JP2022500042A - 抗ｈｉｖ抗体１０−１０７４バリアント - Google Patents

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Abstract

本開示は、改良された生物物理学的特徴をもたらす修飾された軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を有する、最適化された広域中和抗ＨＩＶ抗体を提供する。本開示はまた、これらの抗ＨＩＶ抗体を産生する方法及びその使用方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく、２０１８年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／７３１，３５６号に対する優先権を主張する。上記の出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明はＮＩＨによる認可番号第Ｐ０１ＡＩ０８１６７７号に基づく連邦政府の支援を受けて行われたものである。連邦政府は本発明について一定の権利を有する。
本発明は概して、ヒト免疫不全ウイルス（「Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ」）に対する広範かつ強力な抗体に関し、より具体的には、抗ＨＩＶ抗体１０−１０７４バリアント及びその使用に関する。
ＨＩＶは、消耗症候群、中枢神経系変性（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、並びに重篤な日和見感染症及び悪性腫瘍を生じる深刻な免疫抑制を含む臨床的特徴によって特徴づけられるヒトの病態である、後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤＳ）を引き起こす。ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）が１９８１年に発見されて以来、世界中で少なくとも２，５００万人が死亡している。たとえＨＩＶ感染症が年間２．５％減少しても、今後２０年間で２，０００万〜６，０００万人が感染すると予測されている。ＨＩＶ感染症の治療又は阻害のための治療剤及び方法が必要とされる。
一部のＨＩＶ感染個体は血清中に広範な中和ＩｇＧ抗体を示す。しかしながら、効果的なワクチン設計における潜在的重要性にもかかわらず、これらの抗体の特異性と活性及び活性についてはほとんど知られていない。動物モデルでは、中和抗体の受身伝達がウイルス攻撃に対する防御に寄与することもある。中和抗体反応はまたＨＩＶ感染個体でも見られるが、血清学的反応の詳細な構成はいまだ完全には解明されていない。
［課題を解決するための手段］
本開示は、改良された生物物理学的特徴をもたらす修飾された軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を有する広域中和抗ＨＩＶ抗体の新規カテゴリと、その製造方法及び使用方法とに関する。
したがって、第１の態様では、本開示は、配列番号３〜１３、２２、２４〜２８、３５〜３９、４３〜４５、及び４７の軽鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一である軽鎖アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分を提供する。単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、軽鎖可変領域の内部又は外部に位置する１つ以上の残基における１つ以上の軽鎖置換を含む。１つ以上の残基は、ＬｍｄＶ：Ｙ２、ＬｍｄＶ：Ｒ７、ＬｍｄＶ：Ｐ９、ＬｍｄＶ：Ｅ１７、ＬｍｄＶ：Ｈ４６、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３、ＬｍｄＶ：Ｎ８２、ＬｍｄＶ：Ｒ８８、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、配列番号６１〜９４の重鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一である重鎖アミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分を提供する。単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域の内部又は外部に位置する１つ以上の残基における１つ以上の重鎖置換を含む。１つ以上の残基は、ＨＶ：Ｄ２９、ＨＶ：Ｓ４７、ＨＶ：Ｎ７５、ＨＶ：Ｖ７９、ＨＶ：Ｒ８２、ＨＶ：Ｌ８９、ＨＶ：Ｔ１０８、及びＨＶ：Ｋ１４１からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、配列番号３〜１３、２２、２４〜２８、３５〜３９、４３〜４５、及び４７の軽鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一である軽鎖アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分を提供する。単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＬｍｄＶ：Ｙ２、ＬｍｄＶ：Ｒ７、ＬｍｄＶ：Ｐ９、ＬｍｄＶ：Ｅ１７、ＬｍｄＶ：Ｈ４６、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３、ＬｍｄＶ：Ｎ８２、ＬｍｄＶ：Ｒ８８、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２からなる群から選択される１つ以上の残基における１つ以上の軽鎖置換を含む。抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、配列番号６１〜９４の重鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一である重鎖アミノ酸配列を有する重鎖可変領域を更に含む。単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＨＶ：Ｄ２９、ＨＶ：Ｓ４７、ＨＶ：Ｎ７５、ＨＶ：Ｖ７９、ＨＶ：Ｒ８２、ＨＶ：Ｌ８９、ＨＶ：Ｔ１０８、及びＨＶ：Ｋ１４１からなる群から選択される１つ以上の残基における１つ以上の重鎖置換を含む。
いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｒ７Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｎ８２Ｇ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０Ｅ、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２Ｇからなる群から選択される１つ以上の軽鎖置換、又はそれらの保存的置換（すなわち、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｃ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｃ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｓ）を含む。
いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＨＶ：Ｄ２９Ｇ、ＨＶ：Ｓ４７Ｐ、ＨＶ：Ｎ７５Ｑ、ＨＶ：Ｖ７９Ｔ、ＨＶ：Ｒ８２Ｖ、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ、及びＨＶ：Ｋ１４１Ｑからなる群から選択される１つ以上の重鎖置換、又はそれらの保存的置換（すなわち、ＨＶ：Ｌ８９Ｗ、ＨＶ：Ｌ８９Ｙ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｈ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｋ、ＨＶ：Ｋ１４１Ｎ）を含む。
いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｒ７Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｎ８２Ｇ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０Ｅ、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２Ｇからなる群から選択される１つ以上の軽鎖置換又はそれらの保存的置換（すなわち、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｃ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｃ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｓ）と、ＨＶ：Ｄ２９Ｇ、ＨＶ：Ｓ４７Ｐ、ＨＶ：Ｎ７５Ｑ、ＨＶ：Ｖ７９Ｔ、ＨＶ：Ｒ８２Ｖ、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ、及びＨＶ：Ｋ１４１Ｑからなる群から選択される１つ以上の重鎖置換又はそれらの保存的置換（すなわち、ＨＶ：Ｌ８９Ｗ、ＨＶ：Ｌ８９Ｙ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｈ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｋ、ＨＶ：Ｋ１４１Ｎ）と、を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３の軽鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ置換又はＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６３の重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＨＶ：Ｖ７９Ｔ置換又はＨＶ：Ｖ７９におけるスレオニンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６４の重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＨＶ：Ｒ８２Ｖ置換又はＨＶ：Ｒ８２におけるバリンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６５の重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ置換又はＨＶ：Ｌ８９のフェニルアラニンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６６の重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８のアルギニンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖アミノ酸配列が、配列番号２２の軽鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ置換又はＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリンの保存的置換を含み、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６９の重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、かつＨＶ：Ｒ８２Ｖ置換又はＨＶ：Ｒ８２におけるバリンの保存的置換と、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換と、を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号７０の重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、かつＨＶ：Ｖ７９Ｔ置換又はＨＶ：Ｖ７９におけるスレオニンの保存的置換と、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ置換又はＨＶ：Ｌ８９におけるフェニルアラニンの保存的置換と、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換と、を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２４の軽鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ置換又はＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリンの保存的置換を含み、重鎖アミノ酸配列は、配列番号７１の重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、かつＨＶ：Ｖ７９Ｔ置換又はＨＶ：Ｖ７９におけるスレオニンの保存的置換と、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ置換又はＨＶ：Ｌ８９におけるフェニルアラニンの保存的置換と、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換と、を含む。
いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、配列番号６３、６４、６５、６６、又は７０を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号２２の軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号６９の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号２４の軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号７１の重鎖可変領域を含む。
別の態様では、本開示はまた、上記の抗ＨＩＶ抗体又は抗原結合部分と、薬学的に許容される担体又は賦形剤を有する医薬組成物と、を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、第２の治療剤を更に含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、３ＢＮＣ１１７などの抗ＨＩＶ−１広域中和抗体である。
別の態様では、本開示は、上記の抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸又はコドン最適化核酸を更に提供する。また、少なくとも１つの上記の核酸を有するベクタ（ｖｅｃｔｏｒ）又はベクタ系と、少なくとも１つの上記の核酸を有する細胞と、も提供される。
別の態様では、本開示は、組換え抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分を作製する方法を提供する。本方法は、とりわけ、上述の培養細胞を得ることと、ベクタによってコードされるポリペプチドの発現を許容する条件下における培地中で細胞を培養すること及び抗体又はその断片を集成することと、培養細胞又は細胞の培地から抗体又は断片を精製することと、を含む。
別の態様では、本開示は、ＨＩＶ感染症又はＨＩＶ関連疾患を予防又は治療する方法を提供する。本方法は、とりわけ、かかる予防又は治療を必要とする患者を同定することと、治療有効量の少なくとも１つの上で提示された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分を有する第１の治療剤を該患者に投与することと、を含む。本方法は、第２の治療剤を投与することを更に含み得る。第２の治療剤は、抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分の投与の前、同時、又は後に投与され得る。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、３ＢＮＣ１１７などの抗ＨＩＶ−１広域中和抗体である。
別の態様では、本開示は、上に提示した薬学的有効量の少なくとも１つの単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分の薬学的に許容される用量単位を有する、キットを更に提供する。キットは更に、薬学的有効量の抗ＨＩＶ剤の薬学的に許容される用量単位を含み得る。２つの薬学的に許容される用量単位は、単一の薬学的に許容される用量単位の形態を任意にとることができる。例示的な抗ＨＩＶ剤は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入阻害剤又は融合阻害剤、及びインテグラーゼ阻害剤からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ剤は、３ＢＮＣ１１７などの抗ＨＩＶ広域中和抗体である。
前述の要約は本開示の全ての態様を定義することを意図するものではなく、追加の態様は以下の詳細な説明といった他の節で説明される。本文書全体は統一された情報開示として関連することが意図されており、本文書の同じ文、又は段落、又は節において一緒には見られない場合であっても、本明細書に記載されている特徴の全ての組合せが企図されていることが理解されるべきである。本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明により明らかになるであろう。しかしながら、本開示の主旨及び範囲内である様々な変更及び修正がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるため、本開示の具体的な実施形態を提示する一方で、詳細な説明及び具体的な実施例は、説明のためにのみ示されていることが理解されるべきである。
図１Ａ及び図１Ｂ（合わせて「図１」）は、ウイルス中和の前後における高速サイズ排除クロマトグラフィ（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：「ＨＰ−ＳＥＣ」）による抗ＨＩＶ抗体１０−１０７４バリアントＭＳ−１９４（図１Ａ）及びＭＳ−２０３（図１Ｂ）の性質決定を示す。ウイルス不活化中に形成されたオリゴマー種に対応するＨＰ−ＳＥＣプロファイルのピークは、矢印で示す。 図２は、１０−１０７４の抗体バリアントであるＭＳ−１９４、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０３について、精製工程の各々に続く高分子量（ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ：「ＨＭＷ」）及びオリゴマー種のレベルによって表される凝集度の定量を示す。 図３は、１０−１０７４抗体バリアントであるＭＳ−１９４、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０３について、４０℃で最大１３週間のインキュベーション中におけるＨＭＷレベルを示す。 図４は、１０−１０７４抗体バリアントであるＭＳ−１９４、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０３について、６週間及び１３週間におけるサブビジブル粒子（ｓｕｂ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）形成のレベルを示す。 図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃ（合わせて「図５」）は、分析的治療中断（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ：ＡＴＩ）中における３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４併用療法による、遅延したウイルスリバウンドを示す。図５Ａは、ＨＩＶ−１エンベロープスパイク上の独立部位を標的とする２つの強力なモノクローナル抗ＨＩＶ−１広域中和抗体である３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の組合せをＡＴＩ中に投与した、第１ｂ相臨床試験の試験デザインを示す。赤及び青の三角形は、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の注入を表す。図５Ｂは、９人のｂＮＡｂ感受性参加者（左）と、抗体の１つに対して既存の耐性を有する２人の参加者（右）とにおける、血漿ＨＩＶ−１ ＲＮＡレベル（黒；左のＹ軸）及びｂＮＡｂ血清濃度（３ＢＮＣ１１７、赤；１０−１０７４、青；右のＹ軸）を示す。赤及び青の三角形は、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の注入を示す。血清抗体濃度はＴＺＭ−ｂｌアッセイにより判定した。灰色の網掛け部分はＡＲＴの時間を示す。ＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出下限は２０コピー／ｍＬであった。図５Ｃは、ＡＴＩの２週間前及び開始時にＨＩＶ−１ ＲＮＡが２０コピー／ｍＬ未満である参加者（ｎ＝１１、左）、両方の抗体に感受性である参加者（ｎ＝９、中央）、及び抗体の１つに対して既存の耐性を示した参加者（ｎ＝２、右）について、ウイルスリバウンドまでの時間を要約したＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。Ｙ軸はウイルス抑制を維持している参加者の割合を示す。Ｘ軸はＡＴＩ開始から経過した週を示す。３ＢＮＣ１１７＋１０−１０７４を併用された参加者は青色の線で示されている。赤い点線はＡＴＩ中に３ＢＮＣ１１７のみを受けた個体のコホート（ｎ＝１３）を示し、黒い点線は介入治療なしにＡＴＩを受けた参加者のコホート（ｎ＝５２）を示す。 図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃ（合わせて「図５」）は、分析的治療中断（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ：ＡＴＩ）中における３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４併用療法による、遅延したウイルスリバウンドを示す。図５Ａは、ＨＩＶ−１エンベロープスパイク上の独立部位を標的とする２つの強力なモノクローナル抗ＨＩＶ−１広域中和抗体である３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の組合せをＡＴＩ中に投与した、第１ｂ相臨床試験の試験デザインを示す。赤及び青の三角形は、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の注入を表す。図５Ｂは、９人のｂＮＡｂ感受性参加者（左）と、抗体の１つに対して既存の耐性を有する２人の参加者（右）とにおける、血漿ＨＩＶ−１ ＲＮＡレベル（黒；左のＹ軸）及びｂＮＡｂ血清濃度（３ＢＮＣ１１７、赤；１０−１０７４、青；右のＹ軸）を示す。赤及び青の三角形は、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の注入を示す。血清抗体濃度はＴＺＭ−ｂｌアッセイにより判定した。灰色の網掛け部分はＡＲＴの時間を示す。ＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出下限は２０コピー／ｍＬであった。図５Ｃは、ＡＴＩの２週間前及び開始時にＨＩＶ−１ ＲＮＡが２０コピー／ｍＬ未満である参加者（ｎ＝１１、左）、両方の抗体に感受性である参加者（ｎ＝９、中央）、及び抗体の１つに対して既存の耐性を示した参加者（ｎ＝２、右）について、ウイルスリバウンドまでの時間を要約したＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。Ｙ軸はウイルス抑制を維持している参加者の割合を示す。Ｘ軸はＡＴＩ開始から経過した週を示す。３ＢＮＣ１１７＋１０−１０７４を併用された参加者は青色の線で示されている。赤い点線はＡＴＩ中に３ＢＮＣ１１７のみを受けた個体のコホート（ｎ＝１３）を示し、黒い点線は介入治療なしにＡＴＩを受けた参加者のコホート（ｎ＝５２）を示す。 図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃ（合わせて「図５」）は、分析的治療中断（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ：ＡＴＩ）中における３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４併用療法による、遅延したウイルスリバウンドを示す。図５Ａは、ＨＩＶ−１エンベロープスパイク上の独立部位を標的とする２つの強力なモノクローナル抗ＨＩＶ−１広域中和抗体である３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の組合せをＡＴＩ中に投与した、第１ｂ相臨床試験の試験デザインを示す。赤及び青の三角形は、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の注入を表す。図５Ｂは、９人のｂＮＡｂ感受性参加者（左）と、抗体の１つに対して既存の耐性を有する２人の参加者（右）とにおける、血漿ＨＩＶ−１ ＲＮＡレベル（黒；左のＹ軸）及びｂＮＡｂ血清濃度（３ＢＮＣ１１７、赤；１０−１０７４、青；右のＹ軸）を示す。赤及び青の三角形は、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の注入を示す。血清抗体濃度はＴＺＭ−ｂｌアッセイにより判定した。灰色の網掛け部分はＡＲＴの時間を示す。ＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出下限は２０コピー／ｍＬであった。図５Ｃは、ＡＴＩの２週間前及び開始時にＨＩＶ−１ ＲＮＡが２０コピー／ｍＬ未満である参加者（ｎ＝１１、左）、両方の抗体に感受性である参加者（ｎ＝９、中央）、及び抗体の１つに対して既存の耐性を示した参加者（ｎ＝２、右）について、ウイルスリバウンドまでの時間を要約したＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。Ｙ軸はウイルス抑制を維持している参加者の割合を示す。Ｘ軸はＡＴＩ開始から経過した週を示す。３ＢＮＣ１１７＋１０−１０７４を併用された参加者は青色の線で示されている。赤い点線はＡＴＩ中に３ＢＮＣ１１７のみを受けた個体のコホート（ｎ＝１３）を示し、黒い点線は介入治療なしにＡＴＩを受けた参加者のコホート（ｎ＝５２）を示す。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、及び６Ｆ（合わせて「図６」）は、人口統計、参加者における試験期間中のＣＤ４＋Ｔ細胞、並びに３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の薬物動態を示す。図６Ａは、ベースラインの参加者の人口統計を示す表である。＊ＮＮＲＴＩ（Ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）−非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤。図６Ｂは、スクリーニング時（ｎ＝１５）、０日目（ｎ＝１５）、ウイルスリバウンド時（ｎ＝１３）、及び試験終了時（ｎ＝１５）における、ＣＤ３＋Ｔ細胞間のＣＤ４＋Ｔ細胞絶対数及びＣＤ４＋Ｔ細胞パーセンテージを示す（補足表２もまた参照のこと）。ＡＲＴを再開した参加者の試験終了時点として、再抑制後の最終時点を用いた。赤線は平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。Ｐ値は、０日目とウイルスリバウンド時とにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞数を比較する、両側ペアｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて得た。図６Ｃ及び図６Ｄは、ＴＺＭ−ｂｌアッセイ（図６Ｃ）及びＥＬＩＳＡ（図６Ｄ）によって判定した血清中における３ＢＮＣ１１７（赤）及び１０−１０７４（青）レベル（ｎ＝１５）を示す。曲線は平均血清抗体濃度を示し、エラーバーは標準偏差を表す。赤及び青の三角形は、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の注入を示す。ＴＺＭ−ｂｌアッセイでは、検出下限は、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４について、それぞれ、０．４６μｇ／ｍＬ及び０．０１μｇ／ｍＬであった（図６Ｃ）。ＥＬＩＳＡでは、検出下限は、それぞれ、０．７８μｇ／ｍＬ及び０．４１μｇ／ｍＬであった（図６Ｄ）。参加者が早期ウイルスリバウンド（９２４５、９２４９、及び９２５３）のために２回の注入だけを受けた場合、最大２回までの注入の抗体濃度のみが含まれた。各ｂＮＡｂの半減期は日数で示す。図６Ｅ及び図６Ｆは、ＴＺＭ−ｂｌアッセイ（図６Ｅ）及びＥＬＩＳＡ（図６Ｆ）によって測定される両方の抗体の半減期を示す。各丸印は単一の参加者を表す。本試験に登録された１５人の参加者からの両方の抗体の半減期が示されている。黒い線は平均値及び標準偏差を示す（ｎ＝１５）。Ｐ値は２つの抗体を比較する両側対応のない検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて得た。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、及び６Ｆ（合わせて「図６」）は、人口統計、参加者における試験期間中のＣＤ４＋Ｔ細胞、並びに３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の薬物動態を示す。図６Ａは、ベースラインの参加者の人口統計を示す表である。＊ＮＮＲＴＩ（Ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）−非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤。図６Ｂは、スクリーニング時（ｎ＝１５）、０日目（ｎ＝１５）、ウイルスリバウンド時（ｎ＝１３）、及び試験終了時（ｎ＝１５）における、ＣＤ３＋Ｔ細胞間のＣＤ４＋Ｔ細胞絶対数及びＣＤ４＋Ｔ細胞パーセンテージを示す（補足表２もまた参照のこと）。ＡＲＴを再開した参加者の試験終了時点として、再抑制後の最終時点を用いた。赤線は平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。Ｐ値は、０日目とウイルスリバウンド時とにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞数を比較する、両側ペアｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて得た。図６Ｃ及び図６Ｄは、ＴＺＭ−ｂｌアッセイ（図６Ｃ）及びＥＬＩＳＡ（図６Ｄ）によって判定した血清中における３ＢＮＣ１１７（赤）及び１０−１０７４（青）レベル（ｎ＝１５）を示す。曲線は平均血清抗体濃度を示し、エラーバーは標準偏差を表す。赤及び青の三角形は、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の注入を示す。ＴＺＭ−ｂｌアッセイでは、検出下限は、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４について、それぞれ、０．４６μｇ／ｍＬ及び０．０１μｇ／ｍＬであった（図６Ｃ）。ＥＬＩＳＡでは、検出下限は、それぞれ、０．７８μｇ／ｍＬ及び０．４１μｇ／ｍＬであった（図６Ｄ）。参加者が早期ウイルスリバウンド（９２４５、９２４９、及び９２５３）のために２回の注入だけを受けた場合、最大２回までの注入の抗体濃度のみが含まれた。各ｂＮＡｂの半減期は日数で示す。図６Ｅ及び図６Ｆは、ＴＺＭ−ｂｌアッセイ（図６Ｅ）及びＥＬＩＳＡ（図６Ｆ）によって測定される両方の抗体の半減期を示す。各丸印は単一の参加者を表す。本試験に登録された１５人の参加者からの両方の抗体の半減期が示されている。黒い線は平均値及び標準偏差を示す（ｎ＝１５）。Ｐ値は２つの抗体を比較する両側対応のない検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて得た。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、及び６Ｆ（合わせて「図６」）は、人口統計、参加者における試験期間中のＣＤ４＋Ｔ細胞、並びに３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の薬物動態を示す。図６Ａは、ベースラインの参加者の人口統計を示す表である。＊ＮＮＲＴＩ（Ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）−非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤。図６Ｂは、スクリーニング時（ｎ＝１５）、０日目（ｎ＝１５）、ウイルスリバウンド時（ｎ＝１３）、及び試験終了時（ｎ＝１５）における、ＣＤ３＋Ｔ細胞間のＣＤ４＋Ｔ細胞絶対数及びＣＤ４＋Ｔ細胞パーセンテージを示す（補足表２もまた参照のこと）。ＡＲＴを再開した参加者の試験終了時点として、再抑制後の最終時点を用いた。赤線は平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。Ｐ値は、０日目とウイルスリバウンド時とにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞数を比較する、両側ペアｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて得た。図６Ｃ及び図６Ｄは、ＴＺＭ−ｂｌアッセイ（図６Ｃ）及びＥＬＩＳＡ（図６Ｄ）によって判定した血清中における３ＢＮＣ１１７（赤）及び１０−１０７４（青）レベル（ｎ＝１５）を示す。曲線は平均血清抗体濃度を示し、エラーバーは標準偏差を表す。赤及び青の三角形は、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の注入を示す。ＴＺＭ−ｂｌアッセイでは、検出下限は、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４について、それぞれ、０．４６μｇ／ｍＬ及び０．０１μｇ／ｍＬであった（図６Ｃ）。ＥＬＩＳＡでは、検出下限は、それぞれ、０．７８μｇ／ｍＬ及び０．４１μｇ／ｍＬであった（図６Ｄ）。参加者が早期ウイルスリバウンド（９２４５、９２４９、及び９２５３）のために２回の注入だけを受けた場合、最大２回までの注入の抗体濃度のみが含まれた。各ｂＮＡｂの半減期は日数で示す。図６Ｅ及び図６Ｆは、ＴＺＭ−ｂｌアッセイ（図６Ｅ）及びＥＬＩＳＡ（図６Ｆ）によって測定される両方の抗体の半減期を示す。各丸印は単一の参加者を表す。本試験に登録された１５人の参加者からの両方の抗体の半減期が示されている。黒い線は平均値及び標準偏差を示す（ｎ＝１５）。Ｐ値は２つの抗体を比較する両側対応のない検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて得た。 図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃ（合わせて「図７」）は、１０−１０７４接触部位におけるアミノ酸バリアントと、再活性化された潜在ウイルス及びリバウンドウイルスのｂＮＡｂ感受性とを示す。図７Ａは、Ｇ（Ｄ／Ｎ）ＩＲモチーフ（３２４〜３２７位、ＨＸＢ２番号付けによる）における１０−１０７４のＥｎｖ接触部位、及び３３２位における潜在的Ｎ連結グリコシル化部位（３３２〜３３４位におけるＮｘＳ／Ｔモチーフ）におけるグリカンを示す、一組のチャートである。この図は、第３０週以前にリバウンドした７人のｂＮＡｂ感受性参加者（左）と、２つの抗体の１つに対して既存の耐性を有する２人の個体（右）を示す。ＬＲはＱ２ＶＯＡによって単離された潜伏リザーバウイルスを示し、ＲＢはＳＧＡ（血漿）又はウイルス増殖（ＰＢＭＣ）によって単離されたリバウンドウイルスを示す。各アミノ酸は色で表され、各アミノ酸頻度は長方形の高さで示される。陰影を付けた長方形は、指示された位置において潜在リザーバウイルスとリバウンドウイルスとの間に変異がないことを示す。色を付けた長方形は、リザーバとリバウンドウイルスとの間の分布の変化を伴うアミノ酸残基を表す。図７Ｂ及び図７Ｃは、ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイによって判定された潜在ウイルス及びリバウンドウイルスに対する、３ＢＮＣ１１７（図７Ｂ、左側パネル）及び１０−１０７４（図７Ｃ、右側パネル）のＩＣ８０（μｇ／ｍＬ）を示すドットプロットである。Ｑ２ＶＯＡ由来の第−２週及び第１２週の潜在ウイルスは、それぞれ、黒の丸印及び灰色の丸印で示す。増殖培養由来のリバウンドウイルスについては、判定されたＩＣ８０の最高値を赤い丸印で示す。９２４６、９２５２、９２４５、及び９２５１ウイルスについては、リバウンド増殖培養から得ることができず、シュードウイルスは、Ｑ２ＶＯＡ及び血漿ＳＧＡからのｅｎｖ配列から作製した。 図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃ（合わせて「図７」）は、１０−１０７４接触部位におけるアミノ酸バリアントと、再活性化された潜在ウイルス及びリバウンドウイルスのｂＮＡｂ感受性とを示す。図７Ａは、Ｇ（Ｄ／Ｎ）ＩＲモチーフ（３２４〜３２７位、ＨＸＢ２番号付けによる）における１０−１０７４のＥｎｖ接触部位、及び３３２位における潜在的Ｎ連結グリコシル化部位（３３２〜３３４位におけるＮｘＳ／Ｔモチーフ）におけるグリカンを示す、一組のチャートである。この図は、第３０週以前にリバウンドした７人のｂＮＡｂ感受性参加者（左）と、２つの抗体の１つに対して既存の耐性を有する２人の個体（右）を示す。ＬＲはＱ２ＶＯＡによって単離された潜伏リザーバウイルスを示し、ＲＢはＳＧＡ（血漿）又はウイルス増殖（ＰＢＭＣ）によって単離されたリバウンドウイルスを示す。各アミノ酸は色で表され、各アミノ酸頻度は長方形の高さで示される。陰影を付けた長方形は、指示された位置において潜在リザーバウイルスとリバウンドウイルスとの間に変異がないことを示す。色を付けた長方形は、リザーバとリバウンドウイルスとの間の分布の変化を伴うアミノ酸残基を表す。図７Ｂ及び図７Ｃは、ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイによって判定された潜在ウイルス及びリバウンドウイルスに対する、３ＢＮＣ１１７（図７Ｂ、左側パネル）及び１０−１０７４（図７Ｃ、右側パネル）のＩＣ８０（μｇ／ｍＬ）を示すドットプロットである。Ｑ２ＶＯＡ由来の第−２週及び第１２週の潜在ウイルスは、それぞれ、黒の丸印及び灰色の丸印で示す。増殖培養由来のリバウンドウイルスについては、判定されたＩＣ８０の最高値を赤い丸印で示す。９２４６、９２５２、９２４５、及び９２５１ウイルスについては、リバウンド増殖培養から得ることができず、シュードウイルスは、Ｑ２ＶＯＡ及び血漿ＳＧＡからのｅｎｖ配列から作製した。 図８は、循環潜在リザーバとリバウンドウイルスとの比較を示す。Ｑ２ＶＯＡから単離されたウイルスの完全長ｅｎｖ配列の最尤系統樹、リバウンド血漿ＳＧＡ、及び３０週以前にリバウンドした参加者７人中３人（９２４２、９２４３、及び９２５２）からのリバウンドＰＢＭＣ増殖培養。白塗りの長方形及び塗りつぶされた黒い長方形は、それぞれ、第−２週及び第１２週からのＱ２ＶＯＡ由来ウイルスを示す。リバウンド時に得られたウイルスは、赤い長方形（血漿ＳＧＡ）及び赤い星印（リバウンドＰＢＭＣ増殖培養）で示す。アスタリスクは、有意なブートストラップ値（ブートストラップ≧７０％）であるノードを示す。ボックスは、あり得る場合の系統樹及びクローン全体の代表的なウイルスに対する３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４のＩＣ８０（μｇ／ｍＬ）を示す。ボックス内のアスタリスクは、ＩＣ１００値が５０μｇ／ｍＬ超であることを示す。 図８は、循環潜在リザーバとリバウンドウイルスとの比較を示す。Ｑ２ＶＯＡから単離されたウイルスの完全長ｅｎｖ配列の最尤系統樹、リバウンド血漿ＳＧＡ、及び３０週以前にリバウンドした参加者７人中３人（９２４２、９２４３、及び９２５２）からのリバウンドＰＢＭＣ増殖培養。白塗りの長方形及び塗りつぶされた黒い長方形は、それぞれ、第−２週及び第１２週からのＱ２ＶＯＡ由来ウイルスを示す。リバウンド時に得られたウイルスは、赤い長方形（血漿ＳＧＡ）及び赤い星印（リバウンドＰＢＭＣ増殖培養）で示す。アスタリスクは、有意なブートストラップ値（ブートストラップ≧７０％）であるノードを示す。ボックスは、あり得る場合の系統樹及びクローン全体の代表的なウイルスに対する３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４のＩＣ８０（μｇ／ｍＬ）を示す。ボックス内のアスタリスクは、ＩＣ１００値が５０μｇ／ｍＬ超であることを示す。 図９Ａ及び図９Ｂ（合わせて「図９」）は、循環潜在リザーバ及びリバウンドウイルスの分布を示す。図９Ａは、第２週−（青）及び第１２週（灰色）にＱ２ＶＯＡから得られたｅｎｖ配列と、又はウイルスリバウンド時の血漿ＳＧＡ又はリバウンドＰＢＭＣ増殖培養物（赤）との間の配列同一性を示す一組のベン図表である。重複面積は同一配列の数に比例する。得られた配列数を示す。図９Ｂは、Ｑ２ＶＯＡによって判定した、第２週及び第１２週におけるＣＤ４＋Ｔ細胞１００万個当たりの感染単位（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｕｎｉｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ：ＩＵＰＭ）を示す。ＩＵＰＭが０．１より高い参加者及び低い参加者をそれぞれ上部及び下部に示す。この２時点は統計学的に異ならなかった（Ｐ＝０．０７８（ペアｔ検定））。
本開示は、少なくとも部分的に、ｇｐ１２０上の複合型Ｎ−グリカンを含む炭水化物依存性エピトープを認識することができる、ＨＩＶに対する広域中和抗体（ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｂＮＡｂ）の新規カテゴリの予想外の発見に基づく。
抗体はほとんどのワクチンの成功に不可欠であり、最近のＲＶ１４４抗ＨＩＶワクチン治験では、ＨＩＶに対する抗体のみが予防効果と相関しているようである。一部のＨＩＶ−１感染患者では感染から２〜４年後にｇｐ１６０ウイルスのスパイクに対する広域中和血清活性が発現するが、自己由来のウイルスは変異により回避されるため、これらの抗体は一般に感染したヒトを保護しない。それにもかかわらず、広域中和活性はウイルスに選択的圧力をかけ、マカクへの広域中和抗体（ｂＮＡｂ）の受身伝達はＳＨＩＶ感染を防ぐ。したがって、このような抗体を誘導するワクチンはヒトのＨＩＶ感染症に対して予防的であり得る可能性があると提唱されている。
単一細胞抗体クローニング技術の開発は、ｂＮＡｂがＨＩＶ−１ｇｐ１６０スパイク上のいくつかの異なるエピトープを標的とすることを明らかにした。最も強力なＨＩＶ−１ ｂＮＡｂは、Ｖ１／Ｖ２（ＰＧ９／ＰＧ１６）（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」３２６（５９５０）：２８５〜２８９）及びＶ３ループ（ＰＧＴ）（「Ｎａｔｕｒｅ」４７７（７３６５）：４６６〜４７０）を含む、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」３３３（６０４９）：１６３３〜１６３７；「Ｎａｔｕｒｅ」４７７（７３６５）：４６６〜４７０；「Ｓｃｉｅｎｃｅ」３３４（６０６０）：１２８９〜１２９３）及び可変ループに関連する炭水化物依存性エピトープ（「Ｎａｔｕｒｅ」４７７（７３６５）：４６６〜４７０；「Ｓｃｉｅｎｃｅ」３２６（５９５０）：２８５−２８９；「Ｓｃｉｅｎｃｅ」３３４（６０５９）：１０９７〜１１０３；「Ｎａｔｕｒｅ」４８０（７３７７）：３３６〜３４３）を認識する。炭水化物依存性エピトープについては、これまでに研究された抗体が特異な例であるか、又は小さなクローナルファミリのメンバであるかのいずれかのため、あまり知られていない。
ＨＩＶ−１に対する中和抗体応答及びＰＧＴ抗体の標的エピトープをよりよく理解するために、ＰＧＴ１２１を産生したクレードＡ感染患者由来のｇｐ１６０特異的ＩｇＧメモリ応答を支配する大きなクローナルファミリのメンバが単離されている。ＰＧＴ１２１の単離については国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／６５６９６号で詳細に記載されている。ＰＧＴ１２１抗体は、配列、結合親和性、中和活性並びに炭水化物及びＶ３ループの認識に従って、ＰＧＴ１２１様及び１０−１０７４様グループの２つのグループに分けることができる。１０−１０７４及び関連ファミリメンバは、新たに感染したウイルスに対する広い反応性を含む、異常な強力な中和を呈する。以前に性質決定された炭水化物依存性ｂＮＡｂとは異なり、ＰＧＴ１２１は、グリカンマイクロアレイ実験において、高マンノースではなく複合型Ｎ−グリカンに結合する。１０−１０７４のグループはタンパク質を含まないグリカンとは検出可能な結合をしていないにもかかわらず、顕著な能力及び幅を呈する。非配位ＰＧＴ１２１、１０−１０７４及びそれらの生殖細胞系前駆体の結晶構造は、異なる炭水化物認識がＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３との間の裂け目にマッピングされ、これは別個のＰＧＴ１２１構造における複合型Ｎ−グリカンにより占有されたことを明らかにした。ＰＧＴ１２１と１０−１０７４との間のグリカン接触残基の交換により、中和活性におけるこれらの残基の重要性が確認された。
モノクローナル抗体の生物物理学的安定性はその有用性及び商業的価値の重要な決定因子であるため、本開示は、１０−１０７４広域中和抗体の生物物理学的特徴を最適化するための方法を提示する。例えば、一連の置換を行って、１０−１０７４広域中和抗体のＦｖ領域における潜在的に不安定化する残基を同定した。これらの残基は、それら自体で、又は組み合わせて、低ｐＨでの不安定性をもたらし、化学分解に対する感受性を高め、又は生産中若しくは長期貯蔵中に凝集を引き起こす可能性がある。この分析に基づき、組合せ残基置換技術を用いて所望の特徴を最適化しながら効力を維持するために一連のバリアントを設計する。最適化プロセスは異なる段階に分けられ、第１段階は不安定化に潜在的に関与するフレームワーク領域における単一残基の同定である。具体的には、抗ＨＩＶ １０−１０７４抗体バリアント（表２〜表７及び表９に示す）を、同定されたアミノ酸の単一残基修飾を各々が含有する一過性発現によって作製した。バリアントは、表８〜表１６に示すように、中和活性の保持及び所望の生物物理学的特徴について性質決定された。それらは望ましい生物物理学的特徴の増加を示し、中和に影響を与えなかった、５つの異なるアミノ酸残基、ＬｍｄＶ：Ｙ２、ＨＶ：Ｖ７９、ＨＶ：Ｒ８２、ＨＶ：Ｌ８９、及びＨＶ：Ｔ１０８を同定した。残基を使用して、５つのアミノ酸の全ての可能な組合せを包含するバリアントのライブラリ（表２〜表７及び表１２に示す）を作製した。バリアントを再び一過性発現により作製し、精製した組合せバリアントを中和活性の保持及び所望の生物物理学的特徴について分析した。組合せライブラリから、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０２の３つのバリアントを、発現、精製、及び貯蔵安定性を含むより詳細な分析のために同定して、熱安定性の増加、化学的アンフォールディングに対する抵抗性の増加、溶解性の増加、及び貯蔵中の凝集に対する抵抗性の増加を含む、最適化された特徴を持つ組合せバリアントを同定した。
単離された抗ＨＩＶ抗体、医薬組成物、及びキット
したがって、一態様では、本開示は、配列番号３〜１３、２２、２４〜２８、３５〜３９、４３〜４５、及び４７の軽鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一である軽鎖アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分を提供する（表２）。単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、軽鎖可変領域の内部又は外部に位置する１つ以上の残基における１つ以上の軽鎖置換を含み得る。置換に対する残基は、ＬｍｄＶ：Ｙ２、ＬｍｄＶ：Ｒ７、ＬｍｄＶ：Ｐ９、ＬｍｄＶ：Ｅ１７、ＬｍｄＶ：Ｈ４６、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３、ＬｍｄＶ：Ｎ８２、ＬｍｄＶ：Ｒ８８、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２のうちの１つ以上であり得る。
また、配列番号６１〜９４の重鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一である重鎖アミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分も提供される（表３）。単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域の内部又は外部に位置する１つ以上の残基における１つ以上の重鎖置換を含む。置換に対する残基は、ＨＶ：Ｄ２９、ＨＶ：Ｓ４７、ＨＶ：Ｎ７５、ＨＶ：Ｖ７９、ＨＶ：Ｒ８２、ＨＶ：Ｌ８９、ＨＶ：Ｔ１０８、及びＨＶ：Ｋ１４１のうち１つ以上であり得る。
別の態様では、本開示は、配列番号３〜１３、２２、２４〜２８、３５〜３９、４３〜４５、及び４７の軽鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一である軽鎖アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分を提供する（表２）。単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＬｍｄＶ：Ｙ２、ＬｍｄＶ：Ｒ７、ＬｍｄＶ：Ｐ９、ＬｍｄＶ：Ｅ１７、ＬｍｄＶ：Ｈ４６、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３、ＬｍｄＶ：Ｎ８２、ＬｍｄＶ：Ｒ８８、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２のうち１つ以上の残基における１つ以上の軽鎖置換を含む。抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、配列番号６１〜９４の重鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一である重鎖アミノ酸配列を有する重鎖可変領域を更に含む（表３）。単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＨＶ：Ｄ２９、ＨＶ：Ｓ４７、ＨＶ：Ｎ７５、ＨＶ：Ｖ７９、ＨＶ：Ｒ８２、ＨＶ：Ｌ８９、ＨＶ：Ｔ１０８、及びＨＶ：Ｋ１４１のうち１つ以上の残基における１つ以上の重鎖置換を含む。
いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｒ７Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｎ８２Ｇ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０Ｅ、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２Ｇのうち１つ以上の軽鎖置換、又はそれらの保存的置換（すなわち、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｃ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｃ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｓ）を含む。
いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＨＶ：Ｄ２９Ｇ、ＨＶ：Ｓ４７Ｐ、ＨＶ：Ｎ７５Ｑ、ＨＶ：Ｖ７９Ｔ、ＨＶ：Ｒ８２Ｖ、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ、及びＨＶ：Ｋ１４１Ｑのうち１つ以上の重鎖置換、又はそれらの保存的置換（すなわち、ＨＶ：Ｌ８９Ｗ、ＨＶ：Ｌ８９Ｙ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｈ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｋ、ＨＶ：Ｋ１４１Ｎ）を含む。
いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｒ７Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｎ８２Ｇ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０Ｅ、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２Ｇのうち１つ以上の軽鎖置換又はそれらの保存的置換（すなわち、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｃ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｃ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｓ）と、ＨＶ：Ｄ２９Ｇ、ＨＶ：Ｓ４７Ｐ、ＨＶ：Ｎ７５Ｑ、ＨＶ：Ｖ７９Ｔ、ＨＶ：Ｒ８２Ｖ、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ、及びＨＶ：Ｋ１４１Ｑのうち１つ以上の重鎖置換又はそれらの保存的置換（すなわち、ＨＶ：Ｌ８９Ｗ、ＨＶ：Ｌ８９Ｙ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｈ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｋ、ＨＶ：Ｋ１４１Ｎ）と、を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３の軽鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ置換又はＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６３の重鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、ＨＶ：Ｖ７９Ｔ置換又はＨＶ：Ｖ７９におけるスレオニンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６４の重鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、ＨＶ：Ｒ８２Ｖ置換又はＨＶ：Ｒ８２におけるバリンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６５の重鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ置換又はＨＶ：Ｌ８９のフェニルアラニンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６６の重鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８のアルギニンの保存的置換を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖アミノ酸配列が、配列番号２２の軽鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ置換又はＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリンの保存的置換を含み、重鎖アミノ酸配列は、配列番号６９の重鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、かつＨＶ：Ｒ８２Ｖ置換又はＨＶ：Ｒ８２におけるバリンの保存的置換と、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換と、を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、配列番号７０の重鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、かつＨＶ：Ｖ７９Ｔ置換又はＨＶ：Ｖ７９におけるスレオニンの保存的置換と、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ置換又はＨＶ：Ｌ８９におけるフェニルアラニンの保存的置換と、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換と、を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２４の軽鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ置換又はＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリンの保存的置換を含み、重鎖アミノ酸配列は、配列番号７１の重鎖可変領域と少なくとも７５％（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％）同一であり、かつＨＶ：Ｖ７９Ｔ置換又はＨＶ：Ｖ７９におけるスレオニンの保存的置換と、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ置換又はＨＶ：Ｌ８９におけるフェニルアラニンの保存的置換と、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換と、を含む。
いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分は、配列番号６３、６４、６５、６６、又は７０を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号２２の軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号６９の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号２４の軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号７１の重鎖可変領域を含む。
可変ドメイン残基位置は、ＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１年）「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第３０９巻第３号第６５７〜７０頁）構造に基づく番号付けシステムに従って番号付けされる。ＭＳ−１９４の可変ドメインの例示的な残基番号を表１に示す。表１で使用される略語は以下のとおりである。「Ｌｄｒ」とは、リーダ配列（例えば、ＡＫＡシグナル配列又はシグナルペプチド）を指す。「Ｍａｔ．Ｌｉｎｅａｒ」とは、成熟型タンパク質鎖の直鎖数を指す。「ＬｍｄＶ」とは、ラムダ型である軽鎖における可変領域を指す。
用語「抗体」（Ａｂ）とは、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体及び多反応性抗体）、及び抗体断片を含む。したがって、用語「抗体」は、本明細書におけるいずれの文脈で用いる場合も、任意の特異的結合メンバ、免疫グロブリンクラス及び／又はアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ）；並びにそれらの生物学的に関連した断片又は特異的結合メンバ（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ（一本鎖又は関連エンティティ）を、これらに限定されないが、含む）を、これらに限定されないが、含むことを意図したものである。抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を有する糖タンパク質、又はその抗原結合部分であると、当該技術分野では理解されている。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）で構成されている。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。重鎖及び軽鎖両方の可変領域は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＷＲ）及び相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を含む。それら４つのＦＷＲ領域は相対的に保存される一方で、ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は超可変領域に相当し、ＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端へと次のように配列される：ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３及びＦＷＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する一方で、そのアイソタイプに依存して、定常領域（複数可）は、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本明細書で使用される場合の「抗体」の定義にはまた、キメラ抗体、ヒト化抗体及び組換え抗体、トランスジェニック非ヒト動物から産生されたヒト抗体、並びに当業者に利用可能な濃縮技術を用いてライブラリから選択された抗体も含まれる。
用語「可変」とは、可変（Ｖ）ドメインのある一定のセグメントが抗体間で配列の点で大幅に異なることを指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、その可変性は、可変領域のアミノ酸スパン全体にわたって均一に分布していない。それよりむしろ、Ｖ領域は、各々が９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる超可変性のより短い領域によって隔てられた、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、３つの超可変領域によって接続された主としてβシート構造をとる４つのＦＲを含み、この超可変領域は、βシート構造を接続する、及び場合によってはβシート構造の一部を形成する、ループを形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲにより極めて互いに近接して互い保持され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（例えば、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセスダ（１９９１年）を参照されたい）。
用語「超可変領域」とは、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在することがある、起こり得る自然発生突然変異を除いて、同一である。用語「ポリクローナル抗体」とは、異なる決定基（「エピトープ」）にを対象とする異なる抗体を含む調製物を指す。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、この鎖（複数可）の残部は、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにかかる抗体の断片（ただし、それらの断片が所望の生物活性を呈示する場合に限る）における対応する配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８１巻第６８５１〜６８５５頁（１９８４年）を参照されたい）。本記載発明は、ヒト抗体に由来する可変領域抗原結合配列を提供する。したがって、本明細書で主に対象となるキメラ抗体は、１つ以上のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲ）を有すると共に、非ヒト抗体に由来する１つ以上の配列、例えばＦＲ又はＣ領域配列を含有する抗体を含む。加えて、本明細書に含まれるキメラ抗体は、ある抗体クラス又はサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列と、別の抗体クラス又はサブクラスに由来する別の配列、例えばＦＲ又はＣ領域配列とを含むものである。
「ヒト化抗体」は、一般に、非ヒトであるソースから導入された１つ以上のアミノ酸残基を有するヒト抗体であると考えられる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、この移入残基は、典型的に、「移入」可変領域から得られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列を移入超可変領域配列で置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従って行ってもよい（例えば、Ｊｏｎｅｓら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３２１巻第５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３３２巻第３２３〜３２７頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２３９巻第１５３４〜１５３６頁（１９８８年）を参照されたい）。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変領域より実質的に少ない可変領域が非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）である。
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、例えば、インタクト抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号；Ｚａｐａｔａら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．」第８巻第１０号第１０５７〜１０６２頁［１９９５年］を参照されたい）；一本鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「Ｆｖ」は、完全抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、緊密な、非共有結合で会合している１重鎖及び１軽鎖可変領域ドメインの二量体を含有する。これらの２つのドメインのフォールディングから、６つの超可変領域（Ｈ及びＬ鎖から各々３ループ）が生まれ、このループは、アミノ酸残基を抗原結合に与え、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかし、単一可変領域（又は抗原に特異的なＣＤＲを３つだけ含む、Ｆｖの半分）であっても、全結合部位より低い親和性でではあるが、抗原を認識及び結合する能力を有する。
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」）は、単一ポリペプチド鎖へと接続されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメイン間にポリペプチドリンカを更に含むことができ、そのポリペプチドリンカにより、ｓＦｖは抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓＦｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、第２６９〜３１５頁（１９９４年）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（１９９５年、下記）を参照されたい。
用語「ダイアボディ」とは、Ｖドメインの鎖内対合ではなく鎖間の対合が実現され、その結果、二価断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片になるように、ＶＨドメインとＶＬドメイン間に短いリンカ（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片を構築することによって調製された、小さい抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第９０巻第６４４４〜６４４８頁（１９９３年）に、より充分に記載されている。
完全ヒト形態で生産することができるドメイン抗体（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｄＡｂ）は、約１１ｋＤａ〜約１５ｋＤａの範囲の、抗体の最小の公知の抗原結合断片である。ＤＡｂは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）の頑強な可変領域である。それらは、微生物細胞培養で高度に発現され、例えば溶解度及び温度安定性を含む（しかしこれらに限定されない）好適な生物物理学的特性を示し、並びに例えばファージディスプレイなどのインビトロ選択システムによる選択及び親和性成熟によく適している。ＤＡｂは、単量体として生物活性であり、それらの小さいサイズ及び固有の安定性のおかげで、より大きい分子にフォーマットして、長期血清半減期又は他の薬理活性を有する薬物を作ることができる。これらの技術の例は、例えば、ラクダ重鎖Ｉｇに由来する抗体について国際公開第９４２５５９１号に記載されており、加えて、米国特許出願公開第２００３０１３０４９６号にはファージライブラリからの単一ドメイン完全ヒト抗体の単離が記載されている。
Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が全くないインタクト結合部位を有する唯一の種である。したがって、それらは、インビボ使用中の非特異的結合低減に適している。ｓＦｖ融合タンパク質を、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかでエフェクタタンパク質の融合を生じさせるように構築することができる。例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編（上掲）を参照されたい。この抗体断片はまた、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような、例えば「線状抗体」であってもよい。かかる線状抗体断片は、単一特異性又は二重特異性であってもよい。
ある特定の実施形態では、本記載発明の抗体は、二重特異性又は多重特異性である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例として、二重特異性抗体は、単一の抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のかかる抗体は、第１の抗原結合部位と第２の抗原のための結合部位を組み合わせることができる。あるいは、抗ＨＩＶアームを、白血球上のトリガ分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）、又はＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃガンマＲ）、例えばＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、に結合するアームと組み合わせて、細胞防御メカニズムを感染細胞に集中及び局在させることができる。二重特異性抗体を使用して、殺細胞剤を感染細胞に局在させることもできる。二重特異性抗体を、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。例えば、国際公開第９６／１６６７３号には二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃガンマＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５，８３７，２３４号には二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃガンマＲＩ抗体が開示されている。例えば、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗Ｆｃアルファ抗体は、国際公開第９８／０２４６３号において報告されており、米国特許第５，８２１，３３７号には二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体が教示されている。例えば、Ｍｏｕｑｕｅｔら、「Ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｔｈｅ Ａｐｐａｒｅｎｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｏｆ Ａｎｔｉ−ＨＩＶ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂｙ Ｈｅｔｅｒｏｌｉｇａｔｉｏｎ．」、「Ｎａｔｕｒｅ．」第４６７巻第５９１〜５頁（２０１０年）、及びＭｏｕｑｕｅｔら、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＨＩＶ−１ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｅｔｅｒｏｌｉｇａｔｉｏｎ」、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．」（２０１２年１月１７日）第１０９巻第３号第８７５〜８０頁もまた参照されたい。
二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。完全長二重特異性抗体の旧来の生産は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、この場合、この２本の鎖は異なる特異性を有する（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３０５巻第５３７〜５３９頁（１９８３年）を参照されたい）。類似の手順が、例えば、国際公開第９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、「ＥＭＢＯ Ｊ．」第１０巻第３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示されている。また、Ｍｏｕｑｕｅｔら、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＨＩＶ−１ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｅｔｅｒｏｌｉｇａｔｉｏｎ」、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．」（２０１２年１月１７日）第１０９巻第３号第８７５〜８０頁も参照されたい。
あるいは、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変領域を、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。この融合は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、Ｉｇ重鎖定常ドメインとのものである。いくつかの実施形態によると、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体の少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体をコードし、所望の場合は免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクタに挿入し、適する宿主細胞にコトランスフェクトする。これは、その構築に用いられる不等比の３つのポリペプチド鎖が所望の二重特異性抗体の最適な収量を与える実施形態では、３つのポリペプチド断片の相互比率の調整に、より大きい自由度を持たせる。しかし、等比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらすとき、又はこの比が所望の鎖の組合せの収量に有意な影響を及ぼさないときには、２つの又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクタに挿入することが可能である。
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法も文献に記載されている。例えば、化学結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２２９巻第８１頁（１９８５年）には、インタクト抗体をタンパク質分解切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順が記載されている。これらの断片をジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、ビシナルジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロ安息香酸塩（ｔｈｉｏｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏａｔｅ：ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方をメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定のための薬剤として使用することができる。
抗体の他の修飾を本明細書では企図している。例えば、様々な非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに、抗体を結合させることができる。例えばコアセルベーション法により若しくは界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）内に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）内に、又はマクロエマルジョン内に抗体を捕捉することもできる。かかる技法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．編（１９８０年）に開示されている。
典型的には、本記載発明の抗体を、当該技術分野において利用可能なベクタ及び方法を用いて組換え生産する。インビトロ活性化Ｂ細胞によってヒト抗体を産生することもできる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。本開示において有用な分子遺伝学及び遺伝子工学の一般的方法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編（１９９１年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編（１９９０年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｉｎｎｉｓら、（１９９０年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７年）Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク）、及び「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」第１０９〜１２８頁、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州クリフトン）の現行版に記載されている。遺伝子操作のための試薬、クローニングベクタ及びキットは、商業ベンダー、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎＴｅｃｈ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から入手可能である。
内因性免疫グロブリン生産が不在の状態でヒト抗体の全レパートリーを生産できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）においてヒト抗体を生産することもできる。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ｊｏｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体生産の完全阻害をもたらすことが記載されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイのかかる生殖細胞系突然変異体マウスへの移入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の生産をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第９０巻第２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３６２巻第２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、「Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．」第７巻第３３頁（１９９３年）；米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５９１，６６９号（全てＧｅｎＰｈａｒｍ）；米国特許第５，５４５，８０７号；並びに国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。かかる動物を、本記載発明のポリペプチドを含むヒト抗体を生産するように遺伝子操作することができる。
抗体断片の生産のために様々な技法が開発されている。旧来、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解消化によって得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第２４巻第１０７〜１１７頁（１９９２年）；及びＢｒｅｎｎａｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２２９巻第８１頁（１９８５年）を参照されたい）。しかし、今はこれらの断片を遺伝子組換えの宿主細胞によって直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現及び大腸菌から分泌させることができ、このことから大量のこれらの断片の容易な生産が可能である。Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第１０巻第１６３〜１６７頁（１９９２年）を参照されたい）。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片を遺伝子組換えの宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期が増加されたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片の他の生産法は、当業者には明白であろう。
ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９７年）「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」第９４巻第４９３７〜４９４２頁）、細菌ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら（１９９７年）「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第１５巻第２９〜３４頁）及び／又は酵母ディスプレイ（Ｋｉｅｋｅら（１９９７年）「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」第１０巻第１３０３〜１３１０頁）を含む（しかしこれらに限定されない）濃縮法を用いてライブラリから抗体断片を選択するための当該技術分野において公知である他の技法を前に論じた技法の代案として用いて、一本鎖抗体を選択してもよい。一本鎖抗体は、糸状ファージ技術を直接用いて生産された一本鎖抗体のライブラリから選択される。ファージディスプレイ技術は当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７３３，７４３号、同第５，８７１，９０７号、同第５，８７２，２１５号、同第５，８８５，７９３号、同第５，９６２，２５５号、同第６，１４０，４７１号、同第６，２２５，４４７号、同第６，２９１６５０号、同第６，４９２，１６０号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、同第６，５９３，０８１号、並びに他の米国特許ファミリメンバ、又は１９９２年５月２４日に出願された英国特許第９２０６３１８号に基づく優先権出願の願書に開示されているような、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＡＴ）からの技術を参照されたい；Ｖａｕｇｈｎら（１９９６年）「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第１４巻第３０９〜３１４頁も参照されたい）。利用可能な組換えＤＮＡ技術、例えば、ＤＮＡ増幅法（例えば、ＰＣＲ）を用いて、又はことによるとそれぞれのハイブリドーマｃＤＮＡをテンプレートとして使用することにより、一本鎖抗体を設計し、構築してもよい。
バリアント抗体も本発明の範囲に含まれる。したがって、本出願に記載の配列のバリアントも本発明の範囲に含まれる。親和性が向上された抗体配列の更なるバリアントを、当該技術分野において公知の方法を用いて得ることができ、それらのバリアントは本発明の範囲内である。例えば、アミノ酸置換を用いて、親和性が更に向上された抗体を得ることができる。あるいは、ヌクレオチド配列のコドン最適化を用いて、抗体生産のための発現系における翻訳効率を向上させることができる。
かかるバリアント抗体配列は、本出願に記載の配列と７０％以上の（すなわち、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の）配列同一性を共有することになる。かかる配列同一性は、基準配列（すなわち、本出願に記載の配列）の完全長に対して算定される。本明細書において言及するときの同一率は、ＮＣＢＩ（米国国立生物工学情報センター）により指定されたデフォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ ６２行列；ギャップ開始ペナルティ＝１１及びギャップ伸長ペナルティ＝１］を用いてＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を使用して決定したときのものである。例えば、本明細書に開示する配列の１つ以上についての少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、又は１５０以上の近接するペプチド及びこれらの間の全ての中間長のペプチドを含むペプチド配列が本発明によって提供される。用語「中間長」とは、本明細書で使用される場合、引用値間の任意の長さ、例えば、７、８、９、１０、１１、１２，１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９等；２１、２２、２３等；３０、３１、３２等；５０、５１、５２、５３等；１００、１０１、１０２、１０３等、１５０、１５１、１５２、１５３等を記述することを意図したものである。
本開示は、血清中で広域中和活性を有する抗体を、単独で、又は他の抗体、例えばＶＲＣ０１、抗Ｖ３ループ、ＣＤ４ｂｓ及びＣＤ４ｉ抗体並びにＰＧ９／ＰＧ１６様抗体（しかしこれらに限定されない）との組合せで、のいずれかで提供する。
別の実施形態によると、本開示は、ＨＩＶに感染している又はＨＩＶ感染症の危険があるヒト又は非ヒト霊長類患者に、ヒトにおけるＨＩＶに対する防御免疫応答又はＨＩＶウイルスの低減の誘導に充分な量及びスケジュールによる投与に適したＨＩＶ抗体組成物の調製及び投与方法を提供する。
別の実施形態によると、本開示は、本開示の少なくとも１つの抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、ワクチンを提供する。一実施形態によると、ワクチンは、本明細書に記載する少なくとも１つの抗体と、薬学的に許容される担体と、を含むワクチンである。このワクチンは、本明細書に記載する特徴を有する複数の抗体を任意の組合せで含むことができ、及び当該技術分野において公知であるようなＨＩＶを中和する抗体を更に含むことができる。
組成物が、ワクチン接種後の様々なサブタイプのＨＩＶ感染症の進行を予防的に又は治療的に処置するために、本明細書に開示する単一の抗体である場合があり、又は同じである若しくは異なり得る本明細書に開示する抗体の組合せでる場合もあることを理解されたい。かかる組合せは、所望の免疫性に従って選択することができる。抗体を動物又はヒトに投与するとき、それを、当業者に公知であるような１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又はアジュバントと併用することができる。この組成物は、ＶＲＣ０１、ｂ１２、抗Ｖ３ループ、ＣＤ４ｂｓ及びＣＤ４ｉ抗体並びにＰＧ９／ＰＧ１６様抗体を含む（しかしこれらに限定されない）、当該技術分野において公知の広域中和抗体を更に含むことができる。
更に、ＨＩＶの治療についての患者における効果レベルの判定に関しては、特に、適切な動物モデルを利用でき、様々な遺伝子療法プロトコルのＨＩＶに対するインビボ有効性を評価するために幅広く実施されている（Ｓａｒｖｅｒら（１９９３ｂ）、上記）。これらのモデルには、これらのモデルとしては、マウス、サル及びネコが挙げられる。これらの動物がＨＩＶ疾患に自然にかかりやすくなくても、ヒト末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）、リンパ節、胎児肝臓／胸腺又は他の組織を用いて再構成されたキメラマウスモデル（例えば、ＳＣＩＤ、ｂｇ／ｎｕ／ｘｉｄ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ−ｈｕ、免疫適格ＳＣＩＤ−ｈｕ、骨髄切除ＢＡＬＢ／ｃ）をレンチウイルスベクタ又はＨＩＶに感染させ、ＨＩＶ病因モデルとして利用することができる。同様に、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）／サルモデルを利用することができ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）／ネコモデルを利用することもできる。この医薬組成物は、ＡＩＤＳの治療的処置に使用するとき、本発明によるベクタと共に他の医薬を含有することができる。これらの他の医薬をそれらの旧来の様式で（すなわち、ＨＩＶ感染症を処置するための薬剤として）使用することができる。
別の実施形態によると、本開示は、有効量の単離されたＨＩＶ抗体、又は親和性成熟バージョンを含む抗体ベースの医薬組成物を提供し、これは、ＨＩＶウイルスの感染を低下させるための予防的又は治療的処置の選択肢を提供する。医薬組成物は第２の治療剤を更に含み得る。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、抗ＨＩＶ−１広域中和抗体であり得る。抗ＨＩＶ−１広域中和抗体は、１０−２５９、１０−３０３、１０−４１０、１０−８４７、１０−９９６、１０−１１２１、１０−１１３０、１０−１１４６、１０−１３４１、１０−１３６９、１０−１０７４ＧＭ、ＧＬ、１０Ｅ８、１２Ａ１２、１２Ａ２１、２Ｆ５、２Ｇ１２、３５０２２、３ＢＣ１７６、３ＢＮＣ１１７、３ＢＮＣ５５、３ＢＮＣ６０、３ＢＮＣ６２、４４７−５２Ｄ、４Ｅ１０、５Ｈ／Ｉ１−ＢＭＶ−Ｄ５、８ＡＮＣ１９５、ｂ１２、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０１、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０２、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０３、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０４、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０５、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０６、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０７、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０８、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０９、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．１０、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．１１、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．１２、ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３、ＣＨ０４、ＣＨ１０３、ＨＧＮ１９４、ＨＪ１６、ＨＫ２０、Ｍ６６．６、ＮＩＨ４５−４６、ＰＣＤＮ−３３Ａ、ＰＣＤＮ−３３Ｂ、ＰＣＤＮ−３８Ａ、ＰＧ９、ＰＧ１６、ＰＧＤＭ１４００、ＰＧＤＭ１４０１、ＰＧＤＭ１４０２、ＰＧＤＭ１４０３、ＰＧＤＭ１４０４、ＰＧＤＭ１４０５、ＰＧＤＭ１４０６、ＰＧＤＭ１４０７、ＰＧＤＭ１４０８、ＰＧＤＭ１４０９、ＰＧＤＭ１４１０、ＰＧＤＭ１４１１、ＰＧＤＭ１４１２、ＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２２、ＰＧＴ１２３、ＰＧＴ１２５、ＰＧＴ１２６、ＰＧＴ１２７、ＰＧＴ１２８、ＰＧＴ１３０、ＰＧＴ１３１、ＰＧＴ１３５、ＰＧＴ１３６、ＰＧＴ１３７、ＰＧＴ１４１、ＰＧＴ１４２、ＰＧＴ１４３、ＰＧＴ１４５、ＰＧＴ１５１、ＰＧＴ１５２、ＶＲＣ−ＣＨ３０、ＶＲＣ−ＣＨ３１、ＶＲＣ−ＣＨ３２、ＶＲＣ−ＣＨ３３、ＶＲＣ−ＣＨ３４、ＶＲＣ−ＰＧ０４、ＶＲＣ−ＣＨ０４ｂ、ＶＲＣ−ＰＧ２０、ＶＲＣ０１、ＶＲＣ０２、ＶＲＣ０３、ＶＲＣ０７、ＶＲＣ２３、及びＺ１３のうちの１つであり得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ−１広域中和抗体は、３ＢＮＣ１１７である。３ＢＮＣ１１７はＨＩＶエンベロープｇｐ１６０上のＣＤ４結合部位を標的とする次世代ｂＮＡｂである。これはＨＩＶ感染ウイルス血症コントローラからクローニングされた組換えヒトＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体である。３ＢＮＣ１１７の長時間作用バージョンは３ＢＮＣ１１７−ＬＳとして知られている。３ＢＮＣ１１７は米国特許第９，７８３，５９４号に記載された。
本開示の抗体ベースの医薬組成物を、当該技術分野において公知の任意の数の戦略（例えば、ＭｃＧｏｆｆ及びＳｃｈｅｒ（２０００年）「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、ＭｃＮａｌｌｙ，Ｅ．Ｊ．編、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．」、ニューヨーク州ニューヨーク、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、第１３９〜１５８頁；Ａｋｅｒｓ及びＤｅｆｉｌｉｐｐｉｓ（２０００年）「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．」、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」、ペンシルベニア州フィラデルフィア、Ｔａｌｙｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ、第１４５〜１７７頁；Ａｋｅｒｓら、（２００２年）「Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」第１４巻第４７〜１２７頁を参照されたい）によって製剤化してよい。患者への投与に適する薬学的に許容される組成物は、許容される温度範囲内での貯蔵中に生物活性を保持する上に最大安定性を促進しもする製剤中に有効量の抗体を含有することになる。前記医薬組成物は、所望される製剤に依存して、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される担体及び／又は薬学的に許容される賦形剤、若しくは動物又はヒトへの投与用の医薬組成物の製剤化に一般に用いられる、そのようなビヒクルも含むことができる。この希釈剤は、この組合せの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。本開示の医薬組成物又は製剤において有用である賦形剤の量は、それを必要とする被検体に投与すべきときにその組成物を均一に分散させることができるようにその組成物全体にわたって抗体を均一に分配するのに役立つ量である。これは、所望の有益な緩和又は治癒結果もたらすと同時に高すぎる濃度から起こるであろう一切の有害副作用を最少にする濃度に抗体を希釈するのに役立つことがある。これはまた、保存効果を有することもある。したがって、高い生理活性を有する抗体については、いっそう多くの賦形剤を利用することになる。その一方で、より低い生理活性を呈示するいずれの活性成分（複数可）についても、より少ない量の賦形剤を利用することになる。
上記抗体を、及び本明細書に記載する抗体の少なくとも１つ又は組合せを含む抗体組成物又はワクチン組成物を、ＨＩＶウイルス感染の予防的及び治療的処置のために投与することができる。
本開示はまた、表２〜表３に列挙される、軽鎖領域及び重鎖可変領域の新規なアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドにも関する。他の関連した実施形態では、本開示は、本明細書に記載する方法（すなわち、標準パラメータを用いるＢＬＡＳＴ分析）を用いて決定したときに、表２〜３に列挙されるポリペプチド配列と比較して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を共有するＨＩＶ抗体の軽鎖領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する、ポリペプチドバリアントを提供する。アミノ酸の類似性などに考慮することにより、これらの値を適切に調整して、コードされたタンパク質の対応する同一性を決定することができることは、当業者には理解されるであろう。他の関連した実施形態では、本開示は、表２〜表３に列挙されたポリペプチド配列と比較して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列同一性を共有し、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が表４に列挙されたものと同一若しくは実質的に同一である、又は未修飾の１０−１０７４−ＬＳ抗体（又はＭＳ−１９３）のＣＤＲ領域のアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一である、ＨＩＶ抗体の軽鎖領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドバリアントを提供する。他の関連した実施形態では、本開示は、表２〜表３に列挙されたポリペプチド配列と比較して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列同一性を共有し、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が表４に列挙されたものと同一若しくは実質的に同一である、又は未修飾の１０−１０７４−ＬＳ抗体（又はＭＳ−１９３）のＣＤＲ領域のアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一である、ＨＩＶ抗体の軽鎖領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドバリアントを提供し、そのようなポリペプチドバリアントは、ＨＩＶウイルスに対する７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の結合親和性を保持する。用語「実質的に同一」とは、約８５％より大きい別の配列に対する配列の同一性を指す。
用語「ポリペプチド」は、その従来の意味で、すなわち、アミノ酸の配列として用いている。ポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されない。ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれ、かかる用語は、特に別段の指示がない限り、本明細書では互換的に用いることができる。この用語は、自然に発生するもの及び自然に発生しないもの両方の、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、及び当該技術分野において公知の他の修飾も含む。ポリペプチドは、タンパク質全体である場合もあり、又はその部分配列である場合もある。本開示に関連して対象となる特定のポリペプチドは、抗原又はＨＩＶ感染細胞に結合できる、ＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬを含むアミノ酸部分配列である。
ポリペプチド「バリアント」は、この用語を本明細書において用いる場合、本明細書に具体的に開示するポリペプチドとは１つ以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入の点で典型的に異なるポリペプチドである。かかるバリアントは、天然起源である場合もあり、又は例えば、本開示の上記ポリペプチド配列の１つ以上の修飾、及び本明細書に記載のポリペプチドの１つ以上の生物活性の評価、及び／若しくは当該技術分野において周知のいくつかの技法のうちのいずれかの使用によって、合成的に生成される場合もある。
例えば、あるアミノ酸を、タンパク質構造内の他のアミノ酸と、他のポリペプチド（例えば、抗原）又は細胞に結合する能力のかなりの喪失を伴うことなく置換することができる。タンパク質の結合能力及び性質は、そのタンパク質の生物学的機能活性を規定するので、あるアミノ酸配列置換をタンパク質配列、したがってその基礎となるＤＮＡコード配列に起こすことができ、それにより同様の特性を有するタンパク質を得られる。したがって、本開示組成物のペプチド配列、又はこのペプチドをコードする対応ＤＮＡ配列に、それらの生物学的有用性又は活性を著しく喪失することなく、様々な変更を加えることができることが考えられる。
バリアント抗体配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾により保存的置換が導入されている配列を含む。アミノ酸は、物理的性質と、二次及び三次タンパク質構造への寄与と、によって分類できる。「保存的置換」は、類似の特性を有する１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換として当該技術分野で認識されている。例示的な保存的置換を以下に示す。
Figure 2022500042
あるいは、保存的アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、（「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９７５年）第７１〜７７頁）に記載される用にグループ分けすることができ、これは以下に示す。
Figure 2022500042
更に別の代替例として、例示的な保存的置換を以下に示す。
Figure 2022500042
既存の置換の保存的置換とは、置換残基の保存的置換を指す。例えば、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐの保存的置換は、位置ＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリン（Ｐ）の保存的置換（すなわちグリシン（Ｇ））を指す。別の例では、ＨＶ：Ｖ７９Ｔの保存的置換とは、位置ＨＶ：Ｖ７９のスレオニン（Ｔ）の保存的置換（すなわち、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ））を指す。
「相同性」又は「配列同一性」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大相同率を達成するためにギャップを挿入した後に非バリアント配列と同一であるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列バリアントでの残基の百分率を指す。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド及びポリペプチドバリアントは、本明細書に記載するポリヌクレオチド又はポリペプチドとの少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のポリヌクレオチド又はポリペプチド相同性を有する。
かかるバリアントポリペプチド配列は、本出願に列挙した配列と７０％以上の（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を共有することになる。更なる実施形態では、本記載発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列の様々な長さの連続ストレッチを含むポリペプチド断片を提供する。例えば、本明細書に開示する配列の１つ以上についての少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、又は１５０以上の近接するペプチド及びこれらの間の全ての中間長のペプチドを含むペプチド配列が本発明によって提供される。
本開示はまた、本記載発明抗体の軽及び重鎖の一部又は全てをコードする核酸配列、及びそれらの断片も含む。遺伝子コードの冗長性のため、同じアミノ酸配列をコードするこれらの配列のバリアントが存在することになる。
本開示はまた、表２〜表３に列挙するＨＩＶ抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする単離された核酸配列も含む。他の関連した実施形態では、本記載発明は、表５〜６に列挙するＨＩＶ抗体の重鎖及び軽鎖のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドバリアントを提供する。これらのポリヌクレオチドバリアントは、本明細書に記載する方法（すなわち、標準パラメータを用いるＢＬＡＳＴ分析）を用いて判定したときに本開示のポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム配置などを考慮に入れることにより、これらの値を適切に調整して、２つのヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質の対応する同一性を決定することができることは、当業者には理解されるであろう。
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合ポリマーを指すために本明細書では互換的に用いられる。ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、追加のゲノム及びプラスミド配列、並びにより小さい操作された遺伝子セグメントであって、ポリペプチドを発現する又は発現するように適応され得るセグメントを含むことができる。
「単離された核酸」は、他のゲノムＤＮＡからはもちろん、天然に天然配列を伴う、タンパク質又は複合体、例えばリボソーム及びポリメラーゼからも実質的に分離されている核酸である。この用語は、その天然に存在する環境から除去された核酸配列を包含し、組換え体又はクローン化ＤＮＡ単離体、及び化学合成類似体、又は異種のシステムによって生合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸は、単離された形態の前記核酸を含む。したがって、これは、初めから単離されているような核酸を指し、人間の手で単離された核酸に後で加えられた遺伝子又は配列を除外しない。
ポリヌクレオチド「バリアント」は、この用語を本明細書において用いる場合、本明細書に具体的に開示するポリヌクレオチドとは１つ以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入の点で典型的に異なるポリヌクレオチドである。かかるバリアントは、天然起源である場合もあり、又は例えば、本開示のポリヌクレオチド配列の１つ以上の修飾、及び本明細書に記載のコードされたポリペプチドの１つ以上の生物活性の評価、及び／若しくは当該技術分野において周知のいくつかの技法のうちのいずれかの使用によって、合成的に生成される場合もある。
本記載発明のポリヌクレオチドの構造に修飾を施すことができ、所望の特徴を有するバリアント又は誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子をなお得ることができる。本発明のポリペプチドの等価の又は更には改善されたバリアント又は部分を作り出すためにポリペプチドのアミノ酸配列を改変することが所望されるとき、典型的に、当業者は、コードするＤＮＡ配列のコドンの１つ以上を変更することになる。
典型的に、ポリヌクレオチドバリアントは、そのバリアントポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの免疫原性の結合特性が、本明細書に具体的に示すポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドに比べて実質的に減少されないような、１つ以上の置換、付加、欠失及び／又は挿入を含有する。
更なる実施形態では、本記載発明は、本明細書に開示する配列の１つ以上と同一の又は相補的な配列の様々な長さの連続ストレッチを含むポリヌクレオチド断片を提供する。例えば、本明細書に開示する配列の１つ以上についての連続する少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００又は１０００あるいはそれ以上のヌクレオチド及びそれらの間の全ての中間長のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、引用値間の、例えば、１６、１７、１８、１９等、２１、２２、２３等、３０、３１、３２等、５０、５１、５２、５３等、１００、１０１、１０２、１０３等、１５０、１５１、１５２、１５３等、及び２００〜５００、５００〜１，０００中の全ての整数を含む、任意の長さを包含するポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。
本発明の別の実施形態では、本明細書が提供するポリヌクレオチド配列、又はその断片、又はその相補配列に、中から高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズできるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション法は、分子生物学技術分野において周知である。例証のために、本開示のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを試験するための適切な中等度のストリンジェントな条件は、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０〜６０℃、５ｘＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続いて２回の６５℃で２０分間の、各々、０．１％ＳＤＳを含有する２ｘ、０．５ｘ及び０．２ｘＳＳＣでの洗浄を含む。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量及び／又はハイブリダイゼーションを行う温度を変えることによって容易に操作することができることは、当業者には理解されるであろう。例えば、別の実施形態では、適切で高度ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの温度を例えば６０〜６５℃又は６５〜７０℃に上昇させることを除いて、上に記載したものを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアント又は断片によってコードされたポリペプチドは、天然ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと同じ結合特異性を有する（すなわち、同じエピトープ又はＨＩＶ株に特異的に又は優先的に結合する）。いくつかの実施形態では、本記載のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドバリアント、断片及びハイブリダイゼーション配列は、本明細書に具体的に示すポリペプチド配列についてのものの、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％及び少なくとも約９０％のレベルの結合活性を有するポリペプチドをコードする。
本記載発明のポリヌクレオチド、又はそれらの断片を、それ自体のコード配列の長さに関係なく、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメントなどと組み合わせることができるので、それらの全長は、かなり変動し得る。ほぼあらゆる長さの核酸断片が用いられる。例えば、長さ約１００００、約５０００、約３０００、約２０００、約１０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対などの全長（全ての中間長を含む）を持つ例示的なポリヌクレオチドセグメントが本発明の多くの実施に含まれる。
本発明による核酸配列を含むベクタ、例えば発現ベクタが、更に本発明の範囲に含まれる。かかるベクタで形質転換された細胞もまた本発明の範囲に含まれる。
本開示は、本発明の核酸を含むベクタ及び宿主細胞、並びに本発明のポリペプチドの生産のための組換え法も提供する。本発明のベクタは、例えばプラスミド、ファージ、コスミド及びミニ染色体を含む、任意のタイプの細胞又は生物において複製できるものを含む。いくつかの実施形態では、本記載発明のポリヌクレオチドを含むベクタは、そのポリヌクレオチドの成長若しくは複製に適したベクタであるか、又は本記載発明のポリペプチドの発現に適したベクタである。かかるベクタは、当該技術分野において公知であり、市販されている。
「ベクタ」は、シャトルベクタ及び発現ベクタを含む。典型的に、プラスミド構築物は、細菌のプラスミドの、それぞれ複製及び選択のために、複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１複製起点）及び選択マーカ（例えば、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性）も含むことになる。「発現ベクタ」は、細菌細胞又は真核細胞中の、本発明の抗体断片を含む抗体の発現に必要な制御配列又は調節要素を含有するベクタを指す。
用語「細胞」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物細胞又はヒト細胞など（しかしこれらに限定されない）の真核、多細胞種のものを（例えば、単細胞の酵母細胞とは対照的に）含むが、これらに限定されない、任意の細胞であり得る。細胞は、単一エンティティとして存在する場合もあり、又は細胞のより大きなコレクションの一部である場合もある。かかる「細胞のより大きなコレクション」は、例えば、細胞培養物（混合されたものか純粋なもの）、組織（例えば、内皮、上皮、粘膜若しくは他の組織）、器官（例えば、肺、肝臓、筋肉及び他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系、胃腸系、泌尿器系、神経系、外皮系若しくは他の器官系）、又は生物（例えば、鳥類、哺乳類など）を含むことができる。
本発明のポリヌクレオチドを全体として合成してもよく、又は少しずつ合成して組み合わせてもよく、そして、例えば、適切な制限部位及び制限酵素を用いる線状ベクタへの前記ポリヌクレオチドのサブクローニングを含む、ルーチンの分子生物学及び細胞生物学法を用いて、ベクタに挿入してもよい。本記載発明のポリヌクレオチドを、そのポリヌクレオチドの各鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマを使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。これらのプライマは、ベクタへのサブクローニングを助長するための制限酵素切断部位も含む。複製可能なベクタ成分は、一般に、次のものの１つ以上を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、及び１つ以上の、マーカ又は選択可能な遺伝子。
本発明のポリペプチドを発現するために、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は機能的等価物を、適切な発現ベクタ、すなわち、挿入したコード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクタに挿入してよい。対象となるポリペプチド並びに適切な転写及び翻訳制御要素をコードする配列を含有する発現ベクタを構築するために、当業者に周知の方法を用いてよい。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ法、合成法、及びインビボ遺伝子組換えが挙げられる。かかる技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州プレインビューと、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９８９年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨークと、に記載されている。
本開示は、本発明の抗体、ポリペプチド及び核酸を使用して診断及び予後アッセイを実施する際に有用なキットも提供する。本発明のキットは、本発明のＨＩＶ抗体、ポリペプチド又は核酸を標識された形態又は未標識の形態いずれかで含む、適切な容器を含む。加えて、該抗体、ポリペプチド又は核酸を間接結合アッセイに適する標識された形態で供給するとき、そのキットは、適切な間接アッセイを行うための試薬を更に含む。例えば、該キットは、標識の性質に依存して酵素基質又は誘導体化剤を含む、１つ以上の適する容器を含むことがある。対照試料及び／又は説明書も含むことがある。本開示は、ＰＣＲ又は質量分析によって生体試料中の本開示のＨＩＶ抗体の存在又はＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列を検出するためのキットも提供する。
いくつかの実施形態では、該キットは、本明細書に記載の薬学的有効量である少なくとも１つの単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分の薬学的に許容される用量単位を含む。キットは更に、薬学的有効量の抗ＨＩＶ剤の薬学的に許容される用量単位を含み得る。２つの薬学的に許容される用量単位は、単一の薬学的に許容される用量単位の形態を任意にとることができる。例示的な抗ＨＩＶ剤は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入阻害剤又は融合阻害剤、及びインテグラーゼ阻害剤からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ剤は、３ＢＮＣ１１７などの抗ＨＩＶ広域中和抗体である。
「標識」とは、本明細書で使用される場合、「標識された」抗体を生成するために抗体に直接又は間接的に結合される検出可能な化合物又は組成物を指す。標識を本明細書に開示するポリペプチド及び／又は核酸配列に結合することもできる。前記標識は、単独で検出可能であることができ（例えば、放射性同位元素標識若しくは蛍光標識）、又は酵素標識の場合は、検出可能である基質化合物若しくは組成物の化学的変成を触媒することができる。本記載発明の抗体及びポリペプチドを、例えば、精製又は診断応用に用いるために、エピトープタグ又は標識を含むように修飾することもできる。適する検出手段としては、標識、例えば、これらに限定されないが、放射性ヌクレオチド、酵素、補酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素原、酵素基質又は補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素などの使用を含む。
別の実施形態によると、本開示は、診断方法を提供する。診断方法は、一般に、患者から採取した生体試料、例えば、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料又は組織生検材料などをＨＩＶ抗体と接触させること、及び抗体が試料に、対照試料又は所定のカットオフ値と比較して、選択的に結合するかどうかを判定し、それによってＨＩＶウイルスの存在を示すことを含む。
別の実施形態によると、本開示は、患者からの生体試料中の本開示のＨＩＶ抗体の存在を検出するための方法を提供する。検出方法は、一般に、患者から生体試料、例えば、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料又は組織生検材料などを採取し、ＨＩＶ抗体又はそれらの断片、若しくはＨＩＶ抗体をコードする核酸を単離すること、及び生体試料中のＨＩＶ抗体の存在について検査することを含む。また、本開示は、細胞におけるＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列を検出するための方法を提供する。ＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列を、本明細書に開示するプライマを使用して検出してもよい。患者からの生体試料中のＨＩＶ抗体の存在を、公知の組換え法及び／又は質量分析装置の使用により判定してもよい。
別の実施形態では、本開示は、生体試料において高度に保存されたコンセンサス配列を含む重鎖と高度に保存されたコンセンサス配列を含む軽鎖とを含むＨＩＶ抗体を検出するための方法を提供し、この方法は、哺乳動物対象から免疫グロブリン含有生体試料を採取すること、該試料からＨＩＶ抗体を単離すること、及び重鎖及び軽鎖の高度に保存されたコンセンサス配列を同定することを含む。生体試料は、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料又は組織生検材料であってよい。アミノ酸配列を、例えばＰＣＲ及び質量分析を含む、当該技術分野において公知の方法によって判定してよい。
用語「評価」（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）は、任意の形態の測定を含み、及びある要素が存在するか否かを決定することを含む。用語「判定」（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）、「測定」（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）、「評価」（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）、「評価」（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）及び「アッセイ」（ａｓｓａｙｉｎｇ）は、互換的に用いられ、定量的及び定性的決定を含む。評価は、相対的であることもあり、又は絶対的であることもある。「の存在を評価」は、存在する何かの量を判定すること、及び／又はそれが存在するのか、又は不在であるのかを判定することを含む。本明細書で使用される場合、用語「判定」、「測定」及び「評価」及び「アッセイ」は、互換的に用いられ、定量的決定と定性的判定の両方を含む。
ウイルス複製を低減させる方法
対象におけるＨＩＶウイルス力価、ウイルス複製、ウイルス増殖又はＨＩＶウイルスタンパク質の量の増加を低減させるための方法を更に提供する。別の態様によると、ある方法は、対象における１つ以上のＨＩＶ株又は単離体のＨＩＶ力価、ウイルス複製又はＨＩＶタンパク質の量の増加を低減させるのに有効な量のＨＩＶ抗体を対象に投与することを含む。
別の実施形態によると、本開示は、ウイルス複製を低減させる、又は更なる宿主細胞又は組織へのＨＩＶ感染の拡大を低減させる方法を提供し、この方法は、ｇｐ１２０上の抗原エピトープに結合する抗体又はその一部分と哺乳動物細胞を接触させることを含む。
治療方法
別の実施形態によると、本開示は、ウイルス感染症に感染した、例えばＨＩＶなどに感染した、哺乳動物を治療するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示するＨＩＶ抗体を含む医薬組成物を該哺乳動物に投与することを含む。一実施形態によると、ＨＩＶに感染した哺乳動物を治療するための方法は、本開示の抗体又はその断片を含む医薬組成物を該哺乳動物に投与することを含む。本開示の組成物は、開示する特徴を有する１つより多くの抗体（例えば、複数の抗体又は抗体のプール）を含むことができる。また、当該技術分野で周知である他のＨＩＶ中和抗体、例えば、１０−２５９、１０−３０３、１０−４１０、１０−８４７、１０−９９６、１０−１１２１、１０−１１３０、１０−１１４６、１０−１３４１、１０−１３６９、１０−１０７４ＧＭ、ＧＬ、１０Ｅ８、１２Ａ１２、１２Ａ２１、２Ｆ５、２Ｇ１２、３５０２２、３ＢＣ１７６、３ＢＮＣ１１７、３ＢＮＣ５５、３ＢＮＣ６０、３ＢＮＣ６２、４４７−５２Ｄ、４Ｅ１０、５Ｈ／Ｉ１−ＢＭＶ−Ｄ５、８ＡＮＣ１９５、ｂ１２、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０１、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０２、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０３、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０４、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０５、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０６、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０７、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０８、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．０９、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．１０、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．１１、ＣＡＰ２５６−ＶＲＣ２６．１２、ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３、ＣＨ０４、ＣＨ１０３、ＨＧＮ１９４、ＨＪ１６、ＨＫ２０、Ｍ６６．６、ＮＩＨ４５−４６、ＰＣＤＮ−３３Ａ、ＰＣＤＮ−３３Ｂ、ＰＣＤＮ−３８Ａ、ＰＧ９、ＰＧ１６、ＰＧＤＭ１４００、ＰＧＤＭ１４０１、ＰＧＤＭ１４０２、ＰＧＤＭ１４０３、ＰＧＤＭ１４０４、ＰＧＤＭ１４０５、ＰＧＤＭ１４０６、ＰＧＤＭ１４０７、ＰＧＤＭ１４０８、ＰＧＤＭ１４０９、ＰＧＤＭ１４１０、ＰＧＤＭ１４１１、ＰＧＤＭ１４１２、ＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２２、ＰＧＴ１２３、ＰＧＴ１２５、ＰＧＴ１２６、ＰＧＴ１２７、ＰＧＴ１２８、ＰＧＴ１３０、ＰＧＴ１３１、ＰＧＴ１３５、ＰＧＴ１３６、ＰＧＴ１３７、ＰＧＴ１４１、ＰＧＴ１４２、ＰＧＴ１４３、ＰＧＴ１４５、ＰＧＴ１５１、ＰＧＴ１５２、ＶＲＣ−ＣＨ３０、ＶＲＣ−ＣＨ３１、ＶＲＣ−ＣＨ３２、ＶＲＣ−ＣＨ３３、ＶＲＣ−ＣＨ３４、ＶＲＣ−ＰＧ０４、ＶＲＣ−ＣＨ０４ｂ、ＶＲＣ−ＰＧ２０、ＶＲＣ０１、ＶＲＣ０２、ＶＲＣ０３、ＶＲＣ０７、ＶＲＣ２３、及びＺ１３を含むことができるが、これらに限定されない。
この方法は更に、第２の治療剤、例えば治療有効量の第２の治療剤を投与することを含んでもよい。第２の治療剤は、抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分の投与の前、同時、又は後に投与され得る。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、抗ＨＩＶ−１広域中和抗体である。抗ＨＩＶ−１広域中和抗体の例は上に提示されている。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ−１広域中和抗体は、３ＢＮＣ１１７である。
受動免疫がウイルス性疾患の予防及び治療のための有効で安全な戦略であることは証明されている。（例えば、Ｋｅｌｌｅｒら、「Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．」第１３巻第６０２〜１４頁（２０００年）；Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」第２０巻第１１４頁（２００２年）；Ｓｈｉｂａｔａら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」第５巻第２０４〜１０頁（１９９９年）；及びＩｇａｒａｓｈｉら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」第５巻第２１１〜１６頁（１９９９年）を参照されたい）。ヒトモノクローナル抗体を使用する受動免疫は、ＨＩＶの救急予防及び治療のための緊急治療戦略を実現する。
ＨＩＶ関連疾患又は障害の危険がある対象としては、感染者と接触した患者、又は何らかの他の方法でＨＩＶに曝露された患者を含む。疾患又は障害を予防するか、又はその進行を遅らせるために、ＨＩＶ関連疾患又は障害に特有の症状の兆候の前に予防薬の投与を行うことができる。
ヒト及び非ヒト患者のインビボでの治療のために、本開示のＨＩＶ抗体を含む医薬製剤を患者に投与又は提供する。インビボ療法に使用するとき、本開示の抗体を患者に治療有効量（すなわち、患者のウイルス負荷量を無くす又は低減させる量）で投与する。抗体を、公知の方法に従って、例えば、静脈内投与により、例えばボーラスとして若しくはある期間にわたっての持続注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、関節滑液嚢内、クモ膜下、経口、局所又は吸入経路により、ヒト患者に投与する。抗体を非経口投与することができ、可能な場合には標的細胞部位に投与することができ、又は静脈内投与することができる。いくつかの実施形態では、抗体を、静脈内又は皮下投与によって投与する。本開示の治療用組成物を患者又は対象に全身投与してもよいし、非経口投与してもよいし、又は局所投与してもよい。治療成功及び疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師には周知のルーチン手順によって容易に測定される。
非経口投与のために、抗体を、薬学的に許容される非経口ビヒクルを伴う注射用単位剤形（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化してもよい。かかるビヒクルの例としては、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。非水性ビヒクルとしては、不揮発性油及びオレイン酸エチルが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームを担体として使用することができる。ビヒクルは、少量の添加剤、例えば、等張性及び化学的安定性を向上させる物質、例えば緩衝液及び保存薬などを含有することもある。抗体をかかるビヒクル中、約１ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化することができる。
用量及び薬剤投与計画は、医師によって容易に決定される様々な因子、例えば、感染の性質、例えばその治療指数、患者、及び患者の病歴に依存する。一般に、治療有効量の抗体を患者に投与する。いくつかの実施形態では、投与される抗体の量は、患者体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。感染のタイプ及び重症度に依存して、体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体が、例えば１回以上の別々の投与によるか、又は連続注入による、患者への投与のための初期候補の投与量である。この治療の経過は、従来の方法及びアッセイによって、及び医師若しくは他の当業者に公知の基準に基づいて、容易にモニタされる。治療成功及び疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師には周知のルーチン手順によって容易に測定される。
他の治療法を本開示のＨＩＶ抗体の投与と併用してもよい。併用投与は、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及びいずれかの順序での逐次投与を含み、この際、好ましくは両方（又は全ての）活性薬剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間がある。かかる併用療法は、相乗治療効果をもたらすことができる。治療成功及び疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師には周知のルーチン手順によって容易に測定される。
用語「治療する」又は「治療」若しくは「緩和」は、互換的に用いられ、治療的処置と、予防的又は予防対策との両方を指し、この際目的は、標的とされる病的状態又は障害を予防する又は遅らせる（和らげる）ことである。治療を必要とする者は、障害を既に有する者、並びに、障害に罹患しやすい者又は障害を予防しなければならない者も含む。対象又は哺乳動物は、本開示の方法に従って治療量の抗体を受けた後、その患者が、次の１つ以上に関して観察可能な及び／又は測定可能な低減若しくは次の１つ以上の不在：感染細胞数の低減又は感染細胞の不在；感染している全細胞のパーセントの低減；及び／若しくは特定の感染に付随する症状の１つ以上のある程度の軽減；罹患率及び死亡率低減、並びに生活の質の問題の向上を示す場合、感染がうまく「治療される」。治療成功及び疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師には周知のルーチン手順によって容易に測定される。
用語「有効量」、「有効用量」又は「有効投与量」という用語は、所望の効果を達成する、又は少なくとも部分的に達成するのに充分な量として定義される。薬物又は治療剤の「治療有効量」又は「治療有効投与量」は、単独で又は別の治療剤と組み合わせて使用される場合、疾患症状の重篤度の低下、疾患症状のない期間の頻度及び期間の増加、又は疾患症状による機能障害若しくは能力障害の予防によって証明される、疾患の退行を促進する薬物の任意の量である。薬剤の「予防有効量」又は「予防有効投与量」は、疾患を発症するリスク又は疾患の再発に罹患するリスクがある対象に対して、単独で又は別の治療剤と組み合わせて投与された場合に、疾患の発症又は再発を阻害する薬物の量である。疾患の退縮を促進する、又は疾患の発症若しくは再発を阻害する治療剤又は予防薬の能力は、例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける効力を予測する動物モデル系において、又はインビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることにより、当業者に知られている様々な方法を用いて評価することができる。
１つ以上の更なる治療剤と「併用での」投与は、同時（同時に行う）投与及び任意の順序での逐次投与を含む。
「担体」は、本明細書で使用される場合、用いられる投与量及び濃度で、曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含むがこれに限定されない抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、これらに限定されないが、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、これに限定されないが、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、これらに限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含むが、これらに限定されない）；キレート剤、例えば、これに限定されないが、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、これらに限定されないが、マンニトール、ソルビトール、スクロース、又はトレハロース；塩形成性対イオン、例えば、これに限定されないが、ナトリウム；並びに／又は非イオン界面活性剤、例えば、これらに限定されないが、ＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポロキサマー、すなわちＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８及びポリソルベート、すなわちポリソルベート２０又はポリソルベート８０が挙げられるが、これらに限定されない。
定義
本開示による組成物及び方法の詳細な説明の理解を助けるために、いくつかの明確な定義が提供されることで、本開示の様々な態様の明確な開示が容易となる。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
用語「組換体」とは、核酸分子に関する場合、分子生物学的技術によって結合された核酸のセグメントからなる核酸分子を指す。用語「組換体」とは、タンパク質又はポリペプチドに関する場合、組換え核酸分子を用いて発現されるタンパク質分子を指す。
用語「操作可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、核酸発現制御配列（プロモータ、又は転写因子結合部位のアレイなど）と、第２の核酸配列との間の機能的結合を指し、ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
用語「インビトロ」とは、本明細書で使用される場合、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば試験管又は反応容器内、細胞培養物内等で生じる事象を指す。
用語「インビボ」とは、本明細書で使用される場合、非ヒト動物などの多細胞生物内で起こる事象を指す。
用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、及び「予防的処置」などは、障害又は状態を発症しないが、障害又は状態を発症するリスクがある又は発症しやすい対象における、障害又は状態を発症する確率を低下させることを指す。
用語「投与すること」とは、本明細書で使用される場合、当業者に公知の様々な方法及び送達システムのいずれかを用いて、治療剤を含む組成物を対象へ物理的に導入することを指す。本明細書に記載される投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路、例えば注射若しくは点滴による投与を含む。語句「非経口投与」とは、本明細書で使用される場合、通常、注射による、経腸及び局所投与以外の投与方法を意味し、限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管内、皮下、表皮下、関節腔内、関節下、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内の注射及び点滴、並びにインビボ電気穿孔を含む。あるいは、本明細書に記載される組成物は、非非経口経路、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下又は局所的に投与することができる。投与は、例えば１回、複数回、及び／又は１以上の長期間にわたって実行することもできる。
用語「薬剤」とは、本明細書では、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子（核酸、抗体、タンパク質又はその一部、例えばペプチドなど）、又は細菌、植物、真菌、若しくは動物（特に哺乳動物）細胞若しくは組織などの生物学的材料から作られた抽出物を示すように使用される。そのような薬剤の活性は、対象において局所的又は全身的に作用する生物学的、生理学的又は薬理学的に活性な物質（又は複数の物質）である「治療剤」が好適であり得る。
用語「治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」、「治療可能剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｐａｂｌｅ ａｇｅｎｔ）」、又は「治療薬（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）」とは、互換的に使用され、対象への投与に際して何らかの有益な効果を与える分子又は化合物を指す。有益な効果には、以下の診断的決定：疾患、症状、障害、又は病理学的状態の改善；疾患、症状、障害、又は状態の発症の低減又は予防；及び一般的に、疾患、症状、障害又は病態の防御の実施可能性が含まれる。
「併用」療法とは、本明細書で使用される場合、文脈から他に明らかでない限り、協調した様式での２つ以上の治療剤の投与を包含することを意味し、同時投与を含むが、これに限定されない。具体的には、併用療法は、同時投与（例えば、同時処方の投与、又は別々の治療組成物の同時投与）と、連続又は順次投与との両方を包含するが、ただし、１つの治療剤の投与は、別の治療剤の投与に対して何らかの方法で条件付けされる。例えば、１つの治療剤は、異なる治療剤が投与され、かつ所定の期間作用させた後にのみ投与され得る。例えば、Ｋｏｈｒｔら、（２０１１年）「Ｂｌｏｏｄ」第１１７巻第２４２３頁を参照されたい。
範囲の値が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間に、文脈上明らかに他の指示がない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載値又は介在値が、本開示に包含されることが理解される。独立して小さい範囲に含まれ得るこれらの小範囲の上限及び下限もまた、記載された範囲の中で特に除外された任意の制限を条件として、本開示に包含される。記載の範囲に一方又は両方の限界値が含まれている場合、それら両方の限界値をいずれも除いた範囲もまた、本開示に含まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の指示がない限り、複数形の参照を含むことに注意されたい。
用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びその変形は、特に断りのない限り、以下に記載される項目及びその等価物、並びに更なる目的物を包含することを意味する。
語句「一実施形態では」、「種々の実施形態では」、及び「いくつかの実施形態では」などが繰り返し使用されている。このような表現は必ずしも同じ実施形態を指すものではないが、文脈上特に断りのない限り、同じものを指す場合もある。
用語「及び／又は」又は「／」とは、この用語が関連付けられている項目のいずれか１つ、項目の任意の組合せ、又は項目の全てを意味する。
語「実質的に」とは「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくともよい。必要に応じて、本発明の定義から「実質的に」という語を省略してもよい。
本明細書で使用される場合、１つ以上の目的の値に適用される「およそ」又は「約」という用語は、記載された基準値と類似する値を指す。いくつかの実施形態では、用語「およそ」又は「約」とは、別段の記載がない限り、又は文脈から明白でない限り、記載された基準値のいずれかの方向（より大きい又はより小さい）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はより小さい範囲内に入る値の範囲を指す（可能な値の１００％をこのような数が超える場合を除く）。本明細書で別段の指示がない限り、用語「約」とは、個々の成分、組成物、又は実施形態の機能性の観点から同等である、列挙された範囲に近接した値、例えば、重量パーセンテージを含むことを意図している。
本明細書で使用される場合、項目のコレクションに関連して使用される用語「それぞれ」とは、コレクション内の個々の項目を識別することを意図するが、必ずしもコレクション内の全ての項目を指すものではない。明示的な開示又は文脈上明らかに他と判断される場合、例外が生じることもある。
本明細書に提示されている任意及び全ての例、又は例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、他に主張されない限り、本発明の範囲に制限を与えるものではない。本明細書のいかなる文言も、任意の請求されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものと解釈してはならない。
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で別段の断りがない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施される。提供される方法のいずれに関しても、方法の工程は、同時又は連続的に生じ得る。方法の工程が連続して発生する場合、別段に注記がない限り、工程は任意の順序で生じてもよい。
方法が工程の組合せを含む場合、工程の各組合せ又は副組合せは、本明細書に別段の断りがない限り、本開示の範囲内に包含される。
本明細書に引用される各刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、本開示と矛盾しない範囲で、その全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される刊行物は、本発明の出願日より前の開示についてのみ提供される。本明細書のいずれにおいても、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利を与えられていないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、提供された公表日は実際の公表日と異なる場合があり、これらは独立して確認される必要がある。
本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示の目的のみであり、それに照らして種々の修正又は変更が当業者に示唆され、本出願の主旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることが理解されよう。
［実施例１］
１０−１０７４広域中和抗体のバリアントの同定及び性質決定−ラウンド１
表９に示すような、ＭＳ−２０３、ＭＳ−２０４、ＭＳ−２０５、ＭＳ−２０６、ＭＳ−２０７、ＭＳ−２０８、ＭＳ−２０９、ＭＳ−２１０、ＭＳ−２１１、ＭＳ−２１２、ＭＳ−２１３、ＭＳ−２１４、ＭＳ−２１５、ＭＳ−２１６、ＭＳ−２１７、ＭＳ−２１８、ＭＳ−２１９、ＭＳ−２２０、及びＭＳ−２２４を含む第１ラウンドのバリアントを、ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現を用いて作製し、プロテインＡクロマトグラフィによって精製した。バリアントを分析するために使用した性質決定法を、サイズ排除クロマトグラフィ（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＳＥＣ）、示差走査蛍光光度（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ：ＤＳＦ）、低ｐＨ安定性及び相対溶解度アッセイ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ：ＲＳＡ）を含め、表８に列挙する。抗体をリン酸緩衝生理食塩水中へ緩衝液交換し、分析に使用した。第１ラウンドバリアントの分析に使用したアッセイは、精製後の単量体及び高分子量種を定量するためのＳＥＣと、熱ランピング中のＣＨ２及びＦａｂドメインの安定性を性質決定するためのＤＳＦと、中和能の保持と、を含んだ。
バリアントの単量体含量は、下は６０．８％から上は９６．３％までの範囲であった。未修飾１０−１０７４−ＬＳ（又はＭＳ−１９４）の単量体含量は９１．５％であり、全てのバリアントの残り材料は高分子量種（ＨＭＷ）であった。１０％未満のＨＭＷであるバリアントを第２ラウンドの組合せバリアントについて考慮した。ＳＥＣ分析に加え、示差走査蛍光光度を使用して、熱力学的安定性が増加した分子を定義した。１０−１０７４−ＬＳ（又はＭＳ−１９４）親分子については、単一のＴｍのみが測定され、ＣＨ２及びＦａｂドメインが同じ温度でアンフォールドされていることが示された。類似の結果がいくつかのバリアントで観察された。しかし、これは、Ｆａｂドメインの安定化に役立つ修飾が抗体のＦｖドメインで行われた結果、熱遷移が増加したため、一部ではＴｍ１と、Ｔｍ２と称される第２の融解遷移との両方が見られた。ＤＳＦ分析の両方の複製について一貫したＴｍ２を示さなかった抗体は、ラウンド２の組合せでは考慮されなかった。
中和活性もまた測定して、ｂｎＡｂバリアントの活性の保持を確認した。ＨＩＶの６つのシュードウイルス（例えば、Ｄｕ１５６．１２、ＷＩＴＯ４１６０．３３、ＣＮＥ１７、ＣＮＥ３０、ＣＡＡＮ５３４２．Ａ２、Ｄｕ１７２．１７）に対する中和の結果を表１０に示す。これらのシュードウイルスは、１０−１０７４が活性であるより広範なウイルスセットの代表である。特定のシュードウイルスのＩＣ５０値又はＩＣ８０値の増加が３倍を超える抗体は不活性であると考えられ、更なるの検討からは除外された。データから明らかなように、１つのバリアントであるＭＳ−２０８だけが中和活性を失い、更なる開発に選ばれなかった。
更なる開発のためのアミノ酸の最終セットは、精製量、高分子量パーセント、ＤＳＦによる熱力学的安定性の増加、及び中和活性の保持の組合せに基づいた。組合せ分析用の残基を選択するための論拠の例を表１１に記載する。更なる開発のために選択された５つのアミノ酸残基は、ＭＳ−２０３（ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ）、ＭＳ−２１６（ＨＶ：Ｖ７９Ｔ）、ＭＳ−２１７（ＨＶ：Ｒ８２Ｖ）、ＭＳ−２１８（ＨＶ：Ｌ８９Ｆ）、及びＭＳ−２１９（ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ）である。
［実施例２］
１０−１０７４広域中和抗体のバリアントの同定及び性質決定−ラウンド２
第２ラウンドの組合せバリアントは、前のセクションで説明した第１ラウンドのバリアントに基づいて設計した。第２の最適化ラウンドにおいて試験された組合せバリアントを表１２に示す。これは、１０の二重組合せ、１０の三重組合せ、５つの四重組合せ、及び５つ全てのアミノ酸修飾からなる１つの五重組合せからなる。これらのバリアントとして、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、ＭＳ−２０２、ＭＳ−２２５、ＭＳ−２２６、ＭＳ−２２７、ＭＳ−２２８、ＭＳ−２２９、ＭＳ−２３０、ＭＳ−２３１、ＭＳ−２３２、ＭＳ−２３３、ＭＳ−２３４、ＭＳ−２３５、ＭＳ−２３６、ＭＳ−２３７、ＭＳ−２３８、ＭＳ−２３９、ＭＳ−２４０、ＭＳ−２４１、ＭＳ−２４２、ＭＳ−２４３、ＭＳ−２４４、及びＭＳ−２４５が挙げられる。ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現を用いて組合せバリアントを作製し、プロテインＡクロマトグラフィによって精製した。抗体は、分析に使用する前に、リン酸緩衝生理食塩水中へ緩衝液交換した。第２ラウンドのバリアントの分析に使用したアッセイは、精製後の単量体及び高分子量種を定量するためのＳＥＣと、熱ランピング中のＣＨ２及びＦａｂドメインの安定性、化学的アンフォールディング、低ｐＨ安定性、溶解性、中和能の保持を性質決定するための示差走査蛍光光度と、を含んだ。
二量体及びオリゴマーの含量についてのＳＥＣ分析と、熱力学的安定性の増加についてのＤＳＦと、からなる初期スクリーニングの結果を表１３に示す。例えば、ＭＳ−２００は、対照バリアントであるＭＳ−１９４より低いＨＭＷを有する。ＭＳ−２００はまた、Ｔｍ１＝７０．１５℃、Ｔｍ２＝７４．６２℃であり、熱安定性が改善されたことを示唆する。二量体よりも早く溶出するＨＭＷ種を用いて、ＨＭＷ種を二量体とオリゴマー種とに分離することによって、データのより洗練された見解が得られる。データは、二量体含量は１０−１０７４−ＬＳ（又はＭＳ−１９４）と比較的変わらなかった一方で、バリアントのオリゴマー含量は、いくつかのバリアントではどちらについても最大２倍まで増加し、その他については最大でおよそ７倍まで減少したことを示した。異なるＴｍ２アンフォールディング温度の存在によって証明されるように、熱力学的安定性が増加したバリアントを同定するためにＤＳＦによってもまたバリアントを性質決定した。
ＤＳＦによるバリアントの区別をより明確にするため、Ｔｍ１とＴｍ２との間の変化、及び熱アンフォールディング曲線下面積を利用したデータの別の分析を考案した。表１４のＤＳＦショルダースコア（Ｓｈｏｕｌｄｅｒ Ｓｃｏｒｅ）と称されるデータに示されているように、バリアントはＴｍ２の値が類似し得るがショルダースコア値が異なり、値が大きいほど安定性が高いことを示す。例えば、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０２のＤＳＦショルダースコア値は、それぞれ、１６．１２、２９．３９、２２．４９であり、対照抗体バリアントであるＭＳ−１９４のショルダースコア値７．６５よりも有意に大きく、バリアントＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０３は対照抗体バリアントＭＳ−１９４よりも安定していることを示唆している。熱力学的安定性はまた、変性曲線の中点で測定したアンフォールディングに対するネイティブな状態の固有抵抗を評価する、化学的アンフォールディングによっても評価した。値が大きいほど、安定性が高くなる。ＤＳＦショルダースコアと共に、抗体の固有熱力学的安定性のより詳細な識別を行った。固有の安定性に加え、低ｐＨインキュベーション中の凝集に対する耐性、中和、及びバリアントの溶解性もまた分析した。親１０−１０７４−ＬＳ（又はＭＳ−１９４）は最大４０％までのＨＭＷ形成で凝集したが、一方でいくつかのバリアントは２〜３％のＨＭＷ形成のみを示した。溶解度はいくつかのバリアントでも増加し、親分子に比べて溶解度は最大４２％増加した。
組合せバリアントのサブセットの中和能もまた、中和における損失が起こらないことを確実にするために調査した。表１５に示すように、減少したバリアントのセットを、ＳＣ４２２６６１．８、ＷＩＴＯ４１６０．３３、ＣＡＡＮ５３４２．Ａ２、ＤＵ１５６．１２、ＤＵ１７２．１７、ＣＮＥ１７、ＣＮＥ３０、ＣＮＥ５３、２３５−４７、Ｘ１１９３＿ｃ１、Ｘ１２５４＿ｃ３、及び３３０１．ｖ１．ｃ２４を含む１２のシュードウイルスの代表的なセットに対して試験した。Ｔｍ２を有するバリアントを試験用に選択した。試験したバリアントの全てが試験したシュードウイルスのセットに対して中和活性を保持した。
詳細な生物物理学的分析のためのバリアントの最終セットは、表１５に定義された抗体の減少したセットの全てが中和活性を保持していたため、生物物理学的特性に基づいて定義された。詳細な分析用のセットからｂｎＡｂが除外された具体的な理由を表１６に示し、最終セットを以下に示す。
Figure 2022500042
最終バリアントセットの詳細な分析
最終的に最適化されたバリアントは、上で定義された最終的なバリアントセットに基づいた。実施した分析は、下流精製（図１〜図２）、加速安定性（図３〜図４）であった。下流精製分析及び加速安定性のために、ＣＨＯ−Ｓ細胞株における一過性発現を用いて分子を作製した。
詳細な分析による結果は、ＭＳ−２０２が最適化バリアントの最も高性能な分子であったことを示す。ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０２はいずれも４０℃で類似の二量体形成速度を有するが、ＭＳ−２０２は、１３週間にわたりサブビジブル粒子形成に対して良好な耐性を示す。
抗体の生産
抗体材料をクローニングし、以前に説明されたとおりに作製した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．、Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．及びＫａｍｅｎ，Ａ．（２００２年）「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第３０巻第２号第Ｅ９頁）。ｂＮＡｂｓ抗体材料をは、２つの懸濁細胞系である、ヒト胎児腎細胞２９３（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ２９３：ＨＥＫ２９３）及びチャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ：ＣＨＯ）の一過性発現から生成した。軽鎖（ＬＣ）又は重鎖（ＨＣ）コード領域のいずれかを含むｐＴＴ５哺乳動物発現ベクタを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ、Ｐｅｒｒｅｔ、及びＫａｍｅｎ（２００２年））を用いて１×１０＾６細胞／ｍＬの生細胞密度（ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ：ＶＣＤ）でＨＥＫ２９３細胞中にコトランスフェクトし、次いで１／５振とうフラスコ容積となるように予め加温した培地で２倍希釈した。発現期間は、３７℃、５％ＣＯ２、湿度８５％、振とう速度１３０ＲＰＭ、軌道１９ｍｍにおいて５〜７日であった。ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）の「ｍａｘ ｔｉｔｅｒ」法は、基本的にＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号Ａ２９１３３、文書パーツ番号Ａ２９５１８）の説明に従った。ＬＣ又はＨＣコード領域のいずれかを含むｐｃＤＮＡ３．４発現ベクタを、ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて６×１０＾６のＶＣＤにてＣＨＯ−Ｓ細胞にコトランスフェクトした。発現期間は、３２℃、５％ＣＯ２、湿度８５％、振とう速度１３０ＲＰＭ、軌道１９ｍｍにおいて１２日であった。全ての清澄化された上清は、３０００ｇで２０分間細胞をペレッティングし、続いて０．２２μｍのろ過を行って生産した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂を用いて、清澄化した上澄から抗体を精製した。アルギニン洗浄液及び酢酸ｐＨ３．５溶出物を伴うリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム緩衝系を利用した。プロテインＡ溶出液をトリスで中和し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４へ緩衝液交換した。
中和アッセイ
ウイルス中和は、ＴＺＭ．ｂｌ細胞におけるルシフェラーゼに基づくアッセイを用いて評価した（「Ｊ Ｖｉｒｏｌ」第７９巻第１６号第１０１０８〜１０１２５頁）。試験したＨＩＶ−１シュードウイルスは大部分がｔｉｅｒ２及びｔｉｅｒ３ウイルスを含んでいた（「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」第８４巻第３号第１４３９〜１４５２頁）。２５μＭのキフネンシン（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した野生型細胞中、又はＨＥＫ ２９３Ｓ ＧｎＴＩ−／−細胞中で、高マンノースのみのシュードウイルス生産した。非線形回帰分析を使用して、半減期阻害が観察された濃度（ＩＣ５０値）を算出した。中和活性はまた、１９８５年と１９８９年との間（「過去のセロコンバータ」、ｎ＝１４）又は２００３年と２００６年との間（「現在のセロコンバータ」、ｎ＝２１）のいずれかの既知のセロコンバージョン日程を有するクレードＢ感染ドナーから単離した一次ＨＩＶ−１バリアント（ｎ＝９５）による感染を用い、以前に性質決定したＰＢＭＣに基づくアッセイでも評価した（「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」第８５巻第１４号第７２３６〜７２４５頁；「Ｎａｔ Ｍｅｄ」第１６巻第９号第９９５〜９９７頁）。各抗体の中和活性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ５．０ｂ）を用いて、０．００１〜５０μｇ／ｍＬの範囲のＩＣ５０値にわたって中和されたウイルスの割合に適合する最良曲線当嵌め下の面積として、算出した。
ＨＰ−ＳＥＣ
高速サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰ−ＳＥＣ）は、流体力学的体積の違いに基づいてタンパク質を分離する。大きな流体力学的タンパク質体積を持つ分子は、小さな体積を持つ分子よりも早く溶出する。未希釈の試料を、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００Ａカラム（３．５μｍ、７．８×３００ｍｍ）にロードし、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８ランニング緩衝液で等透過的に分離し、溶離物を２８０ｎｍのＵＶ吸光度でモニタした。純度は総面積に対する各分離成分の割合を計算することで判定した。
ＤＳＦ
ＤＳＦ法は、タンパク質の疎水性領域の転移温度及び曝露を判定するために、徐々に温度を上げて疎水性プローブの蛍光強度を測定することからなる。転移温度として報告されたこの方法による測定値は、示差走査熱量測定（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：ＤＳＣ）から得られたデータとよく相関している。ＤＳＦは、タンパク質の相対的な熱力学的安定性を推定するために使用されるハイスループット技術であり、結果をランク付けすることで、より好ましい安定性特性を持つ候補を選択するツールとして使用することができる。ＤＳＦによる熱遷移温度を以前説明された方法に従って測定した（Ｆｅｎｇ Ｈら、「Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ」（２０１０年）第９９巻第４号第１７０７〜１７２０頁）。最終タンパク質濃度０．１５ｍｇ／ｍＬ及び最終Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ濃度３倍で、ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．１）中において分析を行った。タンパク質とＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅとを９６ウェルＰＣＲプレート中で１：１の容積比で混合し、熱シフト分析ソフトウェアを備えたＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０装置を用いて分析した。２０〜９５℃から４．４℃／病のランプ速度で試料を加熱し、Ｅｘ＝４６５ｎｍ、Ｅｍ＝５８０ｎｍで１０回／℃で取得して熱曲線を作成した。遷移温度と及びショルダースコアは融解曲線の一次導関数を用いて判定した。
低ｐＨ安定性
２０ｍＭ ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬでのタンパク質試料のｐＨは、２Ｍ酢酸を用いておよそｐＨ３．３まで低下した。３０分間のインキュベーション後、試料を２Ｍトリス塩基を用いておよそｐＨ５に中和した。試料はＳＥ−ＨＰＬＣ法を用いて高分子量種について二重に測定した。対照として、タンパク質試料に２Ｍ酢酸及び２Ｍトリス塩基と同量のＰＢＳを加え、高分子量種を測定した。
相対溶解度
溶解性は以前に説明した方法に従って評価した（Ｖｉｓｈａｌ Ｍ．Ｔｏｐｒａｎｉ、Ｓａｎｇｅｅｔａ Ｂ．Ｊｏｓｈｉ、Ｌｉｓａ Ａ．Ｋｕｅｌｔｚｏ、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｍｉｄｄａｕｇｈ、Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｖｏｌｋｉｎ）。モノクローナル抗体の設計及び製剤開発のための相対的溶解度スクリーニングツールとしての、マイクロポリエチレングリコール沈殿アッセイ（「Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ」（２０１６年）第１０５巻第８号第２３１９〜２３２７頁）。分析は、ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．１）及び最終ＰＥＧ１０，０００濃度７．９％で行った。１ｍｇ／ｍＬのタンパク質を１：４の比でＰＥＧ溶液に希釈し、９６ウェルの０．２２μｍフィルタプレートで室温にて一晩インキュベートした。ＰＥＧインキュベーション後、試料を遠心分離でフィルタに通し、残った可溶性タンパク質をプロテインＡ力価アッセイにより測定する。
化学的アンフォールディング
０〜６Ｍ ＧＮＤの範囲であるＰＢＳ中の塩酸グアニジン（ＧＮＤ）濃度３２種類を、リキッド・ハンドリング・ロボットを用いて調製した。その後、２０ｍＭのＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料を、最終的なタンパク質濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬを達成するよう各ＧＮＤ濃度に移した。２４時間インキュベーションした後、試料をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダで測定した（励起：２８０ｎｍ、発光：３００〜４５０ｎｍ）。測定された３７３ｎｍの蛍光強度は、散乱及び迷光を補正するために、３００〜３２０ｎｍの間で測定された合計強度（散乱によるシグナルの代用として使用）を少量差し引いて補正し、次いで３２０〜４４０ｎｍの間で測定された合計強度と比例させ、合計強度の変動を補正した。その後、各補正後強度をＧＮＤ濃度に対してグラフ化することで、化学的アンフォールディング曲線を作成した。曲線の変曲点を計算し、この曲線から各タンパク質試料を報告した。試料は３重に作成した。
サブビジブル粒子分析
サブビジブル粒子は、８０μｍのフローセル及び１０倍の拡大レンズを備え、かつＶｉｓｕａｌ Ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔソフトウェアで制御された、Ｆｌｏｗｃａｍ ８１００ベンチトップマイクロフロー撮像システムを用いて測定した。試料を室温に平衡させ、軽く振り混ぜて完全に混合した。１００μＬ／試料の単一読取りを行い、２μｍ以上の総粒子濃度を記録した。
［実施例３］
ウイルス不活性化及び精製工程における１０−１０７４バリアントのオリゴマー種及びＨＭＷの形成に関する性質決定
図１は、ウイルス中和の前後における高速サイズ排除クロマトグラフィ（「ＨＰ−ＳＥＣ」）による抗ＨＩＶ抗体１０−１０７４バリアントＭＳ−１９４（図１Ａ）及びＭＳ−２０３（図１Ｂ）の性質決定を示す。ウイルス不活化中に形成されたオリゴマー種に対応するＨＰ−ＳＥＣプロファイルのピークは、矢印で示す。図２は、１０−１０７４個の抗体バリアントであるＭＳ−１９４、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０３について、精製工程の各々に続く高分子量（「ＨＭＷ」）及びオリゴマー種のレベルによって表される凝集度の定量を示す。
分子ＭＳ−１９４、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０３は、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）の「ｍａｘ ｔｉｔｅｒ」法を用いて、基本的にＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号Ａ２９１３３、文書パーツ番号Ａ２９５１８）の説明に従って作成した。軽鎖又は重鎖コード領域のいずれかを含むｐｃＤＮＡ３．４発現ベクタを、ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて６×１０＾６のＶＣＤにてＣＨＯ−Ｓ細胞にコトランスフェクトした。発現期間は、３２℃、５％ＣＯ２、湿度８５％、振とう速度１３０ＲＰＭ、軌道１９ｍｍにおいて１２日であった。全ての清澄化された上清は、３０００ｇで２０分間細胞をペレッティングし、続いて０．２２μｍのろ過を行って生産した。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂を用いて、清澄化した上澄から抗体を精製した。トリス及び塩化ナトリウムの緩衝液で平衡化した。カラムのロード後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むトリス緩衝液でカラムを洗浄した。結合したｍＡｂは、ｐＨ３．６の０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶出し、中和した。ウイルス不活性化中の各分子の安定性は、溶出物をｐＨ３．５に滴定し、次いで１時間インキュベートし、その後トリス緩衝液で中和することにより確認した。プロテインＡの残りの溶出物もまた、溶出後すぐにトリス緩衝系で中和した。フラクトゲルＳＯ３ −陽イオン交換樹脂（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に中和溶出物をロードし、塩化ナトリウム勾配で溶出することにより、更なる精製を達成した。ｍＡｂを含有するピークを収集し、２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、緩衝液を１０ｍＭ酢酸塩、９％スクロース、ｐＨ５．２に交換した。
高分子量パーセント及びオリゴマーは、前述のＨＰ−ＳＥＣ分析を用いて各試料について判定した。図１Ａ及び図１Ｂに示され、図２において定量化したように、ＭＳ−１９４抗体は低ｐＨウイルス不活性化中にオリゴマーの有意な増加を示した一方で、分子ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０３は、ウイルス不活性化プロセス中にＨＭＷ又はオリゴマー含量の増加を示さなかった。
［実施例４］
１０−１０７４バリアントの安定性の性質決定
図３は、１０−１０７４抗体バリアントであるＭＳ−１９４、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０３について、４０℃で最大１３週間のインキュベーション中におけるＨＭＷレベルを示す。図は、４０℃で最大１３週間までのインキュベーションの間における、二量体形成の同様の速度を示す。図４は、１０−１０７４抗体バリアントであるＭＳ−１９４、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１、及びＭＳ−２０３について、６週間及び１３週間におけるサブビジブル粒子形成のレベルを示す。図は、抗体ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１及びＭＳ−２０３が、ＭＳ−１９４よりもはるかに小さい程度まで粒子化されたことを示す。６週間後、ＭＳ−１９４は、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１及びＭＳ−２０３より６倍多い粒子を示したが、１３週間後にはＭＳ−２００及びＭＳ−２０３はＭＳ−１９４よりおよそ２倍少なく、ＭＳ−２０３は４倍少ない粒子形成を示した。
陽イオン交換クロマトグラフィで精製したモノクローナル抗体ＭＳ−１９４、ＭＳ−２００、ＭＳ−２０１及びＭＳ−２０３、並びに前述のように交換した緩衝液を、２０ｍＭ酢酸塩、９％スクロースに緩衝液交換し、最終ｐＨ５．２で１００ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。各試料の５００μＬアリコートを４ｍＬのＩ型ガラスバイアルに入れ、ゴム栓及びアルミニウムのクリンプシールで密封した。試料を４０℃で最大１３週間インキュベートした。試料を示したた時点で除去し、バイアルを再び密封し、インキュベーター内に戻した。％ＨＭＷは、ＨＰ−ＳＥＣと、上記のようにＦｌｏｗＣａｍ装置を用いて判定したサブビジブル粒子とを用いて測定した。
［実施例５］
抗ＨＩＶ−１抗体との併用療法
抗ＨＩＶ−１抗体はＡＲＴ５の潜在的な代替物を構成するが、単一抗体によるウイルス血症患者の治療もまた、耐性ウイルスバリアントを出現させる（（Ｃａｓｋｅｙ，Ｍ．ら、「Ｎａｔｕｒｅ」第５２２巻第４８７〜４９１頁（２０１５年）；Ｃａｓｋｅｙ，Ｍ．ら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」第２３巻第１８５〜１９１頁（２０１７年）；Ｌｙｎｃｈ，Ｒ．Ｍ．ら、「Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．」第７巻第３１９ｒａ２０６頁（２０１５年））。更に、第一世代の抗ＨＩＶ−１広域中和抗体（ｂＮＡｂ）の併用は、感染に対する測定可能な効果をほとんど示さなかった。本開示は、ＨＩＶ−１エンベロープスパイク上の独立部位を標的とする２つの強力なモノクローナル抗ＨＩＶ−１広域中和抗体である３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の組合せが、分析的治療中断（ＡＴＩ）中に投与された、第１ｂ相臨床試験（ＮＣＴ０２８２５７９７）からの結果を示す（Ｍｅｎｄｏｚａら、「Ｎａｔｕｒｅ．」（２０１８年９月）第５６１巻第７７２４号第４７９〜４８４頁；Ｂａｒ−Ｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」第２４巻第１７０１〜１７０７頁（２０１８年））。参加者は、０、３、及び６週間で各抗体の３０ｍｇ／ｋｇを３回注入した。２つの抗体の注入は一般に忍容性が良好であった。抗体感受性潜在ウイルスリザーバである登録した９人は、１５週〜３０週未満（中央値＝２１週）の抑制を維持した。二重抗体感受性ウイルスを有する４人の個体では、免疫療法は、２．０５ｌｏｇ１０コピー／ｍＬのＨＩＶ−１ウイルス負荷の平均減少をもたらし、最大３回までの注入の初回後から３ヶ月間有意な減少が維持された。加えて、両抗体に耐性を示すウイルスは発生しなかった。抗ＨＩＶ−１モノクローナル抗体３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の併用は、抗体感受性ウイルスリザーバである個体においてＡＲＴの非存在下で長期抑制を維持できると結論された。
試験デザイン
非盲検第１ｂ相試験は抗レトロウイルス療法（ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ：ＡＲＴ）でウイルス学的に抑制されたＨＩＶ−１感染参加者において実施された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ；ＮＣＴ０２８２５７９７；ＥｕｄｒａＣＴ：２０１６−００２８０３−２５）（Ｍｅｎｄｏｚａら、「Ｎａｔｕｒｅ．」（２０１８年９月）第５６１巻第７７２４号第４７９〜４８４頁；Ｂａｒ−Ｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」第２４巻第１７０１〜１７０７頁（２０１８年））。試験参加者は適格基準に従って順次登録した。参加者は、ウイルス性リバウンドが起こらない場合、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４を、各抗体３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、０、３、６週目に静脈内投与された。ＡＲＴは抗体の初回注入から２日後に中止した（２日目）。血漿ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡレベルを毎週モニタし、ウイルス負荷が２００コピー／ｍＬ以上に増加した場合、又はＣＤ４＋Ｔ細胞数が２回の連続した測定で３５０細胞／ｐｌ未満に減少した場合、ＡＲＴを再開した。ウイルスリバウンドの時間は、初回ウイルス負荷を２００コピー／ｍＬ超で判定した。試験参加者を初回注入後３０週間追跡した。安全性データは試験の追跡調査が終了するまで報告される。全ての参加者は試験に参加する前に書面によってインフォームドコンセントを受け、本試験は、優良臨床試験基準（Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：ＧＣＰ）に従って実施した。このプロトコルは、米国の食品医薬品局（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）、ドイツのＰａｕｌ−Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、並びにロックフェラー大学及びケルン大学での治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ：ＩＲＢｓ）によって承認された。
試験参加者
試験参加者は、ロックフェラー大学病院（ニューヨーク、米国）及びケルン大学病院（ケルン、ドイツ）で募集した。適格な参加者は、１８〜６５歳の成人、ＨＩＶ−１感染者、少なくとも２４ヶ月間ＡＲＴを受けており、少なくとも１８ヶ月にわたり血漿中ＨＩＶ−１ＲＮＡレベルが５０コピー／ｍＬ未満（この１８ヶ月間に５０コピー／ｍＬを超えるが５００コピー／ｍＬ未満であるウイルスブリップ（ｂｌｉｐ）が一度認められる）、血漿中ＨＩＶ−１ ＲＮＡレベルがスクリーニング受診時に２０コピー／ｍＬ未満、及び現在のＣＤ４＋Ｔ細胞数が５００細胞／ｐｌ超であった。加えて、参加者は、以下に記載するように、バルクＰＢＭＣウイルス増殖培養によって、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４に対する潜在プロウイルスの感受性について事前にスクリーニングされた。感受性は、増殖ウイルスに対する３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の両方についてＩＣ５０が２ｐｇ／ｍＬ未満と定義された。ＮＮＲＴＩベースのＡＲＴレジメンの参加者は、ＮＮＲＴＩの半減期が長いため、治療中断の４週間前にインテグラーゼ阻害剤ベースのレジメン（ドルテグラビル＋テノホビルジソプロキシルフマル酸塩／エムトリシタビン）に切り替えられた。除外基準は、報告されたＣＤ４＋Ｔ細胞最低値が２００細胞／ｐｌ未満、Ｂ型又はＣ型肝炎の同時感染、任意の種類のモノクローナル抗体の事前投与、臨床的に関連する身体所見、医学的状態又は臨床検査異常、及び妊娠又は授乳を含んだ。
試験手順
３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４は３０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで静脈内投与された（Ｍｅｎｄｏｚａら、「Ｎａｔｕｒｅ．」（２０１８年９月）第５６１巻第７７２４号第４７９〜４８４頁；Ｂａｒ−Ｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」第２４巻第１７０１〜１７０７頁（２０１８年））。３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の適切な貯蔵容量を体重に応じて計算し、滅菌生理食塩水で希釈して、抗体当たりの総容量２５０ｍＬとした。モノクローナル抗体注入は連続的に６０分かけて静脈内投与で行った。試験参加者は最後の抗体注入から１時間後にロックフェラー大学病院又はケルン大学病院で観察された。参加者は、安全性評価のためＡＴＩ期間中に週１回の追跡来院のために戻ってきた。これには，身体検査、及び血液学的検査、化学的検査、尿検査、及び妊娠検査（女性の場合）などの臨床検査パラメータの測定が含まれた。血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡレベルをＡＴＩ期間中は毎週モニタし、ＣＤ４＋Ｔ細胞数を１〜２週間毎に測定した。ＡＲＴが再開された後、参加者はウイルス再抑制が達成されるまで最大２週間毎、その後は８週間毎に追跡調査のため戻った。試験責任医師らは、有害事象をＤＡＩＤＳ ＡＥ Ｇｒａｄｉｎｇ Ｔａｂｌｅ（バージョン２．０、２０１４年１１月）に従って評価及びグレーディングし、因果関係を判定した。白血球アフェレーシスをロックフェラー大学病院又はケルン大学病院で第−２週及び第１２週に実施した。血液試料は、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４注入の前及び後に複数回採取した。試料を回収後４時間以内に処理し、血清及び血漿試料を−８０℃で貯蔵した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣの絶対数を自動細胞計数器（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ ＸＲ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）又は手動で判定し、細胞をウシ胎児血清＋１０％ ＤＭＳＯ中で凍結保存した。
血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡレベル
血漿中のＨＩＶ−１ＲＮＡレベルは、スクリーニング時、−２週目、０日目（注入前）、ＡＴＩ中は毎週、及びウイルスリバウンド発生後は２週毎〜８週毎に測定した。ＲｏｃｈｅのＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ＨＩＶ−１ Ａｓｓａｙ（バージョン２．０）又はＲｏｃｈｅのＣＯＢＡＳ ＨＩＶ−１定量核酸試験（ＣＯＢＡＳ６８００）を用いてＨＩＶ−１ ＲＮＡレベルを測定し、２×１０１〜１×１０７コピー／ｍＬの範囲でＨＩＶ−１ ＲＮＡを定量した。これらのアッセイはＬａｂＣｏｒｐ又はケルン大学病院で実施した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞
ＣＤ４＋Ｔ細胞数は、ＬａｂＣｏｒｐ又はケルン大学病院で、スクリーニング時、０週目（注入前）、２週目、３週目、５週目、６週目、８週目、１０週目、及びその後週１回実施した臨床フローサイトメトリ分析によって測定したが、参加者はＡＲＴを中止したままであった。
ベースライン中和抗体活性の判定
抗体注入前に得られた精製ＩｇＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、前述のように１２のＨＩＶ−１シュードウイルスのパネルに対して試験した（Ｓｃｈｏｏｆｓ Ｔら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第３５２巻第９９７〜１００１頁（２０１６年））。
３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４血清レベルの測定
血液試料を、各３ＢＮＣ１１７注入の前、終了時、及び各１０−１０７４注入の終了時に、０、３、及び６週目に、並びにＡＴＩ期間中の最大３０週目まで毎週、収集した。３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の血清レベルは、ＴＺＭ−ｂｌアッセイ及びＥＬＩＳＡによって、各抗体注入の前後、及び追跡期間中およそ３週間毎、並びにウイルスリバウンド時に得られた試料から判定された。
３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の血清中濃度を、検証されたサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。高結合性ポリスチレンプレートを、３ＢＮＣ１１７を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体（抗ＩＤ１Ｆ１−２Ｅ３ｍＡｂ）４μｇ／ｍＬ、又は１０−１０７４を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体（抗ＩＤ３Ａ１−４Ｅ１１ｍＡｂ）２μｇ／ｍＬでコーティングし、２〜８℃で一晩インキュベートした。洗浄後、プレートをＰＢＳ中の５％Ｍｉｌｋ Ｂｌｏｔｔｏ（ｗ／ｖ）、５％ＮＧＳ（ｖ／ｖ）、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）でブロックした。血清試料、ＱＣｓ、及び基準物質を添加し（ＰＢＳ中の５％Ｍｉｌｋ Ｂｌｏｔｔｏ（ｗ／ｖ）、５％ＮＧＳ（ｖ／ｖ）、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）において１：５０の最小希釈）、室温でインキュベートした。３ＢＮＣ１１７又は１０−１０７４は、３ＢＮＣ１１７についてはワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）結合マウス抗ヒトＩｇＧカッパ鎖特異的抗体（Ａｂｃａｍ）、又は１０−１０７４についてはＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、及びＨＲＰ基質テトラメチルベンジジンを用いて検出した。次いで、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４濃度を、５−ＰＬカーブ当嵌めアルゴリズム（Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ、バージョン５．４．５）を用いて、同じプレート上における３ＢＮＣ１１７又は１０−１０７４実施の標準曲線から計算した。臨床試験で使用した３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の製剤ロットから標準曲線及び陽性対照を作成した。捕捉抗イディオタイプｍＡｂを安定ハイブリドーマ細胞株（Ｄｕｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を用いて生産した。３ＢＮＣ１１７のＥＬＩＳＡの定量下限は０．７８μｇ／ｍＬであり、１０−１０７４のＥＬＩＳＡの定量下限は０．４１μｇ／ｍＬである。３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４のＥＬＩＳＡについて、検出下限はＨＩＶ−１セロポジティブ血清中で、それぞれ、０．５１μｇ／ｍＬ及び０．１４μｇ／ｍＬであると判定された。検出可能（すなわち、ｍＡｂ陽性）であったが定量下限未満であった値については、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４のＥＬＩＳＡの値は、それぞれ０．７８μｇ／ｍＬ未満及び０．４１μｇ／ｍＬ未満と報告されている。０日目のベースライン試料が、それぞれのアッセイによって測定可能なレベルの抗体を有していた場合、バックグラウンド測定された抗体レベルは、その後の結果から差し引かれた。その上、バックグラウンドの３倍以内であると測定された抗体レベルを有する試料は、ＰＫパラメータの分析から除外された。
活性な３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の血清濃度も、前述のように、ＴＺＭ−ｂｌ細胞における有効なルシフェラーゼベースの中和アッセイを用いて測定した（Ｓａｒｚｏｔｔｉ−Ｋｅｌｓｏｅ Ｍら、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４０９巻第１３１〜１４６頁（２０１４年））。簡単に述べれば、血清試料は、ＨＩＶ−１ ＥｎｖシュードウイルスＱ７６９．ｄ２２及びＸ２０８８＿ｃ９に対する一連の５倍滴定シリーズによる１：２０一次希釈を用いて試験した。これらは、それぞれ、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４による中和に非常に感受性であり、投与された他方の抗体に対して完全に耐性である。１０−１０７４の注入後の場合において、Ｘ２０８８＿ｃ９に対する血清ＩＤ５０力価が１００，０００超であったならば、血清試料をより感受性の低い菌株であるＤｕ４２２に対しても試験した。標準曲線を作成するため、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の臨床用医薬品は、一連の５倍滴定で１０μｇ／ｍＬの一次濃度を用いる全てのアッセイセットアップに含まれた。各試料の３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の血清濃度を以下のように計算した：血清ＩＤ５０力価（希釈）×３ＢＮＣ１１７ＩＣ５０又は１０−１０７４ ＩＣ５０力価（μｇ／ｍＬ）＝３ＢＮＣ１１７又は１０−１０７４の血清濃度（μｇ／ｍＬ）。Ｅｎｖシュードウイルスは、血清試料（ＳＧ３ΔＥｎｖ／Ｋ１０１Ｐ．Ｑ１４８Ｈ．Ｙ１８１Ｃ）中に存在する場合、抗レトロウイルス剤のバックグラウンド阻害活性を低下させるＡＲＴ耐性主鎖ベクタを用いて作製した。マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ：ＭｕＬＶ）のエンベロープタンパク質でシュードタイプ化したウイルスを陰性対照として利用した。抗体濃度は、ＭｕＬＶに対する非特異的活性が検出された場合、血清ＩＤ８０力価及びモノクローナル抗体ＩＣ８０を用いて計算した（ＩＤ５０＞２０；９２４６、第３０週；９２４８、ベースライン、０日目、１８週目）。全てのアッセイはＧＣＬＰ基準を満たす実験室で実施した。
バルクＰＢＭＣ培養の事前スクリーニング
３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４に対するＨＩＶ−１ウイルス株の感受性を試験するために、単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＭＯＬＴ−４／ＣＣＲ−５細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ドナーリンパ芽球と共培養することによって、バルクウイルス増殖培養を行った。予備スクリーニングのためのＰＢＭＣは、ロックフェラー大学及びケルン大学のＩＲＢによって承認された別のプロトコルに基づいて、登録の最大７２週間（５４〜５０５日の範囲）前に得られた。以下に記載するように、ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイによって感受性を判定した。ＩＣ５０＜２μｇ／ｍＬの培養上清は感受性でとみなした。
定量的及び定性的なウイルス増殖アッセイ（Ｑ２ＶＯＡ）
定量的及び定性的なウイルス増殖アッセイ（Ｑ２ＶＯＡ）を、前述のように第２週及び第１２週に白血球アフェレーシスから単離したＰＢＭＣを用いて行った（Ｌｏｒｅｎｚｉ ＪＣら、「ＰＮＡＳ」第１１３巻第Ｅ７９０８〜Ｅ７９１６頁（２０１６年））。簡単に述べれば、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で活性化し、２４ウェルプレート中で健康なドナーからの１×１０６照射ＰＢＭＣと共培養した。合計６×１０７〜６．２×１０８個の細胞を、２つの時点の各々で各個体についてアッセイした。２４時間後、ＰＨＡを除去し、０．１×１０６個のＭＯＬＴ−４／ＣＣＲ５細胞を各ウェルに添加した。培養は２週間維持し、培養開始から７日後、及びその後は１日おきに、ＭＯＬＴ−４／ＣＣＲ５細胞を半分に分割した。ＥＬＩＳＡによるｐ２４の測定により陽性ウェルを検出した。潜在感染細胞の頻度はＳｉｌｉｃｉａｎｏ Ｌａｂが開発した１００万個当たりの感染単位（ＩＵＰＭ）のアルゴリズムにより算出した（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｌｉｃｉａｎｏｌａｂ．ｊｏｈｎｓｈｏｐｋｉｎｓ．ｅｄｕ）。
リバウンド増殖培養
リバウンド時点からＰＢＭＣより単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｑ２ＶＯＡについて記載されているとおり正確に限界希釈で培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により、０．５×１０６ビーズ／１０６ＣＤ４＋Ｔ細胞及び２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の濃度で活性化した。リバウンド増殖は、最高ウイルス負荷試料からのＰＢＭＣＳを用いて実施した（通常、反復測定≧２００コピー／ｍＬ）。潜在的に再活性化されたＰＢＭＣ由来潜在リザーバウイルスとは対照的に、その配列がＳＧＡ ｅｎｖ配列と一致し、したがって血漿中に存在するウイルスと同一であるウイルスを、中和試験のために選択した。
ウイルス感受性試験
ｐ２４陽性バルクＰＢＭＣ培養物、リバウンドＰＢＭＣ増殖培養物、及びＱ２ＶＯＡウェルからの上清について、前述のように、ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイによって３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４に対する感受性を試験した（Ｓａｒｚｏｔｔｉ−Ｋｅｌｓｏｅ Ｍら、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４０９巻第１３１〜１４６頁（２０１４年））。
配列決定
ＨＩＶ−１ ＲＮＡ抽出及び単一ゲノム増幅を前述のように行った（Ｓａｌａｚａｒ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＪＦら、「Ｊ Ｖｉｒｏｌ」第８２巻第３９５２〜３９７０頁（２００８年））。要約すると、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて血漿試料又はＱ２ＶＯＡ由来ウイルス上清からＨＩＶ−１ ＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて第一鎖ｃＤＮＡ合成を行った。血漿由来ＨＩＶ−１ ＲＮＡのｃＤＮＡ合成は、アンチセンスプライマｅｎｖＢ３ｏｕｔ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行い、９４℃で２分間；９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、及び６８℃で４分間を３５サイクル；並びに６８℃で１５分実施した。第２ラウンドＰＣＲを、テンプレートとしての１μｌの第１のＰＣＲ生成物及びＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑを用いて、９４℃で２分間；９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、及び６８℃で４分間を４５サイクル；並びに６８℃で１５分実施した。アンチセンスプライマＲ３Ｂ６Ｒを用いて、Ｑ２ＶＯＡ由来ＨＩＶ−１ ＲＮＡのｃＤＮＡ合成を行った。
試験成績
併用ｂＮａｂ注入は高い耐性を示す。
ＡＴＩ中のＨＩＶ−１抑制の維持に対する３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の併用の効果を評価するために、第１ｂ相臨床試験を実施した（図５Ａ）（Ｍｅｎｄｏｚａら、「Ｎａｔｕｒｅ．」（２０１８年９月）第５６１巻第７７２４号第４７９〜４８４頁）。ＡＲＴを受けているＨＩＶ−１感染者を、ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイを用いて、バルク増殖培養由来ウイルスの３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４感受性について事前にスクリーニングした。以前の結果と一致して、増殖後ウイルスの６４％及び７１％が、それぞれ３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４に感受性であり、４８％が両方に感受性であった（ＩＣ５０≦２μｇ／ｍＬ）。
試験の適格基準としては、少なくとも１８ヶ月にわたり血漿中ＨＩＶ−１ ＲＮＡレベルが５０コピー／ｍＬ未満（１回のブリップが５００コピー／ｍＬ未満は許容される」）であり、少なくとも２４ヶ月間ＡＲＴを継続、及びスクリーニング時に２０コピー／ｍＬ未満、並びにＣＤ４＋Ｔ細胞数が５００細胞／μＬ超であることが挙げられた。登録された参加者は、治療中断の２日前に開始して３週間間隔で、各３０ｍｇ／ｋｇの３ＢＮＣ１１７＋１０−１０７４の３回の注入を受けた（図５Ａ）。レジメンに非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤が含まれていた個体はＡＲＴ中止の４週間前にインテグラーゼ阻害剤ベースのレジメンに切り替えた（図６Ａ）。ウイルス負荷及びＣＤ４＋Ｔ細胞数を１〜２週間毎にモニタした。ＡＲＴを再開し、２００コピー／ｍＬ超のウイルス血症が確認された場合、抗体注入を中止した。ウイルスリバウンドの時間は２００コピー／ｍＬ超の二連続ウイルス負荷の初回として規定した。１５人が登録されたが、うち４人は初回ｂＮＡｂ注入の２週間前又は注入時点で２０コピー／ｍＬ超のウイルス負荷を示し、有効性分析から除外された。
抗体注入は一般に安全かつ忍容性良好であり、重篤な有害事象又は抗体関連有害事象は報告されなかったが、２人の参加者では軽度の疲労が認められた。平均ＣＤ４＋Ｔ細胞数は、初回抗体注入時及びリバウンド時に、それぞれ６８５細胞／μＬ及び５５９細胞／μＬであった（図６Ｂ）。ウイルスのリバウンド後にＡＲＴを再開すると、ウイルス血症が再抑制された。３ＢＮＣ１１７＋１０−１０７４の併用療法は一般的に安全で忍容性が良好であると結論された。
併用ｂＮＡｂはウイルス抑制を維持する。
スクリーニング期間中及び０日目に完全なウイルス抑制のあった１１人（ＨＩＶ−１ ＲＮＡ＜２０コピー／ｍＬ）については、併用抗体療法は５週〜３０より長い週ウイルス抑制の維持と関連していた（図５Ｂ及び５Ｃ）（Ｍｅｎｄｏｚａら、「Ｎａｔｕｒｅ．」（２０１８年９月）第５６１巻第７７２４号第４７９〜４８４頁）。リバウンドまでの時間の中央値は２１週間であったのに対し、非介入ＡＴＩ研究に参加した過去の対照では２．３週間であり、３ＢＮＣ１１７による単剤療法では６〜１０週間であった（図５Ｃ）。全体として、１１人の参加者のうち９人は１５週間以上ウイルス抑制を維持したが、２人は５週及び７週にリバウンドした（図５Ｂ及び図５Ｃ）。
定量的及び定性的なウイルス増殖アッセイ（Ｑ２ＶＯＡ）を使用して、全個体における複製能のある潜在ウイルスリザーバを遡及的に分析した。系統発生分析は、試験参加者が疫学的に異なるクレードＢウイルスに感染していたことを示した。Ｑ２ＶＯＡ分析は、早期にリバウンドした２人の個体である９２４５及び９２５１における注入前潜在性リザーバが、それぞれ、１０−１０７４−又は３ＢＮＣ１１７−耐性ウイルスを持つことを明らかにした（図７）。したがって、これらの２人は、２つのｂＮＡｂのうちの１つに対するリザーバに既存の耐性があったため、効果的な抗体単剤療法に供された。この考えと一致して、これらの２人の参加者におけるリバウンドの遅延は、抗体単剤療法で予想される範囲内であった（図５Ｃ）。加えて、不完全なウイルス抑制のために分析から除外された４人の個体は全て、抗体の一方又は両方によって完全に中和されなかった既存の耐性又はウイルスを示し、これらの個体は、１２週目より前にリバウンドした。
早期リバウンド個体に発生するウイルスを調べるために、リバウンド血漿の単一ゲノム分析（ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＳＧＡ）を行った。血漿ＳＧＡから構築したシュードウイルスをＴＺＭ−ｂ１アッセイでｂＮＡｂ感受性について試験した。１０−１０７４標的部位（Ｎ３３２Ｔ＋Ｓ３３４Ｎ、図７Ａ）における耐性に関連する既存の配列に加えて、９２４５のリバウンドウイルスはまた、伸長Ｖ５ループ、及び３ＢＮＣ１１７結合を妨害する可能性のあるＮ結合グリコシル化部位も有していた。逆に、３ＢＮＣ１１７に関する耐性と関連する遺伝的特徴は９２５１の注入前リザーバ中に見出され、リバウンドウイルスの１０−１０７４標的部位における突然変異を伴っていた（Ｓ３３４Ｎ、図７Ａ）。両方の個体について、両抗体に対するリバウンドウイルスの耐性は、ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイによって確認された（図７Ｂ及び図７Ｃ）。このように、スクリーニングに用いたバルク増殖培養では、試験した１１人のうち２人のリザーバで既存の耐性を検出できなかった。この結果はバルク培養が急速に増殖する限られた数のウイルス種で著しく、潜在的なリザーバの多様性を代表し得ないことを考えると、驚くべきことではない。
同様に、抗体注入に反応しなかった参加者９１Ｃ３３は、両方の抗体に耐性のある既存の循環ウイルスを有していた（Ｂａｒ−Ｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」第２４巻第１７０１〜１７０７頁（２０１８年））。これらのウイルスは３ＢＮＣ１１７の接触部位（Ｎ２８０Ｓ及びＡ２８１Ｈ）及び１０−１０７４の接触部位（Ｎ３３２Ｔ及びＳ３３４Ｎ）に変異を有していた。２人（９１Ｃ３５及び９３４１）は抗体療法に反応し、ウイルス血症は−１．５８及び−１．３２ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ減少したが、ＨＩＶ−１ ＲＮＡレベルはそれぞれ３及び４週以内にベースラインに戻った。９１Ｃ３５は３ＢＮＣ１１７に対する感受性が低下した注入前循環ウイルスを有することが発見され、３ＢＮＣ１１７２０からのウイルス逃避と関係したＣＤ４接触残基変異（Ａ２８１Ｔ）を持っていた。９３４１のバルクＣＤ４＋Ｔ細胞増殖培養物由来の注入前ウイルスは、登録された他の全てのウイルス血症患者の幾何平均ＩＣ８０より１．３ｌｏｇ１０高い、１０−１０７４のＩＣ８０を示した。これらのいずれの場合においても、リバウンドウイルスは両方の抗体に対して耐性であり、変異を有するため、結果として１０−１０７４の結合に重要な３３２位の潜在的なＮ−結合グリコシル化部位が失われた。加えて、９１Ｃ３５及び９３４１からのリバウンドウイルスは、それぞれＧ４７１Ｅ及びＮ２７６Ｄ変異を含んだ。これは３ＢＮＣ１１７に対する耐性増加と関係する。これらの突然変異は、上述の注入前循環ウイルス中にも、これら２人の参加者から分析された追加の１１３の注入前ｅｎｖ配列中にも見当たらなかった。このように、９１Ｃ３５及び９３４１は、２つの抗体のうちの一方に対する感受性が低下したウイルスに感染しており、ウイルス血症の低下の程度と、ベースラインのウイルス血症に戻るのに必要な時間との両方において、抗体単剤療法を受けた個体と類似していた。初回スクリーニングに用いたバルク増殖培養は、試験した７人中３人の抗体の一方又は両方に対する部分的又は完全な既存の耐性を検出できなかった。
残りの４人は、循環血中に検出可能な既存の耐性ウイルスを示さず、初回の抗体注入後９４日目までウイルス血症の有意な抑制を経験し、ウイルス負荷の平均最大低下は−２．０５ｌｏｇ１０コピー／ｍＬであった（Ｂａｒ−Ｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」第２４巻第１７０１〜１７０７頁（２０１８年））。初回ウイルス負荷（９７，８００コピー／ｍＬ；患者９３４３）が最も高かったこの群の個体は、８週間後に最初にリバウンドした。初回ウイルス負荷が最も低い９１Ｃ２２及び９３４２（７５０コピー／ｍＬ及び２，５５０コピー／ｍＬ）の２人は、それぞれ、１２及び１６週間にわたり検出限界近く又はそれ以下の抑制を示した。最終的に、参加者９１Ｃ３４のウイルス血症は１２週間減少したが、８１０コピー／ｍＬを下回ることはなかった。持続性ウイルス血症にもかかわらず、ｂＮＡｂ血清中レベルが１０μｇ／ｍＬ超である限り、個の固体において両抗体に対する耐性は生じなかった。当初感受性であった４人のうち３人では、リバウンドウイルス血症は１０−１０７４に耐性のあるウイルスの出現と関連していたが、これらの個体は３ＢＮＣ１１７に感受性のままであった。これは３ＢＮＣ１１７の比較的短い半減期と一致しており、参加者は観察期間の終わりに１０−１０７４の単剤療法に効果的に曝露されたことを意味する。１０−１０７４に対する抵抗性の増加にしたがい、リバウンドウイルスは１０−１０７４接触部位に変異を持っていた。対照的に、３ＢＮＣ１１７接触部位ではデノボ変異の蓄積はなかった。初回ウイルス負荷が最も低い参加者である９１Ｃ２２は、両方の抗体が検出限界未満であった後にのみベースラインのウイルス血症に戻り、リバウンドウイルスは両方の抗体に対して感受性を維持した。全体として、これらの参加者のうちの３人で観察された残存ウイルス血症及び循環ウイルス間の頻繁な組換え事象にもかかわらず、初期に２つの抗体に感受性であった４人の参加者の誰も１年（５６週間）以上の累積観察期間にわたって３ＢＮＣ１１７に対するデノボ耐性を発症しなかった。
注入前潜在リザーバに検出可能な耐性ウイルスを有さず、試験期間中にリバウンドした７人のリバウンドまでの時間の中央値もまた２１週間であり、３ＢＮＣ１１７による単剤療法の６〜１０週間とは異なっていた（図５Ｃ）（Ｍｅｎｄｏｚａら、「Ｎａｔｕｒｅ．」（２０１８年９月）第５６１巻第７７２４号第４７９〜４８４頁）。これらの参加者では、ウイルス抑制はＡＲＴ中止後１５〜２６週間維持された。残り２人の参加者（９２５４及び９２５５）はリバウンドを経験することなく３０週で追跡調査を完了した。特に、両方の投与抗体濃度が１０μｇ／ｍＬ超の場合、ウイルスのリバウンドは起こらなかった。試験追跡調査中にリバウンドした感受性のある個体におけるリバウンド時の平均３ＢＮＣ１１７血清濃度（ＴＺＭ−ｂｌアッセイにより判定）は、１．９μｇ／ｍＬであった（図５Ｂ）。対照的に、リバウンド時の１０−１０７４の平均血清濃度は、１４．８μｇ／ｍＬであった（図５Ｂ）。リバウンド時の抗体濃度の差は、１０−１０７４の長い半減期と一致し、結果として１０−１０７４の単剤療法期間が生じた（図５Ｂ）。最後に、これらの９人は、ｂＮＡｂ注入前に、ウイルスの診断パネルに対する既存の中和抗体をほとんど又は全く示さなかった。
リバウンドウイルス及び潜在ウイルス
リバウンドウイルスと循環潜在性リザーバとの間の関係を調べるために、血漿リバウンドウイルスから得たｅｎｖ配列を、注入前及び１２週試料の両方からＱ２ＶＯＡによって得た配列とＳＧＡによって比較した。加えて、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４に対するリバウンド増殖ウイルス及び／又はシュードウイルスの感受性を、ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイにより測定した（図７Ｂ及び図７Ｃ）。血漿ＳＧＡにより得られた合計１５４のウイルスｅｎｖ配列を分析し、Ｑ２ＶＯＡにより潜在リザーバから得られた４０８の配列と比較した。リバウンドウイルス及びリザーバウイルスは各個体で一緒にクラスタを形成していたが、調査した個体のいずれにおいても２つのコンパートメント間に同一の配列は認められなかった（図８及び図９Ａ）。この差は、インビトロ及びインビボでのＨＩＶ−１再活性化について異なる必要性、リザーバウイルスのコンパートメント化、治験過程中のＨＩＶ−１突然変異、及び／又は一部の個体におけるウイルス組換えによって説明することができた。ｂＮＡｂ療法が組換え事象の選択に影響を及ぼすかどうかはまだ明らかにされていない。
３ＢＮＣ１１７単剤療法と同様に、大部分のリバウンドウイルスは、１〜２の再発ウイルスの拡大と一致する低多様性系統内にクラスタ化した（図８）。対照的に、抗体療法を行わないＡＴＩでは、リバウンドウイルスは常にポリクローナルである。このように、抗体はインビボで潜在ウイルスの増殖を制限する。
平均３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４濃度がそれぞれ１．９μｇ／ｍＬ及び１４．８μｇ／ｍＬであった場合、リバウンドした７人のうち６人の発生ウイルスは、１０−１０７４標的部位に耐性関連突然変異を有していた（図５Ｂ及び図８Ａ）。配列データと一致して、これらのリバウンドウイルスは、ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイによって、一般的に１０−１０７４に対して耐性であったが、３ＢＮＣ１１７に対して感受性のままであった（図７Ｂ及び図７Ｃ）。これらの発生ウイルスにおける３ＢＮＣ１１７に対する感受性のレベルは、各個体におけるリザーバウイルスで見出されたものと同様であった（図７Ｂ）。個体９２４４の一個体は、ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイにおいて両方の抗体に対して感受性のままであったリバウンドウイルスを示した。この個体の血清中の３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４濃度が、それぞれ検出不能及び１１．６μｇ／ｍＬであった場合、リバウンドが生じた（図５Ｂ）。血漿リバウンドウイルスの感受性は、ウイルス増殖培養で得られた潜在注入前及び１２週目のウイルスの感受性と同様であった（図７Ｂ及び図７Ｃ）。したがって、この個体は、両抗体の抗体への長期曝露にもかかわらず、いずれの抗体に対しても耐性を発現しなかった。結論として、両抗体に感受性のあるウイルスを含む注入前リザーバを有する９人の個体は、観察期間中に二重耐性を発症しなかった。
潜在リザーバ
観察期間中に循環リザーバに変化があったかどうかを判定するために、少なくとも１２週間抑制されたままであった９個体のうち８個体について、ＡＴＩの開始時及び開始後１２週間に実施したＱ２ＶＯＡアッセイの結果を比較した（図９）。以前の報告と同様に、Ｑ２ＶＯＡによって得られた全ウイルスの６３％が拡大クローンに属していた。増殖培養で出現したウイルスのｅｎｖ配列を比較した結果、６０％の配列を両時点で見出すことができた。しかし、この時点の間に出現した又は消失したクローンの例は数多くあり、これらの変化のいくつかは重要であった。１００万個当たりの感染単位（ＩＵＰＭ、ｈｔｔｐ：／／ｓｉｌｉｃｉａｎｏｌａｂ．ｊｏｈｎｓｈｏｐｋｉｎｓ．ｅｄｕ／）を決定するために、６．０×１０７〜６．２×１０８個のＣＤ４＋Ｔ細胞を各時点についてＱ２ＶＯＡによってアッセイした（図９Ｂ）。２時点間の差はいずれの個体でも６．５倍を超えることはなく２時点間に統計的な差は認められなかった（Ｐ＝０．０７８）。更に、リバウンドまでの時間はＩＵＰＭと直接相関しなかった。免疫療法を受けている個体におけるリザーバの半減期を計算するためには、更なる時点が必要であろう。
考察
第一世代抗ＨＩＶ−１ ｂＮＡｂは、動物モデル及びヒトにおけるウイルス血症の抑制に一般的に無効であり、このアプローチを追求すべきでないという結論に至った。３ＢＮＣ１１７又はＶＲＣ０１を用いたｂＮＡｂ単剤療法はＨＩＶ−１感染ヒトにおけるＡＴＩ中の制御を維持するのに充分ではなかった。対照的に、３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４の組合せは、両方の抗体の濃度が血清中で特定のレベル、例えば１０μｇ／ｍＬを超えたままである場合、感受性のある個体におけるウイルス抑制を維持するのに充分であった。リバウンドは３ＢＮＣ１１７レベルが１０μｇ／ｍＬを効果的に下回ると起こり、１０−１０７４の単剤療法が発生し、ほぼ全ての患者が１０−１０７４の接触部位の突然変異によって速やかに回避された。異なるウイルスに感染した９人が中央値２１週にわたって二重耐性ウイルスを発生させることができなかったという観察は、ウイルス複製がこの抗体の組合せによって厳しく制限されたことを示唆している。
ヒトでの研究では、３ＢＮＣ１１７による単剤療法は、液性免疫の増強及びＨＩＶ−１感染細胞のクリアランスの促進と関連している。更に、ＳＨＩＶＡＤ８感染マカクに早期に投与した場合、併用３ＢＮＣ１１７＋１０−１０７４免疫療法は、動物のほぼ５０％においてウイルス血症の制御に寄与する宿主ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。しかしながら、これらのマカクにおけるウイルス血症の制御に関与するウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は循環で検出されず、ウイルス抑制へのそれらの寄与はＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後にのみ実証された。ほとんどのコントローラマカクでは、完全なウイルス抑制は抗体除去後のリバウンドウイルス血症後にのみ確立された。
本試験の２個体９２５４、９２５５は、ＡＴＩ後３０週間以上抑制されたままであった。どちらも血液中で検出可能なレベルのＡＲＴを有しておらず、エリート対照と最も高頻度に関連するＨＬＡ対立遺伝子Ｂ＊２７及びＢ＊５７を有していなかった（Ｗａｌｋｅｒ ＢＤ及びＹｕ ＸＧ．、「Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ」第１３巻第４８７〜４９８頁（２０１３年））。第１の、９２５４は、ウイルスへの曝露が想定されてから４〜５ヶ月以内にＡＲＴを開始し、初期のウイルス量が８６０，０００コピー／ｍＬであったことを報告している。比較的早期の治療及び治療による２１年間の優れたウイルス学的制御にもかかわらず、この個体の１２週時点でのＩＵＰＭはＱ２ＶＯＡで０．６８であった。第２の個体、９２５５は、抗体レベルが低下し始めたＡＴＩの１５週後に、自然に制御されたいくつかのウイルスブリップを示した。この個体はＡＲＴ開始前に少なくとも７ヶ月間感染しており、初期ウイルス量は８５，８００コピー／ｍＬ、１２週時点でのＩＵＰＭは１．４であった。ＡＲＴを受けている個体のごく一部はＡＲＴ中止後に自然と長期のウイルス学的制御を示し、この数は感染の急性期にＡＲＴ治療を開始すると増加するようである。
循環潜在リザーバのかなりの部分は、感染Ｔ細胞の拡大したクローンからなる。これらのＴ細胞クローンは、ＡＲＴを受けている個体のリザーバへの循環潜在感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の個々のクローンの特異的な寄与が経時的に変動するという点で動的であると思われる。抗体療法によるウイルス抑制を維持する個体は、抗体感受性と関連していないと思われるリザーバクローンにおいて同様の変動を示すようである。免疫療法中にリザーバで観察された見かけの差がリザーバ半減期の変化をもたらすかどうかは入手可能なデータからは判定できず、長期の観察期間にわたって複数の時点で更なる個体におけるリザーバ評価を必要とする。
３ＢＮＣ１１７及び１０−１０７４に感受性のあるウイルスを保有する個体は、最終抗体投与後、ほぼ中央値４ヶ月間にわたり、ＡＴＩ中にウイルス抑制を維持した。マカクでは、抗ＨＩＶ−１抗体の治療効果はその半減期に直接関連しており、これは新生児Ｆｃ受容体とのＦｃドメイン相互作用を増強する突然変異によって延長することができる。この突然変異は、ヒトにおける抗体の半減期を２〜４倍増加させる可能性がある。このデータは、感受性ウイルスを保有している個体において、半減期が延長したｂＮＡｂの組合せを単回投与することで、６〜１２価月間の抑制を維持できることを示唆している。
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前述の実施例及び好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものというよりも、例示するものとみなされるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲に記載された本発明から逸脱することなく、上に記載された特徴の多数の変形及び組合せを利用することができる。このような変形例は本発明の範囲からの逸脱とはみなされず、このような変形例は全て以下の請求項の範囲内に含まれることが意図される。本明細書に引用される全ての参考文献は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (34)

  1. 単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分であって、配列番号３〜１３、２２、２４〜２８、３５〜３９、４３〜４５、及び４７の軽鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一である軽鎖アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、ここで、前記単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分が、ＬｍｄＶ：Ｙ２、ＬｍｄＶ：Ｒ７、ＬｍｄＶ：Ｐ９、ＬｍｄＶ：Ｅ１７、ＬｍｄＶ：Ｈ４６、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３、ＬｍｄＶ：Ｎ８２、ＬｍｄＶ：Ｒ８８、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２からなる群から選択される１つ以上の残基における１つ以上の軽鎖置換を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  2. 単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分であって、配列番号６１〜９４の重鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一である重鎖アミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、ここで、前記単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分が、ＨＶ：Ｄ２９、ＨＶ：Ｓ４７、ＨＶ：Ｎ７５、ＨＶ：Ｖ７９、ＨＶ：Ｒ８２、ＨＶ：Ｌ８９、ＨＶ：Ｔ１０８、及びＨＶ：Ｋ１４１からなる群から選択される１つ以上の残基における１つ以上の重鎖置換を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  3. 配列番号６１〜９４の前記重鎖可変領域からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一である重鎖アミノ酸配列を有する重鎖可変領域を更に含み、ここで、前記単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分が、ＨＶ：Ｄ２９、ＨＶ：Ｓ４７、ＨＶ：Ｎ７５、ＨＶ：Ｖ７９、ＨＶ：Ｒ８２、ＨＶ：Ｌ８９、ＨＶ：Ｔ１０８、及びＨＶ：Ｋ１４１からなる群から選択される１つ以上の残基における１つ以上の重鎖置換を含む、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  4. ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｒ７Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｎ８２Ｇ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０Ｅ、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２Ｇからなる群から選択される前記１つ以上の軽鎖置換、又はそれらの保存的置換を含む、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  5. ＨＶ：Ｄ２９Ｇ、ＨＶ：Ｓ４７Ｐ、ＨＶ：Ｎ７５Ｑ、ＨＶ：Ｖ７９Ｔ、ＨＶ：Ｒ８２Ｖ、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ、及びＨＶ：Ｋ１４１Ｑからなる群から選択される前記１つ以上の重鎖置換、又はそれらの保存的置換を含む、請求項２に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  6. ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｒ７Ｐ、ＬｍｄＶ：Ｐ９Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｅ１７Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｈ４６Ｑ、ＬｍｄＶ：Ｐ８１．１Ｎ、ＬｍｄＶ：Ｉ８１．３Ｓ、ＬｍｄＶ：Ｎ８２Ｇ、ＬｍｄＶ：Ｒ８８Ｔ、ＬｍｄＶ：Ｄ１１０Ｅ、及びＬｍｄＶ：Ａ１４２Ｇからなる群から選択される前記１つ以上の軽鎖置換又はそれらの保存的置換と、ＨＶ：Ｄ２９Ｇ、ＨＶ：Ｓ４７Ｐ、ＨＶ：Ｎ７５Ｑ、ＨＶ：Ｖ７９Ｔ、ＨＶ：Ｒ８２Ｖ、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ、及びＨＶ：Ｋ１４１Ｑからなる群から選択される前記１つ以上の重鎖置換又はそれらの保存的置換と、を含む、請求項３に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  7. 前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号３の前記軽鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ置換又はＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリンの保存的置換を含む、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  8. 前記重鎖アミノ酸配列が、配列番号６３の前記重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＨＶ：Ｖ７９Ｔ置換又はＨＶ：Ｖ７９におけるスレオニンの保存的置換を含む、請求項２に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  9. 前記重鎖アミノ酸配列が、配列番号６４の前記重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＨＶ：Ｒ８２Ｖ置換又はＨＶ：Ｒ８２におけるバリンの保存的置換を含む、請求項２に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  10. 前記重鎖アミノ酸配列が、配列番号６５の前記重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＨＶ：Ｌ８９Ｆ置換又はＨＶ：Ｌ８９におけるフェニルアラニンの保存的置換を含む、請求項２に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  11. 前記重鎖アミノ酸配列が、配列番号６６の前記重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換を含む、請求項２に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  12. 前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号２２の前記軽鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ置換又はＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリンの保存的置換を含み、ここで、前記重鎖アミノ酸配列が、配列番号６９の前記重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、
    ＨＶ：Ｒ８２Ｖ置換又はＨＶ：Ｒ８２におけるバリンの保存的置換と、
    ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換と、
    を含む、請求項３に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  13. 前記重鎖アミノ酸配列が、配列番号７０の前記重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、
    ＨＶ：Ｖ７９Ｔ置換又はＨＶ：Ｖ７９におけるスレオニンの保存的置換と、
    ＨＶ：Ｌ８９Ｆ置換又はＨＶ：Ｌ８９におけるフェニルアラニンの保存的置換と、
    ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換と、
    を含む、請求項３に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  14. 前記軽鎖アミノ酸配列が、配列番号２４の前記軽鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、ＬｍｄＶ：Ｙ２Ｐ置換又はＬｍｄＶ：Ｙ２におけるプロリンの保存的置換を含み、ここで、前記重鎖アミノ酸配列が、配列番号７１の前記重鎖可変領域と少なくとも７５％同一であり、
    ＨＶ：Ｖ７９Ｔ置換又はＨＶ：Ｖ７９におけるスレオニンの保存的置換と、
    ＨＶ：Ｌ８９Ｆ置換又はＨＶ：Ｌ８９におけるフェニルアラニンの保存的置換と、
    ＨＶ：Ｔ１０８Ｒ置換又はＨＶ：Ｔ１０８におけるアルギニンの保存的置換と、
    を含む、請求項３に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  15. 配列番号３を含む、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  16. 配列番号６３、６４、６５、６６、又は７０を含む、請求項２に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  17. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２２の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号６９の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含む、請求項３に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  18. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２４の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号７１の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含む、請求項３に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分。
  19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  20. 第２の治療剤を更に含む、医薬組成物。
  21. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分をコードする、核酸又はコドン最適化核酸。
  22. 請求項２１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸を含む、ベクタ又はベクタ系。
  23. 請求項２１に記載の核酸を含む、細胞。
  24. 組換え抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分を作製する方法であって、以下：
    ａ．請求項２３に記載の細胞を得ることと、
    ｂ．前記ベクタによってコードされるポリペプチドの発現を許容する条件下における培地中で前記細胞を培養すること、及び抗体又はその断片を集成することと、
    ｃ．前記培養細胞又は前記細胞の前記培地から前記抗体又は断片を精製することと、
    を含む、方法。
  25. ＨＩＶ感染症又はＨＩＶ関連疾患を予防又は治療する方法であって、以下の工程：
    ａ．かかる予防又は治療を必要とする患者を同定することと、
    ｂ．請求項１〜１８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分の治療有効量を含む、第１の治療剤を前記患者に投与することと、
    を含む、方法。
  26. 第２の治療剤を投与することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記第２の治療剤が、前記抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分の前記投与の前、同時、又は後に投与される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記第２の治療剤が、抗ＨＩＶ−１広域中和抗体（ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｂＮＡｂ）である、請求項２４又は２５に記載の方法及び請求項２０に記載の医薬組成物。
  29. 前記抗ＨＩＶ−１広域中和抗体が、３ＢＮＣ１１７である、請求項２６に記載の方法。
  30. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の薬学的有効量である少なくとも１つの単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分の薬学的に許容される用量単位を含む、キット。
  31. 薬学的有効量である抗ＨＩＶ剤の薬学的に許容される用量単位を更に含み、ここで、前記２つの薬学的に許容される用量単位は、単一の薬学的に許容される用量単位の形態を任意にとることができる、請求項３０に記載のキット。
  32. 前記抗ＨＩＶ剤が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入阻害剤又は融合阻害剤、及びインテグラーゼ阻害剤からなる群から選択される抗ＨＩＶ剤である、請求項３１に記載のキット。
  33. 前記抗ＨＩＶ剤が、抗ＨＩＶ広域中和抗体である、請求項３１に記載のキット。
  34. 前記抗ＨＩＶ広域中和抗体が、３ＢＮＣ１１７である、請求項３３に記載のキット。
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