JP2022516731A - 改善された核酸の増幅 - Google Patents

Abstract

本明細書では、核酸の増幅、特に、しかし排他的ではなく、ポリメラーゼ連鎖反応の改善及び改善された安定性を有するポリメラーゼ連鎖反応用の試薬の提供を行うための組成物及び方法に関する技術が提供される。

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本出願は、２０１８年１２月３１日に出願された米国仮特許出願整理番号６２／７８６，８６０の優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書では、核酸の増幅、特に、しかし排他的ではなく、ポリメラーゼ連鎖反応を実行するための及び改善された安定性を有するポリメラーゼ連鎖反応用の試薬を提供するための組成物及び方法に関する技術が提供される。

〔背景技術〕
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイは、迅速ポリメラーゼ酵素に依存している。したがって、迅速ＰＣＲ酵素は、速度及びプロセス性の上昇を達成するために設計されてきたが、非特異的プライミング及び／または二量体－プライマー形成から疑似増幅生成物が生成する傾向の上昇も示し得る。これらの非特異的生成物の形成は、標的増幅を妨げることによって及び／または反応リソースを枯渇させることによってＰＣＲ及び／またはＲＴ－ＰＣＲの全体的効率に負の影響を及ぼし得る。

例えば、ＰＣＲによる核酸の増幅を改善するために多数の技術が開発されてきた。例えば、ＰＣＲにおける非特異的プライミング及び／または二量体－プライマー形成を減少させる組成物及び方法が利用可能である。１つの特定の方策は、熱サイクルプログラムの開始時の高温でのインキュベーションの前の伸長を防止する熱不安定性化学的改変を用いて生成される「ホットスタート」プライマー及び「ホットスタート」ｄＮＴＰの使用を含む。しかしながら、「ホットスタート」メカニズムは、ＲＴ－ＰＣＲに負の影響を及ぼし得るが、その理由は、ほとんどの逆転写酵素が、「ホットスタート」熱サイクル工程の高温によって不可逆的に不活性化されるからである。他のＰＣＲ及びＲＴ－ＰＣＲエンハンサーには、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、ホルムアミド、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれ、これらは通常、ハイブリダイゼーションの特異性を上昇させること及びプライマー／プローブのＴ_ｍを上昇させることによって機能する。

非特異的プライミング及び／または二量体－プライマー形成は、逆転写及び／またはＰＣＲ工程中に生じ得るが、それはまた、マスターミックス調製中及び反応セットアップ中にも生じ得る。これらの問題は、特に製造工程が単一バルク試薬として完全なマスターミックス（例えば、酵素、活性化試薬、プライマー、及び／またはプローブを含む）の集合を必要とする場合に、ＰＣＲ及びＲＴ－ＰＣＲアッセイの製造業者にとって課題である。そのようなバルク試薬の調製、混合、及び充填と典型的に関連する長期リード時間は、製造中に非特異的プライミング及び／または二量体－プライマー形成の可能性を上昇させ、それにより、アッセイ性能の低下につながり得る。

〔発明の概要〕
本明細書で提供される技術は、ＰＣＲのエンハンサーとしての２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＭＩＴ）の使用に関する。ＭＩＴは、（例えば、ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０の商品名で販売されている防腐剤において）殺生物剤として使用されている。本明細書で提供される技術は、（例えば、マスターミックス試薬製造中の）活性化ＰＣＲ及び／またはＲＴ－ＰＣＲマスターミックスの安定性の上昇を提供するためにＭＩＴをＰＣＲのエンハンサーとして使用することを含む。本明細書で提供される技術の実施形態の開発中に、非特異的プライミング及び／またはプライマー－二量体形成を妨害及び／または防止するためにＰＣＲにおいてＭＩＴの使用を試験するための実験が行われた。これらの実験中に収集されたデータは、ＰＣＲ／ＲＴ－ＰＣＲ反応においてＭＩＴを含ませることは、非特異的プライミング及び／またはプライマー－二量体形成を防止及び／または妨害し、それにより非特異的生成物の蓄積を減少させることを実証した（例えば、実施例１及び実施例２参照）。さらに、これらのデータは、ＰＣＲ／ＲＴ－ＰＣＲアッセイ性能の一般的向上（例えば、実施例３及び実施例４参照）及び活性化マスターミックスの改善された安定性（例えば、実施例５参照）を提供することを示していた。

したがって、技術は、ＰＣＲ及び／またはＲＴ－ＰＣＲの用途における一般的なエンハンサーとして利用され、２）（例えばマスターミックス試薬製造中の）ＰＣＲ及び／またはＲＴ－ＰＣＲマスターミックスの安定性を改善するために利用される。いくつかの実施形態では、技術は、核酸増幅組成物を提供する。いくつかの実施形態では、核酸増幅組成物は、ポリメラーゼ、１つ以上のプライマー（例えば、第１のプライマー及び第２のプライマー）、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）の２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＭＩＴ）（例えば、０．００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ））を含む。いくつかの実施形態では、核酸増幅組成物は、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む。いくつかの実施形態では、核酸増幅組成物は、標的鋳型をさらに含む。

いくつかの実施形態では、核酸増幅組成物は、検出可能に標識されたプローブまたはインターカレーター色素をさらに含む。技術は、検出可能な標識またはインターカレーター色素において限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光部位、例えば、合成され得るまたは商業的に得られ得る（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａから）色素である。多数の色素（５０種超）が、蛍光励起用途における用途に利用可能である。これらの色素には、フルオレセイン、ローダミン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ、Ｂｏｄｉｐｙ、クマリン、及びシアニン色素ファミリーからのものが含まれる。フルオロフォアの具体的な例には、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、ＴＭＲ、ＲＯＸ、ＶＩＣ（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のもの）、テキサスレッド、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、及びＬＣレッド７０５が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、４１０ｎｍ（例えば、カスケードブルー）～７７５ｎｍ（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０）の発光極大を有する色素が利用可能であり、使用され得る。当然ながら、当業者は、これらの範囲外の発光極大を有する色素も同様に使用され得ることを認識する。いくつかの場合では、５００ｎｍ～７００ｎｍの間の範囲の色素は、可視スペクトルにあるという利点を有し、既存の光電子増倍管を使用して検出され得る。いくつかの実施形態では、広い範囲の利用可能な色素により、検出範囲にわたって広がる発光波長を有する色素セットの選択が可能になる。多くの色素を区別することが可能な検出システムは、当該技術分野で知られている。

いくつかの実施形態では、核酸増幅組成物は、（例えば、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーを含む）プライマー二量体（例えば、検出可能なレベルのプライマー二量体）を含まない。

いくつかの実施形態では、技術は、オリゴヌクレオチド試薬を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド試薬は、１つ以上のプライマー（例えば、第１のプライマー及び第２のプライマー）、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド試薬は、第１のプライマー、第２のプライマー、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド試薬は、第１のプライマー、第２のプライマー、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド試薬は、第２の検出可能に標識されたプローブ（例えば、上述した蛍光部位を含む）をさらに含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド試薬は、参照色素（例えば、上述した蛍光色素）をさらに含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド試薬は、第３のプライマー及び／または第４のプライマーをさらに含む。

いくつかの実施形態では、技術は、キット（例えば、リアルタイムＰＣＲ（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）によって核酸を検出するためのキット）を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のプライマー（例えば、第１のプライマー及び第２のプライマー）、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含むオリゴヌクレオチド試薬；ならびに塩化マンガン及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む活性化試薬を含むキットが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、緩衝溶液中の熱安定性ポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、熱安定性ポリメラーゼは、ｒＴｔｈポリメラーゼである。しかしながら、技術は、この特定のポリメラーゼに限定されず、当該技術分野で知られている他のポリメラーゼ（例えば、本明細書に記載されている）を含む実施形態を含む。いくつかの実施形態では、キットは、対照核酸及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む内部対照をさらに含む。

技術は、常温保存安定試薬（例えば、リアルタイムＰＣＲのための試薬）を提供することに関する。いくつかの実施形態では、技術は、１０ｍＬを超える（例えば、１００ｍＬを超える、１リットルを超える）体積を有し、かつ第１のプライマー、第２のプライマー、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ（例えば、０．００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含む商業的規模のマスターミックス組成物を提供する。いくつかの実施形態では、商業的規模のマスターミックス組成物は、第１のプライマー、第２のプライマー、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む。

いくつかの実施形態では、技術は、１０ｍＬを超える（例えば、１００ｍＬを超える、１リットルを超える）体積を有し、かつ塩化マンガン及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ（例えば、０．００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含む商業的規模のマスターミックス組成物を提供する。いくつかの実施形態では、商業的規模のマスターミックス組成物は、塩化マンガン及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む。

いくつかの実施形態では、技術は、（例えば、リアルタイムＰＣＲによって）核酸を検出するための方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、ポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ（例えば、０．００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含む反応組成物を提供することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、ヌクレオチド、及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む反応組成物を提供することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルを前記反応組成物に添加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、検出可能に標識されたプローブ（例えば、前記標識は、本明細書に記載される蛍光部位である）またはインターカレーター色素を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、前記反応組成物を熱サイクルにかけることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、前記反応組成物の蛍光発光を測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、（例えば、リアルタイムＰＣＲによって）核酸を検出するための方法は、０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ（例えば、０．００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）ならびにポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、及び／またはヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むリアルタイムＰＣＲ試薬を少なくとも１日間、１週間、または１ヶ月間保存することを含む。いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲ試薬は、ポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ（例えば、０．００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含む反応組成物を調製するために使用される。いくつかの実施形態では、方法は、リアルタイムＰＣＲ試薬を使用して、ポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、ヌクレオチド、及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む反応組成物を調製することを含む。

いくつかの実施形態では、技術は、０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ（例えば、０．００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）をポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、及び／またはヌクレオチドのうちの少なくとも１つと混合することを含む、リアルタイムＰＣＲ試薬を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲ試薬を生成する方法は、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴをポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、及び／またはヌクレオチドのうちの少なくとも１つと混合することを含む。いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲ試薬は、１０ｍＬを超える（例えば、１００ｍＬを超える、１リットルを超える）体積を有する。いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲ試薬を生成する方法は、前記リアルタイムＰＣＲ試薬を少なくとも１日間、１週間、または１ヶ月間保存することを含む。いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲ試薬を生成する方法は、リアルタイムＰＣＲ試薬中に参照色素、検出可能に標識されたプローブ、インターカレーター色素、第３のプライマー、及び／または第４のプライマーを混合することを含む。

いくつかの実施形態では、技術は、核酸を検出するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、システムは、第１のプライマー、第２のプライマー、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含むオリゴヌクレオチド試薬；ならびに塩化マンガン及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む活性化試薬を含む。いくつかの実施形態では、システムは、リアルタイムサーモサイクラーをさらに含む。本明細書で提供される技術のいくつかの実施形態は、データを収集するための、保存するための、及び／または分析するための機能性をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、デバイスは、例えば、命令を記憶及び実行し、データを分析し、データを使用して計算を実施し、データを変換し、データを記憶するためのプロセッサ、メモリ、及び／またはデータベースを含む。その上、いくつかの実施形態では、プロセッサは、デバイスを制御するように構成される。いくつかの実施形態では、プロセッサは、測定及びデータ収集を開始及び／または終了させるために使用される。いくつかの実施形態では、デバイスは、測定を指示するためにプロセッサによって使用されるユーザ入力を受信するためのユーザインターフェース（例えば、キーボード、ボタン、ダイアル、スイッチなど）を含む。いくつかの実施形態では、デバイスは、外部送信先、例えば、コンピュータ、ディスプレイ、ネットワーク、及び／または外部記憶媒体にデータを送信するためのデータ出力をさらに含む。いくつかの実施形態は、デバイスが、これらの特徴及び構成要素を組み込んだ小型のハンドヘルド型ポータブルデバイスであることを提供する。いくつかの実施形態では、システムは、Ｃｔ値を決定するように構成されたコンピュータをさらに含む。いくつかの実施形態では、システムは、緩衝溶液中の熱安定性ポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、熱安定性ポリメラーゼは、ｒＴｔｈポリメラーゼである。

本明細書に含まれている教示に基づいて追加の実施形態が当業者に明らかとなる。

本技術のこれらの及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の図面に関してより良好に理解される。図において、「Ｐｒｏｃｌｉｎ」は、ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（水に溶解した９．５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を指す。

〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕マスターミックスにおいてＭＩＴを含ませることが、非特異的生成物の蓄積を減少させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（それぞれ、０、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ濃度に相当する）を含むサンプルについてのサイクル数の関数としてのｄＲｎを示している。

〔図２〕ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスにおいてＭＩＴを含ませることが、長期保存中に非特異的生成物の蓄積を減少させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（それぞれ、０、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ濃度に相当する）を含むサンプルについてのサイクル数の関数としてのｄＲｎを示している。

〔図３〕ＭＩＴをＨＩＶ－１アッセイマスターミックスに添加することが、ＲＴ－ＰＣＲ性能を向上させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、５０コピーのＨＩＶ－１標的ＲＮＡを含み、０．０１５％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（０．００１５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含むか、またはＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含まないサンプルについてのサイクル数の関数としてのｄＲｎを示している。

〔図４〕ＭＩＴをＣＴ／ＮＧ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）マスターミックスに添加することが、ＲＴ－ＰＣＲ性能を向上させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、０．１封入体形成単位のＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを含み、０．０１５％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（０．００１５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含むか、またはＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含まないサンプルについてのサイクル数の関数としてのｄＲｎを示している。

〔図５〕ＭＩＴがＰＣＲマスターミックスの安定性を改善させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、５０コピーのＨＩＶ－１のＲＮＡを含む反応混合物において使用する前に２～８℃で１６時間インキュベーションした、０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（それぞれ、０、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ濃度に相当する）を含むマスターミックスについてのサイクル数に応じたｄＲｎを示している。

図は、必ずしも縮尺に合わせて描かれているわけではなく、また、図中の物体が必ずしも互いに関連して縮尺に合わせて描かれているわけでもないことが理解されるべきである。図は、本明細書に開示される装置、システム、及び方法の様々な実施形態に明確性及び理解を付与することが意図されている描写である。可能な場合はいつでも、同じまたは類似の部分を指すために図面全体を通して同じ参照番号が使用される。その上、図面は、どのようにも本教示の範囲を限定することが意図されていないことが理解されるべきである。

〔発明を実施するための形態〕
本明細書では、核酸の増幅、特に、しかし排他的ではなく、ポリメラーゼ連鎖反応を実行するための及び改善された安定性を有するポリメラーゼ連鎖反応用の試薬を提供するための組成物及び方法に関する技術が提供される。

様々な実施形態のこの詳細な説明では、説明の目的のため、開示される実施形態の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示されている。しかしながら、当業者は、これらの様々な実施形態がこれらの具体的な詳細を用いてまたは用いずに実施され得ることを理解する。他の例では、構造及びデバイスは、ブロック図形式で示される。さらに、当業者は、方法が提示され、実施される具体的な順序が例示であることを容易に理解し得、順序は、変更され、本明細書に開示される様々な実施形態の趣旨及び範囲内に依然として残り得ることが企図される。

特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネットウェブページを含むがこれらに限定されない本出願において引用されるすべての文献及び同様の資料は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために明示的に組み込まれる。別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本明細書に記載の様々な実施形態が属する技術の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。組み込まれた参照における用語の定義が本教示に提供される定義と異なるようにみえる場合、本教示に提供される定義が優先されるものとする。本明細書で使用される項の見出しは、整理の目的のためのものであり、記載された主題をどのようにも限定するものと解釈されるべきではない。

定義
本技術の理解を容易化するために、多数の用語及び語句が以下に定義されている。追加の定義は、詳細な説明全体を通して示されている。

明細書及び特許請求の範囲全体を通して、以下の用語は、文脈が別段明らかに示さない限り、本明細書で明白に関連する意味をとる。語句「一実施形態では」は、本明細書で使用される場合、必ずしも同じ実施形態を指すものではないが、指す場合もある。さらに、語句「別の実施形態では」は、本明細書で使用される場合、必ずしも異なる実施形態を指すものではないが、指す場合もある。よって、以下に記載されるように、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、容易に組み合わされ得る。

また、本明細書で使用される場合、文脈が別段明らかに示さない限り、用語「または」は、包括的な「または」の操作詞であり、用語「及び／または」に等しい。用語「基づく」は、排他的ではなく、文脈が別段明らかに示さない限り、記載されていない追加の要因に基づくことが可能である。また、明細書全体を通して、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数の言及を含む。「中で（ｉｎ）」の意味は、「中で（ｉｎ）」及び「上で（ｏｎ）」を含む。

本明細書で使用される場合、用語「約」、「およそ」、「実質的に」、及び「有意に」は、当業者によって理解され、それらが使用される文脈によってある程度異なる。これらの用語が使用される文脈を考慮して当業者に明らかでないそれらの使用が存在する場合、「約」及び「およそ」は、特定の用語の１０％（ｗ／ｗ）を超えない範囲で高いもしくは低いことを意味し、「実質的に」及び「著しく」は、特定の用語の１０％（ｗ／ｗ）を超えて高いまたは低いことを意味する。

本明細書で使用される場合、範囲の開示は、全体の範囲内のすべての値及びさらに分割された範囲（範囲について与えられた終点及び副次的範囲を含む）の開示を含む。

本明細書で使用される場合、接尾辞「フリー」は、「フリー」が付属する言葉の語幹の特徴を省略する技術の実施形態を指す。すなわち、用語「Ｘフリー」は、本明細書で使用される場合、「Ｘがない」ことを意味し、Ｘは、「Ｘフリー」技術において省略された技術の特徴である。例えば、「カルシウムフリー」組成物は、カルシウムを含まず、「混合フリー」方法は、混合工程を含まないなどである。

用語「第１」、「第２」、「第３」などは、様々な工程、要素、組成物、成分、領域、層、及び／または部分を記述するために本明細書で使用され得るが、これらの工程、要素、組成物、成分、領域、層、及び／または部分は、別段示されない限り、これらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある工程、要素、組成物、成分、領域、層、及び／または部分を別の工程、要素、組成物、成分、領域、層、及び／または部分から区別するために使用される。「第１」、「第２」、及び他の数値的用語などの用語は、本明細書で使用される場合、文脈によって明らかに示されない限り、順番または順序を暗示しない。よって、本明細書で論述される第１の工程、要素、組成物、成分、領域、層、または部分は、技術から逸脱することなく、第２の工程、要素、組成物、成分、領域、層、または部分と称され得る。

本明細書で使用される場合、「ｄＲｎ」は、各時点及び／またはサイクル数においてＲＴ－ＰＣＲ中に生成された蛍光シグナルの大きさを指す。ｄＲｎ値は、次の式（Ｒｎ＋）－（Ｒｎ－）によって決定される。Ｒｎ（正規化レポーターシグナル）は、レポーター色素の蛍光発光強度をパッシブリファレンス色素の蛍光発光強度で除算したものである。Ｒｎ＋は、鋳型を含むすべての成分を含有する反応のＲｎ値である。Ｒｎ－は、未反応サンプルのＲｎ値である。Ｒｎ－値は、ＲＴ－ＰＣＲの早期サイクル（例えば、蛍光の著しい増加の前のサイクル）からまたは鋳型を含まない反応において得られ得る。

本明細書で使用される場合、用語「Ｃｔ」または「閾値サイクル」は、反応内で生成された蛍光が閾値に交差するサイクル数を指す。Ｃｔは、初期コピー数の対数に逆相関する。よって、特定の反応に割り当てられたＣｔ値は、十分な数のアンプリコンが蓄積した反応中の時点を反映している。

本明細書で使用される場合、用語「インターカレーター色素」または「ｄｓＤＮＡ結合剤」は、ｄｓＤＮＡに結合しない場合と比較して二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合した場合により高い蛍光発光を有する分子を指す。よって、いくつかのリアルタイムＰＣＲでは、蛍光強度は、ｄｓＤＮＡ（アンプリコン）濃度に対して比例的に増加する。例示的なｄｓＤＮＡ結合剤は、溶液中にある場合は蛍光をほとんど放出しないが、二本鎖ＤＮＡに結合すると強力な蛍光シグナルを放出する蛍光性副溝結合色素であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉである。同様のｄｓＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ蛍光色素には、ＥｖａＧｒｅｅｎ及びＬＣＧｒｅｅｎが含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「迅速ＰＣＲ」は、アンプリコン設計、試薬化学、熱サイクル条件、及び器具類（例えば、迅速なランプ速度を有するＰＣＲ装置）の改善により、９０分未満（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０分以下）の実行時間で完了する改変ＰＣＲプロトコルを指す。

本明細書で使用される場合、用語「増幅なし対照」または「ＮＡＣ」は、ポリメラーゼ酵素を含まない対照である。ｍＲＮＡ分析において、ＮＡＣは、逆転写酵素を除き、ＲＴ－ＰＣＲ試薬のすべてを含有する模擬逆転写である。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが鋳型として使用される場合、Ｔａｑポリメラーゼを欠く反応混合物がＮＡＣとしてアッセイに含まれ得る。ＮＡＣでは生成物は合成されるべきではない。

本明細書で使用される場合、用語「鋳型なし対照」または「ＮＴＣ」は、サンプルまたは標的核酸を含まない対照である。ＮＴＣは、ＲＮＡ鋳型を除きＲＴ－ＰＣＲ試薬のすべてを含む。ＮＴＣでは生成物は合成されるべきではない。

本明細書で使用される場合、用語「核酸標的」または「標的鋳型」または「標的核酸」は、増幅されるか、または増幅されることが意図されているＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。標的配列を増幅するために使用される核酸サンプルは、鋳型と呼ばれる。典型的なｑＰＣＲにおいて、反応に含まれるｃＤＮＡサンプルは鋳型である。

本明細書で使用される場合、用語「リアルタイムＰＣＲ」は、サイクル全体を通してポリメラーゼ連鎖反応からの蛍光シグナルの連続的収集を指す。

本明細書で使用される場合、用語「閾値」は、バックグラウンドレベルまたはノイズを超えると考えられる蛍光シグナルレベルを指す。いくつかの実施形態では、閾値は、早期ＰＣＲサイクルについてのＲｎの１０×標準偏差であり、及び／またはＰＣＲ生成物の指数関数的成長と関連し、曲線の線状またはプラトー領域ほど高くない領域に設定される。いくつかの実施形態では、閾値は、最も高いベースラインシグナルレベルを超える。

本明細書で使用される場合、「核酸」は、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらのハイブリッドを含む任意の核酸分子を意味するものとする。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵ、ならびにそれらの誘導体であり得る。これらの塩基の誘導体は、当該技術分野でよく知られている。その用語は、ヌクレオチドアナログから作られたＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかのアナログを均等物として含むことが理解されるべきである。その用語はまた、本明細書で使用される場合、例えば、逆転写酵素の作用によって、ＲＮＡ鋳型から生成された相補的、またはコピーのＤＮＡであるｃＤＮＡを包含する。

塩基、ヌクレオチド、または別の分子に対する言及は、単数または複数であり得る。すなわち、「塩基」は、例えば、溶液中のその塩基の単一分子または複数の塩基を指し得る。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間連結によって接合されたヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはそれらのアナログを含む）の線状ポリマーを指す。典型的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオシドを含む。通常、オリゴヌクレオチドは、数個の単量体単位、例えば、３～４個から数百の単量体単位のサイズの範囲である。オリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列によって表される場合はいつでも、別段記述されない限り、ヌクレオチドは左から右に５’から３’の順序であること、及び「Ａ」または「ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」または「ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」または「ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」または「ｔ」はチミジンを示すことが理解される。文字Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴは、当該技術分野で標準的であるとおり、塩基自体、ヌクレオシド、または塩基を含むヌクレオチドを指すために使用され得る。

いくつかの実施形態では、核酸は、普遍的なまたは改変された塩基、例えば、デオキシイノシン、イノシン、７－デアザ－２’－デオキシイノシン、２－アザ－２’－デオキシイノシン、２’－Ｏ－Ｍｅイノシン、２’－Ｆイノシン、デオキシ３－ニトロピロール、３－ニトロピロール、２’－Ｏ－Ｍｅ３－ニトロピロール、２’－Ｆ３－ニトロピロール、１－（２’－デオキシ－ベータ－Ｄ－リボフラノシル）－３－ニトロピロール、デオキシ５－ニトロインドール、５－ニトロインドール、２’－Ｏ－Ｍｅ５－ニトロインドール、２’－Ｆ５－ニトロインドール、デオキシ４－ニトロベンズイミダゾール、４－ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４－アミノベンズイミダゾール、４－アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’－Ｆネブラリン、２’－Ｆ４－ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ－５－イントロインドール、ＰＮＡ－ネブラリン、ＰＮＡ－イノシン、ＰＮＡ－４－ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ－３－ニトロピロール、モルホリノ－５－ニトロインドール、モルホリノ－ネブラリン、モルホリノ－イノシン、モルホリノ－４－ニトロベンズイミダゾール、モルホリノ－３－ニトロピロール、ホスホルアミダート－５－ニトロインドール、ホスホルアミダート－ネブラリン、ホスホルアミダート－イノシン、ホスホルアミダート－４－ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミダート－３－ニトロピロール、２’－Ｏ－メトキシエチルイノシン、２’－Ｏ－メトキシエチルネブラリン、２’－Ｏ－メトキシエチル５－ニトロインドール、２’－Ｏ－メトキシエチル４－ニトロ－ベンズイミダゾール、２’－Ｏ－メトキシエチル３－ニトロピロール、及びそれらの組み合わせを含む。

本明細書で使用される場合、「相補的」は通常、当業者によって理解されるように、標準のワトソン・クリック型塩基対を形成するための特定のヌクレオチド二本鎖化を指す。しかしながら、相補的はまた、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドと普遍的な塩基対形成が可能なヌクレオチドアナログ及び二本鎖の熱安定性を向上させるロック核酸の塩基対形成を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーが、ハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖におけるマッチまたはミスマッチの程度の決定要因であることを認識する。

本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ」は、一般に３’－ＯＨ５’－三リン酸ヌクレオチド、オリゴマー、及びそれらのアナログを接合するための酵素を指す。ポリメラーゼには、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、クレノウ断片、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ （Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、組換えＴｔｈ（ｒＴｔｈ）ポリメラーゼ；例えば、Ａｂｕ ａｌ－Ｓｏｕｄ ａｎｄ Ｒａｄｓｔｒｏｍ （１９９８） “Ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｎｉｎｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＣＲ－Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅｓ” Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：３７４８－５３；Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ （１９９１） “Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｔｈｅｒｍｕｓ－ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１－６６（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）参照、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｓｔｏｅｆｆｅｌ断片、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼベータ、テロメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＫＯＤ ＨｉＦｉ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＫＯＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ－ベータレプリカーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｐｈｉ６逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、生物資源調査及び／または分子進化によって発見された新規ポリメラーゼ、ならびに米国特許出願公開番号２００７／００４８７４８及び米国特許番号６，３２９，１７８；６，６０２，６９５；及び６，３９５，５２４で引用されているポリメラーゼが含まれるがこれらに限定されない。これらのポリメラーゼには、野生型、変異体アイソフォーム、及び遺伝子改変バリアント、例えば、エキソ^－ポリメラーゼ；最小化された、検出不能な、及び／または減少した３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、及び他の変異体、例えば、標識されたヌクレオチドを許容し、核酸の鎖に組み込んだものが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ハイフィデリティＰＣＲ、次世代ＤＮＡシーケンシング、迅速ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、粗サンプルＰＣＲ、ロバストＰＣＲ、及び／または分子診断において使用するために設計される。そのような酵素は、多くの商業的供給業者、例えば、Ｋａｐａ Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｒｏｃｈｅなどから利用可能である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、よって、核酸の３’－ＯＨから（例えば、プライマー、例えば、ヘアピンプライマーから）核酸の合成を触媒することに加えて５’末端から核酸を分解し得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ（例えば、ハイフィデリティポリメラーゼ）は、プルーフリーディング活性、３’エキソヌクレアーゼ活性、及び／または鎖置換活性を含むが、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。

本明細書で使用される場合、用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下（例えば、ヌクレオチド及び誘発剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在下及び好適な温度及びｐＨ）に置かれた場合に合成の開始点として作用することが可能な、精製された制限消化物中にあるような天然に存在するものであるか、または合成的に生成されるものであるかを問わないオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、好ましくは増幅における最大効率のために一本鎖であるが、代替的に二本鎖であり得る。二本鎖の場合、プライマーはまず、その鎖を分離するために処置されてから、伸長生成物を調製するために使用される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘発剤の存在下で伸長生成物の合成をプライミングするために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源及び方法の使用を含む多くの要素に依存する。本明細書で使用される場合、ヘアピンプライマーの一本鎖（例えば、アンプリコン特異的）部分は、核酸の合成をプライミングする機能を有し得る。

本明細書で使用される場合、用語「アニーリング」または「プライミング」は、オリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸の鋳型核酸への並置を指し、その並置により、ポリメラーゼは、ヌクレオチドを鋳型核酸またはその一部に相補的な核酸分子に重合することが可能となる。用語「ハイブリダイズすること」は、本明細書で使用される場合、相補的一本鎖核酸からの二本鎖核酸の形成を指す。用語「アニーリングすること」と「ハイブリダイズすること」との間に意図される区別はなく、これらの用語は互換的に使用される。プライマーの配列は、それらが鋳型とハイブリダイズしてプライマーとして機能し得る限り、いくつかのミスマッチを含み得る。用語「実質的に相補的な」は、アニーリングされたプライマーがポリメラーゼによって伸長して、鋳型の相補的コピーを形成し得るように、指定されたアニーリング条件またはストリンジェントな条件下でプライマーが鋳型核酸配列に選択的にハイブリダイズするのに十分に相補的あることを表すために本明細書で使用される。

本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は、そのもっとも広い意味で使用される。１つの意味では、それは、動物の細胞または組織を指し得る。別の意味では、それは、任意の源から得られる試料または培養物、ならびに生物学的及び環境サンプルを含むことを意味する。生物学的サンプルは、植物または動物（ヒトを含む）から得られ、流体、固体、組織、及び気体を包含し得る。環境サンプルには、環境物質、例えば、表面物質、土壌、水、及び産業サンプルが含まれる。これらの例は、本発明に適用可能なサンプルタイプを限定するものとして解釈されない。特定の実施形態では、サンプルは、標的核酸を含む。

説明
化合物２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＭＩＴ）は、特定のクレブス回路酵素の阻害を介して微生物の呼吸を抑制することが知られている殺生物性化合物である。ＭＩＴは、ＣＡＳ番号２６８２－２０－４、Ｃ_４Ｈ_５ＮＯＳの実験式、及び分子量１１５．１５を有する。ＭＩＴは、

による構造を有する。

ＭＩＴは、微生物の成長を防止するために使用される抗菌剤ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（水に溶解した９．５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）中の活性成分である。本明細書で提供される技術の実施形態は、ＰＣＲを改善するためのＭＩＴの使用に関する。いくつかの実施形態では、技術は、核酸の増幅（例えば、ＰＣＲ）のために使用される試薬において、殺生物活性を有さない、または低いもしくは不要なレベルの殺生物活性を有する濃度でＭＩＴを使用することを含む。

いくつかの実施形態では、技術は、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及びＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、ポリメラーゼ及びＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、プローブ及びＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、インターカレーター色素及びＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）及びＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、及びＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、プローブ、及びＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、及びＭＩＴを含む組成物を提供する。

本明細書で提供される技術の実施形態の開発中に、ＲＴ－ＰＣＲにおいてＭＩＴの濃度を試験するための実験が行われた。実験中に収集されたデータは、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ））が、ＭＩＴを反応混合物に添加することによって改善されたことを示していた。特に、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む反応混合物が生成された。したがって、いくつかの実施形態では、技術は、およそ０．００１～０．００２％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、およそ０．０００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、およそ０．００４５～０．００５５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、およそ０．００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、技術は、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む核酸増幅のための組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、ＭＩＴは、水中の混合物として（例えば、水に溶解された９．５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ及び、任意に、他の成分を含む溶液（例えば、ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０）として）提供される。いくつかの実施形態では、技術は、０．０１０、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、０．０２０、０．０２１、０．０２２、０．０２３、０．０２４、０．０２５、０．０２６、０．０２７、０．０２８、０．０２９、０．０３０、０．０３１、０．０３２、０．０３３、０．０３４、０．０３５、０．０３６、０．０３７、０．０３８、０．０３９、０．０４０、０．０４１、０．０４２、０．０４３、０．０４４、０．０４５、０．０４６、０．０４７、０．０４８、０．０４９、または０．０５０のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含む核酸増幅のための組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、技術は、ナノリットルからマイクロリットル（例えば、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ反応）まで、ミリリットルまで、センチリットルまで（例えば、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲマスターミックス）、デシリットルまで、リットルまで、デカリットルまでまたはそれ以上（例えば、商業的規模で生成されるＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ試薬）の範囲の体積を有する組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、技術は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００ｎｌの体積有し、かつＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、技術は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００μｌの体積を有し、かつＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、技術は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００ｍｌの体積を有し、かつＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、技術は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００Ｌの体積を有し、かつＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、ＭＩＴをＰＣＲ反応混合物に添加することは、リアルタイムＰＣＲ（例えば、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）のシグナルを、ＭＩＴを含まないＰＣＲ反応と比較して１．１倍～１０倍以上（例えば、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５．０倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６．０倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７．０倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８．０倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９．０倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、または１０．０倍以上）増加させる。

いくつかの実施形態では、ＭＩＴをＰＣＲ反応混合物に添加することは、リアルタイムＰＣＲ（例えば、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）のシグナルである標的核酸の存在を示すＣｔを、ＭＩＴを含まないＰＣＲ反応と比較して１～２０サイクル（例えば、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１．０、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２．０、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３．０、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４．０、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５．０、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６．０、１６．１、１６．２、１６．３、１６．４、１６．５、１６．６、１６．７、１６．８、１６．９、１７．０、１７．１、１７．２、１７．３、１７．４、１７．５、１７．６、１７．７、１７．８、１７．９、１８．０、１８．１、１８．２、１８．３、１８．４、１８．５、１８．６、１８．７、１８．８、１８．９、１９．０、１９．１、１９．２、１９．３、１９．４、１９．５、１９．６、１９．７、１９．８、１９．９、または２０．０サイクル）減少させる。

いくつかの実施形態では、ＭＩＴをＰＣＲ反応混合物に添加することは、非特異的生成物の量を１～１００％（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５、２６．０、２６．５、２７．０、２７．５、２８．０、２８．５、２９．０、２９．５、３０．０、３０．５、３１．０、３１．５、３２．０、３２．５、３３．０、３３．５、３４．０、３４．５、３５．０、３５．５、３６．０、３６．５、３７．０、３７．５、３８．０、３８．５、３９．０、３９．５、４０．０、４０．５、４１．０、４１．５、４２．０、４２．５、４３．０、４３．５、４４．０、４４．５、４５．０、４５．５、４６．０、４６．５、４７．０、４７．５、４８．０、４８．５、４９．０、４９．５、５０．０、５０．５、５１．０、５１．５、５２．０、５２．５、５３．０、５３．５、５４．０、５４．５、５５．０、５５．５、５６．０、５６．５、５７．０、５７．５、５８．０、５８．５、５９．０、５９．５、６０．０、６０．５、６１．０、６１．５、６２．０、６２．５、６３．０、６３．５、６４．０、６４．５、６５．０、６５．５、６６．０、６６．５、６７．０、６７．５、６８．０、６８．５、６９．０、６９．５、７０．０、７０．５、７１．０、７１．５、７２．０、７２．５、７３．０、７３．５、７４．０、７４．５、７５．０、７５．５、７６．０、７６．５、７７．０、７７．５、７８．０、７８．５、７９．０、７９．５、８０．０、８０．５、８１．０、８１．５、８２．０、８２．５、８３．０、８３．５、８４．０、８４．５、８５．０、８５．５、８６．０、８６．５、８７．０、８７．５、８８．０、８８．５、８９．０、８９．５、９０．０、９０．５、９１．０、９１．５、９２．０、９２．５、９３．０、９３．５、９４．０、９４．５、９５．０、９５．５、９６．０、９６．５、９７．０、９７．５、９８．０、９８．５、９９．０、９９．５、１００．０％）減少させる。

いくつかの実施形態では、ＭＩＴをＰＣＲ反応混合物に添加することは、閾値を超える蛍光を発する非特異的生成物の形成を、ＭＩＴを含まないＰＣＲ反応と比較して１～２０サイクル（例えば、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１．０、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２．０、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３．０、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４．０、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５．０、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６．０、１６．１、１６．２、１６．３、１６．４、１６．５、１６．６、１６．７、１６．８、１６．９、１７．０、１７．１、１７．２、１７．３、１７．４、１７．５、１７．６、１７．７、１７．８、１７．９、１８．０、１８．１、１８．２、１８．３、１８．４、１８．５、１８．６、１８．７、１８．８、１８．９、１９．０、１９．１、１９．２、１９．３、１９．４、１９．５、１９．６、１９．７、１９．８、１９．９、または２０．０サイクル）遅らせる。

いくつかの実施形態では、技術は、（例えば、ＰＣＲによって（例えば、ＲＴ－ＰＣＲによって））核酸を増幅するための組成物を生成するための方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及びＭＩＴを含む組成物を提供すること、生成すること、及び／または得ることを含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＴは、ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含む組成物を提供すること、生成すること、及び／または得ることによって提供される。

いくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を混合することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、サンプル（例えば、核酸）をＭＩＴを含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プライマーをＭＩＴを含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プローブをＭＩＴを含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、インターカレーター色素をＭＩＴを含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ポリメラーゼをＭＩＴを含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）を０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物に添加することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、ＭＩＴを含む組成物をサンプル（例えば、核酸）を含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＩＴを含む組成物をプライマーを含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＩＴを含む組成物をプローブを含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＩＴを含む組成物をインターカレーター色素を含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＩＴを含む組成物をポリメラーゼを含む組成物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物をＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）を含む組成物に添加することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を１～６０分間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５、２６．０、２６．５、２７．０、２７．５、２８．０、２８．５、２９．０、２９．５、３０．０、３０．５、３１．０、３１．５、３２．０、３２．５、３３．０、３３．５、３４．０、３４．５、３５．０、３５．５、３６．０、３６．５、３７．０、３７．５、３８．０、３８．５、３９．０、３９．５、４０．０、４０．５、４１．０、４１．５、４２．０、４２．５、４３．０、４３．５、４４．０、４４．５、４５．０、４５．５、４６．０、４６．５、４７．０、４７．５、４８．０、４８．５、４９．０、４９．５、５０．０、５０．５、５１．０、５１．５、５２．０、５２．５、５３．０、５３．５、５４．０、５４．５、５５．０、５５．５、５６．０、５６．５、５７．０、５７．５、５８．０、５８．５、５９．０、５９．５、または６０．０分間）、１～２４時間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、または２４．０時間）、１～３０日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間）、１～１２ヶ月間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、または１２．０ヶ月間）、または１～１０年間（例えば、１．００、１．２５、１．５０、１．７５、２．００、２．２５、２．５０、２．７５、３．００、３．２５、３．５０、３．７５、４．００、４．２５、４．５０、４．７５、５．００、５．２５、５．５０、５．７５、６．００、６．２５、６．５０、６．７５、７．００、７．２５、７．５０、７．７５、８．００、８．２５、８．５０、８．７５、９．００、９．２５、９．５０、９．７５、または１０．００年間）保存することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を－５～３０℃（例えば、－５．０、－４．５、－４．０、－３．５、－３．０、－２．５、－２．０、－１．５、－１．０、－０．５、０．０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５、２６．０、２６．５、２７．０、２７．５、２８．０、２８．５、２９．０、２９．５、または３０．０℃）で保存することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を－５～３０℃（例えば、－５．０、－４．５、－４．０、－３．５、－３．０、－２．５、－２．０、－１．５、－１．０、－０．５、０．０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５、２６．０、２６．５、２７．０、２７．５、２８．０、２８．５、２９．０、２９．５、または３０．０℃）で１～６０分間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５、２６．０、２６．５、２７．０、２７．５、２８．０、２８．５、２９．０、２９．５、３０．０、３０．５、３１．０、３１．５、３２．０、３２．５、３３．０、３３．５、３４．０、３４．５、３５．０、３５．５、３６．０、３６．５、３７．０、３７．５、３８．０、３８．５、３９．０、３９．５、４０．０、４０．５、４１．０、４１．５、４２．０、４２．５、４３．０、４３．５、４４．０、４４．５、４５．０、４５．５、４６．０、４６．５、４７．０、４７．５、４８．０、４８．５、４９．０、４９．５、５０．０、５０．５、５１．０、５１．５、５２．０、５２．５、５３．０、５３．５、５４．０、５４．５、５５．０、５５．５、５６．０、５６．５、５７．０、５７．５、５８．０、５８．５、５９．０、５９．５、または６０．０分間）、１～２４時間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、または２４．０時間）、１～３０日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間）、１～１２ヶ月間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、または１２．０ヶ月間）、または１～１０年間（例えば、１．００、１．２５、１．５０、１．７５、２．００、２．２５、２．５０、２．７５、３．００、３．２５、３．５０、３．７５、４．００、４．２５、４．５０、４．７５、５．００、５．２５、５．５０、５．７５、６．００、６．２５、６．５０、６．７５、７．００、７．２５、７．５０、７．７５、８．００、８．２５、８．５０、８．７５、９．００、９．２５、９．５０、９．７５、または１０．００年間）保存することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００ｎｌ、μｌ、ｍｌ、またはＬの体積を有し、かつＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を１～６０分間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５、２６．０、２６．５、２７．０、２７．５、２８．０、２８．５、２９．０、２９．５、３０．０、３０．５、３１．０、３１．５、３２．０、３２．５、３３．０、３３．５、３４．０、３４．５、３５．０、３５．５、３６．０、３６．５、３７．０、３７．５、３８．０、３８．５、３９．０、３９．５、４０．０、４０．５、４１．０、４１．５、４２．０、４２．５、４３．０、４３．５、４４．０、４４．５、４５．０、４５．５、４６．０、４６．５、４７．０、４７．５、４８．０、４８．５、４９．０、４９．５、５０．０、５０．５、５１．０、５１．５、５２．０、５２．５、５３．０、５３．５、５４．０、５４．５、５５．０、５５．５、５６．０、５６．５、５７．０、５７．５、５８．０、５８．５、５９．０、５９．５、または６０．０分間）、１～２４時間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、または２４．０時間）、１～３０日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間）、１～１２ヶ月間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、または１２．０ヶ月）、または１～１０年間（例えば、１．００、１．２５、１．５０、１．７５、２．００、２．２５、２．５０、２．７５、３．００、３．２５、３．５０、３．７５、４．００、４．２５、４．５０、４．７５、５．００、５．２５、５．５０、５．７５、６．００、６．２５、６．５０、６．７５、７．００、７．２５、７．５０、７．７５、８．００、８．２５、８．５０、８．７５、９．００、９．２５、９．５０、９．７５、または１０．００年間）保存することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００ｎｌ、μｌ、ｍｌ、またはＬの体積を有し、かつＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を－５～３０℃（例えば、－５．０、－４．５、－４．０、－３．５、－３．０、－２．５、－２．０、－１．５、－１．０、－０．５、０．０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５、２６．０、２６．５、２７．０、２７．５、２８．０、２８．５、２９．０、２９．５、または３０．０℃）で１～６０分間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５、２６．０、２６．５、２７．０、２７．５、２８．０、２８．５、２９．０、２９．５、３０．０、３０．５、３１．０、３１．５、３２．０、３２．５、３３．０、３３．５、３４．０、３４．５、３５．０、３５．５、３６．０、３６．５、３７．０、３７．５、３８．０、３８．５、３９．０、３９．５、４０．０、４０．５、４１．０、４１．５、４２．０、４２．５、４３．０、４３．５、４４．０、４４．５、４５．０、４５．５、４６．０、４６．５、４７．０、４７．５、４８．０、４８．５、４９．０、４９．５、５０．０、５０．５、５１．０、５１．５、５２．０、５２．５、５３．０、５３．５、５４．０、５４．５、５５．０、５５．５、５６．０、５６．５、５７．０、５７．５、５８．０、５８．５、５９．０、５９．５、または６０．０分間）、１～２４時間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２０．５、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、または２４．０時間）、１～３０日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間）、１～１２ヶ月間（例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、または１２．０ヶ月間）、または１～１０年間（例えば、１．００、１．２５、１．５０、１．７５、２．００、２．２５、２．５０、２．７５、３．００、３．２５、３．５０、３．７５、４．００、４．２５、４．５０、４．７５、５．００、５．２５、５．５０、５．７５、６．００、６．２５、６．５０、６．７５、７．００、７．２５、７．５０、７．７５、８．００、８．２５、８．５０、８．７５、９．００、９．２５、９．５０、９．７５、または１０．００年間）保存することを含む。

いくつかの実施形態では、技術は、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）及び０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む組成物を複数のより少ない体積に等分することを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載される、例えば、本明細書に記載の方法によって提供される組成物を熱サイクルにかけることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、リアルタイムＰＣＲ及び／またはリアルタイムＲＴ－ＰＣＲのデータを提供するために時間及び／またはサイクル数の関数としての蛍光発光を記録することを含む。

いくつかの実施形態では、サンプル調製及びアッセイ実施は、（例えば、自動化サンプルハンドリング、増幅、及び分析システムを使用して）自動化される。いくつかの実施形態では、市販のシステム（例えば、Ａｂｂｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから利用可能；例えば、米国特許番号８，７０３，４４５参照；参照により本明細書に組み込まれる）が利用される。

いくつかの実施形態では、技術は、データを分析及び表示するためのソフトウェア及びコンピュータプロセッサ及びディスプレイスクリーン（例えば、コンピュータ、ラップトップ、スマートフォン、タブレットなど）を含む。

いくつかの実施形態では、アッセイ成分は、システムまたはキットの形態で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、アッセイ試薬（例えば、核酸プライマーまたはプローブ、緩衝液、対照、ｄＮＴＰなど）、対照、ソフトウェア、指示書などを含む。いくつかの実施形態では、試薬は、１つ以上の別個の容器（例えば、バイアル、ウェル、チューブなど）で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、試薬は、別個の容器でそれぞれ提供される。

いくつかの実施形態では、技術は、本明細書に記載される１つ以上の組成物（例えば、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）を含む組成物）を含むキットであって、キットの組成物の少なくとも１つは、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上、２つ以上、３つ以上、または４つ以上の組成物がＭＩＴを含む。いくつかの実施形態では、１つの組成物がＭＩＴを含む。

いくつかの実施形態では、技術は、本明細書に記載される１つ以上の組成物（例えば、ＰＣＲの１つ以上の成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、プローブ、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰモノマーのうちの１つ以上）、インターカレーター色素、水、緩衝液、サンプル、及び／または標的核酸）を含む組成物）を含むシステムであって、キットの組成物の少なくとも１つは、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１０、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２０、０．００２１、０．００２２、０．００２３、０．００２４、０．００２５、０．００２６、０．００２７、０．００２８、０．００２９、０．００３０、０．００３１、０．００３２、０．００３３、０．００３４、０．００３５、０．００３６、０．００３７、０．００３８、０．００３９、０．００４０、０．００４１、０．００４２、０．００４３、０．００４４、０．００４５、０．００４６、０．００４７、０．００４８、０．００４９、０．００５０、０．００５１、０．００５２、０．００５３、０．００５４、０．００５５、０．００５６、０．００５７、０．００５８、０．００５９、０．００６０、０．００６１、０．００６２、０．００６３、０．００６４、０．００６５、０．００６６、０．００６７、０．００６８、０．００６９、０．００７０、０．００７１、０．００７２、０．００７３、０．００７４、０．００７５、０．００７６、０．００７７、０．００７８、０．００７９、０．００８０、０．００８１、０．００８２、０．００８３、０．００８４、０．００８５、０．００８６、０．００８７、０．００８８、０．００８９、０．００９０、０．００９１、０．００９２、０．００９３、０．００９４、０．００９５、０．００９６、０．００９７、０．００９８、０．００９９、０．０１００、０．０１０１、０．０１０２、０．０１０３、０．０１０４、０．０１０５、０．０１０６、０．０１０７、０．０１０８、０．０１０９、０．０１１０、０．０１１１、０．０１１２、０．０１１３、０．０１１４、０．０１１５、０．０１１６、０．０１１７、０．０１１８、０．０１１９、０．０１２０、０．０１２１、０．０１２２、０．０１２３、０．０１２４、０．０１２５、０．０１２６、０．０１２７、０．０１２８、０．０１２９、０．０１３０、０．０１３１、０．０１３２、０．０１３３、０．０１３４、０．０１３５、０．０１３６、０．０１３７、０．０１３８、０．０１３９、０．０１４０、０．０１４１、０．０１４２、０．０１４３、０．０１４４、０．０１４５、０．０１４６、０．０１４７、０．０１４８、０．０１４９、または０．０１５０％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む、システムを提供する。システムのいくつかの実施形態では、システムは、前記組成物と、サーモサイクラー、蛍光検出器、コンピュータ、前記サーモサイクラー及び／または前記蛍光検出器を制御するためのソフトウェア、ディスプレイ、分注器、サンプル容器、マスターミックスを保持するように構成されたチューブ、冷蔵庫、保存ユニット、インキュベーター、及び／または冷凍庫のうちの１つ以上とを含む。

技術は、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ））のための試薬の商業的規模の製造のためのマスターミックスの生成において及びエンドユーザ（例えば、研究者、臨床医など）による核酸増幅の使用において利用される。

いくつかの実施形態では、技術は、ＰＣＲに有用である。本明細書の実施形態において利用され得るＰＣＲの所定の基本原理は、例えば、米国特許番号４，６８３，１９５；４，６８３，２０２；４，８００，１５９；及び４，９６５，１８８に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。基本的なＰＣＲは、分析または他の用途のために標的ＤＮＡのサンプルを増幅させるために使用される。ＰＣＲは、複数の変性サイクル、プライマー対の逆鎖へのアニーリング、及びプライマー伸長を使用して、標的核酸配列のコピー数を指数関数的に増加させる。基本的なＰＣＲ反応は、標的ＤＮＡの鎖をコピーすること、及び次いでコピーを使用して後続のサイクルにおいてさらなるコピーを生成することを含む。二本鎖標的ＤＮＡの温度は、ＤＮＡを変性するために「変性温度」（例えば、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９７℃、９８℃、９９℃、またはそれらの間の範囲（例えば、９２～９７℃））まで上げられ、次いで温度は、少なくとも１つのプライマーを変性した標的ＤＮＡの各鎖にアニーリングするために「アニーリング温度」（例えば、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７２℃、７４℃、またはそれらの間の範囲（例えば、６２～７２℃））に下げられる。いくつかの実施形態では、プライマーは、ペア、すなわち、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用され、プライマーペアまたはプライマーセットと称され得る。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、変性した標的ＤＮＡの一方の鎖の５’末端とハイブリダイズすることが可能な５’上流プライマー及び変性した標的ＤＮＡの他方の鎖の３’末端とハイブリダイズすることが可能な３’下流プライマーを含む。所与のプライマーが変性した標的ＤＮＡの鎖に結合すると、プライマーは、（例えば、アニーリング温度または区別可能な「伸長温度」（例えば、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、またはそれらの間の範囲）でポリメラーゼの作用によって伸長する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ（またはそれらの好適なバリアント（例えば、ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ、ＣＲＩＭＳＯＮ ＴＡＱ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴＲなど））である。時にアンプリコンと称され得る伸長生成物は次いで、生じた鎖から変性され、プロセスが繰り返される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるデバイス及び方法は、ＰＣＲ反応の様々な温度工程を介する核酸含有サンプルのサイクルに有用である。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、当該技術分野で知られている逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ－ＰＣＲ」）である；例えば、参照により本明細書に組み込まれるＢｕｓｔｉｎ （２０００） “Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２５：１６９－９３を参照されたい。

本開示は所定の例示された実施形態に言及しているが、これらの実施形態は、限定のためではなく例のために提示されていることを理解されたい。

〔実施例〕
実施例１
本明細書で提供される技術の実施形態の開発中に、０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（それぞれ、０、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ濃度に相当する）を含むマスターミックスを使用して、鋳型を含まないＲＴ－ＰＣＲ反応混合物を調製した実験を行った（条件当たり２レプリケート）。反応混合物中のプライマー及びプローブは、ＨＩＶ－１核酸を標的とする。蛍光ＤＮＡ－インターカレーター色素であるＥＶＡ Ｇｒｅｅｎを、非特異的増幅生成物の蓄積をモニタリングするために各反応に含めた。０、０．１５、０．０５．及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含むＲＴ－ＰＣＲ反応からのリアルタイムのＥＶＡ Ｇｒｅｅｎ蛍光シグナルが図１に示されている。ＭＩＴ（ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０の添加に由来する）を含むマスターミックスは、ＭＩＴを含んでいなかった反応と比較して、（ＥＶＡ Ｇｒｅｅｎシグナルの遅延によって実証されているように）低下したレベルの非特異的生成物形成を示した。

実施例２
本明細書で提供される技術の実施形態の開発中に、商業的製造プロセスによってバルクＲＴ－ＰＣＲ試薬の調製をシミュレートするための実験を行った。特に、０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（それぞれ０、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ濃度に相当する）を含むプロトタイプのＨＩＶ－１アッセイマスターミックスを２～８℃で１６時間インキュベーションした。次いでＨＩＶ－１標的ＲＮＡの非存在下で各マスターミックス用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した（条件当たり２レプリケート）。蛍光ＤＮＡ－インターカレーター色素であるＥＶＡ Ｇｒｅｅｎを、非特異的増幅生成物の蓄積をモニタリングするために各反応に含めた。０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含むＲＴ－ＰＣＲ反応からのリアルタイムのＥＶＡ Ｇｒｅｅｎ蛍光シグナルが図２に示されている。ＭＩＴを含むマスターミックスは、ＭＩＴを含んでいなかった反応と比較して（ＥＶＡ Ｇｒｅｅｎのシグナルの遅延によって実証されているように）低下したレベルの非特異的生成物の形成を示した。データはまた、ＭＩＴを用いた反応及びＭＩＴを用いていない反応についてのＣｔ値の差が、実施例１に記載の実験と比較してこの実験ではより明白であることを示していた。したがって、データは、ＭＩＴ及び／またはＰＲＯＣＬＩＮ ９５０が、改善された安定性をマスターミックスに提供することを示していた。

実施例３
本明細書で提供される技術の実施形態の開発中に、プロトタイプのＨＩＶ－１アッセイマスターミックスにおいてＭＩＴの存在下でＲＴ－ＰＣＲを試験するための実験を行った。５０コピーのＨＩＶ－１標的ＲＮＡを含み、０．０１５％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（０．００１５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含むか、またはＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含まないプロトタイプのＨＩＶ－１アッセイマスターミックスをＲＴ－ＰＣＲによって試験した（各条件で８レプリケート）。０または０．０１５％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含むＨＩＶ－１のＲＴ－ＰＣＲ反応からのＨＩＶ特異的リアルタイム蛍光シグナルが図３に示されている。データは、ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含むＲＴ－ＰＣＲが、ＰＲＯＬＣＩＮを含有しない反応と比較して増加したシグナルを示したことを示している。

実施例４
本明細書で提供される技術の実施形態の開発中に、プロトタイプのＣＴ／ＮＧアッセイマスターミックスにおいてＭＩＴの存在下でＲＴ－ＰＣＲを試験するための実験を行った。０．１封入体形成単位のＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを含み、０．０１５％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（０．００１５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含むか、またはＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含まないプロトタイプのＣＴ／ＮＧアッセイマスターミックスをＲＴ－ＰＣＲによって試験した（各条件で８レプリケート）。０または０．０１５％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（０．００１５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含むＣＴ／ＮＧのＲＴ－ＰＣＲ反応からのＣＴ特異的リアルタイム蛍光シグナルが図４に示されている。データは、ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含む反応が、ＰＲＯＬＣＩＮ ９５０を含有しない反応と比較して改善したシグナルを示したことを示している。さらに、プロトタイプのＣＴ／ＮＧアッセイは、実施例３に記載のプロトタイプのＨＩＶ－１アッセイとは異なるプライマー及びプローブセットを使用する。したがって、データは、ＭＩＴのＰＣＲ向上機能が、特定のプライマー／プローブ配列に限定されないことを示していた。

実施例５
本明細書で提供される技術の実施形態の開発中に、ＨＩＶ－ＩアッセイのためのバルクＰＣＲ試薬の生成をシミュレートするための実験を行った。特に、０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（それぞれ０、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ濃度に相当する）を含むマスターミックスを２～８℃で１６時間インキュベーションした。次いで５０コピーのＨＩＶ－１のＲＮＡを使用して各マスターミックスを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した（条件当たり８レプリケート）。０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含むＨＩＶ－１のＲＴ－ＰＣＲ反応からのＨＩＶ特異的リアルタイム蛍光シグナルが図５に示されている。データは、ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含むマスターミックスが、ＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含有しない反応と比較して、（ＲＴ－ＰＣＲ曲線の増加シグナルによって実証されているように）改善した安定性を示すことを示していた。

上記明細書で言及されたすべての刊行物及び特許は、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。記載された技術の組成物、方法、及び使用の様々な改変及び類型が、記載される技術の範囲及び趣旨を逸脱することなく当業者に明らかになる。技術は、特定の例示的な実施形態に関連して記載されているが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者に明らかである本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。

マスターミックスにおいてＭＩＴを含ませることが、非特異的生成物の蓄積を減少させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（それぞれ、０、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ濃度に相当する）を含むサンプルについてのサイクル数の関数としてのｄＲｎを示している。 ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスにおいてＭＩＴを含ませることが、長期保存中に非特異的生成物の蓄積を減少させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（それぞれ、０、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ濃度に相当する）を含むサンプルについてのサイクル数の関数としてのｄＲｎを示している。 ＭＩＴをＨＩＶ－１アッセイマスターミックスに添加することが、ＲＴ－ＰＣＲ性能を向上させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、５０コピーのＨＩＶ－１標的ＲＮＡを含み、０．０１５％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（０．００１５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含むか、またはＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含まないサンプルについてのサイクル数の関数としてのｄＲｎを示している。 ＭＩＴをＣＴ／ＮＧ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）マスターミックスに添加することが、ＲＴ－ＰＣＲ性能を向上させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、０．１封入体形成単位のＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを含み、０．０１５％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（０．００１５％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ）を含むか、またはＰＲＯＣＬＩＮ ９５０を含まないサンプルについてのサイクル数の関数としてのｄＲｎを示している。 ＭＩＴがＰＣＲマスターミックスの安定性を改善させることを示すＲＴ－ＰＣＲデータのプロット図である。プロット図は、５０コピーのＨＩＶ－１のＲＮＡを含む反応混合物において使用する前に２～８℃で１６時間インキュベーションした、０、０．０１５、０．０５、及び０．１％（ｗ／ｗ）のＰＲＯＣＬＩＮ ９５０（それぞれ、０、０．００１５、０．００５、及び０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴ濃度に相当する）を含むマスターミックスについてのサイクル数に応じたｄＲｎを示している。

Claims (35)

1. ポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）の２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＭＩＴ）を含む核酸増幅組成物。
2. ０．００１～０．０１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む、請求項１の核酸増幅組成物。
3. 標的鋳型をさらに含む、請求項１の核酸増幅組成物。
4. 検出可能に標識されたプローブまたはインターカレーター色素をさらに含む、請求項１の核酸増幅組成物。
5. 前記組成物は、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーを含むプライマー二量体を含まない、請求項１の核酸増幅組成物。
6. 第１のプライマー、第２のプライマー、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含むオリゴヌクレオチド試薬。
7. 第２の検出可能に標識されたプローブをさらに含む、請求項６のオリゴヌクレオチド試薬。
8. 参照色素をさらに含む、請求項６のオリゴヌクレオチド試薬。
9. 第３のプライマー及び第４のプライマーをさらに含む、請求項６のオリゴヌクレオチド試薬。
10. キットであって、
    ａ）第１のプライマー、第２のプライマー、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含むオリゴヌクレオチド試薬、及び
    ｂ）塩化マンガン及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む活性化試薬
    を含む、前記キット。
11. 緩衝溶液中の熱安定性ポリメラーゼをさらに含む、請求項１０のキット。
12. 前記熱安定性ポリメラーゼは、ｒＴｔｈポリメラーゼである、請求項１１のキット。
13. 対照核酸及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む内部対照をさらに含む、請求項１０のキット。
14. １リットルを超える体積を有し、かつ第１のプライマー、第２のプライマー、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む商業的規模のマスターミックス組成物。
15. １リットルを超える体積を有し、かつ塩化マンガン及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む商業的規模のマスターミックス組成物。
16. リアルタイムＰＣＲ組成物中の核酸を検出する方法であって、前記方法は、ポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む反応組成物を提供することを含む、前記方法。
17. サンプルを前記反応組成物に添加することをさらに含む、請求項１６の方法。
18. 検出可能に標識されたプローブまたはインターカレーター色素を提供することをさらに含む、請求項１６の方法。
19. 前記反応組成物を熱サイクルにかけることをさらに含む、請求項１６の方法。
20. 前記反応組成物の蛍光発光を測定することをさらに含む、請求項１６の方法。
21. 前記０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴならびに前記ポリメラーゼ、前記第１のプライマー、前記第２のプライマー、及び／または前記ヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むリアルタイムＰＣＲ試薬を少なくとも１日間保存することをさらに含む、請求項１６の方法。
22. 前記リアルタイムＰＣＲ試薬を少なくとも１週間保存することを含む、請求項２１の方法。
23. 前記リアルタイムＰＣＲ試薬を少なくとも１ヶ月間保存することを含む、請求項２１の方法。
24. 前記リアルタイムＰＣＲ試薬は、前記反応組成物を調製するために使用される、請求項２１の方法。
25. ０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴをポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、及び／またはヌクレオチドのうちの少なくとも１つと混合することを含む、リアルタイムＰＣＲ試薬を生成する方法。
26. 前記リアルタイムＰＣＲ試薬は、１リットルを超える体積を有する、請求項２５の方法。
27. 前記リアルタイムＰＣＲ試薬を少なくとも１日間保存することをさらに含む、請求項２５の方法。
28. 前記リアルタイムＰＣＲ試薬を少なくとも１週間保存することをさらに含む、請求項２５の方法。
29. 前記リアルタイムＰＣＲ試薬を少なくとも１ヶ月間保存することをさらに含む、請求項２５の方法。
30. 前記リアルタイムＰＣＲ試薬中に参照色素、検出可能に標識されたプローブ、インターカレーター色素、第３のプライマー、及び／または第４のプライマーを混合することをさらに含む、請求項２５の方法。
31. 核酸を検出するためのシステムであって、前記システムは、
    ａ）第１のプライマー、第２のプライマー、検出可能に標識されたプローブ、ヌクレオチド、及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含むオリゴヌクレオチド試薬、及び
    ｂ）塩化マンガン及び０．０００１～０．１％（ｗ／ｗ）のＭＩＴを含む活性化試薬
    を含む、前記システム。
32. リアルタイムサーモサイクラーをさらに含む、請求項３１のシステム。
33. Ｃｔ値を決定するように構成されたコンピュータをさらに含む、請求項３１のシステム。
34. 緩衝溶液中の熱安定性ポリメラーゼをさらに含む、請求項３１のシステム。
35. 前記熱安定性ポリメラーゼは、ｒＴｔｈポリメラーゼである、請求項３４のシステム。

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