CN114126634A - 作为生物标志物的白介素-4诱导基因1（il4i1）及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新鉴定的AHR活化酶及其作为标志物在诊断和治疗中的用途，例如用于选择用IL4I1调节性干预进行治疗的患者以及用于监测治疗反应的用途。

Description

作为生物标志物的白介素-4诱导基因1(IL4I1)及其用途
本发明涉及一种新鉴定的AHR活化酶及其在诊断和治疗中作为标志物的用途，例如用于选择用IL4I1调节性干预进行治疗的患者以及用于监测治疗反应的用途。
背景技术
IL4I1是一种L-氨基酸氧化酶，其催化L-氨基酸氧化脱氨成α-酮酸，同时产生过氧化氢和氨(1)。IL4I1最初作为B细胞中的立即早期IL-4诱导基因被发现(2，3)，后来在巨噬细胞和树突状细胞中也鉴定到IL4I1(4)。此外，IL4I1在人类恶性肿瘤中表达，无论是在肿瘤细胞本身还是在肿瘤相关巨噬细胞中(5)。IL4I1抑制T细胞增殖(4，6)，这主要归因于它产生H2O2。此外，IL4I1与Th17细胞(7)和调节性T细胞(8)分化有关，这些细胞的分化已知受AHR活化调节(9-11)。
目前，对IL4I1相关病症的治疗意义知之甚少。这可以通过仅存在一项专利出版物WO 2016/040488来举例说明，所述专利出版物公开了在需要的对象中促进中枢神经系统(CNS)组织中的髓鞘形成的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的IL4I1蛋白。
芳烃受体(AHR)是一种配体活化的转录因子，参与多种过程例如胚胎发生、血管发生、代谢、免疫和癌症的调控。在临床前研究中，吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO1)和/或色氨酸-2,3-双加氧酶(TDO2)产生的色氨酸代谢物对AHR的活化，通过增强肿瘤细胞的运动性、失巢凋亡抵抗和克隆存活以及通过抑制抗肿瘤免疫应答来促进肿瘤进展(12)。AHR靶基因表达具有背景特异性(13)，并且需要引入AHR活化的新的生物标志物，它们能够在不同细胞/组织中并对多种多样的AHR配体做出响应以高效检测AHR活化。此外，IL4I1调节和AHR调节的功能含义共享许多共同途径并交叉作用，表明了将IL4I1当作AHR调节病症的潜在生物标志物的重要性，反之亦然。
第一方面，本发明涉及一种检测细胞或对象中AHR调节的方法，所述方法包括检测所述细胞或源自于所述对象的生物样品中IL4I1的生物学状态的变化，其中当与对照细胞或样品例如源自于健康对象、患者或患者组的样品相比时，所述细胞或样品中所述IL4I1的生物学状态的变化指示了所述细胞或对象中IL4I1相关的AHR的调节。
第二方面，本发明提供了一种筛选IL4I1的表达和/或生物学活性的至少一种潜在调节剂的体外方法，所述方法包括将包含IL4I1的样品或表达IL4I1的细胞与至少一种候选调节剂化合物接触并检测所述IL4I1的调节，其中所述调节鉴定了IL4I1的表达和/或生物学活性的潜在调节剂。
优选地，所述方法是一种筛选IL4I1的生物学状态的至少一种调节剂的方法，所述方法包括将至少一种候选调节剂化合物与生物样品接触并检测生物样品中所述IL4I1的生物学状态的变化，其中与不存在所述至少一种调节剂的情况下相比在存在所述至少一种调节剂的情况下所述IL4I1的生物学状态的变化鉴定了调节剂。
第三方面，本发明涉及一种监测对至少一种化合物做出响应的IL4I1的生物学状态的调节的方法，所述方法包括对与至少一种化合物接触的生物样品执行根据本发明所述的方法，并且其中将所述生物样品与未与所述化合物接触的对照样品进行比较。
在这种方法的子方面中，本发明涉及一种监测细胞中AHR的生物学状态的方法，所述方法包括向所述细胞提供至少一种化合物，并检测所述细胞中对所述至少一种化合物做出响应的IL4I1的生物学状态例如表达和/或生物学功能的变化，其中与不存在所述至少一种化合物的情况下相比在存在所述至少一种化合物的情况下所述生物学状态例如表达或生物学功能的变化，指示了所述至少一种化合物对细胞中AHR的所述生物学状态的影响。
因此，在本发明的另一个优选方面中，本发明涉及一种在细胞中，例如在需要治疗的患者的细胞中治疗和/或预防AHR相关的疾病或病症的方法，所述方法包括执行根据本发明所述的方法，并为所述患者提供适合的治疗，其中所述治疗至少部分是基于根据本发明所述的方法的结果，例如提供所鉴定的化合物或监测包含本文中描述的方法的治疗。
本发明的另一个重要方面涉及一种诊断试剂盒，其在一个或分开的容器中包含用于执行根据本发明所述的方法的材料，以及任选的辅助试剂和/或执行所述方法的说明书。因此，本发明的另一个重要方面涉及所述诊断试剂盒在根据本发明所述的方法中的用途。
最后，本发明涉及生物标志物IL4I1的用途，其用于根据本发明所述筛选调节剂或用于根据本发明所述的监测。
通常，优选的是生物标志物IL4I1的人类或密切相关的物种的变体，例如来自于其他灵长动物或哺乳动物的变体。
在阅读了下面的描述和非限制性实例后，可以容易地推演出其他方面和优点。
本发明人在调查色氨酸降解酶在调节AHR活性中的作用时，发现IL4I1这种在人类癌症中表达(图1)并且尚未与AHR活化关联的色氨酸降解酶，与AHR靶基因表达显著相关。基因表达分析(图2a)和AHR核转位(图2b)确定了IL4I1通过产生包括犬尿酸在内的色氨酸代谢物来活化AHR(图2g-i,图3-4)。
正如上文提到的，在本发明的背景中进行的实验中，将新的生物标志物IL4I1鉴定为AHR上游的新组分。这使得一种筛选IL4I1的生物学状态的至少一种调节剂的体外方法成为可能，所述方法包括将至少一种候选调节剂化合物与生物样品接触，并检测生物样品中所述IL4I1的生物学状态的变化，其中与不存在所述至少一种调节剂的情况下相比在存在所述至少一种调节剂的情况下所述IL4I1的生物学状态的变化鉴定了调节剂。调节剂可以是所述IL4I1的生物学状态的活化剂(诱导剂)或抑制剂。
在一种可选方案中，所述筛选IL4I1的表达和/或生物学活性的潜在调节剂的方法包括将包含IL4I1的样品或表达IL4I1的细胞与至少一种候选调节剂化合物接触，并检测所述调节剂与所述IL4I1的结合，其中所述结合鉴定了IL4I1的表达和/或生物学活性的潜在调节剂。这种方法优选地还包括检测所述细胞中IL4I1的表达和/或生物学活性或所述样品中IL4I1的生物学活性的步骤，其中与不存在所述至少一种化合物的情况下相比在存在所述至少一种化合物的情况下IL4I1的表达或生物学活性的变化鉴定了调节剂。
优选的是根据本发明所述的这种方法，其中所述调节剂选自所述表达或生物学活性的抑制剂或诱导剂。
因此，本发明的另一个重要方面涉及一种在细胞和/或对象中诊断AHR相关的疾病或病症的方法，所述方法包括检测源自于所述细胞和/或对象的生物样品中IL4I1的生物学状态的变化，其中与对照样品相比所述样品中所述IL4I1的生物学状态的变化，指示了所述细胞和/或对象中AHR相关的生理或病理状况。
一方面，所述方法包括检测细胞/组织/生物流体中IL4I1的表达或生物学功能，其中与健康或其他适合的对照样品相比所述区室中表达或生物学功能、特别是表达或活化的变化，指示了AHR相关的疾病或病症。这种变化可以是与适合的对照例如健康细胞或源自于健康的人或一组个体的样品中的值相比，或与内部标准例如看家基因相比，表达或生物学功能上调或下调至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。在本发明的情形中，术语“约”意味着给定值的+/-10％，除非另有指明。
在本发明的情形中，发现所述通过检测IL4I1的生物学状态的变化而检测到的细胞或对象中AHR的调节，指示了所述细胞或对象中AHR相关的生理或病理状况。优选地，所述待分层和/或诊断的AHR相关的生理或病理状况选自中毒、癌症、自身免疫障碍、退化、炎症、感染、代谢疾病和病症、血管生成、药物代谢、造血、脂类代谢、细胞运动、免疫调节和胁迫状况例如生物、机械和环境胁迫。
优选的是根据本发明所述的方法，其中检测的所述生物学状态选自突变、核酸甲基化、拷贝数、表达、蛋白质的量、蛋白质修饰、细胞定位、代谢物、特别是由IL4I1产生的代谢物例如色氨酸降解产物、包括犬尿酸在内的色氨酸代谢物和IL4I1的生物学活性。
在优选实施方式中，在根据本发明所述的方法中，所述IL4I1的生物学状态通过根据下文表1所述的至少一种代谢物生物标志物的丰度或生物学活性的变化间接地检测，其中与对照样品相比所述至少一种生物标志物的所述表达或生物学活性的变化指示了所述样品中IL4I1的生物学状态的变化。
在根据本发明所述的方法中，所述生物样品可以选自包含生物流体的适合样品、人类细胞、组织、全血、细胞系、细胞上清液、原代细胞、IPSC、杂交瘤、重组细胞、干细胞和癌细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、胶质细胞、上皮细胞、皮肤细胞、头皮细胞、肺细胞、粘膜细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、横纹肌细胞、平滑肌细胞、心脏细胞、分泌细胞、脂肪细胞、血细胞、红细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、T-细胞、B-细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、调节性T-细胞、树突状细胞、Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞来源的基质细胞、骨髓细胞、脾细胞、胸腺细胞、胰细胞、卵母细胞、精子、肾细胞、成纤维细胞、肠细胞、雌性或雄性生殖道细胞、前列腺细胞、膀胱细胞、眼细胞、角膜细胞、视网膜细胞、感觉细胞、角质细胞、肝细胞、脑细胞、肾细胞和结肠细胞以及所述细胞或组织的转化对应物。
优选的是根据本发明所述的方法，其中所述对象选自哺乳动物对象，特别是人类对象，特别是具有AHR相关的生理或病理状况的人类患者。所述对照样品可以选自如上所述的样品。
因此，本发明的另一方面涉及一种监测对至少一种化合物做出响应的IL4I1的生物学状态的调节的方法，所述方法包括对与一定量的所述至少一种化合物接触的生物样品执行根据本发明所述的方法，并且其中将所述生物样品与未与所述一定量的所述化合物接触的对照样品进行比较。
优选的是这种监测细胞中AHR相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述细胞提供至少一种化合物，并检测对所述至少一种化合物做出响应的所述细胞中IL4I1的表达或生物学功能的变化，其中与不存在所述至少一种化合物的情况下相比在存在所述至少一种化合物的情况下所述表达或生物学功能的变化，指示了所述至少一种化合物对所述IL4I1相关的疾病或病症的影响。
在本发明的情形中，所述AHR相关的疾病或病症可以选自中毒、癌症、自身免疫障碍、退化、炎症、感染、代谢疾病和病症、血管生成、药物代谢、造血、脂类代谢、细胞运动、衰老、免疫调节、胁迫状况例如生物、机械和环境胁迫和AHR调节中的至少一者。
在某些实施方式中，所述病症是癌症。在某些实施方式中，所述癌症选自肾上腺皮质癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸润性癌(BRCA)、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、结肠腺癌(COAD)、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、食管癌(ESCA)、多形性成胶质细胞瘤(GBM)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、肾嫌色细胞癌(KICH)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、脑低级别胶质瘤(LGG)、肝细胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、间皮瘤(MESO)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、胰腺腺癌(PAAD)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)、前列腺腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、肉瘤(SARC)、皮肤黑素瘤(SKCM)、胃腺癌(STAD)、睾丸生殖细胞肿瘤(TGCT)、甲状腺癌(THCA)、胸腺瘤(THYM),子宫体子宫内膜癌(UCEC)、子宫癌肉瘤(UCS)和葡萄膜黑素瘤(UVM)。
提供根据本发明所述的方法一方面是为了寻找调节剂并阐明其对所鉴定的生物标志物IL4I1的影响。此类待鉴定的化合物的实例可以选自小分子、肽和所述化合物的文库。所述鉴定(筛选)的化合物选自小化学分子、肽、抗体和短干扰RNA。优选地，所述化合物可以选自蛋白质结构域、小分子、肽、环境物质、益生物质、毒素、气溶胶、医药、营养物、草药组合物(galenic composition)、植物提取物、挥发性化合物、顺势疗法物质、熏香、药物、疫苗、源自于生物体例如动物、植物、真菌、细菌、古菌的化合物或化合物混合物、化学化合物、在食品或化妆品工业中使用的化合物以及所述化合物的文库。
本文中所公开的使用所述生物标志物的鉴定和筛选可以使用本领域中已知的相应方法来进行，优选地使用所述生物标志物的重组生产的蛋白质和/或重组细胞模型。为此，可以将所述生物标志物用例如化学染料或荧光标志物标记。此外，可以使用酶，其任选地采取与待筛选的生物标志物的融合体的形式的酶。优选地，所述方法还适合于自动化，并且所述筛选优选地以自动化和/或高通量的形式来评估。
因此，另一方面涉及IL4I1的至少一种生物标志物的用途，其用于根据本发明所述筛选调节剂，或用于根据本发明所述的监测，或用于根据本发明所述测试生物安全性，或用于根据本发明所述的诊断。
在本发明的另一个优选方面，本发明涉及一种在需要治疗的患者中治疗和/或预防细胞中的AHR相关的疾病或病症的方法，所述方法包括执行根据本发明所述的方法，并向所述患者提供适合的治疗，其中所述治疗至少部分是基于根据本发明所述的方法的结果，例如提供所鉴定的化合物或监测治疗。
在本发明的情形中，可以使用包含标志物蛋白IL4I1(或其功能相关部分)的任何生物样品，或包含含有标志物蛋白IL4I1(或其功能相关部分)的细胞、例如从癌症患者获得的细胞的样品，或包含在IL4I1的下游产生的例如表1中所示的至少一种代谢物的样品，只要所述样品含有(或推测含有)在分析和/或筛选中使用的至少一种生物标志物即可。优选地，所述生物样品选自包含含有生物标志物的生物流体的样品、细胞、包含生物流体的适合样品、人类细胞、组织、全血、细胞系、细胞上清液、原代细胞、IPSC、杂交瘤、重组细胞、干细胞和癌细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、胶质细胞、上皮细胞、皮肤细胞、头皮细胞、肺细胞、粘膜细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、横纹肌细胞、平滑肌细胞、心脏细胞、分泌细胞、脂肪细胞、血细胞、红细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、T-细胞、B-细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、调节性T-细胞、树突状细胞、Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞来源的基质细胞、骨髓细胞、脾细胞、胸腺细胞、胰细胞、卵母细胞、精子、肾细胞、成纤维细胞、肠细胞、雌性或雄性生殖道细胞、前列腺细胞、膀胱细胞、眼细胞、角膜细胞、视网膜细胞、感觉细胞、角质细胞、肝细胞、脑细胞、肾细胞和结肠细胞以及所述细胞或组织的转化对应物。所述样品也可以选自肿瘤组织(肿瘤或转移肿瘤)、活检组织、全血、外周血或其级分、血清、血沉棕黄层、淋巴液、尿液、骨髓、肝素化全血及其冷冻样品，例如冷冻的肝素化全血。取决于所需目的和情况，在根据本发明所述的方法中使用的细胞可以是重组或非重组的，并表达细胞外源蛋白。如有必要，可以排除全能人类胚胎干细胞。所述样品也可以是来自于一组对象例如患者组的组合样本。
因此，本发明的另一方面涉及一种生产药物制剂的方法，其中将所述鉴定到(筛选到)的化合物/调节剂进一步配制成药物制剂，这通过将所述鉴定到(筛选到)的(至少一种)化合物与可药用载体混合来实现。药物制剂优选地可以以注射剂、片剂、胶囊、糖浆、酏剂、软膏、霜剂、贴片、植入物、气溶胶、喷剂和栓剂(直肠、阴道和尿道)的形式存在。因此，本发明的另一方面涉及根据本发明制备的药物制剂。
因此，在本发明的另一方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，其在一个或分开的容器中包含用于执行本文中根据本发明所述的方法的材料，以及任选的辅助试剂和/或用于执行根据本发明所述的方法的说明书。
“治疗”意味着疾病症状的减轻和/或改善。有效的治疗实现了例如肿瘤团块和癌细胞数目的缩减。治疗也可以避免(预防)和减少癌症的扩散，例如影响癌转移和/或其形成。治疗可以是初始治疗(在疾病的任何其他治疗开始之前)或第一轮治疗之后的治疗(例如在手术后或复发后)。所述治疗也可以是涉及例如化疗、手术和/或放射治疗的联合治疗。
在本发明的方法中，总的来说，所述生物标志物可以使用任何适合的测定法来检测和/或确定。检测通常用于定性信息(“是否存在标志物”)，而确定涉及标志物的量(例如表达水平和/或活性)的分析。检测也用于鉴定例如引起各个标志物的功能改变的突变。测定法的选择取决于待确定的标志物和/或检测方法的参数。因此，所述确定和/或检测优选地可以包括选自消减杂交、微阵列分析、DNA测序、RNA测序、qPCR、ELISA、IP、PLA、BiFC、HPLC、WB、酶活性测试、荧光检测、细胞活力测定例如MTT测定、磷酸化受体酪氨酸激酶测定、磷酸化MAPK阵列和增殖分析例如BrdU分析、蛋白质组学、细胞因子阵列和质谱分析的方法。
优选地，所述方法也适合于自动化，并且优选地以自动化和/或高通量的形式评估所述活性和/或表达。通常，这涉及使用芯片和相应的机械例如机器人。
本公开的另一方面涉及用于确定生物样品的AHR活化状态的方法。在某些实施方式中，所述生物样品从对象获取。在某些实施方式中，确定/测量白介素4诱导1(IL4I1)的生物学状态。
在某些实施方式中，所述确定病症的AHR活化特征的方法包括：(a)从对象获得生物样品；(b)确定所述生物样品中IL4I1的生物学状态；(c)确定对照细胞中IL4I1的生物学状态；(d)将所述步骤(b)中的生物学状态与步骤(c)中的生物学状态进行比较；以及(e)在所述比较的基础上确定生物样品的AHR活化状态。
在某些实施方式中，所述在步骤(b)中检测的生物学状态是RNA表达。在某些实施方式中，所述检测生物学状态包括测量所述生物学状态的水平。在某些实施方式中，生物标志物的RNA表达通过本领域中已知的方法包括但不限于qPCR、RT-qPCR、RNA-Seq和原位杂交来检测。
在某些实施方式中，所述方法还包括用AHR信号传导调节剂(也被称为“AHR调节剂”)治疗所述对象。在某些实施方式中，所述AHR信号传导调节剂被每天、每隔一天、每周两次、每周一次、每月一次或每月两次给药。在某些实施方式中，所述AHR信号传导调节剂与作为联合疗法的一部分的其他药物一起给药。
当在本文中使用时，“AHR信号传导调节剂”或“AHR调节剂”是指影响细胞中的AHR信号传导的调节剂。在某些实施方式中，AHR信号传导调节剂对AHR信号传导表现出直接影响。在某些实施方式中，所述对AHR的直接影响通过与AHR的直接结合来介导。在某些实施方式中，直接调节剂对AHR表现出完全或部分激动和/或拮抗效应。在某些实施方式中，AHR调节剂是间接调节剂。
在某些实施方式中，AHR信号传导调节剂是小分子化合物。术语“小分子化合物”在本文中是指小的有机化学化合物，通常具有低于2000道尔顿、1500道尔顿、1000道尔顿、800道尔顿或600道尔顿的分子量。
在某些实施方式中，AHR调节剂包含2-苯基嘧啶-4-甲酰胺化合物、硫取代的3-酮基-2,3-二氢哒嗪-4-甲酰胺化合物、3-酮基-6-杂芳基-2-苯基-2,3-二氢哒嗪-4-甲酰胺化合物、2-杂芳基嘧啶-4-甲酰胺化合物、3-酮基-2,6-二苯基-2,3-二氢哒嗪-4-甲酰胺化合物、2-杂芳基-3-酮基-2,3-二氢-4-甲酰胺化合物、PDM 2、1,3-二氯-5-[(1E)-2-(4-甲氧基苯基)乙烯基]-苯、α-萘黄酮、6,2',4'-三甲氧基黄酮、CH223191、四氢吡啶并嘧啶衍生物、StemRegenin-1、CH223191、GNF351、CB7993113 HP163、PX-A590、PX-A548、PX-A275、PX-A758、PX-A446、PX-A24590、PX-A25548、PX-A25275、PX-A25758、PX-A26446、吲哚AHR抑制剂和含噁唑(OxC)化合物。
在某些实施方式中，直接AHR调节剂包括：
(a)药物：例如奥美拉唑，舒林酸，来氟米特，曲尼司特，拉喹莫德，氟他胺，尼莫地平，美西律，4-羟基-他莫昔芬，维罗非尼等，
(b)合成化合物：例如10-氯-7H-苯并咪唑并[2,1-a]苯并[de]异喹啉-7-酮(10-Cl-BBQ)，Pifithrin-α氢溴酸盐，
(c)天然化合物：例如犬尿氨酸，犬尿酸，朱砂精酸，ITE，FICZ，包括吲哚-3-甲醇、吲哚-3-丙酮酸、吲哚醛在内的吲哚类化合物，微生物代谢物，膳食成分，槲皮素，白藜芦醇，姜黄素，或
(d)有毒化合物：例如TCDD，香烟烟雾，3-甲基胆蒽，苯并(a)芘，2,3,7,8-四氯二苯并呋喃，燃料排放物，卤代和非卤代芳烃，杀虫剂。
在某些实施方式中，间接AHR调节剂通过调节AHR激动剂或拮抗剂的水平来影响AHR活化。
在某些实施方式中，AHR激动剂或拮抗剂水平的调节通过下述一者或多者来介导：
(a)调控修饰AHR配体的酶，例如通过例如细胞色素p450酶抑制剂包括3′甲氧基-4′硝基黄酮(MNF)、α-萘黄酮(a-NF)、荧蒽(FL)、菲(Phe)、芘(PY)等调控细胞色素p450酶。
(b)调控产生AHR配体的酶，包括色氨酸降解代谢酶的直接和间接抑制剂/活化剂/诱导剂，例如IDO1途径调节剂(indoximod、NLG802)、IDO1抑制剂(1-甲基-L-色氨酸、Epacadostat、PX-D26116、navoximod、PF-06840003、NLG-919A、BMS-986205、INCB024360A、KHK2455、LY3381916、MK-7162)、TDO2抑制剂(680C91、LM10、4-(4-氟吡唑-1-基)-1,2-噁唑-5-胺、稠合的咪唑并吲哚类、吲唑类)、双重IDO/TDO抑制剂(HTI-1090/SHR9146、DN1406131、RG70099、EPL-1410)，免疫疗法包括免疫检查点抑制、疫苗接种，以及细胞疗法、化学疗法、免疫刺激物、放射疗法、暴露于UV光和靶向疗法例如伊马替尼等。
在某些实施方式中，间接AHR调节剂通过调节AHR的表达影响AHR活化，包括例如HSP 90抑制剂如17-烯丙基氨基-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)、雷公藤红素。
在某些实施方式中，间接AHR调节剂通过影响调节AHR的效应的结合配偶体/辅因子包括例如雌激素受体α(ESR1)来影响AHR活化。
AHR调节剂的实例列于US9175266、US2019/225683、WO2019101647A1、WO2019101642A1、WO2019101643A1、WO2019101641A1、WO2018146010A1、AU2019280023A1、WO2020039093A1、WO2020021024A1、WO2019206800A1、WO2019185870A1、WO2019115586A1、EP3535259A1、WO2020043880A1和EP3464248A1中，所有这些文献整体通过参考并入本文。
在某些实施方式中，AHR信号传导调节剂的有效量为约0.01mg/kg至100mg/kg。在其他实施方式中，AHR信号传导调节剂的有效量为约0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、175mg/kg或200mg/kg的AHR信号传导调节剂。
本公开的另一方面涉及一种在需要治疗的患者的细胞中治疗和/或预防AHR相关疾病或病症的方法，所述方法包括执行根据本发明所述的方法，并向所述患者提供适合的治疗，其中所述治疗至少部分是基于根据本发明所述的方法的结果，例如提供所鉴定的化合物或监测包含本文中所描述的方法的治疗。
本公开的另一方面涉及一种诊断试剂盒，其在一个或分开的容器中包含用于执行根据本发明所述的方法的材料，以及任选的辅助试剂和/或执行所述方法的说明书。
本公开的另一方面涉及筛选或鉴定调节AHR活性的化合物。本公开的另一方面涉及确定化合物对细胞的AHR活化状态的影响的方法。
在某些实施方式中，将细胞用候选化合物处理，并确定/测量所述细胞中IL4I1的生物学状态。在某些实施方式中，将所述生物样品中IL4I1的生物学状态与对照样品中IL4I1的生物学状态进行比较。在某些实施方式中，所述生物学状态是IL4I1 RNA表达。
在某些实施方式中，当来自于用候选化合物处理的样品的IL4I1的生物学状态低于来自于对照样品的IL4I1的生物学状态时，将所述候选化合物分类为AHR信号传导的抑制剂，而当来自于用候选化合物处理的样品的IL4I1的生物学状态高于来自于对照样品的IL4I1的生物学状态时，将所述候选化合物分类为AHR信号传导的活化剂。
在某些实施方式中，当候选化合物引起所述IL4I1的生物学状态的至少1.5的绝对上调倍数时，它被表征为AHR活化剂。在某些实施方式中，当候选化合物引起所述IL4I1的生物学状态的至少2的绝对上调倍数、至少2.5的绝对上调倍数、至少3的绝对上调倍数、至少3.5的绝对上调倍数、至少4的绝对上调倍数、至少4.5的绝对上调倍数或至少5的绝对上调倍数时，它被表征为AHR活化剂。
在某些实施方式中，当候选化合物引起所述生物学状态的至少0.67的绝对下调倍数时，它被表征为AHR抑制剂。在某些实施方式中，当候选化合物引起所述生物学状态的至少1的绝对下调倍数、至少2的绝对下调倍数、至少2.5的绝对下调倍数、至少3的绝对下调倍数、至少3.5的绝对下调倍数、至少4的绝对下调倍数、至少4.5的绝对下调倍数或至少5的绝对下调倍数时，它被表征为AHR抑制剂。
短语“变化倍数”是指在两种不同条件下特定生物标志物的值之间的比率。在某些实施方式中，所述两种条件之一可以是对照。短语“绝对变化倍数”(其包括“绝对上调倍数”和“绝对下调倍数”)在本文中用于比较两种条件之间特定生物标志物的对数转换值的情况。绝对变化倍数通过将所述对数的指数自乘到变化倍数值，然后报告所述数字的模数来计算。
本公开的各个不同方面可以体现为程序、软件或计算机指令，它们体现或储存在计算机或机器可用或可读介质或一组介质中，当在计算机、处理器和/或机器上运行时导致所述计算机或机器执行所述方法的步骤。还提供了可以被机器读取的程序存储设备例如计算机可读介质，其具体体现了可以被所述机器运行的指令程序，以执行本公开中描述的各种不同功能和方法。
在某些实施方式中，本公开包括一种系统，其包含CPU、显示器、网络接口、用户界面、存储器、程序存储器和工作存储器(图6)，其中所述系统被编程，以运行针对本公开的方法或过程的程序、软件或计算机指令。示例性实施方式示出在图7中。
术语“处理器”可以包括单核处理器、多核处理器、位于单个设备中的多个处理器或彼此有线或无线通信并分布在设备网络、互联网或云上的多个处理器。因此，当在本文中使用时，由“处理器”执行或被配置为由“处理器”执行的功能、特征或指令，可以包括由单核处理器执行所述功能、特征或指令，可以包括由多核处理器的多个核心共同或协同执行所述功能、特征或指令，或者可以包括由多个处理器共同或协同执行所述功能、特征或指令，其中不需要每个处理器或核心单独地执行每一个功能、特征或指令。所述处理器可以是CPU(中央处理器)。所述处理器可以包含其他类型的处理器，例如GPU(图形处理器)。在本公开的其他方面，代替执行程序存储器中编程的指令的CPU或除了所述CPU之外，所述处理器可以是ASIC(专用集成电路)、模拟电路或其他功能逻辑例如FPGA(现场可编程门阵列)、PAL(相交替线)或PLA(可编程逻辑阵列)。
所述CPU被配置为运行存储在程序存储器中的程序(在本文中也被描述为模块或指令)以执行本文中描述的功能。所述存储器可以是但不限于RAM(随机访问存储器)、ROM(只读存储器)和永久存储。所述存储器是能够临时和/或永久地存储信息例如但不限于数据、程序、指令、程序代码和/或其他适合的信息的任何硬件。
在某些实施方式中，本公开涉及一种处理器，其被编程以执行下述步骤：
(a)将来自于样品的白介素4诱导基因1(IL4I1)的生物学状态与来自于对照样品的IL4I1的生物学状态进行比较；并且
(e)在所述比较步骤的基础上确定生物样品的AHR活化状态。
在某些实施方式中，本公开涉及一种计算机可读存储设备，其包含用于执行下述步骤的指令：
(a)将来自于样品的白介素4诱导基因1(IL4I1)的生物学状态与来自于对照样品的IL4I1的生物学状态进行比较；并且
(e)在所述比较步骤的基础上确定生物样品的AHR活化状态。
因此，本发明涉及下述条目。
条目1.一种检测细胞或对象中AHR的调节的方法，所述方法包括检测源自于所述细胞或对象的生物样品中IL4I1的生物学状态的变化，其中当与对照样品相比时所述样品中所述IL4I1的生物学状态的变化指示所述细胞或对象中IL4I1相关的AHR的调节。
条目2.根据条目1所述的方法，其中所述调节选自AHR的活化或阻遏。
条目3.根据条目1或2所述的方法，其中所述调节指示了所述细胞或对象中AHR相关的生理或病理状况。
条目4.根据条目3所述的方法，其中所述生理或病理状况选自中毒、癌症、自身免疫障碍、退化、炎症、感染、代谢疾病和病症、血管生成、药物代谢、造血、脂类代谢、细胞运动、免疫调节、胁迫状况例如生物、机械和环境胁迫。
条目5.根据条目1至4中的任一项所述的方法，其中检测的所述生物学状态选自突变、核酸甲基化、拷贝数、表达、蛋白质的量、蛋白质修饰、细胞定位、代谢物、特别是由IL4I1产生的代谢物例如色氨酸降解产物、和IL4I1的生物学活性。
条目6.根据条目1至5中的任一项所述的方法，其中所述生物样品选自包含生物流体的适合样品、哺乳动物例如人类、细胞、组织、全血、细胞系、细胞上清液、原代细胞、IPSC、杂交瘤、重组细胞、干细胞和癌细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、胶质细胞、上皮细胞、皮肤细胞、头皮细胞、肺细胞、粘膜细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、横纹肌细胞、平滑肌细胞、心脏细胞、分泌细胞、脂肪细胞、血细胞、红细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、T-细胞、B-细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、调节性T-细胞、树突状细胞、Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞来源的基质细胞、骨髓细胞、脾细胞、胸腺细胞、胰细胞、卵母细胞、精子、肾细胞、成纤维细胞、肠细胞、雌性或雄性生殖道细胞、前列腺细胞、膀胱细胞、眼细胞、角膜细胞、视网膜细胞、感觉细胞、角质细胞、肝细胞、脑细胞、肾细胞和结肠细胞以及所述细胞或组织的转化对应物。
条目7.根据条目1至6中的任一项所述的方法，其中所述对象选自哺乳动物对象例如人类对象，例如具有AHR相关的生理或病理状况的人类患者。
条目8.根据条目1至7中的任一项所述的方法，其中所述对照样品选自例如来自于健康的对象或一组对象的样品。
条目9.一种筛选IL4I1的生物学状态的至少一种调节剂的方法，所述方法包括将至少一种候选调节剂化合物与生物样品接触，并检测IL4I1或编码IL4I1的基因的生物学状态的调节，其中所述调节或活性鉴定了所述生物学状态的调节剂。
条目10.根据条目9所述的方法，其中所述方法还包括检测生物样品中IL4I1的生物学状态的变化，其中与不存在所述至少一种调节剂的情况下相比在存在所述至少一种调节剂的情况下所述IL4I1的生物学状态的变化鉴定了调节剂。
条目11.根据条目9或10所述的方法，其中检测的所述生物学状态选自突变、核酸甲基化、拷贝数、表达、蛋白质的量、蛋白质修饰、细胞定位、代谢物、特别是由IL4I1所调节的代谢物例如色氨酸降解产物、和IL4I1的生物学活性。
条目12.根据条目9至11中的任一项所述的方法，其中所述调节剂选自所述IL4I1的生物学状态的抑制剂或诱导剂。
条目13.根据条目9至12中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括检测AHR的调节。
条目14.根据条目9至13中的任一项所述的方法，其中所述化合物选自蛋白质结构域、小分子、肽、抗体例如结合IL4I1的单克隆抗体、环境物质、益生物质、毒素、气溶胶、医药、营养物、草药组合物、植物提取物、挥发性化合物、顺势疗法物质、熏香、药物、疫苗、源自于生物体例如动物、植物、真菌、细菌、古菌的化合物或化合物混合物、化学化合物、在食品或化妆品工业中使用的化合物以及所述化合物的文库。
条目15.一种监测对至少一种化合物做出响应的AHR的生物学状态的调节的方法，所述方法包括对与一定量的所述至少一种化合物接触的生物样品执行根据条目1至8中的任一项所述的方法，并且其中将所述生物样品与未与所述一定量的所述化合物接触的对照样品进行比较。
条目16.根据条目15所述的方法，其中所述生物样品在治疗过程中获得，和/或与本文中所描述的适合的对照样品或源自于一组对象或患者的样品进行比较。
条目17.根据条目1至16中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括下述步骤：利用所述比较而将所述样品无监督聚类或监督分类成IL4I1调节的亚组，并任选地还将所述样品无监督聚类或监督分类成AHR调节的不同亚组。
条目18.根据条目1至16中的任一项所述的方法，其还包括将所述对象分层为特定的对象组或患者组。
条目19.根据条目1至18中的任一项所述的方法，其中所述方法包括使用高通量方法。
条目20.一种诊断试剂盒，其包含在一个或分开的容器中的用于执行根据条目1至19中的任一项所述的方法的材料，以及任选的辅助试剂和/或用于执行所述方法的说明书。
条目21.根据条目20所述的诊断试剂盒的用途，其用于根据条目1至19中的任一项所述的方法。
条目22.一种例如在需要治疗的患者中治疗和/或预防细胞中的AHR相关疾病或病症的方法，所述方法包括执行条目1至19中的任一项所述的方法，并向所述患者提供适合的治疗，其中所述治疗至少部分是基于所述方法的结果。
表1–受IL4I1调节的氨基酸和代谢物
Figure BDA0003295272450000201
Figure BDA0003295272450000211
现在，在下面的实施例中参考附图进一步描述本发明，但本发明不限于此。出于本发明的目的，本文中引用的所有参考文献整体通过参考并入本文。
图1显示了IL4I1在各种不同的肿瘤实体中表达。a，在包含30种未患病组织的基因型-组织表达数据集(GTEX)中IDO1、IDO2、TDO2和IL4I1表达的log2转录本/百万(log2 TPM)中位数的热图表示。空格表示未检测到表达。点的大小和阴影颜色对应于表达水平，浅灰色表示低表达，深灰色表示高表达水平。b.在32种TCGA肿瘤中IDO1、IDO2、TDO2和IL4I1表达的log2转录本/百万(log2 TPM)中位数的热图表示。
图2显示了IL4I1活化AHR。a，在培养120h的表达IL4I1的shCtrl和shAHR U-87MG细胞相对于没有IL4I1表达的shCtrl U-87MG细胞(虚线)中所选AHR靶基因的mRNA表达(对于EGR1、IL1B、MMP1来说n＝3；对于所有其他基因来说n＝4)。b，在用培养120h的对照和表达IL4I1的U-251MG细胞的上清液处理4h后的LN-229细胞中，AHR蛋白表达的细胞核与细胞质比率的免疫印迹(左)和定量(右)(n＝3)。c，培养72h的用靶向IL4I1的siRNA处理的CAS-1细胞相对于用siCtrl处理的细胞中的TIPARP mRNA表达(n＝4)。d，培养120h的对照和表达IL4I1的U-87MG细胞的上清液中Phe、Tyr和Trp的浓度(n＝3)。e，在Phe、Tyr或Trp存在下表达IL4I1的U-87MG细胞的裂解液中的IL4I1活性(n＝3)。f，IL4I1对于Phe和Trp的Km值(n＝5)。g，火山图，示出了与介质相比暴露于40μM PP(左)、HPP(中)或I3P(右)24小时的U-87MG细胞的微阵列数据中AHR靶基因的差异调控(n＝5)。深灰色数据点代表选定的受调控的AHR靶基因。浅灰色数据点代表所有其他基因。竖直虚线表示+/-0.58的log2FC，水平虚线表示0.01的p-值截止值。h，用PP、HPP、I3P或介质(虚线)处理24h的U-87MG中的TIPARP mRNA表达(n＝3)。i，用25μM PP、HPP、I3P或介质处理4h的表达GFP-Ahr的tao BpRc1c细胞的代表性图像。n值代表独立的实验。数据被呈现为平均值±S.E.M，并通过双尾配对student’s t-检验(c、d、e)、双尾未配对student’s t-检验(f、h)、单向ANOVA和Tukey’s多重比较检验(g)或重复测量ANOVA和Dunnett’s多重比较检验(j)来分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。n.s.，不显著。*shCtrl相比于IL4I1-shCtrl；#IL4I1-shCtrl相比于IL4I1-shAHR。
图3显示了IL4I1降解芳香族氨基酸并产生AHR配体。a，U87-ctrl和U87-IL4I1细胞(120h)的上清液中的苯基丙酮酸(PP)、苯基乙酸(PAA)、羟基苯基丙酮酸(HPP)、羟基苯甲醛(HBA)和羟基苯基乙酸(HPAA)。b，U251-ctrl和U251-IL4I1细胞(120h)的上清液中的HBA、HPAA、HPP、PAA和PP。c，U87-ctrl和U87-IL4I1细胞(120h)的上清液中的犬尿氨酸(Kyn)、犬尿酸(KynA)、吲哚-3-丙酮酸(I3P)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚-3-甲醛(I3CA)和吲哚-3-乳酸(ILA)。d，U251-ctrl和U251-IL4I1细胞(120h)的上清液中的KynA、Kyn、I3P、IAA、I3CA和ILA。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。单样品t检验。
图4示出了IL4I1衍生的Trp代谢物及其对AHR活性的影响。
a，用I3P或介质处理24h的U-87MG细胞的上清液中Kyn、KynA、IAA和I3CA的相对丰度(n＝4)。b，代表性色谱图，示出了通过HPLC测量的KynA与KynA标准品(黑色，最高峰，上柱20pmol)的叠加。黑色，最低峰：3.33mg/mL I3P在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中温育24h。灰色峰：3.33mg/mL I3P在1mM H2O2存在下在PBS中温育24h(n＝2)。c-e，用IAA(c)、ILA(d)、I3CA(e)或介质处理24h的U-87MG细胞中的TIPARP mRNA表达(n＝3)。f，用50μM KynA或介质处理24h的shCtrl和shAHR U-87MG细胞中的TIPARP mRNA表达(n＝3)。g，用介质或50μM KynA处理1h的表达GFP-Ahr的tao BpRc1c细胞的代表性图像。n值代表独立的实验。数据被呈现为平均值±S.E.M，并且通过双尾配对student’s t-检验(a、b、h)或重复测量ANOVA和Dunnett’s多重比较检验(c、e-g)来分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。n.s.，不显著。
图5显示了IL4I1表达受到AHR调控。
用靶向AHR的siRNA处理的CAS-1细胞相对于用siCtrl处理的细胞中的IL4I1 mRNA表达。
图6示出了根据本公开的某些方面所述的系统的方框图。CPU：中央处理器(“处理器”)。
图7示出了示例性实施方式的流程图。
SEQ ID No：1至26示出了在本发明中使用的寡核苷酸的序列。
实施例
材料和方法
微阵列和RNA-seq数据分析
阵列数据集–Affymetrix微阵列芯片“人类基因2.0ST”使用oligo软件包进行分析，并使用NetAffx注释(14)。对原始CEL文件进行RMA归一化和总结。差异基因表达使用用于微阵列的limma流水线来进行(15)。
RNA-seq数据集–癌症基因组图谱(TCGA)肿瘤数据集的协调过的FPKM数据使用TCGAbiolinks(16)从GDC(https://gdc.cancer.gov)下载，并且只保留标识符为“原发性实体肿瘤”的患者。将FPKM值转变成转录本/百万(TPM)(17)，并从基因型-组织表达数据集(GTEX-https://gtexportal.org/home/)下载正常组织的TPM数据。对所有TPM值进行log2变换。
细胞培养
HEK293T、LN-229、Tao BpRc1和U-87MG从ATCC获得。CAS-1和U-251MG分别来自于ICLC和ECACC。CAS-1、HEK293T、LN-229、U-87MG和U-251MG在增补有10％FBS(Gibco,10270106)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco,25030-024)、1mM丙酮酸钠(Gibco,11360-039)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Gibco,15140-122)的无酚红、高葡萄糖DMEM培养基(Gibco,31053028)(在后文中被称为完全DMEM)中培养。Tao BpRc1细胞如上所述进行培养，但使用完全无酚红DMEM和5μg/mL四环素(Sigma-Aldrich,T3383)。对于转位测定来说，使用含有10％Tet系统专用FBS(Clontech,631107)的培养基。细胞在37℃和5％CO2下培养。
转基因细胞系的产生
两侧带有Gateway相容性重组位点的人类IL4I1 cDNA克隆购自MyBiosource(MBS1270935)。将所述cDNA克隆重组到慢病毒相容性Gateway表达载体pLX301(来自于D.Root的礼物，Addgene质粒25895)中18。使用FuGENE HD(Promega,E2311)，按照制造商的方案用pMD2.G(来自于D.Trono的礼物，Addgene质粒12259)、psPAX2(来自于D.Trono的礼物，Addgene质粒12260)和慢病毒质粒转染HEK293T，来实现慢病毒的生产。在48h和72h收获病毒上清液，合并并通过孔径为0.45μm的滤膜过滤。通过在8μg/mL聚凝胺(Merck Millipore,TR-1003-G)存在下用相应的病毒上清液感染U-87MG和U-251MG细胞24小时，然后使用含有1μg/mL嘌呤霉素(AppliChem,A2856)的培养基选择，产生稳定过表达IL4I1(pLX301-IL4I1)和对照(pLX301)细胞系。IL4I1的稳定过表达通过qRT-PCR、western印迹和IL4I1酶活性得以确认。
U-87MG细胞中AHR的稳定敲减使用靶向AHR的shERWOOD UltramiR慢病毒shRNA(transOMIC Technologies，TLHSU1400-196-GVO-TRI)来实现。将神经胶质瘤细胞用含有shAHR或shControl(shC)序列的病毒上清液感染，以产生稳定细胞系。
shERWOOD UltramiR shRNA序列是：
shAHR(ULTRA-3234821)：5’-TGCTGTTGACAGTGAGCGCAGGAAGAATTGTTTTAGGATATAGTGAAGCCACAGATGTATATCCTAAAACAATTCTTCCTTTGCCTACTGCCTCGGA-3’(SEQ ID NO：1)；
shC(ULTRA-NT#4)：5’-TGCTGTTGACAGTGAGCG AAGGCAGAAGTATGCAAAGCATTAGTGAAGCCACAGATGTAATGCTTTGCATACTTCTGCCTGTGCCTACTGCCTCGG A-3’(SEQ ID NO：2)。
siRNA介导的IL4I1的基因敲减使用ON-TARGETplus人类SMARTpool siRNA试剂(Dharmacon,L-008109-00-0005)来进行。siRNA介导的AHR的基因敲减使用ON-TARGETplus人类SMARTpool siRNA试剂(Dharmacon,L-004990-00-0005)来进行。siRNA转染使用Lipofectamine RNAiMAX(Thermo Fisher Scientific,13778100)，按照制造商的方案来进行。使用ON-TARGETplus非靶向合并siRNA(Dharmacon,D-001810-10-05)作为对照。
将在四环素控制下表达带有GFP标签的Ahr的稳定转染的tao BpRc1c细胞用于可视化Ahr的核转位。将鼠类Ahr克隆到包括tet-off表达系统(pRevTRE,CLONTECH)的pEGFP-C1载体(CLONTECH,Palo Alto,CA)中。将Phoenix包装线用于缺乏内源性Ahr表达的鼠类肝细胞瘤tao BpRc1细胞中的反转录病毒转染。
细胞培养物处理条件
为了用已确立和假设的AHR配体处理贴壁细胞，在处理之前将4x105个细胞/孔接种在6孔板中并温育24h。将非贴壁细胞以5x105个细胞的量接种在24孔板中的1mL中并立即处理。为了验证产生的AHR特征，将细胞用已确立的AHR激动剂Kyn(50μM，SigmaAldrich，K8625)处理24h。为了调查直接和下游IL4I1代谢物活化AHR的潜力，将细胞用I3P(3.125μM至100μM，Sigma-Aldrich，I7017)、HPP(8μM至1000μM，Sigma-Aldrich，114286)、PP(8μM至1000μM，Alfa Aesar，L11934)、犬尿酸(50μM，Sigma-Aldrich，K3375)、吲哚-3-乳酸(25μM至100μM，Sigma-Aldrich，I5508)、3-吲哚乙酸(25μM至100μM，Sigma-Aldrich，I2886)、吲哚-3-甲醛(6.25μM至100μM，Sigma-Aldrich，129445)和U-87MG或U-251MG对照和表达IL4I1的细胞的上清液处理24h。当使用AHR拮抗剂SR1(1μM，Merck Millipore，182706)时，将细胞单独地或与AHR配体相组合处理24h。使用DMSO溶解所有化合物，使得DMSO在培养基中的终浓度不超过0.2％。
对于涉及U-87MG和U-251MG对照和表达IL4I1的细胞的基因和蛋白质表达实验来说，将4x105个细胞/孔接种在6孔板中的2mL中，并培养72或120h。对于代谢组学实验来说，将细胞以4x105个细胞/孔的密度接种在6孔板中的2mL完全DMEM中并温育24h。在需要更多细胞和上清液的情况下，将2.6x106个细胞/孔接种在10cm培养皿中的13.3mL完全DMEM中并温育24h。24h后，将细胞用PBS清洗一次，添加2或13.3mL新鲜的无FBS DMEM(取决于孔尺寸和使用的细胞密度)，并将细胞温育120h。样品制备改编自以前的研究19,20。简单来说，将上清液在液氮中速冻，并储存在-80℃下直至代谢物测量。将含有细胞的板用37℃预热的细胞培养级水快速清洗一次，用液氮淬灭并储存在-80℃下直至代谢物测量。
对于在CAS-1细胞中敲落IL4I1的实验来说，将4x105个细胞/孔接种在6孔板中并温育24h。将细胞用相应的对照或靶向siRNA转染。在转染后24h将完全DMEM用1.5mL无FBSDMEM代替，并将细胞温育72h。
RNA分离和实时PCR
使用RNeasy小提试剂盒(Qiagen,80204)从培养的细胞收获总RNA，然后使用HighCapacity cDNA反转录酶试剂盒(Applied Biosystems,4368813)进行cDNA合成。使用SYBRSelect主混合物(Thermo Scientific,4309155)，使用StepOne Plus实时PCR系统(AppliedBiosystems)进行cDNA样品的实时PCR。数据使用StepOne软件v 2.3来处理和分析。靶基因的相对定量使用2ΔΔCt方法，针对作为参比基因的RNA18S来进行。人类引物序列列于下面的表2中。
表2人类引物序列
Figure BDA0003295272450000271
Figure BDA0003295272450000281
Figure BDA0003295272450000291
蛋白质分离和Western印迹
对于AHR转位测定来说，通过免疫印迹比较LN-229神经胶质瘤细胞的细胞核和细胞质级分中的蛋白质含量。将LN-229细胞用U-251MG对照或表达IL4I1的细胞(120h)的上清液处理4h。将裂解液在液氮中速冻并融化三次，在每个冻融循环后进行10轮超声处理。为了从两种不同细胞级分分离蛋白质，使用NE-PERTM细胞核和细胞质提取试剂(Thermo FisherScientific Inc.)。提取按照制造商的说明书进行。核特异性核纤层蛋白A作为对照用于适合的分级，并使用多克隆兔抗核纤层蛋白A抗体(1:500，BioLegend)检测。AHR使用小鼠单克隆抗AHR第一抗体克隆RPT1(Abcam,Berlin,Germany)检测。
AHR核转位测定
为了在转基因tao BpRc1c细胞中诱导GFP-Ahr表达，在转位测定之前24h将细胞从四环素中取出。测定在黑色透明底96孔板(BD,#353219)中进行，在150μl/孔中使用7500个细胞/孔。将代谢物添加到50μL/孔的诱导培养基中。将细胞分别暴露于25μM PP、HPP和I3P4h。舍弃培养基，并将细胞用预加温的PBS中的3.7％甲醛固定(在RT下10min)。在将固定细胞用去污剂缓冲液(DB，0.01％吐温20在PBS中，Sigma Aldrich)清洗之后，用含0.1％Triton X-100的PBS(Sigma Aldrich)在RT下通透化15min。将细胞用DB清洗两次，并与0.4ng/ml Hoechst 33342(Sigma Aldrich)在RT下避光温育30min。在用DB和PBS清洗后，将细胞在PBS中在4℃储存，直至转位分析。在暴露3h后，通过活细胞成像监测KynA引起的转位，包含适合的阴性培养基对照。由不同代谢物的Ahr转位在BD Pathway Imager 855上监测。
代谢组学分析
通过对温育120h后细胞培养上清液中的氨基酸进行定量，评估了表达和不表达IL4I1的U-87MG和U-251MG细胞的苯丙氨酸、酪氨酸和Trp的消耗。为了检测苯丙氨酸和酪氨酸，使用荧光染料AccQ-TagTM(Waters)按照制造商的方案标记氨基酸。将衍生的产物在42℃下在Acquity BEH C18柱(Waters)上，使用与Acquity荧光检测器(FLR)(Waters)偶联的Acquity H-class UPLC系统(Waters)进行分离。如以前由Yang等，201521所述将样品在所述UPLC上分析。为了分析Trp消耗，将上清液与等体积的12％高氯酸混合，并在冰上温育10min。在分析之前，将样品在4℃下以16,400g离心10min，以沉淀蛋白质并除去剩余的细胞碎片。然后将代谢物在连接到Acquity H-class UPLC系统(Waters)的Acquity HSS T3柱(100mm x 2.1mm，1.7μm，Waters)上通过反相色谱进行分离。将柱加热至37℃，并用5倍柱体积的100％溶剂A(20mM乙酸钠，3mM乙酸锌，pH 6)以0.55mL/min的流速平衡。通过如下所述提高溶剂A中溶剂B(乙腈)的浓度实现Trp的清晰分离：4min 0％B，10min 5％B，13min 15％B，15min 25％B，并在3min内返回到0％B。Trp通过荧光检测(Acquity FLR检测器，Waters，激发：254nm，发射：401nm)。使用标准品进行定量(Sigma)。数据获取和处理使用Empower3软件套装(Waters)进行。
我们采用非靶向代谢组学方法来鉴定在培养120h的表达与不表达IL4I1的U-87MG和U-251MG细胞的上清液中丰度有差异的代谢物。为此，将50μl细胞培养上清液与200μl冰冷的乙腈通过涡旋振荡混合，然后在-20℃温育1h。将样品在4℃离心15min，并转移到TruView UPLC-MS小瓶(Waters)中。通过将等体积的所有样品混合来制备合并样品。样品使用偶联到Vion IMS QTof MS(Waters)的I-class UPLC系统来测量。代谢物使用CogentDiamond Hydride 2.0柱(150x2.1mm，2.2μm；MicroSolv USA)或HSS T3柱(100x2.1mm，1.8μm；Waters)来分离。将UNIFI 1.8.2(Waters)用于仪器控制和MS数据的采集。使用Progenesis QI(Waters)进行后续数据分析。ILA在204.0662Da处检测(负模式，预期单一同位素质量：205.0739Da；偏差-2ppm)并通过116.0495、128.0495、130.0652和204.0655Da处的预期片段离子鉴定。所选的丰度差异的Trp、苯丙氨酸和酪氨酸衍生的代谢物(IAA、I3CA、KynA、PP、HPP、HBA)和其他下游转化产物(Kyn、PAA、HPAA)，通过比较它们从可疑LC-MS测量产生的片段模式来鉴定，所述LC-MS测量使用偶联到三重四级杆MS(Agilent 6460)的HPLC(Agilent 1290)并使用外部标准来进行。
对于代谢物的靶向定量来说，使用MRM模式。对于所有测试化合物，通过按照重量将所需的量添加到1.5mL Eppendorf安全锁管中并将所述测试化合物溶解在1mL DMSO中，制备10mM储用溶液。对于每种化合物来说，储用溶液覆盖了从10mM至0.039mM的浓度范围。为了定量代谢物，将300μL的每种生物测定上清液添加到Eppendorf安全锁管中。通过将300μL细胞培养基和1μL测试化合物储用溶液添加到Eppendorf安全锁管中，制备相关的校准样品。随后，添加300μL乙腈以引发培养基组分的沉淀。将所有样品以8000rpm离心4min，并将150μL上清液转移到装备有200μL玻璃内插管的1.5mL玻璃小瓶中，用于HPLC分析。进样5μl样品进行分析。分别使用水和含有0.1％甲酸的乙腈作为洗脱液A和B，以0.5mL/min的流速进行5min的HPLC分离。分离使用50mm长的Poroshell 120EC-C18 2.7微米柱(Agilent)来实现。将Agilent Jetstream ESI源设置为气体，气体鞘温度为300℃，气体流速为10L/min，鞘气体流速为11L/min。在整个运行过程中，喷雾器压力被设置到55psi，毛细管电压设置到2000V。仪器控制和数据采集使用MassHunter软件套装(Agilent)。
IL4I1活性测定法
将稳定表达IL4I1的U-87MG和U-251MG细胞和对照转导的对应物在0.1％TritonX-100/PBS中裂解。将从转移性黑素瘤切除术获得的人类组织在1％Triton X-100/PBS中，通过与不锈钢珠一起在Mixer Mill MM 301中以40Hz频率振摇1分钟的两个循环进行裂解。IL4I1活性通过使用
Figure BDA0003295272450000321
(BMG LABTECH)读板器在黑色96孔板中每分钟读取
Figure BDA0003295272450000322
Red荧光(在530nm处激发并在590nm处发射)来测量H2O2产生共60分钟来确定。反应在PBS中制备，并含有50μM
Figure BDA0003295272450000323
Red(Cayman Chemicals，#Cay10010469)、0.1U/mLHRP(Merck Millipore，#516531)和作为IL4I1底物的如图例中所示的氨基酸。在不存在氨基酸的情况下评估不依赖于的IL4I1的H2O2产生，并将其从在存在底物的情况下获得的活性中减去。IL4I1介导的H2O2产生使用H2O2校准曲线(终浓度为0-10μM)来计算，并归一化到通过Bradford测定法定量的样品蛋白质含量。
软件和统计
基因(实时PCR)和蛋白质表达数据以及代谢物数据的图形和统计分析使用GraphPad Prism软件6.0和8.0版来进行。除非另有指明，否则数据代表至少3个独立实验的平均值±S.E.M。在数据被表示为变化倍数的情况下，将这些值进行Log10转换，并将得到的值用于统计分析。取决于数据，应用下述统计分析：双尾student’s t-检验(配对或未配对)，单向ANOVA和Tukey’s多重比较检验，以及重复测量ANOVA和Dunnett’s多重比较检验。显著差异被报告为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。n.s.表示无显著差异。
在比较正常(GTEX)和肿瘤组织中Trp降解酶的表达水平时，本发明人发现与正常组织相比，在癌组织中IL4I1表达增强，与其他与活化AHR有关的色氨酸降解酶IDO1和TDO2类似(图1a、b)。本发明人显示，AHR靶基因的qRT-PCR确认了由IL4I1介导的AHR活化(图2a)。在用表达IL4I1的细胞的上清液处理的成胶质细胞瘤细胞中检测到AHR的核/细胞质定位的提高，进一步确认了IL4I1介导的AHR活化(图2b)。相反，在组成性表达IL4I1的成胶质细胞瘤细胞中IL4I1的敲减降低了AHR靶基因TIPARP的表达(图2c)。合在一起，本发明人的结果揭示出IL4I1确实活化AHR。
接下来，本发明人着手研究IL4I1如何活化AHR。与以前的报道相一致，IL4I1表达降低苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的水平(图2d)，其中苯丙氨酸的分解代谢最为高效(图2e、f)。IL4I1将苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸分别转变成苯基丙酮酸(PP)、羟基苯基丙酮酸(HPP)和吲哚-3-丙酮酸(I3P)(1)。因此，本发明人将富含AHR的成胶质细胞瘤细胞暴露于这些代谢物，以研究它们是否活化AHR。尽管PP和HPP不引发AHR靶基因的相关调节，但基因表达分析揭示出对I3P做出响应的AHR活化特征基因的显著调控，这种调控是AHR依赖性的(图2g、h)。同样，观察到AHR的核转位仅对I3P做出响应(图2i)。总之，本发明人的结果表明IL4I1主要通过I3P的产生来活化AHR，这与来自于微生物区系衍生的I3P和由D-氨基酸氧化酶和天冬氨酸氨基转移酶产生的I3P的发现相一致(22-25)。
表达IL4I1的细胞显示出高水平的PP和HPP以及它们的下游代谢物苯基乙酸(PAA)、4-羟基苯甲醛(HBA)和羟基苯基乙酸(HPAA)(图3a、b)。令本发明人吃惊的是，本发明人不能检测到I3P(图3c、d)。然而，本发明人检测到源自于I3P的化合物包括吲哚乙酸(IAA)、吲哚-3-甲醛(I3CA)和吲哚-3-乳酸(ILA)的水平提高(图3c、d)，表明通过I3P的代谢流非常快。此外，在表达IL4I1的细胞的上清液中犬尿酸的水平升高(图3c、d)。用浓度逐渐提高的I3P处理成胶质细胞瘤细胞导致所述细胞上清液中IAA、I3CA和犬尿酸的剂量依赖性提高(图4a)。可以通过IL4I1提高犬尿酸水平的一个反应是犬尿氨酸(由IDO1和/或TDO2产生)的转氨作用，因为犬尿氨酸氨基转移酶可以使用I3P、PP或HPP作为氨基受体(26)。然而，在表达IL4I1的细胞中犬尿氨酸浓度没有降低，使这种假说不大可能(图3c、d)。犬尿酸从I3P自发形成，这在H2O2存在下被增强(图4b)，表明与I3P相伴地由IL4I1产生的H2O2促进I3P向犬尿酸的转变。事实上，以前描述了在大鼠组织中犬尿酸从通过色氨酸转氨作用产生的I3P产生(27)。尽管本发明人没有观察到对IAA或I3L做出响应的AHR靶基因TIPARP的相关诱导(图4c、d)，但I3CA(图4e)和犬尿酸(图4f)诱导TIPARP转录本。由犬尿酸介导的AHR活化通过AHR的核转位得以确认(图4g)。总而言之，本发明人的数据表明IL4I1通过包括犬尿酸和I3CA在内的I3P下游产物活化AHR，产生了AHR活化化合物的混合物。
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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<212> DNA
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tgctgttgac agtgagcgaa ggcagaagta tgcaaagcat tagtgaagcc acagatgtaa 60
tgctttgcat acttctgcct gtgcctactg cctcgg 96
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2

Claims (15)

1.一种检测细胞或对象中AHR的调节的方法，所述方法包括检测源自于所述细胞或对象的生物样品中IL4I1的生物学状态的变化，其中当与对照样品相比时所述样品中所述IL4I1的生物学状态的变化指示所述细胞或对象中IL4I1相关的AHR的调节，其中优选地所述调节选自AHR的活化或阻遏。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节指示所述细胞或对象中AHR相关的生理或病理状况，优选地其中所述生理或病理状况选自中毒、癌症、自身免疫障碍、退化、炎症、感染、代谢疾病和病症、血管生成、药物代谢、造血、脂类代谢、细胞运动、免疫调节、胁迫状况例如生物、机械和环境胁迫。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中检测的所述生物学状态选自突变、核酸甲基化、拷贝数、表达、蛋白质的量、蛋白质修饰、细胞定位、代谢物、特别是由IL4I1产生的代谢物例如色氨酸降解产物、和IL4I1的生物学活性。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中所述生物样品选自包含生物流体的适合样品、哺乳动物例如人类、细胞、组织、全血、细胞系、细胞上清液、原代细胞、IPSC、杂交瘤、重组细胞、干细胞和癌细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、胶质细胞、上皮细胞、皮肤细胞、头皮细胞、肺细胞、粘膜细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、横纹肌细胞、平滑肌细胞、心脏细胞、分泌细胞、脂肪细胞、血细胞、红细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、T-细胞、B-细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、调节性T-细胞、树突状细胞、Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞、髓系细胞、巨噬细胞、单核细胞来源的基质细胞、骨髓细胞、脾细胞、胸腺细胞、胰细胞、卵母细胞、精子、肾细胞、成纤维细胞、肠细胞、雌性或雄性生殖道细胞、前列腺细胞、膀胱细胞、眼细胞、角膜细胞、视网膜细胞、感觉细胞、角质细胞、肝细胞、脑细胞、肾细胞和结肠细胞以及所述细胞或组织的转化对应物。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中所述对象选自哺乳动物对象例如人类对象，例如具有AHR相关的生理或病理状况的人类患者。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中所述对照样品选自例如来自于健康的对象或一组对象的样品。
7.一种筛选IL4I1的生物学状态的至少一种调节剂的方法，所述方法包括将至少一种候选调节剂化合物与生物样品接触，并检测IL4I1或编码IL4I1的基因的生物学状态的调节，其中所述调节或活性鉴定了所述生物学状态的调节剂，其中所述方法优选地还包括检测生物样品中IL4I1的生物学状态的变化，其中与不存在所述至少一种调节剂的情况下相比在存在所述至少一种调节剂的情况下所述IL4I1的生物学状态的变化鉴定了调节剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中检测的所述生物学状态选自突变、核酸甲基化、拷贝数、表达、蛋白质的量、蛋白质修饰、细胞定位、代谢物、特别是由IL4I1所调节的代谢物例如色氨酸降解产物、和IL4I1的生物学活性。
9.根据权利要求7或8中的任一项所述的方法，其中所述调节剂选自所述IL4I1的生物学状态的抑制剂或诱导剂。
10.根据权利要求7至9中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括检测AHR的调节。
11.根据权利要求7至10中的任一项所述的方法，其中所述化合物选自蛋白质结构域、小分子、肽、抗体例如结合IL4I1的单克隆抗体、环境物质、益生物质、毒素、气溶胶、医药、营养物、草药组合物、植物提取物、挥发性化合物、顺势疗法物质、熏香、药物、疫苗、源自于生物体例如动物、植物、真菌、细菌、古菌的化合物或化合物混合物、化学化合物、在食品或化妆品工业中使用的化合物以及所述化合物的文库。
12.一种监测对至少一种化合物做出响应的AHR的生物学状态的调节的方法，所述方法包括对与一定量的所述至少一种化合物接触的生物样品执行根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，并且其中将所述生物样品与未与所述一定量的所述化合物接触的对照样品进行比较，其中优选地所述生物样品在治疗过程中获得，和/或与本文中所描述的适合的对照样品或源自于一组对象或患者的样品进行比较。
13.根据权利要求1至12中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括下述步骤：利用所述比较而将所述样品无监督聚类或监督分类成IL4I1调节的亚组，并任选地还将所述样品无监督聚类或监督分类成AHR调节的不同亚组，并且所述方法任选地还包括将所述对象分层为特定的对象组或患者组。
14.一种诊断试剂盒，其包含在一个或分开的容器中的用于执行根据权利要求1至13中的任一项所述的方法的材料，以及任选的辅助试剂和/或用于执行所述方法的说明书。
15.根据权利要求14所述的诊断试剂盒的用途，其用于根据权利要求1至13中的任一项所述的方法。
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