JP2022519829A - 組換え遺伝子発現を調節するための微小環境センサー - Google Patents

Abstract

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、インビボの微小環境内の細胞において、作動可能に連結された治療用ペイロードの特異的な転写を誘導することができる調節エレメントを含む導入遺伝子に関する。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、微小環境の内在性刺激に応答性を示す。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、細胞上のキメラ受容体からの刺激に応答性を示す。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年2月1日に出願された「組換え遺伝子発現を調節するための微小環境センサー」という名称の米国仮特許出願第62/800,049号の優先権を主張するものであり、この出願は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。

配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI207WOSEQLISTのファイル名で2020年1月21日に作成された約105kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、引用によりその全体が本明細書に援用される。

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、インビボの微小環境内の細胞において、作動可能に連結された治療用ペイロードの転写を誘導するように構成された調節エレメントを含む導入遺伝子に関する。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、微小環境により提示された内在性刺激に応答性を示す。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、細胞上のキメラ受容体からの刺激に応答性を示す。

患者の免疫系を調節することによる免疫療法は、転移性悪性黒色腫や大腸癌などの固形腫瘍および血液腫瘍において目覚ましい成功を収めている。このような成功とは対照的に、膠芽腫（GBM）などの固形腫瘍は免疫療法による効果が認められていない。この主な原因として、多くの固形腫瘍および固形腫瘍によって形成される微小環境は、免疫抑制性が強く、腫瘍促進性が高いことから、腫瘍増殖が促進され、細胞傷害性免疫細胞の局在化およびその機能が抑制されることがある。したがって、GBMやその他の固形腫瘍の免疫療法を成功させるための第一歩として、腫瘍微小環境（TME）によって引き起こされる影響と、形質転換細胞を排除する役割を果たす浸潤免疫細胞が受ける影響とを解消するアプローチが必要とされている。

例えば、小児白血病では、Ｔ細胞を用いた治療法に対して顕著な応答性が示されているが、固形腫瘍ではこれほどの治療成果は上げられていない。多くの固形腫瘍において免疫抑制性の微小環境は、腫瘍特異的抗原が存在しないことも相まって、CAR Ｔ細胞免疫療法を以てしてもこれまで克服できない障壁であった。小児がんの20％を占める脳腫瘍などの固形腫瘍は、骨髄系細胞が高度に浸潤するため、細胞傷害性機能に対する腫瘍の抵抗性が高い。したがって、GBMやその他の固形腫瘍の免疫療法を成功させるための第一歩として、腫瘍微小環境（TME）によって引き起こされる影響と、形質転換細胞を排除する役割を果たす浸潤免疫細胞が受ける影響とを解消するアプローチが強く必要とされている。

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、ポリヌクレオチドであって、インビボの微小環境内の細胞において治療用ペイロードの転写を誘導することができるか、またはそのような転写を誘導するように構成された調節エレメントを含む第１の核酸；および前記治療用ペイロードをコードする第２の核酸を含み、前記治療用ペイロードが、第１の核酸に作動可能に連結されていることを特徴とするポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、前記インビボの微小環境は、腫瘍微小環境および炎症性微小環境から選択される。

いくつかの実施形態において、前記微小環境内の刺激に応答した前記調節エレメントにより特異的な転写が誘導される。いくつかの実施形態において、前記刺激は、体循環と比較した場合の前記微小環境における、血管内皮成長因子（VEGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、腫瘍壊死因子（TNF）、IL-6、インターフェロン、C3bおよびマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）から選択されるタンパク質の量もしくは該タンパク質をコードする核酸の量の増加；または体循環と比較した場合の前記微小環境における酸素量の減少を含む。

いくつかの実施形態において、前記細胞上のキメラ受容体からの刺激に応答した前記調節エレメントにより特異的な転写が誘導される。いくつかの実施形態において、前記刺激は、リン酸化されたSykタンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、腫瘍微小環境内の細胞においてペイロードの特異的な転写の誘導が可能な、もしくはそのような転写を誘導するように構成されたプロモーター、エンハンサーまたはその機能性断片を含む。

いくつかの実施形態において、前記プロモーター、エンハンサーまたはその機能性断片は、APOE、C1QA、SPP1、RGS1、C3、HSPA1B、TREM2、A2M、DNAJB1、HSPB1、NR4A1、CCL4L2、SLC1A3、PLD4、HSPA1A、OLR1、BIN1、CCL4、GPR34、EGR1、HLA-DQA1、FCGR3A、VSIG4、LILRB4、CSF1R、HSPA6、TUBA1B、BHLHE41、GSN、JUN、CX3CR1、HLA-DQB1、HSPE1、FCGR1A、CCL3L1、OLFML3、ADAM28、YWHAH、GADD45B、SLCO2B1、HSP90AA1、HSPA8、RNASET2、HLA-DPA1、CDKN1A、CD83、HAVCR2、DDIT4、C3AR1、HSPD1、LGMN、TMIGD3、CD69、IFI44L、SERPINE1、HLA-DMA、ALOX5AP、EPB41L2、HSP90AB1、HSPH1、RHOB、CH25H、FRMD4A、CXCL16、FCGR1B、HLA-DMB、GPR183、HLA-DPB1、SLC2A5、EGR2、ID2、RGS10、APBB1IP、EVL、CSF2RA、SGK1、FSCN1、BEST1、ADORA3、IFNGR1、MARCKS、MT2A、SRGAP2、ARL5A、ADGRG1、HMOX1、RHBDF2、ATF3、SOCS6、NR4A3、PLK3、APMAP、AKR1B1、UBB、HERPUD1、CTSL、BTG2、IER5、LPAR6、USP53、ST6GAL1、ADAP2、HTRA1、KCNMB1、DNAJA1、LPCAT2、ZFP36L1、CCL3、BAG3、TMEM119、LTC4S、EGR3、FCGBP、ABI3、IFNγ、TNFα、IFNα、IL-6もしくはIL-12に由来するものであるか、またはこれらから選択されたものである。

いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、低酸素応答エレメント（HRE）、SRC結合エレメント、SMAD 2応答エレメント、SMAD 3応答エレメント、ATF結合部位、STAT 2結合部位、CBP結合部位およびSYK結合エレメントから選択されるエレメントを含む。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントはHREを含む。

いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、サイトカインをコードする。

いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、インターフェロンをコードする。いくつかの実施形態において、前記インターフェロンは、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγから選択される。

いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、腫瘍壊死因子（TNF）をコードする。いくつかの実施形態において、前記TNFは、TNF-α、TNF-β、TNF-γ、CD252、CD154、CD178、CD70、CD153および4-1BBLから選択される。

いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、インターロイキンをコードする。いくつかの実施形態において、前記インターロイキンは、IL-10、IL-12、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-18およびIL-21から選択される。

いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、ケモカインをコードする。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13およびCXCL15から選択される。

いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、構成的プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、MiniTKプロモーターおよびEF1αプロモーターから選択される。

いくつかの実施形態は、ベクターを含む第３の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、ウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターを含む。

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記ポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞を含む。いくつかの実施形態は、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記細胞外結合ドメイン、前記膜貫通ドメインまたは前記細胞内シグナル伝達ドメインは、LILRB受容体、CD115受容体、M-CSF受容体；CXCR4；ニューロピリン（NRP2）；上皮成長因子受容体；血管内皮成長因子２型受容体；トランスフォーミング成長因子β ２型受容体；腫瘍壊死因子α受容体；インターロイキン６受容体；インターフェロンγ ２型受容体；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体αサブユニット；Toll様受容体４；TGFb、GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-1β、IL-13、IL-10、IFN-α、IFN-βまたはIFN-γの受容体を含むサイトカイン受容体；CCR1～10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5およびCXCR6を含むケモカイン受容体；PDGF、VEGFまたはEGFの受容体を含む成長因子受容体；LPS受容体；LDH受容体；MDH受容体；CpG受容体；ssRNA受容体；ならびに葉酸受容体から選択される受容体に由来するものである。いくつかの実施形態において、前記細胞外ドメインは、LILRBおよびCD115から選択されるタンパク質の細胞外ドメインに由来するものである。

いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、CH3ドメインに連結されたCH2ドメインに連結されたIgG4ヒンジ、CH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジ、およびIgG4ヒンジドメインから選択されるタンパク質の膜貫通ドメインに由来するものである。

いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζおよび41BBから選択されるタンパク質の細胞内ドメインに由来するものである。

いくつかの実施形態において、前記細胞は免疫細胞である。

いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、好塩基球、好中球、好酸球および単球から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、GM-CSFおよび／またはM-CSFに単球を接触させることにより作製されたマクロファージである。

いくつかの実施形態において、前記細胞は、リンパ系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞から選択される。

いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。

いくつかの実施形態において、前記細胞は、エクスビボの細胞である。

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、対象において障害を治療、抑制または緩和する方法であって、前記細胞のいずれかを対象に投与することを含む方法を含む。したがって、医薬品としての、前記組成物のいずれかの使用が想定されている。

いくつかの実施形態において、前記障害は、がんおよび炎症性障害から選択される。したがって、がんまたは炎症性疾患の治療用の、本明細書に記載のいずれかの組成物も想定されている。

いくつかの実施形態において、前記障害は、がんである。いくつかの実施形態において、前記がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、前記がんは、乳がん、脳腫瘍、肺がん、肝臓がん、胃がん、脾臓がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、肉腫、神経芽腫、前立腺がんおよび卵巣がんから選択される。いくつかの実施形態において、前記がんは、膠芽腫である。

いくつかの実施形態において、前記障害は、炎症性障害または炎症性疾患である。いくつかの実施形態において、前記炎症性障害または炎症性疾患は、尋常性ざ瘡、喘息、特定の自己免疫疾患、特定の自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、大腸炎、憩室炎、糸球体腎炎、化膿性汗腺炎、特定の過敏症、特定の炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、扁平苔癬、マスト細胞活性化症候群、マスト細胞症、耳炎、骨盤炎症性疾患、再灌流障害、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、移植拒絶反応、血管炎、急性細菌性感染症、慢性細菌性感染症、移植後関連炎症および移植後関連炎症抑制から選択される。

いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記対象はヒトである。

（A）切断型CD19（CD19t）をコードするCD19tコンストラクト；（B）eF1aプロモーターとGFP／ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含むEF1コンストラクト；（C）最小チミジンキナーゼプロモーターとGFP／ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含むminiTKコンストラクト；および（D）連続する３つの低酸素応答エレメント（HRE）と、最小チミジンキナーゼプロモーターと、GFP／ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含むHRE miniTKコンストラクト（HRE_MiniTK eGFP:ffluc -t2a-CD19t）を示す。

低酸素応答エレメントとルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含む導入遺伝子を形質導入した293T細胞またはRaji細胞を低酸素チャンバーで20時間インキュベートした際の発光量を示したグラフである。コントロールとして、形質導入した細胞を通常の酸素濃度（正常酸素状態）でインキュベートした。

導入遺伝子を形質導入した293T細胞またはRaji細胞を低酸素チャンバーで20時間インキュベートした際の発光量のばらつきの程度を示したグラフである。コントロールとして、形質導入した細胞を通常の酸素濃度（正常酸素状態）でインキュベートした。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーで24時間インキュベートした際の発光量を示したグラフである。コントロールとして、形質導入した細胞を通常の酸素濃度（正常酸素状態）でインキュベートした。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーで24時間インキュベートした際の相対発光量を示したグラフである。コントロールとして、形質導入した細胞を通常の酸素濃度（正常酸素状態）でインキュベートした。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーでインキュベートする前に当該マクロファージから調製したタンパク質抽出物のウエスタンブロットを示したものである。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーでインキュベートする前のルシフェラーゼタンパク質の相対発現量を示したグラフである。

低酸素チャンバーから取り出した後の293T細胞における相対発光量を示したグラフである。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーから取り出してから2日後までのルシフェラーゼ遺伝子の相対発現量を示したグラフである。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーから取り出してから5日後までのルシフェラーゼ遺伝子の相対発現量を示したグラフである。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーから取り出してから5日後までのルシフェラーゼ遺伝子の相対発現量を示したグラフである。各時点において、1列目、2列目および3列目は、それぞれEF1aコンストラクト、miniTKコンストラクト、またはHRE-miniTKコンストラクトを形質導入した細胞における倍率変化を示している。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーから取り出してから3日後までのルシフェラーゼタンパク質の相対発現量を示したグラフである。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーから取り出してから5日後までのルシフェラーゼタンパク質の相対発現量を示したグラフである。各時点において、1列目および2列目は、それぞれminiTKコンストラクトまたはHRE-miniTKコンストラクトを形質導入した細胞におけるルシフェラーゼの相対発現量を示している。

対象に1×10⁶個のU87細胞を0日目に全身注射し、11日目に、低酸素応答エレメントとルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含む試験導入遺伝子またはコントロール導入遺伝子を含む1×10⁶個の遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を全身注射することを示した概略図である（左図）。右図は、試験導入遺伝子またはコントロール導入遺伝子を投与した対象における、投与後1日目、6日目および8日目の発光の検出を示した図である。

HRE MiniTK eGFP:ffluc-t2a-CD19tを含むコンストラクトまたはCD19tを含むコンストラクトを形質導入したGEMからの平均放射輝度を示したグラフである。

CD19tコンストラクト（左図）またはHRE MiniTK eGFP:ffluc-t2a-CD19tコンストラクト（右図）を含むGEMを注射した、U87細胞由来膠芽腫腫瘍を有するマウスのルシフェラーゼの発現量および発現位置を示した写真である。

HRE MiniTK eGFP:ffluc-t2a-CD19tコンストラクトを含むGEMを注射した、側腹部にU87細胞由来膠芽腫腫瘍を有するマウスのルシフェラーゼの発現量および発現位置を示した一連の写真である。

HRE MiniTK eGFP:ffluc-t2a-CD19tコンストラクトを含むGEM（投与量：2.5×10⁶個または5×10⁶個）またはPBSを注射した、頭蓋内にU87細胞由来膠芽腫腫瘍を有するマウスのルシフェラーゼの発現量および発現位置を示した一連の写真である。

各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーから取り出してから5日後までの培養上清中のIL-12のインビトロ濃度を示したグラフである。

（A）eF1aプロモーター（EF1a）を含み、切断型CD19（CD19t）およびヒトインターロイキン12のp40サブユニットとp35サブユニット（hIL21p40p35）をコードするEF1aコンストラクト；（B）最小チミジンキナーゼプロモーター（miniTK）を含み、CD19tおよびhIL21p40p35をコードするminiTKコンストラクト；（C）連続する３つの低酸素応答エレメント（HRE）とminiTKプロモーターとを含み、CD19tおよびhIL21p40p35をコードするHRE miniTKコンストラクト；（D）EF1aプロモーターを含み、GFP／ルシフェラーゼレポーター（eGFP:ffluc）およびhIL21p40p35をコードするEF1a GFP-ルシフェラーゼコンストラクト；（E）miniTKプロモーターを含み、eGFP:fflucおよびhIL21p40p35をコードするminiTK GFP-ルシフェラーゼコンストラクト；ならびに（F）連続する３つのHREとminiTKプロモーターとを含み、eGFP:fflucおよびhIL21p40p35をコードするHRE miniTK GFP-ルシフェラーゼコンストラクトを示す。

コンストラクトA、コンストラクトBまたはコンストラクトCを含むレンチウイルスベクターを形質導入した初代ヒトマクロファージの培養上清中のIL-12のインビトロ濃度を21日間にわたって測定した結果を示したグラフである。各時点において、1列目、2列目および3列目は、それぞれコンストラクトA、コンストラクトBまたはコンストラクトCを形質導入した細胞におけるIL-21の濃度を示している。

形質導入した細胞を低酸素条件または正常酸素条件に晒した後、GFPの発現量に応じて選別したフローサイトメトリー実験の結果である。左側の上段および下段は、ポジティブコントロールのEF1aを形質導入した細胞を選別したものである。中央の上段および下段は、ネガティブコントロールのminiTKを形質導入した細胞を選別したものである。右側の上段および下段は、HRE-miniTKを形質導入した細胞を選別したものである。

EFL1aコンストラクト、miniTKコンストラクトまたはHRE-miniTKコンストラクトを含むGEMとともに低酸素条件で培養した大腸がん切片におけるGFP+EPCAM+細胞の割合を調べるため、GFPの相対発現量を示したグラフである。

腫瘍細胞により発現されたM-CSFが、マクロファージの表面に発現されたキメラ受容体に結合するシステムの一実施形態を示した概略図である。このキメラ受容体は、CD115ドメイン、膜貫通リンカー、およびTLRの細胞質内ドメインを含む。M-CSFがCD115ドメインに結合すると、TLR4ドメインから細胞内シグナル伝達が誘導され、IL-12、IL-1、IL-6、TNF、ROSなどの内在性遺伝子の発現が活性化される。

腫瘍細胞により発現されたMHC Iが、マクロファージの表面に発現されたキメラ受容体に結合するシステムの一実施形態を示した概略図である。このキメラ受容体は、LILRBドメイン、膜貫通リンカー、およびCD3ζ／41BB細胞質内ドメインを含む。MHC I分子がLILRBドメインに結合すると、CD3ζ／41BBドメインから細胞内シグナル伝達が誘導され、これによりSYKタンパク質のリン酸化が誘導され、その結果、レンチウイルスベクター骨格（epHIV7.2）と、リン酸化SYK結合エレメント（pSyk）と、ペイロード（IL-12など）とを含む導入遺伝子からの遺伝子発現が活性化される。

キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドの一例を含むベクターのマップである。

リン酸化Sykに応答する調節エレメントを含む導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドの一例を含むベクターのマップである。

コントロールとしてのCD19t導入遺伝子（左図）またはLILRB1キメラ受容体をコードする試験導入遺伝子（右図）を含む遺伝子組換え初代ヒトマクロファージ（GEM）においてリン酸化syk（矢印）を染色した顕微鏡写真である。

コントロールとしてのCD19t導入遺伝子（左図）またはLILRB1キメラ受容体をコードする試験導入遺伝子（右図）を含む遺伝子組換え初代ヒトマクロファージ（GEM）においてCFSE標識自己Ｔ細胞（十字線の中心）を染色した顕微鏡写真である。

MCSF受容体の細胞外ドメイン（MCSF-R ECD）、ヒンジドメイン、CD28の膜貫通ドメイン（CD28TM）、TLR4の細胞内ドメイン（TLR4.ISD）、T2Aリボソームスキップ配列および切断型CD19マーカードメイン（CD19t）を含むキメラ受容体の一実施形態を示したものである。

インビトロにおいて、キメラ受容体（CR-1もしくはCR-2）を含む細胞またはキメラ受容体を含まない細胞（UT）をM-CSFまたはLPS／IFN-γで刺激した際に、各細胞から分泌されたTNF-αの濃度またはIL-12の濃度を示したグラフである。

MCSF受容体の細胞外ドメインに加えて、ヒンジドメイン、CD28の膜貫通ドメイン、およびTLR4の細胞内ドメインで構成されるMCSFR.TLR4を含み、さらにレポータールシフェラーゼ遺伝子、T2Aリボソームスキップ配列および切断型CD19マーカードメイン（CD19t）を含むキメラ受容体の一実施形態を示したものである。

U87細胞の投与により作製した異種移植マウスモデルに、図23Aに示したキメラ受容体またはCD19tコントロールを含む遺伝子組換えマクロファージを投与して撮影した写真である。

遺伝子発現の差異を判定するためのプロトコルの一例を示したものである。

２種のシングルセル解析アルゴリズム（nGeneおよびnUMI）を用いた10x Genomics社によるシングルセルmRNAシーケンス解析により細胞ごとにmRNAの発現を検出し、ヒトゲノムの既知の翻訳配列にマッピングしたmRNAの数を示したものである。各点は、単球を代表的な解析に供した際の個々の細胞を表す。

10x Genomics社のプロトコルにより単一細胞への分離およびライブラリーの作製を行い、骨髄系細胞を磁気選択する前（左）および磁気選択した後（右）のscRNAseq試料中の各免疫細胞の割合を示したものである。免疫細胞は、各免疫細胞の既知の遺伝子シグネチャーによって定義した。CD14選択を行うことにより、単球とマクロファージの割合が著しく増加する。

770個の遺伝子で構成される骨髄系細胞用パネルを用いて行ったNanoString社の発現解析の結果をヒートマップで示したものである。レーン１：低グレード；レーン２：膠芽腫（GBM）；レーン３：低グレ―ドの神経膠腫患者の単球；レーン４：GBM患者の単球；レーン５：インビトロで培養したGM-CSF誘導マクロファージ；レーン６：インビトロで培養したM-CSF誘導マクロファージ。

神経膠腫患者における特定の遺伝子の相対発現量を生存期間に対してプロットしたグラフである。

卵巣がん患者における特定の遺伝子の相対発現量を再発までの期間に対してプロットしたグラフである。

卵巣がん患者における特定の遺伝子の相対発現量を生存期間に対してプロットしたグラフである。

患者の単球および同じ患者の腫瘍関連マクロファージ（TAM）の主成分分析を示したグラフである。

循環単球（mono）および腫瘍関連マクロファージ（TAM）における、C1QA遺伝子、C1QB遺伝子、C1QC遺伝子、C3遺伝子、CSF1R遺伝子、CCL2遺伝子、RGS1遺伝子、DNAJB1遺伝子、HSPA6遺伝子、SPP1遺伝子、TREM2遺伝子、TUBA1B遺伝子、DNASE2遺伝子およびAPOE遺伝子の相対発現量を示したグラフである。

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、インビボの微小環境内の細胞において、作動可能に連結された治療用ペイロードの特異的な転写の誘導が可能な、またはそのような転写を誘導するように構成された調節エレメントを含む導入遺伝子に関する。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、微小環境により提示された内在性刺激に応答性を示す。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、細胞上のキメラ受容体からの刺激に応答性を示す。いくつかの実施形態において、微小環境として、腫瘍微小環境（TME）および／または炎症性微小環境が挙げられる。

いくつかの実施形態は、作動可能に連結された治療用ペイロードの特異的な転写の誘導が可能な、もしくはそのような転写を誘導するように構成された調節エレメントを含むポリヌクレオチド、および／またはそのようなポリヌクレオチドを含む細胞を含む。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記調節エレメントは、刺激に応答して特異的な転写を誘導する。いくつかの実施形態において、前記刺激は、微小環境に関連したシグナルを含む。いくつかの実施形態において、前記シグナルは、微小環境に関連しており、生物体内のその他のコンパートメント（その他の細胞集団および／または組織など）と比較した場合の特定のシグナル伝達分子の量の増加または減少を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記シグナルは、生物体内のその他のコンパートメント（その他の細胞集団および／または組織の周辺など）と比較した場合の酸素量の減少（微小環境で見られる低酸素状態など）を含んでいてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記細胞はマクロファージである。図１に、前記ポリヌクレオチドの一例を示しているが、これには、コンストラクトDも含まれている。

いくつかの実施形態において、前記刺激は、前記ポリヌクレオチドを含む細胞上のキメラ受容体の活性化により提供される。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ受容体は、微小環境からのシグナルによって活性化され、このようなシグナルとしては、例えば、生物体内のその他のコンパートメント（その他の細胞集団および／もしくは組織など）と比較した場合の特定のシグナル伝達分子の量の増加もしくは減少；および／または特定の活性化免疫細胞の存在が挙げられる。図1Cに、代表的なキメラ受容体および細胞において誘導可能なポリヌクレオチドを示す。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記細胞はマクロファージである。

いくつかの実施形態において、細胞は、キメラ受容体を含んでいてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、細胞上のキメラ受容体が活性化されることによって、該細胞に内在する遺伝子の特異的な転写が誘導される。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ受容体は、微小環境内のシグナルによって活性化され、このようなシグナルとしては、例えば、生物体内のその他のコンパートメント（その他の細胞集団および／もしくは組織など）と比較した場合の特定のシグナル伝達分子の量の増加もしくは減少；および／または特定の活性化免疫細胞の存在が挙げられる。図17Aに、細胞上のキメラ受容体の一例を示す。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記細胞はマクロファージである。

米国特許公開第2017/0087185号（この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）に開示されている特定の方法および組成物は、本明細書で提供する方法および組成物に有用に使用できる。

本明細書で提供する実施形態のいくつかは、摘出不可能な部位に発生した多発性かつ／または転移性の疾患を有する対象の免疫細胞療法に関する。そのような実施形態のいくつかにおいて、治療用遺伝子をコードするレンチウイルスベクターが全身投与され、前記対象の微小環境（腫瘍微小環境（TME）など）に特異的に、このベクターから治療用遺伝子が発現される。

したがって、本明細書で提供する方法および組み合わせに関する実施形態のいくつかを併用してこのような治療法を行うことによって、これまでに特定の細胞療法では適切な治療が行えなかった対象群でも適切な治療を実施できる可能性がある。例えば、キメラ抗原受容体（CAR）Ｔ細胞療法を受ける対象は、正常組織と標的となる腫瘍組織の両方で標的抗原を発現している場合がある。このような対象にCAR Ｔ細胞療法を投与すると、有害な副作用が起こる可能性がある。いくつかの実施形態において、CAR Ｔ細胞療法は、本明細書で提供する特定の方法および組成物を併用することによって、微小環境（腫瘍微小環境（TME）など）を標的とすることができる。

本明細書で提供する実施形態のいくつかは、インビトロまたはインビボにおいて、腫瘍組織でしか見られない微小環境刺激に応答して遺伝子発現を活性化するTME検知プロモーターコンストラクトとTME誘導型キメラ受容体とを含む。レンチウイルスによる遺伝子発現は、TMEを模倣したインビトロ条件の解除後に2～5日間のオフ速度を示したことから、腫瘍負荷が減少すると、レンチウイルスにコードされた治療用ペイロードの発現が停止することが示された。

いくつかの実施形態において、TME検知プロモーターコンストラクトおよび／またはTME誘導型キメラ受容体は、遺伝子発現を調節し、かつ／または腫瘍への免疫細胞のトラフィッキングを改善することにより腫瘍微小環境（TME）を操作する。いくつかの実施形態において、TME検知プロモーターコンストラクトおよび／またはTME誘導型キメラ受容体によって、TMEのパラメータまたはTME領域が定義され、例えば、急速に腫瘍細胞が増殖する領域、低酸素領域または血管周囲領域が定義される。いくつかの実施形態において、定義されたTMEのパラメータまたはTME領域を利用することにより、レンチウイルスにコードされた治療用ペイロードが正確に送達される。そのような実施形態のいくつかでは、通常は免疫細胞がその機能（細胞傷害性リンパ球の機能など）を発揮することができないTME内において、治療用ペイロードにより免疫細胞が活性化され、かつ／または免疫細胞の機能が向上する。

マクロファージは、養子免疫系と自然免疫系のクロストークにおいて中心的な役割を果たし、効率的に腫瘍に動員されて腫瘍内に保持され、炎症促進性の表現型に分極化した後でもTME内で生存を維持することから、TMEなどの微小環境を標的とする治療用細胞として理想的である（Long KB, Beatty GL. Harnessing the antitumor potential of macrophages for cancer immunotherapy. Oncoimmunology 2013;2:e26860; Peng J, Tsang JY, Li D et al. Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages. Cancer Lett 2013;331:239-249; Beatty GL, Chiorean EG, Fishman MP et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science 2011;331:1612-1616; Pyonteck SM, Akkari L, Schuhmacher AJ et al. CSF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma progression. Nat Med 2013;19:1264-1272；これらの文献はいずれも引用によりその全体が明示的に援用される）。さらに、組換えマクロファージは、治療用Ｔ細胞受容体（TCR）やキメラ抗原受容体（CAR）Ｔ細胞の製造過程で廃棄される対象由来単球集団から製造することができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかは、治療を目的とした組換え初代マクロファージの使用、例えば、HIV1系レンチウイルス（ただしこれに限定されない）などのベクターで遺伝子操作されたマクロファージの使用を含む。マクロファージは、逆転写反応に利用されるヌクレオチド三リン酸プールを減少させる制限因子SAMHD1を発現することから、通常、レンチウイルスで形質導入することができない（Lahouassa H, Daddacha W, Hofmann H et al. SAMHD1 restricts the replication of human immunodeficiency virus type 1 by depleting the intracellular pool of deoxynucleoside triphosphates. Nat Immunol 2012;13:223-228；この文献は引用によりその全体が明示的に援用される）。しかしながら、最近になって、SAMHD1の分解を誘導するSIV／HIV2関連ウイルスタンパク質X（Vpx）を含むビリオンを産生可能なレンチウイルスパッケージングシステムが開発されたことから、初代ヒト骨髄系細胞に安定して遺伝子を送達することが可能となった（Bobadilla S, Sunseri N, Landau NR. Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral vector that packages the Vpx accessory protein. Gene Ther 2013;20:514-520；この文献は引用によりその全体が明示的に援用される）。

用語の定義
本明細書において、「微小環境」は、腫瘍細胞や炎症反応と関連する細胞などの細胞集団の局所的な細胞環境を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、微小環境は、インビボの局所的な細胞環境を含んでいてもよい。微小環境は、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症性細胞、リンパ球、シグナル伝達分子または細胞外マトリックス（ECM）を含んでいてもよい。微小環境内の状態は、そこに局在する細胞によって特徴付けられてもよく、例えば、ある生物の体循環またはその他のコンパートメントと比較した場合の細胞間シグナル伝達分子の量の増加または減少により特徴付けることができる。微小環境の一例として、腫瘍微小環境（TME）が挙げられる。

本明細書において、「腫瘍微小環境（TME）」には、腫瘍細胞と常に相互作用している周辺微小環境が含まれていてもよく、この周辺微小環境により腫瘍細胞とその周辺環境のクロストークが可能となる。TMEはがん免疫サイクルを破壊するという役割を果たし、がんの進行の様々な局面において重要な役割を果たす。例えば、TMEは、薬物の移行を低下させることができ、生存細胞に増殖性およびアポトーシス耐性を付与することができ、遺伝的変異やエピジェネティックな変化を起こすことなく抵抗性を助長することができ、このような機能によって疾患の様相を変え、臨床指標を悪化させる。TMEには、腫瘍内細胞環境、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症性細胞、リンパ球、シグナル伝達分子または細胞外マトリックスが含まれうるが、腫瘍微小環境に含まれるものはこれらに限定されない。さらに、腫瘍環境には、腫瘍細胞または悪性細胞が含まれていてもよく、これらの腫瘍細胞または悪性細胞は、TMEの支持および影響を受け、それにより増殖と生存が維持される。また、TMEは、リンパ球様細胞や骨髄系細胞などの腫瘍浸潤免疫細胞を含んでいることがあり、これらの腫瘍浸潤免疫細胞は、抗腫瘍免疫応答を刺激したり抑制したりすることができる。さらに、腫瘍微小環境には間質細胞が含まれていることもあり、これには、腫瘍の構造の統合性を担う腫瘍関連線維芽細胞や内皮細胞などが含まれる。間質細胞としては、さらに、組織構造の統合性を担う内皮細胞や周皮細胞（線維芽細胞）などの腫瘍関連血管を構成する細胞；腫瘍関連マクロファージ（TAM）；ならびに単球、好中球（PMN）、樹状細胞（DC）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞および／またはナチュラルキラー（NK）細胞などの浸潤免疫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。間質細胞が、腫瘍を構成する細胞の大部分を占めるのに対し、固形腫瘍を支配している細胞種は、腫瘍関連マクロファージである。さらに、TMEは小さなニッチを含みうる。ニッチは、血流も酸素も多く存在する場合と、血流が少なく低酸素状態である場合とがある。ニッチの血流が少なく低酸素状態である場合、低栄養・低酸素環境で生存可能な抵抗性腫瘍細胞がニッチ内で維持されることがあるため、宿主にとって特に危険な状態となる。腫瘍は、細胞外シグナルの放出、VEGFのアップレギュレーションなどによる腫瘍血管新生の促進、および末梢免疫寛容の誘導によって、腫瘍の周辺環境を免疫抑制性に変化させることができる。

本明細書において、「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドを指してもよく、例えば、デオキシリボ核酸（DNA）もしくはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られた断片、またはライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用もしくはエキソヌクレアーゼ作用により得られた断片などが挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNAやRNAなど）、または天然のヌクレオチドの類似体（例えば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、例えば、アザ糖または炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。

本明細書において、「ベクター」または「コンストラクト」は、細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸であって、様々な調節エレメントを含むことができることから、細胞において異種核酸を発現させることができる核酸を含んでいてもよい。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル、酵母、およびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、DNAまたはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。本明細書において、「Vpx」は、HIV2型およびいくつかのサル免疫不全ウイルス株にコードされているビリオン関連タンパク質を含んでいてもよい。Vpxは、ヒトにおいてHIV-2の複製を増強することができる。Vpxタンパク質とともにパッケージングされたレンチウイルスベクターをトランスフェクションに使用すると、骨髄系細胞の感染率を上昇させることができる。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。本明細書において、「Vpr」タンパク質はViral Protein Rを指してもよい。Vprは14kDaのタンパク質であり、HIV-1の組込み前複合体の核移行の制御において重要な役割を果たしており、非分裂細胞におけるウイルス複製に必要とされる。非分裂細胞としては、例えば、マクロファージが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターは、Vprタンパク質またはその一部とともにパッケージングすることができる。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターは、ウイルスのアクセサリータンパク質とともにパッケージングされる。いくつかの実施形態において、前記ウイルスアクセサリータンパク質は、Vif、Vpx、Vpu、NefおよびVprからなる群から選択される。このようなvif、Vpx、vpu、nefなどのアクセサリータンパク質は、細胞内リガンドと相互作用してアダプター分子として機能し、宿主因子の正常な機能をウイルス自身の目的のために利用することを可能にする。HIVアクセサリータンパク質はStrebelらよって報告されている（HIV Accessory Proteins versus Host Restriction Factors, Curr Opin Virol. 2013 Dec; 3(6): 10.1016/j.coviro.2013.08.004；この文献は引用によりその全体が明示的に援用される）。

本明細書において、「形質導入」および「トランスフェクション」という用語は同じ意味で使用され、ウイルスを使用した方法やウイルスを使用しない方法などの何らかの人工的な方法によって、細胞に核酸を導入することを意味する。

本明細書において、「キメラ受容体」は、前記疾患または障害に関連する分子と結合する抗体配列やその他のタンパク質配列のリガンド結合ドメインを含む合成設計された受容体を含んでいてもよく、このリガンド結合ドメインは、スペーサードメインを介して、Ｔ細胞受容体またはその他の受容体に由来する１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば共刺激ドメイン）に連結されている。キメラ受容体は、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、およびキメラ抗原受容体（CAR）とも呼ぶことができる。レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターなどのベクターを使用してキメラ受容体のコード配列をＴ細胞に導入することによって、モノクローナル抗体またはその結合断片の特異性をＴ細胞に移植することができる。CARは、特定の細胞表面抗原を発現する標的細胞への標的指向性をＴ細胞に付与するために設計された遺伝子組換えＴ細胞受容体である。養子細胞移入と呼ばれる方法によって、まず対象からＴ細胞を得た後、抗原に対して特異性を発揮することができる受容体を発現できるようにＴ細胞を遺伝子操作する。次いで、このＴ細胞を患者に再導入する。導入されたＴ細胞は抗原を認識し、これを標的とすることができる。このようなCARは、免疫受容体を発現する細胞に任意の特異性を移植することができる遺伝子組換え受容体である。研究者によっては、キメラ受容体（CAR）は、抗体または抗体断片、スペーサー、シグナル伝達ドメインおよび膜貫通領域を含むものであると理解されている。本明細書に記載のCARは、様々な構成要素すなわちドメイン（例えば、エピトープ結合領域（例えば、抗体断片、scFvまたはそれらの一部）、スペーサー、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインなど）を有することから、各構成要素に注目した場合、本明細書を通してCARの構成要素はそれぞれ別個のものとして明確に区別できることが多い。CARに含まれる様々な構成要素は様々なバリエーションを有することから、例えば、特定のエピトープや抗原に対する結合親和性が増強されていることがある。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCARはT2A切断配列を含む。切断配列の一例として、配列番号51が挙げられる。

本明細書において、「調節エレメント」は、調節配列を含んでいてもよく、調節配列とは、プロモーター、エンハンサー、オペレーターなどの、遺伝子発現の調節を担う何らかのDNA配列である。調節エレメントは、生物体内において特定の遺伝子の発現を増加もしくは低減させることが可能な核酸分子のセグメントであってもよく、生物体内において特定の遺伝子の発現を増加もしくは低減するように構成された核酸分子のセグメントであってもよい。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、タンパク質は調節エレメントによって制御される。

本明細書において、「プロモーター」は、遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは遺伝子の５’末端の非コード領域に存在し、構造遺伝子の転写開始点の近傍に位置する。転写を開始させるプロモーター配列のエレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられることが多い。プロモーター配列のエレメントとしては、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント（DSE；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)；引用によりその全体が明示的に本明細書に援用される）、環状AMP応答エレメント（CRE）、血清応答エレメント（SRE；Treisman et al., Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)；引用によりその全体が明示的に援用される）、グルココルチコイド応答エレメント（GRE）、およびその他の転写因子結合部位が挙げられ、例えば、CRE/ATF（O’Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)；引用によりその全体が明示的に援用される）、AP2（Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)；引用によりその全体が明示的に援用される）、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB；Loeken et al., Gene Expr. 3:253 (1993)； 引用によりその全体が明示的に援用される）、および８量体因子（概要は、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed.（The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987；引用によりその全体が明示的に援用される）およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)（引用によりその全体が明示的に援用される）を参照されたい）を挙げることができるが、これらに限定されない。本明細書において、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、抑制可能なプロモーター、誘導型プロモーターのいずれであってもよい。プロモーターが誘導型プロモーターである場合、転写率は誘導剤に応答して上昇する。これに対して、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写率は誘導剤による調節を受けない。抑制可能なプロモーターも公知である。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、Ｔ細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはＴ細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は、調節エレメントによって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、本発明で使用されるプロモーターは、誘導型プロモーターであってもよく、構成的プロモーターであってもよい。誘導型プロモーターとしては、例えば、タモキシフェン誘導型プロモーター、テトラサイクリン誘導型プロモーター、およびドキシサイクリン誘導型プロモーター（例えば、treプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。構成的プロモーターとしては、例えば、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGKおよびCAGGを挙げることができる。

本明細書において、「作動可能に連結された」とは、一方の核酸がもう一方の核酸の機能に影響を与えるように、２つの核酸が連結されていることを指してもよい。作動可能に連結された核酸は、連続した単一分子の一部を構成していてもよく、互いに隣接していてもよく、互いに隣接していなくてもよい。例えば、ポリヌクレオチドにおいて、タンパク質をコードする核酸にプロモーターが作動可能に連結されており、これら２つの核酸は、このプロモーターが、導入遺伝子の発現に影響を与えたり、導入遺伝子の発現を制御するように構成されている。いくつかの実施形態において、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの調節エレメントは、治療用ペイロードをコードする核酸に作動可能に連結することができる。

本明細書において、「免疫細胞」は、感染性疾患からの防御やがん細胞からの防御に関与する免疫系細胞を指してもよい。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、Ｔ細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはＴ細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。

がんは、制御不能な細胞増殖や調節異常を起こした細胞増殖を伴う。がんは、異常な細胞増殖を有する悪性腫瘍や悪性新生物として認められることがあり、このような悪性腫瘍や悪性新生物は、生体内のその他の部分に浸潤して広がることがある。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象（例えばヒト）において、腫瘍微小環境（TME）における免疫応答の抑制を調節する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞のいずれかを前記対象（例えばヒト）に投与すること、ならびに任意で前記遺伝子組換え免疫細胞の投与を受ける対象を選択または特定すること、および／または任意で前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象の腫瘍微小環境（TME）における免疫応答の抑制の調節を測定することを含む方法が提供される。本明細書に記載の方法を用いて処置することができる対象としては、がんを有するとして特定または選択された対象が挙げられ、該がんとしては、大腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん（悪性黒色腫を含む）、骨がん、白血病、多発性骨髄腫、脳腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。がん患者の特定および／または選択は、臨床的評価または診断的評価によって行うことができる。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原または腫瘍関連分子が知られており、該腫瘍としては、悪性黒色腫、乳がん、脳腫瘍、扁平上皮腫、大腸がん、白血病、骨髄腫、前立腺がんなどが挙げられる。前記腫瘍としては、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、脳腫瘍、前立腺がん、および／または白血病が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、１つ以上の腫瘍形成性ポリペプチドが、腎臓がん、子宮がん、大腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん（悪性黒色腫を含む）、骨がん、脳腫瘍、腺癌、膵臓がん、慢性骨髄性白血病または白血病に関連している。いくつかの実施形態において、対象においてがんを治療、緩和または抑制する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記がんは、乳がん、卵巣がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、悪性黒色腫、腎臓がん、膵臓がん、膠芽腫、神経芽腫、髄芽腫、肉腫、肝臓がん、大腸がん、皮膚がん（悪性黒色腫を含む）、骨がんまたは脳腫瘍である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のいずれかの治療法を受ける対象は、さらに、別のがん療法を実施するために選択され、この別のがん療法として、がん治療薬、放射線療法、化学療法またはがん療法薬が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記対象に提供されるがん療法薬として、アビラテロン、アレムツズマブ、アナストロゾール、アプレピタント、三酸化ヒ素、アテゾリズマブ、アザシチジン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カバジタキセル、カペシタビン、カルボプラチン、セツキシマブ、化学療法薬の組み合わせ、シスプラチン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、デノスマブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エリブリン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、イマチニブ、イミキモド、イピリムマブ、イクサベピロン、ラパチニブ、レナリドミド、レトロゾール、ロイプロリド、メスナ、メトトレキサート、ニボルマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パロノセトロン、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、プレドニゾン、ラジウム223、リツキシマブ、Sipuleucel-T、ソラフェニブ、スニチニブ、タルク胸膜腔内注入用懸濁剤、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、トラスツズマブ、ビノレルビンまたはゾレドロン酸が挙げられる。

本明細書において、「ナチュラルキラー細胞」すなわちNK細胞は、自然免疫系において重要な機能を果たす細胞傷害性リンパ球の一種である。NK細胞は、脊椎動物の適応免疫応答において細胞傷害性Ｔ細胞とよく似た役割を果たしている。また、NK細胞は、ウイルス感染細胞に素早く応答し、腫瘍形成にも応答性を示す。さらに、NK細胞は、免疫監視として知られているプロセスによって新たな腫瘍増殖を阻止するという重要な機能を発揮する（Dunn et al., Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3, 991-998 (2002); Langers et al., Natural killer cells: role in local tumor growth and metastasis. Biologics: targets & therapy 6, 73-82 (2012)；これらの文献はいずれも引用によりその全体が明示的に本明細書に援用される）。

本明細書において、「骨髄系細胞」は、骨髄または脊髄に見られる顆粒球前駆細胞または単球前駆細胞や、骨髄または脊髄に見られるこれらと類似した細胞を指してもよい。骨髄系細胞系には、末梢血中を循環する単球、およびこれらの単球から成熟、分化および／または活性化した細胞集団が含まれる。このような細胞集団には、終末分化していない骨髄系細胞、骨髄由来免疫抑制細胞、または分化したマクロファージが含まれる。分化したマクロファージには、分極化していないマクロファージ、分極化マクロファージ、休止状態のマクロファージ、および活性化マクロファージが含まれる。骨髄系細胞系には、さらに、顆粒球前駆細胞、多形核球由来免疫抑制細胞、分化した多形核白血球、好中球、顆粒球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、ミクログリア、骨髄由来免疫抑制細胞、樹状細胞または赤血球が含まれるが、これらに限定されない。ミクログリアは、例えば骨髄系前駆細胞から分化することができる。

本明細書において、「治療する」、「治療すること」、「治療された」または「治療」は、文脈に応じて、治療処置と予防処置の両方を指してもよい。

本明細書において、障害に関して使用される「緩和する」、「緩和すること」、「緩和」または「緩和された」という用語は、障害の症状の軽減、疾患の安定化、または障害の進行の阻止を意味してもよい。がんなどの障害の場合、これらの用語は、腫瘍の大きさの縮小、がん細胞の成長もしくは増殖の抑制、腫瘍の完全な排除もしくは部分的な排除（例えば、完全奏効もしくは部分奏効）、疾患の安定化、がんの進行の阻止（例えば、無増悪生存）、または医師によって治療効果であると見なされるがんに対するその他の効果を含んでいてもよい。

本明細書において、「投与する」、「投与すること」または「投与された」は、化合物もしくは薬学的に許容されるその塩、または組換え細胞組成物を患者に導入するためのあらゆる手段を指してもよく、これには、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または経皮投与が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書において、「対象」または「患者」は、例えば、実験、診断、予防および／または治療を目的として、本明細書に記載の実施形態を使用または投与してもよいあらゆる生物を指してもよい。対象または患者として、例えば、動物が挙げられる。いくつかの実施形態において、対象は、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類またはヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、霊長類またはヒトである。

特定のポリヌクレオチド
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメントを含む第１の核酸を含む。いくつかの実施形態において、この調節エレメントは、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、細胞において治療用ペイロードの特異的な転写を誘導することができるか、そのような転写を誘導するように構成されている。例えば、前記調節エレメントは、特定の刺激に応答して治療用ペイロードの転写を誘導してもよく、この特定の刺激として、例えば、細胞の微小環境に存在するが、その生物の体内のその他の場所には存在しない刺激が挙げられる。いくつかの実施形態において、このような刺激が存在しない場合、転写は起こらないか、または大幅に低減される。例えば、前記刺激が存在しない場合の転写量は、該刺激が存在する場合と比べて、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%もしくは100%低下していてもよく、または前記割合のいずれか２つを上下限とする範囲内の割合だけ低下していてもよい。

いくつかの実施形態において、前記微小環境は、インビボの微小環境であり、例えば、腫瘍微小環境（TME）または炎症性微小環境である。

いくつかの実施形態において、前記刺激は、微小環境に内在する刺激を含んでいてもよい。そのような刺激の例として、生物体内のその他のコンパートメントまたは場所（例えば、恒常性が保たれた体循環または正常組織）と比較した場合の微小環境におけるタンパク質の量または該タンパク質をコードする核酸の量の増加または減少が挙げられる。いくつかの実施形態において、刺激として、ケモカイン量の変化、好中球の溶解物の組成の変化、タンパク質断片もしくは核酸断片の変化、脂質および脂肪酸の変化、ステロールの変化、またはその他の代謝産物および副産物の変化を挙げることができる。いくつかの実施形態において、タンパク質の量または該タンパク質をコードする核酸の量の増加または減少として、シグナル伝達分子（例えば、サイトカインやケモカインなど）の量の増加または減少を挙げることができる。シグナル伝達分子の例として、血管内皮成長因子（VEGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、腫瘍壊死因子（TNF）、IL-6、インターフェロン、C3bおよびマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）が挙げられる。いくつかの実施形態において、内在性刺激は、生物体内のその他のコンパートメントまたは場所（例えば、恒常性が保たれた体循環または正常組織）と比較した場合の微小環境における酸素量の減少であってもよい。いくつかの実施形態において、内在性刺激は、生物体内のその他のコンパートメントまたは場所（例えば、恒常性が保たれた体循環または正常組織）と比較した場合の微小環境における活性酸素種（ROS）の量の増加であってもよい。

いくつかの実施形態において、前記刺激は、細胞上のキメラ受容体の活性化により発生してもよい。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、微小環境において提示される内在性刺激により活性化することができる。微小環境における内在性刺激の別の例として、活性化された免疫細胞が挙げられる。

いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、細胞においてペイロードの転写の誘導が可能な、もしくはそのような転写を誘導するように構成されたプロモーター、エンハンサーまたはその機能性断片を含み、該プロモーター、エンハンサーまたはその機能性断片は、APOE、C1QA、SPP1、RGS1、C3、HSPA1B、TREM2、A2M、DNAJB1、HSPB1、NR4A1、CCL4L2、SLC1A3、PLD4、HSPA1A、OLR1、BIN1、CCL4、GPR34、EGR1、HLA-DQA1、FCGR3A、VSIG4、LILRB4、CSF1R、HSPA6、TUBA1B、BHLHE41、GSN、JUN、CX3CR1、HLA-DQB1、HSPE1、FCGR1A、CCL3L1、OLFML3、ADAM28、YWHAH、GADD45B、SLCO2B1、HSP90AA1、HSPA8、RNASET2、HLA-DPA1、CDKN1A、CD83、HAVCR2、DDIT4、C3AR1、HSPD1、LGMN、TMIGD3、CD69、IFI44L、SERPINE1、HLA-DMA、ALOX5AP、EPB41L2、HSP90AB1、HSPH1、RHOB、CH25H、FRMD4A、CXCL16、FCGR1B、HLA-DMB、GPR183、HLA-DPB1、SLC2A5、EGR2、ID2、RGS10、APBB1IP、EVL、CSF2RA、SGK1、FSCN1、BEST1、ADORA3、IFNGR1、MARCKS、MT2A、SRGAP2、ARL5A、ADGRG1、HMOX1、RHBDF2、ATF3、SOCS6、NR4A3、PLK3、APMAP、AKR1B1、UBB、HERPUD1、CTSL、BTG2、IER5、LPAR6、USP53、ST6GAL1、ADAP2、HTRA1、KCNMB1、DNAJA1、LPCAT2、ZFP36L1、CCL3、BAG3、TMEM119、LTC4S、EGR3、FCGBP、ABI3、IFNγ、TNFα、IFNα、IL-6またはIL-12から選択される遺伝子に由来するものである。本明細書で提供する実施形態において有用なプロモーター配列の代表例を表１に挙げる。いくつかの実施形態において、前記調節エレメントとして、低酸素応答エレメント（HRE）、SRC結合エレメント、SMAD 2応答エレメント、SMAD 3応答エレメント、ATF結合部位、STAT 2結合部位、CBP結合部位およびSYK結合エレメントを挙げることができる。EPO遺伝子由来のHREの一例として、配列番号55「CCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAG」が挙げられる。HREの別の例として、配列番号44が挙げられる。

いくつかの実施形態において、前記調節エレメントは、構成的プロモーターを含んでいてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、追加のエレメントは、微小環境において提示される刺激により誘導可能なエレメントであってもよい。構成的プロモーターの例として、MiniTKプロモーターまたはEF1αプロモーターが挙げられる。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、治療用ペイロードをコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、この治療用ペイロードは、腫瘍微小環境（TME）や炎症性微小環境などの微小環境を治療または緩和する核酸またはタンパク質をコードするものであってもよい。いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、Ｔ細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはＴ細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行う核酸またはタンパク質をコードするものであってもよい。いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、インターロイキンを含んでいてもよい。インターロイキンの例として、IL-10、IL-12、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-18およびIL-21が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、TGFβRII、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγまたはTNF-αをコードするものであってもよい。いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、ケモカインをコードするものであってもよい。ケモカインの例として、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含むケモカインが挙げられる。

いくつかの実施形態において、前記治療用ペイロードは、免疫応答を調節することができる核酸またはタンパク質をコードするものであってもよい。本明細書において、「免疫応答を調節する」とは、例えば、免疫増強、免疫抑制、免疫寛容誘導などにおいて、免疫応答が所望のレベルとなるように免疫応答を調節することを含んでいてもよい。この実施形態において、前記治療用ペイロードは、免疫調節因子をコードするものであってもよい。免疫調節因子の例として、インターロイキン、サイトカイン、免疫調節抗体およびケモカインが挙げられる。免疫調節因子のさらなる例として、IL-2、G-CSF、イミキモド、CCL3、CCL26、CSCL7、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、PD-1チェックポイント結合性阻害物質、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13およびCXCL15が挙げられる。

特定のベクター
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、本明細書で開示されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターは、Vprタンパク質またはその一部とともにパッケージングすることができる。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターは、ウイルスのアクセサリータンパク質とともにパッケージングされる。いくつかの実施形態において、ウイルスのアクセサリータンパク質は、Vif、Vpx、Vpu、NefおよびVprからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。

特定の細胞
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書で開示されたポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含んでいてもよい。例えば、細胞は、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメントを含む第１の核酸を含むポリヌクレオチドを含んでいてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記調節エレメントは、細胞において治療用ペイロードの転写を誘導することができるか、そのような転写を誘導するように構成されている。いくつかの実施形態において、細胞は、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、キメラ受容体タンパク質を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメント（例えば、細胞において治療用ペイロードの特異的な転写を誘導することができるか、そのような転写を誘導するように構成されている調節エレメント）を含む第１の核酸を含むポリヌクレオチドと、キメラ受容体をコードする別のポリヌクレオチドとを含んでいてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ受容体は、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメントを含む第１の核酸の特異的な転写を誘導する刺激を提供する。

いくつかの実施形態において、前記細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、好塩基球、好中球、好酸球および単球から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、GM-CSFに単球を接触させることにより作製されたマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記細胞はリンパ系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、エクスビボの細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、インビボの細胞である。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記インビボの細胞は、遺伝子組換え細胞を含んでいてもよく、例えば、治療法を行うために提供される細胞などを含んでいてもよい。

いくつかの実施形態は、本明細書で提供する細胞の調製を含む。そのような実施形態のいくつかは、本明細書で提供するポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメントを含む第１の核酸を含むポリヌクレオチドを細胞に導入する。いくつかの実施形態において、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する。いくつかの実施形態において、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメント（例えば、細胞において治療用ペイロードの特異的な転写を誘導することができるか、そのような転写を誘導するように構成されている調節エレメント）を含む第１の核酸を含むポリヌクレオチドと、キメラ受容体をコードする別のポリヌクレオチドとを細胞に導入する。

特定のキメラ受容体
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、キメラ受容体を含む。いくつかの実施形態において、細胞においてキメラ受容体が活性化され、活性化されたキメラ受容体により、該細胞に内在する１つ以上の遺伝子の転写が誘導される。この実施形態の一例を図17Aに示す。いくつかの実施形態において、細胞においてキメラ受容体を活性化することができ、活性化されたキメラ受容体は、本明細書で提供するポリヌクレオチドの特異的な転写を誘導する刺激を提供することができる。この実施形態の一例を図17Bに示す。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記ポリヌクレオチドは、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメントを含む第１の核酸を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞外結合ドメイン、前記膜貫通ドメインまたは前記細胞内シグナル伝達ドメインは、LILRB受容体、CD115受容体、M-CSF受容体；CXCR4；ニューロピリン（NRP2）；上皮成長因子受容体；血管内皮成長因子２型受容体；トランスフォーミング成長因子β ２型受容体；腫瘍壊死因子α受容体；インターロイキン６受容体；インターフェロンγ ２型受容体；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体αサブユニット；Toll様受容体４；TGFb、GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-1β、IL-13、IL-10、IFN-α、IFN-βまたはIFN-γの受容体を含むサイトカイン受容体；CCR1～10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5およびCXCR6を含むケモカイン受容体；PDGF、VEGFまたはEGFの受容体を含む成長因子受容体；LPS受容体；LDH受容体；MDH受容体；CpG受容体；ssRNA受容体；ならびに葉酸受容体から選択される受容体に由来するものである。

キメラ受容体の構成要素の配列の一例を表２に挙げる。この表では、細胞外ドメインの配列、膜貫通ドメインの配列および細胞質内ドメインの配列の特定の例を挙げている。いくつかの実施形態において、これらの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインをモジュール式サブユニットとして使用して、キメラ受容体を作製することができる。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ受容体は、内在性遺伝子の発現を調節する刺激を提供し、かつ／または本明細書で提供するポリヌクレオチドの特異的な転写を誘導する刺激を提供する。

いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、可溶性因子（ケモカイン、サイトカイン、成長因子、核酸、代謝酵素など）の存在や表面タンパク質の存在などの、免疫微小環境のシグナルに応答して刺激を提供する。表２に挙げた受容体には、腫瘍関連免疫細胞および腫瘍関連間質細胞において通常発現され、特定の抗炎症性プログラムにおいて誘導されうる受容体が含まれている。

いくつかの実施形態において、がん療法に有用なキメラ受容体は、抗炎症受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むことができるとともに、炎症促進性受容体の細胞内ドメインを含むことができ、これによって、細胞において、内在性の炎症促進遺伝子の多面的な発現を開始することができるか、またはそのような発現を開始するように構成されている。また、いくつかの実施形態において、自己免疫障害または炎症性障害を標的とする治療法に有用なキメラ受容体は、炎症促進性受容体の細胞外ドメインと、抗炎症受容体の細胞内ドメインとを含むことができ、これによって、細胞において、抗炎症性遺伝子の発現を開始することができるか、そのような発現を開始するように構成されている。

特定の治療方法
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、治療方法を含む。そのような実施形態のいくつかは、対象において障害を治療、緩和または抑制することを含んでいてもよく、該治療、緩和または抑制は、本明細書で提供する細胞または細胞集団を投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記障害は、がん、炎症性障害または炎症性疾患を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記対象はヒトである。

いくつかの実施形態において、前記がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、前記がんは、乳がん、脳腫瘍、肺がん、肝臓がん、胃がん、脾臓がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、肉腫、神経芽腫、前立腺がんおよび卵巣がんから選択される。いくつかの実施形態において、前記がんは膠芽腫である。

いくつかの実施形態において、前記障害は、炎症性障害または炎症性疾患を含み、炎症部位を含んでいてもよい。本明細書で提供する１つ以上の組成物の投与に応答し、炎症部位を含む障害および疾患の例として、がん、アテローム性動脈硬化症および虚血性心疾患が挙げられる。さらなる例として、尋常性ざ瘡、喘息、特定の自己免疫疾患、特定の自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、大腸炎、憩室炎、糸球体腎炎、化膿性汗腺炎、特定の過敏症、特定の炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、扁平苔癬、マスト細胞活性化症候群、マスト細胞症、耳炎、骨盤炎症性疾患、再灌流障害、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、移植拒絶反応および血管炎が挙げられる。

いくつかの実施形態において、治療法は、自己細胞の使用を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、治療法は、同種細胞の使用を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、治療法は、腫瘍や炎症部位などの微小環境への直接注射を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、治療法は、静脈内投与を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、腫瘍床を含んでいてもよい。腫瘍床は、がん性腫瘍を取り囲む血管組織および間質組織を含んでいてもよく、がん性腫瘍に酸素、成長因子および栄養素を供給する。したがって、本発明の実施形態は、腫瘍およびその他の免疫抑制性状態の非外科的処置に有用であり、本明細書に記載の態様において、特定の条件に適したすぐに投与可能な既製品としての同種マクロファージ製剤が提供され、このマクロファージ製剤は別の形態の免疫療法を補助することができる。本明細書に記載の方法の実施形態のいくつかにおいて、遺伝子組換え細胞または組成物を腫瘍床に直接注射する。いくつかの実施形態において、1×10⁵～2×10⁷個の遺伝子組換え細胞を腫瘍床に注射する。いくつかの実施形態において、1×10⁵個、2×10⁵個、3×10⁵個、4×10⁵個、5×10⁵個、6×10⁵個、7×10⁵個、8×10⁵個、9×10⁵個、1×10⁶個、2×10⁶個、3×10⁶個、4×10⁶個、5×10⁶個、6×10⁶個、7×10⁶個、8×10⁶個、9×10⁶個、1×10⁷個、2×10⁷個、3×10⁷個、4×10⁷個、5×10⁷個、6×10⁷個、もしくは7×10⁷個の遺伝子組換え細胞、またはこれらの数値のいずれか２つを上下限とする範囲内の数の遺伝子組換え細胞を腫瘍床に注射する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞または組成物は、腫瘍床の半径1mm以内、2mm以内、5mm以内、10mm以内、20mm以内、30mm以内、40mm以内、50mm以内、60mm以内、70mm以内、80mm以内、90mm以内、100mm以内、110mm以内、120mm以内、130mm以内、140mm以内、150mm以内、160mm以内、170mm以内、180mm以内、190mm以内もしくは200mm以内、またはこれらの距離のいずれか２つを上下限とする範囲内の半径以内に注射される。

特定のキットおよびシステム
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、キットを含む。そのような実施形態のいくつかは、本明細書で提供するポリヌクレオチドを含む。そのような実施形態のいくつかは、本明細書で提供するポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、キットは、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメントを含む第１の核酸を含むポリヌクレオチドを含んでいてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記調節エレメントは、細胞において治療用ペイロードの特異的な転写を誘導することができるか、そのような転写を誘導するように構成されている。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書で提供するキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、キットは、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメント（例えば、細胞において治療用ペイロードの特異的な転写を誘導することができるか、そのような転写を誘導するように構成されている調節エレメント）を含む第１の核酸を含む第１のポリヌクレオチドと、本明細書で提供するキメラ受容体をコードする第２のポリヌクレオチドとを含んでいてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ受容体は、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメントを含む第１の核酸の特異的な転写を誘導する刺激を提供することができる。

本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、システムを含む。そのような実施形態のいくつかは、本明細書で提供するポリヌクレオチドを含む。そのような実施形態のいくつかは、本明細書で提供するポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、システムは、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメントを含む第１の核酸を含むポリヌクレオチドを含んでいてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記調節エレメントは、細胞において治療用ペイロードの特異的な転写を誘導することができるか、そのような転写を誘導するように構成されている。いくつかの実施形態において、システムは、本明細書で提供するキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、システムは、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメント（例えば、細胞において治療用ペイロードの特異的な転写を誘導することができるか、そのような転写を誘導するように構成されている調節エレメント）を含む第１の核酸を含む第１のポリヌクレオチドと、本明細書で提供するキメラ受容体をコードする第２のポリヌクレオチドとを含んでいてもよい。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記キメラ受容体は、治療用ペイロードに作動可能に連結された調節エレメントを含む第１の核酸の特異的な転写を誘導する刺激を提供することができる。

実施例1－インビトロでの293T細胞における低酸素誘導性遺伝子発現
図1に示す導入遺伝子を構築した。構築した導入遺伝子は、（A）切断型CD19（CD19t）をコードするCD19tコンストラクト；（B）eF1aプロモーターとGFP／ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含むEF1コンストラクト；（C）最小チミジンキナーゼプロモーターとGFP／ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含むminiTKコンストラクト；および（D）連続する３つの低酸素応答エレメント（HRE）と、最小チミジンキナーゼプロモーターと、GFP／ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含むHRE miniTKコンストラクト（HRE_MiniTK eGFP:ffluc -t2a-CD19t）であった。HREは、配列番号44の配列を含んでいた。CD19tは、選択マーカーおよび／または形質導入効率マーカーとして使用した。

ヒト293T細胞（ヒト胎児腎臓細胞株）またはRaji細胞（ヒトリンパ芽球様細胞株）に、コンストラクト（D）を形質導入し、形質導入した細胞を低酸素チャンバーで20時間インキュベートした。コントロールとして、形質導入した細胞を通常の酸素濃度（正常酸素状態）でインキュベートした。形質導入した細胞の発光量を測定した。図2に示すように、低酸素状態では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現が誘導され、その発現量は、通常の酸素濃度でインキュベートした細胞よりも有意に高かった。図3は、導入遺伝子を形質導入した293T細胞またはRaji細胞を低酸素チャンバーで20時間インキュベートした際の発光量のばらつきの程度を示すグラフである。コントロールとして、形質導入した細胞を通常の酸素濃度（正常酸素状態）でインキュベートした。

実施例2－インビトロでの初代ヒトマクロファージにおける低酸素誘導性遺伝子発現
単球をGM-CSFで処理して初代ヒトマクロファージを得た。単球から分化したマクロファージを1×10³個／ウェルの密度で96穴プレートに播種した。図1に示す導入遺伝子を細胞に形質導入した。7日目に、試験プレートを低酸素チャンバーで24時間インキュベートした（低酸素条件：5% O₂、10% CO₂、85% N₂）。8日目に、形質導入した細胞のルシフェラーゼの発現量を測定した。HRE-MiniTK-ルシフェラーゼコンストラクトの配列の一例を表３に示す。

ルシフェラーゼの活性レベルを測定した。図4に示すように、ルシフェラーゼ活性の測定により、低酸素状態では、組換え初代ヒトマクロファージにおいて低酸素応答エレメントを含む導入遺伝子の発現が誘導されることが明らかになった。低酸素応答エレメントを含む導入遺伝子から発現されたルシフェラーゼの活性は、低酸素条件では非低酸素条件と比べて約10倍に増加した（図5）。

ルシフェラーゼタンパク質量を測定した。0日目に、ルシフェラーゼタンパク質の発現量を測定した。図6は、各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーでインキュベートする前に当該マクロファージから調製したタンパク質抽出物のウエスタンブロットを示したものである。図7は、各種導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージを低酸素チャンバーでインキュベートする前のルシフェラーゼタンパク質の相対発現量を示したグラフである。低酸素応答エレメントを含む導入遺伝子から幾分かルシフェラーゼタンパク質が検出され、その発現量は、コントロール導入遺伝子（コンストラクト（C）－miniTK eGFP:ffluc-t2a-CD19t）を形質導入した細胞で検出された発現量の約4倍であった。

実施例3－293T細胞における低酸素状態後の導入遺伝子の発現
低酸素応答エレメントとルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含む導入遺伝子をヒト293T細胞に形質導入し、低酸素チャンバーでインキュベートした。まず、低酸素チャンバーでインキュベートした形質導入細胞のルシフェラーゼ活性を測定し、次に、低酸素条件を解除した後、通常の条件で形質導入細胞をインキュベートして、0日目、2日目、3日目、4日目および5日目にルシフェラーゼ活性を測定した。通常の条件でインキュベートした形質導入細胞に対する低酸素条件でインキュベートした形質導入細胞の相対ルシフェラーゼ活性を求めた。図8に示すように、低酸素チャンバーから細胞を取り出した後では、相対ルシフェラーゼ活性が低下した。

実施例4－初代ヒトマクロファージにおける低酸素状態後の導入遺伝子の発現
低酸素条件に晒した後の導入遺伝子の発現を測定した。GM-CSFで分化させた後、形質導入した単球由来のマクロファージを溶解した。細胞抽出物からRNAを単離し、単離したRNAからcDNAを調製した。ローディングコントロールであるβ-アクチンの量を基準として、ルシフェラーゼの量を測定した。ルシフェラーゼの量の測定は、低酸素条件を解除してから0日目、1日目、2日目、3日目および5日目に行った。導入遺伝子として、CD19t（切断型CD19（CD19t）をコードする導入遺伝子）；eGFP（eF1aプロモーターとGFP／ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含む導入遺伝子（eF1a eGFP:ffluc-t2a-CD19t））；MiniTK（最小チミジンキナーゼプロモーターとGFP／ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含む導入遺伝子（MiniTK eGFP:ffluc-t2a-CD19t））；またはHRE（低酸素応答エレメントと、最小チミジンキナーゼプロモーターと、GFP／ルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含む導入遺伝子（HRE_MiniTK eGFP:ffluc -t2a-CD19t））をヒト初代マクロファージに形質導入し、このヒト初代マクロファージにおけるルシフェラーゼ転写産物の相対発現量を、低酸素条件の解除後0日目、1日目および2日目に測定し、また、通常の条件を継続した場合（N）でも測定した。

図9Aおよび図9Bに示すように、CD19tを形質導入した細胞では、ルシフェラーゼmRNAの発現は確認されなかった。ポジティブコントロールであるeGFPを形質導入した細胞は、低酸素条件の解除後、各時点で高い発現量を示した。ネガティブコントロールであるMiniTKを形質導入した細胞は、低酸素条件の解除後、各時点において基礎状態である低い発現量を示した。HREを形質導入した細胞では、低酸素条件の解除後2日目、3日目および5日目に、MiniTKを形質導入した細胞と同程度までルシフェラーゼの発現量が減少した。このように、HRE導入遺伝子を形質導入した細胞におけるルシフェラーゼの発現量の減少は、低酸素条件を解除後、少なくとも5日間続いた。

図10は、追加実験の結果を示したものであり、低酸素条件の解除後5日間にわたってレポーター遺伝子の相対発現量が減少したことを示している。

低酸素条件を解除した後のルシフェラーゼタンパク質量を測定した。図11に示すように、HRE導入遺伝子を形質導入した初代ヒトマクロファージにおけるルシフェラーゼタンパク質の相対発現量は、3日間でMiniTKコントロールと同程度まで減少した。図12は、低酸素条件の解除後5日間にわたって、ルシフェラーゼタンパク質量を測定した追加の実験を示すものである。このように、HREは刺激に応答して発現を促進させることが示されており、刺激を取り除くとその発現は減少した。

実施例5－低酸素応答エレメントを含む導入遺伝子のインビボにおける誘導
U87細胞皮下移植低酸素モデルを構築した。0日目に、1×10⁶個のU87細胞（ヒト初代膠芽腫細胞株）をマウスに注射し、11日目に、低酸素応答エレメントとルシフェラーゼレポーター遺伝子とを含む試験導入遺伝子（HRE-mTK-ffluc）またはコントロール導入遺伝子（mTK-ffluc）を含む1×10⁶個の遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を注射した。図13Aの左図を参照されたい。処置を施した対象において、導入遺伝子のレポーター遺伝子であるルシフェラーゼの発現を1日目、6日目および8日目に測定した（図13A、右図）。

低酸素応答エレメントを含む導入遺伝子を注射したマウスでは、6日目と9日目に、導入遺伝子のレポーター遺伝子からのシグナルが、腫瘍の位置と一致する位置で検出された。

別の実験において、HRE MiniTK eGFP:ffluc-t2a-CD19tを含むコンストラクトまたはCD19tを含むコンストラクトを形質導入して遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を作製した。0日目に、1×10⁶個のU87細胞をマウスの皮下に注射した。19日目に、1×10⁶個のGEMをマウスに注射した。ルシフェラーゼの発現量を測定した。GEMの注射後2日目に平均放射輝度を測定した（図13B）。21日目に発現位置と発現量を調べた。図13Cに示すように、HRE MiniTK eGFP:ffluc-t2a-CD19tを含むGEMを注射したマウスでは、腫瘍に局在するルシフェラーゼの発現が認められた（図13C、右図）。一方、CD19tを含むGEMを注射したマウスでは、腫瘍に局在するルシフェラーゼの発現は認められなかった（図13C、左図）。マウスのイメージングを毎日行い、ルシフェラーゼを発現するGEMの移行を確認したところ、4日以内に側腹部の腫瘍に局在することがわかった（図13D）。

別の実験において、20万個のU87-MG細胞をマウスの頭蓋内に注射した。10日後、段階的に細胞数を増やしながら、ルシフェラーゼを発現するGEMをマウスに注射し、生物発光を利用してマウスのイメージングを行った。注射した投与量は、2.5×10⁶個のGEMまたは5×10⁶個のGEMであった。図13Eに示すように、ルシフェラーゼを発現するGEMは、用量依存的に腫瘍組織に移動した。

実施例6－インビトロでの初代ヒトマクロファージにおける低酸素誘導性IL-21発現
IL-12をコードする遺伝子を含み、eF1aプロモーター（EF1a）、最小チミジンキナーゼプロモーター（MiniTK）、または低酸素応答エレメントと最小チミジンキナーゼプロモーター（HRE MiniTK）で駆動する導入遺伝子を初代ヒトマクロファージに形質導入した。形質導入した細胞を低酸素条件でインキュベートした後、低酸素条件を解除した。0日目と、低酸素条件の解除後1日目、2日目、3日目、4日目および5日目に、IL-12の発現量を測定した。

図14に示すように、HREを含む導入遺伝子を形質導入した細胞では、低酸素条件によりIL-12の有意な発現が誘導された。低酸素条件を解除すると、HREを含む導入遺伝子を形質導入した細胞のIL-12の発現量は、コントロール導入遺伝子を形質導入した細胞と実質的に同程度まで減少した。

追加のインビトロ実験として、IL-12をコードする遺伝子を含む導入遺伝子を初代ヒトマクロファージに導入し、IL-12の発現を少なくとも21日間にわたり測定した。図15Aに示す導入遺伝子を構築した。構築した導入遺伝子は、（A）eF1aプロモーター（EF1a）を含み、切断型CD19（CD19t）およびヒトインターロイキン12のp40サブユニットとp35サブユニット（hIL21p40p35）をコードするEF1aコンストラクト；（B）最小チミジンキナーゼプロモーター（miniTK）を含み、CD19tおよびhIL21p40p35をコードするminiTKコンストラクト；（C）連続する３つの低酸素応答エレメント（HRE）とminiTKプロモーターとを含み、CD19tおよびhIL21p40p35をコードするHRE miniTKコンストラクト；（D）EF1aプロモーターを含み、GFP／ルシフェラーゼレポーター（eGFP:ffluc）およびhIL21p40p35をコードするEF1a GFP-ルシフェラーゼコンストラクト；（E）miniTKプロモーターを含み、eGFP:fflucおよびhIL21p40p35をコードするminiTK GFP-ルシフェラーゼコンストラクト；ならびに（F）連続する３つのHREとminiTKプロモーターとを含み、eGFP:fflucおよびhIL21p40p35をコードするHRE miniTK GFP-ルシフェラーゼコンストラクトであった。

初代ヒトマクロファージに、コンストラクトA、コンストラクトB、またはコンストラクトCを含むレンチウイルスベクターを形質導入し、低酸素条件に供する前（正常酸素状態）、24時間の低酸素条件（低酸素状態）、低酸素状態後の期間を含めた21日間にわたって、培地中に分泌されたIL-21の量を測定した。図15Bに示すように、ポジティブコントロールのコンストラクト（A）を形質導入した細胞は、測定期間中にわたりIL-21を発現した。ネガティブコントロールのコンストラクト（B）を形質導入した細胞は、測定期間中にわたりIL-21の発現が最も低く抑えられていた。HREコンストラクト（C）を形質導入した細胞では、低酸素条件に応答してIL-21の発現が大幅に増大し、低酸素条件を解除すると発現量は低下した。

初代ヒトマクロファージに、コンストラクトD、コンストラクトE、またはコンストラクトFを含むレンチウイルスベクターを形質導入した。形質導入した細胞を低酸素条件または正常酸素条件に晒した後、フローサイトメトリーによりGFPの発現量に応じて選別した。図15Cにおいて、左側の上段および下段は、ポジティブコントロールのEF1a（コンストラクトD）を形質導入した細胞を選別したものである。中央の上段および下段は、ネガティブコントロールのminiTK（コンストラクトE）を形質導入した細胞を選別したものである。右側の上段および下段は、HRE-miniTK（コンストラクトF）を形質導入した細胞を選別したものである。図15Cに示すように、HRE-miniTKコンストラクトは、低酸素条件で発現が誘導されることがわかる。

実施例7－培養ヒト大腸腫瘍におけるHRE駆動性発現
大腸がん患者から採取した大腸癌試料を薄切し、250μmの厚さの切片を作製した。この切片を、EF1aコンストラクト、MiniTKコンストラクトまたはHRE MiniTK eGFP:ffluc-t2a-CD19tコンストラクトを含む100000個の遺伝子組換えマクロファージ（GEM）とともに低酸素条件で培養した。培養切片において、各コンストラクトを形質導入したGEMからのGFPの発現を測定した。培養物中のGFPの発現量を測定し、GFP+EPCAM+細胞の割合を求めた。図16に示すように、ポジティブコントロールのコンストラクト（EF1a）またはHREコンストラクトを含むGEMとともに培養した培養物は、ネガティブコントロールのコンストラクト（miniTK）を含むGEMとともに培養した培養物よりも高いGFP発現量を示した。

実施例8－インビトロでの初代ヒトマクロファージにおけるキメラ受容体の活性
ヒト初代マクロファージに、LILRBドメインと、膜貫通リンカーと、CD3ζ／41BB細胞質内ドメインとを含むキメラ受容体をコードする導入遺伝子を形質導入した。図17Bに示すように、MHCクラスＩ分子がLILRBドメインに結合すると、CD3ζ／41BBドメインから細胞内シグナル伝達が誘導され、SYKタンパク質のリン酸化が誘導される。このキメラ受容体のポリヌクレオチドの一例を含むベクターのマップを図18Aに示す。リン酸化Sykに応答する調節エレメントを含む導入遺伝子のポリヌクレオチドの一例を含むベクターのマップを図18Bに示す。コントロール細胞は、CD19tマーカーをコードするベクターを形質導入したものである。形質導入した細胞を、MHCクラスＩ分子を発現する細胞と接触させた。

図18Cに示すように、LILRBドメインと、膜貫通リンカーと、CD3ζ／41BB細胞質内ドメインとを含むキメラ受容体をコードする導入遺伝子を形質導入した細胞を、MHCクラスＩ分子を発現する細胞で刺激することにより、リン酸化されたSykが検出された。

Sykのリン酸化により食作用が誘導されると考えられる（Morrissey et al., 2018: doi.org/10.7554/eLife.36688）。形質導入した細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識された自己Ｔ細胞と接触した。図18Dに示すように、Zスタック画像の解析において、キメラ受容体を形質導入したマクロファージを小麦胚芽凝集素（WGA）で染色したところ、細胞膜の内側にCFSE標識細胞が存在することが観察された。

実施例9－キメラ受容体の活性
キメラ受容体の活性をインビトロで調べた。ヒト単球由来マクロファージに、受容体候補としてのMCSF-RxTLR4キメラ受容体1（CR-1）またはMCSF-RxTLR4キメラ受容体2（CR-2）を形質導入した。CR-1を図19Aに示す。CR-2は、CD28膜貫通ドメインの代わりにMCSF受容体の膜貫通ドメインを含むこと以外は、CR-1と実質的に同じものであった。CR-1およびCR-2に含まれるヌクレオチド配列を表４に示す。コントロール細胞は、形質導入を行わなかった細胞である（UT）。細胞をLPS／IFN-γ（10μg/mlおよび100U/ml）で48時間刺激した。上清を回収し、炎症性サイトカインの分析を行った。キメラ受容体を含む細胞は、刺激によりTNF-αおよびIL-12を発現した（図19B）。

キメラ受容体の活性をインビボで調べた。eGFP/fflucの上流に挿入したMCSF-RxTLR4キメラ受容体候補またはCD19tのみをヒト単球由来マクロファージに形質導入し、作製したU87膠芽腫（GBM）細胞由来の頭蓋内腫瘍に腫瘍内注射した（図20A）。5日後、ルシフェラーゼの発現の誘導を確認するために、IVISを用いて動物のイメージングを行い、生物発光を検出した（図20B）。

実施例10－腫瘍微小環境において活性化される遺伝子の特定
膠芽腫腫瘍の切除術を受けた患者から得た腫瘍関連マクロファージと、同じ患者の末梢血から単離した単球を用いて、シングルセルRNAシーケンス解析を行った。腫瘍関連マクロファージでは誘導されていたが、単球では誘導されていなかった遺伝子が400個以上確認され、このことから、これらの遺伝子のプロモーターが腫瘍微小環境（TME）では活性化されるが、末梢循環では活性化されないことが示唆された。

実験プロトコルの一例を図21に示す。図21（A）に示すように、患者から膠芽腫（GBM）の腫瘍を切除して細胞を分散させ、さらに同じ患者から末梢血を採取した。これらの試料から細胞を分離してCD14+細胞を選択し、cDNAを作製して塩基配列を決定し、解析した（NanoString Technologies社、ワシントン州シアトル）。さらに、図21（B）に示すように、健康対照者から採取した末梢血から細胞を分離してCD14+細胞を選択し、cDNAを作製して塩基配列を決定し、解析した（NanoString Technologies社、ワシントン州シアトル）。CD14+細胞を選択することにより、腫瘍関連マクロファージ（TAM）に関連する遺伝子を発現する希少な細胞亜集団を同定できる可能性が高くなることがわかった。図22Aでは、CD14細胞の磁気選択を行った後に10x Genomics社のシングルセルRNAシーケンス解析を行うことによって、単球またはTAM前駆細胞であることを示す遺伝子を発現する細胞の割合が有意に増加し、TAMよりも転写活性が低い循環単球において1000～5000個の既知のmRNAが同定された（図22B）。表５に、試料中における代表的なTAM特異的遺伝子を発現するCD14+細胞の割合を示す。TAM特異的遺伝子のその他の例としては、CD206、CD209、EGFR、VEGFR、MARCO、VSIG4、HSP5A、HSPA6、HMOX1、LDHA、C5aR、TGFbR1、TGFbR2、TGFbR3、MICA、MICBなどが挙げられる。

図23は、770個の遺伝子で構成される骨髄系細胞用パネルの特定の経路／機能に関して、TAM関連遺伝子とCD14+単球で発現される遺伝子とを比較したNanoString社の解析結果を示したものである。この結果から、炎症促進性または抗炎症性の免疫細胞の機能（細胞傷害性免疫細胞の活性化および抑制を含む）に寄与することが知られている経路において、患者のTAMがCD14+単球とは大きく異なることが示唆された。

実施例11－腫瘍関連マクロファージに特異的な遺伝子の同定
腫瘍微小環境で導入遺伝子を発現させるための別の調節エレメント候補も同定した。神経膠腫の外科的切除術を受けた患者から腫瘍試料を採取し、末梢血も採取した。試料の採取後4時間以内に試料を個々の細胞に分離し、Percoll密度勾配を用いた精製を行い、CD14+細胞を選択した。CD14+細胞をバルクで溶解し、全mRNAの配列を決定した。

発現された遺伝子を解析し、遺伝子発現と予後の関係性および遺伝子発現と疾患進行における役割の関連性を調べた。遺伝子発現は、神経膠腫または卵巣腫瘍の患者における腫瘍の発現と相関しており、これらの患者では、再発までの期間が短く、かつ／または生存期間も短いといった予後不良が見られた。図24Aは、神経膠腫患者における特定の遺伝子の相対発現量を生存期間に対してプロットしたグラフを示し、図24Bは、卵巣がん患者における特定の遺伝子の相対発現量を再発までの期間に対してプロットしたグラフを示し、図24Cは、卵巣がん患者における特定の遺伝子の相対発現量を生存期間に対してプロットしたグラフを示す。図24A～24Cにおいて、上の線は遺伝子の発現量が高い群を表し、下の線は遺伝子の発現量が低い群を表す。DNAJB1、DNASE2、B3GNT5、RGS1、HMOX1、HSPA5、RNASET2、CAPG、CITED2、NEU1、CYCS、CCL2、HSPA6、JUN、ID2、EGR1、ARID5A、ATF3、ADRB2、CDC42、LSM6およびVSIG4を含む22個の遺伝子が同定された。

解釈可能なRNAシーケンス解析データの信頼性を高めるために、GBM患者の腫瘍関連マクロファージ（TAM）（n=6）（中塗り）と単球（n=10）（中抜き）の遺伝子について主成分分析を行った。主成分分析により、複雑なデータセットを圧縮して線形結合で表した。図25に示すように、第１主成分（PC1）は、バルクRNAシーケンス解析から得られた全遺伝子発現シグネチャーを圧縮してＸ軸にプロットしたものである。第１主成分では、遺伝子発現プロファイルは、TAMと単球とで異なるが、同じ材料に由来するその他の細胞と比べて、TAMと単球の間の関係性が複数の患者間でよく似ていることが示されている（末梢血由来の単球と患者の腫瘍由来のTAM）。図25のＹ軸に示した第２主成分（PC2）は、各試料の転写産物インテグリティナンバー（TIN値）を表しており、TIN値とは、処理中およびシーケンス中に生じた転写産物の分解量を補正したものである。この分析により、材料と発現プロファイルの完全性と再現性が確認され、この結果を図26A～26Nにプロットした。より具体的には、図26A～26Nは、循環単球および腫瘍関連マクロファージ（TAM）における特定の遺伝子の相対発現量を示しており、この特定の遺伝子には、C1QA、C1QB、C1QC、C3、CSF1R、CCL2、RGS1、DNAJB1、HSPA6、SPP1、TREM2、TUBA1B、DNASE2およびAPOEが含まれていた。

本明細書で使用されている「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「含む（containing）」または「特徴とする（characterized by）」という用語と同義であるとともに、オープンエンドで包括的な意味であり、本明細書には記載されていないさらなる要素や工程を除外するものではない。

前述の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示するものである。本発明の方法および材料は、変更することができ、製造方法および器具も変更することができる。このような変更は、本明細書に開示された本発明の実施または本開示を考慮に入れて、当業者であれば容易に理解することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されず、本発明の真の範囲および要旨において可能なあらゆる変更および実施形態を包含する。

本明細書において引用された公開特許出願、非公開特許出願、特許および学術文献を含む（ただしこれらに限定されない）すべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する。引用によって援用された文献、特許または特許出願が本明細書の開示内容と矛盾する場合、このような矛盾事項よりも本明細書の記載が採用および／または優先される。

Claims (56)

1. ポリヌクレオチドであって、
   インビボの微小環境内の細胞において治療用ペイロードの転写を誘導することができるか、またはそのような転写を誘導するように構成された調節エレメントを含む第１の核酸；および
   前記治療用ペイロードをコードする第２の核酸
   を含み、
   前記治療用ペイロードが、第１の核酸に作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド。
2. 前記インビボの微小環境が、腫瘍微小環境および炎症性微小環境から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 前記微小環境内の刺激に応答した前記調節エレメントにより特異的な転写が誘導される、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
4. 前記刺激が、体循環と比較した場合の前記微小環境における、血管内皮成長因子（VEGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、腫瘍壊死因子（TNF）、IL-6、インターフェロン、C3bおよびマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）から選択されるタンパク質の量もしくは該タンパク質をコードする核酸の量の増加；または体循環と比較した場合の前記微小環境における酸素量の減少を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
5. 前記細胞上のキメラ受容体からの刺激に応答した前記調節エレメントにより特異的な転写が誘導される、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記刺激が、リン酸化Sykタンパク質を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記調節エレメントが、腫瘍微小環境内の細胞においてペイロードの特異的な転写の誘導が可能な、もしくはそのような転写を誘導するように構成されたプロモーター、エンハンサーまたはその機能性断片を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
8. 前記プロモーター、エンハンサーまたはその機能性断片が、APOE、C1QA、SPP1、RGS1、C3、HSPA1B、TREM2、A2M、DNAJB1、HSPB1、NR4A1、CCL4L2、SLC1A3、PLD4、HSPA1A、OLR1、BIN1、CCL4、GPR34、EGR1、HLA-DQA1、FCGR3A、VSIG4、LILRB4、CSF1R、HSPA6、TUBA1B、BHLHE41、GSN、JUN、CX3CR1、HLA-DQB1、HSPE1、FCGR1A、CCL3L1、OLFML3、ADAM28、YWHAH、GADD45B、SLCO2B1、HSP90AA1、HSPA8、RNASET2、HLA-DPA1、CDKN1A、CD83、HAVCR2、DDIT4、C3AR1、HSPD1、LGMN、TMIGD3、CD69、IFI44L、SERPINE1、HLA-DMA、ALOX5AP、EPB41L2、HSP90AB1、HSPH1、RHOB、CH25H、FRMD4A、CXCL16、FCGR1B、HLA-DMB、GPR183、HLA-DPB1、SLC2A5、EGR2、ID2、RGS10、APBB1IP、EVL、CSF2RA、SGK1、FSCN1、BEST1、ADORA3、IFNGR1、MARCKS、MT2A、SRGAP2、ARL5A、ADGRG1、HMOX1、RHBDF2、ATF3、SOCS6、NR4A3、PLK3、APMAP、AKR1B1、UBB、HERPUD1、CTSL、BTG2、IER5、LPAR6、USP53、ST6GAL1、ADAP2、HTRA1、KCNMB1、DNAJA1、LPCAT2、ZFP36L1、CCL3、BAG3、TMEM119、LTC4S、EGR3、FCGBP、ABI3、IFNγ、TNFα、IFNα、IL-6もしくはIL-12に由来するものであるか、またはこれらから選択されたものである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
9. 前記調節エレメントが、低酸素応答エレメント（HRE）、SRC結合エレメント、SMAD 2応答エレメント、SMAD 3応答エレメント、ATF結合部位、STAT 2結合部位、CBP結合部位およびSYK結合エレメントから選択されるエレメントを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
10. 前記調節エレメントがHREを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
11. 前記治療用ペイロードが、サイトカインをコードする、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
12. 前記治療用ペイロードが、インターフェロンをコードする、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
13. 前記インターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγから選択される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
14. 前記治療用ペイロードが、腫瘍壊死因子（TNF）をコードする、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
15. 前記TNFが、TNF-α、TNF-β、TNF-γ、CD252、CD154、CD178、CD70、CD153および4-1BBLから選択される、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
16. 前記治療用ペイロードが、インターロイキンをコードする、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
17. 前記インターロイキンが、IL-10、IL-12、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-18およびIL-21から選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
18. 前記治療用ペイロードが、ケモカインをコードする、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
19. 前記ケモカインが、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13およびCXCL15から選択される、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
20. 前記調節エレメントが、構成的プロモーターをさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
21. 前記構成的プロモーターが、MiniTKプロモーターおよびEF1αプロモーターから選択される、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
22. ベクターを含む第３の核酸をさらに含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
23. 前記ベクターが、ウイルスベクターを含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
24. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターを含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
25. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
26. 細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２５に記載の細胞。
27. 前記細胞外結合ドメイン、前記膜貫通ドメインまたは前記細胞内シグナル伝達ドメインが、LILRB受容体、CD115受容体、M-CSF受容体；CXCR4；ニューロピリン（NRP2）；上皮成長因子受容体；血管内皮成長因子２型受容体；トランスフォーミング成長因子β ２型受容体；腫瘍壊死因子α受容体；インターロイキン６受容体；インターフェロンγ ２型受容体；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体αサブユニット；Toll様受容体４；TGFb、GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-1β、IL-13、IL-10、IFN-α、IFN-βまたはIFN-γの受容体を含むサイトカイン受容体；CCR1～10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5およびCXCR6を含むケモカイン受容体；PDGF、VEGFまたはEGFの受容体を含む成長因子受容体；LPS受容体；LDH受容体；MDH受容体；CpG受容体；ssRNA受容体；ならびに葉酸受容体から選択される受容体に由来するものである、請求項２６に記載の細胞。
28. 前記細胞外ドメインが、LILRBおよびCD115から選択されるタンパク質の細胞外ドメインに由来するものである、請求項２６または２７に記載の細胞。
29. 前記膜貫通ドメインが、CH3ドメインに連結されたCH2ドメインに連結されたIgG4ヒンジ、CH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジ、およびIgG4ヒンジドメインから選択されるタンパク質の膜貫通ドメインに由来するものである、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の細胞。
30. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ζおよび41BBから選択されるタンパク質の細胞内ドメインに由来するものである、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の細胞。
31. 免疫細胞である、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の細胞。
32. 骨髄系細胞である、請求項３１に記載の細胞。
33. 好塩基球、好中球、好酸球および単球から選択される、請求項３１または３２に記載の細胞。
34. マクロファージである、請求項３１または３２に記載の細胞。
35. GM-CSFおよび／またはM-CSFに単球を接触させることにより作製されたマクロファージである、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の細胞。
36. リンパ系細胞である、請求項３１に記載の細胞。
37. ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞から選択される、請求項３６に記載の細胞。
38. 哺乳動物細胞である、請求項２５～３７のいずれか１項に記載の細胞。
39. ヒト細胞である、請求項２５～３８のいずれか１項に記載の細胞。
40. エクスビボの細胞である、請求項２５～３９のいずれか１項に記載の細胞。
41. 対象において障害を治療、抑制または緩和する方法であって、請求項２５～４１のいずれか１項に記載の細胞を対象に投与することを含む方法。
42. 前記障害が、がん、炎症性障害および炎症性疾患から選択される、請求項４１に記載の方法。
43. 前記障害が、がんである、請求項４２に記載の方法。
44. 前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記がんが、乳がん、脳腫瘍、肺がん、肝臓がん、胃がん、脾臓がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、肉腫、神経芽腫、前立腺がんおよび卵巣がんから選択される、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記がんが膠芽腫である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記障害が炎症性障害である、請求項４２に記載の方法。
48. 前記炎症性障害または炎症性疾患が、尋常性ざ瘡、喘息、特定の自己免疫疾患、特定の自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、大腸炎、憩室炎、糸球体腎炎、化膿性汗腺炎、特定の過敏症、特定の炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、扁平苔癬、マスト細胞活性化症候群、マスト細胞症、耳炎、骨盤炎症性疾患、再灌流障害、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、移植拒絶反応、血管炎、急性細菌性感染症、慢性細菌性感染症、移植後関連炎症および移植後関連炎症抑制から選択される、請求項４７に記載の方法。
49. 前記対象が哺乳動物である、請求項４１～４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 前記対象がヒトである、請求項４１～４９のいずれか１項に記載の方法。
51. 医薬品として使用するための、請求項１～２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２５～４０のいずれか１項に記載の細胞。
52. がんまたは炎症性疾患の治療または緩和のための、請求項１～２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２５～４０のいずれか１項に記載の細胞。
53. 前記がんが、乳がん、脳腫瘍、肺がん、肝臓がん、胃がん、脾臓がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、肉腫、神経芽腫、前立腺がん、膠芽腫および卵巣がんから選択される、請求項５２に記載のポリヌクレオチドまたは細胞。
54. 前記炎症性障害または炎症性疾患が、尋常性ざ瘡、喘息、特定の自己免疫疾患、特定の自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、大腸炎、憩室炎、糸球体腎炎、化膿性汗腺炎、特定の過敏症、特定の炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、扁平苔癬、マスト細胞活性化症候群、マスト細胞症、耳炎、骨盤炎症性疾患、再灌流障害、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻炎、サルコイドーシス、移植拒絶反応、血管炎、急性細菌性感染症、慢性細菌性感染症、移植後関連炎症および移植後関連炎症抑制から選択される、請求項５２に記載のポリヌクレオチドまたは細胞。
55. 前記対象が哺乳動物である、請求項５１～５４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは細胞。
56. 前記対象がヒトである、請求項５１～５５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは細胞。

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