JP2022506081A - ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を含む代謝的健康のためのプロバイオティクス補助食品 - Google Patents

Abstract

本出願は、哺乳動物対象の代謝的健康に対する有益な効果を有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を開示する。さらに開示されるのは、哺乳動物対象における代謝的健康を改善するための、又は血糖値を低下させるための、こうした株を含む組成物及びその使用である。

Description

生物材料の寄託への言及
本出願は、生物材料の寄託への言及を含有し、その寄託は、参照によって本明細書に組み込まれる。完全な情報については、説明の最後の段落を参照のこと。

本発明は、哺乳動物対象の代謝的健康を改善する能力を有する、細菌株、細胞成分、代謝産物、及びその分泌分子に関する。本出願はまた、哺乳動物対象の代謝的健康を改善するための、こうした細菌株を含む組成物、及びこうした組成物の使用に関する。

近年、細菌が、哺乳動物、特にヒトの健康に対する重要且つかなりの影響を有することが何度も示されてきており、また、胃腸内の有益な微生物叢が、適切な栄養摂取及び健康な状態にとって重要であることが認識されている。

プロバイオティクスとも称される培養微生物又は微生物株の摂取は、今では、培養微生物又は微生物株を使用して個人の健康を改善する方法と認識されている。この文脈では、また説明及び特許請求の範囲全体を通して、プロバイオティクス、培養微生物、及び微生物株という用語は、一般に認められている様式で、「適切な量で投与された場合に宿主に健康上の利益を与える、生きている微生物」と理解される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１４．６６？ｆｏｘｔｒｏｔｃａｌｌｂａｃｋ＝ｔｒｕｅ）。

微生物株は、個人における思わしくない健康状態を改善する目的と、思わしくない健康状況が生じることを予防する目的の両方に使用することができる。

プロバイオティクスの有益な性質は、プロバイオティクスを形成する微生物株の性質に依存するので、その株をプロバイオティクスとして使用することを可能にする有益な性質を有する新規の微生物株を提供することが重要である。

第１の態様では、本発明は、哺乳動物対象の代謝的健康を改善する、例えば前糖尿病を緩和する能力を有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株に関する。さらなる態様又は代替の態様では、本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、哺乳動物対象における血糖値を低下させる能力を有する。本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、例えば、ＤＳＭＺ－“Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ”に、寄託番号：ＤＳＭ １７６４８、ＤＳＭ ３２８５１、ＤＳＭ ３２８５３、ＤＳＭ ３２９１０、及び／又はＤＳＭ ３２９１１で寄託された株であり得る。

第２の態様では、本発明は、好ましくは別々の投薬用製剤に製剤化された、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む組成物に関する。

第３の態様では、本発明は、哺乳動物対象における代謝的健康の改善、例えば前糖尿病を緩和させることのための、又は正常な血糖値の維持、及び／又は個人における食後血糖応答を低下させる、インスリン抵抗性を予防又は緩和させるための、又は高脂肪及び／又は高糖質食を有する個人における体重増加を予防する又は緩和するための、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む組成物の使用に関する。

最後に、本発明の第４の態様では、哺乳動物対象の代謝的健康を改善する、例えば前糖尿病を緩和させる能力を有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株についてスクリーニングするための方法に関する。

ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と共に２４時間インキュベートされた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の上清中の、Ｌｕｍｉｎｅｘ又はＥＬＩＳＡによって測定される抗炎症性サイトカイン・インターロイキン１０（ＩＬ１０）と炎症促進性サイトカイン・インターロイキン１２（ＩＬ１２）との比を表す棒グラフを示す。各カラムは、健常なＰＢＭＣドナーで実施された３つの実験の平均を表す。より詳しくは、実施例２を参照のこと。 炎症促進性刺激（リポ多糖）で刺激され、且つラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と共に２４時間インキュベートされたＰＢＭＣの上清中の、Ｌｕｍｉｎｅｘによって測定される炎症促進性サイトカイン・単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）を表す棒グラフを示す。各カラムは、健常なＰＢＭＣドナーで実施された３つの実験の平均を表す。より詳しくは、実施例２を参照のこと。 炎症促進性刺激（リポ多糖）で刺激され、且つラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と共に２４時間インキュベートされたＰＢＭＣの上清中の、Ｌｕｍｉｎｅｘによって測定される、炎症促進性のオステオポンチンを表す棒グラフを示す。各カラムは、健常なＰＢＭＣドナーで実施された３つの実験の平均を表す。より詳しくは、実施例２を参照のこと。 炎症促進性環境中の樹状細胞（ＤＣ）によって分泌されたサイトカインを示す棒グラフを示す。各カラムは、ｎ＝１～３の平均を表す。Ａ：ＭＣＰ－１；Ｂ：オステオポンチン；Ｃ：ＩＬ１２ｐ７０。上清を、遠心分離によって回収し、マルチプレックスアッセイを使用するサイトカイン分析に使用した。より詳しくは、実施例３を参照のこと。 ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、及びＴＮＦα＋ＩＦＮγ＋ＬＰＳ（カクテル）から構成される低悪性度炎症性カクテルと共に２４時間インキュベートされたＤＣ培養物の上清中の、ＢＤ（商標）細胞数測定ビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ）（ＣＢＡ）によって測定される、抗炎症性サイトカイン・インターロイキン１０（ＩＬ１０）と炎症促進性サイトカイン・インターロイキン１２ｐ７０（ＩＬ１２ｐ７０）との比を表す棒グラフを示す。データは、各ドナーからのカクテル対照に対して規準化される。ＤＣは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）と共に４時間培養し、その後、カクテルを添加し、１６時間維持した。カクテル対照は、カクテルと共に１６時間培養されたＤＣである。各カラムは、個々の健常なヒトＰＢＭＣドナーからの単球由来ＤＣで実施された１２回の実験の比を表す。 ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びＴＮＦα＋ＩＦＮγ＋ＬＰＳ（カクテル）から構成される低悪性度炎症性カクテルと共にインキュベートされたＤＣ培養物の上清中の、ＢＤ（商標）細胞数測定ビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ）（ＣＢＡ）によって測定される、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１／ＣＣＬ２）の平均濃度を表す棒グラフを示す。ＤＣは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）と共に４時間培養し、その後、カクテルを添加し、１６時間維持した。カクテル対照は、カクテルと共に１６時間培養されたＤＣである。各カラムは、健常なヒトＰＢＭＣドナーからの単球由来ＤＣで実施された１２回の実験の平均を表す。 ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びＴＮＦα＋ＩＦＮγ＋ＬＰＳ（カクテル）から構成される低悪性度炎症性カクテルと共にインキュベートされたＤＣ培養物の上清中の、ＢＤ細胞数測定ビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ）（ＣＢＡ）によって測定される、サイトカイン・インターロイキン６（ＩＬ６）の平均濃度を表す棒グラフを示す。ＤＣは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）と共に４時間培養し、その後、カクテルを添加し、１６時間維持した。カクテル対照は、カクテルと共に１６時間培養されたＤＣである。各カラムは、健常なヒトＰＢＭＣドナーからの単球由来ＤＣで実施された１２回の実験の平均を表す。 ２４時間のインキュベーション後の、５という感染多重度（ＭＯＩ）での、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の、上皮細胞株Ｃａｃｏ２のバリアの強度に対する効果を示す。この効果は、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）技術を使用して測定され、ＴＥＥＲ比として表される。ＴＥＥＲ比は、Ａ．炎症促進性刺激の非存在下で、及びＢ．炎症促進性刺激の存在下で測定した。より詳しくは、実施例５を参照のこと。 ５というＭＯＩでの、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、及びＴＮＦ－アルファ（ＴＮＦα）及びＩＮＦ－ガンマ（ＩＮＦγ）からなる炎症促進性カクテルの存在下及び非存在下での、２４時間のインキュベーション後の、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の、上皮細胞株Ｃａｃｏ２のバリアの強度に対する効果を示す。Ａ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＨＨ０２のＴＥＥＲ比。２～３／群の平均。Ｂ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＨＨ０４のＴＥＥＲ比。２～３／群の平均。Ｃ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＨＨ０５のＴＥＥＲ比。２～３／群の平均。 ５００という感染多重度（ＭＯＩ）での、上皮細胞Ｃａｃｏ２との２４時間の共インキュベーション後の、－２０℃、４℃、２５℃、及び４０℃で１か月間保管された凍結乾燥されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２及びＨＨ０４の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を示す。Ａ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２のＴＥＥＲ比。３～４／群の平均。Ｂ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０４のＴＥＥＲ比。３～４／群の平均。 腸内での低糖質摂取（塗りつぶされた点）又は高糖質摂取（７ｍＭフルクトース、塗りつぶされた逆三角形）をシミュレーションする実験設定における、又は側底側での全身的な高グルコース（７ｍＭグルコース、塗りつぶされた三角形）を模倣する状況における、又は両方の組み合わせ（塗りつぶされた正方形）における、５というＭＯＩでの、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２及びＨＨ０４の、上皮細胞株Ｃａｃｏ２の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）に対する影響を示す。培地対照は、白抜きの円として表される。効果は、２４時間のインキュベーション時間にわたる連続的なＴＥＥＲ値として表される。Ａ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２についてのＴＥＥＲ値。１～３／群の平均。Ｂ）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０４についてのＴＥＥＲ値。１～３／群の平均。 シミュレーションされた胆汁酸塩液中の乳酸菌（ＬＡＢ）によって消費された胆汁酸塩濃度を表す棒グラフを開示する。各カラムは、１つの実験を表す（ｎ＝１）。より詳しくは、実施例７を参照のこと。 ＹＤＡ培地中で培養されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の無細胞増殖ブロスと共にインキュベートされたＬ細胞（ＮＣＩ－Ｈ７１６）によって放出されたグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）の平均濃度を表す棒グラフを示す。各試験試料を、１０倍及び５０倍希釈し、ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞に２時間添加した。各カラムは、５回のそれぞれの実験の平均を表す。より詳しくは、実施例８を参照のこと。 無細胞培養増殖ブロス（１：１０及び１：５０希釈）、新鮮な培養ブロス（１：１０及び１：５０希釈）、及び１０μＭ ＰＭＡ陽性対照との２時間のインキュベーション後の、ＮＣＩ－Ｈ７１６生存率（％）を表す棒グラフを示す。細胞を、Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ溶液に添加し、２５分間インキュベートし、その後、５６７ｎｍ（励起）／５８７ｎｍ（発光）でＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ蛍光を測定した。各カラムは、５回のそれぞれの実験の平均を表す。 マウスにおける炎症（大腸炎）の急性モデルにおける各群の動物についての、平均体重（第－６日の体重に対する％）を表す折れ線グラフを示す。各線は、実験の過程を通した各治療に相当する（ｎ＝１１～１５）。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株治療は、第－５日に開始した。より詳しくは、実施例９を参照のこと。 マウスにおける炎症（大腸炎）の急性モデルにおける各治療群のＷａｌｌａｃｅスコア（生の結腸損傷スコア）を表す棒グラフを示す。各カラムは、ｎ＝１１～１５の平均を表す。結腸を炎症について評価し、等級付けを、光学顕微鏡を使用して肉眼によって実施して、結腸の外観を評価した。これは、Ｗａｌｌａｃｅスコア化方法に基づいて、２人の盲検化された観察者によって行った。結腸損傷のスコア化の基準は、以下であった：０－損傷なし；１－充血．潰瘍なし；２－充血及び腸管壁の肥厚．潰瘍なし；３－腸管壁の肥厚を伴わない１つの潰瘍；４．－潰瘍形成又は炎症の２つ以上の部位；５．－潰瘍形成及び炎症の２つ以上の重大な部位、又は結腸の長さに沿って１ｃｍを超えて広がる潰瘍形成／炎症の１つの部位、並びに６～１０－損傷が結腸の長さに沿って２ｃｍを超えて広がるならば、それぞれの追加の１センチメートルに対して、スコアは１増大する。より詳しくは、実施例９を参照のこと。 マウスにおける炎症（大腸炎）の急性モデルにおける各治療群の、平均の結腸湿重量（ｇ）／長さ（ｃｍ）を表す棒グラフを示す。各カラムは、ｎ＝１１～１５の平均を表す。より詳しくは、実施例９を参照のこと。 マウスにおける炎症（大腸炎）の急性モデルにおける結腸組織におけるサイトカインを表す棒グラフを示す。各カラムは、ｎ＝１１～１５の平均を表す。Ａ：ＴＮＦα；Ｂ：ＩＬ１ｂ；Ｃ：ＩＬ６；Ｄ：ＩＬ１７Ａ、Ｅ：ＩＬ２５、Ｆ：ＩＬ１２、及びＧ：ＩＬ１０。より詳しくは、実施例９を参照のこと。 治療の微生物組成（種レベル）に対する効果を視覚化するＰＣＡプロットを示す。 治療関連の変動（パーセント）を示す。この解析は、属レベルで行った。 実施例１０に記載するマウス研究の研究概要を示す。 食餌誘導性（ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ）肥満マウス（ＤＩＯ）モデルにおける重量推移及び体組成に対する、ＨＨ０４及びＨＨ０５の効果を示す。１０～１２匹のマウス／群の平均を示す。Ａ）無作為化後の重量。Ｂ）実験食及び強制経口投与治療の開始後の実験群における重量推移。Ｃ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、総重量に対する％としての体脂肪量。Ｄ）Ｃと同様だが、接続線と共に群平均として表したもの。Ｅ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、総重量に対する％としての除脂肪量。Ｆ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、総重量に対する％としての流体質量。より詳細は、実施例１０において参照することができる。 ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株のグルコース調節及び腸管透過性に対する効果を示す。Ａ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食の血糖。バー：１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｂ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食のインスリンレベル。バー：１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｃ、Ｅ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食マウスにおける経口グルコース負荷試験。Ｃは負荷（２μｇ／ｇ（除脂肪量））中の血糖値を表し、Ｅは、グルコース負荷に応答する内因性インスリンの血漿中濃度を表す。１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｄ）ＯＧＴＴ第１０週についての曲線下面積。バー：１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｆ）ＧＳＩＳ第１０週についての曲線下面積。バー：１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｇ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食マウスにおける経口負荷（１５０μＬ／マウス、濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）後の血漿スルホン酸蛍光単位。１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｈ）１２週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療中の累積的食餌摂取／マウス。同一ケージ収容により、摂取は、各群における、ｎ＝４を伴うケージあたりのマウス１匹あたりの平均である。バー：平均。Ａ～Ｇ）すべてのマウスは、経口負荷の３時間前に、そのそれぞれの治療での強制経口投与が行われた。この研究についてのより詳細は、実施例１０において参照することができる。 ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の、食餌誘導性肥満マウスモデルにおける組織重量又は長さに対する効果を示す。バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ａ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の肝臓の重量。Ｂ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の結腸の長さ。バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均を示す。Ｃ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）の重量。Ｄ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）の重量。この研究についてのより詳細は、実施例１０において参照することができる。 ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の、食餌誘導性肥満マウスモデルにおける組織重量に対する効果を示す。バーは、１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の、１０～１２匹のマウス／群の平均を表す。Ａ）後腹膜白色脂肪組織（ｒｐＷＡＴ）の重量。Ｂ）間葉系白色脂肪組織（ｍＷＡＴ）の重量。Ｃ）脳の重量。Ｄ）心臓の重量。この研究についてのより詳細は、実施例１０において参照することができる。 ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の、食餌誘導性肥満マウスモデルにおける血漿マーカーに対する生化学的分析を示す。Ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ。Ｂ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ。Ｃ．１）トリグリセリド（すべての動物が含まれる）。Ｃ．２）トリグリセリド（ここでは、特定のアッセイの検出限界の外であると評価された後に、２匹の動物が除外された）。Ｄ）総コレステロール。各バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均を表す。この研究に関するより詳細は、実施例１０において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウスモデルにおける血漿マーカーに対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株効果の結果を示す。Ａ）血清アミロイドＡ。Ｂ）アディポネクチン。Ｃ）非エステル化脂肪酸。Ｄ）リポ多糖。Ａ～Ｅ）各バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均を表す。この研究に関するより詳細は、実施例１０において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウスモデルにおける肝臓脂質蓄積に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株効果の結果を示す。Ａ）肝臓あたりのｍｇとしての、肝組織におけるトリグリセリド含有量、及びＢ）肝臓あたりのｍｇとしての、肝組織におけるコレステロール。各バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。この研究に関するより詳細は、実施例１０において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウスモデルにおける結腸サイトカインに対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株効果の結果を示す。Ａ）結腸組織におけるサイトカイン・インターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベル、及びＢ）結腸組織におけるサイトカイン・インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）レベル。各バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。この研究に関するより詳細は、実施例１０において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウスモデルにおける腸内微生物叢組成に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株効果の結果を示す。Ａ）糞便試料中に見られるＨＨ０４ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株からのＤＮＡ。Ｂ）小腸内容物中に見られるＨＨ０４プロバイオティクス株からのＤＮＡ。Ｃ）糞便試料中に見られるＨＨ０５ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株からのＤＮＡ。Ｄ）小腸内容物中に見られるＨＨ０５ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株からのＤＮＡ。 Ｅ）示された群内の研究終了からの糞便微生物叢組成をクラスター化する重み付けされたＵｎｉＦｒａｃ距離を使用する主座標分析（ＰＣｏＡ）。より大きい点は、１０～１２匹のマウス／群の群平均を示す。Ｆ）示された群内の研究終了からの小腸微生物叢組成をクラスター化する重み付けされたＵｎｉＦｒａｃ距離を使用する主座標分析（ＰＣｏＡ）。より大きい点は、１０～１２匹のマウス／群の群平均を示す。この研究に関するより詳細は、実施例１０において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウス（ＤＩＯ）モデルにおける重量推移及び体組成に対する、ＨＨ０４、ＨＨ０５、及びＨＨ０２の効果を示す。１０～１２匹のマウス／群の平均を示す。Ａ）無作為化後の重量。Ｂ）実験食及び強制経口投与治療の開始後のそれぞれの群における重量推移。Ｃ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、総重量に対する％としての体脂肪量。Ｄ）接続線と共に群平均として表される、グラムとしての体脂肪量推移。Ｅ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、グラムとしての除脂肪量。Ｆ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、体重に対する％としての流体質量。より詳細は、実施例１１において参照することができる。 ＨＨ０４、ＨＨ０５、及びＨＨ０２のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の、グルコース調節に対する効果を示す。Ａ）１０週の改変されたＷＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食の血糖。バー：１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｂ）１０週の改変ＷＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食のインスリンレベル。Ｃ）負荷（１．５μｇデキストロース／ｇ（除脂肪量））中の、１０週の改変ＷＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食マウスにおける経口グルコース負荷試験。Ｄ）Ｃと同様だが、負荷中の血糖の空腹時の値からの変化を示す。Ｅ）グルコース負荷に応答する内因性インスリンの血漿中濃度。Ｆ）負荷中の血漿におけるＣ－ペプチドレベル。Ａ～Ｆ）データは、１０～１２匹のマウス／群の平均を表す。この研究に関するより詳細は、実施例１１において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウスモデルにおける、ＨＨ０４、ＨＨ０５、及びＨＨ０２のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の、組織重量に対する効果を示す。バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ａ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の肝臓の重量。Ｂ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）の重量。Ｃ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の後腹膜白色脂肪組織（ｒｐＷＡＴ）の重量。Ｄ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の間葉系白色脂肪組織（ｍＷＡＴ）の重量。Ｅ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の肩甲骨間褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の重量。Ｆ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の腓腹筋の重量。この研究に関するより詳細は、実施例１１において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウスモデルにおける血漿マーカーに対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株効果の結果を示す。Ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ。Ｂ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ。Ｃ）トリグリセリド。Ｄ）総コレステロール。Ａ～Ｄ）各バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均を表す。この研究に関するより詳細は、実施例１１において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウスモデルにおける肝臓脂質蓄積に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株効果の結果を示す。Ａ）肝臓（ｍｇ）あたりのμｇとしての、肝組織におけるトリグリセリド含有量、及びＢ）肝臓（ｍｇ）あたりのμｇとしての、肝組織におけるコレステロール。Ｃ）ウエスタンブロットによって定量化される、インスリン刺激されたマウスの肝組織における、リン酸化された（活性化された）Ａｋｔタンパク質レベルの総Ａｋｔタンパク質レベルに対する比。Ａ～Ｂ）各バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ｃ）各バーは、３～４匹のマウス／群の平均値を表す。この研究に関するより詳細は、実施例１１において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウスモデルにおける、肝臓及び結腸組織炎症に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株効果の結果を示す。Ａ）肝組織における腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）レベル及びＢ）肝組織におけるサイトカイン・インターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベル、Ｃ）結腸組織における腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）レベル、Ｄ）結腸組織におけるサイトカイン・インターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベル。Ａ～Ｄ）各バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。この研究に関するより詳細は、実施例１１において参照することができる。 食餌誘導性肥満マウスモデルにおける、腸内微生物叢組成に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株効果の結果を示す。示された群内の研究終了からの糞便微生物叢組成をクラスター化する重み付けされたＵｎｉＦｒａｃ距離を使用する主座標分析（ＰＣｏＡ）。より大きい点は、１０～１２匹のマウス／群の群平均を示す。この研究に関するより詳細は、実施例１１において参照することができる。 ２つの食餌誘導性肥満マウス（ＤＩＯ）モデルにおける、重量推移及び体組成に対するＨＨ０４、ＨＨ０５、及びＨＨ０２の効果を示す。８～９匹のマウス／群の平均を示す。Ａ）ＬＦＤ又はＨＦＤを与えられたマウスについての、無作為化後の重量。Ｂ）ＬＦＤ又は改変されたＷＤを与えられたマウスについての、無作為化後の重量。Ｃ）実験食及び強制経口投与治療の開始後の、ＬＦＤ又はＨＦＤを与えられたそれぞれの群における重量推移。Ｄ）Ｃと同様だが、ＬＦＤ又は改変されたＷＤを与えられた群におけるもの。Ｅ）ＬＦＤ又はＨＦＤを与えられた群についての、表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られた総重量に対する％としての体脂肪量。Ｆ）Ｅと同様だが、ＬＦＤ又は改変されたＷＤを与えられた群におけるもの。Ｇ）ＬＦＤ又はＨＦＤを与えられた群についての、接続線と共に群平均として表される、グラムとしての体脂肪量推移。Ｈ）Ｇと同様だが、ＬＦＤ又は改変ＷＤを与えられた群についてのもの。Ｉ）ＬＦＤ又はＨＦＤを与えられた群についての、表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、グラムとしての除脂肪量。Ｊ）Ｉと同様だが、ＬＦＤ又は改変ＷＤを与えられた群についてのもの。Ａ～Ｊ）より詳細は、実施例１２において参照することができる。 グルコース調節に対するＨＨ０４、ＨＨ０５、及びＨＨ０２のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果を示す。Ａ）１０週の改変されたＬＦＤ又はＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食の血糖。Ｂ）Ａと同様だが、ＬＦＤ又は改変ＷＤを与えられた群についてのもの。Ｃ）１０週のＬＦＤ又はＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食のインスリンレベル。Ｄ）Ｃと同様だが、ＬＦＤ又は改変ＷＤ給餌についてのもの。Ｅ）１０週の毎日の強制経口投与治療及びＬＦＤ又はＨＦＤの給餌後の、経口グルコース負荷試験中の空腹時の値からの血糖の変化。Ｆ）Ｅと同様だが、ＬＦＤ又は改変ＷＤを与えられた群を表すもの。Ｇ）ＬＦＤ又はＨＦＤを与えられた群における、グルコース負荷に応答する内因性インスリンの血漿中濃度。Ｈ）Ｇと同様だが、ＬＦＤ又は改変ＷＤを与えられた群を表すもの。Ｉ）ＬＦＤ又はＨＦＤを与えられた群における、負荷中の血漿中のＣ－ペプチドレベル。Ｊ）Ｉと同様だが、ＬＦＤ又は改変ＷＤを与えられた群。Ａ～Ｊ）バーは、８～９匹のマウス／群の平均値を表す。この研究に関するより詳細は、実施例１２において参照することができる。

ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株
本発明は、哺乳動物対象の代謝的健康を改善する、例えば前糖尿病を緩和する能力を有する、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、細胞成分、代謝産物、及び／又はあらゆるその分泌分子に関する。

本明細書で用語「ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株（単数形）」又は「ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株（複数形）」が使用される場合、単独の、又は細胞成分、代謝産物、及び／又はあらゆるその分泌分子と組み合わせた、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を意味するものとする。

用語「前糖尿病」は、糖尿病と診断するのに必要とされる症状のすべては存在しないが、例えば、血糖が異常に高い対象における状態について使用される。本明細書で使用する場合、前糖尿病には、例えば、インスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び／又は腸管バリア機能障害（すなわち、腸管バリア機能が機能を弱められる）などの症状をもたらす状態が含まれる。

一態様では、本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、胃腸（ＧＩ）管内で生存する。

用語「胃腸（ＧＩ）管内で生存する」は、本明細書では、菌株が、ＧＩ管を通過した後に活性であることを意味するために使用される。腸管内での生存は、例えば、例えば経口摂取によって菌株を投与されている対象の糞便試料中の菌株を同定することによって決定される。

本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、１つ以上の前糖尿病症状、例えばインスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び／又は腸管バリア機能などを改善する能力を有することができる。本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又はこうしたものを含む組成物は、一態様では、対象の食後血糖応答を改善する、及び／又は対象のインスリン抵抗性を緩和することができる。

本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株はまた、又は或いは、１つ以上の２型糖尿病症状、例えばインスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び／又は腸管バリア機能などを改善する能力を有することができる。本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、一態様では、対象の食後血糖応答を改善する、及び／又は対象のインスリン抵抗性を緩和することができる。このように、一実施形態では、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又はこうしたものを含む組成物は、２型糖尿病を有する対象の食後血糖応答を改善する及び／又はインスリン抵抗性を緩和する。

本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株はまた、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が胃腸内に存在する場合に、高脂肪及び／又は高糖質食を摂取する個人における、血糖濃度を低下させる及び／又は体重増加を緩和する能力を有することができる。本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が、特定の食事に起因して正常よりも高い血糖値を有する個人における血糖値を低下させる能力を有することが理解されるべきである。本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が、血糖値を、正常な血糖値未満に低下させる可能性があることが疑われることはない。このように、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、個人の胃腸に存在する場合に、高脂肪食を摂取する個人の体重増加を、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が胃腸に存在しない同じ個人が同じ食事を摂取する状況と比較して緩和することができる。

本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、哺乳動物、特にヒトの胃腸における、高脂肪又は西洋型食生活による（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｄｉｅｔｉｚｅｄ）食事によって誘発される微生物ディスバイオシスを改善する能力をさらに有することができる。これは、胃腸微生物叢中に存在する場合に、本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が、通常は正常な胃腸機能の深刻な障害につながるであろう状態及び疾患から腸を保護する能力を有するという結論となる。例えば、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、大腸炎などの状態から対象を保護することができる。

本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、炎症促進性刺激の存在下での、例えば、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株に曝露された哺乳動物細胞の高いＩＬ１０／ＩＬ１２比として表される、哺乳動物細胞に対する抗炎症効果を発揮することができる。一実施形態では、本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、哺乳動物細胞に対する抗炎症効果を発揮する。さらなる実施形態では、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、炎症促進性刺激の存在下での、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株に曝露された哺乳動物細胞における高いＩＬ１０／ＩＬ１２比をもたらす。

一実施形態では、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株、又はラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）群に属する株の中から選択される。ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）群に属する株には、Ｌ．カゼイ（ｃａｓｅｉ）、Ｌ．パラカゼイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）、及びＬ．ラムノサス（ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株；好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）亜種トレランス（ｔｏｌｅｒａｎｓ）、又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）亜種パラカゼイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）株が含まれる。

特定の好ましい株は、ＤＳＭＺ－“Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ”に、寄託番号：ＤＳＭ １７６４８、ＤＳＭ ３２８５１、ＤＳＭ ３２８５３、ＤＳＭ ３２９１０、又はＤＳＭ ３２９１１で寄託されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の中から選択される。

本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、それを好適な培地中で培養することなどの、それ自体が公知であるあらゆる方式で、好ましくは、このようにして得られる微生物調製物が、ヒト及び／又は動物への投与に適している、特に、胃腸の所望される部分にコロニー形成できるような様式で、またこのような培地を使用して、得ることができる。

本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の培養は、当技術分野で公知であるような、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株発酵させるのに適した標準の発酵設備内で実施することができる。

培養後、本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、発酵ブロスから回収され、当技術分野で公知の技術を使用して本発明の組成物に変えられる、又は、完全な発酵ブロスを本発明による組成物に変えることもできる。

スクリーニング
哺乳動物対象の代謝的健康を改善する、例えば前糖尿病を緩和させる能力を有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を、菌株の所望される性質についてスクリーニングするために使用される１つ以上のスクリーニングステップ／方法によって、候補株のプールから選択することができる。

免疫調節特性、細胞接着、腸管バリア機能の改善、脂肪細胞における脂質蓄積の低下、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）、及び／又は胃腸生存（ＧＩ生存）などの性質についてスクリーニングするスクリーニング方法の中から、１つ以上のスクリーニング方法を選択することができる。

好ましいスクリーニング方法には、限定はされないが、以下が含まれる：
・ＰＢＭＣスクリーニング。ここでは、１人以上のドナー、例えば２人以上、３人以上、４人以上、又は５人以上のドナーから、末梢血単球様細胞が回収され、細菌株と共に所与の期間インキュベートされ、その後、サイトカイン産生、例えばインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；インターロイキン１０（ＩＬ１０）；ＩＬ１２；ＩＬ１３；ＩＬ１７、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５；ＩＬ６；ＩＬ８、リポカリン；単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）：オステオポンチン、及びＴＮＦαのレベルに対するインキュベーションの影響を分析することによって、菌株の免疫調節プロフィールが決定される。

・ＴＥＥＲアッセイ（経上皮電気抵抗（Ｔｒａｎｓ－Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、例えばＢ．Ｓｒｉｎｉｖａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｊ Ｌａｂ Ａｕｔｏｍ ２０１５，２０：１０７－１２６に記載されている通り）。炎症促進性サイトカイン又はリポ多糖（ＬＰＳ）などの生物活性を有する炎症促進因子を添加する又は添加しない。

・樹状細胞（ＤＣ）アッセイ。ここでは、１人以上のドナー、例えば２人以上、３人以上、４人以上、又は５人以上のドナーから回収されたＤＣを、サイトカイン、ＬＰＳ、ＴＮＦα、ＩＦＮγなどの炎症促進性刺激因子とのインキュベーションによって炎症性ＤＣに成熟させ；それに続いて、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株との所与の期間のインキュベーション、及びサイトカインの測定を行う。好ましい実施形態では、ＤＣはまた、炎症促進性刺激が添加される前に、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と共にプレインキュベートされる。代謝的健康を改善する、例えば前糖尿病を緩和させる能力を有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、ＩＬ１２レベルを低下させるはずであり、抗炎症性サイトカインのレベル（又は抗炎症性／炎症促進性の比）は、この特性を有しない株と比較して高いはずである。

・脂肪細胞アッセイ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１６，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ６，３６０８３に記載されている通り）。ここでは、３Ｔ３－Ｌ１細胞を、１０日間、成熟した脂肪細胞に分化させ、特定の時点で、所与の期間、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と共インキュベートさせ、細胞内の蓄積された脂質のＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色を使用して脂質形成、並びにｑＰＣＲによって脂肪生成関連遺伝子及び炎症促進性マーカー遺伝子の遺伝子発現の測定を行う。

・Ｌ細胞アッセイ。ここでは、ヒトＬ細胞株、ＮＣＩ－Ｈ７１６を、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地中で増殖させ、２４ウェルプレートのあらかじめコーティングされたプレート上に（２００．０００細胞／ウェル）、３７℃／５％ ＣＯ₂のインキュベーター内で播種し（１２～２０の間で継代）、４８時間分化させ、その後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、０．２％）を含有するＫｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液で２回洗浄し、最後に、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）放出アッセイのために、３７℃／５％ ＣＯ₂のインキュベーター内で、希釈された上清又は培地対照と共に２時間、共インキュベートする。１３－酢酸１２－ミリスチン酸ホルボール（１０μＭ）、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．２％）が、それぞれ、ＧＬＰ－１陽性対照として、また、ＧＬＰ－１の全放出のために、各試験に含められる。すべての試験試料は、２５μＭのジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤を含有する。インキュベーション後、すべての上清を除去し、ＧＬＰ－１について分析するまで－２０℃で保管する。細胞を、生存率について分析する。上清を、アクティブＧＬＰ－１ ＥＬＩＳＡキットを使用して、ＧＬＰ－１について分析する。

・胆汁酸塩ヒドロラーゼアッセイ。ここでは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を、ＭＲＳ培地（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、及びＳｈａｒｐｅ）中で、胆汁酸塩：グリココール酸塩、タウロコール酸塩、グリコケノデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、及びタウロデオキシコール酸塩の存在下で、３７℃で２４時間インキュベートした。胆汁酸塩は、それぞれ、１．５６ｍｇ／ｍＬ、０．５６ｍｇ／ｍＬ、１．５１ｍｇ／ｍＬ、０．５４ｍｇ／ｍＬ、１．５１ｍｇ／ｍＬ、及び０．３３ｍｇ／ｍＬで存在していた。細菌の非存在下で胆汁酸塩を含有する参照基準を使用した。インキュベーション後、上清を遠心分離によって回収した。試料を、酢酸メタノール（ａｃｅｔｉｃ ｍｅｔｈａｎｏｌ）で抽出し、高質量分解能で逆相（ＲＰ）液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）で分析した。この方法は、上に言及した６種すべての胆汁酸塩を定量化するために設定された。パーセントで表される抱合胆汁酸塩（ＣＢＳ）の変換率は、式ＣＢＳ［％］＝１００［％］－（Ａ＊１００［％］／Ｂ）に従って算出した。Ａは、細菌の存在下での２４時間のインキュベーション後の胆汁酸塩の量であるのに対して、Ｂは、細菌の非存在下での２４時間のインキュベーション後の胆汁酸塩の量である。ＣＢＳ値が高いほど、より多くの胆汁酸塩が変換された。

・ＭＩＣアッセイ：ＭＩＣアッセイ（ＥＦＳＡ Ｐａｎｅｌ ｏｎ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｒ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｒｓｅｄ ｂｙ ｐｕｂｌｉｃ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｏｎ Ｍａｙ ２０１７によって記載されている通り）。ここでは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及び対照株を増殖させ、異なる段階希釈抗生物質に分注した。各抗生物質のブレイクポイントを、３つの異なる反復実験で算出した。さらに、菌株のゲノム中に伝達性耐性遺伝子がないことを、Ｒｅｓｆｉｎｄｅｒ分析（Ｚａｎｋｔａｒｉ ｅｔ ａｌ，２０１２，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，ＰＭＩＤ ２２７８２４８７）を使用して実施した。

好ましい実施形態では、本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、ＤＣアッセイ、脂肪細胞アッセイ、ＭＩＣアッセイ、Ｌ細胞アッセイ、及び胆汁酸塩ヒドロラーゼアッセイの中から選択される少なくとも１つのスクリーニング方法を含むスクリーニングプロトコルにおいて選択される。

別の好ましい実施形態では、本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、ＤＣアッセイ、脂肪細胞アッセイ、ＭＩＣアッセイ、Ｌ細胞アッセイ、及び胆汁酸塩ヒドロラーゼアッセイの中から選択される少なくとも２つのスクリーニング方法を含むスクリーニングプロトコルにおいて選択される。

別の好ましい実施形態では、本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、ステップ：ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、ＤＣアッセイ、Ｌ細胞アッセイ、及び胆汁酸塩ヒドロラーゼアッセイを含むスクリーニングプロトコルにおいて選択される；
・ここでは、ＩＬ１０／ＩＬ１２比が、ＰＢＭＣアッセイにおいて１０を超える、例えば、少なくとも３人の健常なドナーからのＰＢＭＣを使用する平均として算出される場合に２０を超える、３０を超える、又は５０を超える；
・ここでは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が、ＴＥＥＲアッセイにおけるＴＥＥＲ比を少なくとも１．１５倍増大させることが可能であり、ここでは、ＴＥＥＲ比は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株との参照基準における０時間に対する２４時間のインキュベーション後のＴＥＥＲ値の、０時間に対する２４時間のインキュベーション後の培地対照のＴＥＥＲ値に対する商として算出される；
・ここでは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が、炎症促進性カクテルによって刺激されるＤＣアッセイにおいて、ＩＬ１２レベルを、炎症促進性の刺激を受けた対照と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％低下させることが可能である；
・ここでは、菌株は、胆汁酸塩アッセイとＬ細胞アッセイとの両方において、ＨＨ０５株と少なくとも同様のレベルで実施する。

ある特定の好ましい実施形態では、本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、ステップ：ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、ＤＣアッセイ、及びＬ細胞アッセイを含むスクリーニングプロトコルにおいて選択される。

一実施形態では、本発明で使用されるＴＥＥＲアッセイは、炎症促進性サイトカイン又はＬＰＳなどの生物活性を有する炎症促進因子を添加する又は添加しない。別の実施形態では、本発明で使用されるＴＥＥＲアッセイは、炎症促進性サイトカイン又はＬＰＳなどの生物活性を有する炎症促進因子を添加する。代替実施形態では、本発明で使用されるＴＥＥＲアッセイは、炎症促進性サイトカイン又はリポ多糖（ＬＰＳ）などの生物活性を有する炎症促進因子を添加しない。別の代替実施形態では、スクリーニングプロトコルにおいて２つのＴＥＥＲアッセイが使用され、ここでは、一方のＴＥＥＲアッセイは、炎症促進性サイトカイン又はＬＰＳなどの生物活性を有する炎症促進因子を添加せず、他方のＴＥＥＲアッセイは、炎症促進性サイトカイン又はＬＰＳなどの生物活性を有する炎症促進因子を添加する。一実施形態では、生物活性を有する炎症促進因子を添加するＴＥＥＲアッセイは、炎症促進性サイトカインを用いるＴＥＥＲアッセイである。

組成物
本発明は、さらに、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む組成物に関する。この組成物は、１グラムの組成物あたり少なくとも１０³個の生菌、好ましくは、１グラムの組成物あたり少なくとも１０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、１０¹⁰、１０¹¹、１０¹²、又は１０¹³個の生菌を含む。好ましい実施形態では、この組成物は、１グラムの組成物あたり１０⁶～１０¹⁴個の生菌、好ましくは、１グラムの組成物あたり１０⁷～１０¹³個の生菌を含む。

１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、乾燥させる、例えば凍結乾燥させる又は噴霧乾燥させることができる。微生物を乾燥させる、例えば凍結乾燥させる場合、十分な多くの生菌数を守る方法が使用されること、また、選択された株の活性が維持されることが重要である。こうした技術は、当技術分野で公知であり、当技術分野で公知のこうした方法はまた、本発明において適用可能である。

乾燥された、例えば凍結乾燥された調製物は、それ自体が公知である好適な補助剤、例えば、ニュートリオース（ｎｕｔｒｉｏｓｅ）、マルトース、又はプレバイオティクス（例えばガラクトオリゴ糖）などの凍結保護物質を含有することができる。エネルギー価を持たない若しくはエネルギー価が低い、又は非常に低いグリセミック指数を有する凍結保護物質を使用することが好ましい。

組成物は、例えば、充填剤、栄養素、保存剤、安定化剤、着香料、及び着色料の中から選択される、食品及び健康補助食品（ｆｏｏｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を調製する技術者に公知のさらなる成分をさらに含むことができる。

組成物は、粉末、ペースト、又はゲルの形態であり得、また、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、又はカプセルに充填することができる。組成物が、容易に投与できるように、サシェ、錠剤、又はカプセルなどの、別々の投薬用製剤に製剤化されることが好ましい。

組成物は、健康補助食品であってもよいし、食品又は食品成分の形態であってもよい。或いは、組成物は、医薬組成物の形態であってもよい。一態様では、組成物は、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と、任意に１種以上の許容し得る添加物とを含む、食品、食品成分、又は健康補助食品である。別の態様では、組成物は、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と、１種以上の薬学的に許容し得る添加物とを含む医薬組成物である。一態様では、医薬組成物は、例えばメトホルミンなどの薬物と共に投与される。別の実施形態では、医薬組成物は、例えばメトホルミンなどの薬物をさらに含む。

本発明の調製物が、健康補助食品の形態である場合、これは、カプセル、錠剤、粉末などの個別の投与のための形態、又は、好ましくは（１０⁷～１０¹³細胞／用量、好ましくは１０¹⁰～１０¹¹細胞／用量を含有する）単位用量の微生物を含有する類似の形態であり得る。

健康補助食品はまた、すぐに摂取可能である食品の調製のための、粉末の形態、又は、好適な食品（組成物）又は好適な液体若しくは固体の担体に添加される又は混合される類似の形態であり得る。

例えば、健康補助食品は、好適な液体、例えば、水、経口補水液、牛乳、フルーツジュース、又は同様の飲用液体を使用して再構成される、凍結乾燥された粉末の形態であり得る。健康補助食品はまた、固体の食品、又は高い水分量を有する食品、例えば発酵させる発酵乳製品、例えばヨーグルトと混合される粉末の形態であり得る。

本発明の組成物はまた、すぐに摂取可能である食品の形態であり得る。こうした食品は、例えば、上に記載した通りの本発明の補助食品を、食品、又はそれ自体が公知である食品ベースに添加する；投与に必要とされる量の微生物を（単独で又は混合物として）、食品、又はそれ自体が公知である食品ベースに添加する；又は必要とされる細菌を、食品培地中で、投与に必要とされる量の細菌を含有する食品が得られるまで培養することによって調製することができる。食品培地は、好ましくは、既に食品の一部をなしている、又は発酵後に食品の一部をなすこととなるようなものである。

この点においては、食品又は食品ベースは、発酵されても発酵されなくてもよい。

本発明の組成物は、経口摂取のための食品、例えば、完全食品（ｔｏｔａｌ ｆｏｏｄ）又は乳児用調製粉乳であり得る。

組成物は、プレバイオティクス化合物、特に、発酵時に酪酸塩／酪酸又はプロピオン酸塩／プロピオン酸を生じる繊維；タンパク質などのアミノ酸を含有する主要栄養素；並びに特定のビタミン、ミネラル、及び／又は微量元素をさらに含有することができる。後者に関しては、実施例から分かる通り、増大された又は中程度に高い量のビタミンＡ、Ｋ、Ｂ₁₂、ビオチン、Ｍｇ、Ｃｒ、及びＺｎの存在が、葉酸及びオメガ３脂肪酸の存在から分かる通り、好都合であり得る。

健康補助食品は、繊維、例えば、１００ｇの全調製物あたり少なくとも０．５ｇの量の繊維をさらに含むことができる。

繊維として、調製物は、好ましくは、難消化性デンプン又は別の酪酸塩発生因子、並びに好適なプロピオン酸塩発生因子、例えばガム又はダイズ多糖類を、上に示した量で含有する。酪酸及びプロピオン酸などの短鎖脂肪酸も、それ自体で、好ましくは適切にカプセル封入された形態で、又はその生理学的等価物、例えばプロピオン酸ナトリウムとして、１００ｇの全組成物あたり少なくとも０．１ｇの量で使用することができる。

アミノ酸／ペプチド、ビタミン、ミネラル、及び微量元素はまた、例えば酵母エキスの形態で含まれ得る。

組成物はまた、特に組成物が完全食品の形態である場合、ペプチド及び／又はタンパク質、特に、グルタミン酸及びグルタミン、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、及び微量元素が豊富なタンパク質も含有することができる。０．６～３ｇグルタミン／１００ｇ生成物に相当する量のグルタミン／グルタミン酸前駆体、並びに高含有量のグルタミンを有する低分子ポリペプチドの使用が好ましい。或いは、グルタミンが豊富なタンパク質、例えば、乳タンパク質、コムギタンパク質、又はその加水分解産物を添加することができる。

本発明の組成物は、ラクトースフリー、ハラール、ビーガン、及び／又はコーシャであり得る。

使用
本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又は本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む組成物は、１０⁷～１０¹³細胞／日、好ましくは１０¹⁰～１０¹¹細胞／日の量で、それぞれ投与されることが好ましい。これらの細胞は、成人と子供の両方に対して、１回の単回投薬として投与することもできるし、１日あたり２回又は１０回までの用量に分割することもできる。

組成物は、経口的に、典型的には食事と関連付けて投与される。

本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物は、これを受ける個人が必要性を有する限り、したがって、これを受ける個人が本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の特性から恩恵を受けることを望む限り、例えば、個人が栄養豊富すぎる食事の摂取に起因する体重増加を停止、緩和、若しくは制限する、及び／又はその食後血糖応答を改善する、及び／又はそのインスリン抵抗性を緩和することを望む限り、毎日投与されるべきである。

用語「インスリン抵抗性」は、グルコース（糖）を血流から細胞に輸送するインスリンの作用に細胞が応答する能力の減弱である。インスリン抵抗性は、例えば、経口グルコース負荷試験及び／又はグルコース刺激によるインスリン分泌によって、又は、空腹時インスリン及び血糖を測定することによって測定することができる。

用語「インスリン抵抗性を緩和する」又は「インスリン抵抗性を緩和すること」は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を受けていない同じ対象におけるインスリン抵抗性と比較された、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を受けている対象におけるインスリン抵抗性を説明するために使用される。

このように、好ましい実施形態では、本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物は、原理上は数年間続く可能性がある指定されない期間、毎日投与される。

本発明のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、胃腸に対するプラスの影響を有する。この目的のために、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む組成物は、医薬品などの、それ自体が公知である健康改善化合物をさらに含有することができる。特に、この組成物は、胃腸管に対する有益な影響を有する化合物、例えばグルタミン／グルタミン酸又はその前駆体を含有することができる。

本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物は、哺乳動物対象における、前糖尿病を緩和させる、２型糖尿病を緩和する又は改善する、インスリン抵抗性を改善する、肝臓の健康を改善する、腸管炎症を軽減する、腸管バリア機能を改善する、血糖値を低下させる、及び／又は高脂肪食による体重増加を予防する又は緩和するために使用することができる。

用語「肝臓の健康」は、本明細書では、肝組織におけるサイトカイン、トリグリセリド、コレステロール、及び／又は肝臓関連の酵素ＡＬＴ及び／又はＡＫＴの発現を評価することによる、及び／又は血漿、血清、及び／又は血液試料中の肝臓関連の酵素ＡＬＴ及び／又はＡＫＴを測定することによる、及び／又は肝臓重量を測定することによる、及び／又は肝組織の組織学的検査で肝臓状態を評価することによる、（治療されていない疾患又は健常な対照と比較した、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株で治療された）肝臓状態の評価のために使用される。

用語「腸管炎症」は、本明細書では、炎症促進性サイトカインのような炎症性因子が腸内に産生される場合に、及び／又は腸管バリア機能の崩壊が腸管壁浸漏をもたらす場合について使用される。腸管炎症及び腸管壁浸漏は、腸試料及び／又は血漿試料中のサイトカイン濃度を測定することによって、及び／又は血漿中のＬＰＳを測定することによって評価することができる。

用語「腸管バリア」は、本明細書では、腸管粘膜が、栄養を吸収する能力を維持しながら、望ましくない管腔内容物の腸内への適切な封じ込めを確実に行う能力について使用される。腸管バリア機能は、腸管上皮細胞層に沿ってＴＥＥＲを測定することによってインビトロで、また、血漿試料中のＬＰＳレベルを測定することによってインビボで、及び／又はインビボのスルホン（ｓｕｌｆｏｎｉｃ）アッセイによって評価することができる。

用語「血糖値」は、本明細書では、例えば酵素学に基づくアッセイによって測定される、血液中のグルコースの濃度について使用される。血糖濃度は、体によって、狭い範囲内に維持される。この厳しい調節は、グルコースホメオスタシスと称される。血糖を低下させるインスリン、又はインスリン分泌を高めるＧＬＰ－１は、血糖調節に関与するホルモンのうち、最もよく知られたものである。

本発明の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物は、個人の代謝的健康を改善する、例えば前糖尿病及び／又は２型糖尿病を緩和するために使用することができる。本発明の一態様では、１つ以上の前糖尿病及び／又は２型糖尿病症状、例えばインスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び／又は腸管バリア機能などを改善する又は緩和するために、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物が使用される。さらなる又は別の態様では、対象の食後血糖応答を改善する、及び／又は対象のインスリン抵抗性を緩和するために、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物が使用される。いっそうさらなる又は別の態様では、大腸炎を予防する又は軽減するために、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物が使用される。いっそうさらなる又は別の態様では、高脂肪及び／又は高糖質摂取を有する個人における体重増加を緩和するために、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物が使用される。本発明のある特定の態様では、インスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び腸管バリア機能からなる群から選択される２つ以上の前糖尿病及び／又は２型糖尿病症状を改善する又は緩和するために、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物が使用される。本発明の別の特定の態様では、インスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び腸管バリア機能からなる群から選択される３つ以上の前糖尿病及び／又は２型糖尿病症状を改善する又は緩和するために、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物が使用される。本発明のさらに別の特定の態様では、前糖尿病及び／又は２型糖尿病症状：インスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び腸管バリア機能を改善する又は緩和するために、１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株又は組成物が使用される。

好ましい実施形態
本発明はまた、以下の番号付けされた実施形態によって説明することができる：

実施形態１．
哺乳動物対象における、代謝的健康を改善する、例えば前糖尿病を緩和する能力を有する、又は血糖値を低下させる能力を有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態２．前糖尿病を緩和する能力を有する、実施形態１に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態３．インスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び腸管バリア機能からなる群から選択される１つ以上の前糖尿病症状を改善する又は緩和する能力を有する、実施形態１又は２に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態４．２型糖尿病を予防する及び／又は緩和する能力を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態５．インスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び腸管バリア機能からなる群から選択される１以上の２型糖尿病症状を予防する及び／又は緩和する能力を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態６．対象の食後血糖応答を改善する及び／又は対象のインスリン抵抗性を緩和する能力を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態７．胃腸（ＧＩ）管内で生存する、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態８．ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、ＤＣアッセイ、脂肪細胞アッセイ、Ｌ細胞アッセイ、胆汁酸塩ヒドロラーゼアッセイ、及びＭＩＣアッセイの中から選択される少なくとも１つのスクリーニング方法を含むスクリーニングプロトコルにおいて選択される、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態９．ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、ＤＣアッセイ、脂肪細胞アッセイ、Ｌ細胞アッセイ、胆汁酸塩ヒドロラーゼアッセイ、及びＭＩＣアッセイの中から選択される少なくとも２つのスクリーニング方法を含むスクリーニングプロトコルにおいて選択される、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態１０．以下の方法：ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、炎症促進性サイトカインの添加を用いるＴＥＥＲアッセイ、及びＤＣアッセイを含むスクリーニングプロトコルにおいて選択される、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態１１．ＩＬ１０／ＩＬ１２比が、ＰＢＭＣアッセイにおいて１０を超える、例えば、少なくとも３人の健常なドナーからのＰＢＭＣを使用する平均として算出される場合に２０を超える、例えば３０を超える、例えば５０を超える、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態１２．ＴＥＥＲアッセイにおけるＴＥＥＲ比を少なくとも１．１５倍増大させることが可能であり、ここでは、ＴＥＥＲ比は、ＰＢＭＣのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株との参照基準における０時間に対する２４時間のインキュベーション後のＴＥＥＲ値の、０時間に対する２４時間のインキュベーション後の培地対照のＴＥＥＲ値に対する商として算出される、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態１３．炎症促進性カクテルによって刺激されるＤＣアッセイにおいて、ＩＬ１２レベルを、炎症促進性の刺激を受けた対照と比較して少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％低下させることが可能である、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態１４．ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株若しくはラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）株である、又はラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）群に属する、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態１５．ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株である、又はラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）群に属する、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態１６．ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）株、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株、及び／又はラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株である、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態１７．ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）群のものであり、且つラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、及びラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）から選択される、実施形態１４又は１５に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態１８．ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）亜種トレランス（ｔｏｌｅｒａｎｓ）及びラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）亜種パラカゼイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）株から選択される、実施形態１７に記載のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株。

実施形態１９．ＤＳＭ １７６４８、ＤＳＭ ３２９１０、ＤＳＭ ３２９１１、ＤＳＭ ３２８５１、及びＤＳＭ ３２８５３として寄託された株、並びにその変異株の中から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態２０．変異株が、自然進化に由来する、実施形態１９に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態２１．変異株が、ＤＳＭ １７６４８、ＤＳＭ ３２９１０、ＤＳＭ ３２９１１、ＤＳＭ ３２８５１、又はＤＳＭ ３２８５３として寄託されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株に対する、１～５０個のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加、例えば、１～４０、１～３０、１～２０、若しくは１～１０個のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加を含む、実施形態１９に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。

実施形態２２．実施形態１～２１のいずれかに記載の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む組成物。

実施形態２３．実施形態１～２１のいずれかに記載の２種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、例えば、実施形態１～２１のいずれかに記載の３種以上、４種以上、又は５種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む、実施形態２２に記載の組成物。

実施形態２４．ＤＳＭ １７６４８として寄託されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と、ＤＳＭ ３２９１０、ＤＳＭ ３２９１１、ＤＳＭ ３２８５１、及びＤＳＭ ３２８５３として寄託された株から選択される１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株とを含む、実施形態２２～２３のいずれかに記載の組成物。

実施形態２５．ＤＳＭ ３２９１０として寄託されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と、ＤＳＭ １７６４８、ＤＳＭ ３２９１１、ＤＳＭ ３２８５１、及びＤＳＭ ３２８５３として寄託された株から選択される１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株とを含む、実施形態２２～２３のいずれかに記載の組成物。

実施形態２６．ＤＳＭ ３２９１１として寄託されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と、ＤＳＭ １７６４８、ＤＳＭ ３２９１０、ＤＳＭ ３２８５１、及びＤＳＭ ３２８５３として寄託された株から選択される１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株とを含む、実施形態２２～２３のいずれかに記載の組成物。

実施形態２７．ＤＳＭ ３２８５１として寄託されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と、ＤＳＭ １７６４８、ＤＳＭ ３２９１０、ＤＳＭ ３２９１１、及びＤＳＭ ３２８５３として寄託された株から選択される１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株とを含む、実施形態２２～２３のいずれかに記載の組成物。

実施形態２８．ＤＳＭ ３２８５３として寄託されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と、ＤＳＭ １７６４８、ＤＳＭ ３２９１０、ＤＳＭ ３２９１１、及びＤＳＭ ３２８５１として寄託された株から選択される１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株とを含む、実施形態２２～２３のいずれかに記載の組成物。

実施形態２９．実施形態１～２１のいずれかに記載の最大５種のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、例えば、実施形態１～２１のいずれかに記載の最大４、３、又は２種のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む、実施形態２２～２８のいずれかに記載の組成物。

実施形態３０．別の種由来の微生物株をさらに含む、実施形態２２～２９のいずれかに記載の組成物。

実施形態３１．さらなる微生物株が、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株、及びアッカーマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）種に属する株から選択される、実施形態３０に記載の組成物。

実施形態３２．細胞成分、代謝産物、及び／又はその分泌分子をさらに含む、実施形態２２～３１のいずれかに記載の組成物。

実施形態３３．細胞成分、代謝産物、及び／又は分泌分子が、発酵及び遠心分離後のの培養物の残余分由来のものである、実施形態３２に記載の組成物。

実施形態３４．菌株が、乾燥される、例えば、凍結乾燥される又は噴霧乾燥される、実施形態２２～３３のいずれかに記載の組成物。

実施形態３５．菌株が、凍結乾燥される、実施形態２２～３３のいずれかに記載の組成物。

実施形態３６．１グラムあたり１０⁶～１０¹⁴コロニー形成単位（ＣＦＵ）／の組成物、好ましくは１０⁷～１０¹³、好ましくは１グラムあたり１０⁸～１０¹²ＣＦＵの組成物を含む、実施形態２２～３５のいずれかに記載の組成物。

実施形態３７．それぞれが１単位あたり１０⁶～１０¹⁴コロニー形成単位（ＣＦＵ）、好ましくは１単位あたり１０⁷～１０¹³、好ましくは１０⁸～１０¹²ＣＦＵを含む単位用量製剤として製剤化される、実施形態２２～３６のいずれかに記載の組成物。

実施形態３８．１０⁶～１０¹⁴、例えば１０⁶～１０¹³個の細胞、１０⁸～１０¹²個の細胞、又は１０⁹～１０¹¹個の細胞を含み、ここでは、総数は、生きている及び死んでいる細胞の総量を指す、実施形態２２～３７のいずれかに記載の組成物。

実施形態３９．１０⁶～１０¹⁴、例えば１０⁶～１０¹³個の細胞、１０⁸～１０¹²個の細胞、又は１０⁹～１０¹¹個の細胞を含み、ここでは、総数は、生きている細胞の総量を指す、実施形態２２～３７のいずれかに記載の組成物。

実施形態４０．１０⁶～１０¹⁴、例えば１０⁶～１０¹³個の細胞、１０⁸～１０¹²個の細胞、又は１０⁹～１０¹¹個の細胞を含み、ここでは、総数は、死んでいる細胞の総量を指す、実施形態２２～３７のいずれかに記載の組成物。

実施形態４１．ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と、１種以上の薬学的に許容し得る添加物とを含む医薬組成物である、実施形態２２～４０のいずれかに記載の組成物。

実施形態４２．食品、健康補助食品、又は食品成分である、実施形態２２～４０のいずれかに記載の組成物。

実施形態４３．１種以上の許容し得る添加物を含む、実施形態４２に記載の組成物。

実施形態４４．すぐに摂取可能である、実施形態４２～４３のいずれかに記載の組成物。

実施形態４５．さらなる健康補助食品を含む、実施形態４２～４４のいずれかに記載の組成物。

実施形態４６．さらなる健康補助食品が、１種以上のプレバイオティクス、酵素、ビタミン、及びミネラルから選択される、実施形態４５に記載の組成物。

実施形態４７．細胞成分、代謝産物、及び／又はその分泌分子をさらに含む、実施形態２２～４６のいずれかに記載の組成物。

実施形態４８．実施形態１～２１のいずれかに記載の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む栄養補助食品（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）。

実施形態４９．プレバイオティクス、酵素、ビタミン、及び／又はミネラルなどの物語と対話的に（ｎａｒｒａｔｉｖｅｌｙ）有益な１種以上の成分をさらに含む、実施形態４８に記載の栄養補助食品。

実施形態５０．哺乳動物対象の代謝的健康の改善、例えば前糖尿病を緩和させるための、実施形態１～２１のいずれかに記載の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又は実施形態２２～４７のいずれかに記載の組成物の使用。

実施形態５１．哺乳動物対象における、前糖尿病を緩和させる、２型糖尿病を予防する又は緩和する、インスリン抵抗性を緩和する、肝臓の健康を改善する、腸管炎症を軽減する、腸管バリア機能を改善する、血糖値を低下させる、及び／又は高脂肪食による体重増加を予防する又は緩和するための、実施形態１～２１のいずれかに記載の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又は実施形態２２～４７のいずれかに記載の組成物の使用。

実施形態５２．哺乳動物対象における、前糖尿病を緩和させる、２型糖尿病を予防する又は緩和する、インスリン抵抗性を緩和する、肝臓の健康を改善する、腸管炎症を軽減する、及び／又は腸管バリア機能を改善するための、実施形態５０又は５１に記載の使用。

実施形態５３．哺乳動物対象における、インスリン抵抗性を緩和する、肝臓の健康を改善する、腸管炎症を軽減する、及び／又は腸管バリア機能を改善するための、実施形態５０～５２のいずれかに記載の使用。

実施形態５４．哺乳動物対象における血糖値を低下させるための、実施形態１～２１のいずれかに記載の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又は実施形態２２～４７のいずれかに記載の組成物の使用。

実施形態５５．高脂肪食を有する個人における体重増加の予防又は緩和のための、実施形態１～２１のいずれかに記載の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又は実施形態２２～４７のいずれかに記載の組成物の使用。

実施形態５６．哺乳動物がヒトである、実施形態５０～５５のいずれかに記載の使用。

実施形態５７．１０⁶～１０¹⁴コロニー形成単位（ＣＦＵ）、好ましくは１０⁷～１０¹³、好ましくは１０⁸～１０¹²が、哺乳動物対象に毎日投与される、実施形態５０～５６のいずれかに記載の使用。

実施形態５８．ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、ＤＣアッセイ、脂肪細胞アッセイ、Ｌ細胞アッセイ、胆汁酸塩ヒドロラーゼアッセイ、及びＭＩＣアッセイの中から選択される少なくとも１つのスクリーニング方法を含むスクリーニングプロトコルを使用して、実施形態１～２１のいずれかに記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株についてスクリーニングするための方法。

実施形態５９．ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、ＤＣアッセイ、及び脂肪細胞アッセイの中から選択される少なくとも２つのスクリーニング方法を含むスクリーニングプロトコルを使用する、実施形態５８に記載の方法。

実施形態６０．以下のスクリーニング方法：ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、炎症促進性サイトカインの添加を用いるＴＥＥＲアッセイ、及びＤＣアッセイを含むスクリーニングプロトコルを使用する、実施形態５８又は５９に記載の方法。

実施形態６１．以下のスクリーニング方法：ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、ＤＣアッセイ、及びＬ細胞アッセイを含むスクリーニングプロトコルを使用する、実施形態５８～６０のいずれかに記載の方法。

材料及び方法
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を増殖させるために、標準の培地、例えば、１リットルあたり１５～２０ｇのペプトン又はトリプトン及び１リットルあたり約５ｇの酵母エキスを提供する培地を使用した。培地を調製するために、標準の手順（構成成分の濃度、滅菌、接種）を適用し、微生物を、上昇させた温度（例えば３５～４２℃）で十分な時間（例えば８～４８時間）増殖させた。

実施例１．好適なラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株についてスクリーニングすること
代謝的健康、例えば前糖尿病を緩和させることに対する有益な影響を有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を、以下に概説するスクリーニングプロトコルを使用して探し出した。

１．予備スクリーニング：ＰＢＭＣスクリーニングアッセイにおいて、株の免疫調節潜在能力の指標としてＩＬ１０／ＩＬ１２比を解析することによって、６４０種のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株をスクリーニングした：

末梢血単核球（ＰＢＭＣ）アッセイのために、１人のドナーからのＰＢＭＣを、２４時間の順化後に、２４時間、さらなる炎症促進性刺激の非存在下で、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と共インキュベートした。インキュベーション後、サイトカインを含有する上清の適切な希釈物を、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（製造者の指示に従う）、及び／又はＥＬＩＳＡによって測定し、ＩＬ１０／ＩＬ１２比を決定した。

この予備スクリーニングでは、ＩＬ１０／ＩＬ１２比＞３を有する１８０種の株を選択した。

２．免疫調節及び腸管完全性をスクリーニングすること
予備スクリーニングで選択された１８０種の株を、有益なＩＬ１０／ＩＬ１２比を確認するために、３人の異なるドナーからのＰＢＭＣについて株が試験されることを除いて予備スクリーニングと同一であるＰＢＭＣ確認スクリーニングにかけた。ＩＬ１０／ＩＬ１２比の他に、１４種の他のサイトカインを測定した。

腸管完全性に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の影響を評価するために、株を、さらに、いずれの炎症促進性刺激（例えばＴＮＦα）も加えずにＴＥＥＲ評価（経上皮電気抵抗（Ｔｒａｎｓ－Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ））（Ｂ．Ｓｒｉｎｉｖａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｊ Ｌａｂ Ａｕｔｏｍ ２０１５，２０：１０７－１２６に記載されている通り）にかけた。ＴＥＥＲ測定は、０及び２４時間後に行った。

ＰＢＭＣ確認スクリーニングによりＩＬ１０／ＩＬ１２比＞３が確認され、且つＴＥＥＲ値の増大がもたらされた２０種の株を、次のスクリーニング方法のために選択した。

３．炎症促進トリガーの存在下でのヒット確認
この確認ステップでは、ステップ２におけるＴＮＦαを伴わないＴＥＥＲ評価で選択された２０種の株をまた、ＴＮＦα添加を伴うＴＥＥＲ評価にかけた。

菌株を伴わない対照と比較してＴＥＥＲ値の増大をもたらしたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を選択した。

これらの株を、ＤＣアッセイにおいてさらにスクリーニングした。この試験のために、３人のドナーから得られたＰＢＭＣから、ＤＣを産生した。ＤＣを、０．１μｇ／ｍＬ ＬＰＳ＋５０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－α＋２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγでの処理によって炎症性ＤＣに成熟させ、４時間インキュベートした。一定分量の成熟ＤＣを、４つの異なる用量の各ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株と共にインキュベートし、その後、Ｌｕｍｉｎｅｘを使用してサイトカインレベルを決定した。

株を伴わない対照組成物と比較してＩＬ１２誘導を低下させたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を選択した。
ＨＨ０１
種：ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）
１６Ｓ及びＷＧＳにより確認
寄託番号：ＤＳＭ １７６４８．
ＨＨ０２
種：ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）
１６Ｓ及びＷＧＳにより確認
寄託番号：ＤＳＭ ３２９１０．
ＨＨ０３
種：ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）
１６Ｓ及びＷＧＳにより確認
寄託番号：ＤＳＭ ３２９１１
ＨＨ０４
種：ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）亜種トレランス（ｔｏｌｅｒａｎｓ）
１６Ｓ及びＷＧＳにより確認
寄託番号：ＤＳＭ ３２８５１
ＨＨ０５
種：ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）亜種パラカゼイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）
１６Ｓ及びＷＧＳにより確認
寄託番号：ＤＳＭ ３２８５３

実施例２．ＰＢＭＣにおけるサイトカインの誘導
実施例１で選択された株ＨＨ０１～ＨＨ０５を、インビトロでさらに特徴付けた。

健常なドナーから単離された１×１０⁶個のＰＢＭＣ／ｍＬを、賦形剤、又は１×１０⁶個のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株／ｍＬ ＨＨ０１～ＨＨ０５を含む賦形剤と共に、１ｍｌの総体積で、２４時間インキュベートした。サイトカインＩＬ１０、ＩＬ１２、ＭＣＰ－１、及びオステオポンチンは、製造者の指示に従ってＬｕｍｉｎｅｘを使用して測定した。賦形剤として、ＭｇＣｌ₂を含まないリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）（Ｃａｔ．１００１０－０２３，Ｇｉｂｃｏ）を使用した。

結果：
株ＨＨ０１～ＨＨ０５は、賦形剤対照と比較して、ＩＬ１０／ＩＬ１２比の増大を誘発し、選択された株が抗炎症特性を有することが裏付けられた（図１）。

図２は、炎症促進性刺激・リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激された、ＰＢＭＣの上清中のＭＣＰ－１の含有量を示す。この結果は、賦形剤を単独で用いると、ＭＣＰ－１の高い産生が見られるのに対して、株ＨＨ０１～ＨＨ０５は、ＭＣＰ－１誘導を有意に低下させたことを示し、これらの株の抗炎症特性が裏付けられた。

図３は、炎症促進性刺激（リポ多糖）で刺激された、ＰＢＭＣの上清中のオステオポンチンの含有量を示す。この結果は、賦形剤を単独で用いると、オステオポンチンの高い産生が見られるのに対して、株ＨＨ０１～ＨＨ０５は、オステオポンチン誘導を有意に低下させたことを示し、これらの株の抗炎症特性が確認された。

実施例３．樹状細胞におけるサイトカインの誘導
第１の一連のアッセイでは、樹状細胞（ＤＣ）を、３人の健常なドナーからのＰＢＭＣから回収し、一定分量を、賦形剤、又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０１、ＨＨ０３、若しくはＨＨ０５を含む賦形剤と共に、２４時間インキュベートした。この混合物を遠心分離し、上清を収集し、ＭＣＰ－１、オステオポンチン、及びＩＬ１２ｐ７０を、製造者の指示に従ってＬｕｍｉｎｅｘを使用して測定した。

第２の一連のアッセイでは、ＤＣを、１２人の健常なドナーからのＰＢＭＣから回収し、一定分量を、賦形剤、又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２、ＨＨ０４、若しくはＨＨ０５を含む賦形剤と共に、２４時間インキュベートした。この混合物を遠心分離し、上清を収集し、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０、ＭＣＰ－１を、製造者の指示に従ってＬｕｍｉｎｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。

結果：
第１の一連のＤＣアッセイでは、結果は、炎症促進性サイトカインＭＣＰ－１、ＩＬ１２、及びオステオポンチンの濃度が、ＤＣがラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０３と共インキュベートされた場合に、ＨＨ０１株及びＨＨ０５株と比較して最も低かったことを示す（図４）。

第２の一連のＤＣアッセイでは、結果は、低悪性度炎症カクテルを用いてシミュレーションされたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０１、ＨＨ０４、及びＨＨ０５が、すべて、低悪性度炎症カクテル単独を用いてシミュレーションされた対照と比較して、ＩＬ１０／ＩＬ１２ｐ７０比の増大を誘発したことを示す。さらに、低悪性度炎症性カクテルによって刺激されたＤＣは、ＭＣＰ－１を産生したが、カクテル対照と比較して低下され、選択された株が抗炎症特性を有することが確認された。

実施例４．ＤＣ培養物におけるサイトカインの誘導
実施例１で選択されたＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５株を、ＤＣとの共インキュベーションアッセイにおいてさらに特徴付けた。選択されたサイトカインを、炎症促進性カクテルでの刺激後に測定した。

ヒトＰＢＭＣを、軟膜から単離し（Ｎ＝１２）、ポジティブセレクション（ＣＤ１４マイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってＣＤ１４＋単球を精製した。単球を、未成熟ＤＣ（ｉｍＤＣ）への分化のために、ＩＬ４（２０ｎｇ／ｍＬ）及びＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）と共に６日間培養した。成熟ＤＣへの分化のために、１×１０⁵個の細胞を、選択されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２（１０⁶個のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株／ｍＬ）、及びＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）から構成される低悪性度炎症カクテルと共に培養した。ｉｍＤＣを、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株によって４時間刺激し、その後、さらに１６時間、低悪性度炎症カクテルを添加した。ＤＣ成熟を、ＢＤ細胞数測定ビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ）（ＣＢＡ）によってインビトロ刺激後に評価して、ＤＣ誘導性のＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０、ＭＣＰ－１、及びＩＬ６を測定した。これらのサイトカインに対するＨＨ０２、ＨＨ０４、ＨＨ０５株の効果を、炎症促進性カクテル単独で刺激された株を用いない対照と比較した。

結果
これらの結果は、低悪性度炎症カクテルによって刺激されたＤＣが、ＩＬ１０を産生することと、ＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５株の存在が、すべて、ＩＬ１０濃度を、カクテル単独による刺激と比較して増大させること、また低悪性度炎症カクテルによって刺激されたＤＣが、ＩＬ１２ｐ７０を産生することと、ＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５株の存在が、すべて、ＩＬ１２ｐ７０濃度を、カクテル単独による刺激と比較して増大させること、またラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０１、ＨＨ０４、及びＨＨ０５が、すべて、カクテル対照と比較してＩＬ１０／ＩＬ１２ｐ７０比の増大を誘発することを示し（図５）、選択された株が抗炎症特性を有することが確認された。

さらに、低悪性度炎症性カクテルによって刺激されたＤＣが、ＭＣＰ－１を産生することと、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５の存在が、すべて、培養中にＭＣＰ－１濃度を低下させることが分かった（図６）。さらに、これらの結果は、低悪性度炎症カクテルによって刺激されたＤＣが、高レベルのＩＬ６を産生することと、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０４の存在が、ＩＬ６濃度をカクテル対照のレベルに維持するのに対して、ＨＨ０２及びＨＨ０５株は、ＩＬ６濃度を増大させることを示した（図７）。

実施例５．ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０１～ＨＨ０５を用いて実施されるＴＥＥＲアッセイ
ＴＥＥＲアッセイを、Ｂ．Ｓｒｉｎｉｖａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｊ Ｌａｂ Ａｕｔｏｍ ２０１５，２０：１０７－１２６に従って実施した。このアッセイについては、注文番号ＡＣＣ １６９で管理されているＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ ＧｍｂＨ）で購入したＣａＣｏ－２細胞を使用した。２×１０⁵個のＣａＣｏ－２細胞ｐｒｏ ｍＬを播種し、３週間、分化させた。これらを、炎症促進性刺激の非存在下で、１×１０⁶細胞ｐｒｏ ｍＬの濃度で、賦形剤、又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０１～ＨＨ０５を含む賦形剤と共に、２４時間インキュベートし、その後、ＴＥＥＲ比を決定した。賦形剤として、ＭｇＣｌ₂を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（Ｃａｔ．１００１０－０２３，Ｇｉｂｃｏ）を使用した。＞１のＴＥＥＲ比は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が、腸管バリア機能完全性を強化することが可能であることを示した。

ＣａＣｏ－２細胞を、炎症促進性刺激の存在下で、１００ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦαの形態で、賦形剤、又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０１～ＨＨ０５を含む賦形剤と共に、２４時間インキュベートし、その後、ＴＥＥＲ比を決定した。賦形剤として、ＭｇＣｌ₂を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｃａｔ．１００１０－０２３，Ｇｉｂｃｏ）を使用した。＞１のＴＥＥＲ比は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が、腸管バリア機能を強化することが可能であることを示した。

結果：
ＴＥＥＲデータは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０４及び株ＨＨ０３が、炎症促進因子の非存在下（図８Ａ）と存在下（図８Ｂ）の両方で、腸上皮バリアを最も強化したことを示す。炎症促進因子の存在下では、ＨＨ０１、ＨＨ０２、及びＨＨ０５株も、疾患対照単独（炎症促進因子を含む培地）と比較してＴＥＥＲを増大させることが可能であった。

実施例６．ＴＥＥＲアッセイ
炎症性カクテルの存在下での上皮細胞株Ｃａｃｏ２バリアの完全性に対する、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５の影響：
炎症性カクテルの存在下での上皮細胞株Ｃａｃｏ２バリアの完全性に対する、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５の影響を、次の改変を伴って、「実施例５．ＴＥＥＲアッセイ」に記載されているのと同様に実施されるＴＥＥＲ ＥＶＯＭ２アッセイを使用して決定した。共インキュベーションを開始する時に、ＴＮＦα－アルファ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＮＦγ－ガンマ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する炎症性カクテルを側底側に添加した。

結果：
結果は、炎症性カクテルが、ＴＥＥＲ比を低下させる（これは、Ｃａｃｏ２バリアの完全性弱体化の指標である）ことを示した。この影響は、試験された株ＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５によって、最も強力にはＨＨ０４によって打ち消された（図９）。

１か月の保管後のＴＥＥＲ増強能力：
凍結乾燥されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２又はＨＨ０４を含有する製剤化された生成物を、－２０℃、４℃、２５℃、及び４０℃での１か月の保管後のそのＴＥＥＲ増強能力について試験した。製剤化された生成物の存在下での上皮細胞株Ｃａｃｏ２のバリアの完全性に対する、製剤化された生成物の影響を、次の改変を伴って、「実施例５．ＴＥＥＲアッセイ」に記載されているのと同様に実施されるＴＥＥＲ ＥＶＯＭ２アッセイを使用して決定した。播種されたＣａｃｏ２細胞の５倍のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含有する一定量の製剤化された生成物（５００の感染多重度（ＭＯＩ））を、５００μＬの培地内の頂端側培地に溶解した。

結果：
結果は、ＨＨ０２及びＨＨ０４の製剤化された生成物のＴＥＥＲ増強能力が、保管温度－２０℃、４℃、及び２５℃で、少なくとも１か月間安定であることを示した（図１０）。４０℃で１か月を超えて保管した生成物については、より低いＴＥＥＲ活性が見られた。

フルクトース又はグルコースを伴う／伴わない、上皮細胞株Ｃａｃｏ２バリア完全性に対する、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２及びＨＨ０４の影響：
上皮細胞株Ｃａｃｏ２バリア完全性に対する、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２及びＨＨ０４の影響を、次の改変を伴って、「実施例５．ＴＥＥＲアッセイ」に記載されているのと同様に実施される連続的ＴＥＥＲ ｃｅｌｌＺｓｃｏｐｅアッセイを使用して決定した。頂端側には、培地単独、又は７ｍＭフルクトースを含有する培地を添加した。側底側には、培地単独、又は７ｍＭグルコースを含有する培地を添加した。

結果：
結果は、ＨＨ０２が、異なる濃度による影響をほとんど与えず、ＴＥＥＲを最小限に増大させることを示した。側底での高グルコース濃度の存在は、ＨＨ０４による、この株が側底側で標準の培地の存在下で試験された状態と比較して、より早いＴＥＥＲの増大をもたらす。この結果は、健常な個人における効果と比較した、高血糖値に悩む対象におけるＨＨ０４からの効果の増強を示唆する。頂端側での高フルクトース濃度の存在下では、ＨＨ０４を用いて、培地単独と比較して、より早いＴＥＥＲの増大がまた観察された。この結果は、絶食対象における効果と比較した、腸内に高負荷のフルクトースを有する対象における効果の増強を示唆する（図１１）。

実施例７．胆汁酸塩の変換
ＨＨ０１、ＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５株を、ＭＲＳ培地（Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、及びＳｈａｒｐｅ）中で、胆汁酸塩：グリココール酸塩、タウロコール酸塩、グリコケノデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、及びタウロデオキシコール酸塩の存在下で、３７℃で２４時間インキュベートした。胆汁酸塩は、それぞれ、１．５６ｍｇ／ｍＬ、０．５６ｍｇ／ｍＬ、１．５１ｍｇ／ｍＬ、０．５４ｍｇ／ｍＬ、１．５１ｍｇ／ｍＬ、及び０．３３ｍｇ／ｍＬで存在していた。細菌の非存在下で胆汁酸塩を含有する参照基準を使用した。インキュベーション後、上清を遠心分離によって回収した。試料を、酢酸メタノール（ａｃｅｔｉｃ ｍｅｔｈａｎｏｌ）で抽出し、高質量分解能で逆相（ＲＰ）液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）で分析した。この方法は、上に言及した６種すべての胆汁酸塩を定量化するために設定された。パーセントで表される抱合胆汁酸塩（ＣＢＳ）の変換率は、式ＣＢＳ［％］＝１００［％］－（Ａ＊１００［％］／Ｂ）に従って算出した。Ａは、細菌の存在下での２４時間のインキュベーション後の胆汁酸塩の量であるのに対して、Ｂは、細菌の非存在下での２４時間のインキュベーション後の胆汁酸塩の量である。ＣＢＳ値が高いほど、より多くの胆汁酸塩が変換された。

結果を図１２に示し、この結果は、ＨＨ０１及びＨＨ０２株が、すべての胆汁酸塩を部分的に変換することができ、脂肪吸収の低下への寄与を示したのに対して、ＨＨ０４及びＨＨ０５は、タウロデオキシコール酸塩を部分的に変換することができ、代謝に対するプラスの効果を示したことを示す。

実施例８．ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）によって刺激されるグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）放出を測定するためのＬ細胞アッセイ
Ｌ細胞アッセイを、Ｇａｇｎｏｎ ａｎｄ Ｂｒｕｂａｋｅｒ（２０１５）ＮＣＩ－Ｈ７１６ Ｃｅｌｌｓ．Ｐｐ．２２１－２２８ Ｉｎ：Ｖｅｒｈｏｅｃｋｘ Ｋ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｔｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｈａｍ．によって記載されている通りに実施した。ヒトＬ細胞株、ＮＣＩ－Ｈ７１６を、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地中で増殖させた。細胞（１２～２０の間で継代）を、２４ウェルプレートに播種し（２００，０００細胞／ウェル）、４８時間分化させた。２４ウェルプレートは、細胞播種の前に、０．５ｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ／ウェルであらかじめコーティングした。

グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）放出アッセイのために、ヒトＬ細胞を含有するプレートを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、０．２％）を含有するＫｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液で２回洗浄し、その後、ＨＨ０２及びＨＨ０４又は培地対照からのラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）上清の希釈した試料を、３７℃／５％ ＣＯ₂のインキュベーター内で２時間添加した。１３－酢酸１２－ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）（１０μＭ）、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．２％）が、それぞれ、ＧＬＰ－１陽性対照として、また、ＧＬＰ－１の全放出のために、各試験に含められた。すべての試験試料は、２５μＭ Ｄｉｐｒｏｔｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤を含有していた。インキュベーション後、すべての上清を除去し、ＧＬＰ－１について分析するまで－２０℃で保管した。細胞を、Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ生存率染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、生存率について分析した。上清を、アクティブＧＬＰ－１ ＥＬＩＳＡキット（ＥＧＬＰ－３５Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｍｅｒｃｋ）を使用して、ＧＬＰ－１について分析した。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）培養のために使用されるブロス（酵母・デキストロース・寒天ブロス（ＹＤＡ））と、対照細菌の表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ ３５９８４（Ｓ．Ｅ）培養のために使用されるブロス（グルコースを含む培地１７（ＧＭ１７））を、株の非存在下での追加の対照として含めた。

結果：
結果は、ＨＨ０２及びＨＨ０４株からの無細胞ブロスが、１０倍希釈された場合に、Ｌ細胞を刺激してＧＬＰ－１を放出させることを示した。これらの株の無細胞ブロスの放出は、１０倍希釈されたＹＤＡ培地対照よりも高かった。無細胞増殖ブロスが、５０倍希釈されたものとして試験された場合には、バックグラウンドレベルを超える放出は認められなかった（図１３）。ＨＨ０２及びＨＨ０４株から得られた無細胞ブロスは、２時間のインキュベーション中にＮＣＩ－Ｈ７１６の生存率に影響を与えず、ＧＬＰ－１放出が、Ｌ細胞破裂に起因しないことが実証された（図１４）。

実施例９．マウスモデルを使用する実験的大腸炎におけるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）用いる予防的処置
この研究では、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘発急性大腸炎モデル（Ｆｏｌｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ，２００７ ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ１３．ｉ２．２３６）を使用した。大腸炎は、マウスにおいて、ＴＮＢＳの単回直腸内投与によって誘発させ、その後、マウスを２日間観察した。実施例１に記載したラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０１～ＨＨ０５を、この研究に使用した。

研究計画
この実験のために、７つの群の１５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを使用した。マウスを、順化のために第－１９日にケージに移し、食料及び滅菌水を自由に利用させた。

第－５日～第１日に、マウスはそれぞれ、以下のスキームで指定した通りに賦形剤、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含有する１００μＬの強制経口投与を受けた。賦形剤として、ＭｇＣｌ₂を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｃａｔ．１００１０－０２３，Ｇｉｂｃｏ）を使用した。

第０日に、ＴＮＢＳ（それぞれＴＮＢＳ＋ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株）群のマウスはそれぞれ、大腸炎を誘発する１００ｍｇ／ｋｇ ２，４，６－ＴＮＢＳ（エタノール中）の直腸内投与を受けた。

マウスは、第２日に屠殺した。

試料採取
第－６日～第２日まで臨床徴候を観察した：
・体重（図１５参照）
・結腸のＷａｌｌａｃｅスコア化（Ｆｏｌｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ，２００７ ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ１３．ｉ２．２３６）。
研究の最後に、結腸湿重量及び結腸長さを決定し（図１６参照）、次の試料を収集した：
・末梢放血 血漿試料
・直腸試料 瞬間凍結される
・結腸試料（図１７参照）
・盲腸内容物試料
・少量の糞便 第－６日及び０日に収集される

結果：
試験された株は、Ｗａｌｌａｃｅスコアに反映される優れた抗炎症効果を示した。

予想通り、賦形剤対照群は、いかなる結腸損傷も示さなかったのに対して、疾患対照（ＴＮＢＳ群）は、２～３の平均損傷スコアを有していた。ＨＨ０１～ＨＨ０５株のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株投与を受けた群は、ＴＮＢＳ（疾患対照）群と比較して、約１という平均損傷スコアに反映される、結腸損傷の低下を示した。

さらに、炎症促進性サイトカインＩＬ１２、ＴＮＦ－α、ＩＬ１ｂ、ＩＬ２５、ＩＬ６、及びＩＬ１７Ａ、並びに調節性サイトカインＩＬ１０のレベルは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株群において、疾患対照と比較してすべて低く（図１８参照）、これは、炎症の減弱を実証した。このように、この実験は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株が、結腸の炎症を軽減する能力があることを示した。

したがって、全般的臨床状態は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０１～ＨＨ０５によって改善された。

実施例１０．典型的な高脂肪食を与えられた食餌誘導性マウスモデルにおけるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の影響
この研究は、食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスモデルにおける、２種のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株試験株（ＨＨ０４及びＨＨ０５）による代謝的健康の改善、例えば前糖尿病を緩和させることを実証することを目標としていた。この研究は、高脂肪食（ＨＦＤ）を受けると同時に、１２週間の毎日の強制経口投与によるこれらの株の投与を用いる、ＤＩＯに対する予防的取り組みを行った（研究概要については、図２１を参照のこと）。

研究概要：
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｍａｉｎｅ ＵＳＡ）を、１２匹のマウスを４つに分けて（３マウス／群）登録し、毎週（４週間）の治療を開始した。すべてのマウスは、実験の開始時（第０週）に、８週齢であった。マウスを、実験開始の２週前に、順化のためにケージに移した。順化期間には、マウスに、低脂肪食（ＬＦＤ）及び水を自由に利用させた。

実験は、第０週に開始し、ここで、マウスは、実験食に移行し、以下のスキームに従って、１００μＬの総体積の毎日の強制経口投与を受けた。この実施例で使用されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株は、実施例１に記載したラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＨＨ０４株及びＨＨ０５株であった。

試料採取及び測定
それぞれのマウスの体組成を、実験プロトコルの第０、４、８、及び１２週において、核磁気共鳴（ＭＲ）スキャン（Ｂｒｕｋｅｒ、毎日使用時に較正する）３回の測定の平均によって評価した。

新鮮な糞便を、毎日の強制経口投与の前、明周期の初めに（午前９時±１時間）、ＭＲスキャンと同時に収集した。試料を、すぐにドライアイス上で凍結し、さらなる処理まで－８０℃で保管した。

体重を、毎週、午前８～９時に測定した。重量推移及び体組成を、図２２に示す。１０～１２匹のマウス／群の平均を示す。Ａ）無作為化後の重量。Ｂ）実験食及び強制経口投与治療の開始後のそれぞれの群における重量推移。Ｃ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られた総重量に対する％としての体脂肪量。Ｄ）接続線と共に群平均として表される、グラムでの体脂肪量。Ｅ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、総重量に対する％としての除脂肪量。Ｆ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、総重量に対する％としての流体質量。

マウスを、（午前９時±１時間）に、豊かだが巣作り材料はない、新しい清潔なケージに移した。食餌を、移動時と、再び２４時間後に測定し、ここで、マウスを、再び清潔な標準のケージ（巣作り材料を含む）に移した。２４時間の糞便を、寝床から注意深く収集し、さらなる処理まで－８０℃で保管した。

グルコース負荷試験、グルコース刺激によるインスリン分泌、及び腸管透過性試験
実験プロトコルの第１０週に、経口グルコース負荷試験を実施した。マウスを、午前８時から５時間絶食させ、午前１０時に強制経口投与を行った。５時間絶食の血糖測定（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｖａｒｉｏ Ｆｌｅｘ，ＬｉｆｅＳｃａｎ）、及び尾静脈からの血液の採取を実施し、その後、４μＬ／ｇ（除脂肪量）の５０％デキストロース溶液及び１５０μＬスルホン酸溶液を用いる強制経口投与を行った。スルホン酸溶液は、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩（ＣＭＣ）（Ｓｉｇｍａ）を蒸留水に入れた１５０μＬ懸濁液に溶解された１．５ｍｇフルオレセイン－５（６）－スルホン酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から構成されていた。血糖は、デキストロース負荷後に、０、１５、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で尾静脈穿刺から測定し、インスリン及び腸管透過性のための血液試料は、負荷後の０、１５、３０、６０、及び１２０分の時点で、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が準備されている毛細管チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中に採取した。

マウスは、再び水分補給をさせる手順の後、０．５ｍＬ生理食塩水（Ｈｏｓｐｉｒａ）を受けた。血液試料を、４℃で１０００ｒｃｆで１０分間遠心分離した。インスリン測定のために、最初の５μＬの血漿を、ドライアイス上の９６ウェルＰＣＲプレートに移し、その先の処理まで－８０℃に維持した。腸管透過性試験に使用される次の５μＬの血漿を、黒色９６ウェルオプティカルボトムプレート（ｏｐｔｉｃａｌ－ｂｕｔｔｏｎ ｐｌａｔｅ）（Ｎｕｎｃ）に移し、１５０μＬの０．５％ ＣＭＣ（蒸留水中）の添加まで氷上に維持し、十分に混合した。プレートを、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で、４８５／５２８ｎｍの励起／発光波長で読み取った。

インスリンレベルを、マウス超高感度インスリンＥＬＩＳＡ（Ａｌｐｃｏ）によって、製造者のプロトコルに従って測定し、ＥｎＳｐｉｒｅ ２３００マルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で定量化した。

グルコース調節及び腸管透過性に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果を、図２３に示す：Ａ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食の血糖。バー：１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｂ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食のインスリンレベル。バー：１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｃ、Ｅ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食マウスにおける経口グルコース負荷試験。Ｃは負荷（２μｇ／ｇ（除脂肪量））中の血糖値を表し、Ｅは、グルコース負荷に応答する内因性インスリンの血漿中濃度を表す。１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｄ）ＯＧＴＴ第１０週についての曲線下面積。バー：１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｆ）ＧＳＩＳ第１０週についての曲線下面積。バー：１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｇ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食マウスにおける経口負荷（１５０μＬ／マウス、濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）後の血漿スルホン酸蛍光単位。１０～１２匹のマウス／群の平均。Ｈ）１２週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療中の累積的食餌摂取／マウス。同一ケージ収容により、摂取は、各群における、ｎ＝４を伴うケージあたりのマウス１匹あたりの平均である。バー：平均。Ａ～Ｇ）すべてのマウスは、経口負荷の３時間前に、そのそれぞれの治療での強制経口投与が行われた。

屍検
剖検は、実験プロトコルの第１２週において実施した。マウスは、午前７時から絶食させ、午前１０時に強制経口投与が行われた。安楽死は、ケージごとにマウスを１匹ずつ選ぶ交互の順序で行った。第１回の安楽死は、Ｂ群から開始して続いてＣなど、第２回は、Ｃ群などから開始し、残りの回については、それぞれ、Ｄ及びＡ群から開始した。マウスを、イソフルラン（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ）で麻酔した。２５Ｇ針と、ＥＤＴＡでコーティングされた１ｍＬシリンジ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、心臓穿刺を行った。血液を、１μＬのジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び１μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有するエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに移した。試料を、１０００ｒｃｆで１０分間遠心分離し、血漿を３つに分けて分注し、ドライアイス上に置き、さらなる処理まで、－８０℃保管に移した。

組織採取
肝臓、膵臓、精巣上体白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）、後腹膜白色脂肪組織（ｒｐＷＡＴ）、間葉系白色脂肪組織（ｍＷＡＴ）、心臓、四頭筋、腓腹筋、脳、及び結腸の重量を測定し、これらの組織を、すぐに液体窒素中で凍結させ、－８０℃で保管した。組織は、同じ操作者によって切断され、すべてのマウスについて、同じ順序で行われた。脳は、＜６０秒で液体窒素中で凍結させた（死後脳）。

組織重量に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果を、図２４に示し、ここでは、バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ａ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の肝臓の重量。Ｂ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時の結腸の長さ。バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均を示す。Ｃ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時のｉＷＡＴの重量。Ｄ）１２週の毎日の強制経口投与後の剖検時のｅＷＡＴの重量；また、図２５では、バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均を表す。Ａ）ｒｐＷＡＴの重量。Ｂ）ｍＷＡＴの重量。Ｃ）脳の重量。Ｄ）心臓の重量。

小腸（胃から盲腸まで）及び結腸（盲腸から直腸まで）の長さを測定し、取り扱う時間全体を通して氷を下に置くことによって冷却されるプレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）プレート上に維持した。十二指腸は、小腸の最初の５ｃｍであるとみなし、残りの小腸組織を、等しい長さの３つの部分に分けた。最初の３ｃｍは廃棄し、残りの小腸の近位の２／３を、空腸と分類した。小腸の遠位の１／３の最初の３ｃｍは廃棄し、残りの組織を、回腸と分類した。十二指腸、空腸、回腸、及び結腸の最も近位のｃｍを、腸組織を空にする前に、組織学検査のために（粘膜層完全性を維持するために）カルノア液に入れて取っておいた。

小腸、盲腸、及び結腸の内容物を、機械圧力によって単離し、ドライアイス上で凍結し、続いて、－８０℃で保管した。十二指腸、空腸、回腸、結腸、及び盲腸からの組織は、液体窒素中で瞬間凍結し、－８０℃で保管した。第１回目は、肝臓、膵臓、ｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、ｒｐＷＡＴ、ｍＷＡＴ、心臓、四頭筋、及び腓腹筋からの組織学検査のための組織を、４％パラホルムアルデヒド溶液中で７２時間保存し、それに続いて７０％エタノール中で保存した。第２～４回目は、肝臓、ｅＷＡＴ、ｉＷＡＴ、及びｍＷＡＴからの組織学検査のための組織を、４％パラホルムアルデヒド溶液中で７２時間保存し、それに続いて７０％エタノール中で保存した。すべての回について、肝臓組織を、さらにＯ．Ｃ．Ｔ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）中で保存して、組織学的Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ脂質染色を可能にした。

血漿生化学的分析
肝臓損傷及び脂質レベルの血漿バイオマーカーに対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果を、図２６に示し、ここでは、バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、Ｂ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、Ｃ．１）トリグリセリド（すべてのデータポイントが含まれる）、Ｃ．２）Ｃ．１と同様だが、使用されたアッセイの検出限界の評価後に、２つのデータポイントが除外された。Ｄ）総コレステロール。これらの分析は、ラヴァル大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｌａｖａｌ）の医化学部門（ｍｅｄｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）、心肺研究所（Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって、ヒト及び動物試料の取り扱い及び分析についての最も高い基準を満たす、地域で開発された手順の下で実施された。

ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の、他の血漿マーカーに対する効果を、図２７に示し、ここでは、バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ａ）血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｂ）アディポネクチン、Ｃ）非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、Ｄ）ＬＰＳは、ＥＬＩＳＡキット製造者のプロトコルに従って担持された。

肝臓脂質蓄積
各マウスの肝臓を、凍結されたまま乳鉢と乳棒で組織を低温粉砕することによって、液体窒素中でホモジナイズし、新しいチューブに移した。５０ｍｇの粉末化された組織から、脂質を抽出した。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の肝脂質蓄積に対する効果を、熱量測定によって測定し、図２８に示し、ここでは、バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ａ）トリグリセリド及びＢ）コレステロール。

腸内サイトカイン定量化
サイトカインレベルは、ホモジナイズされた結腸組織において、製造者の指示に従ってＢｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００ Ｌｕｍｉｎｅｘシステムを使用して測定した。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の、結腸におけるサイトカインレベルに対する効果を、Ａ）インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）及びＢ）ＩＬ－１０の図２９に示し、ここでは、バーは、１０～１２匹のマウス／群の平均値を表す。

腸内微生物叢分析
細菌ＤＮＡを、凍結された糞便試料から抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して高頻度可変性Ｖ３－Ｖ４ １６Ｓ ｒＲＮＡ領域を増幅及び配列決定した。

配列データを、前処理し、タグ識別及びトリミングし、４というクオリティスコアで、且つ少なくとも１００ｂｐのオーバーラップを必要とするペアエンドリードをマージし、切断した。マージされたリード長は、３００～６００ｂｐの長さであった。配列を、厳密に反復排除し、５配列未満のクラスターを排除した。配列を、重心として最も豊富な厳密に反復排除したリードを使用し、且つ内部比較に基づいてキメラと疑われるものを排除して、９７％配列類似性でクラスター化した。ＯＴＵの分類学的割り当ては、リボソームデータベースプロジェクト（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）からのデータベースを使用して行われる。

ＨＨ０４又はＨＨ０５株に特異的なプライマーを用いる定量的ＰＣＲを使用して、腸の内容物からの試料中に存在するプロバイオティクスＤＮＡの量を定量化した。任意単位における相対量を、図３０に示し、ここでは、バーは、１０～１２本の試料／群の平均を示し、ここでは、Ａ）示された群からの糞便試料中のＨＨ０４量、Ｂ）小腸内容物中のＨＨ０４量、Ｃ）糞便試料中のＨＨ０５、及びＤ）小腸試料中のＨＨ０５。

腸内微生物叢組成に対するプロバイオティクスの効果を、図３０に示し、ここでは、Ｅ）は、糞便微生物叢組成の重み付けされたＵｎｉＦｒａｃ距離の主座標分析（ＰＣｏＡ）であり、大きい点は各群の平均を示し、小さい点は個々の試料を示す。Ｆ）Ｅと同様だが、小腸内容物の微生物叢組成。

結果－重量推移
ＨＦＤ実験群において、ＬＦＤ順化食からＨＦＤへの変更の前、第０週では、すべての群において、体重分布は同様であった。Ｃ群におけるＨＨ０４での毎日の強制経口投与は、高脂肪食での体重増加を、第６週以降、Ｂ群と比較して有意に低下させた。ＨＨ０５で強制経口投与が行われたＤ群は、体重増加に対する同じ効果を呈さなかった。低脂肪食のＡ群は、第２週から研究期間全体を通して、Ｂ群よりも重量が有意に増大しなかった。

第０週では、群間で体脂肪量の差はなかった。ＨＨ０４での強制経口投与は、Ｃ群における高脂肪食で、Ｂ群と比較して、第４、８、及び１２週において、より低い脂肪率をもたらした。この結果は、より低い体重増加が、より低い体脂肪量の増加によって引き起こされることを示唆する。同様に、Ａ群は、Ｂ群と比較して、第４、８、及び１２週において、有意に低い脂肪率を示した。Ｄ群は、Ｂ群と比較して、研究期間全体を通していかなる時点でも、脂肪率の差を呈さなかった。グラムでの脂肪の絶対量は、Ａ群では第４、８、及び１２週において、Ｃ群では第８及び１２週において、Ｂ群と比較して有意に低かった。Ｄ群は、測定されたすべての時点で、Ｂ群と同様の体脂肪絶対量を有していた。

総重量のパーセンテージとしての除脂肪量は、第０週では、群間で等しかった。除脂肪量のパーセンテージは、Ｃ及びＡ群では、Ｂ群と比較して、第４、８、及び１２週において有意に増大した。これらの結果は、より低い体重増加が、より低い体脂肪量の増加に対して特異的であったことをさらに裏付ける。これらの結果は、ＨＨ０４が、体組成に対する有意な影響を有するという、また、この株の毎日の投与が、脂肪含量を低下させることができるという結論を裏付ける。

結果－グルコース調節及び腸管透過性に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
５時間絶食の血糖は、Ａ及びＣ群では、対照Ｂ群と比較して有意に低かった。５時間絶食後のインスリンレベルは、Ａ及びＣ群では、Ｂ群と比較して有意に低かった。Ｄ群は、Ｂ群と比較して、空腹時血糖又はインスリンレベルの差を示さなかった。

Ａ群は、経口グルコース負荷試験全体を通して、Ｂ群よりも低い血糖値を有していた。Ｃ群は、グルコース負荷の３０、６０、及び９０分後に、Ｂ群よりも低い血糖値を呈し、これは、より良好な耐糖能を示唆する。同様に、経口グルコース負荷試験からの曲線下面積は、Ａ及びＣ群における全般的な耐糖能の改善を示唆した。Ｄ群は、経口グルコース試験中の血糖値の改善を示さず、曲線下面積も減少させなかった。

Ｃ群は、グルコース負荷後の最初の１５分、Ｂ群と比較して、グルコース刺激によるより低いインスリン分泌を有しており、ＨＨ０４の強制経口投与後のインスリン感受性の改善を示唆していた。対照的に、Ａ群は、経口グルコース負荷後に、Ｂ群と比較して、インスリンレベルの統計的差異を示さなかった。Ａ群は、グルコース負荷時に、試験の最初の１時間、Ｂ群よりも少ないインスリンを分泌したのに対して、Ｄ群は、試験全体を通して、Ｂ群と違いがなかった。経口グルコース負荷試験中のインスリンレベルの曲線下面積は、Ａ群とＢ群との間に有意差を示し、残りの群に対する差はなかった。

結果－組織重量に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
肝臓重量は、Ｂ群と、Ａ及びＣ群との間で、それぞれ低かった。

ｉＷＡＴ質量、皮下脂肪蓄積は、Ａ及びＣ群では、Ｂ群と比較して低く、Ｄ群に対する差はなかった。

ｍＷＡＴ質量、内臓脂肪蓄積は、Ａ及びＣ群では、Ｂ群と比較して有意に低かった。Ｂ群とＤ群との間に差は認められなかった。

脳及び心臓の重量は、食餌又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株投与とは無関係で、いずれかの群の間で違いはなかった。

結果－血漿脂質及び肝臓の健康バイオマーカーに対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、すなわち肝臓損傷のための一般的に使用されるバイオマーカーは、ＨＨ０４で治療されたＣ群において、疾患対照Ｂ群と比較して低かった。

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、すなわち代替の肝臓疾患バイオマーカーは、群間で、ＡＬＴレベルほど変化しなかったが、疾患対照Ｂ群と比較して、ＨＨ０４（Ｃ群）によって低下する傾向にあった。

循環トリグリセリドレベルは、群の間で違いはなかった。

総循環コレステロールレベルは、疾患対照において、健常な対照（Ｂ及びＣ群）と比較して増大し、ＨＨ０４又はＨＨ０５の治療（Ｃ及びＤ群）によって低下した。

結果－肝臓脂質蓄積に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
肝組織におけるトリグリセリド及びコレステロールの蓄積は、Ａ群と比較してＢ群において脂質レベルの増大が認められる場合、肥満及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の指標である。トリグリセリドとコレステロールレベルは両方とも、Ｃ群では、Ｂ群と比較して低下したのに対して、Ｄ群は、同様の脂質蓄積を有していた。

結果－ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の腸炎に対する効果
Ｂ群では、Ａ群と比較して、典型的に炎症促進性のサイトカイン・インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）が増大した。ＩＦＮγのレベルは、Ｃ群では、Ｂ群と比較して低下した。抗炎症性サイトカインＩＬ－１０は、Ｂ群では、Ａ群と比較して増大した。

結果－腸内微生物叢組成に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
ＨＨ０４ ＤＮＡは、このラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株で治療したマウスのみに、糞便と小腸試料において同様の量で見られた。ＨＨ０５ ＤＮＡは、賦形剤対照及びＨＨ０４で治療されたマウスの糞便試料において少量で見られたが、ＨＨ０５で治療されたマウスで、はるかに豊富であった。小腸内容物では、ＨＨ０５は、このラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株で治療したマウスのみに見られた。全般的な糞便微生物叢組成は、食餌によって大きく影響を受けた。ＨＨ０５で治療されたマウスの糞便微生物叢組成は、賦形剤で治療されたＨＦＤを与えられたマウスとＬＦＤを与えられたマウスの間でクラスター形成し、ここでは、ＨＨ０４で治療されたマウスは、対照と類似した糞便微生物叢を有していた。小腸の微生物叢組成も、食餌によって大きく影響を受け、ＨＨ０４及びＨＨ０５で治療されたマウスは両方とも、対照とは別にクラスター形成し、したがって、異なる微生物組成を有していた。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株治療が、腸内微生物叢組成を適度に調節することが示された。

結論
典型的な高脂肪食では、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０４は、体重及び体脂肪量の増加を緩和したのに対して、除脂肪量のパーセンテージを増大させた。さらに、ＨＨ０４は、５時間絶食のグルコース及びインスリンレベルを低下させ、耐糖能及びインスリン感受性を、高脂肪対照と比較して増大させた。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０４はまた、皮下脂肪蓄積ｉＷＡＴ及び内臓脂肪蓄積ｍＷＡＴ及び肝臓脂質蓄積の質量を低下させ、腸炎を、より抗炎症性のプロフィールに変化させた。

ＨＨ０５は、循環するコレステロールレベルを低下させ、典型的な高脂肪食との組み合わせにおいて腸内微生物叢を変化させる。

実施例１１ 改変高脂肪食を与えられた食餌誘導性マウスモデルにおけるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の影響
この研究は、ヒト肥満表現型と類似した炎症を誘発するように設計された、改変されたウエスタンダイエット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｄｉｅｔ）を使用する食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスモデルにおける、３種のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株試験株（ＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５）による前糖尿病などの代謝的健康の改善を実証することを目標としていた。この研究は、食餌と、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＨＨ０２の添加を除いて、実施例１０に示した研究と同一であった。研究概要を、図２１に示す。

研究概要：
この研究は、以下の群Ｅの追加、及び増強された炎症を特徴とする肥満表現型を誘発するための食餌の変更を除いて、実施例１０に記載した通りに設計及び実施した：

試料採取及び測定：
重量推移及び体組成を、図３１に示す。９～１２匹のマウス／群の平均を示す。Ａ）無作為化後の、実験食及び治療の開始前の体重。Ｂ）実験食及び強制経口投与治療の開始後のそれぞれの群における重量推移。Ｃ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られた総重量に対する％としての体脂肪量。Ｄ）接続線と共に群平均として表される、グラムでの体脂肪量。Ｅ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、グラムでの除脂肪量。Ｆ）表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、総重量に対する％としての流体質量。

グルコース負荷試験及びグルコース刺激によるインスリン分泌
実験プロトコルの第１０週に、経口グルコース負荷試験を実施した。マウスを、午前８時から５時間絶食させ、午前１１時に強制経口投与を行った。５時間絶食の血糖測定（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｖａｒｉｏ Ｆｌｅｘ，ＬｉｆｅＳｃａｎ）、及び尾静脈からの血液の採取を実施し、その後、１．５μｇデキストロース／ｇ（除脂肪量）を用いる強制経口投与を行った。血糖は、デキストロース負荷後に、０、１５、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で尾静脈穿刺から測定し、インスリン及びｃ－ペプチドのための血液試料は、負荷後の０、１５、３０、６０、及び１２０分の時点で、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が準備されている毛細管チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中に採取した。マウスは、再び水分補給をさせる手順の後、０．５ｍＬ生理食塩水（Ｈｏｓｐｉｒａ）を受けた。

グルコース調節及び腸管透過性に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果を、図３２に示す：Ａ）１０週のＷＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食の血糖。バーは９～１２匹のマウス／群の平均を示す。Ｂ）１０週のＷＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食のインスリンレベル。バー：９～１２匹のマウス／群の平均。Ｃ）血糖の絶対値を示す、１０週のＷＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の経口耐糖能。Ｄ）Ｃと同様だが、負荷中の血糖のベースラインからの変化を表す。Ｅ）グルコース負荷試験に応答する内因性インスリンの血漿中濃度。Ｆ）グルコース負荷試験中のＣ－ペプチドレベル。

屍検及び組織採取
剖検は、１２週の実験プロトコル後に実施した。マウスは、午前８時から絶食させ、午前１１時に強制経口投与が行われた。安楽死は、マウスを１匹ずつ選ぶ交互の順序で行った。２５Ｇ針と、ＥＤＴＡでコーティングされた１ｍＬシリンジ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、心臓穿刺を行った。重量を測定し、これらの組織を、すぐに液体窒素中で凍結させ、－８０℃で保管した。組織は、同じ操作者によって切断され、すべてのマウスについて、同じ順序で行われた。

組織重量に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果を、図３３に示し、ここでは、バーは、９～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ａ）グラムでの肝臓重量 Ｂ）鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）重量、Ｃ）後腹膜白色脂肪組織（ｒｐＷＡＴ）重量、Ｄ）間葉系白色脂肪組織（ｍＷＡＴ）重量、Ｅ）肩甲骨内（ｉｎｔｒａｓｃａｐｕｌａｒ）褐色脂肪組織（ＢＡＴ）重量、及びＦ）腓腹筋重量。

血漿生化学的分析
肝臓損傷及び脂質レベルの血漿バイオマーカーに対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果を、図３４に示し、ここでは、バーは、９～１２匹のマウス／群の平均値を表す。これらの分析は、ラヴァル大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｌａｖａｌ）の医化学部門（ｍｅｄｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）、心肺研究所（Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって、ヒト及び動物試料の取り扱い及び分析についての最も高い基準を満たす、地域で開発された手順の下で実施された。Ａ）肝臓損傷のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）バイオマーカー、Ｂ）肝臓損傷のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）バイオマーカー、Ｃ）血漿トリグリセリドレベル、Ｄ）血漿総コレステロールレベル。

肝臓脂質蓄積、及び肝組織におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化
各マウスの肝臓を、凍結されたまま乳鉢と乳棒で組織を低温粉砕することによって、液体窒素中でホモジナイズし、新しいチューブに移した。５０ｍｇの粉末化された組織から、脂質を抽出した。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の肝脂質蓄積に対する効果を、熱量測定によって測定し、図３５に示し、ここでは、バーは、９～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ａ）肝組織における総トリグリセリド量、及びＢ）肝組織における総コレステロール含有量。

３～４匹のインスリン刺激されたマウス／群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ群）の肝組織における、リン酸化された（活性化された）Ａｋｔ及び総Ａｋｔのタンパク質レベルを、ｐＳ４７３ Ａｋｔ及びｐａｎ Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用するウエスタンブロットによって定量化し、ＢｉｏＲａｄソフトウェアを使用して定量化した。Ａｋｔ経路の活性化におけるインスリン－刺激の感受性に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果を、図３５Ｃ）任意単位で表される肝組織における活性化されたＡｋｔ（ｐＳ４７３ Ａｋｔ）の総Ａｋｔタンパク質レベルに対する比に示す。

組織サイトカイン定量化
サイトカインレベルは、ホモジナイズされた肝臓及び結腸組織において、製造者の指示に従ってＢｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００ Ｌｕｍｉｎｅｘシステムを使用して測定した。そのレベルを、図３６に示し、ここでは、バーは、９～１２匹のマウス／群の平均値を表す。Ａ）肝組織における腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）レベル、Ｂ）肝組織におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）レベル、Ｃ）結腸組織における腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）レベル、Ｄ）結腸組織におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）レベル。

腸内微生物叢分析
細菌ＤＮＡを、凍結された糞便試料から抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して高頻度可変性Ｖ３－Ｖ４ １６Ｓ ｒＲＮＡ領域を増幅及び配列決定した。

配列データを、前処理し、タグ識別及びトリミングし、４というクオリティスコアで、且つ少なくとも１００ｂｐのオーバーラップを必要とするペアエンドリードをマージし、切断した。マージされたリード長は、３００～６００ｂｐの長さであった。配列を、厳密に反復排除し、５配列未満のクラスターを排除した。配列を、重心として最も豊富な厳密に反復排除したリードを使用し、且つ内部比較に基づいてキメラと疑われるものを排除して、９７％配列類似性でクラスター化した。ＯＴＵの分類学的割り当ては、リボソームデータベースプロジェクト（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）からのデータベースを使用して行われる。

腸内微生物叢組成に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果を、図３７に示す。図３７は、糞便微生物叢組成の重み付けされたＵｎｉＦｒａｃ距離の主座標分析（ＰＣｏＡ）を示し、大きい点は各群の平均を示し、小さい点は個々の試料を示す。

結果－重量推移に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
強制経口投与及び実験食による毎日の治療の開始前の、研究の開始時には、これらの群の体重は同様であった。ＨＨ０４又はＨＨ０５で治療された群は、改変されたＷＤを与えられた場合、研究期間中、重量の増加がわずかに少なく、ＨＨ０２で治療された群は、研究中、重量の増加が少なかった。

脂肪（％）は、研究期間の最初には、すべての群において同様であり、改変されたＷＤの給餌は、脂肪（％）を増大させた。ＨＨ０４、ＨＨ０５、又はＨＨ０２で治療された群は、研究の第４、８、及び１２週の間、わずかに低い脂肪（％）を有していたのに対して、除脂肪量及び流体質量は、対照群から変化しなかった。

結果－グルコース調節に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
５時間の絶食後の血糖値は、マウスが改変されたＷＤを１０週間与えられた場合、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株治療の効果はなく、増大した。しかし、対応する５時間絶食のインスリンレベルは、ＨＨ０４で治療されたマウスではわずかに低下し、ＨＨ０５又はＨＨ０２で治療されたマウスでは著しく低下し、これは、これらの治療によるグルコースホメオスタシスの改善を示した。

経口グルコース負荷中、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株で治療された群における、ＨＨ０２で治療された群で最も顕著な、少しの改善が存在していた。対応するグルコース刺激によるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）は、ＨＨ０２又はＨＨ０５で治療されたマウスでは強力に低下し、ＨＨ０４治療群ではわずかに低下し、インスリン感受性の改善の方向を示していた。Ｃ－ペプチドレベルは、ＨＨ０４株からのいくらかの効果と共に、特にＨＨ０２及びＨＨ０５株による、グルコース負荷中のインスリン産生の低下をさらに裏付けた。

結果－組織重量に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
肝臓重量は、改変されたＷＤの給餌によって高度に増大し、これは、ＨＨ０２、ＨＨ０４、又はＨＨ０５のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株治療によって低下した。種々の白色脂肪組織は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株治療によって減少する傾向があり、ＨＨ０２で治療されたマウスで最も顕著であった。褐色脂肪組織は、ＨＨ０４で治療された群において低下する傾向があったのに対して、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株治療のいずれかによる筋肉量の差は存在しなかった。

結果－血漿脂質及び肝臓の健康バイオマーカーに対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
肝臓損傷のマーカーＡＬＴは、改変されたＷＤの給餌によって高度に増大した。これは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の治療によって、最も顕著にはＨＨ０２治療によって改善した。肝臓損傷の別のマーカー、ＡＳＴで、同様の知見が得られた。ＨＨ０５又はＨＨ０２で治療されたマウスにおいて、それぞれ、循環トリグリセリド及びコレステロールのレベルが低下した。改変されたＷＤを与えられたマウスにおいて観察された肝組織におけるトリグリセリド及びコレステロールの蓄積は、ＨＨ０２、ＨＨ０４、又はＨＨ０５の治療によって低下した。リン酸化されたＡｋｔの総Ａｋｔタンパク質レベルに対する比の増大によって認められるＡｋｔ経路の活性化は、改変されたＷＤを与えられたマウスでは、肝組織において低下した。肝臓におけるインスリン抵抗性の徴候は、Ａｋｔ活性化の増大によって観察された通り、ＨＨ０４又はＨＨ０２治療によって打ち消された。

結果－肝臓及び腸組織における炎症に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
改変されたＷＤを与えられたマウスは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株治療の効果はなく、肝組織における、増大したレベルの炎症促進性サイトカインＴＮＦａ及びＩＦＮγを有していた。結腸組織では、ＨＨ０５又はＨＨ０２で治療されたマウスは、サイトカインレベルの低下を有していた。

結果－腸内微生物叢組成に対するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の効果
全般的な糞便微生物叢組成は、食餌によって大きく影響を受けた。ＨＨ０２、ＨＨ０４、又はＨＨ０５で治療されたマウスの糞便微生物叢組成は、対照とは別にクラスター形成したが、この影響は、ＬＦＤからＷＤ対照群までの距離よりも小さかった。これは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株治療が、腸内微生物叢組成に対する穏やかな効果を誘発することを示した。

結論
この研究は、食餌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の有効性に影響を与えることを示す。マウスが炎症促進性の改変されたＷＤを与えられる現在の研究では、ＨＨ０４で治療されたマウスは、体重及び肝臓重量低下に対するわずかな効果をさらに示し、ＨＨ０４で治療されたマウスは、グルコース負荷試験中に、より少ないインスリンを分泌し、インスリン感受性の改善が示された。これは、さらに、血漿中で測定される肝臓損傷マーカーの減少、肝臓脂質及びコレステロール蓄積の低下、及び肝組織におけるインスリンシグナル伝達の増強によって裏付けられた。

ＨＨ０５での治療は、空腹時の及びグルコース刺激によるインスリンを大きく低下させ、インスリン感受性の改善を示した。さらに、肝臓重量、肝臓損傷マーカー、トリグリセリド、及び肝臓のコレステロールレベルは、ＨＨ０５治療によって低下した。循環コレステロールレベルも、結腸の炎症の低下と同時に、ＨＨ０５治療によって低下した。

ＨＨ０２で治療されたマウスは、研究中に、体重増加の緩和を示した。グルコース負荷試験中、ＨＨ０２で治療されたマウスは、対照群よりも早く、そのベースライン血糖に戻り、空腹時の及びグルコース刺激によるインスリンレベルを大きく低下させ、インスリン感受性の大きな改善を示した。ＨＨ０２治療は、循環コレステロール及びトリグリセリドのレベルを低下させるのに加えて、肝臓及び間葉系脂肪組織重量を低下させた。肝臓損傷のマーカーも、大きく低下し、肝組織におけるインスリン感受性の増大と関連していた。結腸組織では、炎症促進性サイトカインレベルは低下した。

実施例１２－２つの異なる食餌誘導性マウスモデルにおけるプロバイオティクス効果の再現性
この研究は、典型的なＨＦＤ及び改変されたウエスタンダイエットを使用する２つの異なる食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスモデルにおける、３種のプロバイオティクス試験株（ＨＨ０２、ＨＨ０４、及びＨＨ０５）による前糖尿病などの代謝的健康の改善の再現性を実証することを目標としていた。この研究は、観察された知見を再現することを目的として、実施例１０及び実施例１１に示した研究と同一であった。さらに、典型的なＨＦＤモデルにおけるＨＨ０２の性能を、初めて試験した。研究概要を、図２１に示す。

研究概要：
この研究は、実施例１０及び１１に記載した通りに設計及び実施され、２つの高脂肪食のいずれかを同時に与えられたマウスにおける同じプロバイオティクス治療が含まれていた：

試料採取及び測定：
重量推移及び体組成を、図３８に示す。８～９匹のマウス／群の平均を示す。Ａ）研究（Ａ～Ｅ）中にＬＦ又はＨＦＤ食を与えられた群についての、無作為化後の、実験食及び治療の開始前の体重。Ｂ）研究（Ａ、Ｆ～Ｉ）中にＬＦ又は改変ＷＤ食を与えられた群についての、無作為化後の、実験食及び治療の開始前の体重。Ｃ）実験食及び強制経口投与治療の開始後の、ＬＦＤ又はＨＦＤ（Ａ～Ｅ）を与えられたそれぞれの群における重量推移。Ｄ）実験食及び強制経口投与治療の開始後の、ＬＦＤ又は改変ＷＤ（Ａ、Ｆ～Ｉ）を与えられたそれぞれの群における重量推移。Ｅ）ＬＦＤ又はＨＦＤ（Ａ～Ｅ）を与えられた群についての、表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られた総重量に対する％としての体脂肪量。Ｆ）ＬＦＤ又は改変ＷＤ（Ａ、Ｆ～Ｉ）を与えられた群についての、表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られた総重量に対する％としての体脂肪量。Ｇ）ＬＦＤ又はＨＦＤ（Ａ～Ｅ）を与えられた群についての、接続線と共に群平均として表される、グラムでの体脂肪量。Ｈ）ＬＦＤ又は改変ＷＤ（Ａ、Ｆ～Ｉ）を与えられた群についての、接続線と共に群平均として表される、グラムでの体脂肪量。Ｉ）ＬＦＤ又はＨＦＤ（Ａ～Ｅ）を与えられた群についての、表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、グラムでの除脂肪量。Ｊ）ＬＦＤ又は改変ＷＤ（Ａ、Ｆ～Ｉ）を与えられた群についての、表された時点での核磁気共鳴スキャンから得られる、グラムでの除脂肪量。

グルコース負荷試験及びグルコース刺激によるインスリン分泌
実験プロトコルの第１０週に、経口グルコース負荷試験を実施した。マウスを、午前８時から５時間絶食させ、午前１１時に強制経口投与を行った。５時間絶食の血糖測定（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｖａｒｉｏ Ｆｌｅｘ，ＬｉｆｅＳｃａｎ）、及び尾静脈からの血液の採取を実施し、その後、１．５μｇデキストロース／ｇ（除脂肪量）を用いる強制経口投与を行った。血糖は、デキストロース負荷後に、０、１５、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で尾静脈穿刺から測定し、インスリン及びｃ－ペプチドのための血液試料は、負荷後の０、１５、３０、６０、及び１２０分の時点で、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が準備されている毛細管チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中に採取した。マウスは、再び水分補給をさせる手順の後、０．５ｍＬ生理食塩水（Ｈｏｓｐｉｒａ）を受けた。

グルコース調節及び腸管透過性に対するプロバイオティクスの効果を、図３９に示す：Ａ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食の血糖。バーは、ＬＦＤ又はＨＦＤ（Ａ～Ｅ）を与えられた群あたりの９～１２匹のマウスの平均を示す。Ｂ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食の血糖。バーは、ＬＦＤ又は改変ＷＤ（Ａ、Ｆ～Ｉ）を与えられた群あたりの９～１２匹のマウスの平均を示す。Ｃ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食のインスリンレベル。バー：ＬＦＤ又はＨＦＤ（Ａ～Ｅ）を与えられた群あたりの９～１２匹のマウスの平均。Ｄ）１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の５時間絶食のインスリンレベル。バー：ＬＦＤ又は改変ＷＤ（Ａ、Ｆ～Ｉ）を与えられた群あたりの９～１２匹のマウスの平均。Ｅ）ＬＦＤ又はＨＦＤ（Ａ～Ｅ）を与えられた群における、負荷中の血糖のベースラインからの変化を示す、１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の経口耐糖能。Ｆ）ＬＦＤ又は改変ＷＤ（Ａ、Ｆ～Ｉ）を与えられた群における、負荷中の血糖のベースラインからの変化を示す、１０週のＨＦＤ給餌及び毎日の強制経口投与治療後の経口耐糖能。Ｇ）ＬＦＤ又はＨＦＤ（Ａ～Ｅ）を与えられた群における、グルコース負荷に応答する内因性インスリンの血漿中濃度。Ｈ）ＬＦＤ又は改変ＷＤ（Ａ、Ｆ～Ｉ）を与えられた群における、グルコース負荷に応答する内因性インスリンの血漿中濃度。Ｉ）ＬＦＤ又はＨＦＤ（Ａ～Ｅ）を与えられた群における、グルコース負荷試験の最初の３０分の間のＣ－ペプチドレベル。Ｊ）ＬＦＤ又は改変ＷＤ（Ａ、Ｆ～Ｉ）を与えられた群における、グルコース負荷試験の最初の３０分の間のＣ－ペプチドレベル。

結果－重量推移に対するプロバイオティクスの効果
強制経口投与及び実験食による毎日の治療の開始前の、研究の開始時には、これらの群の体重は同様であった。ＨＦＤを与えられ（実施例１０の通り）、且つＨＨ０４で治療された群は、研究中、重量の増加が少なかった。改変ＷＤを与えられた群は、プロバイオティクス治療にかかわらず、体重増加を緩和しなかった。実施例１０で観察された通り、ＨＦＤを与えられた、且つＨＨ０４で治療された群は、体脂肪量増加が緩和した。マウスが改変ＷＤを与えられた場合には、プロバイオティクス治療は、体脂肪量増大を緩和しなかった。除脂肪量増加は、食餌に関係なく、プロバイオティクス治療によって影響を受けなかった。

結果－グルコース調節に対するプロバイオティクスの効果
５時間の絶食後の血糖値は、ＨＦＤ又は改変ＷＤを与えられたマウスでは増大し、これは、プロバイオティクス治療によって影響を受けなかった。５時間の絶食後のインスリンレベルは、マウスがＨＦＤを与えられた場合には増大し、ＨＨ０４でさらに治療されたマウスでは低下した。改変ＷＤを与えられたマウスは、空腹時インスリンレベルの増大を、これまでに呈した。ＨＨ０５でさらに治療されたマウスは、空腹時インスリンレベルを有意に低下させ、ここで、ＨＨ０２で治療されたマウスは、空腹時インスリン値の大きな低下を有していた。

１０週のＨＦＤの給餌の後の経口グルコース負荷試験中、ＨＨ０４で治療されたマウスは、実施例１０における知見と同様の試験中に血糖値の低下を有しており、これは、耐糖能の改善を示す。改変ＷＤを与えられたマウスは、グルコース負荷試験では、より悪い結果を受けたが、これは、ＨＨ０５又はＨＨ０２の治療によって軽減された。グルコース刺激によるインスリン分泌は、試験中のインスリンとｃ－ペプチドレベルとの両方によって認められる通り、ＨＦＤを与えられた場合にＨＨ０４を与えられたマウスでは、その対照群と比較して低下した。改変ＷＤを与えられた場合にＨＨ０２で治療されたマウスは、インスリンとｃ－ペプチドレベルとの両方を低下させ、これは、これらのマウスにおける著しく改善されたインスリン感受性を示した。改変ＷＤを与えられ、且つＨＨ０５で治療されたマウスは、対照と比較して、ｃ－ペプチドレベルの低下を呈した。

結論：
様々なプロバイオティクス株の有益な効果は、マウスが与えられる食餌に依存する。実施例１０及び実施例１１で認められた、２つの実験食に対する体重及びグルコース調節に対する各プロバイオティクス株の効果は、現在の研究において全般的に再現された。まとめると、ＨＨ０４株は、通常のＨＦＤに対して、体重及び体脂肪量を低下させる（これは、グルコース調節の改善と言い換えられる）効果を示した。ＨＨ０５株は、マウスが炎症促進性の改変ＷＤを与えられた場合に、様々なグルコース負荷試験読み取り値の有益な効果を示す。ＨＨ０２株は、インスリン抵抗性の多大な低下を示し、それによって、マウスが炎症促進性の改変されたＷＤを与えられた場合に、グルコース調節を改善させる。

生物材料の寄託
以下の生物材料は、ブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ ｔｒｅａｔｙ）の条項の下で、Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ－Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ，Ｄ－３８１２４ ドイツ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託されており、次の受託番号が与えられている：
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）（ＨＨ０１）；受託番号：ＤＳＭ １７６４８；寄託日：１２－１０－２００５；原産国：ドイツ。
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ） （ＨＨ０２）；受託番号：ＤＳＭ ３２９１０；寄託日：０４－０９－２０１８；原産国：ドイツ。
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（ＨＨ０３）；受託番号：ＤＳＭ ３２９１１；寄託日：０４－０９－２０１８；原産国：ドイツ。
ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）亜種トレランス（ｔｏｌｅｒａｎｓ）（ＨＨ０４）；受託番号：ＤＳＭ ３２８５１；寄託日０４－０７－２０１８；原産国：ドイツ。
ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）亜種パラカゼイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）（ＨＨ０５）；受託番号：ＤＳＭ ３２８５３；寄託日：０４－０７－２０１８；原産国：ドイツ。

これらの株は、この特許出願の係属中、外国の特許法によって権利が与えられることが定められた人が培養株へのアクセスを利用可能であることを保証する条件下で寄託されている。寄託物は、寄託される株の実質的に純粋な培養株に相当する。寄託物は、対象出願の対応特許又はその後継が出願される国における外国の特許法によって、必要に応じて利用可能である。しかし、寄託物の利用可能性が、政府の措置によって与えられた特許権を逸脱して対象発明を実施する権限を与えることはないことが理解されるべきである。

Claims (14)

1. 哺乳動物対象における、代謝的健康を改善する、例えば前糖尿病を緩和する能力を有するか、又は血糖値を低下させる能力を有する、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。
2. インスリン抵抗性、高血糖、低悪性度炎症、及び腸管バリア機能からなる群から選択される１つ以上の前糖尿病症状を改善する又は緩和する能力を有する、請求項１に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。
3. 胃腸（ＧＩ）管内で生存する、請求項１又は２に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。
4. ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、樹状細胞アッセイ、脂肪細胞アッセイ、Ｌ細胞アッセイ、胆汁酸塩ヒドロラーゼアッセイ、及びＭＩＣアッセイの中から選択される少なくとも１つのスクリーニング方法を含むスクリーニングプロトコルにおいて選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。
5. ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）であるか、又はラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）群に属する、請求項１～４のいずれか一項に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。
6. ＤＳＭ １７６４８、ＤＳＭ ３２９１０、ＤＳＭ ３２９１１、ＤＳＭ ３２８５１、及びＤＳＭ ３２８５３として寄託された株の中から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の１種以上のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む組成物。
8. 細胞成分、代謝産物、及び／又はその分泌分子をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
9. 組成物１グラムあたり１０⁶～１０¹⁴コロニー形成単位（ＣＦＵ）、好ましくは１グラムあたり１０⁷～１０¹³、好ましくは１０⁸～１０¹²ＣＦＵを含む、請求項７又は８に記載の組成物。
10. 請求項１～６のいずれか一項に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含む栄養補助食品。
11. ビタミン及びミネラルなどの、対話的に有益な１種以上の成分をさらに含む、請求項１０に記載の栄養補助食品。
12. 哺乳動物対象の代謝的健康の改善、例えば前糖尿病を緩和させるための、請求項１～６のいずれか一項に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又は請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
13. 哺乳動物対象における血糖値を低下させるための、請求項１～６のいずれか一項に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、又は請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
14. ＰＢＭＣスクリーニング、ＴＥＥＲアッセイ、樹状細胞アッセイ、脂肪細胞アッセイ、Ｌ細胞アッセイ、胆汁酸塩ヒドロラーゼアッセイ、及びＭＩＣアッセイの中から選択される少なくとも１つのスクリーニング方法を含むスクリーニングプロトコルを使用して、請求項１～６のいずれか一項に記載のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株についてスクリーニングするための方法。

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