JP2022514672A - ヒアルロナン合成阻害のための4-メチルウンベリフェリルグルクロニド - Google Patents
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Abstract
ヒアルロナン合成を阻害する化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療するための組成物が記載される。いくつかの実施形態において、ヒアルロナン合成を阻害する化合物は4-メチルウンベリフェロン-グルクロニドである。自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療する方法であって、哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を有する組成物を哺乳動物対象に投与することを含む方法もまた記載される。
Description
ヒアルロナン(HA)は、正常な組織機能および発達において多くの役割を有する細胞外マトリックスグリコサミノグリカンである(Fraser J.R.,et al.,J.Intern.Med.1997;242(1):27-33;Jiang D,et al.,Physiol.Rev.2011;91(1):221-264、Termeer C.,et al.Trends,Immunol.2003;24(3):112-114)。HAは、3つのヒアルロナンシンターゼ(HAS)酵素である、HAS1、HAS2、およびHAS3によって合成される(Weigel P.H.,et al.,J.Biol.Chem.2007;282(51):36777-36781)。これらの酵素は、細胞膜を通して細胞外空間に押し出される際に、新生多糖にグルクロン酸(GlcUA)およびN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を繰り返し付加することによって、HAを長くする(Weigel P.H.,et al.,J.Biol.Chem.2007;282(51):36777-36781)。
HA合成を阻害することに実質的な、実験的および治療的な関心がある。HAは炎症応答を促進することが知られており(Jiang D.,et al.,Physiol.Rev.2011;91(1):221-264)、これらには、複数の免疫細胞型の活性化および成熟(Termeer C.,et al.,J.Exp.Med.2002;195(1):99-111)、炎症促進性ケモカインおよびサイトカインの放出(Taylor K.R.,et al.,J.Biol.Chem.2004;279(17):17079-17084、McKee C.M.,et al.,J.Clin.Invest.1996;98(10):2403-2413)、および増殖(Mahaffey C.L..,et al.,J.Immunol.2007;179(12):8191-8199)および白血球の移動(Itano N.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002;99(6):3609-3614)が含まれる。HAおよびその受容体相互作用は、リンパ球の数および機能の両方に影響を与えることも知られている(Bollyky P.L.,et al.,J.Immunol.2009;183(4):2232-2241、Bollyky P.L.,et al.,J.Immunol.2007;179(2):744-747、Bollyky P.L.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2011;108(19):7938-7943)。HAレベルは、慢性炎症組織において大幅に上昇し(Cheng G.,et al.Matrix Biol.2011;30(2):126-134、Kang L.,et al.Diabetes,2013;62(6):1888-1896、Mine S.,et al.Endocr.J.2006;53(6):761-766)、これらには、腫瘍微小環境における、線維症における、および自己免疫部位におけるものが含まれる(Bollyky P.L.,et al.,Curr.Diab.Rep.2012;12(5):471-480、Nagy N.,et al.,J Clin Invest.2015;125(10):3928-3940)。
自己免疫性1型糖尿病(T1D)において、HAは膵島に蓄積する(Bogdani,M.,et al.,Curr.Diab.Rep.2014;14:552、Bogdani,M.,et al.Diabetes,2014;63:2727-2743)。肥満関連2型糖尿病(T2D)において、HAは高血糖(Shakya,S.,et al.,Int.J.Cell Biol.2015:701738、Wang,A.,et al.,Autophagy 5:864-865)、炎症性サイトカイン(Bollyky,P.L.,et al.,Cell.Mol.Immunol.7:211-220)、および他のトリガー(Jiang,D.,et al.,Physiol.Rev.91:221-264、Laurent,T.C.,et al.,Immunol.Cell Biol.74:A1-7、Lauer,M.E.,et al.J.Biol.Chem.284:5299-5312)に応答して炎症組織内に蓄積する。HAは、T2Dにおいて、骨格筋(Kang L,et al.Diabetes,2013;62(6):1888-1896)、および脂肪組織(Liu,L.F.,et al.Diabetologia,2015;58:1579-1586)で増加する。HAはまた、肝硬変、原発性硬化性胆道炎、腎臓線維症、および他の線維性状態を含む、慢性炎症および線維症の設定において増加する(Lewis,A.,et al.Histol.Histopathol.2008;23:731-739、Li,Y.,et al.,J.Exp.Med.2011;208:1459-1471、Orasan,O.H.,et al.Clujul Med 2016;89:24-31、Colombaro,V.,et al.,Nephrol.Dial.Transplant.2013;28:2484-2493、Vesterhus,M.,et al.Hepatology,2015;62(1):188-197)。
HAの増加は、間断がない炎症を伴う多くの慢性疾患プロセスに関連しており、これらには、2型糖尿病(Mine,S.,et al.Endocr.J.2006;53:761-766、Kang,L.et al.,2013;Diabetes 62:1888-1896)、肝硬変(Plevris,J.N.,et al.,Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.2000;12(10):1121-1127)、喘息、および多様な病因の他の慢性炎症性疾患(Plevris,J.N.et al.,2000;Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.12:1121-1127、Wells,A.F.et al.,Transplantation 1990;50:240-243、Dahl,L.B.,et al.,Ann.Rheum.Dis.1985;44:817-822、Hallgren,R.,et al.,Am.Rev.Respir.Dis.1989;139:682-687、Evanko,S.P.,et al.,Am.J.Pathol.1998;152:533-546)、Cheng,G.et al.Matrix Biol.2011;30:126-134、Ayars,A.G.et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.2013;161:65-73、Liang,J.et al.,J.Allergy Clin.Immunol.2011;128:403-411.e3)が含まれる。
HAは、関節リウマチ(Yoshioka,Y.,et al.,2013;Arthritis Rheum.65(5):1160-1170)、狼瘡(Yung S.,et al.,Autoimmune Dis.2012;2012:207190,PMID:22900150)、シェーグレン症候群(Tishler M.,et al.,Ann Rheum Dis.1998;57(8):506-508)、および橋本甲状腺炎(Gianoukakis,A.G.,et al.,Endocrinology.2007;148(1):54-62)を含む、多発性自己免疫性疾患に関与している。HAは、様々な形態のがんにおける腫瘍を取り囲む(Toole,B.P.Nat.Rev.Cancer 2004;4:528-539)。HAのこの蓄積は、持続性炎症に関連するより大きなパターンのECM堆積の一部である。HAは、局所浮腫を増加させ(Waldenstrom,A.,et al.,J.Clin.Invest.1991;88:1622-1628)、遺伝子発現およびサイトカイン産生および細胞生存への効果を通じて白血球の移動、増殖、分化を駆動する炎症性カスケードに寄与する。これらの経路および先天性免疫に対するHA産生の影響は、いくつかのレビューの対象である(Jiang,D.,et al.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.2007;23:435-461.PMID:17506690)、Jiang,D.,et al.Physiol.Rev.2011;91:221-264、Petrey,A.C.et al.,Front.Immunol.2014;5:101、Slevin,M.et al.Matrix Biol.2007;26:58-68、Sorokin,L.Nat.Rev.Immunol.2010;10:712-723)。
HAの増加は、多くのがんにおいて見出され、がん進行および転移に重要である(Schwertfeger,K.L.,et al.,Front.Immunol.2015;6:236、Misra,S.,et al.,FEBS J.2011;278:1429-1443、Li,Y.,et al.,Br.J.Cancer 2001;85:600-607)。HAは、多くのがん、例えば膵臓がん(Nakazawa H,et al.Cancer Chemother.Pharmacol.2006;57:165-170、Morohashi H,et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.2006;345:1454-1459、Hajime M,et al.,Int.J.Cancer 2007;120:2704-2709)、前立腺がん(Lokeshwar VB,et al.,Cancer Research 2010;70:2613-2623)、皮膚がん(Kudo D,et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.2004;321:783-787、Bhattacharyya,S.et al.,Eur.J.Pharmacol.2009;614:128-136、Edward M.,et al.,Br.J.Dermatol.2010;162:1224-1232)、食道がん、乳がん(Urakawa H.,et al.,Int.J.Cancer 2012;130:454-466;Saito T.,et al.,Oncol.Rep.2013;29:335-342、Saito T.,et al.,Oncol.Lett.2013;5:1068-1074)、肝臓がん(Kundu B.,et al.,Biomaterials(2013)34:9462-9474)、骨がん/転移(Okuda H.,et al.,Cancer Research 2012;72:537-547)、白血病(Lompardia S.L.,et al.Glycobiology,2013;23:1463-1476)、子宮内膜がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮頸がん、食道がん、および卵巣がん(Tamura R.,et al.,J.Ovarian Res.2014;7:94)の病因に関与している。
多数の研究は、HAを炎症の駆動因子として関与させ、HAは広範囲の炎症性障害に関与する(Hull R.L.,et al.,J.Histochem.Cytochem.2012;60(10):749-760、Kuipers H.F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2016;113(5):1339-44、Yoshioka Y.,et al.,Rheum.2013;65(5):1160-1170)。これらには、例えば、腎虚血再灌流損傷(Colombaro V.,et al.,Nephrol.Dial.Transplant.2013;28:2484-2493)、喘息(Liang,J.,et al.,J.Allergy Clin.Immunol.2011;128(2):403-411.e3,2011、Forteza R.M.,et al.,J.Biol.Chem.2012;287:42288-42298)、肺高血圧症(Collum S.D.,et al.,Br.J.Pharmacol.2017;174(19):3284-3301)、肥満関連2型糖尿病(Sim M.-O.,et al.,Chem.Biol.Interact.2014;216:9-16)、関節炎(Campo,G.M.,et al.,BioFactors 2012;38(1):69-76)、アテローム性硬化症(Fischer,J.W.,Matrix Biol.2019;78-79:324-336)、創傷治癒(David-Raoudi,M.,et al.,Wound Repair Regen.2008;16(2):274-287)、慢性閉塞性肺疾患および肺気腫(Dentener M.A.,et al.Thorax,2005;60(2):114-119)、気管支炎オブリテランス症候群(BOS)(Todd J.L.,et al.,Am.J.Respir.Crit.Care Med.2014;189(5):556-566)、移植拒絶(Tesar B.M.,et al.,Am.J.Transplant.2006;6(11):2622-2635)、移植片対宿主病、皮膚筋炎および炎症性腸疾患(Kubo M.,et al.,Arch.Dermatol.Res.1998;290(10):579-581)、および炎症性腸疾患(de la Motte C.A.,et al.,Int.J.Cell Biol.2015;2015:481301)が含まれる。
多くの研究は、HAを線維症の駆動因子として関与させており、HAは幅広い線維性障害に関与する。これらには、肝線維症(Halfon,P.,et al.Comp.Hepatology 2005;4:6)、腎線維症(Kato,N.,et al.,Am.J.Pathology 2011;178(2):572-579)、真皮線維症(Tolg,C.,et al.,Am.J.Pathology 2012;181(4):1250-1270)腸線維症(Rieder,F.,et al.Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology 2009;6(4):228-235)、および肺線維症(Bensadoun,E.S.,et al.,Am.J.Respir.Critical Care Medicine 1996;154(6):1819-1828)、Venkatesan,N.,et al.,Am.J.Respir.Critical Care Medicine 2000;161(6):2066-2073)が含まれる。
HA媒介性炎症シグナルは、がん、線維症、炎症、および自己免疫等の無菌炎症の設定において特に関連され得る(Taylor K.R.,et al.J.Biol.Chem.2007;282(25):18265-18267)。ほとんどの傷害の部位で、HAは急速に除去される。しかしながら、慢性炎症の部位では、HAは持続する(Bollyky P.L.,et al.,J.Leukoc.Biol.2009;86(3):567-572)。これは、局所免疫調節に重要な結果を有することができる(Bollyky P.L.,et al.,Curr.Diab.Rep.2012;12(5):471-480、Garantziotis S.,et al.,Am.J.Respir.Crit.Care Med.2010;181(7):666-675、Hull R.L.,et al.,J.Histochem.Cytochem.2015;63(8):592-603、Yung S.,et al.,Autoimmune Dis.2012;2012:207190、Lee-Sayer S.S.,et al.,Front.Immunol.2015;6:150、Jackson D.G.Immunol.Rev.2009;230(1):216-231、Petrey A.C.,et al.、Front.Immunol.2014;5:101)。
HAは、HAS1、HAS2、およびHAS3の3つのシンターゼによって産生され、慢性炎症の部位において豊富である。分解代謝性の、HAの低分子量量断片(LMW-HA)は、抗原応答(Termeer,C.et al.J.Exp.Med.2002;195:99-111)、および免疫活性化(Jiang,D.,et al.,Physiol.Rev.2011;91:221-264)であって、CD44およびToll様受容体(TLR)シグナル伝達を介するもの(Jiang,D.et al.,Nat.Med.2005;11:1173-1179、Fieber,C.et al.,J.Cell.Sci.2004;117:359-367、Termeer,C.,et al.Trends Immunol.2003;24:112-114(2003)、Taylor,K.R.et al.,J.Biol.Chem.2004;279:17079-17084)を促進する内因性危険シグナルとして作用する。
LMW-HAはまた、樹状細胞(DC)の活性化および成熟を促進し(Termeer,C.et al.,J.Exp.Med.2002;195:99-111)、複数の細胞型によるIL-1、TNF-α、IL-6、およびIL-12等の炎症促進サイトカインの放出を駆動し(Bollyky,P.L.et al.,J.Immunol.2007;179:744-747、Bollyky,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2011;108:7938-7943)、ケモカイン発現および細胞輸送を駆動し(McKee,C.M.et al.,J.Clin.Invest.1996;98:2403-2413)、増殖(Scheibner,K.A.et al.,J.Immunol.2006;177:1272-1281)および血管新生(Kuipers,H.F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2016;113:1339-1344)を促進する。
最近、HA堆積物は最近発症したT1Dを有する個体の膵島内に蓄積し、これらの堆積物がインスリン炎部位に存在したことが報告された(Bogdani,M.et al.Diabetes,2014;63:2727-2743)。同様のHA堆積は、1型糖尿病の動物モデルにおいて観察された(Nagy,N.et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-3940)。このHAは、分解代謝性の、低分子量HAの断片からなる(LMW-HA)。HA過剰発現およびHA断片は特に炎症を駆動することが知られているため(Olsson,M.,et al.,PLoS Genet.2011;7(3):e1001332)、Yoshioka,Y.et al.,Arthritis Rheum.2013;65:1160-1170)、理論に束縛されることを望まずに、HAは1型糖尿病の病因を駆動することが可能である。
4-メチルウンベリフェロン(4-MU)は、HA合成の低分子阻害剤である(Nagy N.,et al.,Front.Immunol.2015;6:123)。4-MUは、インビトロおよびインビボの両方で複数の細胞株および組織型におけるHA産生を阻害する(Yoshioka Y.,et al.,Arthritis Rheum.2013;65(5):1160-1170、Bollyky P.L.,et al.Cell Mol.Immunol.2010、7(3):211-220、Nagy N.,et al.Circulation,2010;122(22):2313-2322)。
4-MUは、少なくとも2つの方法でHA産生を阻害すると考えられる。第1に、4-MUは、HA合成に関与する酵素であるUDP-グルクロニルトランスフェラーゼ(UGT)の競合基質として機能すると考えられる(Kakizaki,I.,et al.,J.Biol.Chem.2004;279(32):33281-9;PMID:15190064)。HAは、前駆体UDP-グルクロン酸(UDP-GlcUA)およびUDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)からのHAシンターゼHAS1、HAS2およびHAS3によって産生される。これらは、UDP残基の、N-アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸へのUDP-グルクロニルトランスフェラーゼ(UGT)を介した移転によって生成される。UDP-GlcUAおよびUDP-GlcNAcの利用可能性は、それによってHA合成を制御する(Vigetti,D.,et al.,J.Biol.Chem.2012;287(42):35544-35555)。4-MUの存在下で、それは、4位のそのヒドロキシル基を介して、UGTを介するグルクロン酸に共有結合する。その結果、UDP-グルクロン酸の濃度は、サイトゾルにおいて低下し、HA合成は減少する。これは、これをもって、細胞内の4MU UDP-GlcUA含有量を減少させる。4-MUは、HAS酵素UDP-GlcUAを枯渇させることによってHA合成を阻害し、それは、4-MUグルクロン酸抱合によって消費される。これまでのところ、第2のメカニズムがどのように正確に働くかは不明確であるが、4-MUは、HAS mRNA(Kultti,A.,et al.,Exp.Cell Res.2009;315(11):1914-1923)、ならびにUDPグルコースピロホスホリラーゼおよびデヒドロゲナーゼのmRNA(Saito,T.,et al.,Oncol.Lett.2013;5(3):1068-1074)の発現を減少させる。
4-MU治療は、腫瘍転移、線維症進行および自己免疫を含む、HAに関連する炎症性表現型の多くを予防する((Nagy N.,et al.,Front.Immunol.2015;6:123)においてレビューされた)。4-MUが重要な抗炎症細胞型であるFoxp3+調節性T細胞の誘導を促進すること、および4-MUが多発性硬化症、T1D、および関節リウマチを含むヒト自己免疫性疾患の複数の動物モデルにおいて線維症および自己免疫を予防することが以前に報告されている(Nagy N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-40、Kuipers H.F.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2016;113(5):1339-1344、Yoshioka Y.,et al.,Arthritis Rheum.2013;65(5):1160-1170、Nagy N.,et al.Front.Immunol.2015;6:123、Mueller A.M.,et al.,J.Biol.Chem.2014;289(33):22888-22899)。
自己免疫および炎症におけるHA合成に対する4-MUの影響を調査した研究は少ない。インビボ研究では、4-MU治療が、ブドウ球菌エンテロトキシン媒介性(McKalip,R.J.,et al.,Toxins(Basel).2013;5(10):1814-1826)およびリポ多糖媒介性急性肺損傷(McKallip,R.J.,et al.Inflammation,2015;38:1250-1259)のマウスモデルにおける肺傷害を予防し、炎症性サイトカインレベルを減少させたことが示された。4-MUはまた、腎虚血および再灌流を含む非感染性炎症に対する保護効果(Colombaro,V.et al.,Nephrol.Dial.Transplant.2013;28:2484-2493)、およびタバコの煙に二次的な気道炎症(Forteza,R.M.,et al.,J.Biol.Chem.2012;287(50):42288-42298)を有することも示されている。4-MUはまた、肥満糖尿病性マウスにおいて、アディポネクチンの産生の増加を介して、正常血糖を回復し、インスリン感受性を促進する(Sim,M.-O.,et al.,Chem.Biol.Interact.2014;216:916)。4-MUはまた、限られた数の自己免疫性疾患のマウスモデルにおいて疾患を改善することも報告されている。具体的には、4-MU治療は、コラーゲン誘導関節炎モデルにおいて有益であり、このモデルでは、それは疾患スコアを改善し、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の発現を減少させた(Yoshioka,Y.,et al.,2013;65(5):1160-1170,PMID:23335273)。
より最近、4-MU治療は、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおいて疾患を予防および治療することが実証され、このモデルでは、それは調節性T細胞の集団を増加させ、T細胞分化を病原性T-ヘルパー1T細胞サブセットから離し、非病原性T-ヘルパー2サブセットに向かって分極させた(Mueller,A.M.et al.,J.Biol.Chem.2014;289:22888-22899)。加えて、4-MU治療は、腫瘍衛星の数を減少させ(Piccioni,F.,et al.,Glycobiology.2012;22(3):400-410)、腫瘍における血管新生および細胞増殖を阻害した(Garcia-Vilas,J.A.,et al.,J.Agric.Food Chem.2013;61(17):4063-4071)。既存のインビトロデータおよびインビボデータは、ヒメクロモネンが、HA産生がんに対して指向される治療レジメンの構成要素として有用性を有し得ることを示唆する。4-MU治療により、抗原提示に必要な細胞-細胞相互作用が予防されたことが報告され(Bollyky,P.L.et al.,Cell.Mol.Immunol.2010;7:211-220)、その他は、T細胞増殖に対する阻害効果を記載している(McKallip,R.J.,et al.,Toxins(Basel)2013;5(10):1814-1826)。これらの効果は、T細胞増殖、活性化、および分化におけるHAおよびその受容体の確立された役割と一致する(Jiang,D.,et al.Physiol.Rev.2011;91:221-264、Guan,H.,et al.,J.Immunol.2009;183:172-180、Ponta,H.,et al.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2003;4:33-45)。また、4-MU治療が炎症のいくつかのモデルを悪化させ得る適応症もある。4-MU治療は、高脂肪食を供給されたApoE欠損マウスにおいて悪化したアテローム性動脈硬化と関連付けられた(Nagy,N.et al.Circulation,2010;122:2313-2322)。
4-MU治療がEAE(Mueller,A.M.,et al.,J.Biol.Chem.2014;289(33):22888-22899、Kuipers et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2016;113(5):1339-1344)、DORmOおよびNODマウスモデルの両方における自己免疫性糖尿病(Nagy,N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-3940;PMID:26368307、Kuipers,H.F.,et al.,Clin.Exp.Immunol.2016;185:372-381)の進行を限定することが報告されている。この治療効果は、病原性Th1応答から離れたT細胞応答の分極化の結果であるだけでなく、これらの細胞の、自己免疫性攻撃の部位への浸潤の減少の結果であることが示される。加えて、4-MU治療は、LMW-HAによるFoxp3+Treg誘導および機能の阻害を持ち上げるため、病原性応答のこの阻害は、Treg数の増加によって補助される(Kuipers,H.F.,et al.,Clin.Exp.Immunol.2016;185:372-381、Mueller,A.M.et al.,J.Biol.Chem.2014;289(33):22888-22899、Nagy,N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-3940;PMID:26368307)。さらに、MS病変における炎症促進環境を維持することに加えて、HA堆積物は、MSおよび他のミエリン変性障害における、CNSのミエリン形成細胞である、オリゴデンドロサイトの成熟を阻害することが示されており、したがって、ミエリンの修復を予防し、MS病因にさらに寄与すると考えられる(Back,S.A.,et al.,Nat.Med.2005;11(9):966-972、Sloane,J.A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2010;107(25):11555-11560、Preston,M.,et al.,Ann.Neurol.2013;73(2):266-280、Bugiani,M.,et al.Brain,2013;136(Pt1):209-322)。
理論によって拘束されることを望むものではないが、4-MU治療は、炎症組織におけるHA負荷を、抗炎症性HMWポリマーの優位性に回復させることができる。したがって、HA合成を阻害するために薬理学的ツールを同定することに大きな関心がある。
4-MUは、ヒトでの使用が承認された市販の薬物である。それは、「ヒメクロモネ」と呼ばれ、ヨーロッパおよびアジア諸国で胆道痙攣を予防するために処方されている(Takeda S,et al.,J.Pharmacobiodyn.1981;4(9):724-734)。これは、4-MUがヒトにおけるHA合成を阻害するために再利用され得ることを示唆する。実際、4-MUは、HA関連線維性肝疾患および自己免疫性胆道疾患の治療としてヒト臨床試験において調査中である(ClinicalTrials.gov Identifiers:NCT00225537,NCT02780752)。
残念ながら、4-MUは、胆管外での使用が制限されると考えられる不十分な薬物動態を有する。4-MUの全身経口バイオアベイラビリティは<3%であることが報告されており、主に、肝臓および小腸における広範な初回通過グルクロン酸抱合に起因する(Garrett E.R.,et al.,Biopharm.Drug Dispos.1993;14(1):13-39、Kultti A.L.,et al.,Exp.Cell.Res.2009;315(11):1914-1923)。全身循環に到達する任意の4-MUは、ヒトにおいて28分の半減期(マウスにおいて3分)で急速に代謝され、所与の用量の<1%が尿中で変化なく排泄される(Garrett E.R.,et al.,Biopharm.Drug Dispos.1993;14(1):13-39、Kultti A.,et al.,Exp.Cell.Res.2009;315(11):1914-1923)。したがって、4-メスリュンベリフェリルグルクロニド(4-MUG)の中央値血漿中濃度は、マウスモデルにおいて4-MUのそれよりも3,000倍以上高い(Nagy N.,et al.,Front.Immunol.2015;6:123)。類似の知見が健康なヒトボランティアにおいて報告されている(Garrett E.R.,et al.,Biopharm.Drug Dispos.1993;14(1):13-39)。不十分なバイオアベイラビリティおよび短い半減期にもかかわらず、4-MUの経口投与は、インビボでのHA合成を阻害し、このことは、追加の因子がその活性および持続的効果を増強し得ることを示唆する。
4-MUGは生物学的に活性であり、HA合成を直接阻害することが発見されている。これは、特にほとんどのグルクロニド代謝産物が生体活性ではないため、予測されなかったか、または自明ではなかった。本明細書に記載されるように、本発明者らは、4-MUGが、がん、自己免疫性、線維性および炎症性疾患を含む様々な文脈において、HA合成を阻害することができることを示している。
この概要は、以下の詳細な説明でさらに説明される、簡略化された形態での概念の選択を導入するために提供される。この概要は、特許請求の範囲の主題の重要な特徴を同定することを意図するものでもなく、特許請求の範囲の主題の範囲を決定する際の補助として使用されることを意図するものでもない。
一態様において、本開示は、(i)ヒアルロナン合成を阻害する化合物、および(ii)薬学的に許容される担体を含む、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療するための組成物を提供する。
一実施形態において、化合物はUDP-グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤である。
一実施形態において、化合物はUDP-グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である。
一実施形態において、化合物は4-メチルウンベリフェロン-グルクロニドである。
一実施形態において、化合物は、調節性T細胞応答を誘導するために有効である。
一実施形態において、化合物は、FoxP3+調節性T細胞を増加させるために有効である。
一実施形態において、自己免疫性疾患または障害は、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、CREST症候群、クローン病、線維筋痛症、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・ショーンライン紫斑病(HSP)、腎症、若年性関節炎、若年性糖尿病(1型糖尿病)、ループス、多発性硬化症、視神経脊髄炎、結節性多発動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆道炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎(巨細胞性動脈炎)、潰瘍性大腸炎(UC)、血管炎、および白斑からなる群から選択される。
一実施形態において、炎症性疾患または障害は、腎虚血再灌流損傷、喘息、肺高血圧症、2型糖尿病、関節炎、アテローム性動脈硬化症、創傷治癒、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、閉塞性細気管支炎症候群(BOS)、同種移植拒絶、移植片対宿主病、皮膚筋炎、炎症性腸疾患、および脳卒中からなる群から選択される。別の実施形態において、炎症性疾患または障害は、2型糖尿病、同種移植拒絶、または移植片対宿主病である。
一実施形態において、線維性疾患または障害は、原発性硬化性胆道炎、胆汁性肝硬変、胆道痙攣、肝硬変、肝線維症、腎線維症、皮膚線維症、腸線維症、および肺線維症からなる群から選択される。
一実施形態において、増殖性疾患または障害は、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、食道がん、乳がん、肝臓がん、骨がん、卵巣がん、腎臓がん、肛門がん、脳がん、胆道がん、黒色腫、インスリノーマ、子宮内膜がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、およびリンパ腫からなる群から選択される。別の実施形態において、増殖性疾患または障害は、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、または卵巣がんである。
一態様において、本開示は、必要とする哺乳動物対象における自己性免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患にしくは障害を治療するための方法を提供し、本方法は、哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、哺乳動物対象に投与することを含む。
一実施形態において、化合物はUDP-グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤である。
一実施形態において、化合物はUDP-グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である。
一実施形態において、化合物は4-メチルウンベリフェロン-グルクロニドである。
一実施形態において、化合物は、調節性T細胞応答を誘導するためにに有効である。
一実施形態において、化合物は、FoxP3+調節性T細胞を増加させるために有効である。
一実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。
一態様において、本開示は、増殖性疾患に罹患しているか、または増殖性疾患を発症するリスクがある哺乳動物対象について増殖性疾患を治療かつ/または増殖性疾患の進行を逆転するための方法を提供し、本方法は、哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、哺乳動物対象に投与することを含む。
一実施形態において、化合物は、UDPグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤またはUDPグルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である。
一実施形態において、化合物は、4メチルウンベリフェロン-グルクロニドである。
一実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。
一実施形態において、増殖性疾患は、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、卵巣がんである。
一態様において、本開示は、1型糖尿病または2型糖尿病を、必要とする哺乳動物対象について治療するための方法を提供し、本方法は、哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、哺乳動物対象に投与することを含む。
一実施形態において、化合物は、UDPグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤またはUDPグルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である。
一実施形態において、化合物は、4メチルウンベリフェロン-グルクロニドである。
一実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。
一実施形態において、化合物は、調節性T細胞応答を誘導するために有効である。
一実施形態において、化合物は、FoxP3+調節性T細胞を増加させるために有効である。
本発明の前述の態様および多くの付随する利点は、より容易に理解され、同じことは、付属の図面と併せて考慮するとき、以下の詳細な説明を参照することによってより良好に理解される。
本開示は、増殖性、自己性免疫性および炎症性疾患もしくは障害における細胞外マトリックス分子HAの重要な役割、ならびにHA合成を阻害する化合物、特に4-MUGの同定を記載する。本開示は、自己免疫を無効にするための新規の治療薬としての4-MUGの使用、ならびに自己性免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害、例えば、がん、1型糖尿病、2型糖尿病、および脳卒中を治療するための4-MUGの使用を記載する。
本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本開示の当業者にとっての意味と同じ意味を有する。特許請求された主題を記載するために本明細書および特許請求の範囲で使用される用語について明確性を提供するために、以下の定義は、提供される。
本明細書で使用される場合、「調節性T細胞」または「Treg」細胞という用語は、細胞表面マーカーCD4+およびCD25+を発現するT細胞を指し、それは、ウェスタンブロットおよび/またはFoxP3 mRNA転写産物によって測定されるようなFoxP3タンパク質を発現する。
本明細書で使用される場合、「抗原特異的調節性T細胞」または「抗原特異的Treg」という用語は、抗原の存在下で誘導され、細胞表面マーカーCD4+およびCD25+を発現するTreg細胞を指し、それは、ウェスタンブロットおよび/またはFoxP3 mRNA転写産物によって測定されるようなFoxP3タンパク質を発現する。
対象は、ヒトまたは非ヒト動物である、脊椎動物であり得、これらには典型的には、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含むが、これらに限定されない。より典型的には、対象は、哺乳動物、特定の実施形態において、ヒトである。
本明細書で使用される場合、「増殖性疾患」は、腫瘍疾患またはがん、および/または任意の転移であり、腫瘍または転移がどこに位置するかにかかわらず、より具体的には、乳房、結腸、肝臓、甲状腺、肺、胃、食道、胆嚢、腎臓、子宮、膀胱、甲状腺、脳、または骨のがんから、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、および卵巣がんを含む群から選択される腫瘍であり、より広義には、ヒアルロナンが増加することが言及されているがんの型である。
本明細書で使用される場合、「自己免疫性疾患」は、個体自身の組織に起因し、それに対して指向される疾患または障害である。自己免疫性疾患または障害の例としては、限定されないが、多発性硬化症、関節炎(リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎)、T細胞の浸潤および慢性炎症反応を伴う状態、自己免疫性心筋炎、天疱瘡、1型糖尿病(自己免疫性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病(IDDM)とも称される)、自己免疫性肺疾患等が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「炎症性疾患」は、限定されないが、糖尿病(2型糖尿病、1型糖尿病、尿崩症、真性糖尿病、成熟発症糖尿病、若年糖尿病、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、栄養不良関連糖尿病、ケトーシスプローン糖尿病またはケトーシス耐性糖尿病など)、脳卒中、腎症(糸球体腎炎または急性/慢性腎不全など)、肥満(遺伝性肥満、食事肥満、ホルモン関連肥満または投薬関連肥満など)、難聴(外耳炎または急性中耳炎に起因するものなど)、線維症関連疾患(肺間質線維症、腎線維症、嚢胞性線維症、肝線維症、創傷性/慢性腎不全損傷または焼灼熱など)、肥満症(リウマチ、関節炎、アレルギー性関節炎など)、アレルギー性呼吸器炎関連疾患(肺間質線維症、腎線維症、嚢胞性線維症、肝線維症、創傷治癒または熱傷治癒であって、ここで熱傷は、第1、第2、または第3度の熱傷、および/または熱、化学、または電気性熱傷であるものなど)、関節炎(関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、痛風など)、アレルギー、アレルギー性鼻炎、急性呼吸困難症候群、喘息、気管支炎、炎症性腸疾患(過敏性腸症候群、粘液性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、胃炎、食道炎、膵炎または腹膜炎など)、または自己免疫性疾患(強皮症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、移植拒絶反応、エンドトキシンショック、敗血症、乾癬、湿疹、皮膚炎、もしくは多発性硬化症など)を含む炎症状態から生じる疾患または障害である。
本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」という用語は、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害に関連する少なくとも1つの症状を効果的に予防、抑制、または排除するために、本開示による化合物を投与することを意味する。少なくとも1つの症状を予防することは、臨床疾患に関連する症状の発症前に、対象に治療を施用することを伴う。少なくとも1つの症状を抑制することは、疾患の臨床的外観の後に、対象に治療を施用することを伴う。
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という表現は、例えば、増殖性、自己免疫性、または炎症性疾患または障害の予防、改善、または予防等の所望の治療結果を達成するために有効な本開示の化合物の量を指す。本開示の化合物は、治療有効量の化合物を、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物として投与することができる。本開示の文脈において、「治療有効量」は、この特定の場合、自己免疫性疾患または障害、特に多発性硬化症を治療する所望の効果を達成するために必要な、同定されたHAポリマーの合成、発現、および/または活性を阻害する化合物の量として理解される。一般に、投与されるべき本開示による化合物の治療有効量は、他の要因の中でもとりわけ、治療されるべき個体、個体が罹患する疾患の重症度、選択された剤形等に依存する。このため、本開示で言及される用量は、当業者のガイドラインとしてのみ考慮されなければならず、当業者は、前述の変数に従って用量を調整しなければならない。
化合物の治療有効量は、概して、最大許容投薬量までの範囲であるが、濃度は重要ではなく、広く変化し得る。主治医によって用いられる正確な量は、もちろん、化合物、投与経路、患者の体調および他の要因に応じて変化する。1日投薬量は、単回用量として投与することができるか、または投与のための複数の用量に分けることができる。
実際に投与される化合物の量は、治療有効量であり、この用語は、実質的な有益な効果を生じるために必要な量を示すために本明細書で使用される。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量応答曲線から推定することができる。動物モデルはまた、典型的には、所望の投薬量範囲および投与経路を決定するために使用される。次いで、かかる情報を使用して、ヒトまたは他の哺乳動物における投与のための有用な用量および経路を決定することができる。有効用量の決定は、当業者の能力の範囲内に十分にある。したがって、実際に投与される量は、治療が適用される個体に依存し、好ましくは、所望の効果が有意な副作用なしに達成されるように最適化された量である。
本開示の化合物の治療有効性および可能な毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる(例えば、集団の50%において治療的に有効な用量であるED50、および集団の50%に対する致死用量であるLD50)。治療効果と毒性効果との間の用量比は、治療指標であり、それは、LD50対ED50の比として表すことができる。大きな治療指標を示す修飾治療薬物化合物は、本開示の方法の実施に特に好適である。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトまたは他の哺乳動物で使用するための投薬量の範囲の製剤化することに使用することができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、典型的には、用いられる剤形、患者の感受性、および投与経路に依存するこの範囲内で変化する。したがって、最適な量は、投与方法によって異なり、一般に、同じまたは同様の形態で投与される従来の医薬品の量に従う。それにもかかわらず、本開示による化合物は、0.1μg~10,000mg/日、典型的には100~1,500mg/日を含む典型的な1日の総量で、1日1回以上、例えば、1日1、2、3、または4回投与することができる。
本開示の化合物は、単独で、または1つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与することができる。各場合における適切な量は、特定の剤によって異なり、当業者に容易に既知であるか、または日常的な実験によって容易に決定可能である。
本開示の化合物の投与は、任意の有効な経路、例えば、非経口、局所、または経口経路によって達成される。投与方法としては、吸入、口腔内、髄内、静脈内、鼻腔内、直腸内、眼内、腹腔内、動脈内、関節内、嚢内、頸椎内、頭蓋内、管内、硬膜内、病変内、筋肉内、腰部内、壁内、眼内、術中、頭頂内、腹腔内、胸膜内、肺内、脊髄内、胸腔内、気管内、鼓膜内、子宮内、血管内、および心室内投与、ならびに他の従来の手段が挙げられる。抗腫瘍活性を有する本開示の化合物は、腫瘍内、腫瘍の近傍、腫瘍に血液を供給する血管内、または腫瘍内にもしくは腫瘍から排出されるリンパ節もしくはリンパ管内に直接注入することができる。
化合物の肺送達のための当該技術分野で既知の好適なエアロゾル推進剤を使用して、本開示のエマルション、マイクロエマルション、およびミセル製剤を霧化することができる。
本開示の化合物を、対象への化合物の投与を容易にする賦形剤および他の化合物を含む、好適な薬学的に許容される担体をさらに含む組成物に製剤化することができる。製剤化および投与のための技法のさらなる詳細は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」(Maack Publishing Co.,Easton,PA)の最新版に見出すことができる。
経口投与のための組成物を、経口投与に好適な投薬量で、当該技術分野で周知の薬学的に許容される担体を使用して製剤化することができる。かかる担体は、本開示の化合物を含有する組成物を、対象による摂取に好適な錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液として製剤化することを可能にする。経口使用のための組成物は、必要に応じて好適な追加の化合物を添加した後、例えば、固体賦形剤と組み合わせて製剤化し、任意選択で、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。好適な賦形剤としては、炭水化物またはタンパク質充填剤が挙げられる。これらには、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、ならびにアラビアガムおよびトラガカントガムを含むガム、ならびにゼラチンおよびコラーゲン等のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を、添加することができる。
糖衣錠コアには、アラビア酸ガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物も含むことができる、濃縮糖溶液等の好適なコーティングが提供される。染料または顔料を、生成物同定のために、または活性化合物の量(すなわち、投薬量)を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
経口投与のための化合物を、例えば、ゼラチンから作製されたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンから作製された軟質密封カプセル、ならびにグリセロールまたはソルビトール等のコーティングとして製剤化することができる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意選択で安定剤と混合された化合物を含有することができる。ソフトカプセルでは、共有結合体を、安定剤を有するか否かにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール等の好適な液体中に溶解または懸濁させることができる。
局所投与または経鼻投与のために、浸透させる特定のバリアに適切な浸透剤が、典型的には製剤に使用される。これらの例は、2-ピロリドン、N-メチル-2-ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾンである。製剤を美容的に許容可能にするために、追加の剤をさらに含むことができる。これらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、香料、防腐剤、安定剤、および表面活性剤である。当該技術分野で知られているもの等の角化分解剤も挙げられ得る。例は、サリチル酸および硫黄である。局所投与のために、組成物は、化合物の全身送達のための経皮軟膏またはパッチの形態であり得、従来の様式で調製することができる(例えば、Barry,Dermatological Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences--Dekker);Harry’s Cosmeticology(Leonard Hill Booksを参照されたい)。
直腸投与のために、組成物を、座薬または保持浣腸の形態で投与することができる。かかる組成物は、化合物を、通常の温度では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸内で溶解して薬物を放出する好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。好適な賦形剤には、ココアバターおよびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
これらの様々な型の添加剤の各々の量は、同じ型の投与のために設計された他の既知の製剤と同じである最適な量であって、当業者には容易に明白である。
本開示の化合物を含有する組成物は、当該技術分野で既知のものと同様の様式で製造することができる(例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥プロセスによって)。組成物を、従来の手段(例えば、コーティング)によって、適切な放出特性、持続放出、または標的化放出を提供するように修正することもできる。上記に言及されるように、一実施形態において、化合物はエマルジョンとして製剤化される。
化合物を含有する組成物は、塩として提供され得、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、およびコハク酸を含むが、これらに限定されない多くの酸と共に形成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性または他のプロトン性溶媒中で可溶性である傾向にある。
4-MUは、ヒト臨床試験を含むHA合成の阻害剤として再利用されている承認された薬物であるが、迅速かつ効率的なグルクロン酸抱合は、その全身的有用性を制限すると考えられる。以下により詳細に記載されるように、4-MU、4-MUGの主要代謝産物は、2つの方式でHA合成阻害に積極的に寄与する。第1に、4-MUGは、血清中で4-MUに加水分解され、それによって薬物の有効なバイオアベイラビリティを大幅に増加させる。4-MUまたは4-MUGのいずれかを供給されたマウスは、血清、肝臓および膵臓において4-MUおよび4-MUGの等価な比を有し、このことは、4-MUと4-MUGとの間には組織中での平衡があることを示す。第2に、4-MUGの非加水分解性バージョンもまた、HA合成を阻害することがさらに示され、このことは、4-MUGが、4-MUへの変換とは無関係に、それ自体の直接的な生物活性を有することを示す。これらの知見と一致して、マウスへの4-MUGの経口投与は、HA合成を阻害し、FoxP3+調節性T細胞拡張を促進し、インビボで自己免疫性糖尿病を予防する。本開示は、4-MUGが4-MUのバイオアベイラビリティに寄与し、定常状態で4-MUの有効な組織薬物レベルが以前に考えられたよりも実質的に高いことを示す。
がん、線維症、糖尿病、炎症、および他の設定におけるHAの重要な役割を考慮すると、HA合成の阻害に大きな関心がある。例えば、4-MUGの標的であるHAを、脳卒中において、連結するデータが存在する(Tang,S.C.,J.Neuroinflammation 2014;11:101;Krupinski J,J.Biomark Insights 2008;12(2):361-367)。
これまでに、HA合成を阻害することが知られている唯一の分子は4-MUである。以下でより詳細に記載されるように、本発明者らは、4-MUの代謝産物である4-メチルウンベリフェロン-グルコロニド(glucoronide)(4-MUG)が、HA合成を直接阻害することができることを発見した。この活性は、単に4-MUへの変換の結果ではなく、4-MUGの非加水分解性バージョンを使用して実証される。さらに、データは、4-MUGが4-MUの濃度のフラクションでHA合成を阻害することを示す。親分子とは独立した生物学的活性を有するグルコロニドが非常に少ないことを考えると、これらの知見は予測されない。さらに、治療および実験用途のためのHAの阻害への関心が非常に高いことを考慮すると、これらの知見は、HAが糖尿病、がん、脳卒中、炎症、線維症、および自己免疫を含む疾患病因に寄与する様々な適応症において実質的な潜在的有用性を有する。
4-MUGは、4-MUの活性代謝産物であり、HA合成を阻害する
4-MUGは、4-MUの活性代謝産物であり、HA合成を阻害する。4-MUGは、4-MUの主要代謝産物である。未公開のデータは、4-MUGおよび新たに記載された4-MUGの誘導体が実際に薬理学的に活性であることを示す。実際、4-MUGは、親薬物である4-MUとちょうど同様に、ヒト細胞株によるHA合成をよく阻害する。4-MUGのいくつかの誘導体も同様に、薬理学的に活性である。4-MUGの全ての誘導体がHA合成に対して活性であるわけではない。これは、HA合成を阻害するための剤として4-MUGまたは4-MUG誘導体を送達することが可能であり得ることを示唆する、刺激的で以前に知られていない知見である。
4-MUGは、4-MUの活性代謝産物であり、HA合成を阻害する。4-MUGは、4-MUの主要代謝産物である。未公開のデータは、4-MUGおよび新たに記載された4-MUGの誘導体が実際に薬理学的に活性であることを示す。実際、4-MUGは、親薬物である4-MUとちょうど同様に、ヒト細胞株によるHA合成をよく阻害する。4-MUGのいくつかの誘導体も同様に、薬理学的に活性である。4-MUGの全ての誘導体がHA合成に対して活性であるわけではない。これは、HA合成を阻害するための剤として4-MUGまたは4-MUG誘導体を送達することが可能であり得ることを示唆する、刺激的で以前に知られていない知見である。
4-MUGがHA合成をどのように阻害するかは不明確である。典型的には、グルコロニド化(glucoronidation)は、ほとんどの薬物の排泄およびクリアランスを促進する代謝ステップである。実際、グルコロニド化(glucoronidated)化合物は多くの場合、より水溶性であるため、それらは典型的には、細胞ならびにより親油性化合物に入らない。したがって、4-MUGまたはその誘導体がHA合成を阻害することは明らかでも直感的でもない。
4-MUGは、インビトロでHA合成を阻害する
複数のUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)による肝臓および腸における4-MUの効率的なグルクロン酸抱合の結果、経口4-MUチョウにおけるマウスに全身的に存在する主な形態は、以前に報告されているように、4-MUGである(Mulder GJ,et al.Biochem Pharmacol.1985;34(8):1325-1329)。例えば、図1Aは、4-MUおよびその一次代謝産物である、4-MUGおよび4-MUSの分子構造を図示する。図1Bは、HPLCを介して測定された、4-MUチョウを2週間供給した動物の血漿中の4-MUおよびその代謝産物の濃度を示す。1群あたりN=3匹の動物である。図1Cは、HPLCを介して測定された、4-MUを2週間供給したマウスの血清中の4-MUおよび4-MUGの異なる濃度を示す。1群あたりN=3匹の動物である。図1Cに示すように、4-MUGの中央値血清濃度は、親化合物4-MUよりも約150倍高かった。
複数のUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)による肝臓および腸における4-MUの効率的なグルクロン酸抱合の結果、経口4-MUチョウにおけるマウスに全身的に存在する主な形態は、以前に報告されているように、4-MUGである(Mulder GJ,et al.Biochem Pharmacol.1985;34(8):1325-1329)。例えば、図1Aは、4-MUおよびその一次代謝産物である、4-MUGおよび4-MUSの分子構造を図示する。図1Bは、HPLCを介して測定された、4-MUチョウを2週間供給した動物の血漿中の4-MUおよびその代謝産物の濃度を示す。1群あたりN=3匹の動物である。図1Cは、HPLCを介して測定された、4-MUを2週間供給したマウスの血清中の4-MUおよび4-MUGの異なる濃度を示す。1群あたりN=3匹の動物である。図1Cに示すように、4-MUGの中央値血清濃度は、親化合物4-MUよりも約150倍高かった。
代謝産物の活性は薬物動態決定における重要な変数であるため、HA合成阻害における主な4-MU代謝産物4-MUGの役割を調査した。これを試験するために、豊富なHAを産生することが知られている細胞株であるマウス黒色腫細胞(B16F10)を使用した。薬物曝露48時間後、4-MUおよび4-MUG処置B16F10細胞の両方におけるHA合成の濃度依存的阻害が観察された。図4Dおよび4Eは、4-MU(図1D)または4-MUG(図1E)中で48時間培養したB16F10細胞によるHA産生を示す。図1Fは、対照(左)、4-MU(中)または4-MUG(右)としてDMSO中で培養したB16F10細胞におけるHA染色の代表的な画像を示す。データは、平均値±SEMを表し、対のないt検定による*p<0.05である。原発性リンパ球にも同様の知見が見られた。HA結合タンパク質(HABP)を使用するこれらの細胞の蛍光染色は、図1Fに示すように、4-MUおよび4-MUGでの処置が両方ともHAを減少させたことを示した。これらの結果を総合すると、4-MUまたは4-MUGのいずれかによる処置がHA合成を阻害することが実証される。
4-MUGは細胞内で4-MUに加水分解される
HA合成の阻害につながる4-MUの確立された活性を考慮すると、4-MUGの生物活性は、その4-MUへの加水分解に起因し得ることは可能であるようであった。4-MUは蛍光性であり、一方、4-MUGは蛍光性でないことは一般に知られている。特に、4-MUは、水中で380nmの励起波長および454nmの発光波長を有する。
HA合成の阻害につながる4-MUの確立された活性を考慮すると、4-MUGの生物活性は、その4-MUへの加水分解に起因し得ることは可能であるようであった。4-MUは蛍光性であり、一方、4-MUGは蛍光性でないことは一般に知られている。特に、4-MUは、水中で380nmの励起波長および454nmの発光波長を有する。
図2Aは、200μlのPBSおよび10%のFCSを充填した96ウェルプレートのウェルにおける蛍光可視化を示し、いくつかのウェルでは4-MU(中央)および4-MUG(右)が添加され、対照ウェルは未処置のままであった(左)。図2Bは、4-MUおよび4-MUGを別々にDMEMに添加した後の、平均蛍光強度(MFI)として測定されるような経時的な蛍光シグナルを示す。4-MUGの蛍光値を、4-MU蛍光に対して正規化した。図2Bを参照すると、4-MUまたは4-MUGを10%のFCSを有するPBSに添加し、蛍光プレートリーダーを使用して蛍光シグナルの増加を、間隔を空けて最大72時間まで監視した。予測通り、4-MUはベースラインで蛍光シグナルを有した。一方、図2Bに示すように、4-MUGの蛍光は、30時間前後に開始してのみ検出されることができた。図2Cは、フローサイトメトリーを使用して検査された4-MUおよび4-MUGと共に24、48、または72時間インキュベートしたB16F10細胞由来の4-MUおよび4-MUGの蛍光を示す。図2Cを参照すると、図2Cに示すように、4-MUおよび4-MUGをB16F10細胞に添加し、4-MUGで処置した細胞が48~72時間後に蛍光になることが見出された。図2Dは、フローサイトメトリーを使用して透過処置前および透過処置後に検査した、4-MUおよび4-MUG処置したB16F10細胞からの4-MUおよび4-MUGシグナルの蛍光を示す。図2Dに示すように、これらの細胞の蛍光は透過処置時に失われ、このことは、蛍光4-MUのほとんどが細胞内であることを示唆する。
総合すると、これらのデータは、4-MUGが細胞によって取り込まれ、再び4-MUに変換され、HA合成阻害に対するその効果をもたらすことを示す。しかしながら、4-MUGから4-MUへの変換も培地単独中にインビトロで行われるため、細胞外変換もまた生じることが明らかである。
4-MUはリンパ球によって取り込まれる
4-MUの蛍光を4-MU取り込みのバイオマーカーとして使用して、4-MUおよび4-MUGが、インビボでの循環細胞および組織によって取り込まれるか否かを決定するために、少なくとも14日間経口4-MU治療をされたマウスの脾臓組織および血液から単離された細胞の4-MUシグナルを、評価した。Pacific Blueチャネルを使用して、4-MUシグナルは、4-MUで治療されたマウス由来の脾細胞および循環白血球において観察され、このことは、4-MUがインビボでリンパ組織内の細胞によって取り込まれること、ならびに細胞外マトリックスへの結合を示す(データ示さず)。
4-MUの蛍光を4-MU取り込みのバイオマーカーとして使用して、4-MUおよび4-MUGが、インビボでの循環細胞および組織によって取り込まれるか否かを決定するために、少なくとも14日間経口4-MU治療をされたマウスの脾臓組織および血液から単離された細胞の4-MUシグナルを、評価した。Pacific Blueチャネルを使用して、4-MUシグナルは、4-MUで治療されたマウス由来の脾細胞および循環白血球において観察され、このことは、4-MUがインビボでリンパ組織内の細胞によって取り込まれること、ならびに細胞外マトリックスへの結合を示す(データ示さず)。
次に、異なる白血球サブセットによる4-MUの取り込みを検査した。このために、マウスに4-MUを供給し、4-MU治療の開始後0、2、7、および14日の間隔で、代表的な動物由来の血液白血球において4-MUシグナルを検査した。図3は、治療開始前、および治療開始2、7、および14日後に、Pacific Blueチャネルで測定されたように、フローサイトメトリーによって分析された血液中の異なる細胞サブセット上での、4-MUおよび4-MUシグナルで治療したマウスの結果を示す。太字ヒストグラムは、4-MU治療マウスにおけるシグナルを示し、陰影付きヒストグラムは、未治療マウスにおけるバックグラウンドPacific Blueシグナルを示す。細胞表面マーカーを染色して、CD4+T細胞(CD3+CD4+)、CD8+T細胞(CD3+CD8+)、B細胞(I-A/I-E+B220+)樹状細胞(DC;I-A/I-E+CD11c+)、マクロファージ(Mφ;I-A/I-E+CD11c-)、好中球(Ly6G/C+CD14+)、および単球(Ly6G/C-CD14+)を含む複数の細胞型による4-MU取り込みを検査した。
再び図3を参照すると、蛍光4-MUシグナルは、48時間治療したマウスでは見られなかったが、1週間の治療後に可視化され始めた。この結果は、1~2週間の経口4-MU治療がHA合成への効果が明らかになるために必要であるという以前の報告と一致する(Kuipers HF,et al.,Clin Exp Immunol.2016 Sep;185(3):372-81)。4-MU治療後の7日目までに、4-MUシグナルは、これらの細胞集団の全てにおいてわずかに可視であり、14日目までに、全てのシグナルが様々な程度で決定的に増加する。これらのデータは、複数の白血球集団が4-MUを取り込むこと、およびこれが発生するために1~2週間の期間が必要であることを示す。総合すると、これらのデータは、4-MUが常在細胞によって取り込まれることを実証する。
4-MUまたは4-MUGのインビボ投与は、4-MUの4-MUGに対する同じ血清比につながる
液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)は、4-MUまたは4-MUGが組織内に存在することを示し、4-MUGと4-MUとの間の相互変換を特徴付ける。図4A~4Jは、4-MUおよび4-MUG治療マウス由来の血清および臓器中の4-MUおよび4-MUG濃度を示す。図4を参照すると、血清中に存在する4-MUと4-MUGとの間の得られた比は、どの薬物が投与されたかにかかわらず1:72のモル比に達し(図4B)、このことは、2つの化合物が共に平衡に存在することを示している。同じ量の各薬物が、同じ比によって示されるように生体利用可能であったが、4-MUおよび4-MUGのレベルは、4-MUG治療マウスにおいて、4-MU治療マウスと比較してより低く(図4A)、このことは、4-MUGがより高い効率で吸収されたことを示唆している。4-MU治療動物において、膵臓組織におけるよりも高いレベルの4-MUが血清中で見られた(1005ng/mL対64.8ng/mL)(図4Aおよび4C)。しかしながら、4-MUG(10200ng/mL対2.5ng/mL)を供給したマウスの血清におけるよりも実質的に高いレベルの4-MUが、膵臓組織において見られた(図4Aおよび4C)。血清中の4-MU:4-MUGの比(4-MU治療では1:73、4-MUG治療では1:72)(図4B)は、膵臓中の4-MU:4-MUGの比(4-MU治療では1:0.27、4-MUG治療では1:0.45)よりもはるかに小さく、このことは、4-MUが4-MUGよりも組織内で効率的に結合されたことを示唆している。さらに、脂肪(図4Eおよび4F)、肝臓(図4Gおよび4H)、ならびに筋肉(図4Iおよび4J)において、4-MUおよび4-MUG濃度を調査した。同様の4-MU:4-MUG比が脂肪および筋肉において観察され、ここで、4-MU治療した動物は、4-MUG治療と比較して有意により高い量の4-MUGを有した(図4Fおよび4J)。興味深いことに、血清と同様に肝臓は、治療が何であれ4-MUと4-MUGとの間の平衡を示した(図4Gおよび4H)。肝臓は、治療に関係なく4-MUGと比較して、4-MUの高濃度を有する(図4H)。
液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)は、4-MUまたは4-MUGが組織内に存在することを示し、4-MUGと4-MUとの間の相互変換を特徴付ける。図4A~4Jは、4-MUおよび4-MUG治療マウス由来の血清および臓器中の4-MUおよび4-MUG濃度を示す。図4を参照すると、血清中に存在する4-MUと4-MUGとの間の得られた比は、どの薬物が投与されたかにかかわらず1:72のモル比に達し(図4B)、このことは、2つの化合物が共に平衡に存在することを示している。同じ量の各薬物が、同じ比によって示されるように生体利用可能であったが、4-MUおよび4-MUGのレベルは、4-MUG治療マウスにおいて、4-MU治療マウスと比較してより低く(図4A)、このことは、4-MUGがより高い効率で吸収されたことを示唆している。4-MU治療動物において、膵臓組織におけるよりも高いレベルの4-MUが血清中で見られた(1005ng/mL対64.8ng/mL)(図4Aおよび4C)。しかしながら、4-MUG(10200ng/mL対2.5ng/mL)を供給したマウスの血清におけるよりも実質的に高いレベルの4-MUが、膵臓組織において見られた(図4Aおよび4C)。血清中の4-MU:4-MUGの比(4-MU治療では1:73、4-MUG治療では1:72)(図4B)は、膵臓中の4-MU:4-MUGの比(4-MU治療では1:0.27、4-MUG治療では1:0.45)よりもはるかに小さく、このことは、4-MUが4-MUGよりも組織内で効率的に結合されたことを示唆している。さらに、脂肪(図4Eおよび4F)、肝臓(図4Gおよび4H)、ならびに筋肉(図4Iおよび4J)において、4-MUおよび4-MUG濃度を調査した。同様の4-MU:4-MUG比が脂肪および筋肉において観察され、ここで、4-MU治療した動物は、4-MUG治療と比較して有意により高い量の4-MUGを有した(図4Fおよび4J)。興味深いことに、血清と同様に肝臓は、治療が何であれ4-MUと4-MUGとの間の平衡を示した(図4Gおよび4H)。肝臓は、治療に関係なく4-MUGと比較して、4-MUの高濃度を有する(図4H)。
総合すると、これらのデータは、4-MUGがインビボで4-MUに変換され、4-MUがインビボである範囲の組織および細胞型によって取り込まれ、組織構造が4-MUのリザーバーとして機能することを示す。
非加水分解性バージョンの4-MUGは、HA合成を阻害する
4-MUGが4-MUへの変換とは無関係に生物活性を有するか否かを試験するために、4-MUGの非加水分解性バージョンを生成した。図5Aは、4-MU、4-MUG、および4-MUGの非加水分解性バージョンの構造を図示する。非蛍光であるこの剤は、培養物中で蛍光4-MUに変換されなかった。
4-MUGが4-MUへの変換とは無関係に生物活性を有するか否かを試験するために、4-MUGの非加水分解性バージョンを生成した。図5Aは、4-MU、4-MUG、および4-MUGの非加水分解性バージョンの構造を図示する。非蛍光であるこの剤は、培養物中で蛍光4-MUに変換されなかった。
図5Bは、4-MU、4-MUGまたは非加水分解性4-MUG中で48時間培養したB16F10細胞によるHA産生を示す。図5Cは、4-MU、4-MUG、または非加水分解性4-MUG中で48時間培養したHAS3合成と併せてHAを過剰発現するように操作されたCHO-HAS3細胞によるHA産生を示す。非加水分解性4-MUGは、B16細胞(図5B)、ならびにHAS3を4-MUまたは従来の4-MUGと同等の用量で過剰発現するように操作されたCHO細胞(図5C)によるHA合成を予防する。総合すると、これらのデータは、4-MUGが4-MUへの変換とは無関係にHA合成を阻害することを実証する。
4-MUGは、T1Dマウスにおいて糖尿病進行を阻害し、Foxp3発現を誘導する
4-MUG投与がインビボでのHA合成を阻害したか否かを評価するために、4-MUについて先に示されたように(Nagy N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-3940)、この薬物を、T1Dの動物モデルである、DO11に投与した。10xRIPmOVA(DORmO)マウスを使用した。DORmOマウスは、卵巣に特異的なT細胞受容体導入遺伝子(自己反応性CD4+T細胞をエミュレートする)を担持し、一方、同時に膵臓ベータ細胞上のインスリン遺伝子プロモーターと併せて卵巣を発現する(自己抗原をエミュレートする)。
4-MUG投与がインビボでのHA合成を阻害したか否かを評価するために、4-MUについて先に示されたように(Nagy N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-3940)、この薬物を、T1Dの動物モデルである、DO11に投与した。10xRIPmOVA(DORmO)マウスを使用した。DORmOマウスは、卵巣に特異的なT細胞受容体導入遺伝子(自己反応性CD4+T細胞をエミュレートする)を担持し、一方、同時に膵臓ベータ細胞上のインスリン遺伝子プロモーターと併せて卵巣を発現する(自己抗原をエミュレートする)。
図6Aは、12週齢で、未治療のDORmOマウス(対照)、4-MUを供給したDORmOマウス、および4-MUGを供給したDORmOマウスからの膵臓組織の代表的なHA染色を示す。図6Aを参照すると、HAについてDORmO膵島を染色することは、未治療のDORmOマウスと比較した、4-MUおよび4-MUG治療後のHA蓄積の減少を実証する。図6Bは、未治療のDORmOマウス、ならびに5週齢から開始し、4-MUおよび4-MUGを供給し、4-MUおよび4-MUGにおいて15週間維持したDORmOマウスの血糖を示す。図6Bに示すように、これと一致して、4-MUG治療は、未治療のDORmOマウスと比較して、経時的に血糖によって測定されたように、T1Dの開始を遅らせた。正常血糖(normo-glycemic)の血糖と一致して、インスリン陽性細胞は、4-MU治療下で膵島に保存された。図6Cは、未治療(対照)および4-MU治療DORmOマウス由来の膵島組織の代表的なFoxP3染色を示す。元の倍率は×40である。図6Cを参照すると、Foxp3調節性T細胞の増加が、非糖尿病性4-MU治療DORmOマウスの膵島において観察された。図6D~6Gは、フローサイトメトリーによって分析されるように、4-MU(0.5mg i.p.)または4-MUG(1mg i.p.)で14日間毎日治療されたマウスから単離された脾細胞中のCD3+細胞、CD3+細胞中のCD4+、およびCD3+/CD4+細胞中のFoxp3+の数を示す。ウェルチ補正による対のないt検定による*p<0.05である。図6D~6Gを参照すると、野生型対照マウスの4-MUおよび4-MUG治療の両方は、Foxp3+調節性T細胞の増加、ならびにFoxp3の発現の増加をもたらし(図6Fおよび6G)、CD4+およびCD3+T細胞数は、いずれの治療によっても影響を受けなかった(図6Dおよび6E)。これらの観察は、4-MUが複数の動物モデルにおいてFoxp3+Tregを誘導するという最近の報告と一致する。
上記に示すように、4-MUGは、4-MUへの変換を介してインビトロおよびインビボの両方の4-MUの生体活性に寄与する。実際、4-MUおよび4-MUGは、インビトロでがん細胞株によるHA合成を阻害する際に、ある範囲の濃度にわたってほぼ等しく有効である。両方とも、T1Dのマウスモデルにおける自己免疫の治療において同様に等しく有効である。
4-MUの薬物動態の考察は、4-MUGの存在を反映するように改訂されなければならない。動物研究は、4-MUGが親分子4-MUについて見られるものよりも300倍高い濃度で存在することを示した。これと一致して、ヒトにおいて、4-MUGへのグルクロン酸抱合は4-MU代謝の90%超を占め、4-MUの単回静脈内用量の93%は、尿中の4-MUG代謝産物として排除される(Garrett E.R.,et al.,Biopharm.Drug Dispos.1993;14(1):13-39、Mulder G.J.,et al.Biochem.Pharmacol.1985;34(8):1325-1329)。
インビトロおよびインビボの両方で4-MUを投与する場合と同じ効果を達成するために4-MUGを投与することが可能である。本明細書に記載されるように、T1DのDORmOマウスモデルにおけるインビボ実験は、4-MU治療と4-MUG治療との間の膵島におけるHAの減少または血糖の減少に目に見える差がなく、両方とも糖尿病進行を停止させるために十分であることを示す。これは、4-MUGが自己免疫性疾患の治療において代替的な治療オプションを提供することを示す。実際、4-MUGは、4-MUGが水溶性であり、例えば飲料水中で投与することができるため、薬物として4-MUを超える多くの利点を有する。
4-MUの他の代謝産物も同様に生体活性である可能性が残る。しかしながら、これらの代謝産物は、実質的にHAに対して全体的効果に寄与しそうでないそのような低レベル(薬物レベルの<1%)で存在する(Kakizaki I.,et al.,J.Biol.Chem.2004;279(32):33281-33289))。
本明細書にさらに記載されるように、4-MUの組織結合を、2光子顕微鏡を使用してインビボで観察することができる。特に、4-MUは、組織マトリックス内のコラーゲンが豊富な構造に結合し、リンパ節、膵臓、脂肪組織、肝臓、および筋肉内の様々な細胞によってまた取り込まれる。したがって、蛍光薬物の組織結合を審尋するための新規なプラットフォームとして2光子生体内顕微鏡を使用することができ、このアプローチを化合物活性または組織局在化の他の読み出しと組み合わせることが可能であり得る。
細胞上でFACSを介して観察される蛍光シグナルは、透過処置時に実質的に縮減し、このことは、薬物の少なくとも一部が細胞内に存在することを示す。組織において、蛍光シグナルは、コラーゲナーゼまたはヒアルロニダーゼでの処置によって失われ得、このことは、4-MUがこれらの分子に結合することができることを示す。これらの知見は、LC-MS/MSによって裏付けられ、このことは、組織が実際に4-MUならびに4-MUGを含有することを示す。薬物が成長しているHAポリマーに組み込まれる可能性があるが、HA合成の既知のメカニズムを考慮すると、この可能性は低いと思われる。HAは通常、HAの前駆体としてN-アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸のUDP糖を使用する3つのHAシンターゼによって合成される。4-MUの存在下で、HA合成は、UDPグルクロン酸の供給を低下させることによって阻害される。4-MUは、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)の優れた基質であり、その結果、UGTは、膨大な量のUDP-グルクロン酸を消費し、グルクロン酸を4-MUに移転させ、それによって、HA合成の阻害につながる細胞前駆体プールを枯渇させる。したがって、4-MUがその合成中にHAに組み込まれる可能性は低い。
総合すると、これらの研究は、4-MUが、その代謝産物4-MUGの寄与のために、以前に信じられたよりも生体利用可能であることを示す。この洞察は、4-MUの実験的および治療的状況を変化させ、がん、自己免疫、ならびに他の疾患および障害等の増殖性疾患におけるHA合成を標的化する潜在的な治療戦略の開発を促進することができる。特に、4-MUGは、それ自体で治療可能性を有する。
実施例1
HA合成阻害に対する4-MUおよびその代謝産物4-MUGの効果を検査するために、以下の実験を行った。
HA合成阻害に対する4-MUおよびその代謝産物4-MUGの効果を検査するために、以下の実験を行った。
マウス
全ての動物を、Stanford University Medical School(Stanford,CA)の動物施設内で、食物および水への自由アクセスを有する、特定の病原体がいない条件下で繁殖および維持した。B6 db/db LeptR-/-マウスを、Jackson Laboratories(JAX)ならびにDO11.10トランスジェニックマウスから購入した。DO11.10マウスを、RIPmOvaを発現するBalb/cマウスで繁殖させて(卵白アルブミンペプチドアミノ酸323~339、Benaroya Research Instituteで入手可能)、DORmO二重トランスジェニックマウスを生成した。さらに、C57Bl/6JマウスをStanford University School of Medicineで組織内繁殖させた。
全ての動物を、Stanford University Medical School(Stanford,CA)の動物施設内で、食物および水への自由アクセスを有する、特定の病原体がいない条件下で繁殖および維持した。B6 db/db LeptR-/-マウスを、Jackson Laboratories(JAX)ならびにDO11.10トランスジェニックマウスから購入した。DO11.10マウスを、RIPmOvaを発現するBalb/cマウスで繁殖させて(卵白アルブミンペプチドアミノ酸323~339、Benaroya Research Instituteで入手可能)、DORmO二重トランスジェニックマウスを生成した。さらに、C57Bl/6JマウスをStanford University School of Medicineで組織内繁殖させた。
マウス糖尿病モニタリング
4週齢で開始して、マウスの体重を毎週測定し、Contour(登録商標)血糖計および血糖モニタリングストリップ(Bayer Healthcare)を使用して血糖レベルを決定するために尾静脈を介して採血した。250mg/dLの2つの連続した血糖値を記録したとき、動物を糖尿病とみなした。300mg/dLの2つの連続した血糖値を記録したとき、動物を安楽死させた。
4週齢で開始して、マウスの体重を毎週測定し、Contour(登録商標)血糖計および血糖モニタリングストリップ(Bayer Healthcare)を使用して血糖レベルを決定するために尾静脈を介して採血した。250mg/dLの2つの連続した血糖値を記録したとき、動物を糖尿病とみなした。300mg/dLの2つの連続した血糖値を記録したとき、動物を安楽死させた。
4-MUおよび4-MUG治療
これまでに記載したように、4-MU(Alfa Aesar)をマウスチョウ(TestDiet,St.Louis,Missouri)に押し込み、出荷前に照射した(Nagy N.,et al.,Circulation.2010;122(22):2313-2322)。このチョウ製剤は、HPLC-MSによって測定されるように、250mg/マウス/日を送達し、マウスにおいて640.3±17.2nmol/Lの血清薬物濃度をもたらす。4-MUG(ChemImpex,Wood Dale,Illinois)を2mg/mlの濃度で飲料水中に分配し、10mg/マウス/日を送達し、LC-MS/MSによって測定されるように、マウスにおいて357.1±72.6ng/mLの血清薬物濃度をもたらした。マウスを、別段の言及がない限り、5、8、または12週齢で4-MUおよび4-MUGで開始し、別段の記載がない限り安楽死されるまでこの食餌で維持した。ナイーブマウスにおけるFoxp3+調節性T細胞数の分析のために、マウスを、腹腔内注射によって生理食塩水中の200μl 0.08%カルボキシメチルセルロース中の0.5mgの4-MUまたは1.0mgの4-MUGで毎日治療した。
これまでに記載したように、4-MU(Alfa Aesar)をマウスチョウ(TestDiet,St.Louis,Missouri)に押し込み、出荷前に照射した(Nagy N.,et al.,Circulation.2010;122(22):2313-2322)。このチョウ製剤は、HPLC-MSによって測定されるように、250mg/マウス/日を送達し、マウスにおいて640.3±17.2nmol/Lの血清薬物濃度をもたらす。4-MUG(ChemImpex,Wood Dale,Illinois)を2mg/mlの濃度で飲料水中に分配し、10mg/マウス/日を送達し、LC-MS/MSによって測定されるように、マウスにおいて357.1±72.6ng/mLの血清薬物濃度をもたらした。マウスを、別段の言及がない限り、5、8、または12週齢で4-MUおよび4-MUGで開始し、別段の記載がない限り安楽死されるまでこの食餌で維持した。ナイーブマウスにおけるFoxp3+調節性T細胞数の分析のために、マウスを、腹腔内注射によって生理食塩水中の200μl 0.08%カルボキシメチルセルロース中の0.5mgの4-MUまたは1.0mgの4-MUGで毎日治療した。
細胞培養
B16F10細胞を、DMEM中で培養し、異なる濃度の4-MUおよび4-MUG(30、100、300μM)で24時間および48時間処置した。培養細胞を溶解し、HA ELISAを使用してHA濃度決定について分析した。96ウェルプレートに配置したB16F10細胞におけるHA染色を、蛍光顕微鏡法を使用して撮像した。4-MUおよび4-MUGで処置したB16F10細胞中の4-MUの蛍光強度を測定するために、B16F10細胞をトリプシン処置し、細胞と関連付けられた4-MUの蛍光を、BD(商標)LSRIIフローサイトメーターを使用して、Pacific Blueチャネルにおけるフローサイトメトリーによって分析した。透過処置のために、トリプシン処置後、細胞を-20℃、20分間メタノール中でインキュベートし、フローサイトメトリー分析の前に1回洗浄した。
B16F10細胞を、DMEM中で培養し、異なる濃度の4-MUおよび4-MUG(30、100、300μM)で24時間および48時間処置した。培養細胞を溶解し、HA ELISAを使用してHA濃度決定について分析した。96ウェルプレートに配置したB16F10細胞におけるHA染色を、蛍光顕微鏡法を使用して撮像した。4-MUおよび4-MUGで処置したB16F10細胞中の4-MUの蛍光強度を測定するために、B16F10細胞をトリプシン処置し、細胞と関連付けられた4-MUの蛍光を、BD(商標)LSRIIフローサイトメーターを使用して、Pacific Blueチャネルにおけるフローサイトメトリーによって分析した。透過処置のために、トリプシン処置後、細胞を-20℃、20分間メタノール中でインキュベートし、フローサイトメトリー分析の前に1回洗浄した。
白血球4-MU取り込み評価
C57Bl/6Jマウスを4-MUで治療し、代表的な動物由来の白血球をベースライン(4-MU治療前)、およびチョウ開始後2、7、および14日の間隔で血液から単離した。末梢静脈血を、4-MUまたは対照チョウにおけるマウスの尾静脈を切断した後、ヘパリンでコーティングされたチューブ内に収集した。単離後、血液試料を30分間遠心分離した(1000×g、4℃)。血清上清を抽出して、これまでに記載した修飾HA ELISAを使用してHAレベルを検出した(Nagy N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-3940)。特定の白血球サブセットにおけるフローサイトメトリーを使用して4-MUによって放出される蛍光を検出するために、末梢赤血球を、塩化アンモニウム-カリウム(ACK)緩衝液を使用して溶解し、白血球を、BD-Biosciences(San Jose,California)からのBV650-CD3(17-A2)、BV785-CD4(RM4-5)、APC-CD11c(N418)、PE-CD14(Sa2-8)、PE-Cy7-Ly-6G/C(RB6-8C5)、PE-Cy5.5-B220(RA3-6B2)およびFITC-I-A/I-E(MHCクラスII)(M5/114.15.2)のフルオロクローム結合抗体で染色した。細胞を、10分間のFc受容体(CD16/32、2.4G2)の遮断の後、室温で30分間染色した。試料を1mLのFACS緩衝液(2%のFBSおよび1mMのEDTAを含有するPBS)で1回洗浄し、1.6%のパラホルムアルデヒドで固定した。試料をBD(商標)LSRIIフローサイトメーター(Beckon Dickinson)上に流し、データを、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を使用して分析した。
C57Bl/6Jマウスを4-MUで治療し、代表的な動物由来の白血球をベースライン(4-MU治療前)、およびチョウ開始後2、7、および14日の間隔で血液から単離した。末梢静脈血を、4-MUまたは対照チョウにおけるマウスの尾静脈を切断した後、ヘパリンでコーティングされたチューブ内に収集した。単離後、血液試料を30分間遠心分離した(1000×g、4℃)。血清上清を抽出して、これまでに記載した修飾HA ELISAを使用してHAレベルを検出した(Nagy N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-3940)。特定の白血球サブセットにおけるフローサイトメトリーを使用して4-MUによって放出される蛍光を検出するために、末梢赤血球を、塩化アンモニウム-カリウム(ACK)緩衝液を使用して溶解し、白血球を、BD-Biosciences(San Jose,California)からのBV650-CD3(17-A2)、BV785-CD4(RM4-5)、APC-CD11c(N418)、PE-CD14(Sa2-8)、PE-Cy7-Ly-6G/C(RB6-8C5)、PE-Cy5.5-B220(RA3-6B2)およびFITC-I-A/I-E(MHCクラスII)(M5/114.15.2)のフルオロクローム結合抗体で染色した。細胞を、10分間のFc受容体(CD16/32、2.4G2)の遮断の後、室温で30分間染色した。試料を1mLのFACS緩衝液(2%のFBSおよび1mMのEDTAを含有するPBS)で1回洗浄し、1.6%のパラホルムアルデヒドで固定した。試料をBD(商標)LSRIIフローサイトメーター(Beckon Dickinson)上に流し、データを、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を使用して分析した。
マウス血清および臓器中の4-MUおよび4-MUG濃度の液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー(LC-MS/MS)分析
4-メチルウンベリフェロン-13C4(Toronto Research Chemicals,Ontario,Canada)を4-MUの内部標準(IS)として使用し、7-ヒドロキシクマリンβ-D-グルクロニド(Toronto Research Chemicals,Ontario,Canada)を4-MUGのISとして使用した。4-MUおよび4-MUGの純粋な原液を混合し、50%メタノール中で希釈して、各化合物について1ng/mL~5000ng/mLの範囲のスパイク溶液を調製した。
4-メチルウンベリフェロン-13C4(Toronto Research Chemicals,Ontario,Canada)を4-MUの内部標準(IS)として使用し、7-ヒドロキシクマリンβ-D-グルクロニド(Toronto Research Chemicals,Ontario,Canada)を4-MUGのISとして使用した。4-MUおよび4-MUGの純粋な原液を混合し、50%メタノール中で希釈して、各化合物について1ng/mL~5000ng/mLの範囲のスパイク溶液を調製した。
組織試料を秤量し、1体積のステンレス鋼Bulletブレンダービーズ(Next Advance)および3体積のMilliQ(登録商標)水を添加した。組織を、4℃のブレンダー(Bulletブレンダー、Next Advance)によって、製造業者の指示に従って均質化した。較正標準のために、25μlのブランク血清または組織ホモジネートを25μlのスパイク溶液と混合した。試験対象の試料について、25μlの血清または組織ホモジネートを25μlの50%メタノールと混合して体積を構成した。次いで、2つのIS(50%メタノール中で各1000ng/ml)の混合物の25μlを加えた。全ての標準および試料をボルテックスした後、メタノール/アセトニトリル20:80(v/v)の150μlを混合物に加え、試料をさらに激しく1分間ボルテックスし、続いて3,000rpmで10分間遠心分離した。上清の100μlを取り、200μlのMilliQ(登録商標)水で希釈した。
LC-MS/MSシステムは、Shimadzu UFLCシステムに連結されたAB SCIEX QTRAP(登録商標)4000質量分析器で構成される。移動相Aは、HPLCグレードの水である。移動相Bは、HPLCグレードのアセトニトリルである。LC分離を、Phenomenex Luna(登録商標)PFP(2)カラム(3μm、150×2mm)上で行い、45%の移動相Bおよび室温で0.4ml/分の流速を使用して、等圧溶出した。分析時間は2.5分であった。抽出した試料の10μlを注入した。質量分析器は、4-MUについてm/z 174.7→132.9、4-MU-13C4(IS)についてm/z 178.7→134.9、4-MUGについてm/z 350.8→174.9、および7-ヒドロキシクマリンβ-D-グルクロニド(IS)についてm/z 336.9→160.9の多重反応モニタリング(MRM)遷移を有する負モードで動作した。Analyst1.6.1ソフトウェア(AB SCIEX)を使用してデータ取得および分析を行った。
HAレベルの測定
試料を解凍し、以前に記載された修飾HA ELISAを使用してHAレベルについてアッセイした(Nagy N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-3940)。各試料を、試料ごとに得られた平均値を用いて3反復で分析した。細胞正規化のために、LI-COR CellTag(商標)700 Stainを製造プロトコルに従って使用した。
試料を解凍し、以前に記載された修飾HA ELISAを使用してHAレベルについてアッセイした(Nagy N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-3940)。各試料を、試料ごとに得られた平均値を用いて3反復で分析した。細胞正規化のために、LI-COR CellTag(商標)700 Stainを製造プロトコルに従って使用した。
組織加工および撮像
組織化学のための組織を動物から抽出し、直ちに10%中性緩衝ホルマリン(NBF)に移転させた。組織を、Leica ASP300組織プロセッサー(Leica Microsystems Inc.)上でパラフィンに加工した。次いで、5μmの厚さの切片をLeica RM2255ミクロトーム(Leica Microsystems Inc.)上で切断した。全ての染色工程を、Leica Bond-Max(商標)自動免疫組織化学(IHC)染色器(Leica Microsystems Inc.)上で行った。HA親和性組織化学(AFC)のために、Bond(商標)Intense R Detectionキット、ストレプトアビジン-HRPシステム(Leica Microsystems,Inc.)を、0.1% BSA-PBS中の4μg/mLのビオチン化-HABPを一次として使用した。Bond(商標)Polymer Detection Kitを全ての他の免疫組織化学のために使用した。この検出キットは、高分子HRPに結合されたヤギ抗ウサギと、マウス一次と共に使用するためのウサギ抗マウス後一次試薬とを含有する。
組織化学のための組織を動物から抽出し、直ちに10%中性緩衝ホルマリン(NBF)に移転させた。組織を、Leica ASP300組織プロセッサー(Leica Microsystems Inc.)上でパラフィンに加工した。次いで、5μmの厚さの切片をLeica RM2255ミクロトーム(Leica Microsystems Inc.)上で切断した。全ての染色工程を、Leica Bond-Max(商標)自動免疫組織化学(IHC)染色器(Leica Microsystems Inc.)上で行った。HA親和性組織化学(AFC)のために、Bond(商標)Intense R Detectionキット、ストレプトアビジン-HRPシステム(Leica Microsystems,Inc.)を、0.1% BSA-PBS中の4μg/mLのビオチン化-HABPを一次として使用した。Bond(商標)Polymer Detection Kitを全ての他の免疫組織化学のために使用した。この検出キットは、高分子HRPに結合されたヤギ抗ウサギと、マウス一次と共に使用するためのウサギ抗マウス後一次試薬とを含有する。
Foxp3およびインスリン(抗インスリン、ab7842 abcam)切片について、8μg/mLのラット抗Foxp3クローンFJK-16s(eBioscience)と共に60分間インキュベートした。ウサギ抗ラットIgG(Vector Labs)とのインキュベーションキットからの後一次試薬の代わりに後一次を添加した。
CD3 IHCは、高pHのEDTAを用いた20分間の熱媒介抗原回収(Bondエピトープ回収溶液2)を使用する前処置を必要とした。その後、切片を2.5μg/mLのウサギ抗CD3(A0452、Dako)と共にインキュベートし、Bond(商標)Polymer Refine Detection Kitを使用して検出を行った。
全ての画像を、Pursuit 4メガ画素冷却色/モノクロ電荷結合デバイスカメラ(Diagnostic Instruments)を備えたLeica DMIRB反転蛍光顕微鏡を使用して可視化した。画像を、Spot(商標)PursuitカメラおよびSpot Advance Software(SPOT Imaging Solutions;Diagnostic Instruments)を使用して取得した。画像分析は、これまでに記載したようにImage J(NIH)を使用してそれに応じて実施した(Nagy N.,et al.,J.Clin.Invest.2015;125(10):3928-40)。
マウス脾細胞単離および調節性T細胞同定
脾臓をマウスから抽出し、細胞を70μmの細胞ストレーナーを介した均質化によって採取した。赤血球を、ACK緩衝液を使用して溶解し、その後、脾細胞懸濁液を上記のプロトコルに従って、V500-CD3(500A2)、BV785-CD4(RM4-5)、およびAl488-Foxp3(FJK-16s)のフルオロクローム結合抗体で染色した。。LSRII上でフローサイトメトリーを行い、FlowJo(Treestar)を使用してデータ分析を行った。
脾臓をマウスから抽出し、細胞を70μmの細胞ストレーナーを介した均質化によって採取した。赤血球を、ACK緩衝液を使用して溶解し、その後、脾細胞懸濁液を上記のプロトコルに従って、V500-CD3(500A2)、BV785-CD4(RM4-5)、およびAl488-Foxp3(FJK-16s)のフルオロクローム結合抗体で染色した。。LSRII上でフローサイトメトリーを行い、FlowJo(Treestar)を使用してデータ分析を行った。
実施例2
4-MUGは、インビトロで複数のがん細胞によるHA合成を阻害する
代謝産物の活性は薬物動態決定における重要な変数であるため、HA合成に対する主な4-MU代謝産物4-MUGの効果を調査した。これを試験するために、豊富なHAを産生する細胞株(B16F10)由来の黒色腫細胞を使用した。
4-MUGは、インビトロで複数のがん細胞によるHA合成を阻害する
代謝産物の活性は薬物動態決定における重要な変数であるため、HA合成に対する主な4-MU代謝産物4-MUGの効果を調査した。これを試験するために、豊富なHAを産生する細胞株(B16F10)由来の黒色腫細胞を使用した。
図1Dおよび1Eは、4-MU(図1D)および4-MUG(図1E)中で48時間培養したB16F10細胞によるHA産生を示す。図1Dおよび1Eを参照すると、48時間の薬物曝露後に、4-MU(図1D)および4-MUG(図1E)処置したB16F10細胞の両方において、HA合成の濃度依存的阻害が観察された。HA結合タンパク質(HABP)を使用したこれらの細胞の蛍光染色は、4-MUおよび4-MUGでの処置が両方ともHAを減少させたことを示した(図1D)。
図1Gは、CTLL2細胞における4-MUまたは4-MUGによる処置時のHA合成阻害を示し、図1Hは、Min6細胞における4MUまたは4-MUGによる処置時のHA合成阻害を示す。B16F10黒色腫細胞に加えて、4-MUGは同様に、CTLL2細胞であるリンパ腫細胞株(図1G)、ならびにMin6細胞であるインスリノーマ細胞株(図1H)によるHA合成を阻害した。これらの結果の総合は、4-MUまたは4-MUGのいずれかでの処置が、HA合成を阻害することを示す。
4-MUGが、4-MUへの任意の可能性がある変換とは無関係に生物活性を有するか否かを試験するために、4-MUGの非加水分解性バージョンを生成した(図5A)。図5Bは、4-MU、4-MUGまたは非加水分解性4-MUG中で48時間培養したB16F10細胞によるHA産生を示す。図5Cは、4-MU、4-MUG、または非加水分解性4-MUG中で48時間培養した、HAS3合成と併せてHAを過剰発現するように操作されたCHO-HAS3細胞によるHA産生を示す。非加水分解性4-MUGは、黒色腫細胞株B16F10(図5B)、ならびに卵巣がん細胞株CHO(図5C)によるHA合成を、4-MUまたは従来の4-MUGと同等の用量で予防した。
総合すると、これらのデータは、4-MUGが4つの異なるがん細胞株(B16F10黒色腫、Min6インスリノーマ、CTLL2リンパ腫、およびCHO卵巣)によるHA合成を直接阻害することを実証する。さらに、これらのデータは、4-MUGが4-MUへの変換を受けることができるが、4-MUGは、それにもかかわらず、この変換の不在下で直接HA合成を阻害することを示す。
実施例3
インビボでのHA合成の阻害に対する4-MUG投与の効果を評価するために、薬物をT1Dの動物モデルである、DO11.10xRIPmOVA(DORmO)マウスに投与した。DORmOマウスは、膵臓ベータ細胞上のインスリン遺伝子プロモーターと併せてOVAを同時に発現しつつ(自己抗原をエミュレートする)、OVAに特異的なT細胞受容体導入遺伝子を担持する(自己反応性CD4+T細胞をエミュレートする)。
インビボでのHA合成の阻害に対する4-MUG投与の効果を評価するために、薬物をT1Dの動物モデルである、DO11.10xRIPmOVA(DORmO)マウスに投与した。DORmOマウスは、膵臓ベータ細胞上のインスリン遺伝子プロモーターと併せてOVAを同時に発現しつつ(自己抗原をエミュレートする)、OVAに特異的なT細胞受容体導入遺伝子を担持する(自己反応性CD4+T細胞をエミュレートする)。
図6Aは、12週齢で、未治療のDORmOマウス(対照)、4-MUを供給したDORmOマウス、および4-MUGを供給したDORmOマウスからの膵臓組織の代表的なHA染色を示す。図6Aを参照すると、HAについてDORmO膵島を染色することは、未治療のDORmOマウスと比較して、4-MUおよび4-MUG治療後のHA蓄積の減少を示す。図6Bは、未治療のDORmOマウス、ならびに5週齢から開始し、4-MUおよび4-MUGを供給し、4-MUおよび4-MUGにおいて15週間維持した、DORmOマウスの血糖を示す。図6Bを参照すると、これと一致して、4-MUG治療は、未治療のDORmOマウスと比較して、経時的に血糖によって測定されるように、T1Dの発症を遅らせた。図6Cは、未治療(対照)および4-MU治療DORmOマウス由来の膵島組織の代表的なFoxP3染色を示す。オリジナル倍率は×40である。さらに、Foxp3調節性T細胞の増加が、非糖尿病性4-MU治療DORmOマウスの膵島で観察された(図6C)。フローサイトメトリーによって分析されるように、図6Fは、4-MU(0.5mg i.p.)または4-MUG(1mg i.p.)で毎日14日間治療したマウスから単離された脾細胞中のCD3+/CD4+細胞中のFoxp3+MFIを示し、図6Gは、4-MU(0.5mg i.p.)または4-MUG(1mg i.p.)で毎日14日間治療したマウスから単離された脾細胞中のCD3+/CD4+細胞中のFoxp3+MFIを示す。図6Fおよび6Gを参照すると、野生型対照マウスの4-MUおよび4-MUG治療の両方は、Foxp3+調節性T細胞の増加、ならびにFoxp3のそれらの発現の増加において産生した。フローサイトメトリーによって分析されるように、図6Dは、4-MU(0.5mg i.p.)または4-MUG(1mg i.p.)で毎日14日間治療したマウスから単離した脾細胞中のCD3+細胞を示し、図6Eは、4-MU(0.5mg i.p.)または4-MUG(1mg i.p.)で毎日14日間治療したマウスから単離した脾細胞中のCD3+細胞のうちのCD4+を示す。図6Dおよび6Eは、CD4+およびCD3+T細胞数がいずれの治療によっても影響を受けなかったことを示す。これらの観察は、4-MUが複数の動物モデルにおいてFoxp3+Tregを誘導することを示す研究と一致し(Nagy,N.,et al.,J.Clin.Invest.125(10):3928-3940、Kuipers,H.F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.113:1339-1344、Kuipers,H.F.,et al.,Clin.Exp.Immunol.185:372-381)、4-MUGもまたそうであることを示す。
実施例4
4-MUGが、本質的に非自己免疫性である異なる炎症性疾患において、HA合成に対して有効であるか否かを評価するために、2型糖尿病のdb/dbモデルにおける4-MUGの役割を調査した。Db/dbマウスは、機能的レプチン受容体を欠き、肥満および糖尿病性である。
4-MUGが、本質的に非自己免疫性である異なる炎症性疾患において、HA合成に対して有効であるか否かを評価するために、2型糖尿病のdb/dbモデルにおける4-MUGの役割を調査した。Db/dbマウスは、機能的レプチン受容体を欠き、肥満および糖尿病性である。
図7Aは、10週間にわたる対照チョウまたは4-MUチョウのいずれかにおける、15週齢のdb/dbマウス、ならびに比較のために提供される、db/+同腹仔の代表的な画像、血糖(BG)値、および重量(Wt)を示す。図7Bは、飲料水中で対照チョウ、4-MUチョウ、または4-MUGのいずれかを10週間供給した15週齢のdb/dbマウス、ならびに対照チョウを供給したdb/+同腹仔対照のランダム(供給)BG値を示す。図7Cは、各点が1匹のマウスを表している、図7Bにおけるマウスの重量を示す。図7A~7Cを参照すると、db/dbマウスへの4-MUまたは4-MUGのいずれかの1ヶ月にわたる投与は、対照チョウを供給された、齢および性別(雄)が適合したマウスと比較して、血糖(BG)レベルを確実に減少させた。図7Dは、5週齢から開始する飲料水中の対照チョウ、4-MUチョウ、または4-MUGにおいて維持されたdb/dbマウスのBGレベルを示す。図7Dを参照すると、血糖コントロールに対する4-MUおよび4-MUGの有益な効果は少なくとも10週間維持され、このことは、持続的な改善を示した。図7Fおよび7Gは、4-MUまたは4-MUGを2週間供給した絶食時db/dbマウスの腹腔内グルコース耐性試験(IPGTT)を示す。図7Fおよび7Gを参照すると、この血糖コントロールの改善は、前の2週間に4-MUまたは4-MUGのいずれかを供給された絶食時db/dbマウスの腹腔内グルコース耐性試験(IPGTT)の際に観察された。
理論によって拘束されることを望むものではないが、これらのデータの1つの潜在的な説明は、4-MUにおけるdb/dbマウスは、チョウをより少なく摂取し、減少したカロリー摂取の結果として正常血糖であることであり得る。実際、4-MUチョウにおけるdb/dbマウスは、治療の開始後数週間、重量の初期の減少を示した。しかしながら、4-MUまたは4-MUGのいずれかを供給されたdb/dbマウスの重量はすぐに回復した(図7E)が、4-MU治療によるグルコースレベルの分離は、これらのマウスにおいて重量が回復する段階を通じて継続し、群間で体重がもはや異なることがなくなったとき、治療開始後も長い間存在した。
最後に、糖尿病対照に対する4-MUおよび4-MUGのこれらの効果は、インビトロで観察されたベータ細胞株によるHA合成の阻害(図7F)と一致して、膵島におけるHA染色の減少と関連付けられた(図7H~7K)。これらのデータの総合は、4-MUおよび4-MUGの両方が、db/dbマウスにおいて正常血糖を等しく良好に回復することを示す。
実施例5
4-MUGの化学安定性を決定するために、その半減期(t1/2)を評価した。4-MUGを100μMの濃度で試験した。内部標準(IS)をDMSO中のトルブタミドと共に50ng/mLで調製し、絶食状態の模擬胃液(FaSSGF)の緩衝液をpH1.6で調製した。この緩衝液を37℃で15分間予温し、その後4-MUGを添加し、この溶液をボルテックスさせた。次に、30μLのこの反応混合物を分析のために各時点で除去した。時点には、0分、15分、30分、60分、120分が含まれていた。IS溶液を添加することにより、実験終了時に反応を停止させた。試料を4,000rpmで4℃、15分間遠心分離した。100μLの上清を、タンデム質量分析(LC-MS/MS)を用いたさらなる液体クロマトグラフィーのために、蒸留水と混合した。質量分析検出は、SCIEX(登録商標)API4500 Qtrap(登録商標)(Sciex,Redwood City,California)を使用して行った。各化合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析した。計算されたパラメータは、4-MUGの比、時間に対する残存4-MUGのパーセント、および4-MUGのt1/2の推定値であった。
4-MUGの化学安定性を決定するために、その半減期(t1/2)を評価した。4-MUGを100μMの濃度で試験した。内部標準(IS)をDMSO中のトルブタミドと共に50ng/mLで調製し、絶食状態の模擬胃液(FaSSGF)の緩衝液をpH1.6で調製した。この緩衝液を37℃で15分間予温し、その後4-MUGを添加し、この溶液をボルテックスさせた。次に、30μLのこの反応混合物を分析のために各時点で除去した。時点には、0分、15分、30分、60分、120分が含まれていた。IS溶液を添加することにより、実験終了時に反応を停止させた。試料を4,000rpmで4℃、15分間遠心分離した。100μLの上清を、タンデム質量分析(LC-MS/MS)を用いたさらなる液体クロマトグラフィーのために、蒸留水と混合した。質量分析検出は、SCIEX(登録商標)API4500 Qtrap(登録商標)(Sciex,Redwood City,California)を使用して行った。各化合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析した。計算されたパラメータは、4-MUGの比、時間に対する残存4-MUGのパーセント、および4-MUGのt1/2の推定値であった。
図8Aは、4-MUGの化学安定性評価の表である。図8Bは、4-MUGの化学安定性を、時間(分)に対する面積比として示すグラフである。図8Cは、4-MUGの化学安定性を、時間(分)に対する残存パーセントで示すグラフである。図8A、8B、および8Cに示すように、4-MUGは、標準化学試験下で比較的長期間安定である。
例示的な実施形態が例示され、記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な変更が行われ得ることを理解されたい。
政府のライセンス権に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された契約AI101984およびDK096087の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された契約AI101984およびDK096087の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
Claims (30)
- (i)ヒアルロナン合成を阻害する化合物、および
(ii)薬学的に許容される担体
を含む、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療するための組成物。 - 前記化合物が、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項1に記載の組成物。
- 前記化合物が、UDP-グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項2に記載の組成物。
- 前記化合物が、4-メチルウンベリフェロン-グルクロニドである、請求項3に記載の組成物。
- 前記化合物が、調節性T細胞応答を誘導するために有効である、請求項1に記載の組成物。
- 前記化合物が、FoxP3+調節性T細胞を増加させるために有効である、請求項5に記載の組成物。
- 前記自己免疫性疾患または障害が、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性膵臓炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、CREST症候群、クローン病、線維筋痛症、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(HSP)、腎症、若年性関節炎、若年性糖尿病(1型糖尿病)、ループス、多発性硬化症、視神経脊髄炎、結節性多発動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆道炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎(巨細胞性動脈炎)、潰瘍性大腸炎(UC)、血管炎、および白斑からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記炎症性疾患または障害が、腎虚血再灌流損傷、喘息、肺高血圧、2型糖尿病、関節炎、アテローム性動脈硬化症、創傷治癒、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、閉塞性細気管支炎症候群(BOS)、同種移植拒絶、移植片対宿主病、皮膚筋炎、炎症性腸疾患、および脳卒中からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記炎症性疾患または障害が、2型糖尿病、同種移植拒絶、または移植片対宿主病である、請求項8に記載の組成物。
- 前記線維性疾患または障害が、原発性硬化性胆道炎、胆汁性肝硬変、胆道痙攣、肝硬変、肝線維症、腎線維症、皮膚線維症、腸線維症、および肺線維症からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記増殖性疾患または障害が、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、食道がん、乳がん、肝臓がん、骨がん、卵巣がん、腎臓がん、肛門がん、脳がん、胆道がん、黒色腫、インスリノーマ、子宮内膜がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮頸がん、およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記増殖性疾患または障害が、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、または卵巣がんである、請求項11に記載の組成物。
- 自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害の治療を必要とする哺乳動物対象について、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療する方法であって、
前記哺乳動物対象についてヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、前記哺乳動物対象に投与することを含む、方法。 - 前記化合物が、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項13に記載の方法。
- 前記化合物が、UDP-グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項14に記載の方法。
- 前記化合物が、4-メチルウンベリフェロン-グルクロニドである、請求項15に記載の方法。
- 前記化合物が、調節性T細胞応答を誘導するために有効である、請求項13に記載の方法。
- 前記化合物が、FoxP3+調節性T細胞を増加させるために有効である、請求項17に記載の方法。
- 前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項13に記載の方法。
- 増殖性疾患に罹患しているかまたは増殖性疾患を発症するリスクがある哺乳動物対象について、増殖性疾患を治療する、かつ/または増殖性疾患の進行を逆転するための方法であって、
前記哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、前記哺乳動物対象に投与することを含む、方法。 - 前記化合物が、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤またはUDP-グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項20に記載の方法。
- 前記化合物が、4-メチルウンベリフェロン-グルクロニドである、請求項21に記載の方法。
- 前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項20に記載の方法。
- 前記増殖性疾患が、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、または卵巣がんである、請求項20に記載の方法。
- 1型糖尿病または2型糖尿病の治療を必要とする哺乳動物対象について、1型糖尿病または2型糖尿病を治療するための方法であって、
前記哺乳動物対象についてヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、前記哺乳動物対象に投与することを含む、方法。 - 前記化合物が、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤またはUDP-グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項25に記載の方法。
- 前記化合物が、4-メチルウンベリフェロン-グルクロニドである、請求項26に記載の方法。
- 前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項25に記載の方法。
- 前記化合物が、調節性T細胞応答を誘導するために有効である、請求項25に記載の方法。
- 前記化合物が、FoxP3+調節性T細胞を増加させるために有効である、請求項29に記載の方法。
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