JP2022514684A - アルロースの無細胞生成 - Google Patents
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Abstract
本明細書において提供されるのは、いくつかの態様において、耐熱性酵素などの酵素の使用を介して多糖をアルロースに変換するための、無細胞のシステム、方法、キットおよび組成物（例えば、細胞および細胞ライセート）である。
Description
関連出願
本願は、２０１８年１２月２１日に出願された米国仮出願番号６２／７８４，３１４の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
本願は、２０１８年１２月２１日に出願された米国仮出願番号６２／７８４，３１４の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
発明の背景
多糖の単純な糖への変換のための既存の技術は、各々のステップの後に大規模な精製プロセスを伴う複数の生体内変換を使用する。これらのプロセスは、固定された酵素および連続的な生成システムの適用のおかげで比較的安価であるが、下流のプロセッシングは、劇的にコストに影響を及ぼす。
多糖の単純な糖への変換のための既存の技術は、各々のステップの後に大規模な精製プロセスを伴う複数の生体内変換を使用する。これらのプロセスは、固定された酵素および連続的な生成システムの適用のおかげで比較的安価であるが、下流のプロセッシングは、劇的にコストに影響を及ぼす。
発明の要旨
本明細書において提供されるのは、多糖のアルロースへの酵素による変換のための無細胞のシステム、方法、組成物およびキットである。本開示の方法およびシステムは、多糖（例えばマルトデキストリン）をアルロースに変換するための無細胞反応（例えば、ワンポット（複数のライセートからなる）無細胞反応システム）における糖生成経路を実行する。典型的にはグルコースなどの基質のグルコース６－リン酸へのリン酸化を伴い、ＡＴＰおよびホスホエノイルピルビン酸などの高エネルギーリン酸源を使用するプロセスとは異なり、本明細書において記載されるプロセスは、典型的には、高エネルギーリン酸源を、例えば安価な無機リン酸（Ｐｉ）で置き換える。α－グルカンホスホリラーゼは、多糖をグルコース１－リン酸に変換するために用いられ、これは次いで、ホスホグルコムターゼを介してグルコース６－リン酸に変換される。任意に、脱分枝酵素（イソアミラーゼまたはプルラナーゼ）を用いて分枝結合の切断を通して多糖を分解し、それによりグルカンホスホリラーゼに対する基質のアベイラビリティを増大させてもよい。その後のホスホグルコイソメラーゼの酵素反応（単数または複数）は、フルクトース６－リン酸を生じ、これは次いで、アルロース６－リン酸３－エピメラーゼ（本明細書においてまた、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、フルクトース６－リン酸３－エピメラーゼ、またはフルクトース６－リン酸エピメラーゼとも称される）を介して、アルロース６－リン酸に変換される。最終的に、アルロース６－リン酸ホスファターゼを用いて、最終生成物であるアルロースを作製する（図１）。炭水化物の集合は、デンプン由来の多糖における高エネルギー状態から、より低エネルギーの単糖アルロースへと変換する。したがって、反応の熱力学－基質のリン酸化から生成物のへの脱リン酸化－は、生成物に有利である。
本明細書において提供されるのは、多糖のアルロースへの酵素による変換のための無細胞のシステム、方法、組成物およびキットである。本開示の方法およびシステムは、多糖（例えばマルトデキストリン）をアルロースに変換するための無細胞反応（例えば、ワンポット（複数のライセートからなる）無細胞反応システム）における糖生成経路を実行する。典型的にはグルコースなどの基質のグルコース６－リン酸へのリン酸化を伴い、ＡＴＰおよびホスホエノイルピルビン酸などの高エネルギーリン酸源を使用するプロセスとは異なり、本明細書において記載されるプロセスは、典型的には、高エネルギーリン酸源を、例えば安価な無機リン酸（Ｐｉ）で置き換える。α－グルカンホスホリラーゼは、多糖をグルコース１－リン酸に変換するために用いられ、これは次いで、ホスホグルコムターゼを介してグルコース６－リン酸に変換される。任意に、脱分枝酵素（イソアミラーゼまたはプルラナーゼ）を用いて分枝結合の切断を通して多糖を分解し、それによりグルカンホスホリラーゼに対する基質のアベイラビリティを増大させてもよい。その後のホスホグルコイソメラーゼの酵素反応（単数または複数）は、フルクトース６－リン酸を生じ、これは次いで、アルロース６－リン酸３－エピメラーゼ（本明細書においてまた、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、フルクトース６－リン酸３－エピメラーゼ、またはフルクトース６－リン酸エピメラーゼとも称される）を介して、アルロース６－リン酸に変換される。最終的に、アルロース６－リン酸ホスファターゼを用いて、最終生成物であるアルロースを作製する（図１）。炭水化物の集合は、デンプン由来の多糖における高エネルギー状態から、より低エネルギーの単糖アルロースへと変換する。したがって、反応の熱力学－基質のリン酸化から生成物のへの脱リン酸化－は、生成物に有利である。
さらに、本明細書において記載される酵素によるプロセスは、全体として、経路の最後のステップに起因して、特異的なアルロース－６ホスファターゼを介したアルロース６－リン酸のアルロースへの変換において本質的に不可逆的であり、これは、所望されるアルロースの高収率を可能にする。対照的に、多糖をアルロースに変換するための典型的な生体内変換方法は、例えば、３つの区別し得るプロセスを使用し、そのうちの２つは可逆的であり、生成物の最終濃度は、利用されている酵素の熱力学により支配される。例えば、デンプンがグルコースに変換され、グルコースがフルクトースに異性化され、フルクトースがアルロースにエピマー化される。グルコースのフルクトースへの異性化は、約４５％の収率を有し、したがって、純粋な生成物を生じ、触媒されていない基質をリサイクルするために、多大な下流のプロセッシングが必要とされる。同様に、フルクトースのアルロースへのエピマー化は、約２０％の収率を有し、やはり、類似の相当な下流のプロセッシングを必要とする。本明細書において記載されるような無細胞システムにおいて直接的に多糖をアルロースに変換する能力は、下流のプロセッシングおよび基質の損失を減少させることにより、コストを減少させる。
本明細書において提供されるプロセスにおいて用いることができる酵素の多くは、耐熱性であり、これは、（１）変換プロセスが行われる細胞ライセート中に含まれる有害な活性の熱失活を可能にし、（２）生成の実行に負の影響を及ぼす微生物汚染の機会を減少させる。これらの変換経路の酵素は、好熱性、中温性、または好冷性の生物から単離することができ、および／または、いくつかの態様においては、酵素の耐熱性または特異性を増大（または低下）させるために操作することができる。好熱性の生物（好熱菌）は、４１℃～１２２℃（１０６°Ｆ～２５２°Ｆ）の間の高温において繁栄する。中温性の生物（中温菌）は、２０℃～４５℃（６８°Ｆ～１１３°Ｆ）の間の中程度の温度において繁栄する。好冷性の生物（好冷菌）は、－２０℃～１０℃（－４°Ｆ～５０°Ｆ）の間の冷温において繁栄する。
したがって、本開示のいくつかの側面は、α－グルカンホスホリラーゼを用いて多糖をグルコース１－リン酸に変換すること、ホスホグルコムターゼを用いてグルコース１－リン酸をグルコース６－リン酸に変換すること、ホスホグルコイソメラーゼを用いてグルコース６－リン酸をフルクトース６－リン酸に変換すること、アルロース－６リン酸エピメラーゼを用いてフルクトース６－リン酸をアルロース６－リン酸に変換すること、および最終的に、アルロース６－リン酸ホスファターゼを用いてアルロース６－リン酸をアルロースに変換することにより、アルロースを生成するための、無細胞的方法を提供する（図１を参照）。
したがって、本開示のいくつかの側面は、セロデキストリンホスホリラーゼを用いてセルロース／セロデキストリンをグルコース１－リン酸に変換すること、ホスホグルコムターゼを用いてグルコース１－リン酸をグルコース６－リン酸に変換すること、ホスホグルコイソメラーゼを用いてグルコース６－リン酸をフルクトース６－リン酸に変換すること、アルロース－６リン酸エピメラーゼを用いてフルクトース６－リン酸をアルロース６－リン酸に変換すること、および最終的に、アルロース６－リン酸ホスファターゼを用いてアルロース６－リン酸をアルロースに変換することにより、アルロースを生成するための、無細胞的方法を提供する（図２を参照）。
本開示のいくつかの側面は、多糖からグルコース１－リン酸を生成する無細胞的方法を提供し、該方法は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼを用いて、多糖をグルコース１－リン酸に変換することを含む。いくつかの態様において、本開示は、アルロースを生成する方法を提供し、該方法は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼを用いて、多糖をグルコース１－リン酸に変換することを含む。当業者により理解されるであろうとおり、多糖からアルロースへのプロセスにおける他のステップは、本明細書においてまたは当該分野において記載される他の酵素により行われるであろう。
本開示のいくつかの態様は、グルコース６－リン酸からフルクトース６－リン酸を生成する無細胞的方法を提供し、該方法は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを用いて、グルコース６－リン酸をフルクトース６－リン酸に変換することを含む。いくつかの態様において、本開示は、アルロースを生成する方法を提供し、該方法は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを用いて、グルコース６－リン酸をフルクトース６－リン酸に変換することを含む。当業者により理解されるであろうとおり、多糖からアルロースへのプロセスにおける他のステップは、本明細書においてまたは当該分野において記載される他の酵素により行われるであろう。
本開示のいくつかの態様は、グルコース６－リン酸からフルクトース６－リン酸を生成する無細胞的方法を提供し、該方法は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを用いて、グルコース６－リン酸をフルクトース６－リン酸に変換することを含む。いくつかの態様において、本開示は、アルロースを生成する方法を提供し、該方法は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを用いて、グルコース６－リン酸をフルクトース６－リン酸に変換することを含む。当業者により理解されるであろうとおり、セルロース／セロデキストリンからアルロースへのプロセスにおける他のステップは、本明細書においてまたは当該分野において記載される他の酵素により行われるであろう。
ある態様は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、アルロースを生成するための細胞ライセートを提供する。
他の態様において、本開示は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、アルロースを生成するための細胞ライセートを提供する。
他の態様において、本開示は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、アルロースを生成するための細胞ライセートを提供する。
本開示のいくつかの側面は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、単一の細胞のライセートを提供する。
本開示のいくつかの態様は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、単一の細胞のライセートを提供する。
本開示のいくつかの態様は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、単一の細胞のライセートを提供する。
ある態様は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、改変細胞を開示する。
他の態様において、本開示は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、改変細胞を提供する。
他の態様において、本開示は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、改変細胞を提供する。
本開示のいくつかの側面は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択される１つ以上の酵素を含む、改変細胞を提供する。
本開示のいくつかの態様は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択される１つ以上の酵素を含む、改変細胞を提供する。
本開示のいくつかの態様は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択される１つ以上の酵素を含む、改変細胞を提供する。
ある態様は、少なくとも２つの細胞集団から得られた細胞ライセートの混合物を開示し、ここで、各々の細胞集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択される１つ以上の酵素を発現する。
他の態様において、本開示は、少なくとも２つの細胞集団から得られた細胞ライセートの混合物を提供し、ここで、各々の細胞集団の細胞は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現する。
他の態様において、本開示は、少なくとも２つの細胞集団から得られた細胞ライセートの混合物を提供し、ここで、各々の細胞集団の細胞は、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現する。
本開示のいくつかの側面は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、多糖、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、アルロース６－リン酸、およびアルロースを含む、細胞ライセートの反応混合物を提供する。
本開示のいくつかの側面は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、任意に多糖、任意にグルコース１－リン酸、任意にグルコース６－リン酸、任意にフルクトース６－リン酸、任意にアルロース６－リン酸、および任意にアルロースを含む、細胞ライセートの反応混合物を提供する。
本開示のいくつかの態様は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、多糖、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、アルロース６－リン酸、およびアルロースを含む、細胞ライセートの反応混合物を提供する。
本開示のいくつかの態様は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、任意に多糖、任意にグルコース１－リン酸、任意にグルコース６－リン酸、任意にフルクトース６－リン酸、任意にアルロース６－リン酸、および任意にアルロースを含む、細胞ライセートの反応混合物を提供する。
本開示のいくつかの態様は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、セルロース／セロデキストリン、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、アルロース６－リン酸、およびアルロースを含む、細胞ライセートの反応混合物を提供する。
本開示のいくつかの態様は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、任意にセルロース、任意にセロデキストリン、任意にグルコース１－リン酸、任意にグルコース６－リン酸、任意にフルクトース６－リン酸、任意にアルロース６－リン酸、および任意にアルロースを含む、細胞ライセートの反応混合物を提供する。
ある態様は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、多糖、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、アルロース６－リン酸、およびアルロースを含む、アルロースの合成のための細胞ライセート混合物を開示する。
ある態様は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、任意に多糖、任意にグルコース１－リン酸、任意にグルコース６－リン酸、任意にフルクトース６－リン酸、任意にアルロース６－リン酸、および任意にアルロースを含む、アルロースの合成のための細胞ライセート混合物を開示する。
他の態様において、本開示は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、多糖、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、アルロース６－リン酸、およびアルロースを含む、アルロースの合成のための細胞ライセート混合物を提供する。
他の態様において、本開示は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、任意に多糖、任意にグルコース１－リン酸、任意にグルコース６－リン酸、任意にフルクトース６－リン酸、任意にアルロース６－リン酸、および任意にアルロースを含む、アルロースの合成のための細胞ライセート混合物を提供する。
他の態様において、本開示は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、セルロース／セロデキストリン、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、アルロース６－リン酸、およびアルロースを含む、アルロースの合成のための細胞ライセート混合物を提供する。
他の態様において、本開示は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、任意にセルロース、任意にセロデキストリン、任意にグルコース１－リン酸、任意にグルコース６－リン酸、任意にフルクトース６－リン酸、任意にアルロース６－リン酸、および任意にアルロースを含む、アルロースの合成のための細胞ライセート混合物を提供する。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、（ａ）AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼを発現するように改変された細胞を培養して、当該酵素を発現した培養細胞を生成すること；（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること、ならびに（ｃ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセートをインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、（ａ）α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびにCtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを発現するように改変された細胞を培養して、当該酵素を発現する培養細胞を生成すること；（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること、ならびに（ｃ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセートをインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、（ａ）セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびにCtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを発現するように改変された細胞を培養して、当該酵素を発現する培養細胞を生成すること；（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること、ならびに（ｃ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において細胞ライセートをインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
ある態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を開示し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｄ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｄ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｄ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｄ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｄ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞ライセートを組み合わせて、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｄ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
ある態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を開示し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物に、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物に、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物に、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｅ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物に、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物に、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物に、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｅ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に脱分枝酵素を発現するように改変された細胞を培養して、当該酵素を発現する培養細胞を生成すること；（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること；（ｃ）細胞ライセートを、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｄ）多糖および無機リン酸の存在下において熱失活したライセートをインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、ならびにCtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを発現するように改変された細胞を培養して、当該酵素を発現する培養細胞を生成すること；（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること；（ｃ）細胞ライセートを、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｄ）多糖および無機リン酸の存在下において熱失活したライセートをインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に脱分枝酵素、ならびにCtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを発現するように改変された細胞を培養して、当該酵素を発現する培養細胞を生成すること；（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること；（ｃ）細胞ライセートを、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｄ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において熱失活したライセートをインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
ある態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を開示し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ｃ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ｃ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ｃ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｅ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｅ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
ある態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を開示し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｅ）熱失活したライセートに、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｅ）熱失活したライセートに、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｅ）熱失活したライセートに、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；（ｅ）細胞ライセート混合物に、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；（ｅ）細胞ライセート混合物に、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；（ｅ）細胞ライセート混合物に、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に耐熱性脱分枝酵素を発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生成すること；（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること；（ｃ）ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで細胞ライセートを加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｄ）多糖および無機リン酸の存在下において熱失活したライセートをインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に耐熱性脱分枝酵素を発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生成すること；（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること；（ｃ）ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで細胞ライセートを加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｄ）多糖および無機リン酸の存在下において熱失活したライセートをインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）耐熱性セロデキストリンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に耐熱性脱分枝酵素を発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生成すること；（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること；（ｃ）ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで細胞ライセートを加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｄ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において、熱失活したライセートをインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
ある態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を開示し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に耐熱性脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に耐熱性脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで細胞ライセート混合物を加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に耐熱性脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成すること；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に耐熱性脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで細胞ライセート混合物を加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に耐熱性脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、耐熱性セロデキストリンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に耐熱性脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで細胞ライセート混合物を加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに（ｅ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成し、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成し、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成し、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；ならびに（ｅ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
ある態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を開示し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に耐熱性脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｅ）熱失活したライセートに、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に耐熱性脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成すること；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｅ）熱失活したライセートに、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
他の態様において、本開示は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、耐熱性セロデキストリンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に耐熱性脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成する；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて細胞ライセート混合物を生成すること；（ｄ）細胞ライセート混合物をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｅ）熱失活したライセートに、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成することを含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成し、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；（ｅ）細胞ライセート混合物に、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成し、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；（ｅ）細胞ライセート混合物に、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ならびに任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成し、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；（ｅ）細胞ライセート混合物に、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの精製された酵素を添加して、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む反応混合物を生成すること；ならびに（ｆ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）脱分枝酵素を発現するように改変された細胞を培養すること、（ｂ）ステップ（ａ）の培養細胞を溶解して、細胞ライセートを生成すること、（ｃ）酵素を発現した培養細胞を生成するために、第２の反応において、少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、ならびにアルロース６－リン酸ホスファターゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように操作される；（ｄ）ステップ（ｃ）における少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｅ）ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）からの細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を作製すること；（ｆ）多糖および無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）脱分枝酵素を発現するように改変された細胞を培養すること；（ｂ）ステップ（ａ）の培養細胞を溶解して、細胞ライセートを生成すること；（ｃ）第２の反応において、少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、ならびにアルロース６－リン酸ホスファターゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように改変されて、酵素を発現した培養細胞を生成する；（ｄ）ステップ（ｃ）における少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｅ）ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）からの細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を作製すること；（ｆ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において細胞ライセート混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成するために、少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、少なくとも１つの脱分枝酵素、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを発現するように操作され、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｅ）多糖および無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本開示のいくつかの態様は、アルロースを生成するための無細胞的方法を提供し、該方法は、以下：（ａ）異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成するために、少なくとも２つの細胞集団を培養すること、ここで、各々の集団の細胞は、少なくとも１つの脱分枝酵素、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを発現するように操作され、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上をネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、細胞ライセート混合物を生成すること；ならびに（ｅ）セルロース／セロデキストリンおよび無機リン酸の存在下において反応混合物をインキュベートして、アルロースを生成すること、を含む。
本明細書において記載される酵素のいずれかは、キットにおいて提供されてもよい。いくつかの態様において、キットは、本明細書において提供される酵素を含む。いくつかの態様において、キットは、ここで記載されるような酵素を発現するための細胞を含む。いくつかの態様において、キットは、脱分枝酵素、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼのうちの少なくとも１つを発現するための細胞を含む。いくつかの態様において、キットは、Tm08495、AaGlgP、TcGlgP、PtAgp、TzAgp、PfAgp、CtPgi、TtPgi、MjPgi、PfPgi、Ap0768、およびCl1150のうちの少なくとも１つを発現するための細胞を含む。いくつかの態様において、キットは、本明細書において記載されるような酵素を発現するための核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、キットは、脱分枝酵素、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼのうちの少なくとも１つを発現するための核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、キットは、Tm08495、AaGlgP、TcGlgP、PtAgp、TzAgp、PfAgp、CtPgi、TtPgi、MjPgi、PfPgi、Ap0768、およびCl1150のうちの少なくとも１つを発現するための核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、キットは、脱分枝酵素、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼのうちの少なくとも１つを発現するための細胞を含む。いくつかの態様において、キットは、脱分枝酵素、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼのうちの少なくとも１つを発現するための核酸ベクターを含む。
いくつかの態様において、キットは、これらに限定されないが、アルロースを生成する方法、多糖をアルロースに変換する方法、マルトデキストリンをアルロースに変換する方法、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、および／またはアルロース６－リン酸のうちのいずれか１つを調製する方法を含む、本明細書において記載される方法を実施するための少なくとも１つの試薬をさらに含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの試薬として、これらに限定されないが、多糖、マルトデキストリン、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、アルロース６－リン酸、無機リン酸、およびコファクターが挙げられる。いくつかの態様において、キットは、これらに限定されないが、アルロースを生成する方法、セルロース／セロデキストリンをアルロースに変換する方法、マルトデキストリンをアルロースに変換する方法、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、および／またはアルロース６－リン酸のうちのいずれか１つを調製する方法を含む、本明細書において記載される方法を実施するための少なくとも１つの試薬をさらに含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの試薬として、これらに限定されないが、セルロース、セロデキストリン、マルトデキストリン、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、フルクトース６－リン酸、アルロース６－リン酸、無機リン酸、およびコファクターが挙げられる。
いくつかの態様において、キットは、本明細書において記載される多糖をアルロースに変換する方法を実施するための、無機リン酸、ならびにα－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼを発現するための細胞を含む。いくつかの態様において、キットは、本明細書において記載される多糖をアルロースに変換する方法を実施するための、無機リン酸、ならびに脱分枝酵素、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼを発現するための細胞を含む。いくつかの態様において、キットは、本明細書において記載されるセルロース／セロデキストリンをアルロースに変換する方法を実施するための、無機リン酸、ならびにセロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼを発現するための細胞を含む。いくつかの態様において、キットは、本明細書において記載されるセルロース／セロデキストリンをアルロースに変換する方法を実施するための、無機リン酸、ならびに脱分枝酵素、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼを発現するための細胞を含む。
また本明細書において提供されるのは、アルロースの生成のために用いられる耐熱性酵素などの酵素を含む、改変細胞、細胞ライセート、反応混合物およびキットである。本明細書における酵素が適用され得る関連するアルロース生成経路は、２０１８年７月１２日に公開された国際公開番号ＷＯ ２０１８／１２９２７５ Ａ１において現れ、これは、本明細書において参考として援用される。
本発明の１つ以上の態様の詳細は、本明細書において記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、詳細な説明、例および請求の範囲から明らかであろう。
詳細な説明
本明細書において記載されるのは、多糖のアルロースへの変換のために用いられる酵素経路である。酵素経路は、少なくとも１つのα－グルカンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸３－エピメラーゼ、および少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素、例えばプルラナーゼまたはイソアミラーゼのいずれかを利用する。いくつかの態様において、酵素または酵素のサブセットは、耐熱性である。これらの耐熱性酵素は、細胞ライセート中に含まれる有害な活性を失活させる糖生成プロセスの任意の加熱ステップを耐えることができ、この加熱失活ステップは、アルロースの生成に負の影響を及ぼす微生物汚染の機会を減少させる。
本明細書において記載されるのは、多糖のアルロースへの変換のために用いられる酵素経路である。酵素経路は、少なくとも１つのα－グルカンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸３－エピメラーゼ、および少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素、例えばプルラナーゼまたはイソアミラーゼのいずれかを利用する。いくつかの態様において、酵素または酵素のサブセットは、耐熱性である。これらの耐熱性酵素は、細胞ライセート中に含まれる有害な活性を失活させる糖生成プロセスの任意の加熱ステップを耐えることができ、この加熱失活ステップは、アルロースの生成に負の影響を及ぼす微生物汚染の機会を減少させる。
本開示は、いくつかの態様において、アルロースを生成するための、高度に効率的であり費用対効果が高い方法、組成物、およびシステムを提供する。アルロースを生成するためのこれらの方法、組成物、およびシステムは、有利な熱力学に起因して、高度に効率的であり費用対効果が高い。反応の熱力学は、最終酵素ステップが不可逆的である点において、生成物にとって有利であり、アルロースの高収率を可能にする。本明細書において記載されるような無細胞のシステムにおいて多糖をアルロースに直接変換する能力は、下流の処理および変換されない基質を減少させることにより、コストを軽減する。
アルロース生成経路および経路の酵素の非限定的な例を、以下の表１において提供する。
表１：例示的な経路の酵素のまとめ
表１：例示的な経路の酵素のまとめ
本明細書において、および表１において提示されるアルロース生成経路は、多段階のプロセスであることが理解されるべきである。いくつかの態様において、経路１、２、３および／または４は、多糖をアルロースに変換するために用いられる（表１および図１）。いくつかの態様において、経路５、６、７および／または８は、セルロース／セロデキストリンをアルロースに変換するために用いられる（表１および図２）。他の態様において、個々のステップは、対応する変換を行うために用いることができる（例えば、ステップ２は、グルコース１－リン酸をグルコース６－リン酸に変換するために用いることができる）。いくつかの態様において、全経路よりも少ないステップの組み合わせが用いられる（例えば、グルコース１－リン酸をアルロース６－リン酸に変換するためにステップ２、３および４を組み合わせる）。
アルロース生成
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのプルラナーゼまたはイソアミラーゼ、少なくとも１つのα－グルカンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼ、または前述の酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）の組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのプルラナーゼまたはイソアミラーゼ、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼ、または前述の酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）の組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのプルラナーゼまたはイソアミラーゼ、少なくとも１つのα－グルカンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼ、または前述の酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）の組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つのプルラナーゼまたはイソアミラーゼ、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼ、または前述の酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）の組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。
本明細書において提供されるようなアルロース生成経路の酵素は、典型的には、宿主細胞にとって異種性であるが、酵素のうちのいくつかは、宿主細胞にとって内在型（ネイティブ）であってもよい。したがって、いくつかの態様において、多糖をアルロースに変換するために用いられる少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）は、宿主細胞にとって異種性である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの酵素は、宿主細胞にとって異種性である。いくつかの態様において、少なくとも１つの酵素は、宿主細胞にとって内在型（ネイティブ）である。いくつかの態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの酵素は、宿主細胞にとって内在型である。
宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Escherichia coli細胞）などの原核細胞であっても、酵母細胞または植物細胞などの真核細胞であってもよい。他の細胞型は、以下に記載される。
いくつかの態様において、多糖をアルロースに変換するために用いられる酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、酵素の全ては、耐熱性酵素である。したがって、いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムターゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に少なくとも１つの脱分枝酵素、または前述の耐熱性酵素のうちの少なくとも２つまたはそれより多くの組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、セルロース／セロデキストリンをアルロースに変換するために用いられる酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、酵素の全ては、耐熱性酵素である。したがって、いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラーゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムターゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、任意に少なくとも１つの脱分枝酵素、または前述の耐熱性酵素のうちの少なくとも２つまたはそれより多くの組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、アルロースを生成する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱、浸透圧、機械、化学、または酵素による溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセートを生成することを含む。複数の細胞ライセート（およびしたがって複数の細胞集団、例えば同じ生物（例えば細菌）から、または異なる生物（例えば、細菌、酵母および／または植物細胞）からのもの）を、本明細書において提供されるようなアルロースの生成において用いることができることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団を、アルロース生成経路の１つ以上の酵素を発現するように操作してもよく、一方、別の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）を、アルロース生成経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように操作してもよい。したがって、いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのα－グルカンホスホリラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞の集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムターゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つの脱分枝酵素を発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養することを含む。細胞の溶解の後で、単一の細胞ライセート／反応混合物中に存在するように、細胞ライセートを組み合わせる。したがって、いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞の集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムターゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つの脱分枝酵素を発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養することを含む。細胞の溶解の後で、酵素が単一の細胞ライセート／反応混合物中に存在するように、細胞ライセートを組み合わせる。
細胞ライセートは、いくつかの態様において、栄養素と組み合わせてもよい。例えば、細胞ライセートは、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２と組み合わせてもよい。他の栄養素の例として、限定することなく、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、オロト酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化コバルト、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、二塩基リン酸カリウム、三塩基リン酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸アンモニウム、二塩基リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および水酸化アンモニウムが挙げられる。
細胞ライセートは、いくつかの態様において、コファクターと組み合わせてもよい。例えば、細胞ライセートは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、または酵素の活性のために必要とされる他の非タンパク質化学化合物（例えば、無機イオンおよび補酵素）と組み合わせてもよい。
本明細書において記載される方法のいずれか１つにおいて、細胞は、機械、化学、酵素、浸透圧、および／または熱による溶解を含む任意の方法により溶解することができることが、理解されるべきである。したがって、ある態様において、溶解ステップと加熱（熱失活）ステップとを、細胞を溶解して望ましくないネイティブの酵素による活性を失活させる温度まで細胞を加熱する単一のステップとして組み合わせてもよい。
いくつかの態様において、方法は、細胞ライセート（または細胞ライセート混合物）を、望ましくないネイティブの酵素による活性を失活させるが生成経路の耐熱性酵素のいずれも失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成することをさらに含む。細胞ライセートは、いくつかの態様において、少なくとも５０℃の温度まで加熱される。例えば、細胞ライセートは、少なくとも５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃または９０℃の温度まで加熱されてもよい。ネイティブの酵素（または他の非耐熱性酵素）は、いくつかの態様において、その活性のレベルが少なくとも５０％低下した場合に、不活性であるとみなされる。いくつかの態様において、ネイティブの酵素（または他の非耐熱性酵素）は、その活性のレベルが少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％低下した場合に、不活性であるとみなされる。
細胞ライセートは、細胞のネイティブの酵素（または他の非耐熱性酵素）が失活するために十分な時間にわたり加熱してよい。例えば、細胞ライセートは、少なくとも２、３、４または５分間にわたり加熱してもよい。いくつかの態様において、細胞ライセートは、５分間より長い時間にわたり加熱される。いくつかの態様において、細胞ライセートは、ネイティブの酵素（または他の非耐熱性酵素）の少なくとも一部の活性を、少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％）低下させるために十分な時間にわたり加熱される。
熱失活の後で、いくつかの態様において、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つまたは少なくとも３つ）の精製された酵素（または部分的に精製された酵素）を、細胞ライセート／反応混合物に添加する。したがって、反応混合物は、いくつかの態様において、細胞ライセート中に存在する（改変された宿主細胞により発現される）酵素の組み合わせ、少なくとも１つのコファクターまたは栄養素、および少なくとも１つの精製された酵素を含む。少なくとも１つの精製された酵素は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択することができる。少なくとも１つの精製された酵素は、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択することができる。有利なことに、このことは、細胞ライセートの一部ではなく、市販で得られる場合もある精製された酵素の組み込みを可能にし、それにより、必要とされる酵素を発現するように細胞を操作する必要性を軽減する。
いくつかの態様において、方法はまた、アルロースを生成するために、熱失活したライセートを、多糖および無機リン酸の存在下においてインキュベートすることを含む。いくつかの態様において、熱失活したライセートを、少なくとも５０℃の温度においてインキュベートする。いくつかの態様において、熱失活したライセートを、少なくとも２分間（例えば、少なくとも３、４または５分間）にわたりインキュベートする。例えば、熱失活したライセートを、３０～６０分間にわたりインキュベートしてもよく、最適化された時間は、３０分間未満、例えば２５～３０分間、２０～２５分間、１５～２０分間、１０～１５分間、５～１０分間、２～５分間または２～１０分間である。多糖は、例えば、デンプン、セルロース、マルトデキストリン、およびセロデキストリンであってもよい。いくつかの態様において、バイオマスが多糖の代わりに用いられる。いくつかの態様において、多糖はマルトデキストリンであり、化合物の構成成分（例えばバイオマスの一部）として存在する。例えば、いくつかの態様において、熱失活したライセート（例えば微生物細胞のライセート）は、アルロース（または本明細書において記載される任意の他の糖）を生成するために、コーンパルプおよび無機リン酸の存在下においてインキュベートされる。
また本明細書において提供されるのは、アルロースの生成のために用いられる細胞および細胞ライセートである。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含んでもよい。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および耐熱性脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含む。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含んでもよい。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、耐熱性セロデキストリンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および耐熱性脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含む。
アルロース生成経路（表１において」記載される）における使用のための酵素の非限定的例を、以下の表２において提供する。
表２．例示的なアルロース経路の酵素
表２．例示的なアルロース経路の酵素
表１における経路のうちの任意のものを用いてもよく、それは、表２から選択される酵素の任意の組み合わせを含んでもよいことが理解されるべきである。例えば、α－グルカンホスホリラーゼは、TzAgp、PfAgp、TcGlgP、PtAgp、Tm08495およびAaGlgPのうちのいずれか１つから選択することができ、Tk1621、Pk02350、Af0458、CtPgm2、TtPgm2およびTiManBのいずれか１つから選択されるホスホグルコムターゼと組み合わせてもよく、表２中の任意のホスホグルコイソメラーゼ、表２中の任意のアルロース６－リン酸エピメラーゼ、および表２中の任意のアルロース６－リン酸ホスファターゼと組み合わせてもよい。他の態様において、少なくとも１つのα－グルカンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼ、および少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼが用いられ、表２において現れる酵素から選択される。他の態様において、表２からの酵素は、表１からのステップの組み合わせにおいて用いられる（例えば、ステップ１および２は、α－グルカンホスホリラーゼがホスホグルコムターゼと組み合わせて多糖をグルコース６－リン酸に変換するために用いられる場合に行われる）。いくつかの態様において、変換を行うために２つのステップが使用される。他の態様において、ステップ１、ステップ２、ステップ３、ステップ４およびステップ５を含む群より選択される３、４または５つのステップのみが、対応する変換を行うために用いられる。いくつかの態様において、表２からの酵素は、表１からの単一のステップを行うためにのみ用いられる（例えば、グルコース１－リン酸をグルコース６－リン酸に変換するためにTk1621などのホスホグルコムターゼが用いられる場合、ステップ２のみが行われる）。他の態様において、ステップ１、ステップ２、ステップ３、ステップ４およびステップ５からなる群より選択される単一のステップのみが行われる。
基質の柔軟性および脱分枝化酵素
本明細書において記載される全ての経路について、多くの多糖基質を用いることができる。多量体グルコース基質の非限定的例として、デンプン、グリコーゲンおよびマルトデキストリンが挙げられる。いくつかの態様において、基質は、デンプンである。他の態様において、基質は、グリコーゲンである。なお他の態様において、基質は、マルトデキストリンである。いくつかの態様において、多量体グルコース基質の部分的に加水分解されたバージョン（例えば、デンプン、グリコーゲン、またはマルトデキストリン）が用いられる。デンプン、グリコーゲンおよびマルトデキストリンは、α（１－４）結合およびいくらかのα（１－６）結合により主に連結された複数のグルコースモノマーを含む。デンプンおよびグリコーゲンは、いずれもこれらのα（１－６）分枝点を含むが、グリコーゲンは、デンプンよりも実質的により多く分枝している。α（１－４）ポリマーについては、α－グルカンホスホリラーゼは、グルコース１－リン酸を１回放出するごとに１グルコース分ポリマーを消費する。
本明細書において記載される全ての経路について、多くの多糖基質を用いることができる。多量体グルコース基質の非限定的例として、デンプン、グリコーゲンおよびマルトデキストリンが挙げられる。いくつかの態様において、基質は、デンプンである。他の態様において、基質は、グリコーゲンである。なお他の態様において、基質は、マルトデキストリンである。いくつかの態様において、多量体グルコース基質の部分的に加水分解されたバージョン（例えば、デンプン、グリコーゲン、またはマルトデキストリン）が用いられる。デンプン、グリコーゲンおよびマルトデキストリンは、α（１－４）結合およびいくらかのα（１－６）結合により主に連結された複数のグルコースモノマーを含む。デンプンおよびグリコーゲンは、いずれもこれらのα（１－６）分枝点を含むが、グリコーゲンは、デンプンよりも実質的により多く分枝している。α（１－４）ポリマーについては、α－グルカンホスホリラーゼは、グルコース１－リン酸を１回放出するごとに１グルコース分ポリマーを消費する。
デンプンの長いポリマーは、しばしば水溶液中で不溶性であり、沈殿することに加えて、溶液のゲル化およびレトログラデーションを引き起こし得る。デンプンがより小さな鎖長のポリマーに部分的に加水分解されると、化学的（例えば、酸加水分解による）方法または酵素による（例えば、α－アミラーゼ）方法のいずれを通したものであっても、結果として生じる生成物は、マルトデキストリンである。これらの加水分解された誘導体は、しばしば、それらの親分子よりも良好に可溶化して混合され、したがって、いくつかの態様において、本明細書において提供される経路において用いられる。
グリコーゲン、デンプンまたは加水分解マルトデキストリンについて、α（１－６）枝は、任意のアルロース生成経路の収率を実質的に低下させるであろう。なぜならば、グルカンホスホリラーゼは、変換されていない利用可能なグルコースの大きな中心コアを残して、ポリマーをそれらの枝の末端まで分解する（chew down）からである。これらの基質／経路について、脱分枝酵素は、α－グルカンホスホリラーゼに対する基質のアベイラビリティを増大させるために用いることができる。これらは、用いることができる２つの例示的なクラスの脱分枝酵素である：イソアミラーゼおよびプルラナーゼ（表３）。酵素的には、いずれのクラスも、同じ機能を行うが、基質特異性において異なる。脱分枝酵素を用いることにより収率が増大する一方で、使用のタイミングは、用いられているプロセスおよび基質に依存するであろう。いくつかの態様において、α－グルカンは、α－アミラーゼおよび脱分枝酵素で前処理され、次いで、結果として生じる脱分枝化されたマルトデキストリンを、経路の他の酵素と共にリアクターに供給する。他の態様において、脱分枝化は、経路と同時に起こり、分枝化α－グルカンを、経路の全ての酵素ならびに脱分枝酵素を含む反応中に供給する。
本開示のいくつかの側面は、アルロースを生成するための方法、組成物、およびシステムを提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つの脱分枝酵素、少なくとも１つのα－グルカンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼ、または前述の酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）の組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。これらの方法は、いくつかの態様において、少なくとも１つの脱分枝酵素、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼ、または前述の酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）の組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、多糖をアルロースに変換するために用いられる酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、酵素の全ては、耐熱性酵素である。したがって、いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性脱分枝酵素、少なくとも１つの耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムターゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、または前述の耐熱性酵素のうちの少なくとも２つまたはそれより多くの組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、セルロース／セロデキストリンをアルロースに変換するために用いられる酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、酵素のうちの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは少なくとも４つ）は、耐熱性酵素である。いくつかの態様において、酵素の全ては、耐熱性酵素である。したがって、いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの耐熱性脱分枝酵素、少なくとも１つの耐熱性セロデキストリンホスホリラーゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコムターゼ、少なくとも１つの耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、少なくとも１つの耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、または前述の耐熱性酵素のうちの少なくとも２つまたはそれより多くの組み合わせを発現するように改変された細胞を培養することを含む。
いくつかの態様において、アルロースを生成する方法は、培養細胞を溶解（例えば、熱、浸透圧、機械、化学、または酵素による溶解）して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の細胞ライセートを生成することを含む。複数の細胞ライセート（およびしたがって複数の細胞集団、例えば同じ生物（例えば細菌）から、または異なる生物（例えば、細菌、酵母および／または植物細胞）からのもの）を、本明細書において提供されるような酵素による反応において用いることができることが、理解されるべきである。例えば、１つの細胞集団を、アルロース生成経路の１つ以上の酵素を発現するように操作してもよく、一方、別の細胞集団（またはいくつかの他の細胞集団）を、アルロース生成経路の別の（少なくとも１つの他の）酵素を発現するように操作してもよい。したがって、いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの脱分枝酵素を発現するように改変された少なくとも１つの細胞の集団を培養すること、少なくとも１つのα－グルカンホスホリラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞の集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムターゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養することを含む。したがって、いくつかの態様において、方法は、少なくとも１つの脱分枝酵素を発現するように改変された少なくとも１つの細胞の集団を培養すること、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞の集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコムターゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養すること、および／または少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼを発現するように改変された少なくとも１つの細胞集団を培養することを含む。細胞の溶解の後で、酵素が単一細胞ライセート／反応混合物中に存在するように、細胞ライセートを組み合わせる。
また本明細書において提供されるのは、アルロースの生成のために用いられる細胞および細胞ライセートである。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、脱分枝酵素、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼからなる群より選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含んでもよい。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、耐熱性脱分枝酵素、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、および耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼからなる群より選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含む。
また本明細書において提供されるのは、アルロースの生成のために用いられる細胞および細胞ライセートである。したがって、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、脱分枝酵素、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼからなる群より選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含んでもよい。いくつかの態様において、本開示の改変細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、および／または植物細胞）または細胞ライセートは、耐熱性脱分枝酵素、耐熱性セロデキストリンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、および耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼからなる群より選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の酵素を含む。
アルロース生成経路（表１において記載される）における使用のための脱分枝酵素の非限定的例を、以下の表３において提供する。
表３．例示的な脱分枝化酵素
表３．例示的な脱分枝化酵素
アルロースを生成するために、表１における経路のうちの任意のものを用いてもよく、これは、表２から選択される酵素の任意の組み合わせを含んでもよいことが、理解されるべきである。例えば、α－グルカンホスホリラーゼは、TzAgp、PfAgp、TcGlgP、PtAgp、Tm08495およびAaGlgPのうちのいずれか１つから選択してもよく、Tk1621、Pk02350、Af0458、CtPgm2、TtPgm2およびTiManBのうちのいずれか１つから選択されるホスホグルコムターゼと組み合わせてもよく、表２中の任意のホスホグルコイソメラーゼ、表２中の任意のアルロース６－リン酸エピメラーゼ、表２中の任意のアルロース６－リン酸ホスファターゼと組み合わせてもよく、さらに、プルラナーゼまたはイソアミラーゼなどの表３から選択される任意の酵素を含んでもよい。他の態様において、少なくとも１つの脱分枝酵素、少なくとも１つのα－グルカンホスホリラーゼ、少なくとも１つのホスホグルコムターゼ、少なくとも１つのホスホグルコイソメラーゼ、少なくとも１つのアルロース６－リン酸エピメラーゼ、および少なくとも１つのアルロース６－リン酸ホスファターゼが用いられ、表２および表３において現れる酵素から選択される。他の態様において、表２および３からの酵素は、表１からのステップと組み合わせて用いられる（例えば、α－グルカンホスホリラーゼ（例えば、TzAgp）およびホスホグルコムターゼ（例えば、Tk1621）が、StGlgXなどの脱分枝酵素と組み合わせて多糖をグルコース６－リン酸に変換するために用いられる場合には、ステップＤ１、１および２が、組み合わせて用いられる）。いくつかの態様において、変換のセットを行うために、２つのステップが使用される。他の態様において、対応する変換を行うために、ステップＤ１、ステップＤ２、ステップ１、ステップ２、ステップ３、ステップ４およびステップ５を含む群より選択される３、４、５、６または７つのみのステップが用いられる。いくつかの態様において、表３からの酵素は、表１からの単一のステップのみを行うために用いられる（例えば、脱分枝化のためにStTreXが用いられる場合には、ステップＤ２のみが行われる）。他の態様において、ステップＤ１、ステップＤ２、ステップ１、ステップ２、ステップ３、ステップ４およびステップ５からなる群より選択される単一のステップのみが行われる。
無細胞的生産
「無細胞的生産」は、生細胞を用いることのない、生体分子または化学物質の合成のための生物学的プロセスの使用である。むしろ、細胞は溶解され、酵素を含有する未精製（クルード）部分が、所望の産物の生産のために用いられる。非限定的な例として、細胞は培養され、収穫され、および高圧ホモジナイゼーションによって溶解される。無細胞的反応は、バッチまたはフェドバッチモードで行われ得る。いくつかの場合には、生物学的反応ネットワークは反応器の有効体積を満たし、細胞内環境よりも希釈され得る。それでもやはり、膜結合している触媒を含む、細胞内触媒の実質的に全てが提供される。内膜は細胞溶解の間に断片化され、それらの膜の断片は機能性膜小胞を形成する。したがって、複雑な生体内変化が触媒作用によってもたらされる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるSwartz, AIChE Journal, 2012, 58(1), 5-13参照。
「無細胞的生産」は、生細胞を用いることのない、生体分子または化学物質の合成のための生物学的プロセスの使用である。むしろ、細胞は溶解され、酵素を含有する未精製（クルード）部分が、所望の産物の生産のために用いられる。非限定的な例として、細胞は培養され、収穫され、および高圧ホモジナイゼーションによって溶解される。無細胞的反応は、バッチまたはフェドバッチモードで行われ得る。いくつかの場合には、生物学的反応ネットワークは反応器の有効体積を満たし、細胞内環境よりも希釈され得る。それでもやはり、膜結合している触媒を含む、細胞内触媒の実質的に全てが提供される。内膜は細胞溶解の間に断片化され、それらの膜の断片は機能性膜小胞を形成する。したがって、複雑な生体内変化が触媒作用によってもたらされる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるSwartz, AIChE Journal, 2012, 58(1), 5-13参照。
本開示の無細胞的方法およびシステムは、いくつかの態様において、本明細書においてより詳細に論じられる細胞ライセート（例えば、クルードなまたは部分精製された細胞ライセート）を利用する。細胞ライセートは、例えば機械的手段（例えば、剪断または粉砕）によって調製され得る。いくつかの態様において、細胞ライセートは化学的透過処理細胞とは異なる。本明細書で論じるように、いくつかの態様においては、細胞溶解（例えば、機械的な細胞溶解）の間に細胞内膜は断片化され、その結果、反転膜小胞が細胞ライセート中に形成される。溶解される細胞（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）はもはや原形ではない。
いくつかの態様において、透過処理細胞が使用される。透過処理細胞は、パーフォレーション（小さい穴）を含有する原形の細胞である。いくつかの態様において、細胞は、本明細書に提供されるような反応において使用するために、細胞内容物を放出するように透過処理されてもよい。
いくつかの態様において、部分的精製細胞画分が使用される。部分的に精製された細胞画分は、そこから１つ以上の細胞成分（例えば、細胞膜）が部分的にまたは完全に除去された細胞ライセートである。
耐熱性酵素
酵素は、酵素が（ａ）他の天然酵素を変性させる高温への暴露後に、その活性の実質的部分を保持するか、または（ｂ）天然酵素が低速で機能する中～高温への暴露後に、比較的高い速度で機能する場合に、耐熱性とみなされる。
酵素は、酵素が（ａ）他の天然酵素を変性させる高温への暴露後に、その活性の実質的部分を保持するか、または（ｂ）天然酵素が低速で機能する中～高温への暴露後に、比較的高い速度で機能する場合に、耐熱性とみなされる。
いくつかの態様において、耐熱性酵素は、類似の（非耐熱性）天然酵素を変性させるであろう比較的高い温度への曝露後に、５０％を超える活性を保持する。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、類似の（非耐熱性）天然酵素を変性させるであろう比較的高い温度への曝露後に、５０～１００％の活性を保持する。例えば、耐熱性酵素は、類似の（非耐熱性）天然酵素を変性させるであろう比較的高い温度への曝露後に、その活性の５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６５％、５０～６０％、または５０～５５％を保持し得る。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、類似の（非耐熱性）天然酵素を変性させるであろう比較的高い温度への曝露後に、その活性の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％を保持する。
いくつかの態様において、媒体を中温から高温に暴露した後の耐熱性酵素の活性は、類似の（非耐熱性）天然酵素の活性より、（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％）高い。
耐熱性酵素（例えば、ホスファターゼまたはホスホリラーゼ）は、例えば、４５℃～８０℃、またはそれ以上の温度で活性を維持し得る（反応を触媒することができる）。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、４５～８０℃、４５～７０℃、４５～６０℃、４５～５０℃、５０～８０℃、５０～７０℃、５０～６０℃、６０～８０℃、６０～７０℃、または７０～８０℃の温度で活性を維持する。例えば、耐熱性酵素は、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃の温度で、活性を維持し得る。耐熱性酵素は、比較的高温に暴露された後、比較的高温で１５分から４８時間、またはそれ以上、活性を維持することができる。例えば、耐熱性酵素は、比較的高温で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８時間、活性を維持し得る。
改変細胞
本開示の改変細胞は、いくつかの態様において、多糖および／またはデンプンおよび／またはマルトデキストリンをアルロースに変換するために必要とされる酵素活性の少なくとも１つ、または全てを含む。「改変細胞」とは、少なくとも１つの改変（例えば、組換え体または合成）核酸を含むか、またはそれらの天然に生ずるカウンターパートとは構造的および／もしくは機能的に別物であるように別様に修飾されている細胞である。それゆえに、改変核酸を含有する細胞は「改変細胞」と見なされる。
本開示の改変細胞は、いくつかの態様において、多糖および／またはデンプンおよび／またはマルトデキストリンをアルロースに変換するために必要とされる酵素活性の少なくとも１つ、または全てを含む。「改変細胞」とは、少なくとも１つの改変（例えば、組換え体または合成）核酸を含むか、またはそれらの天然に生ずるカウンターパートとは構造的および／もしくは機能的に別物であるように別様に修飾されている細胞である。それゆえに、改変核酸を含有する細胞は「改変細胞」と見なされる。
本開示の改変細胞は、いくつかの態様において、α－グルカンホスホリラーゼ（例えば、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ）、ホスホグルコムターゼ（例えば、耐熱性ホスホグルコムターゼ）、およびホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸３－エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）を含む。
本開示の改変細胞は、いくつかの態様において、セロデキストリンホスホリラーゼ（例えば、耐熱性セロデキストリンホスホリラーゼ）、ホスホグルコムターゼ（例えば、耐熱性ホスホグルコムターゼ）、およびホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸３－エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素からなる群より選択される少なくとも１つの酵素（例えば耐熱性酵素）を含む。
いくつかの態様において、改変細胞は選択マーカーを発現する。選択マーカーは、細胞のトランスフェクション後に（または外来性の核酸を細胞内に導入するために用いられる他の手続き後に）、改変核酸を取り込んで発現する改変細胞を選択するために、典型的に用いられる。それゆえに、産物をコードする核酸は、選択マーカーもまたコードし得る。選択マーカーの例は、限定なしに、抗生物質耐性マーカー、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性どちらかを増大または減少させるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子）を包含する。他の選択マーカーが本開示に従って用いられ得る。
改変細胞は、核酸（例えば改変核酸）によってコードされる産物が細胞内で生産される場合に、産物を「発現する」。遺伝子発現が、核酸の形態の遺伝子命令が用いられてタンパク質（例えば酵素）などの産物を合成するプロセスを言う、ということは当分野において公知である。
改変細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。いくつかの態様において、改変細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、または細胞の他の型である。
本開示において有用な改変細菌細胞は、限定なしに、改変Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymomonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.、およびPantoea spp.を包含する。
本開示において有用な改変酵母細胞は、限定なしに、改変Saccharomyces spp.、Schizosaccharomyces、Hansenula、Candida、Kluyveromyces、Yarrowia、およびPichiaを包含する。
いくつかの態様において、本開示において有用な改変細胞は、改変Escherichia coli細胞、Bacillus subtilis細胞、Pseudomonas putida細胞、Saccharomyces cerevisae細胞、またはLactobacillus brevis細胞である。いくつかの態様において、本開示において有用な改変細胞は、改変Escherichia coli細胞である。
改変核酸
「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドであり、いくつかの場合にはホスホジエステル結合（例えばホスホジエステル「バックボ－ン」）を含有し得る。核酸（例えば、核酸の成分または部分）は、天然に生ずるかまたは改変され得る。「天然に生ずる」核酸は、ヒトの介入の非存在下において天然に存在する細胞内に存在する。「改変核酸」は、組換え体核酸および合成核酸を包含する。「組換え体核酸」は、（例えば同じ種からのまたは異なる種からの）核酸分子同士を繋ぎ合わせることによって構築される分子を言い、典型的には生細胞内で複製し得る。「合成核酸」は、生物学的に合成、化学的に合成、または他の手段によって合成もしくは増幅される分子を言う。合成核酸は、化学的に修飾または別様に修飾されているが、天然に生ずる核酸分子と塩基対形成し得る核酸を包含する。組換え体および合成核酸は、前述のどちらかの複製からもたらされる分子をもまた包含する。改変核酸は天然に生ずる核酸の部分を含有し得るが、全体としては、改変核酸は天然には生じず、ヒトの介入を要求する。いくつかの態様において、本開示の産物をコードする核酸は、組換え体核酸または合成核酸である。他の態様において、産物をコードする核酸は、天然に生ずる。
「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドであり、いくつかの場合にはホスホジエステル結合（例えばホスホジエステル「バックボ－ン」）を含有し得る。核酸（例えば、核酸の成分または部分）は、天然に生ずるかまたは改変され得る。「天然に生ずる」核酸は、ヒトの介入の非存在下において天然に存在する細胞内に存在する。「改変核酸」は、組換え体核酸および合成核酸を包含する。「組換え体核酸」は、（例えば同じ種からのまたは異なる種からの）核酸分子同士を繋ぎ合わせることによって構築される分子を言い、典型的には生細胞内で複製し得る。「合成核酸」は、生物学的に合成、化学的に合成、または他の手段によって合成もしくは増幅される分子を言う。合成核酸は、化学的に修飾または別様に修飾されているが、天然に生ずる核酸分子と塩基対形成し得る核酸を包含する。組換え体および合成核酸は、前述のどちらかの複製からもたらされる分子をもまた包含する。改変核酸は天然に生ずる核酸の部分を含有し得るが、全体としては、改変核酸は天然には生じず、ヒトの介入を要求する。いくつかの態様において、本開示の産物をコードする核酸は、組換え体核酸または合成核酸である。他の態様において、産物をコードする核酸は、天然に生ずる。
本明細書において提供される、酵素をコードする改変核酸は、核酸のコントロール領域である「プロモーター」に作動可能に連結され得、そこでは核酸の残りの転写の開始および速度がコントロールされる。プロモーターは、それが制御する核酸の発現を駆動しまたは転写を駆動する。
プロモーターは、遺伝子または配列に天然に結び付けられているものであり得、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られ得る。かかるプロモーターは「内在性」と言われ得る。
いくつかの態様において、コード核酸配列は、組換え体または異種プロモーターのコントロール下に配置され得、これは、通常ではその天然環境においてはコードされている配列に結びつけられていないプロモーターを言う。かかるプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター；いずれかの他の細胞から単離されたプロモーター；および例えば、異なる転写制御領域の異なるエレメント同士および／または当分野において公知である遺伝子工学の方法によって発現を変化させる変異を含有するものなどの、「天然に生じ」ない合成プロモーターまたはエンハンサーを包含し得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、配列は、組換えクローニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する核酸増幅テクノロジ－を用いて、生産され得る。
プロモーターは、それが制御する核酸に対して正しい機能的な位置および向きにあって、その核酸の転写開始および／または発現をコントロールする（「駆動する」）ときに、「作動可能に連結」されていると見なされる。
本開示の改変核酸は、構成的プロモーターまたは誘導型プロモーターを含有し得る。「構成的プロモーター」は、細胞内において常に活性であるプロモーターを言う。「誘導型プロモーター」は、誘導因子もしくは誘導剤の存在下にあるか、それによって影響されるか、もしくはそれと接触するか、または抑圧を引き起こす因子の非存在下において活性化されるときに、転写活性を開始または増強するプロモーターを言う。本開示に従う使用のための誘導型プロモーターは、本明細書に記載されるかまたは当業者に公知のいずれかの誘導型プロモーターを包含する。誘導型プロモーターの例は、限定なしに、化学的／生化学的に制御および物理的に制御されるプロモーター、例えばアルコ－ルによって制御されるプロモーター、テトラサイクリンによって制御されるプロモーター、ステロイドによって制御されるプロモーター、金属によって制御されるプロモーター、発病機構によって制御されるプロモーター、温度／熱誘導型、リン酸によって制御される（例えばＰｈｏＡ）、および光によって制御されるプロモーターを包含する。
誘導因子または誘導剤は、内在的もしくは通常では外来的な条件（例えば光）、化合物（例えば、化学もしくは非化学化合物）、または誘導型プロモーターからの転写活性を制御する点で活性であるようなやり方で誘導型プロモーターに接触するタンパク質であり得る。それゆえに、核酸の「転写を制御するシグナル」は、誘導型プロモーターに作用する誘導因子シグナルを言う。転写を制御するシグナルは、用いられる制御システムに依存して転写を活性化または不活性化し得る。転写の活性化には、プロモーターに直接的に作用して転写を駆動すること、またはプロモーターが転写を駆動することを防ぐリプレッサ－を不活性化することによって、プロモーターに間接的に作用することが関わり得る。反対に、転写の脱活性化には、プロモーターに直接的に作用して転写を防ぐこと、またはリプレッサ－を活性化し、これがそれからプロモーターに作用することによって、プロモーターに間接的に作用することが関わり得る。
改変核酸は、当分野において公知のいずれかの手段を用いてホスト細胞内に導入され得、限定なしに、形質転換、トランスフェクション（例えば、化学的（例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、もしくはリポソーム）または非化学的（例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、インペイルフェクション（impalefection）、光学的トランスフェクション、流体力学的））、および形質導入（例えば、ウイルス系形質導入）を包含する。
天然に生ずる細胞内核酸によってコードされる酵素または他のタンパク質は、「内在性酵素」または「内在性タンパク質」と言われ得る。
プロテアーゼ標的化
本開示の改変細胞は、目的の糖（例えば、アルロ－ス）の生産に悪影響を与える可能性のある細胞の健康に必要な酵素を、発現（例えば、内在的に発現）し得る。かかる酵素は、本明細書において「標的酵素」と呼ばれる。例えば、改変細胞が発現する標的酵素は、基質または補因子について、糖生産経路に供給される前駆体の速度を増加させる酵素と競合し得る。別の例として、改変細胞が発現する標的酵素は、基質または補因子について、糖生産経路の鍵となる経路入り口酵素（pathway entry enzyme）である酵素と競合し得る。さらに別の例として、改変細胞が発現する標的酵素は、基質または補因子について、糖生産経路の基質または補因子を供給する酵素と競合し得る。
本開示の改変細胞は、目的の糖（例えば、アルロ－ス）の生産に悪影響を与える可能性のある細胞の健康に必要な酵素を、発現（例えば、内在的に発現）し得る。かかる酵素は、本明細書において「標的酵素」と呼ばれる。例えば、改変細胞が発現する標的酵素は、基質または補因子について、糖生産経路に供給される前駆体の速度を増加させる酵素と競合し得る。別の例として、改変細胞が発現する標的酵素は、基質または補因子について、糖生産経路の鍵となる経路入り口酵素（pathway entry enzyme）である酵素と競合し得る。さらに別の例として、改変細胞が発現する標的酵素は、基質または補因子について、糖生産経路の基質または補因子を供給する酵素と競合し得る。
この負の影響を無効化または軽減するために、標的酵素を修飾してそれらのタンパク質配列に部位特異的プロテアーゼ認識配列を包含させ、標的酵素が「標的化」されて、糖生産中の不活性化のために切断され得るようにすることができる（例えば、２０１２年３月１日公開の米国公開第２０１２／００５２５４７ Ａ１号；および２０１５年２月１２日公開の国際公開第ＷＯ ２０１５／０２１０５８ Ａ２号を参照、それぞれは参照により、本明細書に組み込まれる）。
部位特異的プロテアーゼ認識配列を含有する標的酵素の切断は、細胞増殖段階（例えば、改変細胞が培養されるにつれて）の細胞のペリプラズムに（標的酵素とは別に）隔離されて、変換段階（例えば、細胞ライセートを生産するためいの細胞溶解後）の間に標的酵素と接触させられる、同種の部位特異的プロテアーゼとの接触からもたらされる。したがって本開示の改変細胞は、いくつかの態様において、以下を含む：（ｉ）変換速度に悪影響を及ぼしかつ標的酵素のタンパク質配列中に部位特異的プロテアーゼ認識配列を含む標的酵素を、コードする、改変核酸、および（ｉｉ）標的酵素の部位特異的プロテアーゼ認識配列を切断しかつペリプラズム標的化配列を含む部位特異的プロテアーゼを、コードする、改変核酸。このペリプラズム標的化配列は、細胞が溶解するまで、部位特異的プロテアーゼを細胞のペリプラズム空間に隔離することを担う。ペリプラズム標的化配列の例を以下に提供する。
本開示に従って使用され得るプロテアーゼの例としては、限定はされないが、以下を含む：アラニンカルボキシペプチダーゼ、アスタシン、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、癌由来凝固促進因子、カテプシンＢ、クロストリパイン、細胞質アラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＢｒｇ－Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリシン、ゼラチナーゼ、Ｇｌｙ－Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒポデルミンＣ、Ｉｇａ特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、リソソームｐｒｏ－Ｘカルボキシペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ミクソバクター（myxobacter）、ナルディライジン、膵エンドペプチダーゼＥ、ピコルナイン（picornain）２Ｂ、ピコルナイン（picornain）３Ｃ、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロタンパク質転換酵素Ｉ、プロタンパク質転換酵素ＩＩ、ラッセルライジン（russellysin）、サッカロペプシン（saccharopepsin）、セメノゲラーゼ、Ｔ－プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子、Ｖ８、ベノムビンＢ、ベノムビンＢＢ、およびＸａａ－Ｐｒｏアミノペプチダーゼ。
ペリプラズム標的化
アルロース生成経路の酵素は、細胞の健康状態（例えば、生存能力）に悪影響を及ぼす、少なくとも１つの酵素を含み得る。この悪影響を無効化または軽減するために、酵素を転置配列を含むように修飾して細胞内または細胞外区画に転置させ、酵素が天然では位置せずかつ細胞の健康に悪影響を及ぼさない配置にすることができる（例えば、２０１１年１１月１０日公開の公開番号ＵＳ－２０１１－０２７５１１６－Ａ１を参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、アルロース生成経路の酵素は、細胞のペリプラズム空間に転置され得る。
アルロース生成経路の酵素は、細胞の健康状態（例えば、生存能力）に悪影響を及ぼす、少なくとも１つの酵素を含み得る。この悪影響を無効化または軽減するために、酵素を転置配列を含むように修飾して細胞内または細胞外区画に転置させ、酵素が天然では位置せずかつ細胞の健康に悪影響を及ぼさない配置にすることができる（例えば、２０１１年１１月１０日公開の公開番号ＵＳ－２０１１－０２７５１１６－Ａ１を参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、アルロース生成経路の酵素は、細胞のペリプラズム空間に転置され得る。
したがっていくつかの態様において、本開示の改変細胞は、ペリプラズム標的化配列に連結されているアルロース生成経路の少なくとも１つの酵素を含む。「ペリプラズム標的化配列」は、それが連結されているタンパク質を細胞のペリプラズムに標的化するアミノ酸配列である。ペリプラズム標的化配列に連結されているタンパク質は、そのタンパク質が発現される細胞のペリプラズム内に隔離されるであろう。
ペリプラズム標的化配列は、例えば、細菌分泌タンパク質のＮ末端に由来し得る。配列は、長さが約１５～約７０アミノ酸まで変化する。ペリプラズム標的化配列の一次アミノ酸配列は様々であるが、一般に以下の成分を含む共通の構造を有する：（ｉ）Ｎ末端部は可変長を有し、一般に正味の正電荷を持ち；（ｉｉ）それに続くのは約６～約１５アミノ酸の疎水性の中心コアであり；（ｉｉｉ）最後の成分はシグナルペプチダーゼの切断部位を規定する４～６のアミノ酸を含む。
本開示のペリプラズム標的化配列は、いくつかの態様において、グラム陰性菌によって分泌されるタンパク質に由来し得る。分泌タンパク質は、細菌によって、または細菌に感染するバクテリオファージによってコードされてもよい。分泌タンパク質のグラム陰性細菌供給源の例としては、限定はされないが、以下の属のメンバ－が挙げられる：Escherichia、Pseudomonas、Klebsiella、Salmonella、Caulobacter、Methylomonas、Acetobacter、Achromobacter、Acinetobacter、Aeromonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Azotobacter、Burkholderia、Citrobacter、Comamonas、Enterobacter、Erwinia、Rhizobium、Vibrio、およびXanthomonas。
本開示に従って使用するためのペリプラズム標的化配列の例としては、限定はされないが、以下からなる群から選択される配列が挙げられる：
MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA（配列番号１）；
MKQSTIALALLPLLFTPVTKA（配列番号２）；
MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA（配列番号３）；
MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA（配列番号４）；
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA（配列番号５）；
MKKIWLALAGLVLAFSASA（配列番号６）；
MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA（配列番号７）；
MKQALRVAFGFLILWASVLHA（配列番号８）；
MRVLLFLLLSLFMLPAFS（配列番号９）；および
MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA（配列番号１０）。
MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA（配列番号１）；
MKQSTIALALLPLLFTPVTKA（配列番号２）；
MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA（配列番号３）；
MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA（配列番号４）；
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA（配列番号５）；
MKKIWLALAGLVLAFSASA（配列番号６）；
MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA（配列番号７）；
MKQALRVAFGFLILWASVLHA（配列番号８）；
MRVLLFLLLSLFMLPAFS（配列番号９）；および
MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA（配列番号１０）。
融合または二機能性タンパク質
いくつかの態様において、α－グルカンホスホリラーゼおよびホスホグルコムターゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。融合タンパク質は、別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子または遺伝子セグメントを連結することにより作製することができる。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一または複数のポリペプチドをもたらす。多機能性タンパク質は、少なくとも２つの異なる活性を有する単一のタンパク質であって、ここで、機能性は、ネイティブの生物学的機能であるか、または改変酵素の融合の結果である。他の酵素もまた、単一の融合タンパク質または多機能性タンパク質として発現させることができる。したがって、融合タンパク質は、本明細書において記載される経路の酵素のうちのいずれかの複数の機能性を含んでもよい。
いくつかの態様において、α－グルカンホスホリラーゼおよびホスホグルコムターゼは、単一の融合（キメラ）タンパク質または二機能性タンパク質として発現される。融合タンパク質は、別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子または遺伝子セグメントを連結することにより作製することができる。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一または複数のポリペプチドをもたらす。多機能性タンパク質は、少なくとも２つの異なる活性を有する単一のタンパク質であって、ここで、機能性は、ネイティブの生物学的機能であるか、または改変酵素の融合の結果である。他の酵素もまた、単一の融合タンパク質または多機能性タンパク質として発現させることができる。したがって、融合タンパク質は、本明細書において記載される経路の酵素のうちのいずれかの複数の機能性を含んでもよい。
細胞培養物および細胞ライセート
典型的には、改変細胞は培養される。「培養する」とは、細胞がコントロールされた条件下において、典型的にはそれらの天然環境の外において増殖させられるプロセスを言う。例えば、改変細菌細胞などの改変細胞は、液体「培養培地」ともまた言われる液体栄養素ブロス中において、細胞懸濁液として増殖させられ得る。いくつかの態様において、無変換デンプンを、増殖細胞用の基質フィードとして使用する。
典型的には、改変細胞は培養される。「培養する」とは、細胞がコントロールされた条件下において、典型的にはそれらの天然環境の外において増殖させられるプロセスを言う。例えば、改変細菌細胞などの改変細胞は、液体「培養培地」ともまた言われる液体栄養素ブロス中において、細胞懸濁液として増殖させられ得る。いくつかの態様において、無変換デンプンを、増殖細胞用の基質フィードとして使用する。
普通に用いられる細菌Escherichia coli増殖培地の例は、限定なしに、ＬＢ（Luria Bertani）Ｍｉｌｌｅｒブロス（１％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および１％ＮａＣｌ；ＬＢ（Luria Bertani）Ｌｅｎｎｏｘブロス（０．５％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＳＯＢ培地（スーパーオプティマルブロス）：２％ペプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣ１、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４；ＳＯＣ培地（異化抑制因子を有するスーパーオプティマルブロス）：ＳＯＢ＋２０ｍＭグルコース；２×ＹＴブロス（２×酵母エキスおよびトリプトン）：１．６％ペプトン、１％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＴＢ（テリフィックブロス）培地：１．２％ペプトン、２．４％酵母エキス、７２ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、および０．４％グリセロ－ル；ならびにＳＢ（スーパーブロス）培地：３．２％ペプトン、２％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ、ならびに／またはＫｏｒｚ培地（Korz, DJ et al. 1995）を包含する。
高密度の細菌Escherichia coli増殖培地の例は、ＤＮＡＧｒｏ（商標）培地、ＰｒｏＧｒｏ（商標）培地、ＡｕｔｏＸ（商標）培地、ＤｅｔｏＸ（商標）培地、ＩｎｄｕＸ（商標）培地、およびＳｅｃＰｒｏ（商標）培地を包含するが、これに限定されない。
いくつかの態様において、改変細胞は、酵素または核酸の発現をもたらす条件下において培養される。かかる培養条件は、発現されようとする特定の産物と産物の所望の量とに依存し得る。
いくつかの態様において、改変細胞は３０℃から４０℃の温度で培養される。例えば、改変細胞は、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、または４０℃の温度で培養され得る。典型的には、改変細胞、例えば改変細菌細胞は、３７℃の温度で培養される。
いくつかの態様において、改変細胞は、１２時間から７２時間、またはより長時間培養される。例えば、改変細胞は、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、または７２時間培養され得る。典型的には、改変細菌細胞などの改変細胞は、１２から２４時間培養される。いくつかの態様において、改変細胞は、３７℃の温度で１２から２４時間培養される。
いくつかの態様において、改変細胞は（例えば、液体細胞培養培地中において）、６００ｎｍの波長で測定された場合に５から２００の光学密度（ＯＤ６００）まで培養される。いくつかの態様において、改変細胞は、５、１０、１５、２０、または２５のＯＤ６００まで培養される。
いくつかの態様において、改変細胞は、１×１０４～１×１０８生存可能細胞／ｍｌ細胞培養培地の密度で培養される。いくつかの態様において、改変細胞は、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０５、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、１×１０９、または１×１０１０生存可能細胞／ｍｌの密度まで培養される。いくつかの態様において、改変細胞は、１×１０８～１×１０１０生存可能細胞／ｍｌの密度まで培養される。いくつかの態様において、改変細胞は、２×１０５～３×１０７生存可能細胞／ｍｌの密度まで培養される。
いくつかの態様において、改変細胞はバイオリアクター内で培養される。バイオリアクターは単純に、細胞が培養される容器、例えば培養フラスコ、ディッシュ、またはバッグを言い、これらは単回使用（使い捨て）、オートクレーブ可能、または滅菌可能であり得る。バイオリアクターはガラスから作られ得、またはこれはポリマーに基づき得、またはこれは他の材料から作られ得る。
バイオリアクターの例は、限定なしに、撹拌槽（例えば完全混合）バイオリアクターおよび管型（例えば押し出し流れ）バイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、膜撹拌槽、スピンフィルター撹拌槽、バイブロミキサ－、流動床反応器、ならびに膜バイオリアクターを包含する。バイオリアクターを作動させるモ－ドは、バッチまたは連続プロセスであり得、培養されようとする改変細胞に依存するであろう。バイオリアクターは、フィ－ドおよび産物流が連続的にフィ－ドされてシステムから取り出されるときに、連続的である。バッチ式バイオリアクターは、連続的な再循環流れを有し得るが、栄養素の連続的なフィ－ドまたは産物収穫はない。断続的収穫およびフェドバッチ（fed-batch）（またはバッチフェド（batch fed））培養では、細胞は、組成がバッチ培地に類似である培地に、より低い生存可能細胞密度で接種される。細胞は、栄養素がやや枯渇し細胞が定常増殖段階に近づくまで、本質的に外的操作なしに指数増殖することを許容される。この時点において、断続的収穫バッチフェド（batch fed）プロセスでは、細胞および産物の部分が収穫され得、除去された培養培地が新しい培地によって補充される。このプロセスは数回繰り返され得る。組換え体タンパク質の生産のためには、フェドバッチプロセスが用いられ得る。細胞が指数増殖していくが栄養素が枯渇してくる一方で、濃縮されたフィ－ド培地（例えば、１０～１５倍濃縮された基礎培地）が連続的または断続的どちらかで追加されて、追加の栄養素を供給し、細胞濃度と変換段階の長さとのさらなる増大を許す。新しい培地が、培養培地（ブロス）の除去なしに細胞濃度に比例して追加され得る。培地の追加を収容するように、フェドバッチ培養はバイオリアクターの満容量よりも大幅に低い体積（例えば、最大体積のおよそ４０％から５０％）で開始される。
本開示のいくつかの方法は、糖の大スケ－ル生産を対象とする。大スケ－ル生産方法では、改変細胞は、５リットル（Ｌ）から５０Ｌの、またはより多くの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、１０Ｌより大きい（またはそれに等しい）体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、またはより多くの体積の液体培養培地中で増殖させられる。いくつかの態様において、改変細胞は、５Ｌから１０Ｌ、５Ｌから１５Ｌ、５Ｌから２０Ｌ、５Ｌから２５Ｌ、５Ｌから３０Ｌ、５Ｌから３５Ｌ、５Ｌから４０Ｌ、５Ｌから４５Ｌ、１０Ｌから１５Ｌ、１０Ｌから２０Ｌ、１０Ｌから２５Ｌ、２０Ｌから３０Ｌ、１０Ｌから３５Ｌ、１０Ｌから４０Ｌ、１０Ｌから４５Ｌ、１０Ｌから５０Ｌ、１５Ｌから２０Ｌ、１５Ｌから２５Ｌ、１５Ｌから３０Ｌ、１５Ｌから３５Ｌ、１５Ｌから４０Ｌ、１５Ｌから４５Ｌ、または１５から５０Ｌの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。
典型的には、改変細胞を培養することには、細胞を溶解することが後続する。「溶解する」は、細胞が例えばウイルス的、酵素的、機械的、化学的、熱的、または浸透圧的機序によって破片化されるプロセスを言う。「細胞ライセート」は、溶解された細胞（例えば、溶解された改変細胞）の内容物を含有する液を言い、例えばオルガネラ、膜脂質、タンパク質、核酸、および反転膜小胞を包含する。本開示の細胞ライセートは、本明細書において提供される改変細胞いずれかの集団を溶解することによって、生産され得る。「細胞ライセート」は、透過処理／穿孔処理（perforated）細胞を除外してもよい。
「溶解する」と言われる細胞溶解の方法は当分野において公知であり、それらのいずれかが本開示に従って用いられ得る。かかる細胞溶解方法は、限定なしに、ホモジナイゼ－ションなどの物理的／機械的溶解、ならびに化学的、熱的、および／または酵素的溶解を包含する。
細胞溶解は綿密にコントロールされた細胞内環境を撹乱し得、無制御な内在性プロテアーゼおよびホスファターゼによるタンパク質分解および修飾をもたらす。それゆえに、いくつかの態様においては、プロテアーゼ阻害剤および／またはホスファターゼ阻害剤が細胞ライセートまたは溶解前の細胞に追加され得、またはそれらの活性は、遺伝子不活性化またはプロテアーゼ標的化によって除去され得る。
いくつかの態様において、細胞ライセートは、少なくとも１つの栄養素と組み合わせられ得る。例えば、細胞ライセートはＮａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２と組み合わせられ得る。他の栄養素の例は、限定なしに、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、オロト酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化コバルト、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、三塩基性リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸アンモニウム、二塩基性リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および水酸化アンモニウムを包含する。
いくつかの態様において、細胞ライセートは、化学的、熱的、酵素的または機械的手段によってさらに修飾されて特定の成分が濃縮または精製または低減または排除された、破壊された（disrupted）細胞懸濁液からなり得る。例えば、上記のような機械的、熱的、化学的または酵素的手段による破壊の後、得られた材料を機械的分離、例えば膜濾過、遠心分離またはその他の方法にかけることができ、選択した酵素活性を部分的に高め、または望ましくない酵素活性またはライセート成分を除去することができる。さらなる例としては、塩または溶媒の、破壊された細胞懸濁液への添加、または破壊された細胞懸濁液のｐＨまたは温度の変更、その結果としての所望の活性の沈殿と、上記のような、その後の沈殿成分の機械的分離が挙げられ得る。逆に、塩もしくは溶媒の添加またはｐＨもしくは温度の変更は、それらの酵素の不活性化、または望ましくない１つもしくは複数の酵素活性の沈殿およびその後の機械的分離のいずれかを通して、望ましくない活性を排除するために利用できる。
細胞ライセートは、いくつかの態様において、少なくとも１つのコファクターと組み合わせてもよい。例えば、細胞ライセートは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、または酵素の活性のために必要とされる他の非タンパク質化学化合物（例えば、無機イオンおよび補酵素）と組み合わせてもよい。
いくつかの態様において、細胞ライセートは、多糖またはデンプンの糖への変換をもたらす条件下においてインキュベートされる。
単一の反応に用いられる細胞ライセートの体積は、変わり得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの体積は、１から１５０ｍ３である。例えば、細胞ライセートの体積は、１ｍ３、５ｍ３、１０ｍ３、１５ｍ３、２０ｍ３、２５ｍ３、３０ｍ３、３５ｍ３、４０ｍ３、４５ｍ３、５０ｍ３、５５ｍ３、６０ｍ３、６５ｍ３、７０ｍ３、７５ｍ３、８０ｍ３、８５ｍ３、９０ｍ３、９５ｍ３、１００ｍ３、１０５ｍ３、１１０ｍ３、１１５ｍ３、１２０ｍ３、１２５ｍ３、１３０ｍ３、１３５ｍ３、１４０ｍ３、１４５ｍ３、または１５０ｍ３であり得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの体積は、２５ｍ３から１５０ｍ３、５０ｍ３から１５０ｍ３、または１００ｍ３から１５０ｍ３である。
精製酵素
本発明のいくつかの態様において、酵素は、生産反応に添加する前に精製することができる。酵素精製は、材料の複雑な混合物からの、特定の酵素もしくは酵素活性または酵素群もしくは酵素活性の、任意の濃縮または抽出を意味すると理解されるべきであり、例としては、限定されないが、破壊細胞懸濁液または培養増殖培地が挙げられる。したがって精製酵素またはタンパク質は、複合マトリックスから分離または濃縮された酵素またはタンパク質であると理解されるべきであり、それにより他のマトリックス成分と比較してその相対濃度は増加している。酵素を精製するための方法としては、限定はされないが、機械的、クロマトグラフィ－的、化学的、ｐＨまたは温度手段が挙げられる。例えば、破壊された細胞懸濁液に塩を添加して標的酵素またはタンパク質を沈殿させ、続いて沈殿した酵素またはタンパク質を機械的に、例えば膜濾過または遠心分離により、分離する。さらなる例は、親和性に基づくクロマトグラフィ－法（例えば、ヘキサ－ヒスチジン－タグまたはストレプトアビジンに基づく精製）を介した、複合マトリックスからの酵素の分離を含み得る。
本発明のいくつかの態様において、酵素は、生産反応に添加する前に精製することができる。酵素精製は、材料の複雑な混合物からの、特定の酵素もしくは酵素活性または酵素群もしくは酵素活性の、任意の濃縮または抽出を意味すると理解されるべきであり、例としては、限定されないが、破壊細胞懸濁液または培養増殖培地が挙げられる。したがって精製酵素またはタンパク質は、複合マトリックスから分離または濃縮された酵素またはタンパク質であると理解されるべきであり、それにより他のマトリックス成分と比較してその相対濃度は増加している。酵素を精製するための方法としては、限定はされないが、機械的、クロマトグラフィ－的、化学的、ｐＨまたは温度手段が挙げられる。例えば、破壊された細胞懸濁液に塩を添加して標的酵素またはタンパク質を沈殿させ、続いて沈殿した酵素またはタンパク質を機械的に、例えば膜濾過または遠心分離により、分離する。さらなる例は、親和性に基づくクロマトグラフィ－法（例えば、ヘキサ－ヒスチジン－タグまたはストレプトアビジンに基づく精製）を介した、複合マトリックスからの酵素の分離を含み得る。
酵素特異性
酵素特異性は、酵素に固有の特性であって、該酵素が１つの基質に対して、他の基質と比較して改善された反応動態学、熱力学または速度を示すものと理解されるべきである。高い特異性を有する酵素は、ミカエリス定数（Ｋｍ）またはｋｃａｔ／Ｋｍに対して、他の基質と比較して高い触媒速度比（タ－ンオ－バ－数またはｋｃａｔとして定義される）を有することにより、最もよく例示される。高い基質特異性を有する酵素を有することは、これが反応速度を改善し、および非標的産物の生産を減少させることによって収率を改善するために、有利である。例えば、本明細書に記載のアルロ－ス生産のための経路は、化学構造が類似しているいくつかの中間体、すなわち、グルコ－ス１－リン酸、グルコ－ス６－リン酸、フルクト－ス６－リン酸およびアルロ－ス６－リン酸を有する。この方法における究極の酵素的ステップは、アルロ－ス６－リン酸の、アルロ－ス６－リン酸ホスファターゼを介した産物アルロ－スへの脱リン酸化である。アルロ－ス６－リン酸に対して非常に高い特異性を有し、他の経路中間体、すなわちグルコ－ス１－リン酸、グルコ－ス６－リン酸およびフルクト－ス６－リン酸に対して比較的低い特異性を有する酵素を利用することが有利である。これらの中間体の触媒的脱リン酸化は、グルコ－スまたはフルクト－スのいずれかの生産をもたらし、したがって収率を低下させ、および産物の複雑さを増大させるであろう。
酵素特異性は、酵素に固有の特性であって、該酵素が１つの基質に対して、他の基質と比較して改善された反応動態学、熱力学または速度を示すものと理解されるべきである。高い特異性を有する酵素は、ミカエリス定数（Ｋｍ）またはｋｃａｔ／Ｋｍに対して、他の基質と比較して高い触媒速度比（タ－ンオ－バ－数またはｋｃａｔとして定義される）を有することにより、最もよく例示される。高い基質特異性を有する酵素を有することは、これが反応速度を改善し、および非標的産物の生産を減少させることによって収率を改善するために、有利である。例えば、本明細書に記載のアルロ－ス生産のための経路は、化学構造が類似しているいくつかの中間体、すなわち、グルコ－ス１－リン酸、グルコ－ス６－リン酸、フルクト－ス６－リン酸およびアルロ－ス６－リン酸を有する。この方法における究極の酵素的ステップは、アルロ－ス６－リン酸の、アルロ－ス６－リン酸ホスファターゼを介した産物アルロ－スへの脱リン酸化である。アルロ－ス６－リン酸に対して非常に高い特異性を有し、他の経路中間体、すなわちグルコ－ス１－リン酸、グルコ－ス６－リン酸およびフルクト－ス６－リン酸に対して比較的低い特異性を有する酵素を利用することが有利である。これらの中間体の触媒的脱リン酸化は、グルコ－スまたはフルクト－スのいずれかの生産をもたらし、したがって収率を低下させ、および産物の複雑さを増大させるであろう。
キット
本明細書において記載されるキットは、本明細書において記載される方法を行うための成分および任意に使用の説明を収容する１つ以上の容器を含んでもよい。本明細書において記載されるキットのうちのいずれかは、方法を行うために必要とされる構成成分をさらに含んでもよい。キットの各々の構成成分は、適用可能である場合、液体の形態において（例えば溶液中で）、または固体の形態において（例えば乾燥粉末）提供してもよい。ある場合において、構成成分のうちのいくつかは、例えば、キットとともに提供されてもされなくともよい好適な溶媒または他の種（例えば水またはバッファー）の添加により、再構成可能であるか、別段に処理可能（例えば活性形態へと）であってもよい。
本明細書において記載されるキットは、本明細書において記載される方法を行うための成分および任意に使用の説明を収容する１つ以上の容器を含んでもよい。本明細書において記載されるキットのうちのいずれかは、方法を行うために必要とされる構成成分をさらに含んでもよい。キットの各々の構成成分は、適用可能である場合、液体の形態において（例えば溶液中で）、または固体の形態において（例えば乾燥粉末）提供してもよい。ある場合において、構成成分のうちのいくつかは、例えば、キットとともに提供されてもされなくともよい好適な溶媒または他の種（例えば水またはバッファー）の添加により、再構成可能であるか、別段に処理可能（例えば活性形態へと）であってもよい。
いくつかの態様において、キットは、任意に、提供された構成成分の使用のための説明および／または販売促進物（promotion）を含んでもよい。本明細書において用いられる場合、「説明」は、説明および／または販売促進物の構成成分を定義し得、典型的には、本開示の包装の上またはこれに関連づけられた書面による説明を含み得る。説明はまた、ユーザーが、当該説明はキットと関連づけられるべきであることを明らかに認識するような任意の様式において提供される、任意の口頭または電子的説明、例えば視聴覚（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはウェブベースの伝達などを含んでもよい。本明細書において用いられる場合、「販売促進される」とは、事業を行う全ての方法を含み、これは、教育、科学研究、学術研究、ならびに本開示に関連付けられる任意の形態の書面、口頭および電子的伝達を含む任意の宣伝または他の販売促進活動の方法を含む。さらに、キットは、本明細書において記載されるように、特定の適用に依存して、他の構成成分を含んでもよい。
キットは、本明細書において記載される構成成分のうちのいずれか１つ以上を、１つ以上の容器中に含んでもよい。キットは、ブリスターパウチ、シュリンクラップされたパウチ、真空密封可能なパウチ、密封可能な熱形成トレー、または類似のパウチもしくはトレーの形態などの、多様な形態を有していてよく、パウチ内に緩く包装されたアクセサリー、１つ以上の管、容器、箱またはバッグを伴っていてもよい。キットはまた、特定の適用に依存して、他の構成成分、例えば容器、細胞培地、塩、バッファー、試薬などを含んでもよい。
さらなる態様
表２または表３において表される酵素の任意の組み合わせを、表１における経路に適用してよいことが、理解されるべきである。本明細書における方法により記載されるようなアルロースの合成における使用のための例示的な非限定的な酵素の組み合わせを以下に提供し、これは、任意により少ない酵素を含み（例えば、Ａ１、Ｉ１、Ｍ１、Ｅ１、Ｐ１は、当該組み合わせ中の１つまたは１つより多くの酵素を含まなくともよい）、任意に、α－グルカンホスホリラーゼを、本明細書において記載される任意のセロデキストリンホスホリラーゼに置き換えるように改変されてもよく、または、任意に、表３において詳述されるような脱分枝酵素を含んでもよいことが理解されるべきである：
(A1,I1,M1,E1,P1);(A1,I1,M1,E1,P2);(A1,I1,M1,E1,P3);(A1,I1,M1,E1,P4);(A1,I1,M1,E1,P5);(A1,I1,M1,E1,P6);(A1,I1,M1,E1,P7);(A1,I1,M1,E1,P8);(A1,I1,M1,E1,P9);(A1,I1,M1,E1,P10);(A1,I1,M1,E1,P11);(A1,I1,M1,E1,P12);(A1,I1,M1,E1,P13);(A1,I1,M1,E1,P14);(A1,I1,M1,E1,P15);(A1,I1,M1,E1,P16);(A1,I1,M1,E1,P17);(A1,I1,M1,E1,P18);(A1,I1,M1,E1,P19);(A1,I1,M1,E1,P20);(A1,I1,M1,E2,P1);(A1,I1,M1,E2,P2);(A1,I1,M1,E2,P3);(A1,I1,M1,E2,P4);(A1,I1,M1,E2,P5);(A1,I1,M1,E2,P6);(A1,I1,M1,E2,P7);(A1,I1,M1,E2,P8);(A1,I1,M1,E2,P9);(A1,I1,M1,E2,P10);(A1,I1,M1,E2,P11);(A1,I1,M1,E2,P12);(A1,I1,M1,E2,P13);(A1,I1,M1,E2,P14);(A1,I1,M1,E2,P15);(A1,I1,M1,E2,P16);(A1,I1,M1,E2,P17);(A1,I1,M1,E2,P18);(A1,I1,M1,E2,P19);(A1,I1,M1,E2,P20);(A1,I1,M1,E3,P1);(A1,I1,M1,E3,P2);(A1,I1,M1,E3,P3);(A1,I1,M1,E3,P4);(A1,I1,M1,E3,P5);(A1,I1,M1,E3,P6);(A1,I1,M1,E3,P7);(A1,I1,M1,E3,P8);(A1,I1,M1,E3,P9);(A1,I1,M1,E3,P10);(A1,I1,M1,E3,P11);(A1,I1,M1,E3,P12);(A1,I1,M1,E3,P13);(A1,I1,M1,E3,P14);(A1,I1,M1,E3,P15);(A1,I1,M1,E3,P16);(A1,I1,M1,E3,P17);(A1,I1,M1,E3,P18);(A1,I1,M1,E3,P19);(A1,I1,M1,E3,P20);(A1,I1,M1,E4,P1);(A1,I1,M1,E4,P2);(A1,I1,M1,E4,P3);(A1,I1,M1,E4,P4);(A1,I1,M1,E4,P5);(A1,I1,M1,E4,P6);(A1,I1,M1,E4,P7);(A1,I1,M1,E4,P8);(A1,I1,M1,E4,P9);(A1,I1,M1,E4,P10);(A1,I1,M1,E4,P11);(A1,I1,M1,E4,P12);(A1,I1,M1,E4,P13);(A1,I1,M1,E4,P14);(A1,I1,M1,E4,P15);(A1,I1,M1,E4,P16);(A1,I1,M1,E4,P17);(A1,I1,M1,E4,P18);(A1,I1,M1,E4,P19);(A1,I1,M1,E4,P20);(A1,I1,M1,E5,P1);(A1,I1,M1,E5,P2);(A1,I1,M1,E5,P3);(A1,I1,M1,E5,P4);(A1,I1,M1,E5,P5);(A1,I1,M1,E5,P6);(A1,I1,M1,E5,P7);(A1,I1,M1,E5,P8);(A1,I1,M1,E5,P9);(A1,I1,M1,E5,P10);(A1,I1,M1,E5,P11);(A1,I1,M1,E5,P12);(A1,I1,M1,E5,P13);(A1,I1,M1,E5,P14);(A1,I1,M1,E5,P15);(A1,I1,M1,E5,P16);(A1,I1,M1,E5,P17);(A1,I1,M1,E5,P18);(A1,I1,M1,E5,P19);(A1,I1,M1,E5,P20);(A1,I1,M1,E6,P1);(A1,I1,M1,E6,P2);(A1,I1,M1,E6,P3);(A1,I1,M1,E6,P4);(A1,I1,M1,E6,P5);(A1,I1,M1,E6,P6);(A1,I1,M1,E6,P7);(A1,I1,M1,E6,P8);(A1,I1,M1,E6,P9);(A1,I1,M1,E6,P10);(A1,I1,M1,E6,P11);(A1,I1,M1,E6,P12);(A1,I1,M1,E6,P13);(A1,I1,M1,E6,P14);(A1,I1,M1,E6,P15);(A1,I1,M1,E6,P16);(A1,I1,M1,E6,P17);(A1,I1,M1,E6,P18);(A1,I1,M1,E6,P19);(A1,I1,M1,E6,P20);(A1,I1,M1,E7,P1);(A1,I1,M1,E7,P2);(A1,I1,M1,E7,P3);(A1,I1,M1,E7,P4);(A1,I1,M1,E7,P5);(A1,I1,M1,E7,P6);(A1,I1,M1,E7,P7);(A1,I1,M1,E7,P8);(A1,I1,M1,E7,P9);(A1,I1,M1,E7,P10);(A1,I1,M1,E7,P11);(A1,I1,M1,E7,P12);(A1,I1,M1,E7,P13);(A1,I1,M1,E7,P14);(A1,I1,M1,E7,P15);(A1,I1,M1,E7,P16);(A1,I1,M1,E7,P17);(A1,I1,M1,E7,P18);(A1,I1,M1,E7,P19);(A1,I1,M1,E7,P20);(A1,I1,M1,E8,P1);(A1,I1,M1,E8,P2);(A1,I1,M1,E8,P3);(A1,I1,M1,E8,P4);(A1,I1,M1,E8,P5);(A1,I1,M1,E8,P6);(A1,I1,M1,E8,P7);(A1,I1,M1,E8,P8);(A1,I1,M1,E8,P9);(A1,I1,M1,E8,P10);(A1,I1,M1,E8,P11);(A1,I1,M1,E8,P12);(A1,I1,M1,E8,P13);(A1,I1,M1,E8,P14);(A1,I1,M1,E8,P15);(A1,I1,M1,E8,P16);(A1,I1,M1,E8,P17);(A1,I1,M1,E8,P18);(A1,I1,M1,E8,P19);(A1,I1,M1,E8,P20);(A1,I1,M1,E9,P1);(A1,I1,M1,E9,P2);(A1,I1,M1,E9,P3);(A1,I1,M1,E9,P4);(A1,I1,M1,E9,P5);(A1,I1,M1,E9,P6);(A1,I1,M1,E9,P7);(A1,I1,M1,E9,P8);(A1,I1,M1,E9,P9);(A1,I1,M1,E9,P10);(A1,I1,M1,E9,P11);(A1,I1,M1,E9,P12);(A1,I1,M1,E9,P13);(A1,I1,M1,E9,P14);(A1,I1,M1,E9,P15);(A1,I1,M1,E9,P16);(A1,I1,M1,E9,P17);(A1,I1,M1,E9,P18);(A1,I1,M1,E9,P19);(A1,I1,M1,E9,P20);(A1,I1,M2,E1,P1);(A1,I1,M2,E1,P2);(A1,I1,M2,E1,P3);(A1,I1,M2,E1,P4);(A1,I1,M2,E1,P5);(A1,I1,M2,E1,P6);(A1,I1,M2,E1,P7);(A1,I1,M2,E1,P8);(A1,I1,M2,E1,P9);(A1,I1,M2,E1,P10);(A1,I1,M2,E1,P11);(A1,I1,M2,E1,P12);(A1,I1,M2,E1,P13);(A1,I1,M2,E1,P14);(A1,I1,M2,E1,P15);(A1,I1,M2,E1,P16);(A1,I1,M2,E1,P17);(A1,I1,M2,E1,P18);(A1,I1,M2,E1,P19);(A1,I1,M2,E1,P20);(A1,I1,M2,E2,P1);(A1,I1,M2,E2,P2);(A1,I1,M2,E2,P3);(A1,I1,M2,E2,P4);(A1,I1,M2,E2,P5);(A1,I1,M2,E2,P6);(A1,I1,M2,E2,P7);(A1,I1,M2,E2,P8);(A1,I1,M2,E2,P9);(A1,I1,M2,E2,P10);(A1,I1,M2,E2,P11);(A1,I1,M2,E2,P12);(A1,I1,M2,E2,P13);(A1,I1,M2,E2,P14);(A1,I1,M2,E2,P15);(A1,I1,M2,E2,P16);(A1,I1,M2,E2,P17);(A1,I1,M2,E2,P18);(A1,I1,M2,E2,P19);(A1,I1,M2,E2,P20);(A1,I1,M2,E3,P1);(A1,I1,M2,E3,P2);(A1,I1,M2,E3,P3);(A1,I1,M2,E3,P4);(A1,I1,M2,E3,P5);(A1,I1,M2,E3,P6);(A1,I1,M2,E3,P7);(A1,I1,M2,E3,P8);(A1,I1,M2,E3,P9);(A1,I1,M2,E3,P10);(A1,I1,M2,E3,P11);(A1,I1,M2,E3,P12);(A1,I1,M2,E3,P13);(A1,I1,M2,E3,P14);(A1,I1,M2,E3,P15);(A1,I1,M2,E3,P16);(A1,I1,M2,E3,P17);(A1,I1,M2,E3,P18);(A1,I1,M2,E3,P19);(A1,I1,M2,E3,P20);(A1,I1,M2,E4,P1);(A1,I1,M2,E4,P2);(A1,I1,M2,E4,P3);(A1,I1,M2,E4,P4);(A1,I1,M2,E4,P5);(A1,I1,M2,E4,P6);(A1,I1,M2,E4,P7);(A1,I1,M2,E4,P8);(A1,I1,M2,E4,P9);(A1,I1,M2,E4,P10);(A1,I1,M2,E4,P11);(A1,I1,M2,E4,P12);(A1,I1,M2,E4,P13);(A1,I1,M2,E4,P14);(A1,I1,M2,E4,P15);(A1,I1,M2,E4,P16);(A1,I1,M2,E4,P17);(A1,I1,M2,E4,P18);(A1,I1,M2,E4,P19);(A1,I1,M2,E4,P20);(A1,I1,M2,E5,P1);(A1,I1,M2,E5,P2);(A1,I1,M2,E5,P3);(A1,I1,M2,E5,P4);(A1,I1,M2,E5,P5);(A1,I1,M2,E5,P6);(A1,I1,M2,E5,P7);(A1,I1,M2,E5,P8);(A1,I1,M2,E5,P9);(A1,I1,M2,E5,P10);(A1,I1,M2,E5,P11);(A1,I1,M2,E5,P12);(A1,I1,M2,E5,P13);(A1,I1,M2,E5,P14);(A1,I1,M2,E5,P15);(A1,I1,M2,E5,P16);(A1,I1,M2,E5,P17);(A1,I1,M2,E5,P18);(A1,I1,M2,E5,P19);(A1,I1,M2,E5,P20);(A1,I1,M2,E6,P1);(A1,I1,M2,E6,P2);(A1,I1,M2,E6,P3);(A1,I1,M2,E6,P4);(A1,I1,M2,E6,P5);(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2,I6,M6,E3,P5);(A2,I6,M6,E3,P6);(A2,I6,M6,E3,P7);(A2,I6,M6,E3,P8);(A2,I6,M6,E3,P9);(A2,I6,M6,E3,P10);(A2,I6,M6,E3,P11);(A2,I6,M6,E3,P12);(A2,I6,M6,E3,P13);(A2,I6,M6,E3,P14);(A2,I6,M6,E3,P15);(A2,I6,M6,E3,P16);(A2,I6,M6,E3,P17);(A2,I6,M6,E3,P
18);(A2,I6,M6,E3,P19);(A2,I6,M6,E3,P20);(A2,I6,M6,E4,P1);(A2,I6,M6,E4,P2);(A2,I6,M6,E4,P3);(A2,I6,M6,E4,P4);(A2,I6,M6,E4,P5);(A2,I6,M6,E4,P6);(A2,I6,M6,E4,P7);(A2,I6,M6,E4,P8);(A2,I6,M6,E4,P9);(A2,I6,M6,E4,P10);(A2,I6,M6,E4,P11);(A2,I6,M6,E4,P12);(A2,I6,M6,E4,P13);(A2,I6,M6,E4,P14);(A2,I6,M6,E4,P15);(A2,I6,M6,E4,P16);(A2,I6,M6,E4,P17);(A2,I6,M6,E4,P18);(A2,I6,M6,E4,P19);(A2,I6,M6,E4,P20);(A2,I6,M6,E5,P1);(A2,I6,M6,E5,P2);(A2,I6,M6,E5,P3);(A2,I6,M6,E5,P4);(A2,I6,M6,E5,P5);(A2,I6,M6,E5,P6);(A2,I6,M6,E5,P7);(A2,I6,M6,E5,P8);(A2,I6,M6,E5,P9);(A2,I6,M6,E5,P10);(A2,I6,M6,E5,P11);(A2,I6,M6,E5,P12);(A2,I6,M6,E5,P13);(A2,I6,M6,E5,P14);(A2,I6,M6,E5,P15);(A2,I6,M6,E5,P16);(A2,I6,M6,E5,P17);(A2,I6,M6,E5,P18);(A2,I6,M6,E5,P19);(A2,I6,M6,E5,P20);(A2,I6,M6,E6,P1);(A2,I6,M6,E6,P2);(A2,I6,M6,E6,P3);(A2,I6,M6,E6,P4);(A2,I6,M6,E6,P5);(A2,I6,M6,E6,P6);(A2,I6,M6,E6,P7);(A2,I6,M6,E6,P8);(A2,I6,M6,E6,P9);(A2,I6,M6,E6,P10);(A2,I6,M6,E6,P11);(A2,I6,M6,E6,P12);(A2,I6,M6,E6,P13);(A2,I6,M6,E6,P14);(A2,I6,M6,E6,P15);(A2,I6,M6,E6,P16);(A2,I6,M6,E6,P17);(A2,I6,M6,E6,P18);(A2,I6,M6,E6,P19);(A2,I6,M6,E6,P20);(A2,I6,M6,E7,P1);(A2,I6,M6,E7,P2);(A2,I6,M6,E7,P3);(A2,I6,M6,E7,P4);(A2,I6,M6,E7,P5);(A2,I6,M6,E7,P6);(A2,I6,M6,E7,P7);(A2,I6,M6,E7,P8);(A2,I6,M6,E7,P9);(A2,I6,M6,E7,P10);(A2,I6,M6,E7,P11);(A2,I6,M6,E7,P12);(A2,I6,M6,E7,P13);(A2,I6,M6,E7,P14);(A2,I6,M6,E7,P15);(A2,I6,M6,E7,P16);(A2,I6,M6,E7,P17);(A2,I6,M6,E7,P18);(A2,I6,M6,E7,P19);(A2,I6,M6,E7,P20);(A2,I6,M6,E8,P1);(A2,I6,M6,E8,P2);(A2,I6,M6,E8,P3);(A2,I6,M6,E8,P4);(A2,I6,M6,E8,P5);(A2,I6,M6,E8,P6);(A2,I6,M6,E8,P7);(A2,I6,M6,E8,P8);(A2,I6,M6,E8,P9);(A2,I6,M6,E8,P10);(A2,I6,M6,E8,P11);(A2,I6,M6,E8,P12);(A2,I6,M6,E8,P13);(A2,I6,M6,E8,P14);(A2,I6,M6,E8,P15);(A2,I6,M6,E8,P16);(A2,I6,M6,E8,P17);(A2,I6,M6,E8,P18);(A2,I6,M6,E8,P19);(A2,I6,M6,E8,P20);(A2,I6,M6,E9,P1);(A2,I6,M6,E9,P2);(A2,I6,M6,E9,P3);(A2,I6,M6,E9,P4);(A2,I6,M6,E9,P5);(A2,I6,M6,E9,P6);(A2,I6,M6,E9,P7);(A2,I6,M6,E9,P8);(A2,I6,M6,E9,P9);(A2,I6,M6,E9,P10);(A2,I6,M6,E9,P11);(A2,I6,M6,E9,P12);(A2,I6,M6,E9,P13);(A2,I6,M6,E9,P14);(A2,I6,M6,E9,P15);(A2,I6,M6,E9,P16);(A2,I6,M6,E9,P17);(A2,I6,M6,E9,P18);(A2,I6,M6,E9,P19);(A2,I6,M6,E9,P20)
表２または表３において表される酵素の任意の組み合わせを、表１における経路に適用してよいことが、理解されるべきである。本明細書における方法により記載されるようなアルロースの合成における使用のための例示的な非限定的な酵素の組み合わせを以下に提供し、これは、任意により少ない酵素を含み（例えば、Ａ１、Ｉ１、Ｍ１、Ｅ１、Ｐ１は、当該組み合わせ中の１つまたは１つより多くの酵素を含まなくともよい）、任意に、α－グルカンホスホリラーゼを、本明細書において記載される任意のセロデキストリンホスホリラーゼに置き換えるように改変されてもよく、または、任意に、表３において詳述されるような脱分枝酵素を含んでもよいことが理解されるべきである：
(A1,I1,M1,E1,P1);(A1,I1,M1,E1,P2);(A1,I1,M1,E1,P3);(A1,I1,M1,E1,P4);(A1,I1,M1,E1,P5);(A1,I1,M1,E1,P6);(A1,I1,M1,E1,P7);(A1,I1,M1,E1,P8);(A1,I1,M1,E1,P9);(A1,I1,M1,E1,P10);(A1,I1,M1,E1,P11);(A1,I1,M1,E1,P12);(A1,I1,M1,E1,P13);(A1,I1,M1,E1,P14);(A1,I1,M1,E1,P15);(A1,I1,M1,E1,P16);(A1,I1,M1,E1,P17);(A1,I1,M1,E1,P18);(A1,I1,M1,E1,P19);(A1,I1,M1,E1,P20);(A1,I1,M1,E2,P1);(A1,I1,M1,E2,P2);(A1,I1,M1,E2,P3);(A1,I1,M1,E2,P4);(A1,I1,M1,E2,P5);(A1,I1,M1,E2,P6);(A1,I1,M1,E2,P7);(A1,I1,M1,E2,P8);(A1,I1,M1,E2,P9);(A1,I1,M1,E2,P10);(A1,I1,M1,E2,P11);(A1,I1,M1,E2,P12);(A1,I1,M1,E2,P13);(A1,I1,M1,E2,P14);(A1,I1,M1,E2,P15);(A1,I1,M1,E2,P16);(A1,I1,M1,E2,P17);(A1,I1,M1,E2,P18);(A1,I1,M1,E2,P19);(A1,I1,M1,E2,P20);(A1,I1,M1,E3,P1);(A1,I1,M1,E3,P2);(A1,I1,M1,E3,P3);(A1,I1,M1,E3,P4);(A1,I1,M1,E3,P5);(A1,I1,M1,E3,P6);(A1,I1,M1,E3,P7);(A1,I1,M1,E3,P8);(A1,I1,M1,E3,P9);(A1,I1,M1,E3,P10);(A1,I1,M1,E3,P11);(A1,I1,M1,E3,P12);(A1,I1,M1,E3,P13);(A1,I1,M1,E3,P14);(A1,I1,M1,E3,P15);(A1,I1,M1,E3,P16);(A1,I1,M1,E3,P17);(A1,I1,M1,E3,P18);(A1,I1,M1,E3,P19);(A1,I1,M1,E3,P20);(A1,I1,M1,E4,P1);(A1,I1,M1,E4,P2);(A1,I1,M1,E4,P3);(A1,I1,M1,E4,P4);(A1,I1,M1,E4,P5);(A1,I1,M1,E4,P6);(A1,I1,M1,E4,P7);(A1,I1,M1,E4,P8);(A1,I1,M1,E4,P9);(A1,I1,M1,E4,P10);(A1,I1,M1,E4,P11);(A1,I1,M1,E4,P12);(A1,I1,M1,E4,P13);(A1,I1,M1,E4,P14);(A1,I1,M1,E4,P15);(A1,I1,M1,E4,P16);(A1,I1,M1,E4,P17);(A1,I1,M1,E4,P18);(A1,I1,M1,E4,P19);(A1,I1,M1,E4,P20);(A1,I1,M1,E5,P1);(A1,I1,M1,E5,P2);(A1,I1,M1,E5,P3);(A1,I1,M1,E5,P4);(A1,I1,M1,E5,P5);(A1,I1,M1,E5,P6);(A1,I1,M1,E5,P7);(A1,I1,M1,E5,P8);(A1,I1,M1,E5,P9);(A1,I1,M1,E5,P10);(A1,I1,M1,E5,P11);(A1,I1,M1,E5,P12);(A1,I1,M1,E5,P13);(A1,I1,M1,E5,P14);(A1,I1,M1,E5,P15);(A1,I1,M1,E5,P16);(A1,I1,M1,E5,P17);(A1,I1,M1,E5,P18);(A1,I1,M1,E5,P19);(A1,I1,M1,E5,P20);(A1,I1,M1,E6,P1);(A1,I1,M1,E6,P2);(A1,I1,M1,E6,P3);(A1,I1,M1,E6,P4);(A1,I1,M1,E6,P5);(A1,I1,M1,E6,P6);(A1,I1,M1,E6,P7);(A1,I1,M1,E6,P8);(A1,I1,M1,E6,P9);(A1,I1,M1,E6,P10);(A1,I1,M1,E6,P11);(A1,I1,M1,E6,P12);(A1,I1,M1,E6,P13);(A1,I1,M1,E6,P14);(A1,I1,M1,E6,P15);(A1,I1,M1,E6,P16);(A1,I1,M1,E6,P17);(A1,I1,M1,E6,P18);(A1,I1,M1,E6,P19);(A1,I1,M1,E6,P20);(A1,I1,M1,E7,P1);(A1,I1,M1,E7,P2);(A1,I1,M1,E7,P3);(A1,I1,M1,E7,P4);(A1,I1,M1,E7,P5);(A1,I1,M1,E7,P6);(A1,I1,M1,E7,P7);(A1,I1,M1,E7,P8);(A1,I1,M1,E7,P9);(A1,I1,M1,E7,P10);(A1,I1,M1,E7,P11);(A1,I1,M1,E7,P12);(A1,I1,M1,E7,P13);(A1,I1,M1,E7,P14);(A1,I1,M1,E7,P15);(A1,I1,M1,E7,P16);(A1,I1,M1,E7,P17);(A1,I1,M1,E7,P18);(A1,I1,M1,E7,P19);(A1,I1,M1,E7,P20);(A1,I1,M1,E8,P1);(A1,I1,M1,E8,P2);(A1,I1,M1,E8,P3);(A1,I1,M1,E8,P4);(A1,I1,M1,E8,P5);(A1,I1,M1,E8,P6);(A1,I1,M1,E8,P7);(A1,I1,M1,E8,P8);(A1,I1,M1,E8,P9);(A1,I1,M1,E8,P10);(A1,I1,M1,E8,P11);(A1,I1,M1,E8,P12);(A1,I1,M1,E8,P13);(A1,I1,M1,E8,P14);(A1,I1,M1,E8,P15);(A1,I1,M1,E8,P16);(A1,I1,M1,E8,P17);(A1,I1,M1,E8,P18);(A1,I1,M1,E8,P19);(A1,I1,M1,E8,P20);(A1,I1,M1,E9,P1);(A1,I1,M1,E9,P2);(A1,I1,M1,E9,P3);(A1,I1,M1,E9,P4);(A1,I1,M1,E9,P5);(A1,I1,M1,E9,P6);(A1,I1,M1,E9,P7);(A1,I1,M1,E9,P8);(A1,I1,M1,E9,P9);(A1,I1,M1,E9,P10);(A1,I1,M1,E9,P11);(A1,I1,M1,E9,P12);(A1,I1,M1,E9,P13);(A1,I1,M1,E9,P14);(A1,I1,M1,E9,P15);(A1,I1,M1,E9,P16);(A1,I1,M1,E9,P17);(A1,I1,M1,E9,P18);(A1,I1,M1,E9,P19);(A1,I1,M1,E9,P20);(A1,I1,M2,E1,P1);(A1,I1,M2,E1,P2);(A1,I1,M2,E1,P3);(A1,I1,M2,E1,P4);(A1,I1,M2,E1,P5);(A1,I1,M2,E1,P6);(A1,I1,M2,E1,P7);(A1,I1,M2,E1,P8);(A1,I1,M2,E1,P9);(A1,I1,M2,E1,P10);(A1,I1,M2,E1,P11);(A1,I1,M2,E1,P12);(A1,I1,M2,E1,P13);(A1,I1,M2,E1,P14);(A1,I1,M2,E1,P15);(A1,I1,M2,E1,P16);(A1,I1,M2,E1,P17);(A1,I1,M2,E1,P18);(A1,I1,M2,E1,P19);(A1,I1,M2,E1,P20);(A1,I1,M2,E2,P1);(A1,I1,M2,E2,P2);(A1,I1,M2,E2,P3);(A1,I1,M2,E2,P4);(A1,I1,M2,E2,P5);(A1,I1,M2,E2,P6);(A1,I1,M2,E2,P7);(A1,I1,M2,E2,P8);(A1,I1,M2,E2,P9);(A1,I1,M2,E2,P10);(A1,I1,M2,E2,P11);(A1,I1,M2,E2,P12);(A1,I1,M2,E2,P13);(A1,I1,M2,E2,P14);(A1,I1,M2,E2,P15);(A1,I1,M2,E2,P16);(A1,I1,M2,E2,P17);(A1,I1,M2,E2,P18);(A1,I1,M2,E2,P19);(A1,I1,M2,E2,P20);(A1,I1,M2,E3,P1);(A1,I1,M2,E3,P2);(A1,I1,M2,E3,P3);(A1,I1,M2,E3,P4);(A1,I1,M2,E3,P5);(A1,I1,M2,E3,P6);(A1,I1,M2,E3,P7);(A1,I1,M2,E3,P8);(A1,I1,M2,E3,P9);(A1,I1,M2,E3,P10);(A1,I1,M2,E3,P11);(A1,I1,M2,E3,P12);(A1,I1,M2,E3,P13);(A1,I1,M2,E3,P14);(A1,I1,M2,E3,P15);(A1,I1,M2,E3,P16);(A1,I1,M2,E3,P17);(A1,I1,M2,E3,P18);(A1,I1,M2,E3,P19);(A1,I1,M2,E3,P20);(A1,I1,M2,E4,P1);(A1,I1,M2,E4,P2);(A1,I1,M2,E4,P3);(A1,I1,M2,E4,P4);(A1,I1,M2,E4,P5);(A1,I1,M2,E4,P6);(A1,I1,M2,E4,P7);(A1,I1,M2,E4,P8);(A1,I1,M2,E4,P9);(A1,I1,M2,E4,P10);(A1,I1,M2,E4,P11);(A1,I1,M2,E4,P12);(A1,I1,M2,E4,P13);(A1,I1,M2,E4,P14);(A1,I1,M2,E4,P15);(A1,I1,M2,E4,P16);(A1,I1,M2,E4,P17);(A1,I1,M2,E4,P18);(A1,I1,M2,E4,P19);(A1,I1,M2,E4,P20);(A1,I1,M2,E5,P1);(A1,I1,M2,E5,P2);(A1,I1,M2,E5,P3);(A1,I1,M2,E5,P4);(A1,I1,M2,E5,P5);(A1,I1,M2,E5,P6);(A1,I1,M2,E5,P7);(A1,I1,M2,E5,P8);(A1,I1,M2,E5,P9);(A1,I1,M2,E5,P10);(A1,I1,M2,E5,P11);(A1,I1,M2,E5,P12);(A1,I1,M2,E5,P13);(A1,I1,M2,E5,P14);(A1,I1,M2,E5,P15);(A1,I1,M2,E5,P16);(A1,I1,M2,E5,P17);(A1,I1,M2,E5,P18);(A1,I1,M2,E5,P19);(A1,I1,M2,E5,P20);(A1,I1,M2,E6,P1);(A1,I1,M2,E6,P2);(A1,I1,M2,E6,P3);(A1,I1,M2,E6,P4);(A1,I1,M2,E6,P5);(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6,I3,M6,E3,P5);(A6,I3,M6,E3,P6);(A6,I3,M6,E3,P7);(A6,I3,M6,E3,P8);(A6,I3,M6,E3,P9);(A6,I3,M6,E3,P10);(A6,I3,M6,E3,P11);(A6,I3,M6,E3,P12);(A6,I3,M6,E3,P13);(A6,I3,M6,E3,P14);(A6,I3,M6,E3,P15);(A6,I3,M6,E3,P16);(A6,I3,M6,E3,P17);(A6,I3,M6,E3,P
18);(A6,I3,M6,E3,P19);(A6,I3,M6,E3,P20);(A6,I3,M6,E4,P1);(A6,I3,M6,E4,P2);(A6,I3,M6,E4,P3);(A6,I3,M6,E4,P4);(A6,I3,M6,E4,P5);(A6,I3,M6,E4,P6);(A6,I3,M6,E4,P7);(A6,I3,M6,E4,P8);(A6,I3,M6,E4,P9);(A6,I3,M6,E4,P10);(A6,I3,M6,E4,P11);(A6,I3,M6,E4,P12);(A6,I3,M6,E4,P13);(A6,I3,M6,E4,P14);(A6,I3,M6,E4,P15);(A6,I3,M6,E4,P16);(A6,I3,M6,E4,P17);(A6,I3,M6,E4,P18);(A6,I3,M6,E4,P19);(A6,I3,M6,E4,P20);(A6,I3,M6,E5,P1);(A6,I3,M6,E5,P2);(A6,I3,M6,E5,P3);(A6,I3,M6,E5,P4);(A6,I3,M6,E5,P5);(A6,I3,M6,E5,P6);(A6,I3,M6,E5,P7);(A6,I3,M6,E5,P8);(A6,I3,M6,E5,P9);(A6,I3,M6,E5,P10);(A6,I3,M6,E5,P11);(A6,I3,M6,E5,P12);(A6,I3,M6,E5,P13);(A6,I3,M6,E5,P14);(A6,I3,M6,E5,P15);(A6,I3,M6,E5,P16);(A6,I3,M6,E5,P17);(A6,I3,M6,E5,P18);(A6,I3,M6,E5,P19);(A6,I3,M6,E5,P20);(A6,I3,M6,E6,P1);(A6,I3,M6,E6,P2);(A6,I3,M6,E6,P3);(A6,I3,M6,E6,P4);(A6,I3,M6,E6,P5);(A6,I3,M6,E6,P6);(A6,I3,M6,E6,P7);(A6,I3,M6,E6,P8);(A6,I3,M6,E6,P9);(A6,I3,M6,E6,P10);(A6,I3,M6,E6,P11);(A6,I3,M6,E6,P12);(A6,I3,M6,E6,P13);(A6,I3,M6,E6,P14);(A6,I3,M6,E6,P15);(A6,I3,M6,E6,P16);(A6,I3,M6,E6,P17);(A6,I3,M6,E6,P18);(A6,I3,M6,E6,P19);(A6,I3,M6,E6,P20);(A6,I3,M6,E7,P1);(A6,I3,M6,E7,P2);(A6,I3,M6,E7,P3);(A6,I3,M6,E7,P4);(A6,I3,M6,E7,P5);(A6,I3,M6,E7,P6);(A6,I3,M6,E7,P7);(A6,I3,M6,E7,P8);(A6,I3,M6,E7,P9);(A6,I3,M6,E7,P10);(A6,I3,M6,E7,P11);(A6,I3,M6,E7,P12);(A6,I3,M6,E7,P13);(A6,I3,M6,E7,P14);(A6,I3,M6,E7,P15);(A6,I3,M6,E7,P16);(A6,I3,M6,E7,P17);(A6,I3,M6,E7,P18);(A6,I3,M6,E7,P19);(A6,I3,M6,E7,P20);(A6,I3,M6,E8,P1);(A6,I3,M6,E8,P2);(A6,I3,M6,E8,P3);(A6,I3,M6,E8,P4);(A6,I3,M6,E8,P5);(A6,I3,M6,E8,P6);(A6,I3,M6,E8,P7);(A6,I3,M6,E8,P8);(A6,I3,M6,E8,P9);(A6,I3,M6,E8,P10);(A6,I3,M6,E8,P11);(A6,I3,M6,E8,P12);(A6,I3,M6,E8,P13);(A6,I3,M6,E8,P14);(A6,I3,M6,E8,P15);(A6,I3,M6,E8,P16);(A6,I3,M6,E8,P17);(A6,I3,M6,E8,P18);(A6,I3,M6,E8,P19);(A6,I3,M6,E8,P20);(A6,I3,M6,E9,P1);(A6,I3,M6,E9,P2);(A6,I3,M6,E9,P3);(A6,I3,M6,E9,P4);(A6,I3,M6,E9,P5);(A6,I3,M6,E9,P6);(A6,I3,M6,E9,P7);(A6,I3,M6,E9,P8);(A6,I3,M6,E9,P9);(A6,I3,M6,E9,P10);(A6,I3,M6,E9,P11);(A6,I3,M6,E9,P12);(A6,I3,M6,E9,P13);(A6,I3,M6,E9,P14);(A6,I3,M6,E9,P15);(A6,I3,M6,E9,P16);(A6,I3,M6,E9,P17);(A6,I3,M6,E9,P18);(A6,I3,M6,E9,P19);(A6,I3,M6,E9,P20)
例
本明細書において記載される発明がより完全に理解され得るために、以下の例を記載する。本願において記載される合成例および生物学的例は、本明細書において提供される方法を説明するために提供され、決してそれらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書において記載される発明がより完全に理解され得るために、以下の例を記載する。本願において記載される合成例および生物学的例は、本明細書において提供される方法を説明するために提供され、決してそれらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
例１．デンプンのアルロースへの無細胞変換
この例は、デンプンのアルロースへの変換を記載する。デンプンのアルロースへの変換のための少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌または酵母細胞）を、液体培養中で高細胞密度まで増殖させる。この例において用いることができる異種性酵素の例として、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼの耐熱性バリアントが挙げられる。増殖期の終了時に異種性酵素の発現を誘導し、細胞バイオマスを、その後収集する。収集されたバイオマスを、次いで、機械的、化学的、または酵素的手段を介して溶解する。細胞ライセートを、次いで、ネイティブの酵素による活性を失活させるが異種性酵素を失活させない温度まで加熱する。デンプンフィードストック、無機リン酸および任意に他のさらなる栄養素を、熱失活したライセートに添加することにより、多糖のアルロースへの変換が可能となる（図１）。
この例は、デンプンのアルロースへの変換を記載する。デンプンのアルロースへの変換のための少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌または酵母細胞）を、液体培養中で高細胞密度まで増殖させる。この例において用いることができる異種性酵素の例として、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼの耐熱性バリアントが挙げられる。増殖期の終了時に異種性酵素の発現を誘導し、細胞バイオマスを、その後収集する。収集されたバイオマスを、次いで、機械的、化学的、または酵素的手段を介して溶解する。細胞ライセートを、次いで、ネイティブの酵素による活性を失活させるが異種性酵素を失活させない温度まで加熱する。デンプンフィードストック、無機リン酸および任意に他のさらなる栄養素を、熱失活したライセートに添加することにより、多糖のアルロースへの変換が可能となる（図１）。
例２．セルロースのアルロースへの無細胞変換
この例は、セルロース／セロデキストリンのアルロースへの変換を記載する。デンプンのアルロースへの変換のための少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌または酵母細胞）を、液体培養中で高細胞密度まで増殖させる。この例において用いることができる異種性酵素の例として、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼの耐熱性バリアントが挙げられる。増殖期の終了時に異種性酵素の発現を誘導し、その後、細胞バイオマスを収集する。収集されたバイオマスを、次いで、機械的、化学的、または酵素的手段を介して溶解する。細胞ライセートを、次いで、ネイティブの酵素による活性を失活させるが異種性酵素を失活させない温度まで加熱する。セルロース／セロデキストリンフィードストック、無機リン酸および任意に他のさらなる栄養素を、熱失活したライセートに添加することにより、セルロース／セロデキストリンのアルロースの変換が可能となる（図２）。
この例は、セルロース／セロデキストリンのアルロースへの変換を記載する。デンプンのアルロースへの変換のための少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように改変された細胞（例えば、細菌または酵母細胞）を、液体培養中で高細胞密度まで増殖させる。この例において用いることができる異種性酵素の例として、セロデキストリンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼの耐熱性バリアントが挙げられる。増殖期の終了時に異種性酵素の発現を誘導し、その後、細胞バイオマスを収集する。収集されたバイオマスを、次いで、機械的、化学的、または酵素的手段を介して溶解する。細胞ライセートを、次いで、ネイティブの酵素による活性を失活させるが異種性酵素を失活させない温度まで加熱する。セルロース／セロデキストリンフィードストック、無機リン酸および任意に他のさらなる栄養素を、熱失活したライセートに添加することにより、セルロース／セロデキストリンのアルロースの変換が可能となる（図２）。
例３．（ａ）Pseudothermotoga thermarum（PtAgp）（図３）、および（ｂ）Thermococcus zilligii（TzAgp）（図４）から採取されたα－グルカンホスホリラーゼを用いるデンプンのアルロースへの無細胞生成
この例は、特異的なα－グルカンホスホリラーゼ、PtAgp（図３）およびTzAgp（図４）を用いるデンプンのアルロースへの変換を記載する。ライセートを、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＭｎＣｌ２、および０．５ｍＭのＣｏＣｌ２と混合し、次いで、反応を開始させる前に、ライセートからの有害なバックグラウンド活性を取り除くために６０℃で４０分間にわたり加熱処理した。次いで、１００ｇ／Ｌのマルトデキストリンを添加する（spike in）ことにより反応を開始させ、６０℃で２４時間にわたりインキュベートし、周期的にサンプリングしてアルロースを測定した。サンプリングは、以下により行った：試料をライセートのカクテルから取り除き、トリクロロ酢酸中でクエンチし、上清を水酸化カリウムで中和し、その溶液を、糖定量のためにＬＣ－ＱＱＱ質量分析により分析するまで－８０℃で保存する。
この例は、特異的なα－グルカンホスホリラーゼ、PtAgp（図３）およびTzAgp（図４）を用いるデンプンのアルロースへの変換を記載する。ライセートを、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＭｎＣｌ２、および０．５ｍＭのＣｏＣｌ２と混合し、次いで、反応を開始させる前に、ライセートからの有害なバックグラウンド活性を取り除くために６０℃で４０分間にわたり加熱処理した。次いで、１００ｇ／Ｌのマルトデキストリンを添加する（spike in）ことにより反応を開始させ、６０℃で２４時間にわたりインキュベートし、周期的にサンプリングしてアルロースを測定した。サンプリングは、以下により行った：試料をライセートのカクテルから取り除き、トリクロロ酢酸中でクエンチし、上清を水酸化カリウムで中和し、その溶液を、糖定量のためにＬＣ－ＱＱＱ質量分析により分析するまで－８０℃で保存する。
例４．（ａ）Pyrococcus furiosus（PfPgi）（図５）（ｂ）Aeropyrum pernix（Ap0768）（図６）、ならびに（ｃ）Caldisphaera lagunensis（Cl1150）（図７）から採取されたホスホグルコイソメラーゼを用いるデンプンのアルロースへの無細胞生成
この例は、特異的なホスホグルコイソメラーゼ：PfPgi（図５）、Ap0768（図６）、およびCl1150（図７）を用いるデンプンのアルロースへの変換を記載する。ライセートを、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＭｎＣｌ２、および０．５ｍＭのＣｏＣｌ２と混合し、次いで、反応を開始させる前に、ライセートからの有害なバックグラウンド活性を取り除くために６０℃で４０分間にわたり加熱処理した。次いで、１００ｇ／Ｌのマルトデキストリンを添加することにより反応を開始させ、６０℃で２４時間にわたりインキュベートし、周期的にサンプリングしてアルロースを測定した。サンプリングは、以下により行った：試料をライセートのカクテルから取り除き、トリクロロ酢酸中でクエンチし、上清を水酸化カリウムで中和し、その溶液を、糖定量のためにＬＣ－ＱＱＱ質量分析により分析するまで－８０℃で保存する。
この例は、特異的なホスホグルコイソメラーゼ：PfPgi（図５）、Ap0768（図６）、およびCl1150（図７）を用いるデンプンのアルロースへの変換を記載する。ライセートを、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＭｎＣｌ２、および０．５ｍＭのＣｏＣｌ２と混合し、次いで、反応を開始させる前に、ライセートからの有害なバックグラウンド活性を取り除くために６０℃で４０分間にわたり加熱処理した。次いで、１００ｇ／Ｌのマルトデキストリンを添加することにより反応を開始させ、６０℃で２４時間にわたりインキュベートし、周期的にサンプリングしてアルロースを測定した。サンプリングは、以下により行った：試料をライセートのカクテルから取り除き、トリクロロ酢酸中でクエンチし、上清を水酸化カリウムで中和し、その溶液を、糖定量のためにＬＣ－ＱＱＱ質量分析により分析するまで－８０℃で保存する。
均等物および範囲
請求の範囲において、「a」、「an」および「the」などの冠詞は、文脈から逆であることが示されるか、または別段に明らかでない限り、１つまたは１つより多くを意味し得る。群の１つ以上のメンバーの間に「or」を含む請求項または説明は、文脈から逆であることが示されるか、または別段に明らかでない限り、当該群のメンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに別段に関連する場合に、満たされるとみなされる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに別段に関連する態様を含む。本発明は、群のメンバーのうちの１つより多くまたは全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに別段に関連する態様を含む。
請求の範囲において、「a」、「an」および「the」などの冠詞は、文脈から逆であることが示されるか、または別段に明らかでない限り、１つまたは１つより多くを意味し得る。群の１つ以上のメンバーの間に「or」を含む請求項または説明は、文脈から逆であることが示されるか、または別段に明らかでない限り、当該群のメンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに別段に関連する場合に、満たされるとみなされる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに別段に関連する態様を含む。本発明は、群のメンバーのうちの１つより多くまたは全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに別段に関連する態様を含む。
さらに、本発明は、列記される請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の限定要因、要素、条項および説明的用語が、別の請求項中に導入される、全てのバリエーション、組み合わせおよび順列を包含する。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基礎請求項に従属する任意の他の請求項において見出される１つ以上の限定要因を含むように改変することができる。要素がリストとして、例えばマーカッシュ群の形式において提示される場合、要素の各々のサブグループもまた開示され、任意の要素を、群から取り除くことができる。また、逆であることが明らかに示されない限り、本明細書において請求される任意の方法であって、１つより多くのステップまたは行為を含むものにおいて、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、当該ステップまたは行為が列挙される順序に限定されないことが、理解されるべきである。一般に、本発明、または本発明の側面が、特定の要素および／または特徴を含むものとして言及される場合に、本発明のある態様または本発明の側面は、かかる要素および／または特徴からなるか、またはこれらから本質的になることが、理解されるべきである。単純化のために、これらの態様は、本明細書においては文言としては具体的には記載されていない。また、用語「～を含むこと（comprising）」および「～を含むこと（containing）」は、オープンであることを意図され、さらなる要素またはステップの包含を許容する。請求の範囲において、ならびに上の説明において、移行句、「～を含むこと（comprising）」、「～を含むこと（including）」、「～を担持すること（carrying）」、「～を有すること（having）」、「～を含むこと（containing）」、「～を含むこと（involving）」、「～を保持すること（holding）」、「～から構成されること（composed of）」などは、オープンエンドである、すなわち、それを含むが、それに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧（United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures）のセクション2111.03.において記載されるとおり、移行句、「～からなる（consisting of）」および「～から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれクローズまたは半クローズの移行句であるべきである。範囲が示される場合、端点が含まれる。さらに、別段に示されるかまたは文脈および当業者の理解から別段に明らかでない限り、範囲として表現された値は、本発明の異なる態様における記述された範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈が明らかに別段に示さない限り、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで、仮定し得る。
本願は、多様な発行された特許、公開された特許出願、学術雑誌の記事、および他の刊行物を引用し、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。援用される参考文献のうちのいずれかと本明細書との間に矛盾が存在する場合、本明細書が支配すべきである。加えて、本発明の任意の特定の態様であって、先行技術に該当するものは、請求項のうちの任意の１つ以上から明示的に除外される。かかる態様は、当業者に公知であるとみなされるので、それらは、除外が本明細書において明示的に記載されない場合においてすら、除外することができる。本発明の任意の特定の態様は、任意の請求項から、任意の理由のために、先行技術の存在に関係するか否かにかかわらず、除外することができる。
当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書において記載される特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、またはこれらを確認することができるであろう。本明細書において記載される本態様の範囲は、上の説明に限定することを意図されず、むしろ、添付される請求の範囲において記載される。当業者は、以下の請求の範囲において定義されるような本開示の精神または範囲から逸脱することなく、この記載に対して多様な変更および改変を行うことができることを理解するであろう。
Claims (84)
- 多糖からグルコース１－リン酸を生成する無細胞的方法であって、以下：
AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、Tm08495（Thermotoga Maritima由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼを用いて、多糖をグルコース１－リン酸に変換すること
を含む、前記方法。 - α－グルカンホスホリラーゼが、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- α－グルカンホスホリラーゼが、AaGlgp（Aquifex aeolicus由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、およびPtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 多糖をグルコース１－リン酸に変換することが、脱分枝酵素を用いることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 脱分枝酵素が、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項４に記載の方法。
- プルラナーゼが、Fp1793（Fervidobacterium pennavorans由来）、BfPull（Bacillus flavocaldarius由来）、およびTRQ5Pul（Thermotoga sp. RQ5由来）からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
- イソアミラーゼが、StTreX（Sulfolobus tokodaii由来）、MhTreX（Metallosphaera hakonensis由来）、およびStGlgX（Sphaerobacter thermophilus由来）からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
- イソアミラーゼが、StTreX（Sulfolobus tokodaii由来）である、請求項５に記載の方法。
- ホスホグルコムターゼを用いて、グルコース１－リン酸をグルコース６－リン酸に変換すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - ホスホグルコムターゼが、Tk1621（Thermococcus kodakaraensis由来）、Pk02350（Pyrococcus kukulkanii由来）、Af0458（Archaeoglobus fulgidus由来）、CtPgm2（Clostridium thermocellum由来）、TtPgm2（Thermus thermophilus由来）、およびTiManB（Thermus islandicus由来）からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
- ホスホグルコムターゼが、Tk1621（Thermococcus kodakaraensis由来）、Pk02350（Pyrococcus kukulkanii由来）、およびCtPgm2（Clostridium thermocellum由来）からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
- ホスホグルコイソメラーゼを用いて、グルコース６－リン酸をフルクトース６－リン酸に変換すること
をさらに含む、請求項９に記載の方法。 - ホスホグルコイソメラーゼが、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
- ホスホグルコイソメラーゼが、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
- ホスホグルコイソメラーゼが、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、およびPfPgi（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
- アルロース６－リン酸エピメラーゼを用いてフルクトース６－リン酸をアルロース６－リン酸に変換すること
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。 - アルロース６－リン酸エピメラーゼが、BtAlsE（Brevibacillus thermoruber由来）、Thebr1340（Thermoanaerobacter brockii由来）、CasuRpe2（Caldanaerobacter subterraneus由来）、Defds2125（Deferribacter desulfuricans由来）、Hg1285（Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1由来）、Tthe1731（Thermoanerobacterium thermosaccharolyticum由来）、Theru00510（Thermocrinis ruber由来）、That0313（Thermosipho atlanticus由来）、およびThtaRpe（Thermosulfidibacter takaii由来）からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
- アルロース６－リン酸エピメラーゼが、BtAlsE（Brevibacillus thermoruber由来）、Hg1285（Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1由来）、およびTthe1731（Thermoanerobacterium thermosaccharolyticum由来）からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
- アルロース６－リン酸ホスファターゼを用いてアルロース６－リン酸をアルロースに変換すること
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。 - アルロース６－リン酸ホスファターゼが、AaGph（Aquifex aeolicus由来）、Acel0099（Acidothermus cellulolyticus由来）、CsPpaX（Caldanaerobacter subterraneus由来）、Cthe0261（Clostridium thermocellum由来）、Desku1269（Desulfotomaculum kuznetsovii由来）、Dgeo0096（Deinococcus geothermalis DSM 11300由来）、Mth1760（Methanothermobacter thermautotrophicus由来）、Pho459（Pyrococcus horikoshii Ot3由来）、Pmob0141（Petrotoga mobilis由来）、Tagg0346（Thermosphaera aggregans由来）、Tfu0224（Thermobifida fusca由来）、Theet2005（Thermoanaerobacter ethanolicus由来）、Thein1775（Thermodesulfatator indicus由来）、TheisHAD（Thermus islandicus由来）、Thewi1735（Thermoanaerobacter wiegelii由来）、TtC1471（Thermus thermophilus由来）、Vdis0326（Crenarchaeota archaeon 13_1_40CM_3_53_5由来）、Bf9343（Bacteroides fragilis由来）、Bvu4110（Bacteroides vulgatus由来）、およびCtn1320（Thermotoga neapolitana由来）からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
- アルロース６－リン酸ホスファターゼが、Cthe0261（Clostridium thermocellum由来）、Bf9343（Bacteroides fragilis由来）およびBvu4110（Bacteroides vulgatus由来）からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
- 多糖が、マルトデキストリン、デンプン、グリコーゲン、セルロースまたはセロデキストリンである、請求項１に記載の方法。
- グルコース６－リン酸からフルクトース６－リン酸を生成する無細胞的方法であって、以下：
CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼを用いて、グルコース６－リン酸をフルクトース６－リン酸に変換すること
を含む、前記方法。 - ホスホグルコイソメラーゼが、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
- ホスホグルコイソメラーゼが、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、およびPfPgi（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
- ホスホグルコムターゼを用いてグルコース１－リン酸をグルコース６－リン酸に変換すること
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。 - ホスホグルコムターゼが、Tk1621（Thermococcus kodakaraensis由来）、Pk02350（Pyrococcus kukulkanii由来）、Af0458（Archaeoglobus fulgidus由来）、CtPgm2（Clostridium thermocellum由来）、TtPgm2（Thermus thermophilus由来）、およびTiManB（Thermus islandicus由来）からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
- ホスホグルコムターゼが、Tk1621（Thermococcus kodakaraensis由来）、Pk02350（Pyrococcus kukulkanii由来）およびCtPgm2（Clostridium thermocellum由来）からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
- α－グルカンホスホリラーゼを用いて多糖をグルコース１－リン酸に変換すること
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。 - α－グルカンホスホリラーゼが、Tm08495（Thermotoga maritima由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
- α－グルカンホスホリラーゼが、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
- α－グルカンホスホリラーゼが、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、およびAaGlgP（Aquifex aeolicus由来）からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
- 多糖をグルコース１－リン酸に変換するステップが、脱分枝酵素を用いることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
- 脱分枝酵素が、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項３３に記載の方法。
- プルラナーゼが、Fp1793（Fervidobacterium pennavorans由来）、BfPull（Bacillus flavocaldarius由来）、およびTRQ5Pul（Thermotoga sp. RQ5由来）からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
- イソアミラーゼが、StTreX（Sulfolobus tokodaii由来）、MhTreX（Metallosphaera hakonensis由来）、およびStGlgX（Sphaerobacter thermophilus由来）からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
- イソアミラーゼが、StTreX（Sulfolobus tokodaii由来）である、請求項３４に記載の方法。
- 多糖が、マルトデキストリン、デンプン、グリコーゲン、セルロース、またはセロデキストリンである、請求項２９に記載の方法。
- アルロース－６リン酸エピメラーゼを用いて、フルクトース６－リン酸をアルロース６－リン酸に変換すること
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。 - アルロース６－リン酸エピメラーゼが、BtAlsE（Brevibacillus thermoruber由来）、Thebr1340（Thermoanaerobacter brockii由来）、CasuRpe2（Caldanaerobacter subterraneus由来）、Defds2125（Deferribacter desulfuricans由来）、Hg1285（Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1由来）、Tthe1731（Thermoanerobacterium thermosaccharolyticum由来）、Theru00510（Thermocrinis ruber由来）、That0313（Thermosipho atlanticus由来）、およびThtaRpe（Thermosulfidibacter takaii由来）からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
- アルロース６－リン酸エピメラーゼが、BtAlsE（Brevibacillus thermoruber由来）、Hg1285（Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1由来）、およびTthe1731（Thermoanerobacterium thermosaccharolyticum由来）からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
- アルロース－６リン酸ホスファターゼを用いてアルロース６－リン酸をアルロースに変換すること
をさらに含む、請求項３９に記載の方法。 - アルロース６－リン酸ホスファターゼが、AaGph（Aquifex aeolicus由来）、Acel0099（Acidothermus cellulolyticus由来）、CsPpaX（Caldanaerobacter subterraneus由来）、Cthe0261（Clostridium thermocellum由来）、Desku1269（Desulfotomaculum kuznetsovii由来）、Dgeo0096（Deinococcus geothermalis DSM 11300由来）、Mth1760（Methanothermobacter thermautotrophicus由来）、Pho459（Pyrococcus horikoshii Ot3由来）、Pmob0141（Petrotoga mobilis由来）、Tagg0346（Thermosphaera aggregans由来）、Tfu0224（Thermobifida fusca由来）、Theet2005（Thermoanaerobacter ethanolicus由来）、Thein1775（Thermodesulfatator indicus由来）、TheisHAD（Thermus islandicus由来）、Thewi1735（Thermoanaerobacter wiegelii由来）、TtC1471（Thermus thermophilus由来）、Vdis0326（Crenarchaeota archaeon 13_1_40CM_3_53_5由来）、Ctn1320（Thermotoga neapolitana由来）、Bf9343（Bacteroides fragilis由来）、およびBvu4110（Bacteroides vulgatus由来）からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
- アルロース６－リン酸ホスファターゼが、Cthe0261（Clostridium thermocellum由来）、Bf9343（Bacteroides fragilis由来）およびBvu4110（Bacteroides vulgatus由来）からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
- 多糖からアルロースを生成するための無細胞的方法であって、以下：
α－グルカンホスホリラーゼを用いて多糖をグルコース１－リン酸に変換すること；
ホスホグルコムターゼを用いてグルコース１－リン酸をグルコース６－リン酸に変換すること；
ホスホグルコイソメラーゼを用いて、グルコース６－リン酸をフルクトース６－リン酸に変換すること；
アルロース－６リン酸エピメラーゼを用いて、フルクトース６－リン酸をアルロース６－リン酸に変換すること；および
アルロース－６リン酸ホスファターゼを用いてアルロース６－リン酸をアルロースに変換すること
を含む、前記方法。 - α－グルカンホスホリラーゼが、Tm08495（Thermotoga maritima由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、TcGlgP（Thermus caldophilus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
- ホスホグルコムターゼが、Tk1621（Thermococcus kodakaraensis由来）、Pk02350（Pyrococcus kukulkanii由来）、Af0458（Archaeoglobus fulgidus由来）、CtPgm2（Clostridium thermocellum由来）、TtPgm2（Thermus thermophilus由来）、およびTiManB（Thermus islandicus由来）からなる群より選択される、請求項４５または４６に記載の方法。
- ホスホグルコイソメラーゼが、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、MjPgi（Methanococcus jannaschii由来）、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
- アルロース６－リン酸エピメラーゼが、BtAlsE（Brevibacillus thermoruber由来）、Thebr1340（Thermoanaerobacter brockii由来）、CasuRpe2（Caldanaerobacter subterraneus由来）、Defds2125（Deferribacter desulfuricans由来）、Hg1285（Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1由来）、Tthe1731（Thermoanerobacterium thermosaccharolyticum由来）、Theru00510（Thermocrinis ruber由来）、That0313（Thermosipho atlanticus由来）、およびThtaRpe（Thermosulfidibacter takaii由来）からなる群より選択される、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。
- アルロース６－リン酸ホスファターゼが、Bf9343（Bacteroides fragilis由来）、Bvu4110（Bacteroides vulgatus由来）、AaGph（Aquifex aeolicus由来）、Acel0099（Acidothermus cellulolyticus由来）、CsPpaX（Caldanaerobacter subterraneus由来）、Cthe0261（Clostridium thermocellum由来）、Desku1269（Desulfotomaculum kuznetsovii由来）、Dgeo0096（Deinococcus geothermalis DSM 11300由来）、Mth1760（Methanothermobacter thermautotrophicus由来）、Pho459（Pyrococcus horikoshii Ot3由来）、Pmob0141（Petrotoga mobilis由来）、Tagg0346（Thermosphaera aggregans由来）、Tfu0224（Thermobifida fusca由来）、Theet2005（Thermoanaerobacter ethanolicus由来）、Thein1775（Thermodesulfatator indicus由来）、TheisHAD（Thermus islandicus由来）、Thewi1735（Thermoanaerobacter wiegelii由来）、TtC1471（Thermus thermophilus由来）、Vdis0326（Crenarchaeota archaeon 13_1_40CM_3_53_5由来）、およびCtn1320（Thermotoga neapolitana由来）からなる群より選択される、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
- α－グルカンホスホリラーゼが、TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、およびPtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）からなる群より選択される、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の方法。
- ホスホグルコムターゼが、Tk1621（Thermococcus kodakaraensis由来）、Pk02350（Pyrococcus kukulkanii由来）、およびCtPgm2（Clostridium thermocellum由来）からなる群より選択される、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の方法。
- ホスホグルコイソメラーゼが、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、およびPfPgi（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の方法。
- アルロース６－リン酸エピメラーゼが、BtAlsE（Brevibacillus thermoruber由来）、Hg1285（Hydrogenivirga sp. 128-5-R1-1由来）、Tthe1731（Thermoanerobacterium thermosaccharolyticum由来）からなる群より選択される、請求項４５～５３のいずれか一項に記載の方法。
- アルロース６－リン酸ホスファターゼが、Cthe0261（Clostridium thermocellum由来）、Bf9343（Bacteroides fragilis由来）およびBvu4110（Bacteroides vulgatus由来）からなる群より選択される、請求項４５～５４のいずれか一項に記載の方法。
- α－グルカンホスホリラーゼが、PfAgp（Pyrococcus furiosus由来）、およびTzAgp（Thermococcus zilligii由来）からなる群より選択される、請求項４５～５０および５２～５５のいずれか一項に記載の方法
- ホスホグルコイソメラーゼが、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、およびPfPgi（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される、請求項４５～５２および５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
- 多糖をグルコース１－リン酸に変換するステップが、脱分枝酵素を用いることをさらに含む、請求項４５～５７のいずれか一項に記載の方法。
- 脱分枝酵素が、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項５８に記載の方法。
- 脱分枝酵素が、Fp1793（Fervidobacterium pennavorans由来）、BfPull（Bacillus flavocaldarius由来）、TRQ5Pul（Thermotoga sp. RQ5由来）、StTreX（Sulfolobus tokodaii由来）、MhTreX（Metallosphaera hakonensis由来）、およびStGlgX（Sphaerobacter thermophilus由来）からなる群より選択される、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項５８または５９に記載の方法。
- 脱分枝酵素が、StTreX（Sulfolobus tokodaii由来）、MhTreX（Metallosphaera hakonensis由来）、およびStGlgX（Sphaerobacter thermophilus由来）からなる群より選択されるイソアミラーゼである、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の方法。
- 脱分枝酵素が、StTreX（Sulfolobus tokodaii由来）である、請求項５８～６１のいずれか一項に記載の方法。
- 多糖が、マルトデキストリン、デンプン、グリコーゲン、またはセロデキストリンである、請求項４５～６２のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法により生成される、アルロース。
- TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
ホスホグルコイソメラーゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；および
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；および
任意に脱分枝酵素
を含む、細胞ライセート。 - PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ；
α－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；および
任意に脱分枝酵素
を含む、細胞ライセート。 - TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
ホスホグルコイソメラーゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；および
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；および
任意に脱分枝酵素
を含む、改変細胞。 - PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ；
α－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；および
任意に脱分枝酵素
を含む、改変細胞。 - 細胞が、細菌細胞または酵母細胞である、請求項６７または６８に記載の改変細胞。
- 少なくとも２つの細胞集団から得られた細胞ライセートの混合物であって、各々の細胞集団の細胞が、以下：
TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
ホスホグルコイソメラーゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；および
脱分枝酵素
からなる群より選択される、少なくとも１つまたはそれより多くの酵素を発現する、前記細胞ライセートの混合物。 - 少なくとも２つの細胞集団から得られた細胞ライセートの混合物であって、各々の細胞集団の細胞が、以下：
PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ；
α－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；および
脱分枝酵素
からなる群より選択される、少なくとも１つまたはそれより多くの酵素を発現する、前記細胞ライセートの混合物。 - TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
ホスホグルコイソメラーゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；
任意に脱分枝酵素；
多糖；
グルコース１－リン酸；
グルコース６－リン酸；
フルクトース６－リン酸；
アルロース６－リン酸；および
アルロース
を含む、細胞ライセートの反応混合物。 - α－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；
任意に脱分枝酵素；
多糖；
グルコース１－リン酸；
グルコース６－リン酸；
フルクトース６－リン酸；
アルロース６－リン酸；および
アルロース
を含む、細胞ライセートの反応混合物。 - TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
ホスホグルコイソメラーゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；
任意に脱分枝酵素；
多糖；
グルコース１－リン酸；
グルコース６－リン酸；
フルクトース６－リン酸；
アルロース６－リン酸；および
アルロース
を含む、アルロースの合成のための細胞ライセート混合物。 - α－グルカンホスホリラーゼ；
ホスホグルコムターゼ；
PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼ；
アルロース６－リン酸エピメラーゼ；
アルロース６－リン酸ホスファターゼ；
任意に脱分枝酵素；
多量体グルコース；
グルコース１－リン酸；
グルコース６－リン酸；
フルクトース６－リン酸；
アルロース６－リン酸；および
アルロース
を含む、アルロースの合成のための細胞ライセート混合物。 - アルロースを生成するための無細胞的方法であって、以下：
（ａ）TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、
耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、および耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ
を発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生成すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること；
（ｃ）ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで細胞ライセートを加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに
（ｄ）熱失活したライセートを、デンプン、グリコーゲン、またはこれらの任意の部分的に加水分解された誘導体、および無機リン酸の存在下においてインキュベートして、アルロースを生成すること；
を含む、前記方法。 - アルロースを生成するための無細胞的方法であって、以下：
（ａ）耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、ならびに
PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択される耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ
を発現するように改変された細胞を培養して、耐熱性酵素を発現する培養細胞を生成すること；
（ｂ）培養細胞を溶解して細胞ライセートを生成すること；
（ｃ）ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで細胞ライセートを加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに
（ｄ）熱失活したライセートを、デンプン、グリコーゲン、またはこれらの任意の部分的に加水分解された誘導体、および無機リン酸の存在下においてインキュベートして、アルロースを生成すること；
を含む、前記方法。 - アルロースを生成するための無細胞的方法であって、以下：
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養して、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成すること、ここで、各々の集団の細胞は、以下：
TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択される耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、
耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、および耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および耐熱性脱分枝酵素
からなる群より選択される少なくとも１つの酵素、
を発現するように操作される；
（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、および耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に耐熱性脱分枝酵素を含む、細胞ライセート混合物を生成すること；
（ｄ）ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ｃ）の耐熱性酵素を失活させない温度まで細胞ライセート混合物を加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに
（ｅ）反応混合物を、デンプン、グリコーゲン、またはこれらの任意の部分的に加水分解された誘導体、および無機リン酸の存在下においてインキュベートして、アルロースを生成すること
を含む、前記方法。 - アルロースを生成するための無細胞的方法であって、以下：
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養して、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成すること、ここで、各々の集団の細胞は、
耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素
および任意に脱分枝酵素
を発現するように操作される；
（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；
（ｃ）少なくとも２つの細胞ライセートを組み合わせて、耐熱性α－グルカンホスホリラーゼ、耐熱性ホスホグルコムターゼ、耐熱性ホスホグルコイソメラーゼ、耐熱性アルロース６－リン酸エピメラーゼ、および耐熱性アルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む細胞ライセート混合物を生成すること；
（ｄ）細胞ライセート混合物を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ｃ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；ならびに
（ｅ）反応混合物を、デンプン、グリコーゲン、またはこれらの任意の部分的に加水分解された誘導体、および無機リン酸の存在下においてインキュベートして、アルロースを生成すること
を含む、前記方法。 - アルロースを生成するための無細胞的方法であって、以下：
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養して、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成すること、ここで、各々の集団の細胞は、以下：
TzAgp（Thermococcus zilligii由来）、AaGlgP（Aquifex aeolicus由来）、PtAgp（Pseudothermotoga thermarum由来）、およびPfAgp（Pyrococcus furiosus由来）からなる群より選択されるα－グルカンホスホリラーゼ、
ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、および脱分枝酵素
からなる群より選択される少なくとも１つの酵素を発現するように操作され、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；
（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；
（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、細胞ライセート混合物を生成すること、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；ならびに
（ｅ）細胞ライセート混合物を、デンプン、グリコーゲン、またはこれらの任意の部分的に加水分解された誘導体、および無機リン酸の存在下において、インキュベートして、アルロースを生成すること；
を含む、前記方法。 - アルロースを生成するための無細胞的方法であって、以下：
（ａ）少なくとも２つの細胞集団を培養して、異なる酵素を発現する細胞の少なくとも２つの培養集団を生成すること、ここで、各々の集団の細胞は、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、PfPgi（Pyrococcus furiosus由来）、CtPgi（Clostridium thermocellum由来）、TtPgi（Thermus thermophilus由来）、Ap0768（Aeropyrum pernix由来）、およびCl1150（Caldisphaera lagunensis由来）からなる群より選択されるホスホグルコイソメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素、および任意に脱分枝酵素を発現するように操作され、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；
（ｂ）少なくとも２つの培養された集団の細胞を溶解して、少なくとも２つの細胞ライセートを生成すること；
（ｃ）任意に、ステップ（ｂ）の細胞ライセートのうちの１つ以上を、ネイティブの酵素活性を失活させるがステップ（ａ）の酵素を失活させない温度まで加熱して、熱失活したライセートを生成すること；
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の細胞ライセートを組み合わせて、α－グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、およびアルロース６－リン酸ホスファターゼ、および任意に脱分枝酵素を含む、細胞ライセート混合物を生成すること、ここで、前述の酵素のうちの少なくとも１つは、耐熱性である；ならびに
（ｅ）細胞ライセート混合物を、デンプン、グリコーゲン、またはこれらの任意の部分的に加水分解された誘導体、および無機リン酸の存在下においてインキュベートして、アルロースを生成すること
を含む、前記方法。 - 細胞が、細菌細胞を含む、請求項７６～８１のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、酵母細胞を含む、請求項７６～８１のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素のうちの少なくとも１つが、細胞に対して異種性である、請求項７６～８３のいずれか一項に記載の方法。
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