JP2022511365A - 神経変性疾患の治療における神経保護剤としてのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び５‐ｈｔ４受容体アゴニストの組合せ - Google Patents

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Abstract

本発明は、神経変性疾患の防止及び／又は治療において、神経保護剤として使用するための、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び5-HT4受容体アゴニストを含む、医薬組成物に関する。本発明はまた、神経変性疾患の防止及び／又は治療において、神経保護剤として同時に、別々に、又は連続して使用するための、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び5-HT4受容体アゴニストを含む、神経保護の医薬的組合せ物にも関する。

Description

本発明は、神経変性疾患の治療に関する。
神経変性疾患は、神経細胞の体系的な変性及び脱落に基づく、神経回路ニューラルネットワーク(nervous circuit neural network)の崩壊によって誘導される疾患であり、様々な難治性疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病、ルイス小体(Lewis body)型認知症、脳血管性認知症、並びに加齢に関連した問題（(i)非認知的な神経変性(non-cognitive neurodegeneration)、(ii)非認知的な神経筋変性(non-cognitive neuromuscular degeneration)、及び(iii)感覚運動神経変性(motor-sensory neurodegeneration)を含む）、ハンチントン病、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む）、ダウン症候群、大脳皮質基底核神経節変性症(corticobasal ganglionic degeneration)、多系統萎縮症、大脳萎縮症、オリーブ橋小脳萎縮症、核上性まひ、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症2型、前頭側頭型変性症(FTD)、並びに原発性進行性失語症として知られている。
神経変性疾患の臨床症状は、疾患によって、軽度のものから重度のものまで様々である。臨床症状は、振戦、固縮、無動、運動機能低下、動作緩徐、姿勢反射不全(attitude reflex failure)、自律神経障害、突進現象、歩行障害、うつ、アパシー、意識障害(confusion)、学習変化(learning alteration)、記憶障害、認知機能障害、筋委縮、筋力低下、肩甲帯の障害(disorder of shoulder girdle)、構音障害、嚥下障害、呼吸障害、しびれ、まひ、及び認知症を含み、日常活動を行ううえで大きな障害である。
恐らく、発現、活性、及び／又は制御に問題が生じた際に、神経変性疾患を引き起こす多様な分子群のため、神経変性死は、複雑なメカニズムである。これは、これまでに、なぜ、神経変性を阻害又は元に戻す効果的な方法が確立されなかったかを説明し得る。
そのような疾患の原因を取り除くための処置に加えて、ニューラルネットワークを再構築することも重要である。例えば、アミロイドβペプチドの細胞毒性が原因として認識されているアルツハイマー病において、神経突起の萎縮及びシナプスの減少の両方が、神経機能の低下を誘発し、逆に、そのような誘発後でさえ、完全には変性していない又は変性せずに生き残った神経細胞は、場合によっては、活性化されて、シナプスを元に戻すために神経突起を伸ばすことが可能である場合、回復することが可能であるといわれている。
米国特許6,037,352 US 6,037,327 US 6,022,683 US 5,935,781 US 5,886,051 US 5,869,484 US 5,798,392 US 5,789,425 US 5,777,108 US 5,731,284 US 5,589,386 US 5,585,375 US 5,550,253 US 5,547,960 US 5,541,340 US 5,500,188
Ellman et al. (1961) Biochemical Pharmacology 7:88-95 Dumuis et al. (1988) Mol Pharmacol. 34:880-7 Gaven et al. (2013) Brain Res. 1511:65-72
従って、神経変性疾患を防止すること、及び治療的に処置することの両方のために、神経突起を保護することができるだけではなく、神経突起の成長を増加させ、新しいシナプスの形成を促進させることができる、新規の物質に関する重要な要求が存在する。
本発明は、この要求を満たす。
本発明は、実際、本発明者らによる予期せぬ発見の結果であり、当該発見は、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性と5-HT4受容体アゴニスト活性との組合せが、タウ過剰リン酸化を減少させることに加えて、神経突起の成長を増加させること、シナプス比率(synapses rate)を維持すること、更には、最も重要で予期しなかったことには、新しいシナプスの形成を促進させることが可能であるため、この組合せが、神経保護活性を有するというものであり、これは、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を示すのみである化合物、例えばドネペジルの場合とは異なる。
神経突起における、この全般的で効果的な保護効果のため、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性と5-HT4受容体アゴニスト活性の組合せの使用は、神経突起変性が関わる任意の神経変性疾患の防止及び／又は治療のための神経保護剤として、非常に有望である。
従って、本発明は、神経変性疾患の防止及び／又は治療において神経保護剤として使用するための、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び5-HT4受容体アゴニストを含む医薬組成物に関する。
本発明は、また、神経変性疾患の防止及び／又は治療において神経保護剤として同時に、別々に、又は連続して使用するための、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び5-HT4受容体アゴニストを含む神経保護の医薬的組合せ物にも関する。
本発明は、また、神経変性疾患の防止及び／又は治療において神経保護剤として、5-HT4受容体アゴニストと組合されて使用するための、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤にも関する。
本発明の別の目的は、神経変性疾患の防止及び／又は治療において神経保護剤として、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤と組合されて使用するための、5-HT4受容体アゴニストにも関する。
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤
本明細書において、「アセチルコリンエステラーゼ」又は「AChE」は、神経伝達物質として機能するアセチルコリン及びいくつかのその他のコリンエステルの分解を触媒として促進する、EC 3.1.1.7群の加水分解酵素を意味する。
本明細書において、「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」は、アセチルコリンエステラーゼのアセチルコリン加水分解機能に影響を与える、任意の天然又は合成の化合物又は分子を意味する。
本発明において、用語アセチルコリンエステラーゼを「阻害する」は、アセチルコリンエステラーゼのアセチルコリン加水分解反応を低下させる、減少させる、除去する、減弱させる、遅らせる、又は停止させることを指す。
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を同定する技術は、当業者によく知られている。典型的には、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、Ellman et al. (1961) Biochemical Pharmacology 7:88-95に開示されるエルマン法を使用して同定することができる。
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の例は、当業者によく知られており、以下の式(I)のドネペジル：
Figure 2022511365000001
リバスチグミン、タクリン、ガランタミン、米国特許6,037,352、米国6,037,327、米国6,022,683、米国5,935,781、米国5,886,051、米国5,869,484 (アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として適したフェニルカルバメート誘導体)、米国5,798,392、米国5,789,425 (イミダゾリジノン誘導体)、米国5,777,108 (アセチルコリンエステラーゼ阻害剤としてのガランタミン誘導体)、米国5,731,284、米国5,589,386、米国5,585,375、米国5,550,253、米国5,547,960、米国5,541,340、及び米国5,500,188に開示される化合物を含む。
特定の実施形態において、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、ドネペジル(Donepezil)、リバスチグミン(rivastigmine)、タクリン(tacrine)、及びガランタミン(galantamine)からなる群から選択される。
特定の実施形態において、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、ドネペジルである。
5-HT4受容体アゴニスト
本明細書において、「5-HT4受容体」又は「5-ヒドロキシトリプタミン受容体4」は、HTR4遺伝子によってヒトにおいてコードされ、セロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン）に反応してcAMPの産生を刺激するヒトセロトニン受容体のファミリーのメンバーである、タンパク質を意味する。
本明細書において、「5-HT4受容体アゴニスト」は、セロトニン4型受容体に対して親和性を有し、この特定の細胞受容体において、セロトニンの刺激効果を模倣することができる、任意の天然又は合成の化合物又は分子を意味する。
5-HT4受容体アゴニストを同定する技術は、当業者によく知られている。典型的には、5-HT4受容体アゴニストは、Dumuis et al. (1988) Mol Pharmacol. 34:880-7で初めて開示され、Gaven et al. (2013) Brain Res. 1511:65-72で更新された方法を使用して同定することができる。
5-HT4受容体アゴニストの例は、当業者によく知れており、プルカロプリド(prucalopride)、シサプリド(cisapride)、ダゾプリド(dazopride)、モサプリド(mosapride)、レンザプリド(renzapride)、ナロナプリド(naronapride)、ザコプリド(zacopride)、ベルセトラッグ(velusetrag)、テガセロッド(tegaserod)、メトクロプラミド(metoclopramide)、シニタプリド(cinitapride)、YM-53389（{(+)-(S)-2-クロロ-5-メトキシ-4-[5-(2-ピペリジルメチル)-1,2,4-オキサジアゾール-3-イル]アニリン一塩酸塩}）({(+)-(S)-2-chloro-5-methoxy-4-[5-(2-piperidylmethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aniline monohydrochloride})、RS-67333、5-メトキシトリプタミン(5-Methoxytryptamine) (5-MT)、RS-56532、ML-10302、SSP-002392、BIMU-8、及びDA-6886（N-((1-(3-(1,2,3-トリアゾール-1-イル)プロピル)ピペリジン-4-イル)メチル)-4-アミノ-5-クロロ-2-メトキシベンズアミド塩酸塩）(N-((1-(3-(1,2,3-triazol-1-yl)propyl)piperidin-4-yl)methyl)-4-amino-5-chloro-2-methoxybenzamide hydrochloride)を含む。
特定の実施形態において、5-HT4受容体アゴニストは、プルカロプリド、シサプリド、ダゾプリド、モサプリド、レンザプリド、ナロナプリド、ザコプリド、ベルセトラッグ、テガセロッド、メトクロプラミド、シニタプリド、YM-53389、RS-67333、5-メトキシトリプタミン(5-MT)、RS-56532、ML-10302、SSP-002392、BIMU-8、及びDA-6886からなる群から選択される。
特定の実施形態において、5-HT4受容体アゴニストは、RS-67333である。
特定の実施形態において、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び5-HT4受容体アゴニストは、両方の活性を有する、特異な化合物である。
従って、特定の実施形態において、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び5-HT4受容体アゴニストは、以下の式(II)：
Figure 2022511365000002
のドネコプリド(donecopride)化合物である。
神経変性疾患
本明細書において、「神経変性疾患」は、神経細胞の体系的な変性及び脱落に基づく、神経回路ニューラルネットワークの崩壊によって誘導される疾患を意味する。
上述のように、本発明者らは、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及び5-HT4受容体アゴニスト活性の組合せは、神経突起に全般的で効果的な保護効果を示すことを実証した。この全般的な神経保護効果のため、この組合せは、任意の神経変性疾患を防止及び／又は治療するための神経保護剤として使用することができる。
神経変性疾患の例は、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病、ルイス小体型認知症、脳血管性認知症、並びに加齢に関連した問題（(i)非認知的な神経変性、(ii)非認知的な神経筋変性、及び(iii)感覚運動神経変性を含む）、ハンチントン病、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む）、ダウン症候群、大脳皮質基底核神経節変性症、多系統萎縮症、大脳萎縮症、オリーブ橋小脳萎縮症、核上性まひ、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症2型、前頭側頭型変性症(FTD)、並びに原発性進行性失語症を含む。
特定の実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多系統萎縮症、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症を含む）、ダウン症候群、前頭側頭型変性症からなる群から選択される。
別の実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
別の実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病でない神経変性疾患である。
医学的適応
本発明は、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患の防止及び／又は治療の際の神経保護剤としての使用のための、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と、上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストと、を含む医薬組成物に関する。
本発明は、また、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患の防止及び／又は治療のための神経保護剤の製造のための、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と、上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストと、を含む医薬組成物の使用にも関する。
本発明は、さらに、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む、医薬組成物の治療的有効量を、神経保護剤として、それを必要とする対象に投与することを含む、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患を防止及び／又は治療する方法に関する。
本発明は、さらに、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む、医薬組成物の治療的有効量を、対象に投与することを含む、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患を患っている、又は患うリスクがある対象における神経保護の方法に関する。
本発明は、また、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患の防止及び／又は治療の際に神経保護剤として、同時に、別々に、又は連続して使用するための、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む、神経保護の医薬的組合せ物にも関する。
本発明は、また、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患の防止及び／又は治療のための、同時、別々、又は連続した投与のための、神経保護の医薬的組合せ物の製造のための、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、及び上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストの使用にも関する。
本発明は、また、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、及び上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストの、治療的有効量を、それを必要とする対象に、神経保護剤として、同時に、別々に、又は連続して投与することを含む、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患を防止及び／又は治療する方法にも関する。
本発明は、また、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、及び上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストの、治療的有効量を、対象に、同時に、別々に、又は連続して投与することを含む、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患を患っている、又は患うリスクがある対象における神経保護の方法にも関する。
本発明によれば、用語「対象」又は「それを必要とする対象」は、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患に罹患している、又は罹患している可能性がある、ヒト又は非ヒト哺乳類を対象としている。
本発明の文脈において、用語「治療する」又は「治療」は、そのような用語が適用される障害若しくは疾患の進行、又はそのような障害若しくは疾患の1つ又は複数の症状を反転、軽減、又は阻害することを意味する。
本発明の文脈において、「防止する」又は「防止」は、そのような用語が適用される障害若しくは疾患の発症、又はそのような障害若しくは疾患の1つ又は複数の症状を遅らせる又は防止することを意味する。
本明細書において、「神経保護」は、中枢神経系における変性の影響の防止又は阻害、及びニューロンインテグリティ(neuronal integrity)の復元を意味し、特に、ニューロン変性の防止又は阻害を意味する。
本明細書において、「神経保護剤」は、上記に規定された神経保護の組合せを意味する。
本発明者らは、より詳細には、本発明のなかで使用される化合物の組合せが、神経突起の成長を増加させ、シナプス比率を維持し、タウ過剰リン酸化を減少させ、及び／又は新しいシナプスの形成を促進させることができることを実証した。
従って、特定の実施形態において、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む医薬組成物、又は上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む神経保護の医薬的組合せ物は、神経突起の成長を増加させるためのものである。
本発明は、また、
‐上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む医薬組成物の治療的有効量を、対象に、投与すること、又は
‐上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、及び上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストの治療的有効量を、対象に、同時に、別々に、又は連続して投与すること
を含む、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患を患っている、又は患うリスクがある対象における、神経突起の成長を増加させる方法にも関する。
本明細書において、「神経突起の成長」は、ニューロンの細胞体由来の任意の突起の伸長プロセス、及び関連するシナプス生成を意味する。
本明細書において、「神経突起の成長を増加させる」は、対象の化合物を使用した場合に、同じ条件だが対象の化合物を使用していない条件において見られる、神経突起の成長と比較して、神経突起の成長がより高い（すなわち、より効率的、速い、又は長い）、好ましくは、統計学的に有意により高いことを意味する。好ましくは、神経突起の成長を、同じ条件だが対象の化合物を使用していない条件において見られる神経突起の成長と比較して、少なくとも120%増加させる。
別の特定の実施形態において、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む医薬組成物、又は上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む神経保護の医薬的組合せ物は、シナプス比率を維持するためのものである。
本発明の別の目的は、
‐上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む医薬組成物の治療的有効量を、対象に、投与すること、又は
‐上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、及び上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストの治療的有効量を、対象に、同時に、別々に、又は連続して投与すること
を含む、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患を患っている、又は患うリスクがある対象における、シナプス比率を維持する方法に関する。
本明細書において、「シナプス比率」は、シナプスの数とニューロンの数の比率を意味する。
本明細書において、「シナプス比率を維持する」は、対象の化合物を使用した場合に、コントロール条件（例えば、同じ条件だが対象の化合物を使用していない条件、又はニューロンが神経変性疾患に直面していない条件）において見られる、シナプス比率と比較して、シナプス比率が類似している（すなわち、統計学的に有意に異ならない）ことを意味する。
別の特定の実施形態において、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む医薬組成物、又は上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む神経保護の医薬的組合せ物は、新しいシナプスの形成を促進させるためのものである。
本発明の別の目的は、
‐上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む医薬組成物の治療的有効量を、対象に、投与すること、又は
‐上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、及び上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストの治療的有効量を、対象に、同時に、別々に、又は連続して投与すること
を含む、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患を患っている、又は患うリスクがある対象における、新しいシナプスの形成を促進させる方法に関する。
本明細書において、「新しいシナプスの形成を促進させる」は、対象の化合物を使用した場合に、同じ条件だが対象の化合物を使用していない条件において見られる、新たに形成されたシナプスの数と比較して、新たに形成されたシナプスの数がより多い、好ましくは、統計学的に有意により多いことを意味する。好ましくは、新しいシナプスの形成を、同じ条件だが対象の化合物を使用していない条件において見られる新しいシナプスの形成と比較して、少なくとも120%増加させる。
別の特定の実施形態において、上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む医薬組成物、又は上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む神経保護の医薬的組合せ物は、タウの過剰リン酸化を減少させるためのものである。
本発明の別の目的は、
‐上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストとを含む医薬組成物の治療的有効量を、対象に、投与すること、又は
‐上記の「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」のセクションで規定されたアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、及び上記の「5-HT4受容体アゴニスト」のセクションで規定された5-HT4受容体アゴニストの治療的有効量を、対象に、同時に、別々に、又は連続して投与すること
を含む、上記の「神経変性疾患」のセクションで規定された神経変性疾患を患っている、又は患うリスクがある対象における、タウの過剰リン酸化を減少させる方法に関する。
本明細書において、「タウの過剰リン酸化」は、タウタンパク質の異常に高度なリン酸化、特に、Thr39、Ser46、Thr50、Ser68、Thr69、Thr71、Ser113、Thr153、Thr175、Thr181、Ser184、Ser185、Ser191、Ser198、Ser199、Ser202、Thr205、Ser208、Ser210、Thr212、Ser214、Thr217、Thr231、Ser235、Ser237、Ser238、Ser241、Ser258、Ser262、Ser285、Ser289、Ser305、Ser324、Ser352、Ser356、Tyr394、Ser396、Ser400、Thr403、Ser404、Ser409、Ser412、Ser413、Thr414、Ser416、Ser422、Ser433、及びSer435残基の少なくとも1つにおける、タウタンパク質の異常なリン酸化を意味する。
本明細書において、「タウの過剰リン酸化を減少させる」は、タウタンパク質のThr39、Ser46、Thr50、Ser68、Thr69、Thr71、Ser113、Thr153、Thr175、Thr181、Ser184、Ser185、Ser191、Ser198、Ser199、Ser202、Thr205、Ser208、Ser210、Thr212、Ser214、Thr217、Thr231、Ser235、Ser237、Ser238、Ser241、Ser258、Ser262、Ser285、Ser289、Ser305、Ser324、Ser352、Ser356、Tyr394、Ser396、Ser400、Thr403、Ser404、Ser409、Ser412、Ser413、Thr414、Ser416、Ser422、Ser433、及びSer435残基の少なくとも1つ、特に、Ser212及びThr214残基の1つが、対象の化合物を使用した場合、異常にリン酸化されず、一方で、同じ条件だが対象の化合物を使用していない条件において、上記残基が異常にリン酸化されることを意味する。
本明細書において、「治療的有効量」は、任意の治療に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で、神経変性疾患を治療及び／又は防止する際に、神経保護剤として作用するのに十分な量の医薬組成物又は組合せを意味する。しかしながら、本発明の化合物の一日の総使用量は、理にかなった医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解される。任意の特定の対象に対する特定の治療的有効用量レベルは、治療される障害、及び障害の重症度、使用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全身状態、性別、及び食事、使用される特定の化合物の投与の時間、投与の経路、及び排出率、治療の期間、使用される特定の化合物と組合されて又は同時に使用される薬剤、並びに医学分野でよく知られている因子を含む様々な因子によって決定される。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要な用量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることは、本分野における技術の範囲内である。
本明細書において使用される、用語「組合せ」、「治療的組合せ」、又は「医薬的組合せ物」は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び5-HT4受容体アゴニストを、組合せ相手が相乗効果を示すことを可能にする時間間隔の範囲内で、同時に又は別々に、独立して投与することができる、併用投与のための、一回単位用量形態中の固定された組合せ又はキットの一部のいずれかを規定する。
本発明の組合せの化合物は、従って、1つ又は2つの別々の医薬組成物中に配合することが可能であり、各組成物は、同じ又は異なる投与経路のためのものである。
本発明のなかで使用される化合物は、治療組成物を形成する、薬学的に許容される賦形剤、及び場合によっては、持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマー、を含む、医薬組成物の形態で投与されてもよい。
「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳類、特にヒトに、必要に応じて投与された場合に、副作用、アレルギー反応、又はその他の有害反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、非毒性の固体、半固体、若しくは液体フィラー、希釈剤、封入材料、又は任意のタイプの製剤補助剤を指す。
本発明のなかで使用される化合物を含む医薬組成物の形態、及び投与経路は、当然に、患者の治療される疾患、病気の重症度、年齢、体重、及び性別などによって決定される。
本発明のなかで使用される化合物は、局所、経口、非経口、経鼻、静脈内、筋内、皮下、眼内投与などのために配合することができる。特定の実施形態において、本発明のなかで使用される化合物は、経口的に投与される。
代替的には、本発明のなかで使用される化合物を含む医薬組成物は、注射可能な配合物において薬学的に許容されるビヒクルを含んでもよい。これらは、特に、等張性で、滅菌された、生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、若しくは塩化マグネシウムなど、又はそれらの塩の混合物）、又は場合によっては、滅菌された水若しくは生理食塩水の追加によって、注射可能な溶液の構成を可能にする、乾燥、特に凍結乾燥組成物であってもよい。
医薬組成物を調整するために、本発明のなかで使用される化合物の有効量を、薬学的に許容される担体又は水性媒体中に、溶解又は分散してもよい。
注射可能な使用に適切な医薬形態は、滅菌された水性溶液又は分散体、及び滅菌された注射可能な溶液又は分散体の即時調製のための滅菌された粉末を含む。全ての場合において、医薬形態は、滅菌され、容易な注射針通過性(syringability)が存在する程度に流動性を有さなければならない。医薬形態は、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用から保護されなければならない。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの適切な混合物を含む、溶媒又は分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用、分散体の場合は必要な粒径の維持、及び界面活性剤、安定化剤、抗凍結剤、又は抗酸化剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、抗細菌剤及び抗真菌剤によって、もたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。
滅菌された注射可能な溶液は、必要な量の活性化合物を、適切な溶媒に、必要に応じて、上記に列挙された、いくつかのその他の成分とともに組み込み、その後、濾過滅菌されることによって、調製する。一般に、分散体は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体、及び上記に列挙されたもののうち必要なその他の成分を含む、滅菌されたビヒクル中に組み込むことによって、調製する。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合、好ましい調製方法は、前もって滅菌濾過された溶液から、活性成分の粉末、更に任意の更なる所望の成分の粉末を産出する、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
配合後、溶液は、投薬製剤に適合した方法で、治療的に有効である量で、投与される。配合物は、様々な投薬形態、例えば、上述された注射可能な溶液のタイプで、容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
水性溶液での非経口投与に関して、例えば、溶液を、必要に応じて、適切に中和し、液体希釈剤を最初に、十分な塩類又はグルコースを用いて等張にしなければならない。これらの特定の水性溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用することができる滅菌された水性媒体は、本開示に照らせば、当業者によく知られている。例えば、一回用量は、1mLの等張性NaCl溶液に溶解して、1000mLの皮下注入液に添加するか、又は提示された注入部位に注射するかのいずれかをすることができる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照）。投薬のいくつかの変形は、治療される対象の状態によって、必然的に生じる。投与を担当する人は、いずれにしても、個々の対象にとって適切な用量を決定する。
本発明のなかで使用される化合物は、典型的には、例えば、経口又は舌下経路によって摂取される錠剤、カプセル、マイクロカプセル、粉末、顆粒、シロップ、溶液又は懸濁液の形態で、経口投与することができる。
特定の実施形態において、本発明のなかで使用される化合物は、適切には、1～20mg/kg体重の一日用量で、特に2mg/kgの一日用量で、経口投与される。
別の特定の実施形態において、本発明のなかで使用される化合物は、適切には、1週間に2回、1～20mg/kg体重の用量で、特に1週間に1回、1mg/kgの用量で、経口投与される。
別の特定の実施形態によると、本発明のなかで使用される化合物は、1日当たり10～1000mgの用量で、好ましくは1日5回、0.2～2mgの用量で投与される。
本発明は、以下の図面及び実施例でさらに説明される。
Aβ 1-42によって損傷した海馬ニューロンの初代培養における、MAP-2ニューロンの生存（Ａ）、総神経突起ネットワーク（Ｂ）、ニューロンの数で標準化された神経突起の長さ（Ｃ）、タウのリン酸化(AT100)（Ｄ）、及びMAP-2ニューロンのシナプスの保護（Ｅ）に対するRS67333の効果。結果は、平均±SEM（n=4-6/群）として、コントロール(control)して、表す。一元配置分散分析(One-way ANOVA)後、LSDフィッシャーの検定(LSD Fisher’s test)。*p<0.05を有意であるとみなした。 Aβ 1-42によって損傷した海馬ニューロンの初代培養における、MAP-2ニューロンの生存（Ａ）、総神経突起ネットワーク（Ｂ）、ニューロンの数で標準化された神経突起の長さ（Ｃ）、タウのリン酸化(AT100)（Ｄ）、及びMAP-2ニューロンのシナプスの保護（Ｅ）に対する、RS67333とドネペジル(Donepezil)との間の相乗効果。結果は、平均±SEM（n=4-6/群）として、コントロールのパーセンテージとして、表す。一元配置分散分析(One-way ANOVA)後、LSDフィッシャーの検定(LSD Fisher’s test)。*p<0.05を有意であるとみなした。
実施例１
この実施例は、Aβ（24時間曝露）によって損傷されたラット初代海馬ニューロンにおける、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及び5-HT4受容体アゴニスト活性の両方を有する化合物（すなわち、ドネコプリド(Donecopride)）の効果を示す。
アルツハイマー病(AD)は、異なる臨床症状、例えば、思考、言語、及び学習能力の進行性の低下を患う、主に65歳超の人々を侵す、神経変性疾患である。様々な情報源からの増加するエビデンスは、Aβオリゴマー(AβO)/プロトフィブリル(protofibrils)を、AD発症における、推定される毒性種として指摘している。
AβOの溶液を作製し、AβOへの曝露の濃度及び時間を調整することで、初期の影響（酸化ストレス）及び構造変化の長期の進展（ニューロンの死）を再現することができた。
本実施例で使用されるモデルは、（自動ウェスタンブロットによって正確に測定された）AβOを含むAβペプチド溶液を使用して、ADの必須の神経病理学的な特徴を再現した。
この研究の目的は、Aβ（24時間曝露）によって損傷されたラット初代海馬ニューロンにおける、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及び5-HT4受容体アゴニスト活性の両方を有する化合物（いくつかの濃度における、ドネコプリドフマレート(Donecopride fumarate)）の効果を評価することであった。アセチルコリンエステラーゼ阻害活性のみを有する化合物、すなわち、ドネペジル（一つの濃度）を、参照試験化合物として使用した。
材料及び方法
海馬ニューロンの初代培養
ラット海馬ニューロンは、Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91706-716に記載されるように培養した。妊娠17日の妊娠した雌のラット（Rats Wistar; Janvier Labs France）を、CO2チャンバー用いて深麻酔、その後頸椎脱臼を用いて、殺した。次いで、胎児を子宮から取り除き、直ぐに、2%ペニシリン(10000U/ml)及びストレプトマイシン(10mg/ml)溶液(PS)、並びに1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む、よく冷えたL15 Leibovitz培地に置いた。海馬ニューロンを、終濃度が0.05%のトリプシン及び0.02%のEDTAの、トリプシン-EDTA溶液で、20分間、37℃で処理した。解離は、DNAse IグレードII（終濃度0.5mg/ml）及び10%のウシ胎児血清(FCS)を含む、4.5g/lのグルコースを有するダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)を加えることによって、停止させた。細胞を、10-mlピペットのチップを3回強制的に通過させることによって、機械的に解離させ、その後、4℃で10分間、515×gで遠心した。上清を捨て、ペレットを、2%のB27サプリメントの溶液、2mmol/lのL-グルタミン、2%のPS溶液、及び10ng/mlの脳由来神経栄養因子(BDNF)を有する、Neurobasal培地からなる規定培養培地(defined culture medium)中に再懸濁した。生存している細胞を、トリパンブルー色素排除試験を使用して、ノイバウアー血球計算器中でカウントした。細胞を、ポリ-L-リシンでプレコートされた96ウェルプレート中に、1ウェルあたり20000個の密度で蒔き、空気(95%)-CO2(5%)インキュベーター中で、37℃で培養した。培地は、2日毎に交換した。
ドネコプリド及びヒトAβ1-42の曝露
海馬ニューロンを、培養の17日後に、Aβ溶液（以下を参照）に曝露した。Aβ1-42の調製は、Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91706-716によって記載された方法に従って、行った。簡潔には、Aβ1-42ペプチドを、40μMの初期濃度で、上記の規定培養培地中に溶解した。この溶液を、暗い中で、3日間、37℃で、静かに攪拌し、培養培地中で適切に希釈して、使用される濃度（2μM又は0.25μMのオリゴマー(Aβ)にそれぞれ対応する、20μM（プレート1）又は2.5μM（プレート2））にした後、直ぐに使用した。
Aβの適用の1時間前に、ドネコプリドフマレートを、培養培地に溶解し、プレインキュベーションした。Aβ1-42の調製物を加えて、ドネコプリドの存在下で、コントロール培地に希釈されて、20又は2.5μMの終濃度（＝自動ウェスタンブロットで評価された、2μM又は0.25μMのAβO）にした。
培養プレートの構成
ドネコプリドフマレート（ドネコプリド）を、96ウェルプレート中での1つの培養で試験した（1条件あたり6ウェル）。化合物は、Aβの適用の1時間前に、プレインキュベーションした。以下の条件を評価した。
Figure 2022511365000003
エンドポイント評価
プレート1：生存、神経突起ネットワーク、及びホスホタウの評価
中毒(intoxication)の24時間後、海馬ニューロンを、エタノール(95%)及び酢酸(5%)の冷えた溶液で、5分間、-20℃で固定した。0.1%のサポニンで透過処理後、細胞を、
a) 1%のウシ胎児血清及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/1000に希釈された、ニワトリの抗-微小管関連タンパク質2(MAP-2)ポリクローナル抗体（この抗体は、神経細胞体及び神経突起の特異的な染色を可能にし、神経細胞死及び神経突起ネットワークの研究を可能にする）
b) 1%のウシ胎児血清及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/400に希釈された、マウスの抗-ホスホタウ モノクローナル抗体(AT100)
とともに、2時間、インキュベーションした。
これらの抗体を、室温で、1時間、1%のFCS及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/400に希釈された、Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG、及びAlexa Fluor 568ヤギ抗ニワトリIgGを用いて、明らかにした。
各条件に関して、1ウェルあたり30個の写真（全てのウェル領域の代表）を、ImageXpress (Molecular Devices社)を使用して、20×の倍率で、取得した。全ての画像は、同じ取得パラメータを用いて、取得した。解析は、Custom Module Editor (Molecular Devices社)を使用することによって、自動的に実施した。
以下のエンドポイントを評価した：
-ニューロンの総数（ニューロンの生存、MAP-2陽性ニューロンの数）
-神経突起ネットワーク（MAP-2陽性ニューロンのμmにおける）
-ニューロンにおけるタウの領域（μm2、MAP-2陽性ニューロンとの重なり）。
プレート2：シナプスの評価
中毒の24時間後、海馬ニューロンを、エタノール(95%)及び酢酸(5%)の冷えた溶液で、5分間、-20℃で固定した。0.1%のサポニンで透過処理後、細胞を、
a) 1%のウシ胎児血清及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/100に希釈された、マウスの抗-PSD95（95kDaのシナプス後肥厚部(post synaptic density 95kDa)）モノクローナル抗体
b) 1%のウシ胎児血清及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/100に希釈された、ウサギの抗-シナプトフィジン(SYN)ポリクローナル抗体
とともに、2時間、インキュベーションした。
これらの抗体を、室温で、1時間、1%のFCS、0.1%のサポニンを含むPBS中で1/400に希釈された、Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG、及びAlexa Fluor 568ヤギ抗ウサギIgGを用いて、明らかにした。
各条件に関して、1ウェルあたり40個の写真を、ImageXpress (Molecular Devices社)を使用して、40×の倍率で、取得した。全ての画像は、同じ取得パラメータを用いて、取得した。
シナプスの評価は、Custom Module Editor (Molecular Devices社)を使用することによって、自動的に実施した。
以下のエンドポイントを評価した：
-シナプスの総数（PSD95/SYN間の重なり）。
統計学的解析
全ての値は、平均+/-SEMとして表される。統計学的解析は、一元配置分散分析(One-way ANOVA)後、PLSDフィッシャーの検定(PLSD Fisher’s test)によって実施し、p<0.05を有意であるとみなした。
異なる条件に関するグラフ及び統計学的解析は、GraphPad Prism software version 7.04を使用して、実施した。*p<0.05を有意であるとみなした。
結果
MAP-2海馬ニューロンの生存及び神経突起ネットワーク、並びにタウの過剰リン酸化に対するドネコプリドの効果
ニューロンの生存
海馬ニューロンの初代培養における、MAP-2ニューロンの生存に対する、ドネコプリドの効果を、以下の表２（Table 1）に示す。
Figure 2022511365000004
MAP-2ニューロンの重大な喪失が、Aβペプチドの適用に続いて生じた。ドネペジル（本明細書において、単独でアセチルコリンエステラーゼ阻害活性のコントロールとして使用された）は、ニューロンを死から、有意に保護することが可能であった。ドネコプリドの2つの用量（100nM及び500nM）は、ドネペジルと同様の程度に、神経保護効果を発揮した。
神経突起ネットワーク
海馬ニューロンの初代培養における、MAP-2ニューロンの神経突起ネットワークに対する、ドネコプリドの効果を、以下の表３（Table 2）に示す。
Figure 2022511365000005
Aβ 1-42損傷の後に、総神経突起ネットワークが、重度に縮んだ。ドネペジルは、ほぼ全ての神経突起ネットワークを有意に保護した。ドネコプリドの4つの用量（50nM、100nM、500nM、及び1μM）も、神経突起ネットワークに対して保護効果を発揮した。
神経突起ネットワークは、培養物中のニューロンの数に比例する。1つのニューロンあたりの神経突起の平均の長さを決定するために、総神経突起ネットワークをニューロンの数で標準化した。対応する結果を、以下の表４（Table 3）に示す。
Figure 2022511365000006
この調整は、1つのニューロンあたりの神経突起の長さが、ドネペジル及びドネコプリド（1μM）の存在下では、より長いことを示し、これらの2つの化合物が、神経突起の伸長に影響を与えることを示唆した。
タウリン酸化
海馬ニューロンの初代培養における、MAP-2ニューロンのタウのリン酸化(AT100)に対する、ドネコプリドの効果を、以下の表５（Table 4）に示す。
Figure 2022511365000007
（AT100における）タウの過剰リン酸化は、Aβ 1-42の適用下において見られた。ドネペジルは、有意に、この過剰リン酸化を軽減することができた。同様に、ドネコプリド（50nM、100nM、500nM）は、用量依存的に、有意に、タウの過剰リン酸化を減少させた。
海馬ニューロンの初代培養におけるシナプスに対するドネコプリドの効果
シナプスの形成を評価するために、PSD-95（シナプス後マーカー）及びシナプトフィジン（シナプス前マーカー）の分布を調査した。PSD-95及びシナプトフィジン染色の両方に関して陽性である構造体は、シナプスとみなした。
これらのシナプスに対するドネコプリドの効果を、以下の表６（Table 5）に示す。
Figure 2022511365000008
（以前に、Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91:706-716よって示されるように、）Aβ 1-42の適用から生じるストレスは、シナプスの数の減少を引き起こした。
ドネペジルは、シナプスの喪失を軽減した。同様に、ドネコプリドも、用量依存的に（5nMから1μM）、シナプスの数を保つことができた。興味深いことに、この効果は、化合物の低い用量（5nM）でみられた。この効果は、用量とともに増加した。
Aβ 1-42ペプチドによって引き起こされる損傷のため、実験条件では、ニューロンの数が減少し、それがシナプスの数の減少をもたらした。従って、1つのニューロンあたりのシナプスの数を推定するために、シナプスの数を、コントロール、Aβ 1-42、ドネコプリド（最も多い数のシナプスを示す条件である、500nM）、及びドネペジル群に関して、ニューロンの数で標準化した。
この調整は、ドネコプリドのみが、新しいシナプスの形成を有意に促進したが、一方で、ドネペジルは、効果を有さなかったことを示した。
結論
本研究は、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及び5-HT4受容体アゴニスト活性の組合せが、アルツハイマー病のin vitroモデルの、Aβ 1-42ペプチドによって損傷した、海馬ニューロンの、ニューロンの生存及び神経突起ネットワークに対して有益な効果を有することを示す。
さらに、この活性の組合せを有する化合物は、AT100部位におけるタウの過剰リン酸化を減少させることができ、新しいシナプスの形成を有意に刺激することができた。
この組合せの効果は、ドネペジルの効果より大きく、この組合せが、神経保護剤として、特に、神経変性疾患を治療するための、興味深い薬剤候補であることを示唆した。
実施例２
この実施例は、アルツハイマー病の5XFADマウスモデルへの長期投与における、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及び5-HT4受容体アゴニスト活性の両方を有する化合物（ドネコプリド）の抗健忘効果、抗アミロイド効果、及び抗炎症効果を示す。
研究の論拠
本研究の目的は、アルツハイマー病のマウスモデルでの長期投与における、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及び5-HT4受容体アゴニスト活性の両方を有する化合物（ドネコプリド）の潜在的な抗健忘効果、抗アミロイド効果、及び抗炎症効果を評価することであった。
使用したマウスモデルは、5XFAD系統（ジャクソン研究所において「B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax」と称される、MMRRCストック番号：34840-JAX、又は「B6.Cg-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/ Mmjax」と称される、MMRRCストック番号：34848-JAX)であった。
これらの5XFADトランスジェニックマウスは、2つのFAD変異（M146L及びL286V）を内包するヒトPS1とともに、Swedish (K670N, M671L)、Florida (I716V)、及びLondon (V717I)家族性アルツハイマー病(FAD)変異を有する、ヒトAPP(695)変異体を過剰に発現する。両方の導入遺伝子を、脳において過剰発現を促進させるようにマウスThy1プロモーターによって制御する。5XFADマウスは、アルツハイマー病のアミロイド病変の主な特徴を再現し、ニューロン内のAβ42誘導性神経変性及びアミロイド斑形成の有用なモデルである。
方法及び実験計画
マウス
動物実験は、1986年11月24日の欧州共同体の理事会による指令（86/609/EEC）に従って、実施した。動物の苦しみを最小化し、使用するマウスの数を減らすための全ての努力が行われた。5XFADマウスの作製は、Oakley et al. (2006) J. Neurosci. 26:10129-10140に記載された。これらのトランスジェニックマウスは、Swedish (K670N, M671L)、Florida (I716V)、及びLondon (V717I)家族性AD(FAD)変異を内包するヒトAPP(695)、並びに2つのFAD変異（M146L及びL286V）を内包するヒトプレセニリン1(PS1)の両方を過剰発現する。両方の導入遺伝子の発現は、マウスThyプロモーターのニューロン特異的要素によって、制御される。5XFAD系統（B6/SJLの遺伝的バックグラウンド）は、ヘミ接合のトランスジェニックマウスをB6/SJL F1繁殖個体と交配することによって、維持した。5XFAD系統（C57BL/6Jの遺伝的バックグラウンド）は、ヘミ接合のトランスジェニックマウスをC57BL/6J F1繁殖個体と交配することによって、維持した。全ての動物を、尾のゲノムDNAを使用して、PCRによってジェノタイピングした。トランスジェニックマウス及び野生型(WT)マウスは、本発明者らの動物施設内で繁殖され、自由に食餌及び水を手に入れることができ、22～24℃で、12時間の明暗サイクル下で、飼育された。雌の5XFADマウスを、この研究で使用した。各実験において、マウスの年齢は、（2週間の範囲を有する）月で示される。
薬剤
ドネコプリド（ドネコプリドフマレート、MR 31155）は、CERMN, Caen, Franceにおいて、合成された。
RS 67333 （1-(4-アミノ-5-クロロ-2-メトキシ-フェニル)-3-(1-ブチル-4-ピペリジニル)-1-プロパノン）(1-(4-amino-5-chloro-2-methoxy-phenyl)-3-(1-butyl-4-piperidinyl)-1-propanone)が、参照5-HT4受容体アゴニストとして使用され、Tocris Bioscience社(R&D Systems Europe, Lille, France)から購入した。
化合物は、DMSO中に再懸濁し（37.5μg/μl、-20℃で保存）、投与前に、0.9%のNaCl中に、新たに1:250で希釈した。ビヒクル溶液（0.9% NaCl、0.4% DMSO）を、コントロールとして使用した。
動物の処置
5XFADマウスは、2つの異なるプロトコルに従って、薬剤又はビヒクルを用いた長期間の処置を受けた。各実験において、薬剤又はビヒクル溶液を、1週間に2回、腹腔内投与した（1mg/kg）。「プロトコル1」では、2～4月齢のマウス（群あたり、n=6～7）を、2か月間、化合物で処置した。「プロトコル2」では、1～4月齢のマウス（n=7）を、3か月間、化合物で処置した。各プロトコルの最後に、マウスを、生理食塩水溶液中の100mg/kgのケタミン及び10mg/kgのキシラジンの混合物を用いて麻酔し、PBSを用いて経心的に(transcardially)灌流した。脳を氷上に素早く単離し、嗅球及び小脳を除去し、両半球を分割した。一方の半球をドライアイス上で凍結し、生化学分析のために-80℃で保存し、他方を免疫組織化学染色(IHC)のために4% PFAで後固定した。
脳脊髄液(CSF)の回収
マウスを麻酔し、定位固定装置に載せた。頸の皮膚を切り、マイクロ開創器(micro-retractors) (Fine Science Tools, Heidelberg, Germany)を用いて、皮下組織と筋肉とを分けた。次いで、マウスを、頭が身体と約135°の角度を形成するように、置いた（Liu and Duff (2008) J. Vis. Exp. 10:960）。キャピラリーチューブ（ホウケイ酸ガラス、B100-75-10、Sutter Instruments社、Novato, California, USA）を使用して、大槽(cisterna magna)の硬膜に穴をあけた。CSFを毛細管現象によって回収して、0.5mLマイクロチューブに移し、速やかにドライアイス上で凍結して、使用するまで-80℃で保存した。一度解けると、サンプルを、国際出願の国際公開第2008/009868号に記載されるように、60℃で、5分間、加熱し、更なる凍結-解凍サイクルをせずに解析をした。
脳抽出調製物
5XFADマウス及びコントロールの脳半球、前頭皮質、海馬を解凍し、重さを量り、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Applied Science, Meylan, France）を有する、4倍量のトリス生理食塩水（50mM Tris-HCl pH=7.4、150mM NaCl）でホモジネートした。生じたホモジネート物を、20分間、54000×gで遠心して、上清（「溶解性分画」）を回収し、分注して-80℃で保存した。ペレットを、10倍量の、50mM Tris-HCl, pH = 7.6中の6M グアニジンHCl (guanidine HCl)の中で、短時間の超音波処理によって、再懸濁し、再度、20分間、26500×gで遠心した。上清（「非溶解性分画」）を分注し、-80℃で保存した（Morishima-Kawashima et al. (2000) Am. J. Pathol. 157:2093-2099）。
Aβ40及びAβ42の定量
Aβ40（ヒトアミロイド-β (1-40)アッセイキット、#27713）又はAβ42（ヒトアミロイド-β (1-42)アッセイキット、#27719）の投薬に関する、IBL International社（Hamburg, Germany）のELISAキットを、メーカーの説明に従って、使用した。反応を、Infinite 2000発光カウンター(Infinite 2000 luminescence counter)を使用して、620nm及び450nmで読み取った。得られた値を、BCAタンパク質アッセイ（Sigma-Aldrich）を使用して測定された、各サンプルのタンパク質濃度に標準化した。
免疫組織化学染色
30μmの厚さの切片を、ビブラトーム(vibratome)（Microm HM 650V, Thermo Scientific, Saint Herblain, France）を使用して切り、-20℃で、抗凍結剤培地中で保存した。アミロイド斑の標識のために、前頭皮質、海馬、及び内嗅皮質(entorhinal cortex)のフリーフローティング組織切片（ブレグマ(bregma)からの座標：前頭皮質=1.98mm、海馬=-1.94mm、内嗅皮質=-3.08mm）をPBS中でよく洗浄し、次いで、ブロッキング溶液（PBS; 3% BSA; 0.1% Triton X-100）中で1時間インキュベーションした。切片をヘキスト染料（1:1000, Life Technologies, Saint Aubin, France）を用いて、15分間染色して、細胞核を検出し、次いで、新たに調製したチオフラビンT溶液（#T3516-5G, Sigma-Aldrich）（終濃度：ブロッキング緩衝液中で0.01mg/ml）を用いて、15分間染色した。70%エタノール中で5分間洗浄後、サンプルをポリリジンスライド(poly-lysine slides)上に、カバーガラスとともに載せた。GFAP（glial fibrillary acidic protein；グリア線維性酸性タンパク質）染色に関して、フリーフローティング脳切片を、前述の通りにブロッキングし、ウサギ抗GFAPポリクローナル抗体（1:1000, Z0334, Dako, Les Ullis, France）とともに、4℃で、一晩、インキュベーションした。チオフラビンT染色、及び70%エタノールでの洗浄後、Alexafluor 594 ヤギ抗ウサギ二次抗体（1:1000, A11012, Life Technologies）を2時間加えた。前述のように、PBS洗浄及びマウンティングを実施した。
画像の取得及び解析
画像を、AxioImager Z1顕微鏡（Carl Zeiss S.A.S., Marly le Roi, France）を使用して取得した。チオフラビンT染色の解析は、盲検的に実施し、データは、同じ脳領域／動物由来の2～3つの組織切片中の1mm2あたりの粒子の平均個数として表す（Image J software）。GFAP発現を、Image J softwareを用いて定量し、結果を面積率(area fraction)として表す。
ノベルオブジェクト探索試験（Novel object recognition test）
マウスの認知能力を、ノベルオブジェクト探索(NOR)試験（Bevins and Besheer (2006) Nat. Protoc. 1:1306-1311）を使用して、試験した。動物を、試験開始前に、薬物処置の間、大規模に処理した。毎日、試験前に、少なくとも1時間の間、試験室に慣れさせた。試験は、薄暗い部屋に置かれたプレキシグラスボックス(Plexiglas box)（幅：35cm、長さ：20cm、高さ：20cm）中で実施した。1日目及び2日目に、10分間/日、各マウスを空のボックスに慣らした。3日目に、（プラスチック玩具で構築された）2つのオブジェクトを、反対の壁から5cm離れた、ケージに置いた。訓練期間の間、各動物を、2つのオブジェクトの間に、壁に向けて置き、次いで、5分間、オブジェクトを探索できるようにさせた。そして、マウスをホームケージに戻し、24時間後に、2つのオブジェクト(familiar)の1つが新しいもの(novel)に置き換えられた、5分間の試験期間を行った。試験全体はビデオ録画され、オブジェクト探索（マウスの鼻がオブジェクトと接触することよって費やされた時間、又は1cm以下(≦1cm)の距離でオブジェクトの匂いを嗅ぐことによって費やされた時間）を盲検的に測定した。2つのパラメータが考慮された：1)訓練期間の間に、動物が、2つの慣れたオブジェクトとふれあうことによって費やされた探索時間(sec)、及び2)試験の間に、動物が、総探索時間と比較して新しいオブジェクトとふれあうことによって費やされた時間（{novel/(familiar + novel)}×100）。識別指数も計算した（(novel - familiar)/(familiar + novel)）。
統計学的解析
全ての値は、平均±SEMとして表される。処置の有意な効果は、多重比較群の場合、ANOVA解析とそれに続くテューキーの事後検定(Tukey’s post hoc tests)によって決定した。全てのその他の場合には、対応のないスチューデントのt検定(unpaired Student's t test)を使用した。全ての統計学的試験に関して、P<0.05を有意であるとみなした。解析は、GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA)を用いて行った。
結果
5XFADの脳のアミロイド量に対するドネコプリドの効果
27匹の雌の5XFADマウス（B6/SJLの遺伝的バックグラウンド）を、この研究に使用した。2～4月齢のマウスに、2か月間、1週間に2回、腹腔内に、ビヒクル又は化合物（1mg/kg）を受けさせた。
溶解性及び非溶解性分画中の脳抽出物から、Aβ40及びAβ42を定量した。
得られた結果を、以下の表７（Table 6）に示す。
Figure 2022511365000009
表７（Table 6）に提示される、ビヒクル群の値は、以下の通りである：
溶解性分画：
・Aβ40 = 9.48 ± 1.08 μg/mgのタンパク質、
・Aβ42 = 0.24 ± 0.03 μg/mgのタンパク質；
非溶解性分画：
・Aβ40 = 0.68 ± 0.10 μg/mgのタンパク質、
・Aβ42 = 10.84 ± 0.73 μg/mgのタンパク質。
抗アミロイド効果
5XFADマウス脳の溶解性分画において、ドネコプリドの長期投与（1mg/kg、1週間に2回）は、Aβ40のレベルのいかなる変化なしに、Aβ42のレベルを有意に減少させることができた（一元配置分散分析とそれに続くテューキーの検定(Tukey’s tests)によって決定された*p < 0.05）。同様に、非溶解性分画において、ドネコプリドは、マウスの脳において、Aβ42量(laod)を減少させた。非溶解Aβ40のレベルは、薬剤による影響を受けなかった。
5XFADマウスにおける記憶、CFS中のアミロイド量、アミロイド斑、及びアストログリオーシスに対するドネコプリドの効果
28匹の雌の5XFADマウス（C57BL/6Jの遺伝的バックグラウンド）を、この研究で使用した。1～4月齢のマウスに、3か月間、1週間に2回、腹腔内に、ビヒクル又は化合物（1mg/kg）を受けさせた。
処置の最後に、マウスを、ノベルオブジェクト探索試験(NOR)で、長期記憶力に関して評価した。期間の間の間隔は、24時間であった。訓練期間中に、2つのオブジェクトのいずれかを探索しなかった、又は両方のオブジェクトを10秒未満の間で探索したマウスはいなかったので、全てのマウスをデータ解析に含めた。
抗健忘効果
1か月齢の雌の5XFAD及びWTの同腹子を、RS 67333、ビヒクル、又はドネコプリド（1mg/kg、3か月間、1週間に2回）を用いて処置し、その後、認識記憶を、ノベルオブジェクト探索(NOR)試験を用いて評価した。馴化期間を処置の最後の3日後に始めて、急性効果への妨害を避けた。訓練期間及び試験の間の間隔は、24時間であった。類似した探索時間及び有意でない識別指数によって示されるように、ビヒクルで処置されたマウスは、障害された記憶力を提示し、新規のオブジェクトと慣れたオブジェクトとを識別することができなかった。RS 67333処置は、ビヒクルで処置されたマウスと比較して、新規のオブジェクトの探索に充てられる時間のより高いパーセンテージによって示されるように、認知障害を元に戻す（慣れたオブジェクトに対して**p<0.01、2元配置分散分析(two-way ANOVA)とそれに続くシダックの検定(Sidak’s test)によって決定した）。同様に、ドネコプリドの長期処置は、記憶力の変化を防ぐことができた（慣れたオブジェクトに対して**p<0.01、2元配置分散分析とそれに続くシダックの検定によって決定した）。2つの化合物で処置された群の識別指数は、ゼロ、チャンスレベルとは異なった（対応のないスチューデントのt検定によって決定した）。訓練期間の間の総探索時間は、3つの群で有意に異ならず、ドネコプリドで処置された5XFADマウスにおける認識記憶の向上は、探索活動の増加に伴うものではないことを示した。
CSFにおけるアミロイド量
RS 67333又はドネコプリドで処置された（1mg/kg、3か月間、1週間に2回）5XFADマウスの脳脊髄液(CSF)中のAβ42濃度は、コントロールと比較して、有意には異ならず、長期の5-HT4受容体アゴニスト刺激は、CSF中のアミロイドレベルに影響を与えないことを示した（一元配置分散分析とそれに続くテューキーの検定によって決定した）。
抗アミロイド効果
前頭皮質、海馬、及び内嗅皮質を、5XFADマウスの脳（前頭部、正中部、及び尾側部）の代表領域、並びにアルツハイマー病によって初期に影響を受け、及びアミロイド沈着が高度に多いヒトの脳領域の代表領域として、解析した。
ドネコプリド処置（1mg/kg、3か月間、1週間に2回）は、ビヒクルと比較して、前頭皮質（16±3%の減少、ビヒクルと比較して**p<0.01）及び内嗅皮質（24±4%の減少、ビヒクルと比較して**p<0.01）において、アミロイド斑の数を有意に減少させた。RS 67333処置（1mg/kg、3か月間、1週間に2回）後、前頭皮質及び内嗅皮質のどちらにおいても、有意な効果は見られなかった。RS 67333又はドネコプリド（1mg/kg、3か月間、1週間に2回）で処置された5XFADマウスの海馬におけるアミロイド斑の数は、コントロールと比較して、有意には異ならなかった。統計は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの検定によって決定した。
抗炎症効果
アストログリアの免疫組織化学染色評価（抗GFAP抗体、グリア線維性酸性タンパク質）は、ドネコプリド及びRS 67333の長期処置（1mg/kg、3か月間、1週間に2回）が、アストログリオーシスを有意に減少させた（それぞれ、ビヒクルを受けたコントロールと比較して、処置を受けた動物の内嗅の脳切片において、GFAP染色の54±10%及び62±6%の減少）を示した。しかしながら、RS 67333又はドネコプリドを用いて処置（1mg/kg、3か月間、1週間に2回）された5XFADマウスの前頭皮質及び海馬におけるGFAP染色は、コントロールと比較して、有意には異ならなかった。統計は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの検定によって決定した。
結論
本研究は、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及び5-HT4受容体アゴニスト活性を有する化合物（ドネコプリド）が、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルである5XFADマウスへの長期処置後に、抗アミロイド効果（Aβ42レベル及びアミロイド斑の減少）及び抗炎症効果（アストログリオーシスの減少）を発揮することを実証する。これらの効果は、内嗅皮質及び前頭皮質において、主に顕著である。さらに、ドネコプリドの長期投与は、5XFADマウスにおいて、抗健忘効果を発揮し、記憶障害の出現を防止することができる。
これらの全ての効果は、RS 67333（参照として選択された5-HT4受容体アゴニスト）の効果と同等であり、場合によってはより高く、アルツハイマー病に対する有望な薬剤として、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性及び5-HT4受容体アゴニスト活性の組合せを指摘している。
実施例３
この実施例は、Aβ1-42損傷の存在下における、ラット初代海馬ニューロンに対する、RS67333（5-HT4受容体アゴニスト）及びドネペジルの相乗効果を示す。
相乗活性の調査の前に、研究の第一の段階において、各分子の効果を評価した。RS67333単独の効果を、Aβ（24時間曝露）を用いて損傷させた、ラット初代海馬ニューロンにおいて評価した。
第二の工程では、RS67333及びドネペジル（8つの濃度の混合化合物）の相乗効果を、Aβ（24時間曝露）を用いて損傷させた、ラット初代海馬ニューロンにおいて評価した。
材料及び方法
海馬ニューロンの初代培養
全ての実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に従って実施し、最新の欧州連合規則（指令2010/63/EU）に従った。承諾番号：A1301310。
ラット海馬ニューロンを、Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91:706-716に記載されるように培養した。簡潔には、妊娠17日の妊娠した雌のラット（Rats Wistar; Janvier Labs France）を、CO2チャンバー用いて深麻酔、及び頸椎脱臼を用いて、殺した。次いで、胎児を子宮から取り除き、直ぐに、2%ペニシリン(10000U/ml)及びストレプトマイシン(10mg/ml)溶液(PS)、並びに1%ウシ血清アルブミン(BSA)を有する、よく冷えたL15 Leibovitz培地に置いた。海馬を、終濃度が0.05%のトリプシン及び0.02%のEDTAの、トリプシン-EDTA溶液で、20分間、37℃で処理した。解離は、DNAse IグレードII（終濃度0.5mg/ml）及び10%のウシ胎児血清(FCS)を含む、4.5g/lのグルコースを有するダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)を加えることによって、停止させた。細胞を、10-mlピペットのチップを3回強制的に通過させることによって、機械的に解離させた。
その後、細胞を、4℃で10分間、515×gで遠心した。上清を捨て、ペレットを、2%のB27サプリメントの溶液、2mmol/lのL-グルタミン、2%のPS溶液、及び10ng/mlの脳由来神経栄養因子(BDNF)を有する、Neurobasal培地からなる規定培養培地中に再懸濁した。生存している細胞を、トリパンブルー色素排除試験を使用して、ノイバウアー血球計算器中でカウントした。細胞を、ポリ-L-リシンでプレコートされた96ウェルプレート中に、1ウェルあたり20000個の密度で蒔き、空気(95%)-CO2(5%)インキュベーター中で、37℃で培養した。
培地は、2日毎に交換した。96ウェルプレートに関して、60ウェルのみを使用した。最初及び最後の行及び列のウェルは、（あらゆるエッジ効果を避けるために）使用せず、滅菌水で満たした。
試験化合物及びヒトAβ1-42曝露
プレインキュベーション：培養17日目に、Aβ曝露前に、化合物を培養培地中に溶解し、1時間、初代海馬ニューロンとともにプレインキュベーションした。
損傷：海馬ニューロンを、培養の17日後に、Aβ1-42溶液（以下を参照）に曝露した。Aβ1-42調製は、Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91:706-716に記載される方法に従って行った。この研究に使用したAβ1-42のバッチ番号は、10%のオリゴマーを含む（Combes et al. (2015) J. Neurosci. Res. 93:633-643で実施されたようにWBによって定量）。簡潔には、Aβ1-42ペプチドを、上述した規定培養培地中に、40μmol/lの初期濃度で溶解した。この溶液を、暗い中で、3日間、37℃で、静かに攪拌し、培養培地中で適切に希釈して、使用される濃度（2μmol/l又は0.25μmol/lのオリゴマー(AβO)にそれぞれ対応する、20μmol/l又は2.5μmol/l）にした後、直ぐに使用した。Aβ1-42の調製物を加えて、化合物の存在下で、コントロール培地に希釈されて、20又は2.5μmol/lの終濃度（＝自動ウェスタンブロットで評価された、2μmol/l又は0.25μmol/lのAβO）にした。
培養プレートの構成
化合物を、96ウェルプレート中での1つの培養で試験した（1条件あたり6ウェル）。化合物は、Aβ1-42の適用の1時間前に、プレインキュベーションした。以下の条件を評価した。
Figure 2022511365000010
エンドポイント評価
中毒の24時間後、上清を取り出し、直ちに、将来の解析的分析のために、凍結した。上清は、-20℃で、最大6か月保存した。その後、海馬ニューロンを、エタノール(95%)及び酢酸(5%)の冷えた溶液で、5分間、-20℃で固定した。海馬ニューロンを、PBS中で再度2回洗浄し、次いで、0.1%のサポニン及び1%のFCSを含むPBSの溶液を使用して、15分間、室温で、透過処理し、非特異的部位をブロックした。
免疫染色：MAP-2/AT100‐固定及び透過処理後、細胞を、
‐1%のウシ胎児血清及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/1000に希釈された、ニワトリの抗微小管関連タンパク質2(MAP-2)ポリクローナル抗体（この抗体は、細胞体及び神経突起を特異的に染色し、神経細胞死及び神経突起ネットワークの研究を可能にする）；及び
‐1%のウシ胎児血清及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/100に希釈された、マウスの抗ホスホタウモノクローナル抗体(AT100)
とともに、2時間、インキュベーションした。
これらの抗体を、室温で、1時間、1%のFCS及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/400に希釈された、Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG、及びAlexa Fluor 568ヤギ抗ニワトリIgGを用いて、明らかにした。
各条件に関して、1ウェルあたり30個の写真（全てのウェル領域の代表）を、ImageXpress (Molecular Devices社)を使用して、20×の倍率で、取得した。全ての画像は、同じ取得パラメータを用いて、作製した。画像から、解析を、Custom Module Editor（登録商標）（Molecular Devices社）によって直接的及び自動的に実施した。以下の読出しを調査した：
-ニューロンの総数（ニューロンの生存、MAP-2陽性ニューロンの数）
-神経突起ネットワーク（MAP-2陽性ニューロンのμmにおける）
-AT100の領域（μm2、MAP-2陽性ニューロンとの重なり）。
免疫染色：PSD95及びSYN‐固定及び透過処理後、細胞を、
‐1%のウシ胎児血清及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/200に希釈された、マウス抗PSD95（95kDaのシナプス後肥厚部）モノクローナル抗体；
‐1%のウシ胎児血清及び0.1%のサポニンを含むPBS中で1/100に希釈された、ウサギ抗シナプトフィジン(SYN)ポリクローナル抗体
とともに、2時間、インキュベーションした。
これらの抗体を、室温で、1時間、1%のFCS、0.1%のサポニンを含むPBS中で1/400に希釈された、Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG、及びAlexa Fluor 568ヤギ抗ウサギIgGを用いて、明らかにした。
各条件に関して、1ウェルあたり40個の写真を、ImageXpress (Molecular Devices社)を使用して、40×の倍率で、取得した。全ての画像を同じ条件を用いて取得した。シナプス評価を、Custom Module Editor（登録商標）（Molecular Devices社）を使用することによって、自動的に実施した。以下のエンドポイントを評価した：
‐（PSD95/SYN間で重なっている）シナプスの数。
統計学的解析
全ての値は、平均±SEM（standard error of the mean；平均値の標準誤差）として表される。統計学的解析は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの検定(Dunnett’s test)又はLSDフィッシャーの検定(LSD Fisher’s test)によって実施した。p<0.05を有意であるとみなした。
結果
この研究は、RS67333とドネペジルとの間の潜在的な相乗作用を研究するように設計した。本研究の第一の工程は、選択されたパラメータ（ニューロンの生存、神経突起ネットワークのインテグリティ、タウの過剰リン酸化、シナプスの保護）における、最も低い活性用量を同定することを目的とした。本研究の第二の工程は、同じパラメータ（ニューロンの生存、神経突起ネットワークのインテグリティ、タウの過剰リン酸化、シナプスの保護）における、RS67333とドネペジルの不活性用量の異なる組合せを試験するように設計した。
Aβ 1-42を用いて損傷した海馬ニューロンに対するRS67333の効果
Aβ 1-42損傷は、神経突起ネットワークの喪失、タウの過剰リン酸化、及びシナプスの喪失とともに、海馬ニューロンの喪失を誘導する。
RS67333は、ニューロンの生存（図１Ａ）、総神経突起ネットワーク（図１Ｂ）、1つのニューロンあたりの神経突起の平均の長さ（図１Ｃ）、タウの過剰リン酸化（図１Ｄ）、及びシナプスの喪失（図１Ｅ）における、保護効果を示した。最も低い活性用量は、
・ニューロンの生存： 50nM
・神経突起ネットワーク： 10nM
・タウの過剰リン酸化： 1nM
・シナプス： 1nM
であった。
このモデルにおけるドネペジルの最も低い活性用量は、1nMであった（表９(Table 7)）。
Figure 2022511365000011
本研究の第一の工程で生じた結果に従って、RS67333とドネペジルの以下の組合せを、Aβ 1-42を用いて損傷した海馬ニューロンの初代培養に適用した。
Figure 2022511365000012
Aβ 1-42を用いて損傷した海馬ニューロンにおけるRS67333とドネペジル間の相乗作用
Aβ 1-42ペプチドの神経毒性を、全てのパラメータについて確認し、全てのパラメータにおいて、工程１で見られた損傷と同様の程度であった（図２を参照）。
RS67333とドネペジルの不活性用量のいくつかの組合せは、神経を保護した：
・ニューロンの生存が、組合せ#6（10pMのドネペジル及び1nMのRS67333）によって向上した。
・組合せ#4～#8は、神経突起ネットワークの総長を有意に向上することができた。最大効果は、組合せ#6（10pMのドネペジル及び1nMのRS67333）で見られた。興味深いことに、組合せ#6及び#8は、1つのニューロンあたりの神経突起の平均の長さを向上させた。
・ほとんどすべての組合せ（#2から#8）が、AT100エピトープにおける、タウの過剰リン酸化を減少させることができた。最大効果は、組合せ#6（10pMのドネペジル及び1nMのRS67333）で見られた。
・組合せ#6及び#7は、Aβ 1-42損傷からシナプスを保護した。
考察
本研究の目的は、アルツハイマー病のin vitroモデルにおけるRS67333とドネペジル間の潜在的な相乗作用を同定することであった。表１１(Table 8)は、相乗作用の結果をまとめている。
Figure 2022511365000013
上述した結果に従って、以下の結論を下すことができる：
・工程１：
‐タウの過剰リン酸化における、RS67333の最も低い活性濃度は、1nMであった。RS67333の最も低い神経保護（ニューロンの生存）濃度は、50nMであった。
‐ドネペジルの最も低い活性濃度は、1nMであった。
・工程２
‐RS67333とドネペジルとの組合せは、全ての調査したパラメータにおいて、明らかな相乗効果を示した。
‐RS67333とドネペジルとの相乗効果は、ドネペジルの第一の活性用量を用いて得られる効果よりも優れている：
ニューロンの生存（相乗作用：80%生存；ドネペジル単独：75%）
神経突起ネットワーク（相乗作用：80%生存；ドネペジル単独：75%）
AT100（相乗作用：141%；ドネペジル単独：165%）。
要するに、この研究の結果は、アルツハイマー病のin vitroモデルにおける、RS67333とドネペジルとの間の相乗作用を、明確に実証した。

Claims (14)

  1. アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び5-HT4受容体アゴニストを含む、神経変性疾患の防止及び／又は治療において、神経保護剤として使用するための、医薬組成物。
  2. アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジル、リバスチグミン、タクリン、及びガランタミンからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジルである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 5-HT4受容体アゴニストが、プルカロプリド、シサプリド、ダゾプリド、モサプリド、レンザプリド、ナロナプリド、ザコプリド、ベルセトラッグ、テガセロッド、メトクロプラミド、シニタプリド、YM-53389、RS-67333、5-メトキシトリプタミン(5-MT)、RS-56532、ML-10302、SSP-002392、BIMU-8、及びDA-6886からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 5-HT4受容体アゴニストが、RS-67333である、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症を含む運動ニューロン疾患、ダウン症候群、前頭側頭型変性症からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 神経変性疾患の防止及び／又は治療において、神経保護剤として同時に、別々に、又は連続して使用するための、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及び5-HT4受容体アゴニストを含む、神経保護の医薬的組合せ物。
  8. アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジル、リバスチグミン、タクリン、及びガランタミンからなる群から選択される、請求項７に記載の神経保護の医薬的組合せ物。
  9. アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジルである、請求項７又は８に記載の神経保護の医薬的組合せ物。
  10. 5-HT4受容体アゴニストが、プルカロプリド、シサプリド、ダゾプリド、モサプリド、レンザプリド、ナロナプリド、ザコプリド、ベルセトラッグ、テガセロッド、メトクロプラミド、シニタプリド、YM-53389、RS-67333、5-メトキシトリプタミン(5-MT)、RS-56532、ML-10302、SSP-002392、BIMU-8、及びDA-6886からなる群から選択される、請求項７から９のいずれか一項に記載の神経保護の医薬的組合せ物。
  11. 5-HT4受容体アゴニストが、RS-67333である、請求項７から１０のいずれか一項に記載の神経保護の医薬的組合せ物。
  12. 神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症を含む運動ニューロン疾患、ダウン症候群、前頭側頭型変性症からなる群から選択される、請求項７から１１のいずれか一項に記載の神経保護の医薬的組合せ物。
  13. 神経変性疾患の防止及び／又は治療において、神経保護剤として、5-HT4受容体アゴニストと組合せて使用するための、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
  14. 神経変性疾患の防止及び／又は治療において、神経保護剤として、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤と組合せて使用するための、5-HT4受容体アゴニスト。
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