JP2022182154A

JP2022182154A - 毛球部毛根鞘細胞の評価方法

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Publication number: JP2022182154A
Application number: JP2021089537A
Authority: JP
Inventors: 章子山田; Akiko Yamada; 雄三吉田; Yuzo Yoshida
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2022-12-08

Abstract

【課題】より簡便に毛球部毛根鞘細胞を評価する方法の提供を目的とする。【解決手段】ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲＬ１、ＣＤ３６、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、Ｇ２Ａ、ｃＭｅｔ、ＰＤＧＦＲ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子の発現レベルを測定し、発現レベルに基づき遊走能を決定することにより、毛球部毛根鞘細胞を評価する。【選択図】図１

Description

本発明は、毛髪再生の細胞治療の技術分野に関する。より具体的に、本発明は、毛髪再生の細胞治療において用いる毛球部毛根鞘細胞を評価する方法に関する。

脱毛症や薄毛の治療として、薬剤の投与が主に行われていたが、継続的な投与を必要とする一方で、対象によっては十分な効果が得られないこともあった。一方、対象の頭皮組織から採取した毛髪になりうる細胞を増殖させて、自家移植により対象の頭皮に戻すことで、より安全性高く、効果的に毛髪を再生することが期待されている。毛髪再生に使用される細胞は、毛乳頭細胞（Dermal Papilla cells: ＤＰ細胞）、毛球部毛根鞘細胞（Dermal Sheath Cup cells：ＤＳＣ細胞）などが用いられている（特許文献１：特開２０１１－１０１６４８号公報）。

毛球部毛根鞘細胞の自家移植による毛髪再生治療の実用化が近づいており、より有効性を高め、安定した毛髪再生を実現することが期待されている。有効性を高めるためには、移植する細胞の品質の管理が重要であり、移植前に品質の高い毛球部毛根鞘細胞を取得することが重要になる。

特開２０１１－１０１６４８号公報

毛球部毛根鞘細胞を含む組成物の品質管理は、組成物中に、ケラチノサイトやメラノサイトといった細胞の混入がないことを確認することにより行われている。また、組成物中に含まれる毛球部毛根鞘細胞の細胞活性及び／又は細胞活性に基づく毛髪再生能力については評価することを目的として、組成物に含まれる毛球部毛根鞘細胞の遊走能を評価する方法が開発されている。細胞を播種し、所定の時間のインキュベート後に遊走した細胞を確認することで、遊走能を評価することができる。しかしながら、移植前の細胞についてかかる実験を行うことは、事業者の負担が大きかった。そこで、本発明者らは、より簡便に毛球部毛根鞘細胞を評価する方法を構築するという課題に思い至った。

本発明者らは、毛球部毛根鞘細胞を含む細胞組成物において遊走能を評価する簡便な手法の開発に取り組み、遊走関連遺伝子に着目して鋭意研究を行った。遊走関連遺伝子の発現と、実際の遊走試験により決定された遊走能とを比較することで、遊走能に相関性の高い遊走関連遺伝子を同定し、本発明に至った。そこで、本発明は、以下に関する：
［１］毛球部毛根鞘細胞において、以下の：
ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲＬ１、ＣＤ３６、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ｃＭｅｔ、ＰＤＧＦＲ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
発現レベルに基づき遊走能を決定する工程
を含む、毛球部毛根鞘細胞の評価方法。
［２］前記遊走能が、発現レベルを所定の閾値と比較することにより決定される、項目１に記載の評価方法。
［３］前記毛球部毛根鞘細胞が、培養後の細胞である、項目１又は２に記載の方法。
［４］前記毛球部毛根鞘細胞が、凍結保存後に融解され、培養された細胞である、項目３に記載の方法。
［５］前記培養が、接着培養である、項目３又は４に記載の方法。
［６］前記遺伝子のうち、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＣＤ３６、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ｃＭｅｔ、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子の発現レベルを測定する、項目３～５のいずれか一項に記載の方法。
［７］前記毛球部毛根鞘細胞が、培養後に凍結保存された細胞である、項目１又は２に記載の方法。
［８］ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲＬ１、ＦＧＦＲ２、ＣＤ３６、及びＰＤＧＦＲ１からなる群から選ばれる、項目７に記載の方法。
［９］項目１～８のいずれか一項に記載の方法により毛球部毛根鞘細胞を評価することを含む、移植適格性を決定する方法。

本発明により、より短い時間及び少ない労力で、毛球部毛根鞘細胞を評価することができる。

図１Ａはマイグレーションアッセイで、膜チャンバーの下面に遊走した細胞の核を蛍光染色して示した写真を示す。図１Ｂはマイグレーションアッセイで、膜チャンバーの下面に遊走した細胞の数を示すグラフである。

本発明は、毛球部毛根鞘細胞の評価方法に関する。

毛球部毛根鞘細胞とは、毛根を取り囲む鞘細胞（毛根鞘細胞：ＤｅｒｍａｌＳｈｅａｔｈｃｅｌｌｓ：ＤＳ細胞）のうち、毛球部を取り囲む鞘細胞に由来する細胞である。毛球部とは、毛包の最深部に存在し、毛根の膨らんだ領域を指し、主に毛乳頭及び毛母細胞により構成される。頭皮試料の毛包部を切開し、毛球部毛根鞘を反転させて毛乳頭を切除し、毛乳頭が切除された毛球部毛根鞘を培養することで、毛球部毛根鞘細胞を採取することができる。毛球部毛根鞘細胞を継代培養することで、移植に必要な細胞数まで増殖させることができ、移植用の細胞組成物とすることができる。移植用の細胞組成物中の毛球部毛根鞘細胞は、細胞表面マーカーを用いて、同定することができる。一例として、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７４、及びＮＧ２からなる群から選ばれる少なくとも１の細胞表面マーカーの発現により特徴づけられる。毛球部毛根鞘細胞の初代培養の際に、メラノサイトやケラチノサイトが混入することもあり、移植用の細胞組成物では、メラノサイトやケラチノサイトが一定の割合以下となるように品質管理されうる。

理論に限定されることを意図するものではないが、毛球部毛根鞘細胞が頭皮に注入されると、毛球部毛根鞘細胞は遊走して毛包周辺に局在し、さらには遊走後に毛乳頭へと分化することで、毛髪再生に寄与すると考えられる。一方で、適切な場所に遊走できなかった毛球部毛根鞘細胞は、自然に排除されてしまうと考えられる。したがって、毛球部毛根鞘細胞の遊走能は、毛球部毛根鞘細胞の品質、すなわち移植した場合の毛球部毛根鞘細胞の毛髪再生能力に寄与する。毛球部毛根鞘細胞の遊走能が高いほど、毛球部毛根鞘細胞の品質が高く、毛髪再生能力が高いと評価することができる。

遊走能とは、細胞が組織中又は培養環境中で遊走する能力を意味する。細胞の遊走能は、走化性（ケモタキシス）、走触性（ハプトタキシス）、創傷治癒、及び細胞浸潤に大別される。このうち、走化性とは、細胞がケモカインなどの走化性因子の濃度勾配によって遊走することをいい、毛球部毛根鞘細胞は、ケモタキシスに基づき遊走していると考えられる。測定する遊走能の種類に応じて、遊走能を測定する方法及びアッセイキットを選択することができる。

本発明の毛球部毛根鞘細胞の評価方法は、より具体的に、毛球部毛根鞘細胞において、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲＬ１、ＣＤ３６、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ｃＭｅｔ、ＰＤＧＦＲ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
発現レベルに基づき遊走能を決定する工程
を含む。

これらの遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子のｍＲＮＡ量を測定することにより測定されてもよく、またこれらの遺伝子から産生されるタンパク質量を測定することにより測定されてもよい。ｍＲＮＡ量の測定方法としては、本技術分野に周知の方法を用いることができるが、リアルタイムＰＣＲ等、ＰＣＲに基づく測定が主に行われうる。タンパク質発現量としては、ウエスタンブロットやフローサイトメトリー等、抗体を用いた免疫学的手法に基づく測定が主に行われうる。

遊走能は、遺伝子の発現レベルを所定の閾値と比較することにより決定することができる。所定の閾値は、各遺伝子毎に予め決定される。一例として、高い遊走能を有する毛球部毛根鞘細胞の遺伝子の発現レベルと、低い遊走能を有する毛球部毛根鞘細胞の遺伝子の発現レベルとの間で、任意に決定することができる。複数の試料を用いることでより適切な閾値を選択することができる。

本発明において、毛球部毛根鞘細胞の遊走能は、マイグレーションアッセイにより、膜チャンバー下面へと移動した細胞数により決定することができる。マイグレーションアッセイは、市販のマイグレーションプレートを用いて定法に従い実施される。マイグレーションアッセイの下部チャンバーには、遊走を誘導しうる物質を含む培地、一例として毛乳頭細胞（ＤＰ）馴化培地を導入して実験することができる。ＤＰ馴化培地とは、予め毛乳頭細胞を培養して得た培養物の上清を指す。毛乳頭細胞を培養する培地としては、毛乳頭細胞の培養に用いられる任意の培地を使用することができ、一例として、無血清のFollicle Dermal Papilla Cell Growth Medium (PromoCell)、AmnioMAX (Thermo Fisher Scientific)、Follicle Dermal Papilla Cell Basal Medium (Takara-bio)などが用いられる。毛乳頭細胞は任意の密度、例えば７０％コンフルエントで培地に播種され、３７℃ＣＯ₂雰囲気下で、少なくとも１時間、例えば２４～７２時間培養された培養物の上清を使用することができる。こうした毛乳頭細胞培養上清には、毛乳頭細胞が分泌する様々な因子、例えばケモカインやサイトカイン、酵素などの多様なタンパクが分泌されており、こうした因子が、単独で又は協働して、毛球部毛根鞘細胞を誘引することができる。本発明では、毛乳頭細胞培養上清をマイグレーションアッセイで用いることにより、毛球部毛根鞘細胞の遊走能を評価することができる。また、毛乳頭細胞培養上清に代えて、毛球部毛根鞘細胞の遊走因子を含む培地を用いることもできる。

ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲＬ１、ＣＤ３６、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ｃＭｅｔ、ＰＤＧＦＲ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる遺伝子の発現量は、毛球部毛根鞘細胞の遊走能と正の相関を示す。したがって、これらの遺伝子の発現量が高いほど、毛球部毛根鞘細胞の遊走能が高くなる。

毛球部毛根鞘細胞の遺伝子発現は、培養や凍結融解により変化しうる。頭皮移植用の細胞組成物は、継代培養されて増殖された毛球部毛根鞘細胞を回収し、凍結保存により貯蔵される。凍結した状態で輸送され、融解後に移植に供される。本発明の評価方法において測定する遺伝子発現は、培養及び／又は凍結融解の影響を受けた状態でも遊走能を決定できることが好ましい。したがって、本発明において評価される毛球部毛根鞘細胞は、培養前又は後の細胞であってもよいし、凍結細胞、又は凍結保存後に融解された細胞であってもよい。培養は、浮遊培養又は接着培養であり、遊走性を発揮する観点から接着培養が好ましい。培養後に凍結保存された細胞とは、凍結細胞又は融解後の細胞であって、融解後の培養は行われていない細胞を指す。

凍結細胞での遺伝子発現レベルと遊走能との相関性から、ＣＤ３６、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲＬ１、ＩＧＦ１Ｒ、及びＰＤＧＦＲ１からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子の発現レベルを測定し、かかる発現レベルに基づき遊走能を決定することができる。相関性の高さから、ＣＤ３６、ＦＧＦＲ２、及びＰＤＧＦＲ１からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いることができる。ＤＰ細胞培養上清で遊走が促進する細胞数の絶対値に着目する観点から、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲＬ１、及びＩＧＦ１Ｒからなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いることができる。ＤＰ細胞培養上清で遊走が促進する細胞数の相対値に着目する観点から、ＣＤ３６及びＰＤＧＦＲ１からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いることができる。

培養後の細胞での遺伝子発現レベルと遊走能との相関性から、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＣＤ３６、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、ｃ－Ｍｅｔ、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子の発現レベルを測定し、かかる発現レベルに基づき遊走能を決定することができる。相関性の高さから、ＣＤ３６、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、及びＴＬＲ２からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いることができる。ＤＰ細胞培養上清で遊走が促進する細胞数の絶対値に着目する観点から、ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、ｃ－Ｍｅｔ、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いることができる。ＤＰ細胞培養上清で遊走が促進する細胞数の相対値に着目する観点から、ＤＤＲ２及びＣＤ３６からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子を用いることができる。

ＩＧＦ１Ｒは、インスリン様成長因子１受容体であり、インスリン様成長因子ファミリーに属する。ＩＧＦ１Ｒは細胞表面に存在する受容体タンパク質である。ＩＧＦ１ＲのＧｅｎｅＩＤは３４８０である。
ＦＧＦＲ２は、線維芽細胞増殖因子受容体２であり、線維芽細胞増殖因子受容体ファミリーに属する。ＦＧＦＲ２は、細胞表面に存在する受容体タンパク質である。ＦＧＦＲ２のＧｅｎｅＩＤは２２６３である。
ＦＧＦＲＬ１は、線維芽細胞増殖因子受容体様タンパク質１であり、線維芽細胞増殖因子受容体ファミリーに属する。ＦＧＦＲＬ１は、細胞表面に存在する受容体タンパク質である。ＦＧＦＲＬ１のＧｅｎｅＩＤは５３８３４である。
ＣＤ３６は、血小板糖タンパク質４、脂肪酸トランスロカーゼ、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー３（ＳＣＡＲＢ３）などとも呼ばれる膜糖タンパク質である。ＣＤ３６は血球系細胞の表面マーカーとしても使用されうる。ＣＤ３６のＧｅｎｅＩＤは９４８である。
ＤＤＲ１及びＤＤＲ２は、ジスコイジンドメイン受容体１及びジスコイジンドメイン受容体２であり、チロシンキナーゼ受容体サブファミリーに属する。ＤＤＲ１及びＤＤＲ２は、細胞表面に存在する受容愛タンパク質である。ＤＤＲ１及びＤＤＲ２のＧｅｎｅＩＤは、それぞれ７８０及び４９２１である。
ＥＧＦＲは、上皮細胞増殖因子受容体であり、細胞表面に存在する受容体タンパク質である。ＥＧＦＲのＧｅｎｅＩＤは１９５６である。
ＥＤＡＡ２Ｒは、エクトジスプラシンＡ２受容体であり、細胞表面に存在する受容体タンパク質である。ＥＤＡＡ２ＲのＧｅｎｅＩＤは６０４０１である。
ｃＭｅｔは、肝細胞増殖因子受容体としても知られており、細胞表面に存在する受容体タンパク質である。ｃＭｅｔのＧｅｎｅＩＤは４２３３である。
ＰＤＧＦＲ１は、血小板由来増殖因子受容体１であり、細胞表面に存在する受容体タンパク質である。ＰＤＧＦＲ１のＧｅｎｅＩＤは５１５９である。
Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３は、スフィンゴシン－１－リン酸受容体２及びスフィンゴシン－１－リン酸受容体３であり、細胞表面に存在する受容体タンパク質である。Ｓ１Ｐ２及びＳ１Ｐ３のＧｅｎｅＩＤは、それぞれ９２９４及び１９０３である。
ＴＬＲ２はトル様受容体２であり、細胞表面に存在する受容体タンパク質である。ＴＬＲ２のＧｅｎｅＩＤは７０９７である。
ＶＥＧＦＲ２は、血管内皮成長因子受容体２であり、細胞表面に存在する受容体タンパク質である。ＶＥＧＦＲ２のＧｅｎｅＩＤは３７９１である。

本発明に係る遺伝子の発現の測定のために用いるプライマー対は、各遺伝子の塩基配列から任意に設定することができる。一例として、実施例で用いたプライマー対を用いることができる。本発明に係る遺伝子から発現されたタンパク質の測定のために用いる抗体は市販のものと用いてもよいし、抗原を導入して製造することもできる。

本発明において、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲＬ１、ＣＤ３６、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ｃＭｅｔ、ＰＤＧＦＲ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる１の遺伝子の発現レベルに基づいて遊走能を決定してもよいし、複数の遺伝子の発現レベルを組み合わせて、遊走能を決定してもよい。任意の組み合わせを使用してもよい。相関性の高い遺伝子を組み合わせて使用することで、遊走能をより正確に決定することができる。かかる組み合わせは、当業者であれば、統計解析又は機械学習を介して適宜設定することができる。

本発明の別の態様では、発現レベルに基づき遊走能を決定する工程に代えて、毛髪再生の有効性を直接決定する工程が行われうる。かかる方法のために、移植用の細胞組成物の毛球部毛根鞘細胞におけるＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲＬ１、ＣＤ３６、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ｃＭｅｔ、ＰＤＧＦＲ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる１の遺伝子の発現レベルと、前臨床研究の有効性とを比較し、相関性を決定することができる。毛髪再生の有効性は、細胞組成物の移植後の総毛髪密度や積算毛髪径に基づいて決定することができる。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

実施例１：ＤＰ馴化培地に基づく毛球部毛根鞘細胞の遊走活性の検出
毛球部毛根鞘細胞の取得
頭皮試料の毛包部を切開し、毛球部毛根鞘を反転させて毛乳頭を切除した。毛乳頭が切除された毛球部毛根鞘をＡｍｎｉｏＭＡＸ培地中で培養することで、毛球部毛根鞘細胞を取得した。

馴化培地の取得
ヒト頭皮から取得された毛包から得られた１×１０^６～５×１０^６個の毛乳頭細胞を、１０ｍｌのＡｍｎｉｏＭＡＸ培地を入れたフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で２日間培養し、培養上清を取得して、ＤＰ馴化培地とした。

毛球部毛根鞘細胞の遊走活性の測定
取得された２×１０^５～１×１０^６個の毛球部毛根鞘細胞を、１０ｍｌのＡｍｎｉｏＭＡＸ培地中を入れたフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に播種し、サブコンフルエントになるまで２～５日間培養した。培地を無血清培地に置換し、一晩培養を行った。その後、マイグレーションプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の膜チャンバーに、４万個の毛球部毛根鞘細胞を播種した。ボトムチャンバーにはＤＰ馴化培地を入れ、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で５時間培養した。対照として、無血清ＡｍｎｉｏＭａｘ（－）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、５時間の培養後、膜チャンバーを取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定後、ヘキスト（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で染色し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社）で膜チャンバーの下面を撮影した（図１Ａ）。ヘキスト陽性細胞を計数した（図１Ｂ）。
１０ドナーの毛球部毛根鞘細胞サンプルについて、ＤＰ馴化培地により、チャンバー下面へと遊走した毛球部毛根鞘細胞の細胞数（ＤＰ値）、ＡｍｎｉｏＭＡＸ培地により遊走された毛球部毛根鞘細胞数（Ａｍｎｉｏ値）とし、ＤＰ値とＡｍｎｉｏ－値の差（ＤＰ－Ａｍｎｉｏ値）、ＤＰ値とＡｍｎｉｏ値の商（ＤＰ／Ａｍｎｉｏ値）を算出した。
結果を以下に示す：

実施例２：毛球部毛根鞘細胞の遺伝子発現解析
未凍結試料の調製
１０ドナーの毛球部毛根鞘細胞を１０ｍｌのＡｍｎｉｏＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）培地を入れたフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）にそれぞれ播種し、接着培養し、サブコンフルエントになるまで培養した。培地を除去後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＴｒｙｐＬＥＳＥＬＥＣＴＥｎｚｙｍｅ（１Ｘ），ｎｏｐｈｅｎｏｌｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を２～５ｍｌ添加後、３７℃ＣＯ_２インキュベーターで５分間加温し、細胞を剥離させた。ＡｍｎｉｏＭＡＸ培地を１０ｍｌ添加し、細胞を回収後、遠心分離機により細胞を沈殿させ、培地を除去し、細胞ペレットを得て、未凍結試料として得た。

凍結後試料の調製
１０ドナーの毛球部毛根鞘細胞を継代し、細胞保存液・セルバンカー２（日本全薬工業株式会社）に溶解し、液体窒素気相タンクにおいて凍結保存を行った。液体窒素気相タンク下で細胞保存液・セルバンカー２（日本全薬工業株式会社）中に保存しておいた１０ドナーの毛球部毛根鞘細胞を３７℃ウォーターバスにて融解した。遠心分離チューブ内にて融解した細胞溶液とＡｍｎｉｏＭＡＸ培地１０ｍｌを均一に懸濁した後、遠心分離し、培地を除去後、細胞ペレットを得て、凍結後試料として得た。

未凍結試料、凍結後試料の細胞ペレットについて、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、以下の手順によりＲＮＡ抽出を行った。細胞ペレットをＢｕｆｆｅｒＲＬＴ（キット付属）３５０μｌに溶解し、よく攪拌した。細胞溶解液に７０％エタノール３５０μｌを加えてピペッティングにより混合した。細胞溶解液をＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎ（キット付属）に移し、１３，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、カラムを透過した液を捨てた。ＲＮｅａｓｙｃｏｌｕｍｎにＢｕｆｆｅｒＲＷ１３５０μｌを加えて１３，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。ＢｕｆｆｅｒＲＷ１３５０μｌを加えて１３，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。新しいコレクションチューブ（キット付属）にＲＮｅａｓｙｃｏｌｕｍｎを置き、９６～１００％エタノールを添加したＢｕｆｆｅｒＰＲＥ（キット付属）５００μｌを加え、１３，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。カラムを通過した液を捨て、再度ＢｕｆｆｅｒＰＲＥを加え、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。新しい１．５ｍｌチューブ（キット付属）にＲＮｅａｓｙｃｏｌｕｍｎを置き、ＲＮａｓｅｆｒｅｅｗａｔｅｒ（キット付属）３０μｌを加え、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離してＲＮＡを溶出した。精製したＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＲＴ－ＰＣＲＫＩＴ（インビトロジェン社製）を用い、以下の手順によりＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成１反応にはＲＮＡ１μｇを使用し、プライマーには下記表のＯｌｉｇｏＤＴプライマーを用いた。逆転写酵素は５０℃にて１時間反応させた。得られたｃＤＮＡを鋳型として、Ｂｌｅｎｄｔａｑ（東洋紡社製）を用い、内在性コントロールとして常時発現遺伝子であるＧＡＰＤＨ、遊走関連受容体の各遺伝子を増幅した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＳｙｓｔｅｍＩＩ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＫ．Ｋ．社製）により、９５℃にて５分（１サイクル）、９５℃にて１０秒、６０℃にて１５秒、および７２℃にて４５秒（４５サイクル）でＰＣＲ反応を行った。発現解析には、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用い、測定したい目的の遺伝子とハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのＣｔ値の差（ΔＣｔ）を比較して、相対定量した。

実施例３：遺伝子発現解析結果と遊走試験結果の相関解析
各ドナーの細胞について実施例１で決定されたＤＰ値とＡｍｎｉｏ－値の差（ＤＰ－Ａｍｎｉｏ値）、ＤＰ値とＡｍｎｉｏ値の商（ＤＰ／Ａｍｎｉｏ値）と、未凍結試料又は凍結後試料に各遺伝子についての遺伝子発現量とを、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ（マイクロソフト社）上で相関解析を実施した。ＤＰ－Ａｍｎｉｏ値、又はＤＰ／Ａｍｎｉｏ値と上述の４つの遊走試験値いずれかと相関係数が０．６以上で正の相関を示す遺伝子を遊走能関連遺伝子として選出した。

Claims

毛球部毛根鞘細胞において、以下の：
ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲＬ１、ＣＤ３６、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ｃＭｅｔ、ＰＤＧＦＲ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子の発現レベルを測定する工程；及び
発現レベルに基づき遊走能を決定する工程
を含む、毛球部毛根鞘細胞の評価方法。
前記遊走能が、発現レベルを所定の閾値と比較することにより決定される、請求項１に記載の評価方法。
前記毛球部毛根鞘細胞が、培養後の細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
前記毛球部毛根鞘細胞が、凍結保存後に融解され、培養された細胞である、請求項３に記載の方法。
前記培養が、接着培養である、請求項３又は４に記載の方法。
前記遺伝子のうち、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＣＤ３６、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＤＡＡ２Ｒ、ｃＭｅｔ、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、ＴＬＲ２、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子の発現レベルを測定する、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
前記毛球部毛根鞘細胞が、培養後に凍結保存された細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲＬ１、ＦＧＦＲ２、ＣＤ３６、及びＰＤＧＦＲ１からなる群から選ばれる、請求項７に記載の方法。
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法により毛球部毛根鞘細胞を評価することを含む、移植適格性を決定する方法。