JP2022529423A - バイオマーカーとしてのインターロイキン４誘導遺伝子１（ｉｌ４ｉ１）及びその使用 - Google Patents

バイオマーカーとしてのインターロイキン４誘導遺伝子１（ｉｌ４ｉ１）及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、新たに同定されたＡＨＲ活性化酵素、及び例えば、ＩＬ４Ｉ１調節介入による治療のための患者の選択及び治療反応のモニタリングための、診断及び治療におけるマーカーとしてのその使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、新たに同定されたＡＨＲ活性化酵素、及び例えば、ＩＬ４Ｉ１調節介入による治療のための患者の選択及び治療反応のモニタリングための、診断及び治療におけるマーカーとしてのその使用に関する。
ＩＬ４Ｉ１は、過酸化水素及びアンモニアを生成しながら、Ｌ－アミノ酸のアルファ－ケト酸への酸化的脱アミノ化を触媒するＬ－アミノ酸オキシダーゼである（１）。Ｌ４Ｉ１は、Ｂ細胞で前初期ＩＬ４誘導性遺伝子として最初に発見され（２、３）、後にマクロファージや樹状細胞でも同定された（４）。さらに、ＩＬ４Ｉ１は、腫瘍細胞自体又は腫瘍関連マクロファージのいずれかでヒトの悪性腫瘍に発現する（５）。ＩＬ４Ｉ１はＴ細胞の増殖を阻害し（４、６）、これは主にＨ２Ｏ２の産生に起因する。さらに、ＩＬ４Ｉ１はＴｈ１７細胞（７）及び制御性Ｔ細胞（８）の分化に関与しており、ＡＨＲの活性化によって調節されることが知られている（９－１１）。
現在、ＩＬ４Ｉ１関連状態の治療上の意味についてはほとんど知られていない。これは、それを必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）組織におけるミエリン形成を促進する方法を開示する唯一の国際公開ＷＯ２０１６／０４０４８８号の存在によって例示することができ、この方法は、対象に治療的に有効量のＩＬ４Ｉ１タンパク質を投与することを含む。
アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）は、胚発生、脈管形成、代謝、免疫、癌などの多様なプロセスの調節に関与するリガンド活性化転写因子である。前臨床研究では、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）及び/又はトリプトファン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）を介して生成されたトリプトファン代謝産物によるＡＨＲ活性化は、腫瘍細胞の運動性、アノイキ耐性、及びクローン原性生存を増強することによって、及び抗腫瘍免疫応答を抑制することによって、腫瘍の進行を促進した（１２）。ＡＨＲ標的遺伝子の発現は状況に固有であり（１３）、そしてさまざまな細胞/組織にわたって、多様なＡＨＲリガンドに応答してＡＨＲ活性化を効率的に検出するＡＨＲ活性化の新しいバイオマーカーの導入が必要される。さらに、ＩＬ４Ｉ１調節及びＡＨＲ調節の機能的意味合は、多くの共通の経路及びクロストークを共有しており、ＩＬ４Ｉ１をＡＨＲ調節の状態の潜在的なバイオマーカーとして考慮することの重要性を伴う。
その第１の側面によれば、本発明は、細胞又は対象に由来する生物学的サンプルにおけるＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化を検出することを含む、細胞又は対象におけるＡＨＲの調節を検出するための方法に関し、前記細胞又はサンプルにおけるＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態の変化は、対照細胞又はサンプル、例えば、 健康な対象、患者又は患者グループに由来するサンプルと比較した場合、前記細胞又は対象におけるＡＨＲのＩＬ４Ｉ１関連の調節を示す。
その第２の側面によれば、本発明は、本発明は、ＩＬ４Ｉ１又はＩＬ４Ｉ１を発現する細胞を含むサンプルを少なくとも１つの候補体モジュレーター化合物と接触させ、そして前記ＩＬ４Ｉ１の調節を検出することを含む、ＩＬ４Ｉ１の発現及び／又は生物学的活性の少なくとも１つの潜在的モジュレーターをスクリーニングするためのインビトロ方法を提供し、ここで 前記調節は、ＩＬ４Ｉ１の発現及び／又は生物学的活性の潜在的なモジュレーターを同定する。
好ましくは、この方法は、少なくとも１つの候補体モジュレーター化合物を生物学的サンプルと接触させ、そして生物学的サンプル中のＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態の変化を検出することを含む、ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の少なくとも１つのモジュレーターをスクリーニングするための方法であり、 ここで前記少なくとも１つのモジュレーターの非存在下と比較して、前記少なくとも１つのモジュレーターの存在下での前記ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化が、モジュレーターを同定する。
その第３の側面によれば、本発明は、少なくとも１つの化合物と接触された生物学的サンプルに対して本発明による方法を実施することを含む、少なくとも１つの化合物に応答するＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の調節をモニタリングするための方法に関すし、ここで前記生物学的サンプルは、前記化合物と接触されなかった対照サンプルと比較される。
この方法のサブ側面によれば、本発明は、少なくとも１つの化合物を細胞に提供し、そして前記少なくとも１つの化合物に応答して、前記細胞におけるＩＬ４Ｉ１の発現及び／又は生物学的機能などの生物学的状態の変化を検出することを含む、細胞内のＡＨＲの生物学的状態をモニタリングするための方法に関し、ここで前記少なくとも１つの化合物の非存在下と比較された、前記少なくとも１つの化合物の存在下での発現又は生物学的機能などの生物学的状態の変化が、細胞内のＡＨＲの前記生物学的状態に対する前記少なくとも1つの化合物の効果を示す。
次に、本発明の別の好ましい側面によれば、本発明は、本発明を実施し、そして本発明による方法の結果に少なくとも部分的に基づく適切な治療を患者に提供し、例えば本明細書に記載されている通りに、同定された化合物を提供し、又は前記方法を含む治療をモニタリングすることを含む、前記治療を必要とする患者におけるＡＨＲ関連の疾患又は状態を治療及び／又は予防するための方法に関する。
本発明の別の重要な側面は、本発明の方法を、１つ又は別個の容器内で、任意には、補助剤及び／又は前記方法を実行するための指示と共に、実行するための材料を含む、診断キットに関する。次に、本発明の別の重要な側面は、本発明による方法における前記診断キットの使用に関する。
最後に、本発明は、本発明によるモジュレーターのスクリーニング又は本発明によるモニタリングのためのバイオマーカーＩＬ４Ｉ１の使用に関する。
図１は、ＩＬ４Ｉ１が種々の腫瘍実体で発現していることを示している。a、３０の非罹患組織を含む遺伝子型－組織発現データセット（ＧＴＥＸ）におけるＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ２、及びＩＬ４Ｉ１発現の１００万当たりのｌｏｇ２転写産物の中央値（ｌｏｇ２ ＴＰＭ）のヒートマップ表現。空の細胞は、発現が検出されなかったことを示す。ドットサイズ及び陰影の色は発現レベルに対応し、薄い灰色は発現レベルが低いことを示し、そして濃い灰色は発現レベルが高いことを示す。b、３２個のＴＣＧＡ腫瘍におけるＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ２、及びＩＬ４Ｉ１発現の１００万当たりのｌｏｇ２転写産物の中央値（ｌｏｇ２ ＴＰＭ）のヒートマップ表現。
図２は、ＩＬ４Ｉ１がＡＨＲを活性化することを示している。a、１２０時間培養された、ＩＬ４Ｉ１発現のないｓｈＣｔｒｌ Ｕ－８７ＭＧ細胞と比較しての、ＩＬ４Ｉ１を発現するｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＡＨＲ Ｕ－８７ＭＧ細胞における選択されたＡＨＲ標的遺伝子のｍＲＮＡ発現（破線）（ＥＧＲ１、ＩＬ１Ｂ、ＭＭＰ１についてはｎ ＝ ３；他のすべての遺伝子についてはｎ ＝ ４）。 b、１２０時間培養された、Ｃｔｒｌ及びＩＬ４Ｉ１発現Ｕ－２５１ＭＧ細胞の上清液で４時間処理されたＬＮ－２２９細胞におけるＡＨＲタンパク質発現の核対細胞質比の免疫ブロット（左）及び定量化（右）（n = 3）。c、７２時間培養された、ｓｉＣｔｒｌで処理された細胞と比較しての、ＩＬ４Ｉ１を標的とするｓｉＲＮＡで処理されたＣＡＳ－１細胞におけるＴＩＰＡＲＰ ｍＲＮＡ発現（ｎ ＝ ４）。
d、１２０時間培養された、Ｃｔｒｌ及びＩＬ４Ｉ１発現Ｕ－８７ＭＧ細胞の上清液中のＰｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度（ｎ ＝ ３）。e、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒｐの存在下でＩＬ４Ｉ１を発現するＵ－８７ＭＧ細胞の溶解物におけるＩＬ４Ｉ１活性（ｎ ＝ ３）。f、Ｐｈｅ及びＴｒｐのＩＬ４Ｉ１のＫｍ値（ｎ ＝ ５）。
g、４０μＭのＰＰ（左）、ＨＰＰ（中央）、又はＩ３Ｐ（右）にビークルと比較して２４時間曝露されたＵ８７ＭＧ細胞のマイクロアレイデータにおけるＡＨＲ標的遺伝子の異なる調節を示すＶｏｌｃａｎｏプロット（ｎ ＝ ５）。濃い灰色のデータポイントは、選択された規制対象のＡＨＲ標的遺伝子を表す。 薄い灰色のデータポイントは、他の全ての遺伝子を表す。垂直の点線は＋／－ ０．５８のｌｏｇ２ＦＣを示し、そして水平の点線は０．０１のp値カットオフにある。
h、ＰＰ、ＨＰＰ、Ｉ３Ｐ又はビークル（破線）で２４時間処理されたＵ－８７ＭＧでのＴＩＰＡＲＰ ｍＲＮＡ発現（ｎ ＝ ３）。i、２５μＭのＰＰ、ＨＰＰ、Ｉ３Ｐ又はビークルで４時間処理されたＧＦＰ－Ａｈｒ発現ｔａｏＢｐＲｃ1ｃ細胞の代表的な画像。 ｎ値は独立した実験を表す。データは平均±ＳＥＭとして表され、そして両側の対応のあるスチューデントのｔ検定（ｃ、ｄ、ｅ）、両側の対応のないスチューデントのｔ検定（ｆ、ｈ）、Tukeyの多重比較検定を使用した一元配置分散分析（g）又はダネットの多重比較検定（ｊ）を使用した反復測定ＡＮＯＶＡによって分析されました。＊ Ｐ ＜０．０５、＊＊ Ｐ ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊ Ｐ ＜０．０００１。 ｎ．ｓ．、有意ではない。 * IＬ４Ｉ１－ｓｈＣｔｒｌと比較されたｓｈＣｔｒｌ; ＃ＩＬ４Ｉ１－ｓｈＡＨＲと比較されたＩＬ４Ｉ１－ｓｈＣｔｒｌ。
図３は、ＩＬ４Ｉ１が芳香族アミノ酸を分解してＡＨＲリガンドを生成することを示している。a、Ｕ８７－ｃｔｒｌ及びＵ８７－ＩＬ４Ｉ１細胞の上清液中のフェニルピルビン酸（ＰＰ）、フェニル酢酸（ＰＡＡ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）、ヒドロキシベンズアルデヒド（ＨＢＡ）及びヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡＡ）（１２０時間）。
b、Ｕ２５１－ｃｔｒｌ及びＵ２５１－ＩＬ４Ｉ１細胞の上清液中のＨＢＡ、ＨＰＡＡ、ＨＰＰ、ＰＡＡ及びＰＰ（１２０時間）。
c、Ｕ８７－ｃｔｒｌ及びＵ８７－ＩＬ４Ｉ１細胞の上清液中のキヌレニン（Ｋｙｎ）、キヌレン酸（ＫｙｎＡ）、インドール－３－ピルビン酸（Ｉ３Ｐ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール－３－カルボキサルデヒド（Ｉ３ＣＡ）及びインドール－３－乳酸（ＩＬＡ）（１２０時間）。
d、Ｕ２５１－ｃｔｒｌ及びＵ２５１－ＩＬ４Ｉ１細胞の上清液中のＫｙｎＡ、Ｋｙｎ、Ｉ３Ｐ、ＩＡＡ、Ｉ３ＣＡ及びＩＬＡ（１２０時間）。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 1つのサンプルt検定。
図４は、ＩＬ４Ｉ１由来のＴｒｐ代謝物及びそれらのＡＨＲ活性への影響を示す。a、Ｉ３Ｐ又はビークルで２４時間処理されたＵ－８７ＭＧ細胞の上清液中のＫｙｎ、ＫｙｎＡ、ＩＡＡ、及びＩ3CAの相対存在量（ｎ ＝ ４）。b、ＫｙｎＡ標準をオーバーレイされたＨＰＬＣで測定されたＫｙｎＡを示す代表的なクロマトグラム（黒、最高ピーク、カラム上に２０ ｐｍｏｌ）。黒、最低ピーク：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３．３３ ｍｇ / ｍＬＩ３Ｐを２４時間インキュベートした。 灰色のピーク：１ ｍＭのＨ２Ｏ２の存在下でＰＢＳ中で２４時間インキュベートされた３．３３ｍｇ/ｍＬの Ｉ３Ｐ（ｎ ＝ ２）。
c-e、ＩＡＡ（ｃ）、ＩＬＡ（ｄ）、Ｉ３ＣＡ（ｅ）又はビークルで２４時間処理されたＵ－８７ＭＧ細胞におけるＴＩＰＡＲＰ ｍＲＮＡ発現（ｎ ＝ ３）。f、５０μＭのＫｙｎＡ又はビークルで２４時間処理されたｓｈＣｔｒｌ及びｓｈＡＨＲＵ－８７ＭＧ細胞におけるＴＩＰＡＲＰ ｍＲＮＡ発現（ｎ ＝ ３）。g、ビークル又は５０μＭのＫｙｎＡのいずれかで1時間処理されたＧＦＰ－Ａｈｒ発現ｔａｏＢｐＲｃ１ｃ細胞の代表的な画像。 ｎ値は独立した実験を表す。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表され、そして両側の対応のあるスチューデントt検定（a、b、h）又はダネットの多重比較検定（c、e-g）を使用した反復測定ＡＮＯＶＡによって分析された。＊ Ｐ ＜０．０５、＊＊ Ｐ ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊ Ｐ ＜０．０００１。 ｎ．ｓ．、有意ではない。
図５は、ＩＬ４Ｉ１の発現がＡＨＲによって調節されていることを示す 。ｓｉＣｔｒｌで処理された細胞と比較しての、ＡＨＲを標的とするｓｉＲＮＡで処理されたＣＡＳ－１細胞におけるＩＬ４Ｉ１ ｍＲＮＡ発現。
図６は、本開示の側面によるシステムのブロック図を示している。 ＣＰＵ：中央処理装置（「プロセッサー」）。
図７は、例示的な実施形態のフローチャートを示している。
一般的に好ましいのは、バイオマーカーＩＬ４Ｉ１のヒト変異体、又は他の霊長目又は哺乳類からのもののような密接に関連する種である。
他の側面及び利点は、以下の説明及び非限定的な例を読むことから容易に導き出すことができる。
本発明者らは、ＡＨＲ活性の調節におけるトリプトファン分解酵素の役割を調査している間、ヒトの癌で発現され（図1）、そしてＡＨＲ活性化に関与していないトリプトファン分解酵素であるＩＬ４Ｉ１の発現がＡＨＲ標的遺伝子の発現と有意に相関することを発見した。遺伝子発現解析（図２ａ）及びＡＨＲ核転座（図２ｂ）により、キヌレン酸を含むトリプトファン代謝物の生成を介してＡＨＲを活性化するＩＬ４Ｉ１が確立された（図２ｇ－ｉ、図３－４）。
上記のように、本発明の文脈で実施された実験において、新しいバイオマーカーＩＬ４Ｉ１が、ＡＨＲの上流の新しい成分として同定された。これは、少なくとも１つの候補体モジュレーター化合物を生物学的サンプルと接触させ、そして生物学的サンプル中のＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態の変化を検出することを含む、ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の少なくとも１つのモジュレーターをスクリーニングするためのインビトロ方法を可能にし、ここで前記少なくとも１つのモジュレーターの非存在下と比較して、前記少なくとも１つのモジュレーターの存在下での前記ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化が、モジュレーターを同定する。モジュレーターは、ＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態の活性化因子（誘導因子）又は阻害剤であり得る。
１つの代替において、ＩＬ４Ｉ１の発現及び／又は生物学的活性の潜在的なモジュレーターをスクリーニングするための方法は、ＩＬ４Ｉ１又はＩＬ４Ｉ１を発現する細胞を含むサンプルを少なくとも１つの候補体モジュレーター化合物と接触させ、そして前記モジュレーターの前記ＩＬ４Ｉ１への結合を検出することを含み、 ここで、前記結合が、ＩＬ４Ｉ１の発現及び／又は生物学的活性の潜在的なモジュレーターを同定する。この方法は、好ましくは、前記細胞におけるＩＬ４Ｉ１の発現及び／又は生物学的活性、又は前記サンプルにおけるＩＬ４Ｉ１の生物学的活性を検出する工程をさらに含み、ここで、前記少なくとも１つの化合物の不在と比較して、前記少なくとも１つの存在下でのＩＬ４Ｉ１の発現又は生物学的活性の変化がモジュレーターを同定する。
前記モジュレーターが、前記発現又は生物学的活性の阻害剤又は誘導物質から選択される、本発明のそのような方法が好ましい。
次に、本発明の別の重要な側面は、細胞に由来する生物学的サンプルにおけるＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化を検出することを含む、細胞及び／又は対象におけるＡＨＲ関連の疾患又は状態を診断するための方法に関し、ここで前記サンプル中のＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態の変化は、対照サンプルと比較した場合、前記細胞及び／又は対象におけるＡＨＲ関連の生理学的又は病理学的状態を示す。
１つの側面によれば、前記方法は、細胞／組織／生体液中のＩＬ４Ｉ１の発現又は生物学的機能を検出することを含み、ここで、健康又は他の適切な対照と比較した場合、前記区画における発現又は生物学的機能、特に発現又は活性化の変化が、ＡＨＲ関連の疾患又は状態を示す。そのような変化は、健康な細胞又は健康なヒト又は個人のグループに由来するサンプルの値などの適切な対照と比較した場合、又はハウスキーピング遺伝子のような内部標準と比較した場合、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％以上の 発現または生物学的機能のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションでありえる。本発明の文脈において、「約」という用語は、他に示されない限り、所与の値の＋／－ １０％を意味する。
本発明の文脈において、ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化を検出することによって検出されるような細胞又は対象におけるＡＨＲの前記調節は、前記細胞又は対象におけるＡＨＲ関連の生理学的又は病理学的状態を示すことが見出された。好ましくは、層別化及び／又は診断されるべきＡＨＲ関連の生理学的又は病理学的状態は、中毒、癌、自己免疫疾患、変性、炎症、感染症、代謝性疾患及び状態、血管新生、薬物代謝、造血、脂質代謝、細胞運動性、免疫調節、及びストレス状態、例えば、生物学的、機械的及び環境的ストレスから選択される 。
本発明の方法が好ましく、ここで検出される前記生物学的状態は、突然変異、核酸メチル化、コピー数、発現、タンパク質の量、タンパク質修飾、細胞局在、代謝物、特に、例えばトリプトファン分解産物などのＩＬ４Ｉ１によって産生される代謝物、キヌレン酸を含むトリプトファン代謝物、及びＩＬ４Ｉ１の生物活性から選択される。
好ましい実施形態によれば、本発明による方法において、ＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態は、以下の表１による少なくとも１つの代謝産物バイオマーカーの存在量又は生物学的活性の変化を介して間接的に検出され、ここで、対照サンプルと比較した場合の前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記発現又は生物学的活性の変化は、前記サンプル中のＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化を示す。
本発明の方法においては、前記生物学的サンプルは、体液、哺乳類、例えばヒト、細胞、組織、全血、細胞系、細胞上清液、初代細胞、ＩＰＳＣ、ハイブリドーマ、組換え細胞、幹細胞、及び癌細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、皮膚細胞、頭皮細胞、肺細胞、粘膜細胞、筋肉細胞、 骨格筋細胞、線条筋細胞、平滑筋細胞、心臓細胞、分泌細胞、脂肪細胞、血液細胞、赤血球、好塩基球、好酸球、単球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、ＮＫ細胞、調節性Ｔ－ 細胞、樹状細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、骨髄細胞、マクロファージ、単球由来間質細胞、骨髄細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、膵臓細胞、卵細胞、精子、腎臓細胞、線維芽細胞、腸細胞、 女性又は男性の生殖管の細胞、前立腺細胞、膀胱細胞、眼細胞、角膜細胞、網膜細胞、感覚細胞、ケラチノサイト、肝細胞、脳細胞、腎臓細胞、及び結腸細胞、並びに前記細胞又は組織の形質転換された対応物を含む適切なサンプルから選択される。
好ましいのは、本発明による方法であり、ここで前記対象は、哺乳動物対象、特にヒト対象、特にＡＨＲ関連の生理学的又は病理学的状態に罹患しているヒト患者から選択される。 前記対照サンプルは、上記のサンプルから選択することができる。
次に、本発明の別の側面は、ある量の少なくとも１つの化合物と接触された生物学的サンプルに対して本発明による方法を実施することを含む、少なくとも１つの化合物に応答してＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の調節をモニターリングするための方法に関し、ここで前記生物学的サンプルは、前記量の前記化合物と接触されなかった対照サンプルと比較される。
細胞に少なくとも１つの化合物を提供し、そして前記少なくとも１つの化合物に応答した前記細胞におけるＩＬ４Ｉ１の発現又は生物学的機能の変化を検出することを含む、細胞内のＡＨＲ関連疾患又は状態をモニタリングするためのそのような方法が好ましく、 ここで、前記少なくとも１つの化合物の非存在下と比較して、前記少なくとも１つの化合物の存在下での発現又は生物学的機能の変化は、前記ＩＬ４Ｉ１関連疾患又は状態に対する前記少なくとも１つの化合物の効果を示す。
本発明の文脈において、ＡＨＲ関連疾患又は状態は、中毒、癌、自己免疫障害、変性、炎症、感染、代謝性疾患および状態、血管新生、薬物代謝、造血、脂質代謝、細胞の運動性、老化、免疫調節、ストレス状態、例えば、生物学的、機械的及び環境的ストレス、及びＡＨＲ調節のうちの少なくとも１つから選択され得る。
いくつかの実施形態によれば、前記状態は癌である。いくつかの実施形態によれば、前記癌は、以下から選択される：副腎皮質癌（ＡＣＣ）、膀胱尿路癌（ＢＬＣＡ）、乳房浸潤癌（ＢＲＣＡ）、頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌（ＣＥＳＣ）、胆管癌（ＣＨＯＬ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、リンパ系新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫 （ＤＬＢＣ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、褐色細胞腫（ＫＩＣＨ）、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、腎臓腎乳頭細胞癌（ＫＩＲＰ）、脳低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、肝肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮癌（ ＬＵＳＣ）、中皮腫（ＭＥＳＯ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、褐色細胞腫及び傍神経節腫（ＰＣＰＧ）、前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ）、肉腫（ＳＡＲＣ）、皮膚皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、精巣胚細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）、甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、胸腺腫（ＴＨＹＭ）、子宮 コーパス子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）、子宮癌肉腫（ＵＣＳ）、及びブドウ膜黒色腫（ＵＶＭ）。
本発明による方法は、１つの側面によれば、モジュレーターを探し、そして同定されたバイオマーカーＩＬ４Ｉ１に対するその効果を解明するために提供される。同定されるそのような化合物の例は、小分子、ペプチド、及び前記化合物のライブラリーから選択することができる。同定された（スクリーニングされた）前記化合物は、低分子化学分子、ペプチド、抗体、及び短い干渉ＲＮＡから選択される。好ましくは、前記化合物は、以下から選択される：タンパク質性ドメイン、小分子、ペプチド、環境物質、プロバイオティック、毒素、エアロゾル、薬物、栄養素、生薬組成物、植物抽出物、揮発性化合物、ホメオパシー物質、香料、医薬品、 ワクチン、生物、例えば動物、植物、真菌、細菌、古生物に由来する化合物又は化合物混合物、化合物、食品又は化粧品産業で使用される化合物、及び前記化合物のライブラリー。
本明細書に開示されるバイオマーカーを使用する同定およびスクリーニングは、当技術分野で知られているそれぞれの方法を使用して、好ましくはバイオマーカーの組換え産生タンパク質及び／又は組換え細胞モデルを使用して行うことができる。このために、バイオマーカーは、例えば、化学染料又は蛍光マーカーを使用した標識することができる。さらに、酵素は、任意には、スクリーニングされるバイオマーカーとの融合の形で使用することができる。 好ましくは、前記方法は自動化にも従順であり、そして前記スクリーニングは、好ましくは、自動化された及び／又は高スループットのフォーマットで評価される。
次に、別の側面は、本発明によるモジュレーターのスクリーニング、又は本発明によるモニタリング、又は本発明による生物学的安全性の試験、又は本発明による診断のためのＩＬ４Ｉ１の少なくとも１つのバイオマーカーの使用に関する。
次に、本発明の別の好ましい側面によれば、本発明は、本発明による方法を実施すし、そして前記患者に適切な治療を提供することを含む、前記治療を必要とする患者の細胞におけるＡＨＲ関連疾患又は状態を治療及び／又は予防する方法に関し、 ここで、前記治療は、少なくとも部分的に、同定された化合物を提供し、又は治療をモニタリングするなど、本発明による方法の結果に基づかれる。
本発明の文脈において、マーカータンパク質ＩＬ４Ｉ１（又はその機能的に関連する部分）を含む任意の生物学的サンプル、又は例えば、癌患者から得られた、マーカータンパク質ＩＬ４Ｉ１（またはその機能的に関連する部分）を含む細胞を含むサンプル、又は例えば表１に示されるように、ＩＬ４Ｉ１の下流で生成された代謝産物の少なくとも１つを含むサンプルは、それが分析及び/又はスクリーニングで使用される少なくとも１つのバイオマーカーを含む（又は含むと推定される）限り、使用され得る。好ましくは、生物学的サンプルは、以下を含むサンプルから選択される：バイオマーカー、細胞を含む体液を含むサンプル、生体液、ヒト細胞、組織、全血、細胞株、細胞上清、初代細胞、ＩＰＳＣ、ハイブリドーマ、組換え細胞、幹細胞、癌細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、皮膚 細胞、頭皮細胞、肺細胞、粘膜細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、線条筋細胞、平滑筋細胞、心臓細胞、分泌細胞、脂肪細胞、血液細胞、赤血球、好塩基球、好酸球、単球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、ＮＫ細胞、調節Ｔ細胞、樹状細胞、Ｔｈ１７細胞、 Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、骨髄細胞、マクロファージ、単球由来間質細胞、骨髄細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、膵臓細胞、卵母細胞、精子、腎臓細胞、線維芽細胞、腸細胞、雌又は雄の生殖管の細胞、 前立腺細胞、膀胱細胞、眼細胞、角膜細胞、網膜細胞、感覚細胞、ケラチノサイト、肝細胞、脳細胞、腎臓細胞、及び結腸細胞、並びに前記細胞又は組織の形質転換された対応物を含む適切なサンプル。サンプルはまた以下からも選択され得る：腫瘍組織（腫瘍又は転移）、生検、全血、末梢血、又はそれらの画分、血清、バフィーコート、リンパ液、尿、骨髄、ヘパリン化全血、及びそれらの凍結サンプル、例えば凍結ヘパリン化全血。本発明による方法で使用される細胞は、組換え型又は非組換え型であり得、そして所望の目的及び状況に応じて、細胞外来タンパク質を発現し得る。必要に応じて、全能性のヒト胚性幹細胞を除外することができる。 サンプルはまた、被験者のグループ、例えば、患者グループからの組み合わされたサンプルであり得る。
次に、本発明の別の側面は、医薬製剤を製造する方法に関しここで、同定（スクリーニング）された前記化合物／モデュレーターは、同定（スクリーニング）された前記（少なくとも１つの）化合物を、医薬的に許容される担体と混合することによって医薬調製物にさらに処方される。医薬製剤は、好ましくは、注射剤、錠剤、カプセル、シロップ、エリキシル、軟膏、クリーム、パッチ、インプラント、エアロゾル、スプレー及び坐剤（直腸、膣及び尿道）の形態で存在することができる。 次に、本発明の別の側面は、本発明に従って調製される医薬製剤に関する。
本発明の別の側面によれば、次に、本発明は、本発明による方法を１つ又は別個の容器に、任意には補助剤及び／又は前記本発明の方法を実施するための説明書とともに実施するための材料を含む診断キットに関する。
「治療」とは、疾患の症状の軽減及び/又は改善を意味する。 効果的な治療は、例えば、腫瘍の質量及び癌細胞の数の縮小を達成する。 治療はまた、例えば、転移及び／又はその形成に影響を与えるなど、癌の広がりを回避（予防）及び低減することができる。治療は、ナイーブ治療（疾患の他の治療が開始される前）、又は最初の治療ラウンド後の治療（例えば、手術後又は再発後）であり得る。 治療はまた、例えば、化学療法、外科手術、及び／又は放射線治療を含む併用治療であり得る。
本発明の方法では、一般的に、バイオマーカーは、任意の適切なアッセイを使用して検出及び／又は決定され得る。 検出は通常、定性的情報（「マーカーはい－いいえ」）に向けられるｙが、決定にはマーカーの量（例えば、発現レベル及び/又は活性）の分析が含まれる。検出はまた、例えば、個々のマーカーの機能の変化を引き起こす突然変異を特定することにも向けられている。 アッセイの選択は、決定されるマーカーのパラメーター及び/又は検出プロセスに依存する。従って、決定及び／又は検出は、好ましくは、以下から選択された方法を含むことができる：サブトラクティブハイブリダイゼーション、マイクロアレイ分析、ＤＮＡ配列決定、ＲＮＡ配列決定、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＩＰ、ＰＬＡ、ＢｉＦＣ、ＨＰＬＣ、ＷＢ、酵素活性試験、蛍光検出、細胞生存率アッセイ、例えばＭＴＴアッセイ、ホスホレセプタチロシンキナーゼアッセイ、ホスホ- ＭＡＰＫアレイ及び増殖アッセイ、例えば、ＢｒｄＵアッセイ、プロテオミクス、サイトカインアレイ、及び質量分析。
好ましくは、前記方法はまた自動化に適しており、そして前記活性及び／又は発現は、好ましくは、自動化された及び／又は高スループットのフォーマットで評価される。 通常、これにはチップ及びロボットなどのそれぞれの機械の使用が含まれる。
本開示の別の側面は、生物学的サンプルのＡＨＲ活性化状態を決定するための方法に向けられている。 いくつかの実施形態によれば、生物学的サンプルは対象から採取される。 いくつかの実施形態によれば、生物学的状態は、インターロイキン４誘導性遺伝子１（ＩＬ４Ｉ１）について決定／測定される。
いくつかの実施形態によれば、状態のＡＨＲ活性化シグネチャを決定するための方法は、以下を含む：（a）対象から生物学的サンプルを取得し； （b）生物学的サンプルにおいて、ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態を決定し；（c）対照細胞において、ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態を決定し；（d）工程（b）の生物学的状態を工程（c）の生物学的状態と比較し；そして（e）比較に基づいて生物学的サンプルのＡＨＲ活性化状態を決定する。
いくつかの実施形態によれば、工程（b）で検出された生物学的状態はＲＮＡ発現である。 いくつかの実施形態によれば、生物学的状態の検出は、生物学的状態のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態によれば、バイオマーカーのＲＮＡ発現は、当技術分野で知られている方法、例えばｑＰＣＲ、ＲＴ-ｑＰＣＲ、ＲＮＡ-Ｓｅｑ、及びインサイチュハイブリダイゼーションによって検出されるが、但しそれらだけには限定されない。
いくつかの実施形態によれば、この方法は、対象をＡＨＲシグナル伝達モジュレーター（「ＡＨＲモジュレーター」でもある）で治療することをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲシグナル伝達モジュレーターは、毎日、隔日、週２回、週１回、月１回、又は月２回投与される。いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲシグナル伝達モジュレーターは、併用療法の一部として他の薬剤と一緒に投与される。
本明細書で使用される「ＡＨＲシグナル伝達モジュレーター」又は「ＡＨＲモジュレーター」は、細胞内のＡＨＲシグナル伝達に影響を与えるモジュレーターを指す。いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲシグナル伝達モジュレーターは、ＡＨＲシグナル伝達に直接影響を及ぼす。 いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲに対する直接の効果は、ＡＨＲへの直接の結合を介して媒介される。いくつかの実施形態によれば、直接モジュレーターは、ＡＨＲに対して完全又は部分的なアゴニスト及び/又はアンタゴニスト効果を示す。 いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲモジュレーターは間接モジュレーターである。
いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲシグナル伝達モジュレーターは小分子化合物である。 本明細書における「小分子化合物」という用語は、一般的に、２０００ダルトン、１５００ダルトン、１０００ダルトン、８００ダルトン、又は６００ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物を指す。
いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲモジュレーターは、以下を含む：２－フェニルピリミジン－４－カルボキサミド化合物、硫黄置換３－オキソ－２，３－ジヒドロピリダジン－４－カルボキサミド化合物、３－オキソ－６－ヘテロアリール－２－フェニル－２，３－ジヒドロピリダジン－４－カルボキサミド 化合物、２－ヘテロアリールピリミジン－４－カルボキサミド化合物、３－オキソ－２，６－ジフェニル－２，３－ジヒドロピリダジン－４－カルボキサミド化合物、２－ヘテロアリール－３－オキソ－２，３－ジヒドロ－４ －カルボキサミド化合物、ＰＤＭ ２、１，３－ジクロロ－５－[（１Ｅ）－２－（４－メトキシフェニル）エテニル]－ベンゼン、α－ナフトフラボン、６、２ ‘、４’－トリメトキシフラボン、ＣＨ２２３１９１、テトラヒドロピリドピリミジン 誘導体、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ－１、ＣＨ２２３１９１、ＧＮＦ３５１、ＣＢ７９９３１１３ ＨＰ１６３、ＰＸ－Ａ５９０、ＰＸ－Ａ５４８、ＰＸ－Ａ２７５、ＰＸ－Ａ７５８、ＰＸ－Ａ４４６、ＰＸ－Ａ２４５９０、ＰＸ－Ａ２５５４８、ＰＸ－Ａ２５２７５、ＰＸ－Ａ２５７５８、ＰＸ －Ａ２６４４６、インドールＡＨＲ阻害剤、及びオキサゾール含有（ＯｘＣ）化合物。
いくつかの実施形態によれば、直接ＡＨＲモジュレーターは、以下を含む：
（a）薬物：例えば、 オメプラゾール、スリンダク、レフルノミド、トラニラスト、ラキニモド、フルタミド、ニモジピン、メキシレチン、４‐ヒドロキシ－タモキシフェン、ベムラフェニブなど、
（b）合成化合物：例えば、１０－クロロ－７Ｈ－ベンズイミダゾ[２，１－ａ]ベンツ[デ]イソキノリン－７－オン（１０－Ｃｌ－ＢＢＱ）、ピフィスリン―α臭化水素酸塩、
（c）天然化合物：例えば、キヌレニン、キヌレン酸、シンナバリン酸、ＩＴＥ、ＦＩＣＺ、インドール－３－カルビノール、インドール－３－ピルビン酸、インドール－アルデヒド、微生物代謝物、食事成分、ケルセチン、レスベラトロール、クルクルミンを含むインドール、又は
（d）有毒化合物：例えば、 ＴＣＤＤ、タバコの煙、３－メチルコラントレン、ベンゾ（ａ）ピレン、２，３，７，８－テトラクロロジベンゾフラン、燃料排出物、ハロゲン化及び非ハロゲン化芳香族炭化水素、農薬。
いくつかの実施形態によれば、間接ＡＨＲモジュレーターは、ＡＨＲアゴニスト又はアンタゴニストのレベルの調節を通じてＡＨＲの活性化に影響を与える。
いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲアゴニスト又はアンタゴニストのレベルの調節は、以下の1つ又は複数を介して媒介される：
（a）ＡＨＲリガンドを修飾する酵素、例えば３ 'メトキシ－４'ニトロフラボン（ＭＮＦ）、アルファ-ナフトフラボン（α－ＮＦ）、フルオランテン（ＦＬ）、フェナントレン（Ｐｈｅ）、ピレン（ＰＹ）などを含むシトクロムｐ４５０酵素阻害剤によるチトクロームp４５０酵素 の調節、
（b）トリプトファン分解酵素の直接的及び間接的な阻害剤/活性化因子/誘導物質、例えばＩＤＯ１経路モジュレーター（インドキシモド、ＮＬＧ８０２）、ＩＤＯ１阻害剤（１－メチル－Ｌ－トリプトファン、エパカドスタット、ＰＸ－Ｄ２６１１６、ｎａｖｏｘｉｍｏｄ、ＰＦ－０６８４０００３、ＮＬＧ－９１９Ａ、ＢＭＳ－９８６２０５、ＩＮＣＢ０２４３６０Ａ、ＫＨＫ２４５５、ＬＹ３３８１９１６、ＭＫ－７１６２）、ＩＤＯ２阻害剤（６８０Ｃ９１、ＬＭ１０、４－（４－フルオロピラゾール－１－イル）－１，２－オキサゾール－５－アミン、縮合イミダゾ-インドール、インダゾール）、デュアルＩＤＯ/ＴＤＯ阻害剤（ＨＴＩ－１０９０ / ＳＨＲ９１４６、ＤＮ１４０６１３１、ＲＧ７００９９、ＥＰＬ－１４１０）、免疫チェックポイント阻害、ワクチン接種、細胞療法、化学療法、免疫刺激剤、放射線療法、ＵＶ光への曝露、及び標的療法を含む免疫療法、例えばイマチニブなどを含む、ＡＨＲリガンドを産生する酵素の調節。
いくつかの実施形態によれば、間接ＡＨＲモジュレーターは、１７－アリルアミノ-デメトキシゲルダナマイシン（１７－ＡＡＧ）、セラストロールなどのＨＳＰ９０阻害剤を含む、ＡＨＲの発現の調節を通じてＡＨＲの活性化に影響を及ぼす。
いくつかの実施形態によれば、間接ＡＨＲモジュレーターは、例えばエストロゲン受容体α（ＥＳＲ１）を含む、ＡＨＲの効果を調節する結合パートナー/補因子に影響を与えることによってＡＨＲの活性化に影響を与える。
ＡＨＲモジュレーターの例が以下に示されている：ＵＳ９１７５２６６、ＵＳ２０１９ ／ ２２５６８３、ＷＯ２０１９１０１６４７Ａ１、ＷＯ２０１９１０１６４２Ａ１、ＷＯ２０１９１０１６４３Ａ１、ＷＯ２０１９１０１６４１Ａ１、ＷＯ２０１８１４６０１０Ａ１、ＡＵ２０１９２８００２３Ａ１、ＷＯ２０２００３９０９３A1、ＷＯ２０２００２１０２４Ａ１、ＷＯ２０１９２０６８００Ａ１、ＷＯ２０１９１８５８７０Ａ１、ＷＯ２０１９１１５５８６Ａ１、ＥＰ３５３５２５９Ａ１、ＷＯ２０２００４３８８０Ａ１ 及びＥＰ３４６４２４８Ａ１、それらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲシグナル伝達モジュレーターの有効量は約０．０１ｍｇ / ｋｇ～１００ｍｇ / ｋｇである。いくつかの実施形態によれば、ＡＨＲシグナル伝達モジュレーターの有効量は、約０．０１ｍｇ ／ ｋｇ、０．０５ｍｇ ／ ｋｇ、０．１ｍｇ ／ ｋｇ、０．２ｍｇ ／ ｋｇ、０．５ｍｇ ／ ｋｇ、１ｍｇ ／ ｋｇ、５ｍｇ ／ ｋｇ、８ｍｇ ／ ｋｇ、 １０ｍｇ / ｋｇ、１５ｍｇ/ｋｇ、２０ｍｇ/ｋｇ、３０ｍｇ/ｋｇ、４０ｍｇ/ｋｇ、５０ｍｇ/ｋｇ、６０ｍ/kg、７０ｍｇ/ｋｇ、８０ｍｇ/ｋｇ、９０ｍｇ/ｋｇ、 １００ｍｇ/ｋｇ、１５０ｍｇ / kg、１７５ｍｇ/ｋｇ又は２００ｍｇ/ｋｇのＡＨＲシグナル伝達モジュレーターである。
本開示の別の側面は、本発明による方法を実施し、そして、患者に適切な治療を提供することをふくむ、前記治療を必要とする患者の細胞におけるＡＨＲ関連疾患又は状態を治療及び／又は予防する方法に関し、 ここで、前記治療は、少なくとも部分的に、本発明による方法の結果に基づいており、例えば、同定された化合物を提供するか、又は本明細書に記載の方法を含む治療をモニターリングする。
本開示の別の側面は、１つ又は別個の容器内で、任意に補助剤及び／又は前記方法を実行するための説明書とともに、本発明による方法を実行するための材料を含む診断キットに関する。
本開示の別の側面は、ＡＨＲ活性を調節する化合物のスクリーニング又は同定に向けられている。 本開示の別の側面は、細胞のＡＨＲ活性化状態に対する化合物の効果を決定するための方法に向けられている。
いくつかの実施形態によれば、細胞は候補体化合物で処理され、そして細胞内でＩＬ４Ｉ１の生物学的状態が決定/測定される。いくつかの実施形態によれば、生物学的サンプル中のＩＬ４Ｉ１の生物学的状態は、対照サンプル中のＩＬ４Ｉ１の生物学的状態と比較される。いくつかの実施形態によれば、生物学的状態はＩＬ４Ｉ１ ＲＮＡ発現である。
いくつかの実施形態によれば、候補体化合物で処理されたサンプルからのＩＬ４Ｉ１の生物学的状態が対照サンプルからのＩＬ４Ｉ１の生物学的状態よりも小さい場合、候補体化合物はＡＨＲシグナル伝達の阻害剤として分類され、そして候補体化合物は、候補体化合物で処理されたサンプルからのＩＬ４Ｉ１の生物学的状態が対照サンプルからのＩＬ４Ｉ１の生物学的状態よりも大きい場合、ＡＨＲシグナル伝達の活性化因子として分類される。
いくつかの実施形態によれば、候補体化合物は、ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態で少なくとも1.5倍の絶対的なアップレギュレーションをもたらす場合、ＡＨＲ活性化因子として特徴付けられる。いくつかの実施形態によれば、候補体化合物は、ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態において、少なくとも２の絶対倍率、少なくとも２．５の絶対倍率、少なくとも３つの絶対倍率、少なくとも３．５の絶対倍率、少なくとも４の絶対倍率、少なくとも４．５の絶対倍率、又は少なくとも５の絶対倍率のアップレギュレーションもたらす場合、ＡＨＲ活性化因子として特徴付けられる。
いくつかの実施形態によれば、候補体化合物は、生物学的状態で少なくとも０．６７の絶対倍率のダウンレギュレーションをもたらす場合、ＡＨＲ阻害剤として特徴付けられる。いくつかの実施形態によれば、候補体化合物は、生物学的状態において、少なくとも１の絶対倍率、２の絶対倍率、少なくとも２．５の絶対倍率、少なくとも３の絶対倍率、少なくとも３．５の絶対倍率、少なくとも４の絶対倍率、少なくとも４．５の絶対倍率、又は少なくとも５の絶対倍率のダウンレギュレーションをもたらす場合、ＡＨＲ阻害剤として特徴付けられる。
「倍率変化」という句は、２つの異なる条件における特定のバイオマーカーの値間の比率を指す。いくつかの実施形態によれば、２つの条件のうちの１つは対照である可能性がある。「絶対倍率変化」（「絶対倍率のアップレギュレーション」及び「絶対倍率のダウンレギュレーション」を含む）という句は、２つの条件間で特定のバイオマーカーの対数変換値を比較する場合に使用される。絶対倍率変化は、対数の指数を倍率変化値まで上げてから、数値の係数を報告することによって計算される。
本開示の種々の側面は、コンピュータまたは機械の使用可能または読み取り可能な媒体、又はコンピュータ、プロセッサ、及び／又はマシン上で実行された場合、コンピュータ又はマシンに方法の工程を実行させる媒体グループに具体化又は保存されたプログラム、ソフトウェア、又はコンピュータ命令として具体化され得る。本開示に記載される種々の機能性及び方法を実行するためにマシンによって実行可能な命令のプログラムを具体的に具体化する、マシンによって読み取り可能なプログラム記憶装置、例えば、コンピュータ可読媒体も提供される。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、ＣＰＵ、ディスプレイ、ネットワークインターフェース、ユーザインターフェース、メモリ、プログラムメモリ、及び作業メモリ（図６）を含むシステムを含み、ここで前記システムは、プログラム、ソフトウェア、又は本開示の方法又はプロセスに向けられた指示コンピュータを実行するようにプログラムされている。例示的な実施形態は図７に示されている。
「プロセッサ」という用語は、シングルコアプロセッサ、マルチコアプロセッサ、単一のデバイスに配置された複数のプロセッサ、又は相互に有線又は無線通信でデバイスのネットワーク、インターネット、又は クラウドを介して配布された複数のプロセッサを含むことができる。従って、本明細書で使用される場合、「プロセッサ」によって実行又は実行されるように構成された機能、特性、又は命令は、単一コアプロセッサによる機能、特性、又は命令の実行を含み得、マルチコアプロセッサの複数のコアによる機能、特性、又は命令の集合的又は協調的なパフォーマンスを含むことができ、又は複数のプロセッサによる集合的又は協調的な機能、特性、又は命令のパフォーマンスを含むことができ、ここで各プロセッサ又はコアはすべての機能、特性、又は命令を個別に実行する必要がない。プロセッサは、ＣＰＵ（中央処理装置）であってもよい。プロセッサは、ＧＰＵ（グラフィック処理ユニット）などの他のタイプのプロセッサを含むことができる。本開示の他の側面によれば、プログラムメモリにプログラムされたＣＰＵ実行命令の代わりに、又はそれに加えて、プロセッサは、ＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）、アナログ回路、又はＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）、ＰＡＬ（位相交互ライン）又はＰＬＡ（プログラマブルロジックアレイ）などの他の機能論理であり得る。
ＣＰＵは、本明細書で説明する機能を実行するために、プログラムメモリに保存されたプログラム（本明細書ではモジュール又は命令としても説明される）を実行するように構成される。メモリは、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）、ＲＯＭ（読み取り専用メモリ）、及び永続ストレージであり得るが、これらだけには限定されない。メモリは、例えば、データ、プログラム、命令、プログラムコード、及び／又は他の適切な情報などの情報を、一時的及び／叉は永続的に保存することができる任意のハードウェアである。
いくつかの実施形態によれば、開示は、以下を実行するようにプログラムされたプロセッサに向けられている：
（a）サンプルからのインターロイキン４誘導遺伝子１（ＩＬ４Ｉ１）の生物学的状態を対照サンプルからのＩＬ４Ｉ１の生物学的状態と比較し；そして
（e）比較工程に基づいて生体サンプルのＡＨＲ活性化状態を決定する。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、以下を実行するための命令を含む、コンピュータ可読記憶装置に向けられている：
（a）サンプルからのインターロイキン４誘導遺伝子１（ＩＬ４Ｉ１）の生物学的状態を対照サンプルからのＩＬ４Ｉ１の生物学的状態と比較し；そして
（e）比較工程に基づいて生体サンプルのＡＨＲ活性化状態を決定する。
従って、本発明は、以下の項目に関する：
項目１：細胞又は対象に由来する生物学的サンプル中のインターロイキン４誘発遺伝子１（ＩＬ４Ｉ１）の生物学的状態の変化を検出することを含む、細胞又は対象におけるアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の調節の検出方法であって、前記サンプル中のＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態の変化が、対象サンプルに比較して、前記細胞又は対象におけるＡＨＲのＩＬ４Ｉ１関連調節を示す。
項目２：前記調節がＡＨＲの活性化又は抑制から選択される、項目１に記載の方法。
項目３：前記調節が、前記細胞又は対象におけるＡＨＲ関連の生物学的又は病理学的状態を示す、項目１又は２に記載の方法。
項目４：前記生理学的又は病理学的状態が、中毒、癌、自己免疫疾患、変性、炎症、感染症、代謝性疾患及び状態、血管新生、薬物代謝、造血、脂質代謝、細胞運動性、免疫調節、ストレス状態、例えば、生物学的、機械的及び環境的ストレスから選択される、項目３に記載の方法。
項目５：前記検出された生物学的状態が、突然変異、核酸メチル化、コピー数、発現、タンパク質の量、タンパク質修飾、細胞局在、代謝物、特に、例えばトリプトファン分解産物などのＩＬ４Ｉ１によって産生される代謝物、及びＩＬ４Ｉ１の生物活性から選択される、項目１～４のいずれか１項目に記載の方法。
項目６：前記生物学的サンプルが、体液、哺乳類、例えばヒト、細胞、組織、全血、細胞系、細胞上清液、初代細胞、ＩＰＳＣ、ハイブリドーマ、組換え細胞、幹細胞、及び癌細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、皮膚細胞、頭皮細胞、肺細胞、粘膜細胞、筋肉細胞、 骨格筋細胞、線条筋細胞、平滑筋細胞、心臓細胞、分泌細胞、脂肪細胞、血液細胞、赤血球、好塩基球、好酸球、単球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、ＮＫ細胞、調節性Ｔ－ 細胞、樹状細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、骨髄細胞、マクロファージ、単球由来間質細胞、骨髄細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、膵臓細胞、卵細胞、精子、腎臓細胞、線維芽細胞、腸細胞、 女性又は男性の生殖管の細胞、前立腺細胞、膀胱細胞、眼細胞、角膜細胞、網膜細胞、感覚細胞、ケラチノサイト、肝細胞、脳細胞、腎臓細胞、及び結腸細胞、並びに前記細胞又は組織の形質転換された対応物を含む適切なサンプルから選択される、項目１～５のいずれか１項目に記載の方法。
項目７：前記対象が、哺乳類対象、例えばヒト対象、例えばＡＨＲ関連の生理学的又は病理学的状態に苦しんでいるヒト患者から選択される、項目１～６のいずれか１項目に記載の方法。
項目８：前記対象サンプルが、例えば健康な対象又は対象グループからのサンプルから選択される、項目１～７のいずれか１項目に記載の方法。
項目９：少なくとも１つの候補体モジュレーター化合物と、生物学的サンプルとを接触し、そしてＩＬ４Ｉ１又はＩＬ４Ｉ１をコードする遺伝子の生物学的調節を検出することを含む、ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の少なくとも１つのモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、ここで前記調節又は活性が前記生物学的状態のモジュレーターを同定することを特徴とする方法。
項目１０：前記方法が好ましくは、さらに、生物学的サンプル中のＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化を検出することを含み、ここで前記少なくとも１つのモジュレーターの非存在下と比較して前記少なくとも１つのモジュレーターの存在下での前記ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化が、モジュレーターを同定する、項目９に記載の方法。
項目１１：前記検出された生物学的状態が、突然変異、核酸メチル化、コピー数、発現、タンパク質の量、タンパク質修飾、細胞局在、代謝物、特に、例えばトリプトファン分解産物などのＩＬ４Ｉ１によって産生される代謝物、及びＩＬ４Ｉ１の生物活性から選択される、項目９又は１０に記載の方法。
項目１２：前記モジュレーターが、ＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態の阻害剤又は誘導剤から選択される、項目９～１１のいずれか１項目に記載の方法。
項目１３：ＡＨＲの調節を検出することをさらに含む、項目９～１２のいずれか１項目に記載の方法。
項目１４：前記化合物が、タンパク性ドメイン、小分子、ペプチド、抗体、例えばＩＬ４Ｉ１に結合するモノクローナル抗体、環境物質、プロバイオティック、毒素、エアロゾル、薬、栄養素、生薬組成物、植物抽出物、揮発性化合物、ホメオパシー物質、香、医薬品 、ワクチン、生物、例えば動物、植物、真菌、細菌、古生物に由来する化合物又は化合物混合物、化合物、食品又は化粧品産業で使用される化合物、及び前記化合物のライブラリーから選択される、項目９～１３のいずれか１項目に記載の方法。
項目１５：ある量の少なくとも１つの化合物と接触された生物学的サンプルに対して、項目１～８のいずれか１項目に記載の方法を実施することを含む、前記少なくとも１つの化合物に応答してＡＨＲの生物学的状態の調節をモニターするための方法であって、前記生物学的サンプルが前記量の前記化合物と接触されなかった対照サンプルと比較されることを特徴とする方法。
項目１６：前記生物学的サンプルが、治療の過程を通して得られ、そして／又は本明細書に記載されるように、適切な対照サンプル又は対象又は患者のグループに由来するサンプルと比較される、項目１５に記載の方法。
項目１７：ＩＬ４Ｉ１調節のサブグループへの前記サンプルの監視なしのクラスターリング又は監視ありの分類のために、及び任意には、ＡＨＲ調節の異なるサブグループへの前記サンプルの監視なしのクラスターリング又は監視ありの分類のために、前記比較を用いる工程をさらに含む、項目１～１６のいずれか１項目に記載の方法。
項目１８：さらに、対象の特定グループ又は患者グループへの前記対象の分類を含む、項目１～１６のいずれか１項目に記載の方法。
項目１９：前記方法が、高スループット法を使用することを含む、項目１～１８のいずれか１項目に記載の方法。
項目２０：項目１～１９のいずれか１項目に記載の方法を、１つ又は別個の容器内で、任意には、補助剤及び／又は前記方法を実行するための指示と共に、実行するための材料を含む、診断キット。
項目２１：項目１～１９のいずれか１項目に記載の方法の項目２０に記載の診断キットへの使用。
項目２２：項目１～１９のいずれか１項目に記載の方法を実施し、そして本発明による方法の結果に少なくとも部分的に基づく適切な治療を患者に提供することを含む、前記治療を必要とする患者におけるＡＨＲ関連の疾患又は状態を治療及び／又は予防するための方法。
Figure 2022529423000001
次に、本発明は、添付の図を参照し、それにもかかわらず、それに限定されることなく、以下の実施例でさらに説明されるものとする。 本発明の目的のために、本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
配列番号１～２６は、本発明で使用されるようなオリゴマーの配列を示す。
材料及び方法
マイクロアレイ及びＲＮＡ－ｓｅｑデータ分析
アレイデータセット－ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイチップ「ヒト遺伝子２．０ST」を、オリゴパッケージを使用して分析し、そしてＮｅｔＡｆｆｘを使用して注釈を付けた（１４）。生のＣＥＬファイルはＲＭＡで正規化され、そして要約された。 マイクロアレイ用のリムマパイプラインを使用して、差次的遺伝子発現を行った（１５）。
ＲＮＡ－ｓｅｑデータセット－The Cancer Genome Atlas（ＴＣＧＡ）腫瘍データセットの調和したＦＰＫＭデータは、ＧＤＣ（https://gdc.cancer.gov）のＴＣＧＡｂｉｏｌｉｎｋｓ（１６）を使用してダウンロードされ、そして「原発性固形腫瘍」という識別子を持つ患者のみが保持された。ＦＰＫＭ値はＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）（１７）に変換され、正常組織のＴＰＭデータはGenotype-Tissue Expressionデータセット（GTEX-https：//gtexportal.org/home/）からダウンロードされた。 すべてのＴＰＭ値はｌｏｇ２変換された。
細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ、ＬＮ－２２９、Ｔａｏ ＢｐＲｃ１、及びＵ－８７ＭＧをＡＴＣＣから入手した。ＣＡＳ－１及びＵ－２５１ＭＧは、それぞれＩＣＬＣ及びＥＣＡＣＣからのものであった。ＣＡＳ－１、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＬＮ－２２９、Ｕ－８７ＭＧ、及びＵ－２５１ＭＧを、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１０２７０１０６）、２ｍＭの Ｌ-グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０－０２４）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、１１３６０－０３９）、１００Ｕ/ｍＬのペニシリン及び１００μｇ/ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、 １５１４０－１２２）により補充された、フェノールレッドを含まない高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、３１０５３０２８）（以降、完全ＤＭＥＭと呼ぶ）において培養した。ＴＡＯ BpRc1細胞を上記のように培養しが、完全なフェノールレッドを含まないＤＭＥＭと５μｇ/ｍＬのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ３３８３）を使用した。転座アッセイには、１０％Ｔｅｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｒｏｖｅｄ ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３１１０７）を含む培地を使用した。 細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
トランスジェニック細胞系の生成
Ｇａｔｅｗａｙ適合性組換え部位に隣接するヒトＩＬ４Ｉ１ ｃＤＮＡクローンを、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（ＭＢＳ１２７０９３５）から購入した。ｃＤＮＡクローンをレンチウイルス適合性ゲートウェイ発現ベクターｐＬＸ３０１（Ｄ．Ｒｏｏｔからの贈り物、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２５８９５）に再結合しました（１８）。レンチウイルスの生成を、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１１）を使用して、製造元のプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３ＴにｐＭＤ２．Ｇ（Ｄ．Ｔｒｏｎｏからの贈り物、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１２２５９）、ｐｓＰＡＸ2（Ｄ．Ｔｒｏｎｏからの贈り物、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１２２６０）、及びレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトすることによって達成した。ウイルスの上清液を４８時間及び７２時間で回収し、プールし、そして０．４５μｍの細孔フィルターで濾過した。安定したＩＬ４Ｉ１過剰発現（ｐＬＸ３０１－ＩＬ４Ｉ１）及び対照（ｐＬＸ３０１）細胞系を、８μg/ｍＬのポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＴＲ－１００３-G）の存在下でＵ－８７ＭＧ及びＵ－２５１ＭＧ細胞をそれぞれのウイルス上清液に２４時間感染させ、その後、１μｇ/ｍＬのピューロマイシン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、Ａ２８５６）を含む培地で選択することによって、生成した。ＩＬ４Ｉ１の安定した過剰発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ウエスタンブロット、及びＩＬ４Ｉ１酵素活性によって確認された。
Ｕ－８７ＭＧ細胞におけるＡＨＲの安定したノックダウンは、ＡＨＲを標的とするｓｈＥＲＷＯＯＤ ＵｌｔｒａｍｉＲレンチウイルスｓｈＲＮＡ（ｔｒａｎｓＯＭＩＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＴＬＨＳＵ１４００－１９６－ＧＶＯ－ＴＲＩ）を使用して達成された。神経膠腫細胞を、ｓｈＡＨＲ又はｓｈＣｏｎｔｒｏｌ（ｓｈＣ）配列のいずれかを含むウイルス上清液により感染させて、安定した細胞系を生成した。ｈＥＲＷＯＯＤ ＵｌｔｒａｍｉＲ ｓｈＲＮＡ配列は次の通りである：ｓｈＡＨＲ (ＵＬＴＲＡ－３２３４８２１): ５’－TGCTGTTGACAGTGAGCGCAGGAAGAATTGTTT TAGGATATAGTGAAGCCACAGATGTATATCCTAAAACAATTCTTCCTTTGCCTACTGCCTCGGA-3’ (配列番号１); ｓｈＣ (ＵＬＴＲＡ－ＮＴ＃４): ５’－ TGCTGTTGACAGTGA GCG AAGGCAGAAGTATGCAAAGCATTAGTGAAGCCACAGATGTAATGCTTTGCATACTTCTGCCTGTGCCTACTGCCTCGG A-3 (配列番号２)’。 ＩＬ４Ｉ１のｓｉＲＮＡを介した遺伝子ノックダウンは、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ Ｈｕｍａｎ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌ－００８１０９－００－０００５）を使用して実施された。ＡＨＲのｓｉＲＮＡを介した遺伝子ノックダウンは、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ Ｈｕｍａｎ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌ－００４９９０－００－０００５）を使用して実施された。ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１３７78100）を使用して、製造元のプロトコルに従って行われた。 ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ非標的プールｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｄ－００１８１０－１０－０５）を対照として使用した。
テトラサイクリン制御下でＧＦＰタグ付きＡｈｒを発現する、安定的にトランスフェクトされたｔａｏ ＢｐＲｃ１ｃ細胞を使用して、Ａｈｒの核移行を視覚化した。 マウスＡｈｒは、ｔｅｔ－ｏｆｆ発現システム（ｐＲｅｖＴＲＥ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を含むｐＥＧＦＰ－Ｃ１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、カリフォルニア州パロアルト）にクローン化された。Ｐｈｏｅｎｉｘパッケージングラインが、内因性Ａｈｒ発現を欠くマウス肝細胞癌ＢｐＲｃ１細胞へのレトロウイルストランスフェクションに使用された。
細胞培養処理条件
確立された仮想のＡＨＲリガンドで接着細胞を処理するために、ウェル当たり４ ｘ １０５個の細胞を６つのウェルプレートに播種し、そして処理前に２４時間インキュベートした。非接着細胞を２４ウェルプレートに１ｍＬ中５ｘ１０５細胞で播種し、そしてすぐに処理した。生成されたＡＨＲシグネチャを検証するために、細胞を確立されたＡＨＲアゴニストＫｙｎ（５０μＭ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｋ８６２５）で２４時間処理した。直接及び下流のＩＬ４Ｉ１代謝物がＡＨＲを活性化する可能性を調査するために、細胞を、Ｉ３Ｐ（３．１２５μＭ～１００μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ７０１７）、ＨＰＰ（８μＭ～１０００μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１１４２８６）、ＰＰ（８μＭ～１０００μＭ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｌ１１９３４）、キヌレン酸（５０μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｋ３３７５）、インドール－３－乳酸（２５μＭ～１００μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ５５０８）、３－インドール酢酸（２５μＭ～１００μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ２８８６）、インドール －３－カルボキサルデヒド（６．２５μＭ～１００μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１２９４４５）及びＵ－８７ＭＧ又はＵ－２５１ＭＧ対照とｉｌ4I1発現細胞の上清液により２４時間、処理した。ＡＨＲアンタゴニストＳＲ１（１μＭ、Ｍｅｒｃｋ Millipore、182706）を使用する場合、細胞を単独で、又はＡＨＲリガンドと組み合わせて２４時間処理した。 ＤＭＳＯを、培地中の最終濃度が０．２％を超えないように全ての化合物を溶解するために使用した。
Ｕ－８７ＭＧ及びＵ－２５１ＭＧ対照とＩＬ４Ｉ１発現細胞を含む遺伝子及びタンパク質発現実験では、ウェル当たり４ ｘ １０５細胞を、６ウェルプレートの２ｍＬに播種し、そして７２時間又は１２０時間インキュベートした。メタボロミクス実験では、６ウェルプレートの２ ｍＬの完全ＤＭＥＭに、ウェル当たり４ｘ１０５細胞の密度で細胞を播種し、２４時間インキュベートした。 より多くの細胞と上清液が必要な場合、ウェル当たり２．６ｘ１０６個の細胞を１０ｃｍディッシュの１３．３ｍＬの完全ＤＭＥＭに播種し、２４時間インキュベートした。４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２又は１３．３ｍＬの新鮮なＦＢＳフリーＤＭＥＭを添加し（使用したウェルサイズと細胞密度に応じて）、細胞を１２０時間インキュベートした。 サンプル準備は以前の研究から適応された（１９，２０）。簡単に説明すると、上清液を液体窒素で急速凍結し、代謝物を測定するまで－８０℃で保存した。 細胞を含むプレートを３７℃に予熱した細胞培養グレードの水で1回すばやく洗浄し、液体窒素でクエンチし、代謝物を測定するまで－８０℃で保存した。
ＣＡＳ－１細胞でＩＬ４Ｉ１をノックダウンした実験では、６ウェルプレートのウェル当たり４ｘ１０５細胞を播種し、２４時間インキュベートした。 細胞にそれぞれの対照又は標的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。 トランスフェクションの２４時間後に完全ＤＭＥＭを１．５ｍＬのＦＢＳフリーＤＭＥＭに交換し、細胞を７２時間インキュベートした。
ＲＮＡ単離及びリアルタイムＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ キット（Ｑｉａｇｅｎ、８０２０４）を使用して培養細胞から全ＲＮＡを回収した後、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写酵素キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３６８８１３）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４３０９１５５）を使用してｃＤＮＡサンプルのリアルタイムＰＣＲを実行した。データは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．３を使用して処理及び分析された。 標的遺伝子の相対的定量化は、２ΔΔCt法を使用して参照遺伝子としてのＲＮＡ１８Ｓに対して行われた。 ヒトプライマー配列を以下のように表２に示す。
Figure 2022529423000002
タンパク質の単離及びウエスタンブロット
ＨＲ転座アッセイでは、ＬＮ－２２９神経膠腫細胞の核画分と細胞質画分のタンパク質含有量をイムノブロッティングで比較した。ＬＮ－２２９細胞をＵ－２５１ＭＧ対照又はＩＬ４Ｉ１発現細胞の上清液で４時間処理した（１２０時間）。溶解物を液体窒素で急速凍結し、各凍結融解サイクルの後に超音波処理を１０サイクル行った後、３回解凍した。 ２つの異なる細胞画分からタンパク質を単離するために、ＮＥ－ＰＥＲ（登録商標）核及び細胞質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用した。抽出は、製造元の指示に従って実行された。 核特異的ラミンＡは適切な分画の対照として機能し、ポリクローナルウサギ抗ラミンＡ（１：５００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をそれぞれ使用して検出された。 ＡＨＲは、一次マウスモノクローナル抗ＡＨＲ抗体クローンＲＰＴ１（Ａｂｃａｍ、ベルリン、ドイツ）を使用して検出された。
ＡＨＲ核転座アッセイ
トランスジェニックｔａｏ ＢｐＲｃ１ｃ細胞におけるＧＦＰ－Ａｈｒ発現の誘導のために、転座アッセイの２４時間前に細胞をテトラサイクリンから取り出した。 アッセイは、１５０μｌ/ウェルで７５００細胞/ウェルの黒色透明底の９６ウェルプレート（ＢＤ、＃３５３２１９）で実施した。代謝物を５０μＬ/ウェルの誘導培地に添加した。 細胞をそれぞれ２５μＭの ＰＰ、ＨＰＰ、およびＩ３Ｐに４時間曝露した。 培地を廃棄し、細胞をＰＢＳ中の予熱した３．７％ホルムアルデヒドで固定した（ＲＴで１０分）。固定後、細胞を界面活性剤緩衝液（ＤＢ、ＰＢＳ中０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄し、続いてＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でＲＴで１５分間透過処理した。細胞をＤＢで２回洗浄し、０．４ｎｇ/ｍｌの Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）とＲＴで30分間、光から保護してインキュベートした。 ＤＢ及びＰＢＳで洗浄した後、転座分析まで細胞を４℃でＰＢＳに保存した。ＫｙｎＡによる転座は、適切な負の培地対照を含む３時間の曝露後に生細胞イメージングによってモニターされた。 異なる代謝物によるＡｈｒの転座は、ＢＤ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｍａｇｅｒ８５５でモニターされた。
メタボロミクス分析
ＩＬ４Ｉ１を発現及び非発現するＵ－８７ＭＧ及びＵ－２５１ＭＧ細胞によるフェニルアラニン、チロシン、及びＴｒｐの消費を、１２０時間のインキュベーション後の細胞培養上清液中のアミノ酸の定量化によって評価した。フェニルアラニン及びチロシンを検出するために、アミノ酸を製造元のプロトコルに従って蛍光色素ＡｃｃＱ－Ｔａｇ（登録商標）（Ｗａｔｅｒｓ）で標識した。誘導体化生成物は、Ａｃｑｕｉｔｙ蛍光検出器（ＦＬＲ）（Ｗａｔｅｒｓ）に接続されたＡｃｑｕｉｔｙ HクラスＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）で４２℃で分離された。サンプルは、Ｙａｎｇ ｅｔ． ａｌ．， ２０１５（２１）よって以前に説明されたようにＵＰＬＣで分析された。Ｔｒｐ消費の分析のために、上清液を等量の１２％過塩素酸と混合し、氷上で１０分間インキュベートした。 分析の前に、サンプルを４℃、１６，４００ ｇで１０分間遠心分離し、タンパク質を沈殿させ、残っている細胞片を除去した。次に、代謝物を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＨクラスＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）に接続されたＡｃｑｕｉｔｙ ＨＳＳ Ｔ３カラム（１００ ｍｍ ｘ ２．１ ｍｍ、１．７ μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）での逆相クロマトグラフィーによって分離した。 カラムを３７℃に加熱し、５カラム容量の１００％溶媒Ａ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、３ｍＭの酢酸亜鉛、ｐＨ ６）で０．５５ｍＬ/分の流速で平衡化した。Ｔｒｐの明確な分離は、溶媒Ａ中の溶媒Ｂ（アセトニトリル）の濃度を次のように増加させることによって達成された：4分０％Ｂ、１０分５％Ｂ、１３分１５％Ｂ、１５分２５％Ｂ、３分で０％Ｂに戻る。Ｔｒｐは蛍光によって検出された（Ａｃｑｕｉｔｙ ＦＬＲ検出器、Ｗａｔｅｒｓ、励起：２５４ｎｍ、発光：４０１ｎｍ）。 定量化には標準を使用した（Ｓｉｇｍａ）。データの取得と処理は、Ｅｍｐｏｗｅｒ３ソフトウェアスイート（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して実行された。 非標的メタボロミクスアプローチを採用して、１２０時間培養したＩＬ４Ｉ１発現細胞と非発現Ｕ－８７ＭＧ及びＵ－２５１ＭＧ細胞の上清液に差次的に豊富な代謝物を同定した。 この目的のために、５０μｌの細胞培養上清液を２００μｌの氷冷アセトニトリルとボルテックスで混合した後、－２０℃で１時間インキュベートした。サンプルを４℃で１５分間遠心分離し、ＴｒｕＶｉｅｗ ＵＰＬＣ－ＭＳバイアル（Ｗａｔｅｒｓ）に移した。 プールサンプルは、全てのサンプルを等量混合して調製した。 サンプルは、Ｖｉｏｎ ＩＭＳ ＱＴｏｆ ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）に接続されたＩクラスＵＰＬＣシステムを使用して測定された。Ｃｏｇｅｎｔ Ｄｉａｍｏｎｄ Ｈｙｄｒｉｄｅ ２．０カラム（１５０ｘ２．１ｍｍ、２．２μｍ； ＭｉｃｒｏＳｏｌｖ ＵＳＡ）又はＨＳＳ Ｔ３カラム（１００ｘ２．１ｍｍ、１．８μｍ; Ｗａｔｅｒｓ）のいずれかを使用して代謝物を分離した。 機器の制御とＭＳデータの取得には、ＵＮＩＦＩ １．８．２（Ｗａｔｅｒｓ）を使用しました。 フォローアップデータ分析は、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して実行された。ＩＬＡは２０４．０６６２Ｄａ（負のモード;予想されるモノアイソトピック質量：２０５．０７３９Ｄａ;偏差-２ｐｐｍ）で検出され、１１６．０４９５、１２８．０４９５、１３０．０６５２、及び２０４．０６５５Ｄａの予想されるフラグメントイオンによって識別された。選択された示差的に豊富なＴｒｐ、フェニルアラニン、及びチロシン由来の代謝物（ＩＡＡ、Ｉ３ＣＡ、ＫｙｎＡ、ＰＰ、ＨＰＰ、ＨＢＡ）及びさらに下流の変換産物（Ｋｙｎ、ＰＡＡ、ＨＰＡＡ）を、トリプルクワッドＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ ６４６０）と外部標準を組み合わせたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０）を使用した疑わしいＬＣ－ＭＳ測定から得られたフラグメンテーションパターンを比較することにより、同定した。
代謝物の標的化された定量化には、ＭＲＭモードを使用した。 全ての試験化合物について、必要量を１．５ｍＬエッペンドルフセーフロックチューブに重量分析で添加し、試験化合物を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解することにより、１０ｍＭのストック溶液を調製した。 各化合物について、ストック溶液は１０ｍＭ～０．０３９ｍＭの濃度範囲をカバーした。 代謝物の定量化のために、３００μＬの各バイオアッセイ上清液をエッペンドルフセーフロックチューブに添加した。関連するキャリブレーションサンプルは、３００μＬの細胞培養培地と１μLの試験化合物ストック溶液をエッペンドルフセーフロックチューブに添加することによって調製した。 続いて、３００μＬのアセトニトリルを添加し、培地成分の沈殿を引き起こした。 全てのサンプルを８０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、１５０μＬの上清液をＨＰＬＣ分析用に２００μＬのガラスインサートを備えた１．５ｍＬガラスバイアルに移した。分析のために５μｌのサンプルを注入した。 水と０．１％ギ酸を含むアセトニトリルをそれぞれ溶離液ＡとＢとして使用し、流速０．５ｍＬ/分で５分間のＨＰＬＣ分離を行った。 分離は、長さ５０ｍｍのＰｏｒｏｓｈｅｌｌ１２０ ＥＣ－Ｃ１８ ２．７ミクロンカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行った。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊｅｔｓｔｒｅａｍ ＥＳＩソースは、ガス及びガスシース温度３００℃、ガス流量１０Ｌ/分、シースガス流量１１Ｌ/分に設定した。 ネブライザーの圧力は55psiに設定し、キャピラリー電圧は実行中2000Vに設定しました。 機器の制御とデータ取得には、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアスイート（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した。
ＩＬ４Ｉ１活性アッセイ
ＩＬ４Ｉ１及び対照形質導入対応物を安定して発現するＵ－８７ＭＧ及びＵ－２５１ＭＧ細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ / ＰＢＳで溶解した。 転移性黒色腫の切除から得られたヒト組織を、ミキサーミルＭＭ３０１内でステンレス鋼ビーズと共に４０Ｈｚで1分間の２サイクル振盪することにより１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ /ＰＢＳで溶解した。ＩＬ４Ｉ１活性を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）プレートリーダーを使用して、黒色の９６ウェルプレートでＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ蛍光（５３０ｎｍでの励起と５９０ｎｍでの発光）を介して毎分６０分間Ｈ２Ｏ２生成を測定することにより決定した。反応はＰＢＳで調製し、図の凡例に示すように、５０μＭのＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、＃Ｃａｙ１００１０４６９）、０．１Ｕ/ｍＬのＨＲＰ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃５１６５３１）、及びＩＬ４Ｉ１基質としてのアミノ酸を含んだ。 ＩＬ４Ｉ１非依存性Ｈ２Ｏ２産生は、アミノ酸の非存在下で評価され、基質の存在下で得られた活性から差し引かれた。ＩＬ４Ｉ１を介したＨ２Ｏ２生成は、Ｈ２Ｏ２検量線（最終０－１０ μＭ）を使用して計算され、ブラッドフォードアッセイによって定量化されたサンプルタンパク質含有量に対して正規化された。
ソフトウェア及び統計
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０及び８．０を使用して、遺伝子（リアルタイムＰＣＲ）及びタンパク質発現データ、並びに代謝物データのグラフィカル及び統計分析を行った。特に明記しない限り、データは少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。 データが変化の倍数として表された場合、これらの値はＬｏｇ１０変換され、結果の値は統計分析に使用された。データに応じて、次の統計分析が適用された：両側スチューデントt検定（対応のある又は対応のない）、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用した一元配置分散分析及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用した反復測定ＡＮＯＶＡ。 有意差は、＊ ｐ ＜０．０５、＊＊ ｐ ＜０．０１、＊＊＊ ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊ ｐ ＜０．０００１として報告された。 ｎ．ｓ． 有意差がないことを示す。
正常（ＧＴＥＸ）及び腫瘍組織におけるＴｒｐ分解酵素の発現レベルを比較すると、本発明者らは、ＩＤＯ１及びＴＤＯ２、ＡＨＲの活性化に関与する他のトリプトファン分解酵素と同様に、ＩＬ４Ｉ１発現が正常組織と比較して癌組織で増強されることを見出した（図１ａ、ｂ）。 本発明者らは、ＡＨＲ標的遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲが、ＩＬ４Ｉ１によって媒介されるＡＨＲ活性化を確認したことを示している（図２ａ）。ＩＬ４Ｉ１を介したＡＨＲの活性化をさらに確認すると、ＩＬ４Ｉ１発現細胞の上清液で処理した神経膠芽腫細胞でＡＨＲの核/細胞質局在の増加が検出されました（図２ｂ）。 逆に、ＩＬ４Ｉ１を構成的に発現する神経膠芽腫細胞におけるＩＬ４Ｉ１のノックダウンは、ＡＨＲ標的遺伝子ＴＩＰＡＲＰの発現を減少させた（図２ｃ）。 まとめると、本発明者らの結果は、ＩＬ４Ｉ１が実際にＡＨＲを活性化することを明らかにしている。
次に、本発明者らは、ＩＬ４Ｉ１がどのようにＡＨＲを活性化するかを調査することに着手した。 以前の報告と一致して、ｉｌ4I1の発現はフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンのレベルを低下させ（図２ｄ）、フェニルアラニンが最も効率的に異化された（図２ｅ、ｆ）。ＩＬ４Ｉ１は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンをそれぞれフェニルピルビン酸（ＰＰ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）、及びインドール－３－ピルビン酸（Ｉ３Ｐ）に変換する（１）。 従って、本発明者らは、ＡＨＲに熟達した神経膠芽腫細胞をこれらの代謝物に曝露し、それらがＡＨＲを活性化するかどうかを調査した。ＰＰ及びＨＰＰはＡＨＲ標的遺伝子の関連する調節を誘発しなかったが、遺伝子発現分析は、ＡＨＲ依存性であるＩ３Ｐ（図２ｇ、ｈ）に応答したＡＨＲ活性化シグネチャー遺伝子の有意な調節を明らかにした。 並んで、ＡＨＲの核転座はＩ３Ｐに応答してのみ観察された（図２ｉ）。要約すると、本発明者らの結果は、ＩＬ４Ｉ１が主にＩ３Ｐの生成を通じてＡＨＲを活性化することを示しており、これは、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって生成される微生物叢由来のＩ３Ｐ及びＩ３Ｐからの発見と一致している（２２－２５）。
ＩＬ４Ｉ１発現細胞は、高レベルのＰＰ及びＨＰＰと、それらの下流代謝物であるフェニル酢酸（ＰＡＡ）、４－ヒドロキシベンズアルデヒド（ＨＢＡ）、及びヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡＡ）を示した（図３ａ、ｂ）。 発明者の驚いたことに、発明者はＩ３Ｐを検出できなかった（図３ｃ、ｄ）。 しかしながら、本発明者らは、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール－３－カルボキサルデヒド（Ｉ３ＣＡ）及びインドール－３－乳酸（ＩＬＡ）を含むＩ３Ｐに由来する化合物のレベルの増加を検出し（図３ｃ、ｄ）、このことは、Ｉ３Ｐを介した代謝フラックスが非常に速いことを示唆している。さらに、キヌレン酸のレベルは、ＩＬ４Ｉ１発現細胞の上清液で上昇した（図３ｃ、ｄ）。 膠芽腫細胞をＩ３Ｐの濃度を増加させて処理すると、細胞上清液中のＩＡＡ、Ｉ３ＣＡ、及びキヌレン酸が用量依存的に増加した（図４ａ）。 ＩＬ４Ｉ１がキヌレン酸レベルを高めることができる1つの反応は、キヌレニンアミノトランスフェラーゼがアミノ基受容体としてＩ３Ｐ、ＰＰ、又はＨＰＰを使用できるため、キヌレニン（ＩＤＯ１及び/又はＴＤＯ２によって生成される）のアミノ基転移によるものである（２６）。しかしながら、キヌレニン濃度はＩＬ４Ｉ１発現細胞では減少せず、この仮説はありそうになかった（図３ｃ、ｄ）。 キヌレン酸はＩ３Ｐから自発的に形成され、Ｈ２Ｏ２の存在下で増強され（図４ｂ）、ＩＬ４Ｉ１によってＩ３Ｐと同時に生成されたＨ２Ｏ２がキヌレン酸への変換を促進することを示唆している。 実際、ラット組織でトリプトファンアミノ基転移を介して生成されたＩ３Ｐからのキヌレン酸の生成は以前に記載されている（２７）。本発明者らは、ＩＡＡ又はＩ３Ｌ（図４ｃ、ｄ）に応答したＡＨＲ標的遺伝子ＴＩＰＡＲＰの関連する誘導を観察しなかったが、Ｉ３ＣＡ（図４ｅ）及びキヌレン酸（図４ｆ）はＴＩＰＡＲＰ転写物を誘導した。 キヌレン酸によって媒介されるＡＨＲの活性化は、ＡＨＲの核移行によって確認された（図４ｇ）。要約すると、本発明者らのデータは、ＩＬ４Ｉ１がキヌレン酸及びＩ３ＣＡを含むＩ３Ｐの下流生成物を介してＡＨＲを活性化し、ＡＨＲ活性化化合物の混合物を生成することを示唆している。
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Claims (15)

  1. 細胞又は対象に由来する生物学的サンプル中のインターロイキン４誘発遺伝子１（ＩＬ４Ｉ１）の生物学的状態の変化を検出することを含む、細胞又は対象におけるアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の調節の検出方法であって、前記サンプル中のＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態の変化が、対象サンプルに比較して、前記細胞又は対象におけるＡＨＲのＩＬ４Ｉ１関連調節を示し、ここで好ましくは、前記調節がＡＨＲの活性化又は抑制から選択されることを特徴とする方法。
  2. 前記調節が、前記細胞又は対象におけるＡＨＲ関連の生物学的又は病理学的状態を示し、好ましくは、前記生理学的又は病理学的状態が、中毒、癌、自己免疫疾患、変性、炎症、感染症、代謝性疾患及び状態、血管新生、薬物代謝、造血、脂質代謝、細胞運動性、免疫調節、ストレス状態、例えば、生物学的、機械的及び環境的ストレスから選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記検出された生物学的状態が、突然変異、核酸メチル化、コピー数、発現、タンパク質の量、タンパク質修飾、細胞局在、代謝物、特に、例えばトリプトファン分解産物などのＩＬ４Ｉ１によって産生される代謝物、及びＩＬ４Ｉ１の生物活性から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記生物学的サンプルが、体液、哺乳類、例えばヒト、細胞、組織、全血、細胞系、細胞上清液、初代細胞、ＩＰＳＣ、ハイブリドーマ、組換え細胞、幹細胞、及び癌細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、皮膚細胞、頭皮細胞、肺細胞、粘膜細胞、筋肉細胞、 骨格筋細胞、線条筋細胞、平滑筋細胞、心臓細胞、分泌細胞、脂肪細胞、血液細胞、赤血球、好塩基球、好酸球、単球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、ＮＫ細胞、調節性Ｔ－ 細胞、樹状細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、骨髄細胞、マクロファージ、単球由来間質細胞、骨髄細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、膵臓細胞、卵細胞、精子、腎臓細胞、線維芽細胞、腸細胞、 女性又は男性の生殖管の細胞、前立腺細胞、膀胱細胞、眼細胞、角膜細胞、網膜細胞、感覚細胞、ケラチノサイト、肝細胞、脳細胞、腎臓細胞、及び結腸細胞、並びに前記細胞又は組織の形質転換された対応物を含む適切なサンプルから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記対象が、哺乳類対象、例えばヒト対象、例えばＡＨＲ関連の生理学的又は病理学的状態に苦しんでいるヒト患者から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記対象サンプルが、例えば健康な対象又は対象グループからのサンプルから選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 少なくとも１つの候補体モジュレーター化合物と、生物学的サンプルとを接触し、そしてＩＬ４Ｉ１又はＩＬ４Ｉ１をコードする遺伝子の生物学的調節を検出することを含む、ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の少なくとも１つのモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、ここで前記調節又は活性が前記生物学的状態のモジュレーターを同定し、前記方法が好ましくは、さらに、生物学的サンプル中のＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化を検出することを含み、ここで前記少なくとも１つのモジュレーターの非存在下と比較して前記少なくとも１つのモジュレーターの存在下での前記ＩＬ４Ｉ１の生物学的状態の変化が、モジュレーターを同定することを特徴とする方法。
  8. 前記検出された生物学的状態が、突然変異、核酸メチル化、コピー数、発現、タンパク質の量、タンパク質修飾、細胞局在、代謝物、特に、例えばトリプトファン分解産物などのＩＬ４Ｉ１によって産生される代謝物、及びＩＬ４Ｉ１の生物活性から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記モジュレーターが、ＩＬ４Ｉ１の前記生物学的状態の阻害剤又は誘導剤から選択される、請求項７又は８に記載の方法。
  10. ＡＨＲの調節を検出することをさらに含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記化合物が、タンパク性ドメイン、小分子、ペプチド、抗体、例えばＩＬ４Ｉ１に結合するモノクローナル抗体、環境物質、プロバイオティック、毒素、エアロゾル、薬、栄養素、生薬組成物、植物抽出物、揮発性化合物、ホメオパシー物質、香、医薬品 、ワクチン、生物、例えば動物、植物、真菌、細菌、古生物に由来する化合物又は化合物混合物、化合物、食品又は化粧品産業で使用される化合物、及び前記化合物のライブラリーから選択される、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. ある量の少なくとも１つの化合物と接触された生物学的サンプルに対して、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法を実施することを含む、前記少なくとも１つの化合物に応答してＡＨＲの生物学的状態の調節をモニターするための方法であって、前記生物学的サンプルが前記量の前記化合物と接触されなかった対照サンプルと比較され、ここで好ましくは、前記生物学的サンプルが、治療の過程を通して得られ、そして／又は本明細書に記載されるように、適切な対照サンプル又は対象又は患者のグループに由来するサンプルと比較されることを特徴とする方法。
  13. ＩＬ４Ｉ１調節のサブグループへの前記サンプルの監視なしのクラスターリング又は監視ありの分類のために、及び任意には、ＡＨＲ調節の異なるサブグループへの前記サンプルの監視なしのクラスターリング又は監視ありの分類のために、前記比較を用い、そして任意には、さらに、対象の特定グループ又は患者グループへの前記対象の分類を含む工程を、さらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法を、１つ又は別個の容器内で、任意には、補助剤及び／又は前記方法を実行するための指示と共に、実行するための材料を含む、診断キット。
  15. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法の請求項１４に記載の診断キットへの使用。
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