JP2022517226A - がん免疫療法のためのｃｄ２００ａｒリガンド - Google Patents

Abstract

本発明は、特定の実施形態において、細胞にＣＤ２００活性化受容体リガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）を投与することによる、細胞においてＰＤ－１を阻害する方法を提供する。本発明は、特定の実施形態において、哺乳動物において腫瘍溶解物ワクチンの有効性を高める方法であって、腫瘍溶解物ワクチンの投与前に哺乳動物にＣＤ２００活性化受容体リガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）を投与することを含む、方法を提供する。
【選択図】図２Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／７９２，３１１号に対する優先権を主張する。上で参照される出願の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

がん研究の進歩にもかかわらず、多くのがんに対する十分な治療法はまだ存在しない。例えば、悪性神経膠腫は、米国で年間１万４，０００人を超える患者に生じる、深刻な疾患である。神経膠腫細胞がバルク腫瘍の空洞から数センチメートル離れて移動する能力があるため、現在の標準的な治療は、わずかな改善しかもたらさず、５年生存率は３０％未満である。膠芽腫患者は、獲得免疫応答不全を引き起こす全身性免疫抑制を示す。これらの不全は、Ｔ細胞増殖及び細胞障害性機能を抑制する、腫瘍によって分泌される免疫抑制因子の濃縮に起因する。免疫抑制は、膠芽腫患者における腫瘍進行に重要な役割を果たす。免疫抑制を逆転させ、効果的な免疫標的化を可能にすることができる場合、神経膠腫患者は、腫瘍進行がほとんど起こらなくなり、転帰が改善する。

したがって、がんを治療するための新しい組成物及び方法が必要である。特に、腫瘍によって引き起こされる免疫学的に抑制された微小環境を逆転させる新しい組成物が必要である。

本発明は、特定の実施形態において、細胞にＣＤ２００活性化受容体リガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）を投与することによる、細胞においてＰＤ－１を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチド模倣薬である。特定の実施形態において、ペプチド模倣薬は、１つ以上のＤ－異性体アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ペプチド模倣薬は、１つ以上の非天然アミノ酸を含む。

本発明は、特定の実施形態において、哺乳動物において腫瘍溶解物ワクチンの有効性を高める方法であって、腫瘍溶解物ワクチンの投与前に哺乳動物にＣＤ２００活性化受容体リガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）を投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍溶解物は、ＣＤ２００を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」とは、物質（例えば、腫瘍溶解物）が、未処理物質よりも少ないレベルのＣＤ２００、例えば、１～１００％少ないＣＤ２００を有することを意味する。特定の実施形態において、ＣＤ２００は、標準的な方法を使用した吸収によって除去される。

実験モデル。ＣＤ２００及びＰＤ－Ｌは、腫瘍細胞から分泌され、抗原提示細胞上のＣＤ２００阻害性受容体（ＣＤ２００Ｒ１）またはＰＤ－１受容体に結合し、免疫系を停止させる。ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１は両方とも、ＳＨＩＰシグナル伝達分子を介して互いにクロストークし、活性化受容体シグナル伝達経路と相互作用する（図１ａ）。阻害性受容体に加えて、ＣＤ２００チェックポイントは、刺激を受けたときにアジュバント様の特性を有する活性化受容体を有し、阻害性シグナルに打ち勝ち、免疫細胞を活性化する。 実験モデル。ＣＤ２００及びＰＤ－Ｌは、腫瘍細胞から分泌され、抗原提示細胞上のＣＤ２００阻害性受容体（ＣＤ２００Ｒ１）またはＰＤ－１受容体に結合し、免疫系を停止させる。ＣＤ２００阻害性ペプチドリガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）を用いてＣＤ２００活性化を標的とすることで、免疫細胞上でＣＤ２００ＡＲ及びＰＤ－１を下方制御することによってＣＤ２００Ｒ１経路及びＰＤ－Ｌ経路を征服する（図１ｂ）。阻害性受容体に加えて、ＣＤ２００チェックポイントは、刺激を受けたときにアジュバント様の特性を有する活性化受容体を有し、阻害性シグナルに打ち勝ち、免疫細胞を活性化する。 ＣＤ２００活性化受容体を標的化することによって、抗原提示細胞を刺激する。（図２Ａ）異なるＣＤ２００ペプチドの相同性を示す、イヌＣＤ２００（アミノ酸６０～１７８）（配列番号１１）、ヒトＣＤ２００（アミノ酸３３～１５２）（配列番号１２）、及びマウスＣＤ２００（アミノ酸３３～１５２）（配列番号１３）配列。イヌＰ４は、配列番号１１の配列１４７～１６１である。ヒトＰ１は、配列番号１２の配列６１～７５であり、ヒトＰ２は、配列番号１２の配列１１０～１２４であり、ヒトＰ３は、配列番号１２の配列７６～９０であり、ヒトＰ４は、配列番号１２の配列１２１～１３５である。マウスＰ１は、配列番号１３の配列６２～７５である。 健康なドナー由来のＣＤ１４^＋細胞を、ヒトペプチドＰ１（ＩＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮＭ）（配列番号１）、Ｐ２（ＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ）（配列番号２）、Ｐ３（ＶＴＦＳＥＮＨＧＶＶＩＱＰＡＹ）（配列番号３）またはＰ４（ＣＬＦＮＴＦＧＦＧＫＩＳＧＴＡ）（配列番号４）でパルスし、４８時間インキュベートした。パルスされなかった（ＮＰ）細胞を対照として使用した。上清を採取し、ＩＬ１β（図２Ｂ）について分析した。 健康なドナー由来のＣＤ１４^＋細胞を、ヒトペプチドＰ１（ＩＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮＭ）（配列番号１）、Ｐ２（ＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ）（配列番号２）、Ｐ３（ＶＴＦＳＥＮＨＧＶＶＩＱＰＡＹ）（配列番号３）またはＰ４（ＣＬＦＮＴＦＧＦＧＫＩＳＧＴＡ）（配列番号４）でパルスし、４８時間インキュベートした。パルスされなかった（ＮＰ）細胞を対照として使用した。上清を採取し、ＴＮＦα（図２Ｃ）について分析した。 未成熟樹状細胞を、ＣＭＶ抗原ｐｐ６５±Ｐ１－Ｐ４でパルスした。細胞を洗浄し、ＣＭＶ陽性及びＣＭＶ陰性の健康なドナー由来の自家Ｔ細胞を添加して戻し、さらに４８時間インキュベートした。上清を採取し、ＩＦＮα産生について分析した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、二元配置ＡＮＯＶＡによると、＊Ｐ＜０．０５）。データは、各群における３個体の別々の健康なドナーを表す。 アラニン置換は、抗原提示細胞刺激を高める。（図３Ａ）ＣＤ１４^＋細胞を等モル比のペプチドでパルスし、４８時間インキュベートした。上清を採取し、ＩＦＮ－１β、ＩＬ－１２ｐ７０、ＭＩＧ、及びＴＮＦα含有量について分析した。（図３Ｂ）別々の実験において、細胞を１時間インキュベートした。ＲＮＡを採取し、免疫に関連する転写変化についてＮａｎｏＳｉｇｈｔによって分析した。パルスされた細胞を、パルスされていない（ＮＰ）対照に対して正規化し、ヒートマップを導出し、ヒートマップは、ｎＳｏｌｖｅｒ内のＪａｖａ Ｔｒｅｅｖｉｅｗを使用することによって生成された。調べた３５個の遺伝子のクラスター解析は、ＮＰ対照と比較した場合、治療された試料の１つ以上において有意なＰ１Ａ８（ＩＶＴＷＱＫＫＡＡＶＳＰＥＮＭ）（配列番号６）、Ｐ２Ａ０（ＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ）（配列番号７）、Ｐ２Ａ５（ＮＩＴＬＡＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ）（配列番号８）、Ｐ３Ａ１２（ＶＴＦＳＥＮＨＧＶＶＩＡＰＡＹ）（配列番号９）、及びＰ４Ａ１０（ＣＬＦＮＴＦＧＦＧＡＩＳＧＴＡ）（配列番号１０）発現変化を示した。Ｄ１－Ｐ３Ａ１２は外れ値であり、解析から除外した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、二元配置ＡＮＯＶＡによると、＊Ｐ＜０．０５）。 アラニン置換は、抗原提示細胞刺激を高める。（図３Ａ）ＣＤ１４^＋細胞を等モル比のペプチドでパルスし、４８時間インキュベートした。上清を採取し、ＩＦＮ－１β、ＩＬ－１２ｐ７０、ＭＩＧ、及びＴＮＦα含有量について分析した。（図３Ｂ）別々の実験において、細胞を１時間インキュベートした。ＲＮＡを採取し、免疫に関連する転写変化についてＮａｎｏＳｉｇｈｔによって分析した。パルスされた細胞を、パルスされていない（ＮＰ）対照に対して正規化し、ヒートマップを導出し、ヒートマップは、ｎＳｏｌｖｅｒ内のＪａｖａ Ｔｒｅｅｖｉｅｗを使用することによって生成された。調べた３５個の遺伝子のクラスター解析は、ＮＰ対照と比較した場合、治療された試料の１つ以上において有意なＰ１Ａ８（ＩＶＴＷＱＫＫＡＡＶＳＰＥＮＭ）（配列番号６）、Ｐ２Ａ０（ＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ）（配列番号７）、Ｐ２Ａ５（ＮＩＴＬＡＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ）（配列番号８）、Ｐ３Ａ１２（ＶＴＦＳＥＮＨＧＶＶＩＡＰＡＹ）（配列番号９）、及びＰ４Ａ１０（ＣＬＦＮＴＦＧＦＧＡＩＳＧＴＡ）（配列番号１０）発現変化を示した。Ｄ１－Ｐ３Ａ１２は外れ値であり、解析から除外した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、二元配置ＡＮＯＶＡによると、＊Ｐ＜０．０５）。 ＣＤ２００活性化受容体を標的化することによって、樹状細胞成熟を向上させる。ＣＤ１４精製細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ４、または等モル比のペプチドＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、もしくはＰ４Ａ１０でパルスし、４８時間インキュベートした。細胞を採取し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲについて表現型を決定した。 ＣＤ２００活性化受容体を標的化することによって、樹状細胞成熟を向上させる。ＣＤ１４精製細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ４、さらに等モル比のペプチドＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、またはＰ４Ａ１０でパルスし、４８時間インキュベートした。細胞を採取し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲについて表現型を決定した。 ＣＭＶを加えて、または加えずに、ドナー由来の未成熟樹状細胞を、ペプチドＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、またはＰ４Ａ１０のＣＭＶ抗原ｐｐ６５＋／－の等モル比でパルスした。細胞を洗浄し、自家Ｔ細胞を添加して戻し、さらに４８時間インキュベートした。上清をＩＦＮγ産生について分析した。 未成熟樹状細胞を、ＣＭＶ抗原ｐｐ６５＋／－Ｐ４Ａ１０でパルスした。細胞を洗浄した後、自家Ｔ細胞を添加して戻し、さらに４８時間インキュベートした。上清をＩＦＮγ、ＩＬ－６、ＴＮＦα及びＲＡＮＴＥＳ含有量について分析した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３の健康なドナー／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。データは、３個体の別々の健常なドナーを表す。黒色の棒グラフは、ＣＭＶ陰性ドナーを表す。 ＣＤ２００阻害剤による治療は、イヌにおいて腫瘍退縮を誘発する。（図５Ａ）腫瘍を切除し、イヌに自家腫瘍溶解物及びイヌ特異的ＣＤ２００ＡＲ－Ｌをワクチン接種し、無増悪生存期間（最上部の黒色の線）及び全生存期間（矢印の付いた中央の線）について追跡した。比較のために、腫瘍溶解物のみで治療された過去のコホートを示す（左側の急勾配の線）。黒色矢印は、現在治験中のイヌを表す。 （図５Ｂ、５Ｃ）切除後に、（図５Ｂ）残存する腫瘍の範囲が存在し、（図５Ｃ）術後４ヶ月の退縮を示す。 （図５Ｂ、５Ｃ）切除後に、（図５Ｂ）残存する腫瘍の範囲が存在し、（図５Ｃ）術後４ヶ月の退縮を示す。 （図５Ｄ、５Ｅ）脳室周囲白質のトラクトのＴ２高信号域及び心室拡張を特徴とする中心性白質脳症を発症した５匹のイヌのうちの１匹からの画像（図５Ｄ）、コルチコステロイド治療後に消失した（図５Ｅ）。 （図５Ｄ、５Ｅ）脳室周囲白質のトラクトのＴ２高信号域及び心室拡張を特徴とする中心性白質脳症を発症した５匹のイヌのうちの１匹からの画像（図５Ｄ）、コルチコステロイド治療後に消失した（図５Ｅ）。 （図５Ｆ～５Ｉ）しかしながら、このイヌは、コルチコステロイド治療の２ヶ月後に行われたＭＲＩで見ることができる腫瘍再発を有していた。 （図５Ｆ～５Ｉ）しかしながら、このイヌは、コルチコステロイド治療の２ヶ月後に行われたＭＲＩで見ることができる腫瘍再発を有していた。 （図５Ｆ～５Ｉ）しかしながら、このイヌは、コルチコステロイド治療の２ヶ月後に行われたＭＲＩで見ることができる腫瘍再発を有していた。 （図５Ｆ～５Ｉ）しかしながら、このイヌは、コルチコステロイド治療の２ヶ月後に行われたＭＲＩで見ることができる腫瘍再発を有していた。 （図５Ｊ～５Ｍ）ＣＤ２００ＡＲ－Ｌによるワクチン接種は、回復後にこのイヌで再開され、２回のワクチン投与から２ヶ月後に腫瘍退縮の証拠があった。 （図５Ｊ～５Ｍ）ＣＤ２００ＡＲ－Ｌによるワクチン接種は、回復後にこのイヌで再開され、２回のワクチン投与から２ヶ月後に腫瘍退縮の証拠があった。 （図５Ｊ～５Ｍ）ＣＤ２００ＡＲ－Ｌによるワクチン接種は、回復後にこのイヌで再開され、２回のワクチン投与から２ヶ月後に腫瘍退縮の証拠があった。 （図５Ｊ～５Ｍ）ＣＤ２００ＡＲ－Ｌによるワクチン接種は、回復後にこのイヌで再開され、２回のワクチン投与から２ヶ月後に腫瘍退縮の証拠があった。 血清ＣＤ２００（ｓＣＤ２００）レベルは、全生存期間と有意に関連していた（＊ｐ＝０．００５）。生存群を、傾向についてのログランク検定であるＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ、及びＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎを使用して解析した。 ＣＤ２００Ｒ１関連遺伝子は、ヒトにおけるさらに短い全生存期間と関連している。（図６Ａ）全生存期間に関連する遺伝子のクラスターを、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓデータベースで利用可能な患者の腫瘍試料において分析した。Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃｏｒｅｓを使用して、図中の特定されたクラスターを数字によって特定した。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ分析において有意なものは、記号付きで示され、それらに関連するｐ値が示される。 ＣＤ２００を含有する高レベルの遺伝子クラスターを発現した患者（破線）が、低レベルを発現した患者（実線）よりも短い全生存期間を示したことを示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ（ＫＭ）プロット。比較は、３つの最下位四分位数（Ｑ２３４）に対する上位四分位数（Ｑ１）で行われる。 ＣＤ２００を含有する高レベルの遺伝子クラスターを発現した患者（破線）が、低レベルを発現した患者（実線）よりも短い全生存期間を示したことを示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ（ＫＭ）プロット。比較は、２つの最下位四分位数（Ｑ３４）に対する２つの上位四分位数（Ｑ１２）で行われる。 ＣＤ２００を含有する高レベルの遺伝子クラスターを発現した患者（破線）が、低レベルを発現した患者（実線）よりも短い全生存期間を示したことを示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ（ＫＭ）プロット。比較は、最下位四分位数（Ｑ４）に対する３つの上位四分位数（Ｑ１２３）で行われる。 ＣＤ２００関連遺伝子が生存率に関連しているかどうかを示す表を提供し、ＧＣＥＳＳを使用して、ＴＣＧＡデータセット内の患者腫瘍試料の遺伝子発現プロファイルを分析した。これにより、データセット全体にわたって一貫して発現され、偏りのない統計分析において全生存期間に関連する遺伝子クラスターを特定することができた。ＣＤ２００Ｒ１発現は、免疫関連転写物を高度に濃縮した遺伝子の大きなクラスター内で見出された。このクラスター内の遺伝子の転写レベルの増加は、生存率の減少と有意に関連していた。高レベルのＣＤ２００Ｒ１含有クラスターを発現した患者（クラスター１４）は、低レベルのクラスターを発現した患者よりも短い全生存時間を示した。これらの結果は、免疫抑制性膠芽腫微小環境の媒介におけるＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ１相互作用の決定的な重要性を示唆する。 ＣＤ２００ＡＲ－Ｌパルスは、阻害性ＣＤ２００Ｒ１を下方制御する。マウスＣＤ１１ｂ細胞をｍＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスし、ＲＮＡを抽出し、ＣＤ２００Ｒ１またはＰＤ－１発現について分析した（図７Ａ及びＢ）。図７の実験は、ＣＤ２００Ｒ１とＰＤ－１のクロストーク、ならびに阻害性ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１経路が、ＣＤ２００ＡＲ４と相互接続することを検証する、マウス及びヒト抗原提示細胞の両方においてＣＤ２００ＡＲが阻害剤ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１を下方制御することを標的とすることを実証した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５）。 ＣＤ２００ＡＲ－Ｌパルスは、阻害性ＣＤ２００Ｒ１を下方制御する。マウスＣＤ１１ｂ細胞をｍＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスし、ＲＮＡを抽出し、ＣＤ２００Ｒ１またはＰＤ－１発現について分析した（図７Ａ及びＢ）。図７の実験は、ＣＤ２００Ｒ１とＰＤ－１のクロストーク、ならびに阻害性ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１経路が、ＣＤ２００ＡＲ４と相互接続することを検証する、マウス及びヒト抗原提示細胞の両方においてＣＤ２００ＡＲが阻害剤ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１を下方制御することを標的とすることを実証した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５）。 これらの研究をさらに進めるために、ＣＤ１１ｂ細胞をＯＶＡ＋／－ＣＤ２００ＡＲ－Ｌで刺激し、細胞を洗浄し、精製されたＴ細胞を添加した。２４時間インキュベートした後、Ｔ細胞を単離し、ＣＤ２００Ｒ１またはＰＤ－１発現について分析した（図７Ｃ及びＤ）。図７の実験は、ＣＤ２００Ｒ１とＰＤ－１のクロストーク、ならびに阻害性ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１経路が、ＣＤ２００ＡＲ４と相互接続することを検証する、マウス及びヒト抗原提示細胞の両方においてＣＤ２００ＡＲが阻害剤ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１を下方制御することを標的とすることを実証した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５）。 これらの研究をさらに進めるために、ＣＤ１１ｂ細胞をＯＶＡ＋／－ＣＤ２００ＡＲ－Ｌで刺激し、細胞を洗浄し、精製されたＴ細胞を添加した。２４時間インキュベートした後、Ｔ細胞を単離し、ＣＤ２００Ｒ１またはＰＤ－１発現について分析した（図７Ｃ及びＤ）。図７の実験は、ＣＤ２００Ｒ１とＰＤ－１のクロストーク、ならびに阻害性ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１経路が、ＣＤ２００ＡＲ４と相互接続することを検証する、マウス及びヒト抗原提示細胞の両方においてＣＤ２００ＡＲが阻害剤ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１を下方制御することを標的とすることを実証した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５）。 これらの実験をヒトに転換したかどうかを確認するために、ＣＤ１４細胞を本願発明者らのヒトＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスした。２４時間インキュベートした後、細胞を抗ＣＤ２００Ｒ１で染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図７Ｅ）。図７の実験は、ＣＤ２００Ｒ１とＰＤ－１のクロストーク、ならびに阻害性ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１経路が、ＣＤ２００ＡＲ４と相互接続することを検証する、マウス及びヒト抗原提示細胞の両方においてＣＤ２００ＡＲが阻害剤ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１を下方制御することを標的とすることを実証した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５）。 平均蛍光強度をＣＤ２００Ｒ１発現について分析した。図７の実験は、ＣＤ２００Ｒ１とＰＤ－１のクロストーク、ならびに阻害性ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１経路が、ＣＤ２００ＡＲ４と相互接続することを検証する、マウス及びヒト抗原提示細胞の両方においてＣＤ２００ＡＲが阻害剤ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１を下方制御することを標的とすることを実証した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５）。 平均蛍光強度をＰＤ－１発現について分析した。図７の実験は、ＣＤ２００Ｒ１とＰＤ－１のクロストーク、ならびに阻害性ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１経路が、ＣＤ２００ＡＲ４と相互接続することを検証する、マウス及びヒト抗原提示細胞の両方においてＣＤ２００ＡＲが阻害剤ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１を下方制御することを標的とすることを実証した。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３／群、ｔ検定によると、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００００５）。 ＣＤ２００ＡＲ－Ｌパルスは、抑制性ＰＤ－Ｌ１を征服する。マウスＣＤ１１ｂ細胞をＰＭＡで活性化し、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１＋マウスＣＤ２００ＡＲ－Ｌで治療した。４８時間後、上清を採取し、ＴＮＦα（図８Ａ）、ＩＬ４（図８Ｂ）、またはＩＬ５（図８Ｃ）について分析した。これらの実験は、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌで細胞をパルスすることが、ＰＤ－Ｌ１の抑制特性を征服することを示した。 ワクチンスケジュール。０日目に外科的デバルキング及び術後ＭＲＩを実施した。ＣＤ２００阻害剤の皮内（ＩＤ）注射、次いで、６～２４時間後にイミキモド適用、及び腫瘍溶解物ワクチン＋ＣＤ２００阻害剤の混合物のＩＤ注射（下向きの実線矢印）を１０日目に開始し、３週間にわたって毎週、次いで３ヶ月間にわたって４週間毎に１回、次いで、１年間、または腫瘍再発または死亡まで、８週間毎に繰り返した。術後直ちに脳のＭＲＩ（上向きの破線矢印）を行い、その後４ヶ月毎に行った。 実験モデル。 ＣＤ２００活性化受容体を標的化することは、抑制性ＰＤ－Ｌ１の効果を阻害する。マウス脾細胞をＰＭＡ、＋／－ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１＋ｍＣＤ２００ＡＲ－Ｌで活性化した。４８時間インキュベートした後、上清をＴＮＦαについて分析した。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、＊Ｐ＜０．００５。 ＣＤ２００活性化受容体を標的化することは、抑制性ＰＤ－Ｌ１の効果を阻害する。マウス脾細胞をＰＭＡ、＋／－ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１＋ｍＣＤ２００ＡＲ－Ｌで活性化した。４８時間インキュベートした後、上清をＩＬ－４について分析した。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、＊Ｐ＜０．００５。 ＣＤ２００活性化受容体を標的化することは、抑制性ＰＤ－Ｌ１の効果を阻害する。マウス脾細胞をＰＭＡ、＋／－ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１＋ｍＣＤ２００ＡＲ－Ｌで活性化した。４８時間インキュベートした後、上清をＩＬ－５について分析した。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、＊Ｐ＜０．００５。 ＰＤ－Ｌ１の効果は、ＣＤ２００Ｒ１をノックアウトすることによって阻害される。野生型またはＣＤ２００Ｒ１ＫＯマクロファージをＰＤ－Ｌ１でパルスし、ｐＳＨＰについて分析した。 ＰＤ－Ｌ１の効果は、ＣＤ２００Ｒ１をノックアウトすることによって阻害される。ＣＤ２００Ｒ１ＫＯ細胞の野生型をＬＰＳ＋／－ＰＤ－Ｌ１でパルスした。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、ｔ検定によると、＊＊Ｐ＜０．００１。 ＣＤ２００活性化受容体を標的とすることで、ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１の発現を下方制御する。マウスＣＤ１１ｂ細胞をＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスし、ＣＤ２００Ｒ１の転写レベルについて分析した。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００００１。 ＣＤ２００活性化受容体を標的とすることで、ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１の発現を下方制御する。マウスＣＤ１１ｂ細胞をＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスし、ＰＤ－１の転写レベルについて分析した。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００００１。 ヒトＣＤ１４細胞をヒトＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスし、４８時間のインキュベート後、ＣＤ２００Ｒ１の発現についてフローサイトメトリーによって細胞を分析した。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００００１。 ヒトＣＤ１４細胞をヒトＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスし、４８時間のインキュベート後、ＰＤ－１の発現についてフローサイトメトリーによって細胞を分析した。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００００１。 野生型マウス由来のマウスＣＤ１１ｂ細胞をＯＶＡ＋／－ＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスした。細胞を洗浄し、精製されたＣＤ３細胞をＣＤ１１ｂ細胞に２４時間かけて添加した。ＣＤ３細胞を精製し、ＣＤ２００Ｒ１の転写レベルについて分析した。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００００１。 野生型マウス由来のマウスＣＤ１１ｂ細胞をＯＶＡ＋／－ＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスした。細胞を洗浄し、精製されたＣＤ３細胞をＣＤ１１ｂ細胞に２４時間かけて添加した。ＣＤ３細胞を精製し、ＰＤ－１の転写レベルについて分析した。エラーバーは、ｎ＝３の代表であり、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００００１。 ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ＣＴＬＡ４及びＰＤ－Ｌ１の発現を征服する。ＣＤ２００、ＰＤ－Ｌ１＋／－ｍＣＤ２００ＡＲ－Ｌで脾細胞をパルス化した。細胞を、ＣＤ４^＋ＣＴＬＡ４^＋集団についてフローサイトメトリーによって分析した。エラーバーは、ｎ＝２の代表であり、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ＣＴＬＡ４及びＰＤ－Ｌ１の発現を征服する。ＣＤ２００、ＰＤ－Ｌ１＋／－ｍＣＤ２００ＡＲ－Ｌで脾細胞をパルス化した。細胞を、ＣＤ８^＋ＣＴＬＡ４^＋集団についてフローサイトメトリーによって分析した。エラーバーは、ｎ＝２の代表であり、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ＣＴＬＡ４及びＰＤ－Ｌ１の発現を征服する。ＣＤ２００、ＰＤ－Ｌ１＋／－ｍＣＤ２００ＡＲ－Ｌで脾細胞をパルス化した。細胞を、ＣＤ１１ｂ^＋ＰＤ－Ｌ１^＋集団についてフローサイトメトリーによって分析した。エラーバーは、ｎ＝２の代表であり、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００１。

過去１０年間にわたるがん免疫療法の前例のない成功は、免疫監視の概念の直接的な結果であり、以前は予後が悪かった悪性腫瘍の臨床管理に革命をもたらした。免疫療法開発の最前線にあるのは、免疫チェックポイント阻害剤であり、多くの組織学的腫瘍型にわたるそれらの広範な生物活性、それらの応答の耐久性、及び転移性疾患及び化学耐性疾患でさえ観察された治癒の結果として、がん療法において膨大で他に類を見ない成功がみられた。

免疫チェックポイント遮断戦略の中で、（これまでの臨床的成功の点で）最も顕著な２つは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）を標的とすること、ならびにプログラム細胞死１（ＰＤ－１）とプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）との間の相互作用である。しかしながら、腫瘍が免疫応答を阻害するために利用する複数の機構に起因して、単剤療法の使用は妨げられている。このことは、変異負荷が低く、及び／または免疫原性が低い腫瘍が、この形態の療法に本質的に耐性であり得るため、神経膠腫などの高悪性度（ＨＧＧ）及び低悪性度（ＬＧＧ）の両方の悪性脳腫瘍に特に当てはまる。好ましい腫瘍型であっても、腫瘍の多様性が免疫療法を妨げる。これは、免疫チェックポイント阻害剤によって標的化される一連の活性化分子及び阻害分子における冗長性に関連し得る。したがって、生存率を著しく向上させる複数の阻害剤が用いられてきた。残念ながら、これらの療法は、しばしば死亡を含む重大な免疫関連有害事象を引き起こす。したがって、複数のチェックポイントを標的とする代替的アプローチは、必須である。

現在、研究は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ４に対する単一阻害剤に焦点を当てたものである。本願発明者らは、ＣＤ２００チェックポイントを標的とすることで、ＣＤ２００、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ４チェックポイントの抑制特性を征服することを発見した。ＣＤ２００阻害剤は、固形腫瘍に対する免疫療法のための有効かつ安全なチェックポイント阻害剤である。

本発明は、特定の実施形態において、細胞にＣＤ２００活性化受容体リガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）を投与することによる、細胞においてＰＤ－１を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチド模倣薬である。特定の実施形態において、ペプチド模倣薬は、１つ以上のＤ－異性体アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ペプチド模倣薬は、１つ以上の非天然アミノ酸を含む。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、イヌ特異的ペプチド（ｃＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）である。

特定の実施形態において、細胞は、がん細胞である。

特定の実施形態において、がん細胞は、膠芽腫細胞である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチドＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、Ｐ２Ａ５、Ｐ３Ａ１２、またはＰ４Ａ１０である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチドヒトＰ１Ａ８である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチドヒトＰ２Ａ０である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチドヒトＰ４Ａ１０である。

特定の実施形態において、細胞は、がん細胞である。

特定の実施形態において、がん細胞は、膠芽腫細胞である。

本発明は、特定の実施形態において、哺乳動物において腫瘍溶解物ワクチンの有効性を高める方法であって、腫瘍溶解物ワクチンの投与前に哺乳動物にＣＤ２００活性化受容体リガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）を投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍溶解物は、ＣＤ２００を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」とは、物質（例えば、腫瘍溶解物）が、未処理物質よりも少ないレベルのＣＤ２００、例えば、１～１００％少ないＣＤ２００を有することを意味する。特定の実施形態において、ＣＤ２００は、標準的な方法を使用した吸収によって除去される。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ヒト特異的ペプチド（ｈＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、イヌ特異的ペプチド（ｃＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）である。

特定の実施形態において、細胞は、がん細胞である。

特定の実施形態において、がん細胞は、膠芽腫細胞である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチドＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、Ｐ２Ａ５、Ｐ３Ａ１２、またはＰ４Ａ１０である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチドヒトＰ１Ａ８である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチドヒトＰ２Ａ０である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチドヒトＰ４Ａ１０である。

特定の実施形態において、細胞は、がん細胞である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、局所注射によって投与される。

特定の実施形態において、腫瘍溶解物ワクチンは、皮下投与される。

特定の実施形態において、腫瘍溶解物ワクチンは、自家腫瘍溶解物ワクチンである。

特定の実施形態において、哺乳動物は、腫瘍を外科的に除去してから５～１４日後にＣＤ２００ＡＲ－Ｌを投与される。

特定の実施形態において、哺乳動物は、腫瘍を外科的に除去してから約１０日後にＣＤ２００ＡＲ－Ｌを投与される。

特定の実施形態において、（ａ）種特異的ＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドを皮内（ＩＤ）注射し、（ｂ）２４時間後、イミキモドを皮膚に局所的に適用し、１０～１５分間吸収させ、（ｃ）ＣＤ２００ＡＲ－Ｌと混合した自家腫瘍溶解物を皮内注射する。

特定の実施形態において、種特異的ＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドは、約５μｇ／ｋｇの投薬量で皮内（ＩＤ）注射される。

特定の実施形態において、イミキモド（１パケット）は、５％クリーム／１２．５ｇの投薬量で皮膚に局所的に適用される。

特定の実施形態において、自家腫瘍溶解物の約５００μｇのタンパク質を、約５μｇ／ｋｇのＣＤ２００ＡＲ－Ｌと混合し、皮内注射する。

特定の実施形態において、治療レジメンは、３週間にわたって毎週繰り返される。

特定の実施形態において、治療レジメンは、３週間にわたって毎週、次いで３ヶ月間にわたって４週間毎に１回、次いで、必要に応じて６～８週間毎に繰り返される。

「哺乳動物」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト、高等非ヒト霊長類、げっ歯類、家畜、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ及びネコを指す。一実施形態において、対象は、ヒトである。一実施形態において、対象は、イヌである。

本発明は、特定の実施形態において、薬学的に許容される担体または希釈剤と、活性成分としてＣＤ２００ＡＲ－Ｌと、任意選択で、異常な細胞成長、機能または挙動から生じる疾患または障害を治療するための医薬の使用またはその製造のために上で定義されるがんワクチン（例えば、腫瘍溶解物）と、を含む、薬学的組成物の使用を提供する。特定の実施形態において、疾患または障害は、がんである。特定の実施形態において、がんは、結腸、乳房、脳、肝臓、卵巣、胃、肺、及び頭頸部の固形腫瘍から選択される。特定の実施形態において、がんは、膠芽腫、黒色腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、肝細胞癌、及び甲状腺癌から選択される。特定の実施形態において、がんは、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、精巣、生殖泌尿器、食道、喉頭、膠芽腫、神経芽腫、胃、皮膚、ケラトアカントーマ、肺、類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、結腸、腺腫、膵臓、腺癌、甲状腺、濾胞癌、未分化癌、乳頭癌、精巣腫、黒色腫、肉腫、膀胱癌、肝臓癌及び胆道、腎臓癌、骨髄障害、リンパ系障害、有毛細胞、口腔及び咽頭（口腔）、唇、舌、口、咽頭、小腸、結腸直腸、大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジキンリンパ腫及び白血病から選択される。

本発明は、特定の実施形態において、異常な細胞成長、機能または挙動から生じる疾患または障害を治療する方法であって、この方法が、それを必要とする患者に、順次投与されるＣＤ２００ＡＲ－Ｌとがんワクチン（例えば、腫瘍溶解物）とを含む治療レジメンを投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、治療レジメンは、少なくとも２回投与される。特定の実施形態において、投与は、少なくとも３回用量の治療レジメンを投与することを含む。特定の実施形態において、投与は、少なくとも５回用量の治療レジメンを投与することを含む。特定の実施形態において、投与は、少なくとも１０回用量の治療レジメンを投与することを含む。特定の実施形態において、少なくとも２回の連続した投与量の投与は、約１週間または約１ヶ月の間隔によって間があけられる。特定の実施形態において、方法は、治療レジメンの投与の前、同時に、または後に、アジュバントを投与することをさらに含む。

特定の実施形態において、本発明は、異常な細胞成長、機能または挙動から生じる疾患または障害を有する患者において免疫抑制を逆転または調節する方法であって、この方法が、それを必要とする患者に、上述の組成物または治療レジメンを投与することを含む、方法を含む。

特定の実施形態において、本発明は、異常な細胞成長、機能または挙動から生じる疾患または障害を有する患者において腫瘍微小環境またはセンチネルリンパ節における免疫抑制を逆転または調節する方法であって、この方法が、それを必要とする患者に、上述の組成物または治療レジメンを投与することを含む、方法を含む。特定の実施形態において、疾患または障害は、がんである。特定の実施形態において、がんは、膠芽腫、黒色腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、肝細胞癌、及び甲状腺癌から選択される。

特定の実施形態において、がんは、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、精巣、生殖泌尿器、食道、喉頭、膠芽腫、神経芽腫、胃、皮膚、ケラトアカントーマ、肺、類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、結腸、腺腫、膵臓、腺癌、甲状腺、濾胞癌、未分化癌、乳頭癌、精巣腫、黒色腫、肉腫、膀胱癌、肝臓癌及び胆道、腎臓癌、骨髄障害、リンパ系障害、有毛細胞、口腔及び咽頭（口腔）、唇、舌、口、咽頭、小腸、結腸直腸、大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジキンリンパ腫及び白血病から選択される。

特定の実施形態において、本発明は、送達することが、組成物を動物に静脈内投与することを含む、方法を提供する。

特定の実施形態において、本発明は、組成物が全身ポンプを使用して動物に投与される、方法を提供する。

「治療有効量」という用語は、病状／状態を治療することに関して、単回用量として、または複数回用量で投与される場合に、病状／状態の任意の症状、態様、または特徴に対して任意の検出可能な正の効果を有することができる治療薬剤の量を指す。そのような効果は、絶対的に有益である必要はない。

「治療する」及び「治療」という用語は、治療的処置及び防止的もしくは予防的な措置の両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害を防止または低減することである。本発明の目的のために、有益または望ましい臨床結果としては、限定されないが、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行を遅らせるか、または遅くすること、病状の改善または緩和（部分的または全体的）が挙げられる。「治療」は、治療を受けていない場合の予想生存期間と比較して、生存期間の延長も意味し得る。治療を必要としているものとしては、既に状態もしくは障害を患っているもの、状態もしくは障害を患いやすいもの、または状態もしくは障害が予防されるべきものが挙げられる。

がんワクチン
本明細書に記載される場合、がんワクチンは、腫瘍抗原ワクチンであり得る。腫瘍抗原ワクチンは、がん細胞（例えば、腫瘍溶解物）、がん細胞の一部、または純粋な腫瘍抗原（腫瘍細胞から単離された物質）から作製されるワクチンである。腫瘍抗原ワクチンは、身体の免疫系を刺激して、がん細胞を発見し、死滅させることができる。例えば、がんワクチンは、神経膠腫癌細胞、乳癌細胞、または他の固形腫瘍癌細胞、またはこれらの細胞の一部もしくはこれらの細胞に由来する抗原を含み得る。特定の実施形態において、がんワクチンは、ワクチン抗原を含み、ここで、培養した腫瘍細胞由来溶解物は、抗原の供給源である。

ペプチド及びペプチド模倣薬
特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、１２～１５アミノ酸長を有するペプチドである。例えば、特定の実施形態において、ペプチドは、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ヒトＣＤ２００ＡＲ－Ｌである。
Ｐ１：ＩＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮＭ（配列番号１）
Ｐ２：ＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ（配列番号２）
Ｐ３：ＶＴＦＳＥＮＨＧＶＶＩＱＰＡＹ（配列番号３）
Ｐ４：ＣＬＦＮＴＦＧＦＧＫＩＳＧＴＡ（配列番号４）

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、イヌＣＤ２００ＡＲ－Ｌである。
Ｐ４：ＣＬＦＮＴＦＧＳＧＫＩＳＧＴＡ（配列番号５）

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、マウスＣＤ２００ＡＲ－Ｌである。
Ｐ１：ＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮＭ（配列番号１７）

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、天然の産物ではない、天然に存在しないペプチドである。特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ＣＤ２００のドメインに対応する天然に存在するペプチドと比較して、著しく異なる特徴（例えば、構造、機能、及び／または他の特性）を含む。ペプチドの純度は、９５％を超えており、各ペプチドは、その安定性を向上させるために、Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化によって修飾される。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチドＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、Ｐ２Ａ５、Ｐ３Ａ１２、またはＰ４Ａ１０。Ｐ１Ａ８（ＩＶＴＷＱＫＫＡＡＶＳＰＥＮＭ）（配列番号６）、Ｐ２Ａ０（ＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ）（配列番号７）、Ｐ２Ａ５（ＮＩＴＬＡＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ）（配列番号８）、Ｐ３Ａ１２（ＶＴＦＳＥＮＨＧＶＶＩＡＰＡＹ）（配列番号９）、またはＰ４Ａ１０（ＣＬＦＮＴＦＧＦＧＡＩＳＧＴＡ）（配列番号１０）である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ペプチド模倣薬である。本明細書で使用される場合、「ペプチド模倣薬」は、ペプチドを模倣するように化学的に設計された小さなタンパク質様鎖である。特定の実施形態において、ペプチド模倣薬は、非修飾ペプチドと比較して、安定性（例えば、インビボ半減期）または生物学的活性の向上など、特定の調節された分子特性を有するように設計される。例えば、ペプチド模倣薬は、本明細書に記載のペプチドを化学修飾することによって生成され得る。化学修飾としては、限定されないが、Ｄ－異性体アミノ酸、β３アザ－アミノ酸、変化した骨格を含むこと、及び／または非天然アミノ酸の組み込みが挙げられる。例えば、これらの戦略は、天然（Ｌ－）アミノ酸を非天然（Ｄ－）アミノ酸またはβ３アザ－アミノ酸に置き換えることに基づいている。他の戦略としては、アミド結合（－ＣＯＮＨ－）をチオアミドまたはＮ－メチル化アミドで置き換えることが挙げられる。他の方法は、Ｎ末端及びＣ末端アミノ酸をアミド、エステル、またはＤ－アミノ酸に変化させることを伴う。

したがって、特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、１つ以上のＤ－異性体アミノ酸を含むように操作される。特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上のＤ－異性体アミノ酸を含む。特定の実施形態において、アミノ酸の約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％は、Ｄ－異性体アミノ酸である。

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、１つ以上の非天然アミノ酸（例えば、デヒドロアラニン、ホモセリン、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマカルボキシグルタメート、馬尿酸、オクタヒドロインドール ２－カルボン酸、スタチン、１，２，３，４，テトラヒドロイソキノリン－３ カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、αメチルアラニン、パラベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、及びｔｅｒｔブチルグリシン）を含むように操作される。特定の実施形態において、ＣＤ２００ペプチド阻害剤は、１２、１３、１４、または１５個の非天然アミノ酸を含む。特定の実施形態において、アミノ酸の約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％は、非天然アミノ酸である。

ＣＤ２００ＡＲ－Ｌの使用
本明細書に記載される場合、ＣＤ２００ＡＲ－ＬまたはＣＤ２００ＡＲ－Ｌを含む本明細書に記載の組成物は、免疫抑制を逆転させるか、または調節するために使用され得る。ＣＤ２００は、ＣＤ２００Ｒを有する免疫細胞を負に制御する（例えば、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を抑制する）免疫抑制タンパク質である。本明細書に記載される場合、「免疫抑制を逆転または調節すること」は、ＣＤ２００タンパク質及び／または腫瘍の免疫抑制特性を変化させ、妨害し、減少させることを指す。特定の実施形態において、ＣＤ２００タンパク質活性は、哺乳動物において、ＣＤ２００タンパク質が存在しない状態での腫瘍に対する活性と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％減少する。例えば、骨髄由来抑制細胞及び制御性Ｔ細胞などの免疫抑制細胞は、増加した活性を示し、一方で、樹状細胞（ＤＣ）は、がん患者の腫瘍及びセンチネルリンパ節において障害されているようである。したがって、特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－ＬまたはＣＤ２００ＡＲ－Ｌを含む本明細書に記載の組成物の投与により、骨髄由来抑制細胞及び制御性Ｔ細胞などの免疫抑制細胞の活性を低下させることができ、及び／または腫瘍微小環境及び／またはセンチネルリンパ節においてＤＣの活性を増加させることができる。特定の実施形態において、逆転または調節は、本明細書に記載のサイトカインプロファイルを評価することによって確認することができる。（例えば、サイトカインプロファイルは、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌの投与の前及び後に決定し、比較することができる。実施例も参照されたい。）

本明細書で言及される場合、「腫瘍微小環境」は、腫瘍細胞を取り囲み、供給する正常な細胞、分子及び血管である。腫瘍は、その微小環境を変えることができ、微小環境は、腫瘍の成長及び拡散に影響を及ぼす可能性がある。

本明細書に記載される場合、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、（例えば、同時に、または順次投与される場合に）がんワクチンの有効性を高め得る。例えば、特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ及びがんワクチンは、複合製剤（すなわち、本明細書に記載の組成物）であってもよく、または順次投与または同時投与のための別々の製剤であってもよい。

本明細書に記載される場合、「有効性を高める」は、がんワクチンだけを投与することによって生成される有益な免疫応答よりも大きい、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ及びがんワクチンを投与することによって生成される有益な免疫応答を意味する。特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ及びがんワクチン（例えば、本明細書に記載の組成物）の投与によって、哺乳動物において、腫瘍のサイズ（体積）が１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％減少し、この減少は、がんワクチン単独の投与からの減少よりも大きい。特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ及びがんワクチンの投与（例えば、同時投与または逐次投与）によって、相乗効果をもたらす。

薬学的組成物
本発明はまた、特定の実施形態において、薬学的に許容される担体または希釈剤と、活性成分として、本明細書に記載の組成物と、を含む、薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、経口投与または注射のために製剤化される。

本発明はまた、特定の実施形態において、治療によるヒトまたは動物の身体の治療方法で使用するための本明細書に記載の組成物も提供する。

本発明はまた、特定の実施形態において、医薬療法で使用するための本明細書に記載の組成物も提供する。

本発明はまた、特定の実施形態において、異常な細胞成長、機能または挙動から生じる疾患または障害の治療において使用するための本明細書に記載の組成物を提供する。

本発明はまた、特定の実施形態において、異常な細胞成長、機能または挙動から生じる疾患または障害を治療するための医薬の製造における本明細書に記載の組成物の使用を提供する。特定の実施形態において、疾患または障害は、がんである。特定の実施形態において、がんは、結腸、乳房、脳、肝臓、卵巣、胃、肺、及び頭頸部の固形腫瘍から選択される。特定の実施形態において、がんは、膠芽腫、黒色腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、肝細胞癌、及び甲状腺癌から選択される。特定の実施形態において、がんは、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、精巣、生殖泌尿器、食道、喉頭、膠芽腫、神経芽腫、胃、皮膚、ケラトアカントーマ、肺、類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、結腸、腺腫、膵臓、腺癌、甲状腺、濾胞癌、未分化癌、乳頭癌、精巣腫、黒色腫、肉腫、膀胱癌、肝臓癌及び胆道、腎臓癌、骨髄障害、リンパ系障害、有毛細胞、口腔及び咽頭（口腔）、唇、舌、口、咽頭、小腸、結腸直腸、大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジキンリンパ腫及び白血病から選択される。

本発明はまた、特定の実施形態において、異常な細胞成長、機能または挙動から生じる疾患または障害を治療する方法であって、この方法が、それを必要とする患者に、本明細書に記載の組成物を投与することを含む、方法も提供する。特定の実施形態において、疾患または障害は、がんである。特定の実施形態において、がんは、膠芽腫、黒色腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、肝細胞癌、及び甲状腺癌から選択される。特定の実施形態において、がんは、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、精巣、生殖泌尿器、食道、喉頭、膠芽腫、神経芽腫、胃、皮膚、ケラトアカントーマ、肺、類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、結腸、腺腫、膵臓、腺癌、甲状腺、濾胞癌、未分化癌、乳頭癌、精巣腫、黒色腫、肉腫、膀胱癌、肝臓癌及び胆道、腎臓癌、骨髄障害、リンパ系障害、有毛細胞、口腔及び咽頭（口腔）、唇、舌、口、咽頭、小腸、結腸直腸、大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジキンリンパ腫及び白血病から選択される。

本発明はまた、特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物と薬学的に許容される担体とを組み合わせることを含む、薬学的組成物を製造するためのプロセスも提供する。

本発明はまた、特定の実施形態において、がんを治療するためのキットであって、（ａ）本明細書に記載の組成物を含む第１の薬学的組成物と、（ｂ）使用説明書とを含む、キットも提供する。

本発明は、上述のＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドをコードする核酸配列をさらに提供する。ＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドをコードする核酸は、当該技術分野において周知の方法を使用して製造することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１を参照されたい）。

対象に免疫を付与するために、組成物は、通常、適切なビヒクル中の筋肉内注射または皮下注射によって、非経口投与される。しかしながら、経口、鼻腔内、または皮内送達などの他の投与様式も許容される。

ワクチン製剤は、有効量の活性成分をビヒクル中に含有し、有効量は、当業者によって容易に決定される。活性成分は、典型的には、組成物の約１％～約９５％（ｗ／ｗ）、または適切な場合、さらに高いまたは低い範囲であり得る。投与される量は、ワクチン接種を検討される動物またはヒト対象の年齢、体重及び健康状態などの要因に依存する。この量はまた、動物の免疫系が抗体を合成する能力、及び所望な保護の程度に依存する。有効投薬量は、用量応答曲線を確立する日常的な試験を介して、当業者によって容易に確立され得る。対象は、バイオフィルムペプチドまたはその断片を１つ以上の用量で投与することによって免疫化される。目的の細菌に対する免疫状態を維持するために必要に応じて、複数の用量を投与することができる。

鼻腔内製剤としては、鼻粘膜に刺激を引き起こさず、線毛機能を著しく障害しないビヒクルが含まれ得る。水、生理食塩水、または他の既知の物質などの希釈剤は、本発明とともに用いられ得る。経鼻製剤はまた、保存剤（限定されないが、クロロブタノール及び塩化ベンザルコニウムなど）を含有してもよい。界面活性剤は、鼻粘膜による対象タンパク質の吸収を高めるために存在し得る。経口液体調製物は、例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤の形態であってもよく、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで再構成するための錠剤の形態もしくは製品で乾燥状態で提示されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、または保存剤などの従来の添加剤を含み得る。

ワクチンを調製するために、精製された組成物を単離し、凍結乾燥し、安定化することができる。次いで、組成物を適切な濃度に調整し、任意選択で、適切なワクチンアジュバントと組み合わせ、使用のために包装してもよい。

アジュバント
「アジュバント」は、体液及び／または細胞の免疫応答を非特異的に刺激する任意の分子または化合物である。これらは、抗原の存在下でのみ免疫応答を産生するため、非特異的であると考えられる。アジュバントは、かなり少ない用量の抗原を使用することを可能にし、可溶性抗原に対する強力な抗体応答を誘導するために不可欠である。例えば、治療薬剤がアジュバントと併せて投与される場合、治療薬剤は、アジュバントの前、後、及び／または同時に投与され得る。アジュバントは、当該技術分野において知られており、限定されないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリ：ＩＣＬＣ、及びイミキモドが挙げられ得る。

腫瘍溶解物を作製するための方法
腫瘍溶解物は、治療される腫瘍の試料を対象から抽出することによって作製される。次いで、腫瘍細胞を溶解させる。有効な腫瘍溶解物を作製する方法としては、限定されないが、凍結解凍法、超音波処理、マイクロ波、沸騰、高熱、洗剤または化学系細胞溶解、電気または電流に基づく溶解、ならびに極限力などの他の物理的方法が挙げられる。

特定の実施形態において、例えば、神経膠腫が治療される場合、神経膠腫特異的受容体（またはこれらのタンパク質をコードする発現ベクター）であるＥＧＦ受容体ＶＩＩＩバリアント及びＩＬ－１３受容体α－２を、腫瘍溶解物に添加してもよい。

製剤及び投与方法
本発明のワクチン及び組成物は、薬学的組成物として製剤化され、選択された投与経路、すなわち、経口、鼻腔内、皮内、または非経口、静脈内、筋肉内、局所、または皮下経路によって適合される様々な形態で、ヒト患者などの哺乳動物宿主に投与され得る。

したがって、本発明の化合物は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体などの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、全身（例えば、経口）投与され得る。それらは、硬質または軟質のシェルゼラチンカプセルに封入され得るか、錠剤に圧縮され得るか、または患者の食事の食物に直接組み込まれ得る。治療的経口投与のために、活性化合物は、１つ以上の賦形剤と組み合わせられ、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハなどの形態で使用され得る。かかる組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有しなければならない。組成物及び調製物の割合は、もちろん変化してもよく、簡便には、所与の単位剤形の重量の約２～約６０％であってもよい。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、有効な投与量レベルが得られるような量である。

錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、以下のものを含有してもよい。結合剤、例えば、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、もしくはゼラチン、賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム、崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸など、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、及び甘味剤、例えば、スクロース、フルクトース、ラクトース、もしくはアスパルテーム、または香味剤、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはチェリー香味料を添加してもよい。単位剤形がカプセルである場合、上記の種類の材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含み得る。コーティングとして、または固体単位剤形の物理的形態を変更するために、様々な他の材料が存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラック、または糖などでコーティングされ得る。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、ならびにチェリーまたはオレンジ風味などの香味剤を含有し得る。もちろん、任意の単位剤形の調製に使用される任意の材料は、薬学的に許容され、使用される量では実質的に非毒性であるべきである。加えて、活性化合物は、徐放性調製物及びデバイスに組み込まれ得る。

活性化合物はまた、注入または注射によって静脈内投与または腹腔内投与され得る。活性化合物またはその塩の溶液は、任意選択で非毒性の界面活性剤と混合された水中で調製されてもよい。分散剤が、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物の中で、また、油の中で調製される場合もある。通常の保管及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するための保存剤を含有する。

注射または注入に適した薬学的剤形は、滅菌水溶液または分散液、または任意選択でリポソームに封入された、滅菌注射液もしくは注入液もしくは分散液の即時調製に適した活性成分を含む滅菌粉末を含み得る。全ての場合において、最終的な剤形は、製造及び保存条件下で滅菌され、流体であり、かつ安定でなければならない。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒または液体分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、または界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤及び抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、緩衝液、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによってもたらされ得る。

滅菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、上に列挙される種々の他の成分とともに、適切な溶媒に、必要とされる量の活性化合物を組み込み、その後で濾過滅菌することによって調製される。滅菌の注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、予め滅菌濾過した溶液中に存在する活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を得る。局所投与のために、本発明の化合物は、純粋な形態で適用され得る（すなわち、それらが液体である場合に）。しかしながら、それらを組成物または製剤として、固体または液体であり得る皮膚科的に許容される担体と組み合わせて皮膚に投与することが一般的に望ましい。

有用な固体担体としては、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどの細かく分割された固体が挙げられる。有用な液体担体としては、水、アルコールもしくはグリコール、または水－アルコール／グリコールブレンドが挙げられ、ここで、本発明の化合物は、任意選択で非毒性界面活性剤で補助することにより、有効なレベルで溶解または分散することができる。香料または抗菌剤などの追加の成分を添加して、所与の使用のための特性を最適化することができる。得られる液体組成物は、吸収性パッドから塗布することができ、包帯及び他の創傷被覆材を含浸させるために使用することができ、またはポンプ式またはエア路ゾルスプレーを使用して患部にスプレーすることができる。

合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪族アルコール、修飾セルロース、または修飾鉱物材料などの増粘剤も、液体担体とともに用いて、使用者の皮膚に直接適用するための、拡散可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することができる。

本発明の化合物を皮膚に送達するために使用することができる有用な皮膚学的組成物の例は、当技術分野に既知であり、例えば、Ｊａｃｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，５５９，１５７号）及びＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい。

本発明の化合物の有用な投薬量は、動物モデルにおけるそれらのインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の動物における有効投薬量のヒトへの外挿方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。

一般に、ローションなどの液体組成物中の本発明の化合物（複数可）の濃度は、約０．１～２５重量％、好ましくは約０．５～１０重量％である。ゲルまたは粉末などの半固体または固体の組成物中の濃度は、約０．１～５重量％、好ましくは約０．５～２．５重量％である。

治療における使用に必要な化合物、またはその活性塩もしくは誘導体の量は、選択される特定の塩だけでなく、投与経路、治療される状態の性質、ならびに患者の年齢及び状態によっても変化し、最終的には、担当医師または臨床医の裁量である。

しかしながら、一般に、好適な用量は、１日当たり約０．５～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内、例えば、１日当たり約１０～約７５ｍｇ／体重ｋｇ、例えば、１日当たりレシピエントの体重１ｋｇ当たり３～約５０ｍｇ、好ましくは６～９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内、最も好ましくは１５～６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内にある。

化合物は、簡便には単位剤形で投与され、例えば、単位剤形当たり５～１０００ｍｇ、簡便には１０～７５０ｍｇ、最も簡便には５０～５００ｍｇの活性成分を含有する。

理想的には、活性成分は、約０．５～約７５μＭ、好ましくは約１～５０μＭ、最も好ましくは約２～約３０μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を達成するように投与されるべきである。これは、例えば、０．０５～５％の活性成分の溶液（任意選択で生理食塩水の溶液）を静脈内注射するか、または約１～１００ｍｇの活性成分を含有するボーラスとして経口投与することによって達成され得る。望ましい血中レベルは、約０．０１～５．０ｍｇ／ｋｇ／時間を提供するような連続注入によって、または約０．４～１５ｍｇ／ｋｇの活性成分（複数可）を含有する断続的な注入によって維持され得る。

所望の用量は、簡便には、単回用量で、または適切な間隔、例えば、１日当たり２回、３回、４回、またはそれ以上の用量未満の用量として投与される分割用量として提示され得る。用量未満の用量自体を、例えば、複数の個別の緩い間隔の投与、例えば、吸入器からの複数回の吸入、または複数の液滴を眼に塗布することによって、さらに分割してもよい。

特定の実施形態において、本発明のワクチンは、対象における腫瘍のサイズを少なくとも約１０％～１００％（腫瘍の体積）減少させる。

定義
「結合した」とは、例えば、化学的に結合することによって共有結合性であり得るか、または非共有結合性（例えば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合）であり得る結合または接続を指す。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素－硫黄結合、炭素－リン結合などであり得る。「結合した」という用語は、「共役した」、「カップリングした」、「融合した」及び「接続した」などの用語よりも広く、これらを含む。

本発明は、単離されたか、または実質的に精製されたタンパク質（またはペプチド）組成物を包含する。本発明の文脈において、「単離された」か、または「精製された」ポリペプチドは、その天然環境とは別に存在し、したがって、天然の産物ではないポリペプチドである。ポリペプチドは、精製された形態で存在していてもよく、または例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非天然環境に存在していてもよい。例えば、「単離された」もしくは「精製された」タンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、組換え技法によって産生される場合、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。細胞物質を実質的に含まないタンパク質としては、汚染タンパク質を約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満含むタンパク質またはポリペプチドの調製物が挙げられる。本発明のタンパク質、またはその生物学的に活性な部分が、組換えによって産生される場合、好ましくは、培養培地は、目的の化学物質の化学前駆体または非タンパク質の約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満を表す。開示されるタンパク質またはそれによってコードされる部分長タンパク質の断片及びバリアントもまた、本発明によって包含される。「断片」または「部分」とは、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の全長または全長未満を意味する。

「天然に存在する」とは、自然界に見出すことができる物体を、人為的に生じるものとは異なるものとして説明するために用いられる。例えば、天然の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に改変されていない、生物体（ウイルスを含む）内に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列は、天然に存在する。

ペプチドの文脈における「実質的同一性」という用語は、ペプチドが、特定の比較ウィンドウにわたって、参照配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、または７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、または９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。最適アラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して実施される。２つのペプチド配列が実質的に同一であることの指標は、１つのペプチドが、第２のペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に反応性であることである。したがって、ペプチドは、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみによって異なる場合、第２のペプチドと実質的に同一である。

配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。

「アミノ酸」という用語には、Ｄ形態またはＬ形態の天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌ）の残基、ならびに非天然アミノ酸（例えば、デヒドロアラニン、ホモセリン、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタメート、馬尿酸、オクタヒドロインドール ２－カルボン酸、スタチン、１，２，３，４ テトラヒドロイソキノリン－３ カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、αメチルアラニン、パラベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、及びｔｅｒｔブチルグリシン）が含まれる。この用語はまた、従来のアミノ酸保護基（例えば、アセチルまたはベンジルオキシカルボニル）を有する天然及び非天然アミノ酸、ならびにカルボキシ末端で保護される天然及び非天然アミノ酸（例えば、（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、フェニルまたはベンジルエステルまたはアミドとして、またはα－メチルベンジルアミドとして）を含む。他の好適なアミノ保護基及びカルボキシ保護基は、当業者に既知である（例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１、及びその中で引用される参考文献を参照されたい）。この用語はまた、シクロプロピル側鎖またはエチル側鎖を有する天然及び非天然のアミノ酸を含む。

本発明は、単離されたか、または実質的に精製されたタンパク質組成物を包含する。本発明の文脈において、「単離された」か、または「精製された」ポリペプチドは、その天然環境とは別に存在するポリペプチドである。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用される。単離されたタンパク質分子は、精製された形態で存在していてもよく、または例えば、トランスジェニック宿主細胞またはバクテリオファージなどの非天然環境に存在していてもよい。例えば、「単離された」もしくは「精製された」タンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、組換え技法によって産生される場合、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まない場合があり、または化学的に合成される場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合がある。細胞物質を実質的に含まないタンパク質としては、汚染タンパク質を約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満含むタンパク質またはポリペプチドの調製物が挙げられる。特定の実施形態において、「単離された」か、または「精製された」タンパク質は、細胞溶解物を含み得る。本発明のタンパク質、またはその生物学的に活性な部分が、組換えによって産生される場合、好ましくは、培養培地は、目的の化学物質の化学前駆体または非タンパク質の約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量で）未満を表す。開示されるタンパク質またはそれによってコードされる部分長タンパク質の断片及びバリアントもまた、本発明によって包含される。「断片」または「部分」とは、タンパク質のアミノ酸配列の全長または全長未満を意味する。

「バリアント」ポリペプチドは、天然タンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端への１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆるトランケーション）または付加、天然タンパク質中の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失または付加、あるいは天然タンパク質中の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換による、天然タンパク質に由来するポリペプチドを意図する。かかるバリアントは、例えば、遺伝子多型を形成し得るか、または人間による操作から生じ得る。かかる操作のための方法は、一般に、当該技術分野において知られている。

したがって、本発明のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、トランケーション、及び挿入を含む様々な様式で変化し得る。かかる操作のための方法は、一般に、当該技術分野において知られている。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発及びヌクレオチド配列改変のための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７（１９８７）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９８３）、及びその中で引用される参考文献を参照されたい。目的となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に対する助言は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．１９７８）のモデルにおいて見出され得る。あるアミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換は、生物学的活性の変化がほとんどないか、または変化がないことが望ましい場合に好ましい。

したがって、本発明のポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ならびにその変形及び修飾形態を包含する。かかるバリアントは、所望の活性を依然として保持するであろう。本明細書に包含されるポリペプチド配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特徴において根本的な変化をもたらすことは予想されない。しかし、そうする前に、置換、欠失、または挿入の正確な効果を予測することが困難な場合、当業者は、その効果が日常的なスクリーニングアッセイによって評価されることを理解するであろう。

コード配列中の単一アミノ酸または少ない割合のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）を改変、付加または欠失させる個々の置換欠失または付加は、「保存的に改変された変異」であり、改変によって、アミノ酸を化学的に類似したアミノ酸で置換する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野で周知である。以下の５つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。これに加えて、コード配列中の単一アミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変化させ、付加し、または欠失する個々の置換、欠失または付加もまた、「保存的に改変された変異」である。

「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方の機能の影響を受けるような分子の会合を指す。

本明細書で使用される場合、「治療薬剤」または「治療複合体」という用語は、哺乳動物レシピエントに対して有益な効果を有する任意の薬剤または材料を指す。したがって、「治療薬剤」は、核酸またはタンパク質成分を有する治療分子及び予防分子の両方を包含する。

「治療すること」は、本明細書で使用される場合、所与の疾患または状態の少なくとも１つの症状を改善し、治癒し、及び／またはその発症を予防することを指す。

「免疫応答」は、Ｂリンパ球及び／またはＴリンパ球及び／または抗原提示細胞の活性化または増殖をもたらす体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を指す。しかし、いくつかの場合において、免疫応答は、低強度であってもよく、本発明による少なくとも１つの物質を使用する場合にのみ、検出可能になる。「免疫原性」は、免疫系の１つ以上の機能が増加し、免疫原性薬剤に向けられるように、生体の免疫系を刺激するために使用される薬剤を指す。「免疫原性ポリペプチド」は、細胞及び／または体液性免疫応答を単独または担体に連結して誘発するポリペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞を活性化してもよい。

免疫応答を「高める」物質とは、その物質を添加せずに測定した同一の免疫応答と比較した場合、その物質の添加に伴って何らかの方法で増加するか、または強化されるか、または逸脱する免疫応答が観察される物質を指す。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶解活性は、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、免疫化中の物質の使用の有無にかかわらず、得られた試料中で測定することができる。ＣＴＬ溶解活性が、物質を含まないＣＴＬ溶解活性と比較して高められる物質の量は、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに十分な量であると言われている。特定の実施形態において、免疫応答は、少なくとも約２倍、例えば約３倍以上高められる。分泌されるサイトカインの量または種類も変化し得る。あるいは、誘導される抗体またはそのサブクラスの量が、変化し得る。

用語「免疫化する」または「免疫化」または関連用語は、標的抗原またはエピトープに対して実質的な免疫応答（抗体及び／またはエフェクターＣＴＬなどの細胞免疫を含む）をマウントする能力を付与することを指す。これらの用語は、完全な免疫を作製することを必要とせず、むしろベースラインよりも実質的に大きい免疫応答を生成することを必要とする。例えば、標的抗原に対する細胞及び／または体液性免疫応答が本発明の方法の適用後に生じる場合、哺乳動物は標的抗原に対して免疫化されるとみなされ得る。

「免疫療法薬」という用語は、疾患、障害、または状態を治療するための組成物を指す。より具体的には、この用語は、有益な免疫応答が、ワクチン接種によって、または免疫分子の移入によって生成される治療方法を指すように使用される。「免疫学的に有効な量」は、個体に導入されたときに、その個体において免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量を指す。能動免疫化の文脈において、この用語は、「免疫原的に有効な量」と同義である。免疫学的に有効であるために必要な組成物の量は、その組成、組成物中の他の成分の存在、抗原、免疫化の経路、個体、以前の免疫状態または生理学的状態などを含む多くの要因に応じて変化する。

ここで、本発明を、以下の非限定的な実施例によって説明する。

実施例１
膠芽腫免疫療法のための自家腫瘍ワクチン接種と組み合わせた、ＣＤ２００免疫チェックポイントの逆転。
免疫療法の最近の進歩は、腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質の阻害と、腫瘍溶解物に基づくワクチン接種戦略を含んでいる。ここでは、本願発明者らは、膠芽腫モデルにおいて、これらのアプローチを組み合わせた。免疫チェックポイントタンパク質ＣＤ２００を標的とする合成ペプチドの投与は、Ｔ細胞媒介性抗膠芽腫効果を誘導するための抗原提示細胞の能力を向上させた。本願発明者らは、イヌ自然発生神経膠腫において、自家腫瘍溶解物ワクチンの皮下送達前にイヌ特異的ＣＤ２００指向性ペプチドを局所注射すると、自家腫瘍溶解物単独で治療された過去の対照と比較して、生存期間が延びることを見出した（生存期間中央値は、それぞれ１２．７ヶ月及び６．３６ヶ月）。このペプチドでプライミングされた抗原提示細胞及びＴリンパ球は、阻害性ＣＤ２００受容体のそれらの発現を抑制し、それにより、免疫抑制性ＣＤ２００タンパク質が豊富な膠芽腫微小環境において、それらが免疫反応を開始させる能力を高めた。これらの結果は、新規の膠芽腫免疫療法剤としてのＣＤ２００リガンドの使用を裏付ける。

免疫療法は、がん治療の歴史において３番目に重要な進歩である。モノクローナル抗体による免疫チェックポイント遮断の臨床的成功により、推定３０００回の免疫腫瘍学的治験が行われている。対照的に、腫瘍ワクチンに基づく治療戦略に対する免疫チェックポイントの適切さは、あまり注目されていない。原則として、腫瘍ワクチン中に免疫チェックポイント分子が存在すると、局所抗原提示細胞（ＡＰＣ）が腫瘍抗原に対する獲得免疫応答を活性化する能力が損なわれ、それによって、治療の有効性が損なわれるであろう。

獲得免疫応答の間、選択された細胞表面タンパク質の発現は、免疫活性化を下方制御または終結させる。免疫チェックポイント分子として知られるこれらのタンパク質が固形腫瘍で発現するという観察結果は、免疫腫瘍学における影響の大きな発見であった。これらの分子は、Ｔリンパ球上の同種の受容体と相互作用して、抗原提示時にＴ細胞活性化に必要なシグナル伝達を抑制し、それによって腫瘍がその後の免疫応答を回避することを可能にする。これらの所見は、腫瘍微小環境における免疫抑制を逆転させるための免疫チェックポイント阻害剤を開発するための努力の根底にある。

ここでは、ＣＤ２００（ＯＸ２）免疫チェックポイントの阻害剤が、膠芽腫に対する自家腫瘍溶解物ワクチンの有効性を増強するかどうかを検討する。膠芽腫は、原発性成人脳癌の最も一般的な形態である。膠芽腫に罹患した患者の予後は依然として悪く、侵襲的な外科的切除、化学療法、及び放射線療法の後の生存期間中央値は、１４．６ヶ月である。中枢神経系（ＣＮＳ）は、以前は免疫特権を有する部位であると考えられていたが、その後の研究により、先天性免疫応答及び獲得免疫応答が、膠芽腫発病に対する宿主応答において重要な役割を果たすことが明らかになった。この知見は、膠芽腫の治療モダリティとしての腫瘍ワクチンの研究につながった。このアプローチでは、切除された腫瘍由来の抗原を注射して、任意の残存腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発する。しかしながら、膠芽腫は、腫瘍に対する宿主免疫反応を中和する細胞表面及び可溶性タンパク質の両方の形態で、いくつかの免疫抑制チェックポイント分子を発現する。膠芽腫の腫瘍微小環境における免疫抑制に加えて、これらのチェックポイント分子は、腫瘍溶解物に基づくワクチン接種戦略にとって非常に大きな課題を提示する。溶解物中の１つのそのようなチェックポイント分子であるＣＤ２００（ＯＸ２としても知られる）の存在は、局所ＡＰＣが腫瘍抗原に対する獲得免疫応答を開始する能力を損なわせる。

ＣＤ２００は、Ｔ細胞シグナル伝達に必要な共刺激受容体のＢ７ファミリーに関連する免疫チェックポイントタンパク質である。ＣＤ２００欠損マウスは、自己免疫表現型を示し、このことは、免疫チェックポイントタンパク質としてのＣＤ２００の役割をさらに実証する。重要なことに、ＣＤ２００は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、黒色腫、卵巣腫瘍、転移性小細胞癌、及び膠芽腫を含む広範囲のがんで発現される。ＣＤ２００は、腫瘍細胞表面で発現するが、ＡＤＡＭ２８（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ２８）などの金属プロテアーゼによって切断される。特に、血漿中の可溶性ＣＤ２００のレベルは、ＣＬＬ患者における腫瘍負荷及び生存率と相関する。がんによって放出されるＣＤ２００とＡＰＣ上のその阻害性受容体（ＣＤ２００Ｒ１）との間の物理的相互作用（図１Ａ及び１Ｂ）は、インターロイキン２（ＩＬ２）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を含む炎症促進性サイトカインの分泌を抑制し、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の産生を増加させ、抗腫瘍免疫応答が損なわれる。

本願発明者らは、以前に、ＣＤ２００－ＣＤ２００Ｒ１相互作用が、膠芽腫の免疫抑制性微小環境を維持するための中心であることを実証し、これらの相互作用を標的とするペプチドを開発した。その後の研究により、これらのペプチドは、阻害性ＣＤ２００Ｒ１を介するのではなく、別個のＣＤ２００活性化受容体（ＣＤ２００ＡＲ）を介して、それらの効果を媒介することが明らかになった（図１Ａ及び１Ｂ）。これらの所見は、ＣＤ２００を模倣するペプチドがＣＤ２００ＡＲを調節することを示唆する。さらに、本願発明者らの以前のマウス実験は、ＣＤ２００ＡＲを標的とするリガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）としてＣＤ２００を模倣するペプチドを投与することによって、免疫刺激を達成することができることを示唆している。本願発明者らは、注目せずにはいられないＣＤ２００模倣ペプチドの治療効果を見出し、これらの所見を臨床現場に転換することを望んだ。ヒトＣＤ２００ＡＲ－Ｌ受容体とマウスＣＤ２００ＡＲ－Ｌ受容体との間の配列ダイバージェンスのため、マウスペプチドは、ヒトＣＤ２００ＡＲを標的とするのに最適なものではなかった。ここでは、ヒト特異的ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ及びイヌ特異的ＣＤ２００ＡＲ－Ｌの開発を記載する。これらのペプチドが、ヒトＡＰＣが抗腫瘍応答を開始する能力を高めることを示す。重要なことに、皮下自家腫瘍溶解物ワクチンの投与前のイヌＣＤ２００ＡＲ－Ｌの局所注射は、イヌ自然発生膠芽腫モデルにおいてインビボでこのワクチンの有効性を有意に高めた。

方法
ペプチド合成。ペプチドを、１）ＣＤ２００ＡＲと相互作用することが以前に示されたＣＤ２００タンパク質の領域と、２）マウス、イヌ、及びヒトＣＤ２００の間の相同性を示す配列とに基づいて設計した。３つの１５アミノ酸ペプチド（Ｐ１、Ｐ３、及びＰ４）及び１つの１４アミノ酸ペプチド（Ｐ２）を合成した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、ＩＬ）。
Ｐ１：ＩＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮＭ（配列番号１）
Ｐ２：ＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮ（配列番号２）
Ｐ３：ＶＴＦＳＥＮＨＧＶＶＩＱＰＡＹ（配列番号３）
Ｐ４：ＣＬＦＮＴＦＧＦＧＫＩＳＧＴＡ（配列番号４）

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、イヌＣＤ２００ＡＲ－Ｌである。
Ｐ４：ＣＬＦＮＴＦＧＳＧＫＩＳＧＴＡ（配列番号５）

特定の実施形態において、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、マウスＣＤ２００ＡＲ－Ｌである。
Ｐ１：ＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮＭ（配列番号１７）

ペプチドの純度は、９５％を超えており、各ペプチドは、その安定性を向上させるために、Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化によって修飾される。

ＴＣＧＡ分析。Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データポータル（ｔｃｇａ－ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ）を使用して、膠芽腫患者についての生存時間、死亡事象、及びＲＮＡｓｅｑデータをダウンロードした。Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０（Ｃ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ １．５２）を使用して、遺伝子発現データをｌｏｇ_２変換し、平均中心を計算し、次いで、標準偏差＞１．０を有する全ての遺伝子に対してＰｅａｒｓｏｎ類似性基準を使用した階層的平均連結クラスタリングを行った。デンドログラムノード相関＞０．２０であり、少なくとも５０個の個々の遺伝子を有する遺伝子クラスターを同定し、転帰との関連性が生成された。ＣＤ２００Ｒ１含有クラスターのＧｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃｏｒｅｓ（ＧＣＥＳＳ）と転帰との間の関連性は、ＧＣＥＳＳ値の四分位数を使用して生成された群のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ分析に基づいて報告される。クラスター１４に共局在化した遺伝子のリストは、ＣＤ２００Ｒ１＿ｃｌｕｓｔｅｒ＿ｇｅｎｅ ｌｉｓｔ．ｘｌｓとして含まれる。

サイトカイン測定。抗ＣＤ１４ビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を使用して、ヒトＣＤ１４^＋細胞（５×１０^５個）を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、典型的には、７０％以上の回収率及び９０％以上の純度を得た。細胞を２μＭのＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドでパルスし、４８時間インキュベートし、その後、上清をサイトカイン産生のためのビーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）によって分析した。

樹状細胞分化。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）陽性ＨＬＡ－Ａ２^＋リンパ球パックを米国赤十字（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）から入手し、ＣＤ１４^＋細胞を精製した。約１×１０^８個のＣＤ１４^＋細胞を、５％ＣＯ_２中、３７℃のポリスチレン組織培養フラスコ中で培養した。ＧＭ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－４（４０ｎｇ／ｍＬ）の両方を３日目及び５日目に添加して、未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を誘導した。

ＣＭＶアッセイ。ｉＤＣ（５×１０^５個）を１０μｇのＣＭＶ抗原ペプチドｐｐ６５４９５－５０３（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）でパルスし、上述のように培養した。次いで、ｉＤＣを３回洗浄し、ＣＭＶ陽性ドナー由来の５×１０^５個のＣＤ８^＋Ｔ細胞を、パルスされたｉＤＣとともにインキュベートした。ＣＭＶ陰性ＰＢＭＣを陰性対照として使用した。４８時間のインキュベートの後に上清を収集し、サイトメトリービーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってＩＦＮγ産生について分析した。

ナノストリング遺伝子発現分析：ＣＤ１４^＋細胞由来の全ＲＮＡを、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｄｕｎｅｄｉｎ， Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）に送り、炎症の間に差次的に発現される遺伝子の発現を測定した（ｎＣｏｕｎｔｅｒ ＧＸ， ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ， ＵＳＡ）。簡単に述べると、全ＲＮＡを、組織に適合させたプロトコル（ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｄｕｏ機、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、ＣＤ１４^＋細胞（ＭａｇＪＥＴ ＲＮＡキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から抽出した。次いで、ＲＮＡ試料を定量化し（Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＲＮＡ完全性分析（２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ）を行った。ＣＤ４４（ＮＭ＿００１００１３９２．１）、ＮＡＮＯＧ（ＮＭ＿０２４８６５．２）、ＯＣＴ４（ＮＭ＿００２７０１．４）、ＳＴＡＴ３ （ＮＭ＿１３９２７６．２）、及びハウスキーピング遺伝子グルクロニダーゼベータ（ＮＭ＿０００１８１．１）、クラスリン重鎖（ＮＭ＿４８５９．２）、及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＮＭ＿０００１９４．１）をコードする遺伝子のためのプローブは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって設計され、製造された。

ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＧＸを用いて得られた発現データを、デフォルト設定を有するｎＳｏｌｖｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．０（ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｎＳｏｌｖｅｒ）を使用して分析し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。ｎＳｏｌｖｅｒを使用してクラスター解析を行い、Ｊａｖａ Ｔｒｅｅｖｉｅｗ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．１．６ｒ４を使用することによってヒートマップを生成した。経路解析を、ＰａｔｈＣａｒｄｓ Ｐａｔｈｗａｙ Ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｐａｔｈｃａｒｄｓ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）を使用して行った。スチューデントのｔ検定を使用して、有意差を決定した（ｐ＜０．０５）。

イヌの研究。核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって発見された孤発性軸内塊を有するペットのイヌを、パイロット研究に採用し、イヌ特異的ペプチドの効果を評価した。ＭＲＩを実施して、全身発作活性または挙動変化の原因を見出し、発作を制御し、脳浮腫を最小限に抑えるために、それぞれ、抗てんかん薬療法及びコルチコステロイドを処方した。追加の組み入れ基準は、１）外科的切除に適した腫瘍、２）イヌの飼い主から提供されたインフォームドコンセント、３）手術時の正常な精神状態、及び４）神経膠腫の疑いに対する以前の原因療法がないこと、であった。

全てのイヌは、最大限の腫瘍デバルキングのための軸内塊の外科的切除を受けた。取り出した腫瘍を直ちに処理し、自家腫瘍溶解物を生成した。細かく切り刻んだ新鮮な腫瘍試料からの単一細胞懸濁液を、５％Ｏ_２中、３７℃で培養することによって、溶解物を調製した。培養した腫瘍細胞を、複数回の凍結融解サイクルによって溶解し、２０Ｇｙを照射した。術後直ちにＭＲＩを行って、切除の程度を評価し、残存腫瘍体積を定量化した。腫瘍体積は、各ＭＲスライス上の腫瘍周辺の輪郭を描く平面測定法を使用して測定した。Ｏｓｉｒｉｘソフトウェアを使用して面積を計算し、次いで、面積を合計し、スライス厚さ＋ギャップ幅を掛け算した。麻酔から回復した後、全てのイヌを集中治療室で少なくとも２４時間監視した。抗てんかん薬（フェノバルビタール、レベチラセタム、及びゾニサミド、単独または併用）は術後継続したが、コルチコステロイド投与は、徐々に量を減らし、１０～１４日以内に中止した。

最初のワクチン接種は、手術から１０日後に投与され、３週間にわたって毎週、次いで３ヶ月間にわたって４週間毎に１回、次いで、腫瘍の進行または死亡まで６～８週間毎に繰り返された（図９）。ワクチンプロトコルは以下の通りであった。イヌ特異的ＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチド（５μｇ／ｋｇ）を皮内注射した（ＩＤ）。２４時間後、イミキモド（１パケット５％クリーム／１２．５ｇ）を皮膚に局所的に適用し、１０～１５分間吸収させた後に、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ（５μｇ／ｋｇ）と混合した自家腫瘍溶解物（約５００μｇのタンパク質）を皮内注射した。術後４ヶ月、８ヶ月、１２ヶ月のＭＲＩ及び身体検査により疾患状況を監視し、その後、腫瘍再発が疑われる場合は必要に応じて監視した。

外科的切除は、ガドリニウム増強病変に対する残存コントラスト増強がない場合、または非増強病変についてＴ２荷重ＦＬＡＩＲ（流体減衰反転回復）の高強度がない場合、全切除であると定義され、元の腫瘍体積の１０％未満が残存する場合は、ほぼ全切除であると定義され、または１０％を超える残存腫瘍体積がある場合は、部分切除であると定義された。フォローアップＭＲＩに対する臨床応答は、腫瘍の証拠がない場合、完全奏効（ＣＲ）とみなされ、腫瘍体積が６５％以上減少している場合、部分奏効（ＰＲ）とみなされ、腫瘍体積が４０％を超えて増加している場合、進行（ＰＤ）とみなされ、応答が上に定義するＣＲ、ＰＲ、またはＰＤに該当しない場合、安定とみなされた。イヌが予定されたＭＲＩの前に再発性または悪化する神経学的徴候を呈した場合、ＭＲＩが実施された。

結果
ＣＤ２００ＡＲ－Ｌに対する阻害性ペプチドの設計及び同定。ＣＤ２００ＡＲ－Ｌと相互作用するＣＤ２００の領域の以前の分析により、ヒト、イヌ、及びマウスの間で有意な相同性を共有する４つの領域を明らかにした（図２ａ）。ヒトＣＤ２００中のこれらの４つの領域に対応する、Ｐ１～４と呼ばれる４つのＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドを生成した。これらのペプチドがＡＰＣを活性化するかどうかを判定するために、マウスＣＤ２００模倣ペプチドについて以前に観察されたように、精製されたヒトＣＤ１４^＋細胞を、４つの異なるＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドでパルスし、上清を免疫刺激性サイトカインについて分析した（図２ｂ、ｃ）。パルスされていない対照と比較して、それぞれ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４でパルスされたＣＤ１４^＋細胞において、ＩＬ－１β ｐ＝０．０１２６、ｐ＝０．３６４、ｐ＝０．００２２、ｐ＝０．０００８）及びＴＮＦα（ｐ＝０．０１４６、ｐ＝０．０００７、ｐ＝０．００２２、及びｐ＝０．００８２）の統計的に有意な増加が観察された。これらのペプチドが抗原特異的応答を生成するかどうかを判定するために、ＣＭＶ陽性ドナー由来のＴ細胞がＣＭＶ抗原ｐｐ６５でプライミングされたＣＭＶモデルを使用した。未成熟樹状細胞をＣＭＶ抗原ｐｐ６５＋ＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドでパルスすると、ｐｐ６５単独と比較して、有意な抗原特異的応答、すなわち、ＩＦＮγの産生を誘発した（Ｐ１：ｐ＝０．０３４、Ｐ２：ｐ＝０．０３３、Ｐ３：ｐ＝０．００４２、及びＰ４：ｐ＝０．０２０２、図２ｄ）。

ＡＰＣを最大限に刺激するペプチドを作製するために、４つのペプチドの各アミノ酸をアラニンで置換し、６１個のアラニン置換ペプチドを得た。精製されたＣＤ１４^＋細胞をこれらのペプチドでパルスし、応答をサイトカイン放出として測定した。ＣＤ１４^＋細胞からの炎症性サイトカインの分泌を最大限に刺激する５つのペプチドを選択した。Ｐ１Ａ８（Ｐ１Ａ８＝８番目のアミノ酸で置換されたアラニンを有するＰ１ペプチド）、Ｐ２Ａ０（Ｐ１Ａ０＝アラニン置換を有しないＰ２ペプチド）、Ｐ２Ａ５、Ｐ３Ａ１２、及びＰ４Ａ１０。

次に、これらのペプチドがＣＤ１４^＋細胞をパルスするために使用された後の、より広範なセットの免疫刺激性サイトカイン（ＩＬ－１２ｐ７０、ＭＩＧ、及びＴＮＦを含む）に対するこれらのペプチドの効果を分析した（図３ａ）。５つのペプチドの各々での治療後に、有意なサイトカイン誘導が観察された。ＣＤ１４^＋細胞に対するこれらのペプチドの効果を特性決定するために、ＲＮａｓｅｑを行った。Ｐ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、またはＰ４Ａ１０による治療は、ＴＮＦシグナル伝達に応答して放出されるサイトカインのｍＲＮＡ発現の顕著な増加を誘導し（表１、図３ａ）、これは、ＣＤ２００の暴露がＡＰＣにおけるＴＮＦシグナル伝達を抑制し、ＣＤ２００模倣薬がこの効果Ｒを逆転させるという本願発明者らの以前の結果と一致する。これらの結果を、ＴＮＦ制御サイトカインのｍＲＮＡ発現を検出するように設計されたＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームを使用して反復発生させた（図３ｂ）。最も強力かつ一貫してＴＮＦ制御サイトカインのｍＲＮＡ発現を誘導した３つのペプチド（Ｐ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、及びＰ４Ａ１０）を、その後の分析のために選択した。

ＣＤ２００活性化受容体を標的化することによって、樹状細胞成熟を向上させる。ＴＮＦ制御サイトカイン（表１）は、樹状細胞成熟に関与している。したがって、ＲＮＡｓｅｑ結果（図３ｂ）は、Ｐ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、及びＰ４Ａ１０が、樹状細胞成熟に寄与することを示唆する。これを立証するために、健常なヒトドナーからＣＤ１４^＋細胞を単離し、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ４、Ｐ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、またはＰ４Ａ１０ ２７でパルスした。Ｐ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、及びＰ４Ａ１０でパルスされた細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ４で治療された細胞よりも高いレベルの共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲを発現した（ｐ＜０．０００１、図４ａ）。さらに、ＣＤ１４＋細胞をＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ４及び各ペプチドとともにインキュベートした場合の、ＣＤ８０／８６及びＨＬＡ－ＤＲの相乗的上方制御を観察した（ｐ＜０．０００１）（図４ｂ）。これらの結果は、Ｐ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、及びＰ４Ａ１０が、ＣＤ１４＋単球のｉＤＣへの分化を向上させたことを示唆する。

抗原特異的応答に対するＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、及びＰ４Ａ１０の効果を評価するために、以下のアッセイでＩＦＮγ放出を測定した。ｉＤＣを、等モル量のＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、またはＰ４Ａ１０を加えるか、または加えずに、ＣＭＶ抗原ｐｐ６５でパルスした。次いで、自家Ｔ細胞を添加し、ｉＤＣとともに４８時間インキュベートし、その後、上清中でＩＦＮγ産生を測定した。ｐｐ６５への曝露は、Ｔ細胞ＩＦＮγ産生を約４倍増加させた（図４ｃ）。ｐｐ６５及びＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、またはＰ４Ａ１０を用いたｉＤＣの同時治療は、ｐｐ６５単独よりもさらに２～３倍、ＩＦＮγ放出を増加させた。これらのデータは、Ｐ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、またはＰ４Ａ１０が、ヒトＴ細胞から抗原特異的応答を誘導する樹状細胞の能力を高めたことを示す。３つのペプチドのうち最も強力なＰ４Ａ１０によるｉＤＣの治療は、ＩＦＮγ、ＩＬ６、ＴＮＦα、及びＲＡＮＴＥＳのＴ細胞分泌をそれぞれ５．４倍、５．６倍、１６．６倍、及び１６．３倍高めた。スクランブルしたペプチド対照は、ｐｐ６５応答を高めることができなかった（図４ｄ）。これらの結果は、Ｐ４Ａ１０が、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導するＡＰＣの能力を高めることを示唆する。

ＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドは、自然発生イヌ神経膠腫モデルにおける腫瘍溶解物ワクチン接種の有効性を増強する。本願発明者らの研究所は、膠芽腫を治療するための戦略としての自家腫瘍溶解物ワクチン接種の開発に長年の関心を寄せている。本願発明者らは、このような溶解物中の免疫チェックポイントタンパク質の存在は、この療法の有効性を損なう可能性があると仮定する。ヒトＰ４Ａ１０ペプチドは、イヌペプチドと高い相同性を有するため（図２ａ）、自家腫瘍溶解物の導入前にイヌＣＤ２００ＡＲ－Ｌを皮下注射すると、自然発生する膠芽腫のイヌモデルにおいてワクチンの有効性が高まるという仮説を立てた。この仮説を試験するために、自然発生する膠芽腫を有する２１匹のイヌを、腫瘍切除と、イヌＣＤ２００ＡＲ－Ｌ＋自家腫瘍溶解物からなるワクチン接種で治療した（図９）。腫瘍進行及び全生存期間を、腫瘍切除後に自家腫瘍溶解物単独で治療されたイヌの以前のコホートからの過去のデータと比較した。これらの２つのコホートについての切除の程度は、同等であった。イヌＣＤ２００ＡＲ－Ｌを投与されたイヌにおいて、２５ヶ月間の無増悪生存率６７％を観察した（図５ａ）。死亡は、イヌの３３％（７／２１）が腫瘍再発に起因し、イヌの３３％（７／２１）が腫瘍進行以外の原因で死亡したか、または安楽死させられた。死後の検査を行わない２匹のイヌは、腫瘍の進行により死亡したと推定された。対照的に、腫瘍進行は、腫瘍溶解物のみで治療された群のイヌの１００％（１５／１５０）における死因であった。自家腫瘍溶解物接種前のイヌＣＤ２００ＡＲ－Ｌ投与により治療されたイヌの生存期間中央値は、１２．７ヶ月であった。この生存期間は、腫瘍溶解物ワクチン接種のみで治療されたイヌの６．３６ヶ月の生存期間と比較して良好であった（図５ａ）。術後１８ヶ月（５４８日）に腫瘍再発を有する１匹のイヌを、第２の手術、続いてイヌＣＤ２００ＡＲ－Ｌと同時投与された自家腫瘍溶解物ワクチンで治療し、合計２８ヶ月の間、さらに９．９３ヶ月生存した。このイヌは、図５ａに含まれなかった。

興味深いことに、６匹のイヌは、術後最大５０％の残存腫瘍を有していたが、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌと腫瘍溶解物ワクチンの同時投与から４ヶ月後に得られたＭＲＩで腫瘍の退縮が見られた（図５ｂ、ｃ）。５匹のイヌは、脳室周囲白質のトラクトのＴ２高信号域及び心室拡張を特徴とする大脳白質脳症を発症した。しかしながら、これらの徴候は、コルチコステロイド治療後に消失した（図５ｄ及びｅ）。重篤な臨床症状を有する１匹のイヌにおいて、ワクチン療法も中止され、Ｔ２高信号域は消失したが、２ヶ月後に実施されたＭＲＩで腫瘍再発が認められた（図５ｆ～５ｉ）。イヌが回復したときにワクチン及びペプチド療法を再開し、２ヶ月時点で再び腫瘍退縮がみられた（図５Ｊ～５Ｍ）。

血清ＣＤ２００レベルは、上衣腫患者における腫瘍負荷及び全生存期間と関連することが以前に示されていたため、本願発明者らは、２１匹のイヌ対象から血清を収集し、分析した。前回の研究と一致して、本願発明者らは、血清ＣＤ２００レベルと全生存期間との間に有意な関連性を見出した（図５ｎ）。全血球数及び血清化学プロファイルは、治療に関連する有害作用の明らかな証拠を明らかにしなかった。これらのデータは、Ｐ４Ａ１０に基づく治療戦略のためのコンパニオンバイオマーカーとしての血清ＣＤ２００の潜在的な有用性を示唆する。

Ｐ４Ａ１０でプライミングされたＴリンパ球は、ＣＤ２００Ｒ１の発現を下方制御する。ＣＤ２００関連遺伝子が生存期間に関連しているかどうかを調べるために、ＧＣＥＳＳ２４を使用して、ＴＣＧＡデータセット内の患者腫瘍試料の遺伝子発現プロファイルを分析した。これにより、データセット全体にわたって一貫して発現され、偏りのない統計分析において全生存期間に関連する遺伝子クラスターを特定することができた。ＣＤ２００Ｒ１発現は、免疫関連転写物を高度に濃縮した遺伝子の大きなクラスター内で見出された。このクラスター内の遺伝子の転写レベルの増加は、生存率の減少と有意に関連していた（図６ａ、６ｅ）。高レベルのＣＤ２００Ｒ１含有クラスターを発現した患者（クラスター１４）は、低レベルのクラスターを発現した患者よりも短い全生存時間を示した（図６ｂ～ｄ）。これらの結果は、免疫抑制性膠芽腫微小環境の媒介におけるＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ１相互作用の決定的な重要性を示唆する。

この文脈におけるＰ４Ａ１０＋自家腫瘍溶解物戦略の有効性は、興味深い解決困難な問題を生じさせる。刺激後にＡＰＣ提示に応答するＴ細胞は、阻害性ＣＤ２００Ｒ１２９を発現する。したがって、これらのプライミングされたＴ細胞の免疫刺激効果は、可溶性であり腫瘍によって発現されるＣＤ２００が豊富な膠芽腫微小環境に入ると鈍化すると予想される。しかしながら、本願発明者らは、Ｔ細胞に対する抗原提示前のＣＤ２００ＡＲ－Ｌプライミングが、本願発明者らのマウスモデルにおけるＡＰＣ（ｐ＝０．０００１）及びＴ細胞（ｐ＝０．００９）の両方における阻害性ＣＤ２００Ｒ１の発現を抑制し（図７ａ、ｂ）、それによって、膠芽腫腫瘍微小環境におけるＣＤ２００の効果に対するこれらの細胞の耐性を生じさせることを見出した。この仮説を裏付けるように、抗原提示前のＰ４Ａ１０プライミングがＣＤ２００Ｒ１発現を抑制することを見出した（図７ｄ）。このような抑制は、モック治療細胞において観察されなかった。同様のＰＤ－１の下方制御がＡＰＣで観察された（ｐ＝０．００５、図７ｃ）。これらの結果は、ＣＮＳにおける免疫抑制を、ＣＮＳ外で生じる免疫調節を通じて克服することができることを示す。

さらに、ヒトＣＤ１４細胞をヒトＣＤ２００ＡＲ－Ｌ（Ｐ１Ａ８）でパルスし、パルスされていない細胞を対照として使用して実験を行った。細胞を単離し、ＰＤ－１のレベルについてフローサイトメトリー（図７ｅ）によって分析した。平均蛍光強度をＣＤ２００Ｒ１（図７ｆ）及びＰＤ－１発現（図７ｇ）について分析した。これらの実験により、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、抑制性ＰＤ－１受容体を下方制御することが示された（図７ｇ）。

考察
ほとんどの免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍微小環境における免疫抑制を逆転させることを目的として開発される。ここで、本願発明者らは、自家腫瘍ワクチン接種の部位における免疫チェックポイント逆転の有効性を探る代替のパラダイムを探索した。本願発明者らの以前の研究は、腫瘍溶解物中のＣＤ２００免疫チェックポイントタンパク質の存在が、局所ＡＰＣが動員されたＴ細胞を活性化し、効果的な抗腫瘍免疫応答を引き起こす能力を抑制するという、注目せずにはいられないデータを提供した。この観察に基づいて、ＣＤ２００媒介性免疫抑制を標的とするペプチドであるＰ４Ａ１０が、ＣＤ２００の免疫抑制効果を逆転させることができるかどうかを調べた。本願発明者らの結果は、Ｐ４Ａ１０が、ヒトＴ細胞から抗原特異的応答を誘導するＡＰＣの能力を高めることを示した。注目すべきことに、Ｔ細胞に対する抗原提示前のＣＤ２００ＡＲ－Ｌプライミングが、阻害性ＣＤ２００Ｒ１の発現を抑制し、それによって、膠芽腫腫瘍微小環境におけるＣＤ２００の効果に対するこれらの細胞の耐性を生じさせる。これらの免疫刺激分子の皮内注射は、免疫調節因子の全身投与に関連する全身毒性の可能性を最小限にする。

マウス脳腫瘍モデルは、膠芽腫の病因に関する貴重な洞察をもたらしたが、これらのモデルにおいて非常に有望であることを示した療法は、臨床転換においてしばしば失敗している。最適な治療モデルに対するコンセンサスなしに、これらの失敗に対処するために米国国立衛生研究所（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって複数の専門家パネルが招集されている。そのようなコンセンサスがない場合、マウス以外の動物における治療試験は、臨床試験を設計する前に考慮する必要がある。本願発明者らのイヌ研究は、この文脈で特に関連がある。膠芽腫は、ボクサー、フレンチブルドッグ、及びイングリッシュブルドッグを含む特定の種のイヌで頻繁に自然発生する。この自然発生イヌ「モデル」は、ＣＤ２００の免疫学的効果を特性決定するための魅力的なプラットフォームである。１）腫瘍が、ヒト膠芽腫で観察されるものと非常に類似した組織学的特徴を示し、２）腫瘍が、実験的操作を行わずに免疫微小環境で生じ、成長し、３）ヒト及びイヌ膠芽腫の組織病理学的試料において、免疫細胞集団に関してかなりの類似性があり、４）ヒトの膠芽腫と同様に、イヌにおける膠芽腫は、典型的には、腫瘍負荷が神経学的欠損を引き起こす後期に検出され、５）ヒトＣＤ２００とイヌＣＤ２００との間に有意な相同性が存在するからである。この文脈で理解すると、イヌモデルにおけるイヌＣＤ２００ＡＲ－Ｌの有効性は、将来のヒト臨床試験のための強力な裏付けを提供する。

現在の臨床診療において、治療応答の評価は、主にＭＲＩ上の膠芽腫の外観の評価に基づいている。ＭＲＩはコストが高く、ＭＲ画像の解像度が細胞レベルでの腫瘍成長を検出するには不十分であるため、この診療は問題がある。したがって、膠芽腫の成長を評価するための最低限の侵襲性のバイオマーカーが決定的に必要である。多くの態様において、ＣＤ２００の生物学的特性は、ＣＤ２００を腫瘍負荷のバイオマーカーとして十分に好適なものにする。ＣＤ２００は、細胞表面糖タンパク質であるが、膠芽腫で発現するＣＤ２００のほとんどは、可溶性因子１０として放出される。この原稿に示されるデータを含む、独立した群は、がん患者の血清中の可溶性ＣＤ２００のレベルが、腫瘍負荷と相関することを決定し、このことは、この原稿に示されるデータによって裏付けられた（図５ｎ）。概して、これらの結果は、膠芽腫監視のための潜在的な「液体生検」プラットフォームとしての血清ＣＤ２００を裏付ける。

要約すると、本願発明者らの研究は、膠芽腫に対する新規療法として、腫瘍ワクチン投与前のＣＤ２００免疫チェックポイントの生物学的機能を妨げることを指向する免疫刺激ペプチドの皮下投与の治療有効性を裏付けるデータを提供する。

実施例２
ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ＰＤ－Ｌ１阻害性シグナルを征服する。
これらの実験において、マウスＣＤ１１ｂ細胞をＰＭＡで刺激し、マウスＣＤ２００ＡＲ－Ｌを加えるか、または加えずに、ＰＤ－Ｌ１でパルスした。これらの実験は、ＰＤ－Ｌ１がＣＤ１１ｂ細胞の活性化を抑制するが、ＣＤ２００ＡＲ－ＬがＰＤ－Ｌ１の阻害効果を征服することを示した（図８Ａ～８Ｃ）。

実施例３
Ｔ細胞阻害に対する抑制分子（ＣＤ２００及びＰＤ－Ｌ１）の効果
本願発明者らは、可溶性ＣＤ２００及びＰＤ－Ｌ１が、複数のチェックポイントを介したＴ細胞活性化を阻害することを提案する（図１０）。したがって、複数の抑制分子（ＣＤ２００及びＰＤ－Ｌ１）がＴ細胞阻害に及ぼす効果を調査した。これを達成するために、全脾細胞をＣＤ２００またはＰＤ－Ｌ１でパルスし、ＣＤ２００治療後のＣＤ４細胞上のＣＴＬＡ４の上方制御を明らかにした。加えて、ＰＤ－Ｌ１治療後、ＣＤ１１ｂ上のＰＤ－Ｌ１の上方制御及びＴ細胞上のＣＴＬＡ４の上方制御が観察された。ＣＴＬＡ４及びＰＤ－Ｌ１は別個の阻害性シグナルを伝播するため、ＰＤ－Ｌ１は、１）Ｔ細胞上の直接的なＣＤ２００及びＰＤ－Ｌ１、ならびに２）ＣＴＬＡ４を上方制御するサイトカインを産生する直接的なＰＤ－Ｌ１（ＡＰＣ上）／ＰＤ－Ｉ（ＡＰＣ上）を介して、Ｔ細胞活性化を阻害し、α－ＰＤ－１及びα－ＣＴＬＡ４治療の組み合わせでみられる高められた応答を説明するという仮説を立てた。しかし、いずれもＴ細胞に対するＣＤ２００効果を阻害するものではない。

ＣＤ２００及びＰＤ－１経路はクロストークし、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが抑制性ＰＤ－Ｌ１に優先することを可能にする。本願発明者らは、マウスＰ１Ａ１２（ＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＡＮＭ、配列番号１５）及びイヌＰ４Ａ１０ ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ（ＣＬＦＮＴＦＧＳＧＡＩＳＧＴＡ、配列番号１６）で動物を治療することで、マウス及びイヌの神経膠腫モデルの両方において有意な生存利益をもたらすことを確立した。これらの結果は、ＣＤ２００及びＰＤ－１が共通のシグナル伝達経路を共有する可能性があるという仮説を導いた。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に対するＣＤ２００ＡＲ－Ｌの効果を評価するために、脾細胞をＰＭＡ＋／－ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ２００ＡＲ－Ｌで活性化し、上清をＴＮＦα、ＩＬ－４、及びＩＬ－５産生について分析した（図１１Ａ～１１Ｃ）。ＣＤ２００タンパク質で観察されるように（図１１Ｂ）、ＰＤ－Ｌ１は、サイトカイン産生によって測定されるような免疫抑制環境を誘導したが、ＰＤ－Ｌ１は、ＰＭＡによって誘導されるＴＮＦα、ＩＬ－４、及びＩＬ－５の産生を減少させ、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌの添加によって回復した。これらの実験は、ＣＤ２００経路とＰＤ－１経路が接続されているという仮説を導いた。

ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１の発現を下方制御する。ＣＤ２００ＡＲ－ＬがＰＤ－Ｌ１阻害を防止する機構をさらに調べるために、ＣＤ１１ｂ細胞をＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスし、ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１の転写レベルを分析した（図１２Ａ～１２Ｂ）。両方の阻害性受容体が、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌによって下方制御された。加えて、ヒトＣＤ１４細胞をヒトＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスすると、同じ阻害が生じた（図１２Ｃ～１２Ｄ）。野生型マウス由来のＣＤ１１ｂ細胞を、十分に特性決定されたタンパク質ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１４）を含有する卵白アルブミン（ＯＶＡ）でパルスして、抗原特異的応答を解明した。ＯＶＡ＋／－ＣＤ２００ＡＲ－Ｌを洗浄し、ＣＤ３細胞をＣＤ１１ｂ細胞に添加した。これらの実験は、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが抗原提示細胞（ＣＤ１１ｂ及びヒトＣＤ１４）及びＴ細胞上でのＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１の発現を制御することが可能であることを示し、異なるチェックポイントが相互接続されていることを示した。

ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１の発現を下方制御する。ＣＤ２００ＡＲ－ＬがＰＤ－Ｌ１阻害を防止する機構をさらに調べるために、ＣＤ１１ｂ細胞をＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスし、ＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１の転写レベルを分析した（図１３Ａ～１３Ｂ）。両方の阻害性受容体が、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌによって下方制御された。加えて、ヒトＣＤ１４細胞をヒトＣＤ２００ＡＲ－Ｌでパルスすると、同じ阻害が生じた（図１３Ｃ～１３Ｄ）。野生型マウス由来のＣＤ１１ｂ細胞を、十分に特性決定されたタンパク質ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１４）を含有する卵白アルブミン（ＯＶＡ）でパルスして、抗原特異的応答を解明した。ＯＶＡ＋／－ＣＤ２００ＡＲ－Ｌを洗浄し、ＣＤ３細胞をＣＤ１１ｂ細胞に添加した。これらの実験は、ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが抗原提示細胞（ＣＤ１１ｂ及びヒトＣＤ１４）及びＴ細胞上でのＣＤ２００Ｒ１及びＰＤ－１の発現を制御することが可能であることを示し、異なるチェックポイントが相互接続されていることを示した。

ＣＤ２００ＡＲ－Ｌは、ＣＴＬＡ－４上方制御を阻害する。次に、Ｔ細胞阻害に対するＣＤ２００ＡＲ－Ｌの効果を調べた。これらの実験において、脾細胞をＣＤ２００またはＰＤ－Ｌ１でパルスし、ＣＤ８細胞上ではなく、ＣＤ４細胞上のＣＴＬＡ４の上方制御を明らかにした（図１４Ａ）。ＣＤ２００とは対照的に、ＰＤ－Ｌ１は、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方でＣＴＬＡ４を上方制御した（図１４Ａ）。さらに、ＣＤ２００ではなくＰＤ－Ｌ１は、ＣＤ１１ｂ細胞上でのＰＤ－Ｌ１の発現を上方制御し（図１４Ｃ）、これは可溶性ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１（ＣＤ１１ｂ上での）相互作用を介する可能性がある。ＣＴＬＡ４及びＰＤ－Ｌ１は、別個の阻害性シグナルを伝播するため、ＰＤ－Ｌ１が、１）直接的なＰＤ－Ｌ１（ＡＰＣ上）／ＰＤ－Ｉ（Ｔ細胞上）相互作用による、また、ＣＤ１１ｂ細胞上のＰＤ－１にＰＤ－Ｌ１が結合した後のサイトカイン産生による、２つの別個の機構によって、Ｔ細胞活性化を阻害するという仮説が成り立ち、α－ＰＤ－１及びα－ＣＴＬＡ４治療の組み合わせでみられる応答の向上を説明するだろう。

上述の明細書及び実施例は、本発明を完全に開示し、可能にするが、それらは、本明細書に添付される特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。

全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明を、その特定の実施形態に関して説明しており、多くの詳細を例示の目的で記載しているが、本発明が追加の実施形態に影響を受けやすく、本明細書に記載される特定の詳細が、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることは、当業者には明らかであろう。

本発明を説明する文脈において、用語「ａ」及び「ａｎ」ならびに「ｔｈｅ」及び同様の指示対象の使用は、本明細書で別段の指示がなされるか、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅するように解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の記載がない限り、オープンエンド用語（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、単に、その範囲内に含まれる各個別の値を個別に参照する簡略法として機能することのみを意図しており、各個別の値は、本明細書に個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書に提供される任意の及び全ての実施例、または例示的な言語（例えば、「例えば」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることを意図しており、特に別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、任意の請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すものとして解釈されるべきではない。

本発明を実施するための発明者に知られている最良の形態を含む、本発明の実施形態を本明細書で説明する。これらの実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者に明らかになり得る。本願発明者らは、当業者がかかる変形を適切に用いることを期待し、本願発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載される以外の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用される法律によって許可されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙された主題の全ての修正及び等価物を含む。さらに、本明細書に別段に示さない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせは、本発明によって包含される。

Claims (32)

1. 細胞においてＰＤ－１を阻害する方法であって、前記細胞にＣＤ２００活性化受容体リガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）を投与することを含むか、またはそれからなる、前記方法。
2. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ヒト特異的ペプチド（ｈＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、イヌ特異的ペプチド（ｃＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）である、請求項１に記載の方法。
4. 前記細胞が、がん細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記がん細胞が、膠芽腫細胞である、請求項４に記載の方法。
6. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ペプチドＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、Ｐ２Ａ５、Ｐ３Ａ１２、またはＰ４Ａ１０である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ペプチドヒトＰ１Ａ８である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ペプチドヒトＰ２Ａ０である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ペプチドヒトＰ４Ａ１０である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記細胞が、がん細胞である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記がん細胞が、膠芽腫細胞である、請求項１０に記載の方法。
12. 哺乳動物において腫瘍溶解物ワクチンの有効性を高める方法であって、前記腫瘍溶解物ワクチンの投与前に前記哺乳動物にＣＤ２００活性化受容体リガンド（ＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）を投与することを含むか、またはそれからなる、前記方法。
13. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ヒト特異的ペプチド（ｈＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、イヌ特異的ペプチド（ｃＣＤ２００ＡＲ－Ｌ）である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記細胞が、がん細胞である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記がん細胞が、膠芽腫細胞である、請求項５に記載の方法。
17. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ペプチドＰ１Ａ８、Ｐ２Ａ０、Ｐ２Ａ５、Ｐ３Ａ１２、またはＰ４Ａ１０である、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ペプチドヒトＰ１Ａ８である、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ペプチドヒトＰ２Ａ０である、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、ペプチドヒトＰ４Ａ１０である、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記細胞が、がん細胞である、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌが、局所注射によって投与される、請求項１２～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記腫瘍溶解物ワクチンが、皮下投与される、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記腫瘍溶解物ワクチンが、自家腫瘍溶解物ワクチンである、請求項１２～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記哺乳動物が、腫瘍を外科的に除去してから５～１４日後に前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌを投与される、請求項１２～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記哺乳動物が、腫瘍を外科的に除去してから約１０日後に前記ＣＤ２００ＡＲ－Ｌを投与される、請求項１２～２４のいずれか１項に記載の方法。
27. （ａ）種特異的ＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドを皮内（ＩＤ）注射し、（ｂ）２４時間後、イミキモドを皮膚に局所的に適用し、１０～１５分間吸収させ、（ｃ）ＣＤ２００ＡＲ－Ｌと混合した自家腫瘍溶解物を皮内注射する、請求項１２～２３のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記種特異的ＣＤ２００ＡＲ－Ｌペプチドが、約５μｇ／ｋｇの投薬量で皮内（ＩＤ）注射される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記イミキモド（１パケット）が、５％クリーム／１２．５ｇの投薬量で前記皮膚に局所的に適用される、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 前記自家腫瘍溶解物の約５００μｇのタンパク質を、約５μｇ／ｋｇのＣＤ２００ＡＲ－Ｌと混合し、皮内注射する、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 治療レジメンが、３週間にわたって毎週繰り返される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記治療レジメンが、３週間にわたって毎週、次いで３ヶ月間にわたって４週間毎に１回、次いで、必要に応じて６～８週間毎に繰り返される、請求項３１に記載の方法。

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