JP2022528053A - がん診断及び治療のための新規psma特異的結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]前立腺特異的膜抗原(PSMA)結合タンパク質であって、前記PSMA結合タンパク質は、GFAHR、GWAHR、SFAHR、SYAHR、GFAHL、WTTTF、WTPSI、WTETI、GHEYL、GDGDV、KHNTW、VAYRP、若しくはWWNPN、又はこれらと80%の同一性を有するモチーフから選択される少なくとも1つのアミノ酸結合モチーフを含む、PSMA結合タンパク質。
[2]配列番号1に記載のユビキチンをベースとする1つ以上のユビキチン変異タンパク質を含む、[1]に記載のPSMA結合タンパク質。
[3]結合モチーフのアミノ酸残基は、配列番号1に記載のユビキチンの62位、63位、64位、65位、66位に相当し、好ましくは、前記PSMA結合タンパク質は、配列番号1に記載のユビキチンをベースとする1つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、配列番号1に記載のユビキチンの62位、63位、64位、65位、66位に対応するアミノ酸残基においてアミノ酸結合モチーフGFAHR、又はこれと80%の同一性を有するモチーフを含む、[2]に記載のPSMA結合タンパク質。
[4]さらに、配列番号1のユビキチンの6位及び8位に対応するアミノ酸は置換されている、[3]に記載のPSMA結合タンパク質。
[5]さらに、配列番号1のユビキチンの42位、44位、68位、70位、及び72位に対応するアミノ酸は置換されている、[3]に記載のPSMA結合タンパク質。
[6]さらに、ユビキチン(配列番号1)の6位、8位、9位、10位、12位、及び46位に対応するアミノ酸は置換されているか、又はさらにユビキチン(配列番号1)の9位及び10位に対応するアミノ酸間に6以下のアミノ酸が挿入されているか、又はユビキチン(配列番号1)の11位、33位、51位、48位、及び74位に対応するアミノ酸は置換されている、[3]に記載のPSMA結合タンパク質。
[7]前記PSMA結合タンパク質は、[1]~[6]のいずれか1つに記載の複数のPSMA結合タンパク質を含む多量体、好ましくは、[1]~[6]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質の二量体である、[1]~[6]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質。
[8]配列番号3~55の群から選択される、又はそれぞれ、これらと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むか又はから成る、[1]~[7]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質。
[9]前記PSMA結合タンパク質は、500nM以下のPSMAの細胞外ドメインと特異的結合親和性を有する、[1]~[8]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質。
[10]前記PSMA結合タンパク質は、化学部分との結合のための1つ以上の結合部位をさらに含み、好ましくは、前記化学部分は、キレート剤、薬剤、トキシン、染料、及び小分子のいずれかから選択される、[1]~[9]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質。
[11]放射性核種、蛍光タンパク質、感光剤、染料、若しくは酵素、若しくは上記のいずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも1つの診断的活性部分をさらに含む、[1]~[10]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質。
[12]モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、結合タンパク質、放射性核種、細胞傷害性化合物、サイトカイン、ケモカイン、酵素、若しくはこれらの誘導体、又は上記いずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも1つの治療的活性部分をさらに含む、[1]~[11]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質。
[13]ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合タンパク質、免疫グロブリン結合タンパク質、又は免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンフラグメント、多糖類、又はアミノ酸アラニン、グリシン、セリン、プロリンを含む不飽和アミノ酸配列から必要に応じて選択される薬物動態を調節する少なくとも1つの部分をさらに含む、[1]~[12]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質。
[14]PSMA関連腫瘍の診断又は治療において使用するため、好ましくは、腫瘍の画像診断のため、及びPSMA関連腫瘍の放射線治療のための、[1]~[13]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質。
[15]医療において使用するため、好ましくは、前記PSMA関連腫瘍の診断又は治療において使用するため、好ましくは、腫瘍の画像診断のため及びPSMA関連腫瘍の放射線治療のための、[1]~[14]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質を含む組成物。
[16][1]~[15]のいずれか1つに記載のPSMA結合タンパク質の製造方法であって、前記方法は、a)前記PSMA結合タンパク質を得るために適した条件下で宿主細胞を培養するステップ及びb)前記製造されたPSMA結合タンパク質を単離するステップを含む、方法。
用語「PSMA」は、前立腺特異的膜抗原を表す。ヒトPSMAは、短い細胞内ドメイン(残基1~19)、膜貫通型ドメイン(残基20~43)、及び細胞外ドメイン(残基44~750)を含む約100kDの糖タンパク質である。PSMAは、UniProt ID Q04609(2017年3月15日のバージョン)により表され;ヒトPSMA mRNAは、NCBI参照配列NM_004476.1により表される。用語PSMAは、Q04609と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、又は100%の配列同一性を示すポリペプチドを含む。
様々な実施形態では、PSMA結合タンパク質は、ユビキチン(配列番号1)の62位、63位、64位、65位、66位に特徴的なアミノ酸モチーフWWNPNを有する。様々な実施形態では、PSMA結合タンパク質は、配列番号1に記載のユビキチンの変異タンパク質を含み、ユビキチン変異タンパク質はユビキチン(配列番号1)の62位、63位、64位、65位、66位に対応する位置においてアミノ酸結合モチーフWWNPN、及び配列番号1の6位、8位、9位、10位、12位、42位、44位、46位、68位、70位、72位に対応する位置におけるあらなる置換を含む。いくつかの実施形態では、PSMA結合タンパク質は、Q62W、K63W、E64N、S65P、及びT66Nにさらに、K6Y又はK6W;L8R又はL8A又はL8K;T9A、T9V、T9E、又はT9Q;G10L又はG10F;T12Q;R42M又はR42K又はR42T;I44F又はI44K;A46K又はA46R;H68S;V70N又はV70D;R72D又はR72N又はR72Gの群から選択されるさらなる置換により修飾された少なくとも1つのユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成る。いくつかの実施形態では、PSMA結合タンパク質は、例えば、これらに限定されないが、E16A、E18G、I23V、K29R、Q31R、K33R、I36T、K48R、L71R、及びL73R(例えば、配列番号38、39、40、41、47、48、49、50、51参照)の群から選択される付加的1、2、又は3置換を有するユビキチン変異タンパク質を含む。
様々な実施形態では、PSMA結合タンパク質は、ユビキチン(配列番号1)の62位、63位、64位、65位、66位に特徴的なアミノ酸モチーフKHNTWを有する。様々な実施形態では、PSMA結合タンパク質は、ユビキチン(配列番号1)のR42H、I44Y、Q62K、K63H、E64N、S65T、T66W、H68E、V70M、及びR72Fから選択される置換により修飾されたユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成る。
いくつかの実施形態では、PSMA結合タンパク質は、ユビキチンの62位、63位、64位、65位、66位に特徴的5アミノ酸モチーフGWAHR又はGFAHR又はSFAHR又はSYAHR又はGFAHL又はこれらの多様体を有するユビキチン変異タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、PSMA結合タンパク質は、配列番号1に記載のユビキチンをベースとする1つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、配列番号1に記載のユビキチンの62位、63位、64位、65位、66位に対応するアミノ酸残基においてアミノ酸結合モチーフGFAHR、又はこれと80%の同一性を有するモチーフを含む。いくつかの実施形態では、PSMA結合タンパク質は、配列番号1に記載のユビキチンの62位、63位、64位、65位、66位に対応するアミノ酸残基において、配列番号1に記載のユビキチンをベースとしアミノ酸結合モチーフX1X2AHX3を含む1つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、X1はG又はSから選択され、X2は芳香族アミノ酸、好ましくはW又はFから選択され、X3はR又はLから選択される。いくつかの実施形態では、PSMA結合タンパク質は、配列番号1に記載のユビキチンをベースとしアミノ酸結合モチーフG(X)AHRを含む1つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、Xは芳香族アミノ酸残基、好ましくは、XはF又はWから選択される。いくつかの実施形態では、PSMA結合タンパク質は、配列番号1に記載のユビキチンの62位、63位、64位、65位、66位に対応するアミノ酸残基において、配列番号1に記載のユビキチンをベースとしアミノ酸結合モチーフGFAHR、GWAHR、SFAHR、又はSYAHR又はGFAHLを含む1つ以上のユビキチン変異タンパク質を含む。
MQIFVRTPTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIGFAHRLHLVLRLRAAMQIFVMTQTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIWTTTFLHLVLRLRAA;
配列番号4(Affilin-191871)MQIFVRTQTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIGWAHRLHLVLRLRAAMQIFVHTNTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIWTETILHLVLRLRAA。
ライブラリー構築及びクローニング。無作為化アミノ酸位置を含むユビキチンライブラリーを、triplet technology(MorphoSys Slonomics、独国)により合成あるいは合成トリヌクレオチドホスホラミダイト(ELLA Biotech)により生成される無作為化オリゴヌクレオチドによる社内合成して無作為化位置のシステイン及び他のアミノ酸残基を同時に除いてバランスのよいアミノ酸分布を達成した。
ライブラリーSPV2:アミノ酸位置6位、8位、9位、10位、12位、42位、44位、46位、62位、63位、64位、65位、66位、68位、70位、及び72位に無作為化されたユビキチン(配列番号1)。
ライブラリーSPL27:62位、63位、64位、65位、66位、68位、70位、及び72位に対応するアミノ酸に無作為化されたユビキチン(配列番号1)並びにユビキチンのT9及びG10間に導入された6無作為化アミノ酸の挿入。アミノ酸残基Cys、Ile、Leu、Val及びPheは挿入において出現しなかった。
ライブラリーSPVF19:アミノ酸位置6位、8位、62位、63位、64位、65位、66位、68位、70位、72位、82位、84位、138位、139位、140位、141位、142位に無作為化されたビスユビキチン(配列番号2)(これは、両方のユビキチン部分における6位、8位、62位、63位、64位、65位、66位の無作為化に対応する;ライブラリーSPVF19では、2つのユビキチン部分は直接結合している)。
ヒトPSMAの細胞外ドメインをコードするDNA配列(uniprot受託番号Q04609;残基45~750)をヒトIgG1のFc領域と遺伝子的に融合し、次いで、N末端にHisタグ化した。ヒトコドン使用頻度を有する完全長cDNAは、GeneArt(Thermo Scientific)により提供され、哺乳類発現ベクターpCEP4にクローン化され、振盪フラスコ中250mlの規模で、哺乳類Expi293F細胞内で発現された。SDS-PAGE及びPSMAに対する抗体及びヒトIgG1のFc部分を用いて免疫ブロット解析により発現を分析した。大規模発現の130ml細胞培養液の上澄液を遠心分離し、タンパク質A HP 1mLカラム(GE Healthcare)のアフィニティクロマトグラフィーへの適用のためにろ過した。標的タンパク質を、穏やかなpHシフト(pH4)により溶離し、Superdex XK16/600ゲルろ過カラムに適用した。9mgのHis-Fc-PSMAを回収することができた;SDS-PAGE分析及びSE-HPLC分析により標的タンパク質の純度を確認した。基質N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタメート(NAAG)に対する標的タンパク質の酵素活性を確認した。
成熟選択及び分析親和性成熟のため、計画の2ラウンドを行った。両ラウンドのため、IgG1のFcフラグメントでの事前選択を行った。選択ラウンドの一部では、マウス血清を、血清安定性が増大した選択分子に添加した。特異的標的結合に関する成熟及び選択プールを分析するため、ファージプールELISAを行い、次いで、ポジティブプールを発現ベクターpET-28aにクローン化し、上記のようにヒットELISAを行った。
PSMA結合分子を当業者に公知の標準的方法を用いて発現ベクターにクローン化し、精製して下記のように分析した。
本発明の結合タンパク質の熱安定性を、示差走査蛍光分析(DSF)によって決定した。各サンプルを0.1μg/μLの濃度において、LightCycler(登録商標)480 Multiwell Plate 96(Roche)に移し、SYPRO橙色染料を適切な希釈で添加した。20~90℃の温度勾配を、毎分1℃の加熱速度でプログラムした(LightCycler(登録商標)480、Roche)。465nmの励起波長及び580nmの発光波長において蛍光を常に測定した(LightCycler(登録商標)480、Roche)。熱的アンフォールディング転移の中間点(Tm、融点)を、図1,図2、及び図3に選択された変異タンパク質について示す。本発明のPSMA結合タンパク質は、85℃以下の融点を有する。配列番号5のTmは69.3℃であり、配列番号6のTmは84.2℃である。選択された二量体PSMA結合タンパク質の熱安定性について、表2参照。
CM5センサーチップ(GE Healthcare)をSPRランニングバッファーと平衡を保った。表面露出カルボン酸を、EDC及びNHSの混合物を通過させることにより活性化し、反応性エステル基を得た。標的に対して1:3の比(hIgG-Fc:標的)で、700~1500RU PSMA-Fc(オンリガンド)をフローセルに固定し、IgG-Fc(オフリガンド)を別のフローセルに固定した。リガンド固定化後のアタノールアミンの注射を使用して未反応のNHS基を遮断した。リガンド結合時、タンパク質分析物を表面に蓄積し、屈折率が増加した。この屈折率変化をリアルタイムで測定し、時間に対する応答又は応答単位(RU)としてプロットした。分析物を、30μl/分の流速で段階希釈してチップに適用した。会合を120秒行い、解離を360秒行った。各実行後、チップ表面を30μl再生バッファーで再生し、ランニングバッファーと平衡を保った。希釈系列はポジティブコントロールの役割をしたが、未修飾ユビキチンの希釈系列はネガティブコントロールである。コントロールサンプルを30μl/分の流速でマトリックスに適用したが、これらは60秒間で会合し、120秒間で解離した。再生及び再平衡を前述のように行った。Biacore 3000(GE Healthcare)の使用により結合試験を行い;データ評価を、ラングミュア1:1モデル(RI=0)を用いて、製造者により提供されたBIAevaluation 3.0ソフトウェアにより操作した。1:1ラングミュアモデルでデータをフィッティング後、例えば、KD値を算出し、図1、図2、図3、及び表2に示した。評価された解離定数(KD)をオフターゲットに対して標準化し、示した。例えば、配列番号5のKDは、hPSMA-Fcに対して1.8nMであり(1100RU、タンパク質Aによる固定化);配列番号6のKDは113nMであり、配列番号22のKDは484nMであり、配列番号45のKDは33nMであり、配列番号26のKDは9.3nMである。表2は、二量体PSMA結合タンパク質のSPRにより決定された結合親和性及び温度安定性(実施例3参照)を示す。
フローサイトメトリーを使用して細胞表面露出PSMAとのPSMA結合タンパク質の結合を分析した。PSMA過剰発現ヒト前立腺がんセルラインLNCaP、PSMA過剰発現トランスフェクトHEK293-PSMA細胞、PSMA非発現PC3細胞及び空ベクターコントロールHEK293-pEntry細胞を使用した。細胞をトリプシン処理し、FCSを含む培地に再懸濁し、洗浄し、予備冷却されたFACSブロッキングバッファーで染色した。1×106細胞/mlの細胞濃度を細胞染色のために調製し、100μlを、それぞれ、各セルラインに対して三通り96ウェルプレート(Greiner)のウェル中に充填した。いくつかの実験において、ポジティブコントロールとして、PSMA結合タンパク質の異なる濃度、例えば、50nM、又は0.5μg/mlモノクローナル抗ヒトPSMA抗体(クローンLNI-17;Biolegend;342502)を、PSMA過剰発現及びコントロール細胞に添加した。PSMA結合タンパク質は、精製及び検出目的のため、C末端Strepタグ(例えば、配列番号71参照)を含んだ。45分後、上澄液を取り出し、FACSブロッキングバッファー中に1:300希釈した、100μl/ウェルウサギ抗Strepタグ抗体(GenScriptから得た;A00626)を添加した。抗PSMA抗体を、ポジティブコントロールウェル中において1:1000希釈の抗マウスIgG-Alexa488(Invitrogen;A-10680)を用いて検出した。他のウェルからの抗Strepタグ抗体の除去後、ヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 488抗体(Invitrogenから得た;A11008)を1:1000希釈で適用した。励起波長488nm及び発光波長525/30nmにおいてMerck-MilliporeのGuava easyCyte 5HT装置でフローサイトメトリー測定を行った。本発明の全てのPSMA結合タンパク質(二量体を含む)は、LNCaP細胞及びHEK293-PSMA細胞の細胞表面発現PSMAと結合していること(図1、図2、図3参照;結合は、図において「はい」で示す)、及びPSMAネガティブセルラインHEK293-pEntry又はPC3細胞で結合しないことを示した。ユビキチンは、LNCaP細胞及びHEK293-PSMA細胞で結合しないことを示した。PSMA発現細胞でのポジティブ結合も、抗PSMA抗体に対して観察された。例えば、配列番号4は、HEK-PSMA及びLNCaP細胞との強い細胞結合を示した。
50nMの濃度を、PSMA発現LNCaP細胞及びコントロールセルラインPC3(PSMA発現なし)で試験した。ビスユビキチンを、非PSMA結合タンパク質に対するコントロールとして使用し、1μg/ml抗PSMA抗体はPSMA結合に対するポジティブコントロールの役割をした。ポリ-D-溶解素被覆Lab-Tek(登録商標)Chamber-Slides(Sigma-Aldrich)中に1×105細胞/mlの濃度で細胞を播種した。72時間を超えて培養後、細胞をメタノール(5分、-20℃)で固定し、次いで、遮断(PBS中の5%ウマ胎児血清、1時間)し、室温で45分間50nMのPSMA結合タンパク質と共にインキュベーションした。ウサギ抗Strepタグ抗体(1:500)と共に1時間、その後、抗ウサギIgG-Alexa488抗体(1:1000)と共に1時間のインキュベーションによりPSMA結合を検出した。4μg/mlのDAPIで核を染色した。全インキュベーションステップを室温で行った。LNCaP細胞の二量体配列番号54、二量体配列番号55及び単量体配列番号25のPSMA結合を確証したが、PC3細胞との結合は観察できなかった。
凍結LNCaP異種移植腫瘍及びF9同系移植腫瘍スライスの組織片を使用して、本発明の結合タンパク質を分析した。組織片を、10分間氷冷アセトンで固定した。PSMA結合タンパク質の二量体は、精製及び検出目的のため、C末端Strepタグ(例えば、配列番号71参照)を含んだ。遮断し、配列番号54の50nM及び10nMの二量体、配列番号52及び配列番号53の100nM及び10nMの二量体並びに100nMのコントロールタンパク質未修飾ビスユビキチンと共にインキュベートした後、ウサギ抗Strepタグ抗体(1:500)と共に1時間、切片をインキュベートした。次いで、Novolink(商標)ポリマー(Leica、RE7290-CE)で、切片を処理した。AEC溶液(DAKO)で1分間、切片をインキュベートしてタンパク質の結合を可視化した。核をマイアーのヘマラム溶液(Merck Millipore、カタログ番号109249)で染色した。全インキュベーションステップを室温で行った。2μg/mlの抗PSMA抗体GCP-04(Novus Biologicals)及び14μg/mlのGCP-05(Thermo Scientific)は、ポジティブコントロールの役割をした。LNCaP腫瘍組織の50nMヘテロ二量体(配列番号54)及び100nMホモ二量体(配列番号52及び配列番号53)の強いPSMA結合を確証した。抗PSMA抗体GCP-04及びGCP-05は同じ染色パターンを示したが、未修飾ユビキチンは染色しなかった。F9腫瘍組織の非特異的染色は観察されなかった。
単離PSMA-Affilinタンパク質が同じ又は異なるPSMAエピトープと結合するかどうかを調査するため、次のアッセイを行った:PSMA-Fc融合タンパク質(60nM)を、NHS/EDC化学を用いて組換えタンパク質Aと結合されたCM5 Biacoreチップに固定し、1000応答単位(RU)を得た。第一実験では、配列番号25(モチーフKHNTW)及び配列番号15(モチーフGFAHR及びWTTTF)を、0.005%のTween20を含むPBST 30μl/分の流速で1つの規定濃度(0.5μM)で注射した。第二実験では、同じフローチャネルに、先ず500nMの配列番号25を、チップ表面が飽和するまで事前ロードした。次のステップでは、500nMの配列番号15を、第一実験と同様に適用した。あるいは、第二実験では、同じフローチャネルに、先ず500nMの配列番号15を、チップ表面が飽和するまで事前ロードし、次いで、500nMの配列番号25をロードした。
二量体タンパク質を、室温で3時間、50mM HEPES、150mM塩化ナトリウム、5mM EDTA pH7.0中の20倍過剰のマレイミド-DOTA(2,2’,2’’-(10-(2-((2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル)アミノ)-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリイル)三酢酸、CheMatech)と共にインキュベートした。DOTA分子と相互作用するかもしれない金属イオンを低減するため、全カラム及びAKTA装置(GE Healthcare)を、30分間、0.1M EDTA溶液と共にインキュベートした。溶液を調製するため、金属フリー又は金属低減成分のみを使用した。インキュベーション後、サンプルを、100mM酢酸ナトリウム pH5.0~5.8中のゲルろ過(Superdex S200、GE Healthcare)によって、非結合DOTA分子から分離した。標識化タンパク質のサンプルを、室温で1時間、5mM塩化鉄(II)と共にインキュベートして、DOTA分子が放射性同位体との結合に使用可能であることを証明した。インキュベーション後、非結合鉄を、HiTrap脱塩カラム(GE Healthcare)を用いて除去した。MALDI-TOF分析を使用して、標識化の程度を決定した。
マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析(MALDI-TOF)を次のように行った:融合タンパク質を、C18-P10-ZipTips(Millipore;カタログ番号ZTC18S096)を用いて精製・濃縮した。チップを0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液で洗浄し、50%(v/v)アセトニトリル/0.1%TFAで溶離した。サンプルを2%(v/v)TFA水溶液で処理し、2,5-ジヒドロキシアセトフェノン(DHAP)マトリックス(Bruker、カタログ番号8231829)に包埋した。融合タンパク質の質量を、autoflex(商標)speed質量分析装置(Bruker)で測定した。タンパク質校正標準(Bruker、パーツ番号8206355及びパーツ番号8207234)を、autoflex speed質量分析装置の調節のために使用した。
たとえ血清が存在してもPSMA結合タンパク質が安定することを分析した。PSMA結合タンパク質は、精製及び検出目的のため、C末端FLAGタグ(DYKDDDDK;例えば、配列番号78参照)を含んだ。GFAHRを有するユビキチン変異タンパク質、又はこれと80%同一性を有するモチーフ、例えば、配列番号4又は配列番号11をベースとするPSMA結合タンパク質を、37℃0時間又は24時間、100%マウス血清中1μM~5.6pMの段階希釈と共にインキュベートした。100μlのAffilin血清溶液を使用してHEK293-PSMA細胞における血清安定性を分析した。上澄みを取り出した後、1μg/ml抗Flagタグ抗体(Sigma-Aldrich;F1804)及び抗マウスIgG-Alexa488(Invitrogen;A10680)を用いて結合を証明した。FACS分析は、マウス血清における24時間インキュベーション後でさえPSMA結合を確認した(表4参照)。さらに、PSMA結合タンパク質を試験し、PSMAとの結合を血清の存在下でも確認した。
高結合96ウェルプレート(Greiner、781061)を、4℃で一夜、2.5μg/mlのPSMA-Fcで固定した。Affilin-191871(C末端SACを有する;配列番号5)の段階希釈及びルテチウムLu3+で標識化された配列番号5 Dotaを、37℃で一夜、100%マウス血清中でインキュベートした。ELISAプレートを1×PBSで洗浄し、室温において2時間、3%BSA/0.5%Tween/PBSで遮断した。血清の存在下、0時間又は24時間インキュベーション後の段階希釈を、室温で1時間、ELISAプレートでインキュベートした。PBSTでの洗浄後、ウェルを、室温で1時間、ビオチン化抗ユビキチン抗体(1:1000)と共にインキュベートした。結合を、ストレプトアビジン-HRP(1:10,000)で可視化した。PSMA結合タンパク質は、24時間の血清インキュベーション後、KDの有意なシフトを示さない。例えば、ELISA分析は、0.75±0.02のKDを有するマウス血清中の24時間インキュベーション後でさえ、配列番号5及びルテチウムLu3+で標識化された配列番号5 Dotaの、PSMAとの結合を確証した(マウス血清中0時間のインキュベーションにおける0.53±0.02のKDと比較して)。
Claims (14)
- 前立腺特異的膜抗原(PSMA)結合タンパク質であって、前記PSMA結合タンパク質は、配列番号1に記載のユビキチンをベースとする1つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、配列番号1に記載のユビキチンの62位、63位、64位、65位、66位に対応するアミノ酸残基においてアミノ酸結合モチーフGFAHR、又はこれと80%の同一性を有するモチーフを含む、PSMA結合タンパク質。
- さらに、配列番号1のユビキチンの6位及び8位に対応するアミノ酸は置換されている、請求項1に記載のPSMA結合タンパク質。
- さらに、配列番号1のユビキチンの42位、44位、68位、70位、及び72位に対応するアミノ酸は置換されている、請求項2に記載のPSMA結合タンパク質。
- さらに、ユビキチン(配列番号1)の6位、8位、9位、10位、12位、及び46位に対応するアミノ酸は置換されているか、又はさらに、ユビキチン(配列番号1)の9位及び10位に対応するアミノ酸間に6以下のアミノ酸が挿入されている、請求項3に記載のPSMA結合タンパク質。
- 前記PSMA結合タンパク質は、請求項1~4のいずれか一項に記載の複数のPSMA結合タンパク質を含む多量体である、請求項1~4のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質。
- 前記PSMA結合タンパク質は、請求項1~4のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質の二量体である、請求項1~5のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質。
- 前記PSMA結合タンパク質は、配列番号3~15、20~22、24、52、54、及び55の群から選択される、又はそれぞれ、これらと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むか又はから成る、請求項1~6のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質。
- 前記PSMA結合タンパク質は、500nM以下のPSMAの細胞外ドメインと特異的結合親和性を有する、請求項1~7のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質。
- 前記PSMA結合タンパク質は、化学部分との結合のための1つ以上の結合部位をさらに含み、好ましくは、前記化学部分は、キレート剤、薬剤、トキシン、染料、及び小分子のいずれかから選択される、請求項1~8のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質。
- 前記PSMA結合タンパク質は、放射性核種、蛍光タンパク質、感光剤、染料、若しくは酵素、若しくは上記のいずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも1つの診断的活性部分をさらに含むか、又はモノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、結合タンパク質、放射性核種、細胞傷害性化合物、サイトカイン、ケモカイン、酵素、若しくはこれらの誘導体、若しくは上記いずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも1つの治療的活性部分をさらに含む、請求項1~9のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質。
- 前記PSMA結合タンパク質は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合タンパク質、免疫グロブリン結合タンパク質、又は免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンフラグメント、多糖類、又はアミノ酸アラニン、グリシン、セリン、プロリンを含む不飽和アミノ酸配列から必要に応じて選択される薬物動態を調節する少なくとも1つの部分をさらに含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質。
- PSMA関連腫瘍の診断又は治療において使用するため、好ましくは、腫瘍の画像診断のため、及びPSMA関連腫瘍の放射線治療のための、請求項1~11のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質。
- PSMA結合タンパク質を含む組成物であって、医療において使用するため、好ましくは、前記PSMA関連腫瘍の診断又は治療において使用するため、好ましくは、腫瘍の画像診断のため及びPSMA関連腫瘍の放射線治療のための、請求項1~12のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質を含む組成物。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載のPSMA結合タンパク質の製造方法であって、前記方法は、a)前記PSMA結合タンパク質を得るために適した条件下で宿主細胞を培養するステップ及びb)前記産生されたPSMA結合タンパク質を単離するステップを含む、方法。
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