JP2022528323A - 周波数符号化画像に基づく細胞選別のシステムとその使用方法 - Google Patents

周波数符号化画像に基づく細胞選別のシステムとその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示の態様には、流体ストリーム内の細胞の画像に基づいて試料中の細胞を選別する方法が含まれる。ある特定の実施形態に基づく方法は、流体ストリーム内の細胞を含有する試料から光を検出することと、試料から細胞の画像マスクを生成することと、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別することとを含む。プロセッサに動作可能に結合され、命令が保存されているメモリを有するプロセッサを備えるシステムであって、プロセッサによって命令が実行されると、プロセッサに流体ストリーム内の試料中の細胞の画像マスクを生成させ、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別させるシステムもまた記載される。画像マスクを生成し、細胞の１つまたは複数の特徴を決定するためのプログラミングを備えた集積回路デバイス（例えば、フィールドプログラマブルゲートアレイなど）も提供される。

Description

選別フローサイトメータなどのフロー式粒子選別システムは、粒子の少なくとも１つの測定された特性に基づいて、流体試料中の粒子を選別するために使用される。フロー式粒子選別システムにおいて、流体懸濁液中の分子、分析物結合ビーズ、または個々の細胞などの粒子は、センサがストリーム内に含まれる選別対象の粒子を検出する検出領域を経て、ストリーム内を通過する。センサは、選別対象の粒子を検出すると、関心の粒子を選択的に単離する選別機構をトリガする。
粒子検知は、通常、１つ以上のレーザからの照射光に粒子がさらされ、また粒子の光散乱特性及び蛍光特性が測定される検出領域に流体ストリームを通過させることによって実行される。粒子またはその成分は、検出を容易にするために、蛍光色素で標識され得、スペクトル的に異なる蛍光色素を使用して、異なる粒子または成分を標識することによって、多数の異なる粒子または成分が同時に検出され得る。検出は、各異なる蛍光色素の蛍光の独立した測定を容易にするために、１つ以上の光センサを使用して実行される。
試料中の粒子を選別するために、液滴帯電機構が、流体ストリームのブレークオフポイントで、選別されるタイプの粒子を含む流体ストリームの液滴に電荷を帯電する。液滴は、静電場を通過させられ、液滴の極性及び電荷の大きさに基づいて、１つ以上の収集容器内に偏向される。帯電していない液滴は静電場によって偏向されない。
本開示の態様には、流体ストリーム内の細胞の画像に基づいて試料中の細胞を選別する方法が含まれる。ある特定の実施形態に基づく方法は、流体ストリーム内の細胞を含有する試料から光を検出することと、試料から細胞の画像マスクを生成することと、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別こととを含む。プロセッサに動作可能に結合され、自信に命令が保存されているメモリを備えたプロセッサを有するシステムであって、プロセッサによって実行されると、プロセッサに流体ストリーム内の試料中の細胞の画像マスクを生成し、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別させるシステムについても記載される。画像マスクを生成し、細胞の１つ以上の特徴を決定するためのプログラミングを有する集積回路デバイス（例えば、フィールドプログラマブルゲートアレイなど）も提供される。
流体ストリーム内の試料中の細胞は、流体ストリーム内の細胞の生成された画像（例えば、周波数符号化画像など）に基づいて選別される。流体ストリーム内の細胞は、試料からの光を検出することによって撮像される。いくつかの実施形態では、方法は、流体ストリーム内の試料から光吸収、光散乱、光放射（例えば、蛍光など）のうちの１つ以上を検出することを含む。いくつかの事例では、試料中の１つ以上の細胞の画像は、検出された光吸収（例えば、明視野画像データなど）から生成される。他の事例では、試料中の１つ以上の細胞の画像は、検出された光散乱（例えば、前方散乱画像データ、側方散乱画像データなど）から生成される。さらに他の事例では、試料中の１つ以上の細胞の画像は、検出された蛍光（例えば、蛍光マーカー画像データなど）から生成される。さらに他の事例では、試料中の１つ以上の細胞の画像は、検出された光吸収、検出された光散乱、及び検出された蛍光のうちの２つ以上の組み合わせから生成される。
実施形態では、方法は、流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成することを含む。いくつかの事例では、画像マスクを生成することは、流体ストリーム内の細胞のグレースケール画像を生成することを含む。これらの事例では、方法は、グレースケール画像から画素強度閾値を決定することを含む。画素強度閾値を決定するために、１つの方法は、グレースケール画像のクラス内分散を最小限にすることと、最小限にされたクラス内分散に基づいて画素強度閾値を計算することとを含む。いくつかの実施形態では、画像マスクを生成することは、グレースケール画像からの各画素の強度と決定された画素強度閾値とを比較することと、グレースケール画像の各画素を２値化された画素値に変換することとを含む。いくつかの事例では、画像マスクを生成することは、グレースケール画像の各画素強度値と決定された閾値とを水平列にわたって比較することを含む。一実施例では、方法は、流体ストリームから光吸収（例えば、明視野画像データなど）を検出することと、グレースケール画像の画素強度が閾値未満の場合は画素値１を、グレースケール画像の画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てることを含む。他の実施例では、方法は、流体ストリーム内の細胞から光散乱を検出することと、画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値１を、画素強度が閾値未満の場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てることを含む。さらに他の実施例では、流体ストリーム内の細胞から蛍光を検出することと、画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値１を、画素強度が閾値未満の場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てることを含む。これらの実施例では、方法は、割り当てられた画素値が１である第１画素及び第２画素をグレースケール画像の水平列にわたって決定することも含む。いくつかの事例では、第１画素は画素値が１である水平列中の最初の画素である。これらの事例では、第２画素は画素値が１である水平列中の最後の画素である。他の事例では、第１画素は画素値が０である水平列中の最初の画素であり、第２画素は画素値が０である水平列中の最後の画素である。いくつかの実施形態では、画像マスクは、２値の画素値が１である画素から生成される。他の実施形態では、画像マスクは、２値の画素値が０である画素から生成される。
特定の実施形態に基づく方法は、生成された画像マスクに基づいて、流体ストリーム内の細胞の１つ以上の性質を決定することを含む。例えば、方法は、画像マスクに基づいて、細胞のサイズ、細胞の質量中心、または細胞の偏心を決定すること含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の第２画像マスクを生成し、第１画像マスクと第２画像マスクとを比較して、例えば細胞の画像がダブレットを含むか否かを決定することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、画像マスクから画像モーメントを算出することを含む。例えば、画像モーメントは、以下に従って画像マスクから計算されてもよい。
Figure 2022528323000002
ここで、ｍは、画像マスクのｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、画像マスクのｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
いくつかの事例では、質量中心は、画像マスクの画像モーメントから計算されてもよい。例えば、質量中心は、画像マスクの画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000003
他の事例では、細胞の配向は、画像マスクの画像モーメントから計算されてもよい。例えば、細胞の配向は、画像マスクの画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000004
さらに他の事例では、細胞の偏心は、画像マスクの画像モーメントから計算されてもよい。例えば、細胞の偏心は、画像マスクの画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000005
ある特定の実施形態では、方法は、画像からの各画素値と画像マスクからの各画素値とを乗算して、細胞のマスクされた画像を生成することをさらに含む。いくつかの事例では、方法はマスクされた画像から画像モーメントを以下に従って計算することを含む。
Figure 2022528323000006
ここで、ｍは、マスクされた画像のｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、マスクされた画像のｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
他の事例では、質量中心は、マスクされた画像の画像モーメントから計算されてもよい。例えば、質量中心は、マスクされた画像の画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000007
さらに他の事例では、細胞の配向は、マスクされた画像の画像モーメントから計算されてもよい。例えば、細胞の配向は、マスクされた画像の画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000008
さらに他の事例では、細胞の偏心は、マスクされた画像の画像モーメントから計算されてもよい。例えば、細胞の偏心は、マスクされた画像の画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000009
いくつかの実施形態では、方法は各細胞について、画像、画像マスク及びマスクされた画像の２つ以上を比較することを含む。他の実施形態では、方法は、細胞の２つ以上の異なる画像マスク、細胞の２つ以上の異なる画像、または細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を生成し、且つ比較することを含む。これらの実施形態では、方法は、画像マスク、画像またはマスクされた画像における細胞の１つ以上の特徴について共局在係数（すなわち、共局在の度合い)を計算することをさらに含む。実施形態では、細胞の特徴は、細胞間の細胞小器官（例えば、細胞核、ミトコンドリア）または細胞間の高分子（例えば、タンパク質、核酸)であってよい。一実施例では、共局在係数は、細胞の２つ以上の異なる画像マスクを使って細胞の特徴について計算される。他の実施例では、共局在係数は、細胞の２つ以上の異なる画像を使って細胞の特徴について計算される。さらに他の実施例では、共局在係数は、細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を使って、細胞の特徴について計算される。さらに他の実施例では、共局在係数は、細胞の画像マスク、画像、及びマスクされた画像の２つ以上の組み合わせを使って細胞の特徴について計算される。
ある特定の実施形態では、細胞の特徴についての共局在係数は以下に従って計算される。
Figure 2022528323000010
ここで、ｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の画素である。ｙは第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の画素である。バーｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の平均画素値である。バーｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の平均画素値である。
他の実施形態では、細胞の特徴についての共局在係数は以下に従って計算される。
Figure 2022528323000011
その他の実施形態では、細胞の特徴についての共局在係数は以下に従って計算される。
Figure 2022528323000012
本開示の態様は、流体ストリーム内の試料中の細胞を選別するためのシステムも含む。特定の実施形態に基づくシステムは、流体ストリーム内の細胞を含有する試料を照射するように構成されている光源と、光検出器を有する光検出システムと、メモリが自身に保存された命令を含むようにメモリが動作可能に結合されたプロセッサと、その命令がプロセッサによって実行されると、システムはプロセッサに、流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成させ、及び生成された画像マスクに基づいて試料中の細胞を選別するように構成される細胞選別部品とを含む。実施形態では、光検出システムは、光吸収、光散乱、蛍光またはそれらの組み合わせを検出するための１つ以上の光検出器を含む。
実施形態では、システムは、メモリが自身に保存された命令を含むようにメモリが動作可能に結合されたプロセッサを含み、その命令がプロセッサによって実行されると、システムはプロセッサに、流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成させる。いくつかの実施形態では、メモリは、流体ストリーム内の細胞のグレースケール画像を生成するための命令を含む。これらの実施形態では、メモリは命令を含み、その命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサにグレースケール画像から画素強度閾値を決定させる。いくつかの事例では、メモリは、グレースケール画像からの各画素と決定された閾値とを比較する命令と、各画素を２値の画素値に変換するための命令とを含む。例えば、メモリは、グレースケール画像の各画素強度閾値と決定された閾値とを水平列にわたって比較するための命令を含んでもよい。
一実施例では、メモリは命令を含み、その命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサに流体ストリームから光吸収を検出させ、画素強度が閾値未満の場合は画素値１を、画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てさせる。他の実施例では、メモリは命令を含み、その命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサに流体ストリーム内の細胞から光散乱を検出させ、画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値１を、画素強度が閾値未満の場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てさせる。さらに他の実施例では、メモリは命令を含み、その命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサに流体ストリーム内の細胞から蛍光を検出させ、画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値１を、画素強度が閾値未満の場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てさせる。これらの実施例では、メモリは命令を含み、その命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサに割り当てられた画素値が１である第１画素及び第２画素をグレースケール画像の水平列にわたって決定させることも含む。いくつかの事例では、第１画素は画素値が１である水平列中の最初の画素である。これらの事例では、第２画素は画素値が１である水平列中の最後の画素である。他の事例では、第１画素は画素値が０である水平列中の最初の画素であり、第２画素は画素値が０である水平列中の最後の画素である。いくつかの実施形態では、画像マスクは、２値の画素値が１である画素から生成される。他の実施形態では、画像マスクは、２値の画素値が０である画素から生成される。
対象のシステムもまた命令を有するメモリを含み、その命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサにイメージマスクに基づいて流体ストリーム内の細胞の１つまたはそれ以上の性質を決定させる。これらの実施形態では、メモリは、画像マスクに基づいて、細胞のサイズ、細胞の質量中心、または細胞の偏心を決定するための命令を含んでもよい。ある特定の事例では、メモリは、細胞の第２画像マスクを生成する命令と、第１画像マスクと第２画像マスクとを比較するための命令とを含む。ある特定の事例では、メモリは、第１画像マスク及び第２画像マスクに基づいてダブレット（すなわち、細胞集合）の存在を判定するための命令を含む。
いくつかの実施形態では、システムは、メモリが自身に記憶された命令を含むように、プロセッサに動作可能に結合されたメモリを備えたプロセッサを含み、命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサに、画像マスクから画像モーメントを計算させる。ある特定の事例では、画像モーメントは、画像マスクから以下に従って計算される。
Figure 2022528323000013
ここで、ｍは、画像マスクのｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、画像マスクのｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
いくつかの実施形態では、メモリは画像マスクの画像モーメントから質量中心を計算するための命令を含む。例えば、メモリは、画像マスクの画像モーメントから、細胞の質量中心を以下に従って計算するための命令を含んでもよい。
Figure 2022528323000014
他の実施形態では、メモリは、画像マスクの画像モーメントから細胞の配向を計算するための命令を含む。例えば、メモリは、画像マスクの画像モーメントから細胞の配向を以下に従って計算するための命令を含んでもよい。
Figure 2022528323000015
さらに他の実施形態では、メモリは、画像マスクの画像モーメントから細胞の偏心を計算するための命令を含む。例えば、メモリは、画像マスクの画像モーメントから細胞の偏心を以下に従って計算するための命令を含んでもよい。
Figure 2022528323000016
ある特定の実施形態では、システムは、メモリが自身に記憶された命令を含むように、プロセッサに動作可能に結合されたメモリを備えるプロセッサを含み、命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサに、画像からの各画素値と画像マスクからの各画素値とを乗算して、細胞のマスクされた画像を生成させる。いくつかの事例では、メモリは、マスクされた画像から画像モーメントを以下に従って計算するための命令をさらに含む。
Figure 2022528323000017
ここで、ｍは、マスクされた画像のｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、マスクされた画像のｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
いくつかの実施形態では、メモリは、マスクされた画像の画像モーメントから質量中心を計算するための命令を含む。例えば、メモリは、マスクされた画像の画像モーメントから、細胞の質量中心を以下に従って計算するための命令を含んでもよい。
Figure 2022528323000018
他の実施形態では、メモリは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の配向を計算するための命令を含む。例えば、メモリは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の配向を以下に従って計算するための命令を含んでもよい。
Figure 2022528323000019
さらに他の実施形態では、メモリは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の偏心を計算するための命令を含む。例えば、メモリは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の偏心を以下に従って計算するための命令を含んでもよい。
Figure 2022528323000020
対象のシステムは、細胞ごとに画像マスク、画像、またはマスクされた画像の２つ以上を生成するように構成されてもよい。いくつかの事例では、システムは、細胞の２つ以上の異なる画像マスク、細胞の２つ以上の異なる画像、または細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を生成するように構成される。
いくつかの実施形態では、メモリは、画像マスク、画像またはマスクされた画像における細胞の１つ以上の特徴について共局在係数（すなわち、共局在の度合い）を計算するための命令をさらに含んでもよい。一実施例では、メモリは、細胞の２つ以上の異なる画像マスクを使って細胞の特徴について共局在係数を計算するための命令を含む。他の実施例では、メモリは、細胞の２つ以上の異なる画像を使って細胞の特徴について共局在係数を計算するための命令を含む。さらに他の実施例では、メモリは、細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を使って、細胞の特徴について共局在係数を計算するための命令を含む。さらに他の実施例では、メモリは、細胞の画像マスク、画像、マスクされた画像の２つ以上の組み合わせを使って、細胞の特徴について共局在係数を計算するための命令を含む。
いくつかの事例では、メモリは命令を含み、その命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサに細胞の特徴について共局在係数を以下に従って計算させる。
Figure 2022528323000021
ここで、ｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の画素である。ｙは第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の画素である。バーｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の平均画素値である。バーｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の平均画素値である。
他の事例では、メモリは、細胞の特徴について共局在係数を以下に従って計算するための命令を含む。
Figure 2022528323000022
その他の事例では、メモリは、細胞の特徴について共局在係数を以下に従って計算するための命令を含む。
Figure 2022528323000023
本開示の態様は、光検出器を備えた光検出システムによって検出された流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成し、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別するようにプログラムされている集積回路デバイスも含む。対象の集積回路デバイスは、ある特定の事例では、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または複合プログラマブル論理デバイス（ＣＰＬＤ）を含んでもよい。
ある特定の実施形態に従う集積回路デバイスは、流体ストリーム内の細胞のグレースケール画像を生成するようにプログラムされている。いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、グレースケール画像から画素強度閾値を決定するようにプログラムされている。ある特定の事例では、集積回路デバイスは、グレースケール画像の各画素と決定された閾値とを比較し、各画素を２値の画素値に変換するようにプログラムされている。いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、画素強度が閾値未満の場合は画素値１を、画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てるようにプログラムされている。他の実施形態では、集積回路は、画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値１を、画素強度が閾値未満の場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てるようにプログラムされている。ある特定の事例では、集積回路は、割り当てられた画素値が１である第１画素及び第２画素をグレースケール画像の水平列にわたって決定するようにプログラムされている。
いくつかの事例では、集積回路デバイスは、割り当てられた画素値が１である第１画素及び第２画素をグレースケール画像の水平列にわたって決定するようにプログラムされている。いくつかの事例では、第１画素は画素値が１を有する水平列中の最初の画素である。これらの事例では、第２画素は画素値が１を有する水平列中の最後の画素である。他の事例では、集積回路デバイスは、割り当てられた画素値が０である第１画素及び第２画素をグレースケール画像の水平列にわたって決定するようにプログラムされている。これらの事例では、第１画素は画素値が０である水平列中の最初の画素であり、第２画素は画素値が０である水平列中の最後の画素である。いくつかの実施形態では、画像マスクは、２値の画素値が１である画素から集積回路デバイスによって生成される。他の実施形態では、画像マスクは、２値の画素値が０である画素から集積回路デバイスによって生成される。
いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、画像マスクに基づいて細胞のサイズを決定するようにプログラムされている。他の実施形態では、集積回路デバイスは、画像マスクに基づいて細胞の質量中心を決定するようにプログラムされている。さらに他の実施形態では、集積回路デバイスは、画像マスクに基づいて細胞の偏心を決定するようにプログラムされている。
集積回路デバイスは、細胞の第２画像マスクを生成するようにプログラムされてもよい。これらの実施形態では、集積回路デバイスは、細胞の第１画像マスクと第２画像マスクとを比較するようにプログラムされてもよい。例えば、第１画像マスクと第２画像マスクとを比較することには、細胞の画像マスクにダブレットが含まれていると判断することを含んでもよい。
いくつかの事例では、集積回路デバイスは、画像マスクから画像モーメントを算出するようにプログラムされている。例えば、集積回路デバイスは、画像マスクを以下に従って計算するようにプログラムされてもよい。
Figure 2022528323000024
ここで、ｍは、画像マスクのｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、画像マスクのｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
画像モーメントは、細胞の質量中心を計算するために使用されてもよい。これらの実施形態では、集積回路デバイスは、画像マスクの画像モーメントから、細胞の質量中心を以下に従って計算するようにプログラムされてもよい。
Figure 2022528323000025
画像モーメントは、画像モーメントから細胞の配向を計算するために使用されてもよい。これらの実施形態では、集積回路デバイスは、画像モーメントから細胞の配向を以下に従って計算するようにプログラムされてもよい。
Figure 2022528323000026
画像モーメントは、画像モーメントから細胞の偏心を計算するために使用されてもよい。これらの実施形態では、集積回路デバイスは、画像モーメントから細胞の偏心を以下に従って計算するようにプログラムされてもよい。
Figure 2022528323000027
ある特定の実施形態では、対象の集積回路デバイスは、画像からの各画素値と画像マスクからの各画素値とを乗算して、細胞のマスクされた画像を生成するようにプログラムされている。いくつかの事例では、集積回路デバイスは、マスクされた画像から画像モーメントを以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000028
ここで、ｍは、マスクされた画像のｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、マスクされた画像のｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、マスクされた画像の画像モーメントから、質量中心を計算するようにプログラムされている。例えば、集積回路デバイスは、マスクされた画像の画像モーメントから、細胞の質量中心を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000029
他の実施形態では、集積回路デバイスは、マスクされた画像の画像モーメントから、細胞の配向を計算するようにプログラムされている。例えば、集積回路デバイスは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の配向を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000030
さらに他の実施形態では、集積回路デバイスは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の偏心を計算するようにプログラムされている。例えば、集積回路デバイスは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の偏心を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000031
対象の集積回路デバイスは、細胞ごとに画像マスク、画像、またはマスクされた画像の２つ以上を生成するようにプログラムされてもよい。いくつかの事例では、集積回路デバイスは、細胞の２つ以上の異なる画像マスク、細胞の２つ以上の異なる画像、または細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を生成するようにプログラムされている。
いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、画像マスク、画像またはマスクされた画像における細胞の１つ以上の特徴について共局在係数を計算するようにプログラムされている。一実施例では、集積回路デバイスは、細胞の２つ以上の異なる画像マスクを使って、細胞の特徴について共局在係数を計算するようにプログラムされている。他の実施例では、集積回路デバイスは、細胞の２つ以上の異なる画像を使って、細胞の特徴について共局在係数を計算するようにプログラムされている。さらに他の実施例では、集積回路デバイスは、細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を使って、細胞の特徴について共局在係数を計算するようにプログラムされている。さらに他の実施例では、集積回路デバイスは、細胞の画像マスク、画像、マスクされた画像の２つ以上の組み合わせを使って、細胞の特徴について共局在係数を計算するようにプログラムされている。
いくつかの事例では、集積回路デバイスは、細胞の特徴についての共局在係数を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000032
ここで、ｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の画素である。ｙは第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の画素である。バーｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の平均画素値である。バーｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の平均画素値である。
他の事例では、集積回路デバイスは、細胞の特徴について共局在係数を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000033
さらに他の事例では、集積回路デバイスは、細胞の特徴について共局在係数を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000034
本発明は、添付の図面と併せて読む場合、以下の詳細な説明から最もよく理解され得る。
特定の実施形態による、流体ストリーム内の細胞を撮像し、特徴付けるためのフローチャートである。
本開示の態様には、流体ストリーム内の細胞の画像に基づいて試料中の細胞を選別する方法が含まれる。ある特定の実施形態に基づく方法は、流体ストリーム内の細胞を含有する試料からの光を検出することと、試料から細胞の画像マスクを生成することと、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別することとを含む。プロセッサに動作可能に結合され、自身に命令が保存されているメモリを備えたプロセッサを有するシステムであって、その命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサに流体ストリーム内の試料に含まれる細胞の画像マスクを生成し、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別させるシステムについても記載される。画像マスクを生成し、細胞の１つ以上の特徴を決定するためのプログラミングを有する集積回路デバイス（例えば、フィールドプログラマブルゲートアレイなど）も提供される。
本発明がより詳細に記載される前に、本発明は、記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、従って、当然ながら変更され得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別段明確に指示しない限り、その範囲の上限及び下限と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在値との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、記載された範囲内の任意の具体的に除外された制限に従って、より小さい範囲に独立して含まれてよく、本発明内にも包含される。記載された範囲が制限の１つまたは両方を含む場合、それらの含まれる制限のいずれかまたは両方を除く範囲も本発明に含まれる。
本明細書では、数値の前に「約」という用語が付けられて、特定の範囲が提示される。本明細書では、「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行する数に近い、または近似する数について文字通りの支持を提供するために使用される。数が具体的に列挙された数に近いまたは近似しているか否かを決定する際に、近いまたは近似する列挙されない数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価物を提供する数であり得る。
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の如何なる方法及び材料も、本発明の実施または試験に使用することができるが、代表的で例示的な方法及び材料がここに記載されている。
本明細書に引用されるすべての公開及び特許は、各個々の公開または特許が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、引用される公開に関連した方法及び／または材料を開示し、記載するために参照により本明細書に組み込まれる。いずれかの公開の引用は、出願日前のその開示のためであり、本発明が先行発明によってそのような公開に先行する権利がないことを認めるものと解釈されないものとする。さらに、提供された公開日は、独立して確認される必要がある可能性がある実際の公開日とは異なる場合がある。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段明確に指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。従って、この記述は、請求項の要素の列挙、または「否定的」な制限の使用に関連して、「単に」、「唯一」などの排他的な用語を使用するための先行詞として機能することが意図されている。
本開示を読むと当業者には明らかになるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、またはそれらと組み合わされ得る個別の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙されたイベントの順序、または論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。
装置及び方法は、機能的な説明を伴う文法的流動性のために記載されているか、または記載されるが、特許請求の範囲は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２に基づいて明示的に策定されない限り、「手段」または「ステップ」制限の構築によって必ずしも制限されるものと解釈されるべきではなく、同等物の司法理論の下で特許請求の範囲によって提供される定義の意味及び同等物の完全な範囲を付与されるべきであり、特許請求の範囲が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２下で明示的に策定される場合、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２下で完全な法定同等物が付与されるべきであることを明示的に理解されたい。
上記で要約したように、本開示は、生体試料中の細胞などの、試料の粒子成分を選別するためのシステム及び方法を提供する。本開示の実施形態をさらに記載すると、流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成し、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別する方法が最初に非常に詳細に記載されている。次に、試料中の粒子をリアルタイムに特徴付け、選別するシステムが記載されている。細胞の画像マスクを生成し、細胞を特徴付け、細胞を選別するプログラミングを備えたフィールドプログラマブルゲートアレイなどの集積回路デバイスも提供される。
試料の粒子を選別するための方法
本開示の態様は、試料の粒子（例えば、生体試料中の細胞など）を選別するための方法も含む。ある特定の実施形態に従う方法を実施する際に、試料が光源で照射され、試料からの光が検出されて、試料中の細胞の画像マスクを生成し、その細胞は生成された画像マスクに基づいて選別される。いくつかの事例では、試料は、生体試料である。「生体試料」という用語は、その従来の意味で、全生物、植物、真菌、または、ある特定の事例において、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、気管支肺胞洗浄、羊水、羊髄血、尿、膣液、及び精液中に見られ得る動物組織、細胞、または成分部分のサブセットを指すために使用される。従って、「生体試料」は、天然生物またはその組織のサブセットの両方、ならびに、これらに限定されないが、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の切片、呼吸器、胃腸、心血管、及び泌尿器管、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、臓器を含む、生物またはその組織のサブセットから調製されるホモジネート、溶解物、または抽出物を指す。生物学的試料は、健康組織と疾患組織（例えば、がん性、悪性、壊死性など）との両方を含む、任意のタイプの生物組織であってもよい。ある特定の実施形態では、生体試料は、血液またはその誘導体、例えば、血漿、涙液、尿、精液などの液体試料であり、いくつかの事例では、試料は、静脈穿刺または指先から取得された血液など、全血を含む血液試料である（血液は、防腐剤、抗凝固剤などのアッセイの前に任意の試薬と組み合わされてもよく、組み合わされなくてもよい）。
ある特定の実施形態では、試料のソースは、「哺乳類」または「哺乳類の動物」であり、これらの用語は、肉食類（例えば、イヌ及びネコ）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモット、及びラット）、及び霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、及びサル）を含む、哺乳類内の生物を記載するために広く使用される。いくつかの事例では、対象は、ヒトである。方法は、両方の性別のヒト対象及び発達の任意の段階（すなわち、新生児、幼児期、少年期、思春期、成人）から取得された試料に適用されてもよく、ある特定の実施形態では、ヒト対象は、少年期、思春期、または成人である。本発明は、ヒト対象からの試料に適用され得るが、これらに限定されず、鳥、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜、及びウマなど他の動物対象（すなわち、「非ヒト対象」において）からの試料に対しても実施され得ることを理解されたい。
主題の方法を実践する際に、試料（例えば、フローサイトメータの流体ストリーム内）は、光源からの光で照射される。いくつかの実施形態では、光源は、例えば１００ｎｍ以上、例えば１５０ｎｍ以上、例えば２００ｎｍ以上、例えば２５０ｎｍ以上、例えば３００ｎｍ以上、例えば３５０ｎｍ以上、例えば４００ｎｍ、及び５００ｎｍ以上を含む、例えば５０ｎｍ以上など、広範囲の波長を有する光を発する広帯域光源である。例えば、１つの好適な広帯域光源は、２００ｎｍ～１５００ｎｍの波長を有する光を発する。好適な広帯域光源の別の例は、４００ｎｍ～１０００ｎｍの波長を有する光を発する光源を含む。方法が広帯域光源で照射することを含む場合、対象の広帯域光源プロトコルは、これらに限定されないが、ハロゲンランプ、重水素アークランプ、キセノンアークランプ、安定化繊維結合広帯域光源、連続スペクトルの広帯域ＬＥＤ、超発光ダイオード、半導体発光ダイオード、ワイドスペクトルＬＥＤ白色光源、マルチＬＥＤ一体型白色光源のような他の広帯域光源またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
他の実施形態では、方法は、例えば４０ｎｍ以下、例えば３０ｎｍ以下、例えば２５ｎｍ以下、例えば２０ｎｍ以下、例えば１５ｎｍ以下、例えば１０ｎｍ以下、例えば５ｎｍ以下、例えば２ｎｍ以下、及び特定の光の波長（すなわち、単色光）を発する光源を含む、５０ｎｍ以下の範囲のような狭波長範囲の光を発する光源など、特定の波長または狭い範囲の波長を発する狭帯域光源で照射することを含む。方法が、狭帯域光源で照射することを含む場合、対象の狭帯域光源プロトコルは、これらに限定されないが、狭波長ＬＥＤ、レーザダイオード、または１つ以上の光学バンドパスフィルタ、回折格子、モノクロメータ、またはこれらの任意の組み合わせに結合された広帯域光源を含んでもよい。
ある特定の実施形態では、方法は、流体ストリームを１つ以上のレーザで照射することを含む。上述したように、レーザのタイプ及び数は、試料ならびに収集される所望の光に応じて変わり、パルスレーザまたは連続波レーザであり得る。例えば、レーザは、ヘリウムネオンレーザ、アルゴンレーザ、クリプトンレーザ、キセノンレーザ、窒素レーザ、ＣＯ２レーザ、ＣＯレーザ、アルゴンフッ素（ＡｒＦ）エキシマレーザ、クリプトンフッ素（ＫｒＦ）エキシマレーザ、キセノン塩素（ＸｅＣｌ）エキシマレーザまたはキセノンフッ素（ＸｅＦ）エキシマレーザまたはそれらの組み合わせなどのガスレーザ、スチルベン、クマリン、またはロダミンレーザなどの色素レーザ、ヘリウムカドミウム（ＨｅＣｄ）レーザ、ヘリウム－水銀（ＨｅＨｇ）レーザ、ヘリウム－セレン（ＨｅＳｅ）レーザ、ヘリウム－銀（ＨｅＡｇ）レーザ、ストロンチウムレーザ、ネオン銅（ＮｅＣｕ）レーザ、銅レーザまたは金レーザならびにそれらの組み合わせなどの金属蒸気レーザ、例えば、ルビーレーザ、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ、ＮｄＣｒＹＡＧレーザ、Ｅｒ：ＹＡＧレーザ、Ｎｄ：ＹＬＦレーザ、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ、Ｎｄ：ＹＣａ４Ｏ（ＢＯ３）３レーザ、Ｎｄ：ＹＣＯＢレーザ、チタンサファイアレーザ、トリウムＹＡＧレーザ、イッテルビウムＹＡＧレーザ、Ｙｂ２Ｏ３レーザまたはセリウムドープレーザ及びこれらの組み合わせなどの固体レーザ、半導体ダイオードレーザ、光学ポンプ半導体レーザ（ＯＰＳＬ）、または上記レーザのいずれかの周波数２倍型または３倍型の実装であってもよい。
試料は、例えば２つ以上の光源、例えば３つ以上の光源、例えば４つ以上の光源、例えば５つ以上の光源、及び１０個以上の光源を含む、上記の光源のうちの１つ以上で照射され得る。光源は、任意のタイプの光源の組み合わせを含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のガスレーザ、１つ以上の色素レーザ、及び１つ以上の固体レーザを有するアレイなどのレーザのアレイで流体ストリーム内の試料を照射することを含む。
試料は、例えば２５０ｎｍ～１２５０ｎｍ、例えば３００ｎｍ～１０００ｎｍ、例えば３５０ｎｍ～９００ｎｍ、及び４００ｎｍ～８００ｎｍを含む、２００ｎｍ～１５００ｎｍの範囲の波長で照射され得る。例えば、光源が広帯域光源である場合、試料は、２００ｎｍ～９００ｎｍの波長で照射され得る。他の事例では、光源が複数の狭帯域光源を含む場合、試料は、２００ｎｍ～９００ｎｍの範囲の特定の波長で照射されてもよい。例えば、光源は、２００ｎｍ～９００ｎｍの波長の範囲を有する光を各々独立して発する複数の狭帯域ＬＥＤ（１ｎｍ～２５ｎｍ）であってよい。他の実施形態では、狭帯域光源は、１つ以上のレーザ（レーザアレイなど）を含み、試料は、上述のように、ガスレーザ、エキシマレーザ、色素レーザ、金属蒸気レーザ、及び固体レーザを有するレーザアレイで、２００ｎｍ～７００ｎｍの範囲の特定の波長で照射される。
２つ以上の光源が使用される場合、試料は、光源で同時にもしくは順次、またはそれらの組み合わせで照射され得る。例えば、試料は、光源の各々で同時に照射され得る。他の実施形態では、流体ストリームは、光源の各々で順次照射される。試料を順次照射するために２つ以上の光源が使用される場合、各光源が試料を照射する時間は、例えば０．０１マイクロ秒以上、例えば０．１マイクロ秒以上、例えば１マイクロ秒以上、例えば５マイクロ秒以上、例えば１０マイクロ秒以上、例えば３０マイクロ秒以上、及び６０マイクロ秒以上を含む、単独で０．００１マイクロ秒以上であってもよい。例えば、方法は、例えば０．０１マイクロ秒～７５マイクロ秒、例えば０．１マイクロ秒～５０マイクロ秒、例えば１マイクロ秒～２５マイクロ秒、及び５マイクロ秒～１０マイクロ秒を含む、０．００１マイクロ秒～１００マイクロ秒の範囲の期間、試料を光源（例えば、レーザなど）で照射することを含み得る。試料が２つ以上の光源で順次照射される実施形態では、試料が各光源によって照射される持続時間は、同じであっても異なってもよい。
各光源による照射間の期間もまた、必要に応じて、例えば０．０１マイクロ秒以上、例えば０．１マイクロ秒以上、例えば１マイクロ秒以上、例えば５マイクロ秒以上、例えば１０マイクロ秒以上、例えば１５マイクロ秒以上、例えば３０マイクロ秒以上、及び６０マイクロ秒以上を含む、０．００１マイクロ秒以上の遅延によって個別に分離して、変わり得る。例えば、各光源による照射間の期間は、例えば０．０１マイクロ秒～５０マイクロ秒、例えば０．１マイクロ秒～３５マイクロ秒、例えば１マイクロ秒～２５マイクロ秒、及び５マイクロ秒～１０マイクロ秒を含む、０．００１マイクロ秒～６０マイクロ秒の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、各光源による照射間の期間は、１０マイクロ秒である。試料が２つを超える（すなわち、３つ以上の）光源によって順次照射される実施形態では、各光源による照射間の遅延は、同じであっても異なっていてもよい。
試料は、連続的に、または個別の間隔で照射され得る。いくつかの事例では、方法は、試料を光源で連続的に照射することを含む。他の事例では、試料は、０．００１ミリ秒毎、０．０１ミリ秒毎、０．１ミリ秒毎、１ミリ秒毎、１０ミリ秒毎、１００ミリ秒毎、及び１０００ミリ秒毎または何らかの他の間隔を含む個別の間隔で、光源で照射される。
光源に応じて、試料は、例えば０．０１ｍｍ以上、例えば０．０５ｍｍ以上、例えば０．１ｍｍ以上、例えば０．５ｍｍ以上、例えば１ｍｍ以上、例えば２．５ｍｍ以上、例えば５ｍｍ以上、例えば１０ｍｍ以上、例えば１５ｍｍ以上、例えば２５ｍｍ以上、及び５０ｍｍ以上を含むまで変化する距離から照射されてもよい。また、角度または照射は、例えば９０°の角度で、例えば１５°～８５°、例えば２０°～８０°、例えば２５°～７５°、及び３０°～６０°を含む、１０°～９０°の範囲で変わり得る。
主題の方法を実践する際に、照射された試料からの光は、例えば、波長の範囲（例えば、２００ｎｍ～１０００ｎｍなど）にわたって試料からの光を収集することによって測定される。実施形態では、方法は、試料による光吸収の測定（例えば、明視野光データなど）、光散乱の測定（例えば、前方散乱光データまたは側方散乱光データなど）、及び試料による光放射の測定（例えば、蛍光データなど）のうちの１つ以上を含み得る。
試料からの光は、例えば５つ以上の異なる波長、例えば１０個以上の異なる波長、例えば２５個以上の異なる波長、例えば５０個以上の異なる波長、例えば１００個以上の異なる波長、例えば２００個以上の異なる波長、例えば３００個以上の異なる波長、及び収集された光を４００個以上の異なる波長で測定することを含む、１つ以上の波長で測定されてもよい。
光は、２００ｎｍ～１２００ｎｍの波長範囲のうちの１つ以上にわたって収集され得る。いくつかの事例では、方法は、例えば２００ｎｍ～１２００ｎｍ、例えば３００ｎｍ～１１００ｎｍ、例えば４００ｎｍ～１０００ｎｍ、例えば５００ｎｍ～９００ｎｍ、及び６００ｎｍ～８００ｎｍを含む、波長の範囲にわたって試料からの光を測定することを含む。他の事例では、方法は、１つ以上の特定の波長で収集された光を測定することを含む。例えば、収集された光は、４５０ｎｍ、５１８ｎｍ、５１９ｎｍ、５６１ｎｍ、５７８ｎｍ、６０５ｎｍ、６０７ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６６０ｎｍ、６６７ｎｍ、６７０ｎｍ、６６８ｎｍ、６９５ｎｍ、７１０ｎｍ、７２３ｎｍ、７８０ｎｍ、７８５ｎｍ、６４７ｎｍ、６１７ｎｍ、及びこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上で測定され得る。ある特定の実施形態では、方法は、ある特定の蛍光物質の蛍光ピーク波長に対応する光の波長を測定することを含む。
収集された光は、連続的に、または個別の間隔で測定され得る。いくつかの事例では、方法は、光の測定を連続的に行うことを含む。他の事例では、光は、０．００１ミリ秒毎、０．０１ミリ秒毎、０．１ミリ秒毎、１ミリ秒毎、１０ミリ秒毎、１００ミリ秒毎、及び１０００ミリ秒毎を含む、または何らかの他の間隔毎に光を測定するなど、個別の間隔で測定される。
収集された光の測定は、例えば２回以上、例えば３回以上、例えば５回以上、及び１０回以上を含む、主題の方法の期間に１回以上行われ得る。ある特定の実施形態では、試料からの光は２回以上測定され、ある特定の事例では、データが平均化される。
いくつかの実施形態では、方法は、光を検出する前に、試料からの光をさらに調整することを含む。例えば、試料源からの光は、１つ以上のレンズ、鏡、ピンホール、スリット、格子、光屈折器、及びそれらの任意の組み合わせを通過し得る。いくつかの事例では、収集された光は、光のプロファイルを低減するように、１つ以上の集束レンズを通過する。他の事例では、試料から発せられた光は、光ビーム発散を低減するために１つ以上のコリメータを通過する。
ある特定の実施形態では、方法は、試料に周波数シフト光の２つ以上のビームを照射することを含む。上述のように、レーザ及びレーザ光の周波数シフトのための音響光学デバイスを有する光ビーム生成器構成要素が採用され得る。これらの実施形態では、方法は、音響光学デバイスをレーザで照射することを含む。出力レーザビームで生成される光の所望の波長に応じて（例えば、流体ストリーム内の試料を照射する際に使用するために）、レーザは、例えば２５０ｎｍ～１２５０ｎｍ、例えば３００ｎｍ～１０００ｎｍ、例えば３５０ｎｍ～９００ｎｍ、及び４００ｎｍ～８００ｎｍを含む、２００ｎｍ～１５００ｎｍの間で変化する特定の波長を有し得る。音響光学デバイスは、例えば２つ以上のレーザ、例えば３つ以上のレーザ、例えば４つ以上のレーザ、例えば５つ以上のレーザ、及び１０個以上のレーザを含む、１つ以上のレーザで照射され得る。レーザは、いくつかのタイプのレーザの任意の組み合わせを含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、音響光学デバイスを、１つ以上のガスレーザ、１つ以上の色素レーザ、及び１つ以上の固体レーザを有するアレイなどのレーザのアレイで照射することを含む。
２つ以上のレーザが使用される場合、音響光学デバイスは、同時にもしくは順次、またはそれらの組み合わせで、レーザで照射され得る。例えば、音響光学デバイスは、レーザの各々で同時に照射され得る。他の実施形態では、音響光学デバイスは、レーザの各々で順次照射される。音響光学デバイスを順次照射するために２つ以上のレーザが採用される場合、各レーザが音響光学デバイスを照射する時間は、例えば０．０１マイクロ秒以上、例えば０．１マイクロ秒以上、例えば１マイクロ秒以上、例えば５マイクロ秒以上、例えば１０マイクロ秒以上、例えば３０マイクロ秒以上、及び６０マイクロ秒以上を含む、単独で０．００１マイクロ秒以上であってもよい。方法は、例えば０．０１マイクロ秒～７５マイクロ秒、例えば０．１マイクロ秒～５０マイクロ秒、例えば１マイクロ秒～２５マイクロ秒、及び５マイクロ秒～１０マイクロ秒を含む、０．００１マイクロ秒～１００マイクロ秒の範囲の持続時間、音響光学デバイスをレーザで照射することを含み得る。音響光学デバイスが２つ以上のレーザで順次照射される実施形態では、音響光学デバイスが各レーザによって照射される持続時間は、同じであっても異なってもよい。
各レーザによる照射間の期間もまた、必要に応じて、例えば０．０１マイクロ秒以上、例えば０．１マイクロ秒以上、例えば１マイクロ秒以上、例えば５マイクロ秒以上、例えば１０マイクロ秒以上、例えば１５マイクロ秒以上、例えば３０マイクロ秒以上、及び６０マイクロ秒以上を含む、０．００１マイクロ秒以上の遅延によって個別に分離して、変わり得る。例えば、各光源による照射間の期間は、例えば０．０１マイクロ秒～５０マイクロ秒、例えば０．１マイクロ秒～３５マイクロ秒、例えば１マイクロ秒～２５マイクロ秒、及び５マイクロ秒～１０マイクロ秒を含む、０．００１マイクロ秒～６０マイクロ秒の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、各レーザによる照射間の期間は、１０マイクロ秒である。音響光学デバイスが２つを超える（すなわち、３つ以上の）レーザによって順次照射される実施形態では、各レーザによる照射間の遅延は、同じであっても異なっていてもよい。
音響光学デバイスは、連続的に、または個別の間隔で照射され得る。いくつかの事例では、方法は、音響光学デバイスをレーザで連続的に照射することを含む。他の事例では、音響光学デバイスは、０．００１ミリ秒毎、０．０１ミリ秒毎、０．１ミリ秒毎、１ミリ秒毎、１０ミリ秒毎、１００ミリ秒毎、及び１０００ミリ秒毎、または何らかの他の間隔を含む個別の間隔で、レーザで照射される。
レーザに応じて、音響光学デバイスは、例えば０．０１ｍｍ以上、例えば０．０５ｍｍ以上、例えば０．１ｍｍ以上、例えば０．５ｍｍ以上、例えば１ｍｍ以上、例えば２．５ｍｍ以上、例えば５ｍｍ以上、例えば１０ｍｍ以上、例えば１５ｍｍ以上、例えば２５ｍｍ以上、及び５０ｍｍ以上を含み変化する距離から照射されてもよい。また、角度または照射は、例えば９０°の角度で、例えば１５°～８５°、例えば２０°～８０°、例えば２５°～７５°、及び３０°～６０°を含む、１０°～９０°の範囲で変わり得る。
実施形態では、方法は、高周波駆動信号を音響光学デバイスに印加して角度偏向レーザビームを生成することを含む。２つ以上の高周波駆動信号を音響光学デバイスに印加して、例えば３つ以上の高周波駆動信号、例えば４つ以上の高周波駆動信号、例えば５つ以上の高周波駆動信号、例えば６つ以上の高周波駆動信号、例えば７つ以上の高周波動信号、例えば８つ以上の高周波駆動信号、例えば９つ以上の高周波駆動信号、例えば１０個以上の高周波駆動信号、例えば１５個以上の高周波駆動信号、例えば２５個以上の高周波駆動信号、例えば５０個以上の高周波駆動信号、及び１００個以上の高周波駆動信号を含む、所望の数の角度偏向レーザビームを有する出力レーザビームを生成し得る。
高周波駆動信号によって生成される角度偏向レーザビームは、各々、印加された高周波駆動信号の振幅に基づいた強度を有する。いくつかの実施形態では、方法は、所望の強度で角度偏向レーザビームを生成するために十分な振幅を有する高周波駆動信号を印加することを含む。いくつかの事例では、印加された各高周波駆動信号は、例えば約０．００５Ｖ～約４００Ｖ、例えば約０．０１Ｖ～約３００Ｖ、例えば約０．０５Ｖ～約２００Ｖ、例えば約０．１Ｖ～約１００Ｖ、例えば約０．５Ｖ～約７５Ｖ、例えば約１Ｖ～５０Ｖ、例えば約２Ｖ～４０Ｖ、例えば３Ｖ～約３０Ｖ、及び約５Ｖ～約２５Ｖを含む、単独で、約０．００１Ｖ～約５００Ｖの振幅を有する。印加された各高周波駆動信号は、いくつかの実施形態では、例えば約０．００５ＭＨｚ～約４００ＭＨｚ、例えば約０．０１ＭＨｚ～約３００ＭＨｚ、例えば約０．０５ＭＨｚ～約２００ＭＨｚ、例えば約０．１ＭＨｚ～約１００ＭＨｚ、例えば約０．５ＭＨｚ～約９０ＭＨｚ、例えば約１ＭＨｚ～約７５ＭＨｚ、例えば約２ＭＨｚ～約７０ＭＨｚ、例えば約３ＭＨｚ～約６５ＭＨｚ、例えば約４ＭＨｚ～約６０ＭＨｚ、及び約５ＭＨｚ～約５０ＭＨｚを含む、約０．００１ＭＨｚ～約５００ＭＨｚの周波数を有する。
これらの実施形態では、出力レーザビーム内の角度偏向レーザビームは、空間的に分離される。出力レーザビームの印加された高周波駆動信号及び所望の照射プロファイルに応じて、角度偏向レーザビームは、例えば０．００５μｍ以上、例えば０．０１μｍ以上、例えば０．０５μｍ以上、例えば０．１μｍ以上、例えば０．５μｍ以上、例えば１μｍ以上、例えば５μｍ以上、例えば１０μｍ以上、例えば１００μｍ以上、例えば５００μｍ以上、例えば１０００μｍ以上、及び５０００μｍ以上を含む、０．００１μｍ以上によって分離され得る。いくつかの実施形態では、角度偏向レーザビームは、例えば、出力レーザビームの水平軸に沿った隣接する角度偏向レーザビームと重複する。隣接する角度偏向レーザビーム間の重複（ビームスポットの重複など）は、例えば０．００５μｍ以上の重複、例えば０．０１μｍ以上の重複、例えば０．０５μｍ以上の重複、例えば０．１μｍ以上の重複、例えば０．５μｍ以上の重複、例えば１μｍ以上の重複、例えば５μｍ以上の重複、例えば１０μｍ以上の重複、及び１００μｍ以上の重複を含む、０．００１μｍ以上の重複であり得る。
ある特定の事例では、流体ストリームを複数の周波数シフト光のビームで照射し、流体ストリーム内の細胞が、高周波タグ付き発光（ＦＩＲＥ）を使用して蛍光撮像によって撮像されて、Ｄｉｅｂｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｖｏｌ．７（１０）；８０６－８１０（２０１３）に記載されるもの、ならびに米国特許第９，４２３，３５３号、第９，７８４，６６１号及び第１０，００６，８５２号、ならびに米国特許公開第２０１７／０１３３８５７号及び第２０１７／０３５０８０３号に記載されるものなどの、周波数符号化画像を生成し、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、方法は、検出された光から流体ストリーム内の細胞の画像マスク生成することを含む。画像マスクは、検出された光吸収、検出された光散乱、検出された光放射、またはそれらの任意の組み合わせから生成され得る。いくつかの事例では、画像マスクは、例えば、明視野光検出器からなど、試料から検出された光吸収から生成される。これらの事例では、画像マスクは、流体ストリーム内の細胞からの明視野画像データに基づいて生成される。他の事例では、画像マスクは、側方散乱検出器、前方散乱検出器、または側方散乱検出器と前方散乱検出器との組み合わせなどによって、試料から検出された光散乱から生成される。これらの事例では、画像マスクは、散乱光画像データに基づいて生成される。さらに他の事例では、画像マスクは、試料に添加された蛍光物質からの光など、試料からの放射光から生成される。これらの事例では、画像マスクは、蛍光画像データ（すなわち、細胞上または細胞中の蛍光成分からの撮像データ）に基づいて生成される。さらに他の事例では、画像マスクは、検出された光吸収、検出された光散乱、及び検出された光放射の組み合わせから生成される。
１つまたはそれ以上の画像マスクが検出光から生成されてもよい。いくつかの実施形態では、単一の画像マスクが検出光の各フォームから生成される。例えば、細胞の第１画像マスクは検出された光吸収から生成され、細胞の第２画像マスクは検出された光散乱から生成され、細胞の第３画像マスクは検出された光放射から生成される。他の実施形態では、例えば３つ以上、例えば４つ以上、例えば５つ以上及び例えば１０個以上の画像マスクを含む２つ以上の画像マスク、またはそれらの組み合わせが検出光の各フォームから生成される。
画像マスクを生成するために、ある特定の実施形態に従う方法は、流体ストリーム内の細胞の画像を生成することを含む。いくつかの実施形態では、画像は流体ストリーム内の細胞のグレースケール画像である。本明細書でいう「グレースケール」という用語は、従来の意味で、各画素の光の強さに基づいたさまざまな階調のグレーで構成される流体ストリーム内の細胞の画像を言及するために使用されている。実施形態では、画素強度閾値は、以下でより詳細に記載するように、画素強度閾値が細胞の画像マスクを生成するために使用される２値の値に各画素を変換するために使用されるグレースケール画像から決定される。いくつかの実施形態では、画素強度閾値は、グレースケール画像のクラス内分散を最小化し、最小化されたクラス内分散に基づいて画素強度閾値を計算することにより決定される。いくつかの実施形態では、画素強度閾値は、検出光データに双峰性のヒストグラムに従って２クラスの画素（前景画素と背景画素を含む）を含むアルゴリズムを使用して決定され、結合されたクラス内分散が最小限となるように２つのクラスを分離する最適な閾値を計算する。他の実施形態では、方法は、クラス間分散が最大となるように２つのクラスを分離する最適な閾値を計算することを含む。
画像マスクを生成する際に、グレースケール画像内の各画素は決定された強度閾値と比較され、２値の画素値に変換される。グレースケール画像の各画素が、必要に応じて任意の順序で、決定された強度閾値と比較されてもよい。いくつかの実施形態では、グレースケール画像内の各水平列に沿った画素は決定された強度閾値と比較される。いくつかの事例では、各画素が、グレースケール画像の左側からグレースケール画像の右側へ、決定された強度閾値と比較される。他の事例では、各画素が、グレースケール画像の右側からグレースケール画像の左側へ、決定された強度閾値と比較される。他の実施形態では、グレースケール画像内の各垂直列に沿った画素は、決定された強度閾値と比較される。いくつかの事例では、各画素が、グレースケール画像の最上部からグレースケール画像の最下部へと各垂直列に沿って、決定された強度閾値と比較される。他の事例では、各画素が、グレースケール画像の最下部からグレースケール画像の最上部へと各垂直列に沿って、決定された強度閾値と比較される。
撮像されている細胞のサイズと試料からの光を収集するために使用される光学部品（以下でより詳細に説明する）のサイズとによって、グレースケール画像の一部分の全部が強度閾値と比較されてもよい。例えば、対象となる方法を実践する際に、グレースケール画像の画素の、例えば６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上、例えば９７％以上、または例えば９９％以上を含む、グレースケール画像内の５０％以上の画素が強度閾値と比較されてもよい。ある特定の実施形態では、細胞のグレースケール画像の画素の全部（１００％）が強度閾値と比較されてもよい。
上記で要約したように、グレースケール画像の各画素は、２値化された画素値に変換される。検出された光のタイプに応じて、各画素には、２値化された画素値の１または２値化された画素値の０が割り当てられる。一実施例では、方法は、流体ストリームから光吸収（例えば、明視野画像データ）を検出することと、画素強度が強度閾値未満の場合は２値化された画素値の１を、グレースケール画像の画素強度が強度閾値よりも大きい場合は２値化された画素値の０をグレースケール画像の各画素に割り当てることを含む。他の実施例では、方法は、流体ストリーム内の細胞から光散乱を検出することと、画素強度が強度閾値よりも大きい場合は２値化された画素値の１を、画素強度が強度閾値未満の場合は２値化された画素値の０をグレースケール画像の各画素に割り当てることを含む。さらに他の実施例では、方法は、流体ストリーム内の細胞から蛍光を検出することと、画素強度が強度閾値よりも大きい場合は２値化された画素値の１を、画素強度が強度閾値未満の場合は２値化された画素値の０をグレースケール画像の各画素に割り当てることを含む。
２値化された画素値がグレースケール画像の各画素に水平列にわたって割り当てられる場合、いくつかの実施形態では、方法は、２値化された画素値の１を有する水平列中の最初の画素を決定することと、２値化された画素値の１を有する水平列中の最後の画素を決定することをさらに含む。一実施例では、方法は、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の左側から最初の画素を決定することと、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の左側から最後の画素を決定することとを含む。他の実施例では、方法は、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の右側から最初の画素を決定することと、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の右側から最後の画素を決定することを含む。他の実施形態では、方法は、２値化された画素値が０である水平列中の最初の画素を決定することと、２値化された画素値が０である水平列中の最後の画素を決定することとをさらに含む。一実施例では、方法は、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の左側から最初の画素を決定することと、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の左側から最後の画素を決定することとを含む。他の実施例では、方法は、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の右側から最初の画素を決定することと、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の右側から最後の画素を決定することとを含む。
２値化された画素値がグレースケール画像の各画素に垂直列に沿って割り当てられる場合、いくつかの実施形態では、方法は、２値化された画素値が１である垂直列沿いの最初の画素を決定することと、２値化された画素値が１である垂直列沿いの最後の画素を決定することとをさらに含む。一実施例では、方法は、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最上部から最初の画素を決定することと、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最上部から最後の画素を決定することとを含む。他の実施例では、方法は、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最下部から最初の画素を決定することと、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最下部から最後の画素を決定することとを含む。他の実施形態では、方法は、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列沿いの最初の画素を決定することと、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列沿いの最後の画素を決定することとをさらに含む。一実施例では、方法は、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最上部から最初の画素を決定することと、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最上部から最後の画素を決定することとを含む。他の実施例では、方法は、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最下部から最初の画素を決定することと、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最下部から最後の画素を決定することとを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、画像マスクから画像モーメントを算出することをさらに含む。本明細書でいう「画像モーメント」という用語は、その従来の意味で画像内の画素強度の加重平均（例えば、生成された画像マスクなど）を言及するために用いられている。以下に記載されるように、画像マスクから決定された画像モーメントは、画像マスクにおける細胞の画素の全強度、画像マスクにおける細胞で占められる全領域、画像マスクにおける細胞の質量中心（すなわち、幾何学的中央）だけでなく画像マスクにおける細胞の配向を計算するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、画像モーメントは画像マスクから以下に従って計算される。
Figure 2022528323000035
ここで、ｍは、画像マスクのｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、画像マスクのｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
特定の実施形態に基づく方法は、生成された画像マスクに基づいて、流体ストリーム内の細胞の１つ以上の性質を決定することを含む。例えば、方法は、画像マスクに基づいて、細胞のサイズ、細胞の質量中心、または細胞の偏心を決定すること含んでもよい。これらの実施形態では、方法は、画像マスクの１つ以上の画像モーメントを計算することと、画像マスクと計算された画像モーメントに基づいて、細胞の特性を決定することとを含む。
いくつかの事例では、質量中心は、画像マスクの画像モーメントから計算されてもよい。例えば、質量中心は、画像マスクの画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000036
他の事例では、細胞の配向は、画像マスクの画像モーメントから計算されてもよい。例えば、細胞の配向は、画像マスクの画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000037
さらに他の事例では、細胞の偏心は、画像マスクの画像モーメントから計算されてもよい。例えば、細胞の偏心は、以下に従って画像マスクの画像モーメントから計算されてもよい。
Figure 2022528323000038
いくつかの実施形態では、方法は、流体ストリーム内の細胞のマスクされた画像を生成することを含む。マスクされた画像は、画像マスクからの各画素値と細胞の画像の画素値とを乗算して生成される。細胞の画像は、画像マスクが生成されたグレースケール画像であってもよく、または流体ストリーム内の試料からの検出光（明視野、散乱または放射）から得られた周波数符号化画像データのような細胞の他の画像であってもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、マスクされた画像から画像モーメントを計算することをさらに含む。いくつかの事例では、マスクされた画像からの画像モーメントは以下に従って計算される。
Figure 2022528323000039
ここで、ｍは、マスクされた画像のｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、マスクされた画像のｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
マスクされた画像と計算された画像モーメントに基づいて、例えば、細胞のサイズ、細胞の配向及び細胞の偏心などの細胞の１つ以上の性質が決定され得る。画像マスクとマスクされた画像との比較は画像マスクの境界内で光信号の分散を決定するためにも使用され得る。一実施例では、質量中心は、マスクされた画像の画像モーメントから計算されてもよい。例えば、質量中心は、マスクされた画像の画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000040
他の実施例では、細胞の配向は、マスクされた画像の画像モーメントから計算されてもよい。例えば、細胞の配向は、マスクされた画像の画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000041
さらに他の実施例では、細胞の偏心は、マスクされた画像の画像モーメントから計算されてもよい。例えば、細胞の偏心は、マスクされた画像の画像モーメントから以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000042
いくつかの実施形態では、方法は、各細胞について、画像、画像マスク及びマスクされた画像の２つ以上を比較することを含む。いくつかの事例では、細胞の画像と画像マスクとが比較されてもよい。他の事例では、細胞の画像とマスクされた画像とが比較されてもよい。さらに他の事例では、細胞の画像マスクとマスクされた画像とが比較されてもよい。他の実施形態では、方法は、細胞の２つ以上の異なる画像マスク、細胞の２つ以上の異なる画像、または細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を生成し、且つ比較することを含む。
いくつかの実施形態では、細胞の１つ以上の特徴についての共局在の度合いの尺度である共局在係数が計算される。細胞の特徴は、例えば、細胞間の細胞小器官（例えば、細胞核、ミトコンドリア）または細胞間の高分子（例えば、タンパク質、核酸)であってよい。いくつかの事例では、共局在係数は、細胞の２つ以上の異なる画像マスクをから計算される。他の事例では、共局在係数は、細胞の２つ以上の異なる画像から計算される。さらに他の事例では、共局在係数は、細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像から計算される。いくつかの実施形態では、共局在係数は、細胞の画像及び画像マスクから計算される。他の実施形態では、共局在係数は、細胞の画像及びマスクされた画像から計算される。さらに他の実施形態では、共局在係数は、細胞の画像マスク及びマスクされた画像から計算される。
ある特定の実施形態では、細胞の特徴についての共局在係数は以下に従って計算される。
Figure 2022528323000043
ここで、ｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の画素である。ｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の画素である。バーｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の平均画素値である。バーｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の平均画素値である。
他の実施形態では、細胞の特徴についての共局在係数は、以下に従って計算される。
Figure 2022528323000044
その他の実施形態では、細胞の特徴についての共局在係数は以下に従って計算される。
Figure 2022528323000045
特定の実施形態に従って、図１は、流体ストリーム内の細胞を撮像し、特徴付けるためのフローチャートを示す。ステップ１０１で、流体ストリーム内の細胞からの光（光吸収、散乱光、または放射）を検出する。ステップ１０２で、細胞の画像（例えば、グレースケール画像など）を生成する。ステップ１０３で、画素強度閾値を画像の画素に基づいて決定する。ステップ１０４で、各画素の強度と決定された画素強度閾値とを比較することによって、画像の各画素を２値の画素値に変換する。次いでステップ１０５で、２値の画素値を使用して、画像マスクを生成する。ステップ１０６で、画像マスクを、マスクされた画像を生成するために使用してもよい。ステップ１０７で、細胞の１つ以上の特徴（例えば、細胞小器官など）の共局在を計算するために、２つ以上の画像マスクを使用してもよく、またはステップ１０８で、画像マスク及びマスクされた画像を使用して、共局在を計算してもよい。
上記で要約したように、本開示の方法は、試料中の細胞を選別することも含む。本明細書でいう「選別」という用語は、その従来の意味で、試料の成分（例えば、細胞を含む液滴、生体高分子などの非細胞粒子を含む液滴）を分離し、いくつかの事例では、分離された成分を１つ以上の試料収集容器に送達することを言及するために使用される。例えば、方法は、例えば３つ以上の成分、例えば４つ以上の成分、例えば５つ以上の成分、例えば１０個以上の成分、例えば１５個以上の成分、及び試料の２５個以上の成分を含む、試料の２つ以上の成分を選別することを含み得る。実施形態では、方法は、細胞の生成された画像マスクに基づいて、細胞を選別することを含む。
細胞を選別する際に、方法は、例えば、コンピュータを使ったデータの取得、分析及び記録を含み、複数のデータチャンネルは、細胞の画像、画像マスク、またはマスクされた画像を生成する際に使用される各検出器（例えば、散乱検出器、明視野光検出器または蛍光検出器）からのデータを記録する。これらの実施形態では、分析は、各粒子がデジタル化されたパラメータ値のセットとして存在するように、粒子を分類し、計数することを含む。主題のシステム（以下に記載する）は、対象の粒子を背景及びノイズから区別するために、選択されたパラメータ上でトリガするように設定され得る。
次いで、対象の特定の亜集団は、集団全体について収集されたデータに基づいて「ゲーティング」することによってさらに分析され得る。適切なゲートを選択するために、部分集団のできるかぎり最良の分離を得るように、データがプロットされる。この手順は、前方光散乱（ＦＳＣ）対側方（すなわち、直交）光散乱（ＳＳＣ）を二次元ドットプロット上にプロットすることによって実行され得る。次いで、粒子の部分集団（すなわち、ゲート内のそれらの細胞）が選択され、ゲート内にない粒子が除外される。必要に応じて、コンピュータ画面上のカーソルを使用して、所望の部分集団の周りにラインを描くことによって、ゲートが選択され得る。次いで、ゲート内のそれらの粒子のみが、例えば、蛍光など、これらの粒子の他のパラメータをプロットすることによって、さらに分析される。必要があれば、上記分析は、試料中の対象の粒子の計数を生成するように構成され得る。
いくつかの実施形態では、試料の成分を選別するための方法は、例えば、２０１７年３月２８日に出願された米国特許公開第２０１７／０２９９４９３号に記載される、デフレクタプレートを有する粒子選別モジュールを用いて粒子（例えば、生体試料中の細胞など）を選別することを含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、試料中の細胞は、２０１９年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８０３，２６４号に記載されているものなど、複数の選別決定ユニットを有する選別決定モジュールを使用して選別され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
試料の粒子を選別するためのシステム
上記で要約したように、本開示の態様は、試料中の粒子を選別するシステムを含む。特定の実施形態に基づくシステムは、流体ストリーム内の細胞を含有する試料を照射するように構成されている光源と、１つ以上の光検出器を備えた光検出システムと、メモリが自身に保存された命令を含むようにメモリが動作可能に結合されたプロセッサと、その命令がプロセッサによって実行されると、システムはプロセッサに、流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成させ、及び生成された画像マスクに基づいて試料中の細胞を選別するように構成されている細胞選別部品とを含む。いくつかの実施形態では、主題のシステムは、生体試料中の細胞など、試料の成分を選別するように構成されている。上述のように、選別は、本明細書ではその従来の意味で、試料の成分（例えば、細胞、生体高分子などの非細胞粒子）を分離し、いくつかの事例では、分離された成分を１つ以上の試料収集容器に送達させることを言及する。例えば、主題のシステムは、例えば３つ以上の成分、例えば４つ以上の成分、例えば５つ以上の成分、例えば１０個以上の成分、例えば１５個以上の成分、及び２５個以上の成分を有する試料を分離することを含む、２つ以上の成分を有する試料を選別するために構成され得る。試料成分のうちの１つ以上は、試料から分離され、試料収集容器に送達され、例えば２つ以上の試料成分、例えば３つ以上の試料成分、例えば４つ以上の試料成分、例えば５つ以上の試料成分、例えば１０個以上の試料成分、及び１５個以上を含む試料成分が、試料から分離され、試料収集容器に送達され得る。
対象のシステムは、流体ストリーム内に細胞を有する試料を照射するように構成されている光源を含む。実施形態では、光源は、任意の好適な広帯域または狭帯域の光源であってもよい。試料中の成分（例えば、細胞、ビーズ、非細胞粒子など）に応じて、光源は、例えば２５０ｎｍ～１２５０ｎｍ、例えば３００ｎｍ～１０００ｎｍ、例えば３５０ｎｍ～９００ｎｍ、及び４００ｎｍ～８００ｎｍを含む、２００ｎｍ～１５００ｎｍの範囲で変わる光の波長を発するように構成され得る。例えば、光源は、２００ｎｍ～９００ｎｍの波長を有する光を発する広帯域光源を含んでもよい。他の事例では、光源は、２００ｎｍ～９００ｎｍの範囲の波長を発する狭帯域光源を含む。例えば、光源は、２００ｎｍ～９００ｎｍの範囲の波長を有する光を発する狭帯域ＬＥＤ（１ｎｍ～２５ｎｍ）であってよい。
いくつかの実施形態では、光源は、レーザである。対象のレーザは、パルスレーザまたは連続波レーザを含んでもよい。例えば、レーザは、ヘリウムネオンレーザ、アルゴンレーザ、クリプトンレーザ、キセノンレーザ、窒素レーザ、ＣＯ２レーザ、ＣＯレーザ、アルゴンフッ素（ＡｒＦ）エキシマレーザ、クリプトンフッ素（ＫｒＦ）エキシマレーザ、キセノン塩素（ＸｅＣｌ）エキシマレーザまたはキセノンフッ素（ＸｅＦ）エキシマレーザまたはそれらの組み合わせなどのガスレーザ、スチルベン、クマリン、またはロダミンレーザなどの色素レーザ、ヘリウムカドミウム（ＨｅＣｄ）レーザ、ヘリウム－水銀（ＨｅＨｇ）レーザ、ヘリウム－セレン（ＨｅＳｅ）レーザ、ヘリウム－銀（ＨｅＡｇ）レーザ、ストロンチウムレーザ、ネオン銅（ＮｅＣｕ）レーザ、銅レーザまたは金レーザならびにそれらの組み合わせなどの金属蒸気レーザ、例えば、ルビーレーザ、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ、ＮｄＣｒＹＡＧレーザ、Ｅｒ：ＹＡＧレーザ、Ｎｄ：ＹＬＦレーザ、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ、Ｎｄ：ＹＣａ４Ｏ（ＢＯ３）３レーザ、Ｎｄ：ＹＣＯＢレーザ、チタンサファイアレーザ、トリウムＹＡＧレーザ、イッテルビウムＹＡＧレーザ、Ｙｂ２Ｏ３レーザまたはセリウムドープレーザ及びこれらの組み合わせなどの固体レーザ、半導体ダイオードレーザ、光学ポンプ半導体レーザ（ＯＰＳＬ）、または上記レーザのいずれかの周波数２倍型または３倍型の実装であってもよい。
他の実施形態では、光源は、これらに限定されないが、ハロゲンランプ、重水素アークランプ、キセノンアークランプ、連続スペクトルを有する広帯域ＬＥＤなどの発光ダイオード、超発光ダイオード、半導体発光ダイオード、広域スペクトルＬＥＤ白色光源、マルチＬＥＤ集積を含む、ランプなどの非レーザ光源である。いくつかの事例では、非レーザ光源は、安定化繊維結合広帯域光源、白色光源、とりわけ、他の光源またはそれらの任意の組み合わせである。
ある特定の実施形態では、光源は、周波数シフト光の２つ以上のビームを生成するように構成されている光ビーム生成器である。いくつかの事例では、光ビーム生成器は、レーザ、高周波駆動信号を音響光学デバイスに印加して、２つ以上の角度偏向レーザビームを生成するように構成されている高周波生成器を含む。これらの実施形態では、レーザは、パルスレーザまたは連続波レーザであってもよい。例えば、対象の光ビーム生成器内のレーザは、ヘリウムネオンレーザ、アルゴンレーザ、クリプトンレーザ、キセノンレーザ、窒素レーザ、ＣＯ２レーザ、ＣＯレーザ、アルゴンフッ素（ＡｒＦ）エキシマレーザ、クリプトンフッ素（ＫｒＦ）エキシマレーザ、キセノン塩素（ＸｅＣｌ）エキシマレーザ、またはキセノンフッ素（ＸｅＦ）エキシマレーザまたはそれらの組み合わせなどのガスレーザ、スチルベン、クマリン、またはロダミンレーザなどの色素レーザ、ヘリウムカドミウム（ＨｅＣｄ）レーザ、ヘリウム－水銀（ＨｅＨｇ）レーザ、ヘリウム－セレン（ＨｅＳｅ）レーザ、ヘリウム－銀（ＨｅＡｇ）レーザ、ストロンチウムレーザ、ネオン銅（ＮｅＣｕ）レーザ、銅レーザまたは金レーザならびにそれらの組み合わせなどの金属蒸気レーザ；例えば、ルビーレーザ、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ、ＮｄＣｒＹＡＧレーザ、Ｅｒ：ＹＡＧレーザ、Ｎｄ：ＹＬＦレーザ、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ、Ｎｄ：ＹＣａ４Ｏ（ＢＯ３）３レーザ、Ｎｄ：ＹＣＯＢレーザ、チタンサファイアレーザ、トリウムＹＡＧレーザ、イッテルビウムＹＡＧレーザ、Ｙｂ２Ｏ３レーザまたはセリウムドープレーザ及びこれらの組み合わせなどの固体レーザであってもよい。
音響光学デバイスは、適用された音波を使用してレーザ光を周波数シフトするように構成されている任意の便利な音響光学プロトコルであり得る。ある特定の実施形態では、音響光学デバイスは、音響光学デフレクタである。主題のシステム内の音響光学デバイスは、レーザからの光及び印加された高周波駆動信号から角度偏向レーザビームを生成するように構成されている。高周波駆動信号は、ダイレクトデジタルシンセサイザ（ＤＤＳ）、任意の波形生成器（ＡＷＧ）、または電気パルス生成器など、任意の好適な高周波駆動信号源を有する音響光学デバイスに印加され得る。
実施形態では、コントローラは、例えば４つ以上の高周波駆動信号、例えば５つ以上の高周波駆動信号、例えば６つ以上の高周波駆動信号、例えば７つ以上の高周波駆動信号、例えば８つ以上の高周波駆動信号、例えば９つ以上の高周波駆動信号、例えば１０個以上の高周波駆動信号、例えば１５個以上の高周波駆動信号、例えば２５個以上の高周波駆動信号、例えば５０個以上の高周波駆動信号、及び１００個以上の高周波駆動信号を印加するように構成されていることを含む、例えば３つ以上の高周波駆動信号を印加するように構成されているなど、高周波駆動信号を音響光学デバイスに印加して、出力レーザビーム内に所望の数の角度偏向レーザビームを生成するように構成されている。
いくつかの事例では、出力レーザビーム内の角度偏向レーザビームの強度プロファイルを生成するために、コントローラは、例えば約０．００５Ｖ～約４００Ｖ、例えば約０．０１Ｖ～約３００Ｖ、例えば約０．０５Ｖ～約２００Ｖ、例えば約０．１Ｖ～約１００Ｖ、例えば約０．５Ｖ～約７５Ｖ、例えば約１Ｖ～５０Ｖ、例えば約２Ｖ～４０Ｖ、例えば３Ｖ～約３０Ｖ、及び約５Ｖ～約２５Ｖを含む、約０．００１Ｖ～約５００Ｖで変化する振幅を有する高周波駆動信号を印加するように構成されている。印加された各高周波駆動信号は、いくつかの実施形態では、例えば約０．００５ＭＨｚ～約４００ＭＨｚ、例えば約０．０１ＭＨｚ～約３００ＭＨｚ、例えば約０．０５ＭＨｚ～約２００ＭＨｚ、例えば約０．１ＭＨｚ～約１００ＭＨｚ、例えば約０．５ＭＨｚ～約９０ＭＨｚ、例えば約１ＭＨｚ～約７５ＭＨｚ、例えば約２ＭＨｚ～約７０ＭＨｚ、例えば約３ＭＨｚ～約６５ＭＨｚ、例えば約４ＭＨｚ～約６０ＭＨｚ、及び約５ＭＨｚ～約５０ＭＨｚを含む、約０．００１ＭＨｚ～約５００ＭＨｚの周波数を有する。
ある特定の実施形態では、コントローラは、メモリが自身に記憶された命令を含むように、プロセッサに動作可能に結合されたメモリを備えたプロセッサを有し、命令はプロセッサによって実行されると、プロセッサに、所望の強度プロファイルを有する角度偏向レーザビームを有する出力レーザビームを生成させる。例えば、メモリは、同じ強度を有する、例えば３つ以上、例えば４つ以上、例えば５つ以上、例えば１０個以上、例えば２５個以上、例えば５０個以上を含む２つ以上の角度偏向レーザビームを生成するための命令を含み、メモリは、同じ強度を有する１００個以上の角度偏向レーザビームを生成するための命令を含んでもよい。他の実施形態では、メモリは、異なる強度を有する、例えば３つ以上、例えば４つ以上、例えば５つ以上、例えば１０個以上、例えば２５個以上、例えば５０個以上を含む２つ以上の角度偏向レーザビームを生成するための命令を含み、メモリは、異なる強度を有する１００個以上の角度偏向レーザビームを生成するための命令を含んでもよい。
ある特定の実施形態では、コントローラは、メモリが自身に記憶された命令を含むように、プロセッサに動作可能に結合されたメモリを備えたプロセッサを有し、命令はプロセッサによって実行されると、プロセッサに、水平軸に沿って出力レーザビームの端から中心に増加する強度を有する出力レーザビームを生成させる。これらの事例では、出力ビームの中心における角度偏向レーザビームの強度は、例えば０．５％～約９５％、例えば１％～約９０％、例えば約２％～約８５％、例えば約３％～約８０％、例えば約４％～約７５％、例えば約５％～約７０％、例えば約６％～約６５％、例えば約７％～約６０％、例えば約８％～約５５％、及び水平軸に沿った出力レーザビームの端における角度偏向レーザビームの強度の約１０％～約５０％を含む、水平軸に沿った出力レーザビームの端における角度偏向レーザビームの強度の０．１％～約９９％の範囲であり得る。他の実施形態では、コントローラは、メモリが自身に記憶された命令を含むように、プロセッサに動作可能に結合されたメモリを備えたプロセッサを有し、命令はプロセッサによって実行されると、プロセッサに、水平軸に沿って出力レーザビームの端から中心に増加する強度を有する出力レーザビームを生成させる。これらの事例では、出力ビームの端における角度偏向レーザビームの強度は、例えば０．５％～約９５％、例えば１％～約９０％、例えば約２％～約８５％、例えば約３％～約８０％、例えば約４％～約７５％、例えば約５％～約７０％、例えば約６％～約６５％、例えば約７％～約６０％、例えば約８％～約５５％、及び水平軸に沿った出力レーザビームの中心における角度偏向レーザビームの強度の約１０％～約５０％を含む、水平軸に沿った出力レーザビームの中心における角度偏向レーザビームの強度の０．１％～約９９％の範囲であり得る。また他の実施形態では、コントローラは、メモリが自身に記憶された命令を含むように、プロセッサに動作可能に結合されたメモリを備えたプロセッサを有し、命令はプロセッサによって実行されると、プロセッサに、水平軸に沿ったガウス分布を有する強度プロファイルを有する出力レーザビームを生成させる。さらに他の実施形態では、コントローラは、メモリが自身に記憶された命令を含むように、プロセッサに動作可能に結合されたメモリを備えたプロセッサを有し、命令はプロセッサによって実行されると、プロセッサに、水平軸に沿ってトップハット強度プロファイルを有する出力レーザビームを生成させる。
実施形態では、対象の光ビーム生成器は、空間的に分離された出力レーザビーム内で角度偏向レーザビームを生成するように構成され得る。出力レーザビームの印加された高周波駆動信号及び所望の照射プロファイルに応じて、角度偏向レーザビームは、例えば０．００５μｍ以上、例えば０．０１μｍ以上、例えば０．０５μｍ以上、例えば０．１μｍ以上、例えば０．５μｍ以上、例えば１μｍ以上、例えば５μｍ以上、例えば１０μｍ以上、例えば１００μｍ以上、例えば５００μｍ以上、例えば１０００μｍ以上、及び５０００μｍ以上を含む、０．００１μｍ以上によって分離され得る。いくつかの実施形態では、システムは、例えば、出力レーザビームの水平軸に沿った隣接する角度偏向レーザビームと重複する角度偏向レーザビームを出力レーザビームに生成するように構成されている。隣接する角度偏向レーザビーム間の重複（ビームスポットの重複など）は、例えば０．００５μｍ以上の重複、例えば０．０１μｍ以上の重複、例えば０．０５μｍ以上の重複、例えば０．１μｍ以上の重複、例えば０．５μｍ以上の重複、例えば１μｍ以上の重複、例えば５μｍ以上の重複、例えば１０μｍ以上の重複、及び１００μｍ以上の重複を含む、０．００１μｍ以上の重複であり得る。
ある特定の事例では、周波数シフト光の２つ以上のビームを生成するように構成されている光ビーム生成器は、米国特許第９，４２３，３５３号、第９，７８４，６６１号、及び第１０，００６，８５２号、ならびに米国特許公開第２０１７／０１３３８５７号及び第２０１７／０３５０８０３号に記載されるようなレーザ励起モジュールを含み、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、システムは、試料からの光を検出し、測定するための１つ以上の光検出器を有する光検出システムを含む。対象の光検出器は、試料からの光吸収（例えば、明視野光データに関して）、光散乱（例えば、前方または側方散乱光データ）、光放射（例えば、蛍光光データ）、またはそれらの組み合わせを測定するように構成され得る。対象の光検出器は、これらに限定されないが、他の光検出器の中でも、アクティブピクセルセンサ（ＡＰＳ）、アバランシェフォトダイオード、画像センサ、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、強化電荷結合デバイス（ＩＣＣＤ）、発光ダイオード、フォトンカウンタ、ボロメータ、焦電検出器、光抵抗器、太陽電池、フォトダイオード、光電子増倍管、フォトトランジスタ、量子ドット光伝導体またはフォトダイオード、ならびにこれらの組み合わせなどの光学センサを含み得る。ある特定の実施形態では、試料からの光は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、半導体電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、アクティブピクセルセンサ（ＡＰＳ）、相補的金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）画像センサ、またはＮ型金属酸化物半導体（ＮＭＯＳ）画像センサで測定される。
いくつかの実施形態では、対象の光検出システムは、複数の光検出器を含む。いくつかの事例では、光検出システムは、フォトダイオードなどの複数の固体検出器を含む。ある特定の事例では、光検出システムは、フォトダイオードのアレイなどの光検出器アレイを含む。これらの実施形態では、光検出器アレイは、例えば１０個以上の光検出器、例えば２５個以上の光検出器、例えば５０個以上の光検出器、例えば１００個以上の光検出器、例えば２５０個以上の光検出器、例えば５００個以上の光検出器、例えば７５０個以上の光検出器、及び１０００個以上の光検出器を含む、４つ以上の光検出器を含み得る。例えば、検出器は、例えば１０個以上のフォトダイオード、例えば２５個以上のフォトダイオード、例えば５０個以上のフォトダイオード、例えば１００個以上のフォトダイオード、例えば２５０個以上のフォトダイオード、例えば５００個以上のフォトダイオード、例えば７５０個以上のフォトダイオード、及び１０００個以上のフォトダイオードを含む、４つ以上のフォトダイオードを有するフォトダイオードアレイであってよい。
光検出器は、必要に応じて任意の幾何学的構成で配置されてもよく、対象の構成は、これらに限定されないが、正方形構成、長方形構成、台形構成、三角形構成、六角形構成、七角形構成、八角形構成、非長方形構成、十角形構成、十二角形構成、円形構成、楕円形構成、ならびに不規則パターン化構成を含む。光検出器アレイ内の光検出器は、（Ｘ－Ｚ平面で参照されるように）他方に対して、例えば１５°～１７０°、例えば２０°～１６０°、例えば２５°～１５０°、例えば３０°～１２０°、及び４５°～９０°を含む、１０°～１８０°の範囲の角度で配向され得る。光検出器アレイは、任意の好適な形状であってもよく、例えば、正方形、長方形、台形、三角形、六角形などの直線形状、例えば、円、楕円形などの曲線形状、ならびに、例えば、平面頂部に結合された放物線底部などの不規則形状であってもよい。ある特定の実施形態では、光検出器アレイは、矩形状の活性表面を有する。
アレイ内の各光検出器（例えばフォトダイオード）は、例えば１０μｍ～２２５μｍ、例えば１５μｍ～２００μｍ、例えば２０μｍ～１７５μｍ、例えば２５μｍ～１５０μｍ、例えば３０μｍ～１２５μｍ、及び５０μｍ～１００μｍを含む、５μｍ～２５０μｍの範囲の幅を有し、例えば１０μｍ～２２５μｍ、例えば１５μｍ～２００μｍ、例えば２０μｍ～１７５μｍ、例えば２５μｍ～１５０μｍ、例えば３０μｍ～１２５μｍ、及び５０μｍ～１００μｍを含む、５μｍ～２５０μｍの範囲の長さを有する活性表面を有していてよく、アレイ内の各光検出器（例えばフォトダイオード）の表面積は、例えば５０μｍ２～９０００μｍ２、例えば７５μｍ２～８０００μｍ２、例えば１００μｍ２～７０００μｍ２、例えば１５０μｍ２～６０００μｍ２、及び２００μｍ２～５０００μｍ２を含む、２５μｍ２～１００００μｍ２の範囲である。
光検出器アレイのサイズは、光の量及び強度、光検出器の数、ならびに所望の感度に応じて変わり得、例えば０．０５ｍｍ～９０ｍｍ、例えば０．１ｍｍ～８０ｍｍ、例えば０．５ｍｍ～７０ｍｍ、例えば１ｍｍ～６０ｍｍ、例えば２ｍｍ～５０ｍｍ、例えば３ｍｍ～４０ｍｍ、例えば４ｍｍ～３０ｍｍ、及び５ｍｍ～２５ｍｍを含む、０．０１ｍｍ～１００ｍｍの範囲の長さを有し得る。光検出器アレイの幅はまた、例えば０．０５ｍｍ～９０ｍｍ、例えば０．１ｍｍ～８０ｍｍ、例えば０．５ｍｍ～７０ｍｍ、例えば１ｍｍ～６０ｍｍ、例えば２ｍｍ～５０ｍｍ、例えば３ｍｍ～４０ｍｍ、例えば４ｍｍ～３０ｍｍ、及び５ｍｍ～２５ｍｍを含む、０．０１ｍｍ～１００ｍｍの範囲で変わり得る。従って、光検出器アレイの活性表面は、例えば０．５ｍｍ２～５０００ｍｍ２、例えば１ｍｍ２～１０００ｍｍ２、例えば５ｍｍ２～５００ｍｍ２、及び１０ｍｍ２～１００ｍｍ２を含む、０．１ｍｍ２～１００００ｍｍ２の範囲であり得る。
対象の光検出器は、例えば２つ以上の波長、例えば５つ以上の異なる波長、例えば１０個以上の異なる波長、例えば２５個以上の異なる波長、例えば５０個以上の異なる波長、例えば１００個以上の異なる波長、例えば２００個以上の異なる波長、例えば３００個以上の異なる波長、及び４００個以上の異なる波長で流体ストリーム内の試料によって発せられる光を測定することを含む、１つ以上の波長で収集された光を測定するように構成されている。
いくつかの実施形態では、光検出器は、波長の範囲（例えば、２００ｎｍ～１０００ｎｍ）にわたって収集された光を測定するように構成されている。ある特定の実施形態では、対象の光検出器は、ある範囲の波長にわたって光のスペクトルを収集するように構成されている。例えば、システムは、２００ｎｍ～１０００ｎｍの波長範囲のうちの１つ以上にわたって光のスペクトルを収集するように構成されている１つ以上の検出器を含み得る。さらに他の実施形態では、対象の検出器は、１つ以上の特定の波長で流体ストリーム内の試料からの光を測定するように構成されている。例えば、システムは、４５０ｎｍ、５１８ｎｍ、５１９ｎｍ、５６１ｎｍ、５７８ｎｍ、６０５ｎｍ、６０７ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６６０ｎｍ、６６７ｎｍ、６７０ｎｍ、６６８ｎｍ、６９５ｎｍ、７１０ｎｍ、７２３ｎｍ、７８０ｎｍ、７８５ｎｍ、６４７ｎｍ、６１７ｎｍ、及びこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上で光を測定するように構成されている１つ以上の検出器を含んでもよい。
光検出システムは、連続的に、または別個の間隔で光を測定するように構成されている。いくつかの事例では、対象の光検出器は、収集された光の測定を連続的に行うように構成されている。他の事例では、光検出システムは、０．００１ミリ秒毎、０．０１ミリ秒毎、０．１ミリ秒毎、１ミリ秒毎、１０ミリ秒毎、１００ミリ秒毎、及び１０００ミリ秒毎を含む、または何らかの他の間隔毎に光を測定するなど、個別の間隔で測定するように構成されている。
実施形態では、システムは照射された試料からの光を分析し、流体ストリーム内の細胞の画像マスクをリアルタイムに生成するように構成されており、試料からの細胞が生成された画像マスクに基づいて選別され得る。対象となるシステムは、本明細書に記載されている方法を実施するためのシステムの完全な自動化、または部分的な自動化のための１または複数台以上のコンピュータが含まれるコンピュータ制御システムを含み得る。いくつかの実施形態では、システムは、コンピュータプログラムを自身に記憶したコンピュータ可読記憶媒体を有するコンピュータを含み、コンピュータプログラムは、コンピュータにロードされると、流体ストリーム内の試料を含有するフローセルを光源で照射し、複数の光検出器を有する光検出システムによってフローセルからの光を検出するための命令と、流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成するための命令と、生成された画像マスクに基づいて試料中の細胞を選別するための命令とを含む。
いくつかの実施形態では、システムは、コンピュータプログラムを自身に記憶したコンピュータ可読記憶媒体を有するコンピュータを含み、コンピュータプログラムは、コンピュータにロードされると、検出光から流体ストリーム内の細胞の画像を生成するための命令をさらに含む。画像は、検出された光吸収、検出された光散乱、検出された光放射、またはそれらの任意の組み合わせから生成され得る。ある特定の実施形態では、流体ストリーム内の細胞の画像は、グレースケール画像である。いくつかの事例では、グレースケール画像は、例えば、明視野光検出器からなど、試料から検出された光吸収から主題のシステムによって生成される。これらの事例では、グレースケール画像は、流体ストリーム内の細胞からの明視野画像データに基づいて生成される。他の事例では、グレースケール画像は、側方散乱検出器、前方散乱検出器、または側方散乱検出器と前方散乱検出器との組み合わせなど、試料から検出された光散乱から主題のシステムによって生成される。これらの事例では、グレースケール画像は、散乱光画像データに基づいて生成される。さらに他の事例では、グレースケール画像は、試料に添加された蛍光物質からの光など、試料からの光放射から主題のシステムによって生成される。これらの事例では、グレースケール画像は、蛍光画像データ（すなわち、細胞上または細胞中の蛍光成分からの撮像データ）に基づいて生成される。さらに他の事例では、グレースケール画像は、検出された光吸収、検出された光散乱、及び検出された光放射の組み合わせから主題のシステムによって生成される。
実施形態では、システムは、コンピュータプログラムを自身に記憶したコンピュータ可読記憶媒体を有するコンピュータを含み、コンピュータプログラムは、コンピュータにロードされると、グレースケール画像から画素強度閾値を決定するための命令をさらに含む。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは命令を含み、プロセッサによって実行されると、プロセッサに、グレースケール画像のクラス内分散を最小化し、最小化されたクラス内分散（またはクラス間分散が最大となる）に基づいて画素強度閾値を計算することにより画素強度閾値を決定させる。
システムは、グレースケール画像の各画素と決定された強度閾値とを比較するための命令と、各画素を２値の画素値に変換するための命令とを有するメモリを含む。いくつかの実施形態では、メモリは、グレースケール画像内の各水平列に沿って各々の画素と決定された強度閾値とを比較するための命令を含む。いくつかの事例では、メモリは、グレースケール画像の左側からグレースケール画像の右側へ各々の画素と決定された強度閾値とを比較するための命令を含む。他の事例では、メモリは、グレースケール画像の右側からグレースケール画像の左側へ各々の画素と、決定された強度閾値とを比較するための命令を含む。他の実施形態では、メモリは、グレースケール画像内の各垂直列に沿って各々の画素を決定された強度閾値と比較するための命令を含む。いくつかの事例では、メモリは、グレースケール画像の最上部からグレースケール画像の最下部へと各垂直列に沿って、各々の画素と決定された強度閾値とを比較するための命令を含む。他の事例では、メモリは、グレースケール画像の最下部からグレースケール画像の最上部へと各垂直列に沿って、各々の画素と決定された強度閾値とを比較するための命令を含む。
検出された光のタイプに応じて、各画素には、２値化された画素値の１または２値化された画素値の０が割り当てられる。一実施例では、システムは、流体ストリームから光吸収（例えば、明視野画像データ）を検出するための命令と、画素強度が強度閾値未満の場合は２値化された画素値の１を、グレースケール画像の画素強度が強度閾値よりも大きい場合は２値化された画素値の０をグレースケール画像の各画素に割り当てるための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。他の実施例では、システムは、流体ストリーム内の細胞から光散乱を検出するための命令と、画素強度が強度閾値よりも大きい場合は２値化された画素値の１を、画素強度が強度閾値未満の場合は２値化された画素値の０をグレースケール画像の各画素に割り当てるための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。さらに他の実施例では、システムは、流体ストリーム内の細胞から蛍光を検出するための命令と、画素強度が強度閾値よりも大きい場合は２値化された画素値の１を、画素強度が強度閾値未満の場合は２値化された画素値の０をグレースケール画像の各画素に割り当てるための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。
２値化された画素値がグレースケール画像の各画素に水平列にわたって主題のシステムによって割り当てられる場合、いくつかの実施形態では、システムは、２値化された画素値が１である水平列中の最初の画素をさらに決定するための命令と、２値化された画素値が１である水平列中の最後の画素をさらに決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。一実施例では、システムは、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の左側から最初の画素を決定するための命令と、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の左側から最後の画素を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。他の実施例では、システムは、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の右側から最初の画素を決定するための命令と、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の右側から最後の画素を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。他の実施形態では、システムは、２値化された画素値が０である水平列中の最初の画素をさらに決定するための命令と２値化された画素値が０である水平列中の最後の画素を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。一実施例では、システムは、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の左側から最初の画素を決定するための命令と、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の左側から最後の画素を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。他の実施例では、システムは、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の右側から最初の画素を決定するための命令と、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の右側から最後の画素を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。
２値化された画素値がグレースケール画像の各画素に垂直列に沿って割り当てられる場合、いくつかの実施形態では、システムは、２値化された画素値が１である最初の画素を垂直列に沿ってさらに決定するための命令と、２値化された画素値が１である最後の画素を垂直列に沿ってさらに決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。一実施例では、システムは、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最上部から最初の画素を決定するための命令と、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最上部から最後の画素を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。他の実施例では、システムは、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最下部から最初の画素を決定するための命令と、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最下部から最後の画素を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。他の実施形態では、システムは、２値の画素値が０である最初の画素を垂直列に沿ってさらに決定する命令と、２値の画素値が０である最後の画素を垂直列に沿ってさらに決定する命令とを含む。一実施例では、システムは、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最上部から最初の画素を決定するための命令と、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最上部から最後の画素を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。他の実施例では、システムは、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最下部から最初の画素を決定するための命令と、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最下部から最後の画素を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。
いくつかの実施形態では、システムは、コンピュータプログラムを自身に記憶したコンピュータ可読記憶媒体を有するコンピュータを含み、コンピュータプログラムは、コンピュータにロードされると、画像マスクの画像モーメントを計算するための命令をさらに含む。いくつかの事例では、システムは、画像マスクから画像モーメントを以下に従って算出するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。
Figure 2022528323000046
ここで、ｍは、画像マスクのｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、画像マスクのｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
ある特定の実施形態では、システムは、生成された画像マスクに基づいて、流体ストリーム内の細胞の１つ以上の性質を決定するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。例えば、システムは、画像マスクに基づいて、細胞のサイズ、細胞の質量中心、または細胞の偏心を決定するための命令を含むコンピュータプログラムを含んでもよい。これらの実施形態では、システムは、画像マスクの１つ以上の画像モーメントを計算するための命令と、画像マスクと計算された画像モーメントに基づいて細胞の特性を決定するための命令とを含むコンピュータプログラムを含む。
いくつかの事例では、システムは、画像マスクの画像モーメントから質量中心を計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。例えば、質量中心は、画像マスクの画像モーメントから主題のシステムによって以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000047
他の事例では、システムは、画像マスクの画像モーメントから、細胞の配向を計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。例えば、細胞の配向は、画像マスクの画像モーメントから主題のシステムによって以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000048
さらに他の事例では、システムは、画像マスクの画像モーメントから細胞の偏心を計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。例えば、細胞の偏心は、画像マスクの画像モーメントから主題のシステムによって以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000049
いくつかの実施形態では、システムは、コンピュータプログラムを自身に記憶したコンピュータ可読記憶媒体を有するコンピュータを含み、コンピュータプログラムは、コンピュータにロードされると、流体ストリーム内の細胞のマスクされた画像を生成するための命令をさらに含む。これらの実施形態では、マスクされた画像を生成するためにシステムは、画像マスクの各画素値と細胞の画像からの各画素値とを乗算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。マスクされた画像を生成するためにシステムによって使用された細胞の画像は、画像マスクが生成されたグレースケール画像であってもよく、または流体ストリーム内の試料からの検出光（明視野、散乱または放射）から得られた周波数符号化画像データといった細胞の他の画像であってもよい。
いくつかの実施形態では、システムは、マスクされた画像から画像モーメントを計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。いくつかの事例では、システムは、マスクされた画像から画像モーメントを以下に従って計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。
Figure 2022528323000050
ここで、ｍは、マスクされた画像のｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、マスクされた画像のｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
マスクされた画像と計算された画像モーメントとに基づいて、主題のシステムは、例えば、細胞のサイズ、細胞の配向及び細胞の偏心などの細胞の１つ以上の性質を決定するように構成され得る。主題のシステムは、画像マスクとマスクされた画像とを比較して、画像マスクの境界内で光信号の分散を決定するように構成されてもよい。一実施例では、システムは、マスクされた画像の画像モーメントから質量中心を以下に従って計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。
Figure 2022528323000051
他の実施例では、システムは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の配向を以下に従って計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。
Figure 2022528323000052
さらに他の実施例では、システムは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の偏心を以下に従って計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。
Figure 2022528323000053
いくつかの実施形態では、システムは、コンピュータプログラムを自身に記憶したコンピュータ可読記憶媒体を有するコンピュータを含み、コンピュータプログラムは、コンピュータにロードされると、各細胞について画像、画像マスク及びマスクされた画像の２つ以上を比較するための命令をさらに含む。いくつかの事例では、システムは、細胞の画像と画像マスクとを比較するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。他の事例では、システムは、細胞の画像とマスクされた画像とを比較するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。さらに他の事例では、システムは、細胞の画像マスクとマスクされた画像とを比較するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。他の実施形態では、システムは、細胞の２つ以上の異なる画像マスク、細胞の２つ以上の異なる画像、または細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を生成し、且つ比較する命令を含むコンピュータプログラムを含む。
ある特定の実施形態では、システムは、生成された画像、画像マスク、またはマスクされた画像における細胞の１つ以上の特徴について共局在係数を計算するように構成されている。いくつかの事例では、システムは、細胞の２つ以上の異なる画像マスクから共局在係数を計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。他の事例では、システムは、細胞の２つ以上の異なる画像から共局在係数を計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。さらに他の事例では、システムは、細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像から共局在係数を計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。いくつかの実施形態では、システムは、細胞の画像と画像マスクとから共局在係数を計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。他の実施形態では、システムは、細胞の画像とマスクされた画像とから共局在係数を計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。他の実施形態では、システムは、細胞の画像マスクとマスクされた画像とから共局在係数を計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。
いくつかの実施形態では、システムは、コンピュータプログラムを自身に記憶したコンピュータ可読記憶媒体を有するコンピュータを含み、コンピュータプログラムは、コンピュータにロードされると、細胞の特徴について共局在係数を以下に従って計算するための命令をさらに含む。
Figure 2022528323000054
ここで、ｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の画素である。ｙは第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の画素である。バーｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の平均画素値である。バーｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の平均画素値である。
他の実施形態では、システムは、細胞の特徴についての共局在係数を以下に従って計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。
Figure 2022528323000055
その他の実施形態では、システムは、細胞の特徴についての共局在係数を以下に従って計算するための命令を含むコンピュータプログラムを含む。
Figure 2022528323000056
いくつかの実施形態に従う選別システムは、ディスプレイと、オペレータ入力デバイスとを含み得る。オペレータ入力デバイスは、例えば、キーボード、マウスなどであってもよい。処理モジュールは、主題の方法のステップを実行するために、記憶された命令を有するメモリにアクセスするプロセッサを含む。処理モジュールは、オペレーティングシステム、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）コントローラ、システムメモリ、メモリ記憶デバイス、及び入出力コントローラ、キャッシュメモリ、データバックアップユニット、ならびに多くの他のデバイスを含み得る。プロセッサは、市販のプロセッサであり得るか、または利用可能であるか、もしくは利用可能になる他のプロセッサのうちの１つであり得る。プロセッサは、オペレーティングシステムを実行し、オペレーティングシステムは、周知の様式でファームウェア及びハードウェアとインターフェースし、当技術分野で既知のように、Ｊａｖａ、Ｐｅｒｌ、Ｃ＋＋、他の高レベルまたは低レベル言語、ならびにそれらの組み合わせなどの様々なプログラミング言語で書かれ得る様々なコンピュータプログラムの機能をプロセッサが調整し、かつ実行することを容易にする。オペレーティングシステムは、通常、プロセッサと協働して、コンピュータの他の構成要素の機能を調整し、実行する。オペレーティングシステムはまた、すべて既知の技術に従って、スケジューリング、入出力制御、ファイル及びデータ管理、メモリ管理、ならびに通信制御及び関連サービスを提供する。プロセッサは、任意の好適なアナログまたはデジタルシステムであり得る。いくつかの実施形態では、プロセッサは、例えば、負帰還制御などのフィードバック制御を提供するアナログ電子機器を含む。
システムメモリは、様々な既知または将来のメモリ記憶デバイスのいずれかであり得る。例としては、任意の一般的に入手可能なランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、常駐ハードディスクもしくはテープなどの磁気媒体、リードライトコンパクトディスクなどの光学媒体、フラッシュメモリデバイス、または他のメモリ記憶デバイスが挙げられる。メモリ記憶デバイスは、コンパクトディスクドライブ、テープドライブ、リムーバブルハードディスクドライブ、またはディスケットドライブを含む、様々な既知または将来のデバイスのいずれかであり得る。そのようなタイプのメモリ記憶デバイスは、通常、それぞれ、コンパクトディスク、磁気テープ、リムーバブルハードディスク、または磁気ディスクなどのプログラム記憶媒体（図示せず）から読み出し、且つ／またはプログラム記憶媒体に書き込む。これらのプログラム記憶媒体のいずれか、または現在使用されている、もしくは後に開発され得る他のものは、コンピュータプログラム製品とみなされ得る。理解されるように、これらのプログラム記憶媒体は、通常、コンピュータソフトウェアプログラム及び／またはデータを記憶する。コンピュータ制御ロジックとも呼ばれるコンピュータソフトウェアプログラムは、通常、システムメモリ、及び／またはメモリ記憶デバイスと併せて使用されるプログラム記憶デバイスに記憶される。
いくつかの実施形態では、コンピュータプログラム製品は、その中に記憶された制御ロジック（プログラムコードを含むコンピュータソフトウェアプログラム）を有するコンピュータ使用可能媒体を備えて記載される。制御ロジックは、コンピュータのプロセッサによって実行されると、プロセッサに、本明細書に記載された機能を実行させる。他の実施形態では、いくつかの機能は、例えば、ハードウェアステートマシンを使用して、主にハードウェア内に実装される。本明細書に記載される機能を実行するためのハードウェアステートマシンの実装は、関連技術分野の当業者には明らかである。
メモリは、磁気、光学、またはソリッドステート記憶デバイス（磁気もしくは光学ディスク、またはテープ、またはＲＡＭ、または固定型もしくは携帯型のいずれかの任意の他の好適なデバイスを含む）などの、プロセッサがデータを記憶し、取り出すことができる任意の好適なデバイスであり得る。プロセッサは、必要なプログラムコードを担持するコンピュータ可読記憶媒体から好適にプログラムされている汎用デジタルマイクロプロセッサを含み得る。プログラミングは、通信チャネルを介してプロセッサにリモートで提供され得るか、またはメモリまたは何らかの他の携帯型もしくは固定型のコンピュータ可読記憶媒体などのコンピュータプログラム製品に、メモリと一緒にそれらのデバイスのいずれかを使用して、あらかじめ保存され得る。例えば、磁気ディスクまたは光学ディスクは、プログラミングを担持し得、ディスクライタ／リーダによって読み取ることができる。本発明のシステムは、例えば、コンピュータプログラム製品の形態のプログラミング、上記の方法を実施する際に使用するためのアルゴリズムも含む。本発明によるプログラミングは、コンピュータ可読記憶媒体、例えば、コンピュータによって直接読み取り且つアクセスすることができる任意の媒体に記録され得る。そのような媒体としては、以下に限定されないが、磁気ディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体、ＣＤ－ＲＯＭなどの光学記憶媒体、ＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気記憶媒体、ポータブルフラッシュドライブ、ならびに磁気／光学記憶媒体などのこれらのカテゴリのハイブリッドが挙げられる。
プロセッサはまた、リモート位置でユーザーと通信するための通信チャネルへのアクセスを有し得る。リモート位置とは、ユーザーがシステムと直接接触せず、広域ネットワーク（「ＷＡＮ」）、電話ネットワーク、衛星ネットワーク、または携帯電話（すなわち、スマートフォン）を含む任意の他の好適な通信チャネルに接続されたコンピュータなどの外部デバイスから入力マネージャに入力情報を中継することを意味する。
いくつかの実施形態では、本開示によるシステムは、通信インターフェースを含むように構成され得る。いくつかの実施形態では、通信インターフェースは、ネットワーク及び／または別のデバイスと通信するための受信機及び／または送信機を含む。通信インターフェースは、以下に限定されないが、無線周波数（ＲＦ）通信（例えば、無線周波数識別（ＲＦＩＤ））、Ｚｉｇｂｅｅ通信プロトコル、ＷｉＦｉ、赤外線、無線ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、超広帯域（ＵＷＢ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）通信プロトコル、及び符号分割多元接続（ＣＤＭＡ）またはモバイル通信のためのグローバルシステム（ＧＳＭ）などのセルラー通信を含む、有線または無線通信のために構成され得る。
一実施形態では、通信インターフェースは、主題のシステムと、同様の補完的データ通信のために構成されるコンピュータ端末（例えば、診療所または病院環境における）などの他の外部デバイスとの間のデータ通信を可能にするために、例えば、ＵＳＢポート、ＲＳ－２３２ポート、または任意の他の好適な電気接続ポートなどの物理ポートまたはインターフェースなど、１つ以上の通信ポートを含むように構成される。
一実施形態では、通信インターフェースは、赤外線通信、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）通信、または任意の他の好適な無線通信プロトコルのために構成され、主題のシステムが、コンピュータ端末及び／またはネットワーク、通信可能な携帯電話、パーソナルデジタルアシスタント、またはユーザーが併せて使用し得る任意の他の通信デバイスなど、他のデバイスと通信することを可能にする。
一実施形態では、通信インターフェースは、携帯電話ネットワーク、ショートメッセージサービス（ＳＭＳ）、インターネットに接続されたローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）上のパーソナルコンピュータ（ＰＣ）への無線接続、またはＷｉＦｉホットスポットでのインターネットへのＷｉＦｉ接続を介して、インターネットプロトコル（ＩＰ）を利用するデータ転送のための接続を提供するように構成される。
一実施形態では、主題のシステムは、例えば、８０２．１１もしくはＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）ＲＦプロトコル、またはＩｒＤＡ赤外線プロトコルなどの共通標準を使用して、通信インターフェースを介してサーバデバイスと無線で通信するように構成される。サーバデバイスは、スマートフォン、パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）もしくはノートブックコンピュータなどの別のポータブルデバイス、またはデスクトップコンピュータ、アプライアンスなどのより大きなデバイスであってもよい。いくつかの実施形態では、サーバデバイスは、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などのディスプレイ、ならびにボタン、キーボード、マウス、またはタッチスクリーンなどの入力デバイスを有する。
いくつかの実施形態では、通信インターフェースは、上述の通信プロトコル及び／または機構のうちの１つ以上を使用して、ネットワークまたはサーバデバイスと、主題のシステム内、例えば、任意のデータ記憶ユニット内に記憶されたデータを自動的または半自動で通信するように構成される。
出力コントローラは、人間であろうと機械であろうと、ローカルであろうとリモートであろうと、ユーザーに情報を提示するための様々な既知の表示デバイスのいずれかのためのコントローラを含み得る。表示デバイスのうちの１つが視覚情報を提供する場合、この情報は、通常、ピクセルのアレイとして論理的及び／または物理的に編成され得る。グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）コントローラは、システムとユーザーとの間にグラフィカル入力及び出力インターフェースを提供するための、及びユーザー入力を処理するための、様々な既知または将来のソフトウェアプログラムのいずれかを含み得る。コンピュータの機能要素は、システムバスを介して互いに通信し得る。これらの通信のいくつかは、ネットワークまたは他のタイプのリモート通信を使用して代替の実施形態で達成され得る。出力マネージャはまた、既知の技術に従って、例えば、インターネット、電話、または衛星ネットワークを介して、リモート位置でユーザーに、処理モジュールによって生成された情報を提供し得る。出力マネージャによるデータの提示は、様々な既知の技術に従って実施され得る。いくつかの例として、データは、ＳＱＬ、ＨＴＭＬ、もしくはＸＭＬドキュメント、電子メールもしくは他のファイル、または他の形態のデータを含み得る。データは、ユーザーが追加のＳＱＬ、ＨＴＭＬ、ＸＭＬ、または他のドキュメントもしくはデータをリモートソースから取り出すことができるように、インターネットＵＲＬアドレスを含み得る。主題のシステム内に存在する１つ以上のプラットフォームは、通常、一般的にサーバと呼ばれるコンピュータのクラスのものであるが、任意のタイプの既知のコンピュータプラットフォームまたは将来開発されるタイプであってもよい。また一方、それらは、メインフレームコンピュータ、ワークステーション、または他のコンピュータタイプであってもよい。それらは、任意の既知または将来のタイプのケーブル配線、またはネットワーク化されているか、またはされていないかのいずれかの無線システムを含む、他の通信システムを介して接続され得る。それらは、同一場所に配置され得るか、または物理的に分離され得る。場合により、選択されたコンピュータプラットフォームのタイプ及び／または構成に応じて、様々なオペレーティングシステムが、コンピュータプラットフォームのいずれかで採用され得る。適切なオペレーティングシステムとしては、Ｗｉｎｄｏｗｓ １０、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＸＰ、Ｗｉｎｄｏｗｓ ７、Ｗｉｎｄｏｗｓ ８、ｉＯＳ、Ｓｕｎ Ｓｏｌａｒｉｓ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、ＯＳ／４００、Ｃｏｍｐａｑ Ｔｒｕ６４ Ｕｎｉｘ、ＳＧＩ ＩＲＩＸ、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｒｅｌｉａｎｔ Ｕｎｉｘ、Ｕｂｕｎｔｕ、Ｚｏｒｉｎ ＯＳなどが挙げられる。
ある特定の実施形態では、主題のシステムは、試料に照射された光（例えばレーザから）もしくは試料から収集された光（例えば、散乱光、蛍光）といった光を調整するための１つ以上の光学調整部品を含む。例えば、光学調整は、光の寸法、光の焦点距離を増加すること、または光をコリメートすることであり得る。いくつかの例では、光学調整は、例えば、１０％以上、例えば、２５％以上、例えば、５０％以上、及び７５％以上寸法を増加させることを含む、５％以上寸法を増加させることなど、光（例えば、ビームスポット）の寸法を増加させるための拡大プロトコルである。他の実施形態では、光学調整は、例えば、１０％以上、例えば、２５％以上、例えば、５０％以上、及び７５％以上ビームスポットの寸法を低減することを含む、５％以上光の寸法を低減するように光を集束させることを含む。特定の実施形態では、光学調整は、光をコリメートすることを含む。「コリメート」という用語は、光伝播のコリニアリティを光学的に調整すること、または、光による共通の伝播軸からの発散を低減することを言及するために、一般的な意味で使用される。いくつかの例では、コリメートすることは、光ビームの空間断面を狭める（例えば、レーザのビームプロファイルを低減する）ことを含む。
いくつかの実施形態では、光学調整部品は、例えば、０．２～０．９の倍率、例えば、０．３～０．８５の倍率、例えば、０．３５～０．８の倍率、例えば、０．５～０．７５の倍率、及び、０．５５～０．７の倍率、例えば、０．６の倍率を含む、０．１～０．９５の倍率を有する集束レンズを含む。例えば、集束レンズは、特定の例では、約０．６の倍率を有する二重色消し縮小レンズである。集束レンズの焦点距離は、例えば、６ｍｍ～１９ｍｍ、例えば、７ｍｍ～１８ｍｍ、例えば、８ｍｍ～１７ｍｍ、例えば、９ｍｍ～１６、及び１０ｍｍ～１５ｍｍの範囲の焦点距離を含む、５ｍｍ～２０ｍｍの範囲で変わり得る。特定の実施形態では、集束レンズは、約１３ｍｍの焦点距離を有する。
他の実施形態では、光学調整部品は、コリメータである。コリメータは、１つ以上のミラーもしくは湾曲レンズ、またはそれらの組み合わせなど、任意の好都合なコリメーティングプロトコルであり得る。例えば、コリメータは、特定の例では、単一のコリメーティングレンズである。他の例では、コリメータは、コリメーティングミラーである。さらに他の例では、コリメータは、２つのレンズを含む。さらに他の例では、コリメータは、ミラーと、レンズとを含む。コリメータが１つ以上のレンズを含む場合、コリメーティングレンズの焦点距離は、例えば、６ｍｍ～３７．５ｍｍ、例えば、７ｍｍ～３５ｍｍ、例えば、８ｍｍ～３２．５ｍｍ、例えば、９ｍｍ～３０ｍｍ、例えば、１０ｍｍ～２７．５ｍｍ、例えば、１２．５ｍｍ～２５ｍｍ、及び１５ｍｍ～２０ｍｍの範囲の焦点距離を含む、５ｍｍ～４０ｍｍの範囲で変わり得る。
いくつかの実施形態では、主題のシステムは、フローセルノズルを通って流体ストリームを流れさせるように構成されたノズルオリフィスを有するフローセルノズルを含む。主題のフローセルノズルは、流体試料を試料検査領域に伝播させるオリフィスを含み、いくつかの実施形態では、フローセルノズルは、長手方向軸を画定する近位円筒形部分と、長手方向軸に対して横方向である、ノズルオリフィスを有する平坦な表面で終端する遠位円錐台形部分とを含む。近位円筒形部分の長さ（長手方向軸に沿って測定される）は、例えば、１．５ｍｍ～１２．５ｍｍ、例えば、２ｍｍ～１０ｍｍ、例えば、３ｍｍ～９ｍｍ、及び４ｍｍ～８ｍｍを含む、１ｍｍ～１５ｍｍの範囲で変わり得る。遠位円錐台形部分の長さ（長手方向軸に沿って測定される）も同様に、例えば、２ｍｍ～９ｍｍ、例えば、３ｍｍ～８ｍｍ、及び４ｍｍ～７ｍｍを含む、１ｍｍ～１０ｍｍの範囲で変わり得る。フローセルノズルチャンバの直径は、いくつかの実施形態では、例えば、２ｍｍ～９ｍｍ、例えば、３ｍｍ～８ｍｍ、及び４ｍｍ～７ｍｍを含む、１ｍｍ～１０ｍｍの範囲で変わり得る。
特定の例では、ノズルチャンバは、円筒形部分を含まず、フローセルノズルチャンバ全体が円錐台形に形成される。これらの実施形態では、円錐台形ノズルチャンバの長さ（ノズルオリフィスに対して横方向の長手方向軸に沿って測定される）は、例えば、１．５ｍｍ～１２．５ｍｍ、例えば、２ｍｍ～１０ｍｍ、例えば、３ｍｍ～９ｍｍ、及び４ｍｍ～８ｍｍを含む、１ｍｍ～１５ｍｍの範囲であり得る。円錐台形ノズルチャンバの近位部分の直径は、例えば、２ｍｍ～９ｍｍ、例えば、３ｍｍ～８ｍｍ、及び４ｍｍ～７ｍｍを含む、１ｍｍ～１０ｍｍの範囲であり得る。
実施形態では、試料流体ストリームは、フローセルノズルの遠位端でオリフィスから発生する。流体ストリームの所望の特性に応じて、フローセルノズルオリフィスは、任意の好適な形状であり得、対象の断面形状としては、以下に限定されないが、例えば、正方形、長方形、台形、三角形、六角形などの直線断面形状、例えば、円形、楕円形などの曲線断面形状、ならびに、例えば、平面状の上部に結合された放物線状の底部などの不規則形状が挙げられる。特定の実施形態では、対象のフローセルノズルは、円形オリフィスを有する。ノズルオリフィスのサイズは、いくつかの実施形態では、例えば、２μｍ～１７５００μｍ、例えば、５μｍ～１５０００μｍ、例えば、１０μｍ～１２５００μｍ、例えば、１５μｍ～１００００μｍ、例えば、２５μｍ～７５００μｍ、例えば、５０μｍ～５０００μｍ、例えば、７５μｍ～１０００μｍ、例えば、１００μｍ～７５０μｍ、及び１５０μｍ～５００μｍを含む、１μｍ～２００００μｍの範囲で変わり得る。特定の実施形態では、ノズルオリフィスは、１００μｍである。
いくつかの実施形態では、フローセルノズルは、試料をフローセルノズルに提供するように構成された試料注入ポートを含む。実施形態では、試料注入システムは、フローセルノズルチャンバに試料の好適な流れを提供するように構成される。流体ストリームの所望の特性に応じて、試料注入ポートによってフローセルノズルチャンバに搬送される試料の速度は、例えば、２μＬ／秒以上、例えば、３μＬ／秒以上、例えば、５μＬ／秒以上、例えば、１０μＬ／秒以上、例えば、１５μＬ／秒以上、例えば、２５μＬ／秒以上、例えば、５０μＬ／秒以上、例えば、１００μＬ／秒以上、例えば、１５０μＬ／秒以上、例えば、２００μＬ／秒以上、例えば、２５０μＬ／秒以上、例えば、３００μＬ／秒以上、例えば、３５０μＬ／秒以上、例えば、４００μＬ／秒以上、例えば、４５０μＬ／秒以上、及び５００μＬ／秒以上を含む、１μＬ／秒以上であり得る。例えば、試料の流量は、例えば、２μＬ／秒～約４５０μＬ／秒、例えば、３μＬ／秒～約４００μＬ／秒、例えば、４μＬ／秒～約３５０μＬ／秒、例えば、５μＬ／秒～約３００μＬ／秒、例えば、６μＬ／秒～約２５０μＬ／秒、例えば、７μＬ／秒～約２００μＬ／秒、例えば、８μＬ／秒～約１５０μＬ／秒、例えば、９μＬ／秒～約１２５μＬ／秒、及び１０μＬ～約１００μＬ／秒を含む、１μＬ／秒～約５００μＬ／秒の範囲であり得る。
試料注入ポートは、ノズルチャンバの壁内に位置付けられたオリフィスであり得るか、またはノズルチャンバの近位端に位置付けられた導管であり得る。試料注入ポートがノズルチャンバの壁内に位置付けられたオリフィスである場合、試料注入ポートオリフィスは、任意の好適な形状であり得、対象の断面形状としては、以下に限定されないが、例えば、正方形、長方形、台形、三角形、六角形などの直線断面形状、例えば、円形、楕円形などの曲線断面形状、ならびに、例えば、平面状の上部に結合された放物線状の底部などの不規則形状が挙げられる。特定の実施形態では、試料注入ポートは、円形オリフィスを有する。試料注入ポートオリフィスのサイズは、形状に応じて変わり得、特定の例では、例えば、０．２～３．０ｍｍ、例えば、０．５ｍｍ～２．５ｍｍ、例えば、０．７５ｍｍ～２．２５ｍｍ、例えば、１ｍｍ～２ｍｍ、及び１．２５ｍｍ～１．７５ｍｍ、例えば、１．５ｍｍを含む、０．１ｍｍ～５．０ｍｍの範囲の開口部を有する。
特定の実施例では、例えば、試料注入ポートは、フローセルノズルチャンバの近位端に位置付けられた導管である。例えば、試料注入ポートが、フローセルノズルオリフィスと一列に並んだ試料注入ポートのオリフィスを有するように位置づけられた導管であり得る。試料注入ポートが、フローセルノズルオフィスと一列に並んで位置付けられた導管である場合、試料注入管の断面形状は、任意の好適な形状であり得、対象の断面形状としては、以下に限定されないが、例えば、正方形、長方形、台形、三角形、六角形などの直線断面形状、例えば、円形、楕円形などの曲線断面形状、ならびに、例えば、平面状の上部に結合された放物線状の底部などの不規則形状が挙げられる。導管のオリフィスのサイズは、形状に応じて変わり得、特定の例では、例えば、０．２ｍｍ～３．０ｍｍ、例えば、０．５ｍｍ～２．５ｍｍ、例えば、０．７５ｍｍ～２．２５ｍｍ、例えば、１ｍｍ～２ｍｍ、及び１．２５ｍｍ～１．７５ｍｍ、例えば、１．５ｍｍを含む、０．１ｍｍ～５．０ｍｍの範囲の開口部を有する。試料注入ポートの先端部の形状は、試料注入管の断面形状と同じであるか、または異なってもよい。例えば、試料注入ポートのオリフィスは、例えば、２°～９°、例えば、３°～８°、例えば、４°～７°、及び５°のベベル角を含む、１°～１０°の範囲のベベル角を有する傾斜した先端部を含み得る。
いくつかの実施形態では、フローセルノズルは、フローセルノズルにシース流体を提供するように構成されているシース流体注入ポートも含む。実施形態では、シース流体注入システムは、例えば、試料と併せて、シース流体の流れをフローセルノズルチャンバに提供して、試料流体ストリームを取り囲むシース流体の積層流体ストリームを生じるように構成される。流体ストリームの所望の特性に応じて、フローセルノズルチャンバに搬送されるシース流体の速度は、例えば、５０μＬ／秒以上、例えば、７５μＬ／秒以上、例えば、１００μＬ／秒以上、例えば、２５０μＬ／秒以上、例えば、５００μＬ／秒以上、例えば、７５０μＬ／秒以上、例えば、１０００μＬ／秒以上、及び２５００μＬ／秒以上を含む、２５μＬ／秒以上であり得る。例えば、シース流体の流量は、例えば、２μＬ／秒～約４５０μＬ／秒、例えば、３μＬ／秒～約４００μＬ／秒、例えば、４μＬ／秒～約３５０μＬ／秒、例えば、５μＬ／秒～約３００μＬ／秒、例えば、６μＬ／秒～約２５０μＬ／秒、例えば、７μＬ／秒～約２００μＬ／秒、例えば、８μＬ／秒～約１５０μＬ／秒、例えば、９μＬ／秒～約１２５μＬ／秒、及び１０μＬ／秒～約１００μＬ／秒を含む、１μＬ／秒～約５００μＬ／秒の範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、シース流体注入ポートは、ノズルチャンバの壁内に位置付けられたオリフィスである。シース流体注入ポートのオリフィスは、任意の好適な形状であり得、対象の断面形状としては、以下に限定されないが、例えば、正方形、長方形、台形、三角形、六角形などの直線断面形状、例えば、円形、楕円形などの曲線断面形状、ならびに、例えば、平面状の上部に結合された放物線状の底部などの不規則形状が挙げられる。試料注入ポートオリフィスのサイズは、形状に応じて変わり得、特定の例では、例えば、０．２～３．０ｍｍ、例えば、０．５ｍｍ～２．５ｍｍ、例えば、０．７５ｍｍ～２．２５ｍｍ、例えば、１ｍｍ～２ｍｍ、及び１．２５ｍｍ～１．７５ｍｍ、例えば、１．５ｍｍを含む、０．１ｍｍ～５．０ｍｍの範囲の開口部を有する。
特定の実施例では、主題のシステムは、フローセルノズルオリフィスと流体連通する試料検査領域を含む。これらの実施例では、試料流体ストリームは、フローセルノズルの遠位端でオリフィスから発生し、流体ストリーム内の粒子は試料検査領域において、光源で照射され得る。検査領域のサイズは、ノズルオリフィスのサイズ及び試料注入ポートのサイズなど、フローノズルの特性に応じて変わり得る。実施形態では、検査領域は、例えば０．０５ｍｍ以上、例えば０．１ｍｍ以上、例えば０．５ｍｍ以上、例えば１ｍｍ以上、例えば２ｍｍ以上、例えば３ｍｍ以上、例えば５ｍｍ以上及び１０ｍｍ以上を含む、０．０１ｍｍ以上の幅を有してもよい。検査領域の長さも変わり得、いくつかの例では、例えば、０．１ｍｍ以上、例えば、０．５ｍｍ以上、例えば、１ｍｍ以上、例えば、１．５ｍｍ以上、例えば、２ｍｍ以上、例えば、３ｍｍ以上、例えば、５ｍｍ以上、例えば、１０以上、例えば、１５ｍｍ以上、例えば、２０ｍｍ以上、例えば、２５ｍｍ以上、及び５０ｍｍ以上を含む、０．０１ｍｍ以上に沿った範囲で変わり得る。
検査領域は、発生する流体ストリームの平面断面の照射を容易にするように構成され得るか、または所定の長さの拡散場（例えば、拡散レーザまたはランプによる）の照射を容易にするように構成され得る。いくつかの実施形態では、検査領域は、例えば、１ｍｍ以上、例えば、２ｍｍ以上、例えば、３ｍｍ以上、例えば、４ｍｍ以上、例えば、５ｍｍ以上、及び１０ｍｍ以上などの、発生する流体ストリームの所定の長さの照射を容易にする透明窓を含む。発生する流体ストリームを照射するために使用される光源に応じて（後述するように）、検査領域は、例えば、１５０ｎｍ～１４００ｎｍ、例えば、２００ｎｍ～１３００ｎｍ、例えば、２５０ｎｍ～１２００ｎｍ、例えば、３００ｎｍ～１１００ｎｍ、例えば、３５０ｎｍ～１０００ｎｍ、例えば、４００ｎｍ～９００ｎｍ、及び５００ｎｍ～８００ｎｍを含む、１００ｎｍ～１５００ｎｍの範囲の光を通過させるように構成され得る。従って、検査領域は、所望の範囲の波長を通過させる任意の透明な材料から形成され得、そのような材料として、以下に限定されないが、光学ガラス、ホウケイ酸ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、紫外線クォーツ、赤外線クォーツ、サファイア、ならびに、例えば、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリウレタン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリイミド、または他の高分子プラスチック材料の中でも、ポリエステルを含む、ＰＥＴＧ（グリコール変性ポリエチレンテレフタレート）などのこれらの熱可塑性プラスチックのコポリマーが挙げられ、ポリエステルとしては、以下に限定されないが、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ボトルグレードＰＥＴ（モノエチレングリコール、テレフタル酸、及びイソフタル酸、シクロヘキサンジメタノールなどの他のコモノマーに基づいて作られたコポリマー）、ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＢＴ）、及びポリ（ヘキサメチレンテレフタレート）などのポリ（アルキレンテレフタレート）、ポリ（エチレンアジピン酸塩）、ポリ（１，４－ブチレンアジピン酸塩）、及びポリ（ヘキサメチレンアジピン酸塩）などのポリ（アルキレンアジピン酸塩）、ポリ（エチレンスベレート）などのポリ（アルキレンスベレート）、ポリ（エチレンセバケート）などのポリ（アルキレンセバケート）、ポリ（ε－カプロラクトン）及びポリ（β－プロピオラクトン）、ポリ（エチレンイソフタレート）などのポリ（アルキレンイソフタレート）、ポリ（エチレン２，６－ナフタレン－ジカルボキシレート）などのポリ（アルキレン２，６－ナフタレン－ジカルボキシレート）、ポリ（エチレンスルホニル－４，４’－ジベンゾエート）などのポリ（アルキレンスルホニル－４，４’－ジベンゾエート）、ポリ（ｐ－フェニレンエチレンジカルボキシレート）などのポリ（ｐ－フェニレンアルキレンジカルボキシレート）、ポリ（トランス－１，４－シクロヘキサンジイルエチレンジカルボキシレート）などのポリ（トランス－１，４－シクロヘキサンジイルアルキレンジカルボキシレート）、ポリ（１，４－シクロヘキサン－ジメチレンエチレンジカルボキシレート）などのポリ（１，４－シクロヘキサン－ジメチレンアルキレンジカルボキシレート）、ポリ（［２．２．２］－ビシクロオクタン－１，４－ジメチレンエチレンジカルボキシレート）などのポリ（［２．２．２］－ビシクロオクタン－１，４－ジメチレンアルキレンジカルボキシレート）、（Ｓ）－ポリラクチド、（Ｒ，Ｓ）－ポリラクチド、ポリ（テトラメチルグリコリド）、及びポリ（ラクチド－コ－グリコリド）などの乳酸ポリマー及びコポリマー、及びビスフェノールＡ、３，３’－ジメチルビスフェノールＡ、３，３’，５，５’－ｆテトラクロロビスフェノールＡ、３，３’，５，５’－テトラメチルビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリ（ｐ－フェニレンテレフタルアミド）などのポリアミド、例えば、ポリエチレンテレフタレート、例えば、Ｍｙｌａｒ（商標）ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステルなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、主題のシステムは、試料検査領域内に位置付けられたキュベットを含む。実施形態では、キュベットは、例えば、１５０ｎｍ～１４００ｎｍ、例えば、２００ｎｍ～１３００ｎｍ、例えば、２５０ｎｍ～１２００ｎｍ、例えば、３００ｎｍ～１１００ｎｍ、例えば、３５０ｎｍ～１０００ｎｍ、例えば、４００ｎｍ～９００ｎｍ、及び５００ｎｍ～８００ｎｍを含む、１００ｎｍ～１５００ｎｍの範囲の光を通過させ得る。
いくつかの実施形態では、主題のシステムは、試料中の細胞を選別するための粒子選別構成要素を含む。ある特定の例では、粒子選別構成要素は、２０１７年３月２８日に出願された米国特許公開第２０１７／０２９９４９３号及び２０１８年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７５２，７９３号に記載されるものなど、粒子選別モジュールであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、粒子選別構成要素は、２０１７年６月１４日に出願された米国特許公開第２０１８／００９５０２２号に記載されるものなど、１つ以上の液滴デフレクタを含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、主題のシステムは、試料中の粒子（例えば、生体試料中の細胞）を分析し、選別するための上述の重み付き最小二乗アルゴリズムを採用するフローサイトメトリシステムである。好適なフローサイトメトリシステムは、これらに限定されないが、Ｏｒｍｅｒｏｄ（ｅｄ．）、フローサイトメトリ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｎｏ．９１，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ（１９９５）；Ｖｉｒｇｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊａｎ；４９（ｐｔ１）：１７－２８；Ｌｉｎｄｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍ Ｈｅｍｏｓｔ．２００４ Ｏｃｔ；３０（５）：５０２－１１；Ａｌｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２０１０ Ｄｅｃ；２２２（４）：３３５－３４４；及びＨｅｒｂｉｇ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２４（３）：２０３－２５５に記載されているものを含んでもよく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ ｅｔａｌ．ある特定の事例では、対象のフローサイトメトリシステムは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメータ、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメータ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）フローサイトメータ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（商標）フローサイトメータ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標）フローサイトメータ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ（商標）フローサイトメータ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメータ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓ（商標）Ｘ－２０フローサイトメータ、及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）細胞選別機、ａ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣｏｕｎｔ（商標）細胞選別機、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（商標）細胞選別機、及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｉａ（商標）細胞選別機、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｆｌｕｘ（商標）細胞選別機、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｚｚ（商標）細胞選別機、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｒｉａ（商標）細胞選別機、及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（商標）細胞選別機などを含む。
いくつかの実施形態では、主題の粒子選別システムは、例えば、米国特許第１０，００６，８５２号、第９，９５２，０７６号、第９，９３３，３４１号、第９，７８４，６６１号、第９，７２６，５２７号、第９，４５３，７８９号、第９，２００，３３４号、第９，０９７，６４０号、第９，０９５，４９４号、第９，０９２，０３４号、第８，９７５，５９５号、第８，７５３，５７３号、第８，２３３，１４６号、第８，１４０，３００号、第７，５４４，３２６号、第７，２０１，８７５号、第７，１２９，５０５号、第６，８２１，７４０号、第６，８１３，０１７号、第６，８０９，８０４号、第６，３７２，５０６号、第５，７００，６９２号、第５，６４３，７９６号、第５，６２７，０４０号、第５，６２０，８４２号、第５，６０２，０３９号に記載されるものなど、フローサイトメトリシステムであり、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の事例では、主題のシステムは、Ｄｉｅｂｏｌｄ，ｅｔ ａ ｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｖｏｌ．７（１０）；８０６－８１０（２０１３）に記載されるもの、ならびに米国特許第９，４２３，３５３号、第９，７８４，６６１号、及び第１０，００６，８５２号、ならびに米国特許公開第２０１７／０１３３８５７号及び第２０１７／０３５０８０３号に記載されるものなど、高周波タグ付き発光（ＦＩＲＥ）を使用して蛍光撮像によって、流体ストリーム内の粒子を撮像するように構成されているフローサイトメトリシステムであり、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
集積回路デバイス
本開示の態様は、流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成し、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別するようにプログラムされている集積回路デバイスも含む。いくつかの実施形態では、対象の集積回路デバイスは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を含む。他の実施形態では、集積回路デバイスは、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を含む。さらに他の実施形態では、集積回路デバイスは、複合プログラム可能論理デバイス（ＣＰＬＤ）を含む。
いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、検出光から流体ストリーム内の細胞のグレースケール画像を生成するようにプログラムされている。これらの実施形態では、集積回路デバイスは、グレースケール画像から画素強度閾値を決定するようにプログラムされている。いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、グレースケール画像のクラス内分散を最小化し、最小化されたクラス内分散（またはクラス間分散が最大となる）に基づいて画素強度閾値を計算することにより画素強度閾値を決定するようにプログラムされている。
集積回路デバイスは、グレースケール画像の各画素と決定された強度閾値とを比較し、各画素を２値の画素値に変換するようにプログラムされている。いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、グレースケール画像内の各水平列に沿って夫々の画素と決定された強度閾値とを比較するようにプログラムされている。いくつかの事例では、集積回路デバイスは、グレースケール画像の左側からグレースケール画像の右側へ夫々の画素と、決定された強度閾値とを比較するようにプログラムされている。他の事例では、集積回路デバイスは、グレースケール画像の右側からグレースケール画像の左側へ夫々の画素と、決定された強度閾値とを比較するようにプログラムされている。他の実施形態では、集積回路デバイスは、グレースケール画像内の各垂直列に沿った夫々の画素を決定された強度閾値と比較するようにプログラムされている。いくつかの事例では、集積回路デバイスは、グレースケール画像の最上部からグレースケール画像の最下部へと各垂直列に沿って、夫々の画素と決定された強度閾値とを比較するようにプログラムされている。他の事例では、集積回路デバイスは、グレースケール画像の最下部からグレースケール画像の最上部へと各垂直列に沿って、夫々の画素と決定された強度閾値とを比較するようにプログラムされている。
検出された光のタイプに応じて、各画素には、２値化された画素値の１または２値化された画素値の０が集積回路デバイスによって割り当てられる。一実施例では、集積回路デバイスは、画素強度が強度閾値未満の場合は２値化された画素値の１を、グレースケール画像の画素強度が強度閾値よりも大きい場合は２値化された画素値の０をグレースケール画像の各画素に割り当てるようにプログラムされている。他の実施例では、集積回路デバイスは、画素強度が強度閾値よりも大きい場合は２値化された画素値の１を、画素強度が強度閾値未満の場合は２値化された画素値の０をグレースケール画像の各画素に割り当てるようにプログラムされている。
２値化された画素値がグレースケール画像の各画素に水平列にわたって割り当てられる場合、いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、２値化された画素値の１を有する水平列中の最初の画素をさらに決定し、２値化された画素値の１を有する水平列中の最後の画素をさらに決定するようにプログラムされている。一実施例では、集積回路デバイスは、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の左側から最初の画素を決定し、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の左側から最後の画素を決定するようにプログラムされている。他の実施例では、集積回路デバイスは、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の右側から最初の画素を決定し、割り当てられた２値の画素値が１である水平列の右側から最後の画素を決定するようにプログラムされている。他の実施形態では、集積回路デバイスは、２値化された画素値が０である水平列中の最初の画素をさらに決定し、２値化された画素値が０である水平列中の最後の画素を決定するようにプログラムされている。一実施例では、集積回路デバイスは、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の左側から最初の画素を決定し、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の左側から最後の画素を決定するようにプログラムされている。他の実施例では、集積回路デバイスは、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の右側から最初の画素を決定し、割り当てられた２値の画素値が０である水平列の右側から最後の画素を決定するようにプログラムされている。
２値化された画素値がグレースケール画像の各画素に垂直列に沿って割り当てられる場合、いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、２値化された画素値の１を有する最初の画素を垂直列に沿ってさらに決定し、２値化された画素値の１を有する最後の画素を垂直列に沿ってさらに決定するようにプログラムされている。一実施例では、集積回路デバイスは、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最上部から最初の画素を決定し、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最上部から最後の画素を決定するようにプログラムされている。他の実施例では、集積回路デバイスは、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最下部から最初の画素を決定し、割り当てられた２値の画素値が１である垂直列の最下部から最後の画素を決定するようにプログラムされている。他の実施形態では、集積回路デバイスは、割り当てられた２値の画素値が０である最初の画素を垂直列に沿ってさらに決定し、割り当てられた２値の画素値が０である最後の画素を垂直列に沿ってさらに決定するようにプログラムされている。一実施例では、集積回路デバイスは、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最上部から最初の画素を決定し、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最上部から最後の画素を決定するようにプログラムされている。他の実施例では、集積回路デバイスは、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最下部から最初の画素を決定し、割り当てられた２値の画素値が０である垂直列の最下部から最後の画素を決定するようにプログラムされている。
いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、画像マスクから画像モーメントを計算するようにプログラムされている。いくつかの事例では、集積回路デバイスは、画像マスクから画像モーメントを以下に従って、計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000057
ここで、ｍは、画像マスクのｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、画像マスクのｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
ある特定の実施形態では、集積回路デバイスは、生成された画像マスクに基づいて、流体ストリーム内の細胞の１つ以上の性質を決定するようにプログラムされている。例えば、集積回路デバイスは、画像マスクに基づいて、細胞のサイズ、細胞の質量中心、または細胞の偏心を決定するようにプログラムされてもよい。これらの実施形態では、集積回路デバイスは、画像マスクの１つ以上の画像モーメントを計算し、画像マスクと計算された画像モーメントとに基づいて、細胞の特性を決定するようにプログラムされている。
いくつかの事例では、集積回路デバイスは、画像マスクの画像モーメントから質量中心を計算するようにプログラムされている。例えば、質量中心は以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000058
他の事例では、集積回路デバイスは、画像マスクの画像モーメントから、細胞の配向を計算するようにプログラムされている。例えば、細胞の配向は以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000059
さらに他の事例では、集積回路デバイスは、画像マスクの画像モーメントから細胞の偏心を計算するようにプログラムされている。例えば、細胞の偏心は以下に従って計算されてもよい。
Figure 2022528323000060
いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、流体ストリーム内の細胞のマスクされた画像を生成するようにプログラムされている。これらの実施形態では、集積回路デバイスは、画像マスクの各画素値と細胞の画像からの各画素値とを乗算するようにプログラムされている。
いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、マスクされた画像から画像モーメントを計算するようにプログラムされている。いくつかの事例では、集積回路デバイスは、マスクされた画像から画像モーメントを以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000061
ここで、ｍは、マスクされた画像のｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、マスクされた画像のｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
主題の集積回路デバイスは、画像マスクとマスクされた画像とを比較して、画像マスクの境界内で光信号の分散を決定するようにプログラムされてもよい。一実施例では、集積回路デバイスは、マスクされた画像の画像モーメントから、質量中心を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000062
他の実施例では、集積回路デバイスは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の配向を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000063
さらに他の実施例では、集積回路デバイスは、マスクされた画像の画像モーメントから細胞の偏心を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000064
いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、各細胞について、画像、画像マスク及びマスクされた画像の２つ以上を比較するようにプログラムされている。いくつかの事例では、集積回路デバイスは、細胞の画像と画像マスクとを比較するようにプログラムされている。他の事例では、集積回路デバイスは、細胞の画像とマスクされた画像とを比較するようにプログラムされている。さらに他の事例では、集積回路デバイスは、細胞の画像マスクとマスクされた画像とを比較するようにプログラムされている。他の実施形態では、集積回路デバイスは、細胞の２つ以上の異なる画像マスク、細胞の２つ以上の異なる画像、または細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を生成し、且つ比較するようにプログラムされている。
ある特定の実施形態では、集積回路デバイスは、生成された画像、画像マスクまたはマスクされた画像における細胞の１つ以上の特徴について共局在係数を計算するようにプログラムされている。いくつかの事例では、集積回路デバイスは、細胞の２つ以上の異なる画像マスクから共局在係数を計算するようにプログラムされている。他の事例では、集積回路デバイスは、細胞の２つ以上の異なる画像から共局在係数を計算するようにプログラムされている。さらに他の事例では、集積回路デバイスは、細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像から共局在係数を計算するようにプログラムされている。いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、細胞の画像と画像マスクとから共局在係数を計算するようにプログラムされている。他の実施形態では、集積回路デバイスは、細胞の画像とマスクされた画像とから共局在係数を計算するようにプログラムされている。さらに他の実施形態では、集積回路デバイスは、細胞の画像マスクとマスクされた画像とから共局在係数を計算するようにプログラムされている。
いくつかの実施形態では、集積回路デバイスは、細胞の特徴についての共局在係数を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000065
ここで、ｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の画素である。ｙは第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の画素である。バーｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の平均画素値である。バーｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の平均画素値である。
他の実施形態では、集積回路デバイスは、細胞の特徴について共局在係数を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000066
さらに他の実施形態では、集積回路デバイスは、細胞の特徴について共局在係数を以下に従って計算するようにプログラムされている。
Figure 2022528323000067
キット
本開示の態様は、キットをさらに含み、キットは、本明細書に記載される集積回路デバイスのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは、コンピュータ可読記憶媒体（例えば、フラッシュドライブ、ＵＳＢストレージ、コンパクトディスク、ＤＶＤ、ブルーレイディスクなど）の形態、またはインターネットウェブプロトコルもしくはクラウドサーバからプログラミングをダウンロードする命令など、主題のシステムのためのプログラミングをさらに含んでもよい。キットは、主題の方法を実践する命令をさらに含み得る。これらの命令は、様々な形態で対象キット中に存在し得、そのうちの１つ以上は、キット中に存在し得る。これらの命令が存在し得る１つの形態は、好適な媒体または基板、例えば、情報が印刷される１枚以上の紙、キットのパッケージ、パッケージ内印刷物などに印刷される情報としてである。これらの命令のさらに別の形態は、情報が記録されたコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、ポータブルフラッシュドライブなどである。存在し得るこれらの命令のさらに別の形態は、遠隔の地で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。
ユーティリティ
主題のシステム、方法、及びコンピュータシステムは、生体試料など、流体培地中の試料中の粒子成分を分析し、選別することが望ましい、様々な用途での使用を見出す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステム及び方法は、蛍光タグで標識された生体試料のフローサイトメトリ特徴付けでの使用を見出す。他の実施形態では、システム及び方法は、発せられた光の分光法での使用を見出す。さらに、主題のシステムと方法とは、試料（例えば、流体ストリーム内）から収集された光の入手可能な信号の増強での使用を見出す。ある特定の事例では、本開示はフローサイトメータの流体ストリームに照射された試料から収集された光の計測を増大させることに使用を見出す。本開示の実施形態は、改善された細胞選別精度、強化された粒子収集、粒子充電効率、より正確な粒子充電、及び細胞選別中の強化された粒子偏向を有するフローサイトメータを提供することが望ましい場合に使用を見出す。
本開示の実施形態はまた、生物学的試料から調製された細胞が研究、実験室試験、または治療で使用するために望まれ得る用途での使用も見出す。いくつかの実施形態では、主題の方法及びデバイスは、目的の流体または組織生体試料から調製された個々の細胞の取得を促進し得る。例えば、主題の方法及びシステムは、癌などの疾患の研究または診断標本として使用される流体または組織試料から細胞を取得することを容易にする。同様に、主題の方法及びシステムは、治療で使用される流体または組織試料から細胞を取得することを容易にし得る。本開示の方法及びデバイスは、従来のフローサイトメトリシステムと比較して、効率が向上し、コストが低い生体試料（例えば、臓器、組織、組織断片、流体など）から細胞を分離し、収集することを可能にする。
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示はまた、以下の付記によっても定義される。
１．試料中の細胞を選別するための方法であって、
流体ストリーム内の細胞を含む試料から光を検出することと、
流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成することと、
生成された画像マスクに基づいて細胞を選別することと
を含む、方法。
２．流体ストリーム内の試料から光を検出することは、光吸収、光散乱、蛍光、またはそれらの組み合わせを含む、付記１に記載の方法。
３．画像マスクを生成することは、流体ストリーム内の細胞のグレースケール画像を生成することを含む、付記１または２に記載の方法。
４．グレースケール画像から画素強度閾値を決定することをさらに含む、付記３に記載の方法。
５．レースケール画像の各画素を決定された閾値と比較することと、
各画素を２値の画素値に変換することと
を含む、付記４に記載の方法。
６．流体ストリームから光吸収を検出することと、
グレースケール画像の画素強度が強度閾値未満の場合は１の画素値を、グレースケール画像の画素強度が強度閾値よりも大きい場合は０の画素値をグレースケール画像の各画素に割り当てることと
を含む、付記５に記載の方法。
７．割り当てられた画素値が１である第１画素及び第２画素をグレースケール画像の水平列にわたって決定することを含む、付記６に記載の方法。
８．第１画素は、画素値が１である水平列中の最初の画素である、付記７に記載の方法。
９．第２画素は、画素値が１である水平列中の最後の画素である、付記７または８に記載の方法。
１０．流体ストリーム内の細胞から光散乱を検出することと、
画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値１を、画素強度が閾値未満の場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てることと
を含む、付記５に記載の方法。
１１．流体ストリーム内の細胞から蛍光を検出することと、
画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値１を、画素強度が閾値未満の場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てることと
を含む、付記５に記載の方法。
１２．グレースケール画像の各画素強度値と決定された閾値とを水平列にわたって比較することを含む、付記１０または１１に記載の方法。
１３．画像マスクは、画素値が１である画素を含んでいる、付記５～１２のいずれか一つに記載の方法。
１４．画像マスクに基づいて細胞のサイズを決定することをさらに含む、付記１～１３のいずれか一つに記載の方法。
１５．画像マスクに基づいて細胞の質量中心を決定することをさらに含む、付記１～１３のいずれか一つに記載の方法。
１６．画像マスクに基づいて細胞の偏心を決定することをさらに含む、付記１５に記載の方法。
１７．細胞の第２の画像マスクを生成することをさらに含む、付記１～１６のいずれか一つに記載の方法。
１８．細胞の第１画像マスクと第２画像マスクとを比較することをさらに含む、付記１７に記載の方法。
１９．細胞の画像マスクがダブレットを含むことを決定することをさらに含む、付記１８に記載の方法。
２０．画像マスクから画像モーメントを以下に従って算出することをさらに含む、付記１～１３のいずれか一つに記載の方法。
Figure 2022528323000068
ここで、ｍは、画像マスクのｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、画像マスクのｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
２１．細胞の質量中心を画像モーメントから以下に従って計算することをさらに含む、付記２０に記載の方法。
Figure 2022528323000069
２２．細胞の配向を画像モーメントから以下に従って計算することをさらに含む、付記２０に記載の方法。
Figure 2022528323000070
２３．細胞の偏心を画像モーメントから以下に従って計算することをさらに含む、付記２０に記載の方法。
Figure 2022528323000071
２４．細胞の画像を生成させることをさらに含む、付記１～２３のいずれか一つに記載の方法。
２５．細胞の画像からの各画素と画像マスクとを乗算して、マスクされた画像を生成することをさらに含む、付記２４に記載の方法。
２６．マスクされた画像から画像モーメントを以下に従って計算することをさらに含む、付記２５に記載の方法。
Figure 2022528323000072
ここで、ｍはマスクされた画像のｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎはマスクされた画像のｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
２７．マスクされた画像における細胞の質量中心を画像モーメントから以下に従って計算することをさらに含む、付記２６に記載の方法。
Figure 2022528323000073
２８．マスクされた画像における細胞の配向を画像モーメントから以下に従って計算することをさらに含む、付記２６に記載の方法。
Figure 2022528323000074
２９．マスクされた画像における細胞の偏心を画像モーメントから以下に従って計算することをさらに含む、付記２６に記載の方法。
Figure 2022528323000075
３０．（１）細胞の２つ以上の異なる画像マスク、
（２）細胞の２つ以上の異なる画像、または
（３）細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を生成することを含む、付記１～２９のいずれか一つに記載の方法。
３１．細胞の２つ以上の異なる画像マスク、細胞の２つ以上の異なる画像、または細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像での細胞の特徴について共局在係数を計算することをさらに含む、付記３０に記載の方法。
３２．特徴は細胞間の細胞小器官である、付記３１に記載の方法。
３３．特徴は細胞間の生体高分子である、付記３１に記載の方法。
３４．生体高分子はタンパク質である、付記３３に記載の方法。
３５．共局在係数は以下に従って計算される、付記３１～３４のいずれか一つに記載の方法。
Figure 2022528323000076
ここで、ｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の画素であり、ｙは第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の画素であり、バーｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の平均画素値であり、バーｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の平均画素値である。
３６．共局在係数は以下に従って計算される、付記３５に記載の方法。
Figure 2022528323000077
３７．共局在係数は以下に従って計算される、付記３１～３６のいずれか一つに記載の方法。
Figure 2022528323000078
３８．画像マスクはフィールドプログラマブルゲートアレイによって生成される、付記１～３７のいずれか一つに記載の方法。
３９．流体ストリームを光源で照射することをさらに含む、付記１～３８のいずれか一つに記載の方法。
４０．流体ストリームは、２００ｎｍ～８００ｎｍの波長範囲で光源によって照射される、付記３９に記載の方法。
４１．周波数シフト光の第１ビームと周波数シフト光の第２ビームとで流体ストリームを照射することを含む、付記３９または４０に記載の方法。
４２．周波数シフト光の第１ビームは、局部発振（ＬＯ）ビームを含み、周波数シフト光の第２ビームは、無線周波数コムビームを含む、付記４１に記載の方法。
４３．高周波駆動信号を音響光学デバイスに印加することと、
音響光学デバイスをレーザで照射して、周波数シフト光の第１ビームと周波数シフト光の第２ビームとを生成することと
をさらに含む、付記４１または４２に記載の方法。
４４．レーザは連続波レーザである、付記４３に記載の方法。
４５．流体ストリーム内に細胞を含有する試料を照射するように構成されている光源と、
光検出器を有する光検出システムと、
動作可能に結合されたメモリを有するプロセッサと
を備えており、
メモリは自身に保存された命令を含み、その命令がプロセッサによって実行されると、プロセッサに、流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成させ、
生成された画像マスクに基づいて前記試料中の細胞を選別するように構成されている細胞選別部品を備える、
システム。
４６．光検出システムは、光吸収、光散乱及び蛍光の一つまたはそれ以上を検出するように構成されている光検出器を含む、付記４５に記載のシステム。
４７．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、流体ストリーム内の細胞のグレースケール画像を生成させる、付記４５または４６に記載のシステム。
４８．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、グレースケール画像から画素強度閾値を決定させる、付記４７に記載のシステム。
４９．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、
グレースケール画像の各画素と決定された閾値とを比較させ、
各画素を２値の画素値に変換させる、付記４８に記載のシステム。
５０．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、
流体ストリームから光吸収を検出させ、
画素強度が強度閾値未満の場合は１の画素値を、画素強度が強度閾値よりも大きい場合は０の画素値をグレースケール画像の各画素に割り当てさせる、付記４９に記載のシステム。
５１．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、割り当てられた画素値が１である第１画素及び第２画素をグレースケール画像の水平列にわたって決定させる、付記５０に記載のシステム。
５２．第１画素は、画素値が１である水平列中の最初の画素である、付記５１に記載のシステム。
５３．第２画素は、画素値が１である水平列中の最後の画素である、付記５１または５２に記載のシステム。
５４．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、
流体ストリーム内の細胞から光散乱を検出させ、
画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値１を、画素強度が閾値未満の場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てさせる、付記５３に記載のシステム。
５５．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、
流体ストリーム内の細胞から蛍光を検出させ、
画素強度が閾値よりも大きい場合は画素値１を、画素強度が閾値未満の場合は画素値０をグレースケール画像の各画素に割り当てさせる、付記５４に記載のシステム。
５６．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、グレースケール画像の各画素強度値と決定された閾値とを水平列にわたって比較させる、付記５４または５５に記載のシステム。
５７．画像マスクは、画素値が１である画素を含んでいる、付記４９～５６のいずれか一つに記載のシステム。
５８．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、画像マスクに基づいて細胞のサイズを決定させる、付記４５～５７のいずれか一つに記載のシステム。
５９．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、画像マスクに基づいて細胞の質量中心を決定させる、付記４５～５８のいずれか一つに記載のシステム。
６０．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、画像マスクに基づいて細胞の偏心を決定させる、付記５９に記載のシステム。
６１．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、細胞の第２画像マスクを生成させる、付記４５～６０のいずれか一つに記載のシステム。
６２．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、細胞の第１画像マスクと第２画像マスクとを比較させる、付記６１に記載のシステム。
６３．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、細胞の画像マスクがダブレットを含むことを決定させる、付記６２に記載のシステム。
６４．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、画像マスクから画像モーメントを以下に従って算出させる、付記４５～６０のいずれか一つに記載のシステム。
Figure 2022528323000079
ここで、ｍは画像マスクのｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは画像マスクのｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
６５．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、細胞の質量中心を画像モーメントから以下に従って計算させる、付記６４に記載のシステム。
Figure 2022528323000080
６６．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、細胞の配向を画像モーメントから以下に従って計算させる、付記６４に記載のシステム。
Figure 2022528323000081
６７．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、細胞の偏心を画像モーメントから以下に従って計算させる、付記６４に記載のシステム。
Figure 2022528323000082
６８．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、細胞の画像を生成させる、付記４５～６７のいずれか一つに記載のシステム。
６９．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、細胞の画像の各画素と画像マスクとを乗算して、マスクされた画像を生成させる、付記６８に記載のシステム。
７０．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、マスクされた画像から画像モーメントを以下に従って計算させる、付記６９に記載のシステム。
Figure 2022528323000083
ここで、ｍはマスクされた画像のｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎはマスクされた画像のｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
７１．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、マスクされた画像における細胞の質量中心を画像モーメントから以下に従って計算させる、付記７０に記載のシステム。
Figure 2022528323000084
７２．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、マスクされた画像における細胞の配向を画像モーメントから以下に従って計算させる、付記７０に記載のシステム。
Figure 2022528323000085
７３．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、マスクされた画像における細胞の偏心を画像モーメントから以下に従って計算させる、付記７０に記載のシステム。
Figure 2022528323000086
７４．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、
１）細胞の２つ以上の異なる画像マスク、
２）細胞の２つ以上の異なる画像、または
３）細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を生成させる、付記４５～７３のいずれか一つに記載のシステム。
７５．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、細胞の２つ以上の異なる画像マスク、細胞の２つ以上の異なる画像、または細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像の細胞の特徴について共局在係数を計算させる、付記７４に記載のシステム。
７６．特徴は細胞間の細胞小器官である、付記７５に記載のシステム。
７７．特徴は細胞間の生体高分子である、付記７５に記載のシステム。
７８．生体高分子はタンパク質である、付記７７に記載のシステム。
７９．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、共局在係数を以下に従って計算させる、付記７４～７８のいずれか一つに記載のシステム。
Figure 2022528323000087
ここで
ｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の画素であり、
ｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の画素であり、
バーｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の平均画素値であり、
バーｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の平均画素値である。
８０．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、共局在係数を以下に従って計算させる、付記７９に記載のシステム。
Figure 2022528323000088
８１．メモリは自身に記憶された命令を含み、プロセッサによって命令が実行されるとプロセッサに、共局在係数を以下に従って計算させる、付記７４～８０のいずれか一つに記載のシステム。
Figure 2022528323000089
８２．画像マスクを生成するために構成されるフィールドプログラマブルゲートアレイを含む、付記４５～８１のいずれか一つに記載のシステム。
８３．光源は少なくとも周波数シフト光の第１ビームと周波数シフト光の第２ビームとを生成するように構成されている光ビーム生成器構成要素を含む、付記４５～８２のいずれか一つに記載のシステム。
８４．光ビーム生成器は音響光学デフレクタを含む、付記８３に記載のシステム。
８５．光ビーム生成器はダイレクトデジタルシンセサイザ（ＤＤＳ）ＲＦコム生成器を含む、付記８３または８４に記載のシステム。
８６．光ビーム生成器構成要素は周波数シフト局部発振ビームを生成するように構成されている、付記８３～８５のいずれか一つに記載のシステム。
８７．光ビーム生成器構成要素は、複数の周波数シフトコムビームを生成するように構成されている、付記８３～８６のいずれか一つに記載のシステム。
８８．光源はレーザを含む、付記４５～８７のいずれか一つに記載のシステム。
８９．レーザは連続波レーザである、付記８８に記載のシステム。
９０．システムはフローサイトメータである、付記４５～８９のいずれか一つに記載のシステム。
９１．細胞選別部品は液滴デフレクタを含む、付記４５～９０のいずれか一つに記載のシステム。
９２．フローセルノズルはオリフィスと、
光源で流体ストリーム内の試料を照射するためのフローセルノズルオリフィスと連通する試料検査領域と
をさらに含む、付記４５～９１のいずれか一つに記載のシステム。
９３．試料検査領域に位置するキュベットをさらに含む、付記９２に記載のシステム。
９４．光検出器を有する光検出システムによって検出された流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成し、
生成された画像マスクに基づいて細胞を選別するようにプログラムされている、集積回路。
９５．流体ストリーム内の細胞のグレースケール画像を生成するようにプログラムされている、付記９４に記載の集積回路。
９６．グレースケール画像から閾値を決定するようにプログラムされている、付記９５に記載の集積回路。
９７．グレースケール画像の各画素を決定された閾値と比較させ、
各画素を２値の画素値に変換させるようにプログラムされている、付記９６に記載の集積回路。
９８．画素強度が閾値未満の場合は１の画素値を、画素強度が閾値よりも大きい場合は０の画素値をグレースケール画像の各画素に割り当てるようにプログラムされている、付記９７に記載の集積回路。
９９．画素強度が閾値よりも大きい場合は１の画素値を、画素強度が閾値未満の場合は０の画素値をグレースケール画像の各画素に割り当てるようにプログラムされている、付記９７に記載の集積回路。
１００．割り当てられた画素値が１である第１画素及び第２画素をグレースケール画像の水平列にわたって決定するようにプログラムされている、付記９７に記載の集積回路。
１０１．第１画素は画素値が１である水平列中の最初の画素である、付記１００に記載の集積回路。
１０２．第２画素は画素値が１である水平列中の最後の画素である、付記１００または１０１に記載の集積回路。
１０３．画像マスクに基づいて細胞のサイズを決定するようにプログラムされている、付記９４～１０２のいずれか一つに記載の集積回路。
１０４．画像マスクに基づいて細胞の質量中心を決定するようにプログラムされている、付記９４～１０２のいずれか一つに記載の集積回路。
１０５．画像マスクに基づいて細胞の偏心を決定するようにプログラムされている、付記９４～１０２のいずれか一つに記載の集積回路。
１０６．細胞の第２画像マスクを生成するようにプログラムされている、付記９４～１０４のいずれか一つに記載の集積回路。
１０７．細胞の第１画像マスクと第２画像マスクとを比較するようにプログラムされている、付記１０６に記載の集積回路。
１０８．細胞の画像マスクがダブレットを含むことを決定するようにプログラムされている、付記１０７に記載の集積回路。
１０９．画像マスクから画像モーメントを以下に従って計算するようにプログラムされている、付記９４～１０８のいずれか一つに記載の集積回路。
Figure 2022528323000090
ここで、ｍは、画像マスクのｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎは、画像マスクのｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
１１０．画像モーメントから細胞の質量中心を以下に従って計算するようにプログラムされている、付記１０９に記載の集積回路。
Figure 2022528323000091
１１１．画像モーメントから細胞の配向を以下に従って計算するようにプログラムされている、付記１０９に記載の集積回路。
Figure 2022528323000092
１１２．画像モーメントから細胞の偏心を以下に従って計算させるようにプログラムされている、付記１０９に記載の集積回路。
Figure 2022528323000093
１１３．細胞の画像を生成するようにプログラムされている、付記９４～１１２のいずれか一つに記載の集積回路。
１１４．細胞の画像の各画素と画像マスクとを乗算して、マスクされた画像を生成するようにプログラムされている、付記１１３に記載の集積回路。
１１５．マスクされた画像から画像モーメントを以下に従って計算するようにプログラムされている、付記１１３に記載の集積回路。
Figure 2022528323000094
ここで、ｍはマスクされた画像のｘ軸に沿って算出された画像モーメントであり、ｎはマスクされた画像のｙ軸に沿って算出された画像モーメントである。
１１６．画像モーメントからマスクされた画像における細胞の質量中心を以下に従って計算するようにプログラムされている、付記１１３に記載の集積回路。
Figure 2022528323000095
１１７．画像モーメントからマスクされた画像における細胞の配向を以下に従って計算するようにプログラムされている、付記１１６に記載の集積回路。
Figure 2022528323000096
１１８．画像モーメントからマスクされた画像における細胞の偏心を以下に従って計算するようにプログラムされている、付記１１６に記載の集積回路。
Figure 2022528323000097
１１９．（１）細胞の２つ以上の異なる画像マスク、
（２）細胞の２つ以上の異なる画像、または
（３）細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像を生成するようにプログラムされている、付記９４～１１８のいずれか一つに記載の集積回路。
１２０．細胞の２つ以上の異なる画像マスク、細胞の２つ以上の異なる画像、または細胞の２つ以上の異なるマスクされた画像での細胞の特徴について共局在係数を計算するようにプログラムされている、付記１１９に記載の集積回路。
１２１．特徴は細胞間の細胞小器官である、付記１２０に記載の集積回路。
１２２．特徴は細胞間の生体高分子である、付記１２０に記載の集積回路。
１２３．生体高分子はタンパク質である、付記１２２に記載の集積回路。
１２４．共局在係数を以下に従って計算させる、付記１２０～１２３のいずれか一つに記載の集積回路。
Figure 2022528323000098
ここで、ｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の画素であり、ｙは第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の画素であり、バーｘは、第１画像、第１画像マスク、または第１のマスクされた画像の平均画素値であり、バーｙは、第２画像、第２画像マスク、または第２のマスクされた画像の平均画素値である。
１２５．共局在係数を以下に従って計算するようにプログラムされている、付記１２４に記載の集積回路。
Figure 2022528323000099
１２６．共局在係数を以下に従って計算するようにプログラムされている、付記１２４または１２５に記載の集積回路。
Figure 2022528323000100
１２７．フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）である、付記９４～１２６のいずれか一つに記載の集積回路。
１２８．特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である、付記９４～１２６のいずれか一つに記載の集積回路。
１２９．複合プログラム可能論理デバイス（ＣＡＰＬＤ）である、付記９４～１２６のいずれか一つに記載の集積回路。
上記の発明は、明確な理解のために例示及び例としてある程度詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明の教示に照らして、ある特定の変更及び修正が行われてもよいことは、当業者には容易に明らかである。
従って、前述した記載は、本発明の原理を例示するにすぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載または示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々な配置を考案することができることが理解される。さらに、本明細書に列挙されるすべての例及び条件付き言語は、主に、読者が本発明の原理及び当該技術をさらに進めるために発明者が寄与する概念を理解することを助ける点を意図しており、そのような具体的に列挙される例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、及び実施形態を列挙する本明細書におけるすべての記述、ならびにその具体例は、その構造的及び機能的等価物の両方を包含することが意図される。加えて、そのような等価物は、構造に関係なく、現在知られている等価物と将来開発される等価物との両方、すなわち、同じ機能を実行するように開発された任意の要素を含むことが意図される。さら
に、本明細書に開示されるものは、そのような開示が特許請求の範囲において明示的に列挙されるか否かにかかわらず、公衆専用であることが意図されるものではない。
よって、本発明の範囲は、本明細書に示され、記載される例示的な実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。特許請求の範囲において、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ｆ）または３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（６）は、特許請求の範囲におけるそのような制限の開始時に厳密な語句「のための手段」または厳密な語句「のためのステップ」が列挙される場合にのみ、特許請求の範囲における制限のために呼び出されるものとして明示的に定義され、そのような厳密な語句が特許請求の範囲における制限で使用されない場合、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ｆ）または３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（６）は呼び出されない。
関連出願の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）に従って、本出願は、２０１９年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／８２４，９０３号の出願日に対する優先権を主張し、その出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

  1. 試料の細胞を選別する方法であって、
    流体ストリーム内の細胞を含有する試料から光を検出することと、
    前記流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成することと、
    生成された画像マスクに基づいて細胞を選別することと
    を含む、方法。
  2. 前記流体ストリーム内の細胞を含有する試料から光を検出することは、光吸収、光散乱、蛍光、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記画像マスクを生成することは、前記流体ストリーム内の細胞のグレースケール画像を生成することを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記グレースケール画像から画素強度閾値を決定することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記グレースケール画像からの各画素と決定された前記画素強度閾値とを比較することと、
    各画素を２値の画素値に変換することと
    を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記流体ストリームから光吸収を検出することと、
    前記グレースケール画像の前記画素強度が前記画素強度閾値未満の場合は１の画素値を前記グレースケール画像の各画素に割り当て、前記グレースケール画像の前記画素強度が前記画素強度閾値よりも大きい場合は０の画素値を前記グレースケール画像の各画素に割り当てることと
    を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 割り当てられた画素値が１である第１画素及び第２画素を前記クレースケール画像の水平列にわたって決定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記第１画素は、画素値が１である水平列中の最初の画素である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記画像マスクに基づいて、細胞の質量中心を決定することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 細胞の第２画像マスクを生成することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 細胞の前記第１画像マスクと前記第２画像マスクとを比較することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 細胞の前記画像マスクはダブレットを含むことを決定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 細胞の画像を生成することをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 流体ストリーム内に細胞を含有する試料を照射するように構成されている光源と、
    光検出器を有する光検出システムと、
    動作可能に結合されたメモリを有するプロセッサと、
    を備えており、
    前記メモリは自身に保存された命令を含み、前記プロセッサによって実行されると前記プロセッサに、前記流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成させ、
    請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法に従って生成された画像マスクに基づいて前記試料中の細胞を選別するように構成されている細胞選別部品を備える、
    システム。
  15. 光検出器を有する光検出システムによって検出された流体ストリーム内の細胞の画像マスクを生成し、
    請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法に従って、生成された画像マスクに基づいて細胞を選別する
    ようにプログラムされている、集積回路。
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