JP2022514083A - 非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、微生物宿主細胞において目的の組換えポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節されるように改変された微生物宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記微生物宿主細胞において、目的の前記ポリペプチドを発現させること、を含む方法に関する。さらに、本発明は、微生物宿主細胞で発現させた目的の組換えポリペプチドへの、少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減する方法に関する。

Description

本発明は、微生物宿主細胞において目的の組換えポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節される（上昇するなど）ように改変された微生物宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記微生物宿主細胞において、目的の前記ポリペプチドを発現させること、を含む方法に関する。さらに、本発明は、微生物宿主細胞で発現させた目的の組換えポリペプチドへの、少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減する方法に関する。さらに本発明によって、（ａ）目的のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、および（ｂ）酵素活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む微生物宿主細胞、が想定される。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの微生物宿主において組換えタンパク質を発現させることは、インスリンなどの組換え治療用タンパク質を製造するための標準的技術となっている。現在では、大腸菌などの微生物細胞で産生された様々なバイオ医薬品が市販されている。

しかし、組換えタンパク質を過剰に発現させると、微生物宿主にストレスを与えることが知られており、その結果、タンパク質のミスフォールディングや、望まないアミノ酸の取り込みがよく生じる。変化したタンパク質は、生物活性の変化、タンパク質分解や免疫原性に対する感受性の増加、などの望ましくない特性を示す場合がある。特に、組換えインスリンなどの医薬品は均質で純粋でなければならないため、組換えタンパク質へのアミノ酸の誤取り込みは問題となる。そのため、誤取り込みされたアミノ酸を含む組換えタンパク質を生産物から取り除く必要がある。

分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）は、非直鎖状の分子構造を持つアミノ酸である。ＢＣＡＡは、分枝した脂肪族側鎖を有し、すなわち中心の炭素原子が３つ以上の炭素原子と結合している。ロイシン、イソロイシン、およびバリンは、いわゆるタンパク質原性または正準ＢＣＡＡである。正準ＢＣＡＡ以外にも、非正準ＢＣＡＡまたは非タンパク性原性ＢＣＡＡが存在する。そのような非正準ＢＣＡＡ（ｎｃＢＣＡＡ）は、ノルロイシン、ノルバリン、ホモイソロイシン、およびβ－メチルノルロイシンである。

ノルロイシンやノルバリンなどの非正準分枝鎖アミノ酸（ｎｃＢＣＡＡ）は、大腸菌で発現させた組換えタンパク質内で、ロイシンやメチオニンの代わりにそれぞれ誤って取り込まれることが報告されている（非特許文献１；非特許文献２）。ｎｃＢＣＡＡの合成と蓄積は、ＢＣＡＡ生合成経路に関与するｌｅｕおよびｉｌｖオペロンにコードされた酵素のα－ケト酸に対する特異性が低いことに起因する。いくつかの研究により、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンにコードされているロイシン生合成経路の酵素が、ノルロイシンのような非正準分枝鎖アミノ酸の産生に重要であることが示されている。正準モードでは、ロイシン経路の酵素は、α－ケトイソバレレートをα－ケトイソカプロエートに変換する；つまり、炭素数５のα－ケト酸に炭素１個の付加を引き起こすことを意味する。さらに、ロイシン生合成経路は非常に幅広い基質特異性を持つことも示されており、その酵素は様々なα－ケト酸に作用することができる。例えば、ロイシン経路の酵素は、α－ケトバレレートを、ノルロイシンの前駆体であるα－ケトカプロエートに変換することもできる。

アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）の混乱状態により、非正準分枝鎖アミノ酸（ｎｃＢＣＡＡ）の新生組換えタンパク質への誤取り込みが生じる。タンパク質合成の正確さは、ａａＲＳが適切な正準アミノ酸を対応するｔＲＮＡに装填する能力にかかっている（例えば、非特許文献３、によって概説されている）。このような正確さは、多くの非正準アミノ酸、特にそれらの正準アミノ酸と構造的に類似したｎｃＢＣＡＡによって損なわれる可能性がある（非特許文献４）。例えば、ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（ｌｅｕＲＳ）は、ロイシンと非正準の対応するノルバリンとを区別しなければならず、その違いは１つのメチル基だけである（非特許文献１）。メチオニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｍｅｔＲＳ）も同様であり、メチオニンとノルロイシンとを識別する必要があり（非特許文献５）、イソロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（ｉｌｅＲＳ）は、イソロイシンとβ－メチルノルロイシンを区別する必要がある（非特許文献６）。例えば、ミネラル塩培地で大腸菌を培養し、メチオニンが制限されている場合、ノルロイシンはメチオニルトランスファーＲＮＡ上でアシル化され、続いてメチオニンコドンが翻訳されるたびに組換えタンパク質に取り込まれる。

組換えタンパク質産生のための様々な発現システムが利用可能であり、組換えタンパク質生産を向上させるための培養条件の採用が報告されているが、オーバーフロー代謝の可能性や、不要なアミノ酸の目的の組換えタンパク質への誤取り込みの問題はまだ解決されていない。

Ａｐｏｓｔｏｌ Ｉ．ら、１９９７、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｖａｌｉｎｅ ａｔ ｌｅｕｃｉｎｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２．４６：２８９８０～２８９８８ Ｔｓａｉら、（１９８８）、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１５６（２）：７３３～７３９ Ｒｅｉｔｚら、２０１８、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｂｒａｎｃｈｅｄ－ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ａｖｏｉｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１０月；５３：２４８～２５３ Ｍａｒｔｉｎｉｓ ＳＡ、 Ｆｏｘ ＧＥ． Ｎｏｎ－ｓｔａｎｄａｒｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｌｅｕｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ．１９９７；３６：１２５～１２８ Ｋｉｉｃｋ，Ｋ．Ｌ．ら、２００１、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｅｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５０２（１～２）、２５～３０ Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｒ．ら、２００３、Ｆｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｕｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ、３１（５）、９７９～９８７

異種組換えタンパク質への非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みが起こる条件や、そのような誤取り込みを効率的に防ぐ方法は完全には解明されていない。そのため、非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みのない組換えポリペプチドの産生方法が強く望まれている。

本発明の根底にある技術的課題は、上述の要望を満たすための手段と方法を提供することであると考えられる。この技術的課題は、特許請求の範囲および本明細書で特徴づけられた実施形態によって解決される。

本発明は、微生物宿主細胞において目的の組換えポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節される（上昇するなど）ように改変された微生物宿主細胞に導入する工程、および
（ｂ）前記微生物宿主細胞において、目的の前記ポリペプチドを発現させる工程
を含む方法に関する。

さらに、本発明は、微生物宿主細胞で発現させた目的の組換えポリペプチドへの、少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減する方法であって、
（ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を微生物宿主細胞において調節する（上昇させるなど）こと、
（ｂ）前記微生物宿主細胞に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すること、および
（ｃ）前記微生物宿主細胞において、目的の前記ポリペプチドを発現させること
を含む前記方法に関する。

微生物宿主細胞であって、
（ａ）目的のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、および
（ｂ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド
を含む微生物宿主細胞、が本発明によってさらに想定される。

本発明の微生物宿主細胞を含むバイオリアクターが、本発明によってさらに想定される。一部の実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０Ｌの体積を有する。

さらに、本発明は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を有するポリペプチドの使用、または微生物宿主細胞で産生される目的の組換えポリペプチドへの少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減するための前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、に関する。

最後に、本発明は、目的の組換えポリペプチドを産生するための微生物宿主細胞の使用であって、微生物宿主細胞は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節されるように改変された、微生物宿主細胞の使用、に関する。

本発明の方法、使用、または微生物宿主細胞の一実施形態では、微生物宿主細胞は、前記酵素活性を有する内因性ポリペプチドを発現していない。したがって、前記酵素活性を有するポリペプチドをコードする内因性の、すなわち天然に存在するポリヌクレオチドは、微生物宿主細胞において欠失している、すなわちノックアウトされている。

本発明の方法、使用、または微生物宿主細胞の一実施形態では、目的のポリペプチドは、プロインスリン、インスリンまたはインスリンアナログのような治療用ポリペプチドである。

本発明の方法、使用、または微生物宿主細胞の一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターに動作可能に連結されている。

本発明の方法、使用、または微生物宿主細胞の一実施形態では、微生物宿主細胞は、大腸菌細胞である。

ミニプロインスリンを発現するｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋のプラスミドマップの図である。プラスミドｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋は、アンピシリンに対する耐性を付与し、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下で１１ｋＤａの組換えタンパク質（ミニプロインスリン）を発現する。プラスミドは、ｌａｃＩ^＋プロモーターバリアントの制御下にあるリプレッサーＬａｃＩも共発現している。Ｓｎａｐｇｅｎｅ（登録商標）で作成した。 フラグメント１を含む１６ＡＢＺ５ＮＰ＿１９３４１７７のプラスミドマップの図である。Ｓｎａｐｇｅｎｅ（登録商標）で作成した。 ｐＣＰ２０のプラスミドマップの図である。Ｓｎａｐｇｅｎｅ（登録商標）で作成した。 ｏｒｉ２およびその要素（ｒｅｐＥ、ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＣ）を含むｐＥＴｃｏｃｏ１のプラスミドマップの図である。Ｓｎａｐｇｅｎｅ（登録商標）で作成した。 アラビノースで調整可能なプラスミドｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤのプラスミドマップの図である。ｏｒｉ２とその要素（ｒｅｐＥ、ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＣ）が含まれており、細胞あたり１コピーのプラスミドを保証している。プラスミドはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する。外因性遺伝子は、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ酵素を用いた制限クローニングによってクローニングすることができる。クローン化された遺伝子は、アラビノースプロモーターの制御下にある。ＡｒａＣはアラビノースプロモーターの活性化に必要であり、プラスミド中にも存在する。複製起点、抗生物質耐性マーカー、プロモーター領域の交換を可能にするために、追加のユニークな制限部位（ＳｍｉＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＪＩ、ＭｓｓＩ）が存在する。Ｓｎａｐｇｅｎｅ（登録商標）で作成した。 アラビノースで調整可能なプラスミドｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨのプラスミドマップの図である。このプラスミドは、元のｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤプラスミドにｉｌｖＩＨ遺伝子をＮｈｅＩとＮｏｔＩの酵素で制限クローニングした結果である。このプラスミドは、培地にアラビノースを添加することにより、ｉｌｖＩＨ遺伝子の発現を制御することができる。Ｓｎａｐｇｅｎｅ（登録商標）で作成した。 本研究で野生型大腸菌に行った遺伝子改変の図である。ゲノムＤＮＡは、特定の遺伝子をノックアウトしたもの（遺伝子Ａ）を含む。この遺伝子の発現をＬ－アラビノースで制御できるのは、この遺伝子を含む調整可能な発現プラスミド（ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｇｅｎｅＡ）の存在によるものである。さらに、プラスミドｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋はミニプロインスリンを発現しており、ｎｃＢＣＡＡの誤取り込みをテストすることができる。 ｐＫＤ４６のプラスミドマップの図である。Ｓｎａｐｇｅｎｅ（登録商標）で作成した。 ｐＫＤ３のプラスミドマップの図である。Ｓｎａｐｇｅｎｅ（登録商標）で作成した。 ｐＫＤ４のプラスミドマップの図である。Ｓｎａｐｇｅｎｅ（登録商標）で作成した。 標準条件（ＳＴＤ）と、ｎｃＢＣＡＡの蓄積を誘発する条件、すなわちピルビン酸パルスと酸素制限（ＰＹＲ－Ｏ２）とで、１５Ｌリアクターで異なる大腸菌培養を誘導した後、細胞内可溶性タンパク質画分に存在するノルバリン（Ａ）、ノルロイシン（Ｂ）、β－メチルノルロイシン（Ｃ）のモル濃度をＯＤ_{６００ｎｍ}で規格化して経時的に算出した図である。凡例に示すように、「ＷＴ大腸菌」は野生型の大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋株を表し、「ｉｌｖＧＭ調整可能大腸菌」は大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＧＭ株を示し、「ｉｌｖＩＨ調整可能大腸菌」は大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＩＨ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨ株に対応している。矢印は、１ｇ／Ｌピルビン酸パルスと５分間の酸素制限を組み合わせた時点を示す。 標準条件（ＳＴＤ）と、ｎｃＢＣＡＡの蓄積を誘発する培養条件、すなわちピルビン酸パルスと酸素制限（ＰＹＲ－Ｏ２）とで、１５Ｌリアクターで異なる大腸菌培養を誘導した後、封入体画分に存在するノルバリン（Ａ）およびノルロイシン（Ｂ）のモル濃度をＯＤ_{６００ｎｍ}で規格化して経時的に算出した図である。凡例に示すように、「ＷＴ大腸菌」は野生型の大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋株を表し、「ｉｌｖＧＭ調整可能大腸菌」は大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＧＭ株を示し、「ｉｌｖＩＨ調整可能大腸菌」は大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＩＨ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨ株に対応している。矢印は、１ｇ／Ｌピルビン酸パルスと５分間の酸素制限を組み合わせた時点を示す。

上述したように、本発明は、微生物宿主細胞において目的の組換えポリペプチドを産生する方法に関する。方法は、（ａ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本明細書の他の箇所に記載される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節されるように改変された微生物宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記微生物宿主細胞において目的の前記ポリペプチドを発現させることを含む。

本発明にしたがって、目的の組換えポリペプチドは、微生物宿主細胞で産生されるものとする。本明細書で使用される「組換えポリペプチド」という用語は、遺伝子操作されたポリペプチドを表す。したがって、産生されるポリペプチドは、微生物宿主細胞に対して異種でなければならず、これは宿主細胞が目的のポリペプチドを天然には発現しないことを意味する。したがって、「異種」という用語は、ポリヌクレオチド／ポリペプチドが微生物宿主細胞に天然には存在しないことを意味する。

本発明の好ましい実施形態では、産生される目的の組換えポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。

特に、目的の組換えポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメント、酵素、受容体、分泌タンパク質、融合タンパク質、またはホルモン、特にペプチドホルモン（インスリン、またはその前駆体であるプロインスリンなど）であることが想定される。

好ましい実施形態では、目的の組換えポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、好ましくは、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および一本鎖抗体から選択される。好ましくは、抗体の抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、およびＦｖフラグメントからなる群から選択される。例えば、抗原結合フラグメントはＦ（ａｂ’）_２フラグメントである。

別の好ましい実施形態では、目的の組換えポリペプチドは、プロインスリンまたはインスリンである。インスリンは、ランゲルハンス島から天然に分泌されるペプチドホルモンであり、炭水化物および脂肪の代謝の調節、特にグルコースのグリコーゲンへの変換において機能する。インスリンは、天然に存在するインスリン、特にヒトインスリン、または天然に存在するインスリンのアナログ、特にヒトインスリンのアナログである場合がある。したがって、「インスリン」という用語は、天然に存在するインスリンおよびそのアナログを包含する。インスリンアナログは、天然に存在するものとは異なるが、血糖コントロールの観点からヒトインスリンと同じ作用を行うために人体が利用できるインスリンの変化した形態である。好ましくは、インスリンアナログは、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリンデテミル、およびインスリングラルギンから選択される。

その他の目的の組換えポリペプチドは、ヒルジン、ソマトトロピン、インターロイキン２などのインターロイキン、またはヘモグロビンである。

目的の組換えポリペプチドは、少なくとも１つのイソロイシン残基、少なくとも１つのロイシン残基、および／または少なくとも１つのメチオニン残基を含むものと理解されるべきである。

一実施形態では、目的の組換えポリペプチドは、ロイシンリッチポリペプチドである。例えば、ポリペプチドの少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％またはすべてのアミノ酸はロイシン残基である。例えば、目的の組換えポリペプチドは、９６アミノ酸の長さを有し、１４個のロイシン残基を含む場合がある。あるいは、目的の組換えポリペプチドは、４４アミノ酸の長さを有し、８個のロイシン残基を含む場合がある。あるいは、目的の組換えポリペプチドは、５２アミノ酸の長さを有し、６個のロイシン残基を含む場合がある。

別の実施形態では、目的の組換えポリペプチドは、イソロイシンリッチポリペプチドである。例えば、ポリペプチドの少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％またはすべてのアミノ酸はイソロイシン残基である。

別の実施形態では、目的の組換えポリペプチドは、メチオニンリッチポリペプチドである。例えば、ポリペプチドの少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％またはすべてのアミノ酸はメチオニン残基である。

特に、インスリンのアナログは、インスリングラルギンである。インスリングラルギンは、長時間作用型の基本インスリンアナログである。インスリングラルギンは、非病原性の実験室株である大腸菌（Ｋ１２）を生産生物として用いた組換えＤＮＡ技術によって産生される。Ａ鎖のＡ２１位のアスパラギン残基をグリシンに置換し、Ｂ鎖のＣ末端（Ｂ３１位および３２位）に２つのアルギニン残基を付加したヒトインスリンのアナログである。得られたタンパク質は、ｐＨ４で可溶であり、生理的ｐＨ７．４で微小沈殿物を形成する。少量のインスリングラルギンは、微小沈殿物からゆっくりと放出されるため、薬物に長い作用時間（最大２４時間）を付与し、顕著なピーク濃度を示さない。Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）の名称で販売されている。インスリングラルギンのＣＡＳ登録番号は１６０３３７－９５－１である。

目的の組換えポリペプチドは、好ましくは、形質転換されていない状態の生物で発現されるポリペプチドではない。また、好ましくは、選択マーカーとして発現しているポリペプチドではない（すなわち、抗生物質に対する耐性のような抵抗性を細胞に付与しないポリペプチドである）。さらに、好ましくは、レポーターポリペプチド（蛍光ポリペプチドまたはＧＵＳポリペプチドなど）として発現されるポリペプチドではない。

本発明の方法の一実施形態では、目的の組換えポリペプチド、および本明細書で言及される酵素活性を有するポリペプチドが共発現している。このように、目的の組換えポリペプチドは、本発明の方法に関連して本明細書で言及されるような酵素活性を有するポリペプチドではない。好ましくは、目的のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、および本明細書で言及されるような酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、同じプラスミド上に存在しない。したがって、それらは異なるプラスミドから発現されることが想定される。このように、ポリペプチドは異なるＤＮＡ分子に含まれる。

本発明にしたがって、目的のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本明細書で定義した微生物宿主細胞に導入し、前記微生物宿主細胞で前記目的の組換えポリペプチドを発現させることにより、目的の組換えポリペプチドが産生される。

好ましくは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現プラスミド、すなわち、前記ポリヌクレオチドの発現を可能にするプラスミドに含まれる。同じことが、本明細書の別の場所で定義される酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも当てはまる。ポリヌクレオチドを発現させるために、前記ポリヌクレオチドはプロモーターに動作可能に連結されている。本明細書で使用される「動作可能に連結された」という用語は、プロモーターが前記ポリヌクレオチドの転写を開始することができるような、プロモーターと発現すべきポリヌクレオチドとの間の機能的連結を表す。好ましいプロモーターは、本明細書の他の箇所に記載されている。

発現プラスミドは、さらなる要素を含んでいてもよい。好ましくは、プラスミドは、微生物宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む。例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはテトラサイクリンのような抗生物質への耐性を付与する遺伝子であることができる。

さらに、プラスミドが、微生物宿主細胞内でのプラスミドの複製を可能にするレプリコンを含むことが想定される。好ましい実施形態では、本発明の方法に関連して本明細書に記載された酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドのコピーが、微生物宿主細胞内に１つだけ存在する。したがって、微生物宿主細胞における前記プラスミドのコピー数は１とする。これは、細胞あたりのプラスミドのコピー数が１であることを保証するｏｒｉ２およびその要素ｒｅｐＥ、ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、およびｓｏｐＣの存在によって達成される場合がある。対照的に、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、中コピーまたは高コピーのプラスミド上に存在する場合がある。

微生物宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する方法は、当技術分野でよく知られている。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、形質転換によって微生物宿主細胞に導入される。形質転換とは、生物が異種ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを獲得するプロセスである。一実施形態では、微生物宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウムのような二価の陽イオンを使用して宿主細胞の膜の透過性を高め、宿主細胞を化学的にコンピテントにして、それによって組換えポリヌクレオチドの取り込みの可能性を高める。別の実施形態では、ポリヌクレオチドはエレクトロポレーションによって宿主細胞に形質転換される。さらに、ポリヌクレオチドは、宿主細胞に、すなわち宿主細胞の染色体に、安定的に導入される場合がある。

微生物宿主細胞は、好ましくは細菌である。より好ましくは、微生物宿主細胞は、大腸菌細胞である。大腸菌は、グラム陰性のガンマプロテオバクテリア綱である。Ｋ－１２株とＢ株という２つの分離株の子孫は、分子生物学ではツールとしてもモデル生物としても日常的に使用されている。好ましくは、大腸菌細胞は、Ｋ１２株の大腸菌細胞である。好ましくは、大腸菌細胞株は、大腸菌Ｋ１２ＢＷ２５１１３である（Ｇｒｅｎｉｅｒ、２０１４、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ．９月～１０月；２（５）：ｅ０１０３８～１４を参照）。

ｎｃＢＣＡＡの誤取り込みは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のような他の細菌でも発生するので、本発明は大腸菌に限定されるものではない。

本発明によれば、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、微生物宿主細胞に導入されるものとする。前記微生物宿主細胞は、本明細書の他の箇所に記載される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節されている（上昇しているなど）ように改変されているものとする。したがって、本発明の方法は、（工程ａ）、すなわち導入工程の前に）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される調節された酵素活性を有する微生物宿主細胞を提供するまたは得る工程をさらに含む場合がある。この特定の方法では、前記酵素活性は、改変されていない微生物宿主細胞と比較して調節されているものとする。あるいは、本発明の例示的な方法は、工程ａ）の前に、微生物宿主細胞において上記のような酵素活性を調節する工程を含む場合がある。

本発明の一実施形態において、「酵素活性を調節する」という用語は、（対照または未改変の酵素活性と比較して）酵素活性を上昇させることを表す。別の実施形態では、この用語は、（対照または未改変の酵素活性と比較して）酵素活性を低下させることを表す。

ポリペプチドの酵素活性を上昇させる方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、酵素活性を有するポリペプチドを変異させて、その活性を上昇させることができる（例えば、酵素設計または酵素工学によって）。

本発明の一実施形態では、本明細書で言及する酵素活性は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された微生物宿主細胞において上昇する。好ましくは、酵素活性は、改変されていない微生物宿主細胞における対応する酵素活性と比較して、少なくとも１０％上昇する。より好ましくは、酵素活性は、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％上昇する。一実施形態では、酵素活性は、少なくとも１００％、または別の実施形態では、少なくとも１５０％上昇する。さらに、酵素活性は２０％～３００％、例えば５０％～２００％上昇することが想定される。一実施形態では、酵素活性は、前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現させることによって上昇する。

本発明の一実施形態では、本明細書で言及する酵素活性は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された微生物宿主細胞において低下する。好ましくは、酵素活性は、改変されていない微生物宿主細胞における対応する酵素活性と比較して、少なくとも１０％低下する。より好ましくは、酵素活性は、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％低下する。一実施形態では、酵素活性は、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、少なくとも８０％低下する。しかし、酵素活性は完全にノックアウトされないことが想定される。例えば、宿主細胞は、改変されていない微生物宿主細胞の酵素活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも２０％を保持している可能性がある。このように、酵素活性は２０％～８０％低下する可能性がある。あるいは、酵素活性は３０～７０％低下する可能性がある。一実施形態では、前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害するアンチセンスＲＮＡによって、酵素活性が低下する。このように、アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子に相補的であるべきである。

特定の実施形態では、改変されていない微生物宿主細胞は、野生型の細胞であってもよい。特定の実施形態では、改変されていない微生物宿主細胞は、改変されているものと同じ株である。例えば、改変されていない微生物宿主細胞は、本明細書に記載されているように、その後改変された大腸菌Ｋ１２株であってもよい。

微生物宿主細胞において上昇するように調節された酵素活性は、好ましくは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される。前述の酵素活性は、当技術分野でよく知られているアッセイによって測定することができる。括弧内の数字は、いわゆる酵素番号（「ＥＣ番号」と略す）である。当技術分野で知られているように、すべてのＥＣ番号は、ＥＣの文字の後にピリオドで区切られた４つの数字で構成される。これらの番号は、酵素の段階的な細かい分類を表している。ＥＣ番号に基づいて、酵素によって触媒される反応が特定される。

本発明の一実施形態では、調節されるべき酵素活性は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性である。したがって、ケトール酸レダクトイソメラーゼの活性を調節するものとし、好ましくは上昇させるものとする。この酵素の系統名は、（Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－３－メチルブタノエート：ＮＡＤＰ^＋オキシドレダクターゼ（異性化）である。この酵素のＥＣ番号はＥＣ１．１．１．８６である。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、（Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－３－メチルブタノエート＋ＮＡＤＰ^＋から（Ｓ）－２－ヒドロキシ－２－メチル－３－オキソブタノエート、ＮＡＤＰＨ、Ｈ^＋への化学反応を触媒することができるものとする。したがって、以下の化学反応：
（Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－３－メチルブタノエート＋ＮＡＤＰ^＋⇔（Ｓ）－２－ヒドロキシ－２－メチル－３－オキソブタノエート＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋
を触媒することができるものとする。

本発明の別の実施形態では、調節されるべき酵素活性は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性である。したがって、アセトヒドロキシ酸シンターゼの活性を調節する（例えば、上昇または低下させる）ものとする。この酵素は、アセト乳酸シンターゼとしても知られている。この酵素のＥＣ番号はＥＣ２．２．１．６である。アセトヒドロキシ酸シンターゼは、２つのピルビン酸分子をアセト乳酸分子と二酸化炭素に変換する反応を触媒する能力を有するものとする。この反応は、チアミンピロリン酸を使用して２つのピルビン酸分子を連結する。したがって、以下の化学反応：
２ピルビン酸⇔２－アセト乳酸＋ＣＯ_２
を触媒することができるものとする。

本発明の別の実施形態では、調節されるべき酵素活性は、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性である。したがって、スレオニンシンターゼの活性を調節するものとする。この酵素の系統名は、Ｌ－スレオニンアンモニア－リアーゼ（２－オキソブタノエート形成）である。この酵素のＥＣ番号はＥＣ４．３．１．１９である。

本発明の別の実施形態では、調節されるべき酵素活性は、アスパラギン酸キナーゼ活性である。したがって、アスパラギン酸キナーゼの活性を調節するものとする。この酵素の系統名は、ＡＴＰ：Ｌ－アスパラギン酸４－ホスホトランスフェラーゼである。この酵素のＥＣ番号はＥＣ２．７．２．４である。アスパラギン酸キナーゼは、アスパラギン酸とＡＴＰからβ－アスパラチルリン酸の変換を触媒する能力を有するものとする。スレオニンは、この酵素のアロステリックレギュレータとして、アスパラギン酸からスレオニンへの生合成経路を制御する役割を果たしている。したがって、以下の化学反応：
ＡＴＰ＋Ｌ－アスパラギン酸⇔ＡＤＰ＋４－ホスホ－Ｌ－アスパラギン酸
を触媒することができるものとする。

本発明の別の実施形態では、調節されるべき酵素活性は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性である。したがって、ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を調節するものとする。この酵素の系統名は、Ｌ－ホモセリン：ＮＡＤ（Ｐ）^＋オキシドレダクターゼである。この酵素のＥＣ番号はＥＣ１．１．１．３である。ホモセリンデヒドロゲナーゼは、Ｌ－ホモセリンとＮＡＤ^＋（またはＮＡＤＰ^＋）がＬ－アスパラギン酸４－セミアルデヒド、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）、Ｈ^＋になる化学反応を触媒することができるものとする。したがって、以下の化学反応：
Ｌ－ホモセリン＋ＮＡＤ（Ｐ）^＋⇔Ｌ－アスパラギン酸４－セミアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ^＋
を触媒することができるものとする。

アスパラギン酸キナーゼ活性を有する大腸菌由来の酵素は、ＥＣ１．１．１．３ホモセリンデヒドロゲナーゼの反応も触媒する。したがって、前記酵素は、アスパラギン酸キナーゼ活性とホモセリンデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する二機能性酵素である。したがって、微生物宿主細胞において、アスパラギン酸キナーゼ活性とホモセリンデヒドロゲナーゼ活性の両方の酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞におけるアスパラギン酸キナーゼ活性とホモセリンデヒドロゲナーゼ活性に比べて調節されることが想定される。

本明細書で言及する酵素活性は、好ましくは前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを微生物宿主細胞に導入して発現させることによって上昇する。例えば、ポリヌクレオチドを過剰発現させるものとする。前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、本明細書で言及する酵素活性を有する酵素であるものとする。前記酵素活性を付与する好ましいポリペプチドは、本明細書の他の箇所に詳細に開示されている。また、本明細書で言及するポリペプチドは、さらなる生物学的活性を示す場合があることも理解されるべきである。

前記酵素活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドではないことが理解されるべきである。したがって、本明細書で言及する微生物宿主細胞は、ａ）本明細書で言及する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ｂ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む。したがって、ａ）およびｂ）の下のポリヌクレオチドは、微生物宿主細胞において共発現される。さらに、両ポリヌクレオチドは、人為的に宿主細胞に導入された組換えポリヌクレオチドであることが理解されるべきである。

本明細書で言及する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの好ましい配列を以下に示す。

本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋）活性（ＥＣ１．１．１．８６）を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号３に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。

本発明の別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。

一実施形態では、調節すべき酵素活性は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）活性、特に、ＡＨＡＳアイソフォームＩ、もしくはそのバリアント、ＡＨＡＳアイソフォームＩＩ、もしくはそのバリアント、またはＡＨＡＳアイソフォームＩＩＩ、もしくはそのバリアントの活性である。ｎｃＢＣＡＡの誤取り込みを減少させるために、ＡＨＡＳアイソフォームＩ、またはそのバリアントの活性は低下することが好ましい。ｎｃＢＣＡＡの誤取り込みを減少させるために、ＡＨＡＳアイソフォームＩＩおよびＩＩＩ、またはそれらのバリアントの活性は上昇することが好ましい。

当技術分野で知られているように、機能性アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えば、ＡＨＡＳ Ｉ、ＡＨＡＳ ＩＩまたはＡＨＡＳ ＩＩＩ）は、２つの大サブユニットと２つの小サブユニットを含み、これらは４量体を形成する（アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有する）。この２つの大サブユニットと同様に、２つの小サブユニットは同一である。したがって、アセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットをコードする第１のポリヌクレオチドと、アセトヒドロキシ酸シンターゼの小サブユニットをコードする第２のポリヌクレオチドとを微生物宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチドを発現させることにより、微生物宿主細胞においてアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性が上昇することが好ましい。微生物細胞では、２つの大サブユニットと２つの小ユニットは、好ましくは４量体を形成している。前記四量体は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するものと理解される。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、好ましくは、同じコンストラクト中に存在し、好ましくは、単一のプロモーターの制御下においてバイシストロニック様式で発現される。

ＡＨＡＳ Ｉまたはそのバリアント
本発明の一実施形態では、前記第１のポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号２３に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）アセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットをコードし、前記大サブユニットは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ならびに、前記第２のポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号２５に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）アセトヒドロキシ酸シンターゼの小サブユニットをコードし、前記小サブユニットは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

配列番号２４は、大腸菌由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソフォームＩの大サブユニットのアミノ酸配列であり、一方、配列番号２６は、前記アイソフォームの小サブユニットのアミノ酸配列である。

ＡＨＡＳ ＩＩまたはそのバリアント
本発明の別の実施形態では、前記第１のポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号５、２７、または３１に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、
ｉｉ）アセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットをコードし、前記大サブユニットは、配列番号６、２８または３２に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ならびに、前記第２のポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号７、２９、または３３に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）アセトヒドロキシ酸シンターゼの小サブユニットをコードし、前記小サブユニットは、配列番号８、３０または３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

配列番号６は、大腸菌由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソフォームＩＩの大サブユニットのアミノ酸配列であり、一方、配列番号８は、前記アイソフォームの小サブユニットのアミノ酸配列である。好ましい実施形態では、大腸菌のＡＨＡＳアイソフォーム（またはそのバリアント）が使用される。

配列番号２８は、シゲラ・ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ）由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソフォームＩＩＩの大サブユニットのアミノ酸配列であり、一方、配列番号３０は、前記アイソフォームの小サブユニットのアミノ酸配列である。

配列番号３２は、霊菌由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソフォームＩＩＩの大サブユニットのアミノ酸配列であり、一方、配列番号３４は、前記アイソフォームの小サブユニットのアミノ酸配列である。

ＡＨＡＳ ＩＩＩまたはそのバリアント
本発明の別の実施形態では、前記第１のポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号１３、３５、３９、または４３に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）アセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットをコードし、前記大サブユニットは、配列番号１４、３６、４０または４４に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ならびに、前記第２のポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号１５、３７、４１、または４５に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）アセトヒドロキシ酸シンターゼの小サブユニットをコードし、前記小サブユニットは、配列番号１６、３８、４２または４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

配列番号１４は、大腸菌由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソフォームＩＩＩの大サブユニットのアミノ酸配列であり、一方、配列番号１６は、前記アイソフォームの小サブユニットのアミノ酸配列である。好ましい実施形態では、大腸菌のＡＨＡＳアイソフォーム（またはそのバリアント）が使用される。

配列番号３６は、シゲラ・ボイディ由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソフォームＩＩＩの大サブユニットのアミノ酸配列であり、一方、配列番号３８は、前記アイソフォームの小サブユニットのアミノ酸配列である。

配列番号４０は、霊菌由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソフォームＩＩＩの大サブユニットのアミノ酸配列であり、一方、配列番号４２は、前記アイソフォームの小サブユニットのアミノ酸配列である。

配列番号４４は、枯草菌由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼアイソフォームＩＩＩの大サブユニットのアミノ酸配列であり、一方、配列番号４６は、前記アイソフォームの小サブユニットのアミノ酸配列である。

上述したように、アスパラギン酸キナーゼの活性とホモセリンデヒドロゲナーゼの活性の両方が、微生物宿主細胞において（改変されていない微生物宿主細胞と比較して）調節されることが想定される。好ましい実施形態では、これら２つの活性の上昇は、アスパラギン酸キナーゼ活性およびホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入して発現させることによるものである。したがって、前記ポリペプチドは、二機能性ポリペプチドである。好ましくは、アスパラギン酸キナーゼ活性とホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは：
ｉ）配列番号１７に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、直鎖状または環状の核酸分子を表す。それは、ＤＮＡだけでなく、ＲＮＡ分子も包含する。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチド（すなわち、その自然の状態から単離されたもの）として、または遺伝子組換えの形態で提供されるものとする。この用語は、一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドを包含する。さらに、この用語は、グリコシル化ポリヌクレオチドまたはメチル化ポリヌクレオチドなどの天然に存在する改変ポリヌクレオチド、またはビオチン化ポリヌクレオチドなどの人工的な改変ポリヌクレオチドを含む、化学的に改変されたポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、上記で言及したようなポリペプチドをコードするものであることを特徴とする。ポリヌクレオチドは、好ましくは、上述したような特定のヌクレオチド配列を有する。さらに、遺伝暗号の縮重により、上記で言及したような特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが包含される。

さらに、本発明にしたがって使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、前述の特定のポリヌクレオチドのバリアントをさらに包含する。前記バリアントは、本発明のポリヌクレオチドのオルソログ、パラログまたは他のホモログを表していてもよい。ポリヌクレオチドのバリアントは、好ましくは、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、付加および／または欠失によって、前記特定の核酸配列から配列を導出することができることを特徴とする核酸配列を含み、それによって、バリアントの核酸配列は、依然として、上記で規定した活性を有するポリペプチドをコードするものとする。

本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３または４５に示されるような核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するものとする。さらに、ポリヌクレオチドは、配列番号４、６、８、１２、１４、１６、１８、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４または４６に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることが想定される。本明細書で使用される「少なくとも４０％」という用語は、４０％以上を意味する。特に、この用語は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性（好ましい順に）を意味する。さらに、この用語は、正確な配列、すなわち、１００％の配列同一性を包含する。したがって、ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、または４５に示されるような核酸配列を有するか、または含んでもよく、あるいは配列番号４、６、８、１２、１４、１６、１８、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、または４６に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしていてもよい。

本明細書で使用されるアミノ酸配列または核酸配列間の配列同一性は、最も高い並びの適合が得られるように配列が並べられた２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数を決定することによって評価することができる。好ましくは、同一性のパーセント値は、アミノ酸または核酸の配列領域全体にわたって計算される。異なる配列を比較するために、様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが当業者に提供されている。この文脈において、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、またはＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムは、特に信頼性の高い結果を与える。例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムで公開されている技術や体系化された方法を用いて計算することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９０、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５、４０３）。同一性のパーセント値は、好ましくは、比較ウインドウを用いて計算される。比較ウインドウは、好ましくは、並べられる短い配列の全配列の長さ、または前記配列の少なくとも半分の長さである。配列のアラインメントを行うために、プログラムＰｉｌｅＵｐ（Ｈｉｇｇｉｎｓ １９８９、ＣＡＢＩＯＳ ５、１５１）またはプログラムＧａｐおよびＢｅｓｔＦｉｔ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ １９７０、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３；Ｓｍｉｔｈ １９８１、Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ ２：４８２）を使用する場合があり、これらは、ＧＣＧソフトウェアパケット（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ １９９１、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ ５３７１１）の一部である。本発明の別の態様では、プログラムＧＡＰを用いて、以下の設定：ギャップ重み：５０、長さ重み：３、平均一致：１０．０００、平均不一致：０．０００、で配列領域全体の、上記の配列同一性をパーセント（％）で決定し、これらの設定は、特に指定しない限り、配列アラインメントの標準設定として常に使用されるものとする。好ましくは、配列同一性の度合いを全長にわたって計算する。

一実施形態では、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（上記参照）のアルゴリズムを配列の比較に使用する。このアルゴリズムは、配列アライメントソフトウェアパッケージであるＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ１０およびｗＮＥＥＤＬＥに組み込まれている。例えば、ｗＮＥＥＤＬＥは、整列対象の２つの配列を読み込み、その全長にわたって最適なアラインメントを見つける。アミノ酸配列を比較する場合は、デフォルトのＧａｐオープンペナルティ１０、Ｇａｐエクステンドペナルティ０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスを使用する。ｗＮＥＥＤＬＥを使ってＤＮＡ配列を比較する場合は、Ｇａｐオープンペナルティ１０、Ｇａｐエクステンドペナルティ０．５、比較マトリックスＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。

また、バリアントは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、前述の特定の核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含する。このストリンジェントな条件は、当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１～６．３．６に見出すことができる。したがって、上記のポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３または４５に示される配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるものとし、特に、配列番号３、５、７、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３または４５に示される配列を有するポリヌクレオチドの相補体であるものとすることが想定される。

「ハイブリダイゼーション」という用語は、当技術分野でよく知られており、実質的に相同な相補的ヌクレオチド配列が互いにアニーリングするプロセスのことを表す。ハイブリダイゼーションプロセスは、完全に溶液中で起こることができ、すなわち、両方の相補的な核酸が溶液中にある。また、ハイブリダイゼーションは、相補的な核酸の一方をセファロースビーズなどのマトリックスに固定化して行うこともできる。ハイブリダイゼーションを可能にするために、核酸分子を熱的または化学的に変性させて、二本鎖を２本の一本鎖に融解したり、一本鎖の核酸からヘアピンまたは他の二次構造を除去したりする。

本発明にしたがって、ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、１１、１３、１５、１７、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、または４５に示される配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件、特に高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることができるものとする。「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーションが行われる条件を表す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、イオン強度、ハイブリダイゼーションバッファーの組成などの条件に影響される。好ましい実施形態では、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、１×ＳＳＣ中６５℃でのハイブリダイゼーション、または１×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．３×ＳＳＣ中６５℃での洗浄を包含する。さらに、ハイブリダイゼーションの後に、０．１×ＳＳＣ中６５℃で洗浄することが想定される。１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである；ハイブリダイゼーション溶液および洗浄溶液は、さらに、５×デンハルト試薬、０．５～１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性し断片化したサケ精子ＤＮＡ、および０．５％ピロリン酸ナトリウムを含んでいてもよい。

本発明の方法の工程（ｂ）では、目的のポリペプチドを前記微生物宿主細胞で発現させる。好ましくは、前記工程は、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件で実行される。適切な培養条件は、当業者がさらに苦労することなく決定することができる。好ましくは、工程は、標準的な条件で実行される。このように、宿主細胞は、標準的な条件で、例えば、実施例９に記載された標準的な条件で培養される。

一実施形態では、発現はバイオリアクター内の大規模な条件で行われる。本明細書で使用される「バイオリアクター」という用語は、条件が厳密に制御されるシステムを表す。一実施形態では、前記バイオリアクターは、撹拌槽型バイオリアクターである。好ましくは、バイオリアクターは、ステンレス鋼などの非腐食性材料で作られる。バイオリアクターは、任意のサイズであることができる。一部の実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０、少なくとも１００、５００、少なくとも１０００、少なくとも２５００、または少なくとも５０００リットルの体積、または任意の中間的な体積を有する。

本発明にしたがって、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結されている。同じことが、本明細書で言及する酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも当てはまる。しかし、前記のポリヌクレオチドが異なるプロモーターに連結されていることが好ましい。

プロモーターは、ポリヌクレオチドの発現を可能にするものとする。好ましくは、プロモーターは、それによって制御される配列に関して異種である。このように、プロモーターは、酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの、それぞれに異種であるものとする。好ましくは、プロモーターは構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである。微生物宿主細胞での発現を可能にする構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターは、当技術分野でよく知られている。

「構成的プロモーター」とは、必ずしもすべての成長段階ではなく、ほとんどの環境条件下で転写活性を示すプロモーターを表す。

「誘導性プロモーター」とは、刺激に反応して転写開始が増加するプロモーターを表す。

本発明にしたがって、プロモーターが誘導性プロモーターであることが特に企図されている。このように、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターに動作可能に連結されているものとする。この場合、酵素活性は一時的にしか上昇しない（すなわち、プロモーターの誘導後）。

一実施形態では、誘導性プロモーターは、アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターである。このプロモーターは当技術分野でよく知られている。アラビノース濃度の広い範囲で発現を調整できることから、アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーター（ＰＢＡＤ）は、その制御タンパク質であるＡｒａＣとともに、高レベルの組換えタンパク質生産のための発現系として、また、代謝工学を目的とした発現系として記載されている。（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５、Ｔｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ＰＢＡＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７７（１４）、４１２１～４１３０）。ＡｒａＣ－ＰＢＡＤプロモーター系は、異化抑制によっても制御されていることが示されている（Ｓｃｈｌｅｉｆ， Ｒ． ２０００、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６（１２）、５５９～５６５；Ｍｅｇｅｒｌｅら、２００８、Ｔｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ、９５（４）、２１０３～２１１５）。さらに、ＡｒａＣ－ＰＢＡＤ発現系の適用性は、大腸菌の株に依存することが報告されている。クローニングベクターには、通常、ネイティブなａｒａＢＡＤ制御システム由来のａｒａＢＡＤプロモーターとａｒａＣ遺伝子のネイティブな配列が含まれている。

ａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、配列番号１９に示されている。したがって、好ましくは、ａｒａＢＡＤプロモーターは、配列番号１９に示される核酸配列を含み、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する。

ポリヌクレオチドａｒａＣの核酸配列を配列番号２０に示す。この遺伝子は、ＡｒａＣポリペプチドをコードする。ａｒａＢＡＤプロモーターを使用する場合は、ＡｒａＣポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを微生物宿主細胞に導入してプロモーターを活性化する必要がある。

さらに、誘導性プロモーターは、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ｌａｃプロモーターのバリアント（ｌａｃＵＶ５、Ｐｔａｃ、Ｐｔｒｃ、およびＴ７ｌａｃプロモーターなど）、ＸｙｌＳＰｍプロモーター、およびｔｅｔプロモーターである。

本明細書で言及される酵素活性を有するポリペプチドおよび／または目的のポリペプチドは、追加の配列を含んでいてもよい。例えば、ポリペプチドは、精製タグをさらに含んでいてもよい。このタグは、ポリペプチドに動作可能に連結されているものとする。

タグは、ポリペプチドの精製を可能にするものとする。そのようなタグは、当技術分野でよく知られている。本明細書で使用される「精製タグ」という用語は、好ましくは、ポリペプチドの精製を可能にする追加のアミノ酸配列（ポリペプチドのペプチド）を表す。一実施形態では、精製タグは、本明細書で言及されるポリペプチドに自然に連結されていないペプチドまたはポリペプチドである。このように、精製タグは、ポリペプチドに関して異種のものとする。

好ましくは、精製タグは、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザウイルスＨＡタグ、チオレドキシン、スタフィロコッカルプロテインＡタグ、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、およびｃ－ｍｙｃエピトープからなる群から選択される。好ましい実施形態では、精製タグは、ポリヒスチジンタグである。好ましくは、前記ポリヒスチジンタグは、少なくとも６個の連続したヒスチジン残基を含む。

本発明の方法の好ましい実施形態では、方法は、細胞からの目的のポリペプチドの単離、および前記ポリペプチドの精製をさらに含む。ポリペプチドの単離は、適切な精製タグの使用など、よく知られた手段によって達成することができる。

一実施形態では、精製は、非正準分枝鎖アミノ酸を含まないポリペプチドの濃縮を含む。これは、例えば、Ｍｉｎ，Ｃ． Ｋ．ら、２０１２、Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、９０８、１０５～１１２；Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｐ．ら、２０１４、Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０、４５～５０；Ｃｖｅｔｅｓｉｃ，Ｎ．ら、２０１６、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ、６、２８６３、に記載のよく知られている方法で達成できる。例えば、濃縮はクロマトグラフィーによって行われる。

微生物宿主細胞は、上で定義されている。上述したように、微生物宿主細胞は、好ましくは大腸菌細胞である。当業者に知られているように、大腸菌細胞は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋）活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、またはＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）を有するポリペプチドを自然に発現する。
・ｉｌｖＣ遺伝子は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋）活性（ＥＣ１．１．１．８６））を有するポリペプチドをコードする。
・ｉｌｖＩＨオペロンは、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩＩ）を有するポリペプチドをコードする、
・ｉｌｖＢＮオペロンは、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩ）を有するポリペプチドをコードする、
・ｉｌｖＧＭオペロンは、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（アセトヒドロキシ酸シンターゼアイソザイムＩＩ）を有するポリペプチドをコードする、
・ｔｈｒＡ遺伝子は、アスパラギン酸キナーゼ活性とホモセリンデヒドロゲナーゼ活性とを有する二機能性ポリペプチドをコードする、および
・ｉｌｖＡ遺伝子は、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。

したがって、改変された微生物宿主細胞は、内因性の酵素活性、すなわち微生物宿主細胞内に自然に存在する活性を有していてもよい。しかし、微生物宿主が、本明細書で言及する酵素活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドを発現していないことが特に想定されている。このように、内因性酵素活性がノックアウトされている場合がある。したがって、内因性ポリヌクレオチド（したがって内因性酵素活性）がノックアウトされていることが想定される。このように、ｉｌｖＣ遺伝子、ｉｌｖＩＨオペロン、ｉｌｖＢＮオペロン、ｔｈｒＡ遺伝子、ｉｌｖＧＭオペロン、またはｉｌｖＡ遺伝子がノックアウトされている場合がある。これは、当技術分野でよく知られた方法によって達成することができ、実施例の項に記載されている。さらに、このようなノックアウトは既に知られており、例えば、エール大学の大腸菌遺伝子保存センター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＧＳＣ）から評価することができる。例えば、大腸菌Ｋ１２ＢＷ２５１１３は、ｉｌｖＧ遺伝子配列の塩基対１２５０と１２５３との間に２塩基の挿入事象があり、フレームシフト変異が生じている。その結果、終止コドンが形成され、ｉｌｖＧ遺伝子の発現が早期に終了する（ｉｌｖＧ－）。次いで機能性ＡＨＡＳＩＩは発現されず、ｉｌｖＥＤＡオペロンの遠位の遺伝子発現が損なわれる。（Ｌａｗｔｈｅｒら、１９８１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｖａｌｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２、ＰＮＡＳ ７８（２）９２２～９２５；Ｐａｒｅｋｈ， Ｂ．Ｓ．およびＨａｔｆｉｅｌｄ， Ｇ．Ｗ． １９９７．Ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｌｖＧＭＥＤＡ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｉｓ ａ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌａｒ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｌｖＧ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７９（６）２０８６～２０８８）。本明細書で開示された特定の実施形態では、エール大学の大腸菌遺伝子保存センター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＧＳＣ）から、ΔｔｈｒＡ、ΔｉｌｖＡ、およびΔｉｌｖＣのノックアウト株を入手した（実施例の項を参照）。

一実施形態では、前記酵素活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドが欠失されている。あるいは、それが変異しており、それによって内因性酵素活性が不活性化されている場合がある。内因性ポリヌクレオチドは、本明細書で言及する酵素活性を有するポリペプチドをコードする天然に存在するポリヌクレオチドである。

例えば、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（すなわち、組換えポリヌクレオチド）を導入して発現させることにより、微生物宿主細胞において、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性を上昇させることができる。一実施形態では、前記微生物宿主細胞は、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドを発現する（すなわち、組換えポリヌクレオチドに加えて）。別の、より好ましい実施形態では、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチド（したがって、ｉｌｖＡ遺伝子）は、前記微生物細胞においてノックアウトされている。したがって、前記微生物細胞は、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性を有する内因性ポリペプチドを発現していない。前記活性を有する組換えポリペプチドのみが発現する。

内因性遺伝子（すなわち内因性酵素活性）のノックアウトと、上述のような誘導性プロモーターの使用とを組み合わせることで、微生物宿主細胞における酵素活性の制御を改善することができる。

好ましい実施形態では、産生された目的のポリペプチドは、改変されていない微生物宿主細胞における発現によって産生されたポリペプチドと比較して、非正準分枝鎖アミノ酸（ｎｃＢＣＡＡ）の低い誤取り込みを示す。したがって、ｎｃＢＣＡＡの誤取り込みが減少する。

好ましくは、非正準分枝鎖アミノ酸は、ノルバリン、ノルロイシンおよびβ－メチルノルロイシンから選択される。したがって、目的のポリペプチドは、改変されていない微生物宿主細胞における発現によって産生されたポリペプチドと比較して、ノルバリン、ノルロイシンおよびβ－メチルノルロイシンの誤取り込みが低いことが好ましい。

一部の実施形態では、細胞内可溶性タンパク質画分において、非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みが減少する。一部の実施形態では、封入体画分において、非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みが減少する。

ノルバリンは、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_２ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯ_２Ｈという式で表されるアミノ酸である。この化合物は、より一般的なアミノ酸であるバリンの異性体である。ＩＵＰＡＣ名は２－アミノペンタン酸である。ノルバリンはロイシン残基の代わりに組換えタンパク質に誤って取り込まれる可能性がある。したがって、「ノルバリンの誤取り込み」という用語は、目的のポリペプチドをコードする対応する核酸によってロイシン残基がコードされている目的のポリペプチドに、ノルバリン残基が取り込まれることを表す。

ノルロイシンは、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯ_２Ｈという式で表されるアミノ酸である。ノルロイシンは、より一般的なアミノ酸であるロイシンの異性体である。ＩＵＰＡＣ名は２－アミノヘキサン酸である。ノルロイシンはメチオニン残基の代わりに組換えタンパク質に誤って取り込まれる可能性がある。したがって、「ノルロイシンの誤取り込み」という用語は、目的のポリペプチドをコードする対応する核酸によってメチオニン残基がコードされている目的のポリペプチドに、ノルロイシン残基が取り込まれることを表す。

β－メチルノルロイシンは、アミノ酸である。このアミノ酸の同義語は、β－メチルノルロイシン；（２Ｓ，３Ｓ）－２－アミノ－３－メチルヘキサン酸、および［２Ｓ，３Ｓ，（＋）］－２－アミノ－３－メチルヘキサン酸である。β－メチルノルロイシンはイソロイシン残基の代わりに組換えタンパク質に誤って取り込まれる可能性がある。したがって、「β－メチルノルロイシンの誤取り込み」という用語は、目的のポリペプチドをコードする対応する核酸によってイソロイシン残基がコードされている目的のポリペプチドに、β－メチルノルロイシン残基が取り込まれることを表す。

このように、目的のポリペプチドが少なくとも１つのロイシン残基、少なくとも１つのメチオニン残基、および／または少なくとも１つのイソロイシン残基を含む場合、上記で言及したｎｃＢＣＡＡの誤取り込みが生じる場合がある。したがって、目的のポリペプチドが、少なくとも１つのロイシン残基、少なくとも１つのメチオニン残基、および／または、少なくとも１つのイソロイシン残基を含むことが想定される。

本発明の一実施形態では、ノルバリンの誤取り込みが低減される。
本発明の一実施形態では、ノルロイシンの誤取り込みが低減される。
本発明の一実施形態では、β－メチルノルロイシンの誤取り込みが低減される。
本発明の一実施形態では、ノルバリンおよびノルロイシンの誤取り込みが低減される。
本発明の一実施形態では、ノルロイシンおよびβ－メチルノルロイシンの誤取り込みが低減される。
本発明の一実施形態では、ノルバリンおよびβ－メチルノルロイシンの誤取り込みが低減される。
本発明の一実施形態では、ノルバリン、ノルロイシンおよびβ－メチルノルロイシンの誤取り込みが低減される。

本発明にしたがって、ｎｃＢＣＡＡ含有量、特にノルバリン、ノルロイシンおよび／またはβ－メチルノルロイシン含有量の低減率は、（改変されていない微生物宿主細胞、すなわち対照細胞における発現によって産生されたポリペプチド中の含有量と比較して）好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも１５％、さらに好ましくは少なくとも２０％である。このように、ｎｃＢＣＡＡの誤取り込みは、好ましくは少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％低減される。ｎｃＢＣＡＡｓの含有量またはノルバリン、ノルロイシンおよび／またはβ－メチルノルロイシンの含有量の減少率は、好ましくは、ｎｃＢＣＡＡｓまたはノルバリン、ノルロイシンおよび／またはβ－メチルノルロイシンを含む目的のポリペプチドの割合の減少として計算される。

本明細書で上述した定義と説明は、本発明の以下の実施形態に準用される。

さらに、本発明は、微生物宿主細胞で発現させた目的の組換えポリペプチドへの、少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減する方法であって、
（ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を微生物宿主細胞において調節すること、
（ｂ）前記微生物宿主細胞に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すること、および
（ｃ）前記微生物宿主細胞において、目的の前記ポリペプチドを発現させること
を含む前記方法に関する。

あるいは、工程（ａ）は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性の調節された活性を有する微生物宿主細胞を得ることを含んでもよい。

一実施形態では、上記の酵素活性は、改変されていない微生物宿主細胞と比較して、微生物宿主細胞において調節（上昇または低下）されるものとする。酵素活性を調節する方法は上述の通りである。好ましくは、前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記微生物宿主細胞に導入して発現させることにより、前記酵素活性は調節される（例えば、上昇する）。ポリヌクレオチド／ポリペプチドの好ましい配列は上述の通りである。

微生物宿主細胞であって、
（ａ）目的のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、および
（ｂ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド
を含む微生物宿主細胞、が本発明によってさらに想定される。

さらに、本発明は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を有するポリペプチドの使用、または微生物宿主細胞で産生される目的の組換えポリペプチドへの少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減するための前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用、に関する。

最後に、本発明は、目的の組換えポリペプチドを産生するための微生物宿主細胞の使用であって、微生物宿主細胞は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節されるように改変された、微生物宿主細胞の使用、に関する。

以下では、本発明の実施形態を要約する。上述した定義と説明は、実施形態に準用される。

実施形態の一覧
１．微生物宿主細胞において目的の組換えポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節されるように改変された微生物宿主細胞に導入する工程、および
（ｂ）前記微生物宿主細胞において、目的の前記ポリペプチドを発現させる工程
を含む方法。

２．産生された目的のポリペプチドは、改変されていない微生物宿主細胞における発現によって産生されたポリペプチドと比較して、非正準分枝鎖アミノ酸の低い誤取り込みを示す、実施形態１に記載の方法。

３．産生されたポリペプチドの量が、改変されていない微生物宿主細胞で産生された前記ポリペプチドの量と比較して増加している、実施形態１または２に記載の方法。

４．方法は、細胞からのポリペプチドの単離、およびポリペプチドの精製をさらに含む、実施形態１～３のいずれか１項に記載の方法。

５．精製は、非正準分枝鎖アミノ酸を含まないポリペプチドの濃縮を含む、実施形態４に記載の方法。

６．前記酵素活性は、前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記微生物宿主細胞に導入して発現させることによって上昇する、実施形態１または５に記載の方法。

７．（ａ）ポリヌクレオチドは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋）活性（ＥＣ１．１．１．８６））を有するポリペプチドをコードし、
ｉ）ポリヌクレオチドは配列番号３に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）ポリヌクレオチドは配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、
または
（ｂ）ポリヌクレオチドは、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）を有するポリペプチドをコードし、
ｉ）ポリヌクレオチドは配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または
ｉｉ）ポリヌクレオチドは配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、
実施形態６に記載の方法。

８．前記微生物宿主細胞は、前記酵素活性を有する内因性ポリペプチドを発現していない、実施形態６または７のいずれか１項に記載の方法。

９．目的のポリペプチドは治療用のペプチドまたはポリペプチドである、実施形態１～８のいずれか１項に記載の方法。

１０．目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターに動作可能に連結されている、実施形態１～９のいずれか１項に記載の方法。

１１．前記微生物宿主細胞は大腸菌細胞である、実施形態１～１０のいずれか１項に記載の方法。

１２．微生物宿主細胞で発現させた目的の組換えポリペプチドへの、少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減する方法であって、
（ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を微生物宿主細胞において調節すること、
（ｂ）前記微生物宿主細胞に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すること、および
（ｃ）前記微生物宿主細胞において、目的の前記ポリペプチドを発現させること
を含む前記方法。

１３．少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸は、ノルバリン、ノルロイシンおよびβ－メチルノルロイシンから選択される、実施形態１２に記載の方法。

１４．微生物宿主細胞であって、
（ａ）目的のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、
（ｂ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド
を含む微生物宿主細胞。

１５．ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を有するポリペプチドの使用、または微生物宿主細胞で産生される目的の組換えポリペプチドへの少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減するための前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。

１６．目的の組換えポリペプチドを産生するための微生物宿主細胞の使用であって、微生物宿主細胞は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節されるように改変された、微生物宿主細胞の使用。

１７．酵素活性は調節されている、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の方法、実施形態１４に記載の微生物細胞、または実施形態１５もしくは１６に記載の使用。

１８．目的のポリペプチドはプロインスリンである、実施形態１～１３または１７のいずれか１項に記載の方法、実施形態１４もしくは１７に記載の微生物細胞、または実施形態１５、１６もしくは１７に記載の使用。

上記で言及したすべての文献は、その開示内容全体、および上記の説明で明示的に言及されている特定の開示内容に関して、参照によって本明細書に組み入れる。

以下の実施例は、単に本発明を説明するものである。これらはいかなる方法でも保護の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

Ｋ１２ ＢＷ２５１１３ ΔｔｈｒＡ、ΔｉｌｖＡ、ΔｉｌｖＣ、ΔｉｌｖＩＨ、ΔｉｌｖＢＮ変異体のプラスミドｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋による形質転換
ΔｔｈｒＡ、ΔｉｌｖＡ、ΔｉｌｖＣのノックアウト
大腸菌Ｋ１２ＢＷ２５１１３、ならびにシングルノックアウト変異体である大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３ ΔｔｈｒＡ、ΔｉｌｖＡ、およびΔｉｌｖＣは、エール大学の大腸菌遺伝子保存センター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＧＳＣ）から入手した。これらの変異株は、ＫＥＩＯコレクションと呼ばれるものに属する（Ｂａｂａ，Ｔ．，Ａｒａ，Ｔ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．，Ｔａｋａｉ，Ｙ．，Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｙ．，Ｂａｂａ，Ｍ．＆ Ｍｏｒｉ，Ｈ．（２００６）． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｉｎ－ｆｒａｍｅ，ｓｉｎｇｌｅ－ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｕｔａｎｔｓ：ｔｈｅ Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ、２（１））。これらの菌株にはプラスミドｐＫＤ４６（図８）と標的遺伝子に代わるカナマイシン耐性マーカーが含まれている。入手した各菌株のＣＧＳＣ識別情報は以下の通りである。

入手した大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３シングルノックアウト変異体からプラスミドｐＫＤ４６を精選し、それぞれのエレクトロコンピテントセルを、フリッパーゼをコードする温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（図３）で形質転換した。プラスミドｐＣＰ２０を精選し、変異体からの抗生物質耐性マーカーの除去を塩基配列決定により検証した。最終的に得られたそれぞれのエレクトロコンピテント大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３変異体を、ミニプロインスリンをコードする高コピープラスミドであるｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋（図１）で形質転換した。

ΔｉｌｖＩＨおよびΔｉｌｖＢＮのノックアウト
ノックアウト株である大腸菌Ｋ１２ＢＷ２５１１３ΔｉｌｖＩＨとΔｉｌｖＢＮは入手せずに手動で作製した。「Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．＆ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．（２０００）、Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、９７（１２）、６６４０～６６４５」に記載の大腸菌ノックアウト変異体の作製手順を参考にした。大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３細胞を温度感受性組換えヘルパープラスミドであるｐＫＤ４６で形質転換した。次いで、ｐＫＤ４６を含むエレクトロコンピテント大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３細胞を、あらかじめｐＫＤ３（図９）またはｐＫＤ４（図１０）からＰＣＲで得たそれぞれの欠失カセットで形質転換することにより、オペロンｉｌｖＩＨおよびｉｌｖＢＮのノックアウト変異体を作製した。欠失カセットのゲノムへの適切な組込みを調べるために、ＰＣＲによる検証を行った。プラスミドｐＫＤ４６を精選し、それぞれのエレクトロコンピテント大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３変異体を、フリッパーゼをコードする温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（図３）で形質転換した。プラスミドｐＣＰ２０を精選し、変異体からの抗生物質耐性マーカーの除去を塩基配列決定により検証した。最終的に得られたそれぞれのエレクトロコンピテント大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３変異体を、ミニプロインスリンをコードする高コピープラスミドであるｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋（図１）で形質転換した。

ａｒａＣ－ＰＢＡＤ調節可能発現ベクター（ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ）の設計および作製
これまでノックアウトされていた研究対象遺伝子の制御を可能にするアラビノースベースの調整可能発現プラスミドは、３つの異なるＤＮＡセグメントの接合によって得られた。フラグメント１は、ａｒａＣ－ＰＢＡＤプロモーター領域（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５、Ｔｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ＰＢＡＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７７（１４）、４１２１～４１３０）、ＵＴＲ、Ｔ７ターミネーター、稀少制限酵素ＮｈｅＩとＮｏｔＩによる遺伝子クローニングを可能にするクローニング部位、融合タンパク質の発現を可能にするＣ末端６×ｈｉｓ－タグ配列を含む。フラグメント２にはクロラムフェニコール耐性カセットが、フラグメント３にはｏｒｉ２複製開始点とｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＣ、ｒｅｐＥの遺伝子が含まれている。

フラグメント１を化学合成し、続いてプラスミド１６ＡＢＺ５ＮＰ＿１９３４１７７にクローニングした（図２）。次いでフラグメント１を、プラスミド１６ＡＢＺ５ＮＰ＿１９３４１７７からＰＣＲで増幅した。フラグメント２および３を、それぞれプラスミドｐＣＰ２０（図３）およびｐＥＴｃｏｃｏ１（図４）からＰＣＲによって直接増幅した。これらの３つのＤＮＡセグメントをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ戦略（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ；Ｒｅｆ．：６３９６４９）にしたがって結合し、プラスミドｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤを作製した（図５）。

調整可能発現ベクターへの標的遺伝子のクローニング
研究用遺伝子（ｉｌｖＡ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩＨ、ｉｌｖＢＮ、およびｔｈｒＡ）を、大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅し、制限酵素ＮｈｅＩとＮｏｔＩを用いて、先に作製した調整可能発現プラスミドにクローニングした（図５）。ｉｌｖＧＭを、ｉｌｖＧが変異していない大腸菌株から増幅した。例として、得られたアラビノースで調整可能なプラスミドｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨのプラスミドマップを図６に示す。

クローニングされた遺伝子を持つ調整可能発現ベクターのｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋を含むそれぞれの変異体への形質転換
ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋を含む最終的なそれぞれのエレクトロコンピテント大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３変異体を、対応する研究用遺伝子を発現する調整可能発現プラスミドで形質転換した。

すべての遺伝子を改変した後、作製した大腸菌の変異株は、図７に示すようになる。次いで、合計６つの大腸菌変異株：
・ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋およびｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＣを発現する大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＣ
・ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋およびｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨを発現する大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＩＨ
・ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋およびｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＢＮを発現する大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＢＮ
・ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋およびｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｔｈｒＡを発現する大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３ ΔｔｈｒＡ
・ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋およびｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＡを発現する大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＡ
・ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋およびｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＧＭを発現する大腸菌Ｋ１２ ＢＷ２５１１３
を作製した。

変異大腸菌株の細胞増殖に対するＬ－アラビノース誘導効果の評価。
本実験の目的は、異なる濃度のＬ－アラビノースを添加することで、ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある遺伝子の発現に及ぼす影響を評価し、その結果、作製された変異大腸菌株の細胞増殖に及ぼす影響を調べることである。

大腸菌細胞を、規定のミネラル塩培地：（１Ｌあたり）Ｎａ_２ＳＯ_４ ０．６７ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ０．８２ｇ、ＮＨ_４Ｃｌ ０．１７ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ４．８７ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ １．２ｇ、（ＮＨ_４）_２－Ｈ－クエン酸塩 ０．３３ｇ、を含む、で培養した。この培地に０．６７ｍｌ／Ｌの微量元素溶液と０．６７ｍｌ／ＬのＭｇＳＯ_４溶液（１．０Ｍ）を添加した。微量元素溶液は、ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ ０．１８ｇ、ＭｎＳＯ_４×Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ、ＦｅＣｌ_３×６Ｈ_２Ｏ １６．７ｇ、ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏ ０．１６ｇ、ＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ ０．１８ｇを含んでいた（１Ｌあたり）。さらに、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファーを用いて、培地のさらなる緩衝を行った。

培養を作製するために、対応する大腸菌株を含むクリオストック５０μＬを使用して、５ｇ／Ｌグルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（変異大腸菌株の場合のみ）および所与の濃度のＬ－アラビノースを含む規定のミネラル塩添加培地５ｍＬに接種した。培養は、オービタルシェーカーを用いて、３７℃、２２０ｒｐｍで１５時間インキュベートした。培養の最後に、各培養物のＯＤ_{６００ｎｍ}を測定した。以下の表は、得られた結果をまとめたものである。

ミニバイオリアクターレベルでの変異大腸菌株のｎｃＢＣＡＡ産生に対するＬ－アラビノース誘導効果を評価するための培養条件。
培養培地
大腸菌を、規定のミネラル塩培地：（１Ｌあたり）Ｎａ_２ＳＯ_４ ０．６７ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ０．８２ｇ、ＮＨ_４Ｃｌ ０．１７ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ４．８７ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４×２Ｈ_２Ｏ １．２ｇ、（ＮＨ_４）_２－Ｈ－クエン酸塩 ０．３３ｇを含む、で培養した。この培地に０．６７ｍｌ／Ｌの微量元素溶液と０．６７ｍｌ／ＬのＭｇＳＯ_４溶液（１．０Ｍ）を添加した。微量元素溶液は、ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ ０．１８ｇ、ＭｎＳＯ_４×Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ、ＦｅＣｌ_３×６Ｈ_２Ｏ １６．７ｇ、ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏ ０．１６ｇ、ＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ ０．１８ｇを含んでいた（１Ｌあたり）。さらに、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファーを用いて、培地のさらなる緩衝を行った。

前培養
対応する大腸菌株を含むクライオストック３０μＬを、５ｇ／Ｌグルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（変異大腸菌株の場合のみ）を含む規定ミネラル塩添加培地３０ｍＬに接種して、前培養を作製した。各変異大腸菌株について、培地には、実施例５で事前に試験した非遺伝子操作菌株の細胞増殖を回復させるのに必要な最小Ｌ－アラビノース濃度も含まれていた。前培養液は、オービタルシェーカーを用いて３７℃、２２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。

本培養
前培養終了時のＯＤ_{６００ｎｍ}を測定し、初期のＯＤ_{６００ｎｍ}が０．４となるように、所与の容量を５ｍＬの開始量のＰａｌｌ Ｍｉｃｒｏ２４ミニバイオリアクター（Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に接種した。ミニリアクターの培地は、４ｇ／Ｌグルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（変異大腸菌株のみ）、１μＬ／ｍＬデスモフェン消泡剤を含む規定のミネラル塩添加培地からなっていた。培地には、異なる濃度のＬ－アラビノースも添加した。培養は３７℃で行い、ＮＨ_４ＯＨとＣＯ_２による自動制御でｐＨを７に維持した。撹拌速度は８００ｒｐｍ、ＤＯの設定値は２５％に設定し、ミニリアクター内の酸素流量を自動的に増加させることで最後の状態を維持した。バッチ段階は約４時間継続した。バッチ段階が終了した後、４００ｇ／Ｌ ＥｎＰｕｍｐ ２００溶液 １ｍＬと３０００Ｕ／Ｌアミラーゼ溶液 ５０μＬを手動でミニリアクターに添加し、フェドバッチ段階を開始した。ＥｎＰｕｍｐ ２００はグルコースポリマーであり、アミラーゼが存在すると、常にポリマーを加水分解するため、時間の経過とともに遊離のグルコース分子が生成され、グルコース制限のある発酵が保証される。フェドバッチ段階の開始から３０分後、最終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧパルスを手動で添加し、組換えタンパク質の発現を誘導した。フェドバッチ段階は３．５時間有効であった。

アミノ酸分析
細胞抽出液から「ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ」キット（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号７０５８４－４）のプロトコールにしたがって、細胞内可溶性タンパク質画分と封入体画分を単離した。単離した細胞内可溶性タンパク質画分 ２５０μＬを５Ｍ塩酸 ７５０μＬと混合した。単離した封入体ペレットをｄＨ_２Ｏ ２００μＬで再懸濁し、得られた封入体懸濁液１００μＬを５Ｍ塩酸 ９００μＬと混合した。得られた溶液をスクリューキャップ付きのクリスタルバイアルに導入し、バイアルを密閉して８０℃で２４時間インキュベートして酸加水分解を行った。その後、バイアルを開けたまま、液体がすべて蒸発するまで回転させながら、６５℃で１６～２４時間加熱ブロックに放置した。乾燥した加水分解試料からのアミノ酸の単離は、「ＧＣ－ＦＩＤによる遊離（生理的）アミノ酸分析用ＥＺ：ｆａａｓｔ（商標）」キット（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号ＫＧ０－７１６５）のプロトコールにしたがって行った。単離工程後、得られた上層の約１２０μＬをＧＣバイアルに導入し、次いで２μＬをＧＣ分析装置に注入した。ＧＣは、次のオーブン条件：平衡化時間０．５分、１１０℃で１分、３０℃／分で３２０℃まで昇温し、次いで３２０℃で１分、にしたがって運転した。キャリアガスには窒素を用い、１．５ｍＬ／分の一定流量にした。注入は、２５０℃で１：１５のスプリット比で行った。

ミニバイオリアクターレベルでの変異大腸菌株のｎｃＢＣＡＡ産生に対するＬ－アラビノース誘導効果を評価するための培養条件。
以下の表は、異なる濃度のＬ－アラビノースにおける、各試験したタンパク質画分、ｎｃＢＣＡＡおよび変異株の実験結果をまとめたものである。表中の太字のデータは、大腸菌ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋対照株の所与のｎｃＢＣＡＡの濃度に相当する。表中のパーセント表示のデータは、所与のＬ－アラビノース濃度下において変異株で得られたｎｃＢＣＡＡ濃度の、大腸菌ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋対照株で得られたｎｃＢＣＡＡ濃度に対する変動率に相当する。

封入体画分
Ａ）ノルバリン

大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＣ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＣ株および大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＩＨ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨ株では、Ｌ－アラビノースの濃度を上げて培地に添加すると、ノルバリン濃度が有意に減少した。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＢＮ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＢＮ株では、その逆の挙動が見られた。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｔｈｒＡ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｔｈｒＡ株および大腸菌ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＧＭ株では、ノルバリン濃度が有意に減少したが、Ｌ－アラビノース濃度の増加によるノルバリン濃度の変動には明確な傾向が見られなかった。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＡ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＡ株では、ノルバリン濃度の有意な減少は報告されず、Ｌ－アラビノース濃度の増加によるノルバリン濃度の変動に明確な傾向は見られなかった。

Ｂ）ノルロイシン

大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＣ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＣ株および大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＩＨ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨ株では、Ｌ－アラビノースの濃度を上げて培地に添加すると、ノルロイシン濃度が有意に減少した。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＢＮ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＢＮ株では、その逆の挙動が見られた。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｔｈｒＡ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｔｈｒＡ株および大腸菌ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＧＭ株では、ノルロイシン濃度が有意に減少したが、Ｌ－アラビノース濃度の増加によるノルロイシン濃度の変動には明確な傾向が見られないようであった。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＡ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＡ株では、ノルロイシン濃度の有意な減少は報告されず、Ｌ－アラビノース濃度の増加がノルロイシン濃度の変動に明確な影響を与えていないようである。

細胞内可溶性タンパク質画分
Ａ）ノルバリン

大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＣ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＣ株および大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＩＨ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨ株では、Ｌ－アラビノースの濃度を上げて培地に添加すると、ノルバリン濃度が減少した。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＢＮ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＢＮ株では、その逆の挙動が見られた。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｔｈｒＡ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｔｈｒＡ株、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＡ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＡ株および大腸菌ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＧＭ株では、ノルバリン濃度が有意に減少したが、Ｌ－アラビノース濃度の増加によるノルバリン濃度の変動には明確な傾向が見られないようであった。

Ｂ）ノルロイシン

大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＣ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＣ株および大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＩＨ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨ株では、Ｌ－アラビノースの濃度を上げて培地に添加すると、ノルロイシン濃度が減少した。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＢＮ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＢＮ株では、その逆の挙動が見られた。大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｔｈｒＡ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｔｈｒＡ株、大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＡ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＡ株および大腸菌ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＧＭ株では、ノルロイシン濃度が有意に減少したが、Ｌ－アラビノース濃度はノルロイシン濃度に明確な影響を与えていないようである。

Ｃ）β－メチルノルロイシン

ほとんど全ての試験菌株とＬ－アラビノース濃度において、細胞内可溶性タンパク質画分中のβ－メチルノルロイシン濃度がわずかに減少したことが報告されている。しかし、この減少は、ノルバリンやノルロイシンと比較すると、それほど大きなものではなく、ただし、０．０５％のＬ－アラビノースで誘導した大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＢＮ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＢＮ株では、減少は約４２％に達した。さらに、Ｌ－アラビノース濃度の増加によるβ－メチルノルロイシン濃度の変動には、明確な傾向は見られなかった。

ｎｃＢＣＡＡ生成を誘発する条件における１５Ｌのリアクターを用いた、可能性のあるｉｌｖＧＭ調整可能およびｉｌｖＩＨ調整可能な大腸菌株のスクリーニング
大規模リアクターでの発酵中、非効率な混合により基質、溶存酸素、ｐＨなどのパラメータの勾配ゾーンが形成され、大腸菌細胞は、代謝を調節することによって、これらの環境変化に応答する（Ｓｃｈｗｅｄｅｒ（１９９９）、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｐｒｏｃｅｓｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６５（２）、１５１～１５９）。例えば、大腸菌はグルコース過剰と酸素制限に応答して、酸化的呼吸から混酸発酵へと代謝を変化させ、オーバーフロー代謝を行う（Ｅｎｆｏｒｓら、（２００１）、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｍｉｘｉｎｇ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８５（２）、１７５～１８５）。このような条件下では、混酸発酵産物だけでなく、ピルビン酸も蓄積される（Ｓｏｉｎｉ， Ｊ．ら、（２００８）、Ｎｏｒｖａｌｉｎｅ ｉｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ａ ｄｏｗｎ－ｓｈｉｆｔ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０．Ｍｉｃｒｏｂ． Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．７：１～１４）。細胞内に存在するピルビン酸が過剰になると、ｌｅｕオペロンにコードされた酵素の働きにより、ピルビン酸からα－ケトカプロン酸、α－ケト酪酸、α－ケト吉草酸へと順次ケト酸鎖が伸長し、ｎｃＢＣＡＡの生合成にかかる代謝フラックスが増加する（Ａｐｏｓｔｏｌ，Ｉ．ら、（１９９７）、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｖａｌｉｎｅ ａｔ ｌｅｕｃｉｎｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７２（４６）、２８９８０～２８９８８）。この仮説は、Ｓｏｉｎｉら（２０１１、Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｄｅｒｉｖｉｎｇ ｆｒｏｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ｄｕｒｉｎｇ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｔｗｏ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｓｃａｌｅ－ｄｏｗｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２（０５）、３３６）が報告した観察結果からも支持されている：２区画のＳＴＲ－ＰＦＲスケールダウンバイオリアクターにおいて、酸素制限と一定のグルコース供給を組み合わせることで、組換え大腸菌培養のピルビン酸蓄積によるノルバリン生合成の促進に大きな影響を与えたことが報告されている。さらに、Ｓｏｉｎｉら（２００８）は、グルコース過剰の状態で、撹拌機のダウンシフトにより酸素制限をかけた標準的なＳＴＲフェドバッチ大腸菌培養において、ｎｃＢＣＡＡであるノルロイシン、ノルバリン、ならびに、アラニン、バリンなどのピルビン酸ベースのアミノ酸が蓄積することを報告している。

大規模な工業規模のバイオリアクターで発生する混合不足による濃度勾配は、実験室の小型バイオリアクターでもシミュレートすることができる。本研究では、ピルビン酸パルスと酸素制限を組み合わせることで、１５Ｌのリアクターでスケールアップ効果を再現している。この新しい培養戦略は、大規模なバイオリアクターで行われる細菌培養の生理的挙動をより正確に表すことができる可能性がある。

対照の非遺伝子組換え大腸菌株と比較して、組換えミニプロインスリンへのｎｃＢＣＡＡの誤取り込みが最も顕著に減少したことが報告されているので、ミニバイオリアクタースクリーニング（実施例８）では、０．８％のＬ－アラビノースで誘導した大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＧＭ株（ｉｌｖＧＭ調整可能大腸菌）および大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ΔｉｌｖＩＨ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋ ｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＩＨ株（ｉｌｖＩＨ調整可能大腸菌）は、１０ｍＬのミニバイオリアクターにおいて、スクリーニングしたすべての変異体の中で最も優れた性能を示した。本実験の目的は、１５Ｌのリアクターを用いて、前述の調整可能な大腸菌株の性能を、ｎｃＢＣＡＡ生成を誘発する培養条件、すなわちピルビン酸パルスと酸素制限、で検証し、生産物の品質を保証する菌株としての優位性を確認することである。また、比較のために、対照となる非遺伝子組換え大腸菌宿主（大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋）も培養した。

大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋（対照株）の標準的な条件下における培養
大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋を含むクライオストック１００μＬを、５ｇ／Ｌグルコースと１００μｇ／ｍＬアンピシリンとを含むミネラル塩添加培地５００ｍＬに接種して、前培養を作製した。ミネラル塩培地の組成は以下の通りである：２ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＳＯ_４、２．４６８ｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．５ｇ／Ｌ ＮＨ_４Ｃｌ、１４．６ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、３．６ｇ／Ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４．２Ｈ_２Ｏおよび１ｇ／Ｌ （ＮＨ４）_２－Ｈ－クエン酸塩。次いでこのミネラル塩培地に、２ｍＬ／Ｌ ＭｇＳＯ_４溶液（１．０Ｍ）と２ｍＬ／Ｌの微量元素溶液を添加した。微量元素溶液は、ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ ０．１８ｇ、ＭｎＳＯ_４×Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ、ＦｅＣｌ_３×６Ｈ_２Ｏ １６．７ｇ、ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏ ０．１６ｇ、ＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ ０．１８ｇを含んでいた（１Ｌあたり）。前培養は、初期のコールドスタート法を用いて、オービタルシェーカーで３７℃、２２０ｒｐｍで１２時間インキュベートした。前培養終了時のＯＤ_{６００ｎｍ}を測定し、初期のＯＤ_{６００ｎｍ}が０．４となるように、所与の容量を７Ｌの開始量のリアクターに接種した。リアクターの培地は、５ｇ／Ｌグルコース、２ｍＬ消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ ２０１４、Ｓｉｇｍａ）および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むミネラル塩添加培地からなっていた。培養は３７℃で行い、２５％ＮＨ_４ＯＨによる自動制御でｐＨを７に維持した。気流は７ｖｖｍ、ＤＯの設定値は２０％に設定し、カスケード制御で撹拌速度を変更して最後の状態を維持した（撹拌の初期速度は８００ｒｐｍに設定した）。バッチ段階は、１５℃で１３時間のコールド段階を挟んで、４時間効果的に継続した。バッチ段階の終わりに、以下の式：

式中、Ｆ（ｔ）は経時的な供給流量（Ｌｈ^－１）、ｑ_ｓは特異的な基質取り込み速度の設定値（０．５１４ｇＳｇＸ^－１ｈ^－１）、Ｓは供給溶液中のグルコース濃度（４４２ｇ／Ｌ）、Ｘは経時的なバイオマス濃度（ｇ／Ｌ）、Ｖは経時的なリアクターの体積（Ｌ）、μ_ｓｅｔは特異的な細胞増殖速度の設定値（０．３ｈ^－１）、およびｔはフェドバッチ段階中の時間を表す、にしたがって指数関数的な供給が開始された。供給溶液は、４ｍＬ／Ｌ 微量元素溶液，２ｍＬ／Ｌ ＭｇＳＯ_４溶液（１．０Ｍ）、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、４４２ｇ／Ｌ グルコースを添加したＴＵＢミネラル塩培地からなっていた。

指数関数的フェドバッチ段階を３時間行い、その後、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭになるように自動添加して、組換えミニプロインスリンの発現を誘導した。誘導時間は３０分であった。誘導段階では、リアクターに供給しなかった。誘導後、一定の流量が指数関数的供給段階で達成された最後の流量と等しくなるように、一定の供給段階を開始した。一定の供給フェドバッチ段階は５～６時間有効であった。

大腸菌Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３ ｐＳＷ３＿ｌａｃＩ^＋（対照株）のｎｃＢＣＡＡ生成を誘発する条件下における培養
培養は、前節の標準的な培養方法と同様に行った。しかし、指数関数的なフェドバッチ段階の後、１ｇ／Ｌ ピルビン酸パルスをリアクターに自動的に加えた。ピルビン酸溶液を、５分間、常にポンプで送った。その間、供給は追加されず、空気流量は一時的に０に設定され、ＤＯカスケード制御は切断された。最初のピルビン酸パルスの後、最終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを自動添加し、組換えミニプロインスリンの発現を誘導した。誘導時間は３０分であった。誘導段階では、リアクターには供給せず、空気流量とＤＯカスケード制御を再確立した。誘導後、上記のように３０分ごとに１ｇ／Ｌ ピルビン酸パルスを連続して行い、合計４回のパルスを行った。パルスとパルスの間には、一定の流量が指数関数的供給段階で達成された最後の流量と等しくなるように、一定の供給段階を始動し、空気流量とＤＯカスケード制御を再確立した。一定の供給フェドバッチ段階は５～６時間有効であった。

ｎｃＢＣＡＡ生成を誘発する条件下におけるｉｌｖＧＭ調整可能な大腸菌の培養
培養操作は前節と同様であるが、ｉｌｖＧＭ調整可能な大腸菌に適合させるために、若干の変更を行った。前培養培地とリアクター培地に、２５μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを追加した。リアクター培地には、プラスミドｐＡＣＧ＿ａｒａＢＡＤ＿ｉｌｖＧＭに組み込まれた遺伝子ｉｌｖＧＭの発現を誘導するために必要な０．８％ Ｌ－アラビノースが追加で含まれていた。また、供給溶液には２５μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールと０．８％ Ｌ－アラビノースを追加で添加した。

ｎｃＢＣＡＡ生成を誘発する条件下におけるｉｌｖＩＨ調整可能な大腸菌の培養
培養操作は、前節と同様に行った。

ｎｃＢＣＡＡの分析
実施例９の各試験菌株の培養時間経過に伴う細胞内可溶性タンパク質画分および封入体画分に存在するｎｃＢＣＡＡの濃度をそれぞれ図１１および図１２に示す。

ピルビン酸パルスと酸素制限を組み合わせた対照の大腸菌株（ＷＴ大腸菌、ＰＹＲ－Ｏ２）を培養したところ、誘導後、時間経過とともに、細胞内の可溶性タンパク質画分にノルロイシンとβ－メチルノルロイシンが徐々に蓄積され、ノルロイシンの蓄積が顕著であった。さらに、ノルバリン濃度も前述の培養条件で徐々に上昇したが、誘導後３時間までであった。その時点からノルバリン濃度は徐々に低下し、誘導後５時間で初期値に達した。これは、最後のピルビン酸パルスとＯ_２制限との組み合わせから２時間後には、ノルバリン蓄積を誘発する関連効果がもはや有効ではないことを示唆している可能性がある（図１１）。予想通り、前述の菌株は、標準的な条件で培養した対照の大腸菌株（「ＷＴ大腸菌、ＳＴＤ」）よりも、ノルバリンおよびノルロイシンのレベルが高かった。β－メチルノルロイシンについては、このような濃度差は見られなかった。

試験した培養中の有望な変異株「ｉｌｖＧＭ調整可能な大腸菌、ＰＹＲ－Ｏ２」および「ｉｌｖＩＨ調整可能な大腸菌、ＰＹＲ－Ｏ２」の両者では、細胞内可溶性タンパク質画分中のノルバリンおよびノルロイシンの濃度が劇的に減少し、「ｉｌｖＧＭ調整可能な大腸菌、ＰＹＲ－Ｏ２」では、ノルロイシンがこのように大幅に減少した。しかし、β－メチルノルロイシン濃度は対照培養と比較して有意に変化しなかった。注目すべきは、ほとんどの試料において、ノルバリンの濃度がＧＣ－ＦＩＤ装置の検出限界以下であったため、ノルバリンを適切に検出できなかったことである（図１１）。

ピルビン酸パルスと酸素制限を組み合わせた対照の大腸菌株（ＷＴ大腸菌、ＰＹＲ－Ｏ２）を培養したところ、誘導後、時間経過とともに、封入体画分にノルバリンとノルロイシンが徐々に蓄積された。予想通り、前述の菌株は、標準的な条件で培養した対照の大腸菌株（「ＷＴ大腸菌、ＳＴＤ」）よりも、ノルバリンおよびノルロイシンのレベルが高かった。やはり、細胞内可溶性画分での報告と同様に、試験した培養中の有望な変異株「ｉｌｖＧＭ調整可能な大腸菌、ＰＹＲ－Ｏ２」および「ｉｌｖＩＨ調整可能な大腸菌、ＰＹＲ－Ｏ２」の両者では、封入体画分中のノルバリンおよびノルロイシンの濃度が劇的に減少し、「ｉｌｖＧＭ調整可能な大腸菌、ＰＹＲ－Ｏ２」では、ノルロイシンがさらに減少した。試験したいずれの変異体においてもノルバリンは検出されなかった。また、β－メチルノルロイシンは試験したどのサンプルからも検出されなかった（図１２）。

Claims (18)

1. 微生物宿主細胞において目的の組換えポリペプチドを産生する方法であって、
   （ａ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節されるように改変された微生物宿主細胞に導入する工程、および
   （ｂ）前記微生物宿主細胞において、目的の前記ポリペプチドを発現させる工程
   を含む前記方法。
2. 産生された目的のポリペプチドは、改変されていない微生物宿主細胞における発現によって産生されたポリペプチドと比較して、非正準分枝鎖アミノ酸の低い誤取り込みを示す、請求項１に記載の方法。
3. 方法は、細胞からのポリペプチドの単離、およびポリペプチドの精製をさらに含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
4. 精製は、非正準分枝鎖アミノ酸を含まないポリペプチドの濃縮を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記酵素活性は、前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記微生物宿主細胞に導入して発現させることによって上昇する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記微生物宿主細胞は、前記酵素活性を有する内因性ポリペプチドを発現していない、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 目的のポリペプチドは治療用のペプチドまたはポリペプチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターに動作可能に連結されている、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記微生物宿主細胞は大腸菌細胞である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 微生物宿主細胞で発現させた目的の組換えポリペプチドへの、少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減する方法であって、
    （ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を微生物宿主細胞において調節すること、
    （ｂ）前記微生物宿主細胞に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すること、および
    （ｃ）前記微生物宿主細胞において目的の前記ポリペプチドを発現させること
    を含む前記方法。
11. 少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸は、ノルバリン、ノルロイシンおよびβ－メチルノルロイシンから選択される、請求項１０に記載の方法。
12. ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を有するポリペプチドの使用、または微生物宿主細胞で産生される目的の組換えポリペプチドへの少なくとも１つの非正準分枝鎖アミノ酸の誤取り込みを低減するための前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
13. 目的の組換えポリペプチドを産生するための微生物宿主細胞の使用であって、微生物宿主細胞は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性が、改変されていない微生物宿主細胞における酵素活性と比較して、前記微生物宿主細胞において調節されるように改変された、微生物宿主細胞の使用。
14. 酵素活性は調節されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法、または請求項１２もしくは１３に記載の使用。
15. 目的のポリペプチドはプロインスリンである、請求項１～１１または１４のいずれか１項に記載の方法、または請求項１２、１３もしくは１４に記載の使用。
16. 微生物宿主細胞であって、
    （ａ）目的のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド、および
    （ｂ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））活性（ＥＣ１．１．１．８６）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．２．１．６）、アスパラギン酸キナーゼ活性（ＥＣ２．７．２．４）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．３）、およびＬ－スレオニンデヒドラターゼ活性（ＥＣ４．３．１．１９）からなる群から選択される酵素活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド
    を含む前記微生物宿主細胞。
17. バイオリアクターであって、請求項１６に記載の微生物宿主細胞を含む前記バイオリアクター。
18. バイオリアクターは少なくとも１０Ｌの体積を有する、請求項１７に記載のバイオリアクター。

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