JP2022529771A - プロモーター配列及び関連製品並びにそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、医学的に関心のある複数の哺乳動物細胞型において遺伝子発現を駆動することができる短いユビキタスプロモーター要素を提供する。プロモーターを組み込んだ発現ベクターが本明細書に開示される。ウイルスベクター、特に、従来のプロモーターで可能であるよりも大きい導入遺伝子を取り込めるＡＡＶベクターが本明細書に開示される。遺伝子発現を増強する方法が本明細書に開示される。

Description

関連出願
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／８３８，０６３号の優先権を主張する。

連邦政府主催の研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号Ｕ０１ ＤＫ０８９５６９の下で政府の支援を受けて作成された。政府は発明に一定の権利を有する。

本開示は、概してバイオテクノロジーの分野、特にプロモーター配列及び関連製品並びにそれらの使用に関する。

ウイルスベクターに使用される最も広く使用されている強力なユビキタスプロモーター（ＣＭＶ、ＣＡＧなど）は非常に大きい（約１，０００ｂｐ）。これは、発現させることができる導入遺伝子の点で制限し得る。例えば、ＡＡＶパッケージの制限は、約４．８ｋｂである。現在使用されているプロモーターの減算後、これでは、一本鎖ＡＡＶの場合は導入遺伝子用に約３．７ｋｂしか残らず、自己相補的ｒＡＡＶの場合は約１．２ｋｂしか残らない。より大きな導入遺伝子を発現させることを可能にすることになるプロモーターが必要とされている。

医学的関心のある複数の哺乳類細胞型において高収率の遺伝子発現を駆動することができる小さいユビキタスプロモーター要素が本明細書で提供される。加えて、このプロモーターは、ヒト膵臓内分泌細胞（β細胞及びα細胞）並びに原発性ヒト肝細胞においてうまく機能する。これらは、非常に強力なユビキタスプロモーターＣＭＶ及びＣＡＧに匹敵する強さである。

プロモーターは、プラスミド及びウイルスベクターと共に使用することができる。プロモーターは、一本鎖ＡＡＶでは約４ｋｂ、自己相補的ＡＡＶでは約１．６ｋｂの導入遺伝子を挿入することを可能にし得る。このサイズの利点は、自己相補的ベクターで特に顕著である。

図１Ａは、β様細胞に分化したヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の顕微鏡画像を示す。上側のパネルは、例示的なＩＮＳ８４プロモーター下でｍＲＦＰを発現するＡＡＶ－ＫＰ１が形質導入された細胞の画像を示す。下側のパネルは、ＡＡＶが形質導入されなかった細胞を示す。左側のパネルは、ＥＳ－β様細胞の明視野顕微鏡画像を示し、中央のパネルは、インスリン発現を示す緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞の画像を示す。右側のパネルは、ＩＮＳ８４プロモーターからの導入遺伝子の発現を示唆する赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の画像を示す。 図１Ｂは、ＲＦＰ及びＣペプチド（ｃ－ｐｅｐ）、成熟β細胞で発現されるペプチドを測定するＦＡＣＳ分析のグラフ表示である。 図２は、例示的なＩＮＳ８４プロモーター（左側のパネル）又は完全長インスリンプロモーター（右側のパネル）下でｍＲＦＰを発現するＡＡＶが形質導入された死体に由来する初代ヒト膵島の顕微鏡画像を示す。上側のパネルはＲＦＰの落射蛍光顕微鏡画像を示し、下側のパネルは明視野顕微鏡画像を示す。 図３は、例示的なＡＡＶ－ＩＮＳ８４－ｍＲＦＰが形質導入されたヒト膵島細胞のＦＡＣＳ分析グラフである。左側のパネルは、試験した総細胞集団におけるＲＦＰ発現を表すグラフである。右側のパネルは、ＲＦＰ陽性細胞におけるｃ－ｐｅｐ及びグルカゴン（ｇｃｇ）の測定値を表すグラフである。これは、α細胞及びβ細胞の両方における導入遺伝子の発現を示す。 図４は、例示的なＡＡＶ－ＩＮＳ８４－ｍＲＦＰ（左側のパネル）又はＡＡＶ－ＩＮＳｘ１－ｍＲＦＰ（右側のパネル）が形質導入された初代ヒト膵島細胞のＦＡＣＳ分析のグラフ表示である。上側のパネルは、側方散乱対ＲＦＰの測定値を表すグラフである。下側のパネルは、細胞集団の定量値を示す。 図５は、例示的なＡＡＶ－ＩＮＳ８４－ｍＲＦＰが形質導入されたヒト胚性幹細胞由来β細胞の顕微鏡画像を示す。左から右に、明視野顕微鏡画像、ＧＦＰの描写、そしてｍＲＦＰの描写である。 図６は、例示的なＩＮＳ８４プロモーター（左側のパネル）下でｍＲＦＰを発現するＡＶＶが形質導入された、又はＣＡＧプロモーター（右側のパネル）下でｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＡＡＶが形質導入されたヒト肝細胞の蛍光顕微鏡画像である。 図７は、例示的なＡＡＶ－ＩＮＳ８４－ｍＲＦＰが形質導入されたヒト胚性腎臓細胞（左側のパネル）、マウスインシュリノーマ細胞（中央のパネル）、及びマウスα細胞（右側のパネル）におけるＲＦＰ強度の落射蛍光顕微鏡画像を示す。

本開示は、医学的関心のある複数の哺乳動物細胞型において遺伝子発現を駆動することができる短いユビキタスプロモーター要素を提供する。この短いユビキタスプロモーター要素は、非常に強いユビキタスプロモーターＣＭＶ及びＣＡＧの強度に匹敵し得る。

プラスミド及びウイルス発現ベクターを含むクローニングベクターにおける遺伝子及びＤＮＡ要素の転写のためのプロモーターが本明細書に開示される。プロモーターの例（本明細書では「ＩＮＳ８４」と呼ばれる）は、ヒトインスリンプロモーター由来の８４塩基対から構成され、コアプロモーターＴＡＴＡボックス及び転写開始＋１の上流に位置する上流ＣＡＡＴボックス領域を含む。

ＩＮＳ８４を、遺伝子治療における潜在的な使用のための組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターでの転写活性について試験した。試験した細胞は、ヒト膵島細胞、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞、及びＥＳ細胞から分化したβ細胞、ヒト肝細胞、及びいくつかの不死の細胞株細胞であった。ＩＮＳ８４は、試験されたすべての細胞において活性であり、強力なユニバーサルプロモーターとして潜在的に分類される。ＩＮＳ８４は、α、β、及び他のタイプを含むヒト膵島のすべての細胞型で赤色蛍光レポーター導入遺伝子ｍＲＦＰを発現した。さらに、ＩＮＳ８４は、膵島における完全長ヒトインスリンプロモーター（３６３ｂｐ）よりも高い活性を示した。従って、ＩＮＳ８４プロモーターは、ＡＡＶ媒介遺伝子発現及び他の発現ベクターに有用なツールとなり得る。

本明細書で使用される「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を誘導し、これによりＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、即ち、転写を誘導するのに十分な最小配列を包含する。プロモーター及び対応するタンパク質又はポリペプチド発現は、遍在性であってもよい、つまり、広範囲の細胞、組織、及び種、又は細胞型特異的、組織特異的、若しくは種特異的に活性が強いことを意味する。プロモーターは、継続的な活性を意味する「構成的」、又はプロモーターが生物的因子若しくは非生物的因子の存在若しくは非存在によって活性化若しくは非活性化され得ることを意味する「誘導性」であり得る。

本明細書で使用される「同一性」は、２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド部分間のパーセント同一性を指す。「実質的な同一性」という語は、核酸、又はその断片を指す場合、適切なヌクレオチドの挿入、又は欠失で別の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列した場合、整列された配列の約９０～１００％にヌクレオチド配列同一性があることを示す。ポリペプチド、又はその断片を指す場合、「実質的な同一性」という語は、別のポリペプチドと適切なギャップ、挿入、又は欠失で最適に整列した場合、整列された配列の約９０～１００％にヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。「高度に保存された」という語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％を超える同一性を意味する。場合によっては、高度に保存されたは、１００％の同一性を指し得る。同一性は、例えば、当業者に公知のアルゴリズム及びコンピュータプログラムの使用によって当業者により容易に決定される。

本明細書に記載のように、核酸又はポリペプチドの配列間のアラインメントは、インターネット上のＷｅｂサーバーを介してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」などの様々な公的又は商業的に入手可能な多重配列アラインメントプログラムのいずれかを使用して行われる。別法では、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティも使用することができる。また、上記のプログラムに含まれるものも含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる当分野で公知のいくつかのアルゴリズムが存在する。

ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して一定パーセントの「配列同一性」を有する、つまり、整列された場合、２つの配列を比較すると塩基又はアミノ酸のパーセンテージが同じである。配列類似性は、いくつかの異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法及びコンピュータプログラムを使用して配列を整列させることができる。もう一つのアラインメントアルゴリズムは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の１００％子会社であるＭａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで利用可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントの他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡで説明されている。特に興味深いのは、配列のギャップを許容するアラインメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントのギャップを可能にするアルゴリズムの１つのタイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を用いるＧＡＰプログラムを使用して配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）を参照されたい。

特定の実施形態では、本明細書に開示されるプロモーターは、配列番号１の配列又は配列番号１に対して８０％の同一性を有する配列；及び組織特異的転写因子結合部位配列を除いたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、２００未満のヌクレオチド、１５０未満のヌクレオチド、１００未満のヌクレオチド、９０未満のヌクレオチド、又は８４のヌクレオチドを有する。特に、プロモーターは、８０～８９のヌクレオチド、９０～９９のヌクレオチド、１００～１４９のヌクレオチド、又は１５０～１９９のヌクレオチドを有することを含む。

発現ベクターは、本明細書に記載のプロモーター要素を含み得る。発現ベクターは、ＡＡＶベクター、一本鎖ＡＡＶ、自己相補的ＡＡＶ、アデノウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、マウス幹細胞ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、クンジンウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、サイトメガロウイルス、又はコクサッキーウイルスなどのプラスミド又はウイルスベクターであってもよい。本明細書で使用される語「ＡＡＶベクター」という語は、ＡＡＶの成分を含む又はそれに由来する任意のベクターを意味し、インビトロ又はインビボのいずれかにかかわらず、脳、心臓、肺、骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓、又は膵臓などのいくつかの組織タイプのいずれかの、ヒト細胞を含む哺乳類細胞に感染するのに適している。「ＡＡＶベクター」という語は、目的のタンパク質をコードする核酸分子を含むＡＡＶ型ウイルス粒子（又はビリオン）を指すために使用することができる。

さらに、本明細書に開示されるＡＡＶは、血清型の組み合わせ（例えば、「疑似型」ＡＡＶ）を含む様々な血清型、又は様々なゲノム（例えば、一本鎖又は自己相補的）に由来し得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、所望のタンパク質又はタンパク質変異体をコードし得る。

特定の実施形態では、ウイルスベクターは、少なくとも３．７ｋｂの導入遺伝子、少なくとも３．８ｋｂの導入遺伝子、少なくとも３．９ｋｂの導入遺伝子、又は少なくとも４．０ｋｂの導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、カプシドは、本明細書に記載のウイルスベクターを含む。

ｒＡＡＶベクターに使用される最も広く使用されている強力なユビキタスプロモーター（ＣＭＶ、ＣＡＧなど）は非常に大きい（約１，０００ｂｐ）。ｒＡＡＶのパッケージング限界を考えると、これは、発現できる導入遺伝子の点で制限される。ＡＡＶパッケージ限界は約４．８ｋｂである。現在使用されているプロモーターの減算後、これでは、一本鎖ＡＡＶの場合は導入遺伝子用に約３．７ｋｂしか残らず、自己相補的ｒＡＡＶの場合は約１．２ｋｂしか残らない。本明細書に開示されるプロモーターは、２つの反転端末反復（ＩＴＲ）及びＰｏｌｙＡ転写終結シグナル配列と共に、一本鎖ＡＡＶでは約４ｋｂ、自己相補的ＡＡＶで約１．６ｋｂの導入遺伝子を挿入することを可能にし得る。いくつかの実施形態では、一本鎖ＡＡＶは、約３．７５ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子、約３．８ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子、約３．９ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子、又は約４．０ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、自己相補的ｒＡＡＶは、約１．１５ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、約１．２ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、約１．３ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、約１．４ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、又は約１．５ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子を含む。

さらにいくつかの実施形態では、一本鎖ＡＡＶ又は自己相補的ｒＡＡＶは、本明細書に記載のプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターをさらに含む一本鎖ＡＡＶ又は自己相補的ｒＡＡＶは、制御要素又は制御配列を含む。

また、約３．７５ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子、約３．８ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子、約３．９ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子、又は約４．０ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子を含む一本鎖ＡＡＶを調製する方法が本明細書に記載されており、この方法は、ウイルスベクターを用いた本明細書に記載のプロモーターの使用又は挿入を含む。また、約１．１５ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、約１．２ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、約１．３ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、約１．４ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、又は約１．５ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子を含む自己相補的ｒＡＡＶを調製する方法が本明細書に記載されており、この方法はウイルスベクターを用いた本明細書に記載のプロモーターの使用又は挿入を含む。

本明細書に記載のプロモーターを用いて特定の遺伝子の発現を促進することを含む、哺乳動物細胞における遺伝子発現を増強する方法が提供される。哺乳動物細胞はヒト細胞であってもよい。特定の実施形態では、ヒト哺乳動物細胞は、膵臓内分泌細胞、膵臓内分泌α細胞、膵臓内分泌β細胞、ヒト膵島のβ細胞、肝細胞、又は初代ヒト肝細胞であってもよい。ウイルスベクターの開発は、広範囲の臓器及び組織におけるウイルス伝達の効率を高めた。ウイルスベクターは、臨床用途における有望な遺伝子送達ツールであり得、細胞に遺伝子を送達するために開発することができる。細胞内に遺伝子を送達する他の手段は、様々なトランスフェクション技術を含め、当分野で周知であり、説明されている。トランスフェクション及び形質導入の方法は、宿主細胞におけるＤＮＡの一過性又は安定した発現をもたらし得る。ウイルスベクターは、組み込みベクター又は非組み込みベクターであってもよい。例えば、一部のレンチウイルスベクターは、組み込みに優れている一方、他のＡＡＶベクターは、細胞内でエピソーム型を持続することができる。ウイルスベクターは、一過性の短期間から長期間の導入遺伝子の発現を提供することができる。いくつかの実施形態では、改変細胞は、本明細書に記載のプロモーターを含み得る。

以下の実施例は、単に例示目的である。この開示に照らして、当業者は、これらの実施例及び開示される主題の他の実施形態のバリエーションが過度の実験をせずに可能であることを認識するであろう。

実施例１－細胞、ウイルスベクター、及び抗体材料
非糖尿病ドナーからのヒト膵島を、Ｃｉｔｙ ｏｆ ＨｏｐｅにあるＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｓｌｅｔ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＩＩＤＰ）から得た。ヒト肝細胞を、Ｇｒｏｍｐｅ研究室のＤｒ．Ｂｉｎ ＬｉによってＯｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得る。抗体マウス抗グルカゴン（ＧＣＧ）抗体及びラット抗ｃ－ペプチド（ｃ－ｐｅｐ）をそれぞれ、α細胞及びβ細胞を標識するために使用した。ヒトの膵島培地及び初代培養肝細胞用の培地のプロトコルは、Ｇｒｏｍｐｅ研究室で十分に確立されている。完全長インスリンプロモーター（配列番号２）を、ペンシルベニア大学のＤｒ．Ｋｌａｕｓ Ｋａｅｓｔｎｅｒの研究室から得た。ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏを含むＡＡＶは、ＯＨＳＵウイルスベクターコアによって作製された。

実施例２－クローニング
ＩＮＳｘ１と呼ばれる、ＩＮＳ８４（配列番号１）プロモーター及びインスリン完全長プロモーターを含むＡＡＶベクターを、赤色蛍光レポーター導入遺伝子（ｍＲＦＰ）と共に一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターにクローニングした。ＩＮＳ８４配列は、より大きなＩＮＳｘ１配列内に位置する。ＩＮＳ８４ ＤＮＡ断片を、一本鎖ＤＮＡの合成オリゴマーを用いて、二本鎖ＤＮＡを形成してからｓｓＡＡＶベクターに挿入することによってクローニングした。

実施例３－ＡＡＶの作製
標準的な方法をＡＡＶの作製に使用した。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を大量に培養した。コンフルエンスに達したら、ＨＥＫ２９３細胞を、プロモーターｍＲＦＰをコードするｓｓＡＡＶプラスミド、アデノウイルスのヘルパープラスミド、及びＲｅｐ／ＣａｐプラスミドｐＫＰ１（マークケイ研究室）の３つのプラスミドを用いてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法によってトランスフェクトした。トランスフェクションの５日後に、新たにパッケージ化されて放出されたＡＡＶを細胞培養培地から回収した。次いで、ＡＡＶを、ＰＥＧ８０００を用いて濃縮し、－８０℃で貯蔵した。

実施例４－ヒト膵島におけるプロモーター活性
試料当たり５００個のヒト膵島を、１０^５の多重感染（ｍｏｉ）を目的とするＡＡＶと混合した。４℃で１時間、形質導入を行った。次いで、膵島を、ヒト膵島培地を含む２４ウェル懸濁液培養プレートのウェルに入れる。次いで、膵島を、加湿ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で４日間培養した。膵島のＲＦＰ発現を、図２に示されているように倒立落射蛍光顕微鏡を用いて記録した。導入遺伝子ｍＲＦＰは、ＩＮＳ８４（図２の左側のパネル）及びインスリン３６３ｂｐ（ＩＮＳｘ１）プロモーター下でＡＡＶから発現される。

膵島細胞のＦＡＣＳ分析に先立って、膵島を、トリプシンを用いて個々の細胞に分離し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、細胞を、抗体を内在化させるために０．１％サポニン／ＰＢＳで透過処理した。次いで、一次抗体を、分離膵島細胞に添加した。ラット抗Ｃ－ペプチドをβ細胞マーカーとして使用して、プロインスリン切断産物Ｃ－ペプチドを標識した。α細胞は、グルカゴン（ＧＣＧ）を産生して分泌し、このグルカゴンを使用して、この実験ではマウス抗ＧＣＧでα細胞を標識した。二次抗体Ａｌｅｘａ－４８８及びＡｌｅｘａ－６４７をそれぞれ使用して、抗ｃ－ｐｅｐ及び抗ＧＣＧを標識した。Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターを使用してＦＡＣＳ分析を行って、図３に示されているように、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。

ＲＦＰ陽性細胞を全細胞集団及びＲＦＰ細胞からα細胞群及びβ細胞群に分けるデータ分析を行った。α細胞及びβ細胞は、膵島の２つの主要なタイプの細胞であり、総人口の約８０％を占めている。従って、本発明の分析では、膵島細胞を３つの群、即ち、α細胞群、β細胞群、及び他の細胞群に分類した。

実施例５－ＩＮＳ８４及びＩＮＳｘ１（インスリン完全長プロモーター）活性を用いたＡＡＶの比較分析
ヒト膵島に、１０^５のｍｏｉでＡＡＶ－ＩＮＳ８４－ｍＲＦＰ又はＡＡＶ－インスリン完全長プロモーター（ＩＮＳｘ１）を形質導入した。培養４日後に、膵島を分離し、α細胞マーカー及びβ細胞マーカーの細胞内染色のために固定した。ＦＡＣＳ分析は、ＩＮＳ８４プロモーターを含むＡＡＶが、ＲＦＰの強度がより高いＩＮＳｘ１を含むＡＡＶ（１０．３％）よりも効率的に（５７．４％）膵島細胞集団に形質導入することを示している（図４を参照）。データは、代表的な実験からのデータである。個々の細胞からのＲＦＰの強度は、ドットプロット（５６１－Ａ）のＲＦＰ軸に示されている。ＲＦＰ強度は、細胞内に存在するＲＦＰタンパク質分子の数に依存する。従って、高いＲＦＰ強度は、多数のｍＲＮＡ分子を反映し、それに応じて強力なプロモーターを示す。ＲＦＰ細胞の大部分は、ＩＮＳ８４細胞では１０^３～１０^４、ＩＮＳｘ１細胞では１０^２～１０^３のスケールが検出されている。これらのデータは、ＩＮＳ８４活性がＩＮＳｘ１活性の約１０倍高いことを示唆している。

実施例６－ヒトＥＳ細胞におけるＩＮＳ８４プロモーター活性
ＥＳ細胞におけるＡＡＶの形質導入は、本発明者ら共同研究者であるサンフランシスコのカリフォルニア大学のＤｒ．Ｍａｔｔｈｉａｓ Ｈｅｂｒｏｋ及びＤｒ．Ｙｏｕｎｇｊｉｎ Ｋｉｍによって行われた。ＥＳ細胞は、インスリンプロモーターの下流でＧＦＰ遺伝子がゲノムに組み込まれている。インスリン遺伝子は、β細胞でのみ発現する。細胞分化中にβ細胞特性の同一性を獲得すると、インスリンプロモーターが活性となり、従って、これらの細胞からＧＦＰが発現する。簡単に述べると、ＡＡＶ試験は以下のように行った。ＥＳ細胞を濃縮し、球体をβ細胞分化培地で２０日間インキュベートした。完全に分化したβ細胞を、ＧＦＰ発現細胞を選択するためにＦＡＣＳによって選別した。これらの細胞（ｅβ細胞）に、１０^５のｍｏｉでＡＡＶ－ＩＮＳ８４－ｍＲＦＰを形質導入した。形質導入の４日後に、細胞を、図５に示されているように、固定して、抗Ｃ－ｐｅｐ及び抗ＧＣＧで抗体を標識した後にＦＡＣＳによって分析した。ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞がβ様細胞に分化した。ＧＦＰ遺伝子が、β細胞のみで染色体のインスリン遺伝子プロモーターから発現される。ＩＮＳ８４プロモーターを用いたＡＡＶの形質導入により、強度が強いすべてのｅβ細胞でｍＲＦＰが発現する。また、ＩＮＳ８４プロモーター下でｍＲＦＰを発現するＡＡＶ ＫＰ１が形質導入されたｅβ細胞も示されており、大部分の細胞がＲＦＰ陽性である（図１Ａ及び図１Ｂを参照）。

実施例７－ヒト肝細胞におけるＩＮＳ８４プロモーターの活性
ヒト肝細胞による試験が、Ｇｒｏｍｐｅ研究室のＤｒ．Ｂｉｎ Ｌｉによって行われた。実験標準プロトコルに従って、ドナー肝細胞を分離し、２４ウェルプレートのウェルにプレーティングした。ＡＡＶ、ＡＡＶ－ＩＮＳ８４－ｍＲＦＰ、及びＡＡＶ－ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏを、１０^５のｍｏｉでウェルに加える。細胞増殖中の導入遺伝子からの赤色蛍光をモニタリングして記録するために、培養プレートを、ＯＨＳＵの最先端光顕微鏡コアに自動顕微鏡（インキュベーター顕微鏡）を搭載した３７℃の加湿ＣＯ２インキュベーターに入れた。５日目の培養の画像を図６に示した。ＩＮＳ８４プロモーターを、ヒト肝細胞の一次培養においてＣＡＧプロモーターと比較した。ＩＮＳ８４プロモーターを含むＡＡＶはｍＲＦＰを発現し、ＣＡＧプロモーターを含むＡＡＶはｔｄＴｏｍａｔｏを発現する。発現レベルは同等に強かった。

実施例８－細胞株におけるＩＮＳ８４プロモーターの活性
細胞株をそれぞれの培養条件で増殖させた。ＡＡＶ形質導入の１日前に、細胞を、５０％の細胞密度まで１２－ウェルにプレーティングした。形質導入のために、ＡＡＶ－ＩＮＳ８４－ｍＲＦＰを、１０^５のｍｏｉまで培養培地に直接添加した。図７に示されているように、画像を、４～６日の間に倒立落射蛍光顕微鏡を用いて撮影した。細胞株細胞に、ＡＡＶ－ＩＮＳ８４－ｍＲＦＰを形質導入した。ＩＮＳ８４は、ＲＦＰの異なる強度を有するにもかかわらず、試験したすべての細胞で活性である。この違いは、細胞表面上のウイルス受容体の利用可能性又は異なる細胞型におけるプロモーター活性の違いから生じる可能性があり、これは、他の既知のプロモーターでも一般的に観察される。

Claims (20)

1. 配列番号１の配列、又は配列番号１に対して８０％の同一性を有する配列を含むプロモーターであって；組織特異的転写因子結合部位配列を含まない、プロモーター。
2. 配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載のプロモーター。
3. ２００未満のヌクレオチド、１５０未満のヌクレオチド、１００未満のヌクレオチド、９０未満のヌクレオチド、又は８４のヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載のプロモーター。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のプロモーターを含む発現ベクター。
5. プラスミド、ＡＡＶベクター、一本鎖ＡＡＶ、自己相補的ＡＡＶ、アデノウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、マウス幹細胞ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、クンジンウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、サイトメガロウイルス、又はコクサッキーウイルスを含む、請求項４に記載の発現ベクター。
6. 少なくとも３．７ｋｂの導入遺伝子、少なくとも３．８ｋｂの導入遺伝子、少なくとも３．９ｋｂの導入遺伝子、又は少なくとも４．０ｋｂの導入遺伝子をさらに含む、請求項４又は５に記載の発現ベクター。
7. 請求項４～６のいずれか一項に記載のウイルス発現ベクターを含むカプシド。
8. 約３．７５ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子、約３．８ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子、約３．９ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子、又は約４．０ｋｂ～約４．６ｋｂの導入遺伝子を含む、一本鎖ＡＡＶ。
9. 約１．１５ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、約１．２ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、約１．３ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、約１．４ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子、又は約１．５ｋｂ及び約２．０ｋｂの導入遺伝子を含む、自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
10. 請求項１～３のいずれか一項に記載のプロモーターをさらに含む、請求項８に記載の一本鎖ＡＡＶ又は請求項９に記載の自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス。
11. 請求項８に記載の一本鎖ＡＡＶ又は請求項９に記載の自己相補的組換えアデノ随伴ウイルスを調製する方法であって、ウイルスベクターを用いた請求項１～３のいずれか一項に記載のプロモーターの使用又は挿入を含む、方法。
12. 哺乳動物細胞における遺伝子発現を増強する方法であって、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロモーターを用いて特定の遺伝子の発現を促進することを含む、方法。
13. 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記細胞がヒト膵臓内分泌細胞である、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記細胞がヒト膵臓内分泌α細胞である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記細胞が、ヒト膵臓内分泌β細胞である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記細胞がヒト膵島におけるβ細胞である、請求項１２又は１３に記載の方法。
18. 前記細胞がヒト肝細胞である、請求項１２又は１３に記載の方法。
19. 前記細胞が、初代ヒト肝細胞である、請求項１２、１３、及び１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 請求項１に記載のプロモーターを含む改変細胞。

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