒの小ピーク解析モードを使用してデータを解析した。ドーナツチャート（図６）は、１．４％タンパク質濃度で個々のカゼインタンパク質からミセルが再構成された実験のための、粒子サイジングデータを示す。いずれか主要な光散乱粒子集団に関して、機器によってガウス様ピークが報告される。ピークの平均は、ナノメートル（ｎｍ）単位の粒子（ミセル）直径を導き、ピークの強度は、報告される他のピークと比較した相対的散乱を導く。ドーナツチャートはまた、ピーク平均（ｎｍ単位の粒子サイズ）を、ドーナツチャートのスライスに書かれた数として、その強度（相対量）を、ドーナツチャートの一部としてのスライスの比率（角度）として報告する。ドーナツチャートは、３回複製した測定にわたる平均粒子サイズおよび平均強度を示す。ウシのミルクにおいて、カゼインミセルは、３０～８０ｎｍのサイズで検出されるサブミセル粒子を伴う、典型的に１５０～３００ｎｍ、最大で一般に５００ｎｍまでのサイズで検出される優勢な粒子である。
（実施例７）
再構成されたミセル／液体コロイドによるカードおよびチーズ作製

スモールスケール（数ｍＬ）で、２４ウェルプレートにおいてチーズを作製した。初期ｐＨを記録し、５．１～５．２の標的ｐＨに達するまで、６．６５％クエン酸溶液を徐々に滴定した。再構成された液体コロイドの体積の１．３６％で、０．１５％レンネット溶液を添加し、穏やかに混合した。およそ３０分間またはカードが形成されるまで、試料をそのままにして置いた。次に、カードをピペッティングしてマイクロチューブに入れ、２分間遠心分離してカードを分離した。分離された液体の水気を切り、熱水（＞６０℃）に浸すことによりカードを伸展した。滑らかで均質になるまでチーズを伸展し、次いでボールに成形し、秤量した。より大きい体積のため、プロセスは、遠心分離ステップを除いて同じプロトコールに従った。その代わりに、チーズクロスで裏打ちしたメッシュの濾し器を使用してカードの水気を切った。

脂肪、糖および追加的な構成成分を有する完全処方チーズのため、誘導されたミセルを有する液体コロイドをウォーターバスにおいて４０℃に温めた。脂肪を溶かし、糖がコーティングされるまで糖とブレンドした。乳化剤が使用された場合、これも脂肪／糖ブレンドに添加した。次に、温められたタンパク質液体コロイドを脂肪／糖混合物に注ぎ、高剪断ミキサーを使用してブレンドした。混合時間は、試料体積に依存したが、１～５分間に及んだ。次に、１回の通過につき５０００ｐｓｉで混合物をＡｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ－５ホモジナイザーに通過させた。次に、上に記載されている通りに、酸性化およびレンネット処理を行う。図７Ａおよび図７Ｂは、ミセル組成物Ａ～Ｆを含む実施例６の液体コロイドから形成されたカードおよびチーズを示す。
（実施例８）
シミュレートされた（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ）ミルク限外濾液（ＳＭＵＦ）「乳清」におけるカードおよびチーズ作製

異なる塩条件Ａ～Ｆおよび追加的な組成物Ｇ（塩なし）による液体コロイド組成物を用いて、実施例７の上述のカードおよびチーズ作製プロトコールを行った。結果を下の表４に要約する。
表４：カードおよびチーズ作製結果

（実施例９）
アルファカゼインおよびカッパーカゼインを使用した、カゼインミセル／液体コロイド再構成、カードおよびチーズ作製

これらの実験におけるアルファカゼインおよびカッパーカゼインは、凍結乾燥した粉末としてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ミセル／液体コロイド形成実験において使用されるタンパク質の標準量は、表５にも示すが、１．４％（カゼインについて０．５×ミルク濃度）、２．８％（カゼインについて１×ミルク濃度）または３．２％（総タンパク質について１×ミルク濃度、ｗ／ｖ）であった。他に記述がなければ、総タンパク質の１５％（質量で）はカッパーカゼインであり、一方、総タンパク質の８５％はアルファカゼインであった。
表５：タンパク質濃度

１．４％タンパク質液体コロイドのため、アルファカゼインおよびカッパーカゼインを水に逐次添加し、完全に溶解するまで撹拌した。一部の実験では、混合物を室温で一晩インキュベートした。次に、カルシウム、リン酸塩およびクエン酸塩を、表３の最終濃度まで滴定した。塩添加スケジュールおよびその後の粒子サイズ測定方法は、実施例６に示すものと同様に行った。粒子サイジングの結果を図８に示し、ドーナツチャートの標識は、実施例６に記載されているものと同じである。粒子サイズデータは、各条件間のごく僅かな変動を表示し、いずれも、いかなる主要な凝集を示さなかった。

ミセル／液体コロイド再構成およびチーズ作製はまた、表６の塩条件を使用して、表７に示す通り２．８％および３．２％最終タンパク質濃度で検査した。初期ｐＨは約６．０であり、最終ｐＨは約５．２であった。チーズ作製のため、クエン酸およびレンネットを、実施例７の通りに添加した。
表６：最終塩濃度（ｍＭ）およびタンパク質濃度（％）

表７：カードおよびチーズ作製結果

テイスティングおよびテクスチャー解析のためのスケールアップされたアルファカゼイン＋カッパーカゼインチーズ（完全処方における）

本実験は、対照としてカゼイン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入）を使用して、３０ｍＬスケールで行った。両方のタンパク質混合物（アルファおよびカッパーカゼイン対カゼイン酸ナトリウム）においてミセルを誘導し、次いで、下の表８に示す完全処方において使用した。
表８：チーズ組成

タンパク質がアルファ＋カッパーカゼインまたは対照としてのカゼイン酸ナトリウムである上述の組成（表８）により、カードおよびチーズ作製を行った。出発ｐＨは約６．０であり、最終ｐＨは約５．１～５．２であった。クエン酸およびレンネットを、実施例７の通りに添加した。結果を表９に提示する。
表９：カードおよびチーズ作製結果

アルファ＋カッパーカゼインは、より多くのチーズおよびより優れた品質のカードを生じたが、カゼイン酸ナトリウムチーズと同様のテクスチャーを有した。カゼイン酸ナトリウムチーズは強い異臭を有し、一方、アルファ＋カッパーチーズは異臭を有しなかった。両方のチーズをテクスチャー分析機器において３回繰り返して測定し、結果を図９Ａおよび図９Ｂに示す。アルファ＋カッパーカゼイン由来のチーズは、より堅いテクスチャーを有したが、全体的に見て、カゼイン酸ナトリウムチーズと非常に類似していた。このことは、アルファ＋カッパーカゼインが、ミセル／液体コロイド、乳製品のカードおよび乳製品のチーズを形成し得ること、また、ベータカゼインが、これらの機能に必要ないことを実証する。
（実施例１０）
アルファカゼイン（脱リン酸化／低リン酸化）およびカッパーカゼインを使用した、カゼインミセル／液体コロイド再構成、カードおよびチーズ作製

本実験に使用されるタンパク質は、脱リン酸化アルファカゼインおよびカッパーカゼイン（両方共にＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手）であった。このアルファカゼイン（脱リン酸化アルファカゼインとして市販）のリン酸化状態を、個々のタンパク質のホスホ種を分離するための確立された方法である中性尿素Ｔｒｉｔｏｎ ＰＡＧＥによって評価した。この系は、変性剤として尿素を使用し、中性ｐＨで泳動される。この評価は、脱リン酸化アルファカゼインタンパク質が、タンパク質の大部分に残っている平均で１～２個のリン酸を有し、少量のタンパク質が、より高いレベルのリン酸化を有することを実証した。したがって、このタンパク質は低リン酸化されており、ミルクアルファカゼインと比較して実質的に低下されたリン酸化を有することを意味する（１～２個のリン酸形態が優勢 対 ８～９個のリン酸形態が優勢）。

低リン酸化アルファカゼインおよびカッパーカゼインタンパク質を上の表５に示す量で使用し、これを水に逐次添加し、完全に溶解するまで撹拌することにより、ミセル／液体コロイドへと再構成した。次に、混合物を実施例７および８に記載されている通りに処置し、同様の塩条件下およびタンパク質濃度で評定した。

実施例６に示す通りに粒子サイズを測定した。実施例７および８に示す方法を使用して、カードおよびチーズ作製を行った。低リン酸化アルファ＋カッパーは、低減された濁度（Ａ４００）から分かる通り、アルファ＋カッパーよりも少ない単量体からミセルへの変換効率を示した。低リン酸化アルファ＋カッパーは、一般に、アルファおよびカッパーまたはアルファ、ベータおよびカッパーと比較した場合、若干より緩いミセルを産生するが、依然として、ミルク由来のネイティブミセルサイズの範囲（１５０～５００ｎｍ）内にある。低リン酸化アルファ＋カッパーは、いかなる主要な凝集も示さなかった。

酸性化およびレンネットによる低リン酸化アルファ＋カッパー液体コロイドのチーズ作製結果を図１０に示し、チーズボールのより近接した視覚的比較を図１１に示す。

低リン酸化アルファおよびカッパーミセル／液体コロイドはまた、実施例９に記載されている塩条件において、より高いタンパク質濃度で評定した。これらの条件の粒子サイズを図１２に示す。２種の濃度のタンパク質（２．８％および３．２％）は、一体となったカードを生じ、多少の液体がその上にあり、カードは伸展が容易であった。チーズ重量は、０．０４６７グラムであり、２．８％試料について１．０７ｇチーズ／ｇタンパク質の収量をもたらした。チーズ重量は、０．０８９９グラムであり、３．２％試料について２．０６ｇチーズ／ｇタンパク質の収量をもたらした。Ａ５７５は、２．８％試料について０．０５４であり、３．２％試料について０．０３８であった。どちらの試料も、いかなる凝集も示さなかった。
（実施例１１）
アルファカゼインおよびカッパーカゼイン（脱グリコシル化）を使用した、カゼインミセル／液体コロイド再構成、カードおよびチーズ作製

凍結乾燥されたカッパーカゼイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）から脱グリコシル化カッパーカゼインを生成した。これは、有意なタンパク質分解を伴わずにタンパク質を選択的に脱グリコシル化する、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）により達成された（Ｓｏｊａｒ ａｎｄ Ｂａｈｌ， １９８７， Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ； Ｅｌｅｃｔｒｉｃｗａｌａ ｅｔ ａｌ， Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。

ＰｒｏＱ Ｅｍｅｒａｌｄ３００糖タンパク質染色キットを使用して、カッパーカゼインのグリコシル化を検出し、脱グリコシル化に成功したことを確認した。結果は、カゼインタンパク質における脱グリコシル化反応後に糖タンパク質シグナルが排除された（＞９５％）ことを指し示し、カッパーカゼインの脱グリコシル化に成功したことを意味する。

出発点として１．４％タンパク質プロトコール（実施例６および９に記載されている通り）を使用して、ミセル／液体コロイド再構成実験を行い、アルファカゼイン濃度を一定に保持しつつ、２×および３×カッパーカゼイン濃度を検査した。脱グリコシル化カッパーカゼインをクエン酸に貯蔵し、カッパーカゼインおよびアルファカゼインを混合した後に、ＮａＯＨの化学量論的添加によってクエン酸を中和した。次に、固定された添加スケジュールに要求される総クエン酸塩から、添加されたクエン酸塩の量を付随して低下させた。

ミセル／液体コロイドを形成した後に、図１３に示すように各試料を視覚的に試験し、下の表１０に示す通り５２５ｎｍにおける吸光度によって濁度をアッセイした。実施例６に記載されている通りに測定されたミセルピークの平均粒子サイズを図１４に示す。エラーバーは、３回複製した測定の標準偏差を指し示す。
表１０：濁度結果

実施例８に記載されているチーズ形成のための酸性化およびレンネット処理後に、異なる試料を視覚的に（図１５）および１ｍｌの液体コロイドから得られる収量について（図１６）アッセイした。溶液からタンパク質が崩壊した１×脱グリコシル化カッパーカゼインを除いて、全試料が、形を崩さずにひっくり返すのに十分なほど強いゲルを有する優良なカードを形成した。これらの条件の全てのカードが、優良な伸展性を有し、良く溶けた。
（実施例１２）
アルファカゼイン（脱リン酸化／低リン酸化）およびカッパーカゼイン（脱グリコシル化）を使用した、カゼインミセル／液体コロイド再構成、カードおよびチーズ作製

本実施例のための方法は、アルファカゼインの代わりに低リン酸化アルファカゼインが使用され、１×および２×カッパーカゼイン条件のみが検査されたことを除いて、実施例１１において使用される方法と同じものである。ミセル／液体コロイド形成後に、濁度（Ａ５２５）をアッセイし、結果を下の表に示す。
表１１：濁度結果

ミセルピークの平均粒子サイズを図１７に示す。エラーバーは、３回複製した測定の標準偏差を指し示す。各条件において形成された１ｍｌのミセルから得たカード収量は、相対的に同様であり、全条件におけるカードが、優良な伸展性を有し、良く溶けた。
（実施例１３）
組換えアルファ－Ｓ１－カゼイン（脱リン酸化）およびカッパーカゼインを使用した、カゼインミセル／液体コロイド再構成、カードおよびチーズ作製

組換えアルファ－Ｓ１－カゼインとカッパーカゼイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ミセル／液体コロイドを形成した。１×または２×カッパーカゼインのいずれかと共に、１．４％タンパク質を使用した。次の塩を使用した：２７ｍＭ塩化カルシウム、２２ｍＭリン酸二ナトリウム、１０ｍＭクエン酸三ナトリウム。アルファ－Ｓ１－カゼイン、カッパーカゼイン、クエン酸三ナトリウムおよび半量のリン酸二ナトリウムを含有する溶液により、反応を開始させた。総計９回の添加において塩化カルシウムおよび残りの半量のリン酸二ナトリウムを添加し、それによると、１回目の添加はカルシウムのほんの一部を、他の添加は等しい割合のカルシウムおよびリン酸塩を含んだ。

異なる条件の濁度は、表１２に示す通りであった。
表１２：濁度結果（Ａ５２５）

ミセルピークの平均粒子サイズを図１８に示す。エラーバーは、３回複製した測定の標準偏差を指し示す。条件毎のチーズ収量を図１９に示す。

カードは、伸展されたときに表１３に示す特性を有した。
表１３：カード伸展特性

（実施例１４）
組換えアルファ－Ｓ１－カゼイン（脱リン酸化）およびカッパーカゼイン（脱グリコシル化）を使用した、カゼインミセル／液体コロイド再構成、カードおよびチーズ作製

組換えアルファ－Ｓ１－カゼインと脱グリコシル化カッパーカゼインを使用して、ミセル／液体コロイドを形成した（実施例１１の通りに）。１×または２×カッパーカゼインのいずれかと共に、１．４％タンパク質を使用した。次の塩を使用した：２７ｍＭ塩化カルシウム、２２ｍＭリン酸二ナトリウムおよび１０ｍＭクエン酸三ナトリウム。アルファ－Ｓ１－カゼイン、脱グリコシル化カッパーカゼイン、クエン酸三ナトリウムおよび半量のリン酸二ナトリウムを含有する溶液により反応を開始させた。実施例１３に説明されている通りにミセルを形成した。異なる条件の濁度を表１４に示す。
表１４：濁度結果（Ａ５２５）

ミセルピークの平均粒子サイズを図２０に示す。エラーバーは、３回複製した測定の標準偏差を指し示す。条件毎のチーズ収量を図２１に示す。カードは、伸展されたときに表１５に指し示す特性を有した。
表１５：カード伸展特性

Claims (75)

1. 凝固したコロイドを含むチーズ組成物であって、
   前記凝固したコロイドが、ミセル形態で会合したαカゼインタンパク質およびκカゼインタンパク質を含み、
   前記α（アルファ）カゼインタンパク質および前記κ（カッパー）カゼインタンパク質のうち少なくとも一方が、組換えにより産生され、
   前記チーズ組成物が、β（ベータ）カゼインタンパク質を含有しない、チーズ組成物。
2. 組換えにより産生されたカゼインが、細菌宿主細胞から産生される、請求項１に記載のチーズ組成物。
3. 前記αおよびκカゼインタンパク質が両方共に、組換えにより産生される、請求項１または請求項２に記載のチーズ組成物。
4. 前記組換えにより産生されたαおよびκカゼインタンパク質が、１つまたは複数の細菌宿主細胞から産生される、請求項３に記載のチーズ組成物。
5. 前記αカゼインタンパク質が、ネイティブαカゼインと比較して、翻訳後修飾が完全にないかまたは実質的に低減されている、請求項１～４のいずれかに記載のチーズ組成物。
6. 前記αカゼインタンパク質が、ネイティブαカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかまたは実質的に低減されている、請求項５に記載のチーズ組成物。
7. 前記κカゼインタンパク質が、ネイティブκカゼインと比較して、翻訳後修飾が完全にないかまたは実質的に低減されている、請求項１～６のいずれかに記載のチーズ組成物。
8. 前記κカゼインタンパク質が、ネイティブκカゼインと比較して、グリコシル化が完全にないかまたは実質的に低減されている、請求項７に記載のチーズ組成物。
9. 前記κカゼインタンパク質が、ネイティブκカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかまたは実質的に低減されている、請求項７または請求項８に記載のチーズ組成物。
10. 前記細菌宿主細胞が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．６８０３およびＥ．ｃｏｌｉからなる群から選択される、請求項２または請求項４に記載のチーズ組成物。
11. 前記細菌宿主細胞が、組換えにより産生されたカゼインタンパク質を分泌する、請求項１０に記載のチーズ組成物。
12. 前記細菌宿主細胞が、前記組換えカゼインタンパク質を細胞内に保持する、請求項１０に記載のチーズ組成物。
13. 前記細菌宿主細胞における組換えにより産生されたタンパク質の産生が、誘導性プロモーターによって調節される、請求項１０または請求項１１に記載のチーズ組成物。
14. 前記細菌宿主細胞における組換えにより産生されたタンパク質の産生が、構成的プロモーターによって調節される、請求項１０または請求項１１に記載のチーズ組成物。
15. αカゼインタンパク質のκカゼインタンパク質に対する比が、１：１～約１５：１である、請求項１～１４のいずれかに記載のチーズ組成物。
16. αカゼインタンパク質のκカゼインタンパク質に対する比が、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１または１５：１である、請求項１５に記載のチーズ組成物。
17. 前記αカゼインタンパク質が、αＳ１またはαＳ２である、請求項１～１５のいずれかに記載のチーズ組成物。
18. 前記αカゼインタンパク質が、配列番号１～２６のうち１種または少なくとも８０％配列相同性を有するそのバリアントを含むアミノ酸配列を有する、請求項１～１６のいずれかに記載のチーズ組成物。
19. 前記κカゼインタンパク質が、配列番号２７～４０のうち１種または少なくとも８０％配列相同性を有するそのバリアントを含むアミノ酸配列を有する、請求項１～１６のいずれかに記載のチーズ組成物。
20. 約１５０ｎｍ～約５００ｎｍの間または約１００ｎｍ～約５００ｎｍの間のサイズの前記ミセル形態の集団を含む、請求項１～１９のいずれかに記載のチーズ組成物。
21. 前記集団の前記ミセル形態の一部が、１００ｎｍ未満または約１０ｎｍ～１００ｎｍの間のサイズである、請求項２０に記載のチーズ組成物。
22. カルシウム塩、クエン酸塩およびリン酸塩からなる群から選択される少なくとも１種の塩をさらに含む、請求項１～２１のいずれかに記載のチーズ組成物。
23. 前記チーズが、いかなる追加的な乳製品由来のタンパク質も欠いている、請求項１～２２のいずれかに記載のチーズ組成物。
24. 前記チーズが、いかなる動物由来の乳製品タンパク質も欠いている、請求項１～２３のいずれかに記載のチーズ組成物。
25. 前記チーズが、約０％～約５０％の間の脂肪含量を有し、前記脂肪が、植物ベースの供給源に由来する、請求項１～２４のいずれかに記載のチーズ組成物。
26. 前記チーズが、約０％～約１０％の間の糖含量を有し、前記糖が、植物ベースの供給源に由来する、請求項１～２５のいずれかに記載のチーズ組成物。
27. 前記チーズが、加熱されると、溶けることおよび褐変することが可能になる、請求項１～２６のいずれかに記載のチーズ組成物。
28. 前記チーズが、パスタ・フィラータ様チーズ、パニール、クリームチーズおよびカッテージチーズからなる群から選択される、請求項１～２７のいずれかに記載のチーズ組成物。
29. 前記チーズが、チェダー、スイス、ブリー、カマンベール、フェタ、ハルーミ、ゴーダ、エダム、チェダー、マンチェゴ、スイス、コルビー、ミュンスター、ブルーチーズまたはパルメザンからなる群から選択される熟成したまたは成熟したチーズである、請求項１～２７のいずれかに記載のチーズ組成物。
30. 前記チーズが、モッツァレラである、請求項２７に記載の組成物。
31. 前記チーズの水分保持が、４０～６５％である、請求項１～３０のいずれかに記載のチーズ組成物。
32. 前記チーズのテクスチャーが、動物由来の乳製品のチーズに匹敵する、請求項１～３０のいずれかに記載のチーズ組成物。
33. 前記チーズの硬度が、動物由来の乳製品のチーズに匹敵する、請求項１～３０のいずれかに記載のチーズ組成物。
34. 食用組成物を産生するための方法であって、
    組換えαカゼインタンパク質および組換えκカゼインタンパク質が液体コロイドにおいてミセル形態を形成する条件下で、前記αカゼインタンパク質、前記κカゼインタンパク質および少なくとも１種の塩を組み合わせるステップであって、前記ミセル形態が、βカゼインタンパク質を含まない、ステップと、
    前記液体コロイドを第１の条件に供して、凝固物を形成するステップと
    を含む方法。
35. 前記第１の条件が、酸の添加または微生物による前記液体コロイドの酸性化である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記凝固物を熱水処置に供し、必要に応じて伸展して、フィラータ型チーズを形成するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
37. 前記凝固物をレンネット処理剤に供して、レンネット処理されたカードを形成するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
38. 前記レンネット処理剤が、微小生物に由来するキモシン酵素である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記レンネット処理されたカードを熟成および成熟させて、チーズ様組成物を形成するステップをさらに含む、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
40. 前記レンネット処理されたカードを熱水処置に供し、必要に応じて伸展して、フィラータ型チーズを形成するステップをさらに含む、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
41. 前記食用組成物が、βカゼインタンパク質を含まない、請求項３４～４０のいずれかに記載の方法。
42. 前記食用組成物が、いかなる追加的な乳製品由来のタンパク質も含まない、請求項３４～４１のいずれかに記載の方法。
43. 前記食用組成物が、いかなる動物由来の乳製品タンパク質も含まない、請求項３４～４１のいずれかに記載の方法。
44. 前記組換えにより産生されたαおよびκカゼインタンパク質が、１つまたは複数の細菌宿主細胞から産生される、請求項３４～４３のいずれかに記載の方法。
45. 前記αカゼインタンパク質が、ネイティブαカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかまたは実質的に低減されている、請求項３４～４４のいずれかに記載の方法。
46. 前記κカゼインタンパク質が、ネイティブκカゼインと比較して、グリコシル化が完全にないかまたは実質的に低減されている、請求項３４～４５のいずれかに記載の方法。
47. 前記κカゼインタンパク質が、ネイティブκカゼインと比較して、リン酸化が完全にないかまたは実質的に低減されている、請求項３４～４６のいずれかに記載の方法。
48. 前記細菌宿主細胞が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．６８０３およびＥ．ｃｏｌｉからなる群から選択される、請求項４４～４７のいずれかに記載の方法。
49. １つまたは複数の細菌宿主細胞が、組換えにより産生されたαカゼインタンパク質およびκカゼインタンパク質を分泌する、請求項４４～４８のいずれかに記載の方法。
50. １つまたは複数の細菌宿主細胞が、組換えにより産生されたαカゼインタンパク質およびκカゼインタンパク質を細胞内に保持する、請求項４４～４８のいずれかに記載の方法。
51. αカゼインタンパク質およびκカゼインタンパク質の一方または両方の産生が、誘導性プロモーターによって調節される、請求項４４～５０のいずれかに記載の方法。
52. αカゼインタンパク質およびκカゼインタンパク質の一方または両方の産生が、構成的プロモーターによって調節される、請求項４４～５０のいずれかに記載の方法。
53. 前記ミセル形態におけるαカゼインタンパク質のκカゼインタンパク質に対する比が、約１：１～約１５：１の間である、請求項３４～５２のいずれかに記載の方法。
54. 前記ミセル形態におけるαカゼインタンパク質のκカゼインタンパク質に対する比が、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１または１５：１である、請求項５３に記載の方法。
55. 前記αカゼインタンパク質が、αｓ１またはαｓ２である、請求項３４～５４のいずれかに記載の方法。
56. 前記αカゼインタンパク質が、配列番号１～２６または少なくとも８０％配列相同性を有するそれらのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４～５５のいずれかに記載の方法。
57. 前記κカゼインタンパク質が、配列番号２７～４０または少なくとも８０％配列相同性を有するそれらのバリアントから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４～５５のいずれかに記載の方法。
58. 前記液体コロイドが、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍの間または約１００ｎｍ～約５００ｎｍの間のサイズの前記ミセル形態の集団を含む、請求項３４～５７のいずれかに記載の方法。
59. 前記集団の前記ミセル形態の一部が、１００ｎｍ未満または約１０ｎｍ～１００ｎｍの間のサイズである、請求項３４～５８のいずれかに記載の方法。
60. 前記塩が、カルシウム塩である、請求項３４～５９のいずれかに記載の方法。
61. 前記液体コロイドを形成するステップが、リン酸塩および／またはクエン酸塩の添加をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
62. 請求項３４または請求項４１～６１に記載の方法のいずれかによって形成された凝固した組成物。
63. 請求項３３または請求項３７～６２に記載の方法のいずれかによって形成されたレンネット処理されたカード組成物。
64. 請求項３４～６３に記載の方法のいずれかによって形成されたチーズ様組成物。
65. 前記αカゼインタンパク質が、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ウマまたはラクダαカゼインタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１～３３のいずれかに記載のチーズ様組成物、または請求項３４～６４のいずれかに記載の方法によって形成されたチーズ様組成物。
66. 前記κカゼインタンパク質が、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ウマまたはラクダκカゼインタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１～３３のいずれかに記載のチーズ組成物、または請求項３４～６４のいずれかに記載の方法によって形成されたチーズ組成物。
67. 前記レンネット処理凝固時間が、１分～６時間である、請求項３４に記載の方法。
68. ミセル形態を含む液体コロイドであって、前記ミセル形態が、組換えαカゼインタンパク質、組換えκカゼインタンパク質および少なくとも１種の塩を含み、前記αカゼインタンパク質、前記κカゼインタンパク質またはこれらの組合せが、翻訳後修飾を完全に欠いている、またはこれが実質的に低下されている、液体コロイド。
69. （ａ）前記αカゼインタンパク質が、動物由来のαカゼインと比較して、リン酸化を完全に欠いているもしくはそれが実質的に低下されている、または（ｂ）前記κカゼインタンパク質が、動物由来のκカゼインと比較して、グリコシル化を完全に欠いているもしくはそれが実質的に低下されている、または（ｃ）前記κカゼインタンパク質が、動物由来のκカゼインと比較して、リン酸化を完全に欠いているもしくはそれが実質的に低下されている、または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せである、請求項６８に記載の液体コロイド。
70. 前記ミセル形態が、βカゼインタンパク質を含まない、請求項６８または請求項６９に記載の液体コロイド。
71. 請求項６８～７０のいずれかに記載の液体コロイドから形成されたヨーグルト組成物。
72. 前記液体コロイドを加熱し、次いで冷却するステップと、微生物により前記液体コロイドを酸性化するステップとをさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。
73. 前記微生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、乳酸桿菌またはビフィズス菌のうち１種または複数を含む、請求項７２に記載の方法。
74. 前記αカゼインタンパク質が、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ウマまたはラクダαカゼインタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載のヨーグルト組成物、または請求項７２～７３のいずれかに記載の方法によって形成されたヨーグルト組成物。
75. 前記κカゼインタンパク質が、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ウマまたはラクダκカゼインタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載のヨーグルト組成物、または請求項７２～７３のいずれかに記載の方法によって形成されたヨーグルト組成物。

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