JP2022518479A - 脂質結合体化コア足場を使用する高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子 - Google Patents

脂質結合体化コア足場を使用する高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子 Download PDF

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Abstract

ソフトマテリアルコア（例えば、脂質結合体化無機性コア）を有する球状高密度リポタンパク質様ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）が、本明細書で開示される。上記球状ＨＤＬ－ＮＰを合成するための方法がまた、本明細書で開示される。上記球状ＨＤＬ－ＮＰで、心血管疾患、がん、炎症性障害のような障害を処置するか、またはＮＦ－ｋＢ活性を低減するための方法がまた、本明細書で開示される。さらに、本開示は、脂質結合体化有機性コア足場を使用する球状ＨＤＬ摸倣物の合成および特徴付けのための方法を提供する。

Description

政府支援
本発明は、Ａｉｒ Ｆｏｒｃｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＦＯＳＲ）によって付与された契約番号ＦＡ９５５０－１３－１－０１９２およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金番号ＡＧ０６２９９９の下で政府支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／７９６５３４号（その全内容は、本明細書に参考として援用される）の優先権を主張する。
発明の背景
ナノ粒子は、ミクロン未満のサイズドメインにあり、物質をそれらのバルク形態と比較して、優れたものにする特有のサイズ依存特性を有する。ナノ粒子と関連する進歩した化学的および物理的特性は、生物学および医療の分野においてそれらの広範な用途をもたらした。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、血液中で循環する動的ナノ粒子である。
発明の要旨
本開示は、成熟ヒトＨＤＬと一致するサイズ、形状、表面の化学的性質、組成、タンパク質構造、およびコレステロール輸送特性を有するソフトコアＨＤＬ様ナノ粒子の合成を示す。脂質結合体化（ＬＣ）したＨＤＬ ＮＰは、細胞コレステロールを除去および送達し、炎症を低減するために関連する細胞タイプを標的化し、ヒトＨＤＬの顕著な機能を再現する。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰの合成は簡単であり、時間のかかるかつコストのかかる酵素成熟工程を要しないことから、これらのナノ粒子は、次世代のＨＤＬベースの治療剤の強力な候補であると判明することが認識される。
さらに、本開示は、脂質結合体化有機性コア足場を使用する球状ＨＤＬ摸倣物の合成および特徴付けのための方法を提供する。上記コア設計モチーフは、いくつかの実施形態においておよそ１０ｎｍ直径であり、それらのサイズ、形状、表面の化学的性質、組成およびタンパク質二次構造においてヒトＨＤＬと似ているソフトコアナノ粒子の集合を促進するために、リン脂質幾何形状を制限しかつ方向付ける。
いくつかの局面において、本開示は、コアおよび上記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含み、ここで上記コアは、脂質結合体化有機性コア足場を含む球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を提供する。いくつかの実施形態において、上記シェルは、脂質シェルである。いくつかの実施形態において、上記シェルは、脂質二重層または単層である。いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、約－２０ｍＶのζ電位を有する。いくつかの実施形態において、上記有機性コア足場は、ＰＬ４を含む。いくつかの実施形態において、上記有機性コア足場は、９－ＤＮＡ－ＰＬ４を含む。いくつかの実施形態において、上記有機性コア足場は、１８－ＤＮＡ－ＰＬ４を含む。いくつかの実施形態において、上記シェルは、無機性コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子よりヒトＨＤＬに近いζ電位を有する。いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、金コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子よりヒトＨＤＬに近いζ電位を有する。いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、アポリポタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、上記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉである。
いくつかの局面において、本開示は、上記の球状ＨＤＬ－ＮＰのうちのいずれか１つを含む組成物を提供する。
いくつかの局面において、本開示は、炎症性障害を処置する方法であって、前記方法は、被験体に、有効量の、上記の球状ＨＤＬ－ＮＰのうちのいずれか１つを含む組成物を投与する工程を包含する方法を提供する。
いくつかの局面において、本開示は、ＮＦ－ｋＢ活性を低減する方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の、上記の球状ＨＤＬ－ＮＰのうちのいずれか１つを含む組成物を投与する工程を包含する方法を提供する。
本発明の１またはこれより多くの実施形態の詳細は、以下の説明に示される。本発明の他の特長または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からも明らかである。
一局面において、本開示は、コアおよび上記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含む球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）であって、ここで上記コアは、脂質結合体化有機性コア足場を含むものに関する。
いくつかの実施形態において、上記シェルは、脂質シェルである。いくつかの実施形態において、上記シェルは、脂質二重層または単層である。いくつかの実施形態において、上記シェルは、脂質二重層である。いくつかの実施形態において、上記シェルは、脂質単層である。
いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、約－２０ミリボルト（ｍＶ）の表面ζ電位を有する。
いくつかの実施形態において、上記有機性コア足場は、ＰＬ４を含む。いくつかの実施形態において、上記有機性コア足場は、９－ＤＮＡ－ＰＬ４を含む。いくつかの実施形態において、上記有機性コア足場は、１８－ＤＮＡ－ＰＬ４を含む。
いくつかの実施形態において、上記シェルは、無機性コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子よりヒトＨＤＬに近いζ電位を有する。いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、金コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子よりヒトＨＤＬに近いζ電位を有する。いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、－１６～２６ｍＶのζ電位を有する。
いくつかの実施形態において、本開示の球状ＨＤＬ－ＮＰは、アポリポタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉである。
いくつかの実施形態において、本開示の球状ＨＤＬ－ＮＰは、８．７ｎｍより大きい流体力学的直径を含む。いくつかの実施形態において、上記流体力学的直径は、８．７ｎｍ～１７．７ｎｍである。いくつかの実施形態において、上記流体力学的直径は、１０ｎｍ～１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、上記流体力学的直径は、１２ｎｍ～１４ｎｍである。
いくつかの実施形態において、上記有機性コア足場は、疎水性低分子－リン脂質結合体（ＰＬ４）を含む。いくつかの実施形態において、上記ＰＬ４は、ヘッド基改変リン脂質を含む。いくつかの実施形態において、上記ヘッド基改変リン脂質は、環ひずみアルキン（ｒｉｎｇ－ｓｔｒａｉｎｅｄ ａｌｋｙｎｅ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチルを含む。いくつかの実施形態において、上記リン脂質は、複数の末端官能基を有する上記低分子にカップリングされる。いくつかの実施形態において、上記低分子は、テトラキス（４－アジドフェニル）メタンである。いくつかの実施形態において、上記複数の官能基は、２～６個の官能基である。いくつかの実施形態において、上記複数の官能基は、４個の官能基である。いくつかの実施形態において、上記官能基は、末端アジド（ＳＭ－Ａｚ）である。
他の実施形態において、上記有機性コア足場は、両親媒性ＤＮＡ連結低分子－リン脂質結合体（ＤＮＡ－ＰＬ４）を含む。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、５～１７ヌクレオチド長の２本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、８～１５ヌクレオチド長の２本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、９ヌクレオチド長の２本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記２本鎖ＤＮＡの第１の１本鎖は、リン脂質に連結され、ｓｓＤＮＡ－リン脂質結合体（ｓｓＤＮＡ－ＰＬ）を形成する。いくつかの実施形態において、上記２本鎖ＤＮＡの第１鎖に相補的な上記２本鎖ＤＮＡの第２鎖は、低分子に連結される。いくつかの実施形態において、上記低分子は、四面体低分子であり、上記ＤＮＡに連結された上記低分子は、四面体低分子－ＤＮＡハイブリッド（ＳＭＤＨ４）を形成する。いくつかの実施形態において、上記ＳＭＤＨ４は、ＤＮＡの上記相補的１本鎖の間の水素結合を介して上記ｓｓＤＮＡ－ＰＬに連結される。
いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、アポリポタンパク質または金コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子のものより効率的なコレステロール輸送能を有する。
いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、約５～３０ｎｍ、５～２５ｎｍ、５～２２ｎｍ、５～２０ｎｍ、５～１５ｎｍ、５～１４ｎｍ、５～１３ｎｍ、５～１２ｎｍ、５～１１ｎｍ、５～１０ｎｍ、８～１５ｎｍ、８～１４ｎｍ、８～１３ｎｍ、８～１２ｎｍ、８～１１ｎｍ、８～１０ｎｍ、１０～１２ｎｍ、または１０ｎｍの直径を有する。
いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、上記ＨＤＬ－ＮＰに連結された治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記治療剤は、治療用核酸である。いくつかの実施形態において、上記治療剤は、抗がん剤である。いくつかの実施形態において、上記抗がん剤は、化学療法剤である。いくつかの実施形態において、上記治療剤は、抗炎症剤である。
他の局面において、本発明は、がんを処置するための方法であって、上記方法は、がんを有する被験体に、コアおよび上記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含み、ここで上記コアは、脂質結合体化有機性コア足場を含む球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を、上記がんを処置するために有効な量で投与する工程を包含する方法である。
他の局面において、炎症性障害を有する被験体に、コアおよび上記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含み、ここで上記コアは、脂質結合体化有機性コア足場を含む球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を、上記炎症性障害を処置するために有効な量で投与する工程による、炎症性障害を処置するための方法が提供される。
一局面において、本開示は、本開示の球状ＨＤＬ－ＮＰのうちのいずれかを含む薬学的組成物に関する。
一局面において、本開示は、がんまたは炎症性障害を処置する方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の、本開示の球状ＨＤＬ－ＮＰを含む組成物を投与する工程を包含する方法に関する。
一局面において、本開示は、ＮＦ－ｋＢ活性を低減する方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の、本開示の球状ＨＤＬ－ＮＰのうちのいずれかを含む組成物を投与する工程を包含する方法に関する。
一局面において、本開示は、球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を作製するための方法であって、上記方法は、ｓｓＤＮＡ－リン脂質結合体（ｓｓＤＮＡ－ＰＬ）を調製する工程、四面体低分子－ＤＮＡハイブリッド（ＳＭＤＨ４）を調製する工程であって、ここで上記ｓｓＤＮＡ－ＰＬおよびＳＭＤＨ４は、相補的ＤＮＡ配列を有する工程、上記ｓｓＤＮＡ－ＰＬおよびＳＭＤＨ４を、上記相補的ＤＮＡ配列が互いに塩基対合して、ＤＮＡ－ＰＬコアを形成するようにインキュベートする工程、ならびに上記ＤＮＡ－ＰＬコアリン脂質リポソームおよびアポリポタンパク質に添加して、上記球状ＨＤＬ－ＮＰを生成する工程を包含する方法に関する。
いくつかの実施形態において、上記ｓｓＤＮＡ－ＰＬは、少なくとも９ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、６～１６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＳＭＤＨ４は、少なくとも９ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、９～１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法のうちのいずれかのアポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉである。
一局面において、本開示は、４個の末端アジドを有する四面体低分子コア（テトラキス（４－アジドフェニル）メタン）に連結された１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ ＰＥ）を含む、有機性コア足場に関する。
本発明の限定の各々は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。従って、任意の１つの要素または要素の組み合わせが関わる本発明の限定の各々は、本発明の各局面において包含され得ることが認識される。本発明は、構築の詳細へのその適用および以下の説明に示されるかまたは図面に図示される構成要素の配置において限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、種々の方法で実施または行われることが可能である。本発明の１またはこれより多くの実施形態の詳細は、添付の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲、および図面に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明から、および請求項から明らかである。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の局面をさらに示すために含まれ、これら局面は、本明細書で示される具体的実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１またはこれより多くを参照することによってよりよく理解され得る。明瞭にする目的で、全ての構成要素が、全ての図面において表示されないこともある。図面で例証されるデータが本開示の局面を決して限定しないことは、理解されるべきである。図面において：
図１は、標準逆コレステロール輸送経路を示す。略語： ＦＣ：遊離コレステロール。ＣＥ：コレステリルエステル。ＰＬ：リン脂質。ＬＣＡＴ：レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ。
図２Ａ～２Ｇ。図２Ａ～２Ｃは、ＰＬ４およびＤＮＡ－ＰＬ４コア足場、ならびにＬＣ ＨＤＬ ＮＰ集合体に関する合成スキームを示す。図２Ｄは、質量％（％）によって、天然および合成ＨＤＬの組成を示す。＊Ａｕ ＨＤＬ ＮＰ組成は、以前に公開したデータセットから報告される１８。図２Ｅは、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰおよびヒトＨＤＬに関する円偏光二色性スペクトルを示す。図２Ｆは、それらのコア材料において変動する天然および合成ＨＤＬ種の模式図を示す。図２Ｇは、９８，０００×倍率でのＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰ（９マーＤＮＡ）のＴＥＭ画像を示す。スケールバー＝５０ｎｍ。 図２Ａ～２Ｇ。図２Ａ～２Ｃは、ＰＬ４およびＤＮＡ－ＰＬ４コア足場、ならびにＬＣ ＨＤＬ ＮＰ集合体に関する合成スキームを示す。図２Ｄは、質量％（％）によって、天然および合成ＨＤＬの組成を示す。＊Ａｕ ＨＤＬ ＮＰ組成は、以前に公開したデータセットから報告される１８。図２Ｅは、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰおよびヒトＨＤＬに関する円偏光二色性スペクトルを示す。図２Ｆは、それらのコア材料において変動する天然および合成ＨＤＬ種の模式図を示す。図２Ｇは、９８，０００×倍率でのＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰ（９マーＤＮＡ）のＴＥＭ画像を示す。スケールバー＝５０ｎｍ。 図２Ａ～２Ｇ。図２Ａ～２Ｃは、ＰＬ４およびＤＮＡ－ＰＬ４コア足場、ならびにＬＣ ＨＤＬ ＮＰ集合体に関する合成スキームを示す。図２Ｄは、質量％（％）によって、天然および合成ＨＤＬの組成を示す。＊Ａｕ ＨＤＬ ＮＰ組成は、以前に公開したデータセットから報告される１８。図２Ｅは、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰおよびヒトＨＤＬに関する円偏光二色性スペクトルを示す。図２Ｆは、それらのコア材料において変動する天然および合成ＨＤＬ種の模式図を示す。図２Ｇは、９８，０００×倍率でのＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰ（９マーＤＮＡ）のＴＥＭ画像を示す。スケールバー＝５０ｎｍ。 図２Ａ～２Ｇ。図２Ａ～２Ｃは、ＰＬ４およびＤＮＡ－ＰＬ４コア足場、ならびにＬＣ ＨＤＬ ＮＰ集合体に関する合成スキームを示す。図２Ｄは、質量％（％）によって、天然および合成ＨＤＬの組成を示す。＊Ａｕ ＨＤＬ ＮＰ組成は、以前に公開したデータセットから報告される１８。図２Ｅは、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰおよびヒトＨＤＬに関する円偏光二色性スペクトルを示す。図２Ｆは、それらのコア材料において変動する天然および合成ＨＤＬ種の模式図を示す。図２Ｇは、９８，０００×倍率でのＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰ（９マーＤＮＡ）のＴＥＭ画像を示す。スケールバー＝５０ｎｍ。
図３Ａ～３Ｄ。図３Ａは、ｃＡＭＰ処理Ｊ７７４マクロファージからのＬＣ ＨＤＬ ＮＰ流出Ｈ３－ｃｈｏｌを示す。図３Ｂは、タンデム流出－流入アッセイ（ｔａｎｄｅｍ ｅｆｆｌｕｘ－ｉｎｆｌｕｘ ａｓｓａｙ）からの全ての画分におけるＨ３－ｃｈｏｌの定量を示す。図３Ｃは、タンデムアッセイにおける肝細胞へのコレステロールのパーセント（％）流入を示す。図３Ｄは、ＳＲ－Ｂ１依存性コレステロール流出を示す。統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定を使用して決定した。＊＊ｐ＜０．０１。＊＊＊ｐ＜０．００１。
図４。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰは、フローサイトメトリー（図４Ａ～４Ｂ）および共焦点顕微鏡検査法（図４Ｃ）を介する、３０分間での肝細胞（ＨｅｐＧ２）への蛍光コレステロール（ＮＢＤ－ｃｈｏｌ）の迅速な送達を促進する。統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定を使用して決定した。＊ｐ＜０．０５。＊＊＊ｐ＜０．００１。 図４。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰは、フローサイトメトリー（図４Ａ～４Ｂ）および共焦点顕微鏡検査法（図４Ｃ）を介する、３０分間での肝細胞（ＨｅｐＧ２）への蛍光コレステロール（ＮＢＤ－ｃｈｏｌ）の迅速な送達を促進する。統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定を使用して決定した。＊ｐ＜０．０５。＊＊＊ｐ＜０．００１。
図５Ａ～５Ｂ。図５Ａは、ＬＣＡＴコレステロールエステル化アッセイにおいて遊離コレステロール（ＦＣ）およびコレステロールエステル（ＣＥ）の定量を示す。図５Ｂは、炎症促進性ＮＦ－ｋＢシグナル伝達のＬＣ ＨＤＬ ＮＰ媒介性抑制を示す。統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定を使用して決定した。＊ｐ＜０．０５。＊＊ｐ＜０．０１。
図６は、ＣＰＧに対するテトラキス（４－アジドフェニル）メタンとアルキン官能化９マーＤＮＡとのカップリング反応からの９－ＳＭＤＨ４（配列番号１）の分析的ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。そのトレースは、２６０ｎｍに設定したダイオード検出器のシグナルである。挿入図は、純粋生成物のＭＡＬＤＩ－ＴｏＦスペクトルを示す： ｍ／ｚ＝１２，１４４（１２，１４４．１ 理論値）。
図７は、ＣＰＧに対するテトラキス（４－アジドフェニル）メタンとアルキン官能化１８マーＤＮＡとのカップリング反応からの１８－ＳＭＤＨ４（配列番号２）の分析的ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。そのトレースは、２６０ｎｍに設定したダイオード検出器のシグナルである。挿入図は、純粋生成物のＭＡＬＤＩ－ＴｏＦスペクトルを示す： ｍ／ｚ＝２３，２６４（２３，２６３．７ 理論値）。
図８は、粗製９－ＤＮＡ－脂質（配列番号３）の半分取用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。そのトレースは、２６０ｎｍに設定したダイオード検出器のシグナルである。３３～４２分での純粋９－ＤＮＡ－脂質（配列番号３）を単離し、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦによって同定した（挿入図）： ｍ／ｚ＝３，３４０（３，３４２．４ 理論値）。
図９は、粗製１８－ＤＮＡ－脂質（配列番号４）の半分取用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。そのトレースは、２６０ｎｍに設定したダイオード検出器のシグナルである。３８～４５分での純粋１８－ＤＮＡ－脂質（配列番号４）を単離し、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦによって同定した（挿入図）： ｍ／ｚ＝６，１１５（６，１１８．２ 理論値）。
図１０は、９－ＳＭＤＨ４（配列番号１）および１８－ＳＭＤＨ４（配列番号２）、ならびに９－ＤＮＡ－脂質（配列番号３）結合体および１８－ＤＮＡ－脂質（配列番号４）結合体の変性ＰＡＧＥ－ゲル画像（１５％， ７Ｍ 尿素）を示す。上記ゲル実験を、１×ＴＢＥ緩衝液中、１８０Ｖにおいて１時間行い、次いで、上記ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で染色し、それらの写真を、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）を使用して撮影した。
図１１。ＰＬ４合成スキーム。ＰＬ４コア材料を、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ ＰＥ）と４個の末端アジドを有する四面体低分子コア（テトラキス（４－アジドフェニル）メタン）との銅フリークリックケミストリー結合体化によって合成した（図１１）。代表的反応において、ＤＢＣＯ ＰＥおよびテトラキス（４－アジドフェニル）メタンを各々、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中に０．１重量％で溶解し、ＤＭＦ中、ＤＢＣＯ ＰＥ 対 テトラキス（４－アジドフェニル）メタンの１０：１モル比で混合した。その反応混合物を、ボルテックスおよび浴超音波処理を交互にして３回供し、次いで、ボルテックス下で２４時間、室温で反応させた。次いで、ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析法（図１２）を使用して、得られた反応混合物を特徴づけた。図１２は、ＰＬ４の正確な質量の単一種を示すのみであるので、本発明者らは、部分的にカップリングされた生成物（ＰＬ３、ＰＬ２など）が存在しないと結論づけ、その反応混合物を集合工程に使用する。その集合工程は、大過剰のＤＰＰＣ脂質を添加することを要することから、上記集合におけるその使用の前に、その過剰なＤＢＣＯ ＰＥ分子をＰＬ４コアから除去する必要はない。 図１１。ＰＬ４合成スキーム。ＰＬ４コア材料を、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ ＰＥ）と４個の末端アジドを有する四面体低分子コア（テトラキス（４－アジドフェニル）メタン）との銅フリークリックケミストリー結合体化によって合成した（図１１）。代表的反応において、ＤＢＣＯ ＰＥおよびテトラキス（４－アジドフェニル）メタンを各々、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中に０．１重量％で溶解し、ＤＭＦ中、ＤＢＣＯ ＰＥ 対 テトラキス（４－アジドフェニル）メタンの１０：１モル比で混合した。その反応混合物を、ボルテックスおよび浴超音波処理を交互にして３回供し、次いで、ボルテックス下で２４時間、室温で反応させた。次いで、ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析法（図１２）を使用して、得られた反応混合物を特徴づけた。図１２は、ＰＬ４の正確な質量の単一種を示すのみであるので、本発明者らは、部分的にカップリングされた生成物（ＰＬ３、ＰＬ２など）が存在しないと結論づけ、その反応混合物を集合工程に使用する。その集合工程は、大過剰のＤＰＰＣ脂質を添加することを要することから、上記集合におけるその使用の前に、その過剰なＤＢＣＯ ＰＥ分子をＰＬ４コアから除去する必要はない。
図１２は、ＰＬ４コアのエレクトロスプレーイオン化質量分析法を示す。生成物ｍ／ｚ＝４４０１．６（理論値： ４４０１．７）。
図１３は、陰性染色ＴＥＭを介するＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰの超微細構造特徴付けを示す。画像化を、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ ＴＥＭで行った。挿入図（右端のパネル）は、１２０，０００×倍率である。各画像に表示したスケールバーは、５０～２００ｎｍである。ＴＥＭ直径を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、＞５０粒子の測定によって１０±２ｎｍであることを決定した。
図１４は、１８マーＤＮＡ－ＰＬ４足場を使用する集合試行の超微細構造特徴付けを示す。
図１５は、コア＋ＤＰＰＣ、ａｐｏＡ－１なし（上の列：ＤＮＡ－ＰＬ４コア＋ＤＰＰＣ； 下の列：ＰＬ４コア＋ＤＰＰＣ）のＴＥＭ画像化を示す。注：コア＋タンパク質なしのＤＰＰＣコントロールサンプルの適切な可視化は、タンパク質含有サンプル（２０秒間の染色）と比較して、より長時間（１５分間の染色）の酢酸ウラニル染色を要した。
図１６。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰ集合体およびａｐｏＡ－１オリゴマー化プロフィールの特徴付け。ａｐｏＡ－１は、ＰＬ４およびＤＮＡ－ＰＬ４粒子の両方に関して、脂質結合体コア足場での集合の際に、より高次のオリゴマー化状態をとる。
発明の詳細な説明
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、コレステロールを運び、特定の細胞タイプを標的化し、そして多くの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たす天然の循環するナノ粒子である。結果として、合成ＨＤＬ摸倣物は、有望な治療剤になった。しかし、今日までのアプローチは、最も存在量が豊富なＨＤＬ種であり、特定の臨床上重要である球状ＨＤＬの重要な特徴を再現することができなかった。
天然ＨＤＬは、コレステロールを輸送し、がんおよび心血管疾患において重要な役割を果たす、循環するナノ粒子（直径約８～１３ｎｍ）である。球状ＨＤＬは、最も存在量が豊富なＨＤＬの亜種であり、臨床上特に重要である。しかし、以前のＨＤＬ摸倣物は、無機性のテンプレート材料（例えば、金ナノ粒子）に依拠なしでは球状ＨＤＬ（例えば、球状ＨＤＬコンホメーション）の特徴を再現できなかった。本明細書では、予測外にも、球状ＨＤＬコンホメーションが、脂質結合体化有機性コア足場を有するＨＤＬ様ナノ粒子において達成され得ることを見出した。本開示のこれらＨＤＬ様ナノ粒子は、今までに類を見ない、すなわち、ソフトマテリアルコアを有する球状ＨＤＬ摸倣物である。
本開示のＨＤＬ様ナノ粒子は、新規な脂質結合体化有機性コア足場を使用して、球状ＨＤＬ種を模倣する。上記コア設計モチーフは、いくつかの実施形態においておよそ１０ｎｍ直径であり、それらのサイズ、形状、表面の化学的性質、組成およびタンパク質二次構造においてヒトＨＤＬと似ているソフトコアナノ粒子の集合を促進するために、リン脂質幾何形状を制限しかつ方向付ける。上記ＨＤＬ様ナノ粒子は、サイズ（約１０ｎｍ）、表面の化学的性質（－２０ｍＶ ζ電位）、および円偏光二色性によって決定される場合、ＨＤＬタンパク質二次構造に関して、天然のＨＤＬの構造を模倣する。合成ＨＤＬは、適応症の中でも、心血管疾患およびがんの治療として有望であると示されている。顕著なＨＤＬ機能を再現するために必要とされる合成ＨＤＬ摸倣物の主な特徴のうちの２つは、１）ソフトマテリアルコア、および２）球状コンホメーションである。本開示のＨＤＬ様ナノ粒子は、以前の合成プラットフォーム（これらはいずれも、上記で注記される特徴の両方を再現しない）と比較した場合、優れた治療有効性を可能にするように設計される。
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、血液中で循環し、コレステロールを輸送する動的ナノ粒子である。臨床上、上昇したＨＤＬコレステロールレベルは、アテローム硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）の低減したリスクと関連する１－２。細胞レベルでは、ＨＤＬは、マクロファージおよび肝細胞を標的化して、それぞれ、コレステロールを除去および送達し、これは、炎症およびアテローム硬化性の負荷を低減することが示されている３－４。ＨＤＬとＡＳＣＶＤとの間の有益な関連性、細胞特異的標的化特性、および標的化した薬物送達のためにＨＤＬを使用するという策に起因して、非常な努力が、それらの天然の対応物に似たＨＤＬを合成することに集中されている５。
合成標的として働く多数のＨＤＬ種が、血液中に存在する。未成熟ＨＤＬは、コレステロールが少なく、形状が円板状であり、主に、ＨＤＬを規定するタンパク質である、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（本明細書でａｐｏＡ－Ｉ、ａｐｏＡ－１、および／またはアポリポタンパク質Ａ－１ともいわれ得る）、およびリン脂質からなる。ＨＤＬの成熟形態（これはまた、ａｐｏＡ－Ｉおよびリン脂質の表面層を有する）は、コレステロールおよびコレステリルエステルが豊富であり、より球状の形状と想定される（図１）。球状ＨＤＬは、循環中のＨＤＬの大部分を構成する６－７。しかし、治療として使用されるＨＤＬの合成形態は、専ら未成熟円板状ＨＤＬに似ている８。これは主に、ＨＤＬのこれら組換え形態（ｒＨＤＬ）が、リン脂質およびａｐｏＡ－Ｉを自己集合することによって比較的作製しやすいことが理由である８－１２。ｒＨＤＬを使用する臨床試験は、多少有望であることを示したが、より強くかつ効果的な合成ＨＤＬを作製することに関して、改善の余地がかなりあることを明らかにしている１０－１２。
球状ＨＤＬ種は、低減したＡＳＣＶＤと最も相関する１３。しかし、これらのＨＤＬは、円板状ＨＤＬをコレステロール含有およびコレステリルエステル含有球状ＨＤＬへと成熟させるために必要とされる酵素による工程に起因して、より合成しがたい。以前の研究は、無機性ナノ粒子をテンプレートとして使用することによって、これらの生物学的成熟工程を回避しようと試みた１４－１６。そのテンプレートは、リン脂質およびａｐｏＡ－Ｉで官能化され得、ＨＤＬ摸倣物のサイズを＜１５ｎｍ直径へと成功裡に制限し得る１７。しかし、これらの材料は、天然球状ＨＤＬ、すなわち、コレステロールおよびコレステリルエステルを動的に搭載する（ｌｏａｄｉｎｇ）および降ろす（ｏｆｆ－ｌｏａｄｉｎｇ）ことができる強いソフトマテリアルコアの極めて重要な特徴を再現しない。無機性テンプレート材料とは別に、ソフトコア円板状ＨＤＬ様粒子はまた、両親媒性ペプチドを使用して合成されている２２。
本明細書では、脂質結合体化コア足場を使用するＨＤＬ模倣ナノ粒子（ＬＣ ＨＤＬ ＮＰ）の合成が、２工程プロセスにおいて達成される：第１に、上記コア足場を合成および精製する；第２に、上記粒子を、上記コア足場、遊離リン脂質、および上記ＨＤＬを規定するタンパク質であるアポリポタンパク質Ａ１（ａｐｏ－Ａ１）の超分子集合を介して製作する。種々の脂質結合体化有機性コアは、理論的には、粒子集合のために使用され得る。本明細書では、３つの異なる有機性コア足場を使用する成功裡の粒子製作を示す。具体的には、四面体低分子－リン脂質ハイブリッド（ＰＬ４といわれる）および２つの異なる長さの四面体ｓｓＤＮＡ－リン脂質－低分子ハイブリッド（ＤＮＡ－ＰＬ４といわれる）が使用される。
本開示は、脂質結合体化コア足場を使用する成熟ヒトＨＤＬ（ＬＣ ＨＤＬ ＮＰ）の構造的および機能的特性を有する球状ＨＤＬ様ナノ粒子の合成のための方法を提供する。サイズおよび組成において変動するが、同じ四面体幾何形状の３つの有機性足場を、調査した。第１の足場は、銅フリークリックケミストリーを使用して合成した高度に疎水性の低分子－リン脂質結合体（ＰＬ４）である。具体的には、環ひずみアルキンを有するヘッド基改変リン脂質、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチルを、テトラキス（４－アジドフェニル）メタン（４個の末端アジドを有する低分子（ＳＭ－Ａｚ４））にクリックカップリングした（図２Ａおよび図１１～１２）。ＰＬ４コアとは対照的に、第２の（９－ＤＮＡ－ＰＬ４）および第３の（１８－ＤＮＡ－ＰＬ４）コア足場は、異なるＤＮＡリンカー長（９マー 対 １８マーのｄｓＤＮＡ）を有する両親媒性ＤＮＡ連結ＰＬ４コアである（図２Ｂ）。親水性ＤＮＡリンカーは、水性溶液中での上記コアの溶解度を増強する一方で、外側に向いたリン脂質テール基は、ａｐｏＡ－１およびリン脂質との疎水性相互作用を可能にする。これらのコアのサイズは、異なる長さのＤＮＡリンカーを組み込むことによって容易に調節され得る。ＤＮＡ－ＰＬ４コアを、２工程様式で合成した（本明細書中の合成の節を参照のこと）。第１に、ＤＮＡ－リン脂質結合体（ｓｓＤＮＡ－ＰＬ）、および四面体低分子－ＤＮＡハイブリッド（ＳＭＤＨ４）を合成した（表２）。第２に、塩基対合される相補的な配列を有するｓｓＤＮＡ－ＰＬおよびＳＭＤＨ４を、ハイブリダイズさせて、最終のＤＮＡ－ＰＬ４コアを得た（図２Ｂおよび図６～９）。
新生ＨＤＬが球状ＨＤＬへと成熟する機構は、遊離コレステロールの酵素によるエステル化（酵素、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）によって血液中で行われる反応）を支持することによる。本明細書では、ＰＬ４およびＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰの両方が、ＬＣＡＴ媒介性エステル化を支持し得ることを見出した（図５Ａ）。しかし、ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰは、結合したコレステロールのうちの８７％をコレステリルエステルへと変換する、Ａｕ ＨＤＬ ＮＰおよびＤＮＡ－ ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰを超える、実質的により大きいエステル化能を示した。この結果は、コレステリルエステルの効率的充填を可能にする、金（Ａｕ）およびＤＮＡ－ＰＬ４コアを超えるＰＬ４コアの増大した可撓性および疎水性に起因するようである。
本明細書で使用される場合、用語「ＨＤＬ様（ＨＤＬ－ｌｉｋｅ）」、「ＨＤＬ摸倣物（ＨＤＬ－ｍｉｍｅｔｉｃ）」および「ＨＤＬ摸倣物（ＨＤＬ ｍｉｍｉｃ）」とは、合成ＨＤＬ－ＮＰをいうために交換可能に使用される。
いくつかの局面において、本開示は、コアおよび上記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含み、ここで上記コアは、脂質結合体化有機性コア足場を含む球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を提供する。上記シェルは、図１に模式的に示されるように、上記有機性コア足場の構成要素に、１またはこれより多くの点において連結されている脂質シェルであり得る。いくつかの実施形態において、上記シェルは、脂質二重層または単層である。
実施形態の１セットにおいて、本明細書で記載される構造体またはその一部（例えば、構造体のシェル）は、１またはこれより多くの天然または合成の脂質または脂質アナログ（すなわち、親油性分子）を含む。１またはこれより多くの脂質および／または脂質アナログは、単一層または多数層（例えば、二重層）の構造を形成し得る。多数層が形成されるいくつかの場合には、上記天然または合成の脂質または脂質アナログは、（例えば、異なる層間で）互いに組み合わさる（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅ）。天然または合成の脂質または脂質アナログの非限定的な例としては、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質およびポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合から得られる）、ならびにステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合から得られる）が挙げられる。
実施形態の１つの特定のセットにおいて、本明細書で記載される構造体は、１またはこれより多くのリン脂質を含む。上記１またはこれより多くのリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、レシチン、β，γ－ジパルミトイル－α－レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、Ｎ－（２，３－ジ（９－（Ｚ）－オクタデセニルオキシ））－プロパ－１－イル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル－オレオイル－ホスファチジルコリン、ジ－ステアロイル－ホスファチジルコリン、ステアロイル－パルミトイル－ホスファチジルコリン、ジ－パルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン、ジ－ステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン、ジ－ミリストイル－ホスファチジルセリン、ジ－オレイル－ホスファチジルコリン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチオエタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられ得る。いくつかの場合には、構造体のシェル（例えば、二重層）は、５０～２００の天然または合成の脂質または脂質アナログ（例えば、リン脂質）を含む。例えば、上記シェルは、例えば、構造体のサイズに依存して、約５００未満、約４００未満、約３００未満、約２００未満、または約１００未満の天然または合成の脂質または脂質アナログ（例えば、リン脂質）を含み得る。
非リン含有脂質がまた、使用され得る（例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン（ｄｏｃｅｃｙｌａｍｉｎｅ）、アセチルパルミテート、および脂肪酸アミド）。他の実施形態において、他の脂質（例えば、脂肪）、油、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ）、グリセリド（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド）は、本明細書で記載される構造体の一部を形成するために使用され得る。
本明細書で記載される構造体の一部（例えば、シェルまたはナノ構造の表面）は、その構造体に疎水性を必要に応じて付与する１またはこれより多くのアルキル基（例えば、アルカン含有、アルケン含有、またはアルキン含有種）を必要に応じて含み得る。「アルキル」基とは、飽和脂肪族基であって、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換されたシクロアルキル基、およびシクロアルキル置換されたアルキル基を含むものに言及する。上記アルキル基は、種々の炭素数（例えば、Ｃ２～Ｃ４０の間）を有し得、いくつかの実施形態においては、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ２５、Ｃ３０、またはＣ３５より多くてもよい。いくつかの実施形態において、直鎖または分枝鎖のアルキルは、その骨格の中に、３０個またはこれより少ない炭素原子、およびいくつかの場合には、２０個またはこれより少ない炭素原子を有し得る。いくつかの実施形態において、直鎖または分枝鎖のアルキルは、その骨格の中に、１２個もしくはこれより少ない炭素原子（例えば、直鎖に関してはＣ１～Ｃ１２、分枝鎖に関してはＣ３～Ｃ１２）、６個もしくはこれより少ない、または４個もしくはこれより少ない炭素原子を有し得る。同様に、シクロアルキルは、それらの環構造の中に３～１０個の炭素原子、またはその環構造の中に５個、６個もしくは７個の炭素を有し得る。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、シクロブチル、ヘキシル、シクロヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本開示の球状ＨＤＬ－ＮＰは、アポリポタンパク質をさらに含む。上記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ（例えば、ａｐｏ Ａ－Ｉ、ａｐｏ Ａ－ＩＩ、ａｐｏ Ａ－ＩＶ、およびａｐｏ Ａ－Ｖ）、アポリポタンパク質Ｂ（例えば、ａｐｏ Ｂ４８およびａｐｏ Ｂ１００）、アポリポタンパク質Ｃ（例えば、ａｐｏ Ｃ－Ｉ、ａｐｏ Ｃ－ＩＩ、ａｐｏ Ｃ－ＩＩＩ、およびａｐｏ Ｃ－ＩＶ）、ならびにアポリポタンパク質Ｄ、Ｅ、およびＨであり得る。具体的には、ａｐｏ Ａ１、ａｐｏ Ａ２、およびａｐｏ Ｅは、コレステロールおよびコレステリルエステルを代謝のために肝臓へと移動させることを促進し、本明細書で記載される構造体の中に含めるために有用であり得る。さらにまたは代わりに、本明細書で記載される構造体は、アポリポタンパク質（例えば、上記で記載されるもの）の１またはこれより多くのペプチドアナログを含み得る。当然のことながら、他のタンパク質（例えば、非アポリポタンパク質）がまた、本明細書で記載されるナノ構造体の中に含められ得る。いくつかの実施形態において、上記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉである。
上記ＨＤＬ－ＮＰは、有機性コア足場を有する。有機性コア足場は、本明細書で使用される場合、３次元構造、および球状の形状において脂質層を組織化しかつ保持するために十分な電荷を有する非金属製材料のソフトコアに言及する。本明細書における「球状の」形状または構造は、丸いまたは球状様の構造を有する構造体に言及する。その構造は、完全に丸いまたは正確な球である必要はないが、むしろおよそ球状の形状である。
いくつかの実施形態において、上記有機性コア足場は、疎水性低分子－リン脂質結合体（ＰＬ４）を含む。上記疎水性低分子－リン脂質結合体は、リン脂質に連結され得る任意の低分子を含む。いくつかの実施形態において、上記低分子は、テトラキス（４－アジドフェニル）メタンである。
いくつかの実施形態において、上記リン脂質は、ヘッド基改変リン脂質であり得る。いくつかの実施形態において、上記ヘッド基改変リン脂質は、環ひずみアルキン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチルを含む。
上記低分子は、上記リン脂質に直接連結されてもよいし、官能基の使用を介して連結されてもよい。上記官能基は、上記リン脂質を上記低分子に官能化するために使用され得る任意の適切な末端基を含み得る（例えば、アミノ基（例えば、不飽和または飽和アミン）、アミド基、アジド、イミン基、カルボキシル基、またはスルフェート基）。場合によっては、上記官能基は、少なくとも第２の末端基を含む。他の実施形態において、上記第２の末端基は、別の官能基に共有結合し得る反応性の基であり得る。いくつかの実施形態において、上記リン脂質は、複数の末端官能基を有する低分子にカップリングされる。いくつかの実施形態において、上記複数の官能基は、２～６個の官能基である。いくつかの実施形態において、上記複数の官能基は、４個の官能基である。いくつかの実施形態において、上記官能基は、末端アジドである（ＳＭ－Ａｚ）。
他の実施形態において、上記有機性コア足場は、両親媒性ＤＮＡ連結低分子－リン脂質結合体（ＤＮＡ－ＰＬ４）を含む。上記ＤＮＡ（または任意の他の核酸（改変されたおよび天然に存在する核酸を含む））は、上記リン脂質と低分子との間に特有の連結を提供する。ＤＮＡを使用することは有利である。なぜなら上記ＤＮＡのサイズ、および従って、上記コアは、上記ＤＮＡ鎖の長さを変更することによって容易に制御され得るからである。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、５～５０ヌクレオチド長である。他の実施形態において、上記ＤＮＡは、５～４５、５～４０、５～３５、５～３０、５～２５、５～２０、５～１７、５～１６、５～１５、５～１４、５～１３、５～１２、５～１１、５～１０、５～９、５～８、５～７、６～４５、６～４０、６～３５、６～３０、６～２５、６～２０、６～１７、６～１６、６～１５、６～１４、６～１３、６～１２、６～１１、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～４５、７～４０、７～３５、７～３０、７～２５、７～２０、７～１７、７～１６、７～１５、７～１４、７～１３、７～１２、７～１１、７～１０、７～９、７～８、８～４５、８～４０、８～３５、８～３０、８～２５、８～２０、８～１７、８～１６、８～１５、８～１４、８～１３、８～１２、８～１１、８～１０、８～９、９～４５、９～４０、９～３５、９～３０、９～２５、９～２０、９～１７、９～１６、９～１５、９～１４、９～１３、９～１２、９～１１、または９～１０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、２本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、８～１５ヌクレオチド長の２本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡは、９ヌクレオチド長の２本鎖オリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、上記２本鎖ＤＮＡの第１の１本鎖は、リン脂質に連結され、ｓｓＤＮＡ－リン脂質結合体（ｓｓＤＮＡ－ＰＬ）を形成する。いくつかの実施形態において、上記２本鎖ＤＮＡの第１鎖に相補的な上記２本鎖ＤＮＡの第２鎖は、低分子に連結される。いくつかの実施形態において、上記低分子は、四面体低分子であり、上記ＤＮＡに連結された低分子は、四面体低分子－ＤＮＡハイブリッド（ＳＭＤＨ４）を形成する。いくつかの実施形態において、上記ＳＭＤＨ４は、ＤＮＡの相補的な１本鎖の間での水素結合を介して上記ｓｓＤＮＡ－ＰＬに連結される。
いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、上記ＨＤＬ－ＮＰに連結された治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記治療剤は、治療用核酸である。いくつかの実施形態において、上記治療剤は、抗がん剤である。いくつかの実施形態において、上記抗がん剤は、化学療法剤である。いくつかの実施形態において、上記治療剤は、抗炎症剤である。
治療用核酸は、例えば、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ配列、治療用タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない任意の核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、治療用核酸は、処理されてもよいし、化学的に改変されてもよい。例えば、治療用核酸は、ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間連結を含み得る（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホジエステル、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、またはホスフェートエステル連結）。これらのヌクレオチド間連結は、いくつかの実施形態において、増大した安定性を付与し得る。核酸安定性はまた、３’－デオキシチミジンまたは２’－置換されたヌクレオチド（例えば、アルキル基で置換される）を、合成の間に核酸に組み込むことによって、または上記核酸をフェニルイソウレア（ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｕｒｅａ）誘導体として提供することによって、または他の分子（例えば、アミノアクリジンまたはポリリジン）を上記核酸の３’末端に連結させることによって、増大され得る。ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの改変は、オリゴヌクレオチド全体に、または核酸の選択された領域、例えば、５’および／または３’末端に存在し得る（例えば、メチル化による）。
ある特定の実施形態において、上記抗がん剤は化学療法剤（例えば、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｉｃａｎ）およびドキソルビシン）である。
一局面において、本開示は、２～６個の末端アジドを有する四面体低分子コア（テトラキス（４－アジドフェニル）メタン）に連結された１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ ＰＥ）を含む有機性コア足場に関する。いくつかの実施形態において、上記構造は、４個の末端アジドを有する。
本開示のＨＤＬ－ＮＰのサイズ、物理的特性および機能的特性は、天然に存在するＨＤＬ－ＮＰのものに類似であり、他の合成ＨＤＬ－ＮＰとは異なる。これらの特性としては、例えば、球状の形状、表面の化学的性質、サイズ、流体力学的直径、ζ電位、コレステロール流出、コレステロール送達、および治療上の機能（例えば、炎症の抑制）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本開示の球状ＨＤＬ－ＮＰは、流体力学的直径に基づいて評価され得る。上記球状ＨＤＬ－ＮＰの流体力学的直径は、天然に存在するＨＤＬ－ＮＰのものに類似であり、他の合成ＨＤＬ－ＮＰとは異なる。流体力学的直径は、測定されている粒子のものと同じ様式で拡散する仮定の硬い球のサイズを評価し、動的な水和した／溶媒和した粒子の見かけ上のサイズを示す粒子の拡散特性の指標を提供する。それは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定され得る。いくつかの実施形態において、上記流体力学的直径は、８．７ｎｍより大きい。いくつかの実施形態において、上記流体力学的直径は、８．７ｎｍ～１７．７ｎｍである。いくつかの実施形態において、上記流体力学的直径は、１０ｎｍ～１５ｎｍである。いくつかの実施形態において、上記流体力学的直径は、１２ｎｍ～１４ｎｍである。
本開示の球状ＨＤＬ様ナノ粒子は、例えば、約５００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約１００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約７５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約４０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約３５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約３０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約１５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、または約５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、最大断面寸法（または、ときおり、最小断面寸法）を有する直径を有し得る。いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、約５～３０ｎｍ、５～２５ｎｍ、５～２２ｎｍ、５～２０ｎｍ、５～１５ｎｍ、５～１４ｎｍ、５～１３ｎｍ、５～１２ｎｍ、５～１１ｎｍ、５～１０ｎｍ、８～１５ｎｍ、８～１４ｎｍ、８～１３ｎｍ、８～１２ｎｍ、８～１１ｎｍ、８～１０ｎｍ、１０～１２ｎｍ、または１０ｎｍの直径を有する。
本開示のＨＤＬ様ナノ粒子は、例えば、約３００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約１００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約７５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約４０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約３５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約３０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約２０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、約１５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、または約５ｎｍ未満もしくはこれに等しい、最大断面寸法（または、ときおり、最小断面寸法）を有するコアを有し得る。いくつかの場合には、上記コアは、約１：１より大きい、３：１より大きい、または５：１より大きいアスペクト比を有する。本明細書で使用される場合、「アスペクト比」とは、長さおよび幅が互いに対して垂直で測定され、その長さは、最長の直線的に測定される寸法をいう場合の長さまたは幅の比に言及する。
いくつかの実施形態において、上記シェルは、無機性コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子よりヒトＨＤＬに近いζ電位を有する。いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、金コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子よりヒトＨＤＬに近いζ電位を有する。いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、－１６～２６ｍＶのζ電位を有する。いくつかの実施形態において、上記ＨＤＬ様ナノ粒子のζ電位は、約－２０ミリボルト（ｍＶ）である。いくつかの実施形態において、上記ＨＤＬ様ナノ粒子のζ電位は、－１０ｍＶ、－１２ｍＶ、－１４ｍＶ、－１６ｍＶ、－１８ｍＶ、－２０ｍＶ、－２２ｍＶ、－２４ｍＶ、－２６ｍＶ、および－３０ｍＶからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記ＨＤＬ様ナノ粒子のζ電位は、－２０ｍＶより大きい。いくつかの実施形態において、上記ζ電位は、－２０ｍＶ未満である。いくつかの実施形態において、上記ζ電位は、ヒトＨＤＬのζ電位である。ζ電位は、本明細書で開示される方法を含め、当該分野で公知の方法を使用して評価され得る。
いくつかの実施形態において、本開示のＨＤＬ様ナノ粒子は、ペプチドベースの足場材料を含まない。
本開示の組成物および方法は、球状ＨＤＬの正規の合成の機能的模倣物に向かう、重要な前進を示す。本開示のＨＤＬ様ナノ粒子（合成粒子または合成ＨＤＬ粒子またはＨＤＬ－ＮＰともいわれる）は、マクロファージから（または脂質搭載マクロファージから）のコレステロール流出、肝細胞へのコレステロール送達、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の支持、および炎症の抑制を含む顕著なHDL機能を実行し得る。従って、いくつかの実施形態において、上記球状ＨＤＬ－ＮＰは、アポリポタンパク質または金コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子のものより効率的なコレステロール輸送能を有する。コレステロール輸送能は、インビトロアッセイ（例えば、本明細書で記載されるアッセイ）を使用して評価され得る。上記コレステロール輸送能は、コレステロール輸送の標準的な公知の値に対して、または金コアを有する合成ＨＤＬ－ＮＰ粒子もしくはＡＰＯ－Ａ１のような陰性コントロールに対して、または天然に存在するＨＤＬ－ＮＰのような陽性コントロールに対して、評価され得る。
従って、本開示の組成物および方法は、がん治療、炎症性疾患、心血管疾患治療、骨疾患治療、および免疫疾患治療が挙げられるが、これらに限定されない適用において使用され得る。
治療としての合成ＨＤＬの使用は、非常に有望である。以前のまたは現場で進行中の臨床試験は、再構成されたＨＤＬが、ヒトにおいて安全に注射され得ることを示しており、心血管疾患の状況において、それほど重要ではない臨床上の利益を示している。しかし、より強力な効果を発揮し得る合成ＨＤＬの新規なアプローチが必要である。本開示のＨＤＬ様ナノ粒子は、球状ＨＤＬのソフトコア摸倣物を含むそれらの新規な要素に起因して、クリニックにおいて合成ＨＤＬの実質的に増強された治療効果の強力な候補を示す。
マクロファージＮＦ－ｋＢ活性によって促進される炎症は、疾患進行を駆動し、罹病率および死亡率を増大させるＡＳＣＶＤの特質である。本明細書では、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰが炎症を低減する能力を評価するために、ヒト単球レポーター細胞株（ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ）を、リポポリサッカリドで処理して、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰまたはａｐｏＡ－１コントロールでの処理の前に、ＮＦ－ｋＢ活性を刺激した。ａｐｏＡ－１単独は、ＮＦ－ｋＢ活性を低減する能力を示さなかったが、ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰおよびＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰは両方とも、用量依存性様式において、１５０ｎＭのタンパク質濃度でＮＦ－ｋＢ活性をそれぞれ３１％および１６％低減した（図５Ｂ）。
いくつかの局面において、本発明は、心血管疾患を処置するための方法である。心血管疾患は、血管内皮細胞機能不全であり、ある特定の症状が始まる（従来のようにまたは上記のように、心臓および血管系に、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、ゴジヒョル（ｇｏｊｉｈｙｅｏｌ）、冠動脈性心疾患（心臓発作）、脳血管疾患（脳卒中、認知症）、末梢血管疾患、不整脈、心不全、うっ血性心疾患、心疾患が挙げられ、少なくとも心臓および血管の名称に関して、それらが挙げられるが、限定されない）。心血管疾患の主要因子のうちのいくつかとしては、遺伝的因子、生活習慣、および糖尿病の合併症が挙げられるが、これらに限定されない。
アテローム性動脈硬化症は、心筋に酸素の豊富な血液を供給する動脈が、コレステロールが豊富なプラークで次第に狭くなる機構である。これらのプラークは成長し、時間を経て硬くなり、血流を低減し、破れ、心臓発作を引き起こす。冠状動脈を支え、開いたままにしておく介入（例えば、血管形成術および金属ステント）は、非常に一般的である。これらの治療に伴う1つの極めて重大な問題は、新生内膜過形成（それによって、平滑筋細胞は、ステント中で増殖し、血管を再び狭くする（すなわち、再狭窄））といわれる血管リモデリングに起因する不全である。細胞増殖を防止する薬物でコーティングされている薬物溶出性ステント（ＤＥＳ）は、平滑筋細胞の増殖を制限することによって血管再狭窄を低減する；しかし、その薬物は、血管を天然に裏打ちし、血餅形成を防止する内皮細胞の増殖をも阻害する。患者は、強力な薬物療法を継続したまま、血餅を防止しなければならず、生命を脅かす出血性の合併症に罹りやすくする。
本発明は、血管介入の成功率を改善する、およびアテローム硬化性プラークの破れによって引き起こされる長期の損傷を低減することにおいて非常な価値を有する。本明細書で使用される場合、心血管疾患としては、動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、虚血、内皮機能不全、特に、血管弾性に影響を及ぼす機能不全、再狭窄、血栓症、アンギナ、高血圧症、心筋症、高血圧性心疾患、心不全、肺性心、心律動異常、心内膜炎、炎症性心肥大、心筋炎、心筋梗塞、心臓弁膜症、脳卒中および脳血管疾患、大動脈弁狭窄、うっ血性心不全、および末梢動脈疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、心血管疾患と診断されたかまたはそのリスクにある被験体において、心血管パラメーターを正常範囲へと回復および／または改善する。心血管パラメーターの正常範囲としては、約６５～２４０ｍＬの拡張終期容積（ＥＤＶ）、約１６～１４３ｍＬの収縮終期容積（ＥＳＶ）、約５５～１００ｍＬの１回拍出量、約５５～７０％の駆出率、約６０～１００ｂｐｍの心拍数、および／または約４．０～８．０Ｌ／分の心拍出量が挙げられるが、これらに限定されない。
他の局面において、炎症性障害を有する被験体に、コアおよび上記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含み、ここで上記コアは、脂質結合体化有機性コア足場を含む球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を、上記炎症性障害を処置するために有効な量で投与することによる、炎症性障害を処置する方法が提供される。
本発明の組成物はまた、炎症性疾患を処置するために使用され得る。炎症性疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：尋常性ざ瘡、喘息、自己免疫疾患（例えば、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群、自己免疫性末梢ニューロパシー、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌腺症候群（autoimmunepolyendocrine syndrome）、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性じんま疹、自己免疫性ぶどう膜炎、バロー同心円硬化症（Balo concentricsclerosis）、ベーチェット病、バージャー病、ビッカースタッフ脳炎（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ’ｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性再発性多病巣性骨髄炎、慢性閉塞性肺疾患、チャーグ－ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、接触性皮膚炎、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血病破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、ヘルペス状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん性皮膚強皮症、ドレスラー症候群、薬物誘導性ループス、円板状エリテマトーデス、湿疹、子宮内膜症、腱付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維形成異常、線維化肺胞炎、胃炎、消化管の類天疱瘡（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、化膿性汗腺炎、ヒューズ－ストーヴィン症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、川崎病、ランバート・イートン筋無力症症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病、全身性エリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、限局性強皮症、ムーカ・ハーベルマン病、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、神経性筋緊張病、眼瘢痕性類天疱瘡、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性ニューロパチー、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、スイート症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少症、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化型結合組織病、未分化型脊椎関節症、白斑、およびウェジナー肉芽腫症，セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤腹膜炎、再灌流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植片拒絶、血管炎、間質性膀胱炎、および変形性関節症。
他の局面において、本発明は、がんを処置するための方法であって、上記方法は、がんを有する被験体に、コアおよび上記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含み、ここで上記コアは、脂質結合体化有機性コア足場を含む球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を、上記がんを処置するために有効な量で投与する工程を包含する方法である。
本発明の組成物を使用して処置され得る他の状態は、がんを含む。がんは、調節されない細胞増殖、悪性腫瘍の形成、および身体の近い部分への侵襲によって概して特徴づけられる。がんはまた、リンパ系または血流を通じて、身体のより遠隔部分へと拡がり得る。がんは、喫煙、ある特定の感染症、放射線、運動不足、肥満、および／または環境汚染物質に起因する遺伝子損傷の結果であり得る。がんはまた、細胞内の既存の遺伝的欠陥が遺伝に起因して疾患を引き起こす結果であり得る。任意の顕著な症状が出現する前にがんを検出するためにスクリーニングが使用されてもよいし、処置は、がんを発生させるリスクがより高い者（例えば、がんの家族歴を有する人々）に与えられてもよい。がんのスクリーニング技術の例としては、身体検査、血液または尿検査、医用画像化、および／または遺伝子検査が挙げられるが、これらに限定されない。がんの非限定的な例としては、膀胱がん、乳がん、結腸および直腸がん、子宮内膜がん、腎臓または腎細胞がん、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、消耗病、および甲状腺がんが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるナノ構造体は、スカベンジャーレセプタークラスＢタイプＩ（ＳＲ－ＢＩ）を発現または過剰発現するがんを処置するために有用である。ＳＲ－ＢＩを発現または過剰発現するがんの非限定的な例としては、ヒト前立腺がん、乳がん、および腎細胞癌が挙げられる。ＳＲ－ＢＩを過剰発現するがんおよびがん細胞株のさらなる非限定的な例は、Ｒａｊｏｒａら． Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． （２０１６） ７：３２６に列挙される。本明細書で記載されるように、用語「過剰発現」または「増大した発現」とは、参照細胞（例えば、非がん細胞またはＳＲ－ＢＩを過剰発現しないがん細胞）と比較した場合、所定の細胞、細胞タイプまたは細胞状態において所定の遺伝子生成物の発現の増大したレベルに言及する。いくつかの実施形態において、上記がん細胞は、ＳＲ－ＢＩの任意のレベルを発現する。
上記ナノ構造体はまた、自己免疫疾患または障害を処置および防止するために有用である。自己免疫疾患または障害は、被験体自身の抗体が宿主組織と反応するか、または免疫エフェクターＴ細胞が、内因性自己ペプチドに対して自己反応性でありかつ組織の破壊を引き起こす疾患のクラスである。従って、免疫応答は、被験体自身の抗原（自己抗原といわれる）に対して高められる。自己免疫性疾患または障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、および自己免疫性糖尿病。
有効量を含む組成物は、予防的または治療的処置のために投与され得る。予防的適用において、組成物は、コレステロールの上昇したレベルと関連した障害、心血管疾患、過剰増殖性疾患（例えば、がん）、炎症性疾患、脂質異常症、およびコレステロールと関連する他の病的状態の発生に対する臨床的に決定された素因または増大した感受性を有する患者に投与され得る。本発明の組成物は、上記臨床的疾患の発生を遅らせる、低減する、または好ましくは防止するために十分な量で、患者（例えば、ヒト）に投与され得る。治療的適用において、組成物は、心血管疾患、過剰増殖性疾患（例えば、がん）、炎症性疾患、およびコレステロールと関連する他の病的状態に既に罹患している患者（例えば、ヒト）に、上記状態およびその合併症を治癒するか、またはその症状を少なくとも部分的に停止させるために十分な量で投与される。この目的を達成するために適した量は、疾患または医学的状態と関連するいくつかの症状を実質的に改善するために十分な化合物の量である、「治療上有効な用量として定義される。薬剤または組成物の治療上有効な量は、疾患または状態を治癒することは要求されないが、疾患または状態の発生が遅らされる、妨げられる、もしくは防止される、または上記疾患または状態の症状が改善される、上記疾患もしくは状態の期間が変化する、または例えば、あまり重篤でない、または回復が個体において加速されるように、上記疾患または状態の処置を提供する。
一局面において、本開示は、ＮＦ－ｋＢ活性を低減する方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の、本開示の球状ＨＤＬ－ＮＰのうちのいずれかを含む組成物を投与する工程を包含する方法に関する。
本明細書で使用される場合、「被験体」または「患者」とは、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）に言及する。被験体または患者の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはモルモット）が挙げられる。概して、本発明は、ヒトでの使用に指向される。
いくつかの実施形態において、本開示のＨＤＬ様ナノ粒子は、薬学的組成物中に存在する。これらの「薬学的組成物」または「薬学的に受容可能な」組成物は、１またはこれより多くの薬学的に受容可能なキャリア、添加剤、および／または希釈剤と一緒に製剤化された、本明細書で記載される構造体のうちの1またはこれより多くの治療上有効な量を含み得る。本明細書で記載される薬学的組成物は、敗血症または他の関連する疾患を処置するために有用であり得る。本明細書で記載される任意の適切な構造体が、図面に関連して記載されるものを含め、このような薬学的組成物において使用され得ることは、理解されるべきである。
上記薬学的組成物は、以下のために適合されたものを含め、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化され得る：経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の液剤または懸濁剤）、錠剤（例えば、口内、舌下、および全身吸収のために標的化されるもの）、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への適用のためのパスタ剤；非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは硬膜外注射による（例えば、滅菌液剤または懸濁剤として）、または徐放性製剤；局所投与、例えば、クリーム剤、軟膏剤、または放出制御パッチまたは皮膚、肺、もしくは口腔に適用されるスプレーとして；腟内にもしくは直腸内に、例えば、ペッサリー、クリーム剤もしくはフォーム剤として；舌下に；眼に；経皮的に；または鼻に、肺および他の粘膜表面に。
語句「薬学的に受容可能な」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触した状態での使用に適切であり、合理的な利益／リスク比と釣り合っている、それらの構造、材料、組成物、および／または投与形態に言及するために本明細書で使用される。
語句「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書で使用される場合、本発明の化合物を１つの器官または身体の一部から、別の器官または身体の一部へと運ぶかまたは輸送することに関与する、薬学的に受容可能な材料、組成物またはビヒクル（例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または材料を被包する溶媒）を意味する。各キャリアは、製剤の他の成分と適合性であり、かつ患者に対して有害でないという意味において「受容可能」でなければならない。薬学的に受容可能なキャリアとして働き得る材料のいくつかの例としては、以下が挙げられる：糖（例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース）；デンプン（例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；粉末化トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤（例えば、カカオ脂および坐剤用ワックス）；油（例えば、ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油）；グリコール（例えば、プロピレングリコール）；ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）；エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル）；アガー；緩衝化剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張性食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝化溶液；ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；ならびに薬学的製剤中で使用される他の非毒性適合性物質。
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）ならびに着色剤、放出剤（release agent）、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤がまた、組成物中に存在し得る。
薬学的に受容可能な抗酸化剤の例としては、以下が挙げられる：水溶性抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；油溶性抗酸化剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなど）；および金属キレート剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）。
本明細書で記載される構造体は、経口投与され得る、非経口投与され得る、皮下投与され得る、および／または静脈内投与され得る。ある特定の実施形態において、構造体および薬学的調製物は、経口投与される。他の実施形態において、上記構造体または薬学的調製物は、静脈内投与される。代替の投与経路としては、舌下投与、筋肉内投与および経皮的投与が挙げられる。
一局面において、本開示は、球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を作製するための方法であって、上記方法は、ｓｓＤＮＡ－リン脂質結合体（ｓｓＤＮＡ－ＰＬ）を調製する工程、四面体低分子－ＤＮＡハイブリッド（ＳＭＤＨ４）を調製する工程であって、ここで上記ｓｓＤＮＡ－ＰＬおよびＳＭＤＨ４は、相補的ＤＮＡ配列を有する工程、上記ｓｓＤＮＡ－ＰＬおよびＳＭＤＨ４を、上記相補的ＤＮＡ配列が互いに塩基対合して、ＤＮＡ－ＰＬコアを形成するようにインキュベートする工程、ならびに上記ＤＮＡ－ＰＬコアリン脂質リポソームおよびアポリポタンパク質に添加して、上記球状ＨＤＬ－ＮＰを生成する工程、を包含する方法に関する。
いくつかの実施形態において、上記ｓｓＤＮＡ－ＰＬは、少なくとも９ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、６～１６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＳＭＤＨ４は、少なくとも９ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、９～１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法のうちのいずれかのアポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉである。
さらに作り込むことなく、当業者は、上記の記載に基づいて、その完全な程度まで本発明を利用し得ると考えられる。従って、以下の具体的実施形態は、例証に過ぎないと解釈されるべきであり、本開示の残りをどのようにしても限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で言及される目的または主題に関して参考として援用される。
本明細書中の他の箇所で記載されるように、ＤＮＡ－ＰＬ４コアを、２工程様式で合成した（本明細書中の合成の節を参照のこと）。第１に、ＤＮＡ－リン脂質結合体（ｓｓＤＮＡ－ＰＬ）、および四面体低分子－ＤＮＡハイブリッド（ＳＭＤＨ４）を合成した（表２）。第２に、塩基対合される相補的な配列を有するｓｓＤＮＡ－ＰＬおよびＳＭＤＨ４をハイブリダイズして、最終的なＤＮＡ－ＰＬ４コアを得た（図２Ｂおよび図６～９）。
得られたコア足場を使用して、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰの集合を行い、最適化した。リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ： １０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および１３７ｍＭ ＮａＣｌ； ｐＨ＝７．４）中に薄いフィルム（１ｍＭ ＤＰＰＣ）を再懸濁し、続いて超音波処理することによって、１，２－ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）からリポソームを調製した。次いで、ＰＬ４コア足場を、薄いフィルムとして調製した一方で、改善された水性の溶解度が、既に水性の緩衝液中で、ＤＮＡ－ＰＬ４コア足場で始まることを可能にした。次いで、他のＮＰ構成要素を、コア足場に添加した：第１にＤＰＰＣリポソーム、および第２にａｐｏＡ－１（各々、ＰＢＳ中に予め懸濁されている）。その混合物を、３回の超音波処理に供し、氷上で緩和させ、次いで、濾過し、５０ｋＤａ ＭＷＣＯスピンカラムを使用して濃縮し、交互にベンチトップ遠心分離を行って、凝集物を除去した（図２Ｃ）。
超微細構造的には、高度に単分散性のナノ粒子を、ＰＬ４および９－ＤＮＡ－ＰＬ４足場（ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰ 直径：１０±２ｎｍ、９－ＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰ 直径：９±２ｎｍ）を使用する粒子集合体に関して透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察した（図２Ｇおよび図１３）。注目すべきことに、上記粒子の形態は、未成熟円板状ＨＤＬ、またはｒＨＤＬに特徴的ではなかった。これらはともに、積み重なったリン脂質ディスクの特徴的な連銭形成を示す１７， ２２－２３。代わりに、上記粒子は、ほぼ球状に見え、周辺は、環状の低密度領域があった。動的光散乱実験から、ヒトＨＤＬのものに似た流体力学的直径が明らかになった（ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰおよび９－ＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰに関して、それぞれ、ＤＨ＝１３．８±３．９および１３．３±４．６ｎｍ）（表３）。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、９－ＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰおよびＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰに関して、それぞれ、８．２２ｍＬおよび８．５８～８．８８ｍＬのピーク保持容積を示した。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰのＳＥＣトレースはまた、少量の遊離ａｐｏＡ－Ｉ（１０．１３ｍＬ 保持容積）と一致する右側のテールを明らかにした。これは、ヒトＨＤＬコントロールにおいても観察された。ＰＬ４および９－ＤＮＡ－ＰＬ４足場が、２０ｎｍ未満の粒子を成功裡に生成した一方で、１８－ＤＮＡ－ＰＬ４足場を使用する集合体は、ＤＰＰＣおよびａｐｏＡ－１の添加後の大きな小胞構造体として持続した（図１３）。本明細書では、これは、ハイブリッドのサイズが、ａｐｏＡ－１集合体にしては禁止されるほどに大きいことの結果であると仮定した。興味深いことには、９－ＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰは、ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰより顕著に大きくはなかった。この結果は、１８－ＤＮＡ－ＰＬ４を使用する集合体の欠如とともに、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰ粒径が、所定の閾値未満のコアサイズとは無関係に、ａｐｏＡ－１タンパク質折りたたみによって主に決定され得ることを示唆する。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰは、９－ＤＮＡ－ＰＬ４を使用して達成したが、１８－ＤＮＡ－ＰＬ４を使用して達成しなかったことから、全ての図面および残りの本文は、ＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰとして単純に９－ＤＮＡ－ＰＬ４ 足場を使用して形成される粒子に言及する。
ａｐｏＡ－１タンパク質コンホメーションに関してＬＣ ＨＤＬ ＮＰ構造を特徴づけるために、円偏光二色性を、ヒト血清から単離されたＬＣ ＨＤＬ ＮＰ、ａｐｏＡ－１、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３、ならびに無機性テンプレートＨＤＬ様ナノ粒子（Ａｕ ＨＤＬ ＮＰ）に対して行った。二次構造の分析を、３つの別個の参照タンパク質データベースを使用して行った。驚くべきことに、ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰおよびＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰは、二次構造においてヒトＨＤＬとよく似ていることが見出された一方で、Ａｕ ＨＤＬ ＮＰは対照的に、過剰なαヘリシティーならびに実質的に少ないβシートおよびターン含有量を示した（表１）（図２Ｅ）。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰ構造をさらに特徴づけるために、ａｐｏＡ－１のオリゴマー化状態を、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰとスベリン酸ビススルホスクシンイミジルとの架橋、続いて、イムノブロットによって調査した１８。ＬＣコアとのＡｐｏＡ－１相互作用は、安定なオリゴマー形成を誘導することが見出された（図１６）。さらに、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰの表面ζ電位は、ａｐｏＡ－１単独（－１０±３ｍＶ）またはコア足場なしのａｐｏＡ－１およびＤＰＰＣ（－１２±２ｍＶ）より負であった（ＰＬ４： －２１±２ｍＶ、ＤＮＡ－ＰＬ４： －１９±１ｍＶ）が、ヒトＨＤＬ２（－１９±２ｍＶ）およびＨＤＬ３（－２１±５ｍＶ）と一致した。これらの結果は、ａｐｏＡ－１オリゴマーが非常に負に荷電していることから、オリゴマー化と一致する。最後に、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰの組成を決定し、それらをＡｕ ＨＤＬ ＮＰおよびヒトＨＤＬのものと比較した。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰは、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰがコレステロールもコレステリルエステルも含まないことを除いて、各構成要素の相対的質量寄与に関してＨＤＬ２およびＨＤＬ３を厳密に反映することが見出された（図２Ｄ；表４）。
ＬＣ ＨＤＬ ＮＰが顕著なHDL機能を再現し得るか否かを調査するために、補完的な生物学的アッセイを行った。ＨＤＬ模倣に極めて重要な特性は、コレステロールを脂質搭載マクロファージから流出させる能力である。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰの流出効率を、インビトロ放射性標識コレステロール流出アッセイを使用して試験した（オリゴマー化アッセイの節を参照のこと）２４。簡潔には、Ｊ７７４マクロファージに、トリチウム標識コレステロール（Ｈ３－ｃｈｏｌ）を搭載し、ｃＡＭＰとともに培養して、コレステロール流出レセプターをアップレギュレートし、次いで、ナノ粒子またはコントロールで４時間処理した。その培地上清を、液体シンチレーションカウントに供して、パーセント流出Ｈ３－ｃｈｏｌを定量した。ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰおよびＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰはともに、用量依存性様式において強いコレステロール流出を促進した（ＰＬ４： ６．２±０．７％、ＤＮＡ－ＰＬ４： ６．５±０．２％； １００ｎＭ タンパク質）一方で、コア足場および脂質単独でのコントロール群は、流出に関して最小限の能力を示した（図３Ａ）。
流出に加えて、コレステロール送達は、成熟ＨＤＬによって天然の状況において実行される特別な機能である。コレステロール送達薬剤としてのＬＣ ＨＤＬ ＮＰの有効性を評価するために、培養した肝細胞（ＨｅｐＧ２）を、蛍光コレステロール（ＮＢＤ－ｃｈｏｌ）およびＬＣ ＨＤＬ ＮＰまたはコントロールで同時処理し、その後、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡法のために処理した。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰは、３０分間だけ、ＮＢＤ－ｃｈｏｌの効率的送達を促進し（図４）、ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰ処理細胞のうちの２３％は、Ａｕ ＨＤＬ ＮＰおよびａｐｏＡ－１に関して、それぞれ、５．７％および６．８％と比較して、ＮＢＤ陽性であった。
次いで、単一アッセイにおいて逆方向のコレステロール輸送プロセス全体をシミュレートするように実験を設計した。これを、標準的な放射性標識流出アッセイ、続いて、流入工程を行うことによって達成し、それによって調整した流出媒体をＨｅｐＧ２細胞に導入し、流入を、さらに４時間進めさせた。次いで、液体シンチレーションを、マクロファージ、肝細胞、および培地上清からの全３画分に対して計数して行った。本明細書中の結果（図３Ｂ～３Ｃ）は、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰが、ａｐｏＡ－１（＊＊ｐ＜０．０１）およびＡｕ ＨＤＬ ＮＰ（＊＊＊ｐ＜０．００１）の両方と比較した場合に、優れたコレステロール輸送能を示すことを明らかにした。全体的に、このアッセイは、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰが、強いコレステロール流出および送達の能力があることのみならず、単一の粒子コホートが、動的様式においてコレステロールを搭載および降ろすことによって、これらの機能を逐次的に実行し得ることも示す。
材料および計装
別段述べられなければ、全ての試薬および試薬グレード溶媒を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）から購入し、受容したまま使用した。全ての脂質- １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ ＰＥ）および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）- ならびに蛍光コレステロール（２２－（Ｎ－（７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２３，２４－ビスノル－５－コレン－３β－オール（（ＮＢＤ）－コレステロール））を、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ， ＡＬ）から得た。ＡｐｏＡ－Ｉタンパク質を、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から得た。全ての化学物質を、さらに精製せずに使用した。ウルトラピュア脱イオン（ＤＩ）Ｈ２Ｏ（１８．２ＭΩ・ｃｍ 抵抗率）を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅシステム（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｂｉｏｃｅｌ）から得た。テトラキス（４－アジドフェニル）メタン１および脂質ホスホルアミダイト２を、以前に公開した手順に従って合成した。
ヘキシニル官能化ＤＮＡ鎖およびＤＮＡ－脂質結合体の合成を、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｓｔｅｍで行った。ＤＮＡ生成物を、それぞれ、逆相（ＲＰ）半分取用（Ｄｙｎａｍａｘ、２５０×１０ｍｍ， Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ ３００Å／１０μｍ／Ｃ１８、Ａｇｉｌｅｎｔ ＃ Ｒ０８３２１３Ｃ１０）および分析用（Ｄｙｎａｍａｘ、１００×４．６ｍｍ、Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ １００Å／３μｍ／Ｃ１８、Ａｇｉｌｅｎｔ ＃ Ｒ００８０２００Ｅ３）カラムを装備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣで精製および分析した。ヘキシニル官能化ＤＮＡとテトラキス（４－アジドフェニル）メタンとのカップリングを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ ５３５５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｈａｕｐｐａｕｇｅ， ＮＹ）機器で行った。ＤＮＡ材料の吸収スペクトルを、マスクした石英セル（経路長＝１０ｍｍ， カタログ番号２９Ｂ－Ｑ－１０－ＭＳ， Ｓｔａｒｎａ ｃｅｌｌｓ Ｉｎｃ．， Ａｔａｓｃａｄｅｒｏ， ＣＡ）を使用して、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ３００ Ｂｉｏ ＵＶ－ｖｉｓ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）で記録した。陰性染色透過型電子顕微鏡検査法（ＴＥＭ）画像を、３００メッシュカーボンコーティング銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を使用して、１２０ｋＶで作動するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ ＴＥＭを使用して獲得した。共焦点画像化を、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ Ｓｐｅｃｔｒａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで行った。フローサイトメトリーを、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析機を使用して行った。マトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ）質量分析データを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡｕｔｏＦｌｅｘ ＩＩＩ ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）で線形モードを使用して、陰イオンとして集めた。その機器に、サンプリング速度１０Ｈｚで３０～４０％ 出力において作動させたＳｍａｒｔｂｅａｍＴＭレーザー技術を装備させた。１０００回のスキャンを、各質量スペクトルに対して平均化した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣおよびＢｒｕｋｅｒ ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ機器からのデータを、ＭｅｓｔｒｅＮｏｖａソフトウェアバージョン８．１．１－１１５９１を使用して処理した。
合成
ａ． ＤＮＡ－ＰＬ４コアの合成
ａ－１． ９－ＳＭＤＨ４および１８－ＳＭＤＨ４の合成および精製
９マーおよび１８マーＤＮＡアームとの低分子－ＤＮＡハイブリッド（ＳＭＤＨ）（それぞれ、９－ＳＭＤＨ４（配列番号１）および１８－ＳＭＤＨ４（配列番号２））を、以前に公開した手順３に従って合成および精製した。この研究において使用されるＤＮＡ配列を、表２に列挙する。ＳＭＤＨ調製において形成した種々の生成物を同定するために、粗製ＳＭＤＨの集めたサンプルのアリコートを、先ず、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣカラム（本明細書中の材料および計装の節を参照のこと）、および９５：５ ｖ／ｖ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ（水性）：ＭｅＣＮ（ＴＥＡＡ（水性）＝酢酸トリエチルアンモニウム、水性溶液）で開始し、６０：４０ ｖ／ｖ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ（水性）：ＭｅＣＮへと３５分間かけて（＋１ 容積％ ＭｅＣＮ／分の傾きで）増大させ、流量１ｍＬ／分での勾配法を使用して分析した。次いで、全サンプルを、半分取用ＲＰ－ＨＰＬＣカラム（本明細書中の材料および計装の節を参照のこと）、および９５：５ ｖ／ｖ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ（水性）：ＭｅＣＮで開始し、６０：４０ ｖ／ｖ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ（水性）：ＭｅＣＮへと７０分間かけて（＋０．５ 容積％ ＭｅＣＮ／分の傾きで。ここではより緩やかな勾配を使用して、ピークの適切な分離を確実にした）増大させ、流量３ｍＬ／分での勾配法を使用して精製に供した。その集めたＳＭＤＨ４生成物の正体をＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ ＭＳ分析によって確認し（図６～７の挿入図）、その純度を、前述の分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ溶媒プログラムとともに分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して再評価した（図６～７）。
ａ－２． ＤＮＡ－リン脂質結合体の固相合成および精製
表面に付着したアデニン（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｄＡ－ＣＰＧ ＃ ２０－２００１－１０（１０００Å、２８μｍｏｌ／ｇ））またはチミン（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｄＴ－ＣＰＧ ＃ ２０－２０３１－１０（１０００Å、２７μｍｏｌ／ｇ））のいずれかの１μｍｏｌを有する孔制御ガラス（ＣＰＧ）ビーズを使用して、合成を３’方向から行った。そのＣＰＧビーズを、１μｍｏｌ 合成カラムの中に入れ、次いで、３’－ホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｄＡ－ＣＥホスホルアミダイト ＃ １０－１０００－Ｃ５、Ａｃ－ｄＣ－ＣＥホスホルアミダイト ＃ １０－１０１５－Ｃ５、ｄｍｆ－ｄＧ－ＣＥホスホルアミダイト ＃ １０－１０２９－Ｃ５、ｄＴ－ＣＥホスホルアミダイト ＃ １０－１０３０－Ｃ５）を、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機で標準的な１μｍｏｌ プロトコールを使用して添加して、ＣＰＧ－３’－ｓｓＤＮＡを作製した（配列については表２を参照のこと）。脂質ホスホルアミダイトを、ｓｓＤＮＡ鎖の５’末端に付加し、次いで、ビーズを、乾燥窒素ガス流で乾燥させ、水性の新鮮なＡＭＡ溶液（３０重量％ 水性水酸化アンモニウム溶液および４０重量％ 水性メチルアミン溶液の１：１ ｖ／ｖ 混合物を１ｍＬ）を含むバイアル中に入れた。次いで、そのバイアルに蓋をし、６５℃において１５分間加熱して、ＤＮＡ－脂質結合体を、固体支持体から切断した。次いで、アンモニアおよびメチルアミン副生成物を、特徴的なアンモニア臭が消失するまで、バイアルの内容物に乾燥窒素ガス流を通すことによって除去した。残りの液体（これは、粗製ＤＮＡ－脂質結合体を含む）を、ピペットで集め、残りのビーズを、ウルトラピュア脱イオン水（２００μＬ）でさらに抽出した。その抽出物を、粗製ＤＮＡ－脂質結合体の最初の溶液と合わせ（最終的には全容積０．４ｍＬを得る）、０．４５μｍ ナイロンシリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標） １３ｍｍシリンジフィルター＃ ＰＮ ４４２６Ｔ）を通して濾過した。粗製生成物の集めたサンプルを、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ（図８～９）および９５：５ ｖ／ｖ ０．１Ｍ ＴＥＡＡ（水性）：ＭｅＣＮ（ＴＥＡＡ（水性）＝酢酸トリエチルアンモニウム、水性溶液）で開始し、１００％ ＭｅＣＮへと５０分間かけて増大させ（＋１．９容積％ ＭｅＣＮ／分の傾きで）、流量１ｍＬ／分での勾配法を使用して精製に供した。その集めた生成物の正体をＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ ＭＳ分析によって確認し（図８～９の挿入図）、その純度を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって検証した（図９）。
ａ－３． ＤＮＡ－リン脂質結合体およびＳＭＤＨ４の集合
ＴＡＭｇ緩衝溶液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ 酢酸、および７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２； ｐＨ７．４）中の、調製したとおりのＳＭＤＨ４およびその相補的ＤＮＡ－脂質結合体の等モル混合物を、０．５ｍＬ エッペンドルフチューブへと添加した。次いで、得られた溶液を９０℃へと加熱ブロック（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ； Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ， Ｈａｕｐｐａｕｇｅ， ＮＹ）で加熱し、そこで５分間維持して、全ての最初のＤＮＡ相互作用を除去した。次いで、加熱ブロックへの出力を切って、その溶液を室温へと３時間かけてゆっくりと冷却させた（この装置の代表的な冷却プロフィールに関しては、Ｙｉｌｄｉｒｉｍ， Ｉ．； Ｅｒｙａｚｉｃｉ， Ｉ．； Ｎｇｕｙｅｎ， Ｓ． Ｔ．； Ｓｃｈａｔｚ， Ｇ． Ｃ． Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ ２０１４， １１８， ２３６６－２３７６の補足情報の図Ｓ１６を参照されたい）。
ｂ． ＰＬ４コアの合成
ｂ－１． テトラキス（４－アジドフェニル）メタンの合成
テトラキス（４－アジドフェニル）メタンを、以前に公開した手順１に従って合成した。
ｂ－２． ＤＢＣＯ ＰＥおよびテトラキス（４－アジドフェニル）メタンの結合体化
ＰＬ４コア材料を、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ ＰＥ）と四面体低分子コア（テトラキス（４－アジドフェニル）メタン）との銅フリークリックケミストリー結合体化によって合成した（図１１）。代表的なクリックケミストリー反応において、ＤＢＣＯ ＰＥおよびテトラキス（４－アジドフェニル）メタンを各々、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中に０．１重量％で溶解し、ＤＭＦ中、ＤＢＣＯ ＰＥ 対 テトラキス（４－アジドフェニル）メタンの１０：１モル比で混合した。その反応混合物を、３回の交互になったボルテックスおよび浴超音波処理に供し、次いで、室温において、２４時間ボルテックスして反応させた。次いで、エレクトロスプレーイオン化質量分析法を使用して、得られた生成物を特徴づけた（図１２）。
ｃ． ＬＣ ＨＤＬ ＮＰ集合体
ナノ粒子集合を、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）リポソームを最初に調製することによって行った。ＤＰＰＣを、５ｍＬ ガラスバイアルの中で、クロロホルム中０．１重量％において溶解した。次いで、薄いフィルムを、Ｎ２ガスでその溶媒をエバポレートすることによって生成した。そのフィルムを、デシケーターの中で＞２時間、減圧下でさらに乾燥させた。次いで、リポソームを、浴超音波処理およびボルテックスを交互に行いながら、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ： １０ｍＭ ホスフェートおよび１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）中で、ＤＰＰＣ濃度１ｍＭにおいてその薄いフィルムを再懸濁することによって生成した。ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰに関しては、ＰＬ４コア足場を、ＤＰＰＣに関して上記で記載されるその同じ様式において、ＤＭＦ中の０．１重量％ 溶液から薄いフィルムを生成することによって調製した。ＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰに関しては、コア足場を、オリゴヌクレオチドによって付与されたコアの改善された水への溶解度に起因して、ＴＡＭｇ緩衝溶液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ 酢酸、および７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２； ｐＨ＝７．４）中で開始した。粒子集合を開始するために、非足場ナノ粒子構成要素を、次いで、そのコア足場へと逐次的に添加した。代表的な集合において、４０ｎｍｏｌのＤＰＰＣを、２ｎｍｏｌ 脂質結合体コア足場（ＰＬ４またはＤＮＡ－ＰＬ４のいずれか）に添加し、続いて、４ｎｍｏｌのａｐｏＡ－１を添加した（ＤＰＰＣおよびａｐｏＡ－１はともに、ＰＢＳ中に予め懸濁しておいた）。次いで、その懸濁物を、ＰＢＳにおいて、ＰＢＳ中最終コア濃度１０μＭへと希釈した。その懸濁物を、３回の交互になった浴超音波処理（９０ｓ オン、３０ｓ オフ）およびボルテックスに供し、氷上で＞３０分間緩和した。次いで、その粒子を濾過し、０．５ｍＬ ５０ｋＤａ ＭＷＣＯスピンカラム（ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ）を使用して濃縮した。そのカラムを、ＰＢＳ中で１０分間、１０，０００×ｇにおいて４℃で先ずすすぎ、その後、同じ条件下でその粒子を３回スピン濾過した。５００μｌのＰＢＳを、各スピン後にカラムに添加し、その結果、各粒子懸濁物の溶媒は、スピン濾過後にＰＢＳであり、ＴＡＭｇ緩衝液は、ＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰの溶液から除去された。各回の濾過後に、その粒子を、デスクトップ遠心分離によって遠心分離して、いかなる凝集物をも除去した。最終回の濾過後に、小容積の濃縮粒子（約２０μＬ）を、ＰＢＳ中１００～２００μｌへと希釈し、そのタンパク質濃度を、ＢＣＡ試薬とともに３７℃で３０分間インキュベートした後に、５６２ｎｍの吸光度を分光光度計で測定して、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）によって決定した。次いで、その粒子は、直ぐに使用したか、または短期間の保存のために４℃に置いた。
ｄ． ＴＥＭのためのコントロールの調製
コントロールサンプルを調製して、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰ集合プロセス、ならびに脂質結合体化コア足場およびａｐｏＡ－１に対するその依存性を調査した。コア＋ａｐｏＡ－１なしの足場コントロールを、上記で記載されるとおりのＤＰＰＣリポソームを作製することによって調製した（本明細書中の合成の節を参照のこと）。次いで、ＤＰＰＣリポソームを、ＬＣ ＨＤＬ ＮＰにおけるものと同じ濃度およびモル比でコア足場に添加したところ、ＰＬ４足場は薄いフィルムになり、ＤＮＡ－ＰＬ４足場は、水性緩衝液（ＰＢＳ）中にあった。次いで、その混合物を、３回の交互になった超音波処理およびボルテックスに供し、濾過し、上記のように５０ｋＤａ ＭＷＣＯスピンカラムを通して濃縮した。ａｐｏＡ－１およびＤＰＰＣ単独コントロールは、コア足場なしで同じ様式で集合した。
陰性染色透過型電子顕微鏡検査法
グリッド準備のために、サンプルを、ＰＢＳ中１～２μＭ タンパク質の濃度で調製し、ＵＶ処理炭素コーティング銅３００メッシュグリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）上にドロップキャストし、ドラフトチャンバ（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｕｍｅ ｈｏｏｄ）の中で風乾した。そのグリッドをＰＢＳで２回洗浄し、２％ 酢酸ウラニルで２０秒間、２回染色し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄し、風乾し、その後画像化した。画像化を、８０ｋＶで作動するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ ＴＥＭを使用して行った。
円偏光二色性
円偏光二色性を、ＪＡＳＣＯ Ｊ－８１５ ＣＤ分光計を使用して行った。全てのサンプルを、蒸留水中で７５μｇ／ｍＬ タンパク質に希釈した。１つのサンプルの３つの累積からスペクトルを得た。二次構造データを、分析アルゴリズムＣＯＮＴＩＮを走らせるＣＤＰｒｏソフトウェアパッケージを使用して獲得した。種々の可溶性タンパク質参照セットを使用して、３回の別個の分析を行った。表１に報告される値は、これら３回の分析の平均±ＳＥＭ結果を反映する。
組成特徴付け
ａ． タンパク質定量。 ナノ粒子および天然ＨＤＬのタンパク質含有量を定量するために、本発明者らは、市販のビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造業者の指示に従って使用した。簡潔には、本発明者らは、ＢＣＡ試薬溶液を使用して、９６ウェルプレートの中にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプルを最終容積８０μｌ／ウェルへと０．１２５ｍｇ／ｍＬから２ｍｇ／ｍＬまで希釈することによって、タンパク質標準曲線を作成した。ナノ粒子サンプルを、同じ様式で希釈した；標準およびサンプルを、４０倍希釈した。標準を二連でプレートし、サンプルを三連でプレートした。プレートを、３０分間、３７℃においてインキュベートし、次いで、５６２ｎｍの吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーを使用して測定した。
ｂ． リン脂質定量。 ナノ粒子および天然ＨＤＬのリン脂質含有量を、比色によるＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造業者の指示に従って使用して定量した。簡潔には、リン脂質標準曲線を、１５μＭから２００μＭまで段階希釈を介して調製した。サンプルをＰＢＳ中で段階希釈して、その標準曲線の範囲内の１またはこれより多くの希釈物を得た。次いで、サンプルおよび標準を、酵素反応混合物とともに３０分間室温でインキュベートし、次いで、５７２ｎｍの吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーを使用して決定した。
ｃ． コレステロール、コレステリルエステル、およびコア定量。 コレステロールおよびコレステリルエステル濃度を、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、製造業者の指示に従って使用して決定した。簡潔には、コレステロール標準曲線を、８μｇ／ｍＬから１２５ｎｇ／ｍＬまで、キットが提供する水性緩衝液において調製した。２セットのサンプルを三連で調製し、１×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒへと希釈した。次いで、過酸化水素、レソルフィン、および酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼを含む（コレステロールエステラーゼありまたはなしで）２つの反応混合物を調製して、遊離コレステロールおよびコレステリルエステルの両方の定量を可能にした。次いで、一方のセットのサンプルを、コレステロールエステラーゼを含む反応混合物とともにインキュベートし、他方のセットを、コレステロールエステラーゼなしの反応混合物とともにインキュベートした。次いで、マイクロプレートを、３７℃で１時間、または蛍光シグナルが低下し始めるまでインキュベートした。ＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰのコア濃度を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法を介して２６０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。ＰＬ４コア濃度を直接決定できなかったので、そのコア濃度を、ＤＮＡ－ＰＬ４粒子に関して得た実験的に決定したコア：タンパク質モル比を使用して推測した。この近似値は、ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰおよびＤＮＡ－ＰＬ４ ＨＤＬ ＮＰの粒子１個あたりａｐｏＡ－１分子の同じ平均コピー数を想定し、これは、類似の粒径がＴＥＭによって観察されることを考慮すれば、近い近似値である可能性が高いことは、注目する価値がある。Ａｕ ＨＤＬ ＮＰの組成は、以前に公開された研究から報告された４。
オリゴマー化アッセイ
ａ． 架橋された粒子およびタンパク質サンプルの調製。 架橋剤、スベリン酸ビス［スルホスクシンイミジル］（ＢＳ３）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、イムノブロットを介する検出の前に、集合の際にＬＣ ＨＤＬ ＮＰにおけるａｐｏＡ－１のいかなるより高次のオリゴマー化状態をも安定化させた。ここで使用される方法を、以前に報告したプロトコール４から適合させた。ＬＣ ＨＤＬ ＮＰを、上記のように調製し、ＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬ タンパク質へと希釈した。次いで、ＢＳ３架橋剤を、２．５ｍＭの最終ＢＳ３濃度になるようにＬＣ ＨＤＬ ＮＰに添加し、その反応を、３０分間、室温において進めた。ａｐｏＡ－１オリゴマーラダーを生成するために、脂質非含有純粋ａｐｏＡ－１（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）をＰＢＳ中で透析し、次いで、ＢＳ３（０．２５ｍＭ）で高タンパク質濃度（５００μｇ／ｍＬ）において４時間、室温での架橋に供した。０．５Ｍ トリス塩基を使用して、その架橋反応を停止した（４５ｍＭ 最終）。
ｂ． ａｐｏＡ－１イムノブロット。 ＢｉｏＲａｄ装置を、ゲル電気泳動およびタンパク質転写のために使用した。プレキャスト４－２０％ ポリアクリルアミドゲル（ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ ＴＧＸ， ＢｉｏＲａｄ）を、分離に使用した。ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜へのタンパク質転写を、２０容積％ メタノールを含むトリス－グリシン緩衝液を使用して行った。次いで、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ中ですすぎ、５重量％ 脱脂粉乳中で、１時間室温においてブロッキングした。一次抗体（ウサギ抗ａｐｏＡＩ， Ａｂｃａｍ）を、上記膜に５重量％ 脱脂粉乳中１：１０００希釈で添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、上記膜を、ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．１％）中で３回、各々１０分間洗浄した。次いで、二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ， ＢｉｏＲａｄ）を、５重量％ 脱脂粉乳中１：２０００ 希釈で添加した。次いで、上記膜を、ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中で３回、各々１０分間洗浄し、次いで、エレクトロケミルミネッセンス基質溶液中に１分間浸し、オートラジオグラフィーフィルムに１０～９０秒間、最適露出時間にわたって露出し、発色させた（図１６）。
放射性標識アッセイ
ａ． 流出アッセイ： 流出実験のために、本発明者らは、当該分野で基準のアッセイ、Ｊ７７４マクロファージからのトリチウム標識コレステロール（Ｈ３－ｃｈｏｌ）の流出を使用した。Ｊ７７４マクロファージを、少なくとも２継代にわたって培養し、その後、１日目に、ＲＰＭＩ、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）中で２４ウェルプレートにおいて１５０，０００細胞／ウェルで播種した。Ｈ３－ｃｈｏｌのエタノールストックを、無菌条件下で扱った。Ｈ３－ｃｈｏｌストックをエバポレートし、１ｍＬのエタノール中に再溶解し、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、その溶液を再びエバポレートし、５０μＬ エタノール中に再溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、熱不活化ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）をＨ３－ｃｈｏｌ溶液に添加し、４℃において一晩インキュベートした。２日目に、１％ ＰｅｎＳｔｅｐおよび２μｇ／ｍＬ Ｓａｎｄｏｚ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含む無血清ＲＰＭＩを、上記Ｈ３－ｃｈｏｌ含有ＦＢＳに添加して、ＲＰＭＩ中、２μＣｉ／ｍＬ Ｈ３－ｃｈｏｌ、５容積％ ＦＢＳの最終標識培地を得た。Ｓａｎｄｏｚが、Ｈ３－ｃｈｏｌのエステル化を防止するために使用されるＡＣＡＴインヒビターであることに注意のこと。培地を２４ウェルプレートから吸引し、５００μＬのＨ３－ｃｈｏｌ標識培地を添加した（１μＣｉ／ウェル）。標識を、２４時間にわたって進めた。３日目に、標識培地を除去し、細胞を、ＭＥＭ、２５μＭ ＨＥＰＥＳで２回洗浄し、アップレギュレーション培地（ＲＰＭＩ、１％ ＰｅｎＳｔｒｅｐ、３００μＭ ｃＡＭＰ、２μｇ／ｍＬ Ｓａｎｄｏｚ、１％ ＢＳＡ）を添加して、標準コレステロール流出レセプターＡＢＣＡ１をアップレギュレートした（注： ｃＡＭＰ（－）流出アッセイ（図４Ｄ）に関しては、この培地を、ＳＲ－Ｂ１依存性流出を調査するために、ｃＡＭＰなしで添加した）。アップレギュレーションを、２４時間にわたって進め、その後、流出培地を添加した。ナノ粒子およびコントロールを含む流出サンプルを、無血清培地（ＭＥＭ、２５μＭ ＨＥＰＥＳ、１％ ＰｅｎＳｔｒｅｐ）中に調製して、血清コレステロールキャリアによる非特異的Ｈ３－ｃｈｏｌ流出を低減させた。細胞をＭＥＭ、２５μＭ ＨＥＰＥＳ中で２回洗浄し、流出培地を、処理レジメンに従って各ウェルに添加した。流出を、４時間にわたって進めた。次いで、流出培地を除去し、真空濾過し、シンチレーション計数のために３ｍＬ ＵｌｔｉｍａＧｏｌｄシンチレーション液に添加した。Ｈ３－ｃｈｏｌ搭載マクロファージの別個の三連のコホートを洗浄し、風乾し、イソプロパノール中で室温においてインキュベートして、流出の最初にｔ＝０で全コレステロールの尺度としてＨ３－ｃｈｏｌを抽出した。ＰＢＳ処理コントロールコホートをベースラインとして使用し、次いで、これらのサンプルに関して得た計数を、実験群から差し引いて、ベースライン補正した計数を得た。次いで、流出パーセンテージを、流出培地のベースライン補正した計数 対 ｔ＝０マクロファージの計数の比として計算した。これは、４時間の処理の過程にわたって細胞から除去されたＨ３－ｃｈｏｌの画分が拡散単独に起因しないことを示す。
ｂ． タンデム流出－流入アッセイ： 流出－流入実験のために、流出を、上記と同様に行った。肝細胞（ＨｅｐＧ２細胞）を、３日目に、２４ウェルプレートにおいてＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１％ ＰｅｎＳｔｒｅｐ中、１００，０００細胞／ウェルでプレートした。４日目に、４時間の流出直後に、ＨｅｐＧ２細胞を、無血清ＭＥＭ、２５μＭ ＨＥＰＥＳ中で２回洗浄し、次いで、Ｊ７７４マクロファージからの流出培地を除去し、ＨｅｐＧ２細胞に直接添加した。流入を４時間にわたって進め、その後、採取した。次いで、流入培地上清を集め、上記の流出培地と同様に処理した。次いで、Ｈ３－ｃｈｏｌを、５００μＬ イソプロパノール中で４時間室温においてインキュベートすることによってＨｅｐＧ２細胞から抽出し、パラフィルムでシールした。次いで、Ｈ３－ｃｈｏｌ含有イソプロパノールを集め、エバポレートし、キシレン中に再溶解し、その後、シンチレーション計数のためにＵｌｔｉｍａＧｏｌｄに添加した。
ＮＢＤ－コレステロール送達実験
ａ． 共焦点顕微鏡検査法。 ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ ＦＢＳおよび１％ ＰｅｎＳｔｒｅｐを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。処理の１日前に、細胞を、２４ウェルプレートにおいてガラスカバースリップの上に１００，０００細胞／ウェルでプレートした。処理日に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、５μｇ／ｍＬ ＮＢＤ－コレステロールを含む新鮮な培地を、処理レジメンに従って、送達薬剤ありまたはなしで各ウェルに添加した。取り込みを、上記細胞を固定したときに３０分間にわたって進め、共焦点顕微鏡検査法のために調製した。細胞を、４％ ＰＦＡ中で１０分間、室温において固定した。次いで、細胞を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ＤＡＰＩ（ＰＢＳ中３００ｎＭ）で５分間染色し、ＰＢＳ中でさらに２回洗浄した。次いで、カバースリップを、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ封入媒体を使用してガラススライド上に載せ、室温において少なくとも２４時間シールさせ、その後、画像化した。共焦点顕微鏡検査法を、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ Ｓｐｅｃｔｒａｌを使用して行い、画像処理を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｆｉｊｉソフトウェアで行った。
ｂ． フローサイトメトリー。 ＨｅｐＧ２細胞を、処理の１日前に、２４ウェルプレートにおいて２００，０００細胞／ウェルでプレートした。処理日に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、５μｇ／ｍＬ ＮＢＤ－コレステロールを含む新鮮な培地を、処理レジメンに従って、送達薬剤ありまたはなしで各ウェルに添加した。取り込みを、採取前に３０分間にわたって進めた。次いで、細胞をトリプシン処理し、血清含有培地中で中和し、３００×ｇで６分間遠心分離し、細胞をペレット化した。細胞を、２％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中に再懸濁し、次いで、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーに供した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を行った。事象を、細胞デブリおよび凝集物を排除するようにゲートを設定し、その後、ＮＢＤ－ｃｈｏ陽性の定量を行った。
レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性アッセイ
ＰＢＳ中に懸濁したＬＣ ＨＤＬ ＮＰおよびＡｕ ＨＤＬ ＮＰ（２５０ｎＭ）を、ＰＢＳ中で、ＬＣＡＴ（１０ｎＭ）および遊離コレステロール（１００μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で１５時間、３００ｒｐｍにおいてＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒで振盪してインキュベートした。次いで、サンプルを、１０，０００ｇで１０分間、５０ｋＤａスピンカラムを通して３回遠心分離して、過剰な結合していないコレステロールを除去した。次いで、サンプルを、１×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中で１００倍希釈し、その後、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で定量した。Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙを、製造業者の指示に従って行った。簡潔には、コレステロール標準曲線を、８μｇ／ｍＬから１２５ｎｇ／ｍＬまで、キットが提供する水性緩衝液においてコレステロールを段階希釈し、９６ウェル黒色底マイクロプレートに５０μｌ添加することによって調製した。５０μｌのサンプルもまた、そのマイクロプレートの各ウェルに三連で添加した。２セットのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ反応混合物を、コレステロールエステラーゼありおよびなしで調製した。次いで、５０μｌのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ反応混合物を各ウェルに添加した。マイクロプレートを、３７℃で１時間または蛍光シグナルが低下し始めるまでインキュベートした。
ＮＦ－ｋＢ活性アッセイ
ＮＦ－ｋＢ活性実験のために、ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ細胞を、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）検出キット（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）とともに使用した。ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で懸濁して培養し、実験で使用する前に少なくとも２回継代した。ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ細胞を、９６ウェルプレートにおいて１００，０００細胞／ウェルでプレートした。リポポリサッカリド（ＬＰＳ）（５ｎｇ／ｍＬ）を使用して、ＮＦ－ｋＢ活性を刺激した。実験ウェルを、ナノ粒子またはコントロールを添加する１時間前にＬＰＳで処理した。次いで、検出前に、細胞を、粒子またはコントロールとともに２４時間インキュベートした。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液を、エンドトキシン非含有水中でパケットの中身を溶解し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって調製した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液（１８０μＬ）を９６ウェルプレートにおいて各ウェルに添加した。次いで、ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ細胞上清（２０μＬ）を、そのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液に添加し、そのプレートを３７℃で２～４時間インキュベートした。ＳＥＡＰレベルを、Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーを使用して６５０ｎｍの吸光度を検出することによって定量した。
Figure 2022518479000002
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参考文献
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他の実施形態
本明細書で開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせられ得る。本明細書で開示される各特徴は、同じ、等価な、または類似の目的に役立つ代替の特徴によって置き換えられ得る。従って、別段明示的に述べられなければ、開示される各特徴は、一般的な一連の等価なまたは類似の特徴の例に過ぎない。
上述の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認し得、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明を種々の使用法および条件に適合させるために、本発明に対して種々の変更および改変を行い得る。従って、他の実施形態もまた、特許請求の範囲内である。
均等物
いくつかの本発明の実施形態が、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を果たすならびに／または結果および／もしくは本明細書で記載される利点のうちの１もしくはこれより多くを得るために、種々の他の手段および／または構造を容易に想定し、このようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書で記載される発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、材料、および構成は例示であることが意味され、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される具体的適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書で記載される具体的な発明の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認し得る。従って、前述の実施形態が、例示によって示されるに過ぎず、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の実施形態が、具体的に記載され、特許請求されるとおり以外の別の方法で実施され得ることは、理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関する。さらに、２またはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しなければ、本開示の発明の実施形態の発明の範囲内に含まれる。
全ての定義は、本明細書で定義および使用される場合、辞書の定義、参考として援用される文書中の定義、および／または定義される用語の通常の意味に対して優先されることは、理解されるべきである。
本明細書で開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用され、いくらかの場合には、その文書の全体を包含し得る主題に関して参考として援用される。
不定冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、明らかに逆に示されなければ、「少なくとも１（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を意味することが理解されるべきである。
語句「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方（ｅｉｔｈｅｒ ｏｒ ｂｏｔｈ）」、すなわち、いくらかの場合には接続的に示され、他の場合には離節的に示される要素を意味することが理解されるべきである。「および／または」とともに列挙される多数の要素は、同じ様式において、すなわち、そのように結合された要素の「１またはこれより多くの（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」と解釈されるべきである。他の要素は、「および／または」の文節によって具体的に特製される要素以外に、それらの具体的に特定される要素に関連しようが関連しまいが、必要に応じて存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような制限のない文言とともに使用される場合、１つの実施形態では、Ａのみ（必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）に；別の実施形態では、Ｂのみ（必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）に；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（必要に応じて、他の要素を含む）に；他に言及し得る。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有することが理解されるべきである。例えば、リストの中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的、すなわち、多くの要素または要素のリスト、および必要に応じて、さらなる列挙されない項目のうちの少なくとも１を含むが、１より多くをも含むとして解釈されるものとする。「のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」もしくは「のうちの正確に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、または特許請求の範囲の中で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のような、逆を明らかに示す用語のみが、多くの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことに言及する。概して、用語「または」は、本明細書で使用される場合、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「のうちの１つ（ｏｎｅ ｏｆ）」、」「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」のような排他性の用語が先立つ場合、排他的な代替物（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない（ｏｎｅ ｏｒ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｏｔｈ）」）を示すとして解釈されるに過ぎないものとする。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲の中で使用される場合、特許法の分野で使用されるとおりのその通常の意味を有するものとする。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、語句「少なくとも１」は、１またはこれより多くの要素のリストに言及して、要素のリストの中の要素のうちのいずれか１つまたはこれより多くから選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙される各々および全ての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むわけではなく、要素のリストの中の要素の任意の組み合わせを排除しないことを意味することが理解されるべきである。この定義はまた、語句「少なくとも１」が言及する要素のリスト内で具体的に同定される要素以外の要素が、それら具体的に特定される要素に関連しようが関連しまいが、必要に応じて存在し得ることを可能にする。従って、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または等しくは、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または等しくは、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ａ、Ｂは存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）に；別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ｂ、Ａは存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）に；さらに別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ａおよび少なくとも１つの（必要に応じて、１より多くを含む）Ｂ（必要に応じて、他の要素を含む）に；他に言及し得る。
明確に逆に示されなければ、１より多くの工程または行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、上記方法の工程または行為の順序は、上記方法の工程または行為が記載される順序に必ずしも限定されないことがまた、理解されるべきである。

Claims (51)

  1. 球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）であって、コアおよび前記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含み、ここで前記コアは、脂質結合体化有機性コア足場を含む、ＨＤＬ－ＮＰ。
  2. 前記シェルは、脂質シェルである、請求項１に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  3. 前記シェルは、脂質二重層または単層である、請求項１～２のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  4. 前記球状ＨＤＬ－ＮＰは、約－２０ミリボルト（ｍＶ）の表面ζ電位を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  5. 前記有機性コア足場は、疎水性低分子－リン脂質結合体（ＰＬ４）を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  6. 前記ＰＬ４は、ヘッド基改変リン脂質を含む、請求項５に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  7. 前記ヘッド基改変リン脂質は、環ひずみアルキン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチルを含む、請求項６に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  8. 前記リン脂質は、複数の末端官能基を有する前記低分子にカップリングされる、請求項６～７のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  9. 前記低分子は、テトラキス（４－アジドフェニル）メタンである、請求項８に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  10. 前記複数の官能基は、２～６個の官能基である、請求項８または９に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  11. 前記複数の官能基は、４個の官能基である、請求項８または９に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  12. 前記官能基は、末端アジド（ＳＭ－Ａｚ）である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  13. 前記有機性コア足場は、両親媒性ＤＮＡ連結低分子－リン脂質結合体（ＤＮＡ－ＰＬ４）を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  14. 前記ＤＮＡは、５～１７ヌクレオチド長の２本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  15. 前記ＤＮＡは、８～１５ヌクレオチド長の２本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  16. 前記ＤＮＡは、９ヌクレオチド長の２本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  17. 前記２本鎖ＤＮＡの第１の１本鎖は、リン脂質に連結され、ｓｓＤＮＡ－リン脂質結合体（ｓｓＤＮＡ－ＰＬ）を形成する、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  18. 前記２本鎖ＤＮＡの前記第１鎖に相補的な前記２本鎖ＤＮＡの第２鎖は、低分子に連結される、請求項１７に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  19. 前記低分子は、四面体低分子であり、前記ＤＮＡに連結された前記低分子は、四面体低分子－ＤＮＡハイブリッド（ＳＭＤＨ４）を形成する、請求項１８に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  20. 前記ＳＭＤＨ４は、前記ＤＮＡの相補的な１本鎖の間の水素結合を介して前記ｓｓＤＮＡ－ＰＬに連結される、請求項１９に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  21. 前記球状ＨＤＬ－ＮＰは、約５～３０ｎｍ、５～２０ｎｍ、５～１５ｎｍ、５～１０ｎｍ、８～１３ｎｍ、８～１２ｎｍ、または１０ｎｍの直径を有する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  22. 前記球状ＨＤＬ－ＮＰは、金コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子よりヒトＨＤＬに近いζ電位を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  23. 前記ζ電位は、－１６～－２６ｍＶである、請求項２２に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  24. 前記球状ＨＤＬ－ＮＰは、アポリポタンパク質または金コアを有する合成ＨＤＬナノ粒子のものより効率的なコレステロール輸送能を有する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  25. アポリポタンパク質をさらに含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  26. アポリポタンパク質Ａ－Ｉ （ＡｐｏＡ１）をさらに含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  27. 前記ＨＤＬ－ＮＰは、８．７ｎｍより大きい流体力学的直径を有する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  28. 前記ＨＤＬ－ＮＰは、８．７ｎｍ～１７．７ｎｍの流体力学的直径を有する、請求項１～２７のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  29. 前記ＨＤＬ－ＮＰは、１０ｎｍ～１５ｎｍの流体力学的直径を有する、請求項１～２８のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  30. 前記ＨＤＬ－ＮＰは、１２ｎｍ～１４ｎｍの流体力学的直径を有する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  31. 前記ＨＤＬ－ＮＰに連結された治療剤をさらに含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  32. 前記治療剤は、治療用核酸である、請求項３１に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  33. 前記治療剤は、抗がん剤である、請求項３１に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  34. 前記抗がん剤は、化学療法剤である、請求項３３に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  35. 前記治療剤は、抗炎症剤である、請求項３１に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰ。
  36. 請求項１～３５のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰを含む、薬学的組成物。
  37. がんを処置するための方法であって、前記方法は、
    がんを有する被験体に、コアおよび前記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含む球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を投与する工程であって、ここで前記コアは、前記がんを処置するために有効な量で脂質結合体化有機性コア足場を含む、工程、
    を包含する、方法。
  38. 炎症性障害を処置する方法であって、前記方法は、
    炎症性障害を有する被験体に、コアおよび前記コアを取り囲みかつそれに付着したシェルを含む球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を投与する工程であって、ここで前記コアは、前記炎症性障害を処置するために有効な量で脂質結合体化有機性コア足場を含む、工程、
    を包含する、方法。
  39. 前記球状ＨＤＬ－ＮＰは、請求項１～３５のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰである、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 前記被験体は、哺乳動物である、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記被験体は、ヒトである、請求項４０に記載の方法。
  42. ＮＦ－ｋＢ活性を低減する方法であって、前記方法は、被験体に、有効量の、請求項１～３５のいずれか１項に記載の球状ＨＤＬ－ＮＰを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
  43. 球状高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ－ＮＰ）を作製するための方法であって、前記方法は：
    ｓｓＤＮＡ－リン脂質結合体（ｓｓＤＮＡ－ＰＬ）を調製する工程、
    四面体低分子－ＤＮＡハイブリッド（ＳＭＤＨ４）を調製する工程であって、ここで前記ｓｓＤＮＡ－ＰＬおよびＳＭＤＨ４は、相補的ＤＮＡ配列を有する、工程、
    前記ｓｓＤＮＡ－ＰＬおよびＳＭＤＨ４を、前記相補的ＤＮＡ配列が互いに塩基対合して、ＤＮＡ－ＰＬコアを形成するようにインキュベートする工程、ならびに
    ＤＮＡ－ＰＬコアリン脂質リポソームおよびアポリポタンパク質に添加して、前記球状ＨＤＬ－ＮＰを生成する工程、
    を包含する、方法。
  44. 前記ｓｓＤＮＡ－ＰＬは、少なくとも９ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記オリゴヌクレオチドは、９ヌクレオチド長である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ＳＭＤＨ４は、少なくとも９ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の方法。
  48. 前記オリゴヌクレオチドは、９ヌクレオチド長である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号３を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ－Ｉである、請求項４３～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. ４個の末端アジドを有する四面体低分子コア（テトラキス（４－アジドフェニル）メタン）に連結された１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ ＰＥ）を含む、有機性コア足場。
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