JP2022524975A - 複雑な生物学的マトリックスにおける試料間アナライト変動性の低減 - Google Patents

複雑な生物学的マトリックスにおける試料間アナライト変動性の低減 Download PDF

Info

Publication number
JP2022524975A
JP2022524975A JP2021552175A JP2021552175A JP2022524975A JP 2022524975 A JP2022524975 A JP 2022524975A JP 2021552175 A JP2021552175 A JP 2021552175A JP 2021552175 A JP2021552175 A JP 2021552175A JP 2022524975 A JP2022524975 A JP 2022524975A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
test sample
sample
buffer
assay
total protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021552175A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020198011A5 (ja
Inventor
ダニエル ドロレ
デイビッド アストリング
カルロヴィッツ アイラ ヴォン
トーマス ハワード フラハ
ジャン ホー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Somalogic Operating Co Inc
Original Assignee
Somalogic Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Somalogic Inc filed Critical Somalogic Inc
Publication of JP2022524975A publication Critical patent/JP2022524975A/ja
Publication of JPWO2020198011A5 publication Critical patent/JPWO2020198011A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
    • G01N15/075—Investigating concentration of particle suspensions by optical means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

【課題】本明細書では、生物学的マトリックスからの試料間アナライト測定値の変動性を低減するための組成物及び方法が記載される。【解決手段】いくつかの実施形態において、本開示は、プロテオミクスアッセイによる測定における生物学的試料からの１つ以上のタンパク質の試料間レベルの変動性を低減するための方法に関する。【選択図】なし

Description

本開示は、概して、生物学的試料からの試料間アナライト測定値の変動性を低減することに関する。いくつかの実施形態において、本開示は、プロテオミクスアッセイによる測定における１つ以上のタンパク質の試料間レベルの変動性を低減するための組成物及び方法に関する。
生物学的試料におけるアナライト測定値の試料間変動性は、バイオマーカーの発見、代謝分析、遺伝子発現分析、タンパク質経路分析、ならびに診断及び予後ツールにおいて問題となり、とりわけ結果が比較的差の小さい定量的生物学的シグナルに依存する場合に問題となる。高い試料間変動性を示す生物学的試料タイプは、このような試料タイプを扱う上で主要な課題である。このような変動性を低減すれば、実験及び臨床の適用例において、より一貫性が高く意味のあるデータセットがもたらされるであろう。
そのため、生物学的マトリックスにおける試料間アナライト測定値の変動性を低減するための代替的な組成物及び方法が継続的に必要とされている。本開示は、複雑なマトリックスにおける生物学的シグナルを正規化するための新規の組成物及び方法を提供することによってこのようなニーズを満たすものであり、当該組成物及び方法によってこのような変動性が低減、最小化、または除去される。
本明細書では、緩衝液交換された生物学的試料と、緩衝液交換を含むタンパク質を検出するための生物学的試料を調製する方法とが提供される。いくつかの実施形態において、緩衝液交換生物学的試料を含むまたはそれから生成された試験試料で測定されたアナライトレベルの試料間変動は、緩衝液交換されていない生物学的試料を含むまたはそれから生成された試料と比較して低減される。いくつかの実施形態において、緩衝液交換を含む方法を用いて生成された試験試料のアナライトレベルの試料間変動は、緩衝液交換を含まない方法と比較して低減される。いくつかの実施形態において、緩衝液交換された生物学的試料を含むまたはそれから生成された試験試料中のアナライトにおける測定値の線形範囲は、緩衝液交換されていない生物学的試料を含むまたはそれから生成されたアナライト中のアナライトにおける測定値の線形範囲よりも大きい。いくつかの実施形態において、アナライトはタンパク質（例えば、標的タンパク質）である。いくつかの実施形態において、生物学的試料は尿試料である。いくつかの実施形態において、試験試料中の総タンパク質濃度は２μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、試験試料中の総タンパク質濃度は、２μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬである。いくつかのこのような実施形態において、試験試料または生物学的試料の総タンパク質濃度は、総タンパク質濃度が約２μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬの範囲内にないことが決定した後に、その範囲に調整される。いくつかの実施形態において、試験試料の総タンパク質濃度は、総タンパク質濃度の調整なしで約２μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬの範囲にある。いくつかのこのような実施形態において、総タンパク質濃度は、蛍光リードアウトアッセイを用いて測定される。いくつかの実施形態において、試験試料中の総タンパク質濃度は７０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬである。いくつかのこのような実施形態において、試験試料の総タンパク質濃度は、総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬの範囲内にないことが決定した後に、その範囲に調整される。いくつかの実施形態において、試験試料の総タンパク質濃度は、総タンパク質濃度の調整なしで約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬの範囲にある。いくつかのこのような実施形態において、総タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイを用いて測定される。いくつかの実施形態において、複数の試験試料または複数の生物学的試料の各々の総タンパク質濃度は、同じであるように調整される。
本明細書で提供される、ある特定の実施形態を以下に列挙する。
実施形態１．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
ａ）緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
ｂ）前記試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、調整された試験試料を生成することとを含み、前記調整された試験試料における総タンパク質濃度が約２μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬである、前記方法。
実施形態２．前記試験試料のタンパク質濃度を定量することを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
ａ）緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対する緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
ｂ）前記試験試料の総タンパク質濃度を定量することと、
ｃ）前記試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、調整された試験試料を生成することとを含み、前記調整された試験試料における総タンパク質濃度が約２μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬである、前記方法。
実施形態４．複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することを含み、調整された各試験試料の総タンパク質濃度がほぼ同じである、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５．複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することを含み、調整された各試験試料の総タンパク質濃度が同じである、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製する方法であって、
ａ）緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対する緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
ｂ）前記試験試料のタンパク質濃度を定量することと、
ｃ）前記試験試料の総タンパク質濃度が約２μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬの範囲内にない場合に、試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、調整された試験試料を生成することとを含み、前記調整された試験試料における総タンパク質濃度が約２μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬである、前記方法。
実施形態７．前記試験試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約８μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、または４０μｇ／ｍＬ未満、または３０μｇ／ｍＬ未満、または２０μｇ／ｍＬ未満、または約１５μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬの範囲にない場合に、前記生物学的試料の総タンパク質濃度を前記範囲に調整することにより、調整された試験試料を生成する、実施形態６に記載の方法。
実施形態８．前記１つ以上の塩が各々独立的に、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９．前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０．前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、実施形態８または９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１．前記製剤中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２．前記製剤中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態１０または１１に記載の方法。
実施形態１３．前記製剤中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４．前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５．前記製剤中の前記緩衝剤が、約４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１６．前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７．前記製剤中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８．前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９．前記非イオン界面活性剤が、前記製剤の約０．０１％～約１％、または前記製剤の約０．０２％～約０．５％、または前記製剤の約０．０３％～約０．１％、または前記製剤の約０．０４％～約０．０８％、または前記製剤の約０．０５％、または前記製剤の約０．１％（容量対容量）である、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２０．前記調整された試験試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約８μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、または４０μｇ／ｍＬ未満、または３０μｇ／ｍＬ未満、または２０μｇ／ｍＬ未満、または約１５μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬである、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１．前記試験試料または前記調整された試験試料の総タンパク質濃度が、蛍光リードアウトアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群より選択されるアッセイによって定量される、実施形態２～２０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２．前記蛍光リードアウトアッセイが、メロシアニン色素及びエピココノンから選択される試薬を含む、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４．前記製剤のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２５．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０からなり、ｐＨが７．５である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６．前記緩衝液交換が限外濾過で実施されない、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２７．前記緩衝液交換がゲル濾過クロマトグラフィーによって実施される、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２８．前記生物学的試料が尿試料である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９．前記生物学的試料が血清試料である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０．前記方法が、前記生物学的試料を濃縮することを含まない、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１．緩衝液交換された生物学的試料を含む試験試料であって、前記試験試料の総タンパク質濃度が約２μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬであり、前記緩衝液交換された生物学的試料が、緩衝剤、１つ以上の塩、キレート剤、及び非イオン界面活性剤を含む、前記試験試料。
実施形態３２．１つ以上のタンパク質捕捉試薬をさらに含む、実施形態３１に記載の試験試料。
実施形態３３．前記１つ以上のタンパク質捕捉試薬の各々が、アプタマーまたは抗体である、実施形態３２に記載の試験試料。
実施形態３４．前記試験試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬ～４５μｇ／ｍＬ、または約４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約８μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～３０μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬ未満、または４０μｇ／ｍＬ未満、または３０μｇ／ｍＬ未満、または２０μｇ／ｍＬ未満、または約１５μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬである、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態３５．前記１つ以上の塩が各々独立的に、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態３６．前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態３７．前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、実施形態３５または３６に記載の試験試料。
実施形態３８．前記試験試料中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、実施形態３７に記載の試験試料。
実施形態３９．前記試験試料中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態３７または３８に記載の試験試料。
実施形態４０．前記試験試料中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態４１．前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、実施形態３１～４０のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態４２．前記試験試料中の前記緩衝剤が、約４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、実施形態３１～４１のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態４３．前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、実施形態３１～４２のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態４４．前記試験試料中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、実施形態３１～４３のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態４５．前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、実施形態３１～４４のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態４６．前記非イオン性界面活性剤が、前記試験試料の約０．０１％～約１％、または前記試験試料の約０．０２％～約０．５％、または前記試験試料の約０．０３％～約０．１％、または前記試験試料の約０．０４％～約０．０８％、または前記試験試料の約０．０５％（容量対容量）である、実施形態３１～４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７．前記試験試料の総タンパク質濃度が、蛍光リードアウトアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群より選択されるアッセイによって定量される、実施形態３１～４６のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態４８．前記蛍光リードアウトアッセイが、メロシアニン色素及びエピココノンから選択される試薬を含む、実施形態４７に記載の試験試料。
実施形態４９．前記試験試料が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む、実施形態３１～４８のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態５０．前記試験試料のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、実施形態３１～４９のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態５１．少なくとも１つの捕捉試薬がアプタマーであり、前記少なくとも１つのアプタマーが５位修飾ピリミジンを含む、実施形態３１～５０のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態５２．前記５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの５位に疎水性部分を含む、実施形態５１に記載の試験試料。
実施形態５３．前記疎水性部分が、ナフチル部分、フェニル部分、チロシル部分、インドール部分、及びモルホリノ部分から選択される、実施形態５２に記載の試験試料。
実施形態５４．前記疎水性部分が、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含むリンカーを介して前記塩基の５位と共有結合している、実施形態５２または５３に記載の試験試料。
実施形態５５．前記生物学的試料が尿試料である、実施形態３１～５４のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態５６．前記生物学的試料が血清試料である、実施形態３１～５４のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態５７．試験試料中の標的タンパク質を検出するための方法であって、
ａ）前記試験試料を少なくとも１つの捕捉試薬に接触させることであって、前記少なくとも１つの捕捉試薬が、複合体を形成するように前記標的タンパク質に結合可能である、前記接触させることと、
ｂ）前記複合体の形成を可能にする条件下で、前記試験試料を前記少なくとも１つの捕捉試薬とインキュベートすることと、
ｃ）前記少なくとも１つの捕捉試薬、前記複合体、または前記タンパク質のレベルを測定することにより、前記試験試料中の前記標的タンパク質のレベルを定量することであって、前記少なくとも１つの捕捉試薬または前記複合体のレベルが、前記標的タンパク質のレベルの代替である、前記定量することとを含み、
前記試験試料が、緩衝剤と、塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することによって生成され、
前記試験試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ以上約６０μｇ／ｍＬ未満である、前記方法。
実施形態５８．前記少なくとも１つのタンパク質捕捉試薬が、アプタマーまたは抗体である、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９．複数の捕捉試薬を含み、各捕捉試薬がアプタマーである、実施形態５７または５８に記載の方法。
実施形態６０．前記試験試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬ～４５μｇ／ｍＬ、または約４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約８μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～３０μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬ未満、または４０μｇ／ｍＬ未満、または３０μｇ／ｍＬ未満、または２０μｇ／ｍＬ未満、または約１５μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬである、実施形態５７～５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１．前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、実施形態５７～６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２．前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、実施形態５７～６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３．前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、実施形態６１または６２に記載の方法。
実施形態６４．前記製剤中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５．前記製剤中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態６３または６４に記載の方法。
実施形態６６．前記製剤中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態６３～６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７．前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、実施形態５７～６６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６８．前記製剤中の前記緩衝剤が４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、実施形態５７～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６９．前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、実施形態５７～６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７０．前記製剤中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、実施形態５７～６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７１．前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、実施形態５７～７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２．前記非イオン界面活性剤が、前記製剤の約０．０１％～約１％、または前記製剤の約０．０２％～約０．５％、または前記製剤の約０．０３％～約０．１％、または前記製剤の約０．０４％～約０．０８％、または前記製剤の約０．０５％である、実施形態５７～７１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７３．前記方法の総タンパク質濃度が、蛍光リードアウトアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群より選択されるアッセイによって測定される、実施形態５７～７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７４．前記蛍光リードアウトアッセイが、メロシアニン色素及びエピココノンから選択される試薬を含む、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む、実施形態５７～７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．５）からなる、実施形態５７～７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７．前記製剤のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、実施形態５７～７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７８．前記アプタマーが５位修飾ピリミジンを含む、実施形態５８～７７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７９．前記５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの５位に疎水性部分を含む、実施形態７８に記載の方法。
実施形態８０．前記疎水性部分が、ナフチル部分、フェニル部分、チロシル部分、インドール部分、及びモルホリノ部分から選択される、実施形態７９に記載の方法。
実施形態８１．前記疎水性部分が、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含むリンカーを介して前記塩基の５位と共有結合している、実施形態７９または８０に記載の方法。
実施形態８２．前記複合体が非共有結合複合体である、実施形態５７～８１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８３．前記少なくとも１つの捕捉試薬が、前記試験試料に接触させる前に第１の固体支持体に結合するか、または前記捕捉試薬が、前記試験試料に接触させた後に第１の固体支持体に結合する、実施形態５７～８２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８４．前記複合体を、前記捕捉試薬を介して第１の固体支持体に結合させることをさらに含む、実施形態５７～８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５．前記第１の固体支持体から複合体を解放することと、前記複合体を第２の固体支持体に結合させることとをさらに含む、実施形態８４に記載の方法。
実施形態８６．前記複合体が、前記タンパク質を介し前記第２の固体支持体に結合する、実施形態８５に記載の方法。
実施形態８７．競合分子を前記試験試料に加えること、及び／または競合分子を加え、前記試験試料を希釈することをさらに含む、実施形態５７～８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８８．前記競合分子がポリアニオン競合物質である、実施形態８７に記載の方法。
実施形態８９．前記ポリアニオン競合物質が、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン、及びｄＮＴＰから選択される、実施形態８８に記載の方法。
実施形態９０．前記ポリアニオン性競合物質がポリデキストランであり、前記ポリデキストランがデキストラン硫酸である、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９１．前記ポリアニオン競合物質がオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドが１つ以上の５位修飾ピリミジンを含む、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９２．前記生物学的試料が尿である、実施形態５７～９１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９３．前記生物学的試料が血清である、実施形態５７～９１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９４．前記緩衝液交換がゲル濾過クロマトグラフィーを用いて実施される、実施形態１～３０または５７～９３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９５．前記緩衝液交換された生物学的試料を生成する目的で、ゲル濾過クロマトグラフィーが、前記生物学的試料に対する前記緩衝液交換の実施のために使用された、実施形態３１～５６のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態９６．前記緩衝液交換を実施する前に、前記生物学的試料のタンパク質濃度を測定することをさらに含む、実施形態１～３０または５７～９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９７．前記生物学的試料のタンパク質濃度が、蛍光読み出しアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、マイクロＢＣＡアッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群より選択されるアッセイによって測定される、実施形態９６に記載の方法。
実施形態９８．総タンパク質濃度を定量するために使用される前記アッセイが、前記生物学的試料の緩衝液交換の前に実施される、実施形態４７～５６または９５のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態９９．総タンパク質濃度を定量するために使用される前記アッセイが、前記生物学的試料の緩衝液交換の後に実施される、実施形態４７～５６、９５、または９８のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１００．タンパク質を検出するための複数の生物学的試料を調製するための方法であって、
緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することと、
複数の試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、複数の調整された試験試料を生成することとを含み、調整された各試験試料の総タンパク質濃度がほぼ同じであり、
前記方法が、前記緩衝液交換を実施する前に前記複数の生物学的試料の総タンパク質を濃縮することを含まない、前記方法。
実施形態１０１．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
前記試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、調整された試験試料を生成することとを含み、前記調整された試験試料における総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬである、前記方法。
実施形態１０２．前記試験試料もしくは前記複数の試験試料及び／または前記生物学的試料もしくは前記複数の生物学的試料のタンパク質濃度を定量することを含む、実施形態１００または１０１に記載の方法。
実施形態１０３．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対する緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
前記試験試料の総タンパク質濃度を定量することと、
前記試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、調整された試験試料を生成することとを含み、前記調整された試験試料における総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬである、前記方法。
実施形態１０４．複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することを含み、調整された各試験試料の総タンパク質濃度がほぼ同じである、実施形態１０１～１０３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０５．複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することを含み、調整された各試験試料の総タンパク質濃度が同じである、実施形態１００～１０３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０６．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製する方法であって、
緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対する緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
前記試験試料のタンパク質濃度を定量することと、
前記試験試料の総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬの範囲内にない場合に、試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、調整された試験試料を生成することとを含み、前記調整された試験試料における総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬである、前記方法。
実施形態１０７．前記試験試料の総タンパク質濃度が、約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約９５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約９０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約８５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約７５μｇ／ｍＬの範囲内にない場合に、前記試験試料の総タンパク質濃度を前記範囲に調整することにより、調整された試験試料を生成する、実施形態１０６に記載の方法。
実施形態１０８．前記１つ以上の塩が各々独立的に、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、実施形態１００～１０７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０９．前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、実施形態１００～１０７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１０．前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、実施形態１０８または１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１１．前記製剤中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約７５～１２５ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、実施形態１１０に記載の方法。
実施形態１１２．前記製剤中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態１１０または１１１に記載の方法。
実施形態１１３．前記製剤中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態１１０～１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４．前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、実施形態１００～１１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５．前記製剤中の前記緩衝剤が、約４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、実施形態１１４に記載の方法。
実施形態１１６．前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、実施形態１００～１１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１７．前記製剤中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、実施形態１１６に記載の方法。
実施形態１１８．前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、実施形態１００～１１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１９．前記非イオン界面活性剤が、前記製剤の約０．０１％～約１％、または前記製剤の約０．０２％～約０．５％、または前記製剤の約０．０３％～約０．１％、または前記製剤の約０．０４％～約０．０８％、または前記製剤の約０．０５％、または前記製剤の約０．１％（容量対容量）である、実施形態１１８に記載の方法。
実施形態１２０．前記調整された試験試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬ～約７５μｇ／ｍＬ、または約４μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、または約８μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬである、実施形態１００～１１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２１．前記試験試料または前記調整された試験試料の総タンパク質濃度が、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって定量され、前記ＢＣＡアッセイが、任意選択でマイクロＢＣＡアッセイである、実施形態１０２～１２０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２２．前記アッセイが、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬またはビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬、ならびに任意選択でアルカリ性酒石酸－炭酸緩衝液及び／または硫酸銅溶液を含む、実施形態１２１に記載の方法。
実施形態１２３．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む、実施形態１００～１２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２４．前記製剤のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、実施形態１００～１２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２５．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０からなり、ｐＨが７．５である、実施形態１００～１２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２６．前記緩衝液交換が限外濾過で実施されない、実施形態１００～１２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２７．前記緩衝液交換がゲル濾過クロマトグラフィーによって実施される、実施形態１００～１２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２８．前記生物学的試料が尿試料である、実施形態１００～１２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２９．前記生物学的試料が血清試料である、実施形態１００～１２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３０．前記方法が、前記生物学的試料を濃縮することを含まない、実施形態１０１～１２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３１．緩衝液交換された生物学的試料を含む試験試料であって、前記試験試料の総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬであり、前記緩衝液交換された生物学的試料が、緩衝剤、１つ以上の塩、キレート剤、及び非イオン界面活性剤を含む、前記試験試料。
実施形態１３２．１つ以上のタンパク質捕捉試薬をさらに含む、実施形態１３１に記載の試験試料。
実施形態１３３．前記１つ以上のタンパク質捕捉試薬の各々が、アプタマーまたは抗体である、実施形態１３２に記載の試験試料。
実施形態１３４．前記試験試料の総タンパク質濃度が、約７０μｇ／ｍＬ～９５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～９０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～８５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～８０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬである、実施形態１３１～１３３のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１３５．前記１つ以上の塩が各々独立的に、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、実施形態１３１～１３４のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１３６．前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、実施形態１３１～１３５のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１３７．前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、実施形態１３５または１３６に記載の試験試料。
実施形態１３８．前記試験試料中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、実施形態１３７に記載の試験試料。
実施形態１３９．前記試験試料中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態１３７または１３８に記載の試験試料。
実施形態１４０．前記試験試料中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態１３７～１３９のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１４１．前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、実施形態１３１～１４０のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１４２．前記試験試料中の前記緩衝剤が、約４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、実施形態１３１～１４１のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１４３．前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、実施形態１３１～１４２のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１４４．前記試験試料中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、実施形態１３１～１４３のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１４５．前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、実施形態１３１～１４４のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１４６．前記非イオン性界面活性剤が、前記試験試料の約０．０１％～約１％、または前記試験試料の約０．０２％～約０．５％、または前記試験試料の約０．０３％～約０．１％、または前記試験試料の約０．０４％～約０．０８％、または前記試験試料の約０．０５％（容量対容量）である、実施形態１３１～１４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４７．前記試験試料の総タンパク質濃度が、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって定量され、前記ＢＣＡアッセイが、任意選択でマイクロＢＣＡアッセイである、実施形態１３１～１４６のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１４８．前記アッセイが、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬またはビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬、ならびに任意選択でアルカリ性酒石酸－炭酸緩衝液及び／または硫酸銅溶液を含む、実施形態１４７に記載の試験試料。
実施形態１４９．前記試験試料が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む、実施形態１３１～１４８のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１５０．前記試験試料のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、実施形態１３１～１４９のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１５１．少なくとも１つの捕捉試薬がアプタマーであり、前記少なくとも１つのアプタマーが５位修飾ピリミジンを含む、実施形態１３１～１５０のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１５２．前記５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの５位に疎水性部分を含む、実施形態１５１に記載の試験試料。
実施形態１５３．前記疎水性部分が、ナフチル部分、フェニル部分、チロシル部分、インドール部分、及びモルホリノ部分から選択される、実施形態１５２に記載の試験試料。
実施形態１５４．前記疎水性部分が、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含むリンカーを介して前記塩基の５位と共有結合している、実施形態１５２または１５３に記載の試験試料。
実施形態１５５．前記生物学的試料が尿試料である、実施形態１３１～１５４のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１５６．前記生物学的試料が血清試料である、実施形態１３１～１５４のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１５７．前記緩衝液交換された生物学的試料を生成する目的で、ゲル濾過クロマトグラフィーが、前記生物学的試料に対する前記緩衝液交換の実施のために使用された、実施形態１３１～１５６のいずれか１つに記載の試験試料。
実施形態１５８．試験試料中の標的タンパク質を検出するための方法であって、
前記試験試料を少なくとも１つの捕捉試薬に接触させることであって、前記少なくとも１つの捕捉試薬が、複合体を形成するように前記標的タンパク質に結合可能である、前記接触させることと、
前記複合体の形成を可能にする条件下で、前記試験試料を前記少なくとも１つの捕捉試薬とインキュベートすることと、
前記少なくとも１つの捕捉試薬、前記複合体、または前記タンパク質のレベルを測定することにより、前記試験試料中の前記標的タンパク質のレベルを定量することであって、前記少なくとも１つの捕捉試薬または前記複合体のレベルが、前記標的タンパク質のレベルの代替である、前記定量することとを含み、
前記試験試料が、生物学的試料と、緩衝剤、塩、キレート剤、及び非イオン界面活性剤を含む製剤との緩衝液交換を実施することによって生成され、前記試験試料の総タンパク質濃度が、約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ未満である、前記方法。
実施形態１５９．前記少なくとも１つのタンパク質捕捉試薬が、アプタマーまたは抗体である、実施形態１５８に記載の方法。
実施形態１６０．複数の捕捉試薬を含み、各捕捉試薬がアプタマーである、実施形態１５８または１５９に記載の方法。
実施形態１６１．前記試験試料の総タンパク質濃度が、約７０μｇ／ｍＬ～９５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～９０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～８５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～８０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬである、実施形態１５８～１６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６２．前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、実施形態１５８～１６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６３．前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、実施形態１５８～１６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６４．前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、実施形態１６２または１６３に記載の方法。
実施形態１６５．前記製剤中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、実施形態１６４に記載の方法。
実施形態１６６．前記製剤中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態１６４または１６５に記載の方法。
実施形態１６７．前記製剤中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態１６４～１６６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６８．前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、実施形態１５８～１６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６９．前記製剤中の前記緩衝剤が４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、実施形態１５８～１６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７０．前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、実施形態１５８～１６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７１．前記製剤中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、実施形態１５８～１７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７２．前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、実施形態１５８～１７１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７３．前記非イオン界面活性剤が、前記製剤の約０．０１％～約１％、または前記製剤の約０．０２％～約０．５％、または前記製剤の約０．０３％～約０．１％、または前記製剤の約０．０４％～約０．０８％、または前記製剤の約０．０５％である、実施形態１５８～１７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７４．前記試験試料の総タンパク質濃度が、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって測定され、前記ＢＣＡアッセイが、任意選択でマイクロＢＣＡアッセイである、実施形態１５８～１７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７５．前記アッセイが、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬またはビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬、ならびに任意選択でアルカリ性酒石酸－炭酸緩衝液及び／または硫酸銅溶液を含む、実施形態１７４に記載の方法。
実施形態１７６．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む、実施形態１５８～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７７．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．５）からなる、実施形態１５８～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７８．前記製剤のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、実施形態１５８～１７７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７９．前記アプタマーが５位修飾ピリミジンを含む、実施形態１５８～１７８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８０．前記５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの５位に疎水性部分を含む、実施形態１７９に記載の方法。
実施形態１８１．前記疎水性部分が、ナフチル部分、フェニル部分、チロシル部分、インドール部分、及びモルホリノ部分から選択される、実施形態１８０に記載の方法。
実施形態１８２．前記疎水性部分が、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含むリンカーを介して前記塩基の５位と共有結合する、実施形態１８０または１８１に記載の方法。
実施形態１８３．前記複合体が非共有結合複合体である、実施形態１５８～１８２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８４．前記少なくとも１つの捕捉試薬が、前記試験試料に接触させる前に第１の固体支持体に結合するか、または前記捕捉試薬が、前記試験試料に接触させた後に第１の固体支持体に結合する、実施形態１５８～１８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８５．前記複合体を、前記捕捉試薬を介して第１の固体支持体に結合させることをさらに含む、実施形態１５８～１８４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８６．前記第１の固体支持体から複合体を解放することと、前記複合体を第２の固体支持体に結合させることとをさらに含む、実施形態１８５に記載の方法。
実施形態１８７．前記複合体が、前記タンパク質を介し前記第２の固体支持体に結合する、実施形態１８６に記載の方法。
実施形態１８８．競合分子を前記試験試料に加えること、及び／または競合分子を加え、前記試験試料を希釈することをさらに含む、実施形態１５８～１８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８９．前記競合分子がポリアニオン競合物質である、実施形態１８８に記載の方法。
実施形態１９０．前記ポリアニオン競合物質が、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン、及びｄＮＴＰから選択される、実施形態１８９に記載の方法。
実施形態１９１．前記ポリアニオン性競合物質がポリデキストランであり、前記ポリデキストランがデキストラン硫酸である、実施形態１９０に記載の方法。
実施形態１９２．前記ポリアニオン競合物質がオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドが１つ以上の５位修飾ピリミジンを含む、実施形態１９０に記載の方法。
実施形態１９３．前記生物学的試料が尿である、実施形態１５８～１９２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９４．前記生物学的試料が血清である、実施形態１５８～１９２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９５．前記緩衝液交換がゲル濾過クロマトグラフィーを用いて実施される、実施形態１００～１３０または１５８～１９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９６．前記緩衝液交換を実施する前に、前記生物学的試料のタンパク質濃度を測定することをさらに含む、実施形態１００～１３０または１５８～１９５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９７．前記生物学的試料のタンパク質濃度が、蛍光読み出しアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、マイクロＢＣＡアッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群より選択されるアッセイによって測定される、実施形態１９６に記載の方法。
実施形態１９８．前記アッセイが、ＢＣＡアッセイまたはマイクロＢＣＡアッセイである、実施形態１９７に記載の方法。
実施形態１９９．前記アッセイが、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬またはビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬、ならびに任意選択でアルカリ性酒石酸－炭酸緩衝液及び／または硫酸銅溶液を含む、実施形態１９８に記載の方法。
実施形態２００．前記アッセイが蛍光リードアウトアッセイである、実施形態１９７に記載の方法。
実施形態２０１．前記蛍光リードアウトアッセイが、メロシアニン色素及びエピココノンから選択される試薬を含む、実施形態２００に記載の方法。
実施形態２０２．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
前記生物学的試料または前記試験試料の総タンパク質濃度を定量することと、
前記生物学的試料または前記試験試料の総タンパク質濃度を調整することとを含み、前記方法が、前記緩衝液交換を実施する前に前記生物学的試料の総タンパク質を濃縮することを含まない、前記方法。
実施形態２０３．前記試験試料の総タンパク質濃度が約２μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬである、実施形態２０２に記載の方法。
実施形態２０４．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
前記試験試料の総タンパク質濃度を定量することと、
前記生物学的試料の総タンパク質濃度を約２μｇ／ｍＬから約６０μｇ／ｍＬに調整することと、
緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対する緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することとを含む、前記方法。
実施形態２０５．複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することを含み、各試験試料の総タンパク質濃度がほぼ同じである、実施形態２０２～２０４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０６．複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することを含み、各試験試料の総タンパク質濃度が同じである、実施形態２０２～２０５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０７．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製する方法であって、
前記生物学的試料のタンパク質濃度を定量することと、
前記生物学的試料の総タンパク質濃度が約２μｇ／ｍＬから約６０μｇ／ｍＬの範囲にない場合に、前記生物学的試料の総タンパク質濃度を約２μｇ／ｍＬから約６０μｇ／ｍＬに調整することと、
緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対する緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することとを含む、前記方法。
実施形態２０８．前記生物学的試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約８μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、または４０μｇ／ｍＬ未満、または３０μｇ／ｍＬ未満、または２０μｇ／ｍＬ未満、または約１５μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬの範囲にない場合に、前記方法が、前記生物学的試料の総タンパク質濃度を前記範囲に調整することを含む、実施形態２０７に記載の方法。
実施形態２０９．前記１つ以上の塩が各々独立的に、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、実施形態２０２～２０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１０．前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、実施形態２０２～２０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１１．前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、実施形態２０９または２１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１２．前記製剤中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、実施形態２１１に記載の方法。
実施形態２１３．前記製剤中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態２１１または２１２に記載の方法。
実施形態２１４．前記製剤中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、実施形態２１１～２１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１５．前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、実施形態２０２～２１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１６．前記製剤中の前記緩衝剤が、約４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、実施形態２１５に記載の方法。
実施形態２１７．前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、実施形態２０２～２１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１８．前記製剤中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、実施形態２１７に記載の方法。
実施形態２１９．前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、実施形態２０２～２１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２０．前記非イオン界面活性剤が、前記製剤の約０．０１％～約１％、または前記製剤の約０．０２％～約０．５％、または前記製剤の約０．０３％～約０．１％、または前記製剤の約０．０４％～約０．０８％、または前記製剤の約０．０５％、または前記製剤の約０．１％（容量対容量）である、実施形態２１９に記載の方法。
実施形態２２１．前記試験試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約８μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、または４０μｇ／ｍＬ未満、または３０μｇ／ｍＬ未満、または２０μｇ／ｍＬ未満、または約１５μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬである、実施形態２０２～２２０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２２．前記試験試料または前記生物学的試料の総タンパク質濃度が、蛍光リードアウトアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群より選択されるアッセイによって定量される、実施形態２０３～２２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２３．前記蛍光リードアウトアッセイが、メロシアニン色素及びエピココノンから選択される試薬を含む、実施形態２２２に記載の方法。
実施形態２２４．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む、実施形態２０２～２２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２５．前記製剤のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、実施形態２０２～２２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２６．前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０からなり、ｐＨが７．５である、実施形態２０２～２２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２７．前記緩衝液交換が限外濾過で実施されない、実施形態２０２～２２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２８．前記緩衝液交換がゲル濾過クロマトグラフィーによって実施される、実施形態２０２～２２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２９．前記生物学的試料が尿試料である、実施形態２０２～２２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３０．前記生物学的試料が血清試料である、実施形態２０２～２２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３１．前記方法が、前記生物学的試料を濃縮することを含まない、実施形態２０２～２３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３２．タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
前記生物学的試料または前記試験試料の総タンパク質濃度を定量することと、
前記生物学的試料または前記試験試料の総タンパク質濃度を調整することとを含み、前記方法が、前記緩衝液交換を実施する前に前記生物学的試料の総タンパク質を濃縮することを含まず、
任意選択で、（ｉ）前記総タンパク質濃度が、前記緩衝液交換を実施する前に調整されるか、または（ｉｉ）前記総タンパク質濃度が、前記緩衝液交換を実施した後に調整される、前記方法。
実施形態２３２の方法はさらに、必要な変更を考慮しながら、先行実施形態の任意の適用可能な特徴を含むことができる。任意の前述の実施形態は、緩衝液交換の前または後に総タンパク質の調整（及び該当する場合は測定）が実施される順序で実施されてもよく、必要に応じて、緩衝液交換の前または後に総タンパク質の調整（及び該当する場合は測定）が実施されるように変更されてもよい。本明細書で開示または特許請求される任意の方法は、文言が明らかに別の内容を要求しない限り、両方の順序を包含するものとして、すなわち、緩衝液交換の前または後に総タンパク質の調整（及び該当する場合は測定）が実施されるものとして、解釈されるべきである。
ある特定の方法
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、生物学的試料または試験試料中の総タンパク質濃度の標準化を容易にする一方で、アナライト測定値における試料間変動性を限定し、試料中のアナライトの線形範囲を拡大する。いくつかの実施形態において、当該方法は、緩衝液交換を実施することを含む。いくつかのこのような実施形態において、緩衝液交換は、生物学的試料の総タンパク質濃度の調整及び生物学的試料の塩濃度の制御を共に可能にする。生物学的試料中の塩濃度の変動は、試料内のアナライトの測定で有意な変動を引き起こし得る。総タンパク質濃度及び塩濃度を調整する能力は、このような試料間変動性を限定する。いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、アナライト濃度の線形範囲を拡大し、緩衝液交換されていない生物学的試料または試験試料中のアナライトの測定よりも信頼性の高いアナライトの測定を可能にする。
いくつかの実施形態において、本明細書での方法は、生物学的試料の総タンパク質濃度を定量することを含む。いくつかのこのような実施形態において、生物学的試料の総タンパク質濃度は、生物学的試料の緩衝液交換の前に定量される。いくつかの実施形態において、本明細書での方法は、試験試料の総タンパク質濃度を定量することを含む。いくつかのこのような実施形態において、試験試料の総タンパク質濃度は、生物学的試料の緩衝液交換後に定量される。いくつかの実施形態において、総タンパク質濃度は、蛍光リードアウトアッセイを用いて定量される。いくつかの実施形態において、総タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイを用いて定量される。いくつかの実施形態において、試験試料の総タンパク質濃度は、ある特定の値またはある特定の範囲内であるように定量され、調整されない。いくつかの実施形態において、総タンパク質濃度は、ある特定の値ではないように定量されるか、またはある特定の範囲外であり、調整される。いくつかの実施形態において、範囲は、総タンパク質濃度を定量するために使用されるあらゆるタイプのアッセイにおいて同じではない。いくつかの実施形態において、本明細書での方法は、複数の生物学的試料から複数の試験試料を生成することを含み、いくつかの試験試料またはいくつかの生物学的試料の総タンパク質濃度は調整され、他の試験試料または他の生物学的試料の総タンパク質濃度は調整されない。
いくつかの実施形態において、本明細書での方法は、生物学的試料の総タンパク質の限外濾過または濃縮を含まない。いくつかのこのような実施形態において、緩衝液交換は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて実施される。
ある特定の試験試料
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される緩衝液交換試験試料は、約６０μｇ／ｍＬ未満、６０～１００μｇ／ｍＬ、または７０～１００μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度を含む。いくつかのこのような実施形態は、ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｔｗｅｅｎ、及びＥＤＴＡを含む。
生物学的試料中の試料間変動性
生物学的試料からの総タンパク質濃度の変動性（例えば、ランダムで非タイミング的な「スポット」尿検体）は、プロテオミクス解析に対する課題となっている。スポット尿試料中の総タンパク質の正常範囲は約１～１４ｍｇ／ｄＬであり、安静時には約５０～８０ｍｇ／日が排泄される。尿中タンパク質濃度は、年齢、運動、立位姿勢に伴って増加する傾向がある。ネフローゼ症候群では、タンパク質の総排泄量が１日３．５ｇを超えることがある。
尿検体間のタンパク濃度の変動性については、Ｔｈｏｍａｓ他が報告している（Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｓｅｘｔｏｎ Ｗ．，Ｂｅｎｓｏｎ Ｋ．，Ｓｕｔｐｈｅｎ Ｒ．，ａｎｄ Ｊ．Ｋｏｏｍｅｎ．（２０１０）． Ｕｒｉｎｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ １９（４）：９５３－９５９）。この研究では、連続１０日間にわたり１個体から全ての排尿を収集した。それぞれに対する総タンパク質濃度を定量し、検体間で１００倍超変動することが分かった。変動係数（ＣＶ）が最低だったのは、２４時間プール（３９％）及び朝の最初の排尿（４１％）であった。最大のＣＶは、１日のうち２回目の排尿（５４％）及び全てのスポット収集物（６１％）で観察された。
ヒト尿の組成及び濃度の特性。ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ Ｄｏｕｇｌａｓ Ａｓｔｒｏｎａｕｔｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｂｅａｃｈ，ＣＡ）によって米国航空宇宙局のために準備されたものからは、６８種の小分子成分が尿中の溶解性固体の９９％を構成することを示された。これらの６８種の分子は、典型的な尿試料では、１リットル当たり合計約３６．８グラムになる。上位１０分子は、尿素、塩化物、ナトリウム、カリウム、クレアチニン、無機硫黄、馬尿酸、リン、クエン酸、及びグルクロン酸であり、単位体積当たりの質量が最も高いものから最も低いものまでランク付けされている。ただし、尿検体間では、これらの６８成分のいずれの絶対濃度もかなり変動する。以下の表１は、いくつかの尿試料間で観察されたいくつかの違いをまとめたものである。
Figure 2022524975000001
対象間比較及び同じ対象からの試料間比較からの尿中総タンパク質濃度の変動性、これに加えてｐＨ、塩濃度、及び他の成分の変動性により、尿は、バイオマーカー発見及び診断におけるプロテオミクス測定値に対する困難なマトリックスとなる。これは、タンパク質レベルの測定値が、これらの尿中成分（例えば、塩及び他の固体）の存在、具体的には濃度に影響され得るためである。事実上、これらの成分のレベルが異なるがタンパク質の濃度が同じ試料においては、タンパク質レベルをアッセイする場合、試料の異なる成分のレベルに基づき異なるタンパク質測定値が得られることになる。
本発明の前述及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面を参照しながら進められる以下の詳細な説明からさらに明らかになる。
Ａ及びＢは、ＮａＣｌ濃度の関数としてのアナライト測定値の変化を示している。Ａ及びＢは共に、異なって提示された同じデータを示している。Ａは、ｘ軸上にＳＢ１７緩衝液製剤に対する追加のＮａＣｌ（ｍＭ）濃度（１０２ｍＭ ＮａＣｌで開始）、ｙ軸上にＲＦＵ（相対蛍光単位）のＬｏｇ２倍変化を示しており、この倍数変化は、対照緩衝液条件（ＳＢ１７緩衝液）に比べ、試料中に存在するアナライトの量と相関している。Ｂは、ｘ軸上にＳＢ１７緩衝液に対する追加のＮａＣｌ（ｍＭ）濃度（１０２ｍＭ ＮａＣｌで開始）、ｙ軸上にＮａＣｌ濃度の関数として増加または減少するアナライトのパーセントを示している。 Ａ及びＢは、ＭｇＣｌ２濃度の関数としてのアナライト測定値の変化を示している。Ａ及びＢは共に、異なって提示された同じデータを示している。Ａは、ｘ軸上にＳＢ１７緩衝液製剤に対する追加のＭｇＣｌ２（ｍＭ）濃度（５ｍＭ ＭｇＣｌ２で開始）、ｙ軸上にＲＦＵ（相対蛍光単位）のＬｏｇ２倍変化を示しており、この倍数変化は、対照緩衝液条件（ＳＢ１７緩衝液）に比べ、試料中に存在するアナライトの量と相関している。Ｂは、ｘ軸上にＳＢ１７緩衝液に対する追加のＭｇＣｌ２（ｍＭ）濃度（５ｍＭ ＭｇＣｌ２で開始）、ｙ軸上にＭｇＣｌ２濃度の関数として増加または減少するアナライトのパーセントを示している。 Ａ及びＢは、尿素濃度の関数としてのアナライト測定値の変化を示している。Ａ及びＢは共に、異なって提示された同じデータを示している。Ａは、ｘ軸上にＳＢ１７緩衝液製剤に対する尿素（ｍＭ）濃度（０ｍＭで開始）の追加、ｙ軸上にＲＦＵ（相対蛍光単位）のＬｏｇ２倍変化を示しており、この倍数変化は、対照緩衝液条件（ＳＢ１７緩衝液）に比べ、試料中に存在するアナライトの量と相関している。Ｂは、ｘ軸上にＳＢ１７緩衝液に対する追加の尿素（ｍＭ）濃度（０ｍＭで開始）、ｙ軸上に尿素濃度の関数として増加または減少するアナライトのパーセントを示している。 この滴定で測定された２，２９８検体における線形範囲を可視化したものを示している。黒色のバーは、試料の総タンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）（ｙ軸）の関数として、各アナライト（ｘ軸）における線形範囲の下限及び上限に及んでいる。 線形範囲内にある２，２９８のアナライトのパーセント（ｘ軸）を試料の総タンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）（ｙ軸）の関数として示している。 試料緩衝液交換がプロテオミクスアッセイにおけるアナライト線形性に及ぼす影響を示している。２つの異なるアナライトをアッセイで測定した。一方の試料は緩衝液交換に供し、他方の試料は緩衝液交換に供しなかった（対照）。試料の総タンパク質濃度（ｘ軸）に基づく滴定を実施し、ＲＦＵによって測定したアナライトのレベルをＬｏｇ２スケール（ｙ軸）にプロットした。対照試料中のＡＬＤＯタンパク質アナライトについては、比較的低い総タンパク質濃度で線形範囲が観察されるが、約３０μｇ／ｍＬを超えるとＲＦＵ測定値が減少する。試料を緩衝液交換に供すると、同じアナライト（ＡＬＤＯ）の線形範囲は、１３０μｇ／ｍＬの試料の総タンパク質濃度まで十分に延びる。同様に、対照試料中のＡＮＸＡ４タンパク質アナライトについても、比較的低い総タンパク質濃度では線形範囲が観察されるが、約１６μｇ／ｍＬを超えるとＲＦＵ測定値が横ばいまたはプラトーになる。試料を緩衝液交換に供すると、同じアナライト（ＡＮＸＡ４）の線形範囲は、１３０μｇ／ｍＬの試料の総タンパク質濃度まで十分に延びる。 試料の総タンパク質濃度の関数としてアッセイで測定したアナライトの線形性をグラフにしたものである。図７Ａ及び図７Ｂは共に、異なって提示された同じデータを示している。アナライトは、線形範囲内、線形範囲より上、または線形範囲より下として分類される。図７Ａは、アナライトの数及びそれらの分類（線形範囲より上、下、または範囲内）（ｙ軸）を試料の総タンパク質濃度の関数としてグラフ化したものである。 試料の総タンパク質濃度の関数としてアッセイで測定したアナライトの線形性をグラフにしたものである。図７Ａ及び図７Ｂは共に、異なって提示された同じデータを示している。アナライトは、線形範囲内、線形範囲より上、または線形範囲より下として分類される。図７Ｂは、アナライトのパーセント及びそれらの分類（線形範囲より上、下、または範囲内）（ｙ軸）を試料の総タンパク質濃度の関数としてグラフ化したものである。 アプタマーに組み込まれ得るある特定の例示的５位修飾ウリジン及びシチジンである。 ウリジンの５位に存在し得るある特定の例示的修飾である。Ｃ－５修飾の化学構造は、修飾をウリジンの５位に結合する例示的なアミド結合を含む。示される５位部分としては、フェニル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ、及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ）、ブチル部分（例えば、ｉＢｕ）、フルオロベンジル部分（例えば、ＦＢｎ）、チロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）、３，４－メチレンジオキシベンジル（例えば、ＭＢｎ）、モルホリノ部分（例えば、ＭＯＥ）、ベンゾフラニル部分（例えば、ＢＦ）、インドール部分（例えば、Ｔｒｐ）、ならびにヒドロキシプロピル部分（例えば、Ｔｈｒ）が挙げられる。 シチジンの５位に存在し得るある特定の例示的修飾である。Ｃ－５修飾の化学構造は、修飾をシチジンの５位に結合する例示的なアミド結合を含む。示される５位部分としては、フェニル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ、及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ、及び２ＮＥ）、ならびにチロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）が挙げられる。 アプタマーベースプロテオミクスアッセイによって測定される、線形範囲内にある尿試料中のアナライトの数のグラフを、マイクロＢＣＡアッセイによって測定される総タンパク質濃度の関数として示している。 アプタマーベースのプロテオミクスアッセイによって測定される、線形範囲内にある尿試料中のアナライトの数を、マイクロＢＣＡアッセイによって測定される１～１５０μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度の関数として示している。図１２Ａは、１０例の個別の尿試料の結果を示している。 アプタマーベースのプロテオミクスアッセイによって測定される、線形範囲内にある尿試料中のアナライトの平均数を、マイクロＢＣＡアッセイによって測定される１～１５０μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度の関数として示している。図１２Ｂは、同じ１０例の個別の尿試料を合わせた結果を示している。
Ｉ．用語及び方法
本発明を特定の代表的な実施形態に関連して説明するが、本発明は特許請求の範囲によって定義され、これらの実施形態に限定されないことが理解されよう。
当業者であれば、本発明の実施で使用され得る、本明細書に記載されるものと同様または同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記載された方法及び材料に決して限定されない。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにより出版，１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版，１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）に見出され得る。本発明の実施において、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法、デバイス、及び材料が使用されてもよいが、本明細書では、ある特定の方法、デバイス、及び材料について説明する。
本明細書中で引用される全ての刊行物、公開された特許文献、及び特許出願は、個々の刊行物、公開された特許文献、または特許出願が、参照により援用されるものとして具体的かつ個別に示されたのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。
本出願で使用される場合、添付の特許請求の範囲を含めて、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容による別段の明確な定めがない限り、複数形を含み、「少なくとも１つ」及び「１つ以上」と互換的に使用され得る。したがって、「アプタマー」が言及された場合にはアプタマーの混合物が含まれ、「プローブ」が言及された場合にはプローブの混合物が含まれる、などのようになる。
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及びこれらの任意のバリエーションは、非排他的包含を網羅するように意図され、その結果、要素または要素のリストを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）、または含む（ｃｏｎｔａｉｎ）プロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、または組成物は、明示的に列挙されていない他の要素を含み得る。
さらに、核酸またはポリペプチドに関して示される全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及び全ての分子量または分子質量の値は概算であり、説明のために提供されることを理解されたい。
さらに、本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値の簡略表記であるものと理解されたい。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲、そして内容による別段の明確な定めがない限り、これらの分数を含むものと理解されたい。
任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、両端値、列挙される範囲内の任意の整数、及び適切な場合はその分数（例えば、整数の１０分の１及び１００分の１）の値も含むものと理解されたい。また、本明細書に記載されている任意の物理的特色に関する任意の数字範囲、例えば、ポリマーサブユニット、サイズ、または厚さは、別段の指示がない限り、記載範囲内の任意の整数を含むものと理解されたい。
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはその任意の組合せのいずれかを意味するものと理解されたい。
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするため、特定の用語について以下のように説明する。
約：数値または範囲の文脈における「約」という用語は、別段の指示がない限り、列挙された数値または範囲のプラスまたはマイナス１０％の数値または範囲を意味する。
抗体：「抗体」という用語は、抗原に結合する能力を保持する任意の種の全長抗体、ならびにこのような抗体のフラグメント及び派生物（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、１本鎖抗体、Ｆｖフラグメント、及び１本鎖Ｆｖフラグメントを含む）を指す。また、「抗体」という用語は、合成由来の抗体、例えば、ファージディスプレイ由来の抗体及びフラグメント、アフィボディ、ならびにナノボディを含む。
アプタマー：本明細書で使用する場合、「アプタマー」とは、標的分子に対して特異的結合親和性を有する核酸を指し、このとき、標的分子に対するアプタマーの結合は、ワトソン－クリック塩基対合を含まない。親和性相互作用は、程度の問題であることが認識されているが、この文脈において、その標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」は、アプタマーが試験試料中の他の成分に結合するよりも概してはるかに高い程度の親和性でアプタマーがその標的に結合することを意味する。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つのタイプまたは種のコピーのセットである。アプタマーは、任意の好適な数のヌクレオチド（任意の数の化学修飾ヌクレオチドを含む）を含むことができる。複数の「アプタマー」とは、このような分子の２つ以上のセットを指す。異なるアプタマーは、同数または異なる数のいずれかのヌクレオチドを有し得る。アプタマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは化学修飾核酸とすることができ、また１本鎖、２本鎖であるか、または１本鎖及び２本鎖領域の両方を含むことができ、より高次の構造を含むことができる。また、アプタマーは、その対応標的に共有結合することを可能にする光反応性または化学反応性の官能基を含んでもよい。本明細書で開示される任意のアプタマー法は、同じ標的分子に特異的に結合する２つ以上のアプタマーの使用を含むことができる。以下でさらに説明されるように、アプタマーはタグを含むことができる。アプタマーがタグを含む場合、アプタマーの全てのコピーが同じタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーがそれぞれタグを含む場合、各異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれかを有することができる。
ＢＣＡアッセイまたはビシンコニン酸アッセイもしくはビシンコニン酸アッセイ：本明細書で使用する場合、「ＢＣＡアッセイ」、「ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）アッセイ」、及び「ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）アッセイ」は互換的に使用され、試料中のタンパク質濃度を定量するために使用することができるビシンコニン酸を含む任意のアッセイ、キット、試薬、または組成物を指す。ＢＣＡアッセイとしては、限定されるものではないが、マイクロＢＣＡアッセイが挙げられる。例示的なマイクロＢＣＡアッセイは、実施例６に記載されている。
生物学的試料または生物学的マトリックス：本明細書で使用する場合、「生物学的試料」及び「生物学的マトリックス」は、生物から得られる任意の材料、溶液、または混合物を指す。生物学的試料または生物学的マトリックスには、血液（全血、白血球、末梢血単核球、血漿、及び血清を含む）、痰、呼気、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液が含まれる。生物学的試料または生物学的マトリックスには、実験で分離した前述の全ての画分も含まれる。また、「生物学的試料」及び「生物学的マトリックス」という用語は、均質化された固体材料（例えば、糞便試料、組織試料、または組織生検）を含む材料、溶液、または混合物も含む。また、「生物学的試料」及び「生物学的マトリックス」という用語は、細胞株、組織培養物、細胞培養物、細菌培養物、ウイルス培養物、または無細胞生物システム（例えば、ＩＶＴＴ）に由来する材料、溶液、または混合物も含む。
レベル：本明細書で使用する場合、「標的タンパク質レベル」、「アナライトレベル」、及び「レベル」とは、生物学的試料中のアナライト（例えば、標的タンパク質）を検出するための任意の分析方法を用いて行われる測定値であって、生物学的試料中のアナライトの、そのための、またはそれに対応する存在、非存在、絶対的な量または濃度、相対的な量または濃度、力価、レベル、発現レベル、測定レベルの比などを示す測定値を指す。「レベル」の正確な性質は、アナライトの検出に用いられる特定の分析方法の具体的な設計及び構成要素に依存する。
緩衝剤：本明細書で使用する場合、「緩衝剤」とは、溶解される溶液のｐＨを調整及び／または維持することができる化学物質または化学物質の組合せを意味する。いくつかの実施形態において、緩衝剤は弱酸である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は弱塩基である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は弱酸及び弱塩基である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は塩である。いくつかのこのような実施形態において、緩衝剤は弱酸及び弱塩基の塩である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は双性イオン性である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリスメタン、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（カルバモイルメチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ビス－トリスプロパン、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、コラミンクロリド、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］アミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、４－（Ｎ－モルホリノ）ブタンスルホン酸（ＭＯＢ）、アセトアミドグリシン、２－ヒドロキシ－３－［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－１－プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミン（ＴＥＡ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－（２－ヒドロキシプロパン－３－スルホン酸）水和物（ＨＥＰＰＳＯ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（４－ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、ビシン、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、２－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、β－アミノイソブチルアルコール塩酸塩（ＡＭＰ）、Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－ヒドロキシル－３－アミノプロパンスルホン酸）（ＣＡＰＳＯ）、３－（シクロヘキシルアミノ）－１－プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、及び４－（シクロヘキシルアミノ）－１－ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）から選択される。
緩衝液交換された試料：本明細書で使用する場合、「緩衝液交換された試料」は、緩衝液交換ステップの実施が実施されている。いくつかの実施形態において、緩衝液交換ステップは、１つ以上の緩衝液成分の同一性及び／または濃度を変化させることを含む。このような緩衝液成分としては、限定されるものではないが、緩衝剤、塩、キレート剤、及び界面活性剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、緩衝液交換された試料の総タンパク質濃度は、緩衝液交換工程を実施する前の試料の総タンパク質濃度と同じである。いくつかの実施形態において、緩衝液交換された試料は、緩衝液交換された生物学的試料である。
Ｃ－５修飾ピリミジン：本明細書中で使用する場合、「Ｃ－５修飾ピリミジン」という用語は、Ｃ－５位に修飾を有するピリミジンを指す。Ｃ－５修飾ピリミジンの例としては、米国特許第５，７１９，２７３号、第５，９４５，５２７号、同第９，１６３，０５６号、及びＤｅｌｌａｆｉｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｆｒｏｎｔ． Ｃｈｅｍ．，４：１８に記載されているものが挙げられる。Ｃ－５修飾の例は、すぐ下に例示されているように、Ｃ－５位のデオキシウリジンを、ベンジルカルボキシアミド（代替的にベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（代替的にナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（代替的にトリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、フェネチルカルボキシアミド（代替的にフェネチルアミノカルボニル）（Ｐｅ）、チオフェニルメチルカルボキシアミド（代替的にチオフェニルメチルアミノカルボニル）（Ｔｈ）、及びイソブチルカルボキシアミド（代替的にイソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）から独立的に選択される置換基で置換したものが挙げられる。
また、Ｃ－５修飾ピリミジンの化学修飾は、単独でまたは任意の組合せで、２’位の糖修飾、環外アミンでの修飾、及び４－チオウリジンの置換などと組み合わせることもできる。
代表的なＣ－５修飾ピリミジンとしては、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－フェネチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５－（Ｎ－チオフェニルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンクロリド、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、または５－（Ｎ－［１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン）が挙げられる。
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成の前または後に修飾され得る。オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの配列は、１つ以上の非ヌクレオチド成分によって中断され得る。修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、任意の好適な標識成分との結合体化によって、重合後にさらに修飾され得る。
本明細書で使用する場合、「少なくとも１つのピリミジン」という用語は、核酸の修飾を指す場合、核酸中の１つの、いくつかの、または全てのピリミジンを指し、これは核酸中のＣ、Ｔ、またはＵのいずれかまたは全てのいずれかまたは全ての存在が修飾される場合もあれば、修飾されない場合もあることを示している。
捕捉試薬：本明細書で使用する場合、「捕捉剤」または「捕捉試薬」とは、アナライト（例えば、バイオマーカー、タンパク質、及び／またはペプチド）に特異的に結合可能な分子を指す。「標的タンパク質捕捉試薬」とは、標的タンパク質に特異的に結合可能な分子を指す。非限定的な例示的捕捉試薬としては、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、他の抗体ミメティック及び他のタンパク質スキャフォールド、自己抗体、キメラ、小分子、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、インプリントポリマー、アビマー、ペプチドミメティック、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、ならびに上記の捕獲試薬のいずれかの修飾物またはフラグメントが挙げられる。いくつかの実施形態において、捕捉試薬は、アプタマー及び抗体から選択される。
キレート剤：本明細書で使用する場合、「キレート剤」とは、単一の金属イオンに対し複数の結合を形成することができる化学物質を意味する。いくつかの実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２－ビス（２－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、２，３－ジメルカプトプロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）から選択される。
対照レベル：標的分子の「対照レベル」とは、疾患もしくは状態を有しない個体からの、または疾患もしくは状態を有する疑いのないもしくはリスクがない個体からの、または疾患もしくは状態の非進行性形態を有する個体からの、同じ試料タイプにおける標的分子のレベルを指す。さらに、「対照レベル」は、平均、または正常もしくは健康なパラメーター内で考慮されるものに基づく参照物質を指すことがある。また、「対照レベル」は、以前に採用した参照レベルも指すことがあり、この基準レベルは、標的の後の測定レベルまたは検出レベルと比較するために使用される。例えば、標的のレベルをＡ時点で検出し、次いでＢ時点で検出し、Ｂ時点がＡ時点の後とすることができる。より具体的な例では、Ａ時点を０時間または０日目とみなし、Ｂ時点をＡ時点から何分後（例えば、Ａ時点から１０、２０、３０、４０、５０、６０分後）、何時間後（例えば、Ａ時点から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間後）、何日後（例えば、Ａ時点から１、２、３、４、５、６、または７日後）、何週間後（例えば、Ａ時点から１、２、３、または４週間後）、何ヵ月後（例えば、Ａ時点から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヵ月後）、及びさらには何年後（例えば、Ａ時点から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０年後）とすることができる。標的分子の「対照レベル」は、本発明の方法を実行するたびに定量する必要はなく、特定の試料のレベルが正常なレベルより高いか低いかを判定するために参照物質または閾値として使用される予め定量したレベルであってもよい。
対応相関：「対応相関」または「一致相関係数」は、２つの連続変数Ｘ及びＹ（例えば、予測、推定または判定、及び実測値）の間の一致を測定する。「対応相関」はペアが４５度線上にある程度を評価し、正確さ及び精度（または「Ｌｉｎの一致性」）の測定値を含む。さらなる情報は、Ｌｉｎ，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃ，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．１（Ｍａｒｃｈ，１９８９），２５５－２６８（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。本明細書で使用され得る相関を定量するための他の方法としては、限定されるものではないが、ピアソン相関係数、対応のあるｔ検定、傾き（＝１）及び切片（＝０）の最小二乗解析、変動係数、ならびにクラス内相関係数が挙げられる。ある特定の実施形態において、対応相関は、Ｌｉｎの一致性、ピアソン相関係数、対応のあるｔ検定、傾き（＝１）及び切片（＝０）の最小二乗解析、変動係数、ならびにクラス内相関係数から選択される方法によって定量される。
検出：本明細書で使用する場合、「検出する」または「定量する」は、アナライトレベルに対応するシグナルを観察及び記録するために使用される計測器ならびにそのシグナルを生成するために必要な材料の両方の使用を含む。様々な実施形態において、レベルは、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面弾性波、質量分析、赤外分光法、ラマン分光法、原子間力顕微鏡法、走査型トンネル顕微鏡法、電気化学的検出法、核磁気共鳴、量子ドットなどを含めた任意の好適な方法を用いて検出される。
診断：「診断する」、「診断すること」、「診断」、及びこれらのバリエーションは、個体に関連する１つ以上の徴候、症状、データ、または他の情報に基づいてその個体の健康状態または状態を検出、定量、または認識することを指す。個体の健康状態は、健康／正常（すなわち、疾患もしくは状態の非存在の診断）または病気／異常（すなわち、疾患もしくは状態の存在の診断もしくは特徴の評価）として診断され得る。「診断する」、「診断すること」、「診断」などの用語は、特定の疾患または状態に関して、疾患の初期検出、疾患の特徴付けまたは分類、疾患の進行、寛解、または再発の検出、及び個体への治療または療法の投与後の疾患応答の検出を包含する。
希釈：「希釈」、「希釈系列」、及びこれらのバリエーションは、いくつかの異なるタイプの希釈を包含し、限定されるものではないが、段階希釈、系列希釈、及びこれらの組合せが含まれる。段階希釈の例として、希釈因子が１０００（１：１０００希釈）の場合、ユーザーは最初に１：１０希釈（希釈因子１０）を実施し、次に１：１００希釈（希釈因子１００）を実施することができ、１：１０希釈から１部の溶質及び９９部の希釈剤を用いて希釈することにより、希釈因子を１０００または溶質を１：１０００希釈にすることができる。系列希釈は、それぞれが同じ希釈因子を有する一連の段階希釈を含み、このとき、前の段階からの希釈物質は、後続の希釈を行うために使用される。系列希釈の例として、５点１：２系列希釈を行うには、１部の溶質を使用し、１部の希釈剤と合わせて第１の希釈物（５点のうちの第１点）を作製し、続いて第１の希釈物から１部の溶質を使用し、１部の希釈剤と合わせて第２の希釈物（５点のうちの第２点）を作製し、以下同様に、第５の連続した系列希釈に到達するまで行う必要がある。
希釈因子：「希釈因子」とは、希釈剤の部に対する溶質の部の比率を指す。例えば、希釈係数２は１：２希釈を意味し、溶質が１部、希釈剤が１部で合計２部となる。希釈係数１０は１：１０希釈を意味し、溶質が１部、希釈剤が９部で合計１０部となる。
評価する：「評価する」、「評価すること」、「評価」、及びこれらのバリエーションは、「診断」及び「予後」の両方を包含し、疾患または状態を有する個体の将来の疾患または状態の経過についての判断または予測、ならびに疾患または状態と以前に診断されたことがない個体に疾患または状態が生じる可能性についての判断及び予測、ならびに寛解状態にあるかまたは疾患が治癒したと考えられる個体に疾患または状態が再発する可能性についての判断または予測を包含する。また、「評価する」という用語は、療法に対する個体の応答を評価すること、例えば、個体が治療剤に対して好ましく応答する可能性があるか、または治療剤に対して応答する可能性が低いか（または、例えば、毒性もしくは他の望ましくない副作用を経験するか）を予測すること、個体に投与するための治療剤を選択すること、あるいは個体に投与されたまたは投与されている療法に対する個体の応答をモニタリングまたは判定することも包含する。
個体：本明細書で使用する場合、「個体」及び「対象」は、試験対象または患者を指すために互換的に使用される。個体は、哺乳類または非哺乳類であり得る。様々な実施形態において、個体は哺乳類である。哺乳類個体は、ヒトまたは非ヒトであり得る。様々な実施形態において、個体はヒトである。健康または正常な個体は、目的の疾患または状態が従来の診断方法によって検出されない個体である。
線形回帰：本明細書で使用する場合、「線形回帰」という用語は、スカラー従属変数ｙと、ｘで示される１つ以上の説明変数との間の関係をモデル化するためのアプローチを指す。１つの説明変数の場合は単純線形回帰と呼ばれる。複数の説明変数については、多重線形回帰と呼ばれる。概して、線形回帰は、予測モデルをｙ及びｘの値の観測されたデータセットに適合させるために使用することができる。このようなモデルを開発した後、付随するｙの値を伴わずにｘの値を追加した場合は、適合モデルを使用してｙの値を予測することができる。
マーカー：本明細書で使用する場合、「マーカー」及び「バイオマーカー」は互換的に使用され、個体における正常もしくは異常なプロセスの徴候、または個体における疾患もしくは他の状態の徴候を示すまたはそれである標的分子（またはアナライト）を指す。より具体的には、「マーカー」または「バイオマーカー」は、正常か異常かにかかわらず、また異常である場合は慢性か急性かにかかわらず、特定の生理学的状態またはプロセスの存在に関連する解剖学的、生理学的、生化学的、または分子的パラメーターである。バイオマーカーは、実験室アッセイ及び医療イメージングを含めた様々な方法によって検出可能かつ測定可能である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは標的タンパク質である。
修飾：本明細書で使用する場合、「修飾する」、「修飾された」、「修飾」という用語、及びこれらの任意のバリエーションは、オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）のうちの少なくとも１つが、天然のヌクレオチドのアナログまたはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、アプタマーとタンパク質標的との圧倒的に疎水性の相互作用をもたらし、その結果、高い結合効率及び安定した共結晶複合体がもたらされる。Ｃ－５位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの一例である。修飾としては、骨格修飾、メチル化、稀な塩基対合の組合せ、例えば、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどを挙げることができる。修飾としては、キャッピングなどの３’及び５’修飾も挙げることができる。他の修飾としては、アナログによる１つ以上の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）による修飾及び荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）による修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含む修飾、ならびに修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸など）による修飾などを挙げることができる。さらに、通常はヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれかが、ホスホン酸基またはリン酸基で置き換えられる場合もあれば、標準的な保護基によって保護される場合もあれば、追加のヌクレオチドへの、もしくは固体支持体への追加の結合を準備するために活性化される場合もある。５’末端及び３’末端のＯＨ基は、リン酸化される場合もあれば、アミン、約１～約２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー（いくつかの実施形態においては、約１０～約８０ｋＤａの範囲）、ＰＥＧポリマー（いくつかの実施形態においては、約２０～約６０ｋＤａの範囲）、または他の親水性もしくは疎水性の生体ポリマーもしくは合成ポリマーで置換される場合もある。１つの実施形態において、修飾は、ピリミジンのＣ－５位の修飾である。このような修飾は、Ｃ－５位に直接アミド結合を介し、または他のタイプの結合によって生成され得る。
ポリヌクレオチドは、当技術分野で広く知られているリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態も含むことができ、これには２’－Ｏ－メチル－、２’－Ｏ－アリル、２’－フルオロまたは２’－アジド－リボース、炭素環式等アナログ、α－アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリル酸アナログ、及び脱塩基ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）が含まれる。上記のように、１つ以上のホスホジエステル結合は、代替的な結合基で置き換えられてもよい。このような代替的な結合基としては、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置き換えられる実施形態が挙げられ、式中、各ＲまたはＲ’は独立的に、Ｈであるか、または置換もしくは非置換アルキル（１～２０Ｃ）（任意選択でエーテル（－Ｏ－）結合を含む）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルである。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンの類似形態の置換は、例えば、ポリアミド骨格のような代替的骨格構造が有利であり得るように、最終生成物の設計に有利であり得る。
核酸：本明細書で使用する場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指すために互換的に使用され、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ならびにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾物が挙げられ、様々な実体または部分が任意の位置でヌクレオチド単位に結合することが含まれる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、２本鎖または１本鎖分子に加えて三重らせん分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広義の用語であり、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーを含むが、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されない。
最小二乗法：本明細書で使用する場合、「最小二乗法」または「ＯＬＳ」または「線形最小二乗法」とは、線形回帰モデルにおいて未知のパラメーターを推定するための方法を指す。この方法は、データセット内の観測された応答と線形近似によって予測される応答との間の二乗垂直距離の和を最小化する。得られた推定量は、特に右辺にリグレッサーが１つの場合は、１つの簡単な式で表すことができる。
予後：「予測する」、「予後判定」、「予後」、及びこれらのバリエーションは、疾患または状態を有する個体における疾患または状態の将来の経過の予測（例えば、患者の生存期間の予測）を指し、このような用語は、個体に対する治療または療法の投与中及び／または投与後の疾患応答の評価を包含する。
ＳＥＬＥＸ：「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸ法」という用語は、本明細書では互換的に使用され、概して、（１）望ましい方式で標的分子と相互作用する（例えば、タンパク質に対して高い親和性で結合する）アプタマーの選択と、（２）その選択された核酸の増幅との組合せを指す。ＳＥＬＥＸ法は、標的タンパク質などの特定のアナライトに対して高い親和性を有するアプタマーを同定するために使用され得る。
配列同一性：２つ以上の核酸配列に関連して本明細書で使用する場合、配列同一性は、ギャップの数、及び２つ以上の配列のアラインメントを最適化するために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一ヌクレオチド位置の数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／参照配列における位置の総数×１００）の関数である。配列の比較及び２つ以上の配列間の同一性パーセントの定量は、ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムなどの数学的アルゴリズムをそのデフォルトパラメーターで用いて遂行することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０；また、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＮも参照）。配列比較については、典型的には１つの配列が参照配列として機能し、これと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、コンピューターに試験配列及び参照配列を入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて参照配列（複数可）に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ．，２：４８２，１９８１によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０のホモロジーアラインメントによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８の類似度法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＡＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（概して、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）出版）を参照）によって行うことができる。本明細書で使用する場合、配列が参照ヌクレオチド配列に対し、例えば少なくとも約９５％同一である核酸（例えば、アプタマー）の同一性パーセントについて記載する場合、核酸配列は、参照核酸配列の１００ヌクレオチド当たり最大５個の点突然変異を含み得ることを除いて参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照核酸配列に対し少なくとも約９５％配列が同一である所望の核酸配列を得るには、参照配列中のヌクレオチドの最大５％を欠失させるもしくは別のヌクレオチドで置換するか、または参照配列中のヌクレオチドの総数の最大５％のいくつかの数のヌクレオチドを参照配列中に挿入する（本明細書では挿入と称される）ことができる。所望の配列を生成するための参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置、またはこれらの末端位置の間の任意の場所で生じ得、参照配列中のヌクレオチド間に個々に散在しているかまたは参照配列中の１つ以上の連続した基の中で散在している。
ＳＯＭＡｍｅｒ：本明細書で使用する場合、ＳＯＭＡｍｅｒまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬は、オフレート特徴が改善されたアプタマーを指す。ＳＯＭＡｍｅｒ試薬は、代替的に低速オフレート修飾アプタマー（Ｓｌｏｗ Ｏｆｆ－Ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒ）と称され、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ－Ｒａｔｅｓ」という表題の米国特許公開第２００９０００４６６７号（参照によりその全体が援用される）に記載されている改良ＳＥＬＥＸ法を介して選択することができる。いくつかの実施形態において、低速オフレートアプタマー（疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーを含む）は、オフレート（ｔ１／２）が、２分以上、４分以上、５分以上、８分以上、１０分以上、１５分以上、３０分以上、６０分以上、９０分以上、１２０分以上、１５０分以上、１８０分以上、２１０分以上、または２４０分以上である。
実質的に同等：本明細書で使用する場合、「実質的同等」という表現は、２つの数値間において、当業者が、これら２つの値によって測定される特徴の文脈内で、これらの値の差がほとんどまたは全く生物学的及び／または統計学的有意性がないとみなす程度に十分に類似度が高いことを示す。より具体的には、２つの値の差（例えば、基準値と回帰モデル基準値との間の差）は、好ましくは、約２５％未満、または約２０％未満、または約１５％未満、または約１０％未満、または約５％未満、または約４％未満、または約３％未満、または約２．５％未満、または約２％未満、または約１％未満である。
標的分子：「標的」、「標的分子」、及び「アナライト」とは、本明細書では互換的に使用され、試料中に存在し得る任意の目的分子を指す。この用語は、特定の分子の任意のわずかな変化、例えば、タンパク質の場合は、アミノ酸配列のわずかな変化、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、分子の同一性を実質的に変化させない標識成分との結合体化を含み得る。「標的分子」、「標的」、または「アナライト」とは、分子または多分子構造の１つのタイプまたは種のコピーのセットを指す。「標的分子」、「標的」、及び「アナライト」とは、分子または多分子構造の２つ以上のタイプまたは種を指す。例示的な標的分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、抗体ミメティック、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝産物、遷移状態アナログ、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織、及び上記のいずれかの任意のフラグメントまたは部分が挙げられる。いくつかの実施形態において、標的分子はタンパク質であり、この場合、標的分子は「標的タンパク質」と称することができる。
試験試料：本明細書で使用する場合、「試験試料」とは、生物学的試料を含むか、または生物学的試料に由来する材料、溶液、または混合物を意味する。いくつかの実施形態において、試験試料は、生物学的試料から生成される。いくつかの実施形態において、試験試料は、生物学的試料または生物学的試料を含む溶液に対し緩衝液交換を実施することにより、生物学的試料または生物学的試料を含む溶液から生成される。本明細書で使用する場合、「調整された試験試料」は、総タンパク質濃度の変化などの調整が行われた試験試料である。
総タンパク質：本明細書で使用する場合、溶液、緩衝液、または試料中の「総タンパク質」とは、溶液、緩衝液、または試料中の全てのタンパク質を意味する。総タンパク質の濃度、レベル、量は、溶液、緩衝液、または試料中の全ての異なるタイプのタンパク質を考慮に入れる。これに対し、「標的タンパク質」または「アナライトタンパク質」とは、溶液、緩衝液、または試料中の１つの特定のタンパク質を指す。
本発明の前述及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面を参照しながら進められる以下の詳細な説明からさらに明らかになる。
本明細書に記載されるものと類似または同等の方法及び材料が本開示の実施または試験に使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示的なものに過ぎず、限定的であるようには意図されていない。
アナライト及びアナライトレベルの検出及び定量
本明細書に記載されるアナライトのアナライトレベルは、任意の様々な既知の分析方法を用いて検出することができる。１つの実施形態において、アナライトレベルは、捕捉試薬を用いて検出される。様々な実施形態において、捕捉試薬は、溶液中のアナライトに曝露される場合もあれば、捕捉試薬が固体支持体上に固定化されている間にアナライトに曝露される場合もある。いくつかの実施形態において、捕捉試薬は、固体支持体上の二次的特徴に反応性である特徴を含む。このような実施形態において、捕捉試薬は、溶液中のアナライトに曝露することができ、次いで、捕捉試薬上の特徴を、固体支持体上の二次的特徴と共に使用して、アナライトを固体支持体上に固定化することができる。捕捉試薬は、行われる分析のタイプに基づいて選択される。捕捉試薬としては、限定されるものではないが、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、他の抗体ミメティック及び他のタンパク質スキャフォールド、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、１本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、１本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、インプリントポリマー、アビマー、ペプチドミメティック、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、ならびに合成受容体（これらのいずれかの修飾物及びフラグメントを含む）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、アナライトレベルは、アナライト／捕捉試薬複合体を用いて検出される。
いくつかの実施形態において、アナライトレベルは、アナライト／捕捉試薬複合体に由来し、（例えば、アナライト／捕捉試薬の相互作用に続く反応の結果として）間接的に検出されるが、アナライト／捕捉試薬複合体の形成に依存する。
いくつかの実施形態において、アナライトは、生物学的試料中の２つ以上のアナライトの同時検出を可能にする多重化形式を用いて検出される。多重化形式のいくつかの実施形態において、捕捉試薬は、直接的または間接的に、共有結合的または非共有結合的に、固体支持体上の個別の位置で固定化される。いくつかの実施形態において、多重化形式は、個別の固体支持体を使用し、このとき、各固体支持体は、その固体支持体に関連するユニークな捕捉試薬（例えば、量子ドット）を有する。いくつかの実施形態において、個々のデバイスは、生物学的試料中で検出されるべき複数のアナライトの各々の１つを検出するために使用される。個々のデバイスは、生物学的試料中の各アナライトが同時に処理されるのを許容するように構成され得る。例えば、マイクロタイタープレートを使用して、プレート中の各ウェルが、生物学的試料中で検出されるべき複数のアナライトのうちの１つ以上の分析に使用されるようにすることができる。
本明細書に記載される１つ以上の実施形態において、蛍光タグを使用して、アナライト／捕捉試薬複合体の成分を標識して、アナライトレベルの検出を可能にすることができる。様々な実施形態において、蛍光標識は、既知の技術を用いて、本明細書に記載される任意のアナライトに特異的な捕捉試薬と結合体化することができ、次いで、蛍光標識は、対応するアナライトレベルを検出するために使用することができる。好適な蛍光標識としては、希土類キレート、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ－３、Ｑドット６０５、リサミン、フィコエリトリン、テキサスレッド、ならびに他のこのような化合物が挙げられる。
いくつかの実施形態において、蛍光標識は蛍光色素分子である。いくつかの実施形態において、蛍光色素分子は、少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、このとき、インドリウム環の３炭素上の置換基は、化学反応基または結合体化物質を含む。いくつかの実施形態において、色素分子は、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７００を含む。いくつかの実施形態において、色素分子は、第１のタイプ及び第２のタイプの色素分子、例えば、２つの異なるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ分子を含む。いくつかの実施形態において、色素分子は、第１のタイプ及び第２のタイプの色素分子を含み、２つの色素分子は異なる発光スペクトルを有する。
蛍光は、広範囲のアッセイ形式に適合する様々な計測手段を用いて測定することができる。例えば、分光蛍光計は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、プリントアレイ、キュベットなどを分析するように設計されている。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．，２００４）を参照。Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＆ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ＆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ．Ｓｔａｎｌｅｙ ａｎｄ Ｌａｒｒｙ Ｊ． Ｋｒｉｃｋａ ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｊａｎｕａｒｙ ２００２を参照。
１つ以上の実施形態において、化学発光タグを任意選択で使用して、アナライト／捕捉複合体の成分を標識して、アナライトレベルの検出を可能にすることができる。好適な化学発光材料としては、塩化オキサリル、ローダミン６Ｇ、Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３ ２＋、ＴＭＡＥ（テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン）、ピロガロール（１，２，３－トリヒドロキシベンゼン）、ルシゲニン、ペルオキシオキサレート、アリールオキサレート、アクリジニウムエステル、ジオキセタンなどのいずれかが含まれる。
いくつかの実施形態において、検出方法は、アナライトレベルに対応する検出可能なシグナルを生成する酵素／基質の組み合わせを含む。概して、酵素は、発色基質の化学変化を触媒し、これは、分光光度法、蛍光、及び化学発光を含む様々な技法を用いて測定することができる。好適な酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、検出方法は、蛍光、化学発光、放射性核種の組合せ、及び／または測定可能なシグナルを生成する酵素／基質の組合せであり得る。いくつかの実施形態において、マルチモーダルシグナル伝達は、アナライトアッセイ形式でユニークかつ有利な特徴を有し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアナライトのアナライトレベルは、以下で論じられるように、シングルプレックスアプタマーアッセイ、多重化アプタマーアッセイ、シングルプレックスまたは多重化イムノアッセイ、ｍＲＮＡ発現プロファイリング、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、質量分析、組織学的／細胞学的方法などを含めた任意の分析方法を用いて検出することができる。
アプタマーベースアッセイを用いたアナライトレベルの定量
本明細書に記載されるアナライトのアナライトレベルは、任意の様々なアプタマーベースアッセイを用いて検出することができる。生物学的試料及び他の試料における生理学的に重要な分子の検出及び定量化を対象とするアッセイは、科学研究及びヘルスケア分野の重要なツールである。このようなアッセイの１つのクラスは、固体支持体上に固定化された１つ以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を含む。アプタマーはそれぞれ、非常に特異的な様式で、かつ非常に高い親和性で標的分子に結合可能である。例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４７５，０９６号を参照。また、例えば、それぞれが「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」という表題の米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、及び米国特許第６，５０３，７１５号も参照。ひとたびマイクロアレイが試料に接触すると、アプタマーは、試料中に存在するそれぞれの標的分子に結合し、それによって、アナライトに対応するアナライトレベルの定量が可能になる。
１つの態様において、アプタマーは、最大約１００ヌクレオチド、最大約９５ヌクレオチド、最大約９０ヌクレオチド、最大約８５ヌクレオチド、最大約８０ヌクレオチド、最大約７５ヌクレオチド、最大約７０ヌクレオチド、最大約６５ヌクレオチド、最大約６０ヌクレオチド、最大約５５ヌクレオチド、最大約５０ヌクレオチド、最大約４５ヌクレオチド、最大約４０ヌクレオチド、最大約３５ヌクレオチド、最大約３０ヌクレオチド、最大約２５ヌクレオチド、及び最大約２０ヌクレオチドを含むことができる。関連する態様において、アプタマーは、約２５～約１００ヌクレオチド長（すなわち、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ヌクレオチド長）または約２５～５０ヌクレオチド長（すなわち、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長）であり得る。
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法を含めた任意の既知の方法を用いて同定することができる。ひとたび同定されると、アプタマーは、任意の既知の方法（化学合成法及び酵素合成法を含む）に従って調製または合成することができる。いくつかの実施形態において、アプタマーは、疎水性修飾（例えば、疎水性塩基修飾）を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、これによって標的タンパク質との疎水性接触が可能になる。このような疎水性接触は、いくつかの実施形態においては、アプタマーによる親和性の増大及び／またはオフレート結合の低速化に寄与する。いくつかの実施形態において、アプタマーは、疎水性修飾を有する少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、各疎水性修飾は、他のものと同じ場合も異なる場合もある。いくつかの実施形態において、疎水性塩基修飾はＣ－５修飾ピリミジンである。非限定的な例示的Ｃ－５修飾ピリミジンは本明細書に記載され、及び／または当技術分野で知られている。
いくつかのアッセイ形式において、アプタマーは、試料に接触させる前に、固体支持体上に固定化される。ただし、ある特定の状況下では、試料に接触させる前のアプタマーの固定化は最適なアッセイを提供しない場合がある。例えば、いくつかの例において、アプタマーの事前固定化によって、アプタマーと固体支持体の表面にある標的分子とが非効率的に混合することがあり、これにより場合によっては反応時間が長くなるため、アプタマーがその標的分子に効率的に結合できるようにするためにインキュベーション期間が延長される可能性がある。さらに、フォトアプタマーがアッセイで使用される場合、また固体支持体として利用される材料に応じて、固体支持体は、フォトアプタマーとその標的分子との間の共有結合の形成に影響を及ぼすように使用される光を散乱または吸収する傾向があり得る。さらに、用いる方法によっては、アプタマーに結合した標的分子の検出が不正確になり得る。というのも、固体支持体の表面は、使用する任意の標識剤の曝露及び影響も受け得るからである。最後に、アプタマーの固体支持体上への固定化は、概して、アプタマーを試料に曝露する前に、アプタマーを準備するステップ（すなわち、固定化）を含み、この準備ステップがアプタマーの活性または機能性に影響を及ぼし得る。
アプタマーが溶液中でその標的を捕捉し、次いで検出前にアプタマー－標的混合物の特定の成分を除去するように設計された分離ステップを使用することを可能にするアプタマーアッセイまたは「アプタマーベースアッセイ（複数可）」についても記載されている（例えば、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｔｅｓｔ Ｓａｍｐｌｅｓ」という表題の米国特許公開第２００９／００４２２０６号を参照）。記載されているアプタマーアッセイは、核酸（すなわち、アプタマー）を検出及び定量化することにより、試験試料中の非核酸標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量化を可能にする。記載された方法は、非核酸標的を検出及び定量化するための核酸代替物（すなわち、アプタマー）を作出し、よって、増幅を含む広範な種々の核酸技術が、タンパク質標的を含むより広範な所望の標的に適用されることを可能にする。
アプタマーは、アプタマーアナライト複合体（または光アプタマーアナライト共有結合複合体）からのアッセイ成分の分離を容易にし、検出及び／または定量化のためのアプタマーの単離を可能にするように構築することができる。１つの実施形態において、このようなコンストラクトは、アプタマー配列中に切断可能または放出可能な要素を含むことができる。他の実施形態において、さらなる機能性をアプタマーに導入することができ、例えば、標識または検出可能成分、スペーサー成分、または特異的結合タグもしくは固定化要素を導入することができる。例えば、アプタマーは、切断可能部分を介しアプタマーに接続したタグ、標識、標識を分離するスペーサー成分、及び切断可能部分を含むことができる。１つの実施形態において、切断可能要素は、光切断可能リンカーである。光切断可能リンカーは、ビオチン部分及びスペーサー部分に結合させることができ、アミンの誘導体化のためのＮＨＳ基を含むことができ、ビオチン基をアプタマーに導入するために使用することができ、それにより、後にアッセイ法でアプタマーの放出が可能になる。
均質アッセイは、いくつかの実施形態では溶液中の全てのアッセイ成分を用いて実施されるが、シグナルの検出前に試料及び試薬の分離を必要としない場合がある。これらの方法は迅速かつ容易に使用できる。
いくつかの実施形態において、シグナル生成のための方法は、フルオロフォア標識捕捉試薬とその特異的アナライト標的との相互作用による異方性シグナル変化を利用する。標識された捕捉物質がその標的と反応すると、分子量の増加によって、複合体に結合しているフルオロフォアの回転運動が生じ、異方性値を変化させるのがはるかに遅くなる。異方性変化をモニタリングすることにより、結合事象を使用して溶液中のアナライトを定量的に測定することができる。他の方法としては、蛍光偏光アッセイ、分子ビーコン法、時間分解蛍光消光、化学発光、蛍光共鳴エネルギー移動などが挙げられる。
生物学的試料中のアナライトレベルを検出するために使用され得る例示的な溶液ベースアプタマーアッセイは、以下を含む：（ａ）生物学的試料を、第１のタグを含み、アナライトに対する特異的親和性を有するアプタマーに接触させることであって、アナライトが試料中に存在する場合、アプタマー親和性複合体が形成される、接触させること；（ｂ）混合物を、第１の捕捉要素を含む第１の固体支持体に曝露し、第１のタグを第１の捕捉要素と関連付けさせること；（ｃ）最初の固体支持体に関連しない混合物の成分を除去すること；（ｄ）アプタマー親和性複合体のアナライト成分に第２のタグを結合させること；（ｅ）第１の固体支持体からアプタマー親和性複合体を放出させること；（ｆ）放出されたアプタマー親和性複合体を、第２の捕捉要素を含む第２の固体支持体に曝露し、第２のタグを第２の捕捉要素と会合させること；（ｇ）複合体を形成していないアプタマーをアプタマー親和性複合体から分配することにより、複合体を形成していないアプタマーを混合物から除去すること；（ｈ）固体支持体からアプタマーを溶出させること；（ｉ）アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出することによって分析物を検出すること。例えば、試料中のタンパク質濃度またはレベルは、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表すことができ、これは、アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出することによる産物であり得る（例えば、標的タンパク質と複合体化したアプタマーは、アプタマー親和性複合体を作出する）。すなわち、アプタマーベースアッセイにおいては、タンパク質濃度またはレベルはＲＦＵと相関する。
アプタマーを用いて生物学的試料中のアナライトを検出する非限定的な例示的方法は、Ｋｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（１０）：ｅ２６３３２に記載されている。
イムノアッセイを用いたアナライトレベルの定量
いくつかの実施形態において、標的タンパク質またはアナライトタンパク質のレベルは、イムノアッセイを用いて定量される。イムノアッセイ法は、対応する標的またはアナライトに対する抗体の反応に基づいており、特定のアッセイ形式に応じて試料中のアナライトを検出することができる。免疫反応性に基づくアッセイ法の特異性及び感受性を改善するために、特異的なエピトープ認識を備えていることからモノクローナル抗体及びそのフラグメントがしばしば使用される。ポリクローナル抗体も、モノクローナル抗体と比較して標的に対する親和性が高いことから、様々なイムノアッセイで首尾よく使用されている。イムノアッセイは、広範囲の生物学的試料マトリックスと共に使用するように設計されている。イムノアッセイ形式は、定性的、半定量的、及び定量的な結果をもたらすように設計されている。
定量的な結果は、既知の濃度の検出されるべき特定のアナライトで作出した標準曲線を使用することによって得られる。未知の試料からの応答またはシグナルを標準曲線にプロットし、未知の試料における標的に対応する量またはレベルを確立させる。
多数のイムノアッセイ形式が設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、アナライトの検出において定量的であり得る。この方法は、アナライトまたは抗体のいずれかへの標識の結合に依存し、標識成分は、直接的または間接的に酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、アナライトの直接、間接、競合、またはサンドイッチ検出のためにフォーマット作成することができる。他の方法は、例えば、放射性同位体（Ｉ１２５）または蛍光などの標識に依存する。さらなる技法としては、例えば、凝集、比濁法、濁度法、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイなどが挙げられる（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ（Ｂｒｉａｎ Ｌａｗ編、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｔｄ．発行、２００５年版）を参照）。
例示的なアッセイ形式としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）イムノアッセイが挙げられる。アナライトを検出するための手順の例としては、アナライト免疫沈降、続いてサイズ及びペプチドレベルの識別を可能にする定量的方法（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィーなど）が挙げられる。
検出可能な標識またはシグナル生成材料を検出及び／または定量化する方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素によって触媒された反応の産物（検出可能な標識が酵素である場合（上記参照））は、限定されるものではないが、蛍光、発光、もしくは放射性であり得、またはこのような産物は可視光もしくは紫外光を吸収し得る。このような検出可能な標識を検出するのに好適な検出器の例としては、限定されるものではないが、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、照度計、及び濃度計が挙げられる。
検出のための方法はいずれも、反応の任意の好適な調製、処理、及び分析を可能にする任意の形式で実施することができる。これは例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルまたは３８６ウェル）の場合もあれば、任意の好適なアレイもしくはマイクロアレイを用いる場合もある。様々な薬剤のためのストック溶液は、手動またはロボットにより作製することができ、全ての後続のピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベート、試料リードアウト、データ収集、及び分析は、検出可能な標識を検出可能な市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、及び検出計測器を用いてロボットにより行われ得る。
遺伝子発現プロファイリングを用いたアナライトレベルの定量
いくつかの実施形態において、標的ｍＲＮＡレベルは、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイリング法を用いて定量される。生物学的試料中のｍＲＮＡの測定は、いくつかの実施形態において、生物学的試料中の対応するタンパク質のレベルの検出のための代替物として使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のアナライトまたはアナライトパネルは、適切なＲＮＡを検出することによって検出され得る。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲに続いてｑＰＣＲ）によって測定される。ＲＴ－ＰＣＲ法を使用してｍＲＮＡからｃＤＮＡを作出する。ｃＤＮＡをｑＰＣＲアッセイで使用して、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を生成することができる。標準曲線と比較することにより、ｑＰＣＲは、細胞当たりのｍＲＮＡのコピー数などの絶対的測定値を生じ得る。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、及びキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ－ＰＣＲは全て、試料中のｍＲＮＡの発現レベルを測定するために使用されている。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｓｈｉｍｋｅｔｓ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照。
質量分析法を用いたアナライトレベルの定量
いくつかの実施形態において、標的タンパク質またはアナライトタンパク質のレベルは質量分析を用いて定量される。様々な構成の質量分析計を使用してアナライトレベルを検出することができる。数タイプの質量分析計が利用可能であり、または様々な構成で製造することができる。概して、質量分析計は以下の主要な構成要素を有する：試料インレット、イオン源、質量分析器、検出器、真空系、及び計測器制御系、及びデータ系。試料インレット、イオン源、及び質量分析器における相違は、概して計測器のタイプ及びその能力を規定する。例えば、インレットは、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源であってもよく、マトリックス支援レーザー脱離で使用されるような直接プローブまたは段階であってもよい。一般的なイオン源は、例えば、エレクトロスプレー（ナノスプレー及びマイクロスプレーを含む）またはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析器としては、四重極質量フィルター、イオントラップ質量分析器、及び飛行時間型質量分析器が挙げられる。さらなる質量分析法は当技術分野で周知されている（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７ Ｒ－７１６Ｒ（１９９８）；Ｋｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）参照）。
タンパク質アナライト及びアナライトレベルは、以下のいずれかによって検出及び測定することができる：エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、シリコン上の脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）、タンデム飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術（ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれる）、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ－ＭＳ）、ＡＰＣＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ－（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ－ＭＳ）、ＡＰＰＩ－ＭＳ／ＭＳ及びＡＰＰＩ－（ＭＳ）Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析、及びイオントラップ質量分析。
試料調製戦略は、タンパク質アナライトの質量分析キャラクタリゼーション及びアナライトレベルの定量の前に、試料を標識及び濃縮するために使用される。標識方法としては、限定されるものではないが、相対的及び絶対的定量のための等圧性タグ（ｉＴＲＡＱ）、ならびに細胞培養物中のアミノ酸を含む安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）が挙げられる。質量分析の前に候補アナライトタンパク質のための試料を選択的に濃縮するために使用される捕捉試薬としては、限定されるものではないが、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、１本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、１本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替的抗体スキャフォールド（例えば、ダイアボディなど）インプリントポリマー、アビマー、ペプチドミメティック、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、ならびにこれらの修飾及びフラグメントが挙げられる。
ある特定の検出方法
アプタマーアッセイ法
本明細書で使用する場合、「アプタマーアッセイ法」は、以下に記載されるステップを含むまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、アプタマーベースアッセイは、アプタマーアッセイ法である。別段の指示がない限り、全てのステップは室温で実施した。
アプタマーマスターミックス溶液の調製。
アプタマーを３つのユニークな混合物Ｄｉｌ１、Ｄｉｌ２、及びＤｉｌ３にグループ分けした。これらはそれぞれ２０％、０．５％、及び０．００５％の試料希釈物に対応した。混合物へのアプタマーの割当てを、血漿及び血清試料を各アプタマーと適合させた希釈系列をアッセイし、シグナルの最大線形範囲を示した試料希釈液を同定することによって経験的に決定した。アプタマーの分離及び試料の異なる希釈物（２０％、０．５％、または０．００５％）との混合により、アッセイがタンパク質濃度の１０７倍範囲に及ぶことが可能となる。アプタマーマスターミックスのためのストック溶液は、各アプタマー４ｎＭにおいてＨＥ－Ｔｗｅｅｎ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中で調製され、－２０℃で冷凍保存した。およそ４２７１のアプタマーをＤｉｌ１ミックス中に、約８２８のアプタマーをＤｉｌ２中に、約１７３のアプタマーをＤｉｌ３ミックス中で混合した。使用前に、ストック溶液をＨＥ－Ｔｗｅｅｎ緩衝液で希釈して各アプタマーの作業濃度を０．５５ｎＭとし、個々の使用アリコートに分取した。キャッチ－０プレートの調製にアプタマーマスターミックスを使用する前に、９５℃で１０分間、次いで２５℃で少なくとも３０分間インキュベートすることにより、作業溶液を使用前に加熱冷却してアプタマーをリフォールディングさせた。
キャッチ－０プレートの調製。
６０μＬのストレプトアビジン磁気セファロース１０％スラリー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－９８５７）を、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＢ－０７６９）の各ウェルに分注した。ビーズを、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００または１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％または０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．５）を含む１７５μＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄し、次いで、１００μＬの加熱冷却アプタマーマスターミックスを各ウェルに加えた。プレートを、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ Ｃシェーカー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上で８５０ｒｐｍで振とうしながら、２５℃で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベート後、６μＬのＭＢブロック緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ中の５０ｍＭのＤ－ビオチン、ｐＨ８、０．０１％のＴｗｅｅｎ）をプレートの各ウェルに加え、プレートをさらに２分間、振とうしながらインキュベートした。次いで、プレートを１７５μＬのアッセイ緩衝液で洗浄し、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ Ｃ上で８５０ｒｐｍで振とうしながら１分間の洗浄サイクルを行い、続いて磁石上で３０秒間分離させた。洗浄溶液を除去した後、ビーズを１７５μＬのアッセイ緩衝液中に再懸濁させ、使用するまで－２０℃で保存した。
キャッチ－２ビーズの調製。
アッセイのロボット処理を開始する前に、マルチプレックスアプタマーアッセイのキャッチ－２ステップに使用したＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、製品番号３５００２Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１０ｍｇ／ｍＬのビーズスラリーを、ＭＢ Ｐｒｅｐ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．４％のＳＤＳ）で５分間、まとめて１回洗浄し、続いてアッセイ緩衝液で２回洗浄した。最後の洗浄後、ビーズを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させ、７５μＬのビーズスラリーをキャッチ－２プレートの各ウェルに分注した。アッセイの開始時に、キャッチ－２プレートをアルミニウムアダプター内に置き、Ｆｌｕｅｎｔデッキ上の適切な位置に置いた。
試料結合ステップ。
キャッチ－０プレートを、上記の通りにストレプトアビジン磁気セファロースビーズ上にアプタマーミックスを固定化することによって調製した。凍結プレートを２５℃で３０分間解凍し、１７５μＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄した。１００μＬの各試料希釈液（２０％、０．５％、及び０．００５％）を、３つの異なるアプタマーマスターミックス（それぞれＤｉｌ１、Ｄｉｌ２、及びＤｉｌ３）を含むビーズを含むプレートに加えた。次いで、キャッチ－０プレートをアルミホイルシール（Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ‘Ｆ’Ｆｏｉｌ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で密封し、８５０ｒｐｍ、２８℃に設定した４プレート回転シェーカー（ＰＨＭＰ－４、Ｇｒａｎｔ Ｂｉｏ）内に置いた。試料結合ステップを３．５時間実施した。
Ｆｌｕｅｎｔロボット上でのマルチプレックスアプタマーアッセイ処理。
試料結合ステップが完了した後、キャッチ－０プレートをアルミニウムプレートアダプター内に置き、ロボットデッキ上に置いた。磁気ビーズ洗浄ステップを、温度制御プレートを用いて実施した。全てのロボット処理ステップでは、以下に記載したようなキャッチ－２洗浄を除いて、プレートを２５℃の温度に設定した。プレートを１７５μＬのアッセイ緩衝液で４回洗浄し、各洗浄サイクルをプログラムして、プレートを１０００ｒｐｍで少なくとも１分間振とうし、続いて磁気ビーズを少なくとも３０秒間分離させてから緩衝液を吸引した。最後の洗浄サイクル中に、タグ試薬を、１００倍タグ試薬（ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン、製品番号２１３６３、Ｔｈｅｒｍｏ、無水ＤＭＳＯ中で調製した１００ｍＭ溶液）をアッセイ緩衝液で１：１００に希釈することによって調製し、ロボットデッキ上の溝槽中に注いだ。１００μＬのタグ試薬をプレートのウェルの各々に加え、１２００ｒｐｍで５分間振とうしながらインキュベートして、ビーズ表面上で捕捉したタンパク質をビオチン化した。ビオチン化反応を、１７５μＬのクエンチ緩衝液（アッセイ緩衝液中の２０ｍＭグリシン）を各ウェルに加えることによってクエンチした。プレートを静置して３分間インキュベートし、次いで１７５μＬのアッセイ緩衝液で４回洗浄して、上記に記載したものと同じ条件下で洗浄を実施した。
光切断及び動力学的チャレンジ。
プレートを最後に洗浄した後、９０μＬの光切断緩衝液（アッセイ緩衝液中の２μＭのオリゴヌクレオチド競合物、競合物質オリゴヌクレオチド（Ｚ－ブロックとも称される）は５’－（ＡＣ－Ｂｎ－Ｂｎ）７－ＡＣ－３’のヌクレオチド配列を有し、式中Ｂｎは、５位ベンジル置換デオキシウリジン残基を示す）を、プレートの各ウェルに加えた。プレートをＦｌｕｅｎｔデッキ上の光切断サブステーションに移動させた。サブステーションは、ＢｌａｃｋＲａｙ光源（ＵＶＰ ＸＸシリーズベンチランプ、３６５ｎｍ）及び３つのＢｉｏｓｈａｋｅ ３０００－Ｔシェーカー（Ｑ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からなる。プレートを１０００ｒｐｍで振とうしながら２０分間照射した。
キャッチ－２ビーズ捕捉。
光切断プロセスの最後に、緩衝液を磁気分離によってキャッチ－２プレートから除去し、プレートを１００μＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄した。アプタマー－タンパク質複合体を含む光切断溶出液を、希釈３プレートから開始して各キャッチ－０プレートから除去した。９０μＬの溶液を全て、シェーカー上に配置したキャッチ－１溶出液プレートに最初に移し、磁石を上げて、吸引される可能性がある全てのストレプトアビジン磁気セファロースビーズを捕捉した。その後、溶液をキャッチ－２プレートに移し、プレートを１４００ｒｐｍ、２５℃で振とうしながら３分間インキュベートした。３分間インキュベートした後、磁気ビーズを９０秒間分離させて溶液をプレートから除去し、光切断したＤｉｌ２プレート溶液をプレートに加えた。同一のプロセス後、Ｄｉｌ１プレートからの溶液を加え、３分間インキュベートした。３分間のインキュベートの最後に、６μＬのＭＢブロック緩衝液を磁気ビーズ懸濁液に加え、ビーズを１２００ｒｐｍ、２５℃で振とうしながら２分間インキュベートした。このインキュベート後、プレートを３８℃の温度にプリセットした別のシェーカーに移した。磁気ビーズを２分間分離させてから溶液を除去した。次いで、キャッチ－２プレートを１７５μＬのＭＢ洗浄緩衝液（アッセイ緩衝液中の２０％グリセロール）で４回洗浄し、各洗浄サイクルをプログラムして、ビーズを１２００ｒｐｍで１分間振とうしてビーズを３．５分間、磁石上で分割させた。最後のビーズ分離ステップ中に、シェーカー温度を２５℃に設定した。次いで、ビーズを１７５μＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄した。この洗浄ステップでは、ビーズを１２００ｒｐｍで１分間振とうし、次いで磁石上で２分間分離させた。洗浄ステップ後、溶出緩衝液（１．８ＭのＮａＣｌＯ４、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．８、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のトリトンＸ－１００）を用いて、アプタマーを精製したアプタマー－タンパク質複合体から溶出させた。溶出は、７５μＬの溶出緩衝液を使用して２５℃で１０分間、ビーズを１２５０ｒｐｍで振とうしながら行った。７０μＬの溶出液をアーカイブプレートに移し、磁石上で分離させて、吸引される可能性のある全ての磁気ビーズを分割した。１０μＬの溶出物質を黒ハーフエリアプレートに移し、アッセイ緩衝液で１：５に希釈して、内部アッセイＱＣとしてモニタリングするＣｙ３蛍光シグナルの測定に使用した。２０μＬの溶出物質を、５μＬのハイブリダイゼーションブロッキング溶液（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、大容量、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ５１８８－５３８０、Ａｇｉｌｅｎｔアレイ上のコーナーマーカープローブに相補的なシアニン３標識ＤＮＡ配列のスパイクを含む）を含むプレートに移した。このプレートをロボットデッキから取り外し、ハイブリダイゼーションのためにさらに処理した（以下を参照）。溶出液が残ったままのアーカイブプレートを、アルミホイルを使用して熱密封し、－２０℃で保存した。
ハイブリダイゼーション。
２５μＬの２倍Ａｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーション緩衝液（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製品番号５１８８－５３８０）を、溶出試料及びブロッキング緩衝液を含むプレートの各ウェルに手作業でピペッティングした。４０μＬのこの溶液を、ハイブリダイゼーションガスケットスライド（ハイブリダイゼーションガスケットスライド－スライド形式当たり８マイクロアレイ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の各「ウェル」に手作業でピペッティングした。各アプタマーに相補的な、アレイ当たり１０個のプローブを含むカスタムＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ ８×６０ｋ Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスライドを、製造業者のプロトコルに従ってガスケットスライド上に置いた。各アセンブリ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｋｉｔ－ＳｕｒｅＨｙｂ対応、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をしっかりと固定し、ハイブリダイゼーションオーブンに載せて５５℃で１９時間、２０ｒｐｍで回転させた。
ハイブリダイゼーション後の洗浄。
Ｌｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（モデル６５０Ｃ、Ｓｃｉｇｅｎｅ）を用いてスライド洗浄を実施した。およそ７００ｍＬの洗浄緩衝液１（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を大きなガラス製染色皿に注ぎ、ガスケットスライドからのマイクロアレイスライドの分離に使用した。ひとたび分解させたら、スライドを、Ｌｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ上の洗浄緩衝液１を含む槽内のスライドラックに迅速に移した。スライドを、マグネチックスターバーで混合しながら、洗浄緩衝液１で５分間洗浄した。次いで、スライドラックを３７℃の洗浄緩衝液２（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた槽に移し、撹拌しながら５分間インキュベートした。スライドラックを第２槽からゆっくりと取り出し、次いでアセトニトリルを含む槽に移して、撹拌しながら５分間インキュベートした。
マイクロアレイイメージング。
マイクロアレイスライドを、３μｍ解像度、１００％ＰＭＴ設定でシアニン３チャネルにおいてマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ４９００ＤＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてイメージングし、２０ビットオプションを有効にした。得られたｔｉｆｆ画像を、ＧＥ１＿１２００＿Ｊｕｎ１４プロトコルを用いたＡｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェア（バージョン１０．７．３．１以上）を用いて処理した。
ある特定の生物学的試料の収集及び調製
いくつかの実施形態において、生物学的試料は、以下に記載される試料収集、緩衝液交換、及び／またはタンパク質標準化を実施することによって調製される。
尿試料の収集及び調製
尿試料は、管内に取り込まれた中間尿を介して個体から収集し、次いで直ちに－８０℃の冷凍庫に保存した。凍結尿試料を以下のように処理した：
緩衝液交換：試料を３７℃の水浴中で約１５分間解凍して、全ての低温沈殿物が溶解することを確実にした。解凍した試料を水浴から取り出し、生物学的安全キャビネットに入れた。キャップを除去し、内容物を２００μＬのマルチチャネルピペットで上下に３回ピペッティングすることにより混合した。試料をそれぞれ２１６μＬで新たな管に分取し、２０μＬシングルチャネルピペットを用いて１Ｍのトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）ｐＨ＝８を解凍／混合尿の各アリコートに加え、最終トリス濃度が４０ｍＭ（４％）となるようにした。トリス処置したアリコートを、２００μＬのマルチチャネルピペットで上下に３回穏やかにピペッティングすることにより混合した。１５μＬのトリス処置した尿試料を、ＰＣＲプレート（９６ウェルＰＣＲプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号ＮＣ０５０８６５９））中の対応するウェルに移した。この１５μＬのアリコートを、メロシアニン色素を含むＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）キットを用いてタンパク質濃度の定量化を実施するまで－８０℃で保存した（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ：Ａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３４（４）：８５０－４（２００３）を参照）。
アリコートを、２つのＺｅｂａ（商標）７ｋＤａ ＭＷＣＯスピン脱塩プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号８９８０８）または２つのＨａｒｖａｒｄ Ｇ２５ １．５ｋＤａ ＭＷＣＯ ９６－Ｗｅｌｌ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ（商標）（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ番号７４－５６５２）上でそれぞれの製造業者の説明書に従って緩衝液交換した。Ｚｅｂａ（商標）脱塩プレートについては、製造業者のプロトコルの「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｂｕｆｆｅｒ－Ｅｘｃｈａｎｇｅ」セクションを参照。簡潔に述べると、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩プレートを室温に到達するまでインキュベートした。このアセンブリを、９６ウェルプレート－キャリアローターを用いて１，０００×ｇで２分間遠心分離して、貯蔵緩衝液を除去した。フロースルーを廃棄した。２５０μＬ体積の緩衝液を樹脂床の頂部に加えた。再びプレートを１，０００×ｇで２分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。このステップをさらに３回繰り返した。洗浄プレートを脱イオン水で３回すすぎ、乾燥させ、今後の使用のために保存した。各脱塩プレートを試料収集プレートの上に積み重ねて、プレート上の英数字見出しを整列させた。１００μＬの試料を第１の脱塩プレートの樹脂床の中央に適用した。同じ試料の別の１００μＬの試料を、第２の脱塩プレートの樹脂床の中心に適用した。プレートを１０００×ｇで２分間遠心分離し、処理した試料を収集した。２００μＬのマルチチャネルピペットを使用して、１００μＬの各トリス処置／脱塩試料を２つのマトリックスラックの各々に移し、試料の向きを維持した。マトリックス管を再度キャップし、これでこれらの管は１００μＬのトリス処置／脱塩試料を含んだ。アリコート管をドライアイスに移し、－８０℃で保存した。
Ｈａｒｖａｒｄ Ｇ２５ ９６－Ｗｅｌｌ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ（商標）については、製造業者のプロトコルの「Ｆｏｒ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｏｌｕｍｎｓ」セクションを参照。簡潔に述べると、９６－Ｗｅｌｌ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ（商標）を収集管のうちの１つに入れ、２００μＬの緩衝液を全ての開口ウェルに加えた。管を１５分間インキュベートして水和を可能にした。プレートを２０００×ｇで２分間遠心分離した。９６－Ｗｅｌｌ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ（商標）を収集プレートから取り出し、カラムの外側の水分を吸い取って乾燥させた。１００μＬ体積の試料を、第１の９６－Ｗｅｌｌ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎプレートのウェルの頂部に移した。同じ試料の別の１００μＬ体積を、第２の９６－Ｗｅｌｌ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎプレートのウェルの中心に加えた。各カラムプレートを新たな収集プレートに加え、２０００×ｇで２分間スピンさせ、１００μＬの各トリス処置／脱塩試料を２つのマトリックスラックのそれぞれに移した。マトリックス管を再度キャップした。これでこれらの管は１００μＬのトリス処置／脱塩試料を含む。完了したアリコート管のラックをドライアイスに移し、－８０℃で保存した。
１５μｇ／ｍＬ総タンパク質へのタンパク質標準化：
緩衝液交換された尿試料は、以下のようにして、総タンパク質濃度が１２０μＬにおいて１５μｇ／ｍＬになるように標準化した：緩衝液交換された尿検体を２８～３７℃の水浴で１０分間解凍した。緩衝液交換された検体の必要体積を、以下の式によって計算した：０．１２ｍＬ×１５μｇ／ｍＬ／尿［タンパク質］（μｇ／ｍＬ）＝Ｖ＊（尿試料の体積）。この式により、Ｖ＊が０．１０８ｍＬよりも大きい場合、Ｖ＊を０．１０８ｍＬになるように調整した。以下の式によって１倍アッセイ緩衝液を管に加えた：０．１０８ｍＬ－Ｖ＊＝アッセイ緩衝液の体積。５０μＭのＺ－ブロック（１０倍Ｚ－ブロック）を含む０．０１２ｍＬ体積の１倍アッセイ緩衝液を加えた。試料を穏やかに混合した。１００μＬ体積を、アプタマーベースアッセイの９６－ウェルキャッチ－０プレートの単一ウェルに移した。３つ全ての血漿マスターミックス（Ｄｉｌ１、Ｄｉｌ２、及びＤｉｌ３）を各ウェル内で合わせた。
キット
本明細書に記載の任意のアナライトの組合せは、好適なキット、例えば、本明細書で開示される方法の実施に使用するためのキットを用いて、検出することができる。さらに、任意のキットが、本明細書で記載されているような１つ以上の検出可能標識（例えば、蛍光部分など）を含み得る。
上記の説明では、多数の詳細が記載されている。しかし、本開示の利益を有する当業者には、本開示がこのような具体的な詳細なしで実施され得ることが明らかであろう。いくつかの場合において、周知された構造及びデバイスは、本開示を不明瞭にすることを避けるために、詳細に示されるのではなく、ブロック図形態で示される。
詳細な説明のいくつかの部分は、１つ以上の所望の結果を導くステップの観点から提示されている。概して、このようなステップは、物理量の物理的操作を必要とするステップである。通常、必ずしもそうとは限らないが、このような量は、記憶、移転、組合せ、比較、及び別の形で操作が可能な電気または磁気信号の形態をとる。これらの信号をビット、値、要素、記号、文字、用語、数字などと称することは、一般的な用法という理由から、時として好都合であることが証明されている。
ただし、これらの用語及び類似の用語は全て、適切な物理量に関連するものであり、単にこれらの量に適用される好都合なラベルに過ぎないことに留意すべきである。以下の解説から明らかなように、別段に明記されていない限り、説明全体において、「計算する」、「比較する」、「適用する」、「作出する」、「ランク付けする」、「分類する」などの用語を利用する解説は、コンピューターシステムのレジスタ及びメモリ内の物理的（例えば、電子的）量として表されるデータを、コンピューターシステムのメモリもしくはレジスタ内、または他のこのような情報記憶、伝送、または表示デバイス内の物理的量として同様に表される他のデータに操作及び変換する特化型コンピューターシステムまたは同様の特化型電子コンピューティングデバイスの動作及びプロセスを指すことを理解されたい。
本開示のある特定の例は、本明細書での運用を実施するための装置にも関する。この装置は、意図された目的のために構築される場合もあれば、意図された目的を実施するように選択的にインストール、起動、または構成された特化型コンピューターハードウェア及び／または特化型コンピュータープログラムを含む場合もある。このようなコンピュータープログラムは、コンピューター可読記憶媒体、例えば、限定されるものではないが、フロッピーディスク、光学ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、及び磁気光学ディスク、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、磁気カードもしくは光カード、または電子命令の格納に適した任意のタイプの媒体に格納することができる。
上記の説明は、例示的であり、限定的ではないように意図されていることを理解されたい。多くの他の例は、上記の説明を読み理解すれば当業者には明らかになるであろう。そのため、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲を、このような請求の権利が与えられる等価物の十分な範囲と共に参照して判断されるべきである。
以下の実施例は、ある特定の特徴及び／または実施形態を示すために示されるものである。これらの実施例が、記載された特定の特徴または実施形態に本開示を限定するように解釈されるべきではない。
実施例１：尿の総タンパク質及び組成の変動性
尿試料における試料間変動性を確認するため、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化キット；カタログ番号Ｎ６６６６）を３つの異なる尿収集物で使用し、スポット尿試料から広範囲のタンパク質濃度が得られた。第１群は４６例のボランティアからなり、第２群は１７０例のボランティアからなり、第３群は１８３例のボランティアからなった。概して、尿試料は、管内に取り込まれた中間尿を介して個体から収集し、次いで直ちに－８０℃の冷凍庫に保存した。
３つの異なる採尿群のタンパク質濃度は約４μｇ／ｍＬ～約４４２３μｇ／ｍＬの範囲であり、最も希釈された試料と最も濃縮された試料との間に約１，０００倍の差が生じた。各収集時のタンパク濃度の中央値（四分位範囲）は、第１群の対象で４６．５（２３～７４．５）μｇ／ｍＬ、第２群の対象で５７．５（２７．２～８９．８）μｇ／ｍＬ、及び第３群の対象で７５．０（５１～１１４）μｇ／ｍＬであった。
概して、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅキットを用いた尿中総タンパク質濃度の定量に使用した方法は以下の通り：１０倍濃縮ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化希釈液を蒸留水で１０倍に希釈することにより、１倍タンパク質定量化希釈液を作製した。９６ウェルプレートの各々に１５ｍＬの１倍タンパク質定量化希釈液が必要であった。１．５ｍＬのＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化希釈液を、１３．５ｍＬの蒸留水または脱イオン水に加えた。９６ウェルプレートの各々に、１３ｍＬの１．０４倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）試薬作業溶液を調製した。ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化試薬（成分Ａ）を１倍タンパク質定量化希釈液に入れて４８１倍に希釈した。ホイルで包んだ管内で、０．０２７ｍＬのＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化試薬（成分Ａ）を１３ｍＬの１倍タンパク質定量化希釈液に加えた。ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）色素の光分解を防止するため、１倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）作業溶液を光から保護した。ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）キットは、標準曲線を用意するために使用したＢＳＡ（成分Ｂ）の２ｍｇ／ｍＬ試料を含む。標準曲線を２５倍で生成し、１０．２５～０．４０２μｇ／ｍＬの最終範囲で網羅した。最終１倍タンパク質定量化希釈液中の最初のＢＳＡの２５倍ストック溶液（最終１０．２５μｇ／ｍＬ）を調製した。３９μＬの１０倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化希釈液（製造業者が供給）及び５０μＬの２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを３０２μＬの蒸留水に加えた。１倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化希釈液中の２５倍ＢＳＡ溶液の８つの１．５倍系列希釈液を調製した。２００μＬの前回の標準溶液を１００μＬの１倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化希釈液に加えた。１倍タンパク質定量化希釈液中の２５倍ＱＣ＃１を２０５μｇ／ｍＬ（最終８．２μｇ／ｍＬ）で調製した。４８．８μＬの１０倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化希釈液（製造業者が供給）及び５０μＬの２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを３８９．２μＬの蒸留水に加えた。１倍タンパク質定量化希釈液中の２５倍ＱＣ＃２を１３２．５μＬ（最終５．３μｇ／ｍＬ）で調製した。２２６μＬのＱＣ＃１を１２３．７μＬの１倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化希釈液に加えた。１倍タンパク質定量化希釈液中の２５倍ＱＣ＃３を３０μｇ／ｍＬ（最終１．２μｇ／ｍＬ）で調製した。７９μＬのＱＣ＃２を２６９．９μＬの１倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化希釈液に加えた。各２５倍トリス処置尿試料（下記の処理注記参照）を、１．０４倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）試薬作業溶液に入れて希釈した。ノンスカートＰＣＲプレート（Ａｂｇｅｎｅ番号ＡＢ－０６００－Ｌ）において、６μＬの原尿試料を１４４μＬの１．０４倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）試薬作業溶液に加えた。各２５倍ＱＣ試料を、２連で１．０４倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）試薬作業溶液に入れて希釈した。ノンスカートＰＣＲプレート（Ａｂｇｅｎｅ番号ＡＢ－０６００－Ｌ）において、６μＬのＱＣ試料を、２連で１４４μＬの１．０４倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）試薬作業溶液に加えた。各２５倍標準曲線試料を、１．０４倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）試薬作業溶液に入れて希釈した。ノンスカートＰＣＲプレート（Ａｂｇｅｎｅ番号ＡＢ－０６００－Ｌ）において、６μＬの標準曲線試料を１４４μＬの１．０４倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）試薬作業溶液に加えた。２つの「ブランク」を含めた。
ノンスカートＰＣＲプレート（Ａｂｇｅｎｅ番号ＡＢ－０６００－Ｌ）において、６μＬの１倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）タンパク質定量化希釈液を１４４μＬの１．０４倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）試薬作業溶液に加えた。ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ８－ｃａｐ ｓｔｒｉｐ付きの全ての試料含有ウェルをキャップした（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ番号Ｎ８０１０５６０）。試料を、ヒートリッド付きのサーモサイクラー内で９５℃で１０分間インキュベートし、光から保護し、次いでサーモサイクラーまたはベンチトップのいずれかの中で３０分間室温に冷却し、光から保護した。マルチチャネルピペットを使用して、１００μＬの各試料を黒クリアボトムハーフエリア９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号３８８０）に移した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（または類似の計測器）で蛍光を４７０ｎｍで測定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘのパラメーターを以下のように設定した：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｅｎｄｐｏｉｎｔ；Ｔｏｐ Ｒｅａｄ：４７０ｎｍ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／５９０ｎｍ ｅｍｉｓｓｉｏｎ／５７０ ｃｕｔｏｆｆ；Ａｕｔｏｍｉｘ：ｏｆｆ；Ｃａｌｉｂｒａｔｅ：ｏｎ；ＰＭＴ：Ａｕｔｏ；Ｓｅｔｔｌｅ Ｔｉｍｅ：ｏｆｆ；Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｒｉｏｒｉｔｙ；Ｓｐｅｅｄ：Ｎｏｒｍａｌ；Ｒｅａｄｓ／Ｗｅｌｌ：６。
未知の試料のタンパク質濃度は、最初にＱＣ及び標準物質を含む全ての試料の蛍光値から試薬ブランクの蛍光値を引くことによって定量した。４パラメーター適合による標準曲線を使用して、未知の試料及びＱＣのタンパク質濃度を定量した。２連ＱＣ試料のＣＶ％（＜１５％）及び精度（＜１５％）を計算して、プレートの通過を確認した。
さらに、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ＝８）を加えることがＮａｎｏＯｒａｎｇｅタンパク質定量化アッセイに及ぼす効果を、１７例の独立した尿検体で評価した。新鮮凍結尿アリコートを３７℃水浴中で１５分間解凍し、１４，０００ｇで１０分間遠心分離し、清澄化した上清を新鮮な管に移した。ＮａｎｏＯｒａｎｇｅアッセイでのタンパク質定量化用に、清澄化した上清から６マイクロリットルのアリコートを取り出した。次いで、トリスｐＨ８．０（１Ｍ）を残りの４４μＬの上清に加えて、最終濃度を４０ｍＭとした。６マイクロリットルのこれらのトリス処置試料を同様にＮａｎｏＯｒａｎｇｅアッセイで実行し、タンパク質濃度を未処置の対応物と比較した。
簡潔に述べると、６μＬの尿を、ＰＣＲプレート中の１４４μＬの１倍ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ作業溶液に加えた。試料をキャップし、サーモサイクラー中で１０分間９５℃に加熱し、ベンチトップ上で３０分間冷却し、光から保護した。１００μＬの熱冷却試料をクリアボトム／黒ハーフエリアＵＶプレートに移し、４７０ｎｍ励起／５９０ｎｍ発光波長を用いて蛍光を測定した。各プレートに含まれる標準曲線を用いてタンパク質濃度を定量した。
この実施例では、複数の対象及び複数の収集回数にわたる単一の対象の両方からの尿検体が、総タンパク質測定値で変動性を示すことが確認された。さらに、この実施例では、尿試料の組成及び特徴（例えば、ｐＨ及び塩分含量）が対象によって変動し得ることが示された。
実施例２：アナライト測定値はプロテオミクスアッセイにおける塩及び尿素の濃度差に感受性がある
この実施例は、プロテオミクス解析におけるアナライト測定値が、塩及び尿素（共に尿の成分である）の濃度変化に感受性があることを示すものである。
様々な濃度の尿素、ＮａＣｌ、及び／またはＭｇＣｌ２がアプタマーベースのプロテオミクスアッセイに及ぼす効果を測定した。この実施例で使用した対照（または「真の標準」）製剤は、ＳＢ１７アッセイ緩衝液である。ＳＢ１７は、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（ｖ／ｖ）をｐＨ７．５で合わせることによって作製したアッセイ緩衝液である。様々な塩及び／または尿素濃度を有するＳＢ１７緩衝液の製剤を作製し（表３の製剤１～２８を参照）、表２に列挙された２０１の組換えタンパク質から選択した１つのタンパク質を特定のタンパク質濃度でスパイクした。
Figure 2022524975000002
Figure 2022524975000003
Figure 2022524975000004
表３に示すように、製剤中のＮａＣｌの最終濃度は約１００ｍＭから約４２０ｍＭまで変動し、より具体的には、ＮａＣｌの濃度は、１１２ｍＭ、１２２ｍＭ、１４２ｍＭ、１８２ｍＭ、２６２ｍＭ、３４２ｍＭ、及び４２２ｍＭであった。製剤中のＭｇＣｌ２の最終濃度は約５ｍＭから約１３ｍＭまで変動し、より具体的には、ＭｇＣｌ２の濃度は、５．２５ｍＭ、５．５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、９ｍＭ、１１ｍＭ、及び１３ｍＭであった。製剤中の尿素の最終濃度は約０ｍＭから約３２０ｍＭまで変動し、より具体的には、尿素の濃度は、０ｍＭ、２０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、８０ｍＭ、１６０ｍＭ、２４０ｍＭ、及び３２０ｍＭであった。
ＳＢ１７緩衝液及び製剤１～２８中の２０１の組換えタンパク質の濃度を、アプタマーアッセイ法を用いて測定した。
アプタマーベースアッセイにおいてＮａＣｌの濃度増加が２０１の組換えタンパク質の測定値に及ぼす効果についてのデータを図１に示す。対照（またはベースラインの比較測定値）と比較した２０１のタンパク質アナライトについての、アッセイに存在するタンパク質の相対レベルに対応するＲＦＵ（相対蛍光単位）のＬｏｇ２倍変化は、ＮａＣｌ濃度の増加に伴って、アッセイによる個々のタンパク質アナライトの測定レベルが変化したことを示している。概して、これらのデータは、アプタマーベースアッセイで１つ以上のタンパク質の濃度は同じだがＮａＣｌの濃度は異なる２つ以上の試料（例えば、尿試料）を使用した場合、この２つ以上の試料から得られる１つ以上のタンパク質のレベルは異なり、そのためバイオマーカーの発見及び／または診断に関連する任意の結果が生じるであろうことを示している。
アプタマーベースアッセイでＭｇＣｌ２の濃度増加が２０１の組換えタンパク質の測定値に及ぼす効果についてのデータを図２に示す。対照（またはベースラインの比較測定値）と比較した２０１のタンパク質アナライトについての、アッセイ中存在するタンパク質の相対レベルに対応するＲＦＵ（相対蛍光単位）のＬｏｇ２倍変化は、ＭｇＣｌ２濃度の増加に伴って、アッセイによる個々のタンパク質アナライトの測定レベルが変化したことを示している。概して、これらのデータは、アプタマーベースアッセイで１つ以上のタンパク質の濃度は同じだがＭｇＣｌ２の濃度は異なる２つ以上の試料（例えば、尿試料）を使用した場合、この２つ以上の試料から得られる１つ以上のタンパク質のレベルは異なるであろうことを示している。
アプタマーベースアッセイで尿素の濃度増加が２０１の組換えタンパク質の測定値に及ぼす効果についてのデータを図３に示す。対照（またはベースラインの比較測定値）と比較した２０１のタンパク質アナライトについての、アッセイ中存在するタンパク質の相対レベルに対応するＲＦＵ（相対蛍光単位）のＬｏｇ２倍変化は、尿素濃度の増加に伴って、アッセイによる個々のタンパク質アナライトの測定レベルが変化したことを示している。概して、これらのデータは、アプタマーベースアッセイで１つ以上のタンパク質の濃度は同じだが尿素の濃度は異なる２つ以上の試料（例えば、尿試料）を使用した場合、この２つ以上の試料から得られる１つ以上のタンパク質のレベルは異なるであろうことを示している。
まとめると、これらのデータは、様々な濃度の塩が、アプタマーベースアッセイにおけるタンパク質のレベル測定に影響を及ぼしたことを示している。このような変動は、とりわけ試料間で塩濃度が異なることが知られている生物学的試料（例えば、尿）の場合、バイオマーカーの発見及び診断検査を複雑にする。したがって、生物学的試料に由来するタンパク質またはタンパク質セットのレベルを比較し、意味のある健康関連情報及び／または臨床的決定ツール（例えば、疾患対非疾患）を導き出すためには、塩濃度の変化を軽減しなければならない。
実施例３：アプタマーベースアッセイでアナライトを測定するための固定された尿中タンパク質濃度の使用
この実施例は、アプタマーベースアッセイで尿中の総タンパク質濃度が線形範囲内のアナライトの数に影響を及ぼすことを示すものである。
結合曲線の線形範囲は、標的濃度の変化が相対蛍光単位（ＲＦＵ）シグナルの比例的（すなわち線形的）変化に対応する領域である（すなわち、濃度の変化速度が、アプタマーベースアッセイにおけるハイブリダイゼーションベースリードアウトの測定単位であるＲＦＵの変化速度に等しい）。概して、任意のタイプの試料についての好ましい総タンパク質の濃度または濃度範囲は、線形範囲内のアナライトの数を最大にする濃度として定義される。
好ましい尿中総タンパク質の濃度または濃度範囲を定量するため、タンパク質濃度が高い、例えば１４７μｇ／ｍＬの尿試料を用いて８点滴定を実施した。アプタマーアッセイ緩衝液が反応体積の約２０％を占めるため、検体の１４７μｇ／ｍＬ濃度の約８０％、すなわち１１８μｇ／ｍＬを試料の開始タンパク質濃度とした。次いで、１．８μｇ／ｍＬに対する６点１：２希釈系列を実施し、より高い濃度における解像度をわずかに高めるため、８８μｇ／ｍＬ（すなわち出発タンパク質濃度の７５％）でもう１つの点を加えた。試料を、本明細書に記載のアプタマーベースアッセイでアッセイした。全ての試料を２０μＭのＺ－ブロックと共に１連でアッセイした。
合計２，２９８のアナライトが３点以上の希釈線形性を有することが観察されたが、この線形性は出発総タンパク質濃度に依存した。線形範囲を図４に示す。Ｘ軸はアナライトの数（０～２２９８のアナライト）を特定し、Ｙ軸は総タンパク質濃度（２μｇ／ｍＬ～１２８μｇ／ｍＬ）を特定する。黒色のバーは、総タンパク質濃度の関数として、各アナライトにおける線形範囲の下限及び上限に及んでいる。各総タンパク質濃度で線形範囲内に収まるアナライトが存在したが、試料を１５μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度に標準化すると、６０％超のアナライトが線形範囲を有した。したがって、アナライトにおける線形範囲は、２、４、８、１６、３２、６４、及び１２８μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度で観察された。同じデータを代替的方法で見たものを図５に示す。
図５は、線形範囲内で測定された分析物（ｎ＝２，２９８）の総数のパーセントを総タンパク質濃度の関数として示している。０μｇ／ｍＬから開始して、線形範囲内のアナライトの局所最大値は約７μｇ／ｍＬで生じ、次いで約３０μｇ／ｍＬまでわずかな減少が観察される。５９μｇ／ｍＬの総タンパク濃度で増加が観察されたが、測定シグナル（すなわち、ＲＦＵレベル）は比較的低く（データは示さず）、したがって一貫した測定が困難であった可能性がある。
まとめると、これらのデータは、線形範囲が約２μｇ／ｍＬ～約１２８μｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質濃度のアナライトで得られ得るが、最も多数の線形範囲内のアナライトを相対的に「強力な」ＲＦＵシグナルと共にもたらす好ましい総タンパク質濃度範囲は、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅによる測定において約２μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約５μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは約１０μｇ／ｍＬ～３０μｇ／ｍＬであったことを示している。最も多数の線形範囲内のアナライトをもたらすより正確な総タンパク質濃度は、約７μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び１５μｇ／ｍＬであった。
これらのデータは、試料中のタンパク質アナライトを測定する前に、試料中の総タンパク質濃度を標準化された総タンパク質濃度に調整することにより、線形範囲内のアナライトの数を増加させる得ることを示すが、尿などの複雑なマトリックスは依然塩などの様々な成分を含んでおり、このことから、その試料中のタンパク質レベルを正確かつ一貫して測定する能力が妨げられる恐れがある。
実施例４：アプタマーベースアッセイでアナライトを測定するための尿試料における緩衝液交換の使用
この実施例は、緩衝液交換法を尿試料に適用することが、アプタマーベースアッセイによって測定され得る線形範囲を有するアナライトの数に影響を及ぼすことを示すものである。
緩衝液交換なし（対照）及びＳＢ１７アッセイ緩衝液を用いた緩衝液交換後の尿試料に対し滴定を実施した。緩衝液交換は、Ｚｅｂａ（商標）７ｋＤａ ＭＷＣＯスピン脱塩カラムを使用し、製造業者のプロトコルに従って遂行した。希釈系列は、対照尿試料及び緩衝液交換尿試料の両方において、４、８．１、１６．３、３２．５、６５、及び１３０μｇ／ｍＬの総タンパク質とした。対照試料及び緩衝液交換試料の各々中の２，２９８のアナライトを、実施例３で概説されるように、アプタマーベースアッセイで個別に測定した。
２つのアナライト（ＡＬＤＯＡ及びＡＮＸＡ４）に対する総タンパク質滴定系列におけるアプタマーベースアッセイの結果を図６に示す。緩衝液交換された尿試料（図６で「脱塩」として示される）及び緩衝液交換されない尿試料をプロットし、ｘ軸を試料の総タンパク質濃度とし、ｙ軸をＬｏｇ１０ＲＦＵ値（試料中のタンパク質の相対レベルの代替物）とした。図６は、アプタマーベースアッセイでアナライトを測定する前に尿試料の緩衝液交換を実施することにより、（とりわけ総タンパク質が約１６μｇ／ｍＬ超の場合）アナライトの線形範囲が拡大したことを示している。
試験した他のアナライトも同様の結果を示した。これらのデータは、総タンパク質濃度が高いこと（これは、おそらく尿含量が高いこと（試料が希薄でないこと）を示し、よってアッセイ「妨害物質」（例えば、尿塩）の濃度が高いことを示す）が、アッセイでのアナライト測定値に影響を及ぼしたことを示している。さらに、これらのデータは、試料中のアナライトのレベルをアッセイする前に、尿試料に対し緩衝液交換を実施することにより、尿試料中の特定のアナライトを一貫して再現可能に測定する能力に対しこのような「妨害物質」が及ぼす影響が軽減されたことを示している。
したがって、アプタマーベースアッセイでアナライトのレベルを測定する前に尿試料の緩衝液交換を行うことにより、とりわけタンパク質濃度が約１６μｇ／ｍＬ超（例えば、ＡＬＤＯＡタンパク質）及び３２μｇ／ｍＬ超（例えば、ＡＮＸＡ４タンパク質）の尿試料において、尿の「妨害物質」の影響が軽減された。
実施例５：尿試料の緩衝液交換及び総タンパク質濃度標準化の組合せ
この実施例は、尿試料に緩衝液交換及び総タンパク質濃度標準化の適用を組み合わせることで、アナライト測定の再現性及び試料中のアナライトの数が改善されることを示すものである。これにより、バイオマーカー発見を実施する能力が増大し、プロテオミクスアッセイによる尿試料を用いた個体への診断または予後タイプアッセイがもたらされる。
滴定実験を実施して、最も多数の線形範囲を有するアナライトをもたらす緩衝液交換された尿試料の総タンパク質濃度を定量した。ヒトのドナーからの１１例の尿試料を、２ｍＬのＺｅｂａスピン脱塩カラム（４００μＬ尿装填）を用いてＳＢ１７緩衝液に緩衝液交換した。８０％の「尿」で開始する系列２倍希釈によって滴定を実施し、その間オリゴヌクレオチド競合物質（Ｚ－ブロック）濃度を５μＭに維持した。各試料についての滴定曲線を適合させ、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）によって測定された総タンパク質空間における線形範囲内のアナライトの数、そして線形範囲より上下にあるアナライトを計算しプロットした。
図７は、線形範囲内、線形範囲より上、及び線形範囲より下にあるアナライトの数を示している。Ｘ軸は、試料の総タンパク質濃度（約０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬの範囲）を表し、図７Ａの場合、Ｙ軸は測定されたアナライトの数であり、図７Ｂの場合、同じデータがプロットされているが、Ｙ軸はアナライトのパーセントを示している。概して、図７のデータは、試料を約１０μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬの総タンパク質濃度に標準化し、アプタマーベースアッセイでアナライトを測定する前にアッセイ緩衝液によって緩衝液交換に供すると、アナライトの大部分が線形範囲内にとどまったことを示している。
まとめると、本明細書に記載のデータは、総タンパク質濃度が約１００μｇ／ｍＬよりも有意に高い試験試料（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｈｉｇｈ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ｓｌｏｗ Ｏｆｆ－Ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒ（ＳＯＭＡｍｅｒ）Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５（１０）：３０７２－３０８８（２０１７）に記載されているもの）が、総タンパク質濃度が６０μｇ／ｍＬ以下の試験試料よりも、線形範囲内のアナライトの数が低減していることを示している。
実施例６：尿試料の総タンパク質を測定するためのＢＣＡアッセイの使用
マイクロＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２３５）を使用して、尿検体のタンパク質濃度を測定した。アッセイは、Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｅｎｔ ７８０リキッドハンドリングプラットフォームを用いて半自動プロトコルで実行した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用してタンパク質標準物質を調製し、品質管理（ＱＣ）試料をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから商業的に購入した（カタログ番号ＮＩＳＴ９２７Ｅ）。
６０ｍＬのマイクロＢＣＡ作業試薬を、３０ｍＬの試薬Ａ、２８．８ｍＬの試薬Ｂ、１．２ｍＬの試薬Ｃを用いて調製した。タンパク質標準物質及びＱＣ試料は、４～６４μｇ／ｍＬの範囲の既知の濃度を０．０５倍アッセイ緩衝液で希釈することによって３連の管で調製し、管当たり５００μＬの最終体積とした。尿試料のｐＨを調整し、緩衝液交換を行い、次いで脱イオン水で２０倍に希釈した。
タンパク質標準物質及びＱＣ試料を３連で分析し、「ブランク」緩衝液試料を２連で分析した。タンパク質濃度が未知の尿試料は単一の測定値として分析したが、各試料を４つの異なる希釈物で試験した。
オペレーターは、Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｅｎｔリキッドハンドリングプロトコルを開始した。このプロトコルは、いくつかの試料希釈ステップを実施することと、マイクロＢＣＡ作業試薬を１：１で希釈した試料と混合することとを含んだ。自動プロトコルの完了後、オペレーターは、作業試薬と混合した試料をホイルに包み、これを３７℃のインキュベーター内に２時間置いた。２時間のインキュベートが完了した後、オペレーターは試料を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、次いで標準物質を含めた全ての試料の吸光度を測定した。
重み付けなしの二次適合を使用して、標準物質の吸光度を既知の濃度と相関させる較正曲線を作出した。較正曲線を使用して、ＱＣ試料及び尿試料のタンパク質濃度を計算した。結果の正確性を検証するため、２連ＱＣ試料の濃度を計算し、それらの既知の値の２０％以内であることを確認した。
実施例７：アプタマーベースアッセイと組み合わせたＢＣＡアッセイの使用
実施例３に記載されているように、尿試料中の総タンパク質濃度は、アプタマーベースのプロテオミクスアッセイで線形範囲内にあるアナライトの数に影響を及ぼす。
ＢＣＡアッセイで測定した尿における好ましい総タンパク質の濃度または濃度範囲を定量するため、１０例の尿試料を用いた滴定系列を実質的に実施例３に記載されているように分析し、実施例６に記載されているようにＢＣＡアッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。推定線形範囲内でシグナルをもたらしたアプタマー（例えば、ＳＯＭＡｍｅｒ試薬）の数を、測定した各総タンパク質濃度値ごとにカウントした。
図１１は結果を示しており、実施例６に記載のマイクロＢＣＡアッセイで測定したタンパク質濃度に対する線形範囲内のアプタマー（例えば、ＳＯＭＡｍｅｒ試薬）の数としてプロットしている。尿検査試料における最適なタンパク質濃度は、線形性カウントにさらなる増加がないと思われる最低濃度である。図１１に示す結果によれば、そのポイントは１００μｇ／ｍＬまたはそれよりさらに高いと思われる。ただし、１００μｇ／ｍＬを超える濃度は、典型的にこれより低い濃度である可変性の試料で得るには実用的でない可能性がある。そのため、最適範囲を調整された試験試料に対し７０～１００μｇ／ｍＬと判定した。
同じデータを代替的方法で見たものを図１２に示す。線形範囲内のアプタマー数を、１～１５０μｇ／ｍＬの範囲のタンパク質濃度に対し定量した。図１２Ａは、試験した１０例の試料の各々について、カウントのプロットをタンパク質濃度の関数として示している。図１２Ｂは、１０例全ての試料におけるこれらのカウントの平均をタンパク質濃度の関数として示している。図１２Ｂに示すように、最大平均カウントは９６μｇ／ｍＬで達成されたが、約７０～８５μｇ／ｍＬ及びそれ以上のタンパク質濃度の線形範囲内でのアプタマーの数の増加は小さい。
まとめると、これらのデータは、多くのアナライトにおいて線形範囲は約２μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質濃度で得られ得るが、比較的「強力な」ＲＦＵシグナルと共に最も多数の線形範囲内のアナライトをもたらす好ましい総タンパク質濃度範囲は、マイクロＢＣＡによる測定において約７０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬであったことを示している。

Claims (116)

  1. タンパク質を検出するための複数の生物学的試料を調製するための方法であって、
    緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することと、
    複数の試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、複数の調整された試験試料を生成することとを含み、調整された各試験試料の総タンパク質濃度がほぼ同じであり、
    前記方法が、前記緩衝液交換を実施する前に前記複数の生物学的試料の総タンパク質を濃縮することを含まない、前記方法。
  2. タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
    緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
    前記試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、調整された試験試料を生成することとを含み、前記調整された試験試料における総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬである、前記方法。
  3. 前記試験試料もしくは前記複数の試験試料及び／または前記生物学的試料もしくは前記複数の生物学的試料のタンパク質濃度を定量することを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
    緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対する緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
    前記試験試料の総タンパク質濃度を定量することと、
    前記試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、調整された試験試料を生成することとを含み、前記調整された試験試料における総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬである、前記方法。
  5. 複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することを含み、調整された各試験試料の総タンパク質濃度がほぼ同じである、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することを含み、調整された各試験試料の総タンパク質濃度が同じである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. タンパク質を検出するための生物学的試料を調製する方法であって、
    緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対する緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
    前記試験試料のタンパク質濃度を定量することと、
    前記試験試料の総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬの範囲内にない場合に、試験試料の総タンパク質濃度を調整することにより、調整された試験試料を生成することとを含み、前記調整された試験試料における総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬである、前記方法。
  8. 前記試験試料の総タンパク質濃度が、約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約９５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約９０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約８５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～約７５μｇ／ｍＬの範囲内にない場合に、前記試験試料の総タンパク質濃度を前記範囲に調整することにより、調整された試験試料を生成する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記１つ以上の塩が各々独立的に、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記製剤中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約７５～１２５ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記製剤中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記製剤中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記製剤中の前記緩衝剤が、約４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記製剤中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記非イオン界面活性剤が、前記製剤の約０．０１％～約１％、または前記製剤の約０．０２％～約０．５％、または前記製剤の約０．０３％～約０．１％、または前記製剤の約０．０４％～約０．０８％、または前記製剤の約０．０５％、または前記製剤の約０．１％（容量対容量）である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記調整された試験試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬ～約７５μｇ／ｍＬ、または約４μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、または約８μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬである、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記試験試料または前記調整された試験試料の総タンパク質濃度が、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって定量され、前記ＢＣＡアッセイが、任意選択でマイクロＢＣＡアッセイである、請求項３～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記アッセイが、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬またはビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬、ならびに任意選択でアルカリ性酒石酸－炭酸緩衝液及び／または硫酸銅溶液を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記製剤のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０からなり、ｐＨが７．５である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記緩衝液交換が限外濾過で実施されない、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記緩衝液交換がゲル濾過クロマトグラフィーによって実施される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記生物学的試料が尿試料である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記生物学的試料が血清試料である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記方法が、前記生物学的試料を濃縮することを含まない、請求項２～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 緩衝液交換された生物学的試料を含む試験試料であって、前記試験試料の総タンパク質濃度が約７０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬであり、前記緩衝液交換された生物学的試料が、緩衝剤、１つ以上の塩、キレート剤、及び非イオン界面活性剤を含む、前記試験試料。
  33. １つ以上のタンパク質捕捉試薬をさらに含む、請求項３２に記載の試験試料。
  34. 前記１つ以上のタンパク質捕捉試薬の各々が、アプタマーまたは抗体である、請求項３３に記載の試験試料。
  35. 前記試験試料の総タンパク質濃度が、約７０μｇ／ｍＬ～９５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～９０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～８５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～８０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬである、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の試験試料。
  36. 前記１つ以上の塩が各々独立的に、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の試験試料。
  37. 前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の試験試料。
  38. 前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、請求項３６または３７に記載の試験試料。
  39. 前記試験試料中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、請求項３８に記載の試験試料。
  40. 前記試験試料中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、請求項３８または３９に記載の試験試料。
  41. 前記試験試料中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の試験試料。
  42. 前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、請求項３２～４１のいずれか１項に記載の試験試料。
  43. 前記試験試料中の前記緩衝剤が、約４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、請求項３２～４２のいずれか１項に記載の試験試料。
  44. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、請求項３２～４３のいずれか１項に記載の試験試料。
  45. 前記試験試料中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、請求項３２～４４のいずれか１項に記載の試験試料。
  46. 前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、請求項３２～４５のいずれか１項に記載の試験試料。
  47. 前記非イオン性界面活性剤が、前記試験試料の約０．０１％～約１％、または前記試験試料の約０．０２％～約０．５％、または前記試験試料の約０．０３％～約０．１％、または前記試験試料の約０．０４％～約０．０８％、または前記試験試料の約０．０５％（容量対容量）である、請求項３２～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記試験試料の総タンパク質濃度が、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって定量され、前記ＢＣＡアッセイが、任意選択でマイクロＢＣＡアッセイである、請求項３２～４７のいずれか１項に記載の試験試料。
  49. 前記アッセイが、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬またはビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬、ならびに任意選択でアルカリ性酒石酸－炭酸緩衝液及び／または硫酸銅溶液を含む、請求項４８に記載の試験試料。
  50. 前記試験試料が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む、請求項３２～４９のいずれか１項に記載の試験試料。
  51. 前記試験試料のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、請求項３２～５０のいずれか１項に記載の試験試料。
  52. 少なくとも１つの捕捉試薬がアプタマーであり、前記少なくとも１つのアプタマーが５位修飾ピリミジンを含む、請求項３２～５１のいずれか１項に記載の試験試料。
  53. 前記５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの５位に疎水性部分を含む、請求項５２に記載の試験試料。
  54. 前記疎水性部分が、ナフチル部分、フェニル部分、チロシル部分、インドール部分、及びモルホリノ部分から選択される、請求項５３に記載の試験試料。
  55. 前記疎水性部分が、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含むリンカーを介して前記塩基の５位と共有結合している、請求項５３または５４に記載の試験試料。
  56. 前記生物学的試料が尿試料である、請求項３２～５５のいずれか１項に記載の試験試料。
  57. 前記生物学的試料が血清試料である、請求項３２～５５のいずれか１項に記載の試験試料。
  58. 前記緩衝液交換された生物学的試料を生成する目的で、ゲル濾過クロマトグラフィーが、前記生物学的試料に対する前記緩衝液交換の実施のために使用された、請求項３２～５７のいずれか１項に記載の試験試料。
  59. 試験試料中の標的タンパク質を検出するための方法であって、
    ａ）前記試験試料を少なくとも１つの捕捉試薬に接触させることであって、前記少なくとも１つの捕捉試薬が、複合体を形成するように前記標的タンパク質に結合可能である、前記接触させることと、
    ｂ）前記複合体の形成を可能にする条件下で、前記試験試料を前記少なくとも１つの捕捉試薬とインキュベートすることと、
    ｃ）前記少なくとも１つの捕捉試薬、前記複合体、または前記タンパク質のレベルを測定することにより、前記試験試料中の前記標的タンパク質のレベルを定量することであって、前記少なくとも１つの捕捉試薬または前記複合体のレベルが、前記標的タンパク質のレベルの代替である、前記定量することとを含み、
    前記試験試料が、緩衝剤と、塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することによって生成され、
    前記試験試料の総タンパク質濃度が、約７０μｇ／ｍＬ以上約１００μｇ／ｍＬ未満である、前記方法。
  60. 前記少なくとも１つのタンパク質捕捉試薬が、アプタマーまたは抗体である、請求項５９に記載の方法。
  61. 複数の捕捉試薬を含み、各捕捉試薬がアプタマーである、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. 前記試験試料の総タンパク質濃度が、約７０μｇ／ｍＬ～９５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～９０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～８５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～８０μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬ、または約７０μｇ／ｍＬである、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、請求項５９～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記１つ以上の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩を含む、請求項５９～６２のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. 前記製剤中の前記ＮａＣｌが、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１０２ｍＭの濃度である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記製剤中の前記ＫＣｌが、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、請求項６５または６６に記載の方法。
  68. 前記製剤中の前記ＭｇＣｌ２が、約０．５ｍＭ～約３０ｍＭ、または約１ｍＭ～約２０ｍＭ、または約２ｍＭ～約１５ｍＭ、または約４ｍＭ～約１０ｍＭ、または約５ｍＭの濃度である、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択される、請求項５９～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記製剤中の前記緩衝剤が４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、請求項５９～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択される、請求項５９～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記製剤中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、請求項５９～７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択される、請求項５９～７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記非イオン界面活性剤が、前記製剤の約０．０１％～約１％、または前記製剤の約０．０２％～約０．５％、または前記製剤の約０．０３％～約０．１％、または前記製剤の約０．０４％～約０．０８％、または前記製剤の約０．０５％である、請求項５９～７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記試験試料の総タンパク質濃度が、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって測定され、前記ＢＣＡアッセイが、任意選択でマイクロＢＣＡアッセイである、請求項５９～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記アッセイが、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬またはビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬、ならびに任意選択でアルカリ性酒石酸－炭酸緩衝液及び／または硫酸銅溶液を含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む、請求項５９～７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．５）からなる、請求項５９～７６のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記製剤のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、請求項５９～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記アプタマーが５位修飾ピリミジンを含む、請求項５９～７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの５位に疎水性部分を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記疎水性部分が、ナフチル部分、フェニル部分、チロシル部分、インドール部分、及びモルホリノ部分から選択される、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記疎水性部分が、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含むリンカーを介して前記塩基の５位と共有結合する、請求項８１または８２に記載の方法。
  84. 前記複合体が非共有結合複合体である、請求項５９～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記少なくとも１つの捕捉試薬が、前記試験試料に接触させる前に第１の固体支持体に結合するか、または前記捕捉試薬が、前記試験試料に接触させた後に第１の固体支持体に結合する、請求項５９～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 前記複合体を、前記捕捉試薬を介して第１の固体支持体に結合させることをさらに含む、請求項５９～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 前記第１の固体支持体から複合体を解放することと、前記複合体を第２の固体支持体に結合させることとをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記複合体が、前記タンパク質を介し前記第２の固体支持体に結合する、請求項８７に記載の方法。
  89. 競合分子を前記試験試料に加えること、及び／または競合分子を加え、前記試験試料を希釈することをさらに含む、請求項５９～８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 前記競合分子がポリアニオン競合物質である、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記ポリアニオン競合物質が、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン、及びｄＮＴＰから選択される、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記ポリアニオン性競合物質がポリデキストランであり、前記ポリデキストランがデキストラン硫酸である、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記ポリアニオン競合物質がオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドが１つ以上の５位修飾ピリミジンを含む、請求項９１に記載の方法。
  94. 前記生物学的試料が尿である、請求項５９～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記生物学的試料が血清である、請求項５９～９３のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記緩衝液交換がゲル濾過クロマトグラフィーを用いて実施される、請求項１～３１または５９～８６のいずれか１項に記載の方法。
  97. 前記緩衝液交換を実施する前に、前記生物学的試料のタンパク質濃度を測定することを含む、請求項１～３１または５９～９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 前記生物学的試料のタンパク質濃度が、蛍光読み出しアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、マイクロＢＣＡアッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群より選択されるアッセイによって測定される、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記アッセイが、ＢＣＡアッセイまたはマイクロＢＣＡアッセイである、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記アッセイが、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬またはビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬、ならびに任意選択でアルカリ性酒石酸－炭酸緩衝液及び／または硫酸銅溶液を含む、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記アッセイが蛍光リードアウトアッセイである、請求項９８に記載の方法。
  102. 前記蛍光リードアウトアッセイが、メロシアニン色素及びエピココノンから選択される試薬を含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. タンパク質を検出するための生物学的試料を調製するための方法であって、
    緩衝剤と、１つ以上の塩と、キレート剤と、非イオン界面活性剤とを含む製剤を用いて、前記生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、試験試料を生成することと、
    前記生物学的試料または前記試験試料の総タンパク質濃度を定量することと、
    前記生物学的試料または前記試験試料の総タンパク質濃度を調整することとを含み、前記方法が、前記緩衝液交換を実施する前に前記生物学的試料の総タンパク質を濃縮することを含まず、
    任意選択で、（ｉ）前記総タンパク質濃度が、前記緩衝液交換を実施する前に調整されるか、または（ｉｉ）前記総タンパク質濃度が、前記緩衝液交換を実施した後に調整される、前記方法。
  104. 前記試験試料の総タンパク質濃度が、前記緩衝液交換を実施した後に、約２μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬに調整される、請求項１０３に記載の方法。
  105. 複数の生物学的試料に対し緩衝液交換を実施することにより、複数の試験試料を生成することを含み、各試験試料の総タンパク質濃度がほぼ同じまたは同じである、請求項１０３または１０４に記載の方法。
  106. 前記生物学的試料の総タンパク質濃度が、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約８μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、または４０μｇ／ｍＬ未満、または３０μｇ／ｍＬ未満、または２０μｇ／ｍＬ未満、または約１５μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬの範囲にない場合に、前記方法が、前記生物学的試料の総タンパク質濃度を前記範囲に調整することを含む、請求項１０３～１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記１つ以上の塩が各々独立的に、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩から選択される、請求項１０３～１０６のいずれか１項に記載の方法。
  108. 前記ナトリウム塩がＮａＣｌであり、前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記マグネシウム塩がＭｇＣｌ２である、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記緩衝剤が、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、及びＣＡＢＳから選択され、前記製剤中の前記緩衝剤が、約４ｍＭ～約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、または約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、または約３５ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である、請求項１０３～１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＭＰＳ、及びＡＬＡから選択され、前記製剤中の前記キレート剤が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭの濃度である、請求項１０３～１０９のいずれか１項に記載の方法。
  111. 前記非イオン界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－２０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（４０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－４０）、及びモノラウリン酸ポリオキシエチレン（８０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）から選択され、かつ前記非イオン界面活性剤が、前記製剤の約０．０１％～約１％、または前記製剤の約０．０２％～約０．５％、または前記製剤の約０．０３％～約０．１％、または前記製剤の約０．０４％～約０．０８％、または前記製剤の約０．０５％もしくは約０．１％（容量対容量）である、請求項１０３～１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記試験試料または前記生物学的試料の総タンパク質濃度が、蛍光リードアウトアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、Ｌｏｗｒｙアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群より選択されるアッセイによって定量される、請求項１０３～１１１のいずれか１項に記載の方法。
  113. 前記蛍光リードアウトアッセイが、メロシアニン色素及びエピココノンから選択される試薬を含む、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記製剤が、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含み、前記製剤のｐＨが、約ｐＨ５～約ｐＨ９、または約ｐＨ６～約ｐＨ８、または約ｐＨ７～約ｐＨ７．９、または約ｐＨ７．５である、請求項１０３～１１３のいずれか１項に記載の方法。
  115. 前記緩衝液交換がゲル濾過クロマトグラフィーによって実施される、請求項１０３～１１４のいずれか１項に記載の方法。
  116. 前記生物学的試料が尿試料である、請求項１０３～１１５のいずれか１項に記載の方法。
JP2021552175A 2019-03-22 2020-03-20 複雑な生物学的マトリックスにおける試料間アナライト変動性の低減 Pending JP2022524975A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962822349P 2019-03-22 2019-03-22
US62/822,349 2019-03-22
PCT/US2020/023866 WO2020198011A1 (en) 2019-03-22 2020-03-20 Reducing intersample analyte variability in complex biological matrices

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022524975A true JP2022524975A (ja) 2022-05-11
JPWO2020198011A5 JPWO2020198011A5 (ja) 2023-03-23

Family

ID=70228886

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021552175A Pending JP2022524975A (ja) 2019-03-22 2020-03-20 複雑な生物学的マトリックスにおける試料間アナライト変動性の低減

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220178940A1 (ja)
EP (1) EP3942295A1 (ja)
JP (1) JP2022524975A (ja)
KR (1) KR20210142694A (ja)
CN (1) CN113508297A (ja)
AU (1) AU2020245346A1 (ja)
CA (1) CA3134336A1 (ja)
IL (1) IL286495A (ja)
SG (1) SG11202109160UA (ja)
WO (1) WO2020198011A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11728147B2 (en) * 2020-10-20 2023-08-15 Definitek, Inc. Quantification of previously undetectable quantities
CN112666356A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 国家纳米科学中心 一种检测痕量蛋白质的方法
CN116899626B (zh) * 2023-09-08 2023-12-26 北京青颜博识健康管理有限公司 一种点击化学反应的催化体系组合物及其制备方法和在生物检测中的应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1493825A3 (en) 1990-06-11 2005-02-09 Gilead Sciences, Inc. Method for producing nucleic acid ligands
US5719273A (en) 1993-06-14 1998-02-17 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Palladium catalyzed nucleoside modifications methods using nucleophiles and carbon monoxide
US5945527A (en) 1996-05-30 1999-08-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Palladium catalyzed nucleoside modification methods using nucleophiles and carbon monoxide
US6242246B1 (en) 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
US7855054B2 (en) 2007-01-16 2010-12-21 Somalogic, Inc. Multiplexed analyses of test samples
US7947447B2 (en) 2007-01-16 2011-05-24 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
WO2010118124A2 (en) * 2009-04-07 2010-10-14 Reveal Sciences, Llc Device, method, and apparatus for biological testing with a mobile device
JP6012591B2 (ja) 2010-04-12 2016-10-26 ソマロジック, インコーポレイテッドSomaLogic, Inc. β−ＮＧＦに対するアプタマー及びβ−ＮＧＦ介在疾患及び障害の治療におけるその使用

Also Published As

Publication number Publication date
US20220178940A1 (en) 2022-06-09
WO2020198011A1 (en) 2020-10-01
AU2020245346A1 (en) 2021-09-09
IL286495A (en) 2021-10-31
CN113508297A (zh) 2021-10-15
EP3942295A1 (en) 2022-01-26
KR20210142694A (ko) 2021-11-25
CA3134336A1 (en) 2020-10-01
SG11202109160UA (en) 2021-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chao et al. Biomarkers of nucleic acid oxidation–A summary state-of-the-art
Drabovich et al. Toward an integrated pipeline for protein biomarker development
KR101658347B1 (ko) 폐암 바이오마커 및 그것들의 용도
Lin et al. Ultra-sensitive digital quantification of proteins and mRNA in single cells
KR101857462B1 (ko) 췌장암 바이오마커 및 그것의 용도
EP3660512B1 (en) Nonalcoholic fatty liver disease (nafld) and nonalcoholic steatohepatitis (nash) biomarkers and uses thereof
JP2022524975A (ja) 複雑な生物学的マトリックスにおける試料間アナライト変動性の低減
CA2809282A1 (en) Mesothelioma biomarkers and uses thereof
WO2011043840A1 (en) Cancer biomarkers and uses thereof
WO2011031344A1 (en) Cancer biomarkers and uses thereof
CA2847188A1 (en) Non-small cell lung cancer biomarkers and uses thereof
EP3414575A1 (en) Nonalcoholic fatty liver disease (nafld) and nonalcoholic steatohepatitis (nash) biomarkers and uses thereof
US20130065782A1 (en) Renal Cell Carcinoma Biomarkers and Uses Thereof
US20220260585A1 (en) Controlling Intersample Analyte Variability in Complex Biological Matrices
US20240044902A1 (en) Methods for the detection and treatment of ovarian cancer
Sun et al. Promises and challenges of populational proteomics in health and disease
WO2015153860A1 (en) Glomerular filtration rate biomarkers and uses thereof
Meng et al. Mass spectrometry–based approach for protein biomarker verification
KR20240137560A (ko) 샘플 품질 평가 방법
Turan et al. Proteomic-based identification of novel biomarkers
WO2024015486A1 (en) Methods for sample quality assessment
WO2023211771A1 (en) Methods for sample quality assessment
CN118829884A (zh) 用于样品质量评估的方法
WO2023211773A1 (en) Methods for sample quality assessment
Hanash et al. Application of proteomics to disease diagnostics

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230313

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230313

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20231220

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240501

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240813