JP2022513618A - 血液脳関門の標的化に有用な組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

対象のＣＮＳにエフェクター実体を送達するための組成物および方法が提供される。ＢＢＢ上のＧＰＩアンカータンパク質に結合する操作ＡＡＶカプシド、ならびに遺伝子療法およびエフェクター実体の送達を含む、それらの使用のための方法が提供される。また、ＡＡＶによってＣＮＳの感染性を低減するための方法も提供される。【選択図】なし

Description

遺伝子療法は、いくつかの希少な単一遺伝子疾患の治療に関して、成功裏に臨床へと進展している。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の天然分離株に基づくベクタープラットフォームは、この成功には不可欠であった。ＡＡＶ９と呼ばれるヒト心筋由来のＡＡＶの天然バリアント（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８，６３８１－６３８８，２００４、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２１，２４２７－２４３５，２０１１）は、静脈内送達後に、優れた分布を示す（Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６，１０７３－１０８０，２００８、Ｄｕｑｕｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７，１１８７－１１９６，２００９、Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９，１９７１－１９８０，２０１１）。ＡＡＶ９に基づくベクターもまた、脊髄性筋萎縮症を有する患者の運動ニューロンを標的とするために使用されおり、運動機能の改善および生存期間の延長をもたらした（Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎ
Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，１７１３－１７２２，２０１７）。希少な遺伝性筋症を有する子供の治療では、マカクから単離されたＡＡＶ８血清型のベクターを静脈内に送達することで、同様に、印象的な結果が得られている（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９，１１８５４－１１８５９，２００２）（ＮＣＴ０３１９９４６９）。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９などのバリアントの単離によるＡＡＶベクターの改善にもかかわらず、標的組織の細胞への送達が限られていることから、ほとんどの候補疾患では、インビボ遺伝子療法の成功が及んでいない。
血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る遺伝子療法ベクターの効率的な送達は、神経疾患の療法に不可欠である。しかし、適切な送達レベルが、まだ達成されていない。ＡＡＶベクターの性能を改善するために、効率を向上させたカプシドバリアントを操作することを含めて、様々なアプローチが追求されてきた。１つの操作戦略は、集団変異誘発を通してカプシド構造の多様性を生成し、次いで細胞または動物の集団をスクリーニングすることによって、好ましい候補を選択することである。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂと呼ばれる最も広く知られている操作ＡＡＶバリアントは、優れた向神経特性を有することが示された（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，２０４－２０９，２０１６）。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂは、７つのアミノ酸ドメインの集団をＡＡＶ９の超可変領域ＶＩＩＩに挿入することによって、バリアントのライブラリの生成することで同定された。ＣＮＳを標的とするバリアントは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景の星状細胞特異的ＣＲＥリコンビナーゼマウスに静脈内注射することで同定された。この選択から、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂが見出され、カプシドは、ＴＬＡＶＰＦＫドメインを含有し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの静脈内送達後、ＣＮＳ形質導入で５０倍の改善を示す（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，２０４－２０９，２０１６）。この導入レベルは、ヒトの神経障害に対するＡＡＶ遺伝子療法の有用性を広げる可能性を有する。
様々なＣＮＳ状態に対してより効果的な治療を提供するために、ＢＢＢを横切る遺伝子療法のベクターおよび治療薬の送達を改善する必要性が依然として存在している。
本明細書に記載の実施形態は、それを必要とする対象のＣＮＳへの遺伝子療法ベクターおよびエフェクター実体の送達を改善するための組成物および方法に関する。ＣＮＳのＡＡＶ感染性を改変するための方法も提供される。
一態様では、カプシドを有する組換えＡＡＶを含む組成物が本明細書に提供され、カプシドは、ＧＰＩアンカー血液脳関門（ＢＢＢ）リガンドの結合パートナーを含み、エフェ
クター実体（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｔｉｔｙ）にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、リガンドは、Ｌｙ６Ｅである。別の態様では、リガンドは、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される。
一態様では、ＡＡＶカプシドは、空のカプシドである。別の実施形態では、カプシドは、異種遺伝子をコードするＡＡＶベクターゲノムを含む。
さらに別の態様では、エフェクター実体は、ペプチド、核酸、ｓｉＲＮＡ、抗体、抗体断片、小分子、脂質ナノ粒子、または細胞傷害性剤である。一態様では、ＡＡＶカプシドおよびエフェクター実体は、リンカーを介してコンジュゲートされる。
別の実施形態では、神経疾患または神経障害の治療を必要とする対象において、神経疾患または神経障害を治療するための方法が本明細書に提供され、対象のＢＢＢを、エフェクター実体にコンジュゲートされるＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドの結合パートナーを含むカプシドを有するＡＡＶと接触させることを含み、カプシドがＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドに結合して、ＢＢＢを横切るエフェクター実体の輸送を媒介する。一実施形態では、リガンドは、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される。別の態様では、神経疾患または神経障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、リソソーム蓄積症、および外傷性脳損傷からなる群から選択される。特定の実施形態では、エフェクター実体は、ペプチド、核酸、ｓｉＲＮＡ、抗体、抗体断片、小分子、または細胞傷害性剤である。さらに別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、リンカーを介してエフェクター実体にコンジュゲートされる。
さらに別の実施形態では、併用療法が、本明細書に提供され、併用療法は、ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドの結合パートナーとＡＡＶカプシドを有する遺伝子療法ベクターの中枢神経系への取り込みを低減または阻害し、ＢＢＢリガンドに結合する抗体または抗体断片を遺伝子療法ベクターと同時投与することを含む。一態様では、抗体は、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択されるリガンドに結合する。
別の態様では、ＣＮＳを標的とするようにＡＡＶカプシドを操作する方法が、本明細書に提供され、ａ）ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドに特異的に結合するペプチド断片をコードするアミノ酸配列を同定することと、ｂ）ＡＡＶ ＨＶＲＶＩＩＩ部位を修飾して、アミノ酸配列を発現させることとを含み、操作されたカプシドは、ＧＰＩアンカーＢＢＢリ
ガンドに結合する。特定の実施形態では、リガンドは、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される。別の実施形態では、修飾されたＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶ９である。
さらに別の態様では、ＣＮＳを標的とするようにＡＡＶカプシドを操作する方法によって得られる操作ＡＡＶカプシドが、本明細書に提供され、ａ）ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドに特異的に結合するペプチド断片をコードするアミノ酸配列を同定することと、ｂ）ＡＡＶ ＨＶＲＶＩＩＩ部位を修飾して、当該アミノ酸配列を発現させることと、を含み、ここで、操作されたカプシドは、ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドに結合する。
一実施形態では、ＣＮＳ標的を検出可能に標識するための方法が、本明細書で提供され、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカーリガンドに結合し、検出可能なエフェクター実体にコンジュゲートされたＡＡＶカプシドを投与することを含み、ＡＡＶカプシドは、ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドに結合すると、それにコンジュゲートされた検出可能なエフェクター実体を、ＢＢＢを透過して輸送する。一態様では、リガンドは、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される。さらに別の態様では、検出可能なエフェクター実体は、ペプチド、核酸、ｓｉＲＮＡ、抗体、抗体断片、小分子、脂質ナノ粒子、または細胞傷害性剤を含む。
これらの組成物および方法の他の態様および利点を、以下の詳細な説明においてさらに説明される。
マウスにおいてＢＢＢを横切るためのＰＨＰ．Ｂの能力が、系統特異的であり、共優性形質として遺伝することを示す。（図１Ａ）１×１０１２ｇｃのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＥＧＦＰをＩＶで注入した近交系統および交雑系統の脳内の代表的な直接ＧＦＰ蛍光。中間（５５．５％）、最小（２７．８％）および強い（１６．７％）脳内形質導入を示すＦ２マウスの割合は、メンデル遺伝を示唆している。合計１８匹のＦ２マウスに注入した。スケールバー１００μｍ。（図１Ｂ）脳内のＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって測定されたベクターゲノムコピー（群当たりの平均およびエラーバー（標準偏差）による）。分散分析、クラスカル・ウォリス検定、続いて、ダンの多重比較検定：＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。 １５番染色体に位置するＬｙ６ａ遺伝子が、高い脳内形質導入表現型と関連していることを示す。（図２Ａ）ＷＥＳ関連試験設計の概要。Ｆ１は、近交系統のＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪを交配することによって生成され、全て中間の脳内形質導入の表現型を有するヘテロ接合体である。Ｆ２は、Ｆ１を一緒に交差させることによって生成され、様々な表現型および遺伝子型を産生する。ＷＥＳライブラリを、１６匹のマウス（４匹のＦ１と１２匹のＦ２）から単離したゲノムＤＮＡから生成し、参照ゲノム（ＧＲＣｍ３８、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にマッピングした。（図２Ｂ）マウスにおけるＢＢＢ全体にわたるＰＨＰ．Ｂ形質導入と有意に関連する（赤線、ｐ≦５Ｅ－８）遺伝的バリアントを示すマンハッタンプロット。最も強い関連は、Ｌｙ６ａ遺伝子の２つの標識されたミスセンス変異を含むＤ３核型バンド（緑色）内で観察される。上位候補Ｌｙ６ａ（Ｓｃａ－１）存在が、インビボでＢＢＢを横切るＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの脳内形質導入に必要であることの遺伝的確認。（図２Ｃ）１×１０１２ｇｃのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＥＧＦＰのＩＶ投与後の、近交ＷＴおよびＬｙ６ａ－ヌルマウスの脳（海馬）ならびに肝臓における代表的な直接ＧＦＰ蛍光。（図２Ｄ）両方のハプロタイプ（クローンＤ７）を認識するラットモノクローナル抗体を使用した、ＫＯおよびＷＴマウスの脳皮質におけるＬＹ６Ａ免疫染色。ＬＹ６Ａの発現は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪのＷＴマウスの脳毛細血管では強く、ＢＡＬＢ／ｃＪのＷＴマウスの脳毛細血管では弱く、全てのＫＯマウスの脳では検出されない。スケールバー：（図２Ｃ）１００μｍ、（図２Ｄ）５０μｍ。 Ｌｙ６ａハプロタイプが、マウスにおけるＢＢＢを横切るＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの能力を決定することを示す。（図３Ａ）近交系マウスの選択からのＬｙ６ａハプロタイプ（マウスゲノムプロジェクト、ＭＭ１０ ｄｂＳＮＰ１４２に従うデータ）。（図３Ｂ）参照Ｌｙ６ａ遺伝子（Ｌｙ６ｂハプロタイプ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ様）を有する近交系マウス、およびＢＡＬＢ／ｃＪ様ＳＮＰ（Ｌｙ６ａハプロタイプ）を有する系統における全身投与後のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ脳内形質導入。スケールバー１００μｍ。 ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢがＬＹ６Ａタンパク質に結合することを示す。（図４Ａ）ＬＹ６Ａタンパク質への、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰｅＢ、ＡＡＶ９、または不活性ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ Ｖ５９２Ｇ変異体の結合のＥＬＩＳＡ測定。ＡＡＶ－ＰＨＰｅＢおよびＰＨＰ．ＢはいずれもＬＹ６Ａに結合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバリアントについてより高い最大シグナルを有する。ＡＡＶ９およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ Ｖ５９２Ｇは、ＬＹ６Ａに結合しない。曲線は、３反復の平均値を示す（エラーバーは、平均値の標準誤差）。（図４Ｂ）Ｌｙ６ａトランスフェクト細胞におけるＡＡＶ．ＬａｃＺ形質導入アッセイ。ＨＥＫ２９３細胞におけるＬｙ６ａハプロタイプの両方の一過性発現は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを増強するが、ＡＡＶ９形質導入は増強せず、一方、別のｌｙ６ファミリーメンバーであるｌｙ６ｃ１は効果を有さない。同じトランスフェクション条件内のＡＡＶ９およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ媒介形質導入効率を、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して比較し、続いて、テューキーの多重比較検定を使用して平均比較検定を行う（ＧｒａｐｈＰＡＤ Ｐｒｉｓｍ）。（図４Ｃ）抗ＬＹ６Ａ抗体の存在下でのＡＡＶ．ＬａｃＺ形質導入アッセイ。強化された形質導入（ＭＯＩ１０，０００）は、ラットモノクローナル抗ＬＹ６Ａ抗体（クローンＤ７、１００ｎＭ、＋４℃で１時間）とプレインキュベートすることによって防止される。異なる抗体の存在下での導入効率は、同じトランスフェクション条件内で、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して比較し、続いて、テューキーの多重比較検定（ＧｒａｐｈＰＡＤ Ｐｒｉｓｍ）を使用した平均比較検定を行う。６反復（図４Ｂ）または８反復（図４Ｃ）の平均を示す棒グラフ（エラーバーは標準偏差）。 ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂは、ＢＢＢを通過することはできないが、脳室内投与後、脳を形質導入することができることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪマウスへの静脈内（ＩＶ、１ｘ１０１２ｇｃ）（図５Ａ）または脳室内（ＩＣＶ、１ｘ１０１１ｇｃ）（図５Ｂ）投与後の脳内の直接ＧＦＰ蛍光。スケールバー：（図５Ａ）１ｍｍ、（図５Ｂ）１００μｍ。 ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの操作ドメインにおける変異で、ＢＢＢを通過するその能力が抑制されることが示される。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１ｘ１０１２ｇｃのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－Ｖ５９２ＧをＩＶ投与した後の、肝臓および脳における直接ＧＦＰ蛍光。スケールバー１００μｍ。 ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ媒介脳内形質導入が株依存性であることを示す。Ｃ５７ＢＬ６／ＪおよびＢＡＬＢｃ／Ｊマウスへの１ｘ１０１２ｇｃのＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＥＧＦＰの静脈内（ＩＶ）投与後の、脳内の直接ＧＦＰ蛍光。ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢは、ＢＡＬＢ／ｃＪのＢＢＢを通過しない。スケールバー１００μｍ。 ＰＨＰ．Ｂ変異体がＬｙ６ａ受容体に対して様々な親和性を有することを示す。５８８－ＴＬＡＶＰＦＫペプチド挿入の中にあるＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂカプシドのバリン５９２を、飽和変異誘発に供した。各ベクターバリアントを精製し、ＳＰＲを使用してＬｙ６ａへの結合親和性について個別に試験した。左から右へ：ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂの高親和性バリアント、天然親和性バリアント、および低親和性バリアントのためのＢｉａｃｏｒｅセンサグラム。 細胞形質導入に対するＬｙ６ａ結合親和性の影響を示す。Ｌｙ６ａを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞におけるβ－ガラクトシダーゼの発現によって、各親和性バリアントの形質導入効率を定量した。低親和性バリアントは、低ＭＯＩでの高親和性バリアントと比較して、導入効率の適度な増加（２倍）を示す。Ｌｙ６ａ受容体への任意のレベルの結合は、ＡＡＶ９と比較して、形質導入効率を１０倍超向上させるのに十分である。 生体分布に対するＬｙ６ａ結合親和性の影響を示す。（図１０Ａ）Ｌｙ６ａ受容体に対する親和性を有するベクターは、脳組織と同等のレベルの局在化を示す。ｅＧＦＰの肝臓発現により生体分布を追跡すると、Ｌｙ６ａに対する親和性が低いバリアントは、肝臓組織への局在化および肝臓組織での発現の増加を示す。（図１０Ｂ）脳組織学的には、高親和性ベクターおよび低親和性ベクターは、脳組織において同様の生体分布を有するが、Ｌｙ６ａに対する低～中程度の親和性を有するベクターでは、発現が改善されたことを示す。 ＰＨＰ．Ｂペプチド提示の結合価および細胞形質導入に対する効果を示す。キメラカプシドは、ベクター産生中に使用されるＡＡＶ９カプシド遺伝子またはＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂカプシド遺伝子のいずれかをコードするプラスミドの割合を変更することによって産生された。各キメラバリアントの形質導入効率は、Ｌｙ６ａを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞でのβ－ガラクトシダーゼの発現によって定量した。 可溶性Ｌｙ６ａとＰＨＰ．Ｂとの間の結合に必要なＬｙ６ａドメインの多価提示を示す。 脳内皮上の高密度発現を明らかにした、標的分子ＳＥＭＡ７Ａについての非ヒト霊長類からの脳切片の染色を示す。
本明細書に記載されるように、本発明者らは、ＡＡＶベクターのＣＮＳへの効率的な輸送を媒介するＢＢＢ上のリガンドを同定した。リガンド、ＬＹ６Ａ（Ｓｃａ－１）は以前から知られていたが、このＧＰＩアンカータンパク質の機能的役割は、造血の生物学に限定されていると考えられた。したがって、本発明者らは、初めて、ＧＰＩアンカータンパク質がＢＢＢを横切るウイルスベクターの送達を促進する上で重要な役割を果たし得ることを示した。したがって、遺伝子療法ベクターおよび／または治療剤をＣＮＳに送達するために、ＢＢＢのＧＰＩアンカーリガンドを標的とするための新規の組成物および方法を本明細書に開示する。
本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、生物学、生物工学、および分子生物学の分野の当業者により一般的に理解されているもの、ならびに本出願で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供している公開文書への参照により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書における定義は、明確性のために提供されているに過ぎず、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物を指し、ヒト、獣医学用動物または農業用動物、家庭用動物または愛玩動物、ならびに通常臨床研究に使用される動物が含まれる。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、ヒトである。さらに他の好適な対象としては、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類、および他が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、「患者」と互換的に使用される。
「血液脳関門（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）」または「ＢＢＢ」は、末梢循環と脳および脊髄との間の生理学的な関門を指し、これは、脳の毛細血管内皮の形質膜内の密着結合によって形成され、尿素（６０ダルトン）などの非常に小さい分子でさえ、分子の脳への輸送を制限する密接な関門を作製する。脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液脊髄関門、および網膜内の血液網膜関門は、ＣＮＳ内の連続した毛細血管関門であり、本明細書では、まとめて血液脳関門またはＢＢＢと称される。ＢＢＢはまた、関門が毛細血管内皮細胞ではなく上衣細胞で構成される血液－ＣＳＦ関門（脈絡叢）も包含する。
「中枢神経系」または「ＣＮＳ」は、脳および脊髄を含む身体機能を制御する神経組織の複合体を指す。
本明細書で使用される場合、「全身送達（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」とは、例えば、かかる組成物が体循環を介してある場所から別の場所への移動の結果として、生物内の本明細書に記載の組成物の広範な生体分布をもたらす送達を指す。全身送達とは、有用な、好ましくは治療量の組成物が身体のほとんどの部分に曝露されることを意味する。本明細書で提供される組成物の全身送達は、好ましくは静脈内送達によって得られるが、他の送達経路によっても達成することができ、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋肉内、および他の非経口経路を含む。
本明細書で使用される「神経障害」は、ＣＮＳに影響を及ぼす、および／またはＣＮＳにおける病因を有する疾患または障害を指す。例示的なＣＮＳの疾患または障害としては、神経障害、アミロイドーシス、癌、眼疾患または障害、ウイルス感染または微生物感染、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、およびリソソーム蓄積症が挙げられるが、これらに限定されない。神経障害の具体的な例としては、限定されないが、神経変性疾患（レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症を含む）、線条体黒質変性症、タウオパシー（アルツハイマー病および核上性麻痺を含むが、これらに限定されない）、プリオン病（ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ症候群、クールー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病、および致死性家族性不眠症を含むが、これらに限定されない）、球麻痺、運動ニューロン疾患、および神経系ヘテロ変性障害（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス縮れ毛症候群、コカイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト・ルントボルグ症候群を含むが、これらに限定されない）、認知症（ピック病および脊髄小脳失調症を含むが、これらに限定されない）、硬膜外神経膠腫、ならびにＣＮＳに影響を与える癌（神経膠腫、多形性神経膠芽腫、髄膜腫、星状細胞腫、聴神経腫、軟骨腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、神経鞘腫、神経線維腫、神経芽腫、および硬膜外、髄内または硬膜内の腫瘍を含むが、これらに限定されない）が挙げられる。
ＣＮＳのウイルス感染または微生物感染としては、ウイルス（すなわち、インフルエンザ、ＨＩＶ、ポリオウイルス、風疹）、細菌（すなわち、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ならびに他の微生物（真菌（すなわち、酵母、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、寄生虫（すなわち、ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、またはＣＮＳの病態生理（急性もしくは慢性であり得る膜炎、脳炎、脊髄炎、血管炎、および膿瘍を含むが、これらに限定されない）をもたらすアメーバなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「イメージング剤」は、その存在および／または位置が直接的または間接的に検出されることを可能にする１つ以上の特性を有する化合物である。そのようなイメージング剤の例としては、検出を可能にする標識された実体を組み込むタンパク質および小分子化合物が挙げられる。「検出可能な標識」は、検出またはイメージングに使用されるマーカーである。かかる標識の例としては、放射性標識、フルオロフォア、発色団、または親和性タグが挙げられる。一実施形態では、標識は、医療画像診断に使用される放射性標識、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像診断（磁気共鳴画像診断、ＭＲＩとしても知られる）のためのテクネチウム９９ｍもしくはヨウ素－１２３またはスピン標識（例えば、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、鉄など）である。
本明細書で使用される用語「細胞傷害性剤」は、細胞機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ、Ｉ－１３１、Ｉ－１２５、Ｙ－９０、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｂｉ－２１２、Ｐ－３２、Ｐｂ－２１２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法の薬剤または薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）、増殖阻害剤、酵素およびその断片（核酸分解酵素など）、抗生物質、毒素（小分子毒素、または細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素など、その断片および／またはバリアントを含む）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療」という用語、および「治療する」または「治療すること」などのその変形形態は、治療される個体の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理学的経過の間に行われ得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防または低減、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、疾患の進行速度の低減、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクターは、疾患の発症を遅らせるために、または疾患の進行を遅らせるために使用される。同様に、「がんを治療すること」は、いくつかの異なるパラメータによって説明され得、限定されないが、がんを有する動物における腫瘍のサイズの減少、がんを有する動物における腫瘍の増殖（ｇｒｏｗｔｈもしくはｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の低減、転移の程度の阻止、抑制もしくは低減、および／または対照と比較してがんを有する動物の生存を延長することを含む。
本明細書に記載される方法および組成物に関して使用される場合、「抗体」という用語は、バイオマーカータンパク質またはバイオマーカータンパク質の断片に結合することができる２つの軽鎖および２つの重鎖もしくはその断片を有する無傷の免疫グロブリンを指す。したがって、単一の単離された抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または２つ以上の抗原に結合し得る二重特異性抗体もしくは多重特異性構築物であり得る。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗体断片を指す場合もある。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能なバリアント（かかるバリアントは、概して少量で存在する）を除いて、同一である、かつ／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向性が異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向性である。それ
らの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。モノクローナル抗体は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている技法を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。本明細書におけるモノクローナル抗体の具体的な例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体（それらの抗原結合断片を含む）が挙げられる。本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種に由来する抗体または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖（複数可）の残部が別の種に由来する抗体、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、ならびにそれらが所望の生物学的活性を呈する限り、かかる抗体の断片も含む（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザルなどの旧世界ザル）およびヒト定常領域配列（米国特許第５，６９３，７８０号）に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限に含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ（典型的には、２つ）の可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、超可変領域のすべてもしくは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべては、上記のＦＲ置換（複数可）を除いて、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリンの定常領域（典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ ２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。
本明細書に記載される方法および組成物に関して使用される場合、「抗体断片」という用語は、抗原結合能力を有する無傷の抗体よりも小さい構造を指す。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、抗体断片から形成された単鎖Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、および多重特異性抗体など）を含む。「単鎖Ｆａｂ」形式は、例えば、Ｈｕｓｔ Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｍａｒ８；７：１４に記載されている。ｓｃＦＶ構築物は、単鎖（タンデムｓｃＦｖ）または二重特異性タンデムｓｃＦｖとして産生される相補ｓｃＦｖを含む。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「～と特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔｏ）」、「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、例えば、抗原に選択的にまたは優先的に結合する抗体を指す。例えば、本明細書に記載の抗体またはカプシドおよびその使用方法に関して、「特異的結合」とは、抗原の混合集団を含有する試料または環境中の他の分子を実質的に認識せず、かつ結合せずに、目的の抗原または結合パートナーの１つ以上のエピトープに結合する抗体またはカプシドの能力を指す選択的結合を指す。特異的結合の相互作用は、結合分子間または結合パートナー間の１つ、または典型的にはそれ以上の非共有結合によって媒介される。本明細書に記載の特定の態様では、結合パートナーは、標的リガンド（すなわち、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカータンパク質）に特異的に結合するカプシドタンパク質（もしくはその一部）またはカプシドタンパク質にコンジュゲートされた分子（抗体など）である。一実施形態では、標的とされるＧＰＩアンカータンパク質は、Ｌｙ６Ａファミリーのメンバーである。特定の実施形態では、ＧＰＩアンカータンパク質は、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される。
本明細書の様々な実施形態は、他の構成要素または方法ステップを包含する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を使用して提示される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、関連する実施形態は、他の構成要素または方法ステップを除外する「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語、および実施形態または発明の性質を実質的に変化させるいずれの構成要素または方法ステップを除外する「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を使用する説明が含まれることを理解されたい。
「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「リガンド（ａ ｌｉｇａｎｄ）」は、１つ以上のリガンドを表すことを理解されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用される「約」という用語は、量（ａｍｏｕｎｔ）、持続時間（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｕｒａｔｉｏｎ）などの測定可能な値を指す場合、指定された値からの最大±１０％の変動を包含することを意味し、かかる変動は、開示された方法を実施するために適切である。特に指示しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分、特性（例えば分子量、反応条件など）の量を表す全ての数字は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「化合物」、「組成物」、または「物質」という用語は、治療組成物を論じるために互換的に使用され得る。
本明細書で提供される発明の説明に関して、記載される組成物の各々は、別の実施形態では、本発明の方法で有用であることが意図される。これに加えて、本方法で有用な本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、それ自体が本発明の実施形態であることも意図される。
一態様では、エフェクター実体にコンジュゲートされたカプシドを有する組換えＡＡＶが提供される。本明細書に記載のＡＡＶカプシドは、エフェクター実体を含むコンジュゲートのＣＮＳへの送達を促進するために、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカーリガンドに特異的に結合する結合パートナーを有する。一実施形態では、ＧＰＩアンカーリガンドは、Ｌｙ６Ｅである。本明細書で提供される追加のコンジュゲートとしては、ＢＢＢ上の他のＧＰＩアンカータンパク質に特異的に結合するＡＡＶカプシドが挙げられ、限定されないが、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂが含まれる。
本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在し、利用可能な何十ものアデノ随伴ウイルス、ならびに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、その中に標的細胞に送達するための核酸配列がパッケージされる。ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニットＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３からなり、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比率で二十面体対称に配置される。上述のＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択されてもよい。例えば、米国公開特許出願第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国公開特許出願第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７および他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号および米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１、およびＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、およびＷＯ２００６／１１０６８９、ＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ１０）、ならびにＷＯ２０１８／１６０５８２（ＡＡＶｈｕ６８）も参照されたい。また、これらの文書には、他のＡＡＶも記載されており、ＡＡＶを生成するために選択され得る（参照により援用される）。特に明記しない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、および他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶＰＨＰ．Ｂとして一般に同定されているＡＡＶ、ならびに既知のもしくは言及されたＡＡＶのうちのいずれかのバリアント、または未だ発見されていないＡＡＶもしくはバリアント、あるいはそれらの混合物を含む、任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶ８カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶ９カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶｒｈ．１０カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶｈｕ．３７カプシドもしくはそのバリアント、またはＡＡＶ３Ｂもしくはそのバリアントである。
ＡＡＶＰＨＰ．Ｂバリアントカプシドのアミノ酸配列は、公的に入手可能であり（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＵ０５６４７３）、以下のとおりである。
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰ
ＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号１）
ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢバリアントカプシドは、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ａｕｇ．２０１７，２０（８）：１１７２－９）によって記載された。アミノ酸配列は、公的に入手可能であり（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＦ１８７３５７．１）、以下のとおりである。
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号２）
ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ分離株全体で最も多くの配列分散を示す９つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６ Ｄｅｃ；８０（２３）：１１５５６－７０．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｓｅｐ１３を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。例えば、ＡＡＶ９ ＶＰは、ＡＡＶ４と比較して、９つの可変表面領域（ＶＲ－Ｉ～－ＩＸ）で異なるが、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８と比較すると、３つの可変表面領域（ＶＲ－Ｉ、ＶＲ－ＩＩ、およびＶＲ－ＩＶ）でのみ異なる。例えば、ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ；８６（１２）：６９４７－５８を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＨＶＲＶＩＩＩなどのＨＶＲに１つ以上の変異を有する。特定の実施形態では、ＨＶＲＶＩＩＩ領域の変異は、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカータンパク質に特異的な結合を付与する（すなわち、結合パートナーを形成する）。したがって、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカーリガンドに特異的に結合して、その感染性を改変するか、またはそれにコンジュゲートされたエフェクター実体の送達を促
進するように操作され得る。
一実施形態では、結合パートナーを生成するために前述の方法を使用して、修飾されたＡＡＶカプシド、または他の分子（例えば、抗体）連結されたＡＡＶカプシド（すなわち、カプシドが、中間体を介してＢＢＢ上のＧＰＩアンカーリガンドに特異的に結合する）が提供される。したがって、本明細書に記載のコンジュゲートのＡＡＶカプシドは、リガンドに直接結合するか、または中間体（例えば、抗体またはオリゴヌクレオチド）にコンジュゲートされ、リガンドの結合パートナーを形成し得る。改変された受容体結合を有するＡＡＶカプシドを生成するために、および／または受容体結合パートナーを導入するために使用することができる方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、以下の参考文献に提供されている（参照により本明細書に援用される）。Ｍｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１３ Ｊａｎ；２１（１）：１０９－１８、Ｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２ Ｍａｙ；７６（９）：４５５９－６６、Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２ Ｄｅｃ；７６（２４）：１２９００－０７、およびＫａｔｒｅｋａｒ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８ Ｆｅｂ ２６；８（１）：３５８９。
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」または「コンジュゲートされた」は、例えば、１つ以上のエフェクター実体に結合されたＡＡＶカプシドを指す。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドおよびエフェクター実体は、リンカーによって結合される。本明細書で使用される「リンカー」は、本明細書に記載のコンジュゲートのＡＡＶカプシドおよびエフェクター実体を共有結合する、化学リンカーまたは単鎖ペプチドリンカーを指す。共有結合は、直接的またはリンカーを介してのいずれかであり得る。特定の実施形態では、直接的なコンジュゲーションは、カプシド上の反応性基と、（例えば、神経薬上の）対応する基またはアクセプターとの間の共有結合の形成によるものである。特定の実施形態では、直接的なコンジュゲーションは、コンジュゲートされる２つの分子のうちの１つを修飾（例えば、遺伝子修飾）することによって行われ、適切な条件下でコンジュゲートされる他の分子への共有結合を形成する反応性基（非限定的な例として、スルフヒドリル基またはカルボキシル基）を含む。１つの非限定的な例として、所望の反応性基（例えば、システイン残基）を有する分子（例えば、アミノ酸）がカプシドに導入され得、例えば、神経薬とジスルフィド結合が形成される。核酸をタンパク質と共有結合的にコンジュゲートするための方法も、当該技術分野で既知である（例えば、光架橋、例えば、Ｚａｔｓｅｐｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｒｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．７４：７７－９５（２００５））を参照されたい）。非共有結合性のコンジュゲーションは、当業者によって容易に理解され得るように、疎水性結合、イオン結合、静電相互作用などを含む任意の非共有結合手段であり得る。
様々なリンカーを使用してコンジュゲーションを行うこともできる。例えば、抗体および神経薬は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－Ｌ－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用してコンジュゲートされ得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製され得る。炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－Ｄ
ＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。ペプチド結合によって結合された１～２０個のアミノ酸からなるペプチドリンカーも使用され得る。特定のかかる実施形態では、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。特定の他のかかる実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。リンカーは、脳への送達時に、神経薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸分解性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光分解性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
コンジュゲートには、架橋試薬で調製されたコンジュゲートが含まれてもよく、限定されないが、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）安息香酸）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ＣＮＳ抗原」または「ＣＮＳ標的」は、脳を含むＣＮＳで発現される抗原および／または分子であり、抗体または小分子などのエフェクター実体で標的化され得る。かかる抗原および／または分子の例としては、限定されないが、βセクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、αシヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、γセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、およびカスパーゼ６が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、アルツハイマー病の治療に有用であり、アデュマヌカブ（Ｂｉｏｇｅｎ）、バピニューズマブ（Ｅｌａｎ、Ａβのアミノ末端を対象とするヒト化ｍＡｂ）、ソラネズマブ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、可溶性Ａβの中央部分に対するヒト化ｍＡｂ）、ガンテネルマブ（ＣｈｕｇａｉおよびＨｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ、Ａβのアミノ末端および中央部分の両方を対象とする完全ヒトｍＡｂである）、クレネズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、単量体エピトープおよび構造エピトープに作用するヒト化ｍＡｂ、Ａβのオリゴマー形態およびプロトフィブリル形態を含む）、ＢＡＮ２４０１（Ｅｓａｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、Ａβプロトフィブリルに選択的に結合するヒト化免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）ｍＡｂ、Ａβプロトフィブリルのクリアランスを促進する、および／または脳のニューロンに対するそれらの毒性効果を中和すると考えられている）、ＧＳＫ９３３７７６（Ａβのアミノ末端を対象とするヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体）、ＡＡＢ－００１，ＡＡＢ－００２，ＡＡＢ－００３（Ｆｃ操作バピニューズマブ）、ＳＡＲ２２８８１０（プロトフィブリルおよび低分子量Ａβを対象とするヒト化ｍＡｂ）、ＢＩＩＢ０３７／ＢＡＲＴ（不溶性線維ヒトＡβに対する完全ヒトＩｇＧ１、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ならびにｍ２６６などの抗Ａβ抗体（Ａβオリゴマーに対しする相対的特異性）［Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００８；３１：１７５－１９３］から選択される抗体を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、パーキンソン病の治療に有用な抗体を含み、例えば、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、ダルダリン（ＬＲＲＫ２）、シヌク
レイン、αシヌクレイン、またはＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）を対象とする抗体を含む。他の抗体としては、ＰＲＸ００２（ＰｒｏｔｈｅｎａおよびＲｏｃｈｅ）パーキンソン病ならびに関連するシヌクレイン病が含まれ得る。これらの抗体、特に、抗シヌクレイン抗体は、１つ以上のリソソーム蓄積症の治療にも有用であり得る。
さらに別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、多発性硬化症の治療に有用な抗体を含み、ナタリズマブ（ヒト化抗ａ４－イングリン、ｉＮＡＴＡ、タイサブリ、Ｂｉｏｇｅｎ ＩｄｅｃおよびＥｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、２００６年に承認）、アレムツズマブ（キャンパス－１Ｈ、ヒト化抗ＣＤ５２）、リツキシマブ（リツジン、キメラ抗ＣＤ２０）、ダクリズマブ（ゼネパックス、ヒト化抗ＣＤ２５）、オクレリズマブ（ヒト化、抗ＣＤ２０、Ｒｏｃｈｅ）、ウステキヌマブ（ＣＮＴＯ－１２７５、ヒト抗ＩＬ１２ｐ４０＋ＩＬ２３ｐ４０）、抗ＬＩＮＧＯ－１およびｃｈ５Ｄ１２（キメラ抗ＣＤ４０）、ならびにｒＨＩｇＭ２２（再ミエリン化モノクローナル抗体、ＡｃｏｒｄａおよびＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などを含む。さらに他の抗ａ４－インテグリン抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩＬ１７抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＳＥＭＡ４Ｄ抗体、および抗ＣＤ４０抗体は、本明細書に記載のコンジュゲートを介して送達され得る。
一実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ＡＬＳの治療に有用な抗体を含み、例えば、酵素スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）およびそのバリアントに対する抗体（例えば、ＡＬＳバリアントＧ９３Ａ、Ｃ４Ｆ６ ＳＯＤ１抗体）、ＭＳ７８５（ダーリン－１結合領域を対象とする）、ならびに神経突起伸長阻害剤（ＮＯＧＯ－Ａまたはレチキュロン４）に対する抗体、例えば、ＧＳＫ１２２３２４９、オザネズマブ（ヒト化、ＧＳＫ、多発性硬化症に有用とも記載されている）を含む。
ＡＡＶカプシド、コーディング配列を生成する方法、したがって、ｒＡＡＶウイルスベクターを産生する方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）、およびＵＳ２０１５／０３１５６１２を参照されたい。一実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、ＡＡＶ１またはそのバリアントである。別の実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、ＡＡＶ３Ｂまたはそのバリアントである。一実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、ＡＡＶ９またはそのバリアントである。さらに別の実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、クレードＥのＡＡＶまたはそのバリアントである。かかるＡＡＶには、ｒｈ．２、ｒｈ．１０、ｒｈ．２５、ｂｂ．１、ｂｂ．２、ｐｉ．１、ｐｉ．２、ｐｉ．３、ｒｈ．３８、ｒｈ．４０、ｒｈ．４３、ｒｈ．４９、ｒｈ．５０、ｒｈ．５１、ｒｈ．５２、ｒｈ．５３、ｒｈ．５７、ｒｈ．５８、ｒｈ．６１、ｒｈ．６４、ｈｕ．６、ｈｕ．１７、ｈｕ．３７、ｈｕ．３９、ｈｕ．４０、ｈｕ．４１、ｈｕ．４２、ｈｕ．６６、およびｈｕ．６７が含まれる。このクレードには、修飾ｒｈ．２、修飾ｒｈ．５８、および修飾ｒｈ．６４がさらに含まれる。ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶに関して「バリアント」という用語は、アミノ酸配列または核酸配列にわたって、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を共有する配列を含む、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味する。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、任意の記載または既知のＡＡＶカプシド配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書に提供され、かつ／または当該技術分野で既知のＡＡＶカプシドと、約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、または約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡ
Ｖカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドのパーセント同一性を決定する場合、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のうちのいずれかにわたって行われ得る。別の実施形態では、自己相補的ＡＡＶが使用される。
本明細書で使用される場合、「人工ＡＡＶ」は、限定されないが、非天然カプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味する。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を使用して、異種配列（異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得ることができる）と組み合わせて、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、疑似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得るが、これらに限定されない。疑似型ベクターは、本発明において有用であり、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされたベクターゲノムが、カプシドとは異なる供給源からの逆位末端反復（ＩＴＲ）を有する。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ、ならびにＡＡＶ５由来およびＡＡＶ８由来のカプシドをそれぞれ有するＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
一態様では、エフェクター実体とコンジュゲートを形成するＡＡＶカプシドは、「空の」カプシドである。そのような空のカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列をまったく含まないか、または遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含み得る。
さらに別の態様では、提供されるＡＡＶカプシドは、異種遺伝子をコードする核酸配列を含む発現カセットを有するベクターゲノムを含む。本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するＡＡＶカプシドの中にパッケージされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ベクターゲノムは、少なくとも、５’から３’へ、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ、異種コード配列、およびＡＡＶ２の３’ＩＴＲを含む。しかしながら、ＡＡＶ２以外の異なる供給源のＡＡＶから、ＩＴＲが選択されてもよい。さらに、他のＩＴＲが使用され得る。さらに、ベクターゲノムは、好ましくは、目的の遺伝子の発現を誘導する制御配列を含む。一態様では、ＣＮＳに送達される異種遺伝子または発現カセットの発現に好適な組織特異的プロモーターを使用することが好ましい。
核酸配列またはタンパク質を説明するために使用される場合、「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、それが発現される宿主細胞または対象とは異なる生物または同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。タンパク質または、プラスミド、発現カセット、もしくはベクターの核酸を参照して使用される場合、「異種」という用語は、タンパク質または核酸が、天然には互いに同じ関係で見出されない等のタンパク質または核酸とは別の配列もしくはサブ配列が存在することを示す。したがって、一態様では、本明細書に提供されるＡＡＶカプシドは、特に、ＣＮＳで発現される場合、治療上有益であり得る少なくとも１つの遺伝子をコードする配列を含む。
「エフェクター実体（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｔｉｔｙ）」は、ＢＢＢを横切ってＣＮ
Ｓに輸送される分子を指す。エフェクター実体は、典型的には、脳に送達されることが望まれる特徴的な治療活性を有する。エフェクター実体には、神経障害を治療するための薬剤および細胞傷害性剤が含まれ、脳の標的を対象とし得る、ペプチド、タンパク質、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、抗体（特に、モノクローナル抗体またはその断片）、小分子、および脂質ナノ粒子などが含まれる。特定の態様では、エフェクター実体は、ＣＮＳの画像診断に有用な検出可能な標識を含み得る。
一態様では、ＡＡＶカプシドは、薬物、化学療法剤、および／またはイメージング剤をＢＢＢを横切って輸送するために、神経障害薬物、化学療法剤、および／またはイメージング剤とコンジュゲートされる。
ニューロパシー障害の場合、限定されないが、麻薬鎮痛薬／オピオイド鎮痛薬（すなわち、モルヒネ、フェンタニル、ヒドロコドン、メペリジン、メサドン、オキシモルフォン、ペンタゾシン、プロポキシフェン、トラマドール、コデインおよびオキシコドン）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（すなわち、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、およびトルメチン）、コルチコステロイド（すなわち、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロンおよびトリアムシノロン）、抗片頭痛剤（すなわち、スマトリプチン、アルモトリプタン、フロバトリプタン、スマトリプタン、リザトリプタン、エレトリプタン、ゾルミトリプタン、ジヒドロエルゴタミン、エレトリプタン、およびエルゴタミン）、アセトアミノフェン、サリチレート（すなわち、アスピリン、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、ジフルニサル、およびサルサラート）、抗痙攣剤（すなわち、カルバマゼピン、クロナゼパム、ガバペンチン、ラモトリギン、プレガバリン、チアガビン、およびトピラマート）、麻酔薬（すなわち、イソフルラン、トリクロロエチレン、ハロタン、セボフルラン、ベンゾカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、ノボカイン、プロパラカイン、テトラカイン、アルチカイン、ブピバカイン、カルチカイン、シンコカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、ピペロカイン、プリロカイン、ロピバカイン、トリメカイン、サキシトキシンおよびテトロドトキシン）、ならびにＣＯＸ－２阻害剤（すなわち、セレコキシブ、ロフェコキシブ、およびバルデコキシブ）が挙げられる鎮痛薬である神経薬が選択され得る。めまいが関与するニューロパシー障害の場合、限定されないが、メクリジン、ジフェンヒドラミン、プロメタジンおよびジアゼパムを含む抗めまい剤である神経薬が選択され得る。吐き気が関与するニューロパシー障害の場合、限定されないが、プロメタジン、クロルプロマジン、プロクロルペラジン、トリメトベンズアミド、およびメトクロプラミドが含む制吐剤である神経薬が選択され得る。神経変性疾患の場合、成長ホルモンまたは神経栄養因子である神経薬が選択されてもよく、例としては、限定されないが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－４／５、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）－２および他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）－３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）－α、ＴＧＦ－β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＦＲ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ネトリン、カルジオトロフィン－１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリンおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）が挙げられる。
がんの場合、神経薬は化学療法剤であり得る。化学療法剤の例としては、アルキル化剤（チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、シクロスホスファミド等）；アルキルスルホネート（ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン等）、アジリジン（ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ等）、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチローロメラミンを含む）、アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブルタシノン）、デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））、β－ラパコロン、ラパコール、コルヒチン、ベツリン酸、カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）を含む）、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９－アミノカンプトテシン）、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５（アドレスチン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）、ポドフィルポドキシン、ポドフィリン酸、テニポシド、クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）、ドラスタチン、デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコディクチン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード（クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど）、ニトロソウレア（カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムヌスチンなど）、エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンγ１Ｉおよびカリケアマイシンω１Ｉ（Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ，３３：１８３－１８６（１９９４）を参照））、ダイネミシンＡを含むダイネミシン、エスペラミシン、ネオカルジノスタチンのクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、抗代謝剤（メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）など）、葉酸類似体（デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど）、プリン類似体（フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど）、ピリミジン類似体（アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど）、アンドロゲン（カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストトラクトンなど）、抗副腎（アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど）、葉酸補充剤（フロリン酸など）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン、マイタンシノイド（マイタンシンやアンサマイトシンなど）、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）、多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ラゾキサン、リゾキシン、シゾ
フィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、およびアンギジン）、ウレタン、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）、チオテパ、タキソイド（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．））、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭクレモホール不含、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＰｖＥ（登録商標）、ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））、クロランブシル、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、６－チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金類似体（シスプラチンおよびカルボプラチンなど）、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、白金、エトポシド（ＶＰ－１６）、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、オキサリプラチン、ロイコボビン、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、ノバントロン、エダトレキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、イバンドロン酸、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）レチノイド（レチノイン酸など）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体、ならびに上記のうちの２つ以上の組み合わせ（ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略称）およびＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵおよびロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）による治療レジメンの略語）など）が挙げられる。
また、本明細書に記載される本発明の特定の態様では、化学療法剤も有用であり、がんの増殖を促進し得るホルモンの効果を調節、低減、遮断、または阻害するように作用し、しばしば全身治療（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または全身治療の形態（ｗｈｏｌｅ－ｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）である。それらは、ホルモン自体でもあり得る。例としては、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン、抗プロゲステロン、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）、卵巣を抑制または停止するように機能する薬剤（例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリドなどの黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン、およびトリプテレリン）、他の抗アンドロゲン剤（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミドなど）、ならびに副腎でエストロゲン産生を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤（例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）－酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールが挙げられる。加えて、化学療法剤のかかる定義としては、クロドロネートなどのビスホスホネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）もしくはＯＳＴＡＣ（登録商標）、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ－５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロン酸、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、またはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート）、ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシドシトシン類似体）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（特に、異常細胞増殖に関与するシグナル経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、
ＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、および表皮増殖因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）など）、ワクチン（ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンなど）および遺伝子療法ワクチン（例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン）、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＬＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ラパチニブトシル酸塩（ＥｒｂＢ－２およびＥＧＦＲのデュアルチロシンキナーゼ小分子阻害剤、別名ＧＷ５７２０１６）、ならびに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体が挙げられる。癌の治療または予防のための神経薬として選択され得る化合物の別の群は、抗癌免疫グロブリン（トラスツズマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・チウキセタン、パニツムマブおよびリツキシマブが含まれるが、これらに限定されない）である。場合によっては、抗体が、毒性標識とともに、所望の細胞（すなわち、癌細胞）を標的化し、死滅させるために使用され得る（放射標識を有するトシツモマブが含まれるが、これに限定されない）。
リソソーム蓄積症については、疾患で損なわれた酵素自体、さもなければ酵素の活性を模倣する神経薬が選択され得る。リソソーム蓄積症の治療のための例示的な組換え酵素としては、限定されないが、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１４２１４１号（すなわち、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、β－グルクロニダーゼ、酸性α－グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＡ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β－ガラクトセレブロシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、酸性セラミダーゼ、アスパルトアシラーゼ、パルミトイルタンパク質－チオエステラーゼ１、およびトリペプチジルアミノペプチダーゼ１）に記載されているものが挙げられる。
アミロイドーシスの場合、以下の神経薬が選択され得、限定されないが、標的（βセクレターゼ、タウ、プレセニリン、アミロイド前駆タンパク質もしくはその一部、アミロイドβペプチドまたはそのオリゴマーもしくはフィブリル、デスレセプター６（ＤＲ６）、終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）、パーキン、およびハンチンチンから選択される）に特異的に結合する抗体または他の結合分子（限定されないが、小分子、ペプチド、アプタマー、または他のタンパク質結合剤を含む）、コリンエステラーゼ阻害剤（すなわち、ガランタミン、ドネペジル、リバスチグミンおよびタクリン）、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（すなわち、メマンチン）、モノアミン枯渇剤（すなわち、テトラベナジン）、メシル酸エルゴロイド、抗コリン性抗パーキンソニズム剤（すなわち、プロシクリジン、ジフェンヒドラミン、トリヘキシフェニジル、ベンズトロピン、ビペリデンおよびトリヘキシフェニジル）、ドーパミン作動性抗パーキンソニズム剤（すなわち、エンタカポン、セレギリン、プラミペキソール、ブロモクリプチン、ロチゴチン、セレギリン、ロピニロール、ラサギリン、アポモルヒネ、カルビドパ、レボドパ、ペルゴリド、トルカポン、およびアマンタジン）、テトラベナジン、ならびに抗炎症剤（非ステロイド性抗炎症薬（すなわち、インドメチシンおよび上に列挙された他の化合物）、ホルモン（すなわち、エストロゲン、プロゲステロン、およびリュープロリド）、ビタミン（すなわち、葉酸およびニコチンアミド）、ジメボリン、ホモタウリン（すなわち、３－アミノプロパンスルホン酸、３ＡＰＳ）、セロトニン受容体活性調節剤（すなわち、キサリプロデン）、インターフェロン、ならびにグルココルチコイドが含まれる。
ウイルス疾患または微生物疾患の場合、以下から選択される神経薬が選択され得、限定されないが、抗ウイルス化合物（アダマンタン抗ウイルス剤（すなわち、リマンタジンおよびアマンタジン）、抗ウイルスインターフェロン（すなわち、ＰＥＧインターフェロンα－２ｂ）、ケモカイン受容体アンタゴニスト（すなわち、マラビロク）、インテグラー
ゼ鎖転移阻害剤（すなわち、ラルテグラビル）、ノイラミニダーゼ阻害剤（すなわち、オセルタミビルおよびザナミビル）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（すなわち、エファビレンツ、エトラビリン、デラビルジンおよびネビラピン）、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（テノホビル、アバカビル、ラミブジン、ジドブジン、スタブジン、エンテカビル、エムトリシタビン、アデホビル、ザルシタビン、テルビブジンおよびジダノシン）、プロテアーゼ阻害剤（すなわち、ダルナビル、アザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、リトナビル、ネルフマビル、アンプレナビル、インジナビル、およびサキナビル）、プリンヌクレオシド（すなわち、バラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、リバビリン、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、およびシドフォビル）、ならびにその他の抗ウイルス剤（すなわち、エンフビルチド、ホスカルネット、パリビズマブ、およびホミビルセン）を含むが、これらに限定されない）、抗生物質（アミノペニシリン（すなわち、アモキシシリン、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルコキサシリン、テモシリン、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、ピペラシリンおよびバカンピシリン）、セファロスポリン（すなわち、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セファドロキシル、セフラジン、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、およびセフォキシチン）、カルバペネム／ペネム（すなわち、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ファロペネム、およびドリペネム）、モノバクタム（すなわち、アズトレオナム、チゲモナム、ノルカルジシンＡ、およびタブトキシニンβラクタム）、別のベータラクタム抗生物質と組み合わせてβラクタマーゼ阻害剤（クラブラン酸、タゾバクタム、およびスルバクタム）、アミノグリコシド（すなわち、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、およびパロモマイシン）、アンサマイシン（すなわち、ゲルダナマイシンおよびハービマイシン）、カルバセフェム（すなわち、ロラカルベフ）、糖ペプチド（すなわち、テイコプラニンおよびバンコマイシン）、マクロライド（すなわち、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、およびスペクチノマイシン）、モノバクタム（すなわち、アズトレオナム）、キノロン（すなわち、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、およびテマフロキサシン）、スルホンアミド（すなわち、マフェニド、スルホンアミドクリソイジム、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム、およびスルファメトキサゾール）、テトラサイクリン（すなわち、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、およびオキシテトラサイクリン）、抗悪性腫瘍剤もしくは細胞傷害性抗生物質（すなわち、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ペントスタチン、およびバルルビシン）、ならびに、その他の抗菌化合物（すなわち、バシトラシン、コリスチン、およびポリミキシンＢ）を含むが、これらに限定されない）、抗真菌剤（すなわち、メトロニダゾール、ニタゾキサニド、イミダゾール、クロロキン、ヨードキノール、およびパロモマイシン）、ならびに抗寄生虫剤（キニーネ、クロロキン、アモジアキン、ピリメタミン、スルファドキシン、プログアニル、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテメシニン、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、メベンダゾール、パモ酸ピランテル、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、リファンピン、アムホテリシンＢ、メラルソプロール、エフロルニチン、およびアルベンダゾールを含むが、これらに限定されない）が含まれる。虚血の場合、限定されないが、血栓溶解剤（すなわち、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、およびテネクテプラーゼ）、血小板凝集阻害剤（すなわち、アスピリン、シロスタゾール、クロピドグレル、プラスグレル、およびジピ
リダモール）、スタチン（すなわち、ロバスタチン、プラバスタチン、フイウバスタチン、ロスバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、およびピタバスタチン）、ならびに血流または血管の柔軟性を改善するための化合物（例えば、血圧の薬を含む）を含む神経薬が選択され得る。
行動障害に関して、以下の行動修正化合物から選択される神経薬が選択され得、限定されないが、非定型抗抗精神病剤（すなわち、リスペリドン、オランザピン、アプリピプラゾール、クエチアピン、パリペリドン、アセナピン、クロザピン、イロペリドン、およびジプラシドン）、フェノチアジン抗精神病剤（すなわち、プロクロルペラジン、クロルプロマジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、トリフルオペラジン、チオリダジンおよびメソリダジン）、チオキサンテン（すなわち、チオチキセン）、その他の抗精神病剤（すなわち、ピモジド、リチウム、モリンドン、ハロペリドール、およびロキサピン）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（すなわち、シタロプラム、エスシタロプラム、パロキセチン、フルオキセチンおよびセトラリン）、セロトニン・エピネフリン再取り込み阻害剤（すなわち、デュロキセチン、ベンラファキシン、デスベンラファキシン）、三環系抗うつ剤（すなわち、ドキセピン、クロミプラミン、アモキサピン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、トリミプラミン、イミプラミン、プロトリプチリン、およびデシプラミン）、四環系抗うつ剤（すなわち、ミルタザピンおよびマプロチリン）、フェニルピペラジン抗うつ剤（すなわち、トラゾドンおよびネファゾドン）、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（すなわち、イソカルボキサジド、フェネルジン、セレギリン、およびトラニルシプロミン）、ベンゾジアゼピン（すなわち、アルプラゾラム、エスタゾラム、フルラゼプタム、クロナゼパム、ロラゼパム、およびジアゼパム）、ノルエピネフリン・ドーパミン再取り込み阻害剤（すなわち、ブプロピオン）、ＣＮＳ刺激剤（すなわち、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、メタンフェタミン、デキストロアンフェタミン、アンフェタミン、メチルフェニデート、デクスメチルフェニデート、リスデキサンフェタミン、モダフミル、ペモリン、フェンジメトラズム、ベンズフェタミン、フェンジメトラズム、アルモダフミル、ジエチルプロピオン、カフェイン、アトモキセチン、ドキサプラム、およびマジンドール）、抗不安剤／鎮静剤／催眠剤（バルビツレート（すなわち、セコバルビタール、フェノバルビタール、およびメホバルビタール）、ベンゾジアゼピン（上記）、ならびに、その他の抗不安剤／鎮静剤／催眠剤（すなわち、ジフェンヒドラミン、ナトリウムオキシベート、ザレプロン、ヒドロキシジン、抱水クロラール、アオルピデム、ブスピロン、ドキセピン、エスゾピクロン、ラメルテオン、メプロバメート、およびエトクロルビノール）を含むが、これらに限定されない）、セクレチン（例えば、Ｒａｔｌｉｆｆ－Ｓｃｈａｕｂ ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｉｓｍ ９：２５６－２６５（２００５）を参照）、オピオイドペプチド（例えば、Ｃｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８９：２７３－２８５（２００４）を参照）、神経ペプチド（例えば、Ｈｅｔｈｗａ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｅ３０１－３０５（２００５）を参照）が含まれる。
ＣＮＳ炎症の場合、炎症自体に対処する神経薬（すなわち、イブプロフェンもしくはナプロキセンなどの非ステロイド性抗炎症剤）、または炎症の根本的な原因を治療する薬物（すなわち、抗ウイルス剤もしくは抗癌剤）が選択され得る。
ＡＡＶカプシドおよびエフェクター実体のコンジュゲートを含む医薬組成物も、本明細書で提供される。本明細書に記載の医薬組成物は、任意の好適な経路または異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達されるように設計される。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、全身に（例えば、静脈内に）投与される。一実施形態では、ＣＮＳへの直接送達が望まれ、髄腔内注入を介して実施され得る。用語「髄腔内投与」は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を標的とする送達を指す。これは、脳室ＣＳＦまたは腰部ＣＳＦへの直接注入、後頭下穿刺、または他の好適な手段によって行うことができる。
Ｍｅｙｅｒら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ（２０１４年１０月３１日）は、ＩＶ適用と比べて１０倍低い用量を使用して、マウスおよび非ヒト霊長類における脊髄全体の広範な導入遺伝子の発現をもたらし、直接ＣＳＦ注射の有効性を実証した。本文書は、参照により本明細書に援用される。一実施形態では、組成物は、脳室内ウイルス注入を介して送達される。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４ Ｓｅｐ １５；（９１）：５１８６３を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。また、Ｐａｓｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｊｕｌ；２５（７）：６１９－３０も参照されたい（参照により本明細書に援用される）。別の実施形態では、組成物は、腰部注入を介して送達される。
あるいは、他の投与経路（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、腹腔内、および他の非経口経路）を選択してもよい。したがって、医薬組成物は、任意の適切な投与経路用（例えば、静脈内投与用、経口投与用など）に製剤化され得る（例えば、液体溶液または懸濁液の形態）。あるいは、医薬組成物は、（例えば、経口投与用に）固形の形態（例えば、錠剤またはカプセル）であり得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、粉末、点滴、エアゾルなどの形態であってもよい。
「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、製剤が投与される対象に対して許容できないほど毒性を有する追加の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、対象に対して無毒である活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
製剤を作製するための当該技術分野で周知の方法および薬剤は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に記載されている。製剤は、例えば、賦形剤、担体、安定剤、または希釈剤（滅菌水、生理食塩水、ポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコールなど）、植物由来の油、もしくは水素化ナフタレンなど）、保存剤（オクタデシルジメチルベンジル、塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール）、アルキルパラベン（メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾール）、低分子量ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、およびリシンなど）、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、およびデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、ならびに／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含んでもよい。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに封入されてもよい。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
本明細書に記載のＡＡＶカプシドおよびエフェクター実体のコンジュゲートは、様々なインビボの方法におよび利用することができる。一実施形態では、神経疾患の治療方法が提供され、本明細書に記載のコンジュゲートを投与することを含む。したがって、ＡＡＶカプシドとＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドとの結合は、それにコンジュゲートされたエフェクター実体のＣＮＳへの送達を促進し、ＢＢＢリガンドは、ＢＢＢを横切るコンジュゲートのウイルスの侵入または輸送を媒介する受容体または共受容体として機能する。
「投与」または「投与経路」とは、医薬担体または賦形剤の有無にかかわらず、本明細書に記載の組成物を対象に送達することを意味する。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。一部の実施形態では、投与は定期的に繰り返される。特定の態様では、本明細書に記載の組成物は、同時投与される。特定の態様では、本発明のＡＶＶベクターまたはコンジュゲートは、抗体と同時投与される。組成物が同時投与される場合、それらは、一緒にまたは別個に製剤化されて、同じまたは異なる経路によって本質的に同時に対象に送達され得る。特定の態様では、対象に組成物を投与する間の時間は、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、または４８時間未満であり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象に１回以上投与される。特定の実施形態では、組成物を１回、２回、３回、またはそれ以上再投与することが許される。ＡＡＶカプシドを含む組成物が投与される特定の態様では、かかる再投与は、同じ種類のベクター、または異なるベクターであってもよい。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるコンジュゲートのＡＡＶカプシドは、発現カセットを含み、その結果、ＣＮＳへのベクターの送達により、異種遺伝子の発現がもたらされる。したがって、ＡＡＶカプシドがＣＮＳに送達されると、遺伝子産物の異所的な発現または変化した発現につながり、神経学的障害を有する患者に恩恵をもたらす。
「発現の変化（ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」または「発現の変化（ａｌｔｅｒｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」または同様の語句は、選択された参照標準もしくは対照と比較して核酸配列（例えば、遺伝子もしくは転写産物）または細胞表面マーカーの発現レベルの上方制御を意味するか、選択された参照標準もしくは対照と比較して核酸配列（例えば、遺伝子もしくは転写産物または細胞表面マーカーの発現レベルの下方制御を意味するか、あるいは特定の上方制御された遺伝子および／または下方制御された遺伝子および／または細胞表面マーカーのパターンもしくは相対パターンの組み合わせを意味する。発現の変化の程度は、各個々の遺伝子もしくはマーカーで異なるか、または対象間で異なり得る。したがって、特定の態様では、ＢＢＢを横切る本明細書に記載のベクターまたはエフェクター実体の送達は、ＣＮＳ標的（すなわち、遺伝子、タンパク質等）の発現の変化をもたらす。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、リソソーム蓄積症の治療に有用である。リソソーム蓄積症は、場合によってはＣＮＳに関連するか、またはＣＮＳ特異的な症状を有する代謝障害であり、そのような障害としては、限定されないが、以下が挙げられる：テイ・サックス病、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型）、糖原病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ファーバー病、カナバン白質ジストロフィー、および神経セロイドリポフスチン症１型および２型、ニーマン・ピック病Ａ型およびＢ型（酸性スフィンゴミエリナーゼ欠乏症またはＡＳＭＤ）、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）、ポンペ病、ならびにクラッベ病。
別の実施形態では、ＡＡＶベクターによってＣＮＳの感染性を変化させる方法が提供される。一態様では、併用療法が提供され、ＡＡＶカプシドを、ＧＰＩアンカーＢＢＢリガ
ンドの結合パートナーおよびＢＢＢリガンドに結合する抗体または抗体断片と同時投与することを含む。したがって、抗体または抗体断片がＧＰＩアンカーリガンドに結合することで、ＢＢＢにおけるウイルス侵入が低減または阻害される。ＣＮＳ感染性の低減または阻害は、同時投与の抗体または抗体断片の不在下で観察される発生率と比較して測定され得る。特定の態様では、抗体の存在下での感染性は、抗体の不在下での感染性と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上低減され得る。
ＣＮＳの標的化に特に有用なＡＡＶカプシドを操作する方法もまた、本明細書で提供される。操作されたカプシドは、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカータンパク質に特異的に結合するペプチド断片（すなわち、結合パートナー）を含む。したがって、ＡＡＶカプシドは、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択されるＧＰＩアンカータンパク質への結合を付与または増強するように操作され得る。一態様では、本方法は、ＧＰＩアンカータンパク質およびかかる結合パートナーをコードするアミノ酸配列に特異的に結合するペプチド断片を同定することを含む。次いで、ＡＶＶカプシドを修飾して結合パートナーを発現し、それによって、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカーリガンドに結合することができるか、またはＧＰＩアンカーリガンドとの強化された結合を有するＡＶＶカプシドを生成する。一態様では、方法は、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択されるリガンドの結合パートナーを同定することを含む。別の態様では、本方法は、ＡＡＶ ＨＶＲＶＩＩＩ部位または別のＨＶＲ部位を修飾して、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカーリガンドの結合パートナーを発現することを含む。さらに別の態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶ９から選択され、操作されたカプシドは、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカータンパク質に特異的に結合する。これらの方法によって得られる操作ＡＡＶカプシドは、従来の遺伝子療法（すなわち、発現カセットの送達）に使用され得、かつ／または本明細書に記載されるエフェクター実体にコンジュゲートされ得る。
別の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートは、対象のＣＮＳに検出可能なエフェクター実体を送達するための方法で利用される。一態様では、検出可能な実体の送達は、ＣＮＳ標的を定量して、神経学的障害を有する対象を診断することを可能にする。一態様では、検出可能な薬剤は、ＣＮＳ標的に結合し、ペプチド、核酸、ｓｉＲＮＡ、抗体、抗体断片、小分子、脂質ナノ粒子、または細胞傷害性剤のうちの１つ以上を含む。したがって、特定の態様では、本明細書に提供される方法は、検出可能な薬剤を投与し、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を使用して、ＣＮＳを画像化することを含む。
これらの実施例は、例示のみを目的として提供される。本明細書に開示され、および／または特許請求される組成物、実験プロトコルおよび方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく、作製および実施することができる。実施例に記載のプロトコルおよび方法は、特許請求される本発明の範囲に対する限定であるとは見なされない。むしろ、本
明細書は、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意のおよびすべての変形例を包含するものと解釈されるべきである。当業者は、実施例の開示される実施形態において変更または変形を行うことができ、期待される同様の結果を得ることができることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載の試薬に対して化学的または生理学的に関連する試薬の置換は、同じまたは同様の結果を生じることが予想される。そのような類似の置換および変更はすべて、当業者には明白であり、本発明の範囲内である。
実施例１：血液脳関門を横切るＧＰＩ結合タンパク質ＬＹ６Ａ（ＳＣＡ－１）媒介輸送
ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂが、かかる効率で血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することを可能にする因子は、以前に定義されていなかった。この研究では、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの高いＢＢＢ透過性は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに特異的であり、以前から造血、間葉、および癌幹細胞生物学９－１２の文脈で研究されているＬＹ６Ａ（別名ＳＣＡ－１）という脳内皮細胞上で発現されるＧＰＩアンカータンパク質に対する７個の挿入アミノ酸の特異的結合に基づくことが決定された。
方法
動物
動物プロトコルはすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって認可され、動物は、ペンシルベニア大学の医学部内のＡＡＡＬＡＣ認定バリア施設内に収容された。ペンシルベニア大学の実験動物福祉室（ＯＬＡＷ）保証番号はＡ３０７９－０１である。Ｃ５６ＢＬ／６Ｊ（系統＃０００６６４）、ＢＡＬＢ／ｃＪ（＃０００６５１）、およびＦ１ハイブリッドＣＢ６Ｆ１／Ｊ（＃１００００７）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｆ２ハイブリッドは、施設でＣＢ６Ｆ１／Ｊを交配することによって得られた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景およびＢＡＬＢ／ｃＪ背景のＬｙ６ａ－ヌルマウスは、ＷｉｌｌｉａｍＬ．Ｓｔａｎｆｏｒｄ（オタワ大学）から寛大な提供を受けた。レポーター遺伝子実験については、成体（６～８週齢）のオスに注射した。動物を、１ケージ当たり２～５匹で、標準的なケージに収容した。バリア施設のケージ、給水瓶、および床敷は、オートクレーブ処理し、ケージは、週に１回交換した。自動制御の１２時間の明暗サイクルが維持された。各暗期は、１９：００時（±３０分）に開始した。放射線照射された実験用げっ歯類の餌は、自由摂食で提供された。
細胞株
ヒト胎児由来腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３、元々雌胎児から得られた）を、ガンマ照射された１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ（商標），ｃａｔ＃ＳＨ３００７１．０３ＩＲ）および１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ Ｇｉｂｃｏ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１９９５－０４０）中に維持し、３７℃で、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーターで増殖させた。
ベクター産生
ＡＡＶ９．ＰＨＰ．Ｂトランスプラスミド（ｐＡＡＶ２／ＰＨＰ．Ｂ）を、製造元のマニュアルに従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１０５１５）を用いて、ｐＡＡＶ２／９（Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）を鋳型として生成した。ｐＡＡＶ２／ＰＨＰ．Ｂを鋳型として、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ変異体も、同じ方法で構築した。以前に記載されているように３７、ＡＡＶベクターを作製し、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって滴定した。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を回収し、濃縮し、イオジキサノール勾配
で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように３８、ウサギβグロビンポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、デジタルドロップレットＰＣＲで滴定した。
インビボ試験および組織学
マウスは、外側尾静脈を介して０．１ｍＬ中の増強ＧＦＰ（Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）をコードする１×１０１２ＧＣ（５×１０１３ＧＣ／ｋｇ）のＡＡＶ９またはＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢもしくはＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢベクターを受け、注射２１日後、ＣＯ２の吸入により安楽死した。脳を始めとする組織を、速やかに回収した。矢状方向に切開した脳の半分を、１０％の中性緩衝ホルマリンに約２４時間浸漬固定し、ＰＢＳ中で軽く洗浄し、ＰＢＳ中の１５％および３０％のスクロースで、４℃で順次平衡化した。次いで、組織を、ＯＣＴ包埋媒体中で凍結し、直接ＧＦＰ可視化用に凍結切片を作製した（脳は、３０μｍ厚で切片化し、他の組織は、１０μｍ厚で切片化した）。画像は、Ｎｉｋｏｎ
Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｅ蛍光顕微鏡で取得、またはＡｐｅｒｉｏ Ｖｅｒｓａスライドスキャナーで全脳切片をスキャンした。他の半分の脳は、いずれか、ｑＰＣＲベクターの生体分布の研究用にドライアイス上でスナップ凍結されたか、または免疫染色用にホルマリン固定およびパラフィン包埋された。ホルマリン固定パラフィン包埋脳試料に対して、ＬＹ６Ａの免疫蛍光を行った。切片を、脱パラフィン化し、抗原賦活化のために１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸し、次いで、ＰＢＳ＋０．２％トリトン中の１％のロバ血清で１５分間ブロッキングし、続いて、ブロッキング緩衝液中に希釈された一次抗体（１時間）および蛍光標識二次抗体（４５分間）を用いて順次インキュベーションした。ＬＹ６Ａに対するモノクローナルラット抗体Ｄ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃１４－５９８１－８２）を、１：２００の希釈で使用し、ＴＲＩＴＣ－標識ロバ抗ラット（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔ＃７１２－０２５－１５３、１：１００の希釈）は、二次抗体として機能した。
ベクター生体分布
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号５１３０６）で組織ＤＮＡを抽出し、ベクターゲノムを、Ｔａｑｍａｎ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびベクターのｒＢＧポリアデニル化配列を標的とするプライマー／プローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって定量した。
全エクソーム配列決定
Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｍｏｕｓｅ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔカタログ番号５１９０－４６４１）を使用して、４匹のＦ１および１２匹のＦ２マウスの脳から単離されたゲノムＤＮＡから全エクソーム配列決定ライブラリを生成した。試料をインデックス化し、ＮｅｘｔＳｅｑ高出力カートリッジ上で配列決定した（フローセル当たり８つの試料）。配列決定後、各試料からのペアエンドリードを、ＮｏｖｏＡｌｉｇｎ（ｖ３．０８．０２）を使用して、全エクソーム配列決定３９について最適化されたパラメータを用いて、参照ゲノム（ＧＲＣｍ３８）にマッピングした。重複リード（ＤＮＡの単一の断片に由来する光学的および／またはＰＣＲ重複）を、その後、Ｐｉｃａｒｄツール（ｖ２．１３．２）でフラグ付けした。データ前処理の後、ＧＡＴＫベストプラクティス４０～４３を使用して、各試料についてバリアントコーリングを実施した。簡潔には、塩基品質スコアの再較正を最初に実施し、続いて、バリアントコーリングを行い、およびＧＡＴＫ（ｖ３．８）を使用してジョイント遺伝子型決定を行った。その後、生のバリアントをフィルタリングして、メンデル違反（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｖｉｏｌａｔｉｏｎ）のバリアント、およびＱＵＡＬスコアが５０以下のバリアントを除去した。その後、信頼性の高いバリアントを、関連性試験に使用した（統計分析を参照）。Ｓｎｐ
Ｅｆｆ４４を使用して、ゲノムバリアントの注釈付け（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）および機能効果の予測を行った。
Ｌｙ６ａ発現ベクターの構築
Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪのコード配列由来のＬＹ６Ａは、ＧｅｎｅＡｒｔストリング（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）として合成された。天然ＬＹ６Ａ発現ベクターの場合、ＧｅｎｅＡｒｔストリングを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリマスターミックス（ＮＥＢカタログ番号Ｅ２６２１）を使用して、ＢａｍＨＩ消化ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＩＲＥＳ ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ ５１４０６）にアセンブリした。Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグ化ＬＹ６Ａ発現ベクターの場合、ＬＹ６Ａの最初の１１１個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅した後、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリマスターミックス（ＮＥＢカタログ番号Ｅ２６２１）を使用して、Ｅｓｐ３Ｉ消化ｐＥＳＧ－ＩＢＡ１０３にアセンブリした。全ての構築物は、サンガー配列決定によって確認された。
Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグ化ＬＹ６Ａの産生および精製
ＨＥＫ２９３細胞を、１：２のＤＮＡ：ポリエチレンイミン（ＰＥＩ－直鎖ポリエチレンイミン塩酸塩（分子量４０，０００）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２４７６５－１）ｗ／ｗ比を使用して、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグ化ＬＹ６Ａ（Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＢＡＬＢ／ｃＪのバリアント）を発現するプラスミドで、一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞培養上清を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、１／１０量の１０×緩衝液Ｗ（１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）を添加することによって、ｐＨ８．０に調整した。トランスフェクトした２９３細胞を、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を補充した１×緩衝液Ｗに溶解し、２７ゲージ針を通して２回通過させた。細胞溶解物および培養上清を合わせ、続いて、１／４００量のＢｉｏＬｏｃｋビオチンブロッキング溶液（ＩＢＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２－０２０５－０５０）を用いて１５分間インキュベーションした後、遠心分離することによって、ビオチンの枯渇を行った。製造元のプロトコル（ＩＢＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴアフィニティークロマトグラフィーにより、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグ化ＬＹ６Ａタンパク質の精製を達成した。簡潔には、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴスーパーフロー樹脂（カタログ番号２－４０１０－０１０）を、細胞溶解物および上清とともに、２時間、室温でインキュベートし、４カラム体積（ＣＶ）の１ｘ緩衝液Ｗで洗浄し、０．６ＣＶ、１．６ＣＶ、および０．８ＣＶの１ｘ緩衝液ＢＸＴで溶出した。組換えＬＹ６Ａを含有する溶出画分をプールし、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で４回透析した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２３２２５）によって決定した。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
Ｓｔｒｅｐ－ＴａｃｔｉｎＸＴでコーティングされたマイクロプレート（ＩＢＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２－４１０１－００１）を、ウェル当たり０μｇまたは０．５μｇのＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグ化ＬＹ６Ａタンパク質を含む２００μＬのコーティング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄し、ＰＢＳ中３％のＢＳＡ中で、室温で２時間ブロッキングした。ＡＡＶ血清型を、１％のＢＳＡおよび０．１％のプルロニックＦ－６８を補充したＰＢＳ中に、示された濃度に希釈した。２００μＬのＡＡＶ希釈液を各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。固定化されたＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９に対するウサギ抗血清（１：５０，０００、Ｐｅｎｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（１：５，０００
、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４６０）と、順次、１時間インキュベーションすることによって検出した。プレートは、製品説明書に従って２００μＬのＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ１成分マイクロウェルペルオキシダーゼ基質（Ｓｅｒａｃａｒｅ、カタログ番号５２－００－０１）を使用して現像し、光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３）によって、４５０ｎｍで測定した。ＬＹ６Ａ依存性のＡＡＶ結合を計算するために、コーティングされていないマイクロプレートウェルへのバックグラウンドＡＡＶ結合を、各ウイルス濃度で観察されたＬＹ６ＡでコーティングされたウェルへのＡＡＶ結合から減算した。データは、３つの独立した実験を表している。ＬＹ６Ａバリアントに対するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂバリアントの見かけの親和性（Ｋｄ）を推定するために、ＥＬＩＳＡデータの最小二乗適合（Ａ４５０シグナルを最大の割合として）を、分子相互作用の単純な１：１モデル［ｆ＝Ａｔ／（Ｋｄ＋Ａｔ）］（式中、ｆは、Ｌｙ６ａ結合の割合であり、Ａｔは、ウェルに適用されるＡＡＶの総量である）に適用した。Ｌｙ６ａを明示的に説明するより複雑なモデルは、適合性を改善しなかった。使用されるＥＬＩＳＡの方向付けは、細胞で見られるような、ＬＹ６Ａタンパク質についてのベクターの見かけの親和性を推定することのみを可能にし、単一のＰＨＰ．Ｂペプチドループの単一のＬＹ６Ａタンパク質との微視的な親和性を表すものではない。
ＨＥＫ２９３形質導入アッセイ
細胞培養は、全て、ＤＭＥＭ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を使用して、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで行った。アッセイの第１日目に、ＨＥＫ２９３細胞をトリプシン処理し、カウントし、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６０３）に、８０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。２０～２４時間後、ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ配列の上流にＬｙ６ａもしくはＬｙ６ｃ１のＣ５７ＢＬ／６ＪまたはＢａｌｂ／ｃＪのアレルを含むプラスミド構築物を、細胞に一過的にトランスフェクトした。１００ｕＬの培養量で、ウェル当たり０．１４ｕｇのプラスミドＤＮＡおよび０．２８ｕｇのＰＥＩを使用して、無血清ＤＭＥＭでトランスフェクションを行った。モックでトランスフェクションされる細胞は、無血清ＤＭＥＭ中にＰＥＩのみを受けた。トランスフェクションの２４時間後、各ウェルに１００ｕＬのＤＭＥＭ＋２０％のＦＢＳ＋１％のＰ／Ｓを補充し、完全な血清条件下で、さらに２４時間増殖させた。トランスフェクションの４８時間後、蛍光顕微鏡を使用して、ＧＦＰ発現を、トランスフェクションされたウェルで定性的に評価した。次いで、ＣＭＶプロモーターの制御下のβ－ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含むＡＡＶ９およびＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂウイルスベクターを、１００，０００～１０の範囲のＭＯＩで、各ウェルに導入した。この形質導入ステップを、１００ｕＬの無血清ＤＭＥＭ中で２時間行い、続いて、１００ｕＬのＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを添加し、２４時間インキュベーションした。次いで、製造元のマイクロプレート培養のための直接溶解プロトコルに従って、Ｇａｌａｃｔｏ－ＳｔａｒＢ－ガラクトシダーゼレポーター遺伝子アッセイシステム（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｔ１０１４）を使用して、β－ガラクトシダーゼ発現を決定した。このプロトコルの溶解ステップを一部修正して、ウェル当たり４０ｕＬの溶解緩衝液を使用し、溶解を３０分間行った。次いで、ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ３発光プレートリーダーで、発光の検出を行った。データは、６つの独立した実験を表している。
ＨＥＫ２９３抗体阻害アッセイ
ＨＥＫ２９３抗体阻害アッセイは、ＨＥＫ２９３形質導入アッセイにおいて上に記載されたように行い、以下の変更または追加を伴った。トランスフェクションには、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢａｌｂ／ｃＪのＬｙ６ａ－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰプラスミドのみを使用した。さらに、アッセイの４日目、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂを形質導入する前に、抗体インキュベーションステップを追加した。このステップでは、低Ｄ７エンドトキシン無アジド
抗ＬＹ６Ａ抗体（Ａｂｅｏｍｉｃｓ、＃３１－２０２７）またはＩｇＧアイソタイプ対照（Ａｂｃａｍ、＃１８４５０）を、細胞とともに４℃で１時間インキュベートした。抗体を、５０ｕＬの無血清ＤＭＥＭ中に１００ｎＭで導入し、このインキュベーション後、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂレポーターベクターを、１０，０００のＭＯＩで５０ｕＬの無血清ＤＭＥＭに導入した。次いで、プレートを、３７℃のインキュベーターに戻し、先に記載したように、アッセイの残りの部分を進めた。データは、８つの独立した実験を表している。
定量および統計分析
マウスにおけるベクターゲノムのコピーを、一元配置ＡＮＯＶＡ（クラスカル・ウォリス検定）、続いて、α値を０．０５としてダンの多重比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して分析した。ＷＥＳ連鎖分析のために、量的形質のための線形ワルド検定を使用して形質関連バリアントを特定した（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｔａｔｇｅｎ／ＥＰＡＣＴＳ）。ｐ値が５Ｅ～８以下のバリアントのみを、有意であると見なした。ＨＥＫ２９３形質導入効率（β－ガラクトシダーゼ活性）は、２元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、テューキーの多重比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を用いた平均比較検定を使用して比較した。
結果
ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂに対するＢＢＢ透過性は、マウスにおいて共優性形質として遺伝する。
ＧＦＰ導入遺伝子を有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを、１×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）ＩＶ投与すると、ＢＡＬＢ／ｃＪマウス１３ではなくＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞の広範な形質導入をもたらすことが以前に示された。それとは対照的に、ＢＢＢを迂回する脳室内注射によるＣＮＳへのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの直接投与は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＢＡＬＢ／ｃＪマウスの脳の両方で、同等に、強いＧＦＰ発現をもたらした（図５Ａおよび図５Ｂ）。したがって、両方の系統のＣＮＳの細胞はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ脳内形質導入に対して感受性であったが、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスでＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの効率が増加したことは、ＢＢＢを横切る送達が強化されたことに起因すると結論づけた。ＢＢＢのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ透過性における系統特異的な違いは、ＢＢＢ輸送に関与する単一遺伝子の遺伝的バリエーションによって引き起こされたと仮定した。この仮説を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＢＡＬＢ／ｃＪ交配の子孫であるＦ１およびＦ２において、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢをＩＶ投与してＣＮＳの形質導入を評価した。全てのＦ１子孫は、親系統と比較して中等度のＣＮＳ形質導入を示したが、Ｆ２世代では、５５．５％が中等度、１６．７％が高度でＣ５７ＢＬ／６Ｊ様、および２７．８％が低度でＢＡＬＢ／ｃＪ様のＣＮＳ形質導入を有する、形質導入の分布を示した（図１Ａ）。この結果を、対応するマウス脳において、ベクターのゲノムコピー数のｑＰＣＲに基づく定量によって確認した（図１Ｂ）。Ｆ１およびＦ２の表現型の分布に基づいて、ＰＨＰ．Ｂに対するＢＢＢの透過性が、単一のゲノム遺伝子座における２つの共優性アレルのメンデル遺伝パターンに従っていると結論付けた。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂとは対照的に、ＡＡＶ９の場合、系統特異的な脳内形質導入は観察されなかった（図１Ｂ）。
ＬＹ６Ａ遺伝子は、ＢＢＢを横切るＰＨＰ．Ｂの形質導入と関連付けられる。
Ｆ１およびＦ２の子孫に記載されるＣＮＳ形質導入の遺伝パターンは、単一遺伝子におけるバリエーションが、この表現型における系統特異的な違い（すなわち、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの高いＢＢＢ透過性）の根底にあり得ることを示唆する。したがって、マウスゲノムのコード領域内の任意の原因となる変異を特定するために、１６種類の関連するマウスの遺伝子型決定および遺伝子連鎖分析に基づいて、全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を行った（図２Ａ）。我々の分析は、観察された表現型（図２Ｂ）と最も有意に関連付けられる（ｐ＝１．９Ｅ－３１）マウス１５番染色体のＤ３およびＥ３核型バンドにまたがる約
４．５ＭｂｐのゲノムＤＮＡストレッチ内に位置する１３５個の固有の変異を同定した。同定された有意なバリアントの機能的なバリアントの注釈から（ｐ≦５Ｅ－８）、Ｌｙ６ａ、Ｌｙ６ｉ、Ｒｈｏｐｈｉｌｉｎ１、およびＲｉｋｅｎ ｃＤＮＡ２０１０１０９Ｉ０３遺伝子内のミスセンス変異が、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの高いＢＢＢ透過性と最も有意に連鎖していることが明らかになった（表１）。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞内の局在化および公開データベース１４による脳内のそれらの存在量に基づいて、脳の微小血管系で高度に発現しているＧＰＩアンカー表面タンパク質であるＬＹ６Ａ（ＳＣＡ－１としても知られる）が原因となるタンパク質であると仮定した。Ｌｙ６ａがＢＢＢを横切るＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの非常に効率的な送達に不可欠であるかどうかを試験するために、ＧＦＰ導入遺伝子を有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景および野生型対照のＬｙ６ａノックアウト（Ｌｙ６ａ－／－）マウスにＩＶ注射した。ＰＨＰ．Ｂは、ＬＹ６Ａ－／－マウスにおいて肝臓を効果的に形質導入したが、脳内の形質導入が最小限であることが観察され（図２Ｃ）、ＬＹ６ＡがＢＢＢを横切るＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ輸送に必要であることを示す。興味深いことに、Ｌｙ６の遺伝子クラスターにおける多型は、Ｌｙ６ａ（ＢＡＬＢ／ｃＪ様）およびＬｙ６ｂ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ様）の２つの主要なハプロタイプを有することが、以前に記載されている。これらの２つのハプロタイプは、プロモーター領域内のいくつかの単一ヌクレオチド変化に関して異なり、ＬＹ６Ａタンパク質内の２つのアミノ酸置換（すなわち、Ｌｙ６ａがコードするタンパク質は、Ｌｙ６ｂと比較して、Ｖａｌ１０６ＡｌａおよびｐＡｓｐ６３Ｇｌｙ置換を有する）において異なる。ＬＹ６Ａに対する抗体を用いた免疫組織化学による脳組織の分析から、その発現が、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ動物の微小血管の内皮細胞では高レベルであり、ＢＡＬＢ／ｃＪ動物では大幅に減少していることが明らかになり（図２Ｄ）、これは、以前の報告１５を確認するものである。Ｌｙ６ａ－／－マウス由来の組織では、ＬＹ６Ａの発現は検出されず、これはアッセイの特異性を確認するものである（図２Ｄ）。ＢＡＬＢ／ｃＪのＬＹ６Ａのプロモーターの変異またはオープンリーディングフレーム内の変異のいずれかが、脳内皮上のＬＹ６Ａ発現の劇的な減少に寄与し得る。
これらの観察に基づいて、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＢＡＬＢ／ｃＪマウスで観察されるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの系統特異的なＢＢＢ透過性が、Ｌｙ６ｂおよびＬｙ６ａのハプロタイプを有するマウスのすべての系統に一般化することができるという仮説を立てた。この仮説を裏付けるために、マウスの６つの追加の近交系統を試験したところ、そのうちの３系統が、Ｌｙ６ｂハプロタイプ（１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍｊ、ＤＢＡ２／Ｊ、およびＦＶＢ／ＮＪ）を有し、３系統が、Ｌｙ６ａハプロタイプ（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＣＢＡ／Ｊ、およびＡ／Ｊ）を有していた（図３Ａ）。各系統からのマウスに、ＧＦＰを発現するＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢをＩＶ注射し、ＣＮＳの形質導入について分析した。予測通り、高レベルＣＮＳ形質導入は、Ｌｙ６ｂ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ様）ハプロタイプと直接的に相関した（図３Ｂ）。まとめると、Ｌｙ６ａ遺伝子のバリアントは、ＢＢＢを横切るＰＨＰ．Ｂ形質導入と関連していることが結論付けられた。
Figure 2022513618000001
Figure 2022513618000002
ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢは、高い親和性でＬＹ６Ａタンパク質に結合する
ＬＹ６ＡバリアントとＡＡＶカプシドとの間の直接的な相互作用の可能性を評価するために、ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪバリアントの両方について、ＬＹ６ＡのＧＰＩ－アンカー切断バージョンを含む発現カセットを構築して、それぞれの組換えタンパク質の可溶性バージョンを単離できるようにした。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＥＬＩＳＡウェルに結合した組換えＬＹ６Ａタンパク質に対するＡＡＶ粒子の結合を分析することによって開発された（図４Ａ）。ＢＡＬＢ／ｃＪ ＬＹ６Ａよりも多くのＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＬＹ６Ａに結合した。ＡＡＶ９とＬＹ６Ａバリアントとの間の結合は検出されなかった（図４Ａ）。ＢＡＢＬ／ｃＪ ＬＹ６Ａに対するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂのより低いシグナル強度にもかかわらず、比較的高い親和性の結合が残存した。実際、両方のデータセットは、サブｎＭ結合等温線に十分に適合する（Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪのバリアントについて、それぞれ０．０７ｎＭおよび０．２８ｎＭ）。この親和性は、複数の固定化Ｌｙ６ａタンパク質とＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターとの強い会合を表しているものと疑われた。ＢＡＢＬ／ｃＪにおけるＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢのＢＢＢ輸送の低減は、ＬＹ６Ａへの結合の低下およびＬＹ６Ａの発現の減少によって引き起こされる可能性がある。
５８８－ＴＬＡＶＰＦＫペプチド挿入の中にあるＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂカプシドのバリン５９２を、飽和変異誘発に供した。各ベクターバリアントを精製し、ＳＰＲを使用してＬＹ６Ａへの結合親和性について個別に試験した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサグラムにより、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂの高親和性、天然親和性、および低親和性バリアントを同定した（図８Ａ～図８Ｃ）。
ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの７個のアミノ酸のループに単一のアミノ酸変異を有するバリアン
トカプシドであるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ Ｖ５９２Ｇ（７個の挿入アミノ酸の４番目の残基におけるＶＰ１の５９２位でのバリンからグリシンへの変異）を生成した。この変異体カプシドのＧＦＰ発現バージョンをＩＶ注射した後の発現プロファイルは、ＡＡＶ９と類似しているが、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂとは類似していない（例えば、肝臓への高い形質導入に対して、ＣＮＳへの導入はほとんどない）（図６）。興味深いことに、ＡＡＶ９およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ Ｖ５９２Ｇのいずれも、ＬＹ６Ａとは検出可能に結合せず（図４Ａ）、インビトロでのＬＹ６Ａとのカプシド相互作用とインビボでのＢＢＢを横切る能力との間に直接的な関連性が示される。
次いで、ＡＡＶカプシドの内在化を強化するＬＹ６Ａの能力を調べた。このアッセイでは、全長Ｌｙ６ａ遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクションし、その後、ｌａｃＺを発現するＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ９を含め、低親和性および高親和性のカプシドとインキュベートした。このアッセイでは、ｌａｃＺの形質導入が、内在化の代用となる。形質導入は、細胞溶解物中のβ－ガラクトシダーゼ活性によって測定され、Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＢＡＬＢ／ｃＪのＬＹ６Ａタンパク質を発現する細胞とともにインキュベートされたＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの用量依存的な様式で達成された（図４Ｂ）。ＡＡＶ９の場合は、任意のバージョンのＬＹ６Ａを発現する細胞で、またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの場合は、無関係のＧＰＩアンカータンパク質ＬＹ６Ｃ１を発現する細胞で、バックグラウンドを超える形質導入は達成されなかった（図４Ｂ）。低親和性バリアントは、低ＭＯＩでの高親和性バリアントと比較して、導入効率の適度な増加（２倍）を示す。Ｌｙ６ａ受容体への結合は、いずれのレベルでも、ＡＡＶ９と比較して１０倍超の形質導入効率を向上させるのに十分である（図９）。さらに、Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＢＡＬＢ／ｃＪのＬＹ６Ａタンパク質を発現する細胞に対して強化されたＰＨＰ．Ｂの形質導入が、細胞を抗ＬＹ６Ａラットモノクローナル抗体とプレインキュベーションすることによって（アイソタイプ対照とのプレインキュベーションによるものではない）阻止され、ＬＹ６Ａに対する共受容体または受容体の役割についての仮説をさらに強める（図４Ｃ）。
ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢと呼ばれるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの第２世代バージョンが、最近記載され、ＩＶ注射後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで、さらにより高いＣＮＳの形質導入がみられた。このバリアントを調査して、ＬＹ６Ａが、ＢＢＢ透過性の主要決定因子であるかどうかを決定した。ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢのＩＶ注射後、ＣＮＳ形質導入は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで観察されたが、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂで観察されたようなＣＮＳ形質導入が、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスでは観察されなかった（図７）。
ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂで達成されたシグナルよりもわずかに高いシグナルで、Ｃ５７ＢＬ／６ＪのＬＹ６Ａに結合した（図４Ａ）。ＬＹ６Ａとの相互作用は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢの両方の向神経特性にとって、依然として重要であることが結論付けられた。
生体分布に対するＬＹ６Ａ結合親和性の影響
ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ親和性バリアントをＣＢ７－ｅＧＦＰレポーター遺伝子を用いて調製し、１ｅ１２ｇｃ／マウスのＩＶ用量で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで試験した。マウスを、注射の２１日後に安楽殺し、臓器を、組織学的検査および生体分布用に回収した。Ｌｙ６ａ親和性は、肝臓生体分布と負の相関を示し、Ｌｙ６ａに対する最も強い親和性を有するベクターでは、減少した肝臓への局在化を示す。この傾向は、脳の生体分布では観察されない。ＬＹ６Ａ受容体に対して親和性を有する全てのベクターは、同等のレベルの脳組織への局在化を示す（図１０Ａ）。ｅＧＦＰの肝臓発現により生体分布を追跡すると、Ｌｙ６ａに対する親和性が低いバリアントは、肝臓組織への局在化および肝臓組織での発現の増加を示す。脳の組織学的検査では、高親和性ベクターおよび低親和性ベクターは、脳組織において同様の生体分布を有するが、ＬＹ６Ａに対して低～中程度の親和性を有す
るベクターでは、発現が改善されたことを示す（図１０Ｂ）。
ＰＨＰ．Ｂペプチド提示の結合価および細胞形質導入に対する効果
キメラカプシドは、ベクター産生中に使用されるＡＡＶ９カプシド遺伝子またはＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂカプシド遺伝子のいずれかをコードするプラスミドの割合を変更することによって産生された。各キメラバリアントの形質導入効率は、Ｌｙ６ａを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞でのβ－ガラクトシダーゼの発現によって定量した。１：３のＰＨＰ．Ｂ、２：３のＡＡＶ９比でＰＨＰ．Ｂペプチドを提示するカプシドは、１００％のＰＨＰ．Ｂペプチドを提示するカプシドと比較した場合、細胞を同等に形質導入した。また、ＰＨＰ．Ｂペプチド提示の結合価を調節すると、形質導入で段階的応答が生じ、一方、ペプチド親和性を調節すると（図１１）、形質導入で多くの二値応答を生じる。
可溶性ＬＹ６ＡとＰＨＰ．Ｂとの間の結合には、ＬＹ６Ａドメインの多価提示が必要である。
以前の結合および親和性のＳＰＲデータでは、ＬＹ６Ａが、センサチップ表面に固定され、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂが、センサー表面上の溶液中にある状態で、生成された。この配向では、ベクターが複数の表面受容体と会合し、アビディティ効果により結合相互作用が強化される。逆の配向では、単量体のＬＹ６Ａは、最大４０μＭの濃度でさえ、表面に固定化されたＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂに結合することができない。ＬＹ６Ａが、ＩｇＧ１－ＦｃドメインのＮ末端に融合された二量体として発現される場合、それは依然として、１μＭの濃度では、表面に固定化されたＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂに結合することができない。ＬＹ６Ａが、ＩｇＭ－ＦｃドメインへのＮ末端融合物として発現される場合、最大１２コピーのＬｙ６ａドメインが、単一分子上に提示され得る。この構築物では、ＡＡＶ９ではなく、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂへの特異的結合が観察され得る（図１２）。
考察
遺伝子導入の技術が進歩するにつれて、形質導入効率や宿主ベクター応答などの性能の主要な原動力についての理解も進んできた。これらのトランスレーショナル研究のいくつかは、関連する基本的な生物学的プロセスの理解を強化した。ＡＡＶベクターが、意図的かつ用量依存的な様式で、全ての哺乳動物のＣＮＳの細胞を形質導入する能力は、光遺伝学などのツールの使用を通して、神経生物学の研究に革命をもたらした（１６で概説）。アデノウイルスを用いたインビボ遺伝子導入に対する適応免疫応答を鈍化させるように設計された研究では、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの会合によりＴ細胞が活性化されるメカニズムが発見された１７。本稿で説明されるストーリーは、遺伝子療法に関連するものよりも広範な影響を与える新しい生物学的原理を照らすトランスレーショナル作業の別の例である。
ＡＡＶ９バリアントＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂの単離は、神経疾患の治療を潜在的に変革する前ぶれとなった。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおいてＩＶ注射後にＣＮＳ細胞を形質導入することができる効率は、以前に達成されたものよりも少なくとも２０倍高く、霊長類に置き換えた場合、広範囲の神経疾患にわたって治療の開発が可能になるであろう１８。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの初期の評価は、そのＢＢＢ透過性が、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ１３などのマウスのいくつかの系統に限定されているという思いがけない発見をもたらした。Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪなどのマウスの、関連するが遺伝子的に異なる２つの系統間での形質導入の生物学における実質的な差により、本発明者らは、古典的な遺伝子連鎖のアプローチを使用して、ほんの１つの遺伝子がＢＢＢ透過性におけるこの劇的な系統差を決定し、それがＧＰＩアンカータンパク質であるＬＹ６Ａをコードしていることを決定することができた。
ＬＹ６Ａ（Ｓｃａ－１とも呼ばれる）は、活性化リンパ球上で上方制御される抗原とし
て４０年超前に発見された。これは、成体マウス造血幹細胞（ＨＳＣ）を富化するために一般的に使用され、多種多様な組織および器官で幹細胞、前駆細胞、および分化細胞の細胞型でも発現する（９で概説）。幹細胞生物学の研究で一般的に使用されているにもかかわらず、ＬＹ６Ａのリガンドが特定されていないことは大変面白い１９～２１。その生理学的機能も不明であるが、Ｌｙ６ａヌルマウスの研究は、Ｔ細胞増殖下方制御２２、造血系統調節、ＨＳＣ移植およびホーミング１０、間葉系幹細胞の自己再生、および骨形成２３，２４における役割を示唆する。ここで、ＬＹ６Ａのリガンド（すなわち、ＡＡＶ９カプシドバリアントＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ）が初めて同定され、このリガンドのＬＹ６Ａへの結合と、ＢＢＢを横切るその能力との間の直接的な関連が実証された。ＬＹ６Ａは、脳微小血管系１４，１５，２５において高度に発現され、Ｌｙ６ｂハプロタイプは、以前、野生型マウスアデノウイルス１誘導性の致死性脳炎２６，２７と関連していることが示された。この文脈では、本発明者らの結果は、このマウスＧＰＩアンカータンパク質が、ＢＢＢにおけるウイルス相互作用および経細胞質輸送において役割を果たし得ることを示唆している。
他のＧＰＩアンカータンパク質の研究は、ＬＹ６ＡがＡＡＶベクターのＢＢＢ透過性を増強し得る機構を示唆している。ＧＰＩアンカータンパク質は、しばしば、脂質ラフトに局在化しており、脂質ラフトは、コレステロール、スフィンゴ脂質、ならびに受容体およびタンパク質チロシンキナーゼなどの特定の一連の重要なシグナル伝達分子が富化された形質膜内の動的マイクロドメインである。ラフト関連ＧＰＩアンカータンパク質の頂端から基底側への送達は、分極細胞２８内の経細胞質輸送経路を介して生じる。さらに、ＢＢＢにおける巨大分子の経細胞質輸送は、部分的には、厳密に調節されたカベオラ関連脂質ラフト２９を介して生じることが知られている。いくつかのＧＰＩアンカータンパク質および脂質ラフトは、一般に、ウイルス粒子の細胞への入出において役割を果たす（３０で概説）。興味深いことに、Ｂ群コクサッキーウイルスは、１）頂端局在性ＧＰＩアンカータンパク質であるＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）との相互作用、２）ＣＤ５５クラスタリングおよびＡｂ１キナーゼ駆動Ｒａｃ依存性アクチン再編成の活性化、ならびに３）ウイルス粒子が受容体ＣＡＲと会合してエンドサイトーシスを起こす側方の密着結合への移行３１を伴う、３ステップの機構を介して、上皮性関門を通過する。このモデルでは、ＧＰＩアンカータンパク質は、ウイルス粒子の初期の捕捉を可能にし、密接接合領域に埋設された受容体へのウイルスの輸送を誘発する。ＢＢＢを横切るＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ形質導入の場合、ＬＹ６Ａが、ウイルスカプシドの他の因子との共局在化を促進する共受容体であるか、またはそれが架橋活性化エンドサイトーシスを介して主受容体として機能するかどうかを決定するために、さらなる実験が必要である。
実験データは、ＡＡＶ９が、基底区画への経内皮輸送を介してその完全性を損なうことなく、ＢＢＢを通過することができることを示唆している３２。しかしながら、これが生じる効率は、Ｃ５７ＢＬ／マウス８においてＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂで達成されるものよりも、少なくとも２０倍低い。ＡＡＶ５などの他のＡＡＶ血清型は、経細胞質輸送を介してインビトロで上皮関門および内皮関門を横切ることができ、この現象は、ＧＰＩアンカータンパク質の輸送を妨げる２つの化学物質であるタンニン酸またはフィリピン３３によって遮断される。興味深いことに、組換えＡＡＶ２は、主要な形質導入経路として、クラスリン非依存性輸送体／ＧＰＩアンカータンパク質富化エンドソーム区画（ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ）エンドサイトーシス経路を使用することが示唆された３４。これらの研究は、本明細書に報告される研究とともに、独立したグループによって実施され、ＡＡＶ経細胞質輸送および／または形質導入におけるＧＰＩ富化脂質ラフトの中心的な役割を支持している。本発明者らの結果は、ＧＰＩアンカータンパク質が、ＡＡＶベクターの共受容体または受容体として機能し得ることを、初めて示すものである。
実施例２：ＧＰＩアンカータンパク質に結合してＢＢＢを横切る形質導入を媒介する操作
されたカプシド
バイオ治療剤の送達を改善するために、ＢＢＢ内皮細胞上で発現されるＧＰＩアンカータンパク質をハイジャックすることができる。しかしながら、いくつかのグループは、非ヒト霊長類において、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢのＩＶ注射後、ＣＮＳ形質導入の増加を実証することに失敗しており１３，３５、これは、おそらく霊長類におけるＬＹ６Ａホモログの不在によって説明される３６。実際、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＢのＢＢＢ透過性の促進を示す唯一の動物モデルは、それが選択されたモデル（すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）と同様の遺伝的背景を有するものであり、新規のカプシドバリアントを選択する方法が、候補カプシドの有用性をどのように制限し得るかを例証する。したがって、それはまた、霊長類に由来する内皮細胞上で発現されるＧＰＩアンカータンパク質に結合するバリアントの集団を評価するために、ヒト遺伝子療法ベクターおよび他のタンパク質治療剤を開発する上で生産的である。
ＬＹ６Ａには、ヒトオーソログがないが、他のＬＹ６ファミリーメンバーおよび他のＧＰＩアンカータンパク質は、ヒト脳内皮上で高度に発現しているか（表２、ソース：ＩＳＨ／ＩＨＣヒトタンパク質アトラスｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）、またはマウス単一細胞ＲＮＡｓｅｑデータに基づき脳内皮発現の増加を有する３（表３）。さらに、ＬＹ６ＥなどのいくつかのヒトＬＹ６タンパク質は、向神経性／向内皮性フラビウイルス感染症と関連している。したがって、ＡＡＶベクターおよびカプシドを、ヒト脳内皮上で発現するＧＰＩアンカータンパク質と相互作用するように操作して、ＢＢＢを横切る効率的な形質導入および送達を媒介することができる。
Figure 2022513618000003
Figure 2022513618000004
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Figure 2022513618000006
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３５．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ＰＨＰ．Ｂ ｃａｐｓｉｄ ｆａｉｌｓ ｔｏ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｒｍｏｓｅｔ ｂｒａｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ６６５，１８２－１８８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｌｅｔ．２０１７．１１．０４９（２０１８）．
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３７．Ｌｏｃｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ，ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｓｃａｌｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ ２１，１２５９－１２７１，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．０５５（２０１０）．
３８．Ｌｏｃｋ，Ｍ．，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｊ．＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｔｉｔｅｒｓ ｂｙ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５，１１５－１２５，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１（２０１４）．
３９．Ｈｗａｎｇ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｅ．，Ｌｅｅ，Ｉ．＆ Ｍａｒｃｏｔｔｅ，Ｅ．Ｍ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｉｎｇ
ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｅｘｏｍｅ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ５，１７８７５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１７８７５（２０１５）．
４０．Ｐｏｐｌｉｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃａｌｉｎｇ ａｃｃｕｒａｔｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏ ｔｅｎｓ ｏｆ ｔｈｏｕｓａｎｄｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ（２０１７）．
４１．Ｖａｎ ｄｅｒ Ａｕｗｅｒａ，Ｇ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｍ ＦａｓｔＱ ｄａｔａ ｔｏ ｈｉｇｈ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｓ：ｔｈｅ
Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ４３，１１．１０．１１－３３，ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１２５０９５３．ｂｉ１１１０ｓ４３（２０１３）．
４２．ＤｅＰｒｉｓｔｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３，４９１－４９８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．８０６（２０１１）．
４３．ＭｃＫｅｎｎａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ：ａ ＭａｐＲｅｄｕｃｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０，１２９７－１３０３，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１０７５２４．１１０（２０１０）．
４４．Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ａｎｎｏｔａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＳｎｐＥｆｆ：ＳＮＰｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ
ｓｔｒａｉｎ ｗ１１１８；ｉｓｏ－２；ｉｓｏ－３．Ｆｌｙ ６，８０－９２，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｆｌｙ．１９６９５（２０１２）．
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、識別数字＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。
Figure 2022513618000008
本明細書に引用される全ての刊行物、ならびに、それぞれ２０１８年１１月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／７６９，６５２号、および２０１９年１０月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／９１４，０３５号は、参照により本明細書に援用される
。出願人は、本明細書とともに出願された配列表を、参照により本明細書に援用する。このファイルは、「１８－８６３４ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」とラベルされている。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (21)

  1. ＧＰＩアンカー血液脳関門（ＢＢＢ）リガンドの結合パートナーを含み、エフェクター実体にコンジュゲートされるカプシドを有する組換えＡＡＶを含む組成物。
  2. 前記リガンドが、Ｌｙ６Ｅである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記リガンドが、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記カプシドが、空のカプシドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記カプシドが、異種遺伝子をコードするＡＡＶベクターゲノムをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記エフェクター実体が、ペプチド、核酸、ｓｉＲＮＡ、抗体、抗体断片、小分子、脂質ナノ粒子、または細胞傷害性剤である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記ＡＡＶカプシドおよびエフェクター実体が、リンカーを介してコンジュゲートされる、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 神経疾患または神経障害の治療を必要とする対象において、神経疾患または神経障害を治療するための方法であって、前記対象の前記ＢＢＢを、ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドの結合パートナーを含み、エフェクター実体にコンジュゲートされるカプシドを有するＡＡＶと接触させることを含み、カプシドの前記ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドとの結合が、前記ＢＢＢを横切る前記エフェクター実体の輸送を媒介する、方法。
  9. 前記リガンドが、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記神経疾患または神経障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、リソソーム蓄積症、および外傷性脳損傷からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  11. 前記エフェクター実体が、ペプチド、核酸、ｓｉＲＮＡ、抗体、抗体断片、小分子、または細胞傷害性剤である、請求項８に記載の方法。
  12. 前記ＡＡＶカプシドが、リンカーを介して前記エフェクター実体にコンジュゲートされ
    る、請求項８に記載の方法。
  13. ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドの結合パートナーを含むＡＡＶカプシドを有する遺伝子療法ベクターの中枢神経系（ＣＮＳ）の取り込みを低減または阻害するための併用療法であって、前記ＢＢＢリガンドに結合する抗体または抗体断片を、前記遺伝子療法ベクターと同時投与することを含む、併用療法。
  14. 前記リガンドが、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. ＣＮＳを標的とするＡＡＶカプシドを操作する方法であって、
    ａ）ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドに特異的に結合するペプチド断片をコードするアミノ酸配列を同定することと、
    ｂ）ＡＡＶ ＨＶＲＶＩＩＩ部位を修飾して、前記アミノ酸配列を発現させることと、を含み、
    操作された前記カプシドが、ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドに結合する、方法。
  16. 前記リガンドが、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 修飾された前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶ９である、請求項１５に記載の方法。
  18. 請求項１５に記載の方法によって得られる、ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドに結合する操作されたＡＡＶカプシド。
  19. ＣＮＳ標的を検出可能に標識するための方法であって、ＢＢＢ上のＧＰＩアンカーリガンドに結合し、検出可能なエフェクター実体にコンジュゲートされたＡＡＶカプシドを投与することを含み、前記ＡＡＶカプシドが、前記ＧＰＩアンカーＢＢＢリガンドに結合すると、前記ＢＢＢを横切ってそれにコンジュゲートされた前記検出可能なエフェクター実体を輸送する、方法。
  20. 前記リガンドが、Ｌｙ６Ｅ、ＧＲＡ３、ＡＬＰＬ、ＢＳＴ２、ＥＦＮＡ５、ＮＴ５Ｅ、ＤＰＥＰ２、ＧＰＣ１、ＬＹＰＤ５、ＧＰＣ６、ＣＤ１４、ＣＡ４、ＧＰＣ５、ＣＤ５９、ＴＦＰＩ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＨＹＡＬ２、ＭＥＬＴＦ、ＵＬＢＰ２、ＥＦＮＡ４、ＣＮＴＮ５、ＢＣＡＮ、ＲＥＣＫ、ＣＦＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＰＲＮＰ、ＬＹ６Ｅ、ＰＲＮＤ、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２４Ａ、ＭＭＰ２５、ＡＲＴ３、ＬＹＰＤ１、ＰＩＢＦ１、ＣＡＰＲＩＮ１、ＧＦＲＡ３、ＧＰＩＨＢＰ１、ＭＡＣＦ１、およびＳＥＣ２４Ｂから選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記検出可能なエフェクター実体が、ペプチド、核酸、ｓｉＲＮＡ、抗体、抗体断片、小分子、脂質ナノ粒子、または細胞傷害性剤を含む、請求項１９に記載の方法。
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