JP2022514672A

JP2022514672A - ヒアルロナン合成阻害のための４－メチルウンベリフェリルグルクロニド

Info

Publication number: JP2022514672A
Application number: JP2021535965A
Authority: JP
Inventors: エル．ボリーキー，ポール; ナギー，ナディーン; ケバー，ゲルノート
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-02-14
Also published as: AU2019403402A1; EP3897620A4; EP3897620A1; CA3123089A1; WO2020132480A1; AU2019403402A8; US20220079966A1

Abstract

ヒアルロナン合成を阻害する化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療するための組成物が記載される。いくつかの実施形態において、ヒアルロナン合成を阻害する化合物は４－メチルウンベリフェロン－グルクロニドである。自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療する方法であって、哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を有する組成物を哺乳動物対象に投与することを含む方法もまた記載される。

Description

ヒアルロナン（ＨＡ）は、正常な組織機能および発達において多くの役割を有する細胞外マトリックスグリコサミノグリカンである（ＦｒａｓｅｒＪ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９９７；２４２（１）：２７－３３；ＪｉａｎｇＤ，ｅｔａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０１１；９１（１）：２２１－２６４、ＴｅｒｍｅｅｒＣ．，ｅｔａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；２４（３）：１１２－１１４）。ＨＡは、３つのヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）酵素である、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、およびＨＡＳ３によって合成される（ＷｅｉｇｅｌＰ．Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７；２８２（５１）：３６７７７－３６７８１）。これらの酵素は、細胞膜を通して細胞外空間に押し出される際に、新生多糖にグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）およびＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を繰り返し付加することによって、ＨＡを長くする（ＷｅｉｇｅｌＰ．Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７；２８２（５１）：３６７７７－３６７８１）。

ＨＡ合成を阻害することに実質的な、実験的および治療的な関心がある。ＨＡは炎症応答を促進することが知られており（ＪｉａｎｇＤ．，ｅｔａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０１１；９１（１）：２２１－２６４）、これらには、複数の免疫細胞型の活性化および成熟（ＴｅｒｍｅｅｒＣ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２；１９５（１）：９９－１１１）、炎症促進性ケモカインおよびサイトカインの放出（ＴａｙｌｏｒＫ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（１７）：１７０７９－１７０８４、ＭｃＫｅｅＣ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６；９８（１０）：２４０３－２４１３）、および増殖（ＭａｈａｆｆｅｙＣ．Ｌ．．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９（１２）：８１９１－８１９９）および白血球の移動（ＩｔａｎｏＮ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００２；９９（６）：３６０９－３６１４）が含まれる。ＨＡおよびその受容体相互作用は、リンパ球の数および機能の両方に影響を与えることも知られている（ＢｏｌｌｙｋｙＰ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３（４）：２２３２－２２４１、ＢｏｌｌｙｋｙＰ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９（２）：７４４－７４７、ＢｏｌｌｙｋｙＰ．Ｌ．，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０１１；１０８（１９）：７９３８－７９４３）。ＨＡレベルは、慢性炎症組織において大幅に上昇し（ＣｈｅｎｇＧ．，ｅｔａｌ．ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．２０１１；３０（２）：１２６－１３４、ＫａｎｇＬ．，ｅｔａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１３；６２（６）：１８８８－１８９６、ＭｉｎｅＳ．，ｅｔａｌ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．２００６；５３（６）：７６１－７６６）、これらには、腫瘍微小環境における、線維症における、および自己免疫部位におけるものが含まれる（ＢｏｌｌｙｋｙＰ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｄｉａｂ．Ｒｅｐ．２０１２；１２（５）：４７１－４８０、ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１０）：３９２８－３９４０）。

自己免疫性１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）において、ＨＡは膵島に蓄積する（Ｂｏｇｄａｎｉ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｄｉａｂ．Ｒｅｐ．２０１４；１４：５５２、Ｂｏｇｄａｎｉ，Ｍ．，ｅｔａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１４；６３：２７２７－２７４３）。肥満関連２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）において、ＨＡは高血糖（Ｓｈａｋｙａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．２０１５：７０１７３８、Ｗａｎｇ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ５：８６４－８６５）、炎症性サイトカイン（Ｂｏｌｌｙｋｙ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：２１１－２２０）、および他のトリガー（Ｊｉａｎｇ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．９１：２２１－２６４、Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７４：Ａ１－７、Ｌａｕｅｒ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：５２９９－５３１２）に応答して炎症組織内に蓄積する。ＨＡは、Ｔ２Ｄにおいて、骨格筋（ＫａｎｇＬ，ｅｔａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１３；６２（６）：１８８８－１８９６）、および脂肪組織（Ｌｉｕ，Ｌ．Ｆ．，ｅｔａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２０１５；５８：１５７９－１５８６）で増加する。ＨＡはまた、肝硬変、原発性硬化性胆道炎、腎臓線維症、および他の線維性状態を含む、慢性炎症および線維症の設定において増加する（Ｌｅｗｉｓ，Ａ．，ｅｔａｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２００８；２３：７３１－７３９、Ｌｉ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１１；２０８：１４５９－１４７１、Ｏｒａｓａｎ，Ｏ．Ｈ．，ｅｔａｌ．ＣｌｕｊｕｌＭｅｄ２０１６；８９：２４－３１、Ｃｏｌｏｍｂａｒｏ，Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１３；２８：２４８４－２４９３、Ｖｅｓｔｅｒｈｕｓ，Ｍ．，ｅｔａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１５；６２（１）：１８８－１９７）。

ＨＡの増加は、間断がない炎症を伴う多くの慢性疾患プロセスに関連しており、これらには、２型糖尿病（Ｍｉｎｅ，Ｓ．，ｅｔａｌ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．２００６；５３：７６１－７６６、Ｋａｎｇ，Ｌ．ｅｔａｌ．，２０１３；Ｄｉａｂｅｔｅｓ６２：１８８８－１８９６）、肝硬変（Ｐｌｅｖｒｉｓ，Ｊ．Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００；１２（１０）：１１２１－１１２７）、喘息、および多様な病因の他の慢性炎症性疾患（Ｐｌｅｖｒｉｓ，Ｊ．Ｎ．ｅｔａｌ．，２０００；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１２：１１２１－１１２７、Ｗｅｌｌｓ，Ａ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ１９９０；５０：２４０－２４３、Ｄａｈｌ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．１９８５；４４：８１７－８２２、Ｈａｌｌｇｒｅｎ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１９８９；１３９：６８２－６８７、Ｅｖａｎｋｏ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９８；１５２：５３３－５４６）、Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．ｅｔａｌ．ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．２０１１；３０：１２６－１３４、Ａｙａｒｓ，Ａ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．ＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１６１：６５－７３、Ｌｉａｎｇ，Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１２８：４０３－４１１．ｅ３）が含まれる。

ＨＡは、関節リウマチ（Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，２０１３；ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．６５（５）：１１６０－１１７０）、狼瘡（ＹｕｎｇＳ．，ｅｔａｌ．，ＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉｓ．２０１２；２０１２：２０７１９０，ＰＭＩＤ：２２９００１５０）、シェーグレン症候群（ＴｉｓｈｌｅｒＭ．，ｅｔａｌ．，ＡｎｎＲｈｅｕｍＤｉｓ．１９９８；５７（８）：５０６－５０８）、および橋本甲状腺炎（Ｇｉａｎｏｕｋａｋｉｓ，Ａ．Ｇ．，ｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００７；１４８（１）：５４－６２）を含む、多発性自己免疫性疾患に関与している。ＨＡは、様々な形態のがんにおける腫瘍を取り囲む（Ｔｏｏｌｅ，Ｂ．Ｐ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ２００４；４：５２８－５３９）。ＨＡのこの蓄積は、持続性炎症に関連するより大きなパターンのＥＣＭ堆積の一部である。ＨＡは、局所浮腫を増加させ（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９１；８８：１６２２－１６２８）、遺伝子発現およびサイトカイン産生および細胞生存への効果を通じて白血球の移動、増殖、分化を駆動する炎症性カスケードに寄与する。これらの経路および先天性免疫に対するＨＡ産生の影響は、いくつかのレビューの対象である（Ｊｉａｎｇ，Ｄ．，ｅｔａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００７；２３：４３５－４６１．ＰＭＩＤ：１７５０６６９０）、Ｊｉａｎｇ，Ｄ．，ｅｔａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０１１；９１：２２１－２６４、Ｐｅｔｒｅｙ，Ａ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：１０１、Ｓｌｅｖｉｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．２００７；２６：５８－６８、Ｓｏｒｏｋｉｎ，Ｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１０：７１２－７２３）。

ＨＡの増加は、多くのがんにおいて見出され、がん進行および転移に重要である（Ｓｃｈｗｅｒｔｆｅｇｅｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：２３６、Ｍｉｓｒａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＪ．２０１１；２７８：１４２９－１４４３、Ｌｉ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２００１；８５：６００－６０７）。ＨＡは、多くのがん、例えば膵臓がん（ＮａｋａｚａｗａＨ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６；５７：１６５－１７０、ＭｏｒｏｈａｓｈｉＨ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００６；３４５：１４５４－１４５９、ＨａｊｉｍｅＭ，ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２００７；１２０：２７０４－２７０９）、前立腺がん（ＬｏｋｅｓｈｗａｒＶＢ，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２０１０；７０：２６１３－２６２３）、皮膚がん（ＫｕｄｏＤ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００４；３２１：７８３－７８７、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９；６１４：１２８－１３６、ＥｄｗａｒｄＭ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１０；１６２：１２２４－１２３２）、食道がん、乳がん（ＵｒａｋａｗａＨ．，ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２０１２；１３０：４５４－４６６；ＳａｉｔｏＴ．，ｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．２０１３；２９：３３５－３４２、ＳａｉｔｏＴ．，ｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０１３；５：１０６８－１０７４）、肝臓がん（ＫｕｎｄｕＢ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１３）３４：９４６２－９４７４）、骨がん／転移（ＯｋｕｄａＨ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２０１２；７２：５３７－５４７）、白血病（ＬｏｍｐａｒｄｉａＳ．Ｌ．，ｅｔａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３；２３：１４６３－１４７６）、子宮内膜がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮頸がん、食道がん、および卵巣がん（ＴａｍｕｒａＲ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．ＯｖａｒｉａｎＲｅｓ．２０１４；７：９４）の病因に関与している。

多数の研究は、ＨＡを炎症の駆動因子として関与させ、ＨＡは広範囲の炎症性障害に関与する（ＨｕｌｌＲ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２０１２；６０（１０）：７４９－７６０、ＫｕｉｐｅｒｓＨ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０１６；１１３（５）：１３３９－４４、ＹｏｓｈｉｏｋａＹ．，ｅｔａｌ．，Ｒｈｅｕｍ．２０１３；６５（５）：１１６０－１１７０）。これらには、例えば、腎虚血再灌流損傷（ＣｏｌｏｍｂａｒｏＶ．，ｅｔａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１３；２８：２４８４－２４９３）、喘息（Ｌｉａｎｇ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１２８（２）：４０３－４１１．ｅ３，２０１１、ＦｏｒｔｅｚａＲ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２；２８７：４２２８８－４２２９８）、肺高血圧症（ＣｏｌｌｕｍＳ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１７；１７４（１９）：３２８４－３３０１）、肥満関連２型糖尿病（ＳｉｍＭ．－Ｏ．，ｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０１４；２１６：９－１６）、関節炎（Ｃａｍｐｏ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ２０１２；３８（１）：６９－７６）、アテローム性硬化症（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｗ．，ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．２０１９；７８－７９：３２４－３３６）、創傷治癒（Ｄａｖｉｄ－Ｒａｏｕｄｉ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒＲｅｇｅｎ．２００８；１６（２）：２７４－２８７）、慢性閉塞性肺疾患および肺気腫（ＤｅｎｔｅｎｅｒＭ．Ａ．，ｅｔａｌ．Ｔｈｏｒａｘ，２００５；６０（２）：１１４－１１９）、気管支炎オブリテランス症候群（ＢＯＳ）（ＴｏｄｄＪ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．２０１４；１８９（５）：５５６－５６６）、移植拒絶（ＴｅｓａｒＢ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００６；６（１１）：２６２２－２６３５）、移植片対宿主病、皮膚筋炎および炎症性腸疾患（ＫｕｂｏＭ．，ｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８；２９０（１０）：５７９－５８１）、および炎症性腸疾患（ｄｅｌａＭｏｔｔｅＣ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．２０１５；２０１５：４８１３０１）が含まれる。

多くの研究は、ＨＡを線維症の駆動因子として関与させており、ＨＡは幅広い線維性障害に関与する。これらには、肝線維症（Ｈａｌｆｏｎ，Ｐ．，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２００５；４：６）、腎線維症（Ｋａｔｏ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ２０１１；１７８（２）：５７２－５７９）、真皮線維症（Ｔｏｌｇ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ２０１２；１８１（４）：１２５０－１２７０）腸線維症（Ｒｉｅｄｅｒ，Ｆ．，ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙａｎｄＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ２００９；６（４）：２２８－２３５）、および肺線維症（Ｂｅｎｓａｄｏｕｎ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｒｉｔｉｃａｌＣａｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ１９９６；１５４（６）：１８１９－１８２８）、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｒｉｔｉｃａｌＣａｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２０００；１６１（６）：２０６６－２０７３）が含まれる。

ＨＡ媒介性炎症シグナルは、がん、線維症、炎症、および自己免疫等の無菌炎症の設定において特に関連され得る（ＴａｙｌｏｒＫ．Ｒ．，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７；２８２（２５）：１８２６５－１８２６７）。ほとんどの傷害の部位で、ＨＡは急速に除去される。しかしながら、慢性炎症の部位では、ＨＡは持続する（ＢｏｌｌｙｋｙＰ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２００９；８６（３）：５６７－５７２）。これは、局所免疫調節に重要な結果を有することができる（ＢｏｌｌｙｋｙＰ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｄｉａｂ．Ｒｅｐ．２０１２；１２（５）：４７１－４８０、ＧａｒａｎｔｚｉｏｔｉｓＳ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．２０１０；１８１（７）：６６６－６７５、ＨｕｌｌＲ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２０１５；６３（８）：５９２－６０３、ＹｕｎｇＳ．，ｅｔａｌ．，ＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉｓ．２０１２；２０１２：２０７１９０、Ｌｅｅ－ＳａｙｅｒＳ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：１５０、ＪａｃｋｓｏｎＤ．Ｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２００９；２３０（１）：２１６－２３１、ＰｅｔｒｅｙＡ．Ｃ．，ｅｔａｌ．、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：１０１）。

ＨＡは、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、およびＨＡＳ３の３つのシンターゼによって産生され、慢性炎症の部位において豊富である。分解代謝性の、ＨＡの低分子量量断片（ＬＭＷ－ＨＡ）は、抗原応答（Ｔｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２；１９５：９９－１１１）、および免疫活性化（Ｊｉａｎｇ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０１１；９１：２２１－２６４）であって、ＣＤ４４およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達を介するもの（Ｊｉａｎｇ，Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５；１１：１１７３－１１７９、Ｆｉｅｂｅｒ，Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．２００４；１１７：３５９－３６７、Ｔｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．，ｅｔａｌ．ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ．２００３；２４：１１２－１１４（２００３）、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４；２７９：１７０７９－１７０８４）を促進する内因性危険シグナルとして作用する。

ＬＭＷ－ＨＡはまた、樹状細胞（ＤＣ）の活性化および成熟を促進し（Ｔｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２；１９５：９９－１１１）、複数の細胞型によるＩＬ－１、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＬ－１２等の炎症促進サイトカインの放出を駆動し（Ｂｏｌｌｙｋｙ，Ｐ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９：７４４－７４７、Ｂｏｌｌｙｋｙ，Ｐ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０１１；１０８：７９３８－７９４３）、ケモカイン発現および細胞輸送を駆動し（ＭｃＫｅｅ，Ｃ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６；９８：２４０３－２４１３）、増殖（Ｓｃｈｅｉｂｎｅｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；１７７：１２７２－１２８１）および血管新生（Ｋｕｉｐｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０１６；１１３：１３３９－１３４４）を促進する。

最近、ＨＡ堆積物は最近発症したＴ１Ｄを有する個体の膵島内に蓄積し、これらの堆積物がインスリン炎部位に存在したことが報告された（Ｂｏｇｄａｎｉ，Ｍ．ｅｔａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１４；６３：２７２７－２７４３）。同様のＨＡ堆積は、１型糖尿病の動物モデルにおいて観察された（Ｎａｇｙ，Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１０）：３９２８－３９４０）。このＨＡは、分解代謝性の、低分子量ＨＡの断片からなる（ＬＭＷ－ＨＡ）。ＨＡ過剰発現およびＨＡ断片は特に炎症を駆動することが知られているため（Ｏｌｓｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ．２０１１；７（３）：ｅ１００１３３２）、Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｙ．ｅｔａｌ．，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．２０１３；６５：１１６０－１１７０）、理論に束縛されることを望まずに、ＨＡは１型糖尿病の病因を駆動することが可能である。

４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）は、ＨＡ合成の低分子阻害剤である（ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：１２３）。４－ＭＵは、インビトロおよびインビボの両方で複数の細胞株および組織型におけるＨＡ産生を阻害する（ＹｏｓｈｉｏｋａＹ．，ｅｔａｌ．，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．２０１３；６５（５）：１１６０－１１７０、ＢｏｌｌｙｋｙＰ．Ｌ．，ｅｔａｌ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０、７（３）：２１１－２２０、ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１０；１２２（２２）：２３１３－２３２２）。

４－ＭＵは、少なくとも２つの方法でＨＡ産生を阻害すると考えられる。第１に、４－ＭＵは、ＨＡ合成に関与する酵素であるＵＤＰ－グルクロニルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）の競合基質として機能すると考えられる（Ｋａｋｉｚａｋｉ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（３２）：３３２８１－９；ＰＭＩＤ：１５１９００６４）。ＨＡは、前駆体ＵＤＰ－グルクロン酸（ＵＤＰ－ＧｌｃＵＡ）およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン（ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ）からのＨＡシンターゼＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３によって産生される。これらは、ＵＤＰ残基の、Ｎ－アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸へのＵＤＰ－グルクロニルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を介した移転によって生成される。ＵＤＰ－ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの利用可能性は、それによってＨＡ合成を制御する（Ｖｉｇｅｔｔｉ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２；２８７（４２）：３５５４４－３５５５５）。４－ＭＵの存在下で、それは、４位のそのヒドロキシル基を介して、ＵＧＴを介するグルクロン酸に共有結合する。その結果、ＵＤＰ－グルクロン酸の濃度は、サイトゾルにおいて低下し、ＨＡ合成は減少する。これは、これをもって、細胞内の４ＭＵＵＤＰ－ＧｌｃＵＡ含有量を減少させる。４－ＭＵは、ＨＡＳ酵素ＵＤＰ－ＧｌｃＵＡを枯渇させることによってＨＡ合成を阻害し、それは、４－ＭＵグルクロン酸抱合によって消費される。これまでのところ、第２のメカニズムがどのように正確に働くかは不明確であるが、４－ＭＵは、ＨＡＳｍＲＮＡ（Ｋｕｌｔｔｉ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２００９；３１５（１１）：１９１４－１９２３）、ならびにＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼおよびデヒドロゲナーゼのｍＲＮＡ（Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０１３；５（３）：１０６８－１０７４）の発現を減少させる。

４－ＭＵ治療は、腫瘍転移、線維症進行および自己免疫を含む、ＨＡに関連する炎症性表現型の多くを予防する（（ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：１２３）においてレビューされた）。４－ＭＵが重要な抗炎症細胞型であるＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の誘導を促進すること、および４－ＭＵが多発性硬化症、Ｔ１Ｄ、および関節リウマチを含むヒト自己免疫性疾患の複数の動物モデルにおいて線維症および自己免疫を予防することが以前に報告されている（ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１０）：３９２８－４０、ＫｕｉｐｅｒｓＨ．Ｆ．，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０１６；１１３（５）：１３３９－１３４４、ＹｏｓｈｉｏｋａＹ．，ｅｔａｌ．，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．２０１３；６５（５）：１１６０－１１７０、ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：１２３、ＭｕｅｌｌｅｒＡ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４；２８９（３３）：２２８８８－２２８９９）。

自己免疫および炎症におけるＨＡ合成に対する４－ＭＵの影響を調査した研究は少ない。インビボ研究では、４－ＭＵ治療が、ブドウ球菌エンテロトキシン媒介性（ＭｃＫａｌｉｐ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｔｏｘｉｎｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１３；５（１０）：１８１４－１８２６）およびリポ多糖媒介性急性肺損傷（ＭｃＫａｌｌｉｐ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，２０１５；３８：１２５０－１２５９）のマウスモデルにおける肺傷害を予防し、炎症性サイトカインレベルを減少させたことが示された。４－ＭＵはまた、腎虚血および再灌流を含む非感染性炎症に対する保護効果（Ｃｏｌｏｍｂａｒｏ，Ｖ．ｅｔａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１３；２８：２４８４－２４９３）、およびタバコの煙に二次的な気道炎症（Ｆｏｒｔｅｚａ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２；２８７（５０）：４２２８８－４２２９８）を有することも示されている。４－ＭＵはまた、肥満糖尿病性マウスにおいて、アディポネクチンの産生の増加を介して、正常血糖を回復し、インスリン感受性を促進する（Ｓｉｍ，Ｍ．－Ｏ．，ｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０１４；２１６：９１６）。４－ＭＵはまた、限られた数の自己免疫性疾患のマウスモデルにおいて疾患を改善することも報告されている。具体的には、４－ＭＵ治療は、コラーゲン誘導関節炎モデルにおいて有益であり、このモデルでは、それは疾患スコアを改善し、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の発現を減少させた（Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，２０１３；６５（５）：１１６０－１１７０，ＰＭＩＤ：２３３３５２７３）。

より最近、４－ＭＵ治療は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて疾患を予防および治療することが実証され、このモデルでは、それは調節性Ｔ細胞の集団を増加させ、Ｔ細胞分化を病原性Ｔ－ヘルパー１Ｔ細胞サブセットから離し、非病原性Ｔ－ヘルパー２サブセットに向かって分極させた（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４；２８９：２２８８８－２２８９９）。加えて、４－ＭＵ治療は、腫瘍衛星の数を減少させ（Ｐｉｃｃｉｏｎｉ，Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１２；２２（３）：４００－４１０）、腫瘍における血管新生および細胞増殖を阻害した（Ｇａｒｃｉａ－Ｖｉｌａｓ，Ｊ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．２０１３；６１（１７）：４０６３－４０７１）。既存のインビトロデータおよびインビボデータは、ヒメクロモネンが、ＨＡ産生がんに対して指向される治療レジメンの構成要素として有用性を有し得ることを示唆する。４－ＭＵ治療により、抗原提示に必要な細胞－細胞相互作用が予防されたことが報告され（Ｂｏｌｌｙｋｙ，Ｐ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；７：２１１－２２０）、その他は、Ｔ細胞増殖に対する阻害効果を記載している（ＭｃＫａｌｌｉｐ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｔｏｘｉｎｓ（Ｂａｓｅｌ）２０１３；５（１０）：１８１４－１８２６）。これらの効果は、Ｔ細胞増殖、活性化、および分化におけるＨＡおよびその受容体の確立された役割と一致する（Ｊｉａｎｇ，Ｄ．，ｅｔａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０１１；９１：２２１－２６４、Ｇｕａｎ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３：１７２－１８０、Ｐｏｎｔａ，Ｈ．，ｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．２００３；４：３３－４５）。また、４－ＭＵ治療が炎症のいくつかのモデルを悪化させ得る適応症もある。４－ＭＵ治療は、高脂肪食を供給されたＡｐｏＥ欠損マウスにおいて悪化したアテローム性動脈硬化と関連付けられた（Ｎａｇｙ，Ｎ．ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１０；１２２：２３１３－２３２２）。

４－ＭＵ治療がＥＡＥ（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４；２８９（３３）：２２８８８－２２８９９、Ｋｕｉｐｅｒｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１６；１１３（５）：１３３９－１３４４）、ＤＯＲｍＯおよびＮＯＤマウスモデルの両方における自己免疫性糖尿病（Ｎａｇｙ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１０）：３９２８－３９４０；ＰＭＩＤ：２６３６８３０７、Ｋｕｉｐｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１８５：３７２－３８１）の進行を限定することが報告されている。この治療効果は、病原性Ｔｈ１応答から離れたＴ細胞応答の分極化の結果であるだけでなく、これらの細胞の、自己免疫性攻撃の部位への浸潤の減少の結果であることが示される。加えて、４－ＭＵ治療は、ＬＭＷ－ＨＡによるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ誘導および機能の阻害を持ち上げるため、病原性応答のこの阻害は、Ｔｒｅｇ数の増加によって補助される（Ｋｕｉｐｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１８５：３７２－３８１、Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４；２８９（３３）：２２８８８－２２８９９、Ｎａｇｙ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１０）：３９２８－３９４０；ＰＭＩＤ：２６３６８３０７）。さらに、ＭＳ病変における炎症促進環境を維持することに加えて、ＨＡ堆積物は、ＭＳおよび他のミエリン変性障害における、ＣＮＳのミエリン形成細胞である、オリゴデンドロサイトの成熟を阻害することが示されており、したがって、ミエリンの修復を予防し、ＭＳ病因にさらに寄与すると考えられる（Ｂａｃｋ，Ｓ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５；１１（９）：９６６－９７２、Ｓｌｏａｎｅ，Ｊ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０１０；１０７（２５）：１１５５５－１１５６０、Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３；７３（２）：２６６－２８０、Ｂｕｇｉａｎｉ，Ｍ．，ｅｔａｌ．Ｂｒａｉｎ，２０１３；１３６（Ｐｔ１）：２０９－３２２）。

理論によって拘束されることを望むものではないが、４－ＭＵ治療は、炎症組織におけるＨＡ負荷を、抗炎症性ＨＭＷポリマーの優位性に回復させることができる。したがって、ＨＡ合成を阻害するために薬理学的ツールを同定することに大きな関心がある。

４－ＭＵは、ヒトでの使用が承認された市販の薬物である。それは、「ヒメクロモネ」と呼ばれ、ヨーロッパおよびアジア諸国で胆道痙攣を予防するために処方されている（ＴａｋｅｄａＳ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．１９８１；４（９）：７２４－７３４）。これは、４－ＭＵがヒトにおけるＨＡ合成を阻害するために再利用され得ることを示唆する。実際、４－ＭＵは、ＨＡ関連線維性肝疾患および自己免疫性胆道疾患の治療としてヒト臨床試験において調査中である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ：ＮＣＴ００２２５５３７，ＮＣＴ０２７８０７５２）。

残念ながら、４－ＭＵは、胆管外での使用が制限されると考えられる不十分な薬物動態を有する。４－ＭＵの全身経口バイオアベイラビリティは＜３％であることが報告されており、主に、肝臓および小腸における広範な初回通過グルクロン酸抱合に起因する（ＧａｒｒｅｔｔＥ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．ＤｒｕｇＤｉｓｐｏｓ．１９９３；１４（１）：１３－３９、ＫｕｌｔｔｉＡ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２００９；３１５（１１）：１９１４－１９２３）。全身循環に到達する任意の４－ＭＵは、ヒトにおいて２８分の半減期（マウスにおいて３分）で急速に代謝され、所与の用量の＜１％が尿中で変化なく排泄される（ＧａｒｒｅｔｔＥ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．ＤｒｕｇＤｉｓｐｏｓ．１９９３；１４（１）：１３－３９、ＫｕｌｔｔｉＡ．，ｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２００９；３１５（１１）：１９１４－１９２３）。したがって、４－メスリュンベリフェリルグルクロニド（４－ＭＵＧ）の中央値血漿中濃度は、マウスモデルにおいて４－ＭＵのそれよりも３，０００倍以上高い（ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：１２３）。類似の知見が健康なヒトボランティアにおいて報告されている（ＧａｒｒｅｔｔＥ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．ＤｒｕｇＤｉｓｐｏｓ．１９９３；１４（１）：１３－３９）。不十分なバイオアベイラビリティおよび短い半減期にもかかわらず、４－ＭＵの経口投与は、インビボでのＨＡ合成を阻害し、このことは、追加の因子がその活性および持続的効果を増強し得ることを示唆する。

４－ＭＵＧは生物学的に活性であり、ＨＡ合成を直接阻害することが発見されている。これは、特にほとんどのグルクロニド代謝産物が生体活性ではないため、予測されなかったか、または自明ではなかった。本明細書に記載されるように、本発明者らは、４－ＭＵＧが、がん、自己免疫性、線維性および炎症性疾患を含む様々な文脈において、ＨＡ合成を阻害することができることを示している。

この概要は、以下の詳細な説明でさらに説明される、簡略化された形態での概念の選択を導入するために提供される。この概要は、特許請求の範囲の主題の重要な特徴を同定することを意図するものでもなく、特許請求の範囲の主題の範囲を決定する際の補助として使用されることを意図するものでもない。

一態様において、本開示は、（ｉ）ヒアルロナン合成を阻害する化合物、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療するための組成物を提供する。

一実施形態において、化合物はＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤である。

一実施形態において、化合物はＵＤＰ－グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である。

一実施形態において、化合物は４－メチルウンベリフェロン－グルクロニドである。

一実施形態において、化合物は、調節性Ｔ細胞応答を誘導するために有効である。

一実施形態において、化合物は、ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞を増加させるために有効である。

一実施形態において、自己免疫性疾患または障害は、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、線維筋痛症、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・ショーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、腎症、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、ループス、多発性硬化症、視神経脊髄炎、結節性多発動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆道炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（巨細胞性動脈炎）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、血管炎、および白斑からなる群から選択される。

一実施形態において、炎症性疾患または障害は、腎虚血再灌流損傷、喘息、肺高血圧症、２型糖尿病、関節炎、アテローム性動脈硬化症、創傷治癒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、同種移植拒絶、移植片対宿主病、皮膚筋炎、炎症性腸疾患、および脳卒中からなる群から選択される。別の実施形態において、炎症性疾患または障害は、２型糖尿病、同種移植拒絶、または移植片対宿主病である。

一実施形態において、線維性疾患または障害は、原発性硬化性胆道炎、胆汁性肝硬変、胆道痙攣、肝硬変、肝線維症、腎線維症、皮膚線維症、腸線維症、および肺線維症からなる群から選択される。

一実施形態において、増殖性疾患または障害は、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、食道がん、乳がん、肝臓がん、骨がん、卵巣がん、腎臓がん、肛門がん、脳がん、胆道がん、黒色腫、インスリノーマ、子宮内膜がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、およびリンパ腫からなる群から選択される。別の実施形態において、増殖性疾患または障害は、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、または卵巣がんである。

一態様において、本開示は、必要とする哺乳動物対象における自己性免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患にしくは障害を治療するための方法を提供し、本方法は、哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、哺乳動物対象に投与することを含む。

一実施形態において、化合物は、調節性Ｔ細胞応答を誘導するためにに有効である。

一実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。

一態様において、本開示は、増殖性疾患に罹患しているか、または増殖性疾患を発症するリスクがある哺乳動物対象について増殖性疾患を治療かつ／または増殖性疾患の進行を逆転するための方法を提供し、本方法は、哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、哺乳動物対象に投与することを含む。

一実施形態において、化合物は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤またはＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である。

一実施形態において、化合物は、４メチルウンベリフェロン－グルクロニドである。

一実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。

一実施形態において、増殖性疾患は、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、卵巣がんである。

一態様において、本開示は、１型糖尿病または２型糖尿病を、必要とする哺乳動物対象について治療するための方法を提供し、本方法は、哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、哺乳動物対象に投与することを含む。

一実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。

本発明の前述の態様および多くの付随する利点は、より容易に理解され、同じことは、付属の図面と併せて考慮するとき、以下の詳細な説明を参照することによってより良好に理解される。

４－ＭＵおよびその一次代謝産物である４－ＭＵＧおよび４－ＭＵＳの分子構造を図示する。ＨＰＬＣを介して測定した４－ＭＵチョウを２週間供給した動物の血漿中の４－ＭＵおよびその代謝産物の濃度を示す。ＨＰＬＣを介して測定した２週間４－ＭＵを供給したマウスの血清中の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの異なる濃度を示す。４－ＭＵ中で４８時間培養したＢ１６Ｆ１０細胞によるＨＡ産生を示す。４－ＭＵＧ中で４８時間培養したＢ１６Ｆ１０細胞によるＨＡ産生を示す。対照（左）、４－ＭＵ（中）または４－ＭＵＧ（右）としてＤＭＳＯ中で培養したＢ１６Ｆ１０細胞におけるＨＡ染色の代表的な画像を示す。ＣＴＬＬ２細胞における４－ＭＵまたは４－ＭＵＧによる処置時のＨＡ合成阻害を示す。Ｍｉｎ６細胞における４－ＭＵまたは４－ＭＵＧによる処置時のＨＡ合成阻害を示す。２００μｌのＰＢＳおよび１０％のＦＣＳを充填した９６ウェルプレートのウェルにおける蛍光可視化を示し、いくつかのウェルでは、４－ＭＵ（中央）および４－ＭＵＧ（右）を添加し、対照ウェルは未処置のままであった（左）。４－ＭＵおよび４－ＭＵＧを別々にＤＭＥＭに添加した後の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した経時的な蛍光シグナルを示す。４－ＭＵＧの蛍光値を４－ＭＵ蛍光に対して正規化した。フローサイトメトリーを使用して検査した、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧと２４、４８、または７２時間インキュベートしたＢ１６Ｆ１０細胞由来の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの蛍光を示す。フローサイトメトリーを使用して検査した、透過処置前および透過処置後の、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ処置したＢ１６Ｆ１０細胞由来の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧシグナルの蛍光を示す。治療開始前、ならびに２、７、および１４日後に、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅチャネルで測定されるような、フローサイトメトリーによって分析した血液中の異なる細胞サブセットにおける４－ＭＵおよび４－ＭＵシグナルで治療したマウスの結果を示す。太字ヒストグラムは、４－ＭＵ治療マウスにおけるシグナルを示し、陰影付きヒストグラムは、未治療マウスにおけるバックグラウンドＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅシグナルを示す。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用した、未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの血清中の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ濃度を示す。未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの血清中の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの計算されたモル比を示す。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用した、未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの膵臓における４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ濃度を示す。未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの膵臓における４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの計算されたモル比を示す。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用した、未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの脂肪中の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ濃度を示す。未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの脂肪における４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの計算されたモル比を示す。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用した、未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの肝臓における４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ濃度を示す。未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの肝臓における４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの計算されたモル比を示す。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用した、未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの筋肉における４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ濃度を示す。未治療対照マウスならびに４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウスの筋肉における４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの計算されたモル比を示す。４－ＭＵ、４－ＭＵＧ、および４－ＭＵＧの非加水分解性バージョンの構造を図示する。４－ＭＵ、４－ＭＵＧまたは非加水分解性４－ＭＵＧ中で４８時間培養したＢ１６Ｆ１０細胞によるＨＡ産生を示す。４－ＭＵ、４－ＭＵＧまたは非加水分解性４－ＭＵＧ中で４８時間培養した、ＨＡＳ３合成と併せてＨＡを過剰発現するように操作されたＣＨＯ－ＨＡＳ３細胞によるＨＡ産生を示す。１２週齢で、未治療のＤＯＲｍＯマウス（対照）、４－ＭＵを供給したＤＯＲｍＯマウス、および４－ＭＵＧを供給したＤＯＲｍＯマウスからの膵臓組織の代表的なＨＡ染色を示す。未治療のＤＯＲｍＯマウス、ならびに５週齢から開始し、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧにおいて１５週間維持した、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧを供給したＤＯＲｍＯマウスの血糖を示す。未治療（対照）および４－ＭＵ治療ＤＯＲｍＯマウスからの膵島組織の代表的なＦｏｘＰ３染色を示す。フローサイトメトリーによって分析されるように、４－ＭＵ（０．５ｍｇｉ．ｐ．）または４－ＭＵＧ（１ｍｇｉ．ｐ．）で１４日間毎日治療したマウスから単離された脾細胞中のＣＤ３＋細胞を示す。フローサイトメトリーによって分析されるように、４－ＭＵ（０．５ｍｇｉ．ｐ．）または４－ＭＵＧ（１ｍｇｉ．ｐ．）で１４日間毎日治療したマウスから単離された脾細胞中のＣＤ３＋細胞のＣＤ４＋を示す。フローサイトメトリーによって分析されるように、４－ＭＵ（０．５ｍｇｉ．ｐ．）または４－ＭＵＧ（１ｍｇｉ．ｐ．）で１４日間毎日治療したマウスから単離された脾細胞中のＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞の中のＦｏｘｐ３＋を示す。フローサイトメトリーによって分析されるように、４－ＭＵ（０．５ｍｇｉ．ｐ．）または４－ＭＵＧ（１ｍｇｉ．ｐ．）で１４日間毎日治療したマウスから単離された脾細胞中のＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞間のＦｏｘｐ３＋ＭＦＩを示す。比較のために提供される、１０週間、対照チョウまたは４－ＭＵチョウのいずれかにおける１５週齢のｄｂ／ｄｂマウス、ならびにｄｂ／＋同腹仔の代表的な画像、血糖（ＢＧ）値、および重量（Ｗｔ）を示す。１０週間、飲料水中の対照チョウ、４－ＭＵチョウ、または４－ＭＵＧのいずれかを供給された１５週齢のｄｂ／ｄｂマウス、ならびに対照チョウを供給されたｄｂ／＋同腹仔対照のランダム（供給）ＢＧ値を示す。各点が１匹のマウスを表している、図７Ｂのマウスの重量を示す。５週齢から開始し、飲料水中の対照チョウ、４－ＭＵチョウ、または４－ＭＵＧにおいて維持されたｄｂ／ｄｂマウスのＢＧレベルを示す。５週齢から開始し、飲料水中の対照チョウ、４－ＭＵチョウ、または４－ＭＵＧにおいて維持されたｄｂ／ｄｂマウスの重量を示す。４－ＭＵを２週間供給された絶食時ｄｂ／ｄｂマウスの腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）を示す。４－ＭＵＧを２週間供給された絶食時ｄｂ／ｄｂマウスの腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）を示す。Ｂ６マウスにおける膵島におけるＨＡ染色を示す。ｄｂ／ｄｂ対照マウスにおける膵島におけるＨＡ染色を示す。４－ＭＵを供給されたｄｂ／ｄｂマウスにおける膵島におけるＨＡ染色を示す。インビトロで観察されるベータ細胞株によるＨＡ合成の阻害を示す。４－ＭＵＧの化学安定性評価の表である。４－ＭＵＧの化学安定性を時間（分）に対する面積比として示すグラフである。４－ＭＵＧの化学安定性を時間（分）に対する残存パーセントで示すグラフである。

本開示は、増殖性、自己性免疫性および炎症性疾患もしくは障害における細胞外マトリックス分子ＨＡの重要な役割、ならびにＨＡ合成を阻害する化合物、特に４－ＭＵＧの同定を記載する。本開示は、自己免疫を無効にするための新規の治療薬としての４－ＭＵＧの使用、ならびに自己性免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害、例えば、がん、１型糖尿病、２型糖尿病、および脳卒中を治療するための４－ＭＵＧの使用を記載する。

本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本開示の当業者にとっての意味と同じ意味を有する。特許請求された主題を記載するために本明細書および特許請求の範囲で使用される用語について明確性を提供するために、以下の定義は、提供される。

本明細書で使用される場合、「調節性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」細胞という用語は、細胞表面マーカーＣＤ４＋およびＣＤ２５＋を発現するＴ細胞を指し、それは、ウェスタンブロットおよび／またはＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ転写産物によって測定されるようなＦｏｘＰ３タンパク質を発現する。

本明細書で使用される場合、「抗原特異的調節性Ｔ細胞」または「抗原特異的Ｔｒｅｇ」という用語は、抗原の存在下で誘導され、細胞表面マーカーＣＤ４＋およびＣＤ２５＋を発現するＴｒｅｇ細胞を指し、それは、ウェスタンブロットおよび／またはＦｏｘＰ３ｍＲＮＡ転写産物によって測定されるようなＦｏｘＰ３タンパク質を発現する。

対象は、ヒトまたは非ヒト動物である、脊椎動物であり得、これらには典型的には、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含むが、これらに限定されない。より典型的には、対象は、哺乳動物、特定の実施形態において、ヒトである。

本明細書で使用される場合、「増殖性疾患」は、腫瘍疾患またはがん、および／または任意の転移であり、腫瘍または転移がどこに位置するかにかかわらず、より具体的には、乳房、結腸、肝臓、甲状腺、肺、胃、食道、胆嚢、腎臓、子宮、膀胱、甲状腺、脳、または骨のがんから、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、および卵巣がんを含む群から選択される腫瘍であり、より広義には、ヒアルロナンが増加することが言及されているがんの型である。

本明細書で使用される場合、「自己免疫性疾患」は、個体自身の組織に起因し、それに対して指向される疾患または障害である。自己免疫性疾患または障害の例としては、限定されないが、多発性硬化症、関節炎（リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎）、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症反応を伴う状態、自己免疫性心筋炎、天疱瘡、１型糖尿病（自己免疫性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも称される）、自己免疫性肺疾患等が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「炎症性疾患」は、限定されないが、糖尿病（２型糖尿病、１型糖尿病、尿崩症、真性糖尿病、成熟発症糖尿病、若年糖尿病、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、栄養不良関連糖尿病、ケトーシスプローン糖尿病またはケトーシス耐性糖尿病など）、脳卒中、腎症（糸球体腎炎または急性／慢性腎不全など）、肥満（遺伝性肥満、食事肥満、ホルモン関連肥満または投薬関連肥満など）、難聴（外耳炎または急性中耳炎に起因するものなど）、線維症関連疾患（肺間質線維症、腎線維症、嚢胞性線維症、肝線維症、創傷性／慢性腎不全損傷または焼灼熱など）、肥満症（リウマチ、関節炎、アレルギー性関節炎など）、アレルギー性呼吸器炎関連疾患（肺間質線維症、腎線維症、嚢胞性線維症、肝線維症、創傷治癒または熱傷治癒であって、ここで熱傷は、第１、第２、または第３度の熱傷、および／または熱、化学、または電気性熱傷であるものなど）、関節炎（関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、痛風など）、アレルギー、アレルギー性鼻炎、急性呼吸困難症候群、喘息、気管支炎、炎症性腸疾患（過敏性腸症候群、粘液性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、胃炎、食道炎、膵炎または腹膜炎など）、または自己免疫性疾患（強皮症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、移植拒絶反応、エンドトキシンショック、敗血症、乾癬、湿疹、皮膚炎、もしくは多発性硬化症など）を含む炎症状態から生じる疾患または障害である。

本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」という用語は、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害に関連する少なくとも１つの症状を効果的に予防、抑制、または排除するために、本開示による化合物を投与することを意味する。少なくとも１つの症状を予防することは、臨床疾患に関連する症状の発症前に、対象に治療を施用することを伴う。少なくとも１つの症状を抑制することは、疾患の臨床的外観の後に、対象に治療を施用することを伴う。

本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という表現は、例えば、増殖性、自己免疫性、または炎症性疾患または障害の予防、改善、または予防等の所望の治療結果を達成するために有効な本開示の化合物の量を指す。本開示の化合物は、治療有効量の化合物を、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物として投与することができる。本開示の文脈において、「治療有効量」は、この特定の場合、自己免疫性疾患または障害、特に多発性硬化症を治療する所望の効果を達成するために必要な、同定されたＨＡポリマーの合成、発現、および／または活性を阻害する化合物の量として理解される。一般に、投与されるべき本開示による化合物の治療有効量は、他の要因の中でもとりわけ、治療されるべき個体、個体が罹患する疾患の重症度、選択された剤形等に依存する。このため、本開示で言及される用量は、当業者のガイドラインとしてのみ考慮されなければならず、当業者は、前述の変数に従って用量を調整しなければならない。

化合物の治療有効量は、概して、最大許容投薬量までの範囲であるが、濃度は重要ではなく、広く変化し得る。主治医によって用いられる正確な量は、もちろん、化合物、投与経路、患者の体調および他の要因に応じて変化する。１日投薬量は、単回用量として投与することができるか、または投与のための複数の用量に分けることができる。

実際に投与される化合物の量は、治療有効量であり、この用語は、実質的な有益な効果を生じるために必要な量を示すために本明細書で使用される。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量応答曲線から推定することができる。動物モデルはまた、典型的には、所望の投薬量範囲および投与経路を決定するために使用される。次いで、かかる情報を使用して、ヒトまたは他の哺乳動物における投与のための有用な用量および経路を決定することができる。有効用量の決定は、当業者の能力の範囲内に十分にある。したがって、実際に投与される量は、治療が適用される個体に依存し、好ましくは、所望の効果が有意な副作用なしに達成されるように最適化された量である。

本開示の化合物の治療有効性および可能な毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる（例えば、集団の５０％において治療的に有効な用量であるＥＤ５０、および集団の５０％に対する致死用量であるＬＤ５０）。治療効果と毒性効果との間の用量比は、治療指標であり、それは、ＬＤ５０対ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指標を示す修飾治療薬物化合物は、本開示の方法の実施に特に好適である。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトまたは他の哺乳動物で使用するための投薬量の範囲の製剤化することに使用することができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、典型的には、用いられる剤形、患者の感受性、および投与経路に依存するこの範囲内で変化する。したがって、最適な量は、投与方法によって異なり、一般に、同じまたは同様の形態で投与される従来の医薬品の量に従う。それにもかかわらず、本開示による化合物は、０．１μｇ～１０，０００ｍｇ／日、典型的には１００～１，５００ｍｇ／日を含む典型的な１日の総量で、１日１回以上、例えば、１日１、２、３、または４回投与することができる。

本開示の化合物は、単独で、または１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与することができる。各場合における適切な量は、特定の剤によって異なり、当業者に容易に既知であるか、または日常的な実験によって容易に決定可能である。

本開示の化合物の投与は、任意の有効な経路、例えば、非経口、局所、または経口経路によって達成される。投与方法としては、吸入、口腔内、髄内、静脈内、鼻腔内、直腸内、眼内、腹腔内、動脈内、関節内、嚢内、頸椎内、頭蓋内、管内、硬膜内、病変内、筋肉内、腰部内、壁内、眼内、術中、頭頂内、腹腔内、胸膜内、肺内、脊髄内、胸腔内、気管内、鼓膜内、子宮内、血管内、および心室内投与、ならびに他の従来の手段が挙げられる。抗腫瘍活性を有する本開示の化合物は、腫瘍内、腫瘍の近傍、腫瘍に血液を供給する血管内、または腫瘍内にもしくは腫瘍から排出されるリンパ節もしくはリンパ管内に直接注入することができる。

化合物の肺送達のための当該技術分野で既知の好適なエアロゾル推進剤を使用して、本開示のエマルション、マイクロエマルション、およびミセル製剤を霧化することができる。

本開示の化合物を、対象への化合物の投与を容易にする賦形剤および他の化合物を含む、好適な薬学的に許容される担体をさらに含む組成物に製剤化することができる。製剤化および投与のための技法のさらなる詳細は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」（ＭａａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に見出すことができる。

経口投与のための組成物を、経口投与に好適な投薬量で、当該技術分野で周知の薬学的に許容される担体を使用して製剤化することができる。かかる担体は、本開示の化合物を含有する組成物を、対象による摂取に好適な錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液として製剤化することを可能にする。経口使用のための組成物は、必要に応じて好適な追加の化合物を添加した後、例えば、固体賦形剤と組み合わせて製剤化し、任意選択で、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。好適な賦形剤としては、炭水化物またはタンパク質充填剤が挙げられる。これらには、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、ならびにアラビアガムおよびトラガカントガムを含むガム、ならびにゼラチンおよびコラーゲン等のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を、添加することができる。

糖衣錠コアには、アラビア酸ガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物も含むことができる、濃縮糖溶液等の好適なコーティングが提供される。染料または顔料を、生成物同定のために、または活性化合物の量（すなわち、投薬量）を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。

経口投与のための化合物を、例えば、ゼラチンから作製されたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンから作製された軟質密封カプセル、ならびにグリセロールまたはソルビトール等のコーティングとして製剤化することができる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意選択で安定剤と混合された化合物を含有することができる。ソフトカプセルでは、共有結合体を、安定剤を有するか否かにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール等の好適な液体中に溶解または懸濁させることができる。

局所投与または経鼻投与のために、浸透させる特定のバリアに適切な浸透剤が、典型的には製剤に使用される。これらの例は、２－ピロリドン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾンである。製剤を美容的に許容可能にするために、追加の剤をさらに含むことができる。これらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、香料、防腐剤、安定剤、および表面活性剤である。当該技術分野で知られているもの等の角化分解剤も挙げられ得る。例は、サリチル酸および硫黄である。局所投与のために、組成物は、化合物の全身送達のための経皮軟膏またはパッチの形態であり得、従来の様式で調製することができる（例えば、Ｂａｒｒｙ，ＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（ＤｒｕｇｓａｎｄｔｈｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ－－Ｄｅｋｋｅｒ）；Ｈａｒｒｙ’ｓＣｏｓｍｅｔｉｃｏｌｏｇｙ（ＬｅｏｎａｒｄＨｉｌｌＢｏｏｋｓを参照されたい）。

直腸投与のために、組成物を、座薬または保持浣腸の形態で投与することができる。かかる組成物は、化合物を、通常の温度では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸内で溶解して薬物を放出する好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。好適な賦形剤には、ココアバターおよびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。

これらの様々な型の添加剤の各々の量は、同じ型の投与のために設計された他の既知の製剤と同じである最適な量であって、当業者には容易に明白である。

本開示の化合物を含有する組成物は、当該技術分野で既知のものと同様の様式で製造することができる（例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥プロセスによって）。組成物を、従来の手段（例えば、コーティング）によって、適切な放出特性、持続放出、または標的化放出を提供するように修正することもできる。上記に言及されるように、一実施形態において、化合物はエマルジョンとして製剤化される。

化合物を含有する組成物は、塩として提供され得、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、およびコハク酸を含むが、これらに限定されない多くの酸と共に形成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性または他のプロトン性溶媒中で可溶性である傾向にある。

４－ＭＵは、ヒト臨床試験を含むＨＡ合成の阻害剤として再利用されている承認された薬物であるが、迅速かつ効率的なグルクロン酸抱合は、その全身的有用性を制限すると考えられる。以下により詳細に記載されるように、４－ＭＵ、４－ＭＵＧの主要代謝産物は、２つの方式でＨＡ合成阻害に積極的に寄与する。第１に、４－ＭＵＧは、血清中で４－ＭＵに加水分解され、それによって薬物の有効なバイオアベイラビリティを大幅に増加させる。４－ＭＵまたは４－ＭＵＧのいずれかを供給されたマウスは、血清、肝臓および膵臓において４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの等価な比を有し、このことは、４－ＭＵと４－ＭＵＧとの間には組織中での平衡があることを示す。第２に、４－ＭＵＧの非加水分解性バージョンもまた、ＨＡ合成を阻害することがさらに示され、このことは、４－ＭＵＧが、４－ＭＵへの変換とは無関係に、それ自体の直接的な生物活性を有することを示す。これらの知見と一致して、マウスへの４－ＭＵＧの経口投与は、ＨＡ合成を阻害し、ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞拡張を促進し、インビボで自己免疫性糖尿病を予防する。本開示は、４－ＭＵＧが４－ＭＵのバイオアベイラビリティに寄与し、定常状態で４－ＭＵの有効な組織薬物レベルが以前に考えられたよりも実質的に高いことを示す。

がん、線維症、糖尿病、炎症、および他の設定におけるＨＡの重要な役割を考慮すると、ＨＡ合成の阻害に大きな関心がある。例えば、４－ＭＵＧの標的であるＨＡを、脳卒中において、連結するデータが存在する（Ｔａｎｇ，Ｓ．Ｃ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ２０１４；１１：１０１；ＫｒｕｐｉｎｓｋｉＪ，Ｊ．ＢｉｏｍａｒｋＩｎｓｉｇｈｔｓ２００８；１２（２）：３６１－３６７）。

これまでに、ＨＡ合成を阻害することが知られている唯一の分子は４－ＭＵである。以下でより詳細に記載されるように、本発明者らは、４－ＭＵの代謝産物である４－メチルウンベリフェロン－グルコロニド（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄｅ）（４－ＭＵＧ）が、ＨＡ合成を直接阻害することができることを発見した。この活性は、単に４－ＭＵへの変換の結果ではなく、４－ＭＵＧの非加水分解性バージョンを使用して実証される。さらに、データは、４－ＭＵＧが４－ＭＵの濃度のフラクションでＨＡ合成を阻害することを示す。親分子とは独立した生物学的活性を有するグルコロニドが非常に少ないことを考えると、これらの知見は予測されない。さらに、治療および実験用途のためのＨＡの阻害への関心が非常に高いことを考慮すると、これらの知見は、ＨＡが糖尿病、がん、脳卒中、炎症、線維症、および自己免疫を含む疾患病因に寄与する様々な適応症において実質的な潜在的有用性を有する。

４－ＭＵＧは、４－ＭＵの活性代謝産物であり、ＨＡ合成を阻害する
４－ＭＵＧは、４－ＭＵの活性代謝産物であり、ＨＡ合成を阻害する。４－ＭＵＧは、４－ＭＵの主要代謝産物である。未公開のデータは、４－ＭＵＧおよび新たに記載された４－ＭＵＧの誘導体が実際に薬理学的に活性であることを示す。実際、４－ＭＵＧは、親薬物である４－ＭＵとちょうど同様に、ヒト細胞株によるＨＡ合成をよく阻害する。４－ＭＵＧのいくつかの誘導体も同様に、薬理学的に活性である。４－ＭＵＧの全ての誘導体がＨＡ合成に対して活性であるわけではない。これは、ＨＡ合成を阻害するための剤として４－ＭＵＧまたは４－ＭＵＧ誘導体を送達することが可能であり得ることを示唆する、刺激的で以前に知られていない知見である。

４－ＭＵＧがＨＡ合成をどのように阻害するかは不明確である。典型的には、グルコロニド化（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｔｉｏｎ）は、ほとんどの薬物の排泄およびクリアランスを促進する代謝ステップである。実際、グルコロニド化（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｔｅｄ）化合物は多くの場合、より水溶性であるため、それらは典型的には、細胞ならびにより親油性化合物に入らない。したがって、４－ＭＵＧまたはその誘導体がＨＡ合成を阻害することは明らかでも直感的でもない。

４－ＭＵＧは、インビトロでＨＡ合成を阻害する
複数のＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）による肝臓および腸における４－ＭＵの効率的なグルクロン酸抱合の結果、経口４－ＭＵチョウにおけるマウスに全身的に存在する主な形態は、以前に報告されているように、４－ＭＵＧである（ＭｕｌｄｅｒＧＪ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍａｃｏｌ．１９８５；３４（８）：１３２５－１３２９）。例えば、図１Ａは、４－ＭＵおよびその一次代謝産物である、４－ＭＵＧおよび４－ＭＵＳの分子構造を図示する。図１Ｂは、ＨＰＬＣを介して測定された、４－ＭＵチョウを２週間供給した動物の血漿中の４－ＭＵおよびその代謝産物の濃度を示す。１群あたりＮ＝３匹の動物である。図１Ｃは、ＨＰＬＣを介して測定された、４－ＭＵを２週間供給したマウスの血清中の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの異なる濃度を示す。１群あたりＮ＝３匹の動物である。図１Ｃに示すように、４－ＭＵＧの中央値血清濃度は、親化合物４－ＭＵよりも約１５０倍高かった。

代謝産物の活性は薬物動態決定における重要な変数であるため、ＨＡ合成阻害における主な４－ＭＵ代謝産物４－ＭＵＧの役割を調査した。これを試験するために、豊富なＨＡを産生することが知られている細胞株であるマウス黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１０）を使用した。薬物曝露４８時間後、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ処置Ｂ１６Ｆ１０細胞の両方におけるＨＡ合成の濃度依存的阻害が観察された。図４Ｄおよび４Ｅは、４－ＭＵ（図１Ｄ）または４－ＭＵＧ（図１Ｅ）中で４８時間培養したＢ１６Ｆ１０細胞によるＨＡ産生を示す。図１Ｆは、対照（左）、４－ＭＵ（中）または４－ＭＵＧ（右）としてＤＭＳＯ中で培養したＢ１６Ｆ１０細胞におけるＨＡ染色の代表的な画像を示す。データは、平均値±ＳＥＭを表し、対のないｔ検定による＊ｐ＜０．０５である。原発性リンパ球にも同様の知見が見られた。ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）を使用するこれらの細胞の蛍光染色は、図１Ｆに示すように、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧでの処置が両方ともＨＡを減少させたことを示した。これらの結果を総合すると、４－ＭＵまたは４－ＭＵＧのいずれかによる処置がＨＡ合成を阻害することが実証される。

４－ＭＵＧは細胞内で４－ＭＵに加水分解される
ＨＡ合成の阻害につながる４－ＭＵの確立された活性を考慮すると、４－ＭＵＧの生物活性は、その４－ＭＵへの加水分解に起因し得ることは可能であるようであった。４－ＭＵは蛍光性であり、一方、４－ＭＵＧは蛍光性でないことは一般に知られている。特に、４－ＭＵは、水中で３８０ｎｍの励起波長および４５４ｎｍの発光波長を有する。

図２Ａは、２００μｌのＰＢＳおよび１０％のＦＣＳを充填した９６ウェルプレートのウェルにおける蛍光可視化を示し、いくつかのウェルでは４－ＭＵ（中央）および４－ＭＵＧ（右）が添加され、対照ウェルは未処置のままであった（左）。図２Ｂは、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧを別々にＤＭＥＭに添加した後の、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定されるような経時的な蛍光シグナルを示す。４－ＭＵＧの蛍光値を、４－ＭＵ蛍光に対して正規化した。図２Ｂを参照すると、４－ＭＵまたは４－ＭＵＧを１０％のＦＣＳを有するＰＢＳに添加し、蛍光プレートリーダーを使用して蛍光シグナルの増加を、間隔を空けて最大７２時間まで監視した。予測通り、４－ＭＵはベースラインで蛍光シグナルを有した。一方、図２Ｂに示すように、４－ＭＵＧの蛍光は、３０時間前後に開始してのみ検出されることができた。図２Ｃは、フローサイトメトリーを使用して検査された４－ＭＵおよび４－ＭＵＧと共に２４、４８、または７２時間インキュベートしたＢ１６Ｆ１０細胞由来の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの蛍光を示す。図２Ｃを参照すると、図２Ｃに示すように、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧをＢ１６Ｆ１０細胞に添加し、４－ＭＵＧで処置した細胞が４８～７２時間後に蛍光になることが見出された。図２Ｄは、フローサイトメトリーを使用して透過処置前および透過処置後に検査した、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ処置したＢ１６Ｆ１０細胞からの４－ＭＵおよび４－ＭＵＧシグナルの蛍光を示す。図２Ｄに示すように、これらの細胞の蛍光は透過処置時に失われ、このことは、蛍光４－ＭＵのほとんどが細胞内であることを示唆する。

総合すると、これらのデータは、４－ＭＵＧが細胞によって取り込まれ、再び４－ＭＵに変換され、ＨＡ合成阻害に対するその効果をもたらすことを示す。しかしながら、４－ＭＵＧから４－ＭＵへの変換も培地単独中にインビトロで行われるため、細胞外変換もまた生じることが明らかである。

４－ＭＵはリンパ球によって取り込まれる
４－ＭＵの蛍光を４－ＭＵ取り込みのバイオマーカーとして使用して、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧが、インビボでの循環細胞および組織によって取り込まれるか否かを決定するために、少なくとも１４日間経口４－ＭＵ治療をされたマウスの脾臓組織および血液から単離された細胞の４－ＭＵシグナルを、評価した。ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅチャネルを使用して、４－ＭＵシグナルは、４－ＭＵで治療されたマウス由来の脾細胞および循環白血球において観察され、このことは、４－ＭＵがインビボでリンパ組織内の細胞によって取り込まれること、ならびに細胞外マトリックスへの結合を示す（データ示さず）。

次に、異なる白血球サブセットによる４－ＭＵの取り込みを検査した。このために、マウスに４－ＭＵを供給し、４－ＭＵ治療の開始後０、２、７、および１４日の間隔で、代表的な動物由来の血液白血球において４－ＭＵシグナルを検査した。図３は、治療開始前、および治療開始２、７、および１４日後に、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅチャネルで測定されたように、フローサイトメトリーによって分析された血液中の異なる細胞サブセット上での、４－ＭＵおよび４－ＭＵシグナルで治療したマウスの結果を示す。太字ヒストグラムは、４－ＭＵ治療マウスにおけるシグナルを示し、陰影付きヒストグラムは、未治療マウスにおけるバックグラウンドＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅシグナルを示す。細胞表面マーカーを染色して、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、Ｂ細胞（Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋Ｂ２２０＋）樹状細胞（ＤＣ；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋ＣＤ１１ｃ＋）、マクロファージ（Ｍφ；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋ＣＤ１１ｃ－）、好中球（Ｌｙ６Ｇ／Ｃ＋ＣＤ１４＋）、および単球（Ｌｙ６Ｇ／Ｃ－ＣＤ１４＋）を含む複数の細胞型による４－ＭＵ取り込みを検査した。

再び図３を参照すると、蛍光４－ＭＵシグナルは、４８時間治療したマウスでは見られなかったが、１週間の治療後に可視化され始めた。この結果は、１～２週間の経口４－ＭＵ治療がＨＡ合成への効果が明らかになるために必要であるという以前の報告と一致する（ＫｕｉｐｅｒｓＨＦ，ｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＥｘｐＩｍｍｕｎｏｌ．２０１６Ｓｅｐ；１８５（３）：３７２－８１）。４－ＭＵ治療後の７日目までに、４－ＭＵシグナルは、これらの細胞集団の全てにおいてわずかに可視であり、１４日目までに、全てのシグナルが様々な程度で決定的に増加する。これらのデータは、複数の白血球集団が４－ＭＵを取り込むこと、およびこれが発生するために１～２週間の期間が必要であることを示す。総合すると、これらのデータは、４－ＭＵが常在細胞によって取り込まれることを実証する。

４－ＭＵまたは４－ＭＵＧのインビボ投与は、４－ＭＵの４－ＭＵＧに対する同じ血清比につながる
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）は、４－ＭＵまたは４－ＭＵＧが組織内に存在することを示し、４－ＭＵＧと４－ＭＵとの間の相互変換を特徴付ける。図４Ａ～４Ｊは、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療マウス由来の血清および臓器中の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ濃度を示す。図４を参照すると、血清中に存在する４－ＭＵと４－ＭＵＧとの間の得られた比は、どの薬物が投与されたかにかかわらず１：７２のモル比に達し（図４Ｂ）、このことは、２つの化合物が共に平衡に存在することを示している。同じ量の各薬物が、同じ比によって示されるように生体利用可能であったが、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧのレベルは、４－ＭＵＧ治療マウスにおいて、４－ＭＵ治療マウスと比較してより低く（図４Ａ）、このことは、４－ＭＵＧがより高い効率で吸収されたことを示唆している。４－ＭＵ治療動物において、膵臓組織におけるよりも高いレベルの４－ＭＵが血清中で見られた（１００５ｎｇ／ｍＬ対６４．８ｎｇ／ｍＬ）（図４Ａおよび４Ｃ）。しかしながら、４－ＭＵＧ（１０２００ｎｇ／ｍＬ対２．５ｎｇ／ｍＬ）を供給したマウスの血清におけるよりも実質的に高いレベルの４－ＭＵが、膵臓組織において見られた（図４Ａおよび４Ｃ）。血清中の４－ＭＵ：４－ＭＵＧの比（４－ＭＵ治療では１：７３、４－ＭＵＧ治療では１：７２）（図４Ｂ）は、膵臓中の４－ＭＵ：４－ＭＵＧの比（４－ＭＵ治療では１：０．２７、４－ＭＵＧ治療では１：０．４５）よりもはるかに小さく、このことは、４－ＭＵが４－ＭＵＧよりも組織内で効率的に結合されたことを示唆している。さらに、脂肪（図４Ｅおよび４Ｆ）、肝臓（図４Ｇおよび４Ｈ）、ならびに筋肉（図４Ｉおよび４Ｊ）において、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ濃度を調査した。同様の４－ＭＵ：４－ＭＵＧ比が脂肪および筋肉において観察され、ここで、４－ＭＵ治療した動物は、４－ＭＵＧ治療と比較して有意により高い量の４－ＭＵＧを有した（図４Ｆおよび４Ｊ）。興味深いことに、血清と同様に肝臓は、治療が何であれ４－ＭＵと４－ＭＵＧとの間の平衡を示した（図４Ｇおよび４Ｈ）。肝臓は、治療に関係なく４－ＭＵＧと比較して、４－ＭＵの高濃度を有する（図４Ｈ）。

総合すると、これらのデータは、４－ＭＵＧがインビボで４－ＭＵに変換され、４－ＭＵがインビボである範囲の組織および細胞型によって取り込まれ、組織構造が４－ＭＵのリザーバーとして機能することを示す。

非加水分解性バージョンの４－ＭＵＧは、ＨＡ合成を阻害する
４－ＭＵＧが４－ＭＵへの変換とは無関係に生物活性を有するか否かを試験するために、４－ＭＵＧの非加水分解性バージョンを生成した。図５Ａは、４－ＭＵ、４－ＭＵＧ、および４－ＭＵＧの非加水分解性バージョンの構造を図示する。非蛍光であるこの剤は、培養物中で蛍光４－ＭＵに変換されなかった。

図５Ｂは、４－ＭＵ、４－ＭＵＧまたは非加水分解性４－ＭＵＧ中で４８時間培養したＢ１６Ｆ１０細胞によるＨＡ産生を示す。図５Ｃは、４－ＭＵ、４－ＭＵＧ、または非加水分解性４－ＭＵＧ中で４８時間培養したＨＡＳ３合成と併せてＨＡを過剰発現するように操作されたＣＨＯ－ＨＡＳ３細胞によるＨＡ産生を示す。非加水分解性４－ＭＵＧは、Ｂ１６細胞（図５Ｂ）、ならびにＨＡＳ３を４－ＭＵまたは従来の４－ＭＵＧと同等の用量で過剰発現するように操作されたＣＨＯ細胞（図５Ｃ）によるＨＡ合成を予防する。総合すると、これらのデータは、４－ＭＵＧが４－ＭＵへの変換とは無関係にＨＡ合成を阻害することを実証する。

４－ＭＵＧは、Ｔ１Ｄマウスにおいて糖尿病進行を阻害し、Ｆｏｘｐ３発現を誘導する
４－ＭＵＧ投与がインビボでのＨＡ合成を阻害したか否かを評価するために、４－ＭＵについて先に示されたように（ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１０）：３９２８－３９４０）、この薬物を、Ｔ１Ｄの動物モデルである、ＤＯ１１に投与した。１０ｘＲＩＰｍＯＶＡ（ＤＯＲｍＯ）マウスを使用した。ＤＯＲｍＯマウスは、卵巣に特異的なＴ細胞受容体導入遺伝子（自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞をエミュレートする）を担持し、一方、同時に膵臓ベータ細胞上のインスリン遺伝子プロモーターと併せて卵巣を発現する（自己抗原をエミュレートする）。

図６Ａは、１２週齢で、未治療のＤＯＲｍＯマウス（対照）、４－ＭＵを供給したＤＯＲｍＯマウス、および４－ＭＵＧを供給したＤＯＲｍＯマウスからの膵臓組織の代表的なＨＡ染色を示す。図６Ａを参照すると、ＨＡについてＤＯＲｍＯ膵島を染色することは、未治療のＤＯＲｍＯマウスと比較した、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療後のＨＡ蓄積の減少を実証する。図６Ｂは、未治療のＤＯＲｍＯマウス、ならびに５週齢から開始し、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧを供給し、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧにおいて１５週間維持したＤＯＲｍＯマウスの血糖を示す。図６Ｂに示すように、これと一致して、４－ＭＵＧ治療は、未治療のＤＯＲｍＯマウスと比較して、経時的に血糖によって測定されたように、Ｔ１Ｄの開始を遅らせた。正常血糖（ｎｏｒｍｏ－ｇｌｙｃｅｍｉｃ）の血糖と一致して、インスリン陽性細胞は、４－ＭＵ治療下で膵島に保存された。図６Ｃは、未治療（対照）および４－ＭＵ治療ＤＯＲｍＯマウス由来の膵島組織の代表的なＦｏｘＰ３染色を示す。元の倍率は×４０である。図６Ｃを参照すると、Ｆｏｘｐ３調節性Ｔ細胞の増加が、非糖尿病性４－ＭＵ治療ＤＯＲｍＯマウスの膵島において観察された。図６Ｄ～６Ｇは、フローサイトメトリーによって分析されるように、４－ＭＵ（０．５ｍｇｉ．ｐ．）または４－ＭＵＧ（１ｍｇｉ．ｐ．）で１４日間毎日治療されたマウスから単離された脾細胞中のＣＤ３＋細胞、ＣＤ３＋細胞中のＣＤ４＋、およびＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋の数を示す。ウェルチ補正による対のないｔ検定による＊ｐ＜０．０５である。図６Ｄ～６Ｇを参照すると、野生型対照マウスの４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療の両方は、Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の増加、ならびにＦｏｘｐ３の発現の増加をもたらし（図６Ｆおよび６Ｇ）、ＣＤ４＋およびＣＤ３＋Ｔ細胞数は、いずれの治療によっても影響を受けなかった（図６Ｄおよび６Ｅ）。これらの観察は、４－ＭＵが複数の動物モデルにおいてＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを誘導するという最近の報告と一致する。

上記に示すように、４－ＭＵＧは、４－ＭＵへの変換を介してインビトロおよびインビボの両方の４－ＭＵの生体活性に寄与する。実際、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧは、インビトロでがん細胞株によるＨＡ合成を阻害する際に、ある範囲の濃度にわたってほぼ等しく有効である。両方とも、Ｔ１Ｄのマウスモデルにおける自己免疫の治療において同様に等しく有効である。

４－ＭＵの薬物動態の考察は、４－ＭＵＧの存在を反映するように改訂されなければならない。動物研究は、４－ＭＵＧが親分子４－ＭＵについて見られるものよりも３００倍高い濃度で存在することを示した。これと一致して、ヒトにおいて、４－ＭＵＧへのグルクロン酸抱合は４－ＭＵ代謝の９０％超を占め、４－ＭＵの単回静脈内用量の９３％は、尿中の４－ＭＵＧ代謝産物として排除される（ＧａｒｒｅｔｔＥ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．ＤｒｕｇＤｉｓｐｏｓ．１９９３；１４（１）：１３－３９、ＭｕｌｄｅｒＧ．Ｊ．，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８５；３４（８）：１３２５－１３２９）。

インビトロおよびインビボの両方で４－ＭＵを投与する場合と同じ効果を達成するために４－ＭＵＧを投与することが可能である。本明細書に記載されるように、Ｔ１ＤのＤＯＲｍＯマウスモデルにおけるインビボ実験は、４－ＭＵ治療と４－ＭＵＧ治療との間の膵島におけるＨＡの減少または血糖の減少に目に見える差がなく、両方とも糖尿病進行を停止させるために十分であることを示す。これは、４－ＭＵＧが自己免疫性疾患の治療において代替的な治療オプションを提供することを示す。実際、４－ＭＵＧは、４－ＭＵＧが水溶性であり、例えば飲料水中で投与することができるため、薬物として４－ＭＵを超える多くの利点を有する。

４－ＭＵの他の代謝産物も同様に生体活性である可能性が残る。しかしながら、これらの代謝産物は、実質的にＨＡに対して全体的効果に寄与しそうでないそのような低レベル（薬物レベルの＜１％）で存在する（ＫａｋｉｚａｋｉＩ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（３２）：３３２８１－３３２８９））。

本明細書にさらに記載されるように、４－ＭＵの組織結合を、２光子顕微鏡を使用してインビボで観察することができる。特に、４－ＭＵは、組織マトリックス内のコラーゲンが豊富な構造に結合し、リンパ節、膵臓、脂肪組織、肝臓、および筋肉内の様々な細胞によってまた取り込まれる。したがって、蛍光薬物の組織結合を審尋するための新規なプラットフォームとして２光子生体内顕微鏡を使用することができ、このアプローチを化合物活性または組織局在化の他の読み出しと組み合わせることが可能であり得る。

細胞上でＦＡＣＳを介して観察される蛍光シグナルは、透過処置時に実質的に縮減し、このことは、薬物の少なくとも一部が細胞内に存在することを示す。組織において、蛍光シグナルは、コラーゲナーゼまたはヒアルロニダーゼでの処置によって失われ得、このことは、４－ＭＵがこれらの分子に結合することができることを示す。これらの知見は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって裏付けられ、このことは、組織が実際に４－ＭＵならびに４－ＭＵＧを含有することを示す。薬物が成長しているＨＡポリマーに組み込まれる可能性があるが、ＨＡ合成の既知のメカニズムを考慮すると、この可能性は低いと思われる。ＨＡは通常、ＨＡの前駆体としてＮ－アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸のＵＤＰ糖を使用する３つのＨＡシンターゼによって合成される。４－ＭＵの存在下で、ＨＡ合成は、ＵＤＰグルクロン酸の供給を低下させることによって阻害される。４－ＭＵは、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）の優れた基質であり、その結果、ＵＧＴは、膨大な量のＵＤＰ－グルクロン酸を消費し、グルクロン酸を４－ＭＵに移転させ、それによって、ＨＡ合成の阻害につながる細胞前駆体プールを枯渇させる。したがって、４－ＭＵがその合成中にＨＡに組み込まれる可能性は低い。

総合すると、これらの研究は、４－ＭＵが、その代謝産物４－ＭＵＧの寄与のために、以前に信じられたよりも生体利用可能であることを示す。この洞察は、４－ＭＵの実験的および治療的状況を変化させ、がん、自己免疫、ならびに他の疾患および障害等の増殖性疾患におけるＨＡ合成を標的化する潜在的な治療戦略の開発を促進することができる。特に、４－ＭＵＧは、それ自体で治療可能性を有する。

実施例１
ＨＡ合成阻害に対する４－ＭＵおよびその代謝産物４－ＭＵＧの効果を検査するために、以下の実験を行った。

マウス
全ての動物を、ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）の動物施設内で、食物および水への自由アクセスを有する、特定の病原体がいない条件下で繁殖および維持した。Ｂ６ｄｂ／ｄｂＬｅｐｔＲ－／－マウスを、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＪＡＸ）ならびにＤＯ１１．１０トランスジェニックマウスから購入した。ＤＯ１１．１０マウスを、ＲＩＰｍＯｖａを発現するＢａｌｂ／ｃマウスで繁殖させて（卵白アルブミンペプチドアミノ酸３２３～３３９、ＢｅｎａｒｏｙａＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅで入手可能）、ＤＯＲｍＯ二重トランスジェニックマウスを生成した。さらに、Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスをＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅで組織内繁殖させた。

マウス糖尿病モニタリング
４週齢で開始して、マウスの体重を毎週測定し、Ｃｏｎｔｏｕｒ（登録商標）血糖計および血糖モニタリングストリップ（ＢａｙｅｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して血糖レベルを決定するために尾静脈を介して採血した。２５０ｍｇ／ｄＬの２つの連続した血糖値を記録したとき、動物を糖尿病とみなした。３００ｍｇ／ｄＬの２つの連続した血糖値を記録したとき、動物を安楽死させた。

４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療
これまでに記載したように、４－ＭＵ（ＡｌｆａＡｅｓａｒ）をマウスチョウ（ＴｅｓｔＤｉｅｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に押し込み、出荷前に照射した（ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１０；１２２（２２）：２３１３－２３２２）。このチョウ製剤は、ＨＰＬＣ－ＭＳによって測定されるように、２５０ｍｇ／マウス／日を送達し、マウスにおいて６４０．３±１７．２ｎｍｏｌ／Ｌの血清薬物濃度をもたらす。４－ＭＵＧ（ＣｈｅｍＩｍｐｅｘ，ＷｏｏｄＤａｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で飲料水中に分配し、１０ｍｇ／マウス／日を送達し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定されるように、マウスにおいて３５７．１±７２．６ｎｇ／ｍＬの血清薬物濃度をもたらした。マウスを、別段の言及がない限り、５、８、または１２週齢で４－ＭＵおよび４－ＭＵＧで開始し、別段の記載がない限り安楽死されるまでこの食餌で維持した。ナイーブマウスにおけるＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞数の分析のために、マウスを、腹腔内注射によって生理食塩水中の２００μｌ０．０８％カルボキシメチルセルロース中の０．５ｍｇの４－ＭＵまたは１．０ｍｇの４－ＭＵＧで毎日治療した。

細胞培養
Ｂ１６Ｆ１０細胞を、ＤＭＥＭ中で培養し、異なる濃度の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ（３０、１００、３００μＭ）で２４時間および４８時間処置した。培養細胞を溶解し、ＨＡＥＬＩＳＡを使用してＨＡ濃度決定について分析した。９６ウェルプレートに配置したＢ１６Ｆ１０細胞におけるＨＡ染色を、蛍光顕微鏡法を使用して撮像した。４－ＭＵおよび４－ＭＵＧで処置したＢ１６Ｆ１０細胞中の４－ＭＵの蛍光強度を測定するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン処置し、細胞と関連付けられた４－ＭＵの蛍光を、ＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用して、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅチャネルにおけるフローサイトメトリーによって分析した。透過処置のために、トリプシン処置後、細胞を－２０℃、２０分間メタノール中でインキュベートし、フローサイトメトリー分析の前に１回洗浄した。

白血球４－ＭＵ取り込み評価
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを４－ＭＵで治療し、代表的な動物由来の白血球をベースライン（４－ＭＵ治療前）、およびチョウ開始後２、７、および１４日の間隔で血液から単離した。末梢静脈血を、４－ＭＵまたは対照チョウにおけるマウスの尾静脈を切断した後、ヘパリンでコーティングされたチューブ内に収集した。単離後、血液試料を３０分間遠心分離した（１０００×ｇ、４℃）。血清上清を抽出して、これまでに記載した修飾ＨＡＥＬＩＳＡを使用してＨＡレベルを検出した（ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１０）：３９２８－３９４０）。特定の白血球サブセットにおけるフローサイトメトリーを使用して４－ＭＵによって放出される蛍光を検出するために、末梢赤血球を、塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）緩衝液を使用して溶解し、白血球を、ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＪｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＢＶ６５０－ＣＤ３（１７－Ａ２）、ＢＶ７８５－ＣＤ４（ＲＭ４－５）、ＡＰＣ－ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、ＰＥ－ＣＤ１４（Ｓａ２－８）、ＰＥ－Ｃｙ７－Ｌｙ－６Ｇ／Ｃ（ＲＢ６－８Ｃ５）、ＰＥ－Ｃｙ５．５－Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）およびＦＩＴＣ－Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ（ＭＨＣクラスＩＩ）（Ｍ５／１１４．１５．２）のフルオロクローム結合抗体で染色した。細胞を、１０分間のＦｃ受容体（ＣＤ１６／３２、２．４Ｇ２）の遮断の後、室温で３０分間染色した。試料を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）で１回洗浄し、１．６％のパラホルムアルデヒドで固定した。試料をＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢｅｃｋｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）上に流し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。

マウス血清および臓器中の４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ濃度の液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析
４－メチルウンベリフェロン－１３Ｃ４（ＴｏｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を４－ＭＵの内部標準（ＩＳ）として使用し、７－ヒドロキシクマリンβ－Ｄ－グルクロニド（ＴｏｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を４－ＭＵＧのＩＳとして使用した。４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの純粋な原液を混合し、５０％メタノール中で希釈して、各化合物について１ｎｇ／ｍＬ～５０００ｎｇ／ｍＬの範囲のスパイク溶液を調製した。

組織試料を秤量し、１体積のステンレス鋼Ｂｕｌｌｅｔブレンダービーズ（ＮｅｘｔＡｄｖａｎｃｅ）および３体積のＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水を添加した。組織を、４℃のブレンダー（Ｂｕｌｌｅｔブレンダー、ＮｅｘｔＡｄｖａｎｃｅ）によって、製造業者の指示に従って均質化した。較正標準のために、２５μｌのブランク血清または組織ホモジネートを２５μｌのスパイク溶液と混合した。試験対象の試料について、２５μｌの血清または組織ホモジネートを２５μｌの５０％メタノールと混合して体積を構成した。次いで、２つのＩＳ（５０％メタノール中で各１０００ｎｇ／ｍｌ）の混合物の２５μｌを加えた。全ての標準および試料をボルテックスした後、メタノール／アセトニトリル２０：８０（ｖ／ｖ）の１５０μｌを混合物に加え、試料をさらに激しく１分間ボルテックスし、続いて３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清の１００μｌを取り、２００μｌのＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水で希釈した。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムは、ＳｈｉｍａｄｚｕＵＦＬＣシステムに連結されたＡＢＳＣＩＥＸＱＴＲＡＰ（登録商標）４０００質量分析器で構成される。移動相Ａは、ＨＰＬＣグレードの水である。移動相Ｂは、ＨＰＬＣグレードのアセトニトリルである。ＬＣ分離を、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＬｕｎａ（登録商標）ＰＦＰ（２）カラム（３μｍ、１５０×２ｍｍ）上で行い、４５％の移動相Ｂおよび室温で０．４ｍｌ／分の流速を使用して、等圧溶出した。分析時間は２．５分であった。抽出した試料の１０μｌを注入した。質量分析器は、４－ＭＵについてｍ／ｚ１７４．７→１３２．９、４－ＭＵ－１３Ｃ４（ＩＳ）についてｍ／ｚ１７８．７→１３４．９、４－ＭＵＧについてｍ／ｚ３５０．８→１７４．９、および７－ヒドロキシクマリンβ－Ｄ－グルクロニド（ＩＳ）についてｍ／ｚ３３６．９→１６０．９の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）遷移を有する負モードで動作した。Ａｎａｌｙｓｔ１．６．１ソフトウェア（ＡＢＳＣＩＥＸ）を使用してデータ取得および分析を行った。

ＨＡレベルの測定
試料を解凍し、以前に記載された修飾ＨＡＥＬＩＳＡを使用してＨＡレベルについてアッセイした（ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１０）：３９２８－３９４０）。各試料を、試料ごとに得られた平均値を用いて３反復で分析した。細胞正規化のために、ＬＩ－ＣＯＲＣｅｌｌＴａｇ（商標）７００Ｓｔａｉｎを製造プロトコルに従って使用した。

組織加工および撮像
組織化学のための組織を動物から抽出し、直ちに１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）に移転させた。組織を、ＬｅｉｃａＡＳＰ３００組織プロセッサー（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）上でパラフィンに加工した。次いで、５μｍの厚さの切片をＬｅｉｃａＲＭ２２５５ミクロトーム（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）上で切断した。全ての染色工程を、ＬｅｉｃａＢｏｎｄ－Ｍａｘ（商標）自動免疫組織化学（ＩＨＣ）染色器（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）上で行った。ＨＡ親和性組織化学（ＡＦＣ）のために、Ｂｏｎｄ（商標）ＩｎｔｅｎｓｅＲＤｅｔｅｃｔｉｏｎキット、ストレプトアビジン－ＨＲＰシステム（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を、０．１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中の４μｇ／ｍＬのビオチン化－ＨＡＢＰを一次として使用した。Ｂｏｎｄ（商標）ＰｏｌｙｍｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔを全ての他の免疫組織化学のために使用した。この検出キットは、高分子ＨＲＰに結合されたヤギ抗ウサギと、マウス一次と共に使用するためのウサギ抗マウス後一次試薬とを含有する。

Ｆｏｘｐ３およびインスリン（抗インスリン、ａｂ７８４２ａｂｃａｍ）切片について、８μｇ／ｍＬのラット抗Ｆｏｘｐ３クローンＦＪＫ－１６ｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に６０分間インキュベートした。ウサギ抗ラットＩｇＧ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）とのインキュベーションキットからの後一次試薬の代わりに後一次を添加した。

ＣＤ３ＩＨＣは、高ｐＨのＥＤＴＡを用いた２０分間の熱媒介抗原回収（Ｂｏｎｄエピトープ回収溶液２）を使用する前処置を必要とした。その後、切片を２．５μｇ／ｍＬのウサギ抗ＣＤ３（Ａ０４５２、Ｄａｋｏ）と共にインキュベートし、Ｂｏｎｄ（商標）ＰｏｌｙｍｅｒＲｅｆｉｎｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔを使用して検出を行った。

全ての画像を、Ｐｕｒｓｕｉｔ４メガ画素冷却色／モノクロ電荷結合デバイスカメラ（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えたＬｅｉｃａＤＭＩＲＢ反転蛍光顕微鏡を使用して可視化した。画像を、Ｓｐｏｔ（商標）ＰｕｒｓｕｉｔカメラおよびＳｐｏｔＡｄｖａｎｃｅＳｏｆｔｗａｒｅ（ＳＰＯＴＩｍａｇｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎｓ；ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して取得した。画像分析は、これまでに記載したようにＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用してそれに応じて実施した（ＮａｇｙＮ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１０）：３９２８－４０）。

マウス脾細胞単離および調節性Ｔ細胞同定
脾臓をマウスから抽出し、細胞を７０μｍの細胞ストレーナーを介した均質化によって採取した。赤血球を、ＡＣＫ緩衝液を使用して溶解し、その後、脾細胞懸濁液を上記のプロトコルに従って、Ｖ５００－ＣＤ３（５００Ａ２）、ＢＶ７８５－ＣＤ４（ＲＭ４－５）、およびＡｌ４８８－Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ－１６ｓ）のフルオロクローム結合抗体で染色した。。ＬＳＲＩＩ上でフローサイトメトリーを行い、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用してデータ分析を行った。

実施例２
４－ＭＵＧは、インビトロで複数のがん細胞によるＨＡ合成を阻害する
代謝産物の活性は薬物動態決定における重要な変数であるため、ＨＡ合成に対する主な４－ＭＵ代謝産物４－ＭＵＧの効果を調査した。これを試験するために、豊富なＨＡを産生する細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）由来の黒色腫細胞を使用した。

図１Ｄおよび１Ｅは、４－ＭＵ（図１Ｄ）および４－ＭＵＧ（図１Ｅ）中で４８時間培養したＢ１６Ｆ１０細胞によるＨＡ産生を示す。図１Ｄおよび１Ｅを参照すると、４８時間の薬物曝露後に、４－ＭＵ（図１Ｄ）および４－ＭＵＧ（図１Ｅ）処置したＢ１６Ｆ１０細胞の両方において、ＨＡ合成の濃度依存的阻害が観察された。ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）を使用したこれらの細胞の蛍光染色は、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧでの処置が両方ともＨＡを減少させたことを示した（図１Ｄ）。

図１Ｇは、ＣＴＬＬ２細胞における４－ＭＵまたは４－ＭＵＧによる処置時のＨＡ合成阻害を示し、図１Ｈは、Ｍｉｎ６細胞における４ＭＵまたは４－ＭＵＧによる処置時のＨＡ合成阻害を示す。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞に加えて、４－ＭＵＧは同様に、ＣＴＬＬ２細胞であるリンパ腫細胞株（図１Ｇ）、ならびにＭｉｎ６細胞であるインスリノーマ細胞株（図１Ｈ）によるＨＡ合成を阻害した。これらの結果の総合は、４－ＭＵまたは４－ＭＵＧのいずれかでの処置が、ＨＡ合成を阻害することを示す。

４－ＭＵＧが、４－ＭＵへの任意の可能性がある変換とは無関係に生物活性を有するか否かを試験するために、４－ＭＵＧの非加水分解性バージョンを生成した（図５Ａ）。図５Ｂは、４－ＭＵ、４－ＭＵＧまたは非加水分解性４－ＭＵＧ中で４８時間培養したＢ１６Ｆ１０細胞によるＨＡ産生を示す。図５Ｃは、４－ＭＵ、４－ＭＵＧ、または非加水分解性４－ＭＵＧ中で４８時間培養した、ＨＡＳ３合成と併せてＨＡを過剰発現するように操作されたＣＨＯ－ＨＡＳ３細胞によるＨＡ産生を示す。非加水分解性４－ＭＵＧは、黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０（図５Ｂ）、ならびに卵巣がん細胞株ＣＨＯ（図５Ｃ）によるＨＡ合成を、４－ＭＵまたは従来の４－ＭＵＧと同等の用量で予防した。

総合すると、これらのデータは、４－ＭＵＧが４つの異なるがん細胞株（Ｂ１６Ｆ１０黒色腫、Ｍｉｎ６インスリノーマ、ＣＴＬＬ２リンパ腫、およびＣＨＯ卵巣）によるＨＡ合成を直接阻害することを実証する。さらに、これらのデータは、４－ＭＵＧが４－ＭＵへの変換を受けることができるが、４－ＭＵＧは、それにもかかわらず、この変換の不在下で直接ＨＡ合成を阻害することを示す。

実施例３
インビボでのＨＡ合成の阻害に対する４－ＭＵＧ投与の効果を評価するために、薬物をＴ１Ｄの動物モデルである、ＤＯ１１．１０ｘＲＩＰｍＯＶＡ（ＤＯＲｍＯ）マウスに投与した。ＤＯＲｍＯマウスは、膵臓ベータ細胞上のインスリン遺伝子プロモーターと併せてＯＶＡを同時に発現しつつ（自己抗原をエミュレートする）、ＯＶＡに特異的なＴ細胞受容体導入遺伝子を担持する（自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞をエミュレートする）。

図６Ａは、１２週齢で、未治療のＤＯＲｍＯマウス（対照）、４－ＭＵを供給したＤＯＲｍＯマウス、および４－ＭＵＧを供給したＤＯＲｍＯマウスからの膵臓組織の代表的なＨＡ染色を示す。図６Ａを参照すると、ＨＡについてＤＯＲｍＯ膵島を染色することは、未治療のＤＯＲｍＯマウスと比較して、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療後のＨＡ蓄積の減少を示す。図６Ｂは、未治療のＤＯＲｍＯマウス、ならびに５週齢から開始し、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧを供給し、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧにおいて１５週間維持した、ＤＯＲｍＯマウスの血糖を示す。図６Ｂを参照すると、これと一致して、４－ＭＵＧ治療は、未治療のＤＯＲｍＯマウスと比較して、経時的に血糖によって測定されるように、Ｔ１Ｄの発症を遅らせた。図６Ｃは、未治療（対照）および４－ＭＵ治療ＤＯＲｍＯマウス由来の膵島組織の代表的なＦｏｘＰ３染色を示す。オリジナル倍率は×４０である。さらに、Ｆｏｘｐ３調節性Ｔ細胞の増加が、非糖尿病性４－ＭＵ治療ＤＯＲｍＯマウスの膵島で観察された（図６Ｃ）。フローサイトメトリーによって分析されるように、図６Ｆは、４－ＭＵ（０．５ｍｇｉ．ｐ．）または４－ＭＵＧ（１ｍｇｉ．ｐ．）で毎日１４日間治療したマウスから単離された脾細胞中のＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋ＭＦＩを示し、図６Ｇは、４－ＭＵ（０．５ｍｇｉ．ｐ．）または４－ＭＵＧ（１ｍｇｉ．ｐ．）で毎日１４日間治療したマウスから単離された脾細胞中のＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋ＭＦＩを示す。図６Ｆおよび６Ｇを参照すると、野生型対照マウスの４－ＭＵおよび４－ＭＵＧ治療の両方は、Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の増加、ならびにＦｏｘｐ３のそれらの発現の増加において産生した。フローサイトメトリーによって分析されるように、図６Ｄは、４－ＭＵ（０．５ｍｇｉ．ｐ．）または４－ＭＵＧ（１ｍｇｉ．ｐ．）で毎日１４日間治療したマウスから単離した脾細胞中のＣＤ３＋細胞を示し、図６Ｅは、４－ＭＵ（０．５ｍｇｉ．ｐ．）または４－ＭＵＧ（１ｍｇｉ．ｐ．）で毎日１４日間治療したマウスから単離した脾細胞中のＣＤ３＋細胞のうちのＣＤ４＋を示す。図６Ｄおよび６Ｅは、ＣＤ４＋およびＣＤ３＋Ｔ細胞数がいずれの治療によっても影響を受けなかったことを示す。これらの観察は、４－ＭＵが複数の動物モデルにおいてＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを誘導することを示す研究と一致し（Ｎａｇｙ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２５（１０）：３９２８－３９４０、Ｋｕｉｐｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１３：１３３９－１３４４、Ｋｕｉｐｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：３７２－３８１）、４－ＭＵＧもまたそうであることを示す。

実施例４
４－ＭＵＧが、本質的に非自己免疫性である異なる炎症性疾患において、ＨＡ合成に対して有効であるか否かを評価するために、２型糖尿病のｄｂ／ｄｂモデルにおける４－ＭＵＧの役割を調査した。Ｄｂ／ｄｂマウスは、機能的レプチン受容体を欠き、肥満および糖尿病性である。

図７Ａは、１０週間にわたる対照チョウまたは４－ＭＵチョウのいずれかにおける、１５週齢のｄｂ／ｄｂマウス、ならびに比較のために提供される、ｄｂ／＋同腹仔の代表的な画像、血糖（ＢＧ）値、および重量（Ｗｔ）を示す。図７Ｂは、飲料水中で対照チョウ、４－ＭＵチョウ、または４－ＭＵＧのいずれかを１０週間供給した１５週齢のｄｂ／ｄｂマウス、ならびに対照チョウを供給したｄｂ／＋同腹仔対照のランダム（供給）ＢＧ値を示す。図７Ｃは、各点が１匹のマウスを表している、図７Ｂにおけるマウスの重量を示す。図７Ａ～７Ｃを参照すると、ｄｂ／ｄｂマウスへの４－ＭＵまたは４－ＭＵＧのいずれかの１ヶ月にわたる投与は、対照チョウを供給された、齢および性別（雄）が適合したマウスと比較して、血糖（ＢＧ）レベルを確実に減少させた。図７Ｄは、５週齢から開始する飲料水中の対照チョウ、４－ＭＵチョウ、または４－ＭＵＧにおいて維持されたｄｂ／ｄｂマウスのＢＧレベルを示す。図７Ｄを参照すると、血糖コントロールに対する４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの有益な効果は少なくとも１０週間維持され、このことは、持続的な改善を示した。図７Ｆおよび７Ｇは、４－ＭＵまたは４－ＭＵＧを２週間供給した絶食時ｄｂ／ｄｂマウスの腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）を示す。図７Ｆおよび７Ｇを参照すると、この血糖コントロールの改善は、前の２週間に４－ＭＵまたは４－ＭＵＧのいずれかを供給された絶食時ｄｂ／ｄｂマウスの腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）の際に観察された。

理論によって拘束されることを望むものではないが、これらのデータの１つの潜在的な説明は、４－ＭＵにおけるｄｂ／ｄｂマウスは、チョウをより少なく摂取し、減少したカロリー摂取の結果として正常血糖であることであり得る。実際、４－ＭＵチョウにおけるｄｂ／ｄｂマウスは、治療の開始後数週間、重量の初期の減少を示した。しかしながら、４－ＭＵまたは４－ＭＵＧのいずれかを供給されたｄｂ／ｄｂマウスの重量はすぐに回復した（図７Ｅ）が、４－ＭＵ治療によるグルコースレベルの分離は、これらのマウスにおいて重量が回復する段階を通じて継続し、群間で体重がもはや異なることがなくなったとき、治療開始後も長い間存在した。

最後に、糖尿病対照に対する４－ＭＵおよび４－ＭＵＧのこれらの効果は、インビトロで観察されたベータ細胞株によるＨＡ合成の阻害（図７Ｆ）と一致して、膵島におけるＨＡ染色の減少と関連付けられた（図７Ｈ～７Ｋ）。これらのデータの総合は、４－ＭＵおよび４－ＭＵＧの両方が、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて正常血糖を等しく良好に回復することを示す。

実施例５
４－ＭＵＧの化学安定性を決定するために、その半減期（ｔ_１／２）を評価した。４－ＭＵＧを１００μＭの濃度で試験した。内部標準（ＩＳ）をＤＭＳＯ中のトルブタミドと共に５０ｎｇ／ｍＬで調製し、絶食状態の模擬胃液（ＦａＳＳＧＦ）の緩衝液をｐＨ１．６で調製した。この緩衝液を３７℃で１５分間予温し、その後４－ＭＵＧを添加し、この溶液をボルテックスさせた。次に、３０μＬのこの反応混合物を分析のために各時点で除去した。時点には、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分が含まれていた。ＩＳ溶液を添加することにより、実験終了時に反応を停止させた。試料を４，０００ｒｐｍで４℃、１５分間遠心分離した。１００μＬの上清を、タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いたさらなる液体クロマトグラフィーのために、蒸留水と混合した。質量分析検出は、ＳＣＩＥＸ（登録商標）ＡＰＩ４５００Ｑｔｒａｐ（登録商標）（Ｓｃｉｅｘ，ＲｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して行った。各化合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。計算されたパラメータは、４－ＭＵＧの比、時間に対する残存４－ＭＵＧのパーセント、および４－ＭＵＧのｔ_１／２の推定値であった。

図８Ａは、４－ＭＵＧの化学安定性評価の表である。図８Ｂは、４－ＭＵＧの化学安定性を、時間（分）に対する面積比として示すグラフである。図８Ｃは、４－ＭＵＧの化学安定性を、時間（分）に対する残存パーセントで示すグラフである。図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃに示すように、４－ＭＵＧは、標準化学試験下で比較的長期間安定である。

例示的な実施形態が例示され、記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な変更が行われ得ることを理解されたい。

政府のライセンス権に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された契約ＡＩ１０１９８４およびＤＫ０９６０８７の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。

Claims

（ｉ）ヒアルロナン合成を阻害する化合物、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含む、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療するための組成物。
前記化合物が、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
前記化合物が、ＵＤＰ－グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項２に記載の組成物。
前記化合物が、４－メチルウンベリフェロン－グルクロニドである、請求項３に記載の組成物。
前記化合物が、調節性Ｔ細胞応答を誘導するために有効である、請求項１に記載の組成物。
前記化合物が、ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞を増加させるために有効である、請求項５に記載の組成物。
前記自己免疫性疾患または障害が、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性膵臓炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、線維筋痛症、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、腎症、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、ループス、多発性硬化症、視神経脊髄炎、結節性多発動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆道炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（巨細胞性動脈炎）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、血管炎、および白斑からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
前記炎症性疾患または障害が、腎虚血再灌流損傷、喘息、肺高血圧、２型糖尿病、関節炎、アテローム性動脈硬化症、創傷治癒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、同種移植拒絶、移植片対宿主病、皮膚筋炎、炎症性腸疾患、および脳卒中からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
前記炎症性疾患または障害が、２型糖尿病、同種移植拒絶、または移植片対宿主病である、請求項８に記載の組成物。
前記線維性疾患または障害が、原発性硬化性胆道炎、胆汁性肝硬変、胆道痙攣、肝硬変、肝線維症、腎線維症、皮膚線維症、腸線維症、および肺線維症からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
前記増殖性疾患または障害が、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、食道がん、乳がん、肝臓がん、骨がん、卵巣がん、腎臓がん、肛門がん、脳がん、胆道がん、黒色腫、インスリノーマ、子宮内膜がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮頸がん、およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
前記増殖性疾患または障害が、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、または卵巣がんである、請求項１１に記載の組成物。
自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害の治療を必要とする哺乳動物対象について、自己免疫性、炎症性、線維性、または増殖性疾患もしくは障害を治療する方法であって、
前記哺乳動物対象についてヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、前記哺乳動物対象に投与することを含む、方法。
前記化合物が、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
前記化合物が、ＵＤＰ－グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項１４に記載の方法。
前記化合物が、４－メチルウンベリフェロン－グルクロニドである、請求項１５に記載の方法。
前記化合物が、調節性Ｔ細胞応答を誘導するために有効である、請求項１３に記載の方法。
前記化合物が、ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞を増加させるために有効である、請求項１７に記載の方法。
前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項１３に記載の方法。
増殖性疾患に罹患しているかまたは増殖性疾患を発症するリスクがある哺乳動物対象について、増殖性疾患を治療する、かつ／または増殖性疾患の進行を逆転するための方法であって、
前記哺乳動物対象におけるヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、前記哺乳動物対象に投与することを含む、方法。
前記化合物が、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤またはＵＤＰ－グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
前記化合物が、４－メチルウンベリフェロン－グルクロニドである、請求項２１に記載の方法。
前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項２０に記載の方法。
前記増殖性疾患が、黒色腫、インスリノーマ、リンパ腫、または卵巣がんである、請求項２０に記載の方法。
１型糖尿病または２型糖尿病の治療を必要とする哺乳動物対象について、１型糖尿病または２型糖尿病を治療するための方法であって、
前記哺乳動物対象についてヒアルロナン合成を阻害するために有効な量の化合物を含む組成物を、前記哺乳動物対象に投与することを含む、方法。
前記化合物が、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ阻害剤またはＵＤＰ－グルクロニルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項２５に記載の方法。
前記化合物が、４－メチルウンベリフェロン－グルクロニドである、請求項２６に記載の方法。
前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項２５に記載の方法。
前記化合物が、調節性Ｔ細胞応答を誘導するために有効である、請求項２５に記載の方法。
前記化合物が、ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞を増加させるために有効である、請求項２９に記載の方法。