JP2022167074A - 流路構造体、流体撹拌方法及び脂質粒子の製造方法 - Google Patents

流路構造体、流体撹拌方法及び脂質粒子の製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】 横渦を発生させることで流体をより均一に混合することができる流路構造体、流体撹拌方法及び脂質粒子の製造方法を提供することである。【解決手段】 実施形態に従う流路構造体は、第１の流路と、第１の流路に合流する第２の流路とを備え、第２の流路の第１の流路側の端は、第１の流路より深さが浅い領域を有する。【選択図】図１

Description

本発明の実施形態は、流路構造体、流体撹拌方法及び脂質粒子の製造方法に関する。
２液を速やか且つ均一に混合させるためには撹拌することが適切である。近年流体の取り扱いにマイクロ流路が用いられているが、２液が少量である場合、レイノルズ数が小さいマイクロ流路内においては乱流が発生しにくく、２液を撹拌混合する事が困難である。よって、マイクロ流路内で定常的な旋回流（渦、スワール）を生成させることにより混合を促進する事が試みられてきている。マイクロ流路内で旋回流を発生させるには立体的な流体制御が必要となり、そのために繊細な金型や流路加工、又は高精度な複数流路の積層成形が求められる。
一方、医療用等、クロスコンタミネーションを避けることが望まれる状況で使用されるマイクロ流路は、使い捨て（ディスポーザブル）品であることが好ましい。その場合、精度を強く要求しない低コストな設計のマイクロ流路が求められる。
特表２０１９－５０６２８６号公報 特表２０１９－５０３２７１号公報
Stroock, Abraham D., et al. Science, Jan 2002, 295.5555: 647-651
本発明が解決しようとする課題は、横渦を発生させることで流体をより均一に混合することができる流路構造体、流体撹拌方法及び脂質粒子の製造方法を提供することである。
実施形態に従う流路構造体は、第１の流路と、第１の流路に合流する第２の流路とを備え、第２の流路の第１の流路側の端は、第１の流路より深さが浅い領域を有する。
図１は、第１実施形態の流路構造体の一例を示す平面図及び断面図である。 図２は、第１実施形態の流路構造体の一例を示す斜視図である。 図３は、実施形態の流路構造体の流路断面の一例を示す断面図である。 図４は、第２実施形態の流路構造体の一例を示す平面図である。 図５は、第３実施形態の流路構造体の一例を示す平面図である。 図６は、第４実施形態の流路構造体の一例を示す平面図である。 図７は、第４実施形態の流路構造体の一例を示す平面図である。 図８は、第４実施形態の流路構造体の一例を示す平面図である。 図９は、第５実施形態の流路構造体の一例を示す平面図である。 図１０は、実施形態の流路構造体の一例を示す断面図である。 図１１は、実施形態の脂質粒子の一例を示す図である。 図１２は、実施形態の脂質粒子の製造方法の一例を示すフローチャートである。 図１３は、実施形態の脂質粒子の製造方法に用いる流路構造体の一例を示す図である。 図１４は、例１の実験結果を示す画像である。 図１５は、例２の実験結果を示す画像である。 図１６は、例２のシミュレーション結果を示す画像である。 図１７は、例３の実験結果を示す写真である。 図１８は、例４の実験結果を示す写真である。 図１９は、例４の実験結果を示す写真である。 図２０は、例４の実験結果を示すグラフである。 図２１は、例４の実験結果を示すグラフである。 図２２は、例５のシミュレーション結果を示す画像である。 図２３は、例６で使用した流路構造体を示す平面図である。 図２４は、例６の実験結果を示すグラフである。 図２５は、例７で使用した流路構造体を示す平面図である。 図２６は、例１０のシミュレーション結果を示す画像である。
以下、実施形態について、添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において、実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。
（第１実施形態）
図１の（ａ）の平面図に示す通り、第１実施形態の流路構造体１は、第１の流路２と、第１の流路２に合流する第２の流路３とを含む。第１の流路２と、第２の流路３とは、流路構造体１の内部に形成された空洞であり、即ちその天面は蓋を有し、液密に構成されている。以下、後述する第３の流路及び第４の流路もまた同様に流路構造体内部に形成された空洞の形状である。
第２の流路３の第１の流路２側の端は、第１の流路２より深さが浅い第１の領域を有する。第１の領域を以下、第１の浅部４とも称する。図１の（ａ）のＢ－Ｂ’に沿って切断した断面図である図１の（ｂ）に示す通り、例えば第１の浅部４は、第１の浅部４よりも上流の領域（以下、「深部５」と称する）、及び第１の流路２よりも底面が突出し、流路の内腔を狭くしている。深部５及び第１の流路２の深さは同じであり得る。なお、本図では流体の進行方向を矢印で示す。図に示すように、第１の流路２の流体の進行方向は、第２の流路３と異なる。第１の流路２の、第２の流路３から流体が合流する領域を「混合領域６」と称する。
例えば、第１の流路２と、第２の流路３とはマイクロ流路である。
図２は、第２の流路３から流体を流した時の様子を示す。矢印は流体の進行方向を示す。流体は第１の浅部４を通過することで第１の流路２に流れ込む際に横渦が発生する。横渦はその回転軸が第１の流路２の長軸と一致した旋回流である。この例では第２の流路３の右側の第１の流路２の端が閉鎖されており壁になっているため、流体は横渦を発生させながら左方向に（図２では横渦を発生させながら右方向に）第１の流路２の長軸に沿って流れる。横渦の発生により流体をよく混合、撹拌することができる。
図１の（ｂ）に示すように、第１の浅部４の深さｄ１は第１の流路２の深さｄ２に対して１／２未満であることが好ましい。ｄ１／ｄ２は１／３以下であればより好ましい。このような深さとすることにより、第１の浅部４から第１の流路２へ流体が流れ込む際の流速が上がり、横渦がより発生しやすくなる。
第１の浅部４の深さｄ１が浅い方がより大きく強い横渦を発生させる流速を得られるものの、浅くしすぎると過剰な圧力損失が起こる可能性があり、また万が一異物が存在する場合に閉塞を招く可能性もある。そのため、例えば実験又はシミュレーションにより、ｄ１／ｄ２を１／３、１／４、１／５等とより浅く設計していったとき、最終的に流路の工作上の精度又は圧力損失、異物に対するロバスト性から妥当な深さｄ１を決定すればよい。
実際には、本流路構造体の製造に用いられる好ましい手法である金型成形又は切削加工の精度が一般的に５μｍであることから、誤差による流路の閉塞を回避するためにも、最低でも浅部４の深さは１０μｍ以上であることが望ましい。
また、定常的に安定な横渦を形成させるため、またキャビテーションによる予期せぬ反応を起こさせぬためにも、流速が乱流域に至るような浅さにまで浅部４の深さを削減することは避けた方がよい。
第１の浅部４の長さは、第２の流路３の流路幅と同じかそれ以上の長さとすることが好ましい。それにより、深部５から第１の浅部４へ流体が流れた時に生じる流れの乱れが、第１の浅部４内で適度に収まり得る。流れの乱れを抑えることで、より効率的に横渦の発生させることができる。しかしながら、第１の浅部４を無用に長くすることは、圧力（流体抵抗）を過剰に上げる可能性があるため好ましくなく、第１の浅部４の長さは通常、最長で流路幅の約３倍程度であることが好ましい。しかしながら、ポンプの吐出性能が許すのであれば、流路の配置等の都合から、必要であれば３倍よりも長くすることも可能である。
第２の流路３は、例えば第１の流路２に直角に合流している。第２の流路３と第１の流路２とがなす角度θ１は、必ずしも直角である必要はないが、角度θ１が大きくなるほど層流合流になりやすい。したがって、角度θ１は可能な限り直角に近いことが好ましい。また、図１の例では第１の流路２は、第２の流路３から見て左側に流れが屈曲するように構成されているが、右側に屈曲する構成としてもよい。
第１の流路２の流路断面は、図３の（ａ）に示すように幅及び深さが同じ長さである正方形であることが好ましい。しかしながら精密に正方形にする必要はなく、一方の辺が僅かに長い略正方形であってもよい。また、可能であれば図３の（ｂ）に示すように断面の底部の２隅をＲ形状とした形状もまた好ましく、又は図３の（ｃ）に示すように断面の底部を正方形の辺の半分の距離を半径としたＲ形状としてもよい。このような断面形状により、横渦がより真円に近い形状となり、横渦がより長く維持される。その結果、流体をよく混合及び撹拌することができる。なお、第１の流路２の全域に亘りこのような断面形状にする必要はなく、少なくとも混合領域６がこのような断面形状になっていればよい。
第２の流路３の深部５及び第１の流路２の流路幅及び深さ、第１の浅部４の深さ、並びに流体の供給量は限定されるものではなく、流体の種類に従って決定される。例えば、横渦を発生させるためにも層流となることを防止する目的で、第１の浅部４以外の通常の深さを有する流路部分におけるレイノルズ数が１０以上となるように調節することが好ましい。また均一な横渦を作る目的において乱流を避けるためにも、少なくともレイノルズ数を２３００未満とすることが好ましい。更に好ましくは、一般的に入手できるポンプの性能と、実効的な横渦の強さを念頭に入れ、レイノルズ数が５０～約１０００であることが好ましい。
例えば、深部５及び第１の流路２の断面を０．３ｍｍ角とする場合、流速を約０．５ｍ／ｓ以上とすることが好ましい。流体を水に近いものと想定すると、室温付近では、この際のレイノルズ数は１００前後である。
例えばレイノルズ数を一定に維持したまま流路断面の一辺の長さを短くすると、圧力へは２乗で影響する。そのため、例えば一辺０．３ｍｍの流路において、第１の浅部４の深さｄ１を０．１ｍｍとすることで第１の浅部４における圧力損失は１０倍になる。また第１の浅部４における圧力の１０倍前後の上昇により、流量範囲に対する適用可能なポンプの仕様変更の必要性が高くなり、またその場合ポンプの種類も限られる。そのため、第１の浅部４の深さｄ１が０．１ｍｍ以上となるように深部５及び第１の流路２の深さを設計することが望ましい。またポンプの負担を軽減するために圧力の上昇の上限は１０倍程度とすることが好ましい。
一方で、本流路構造体でポンプを用いる場合、脈動を起こさないポンプを用いることが好ましい。そのようなポンプとしては１ｍｌ／ｓｅｃ程度の送液量のものが容易に入手できる。それを考慮した場合、深部５及び第１の流路２の断面の幅及び深さは３ｍｍ程度が妥当な上限であり得る。
以上に説明した通り、実施形態の流路構造体１によれば、横渦を発生させることで流体をより混合及び撹拌することができる。詳しくは後述するが、この流路構造体は製造時、基材にトンネル構造を成形する必要がなく、溝状の流路に平面の蓋をする構成（つまり流路同士の積層を行わない構成）とすることができる。そのため、製造時高い工作精度を要求せず、簡単且つ低コストで製造することができる。
（第２実施形態）
第２実施形態の流路構造体は、第１の流路の、第２の流路との合流点のすぐ上流に直列に接続する第３の流路７を更に備える。例えば、図４の（ａ）に示す流路構造体１０のように、例えば第３の流路７及び第１の流路２は一体の直線状の流路を成し、第２の流路３は直角に第１の流路２に合流する。このとき、第２の流路３と第１の流路２とがなす角θ１及び第２の流路３と第３の流路７とがなす角θ２はどちらも直角である。
更なる実施形態においては、図４の（ｂ）に示す流路構造体１１のように第２の流路３と第３の流路７とが、例えば同じ角度で第１の流路２に合流し、全体としてＹ字形状を成している。第２の流路３と第３の流路７との為す角θ２は直角であることが好ましい。また、これら２つの流路が第１の流路２に同じ角度で合流し、言い換えれば第１の流路２の長軸を対称軸として第２の流路３と第３の流路７とが互いに対称に接続している。例えば角θ２は直角であるとき、第２の流路３と第１の流路２とがなす角θ１は例えば１３５°である。
流路構造体１０、１１では、第２の流路３に加え、第３の流路７からもまた流体を流す。それにより混合領域６において２流体が合流する。また第１の浅部４により混合領域６で横渦が発生することにより、２流体が混合及び撹拌される。
流路構造体１１は、流路構造体１０よりも第２の流路３からの合流直後の流れの乱れが少なくなり得る。流れの乱れは攪拌効果を増大させるが、乱れを少なくすることでより均一に混合を行うことが可能であり、また、この場合横渦の寿命（エネルギー）を無駄に消費することが無く、横渦をより持続させることができる。したがって、撹拌効果よりも均一な混合が望まれる場合は流路構造体１０よりも流路構造体１１を用いることが好ましい。反対に、より急激な混合が望まれる場合は流路構造体１０を用いることが好ましい。
第２実施形態の流路構造体１０、１１においても第１の浅部４の深さｄ１は、第１の流路２の深さｄ２に対して１／２未満であることが好ましい。例えば、第１の浅部４を設けない場合、第２の流路３及び第３の流路７から同量に近い流量で流体を流すと、合流後、流体が断面積を１／２ずつ占有するので合流後に層流になろうとする要素が強くなる。したがってｄ１／ｄ２を１／２とした場合、それと同様の状況が体現されるため横渦が発生しにくい可能性がある。したがって、ｄ１／ｄ２を１／２未満とすることでより横渦が発生しやすくなり得る。
第２実施形態の流路構造体１０、１１は、例えば２流体の混合に使用することができ、２流体をより効率よく且つ均一に混合することが可能である。
（第３実施形態）
第３実施形態の流路構造体は、第１実施形態又は第２実施形態の流路構造体の第１の流路の下流の端に、更に流体を混合する流路群（混合ユニット）を備える。図５は、第３実施形態の流路構造体２０の一例を示す。流路構造体２０は、合流ユニット２１と、混合ユニット２２とを備える。本図では便宜上浅部（第１の浅部４ａ～第３の第３の浅部４ｃ）を斜線パターンで示す。また、流体の流れる向きを矢印で示す。
合流ユニット２１は、２つの流体が合流するための流路群を備える。合流ユニット２１は例えば第２実施形態の流路構造体１０又は１１と同じ構造を有する。ここでは流路構造体１１と同じ構造を図示する。合流ユニット２１では、第２実施形態において説明した通り、流体が第１の浅部４ａを通過することにより混合領域６ａで横渦が発生し、第２の流路３及び第３の流路７からそれぞれ流れてきた２つの流体が第１の流路２で混合される。その後流体は下流の混合ユニット２２へと流れる。
混合ユニット２２は、合流ユニット２１の下流に連結され、合流ユニット２１で合流した流体を更に混合及び撹拌する流路群を備える。この流路群は、例えば第１の流路２から流入する流体を２つに分岐させて２つの分流を形成し、この２つの分注を第４の流路に合流させる第１の分岐合流路２３及び第２の分岐合流路２４を備える。
例えば、第２の分岐合流路２４はその中間部にその上流側及び下流側よりも深さが浅い第２の領域（第２の浅部４ｂ）を有し、その下流は屈曲して前記第４の流路に合流する。第２の浅部４ｂと屈曲により、横渦が発生し、流体を混合及び撹拌することができる。また、第１の分岐合流路２３の第４の流路側の端は、第４の流路よりも深さが浅い第３の領域（第３の浅部４ｃ）を有する。第３の浅部４ｃにより、流体が第４の流路で合流する際に横渦が発生し、流体を混合及び撹拌することができる。
以下第１の分岐合流路２３及び第２の分岐合流路２４の構造についてより詳しく説明する。第１の分岐合流路２３は、例えば上流から下流に向けて分岐部２３ａと、中間部２３ｂと、合流部２３ｃとを含む。第２の分岐合流路２４も同様に、例えば分岐部２４ａと、中間部２４ｂと、合流部２４ｃとを含む。
分岐部２３ａ及び分岐部２４ａは、第１の流路２の下流の端に連結され、流体を分岐させる部分である。分岐部２３ａ及び分岐部２４ａは、流量を同等とするために例えば同じ角度で、即ち第１の流路２を軸として互いに対称に連結され、また同じ流路幅及び深さとすることが好ましい。分岐部２３ａと分岐部２４ａとがなす角は限定されるものではないが、例えば直角である。
しかしながら、必ずしも２つの分岐部の流量を同等にしなくとも下流の第２の浅部４ｂ、４ｃで横渦を発生させることは可能であるため、流路の大きさ又は角度を互いに異なるものにすることも可能である。しかしながら、その場合一方の流量を下げることとなり、流量が少ない方の流路では圧力調整の困難度（必要精度）が上がる可能性がある。よって、おおよそ同量に分岐させることが製品のロバスト性において好ましい。
分岐部２３ａ及び分岐部２４ａのそれぞれ下流の中間部２３ｂ及び中間部２４ｂでは、第１の流路２の長軸と平行な角度に流路が屈曲している。続いてその下流の合流部２３ｃ、２４ｃで更に内側に屈曲し、第４の流路２５に接続している。
中間部２４ｂは、例えば合流部２４ｃの深さに対して１／２未満の深さを有する第２の浅部４ｂとなっている。混合ユニット２２で一方の流路が第３の浅部４ｃを有しているため、分岐するときに圧力バランスが偏り、均等に分岐されない可能性がある。そこで、例えば、第２の浅部４ｂを配置することにより、２つの分流の圧力を同様にすることができる。第２の浅部４ｂは、分岐部２４ａに設けることも可能であるが、中間部２４ｂに配置する方が、分流化がより単純となるため好ましい。第２の浅部４ｂの下流の合流部２４ｃで流路が屈曲しているため、合流部２４ｃの上流付近（混合領域６ｂ）で横渦が発生する。それにより、そこで流体を更に撹拌することができる。混合領域６ｂの流路の断面形状は、図３に示す何れかの形状となっていることが好ましい。
合流部２３ｃ及び合流部２４ｃは、例えば互いに同じ角度で、即ち第４の流路２５を軸として互いに対称に第４の流路２５に連結している。合流部２３ｃと合流部２４ｃとがなす角は直角であることが好ましい。
例えば合流部２３ｃは、第４の流路２５の深さに対して１／２未満の深さを有する第３の浅部４ｃとなっている。第３の浅部４ｃにより第４の流路２５の入り口付近（混合領域６ｃ）で横渦が発生する。それにより流体を更に混合及び撹拌することができる。混合領域６ｃの流路の断面形状は、図３に示す何れかの形状となっていることが好ましい。
単に横渦を生成するだけであるならば、必ずしも第２の浅部４ｂを設けなくともよく、圧力の調整を図った上で第２の分岐合流路２４全域にわたり同じ深さとすることも可能である。しかしながら、図５に示す第１の分岐合流路２３及び第２の分岐合流路２４の両方に浅部が配置される構成は、万が一異物の混入によって片方の流路が閉塞した場合でも、どちらか一方の流路で浅部を経由させ、流体を混合及び撹拌することができる点においても好ましい。
図５では、合流ユニット２１の浅部４ａを有する流路（ここでは第２の流路３）の対角に配置された流路（ここでは第２の分岐合流路２４）が中間部２４ｂに第２の浅部４ｂを有しているが、後述する図６のように第１の分岐合流路２３と、第２の分岐合流路２４とが反転して配置されていてもよい。
（第４実施形態）
第４実施形態に従う流路構造体は複数の混合ユニット２２を備える。例えば、図６の（ａ）に示すように、流路構造体３０は、直列に配置された３つの混合ユニット、即ち第１の混合ユニット２２ａ、第２の混合ユニット２２ｂ及び第３の混合ユニット２２ｃを備える。
図６の（ｂ）に示す流路構造体３１は、第２の混合ユニット２２ｂにおいて、第１の分岐合流路２３（合流部に第３の浅部４ｃを備える）と、第２の分岐合流路２４（中間部に第２の浅部４ｂを備える）とが第４の流路２５を軸として反転して配置されている。この例のように第１の分岐合流路２３及び第２の分岐合流路２４の配置が反転した混合ユニットを交互に配置することで、より均等に流体を混合することができる。
混合ユニット２２の数は３つに限られるものではなく、２つ若しくは４つ、５つ、６つ又はそれ以上としてもよい。
更なる実施形態によれば、図７に示す流路構造体４０のように、複数の混合ユニット２２ａ～２ｃを並列に配置した流路構造としてもよい。例えば、上流で流体を分岐させ、複数の混合ユニット２２ａ～ｃを通過させた後、その下流で再び１つの流路に合流させる。この配置は、直列に配置する場合と比較して流量が多い場合も送液の抵抗を低減することができる。送液ポンプを用いる場合は、ポンプへの負荷がより少ない。
また、直列配置と並列配置とを併用した構造としてもよい。その場合、送液の抵抗を調節することができ、且つ撹拌混合の効果を高めることが可能である。例えば、図８に示す流路構造体５０は、直列に配置された２つの混合ユニット２２を備える流路構造が４組あり、これら４組の流路構造が並列に配置されている。また、並列に配置された混合ユニット２２の下流で流体が合流する部分では、混合及び撹拌を促進するために、合流する流路の一方に浅部を配置することが好ましい。直列配置と並列配置とを併用した流路構造は図８に示す例に限定されるものではなく、流体の種類又は用途に応じて改変することが可能である。
第４実施形態に従う流路構造体によれば、混合ユニット２２を一つ備える場合と比べて更に流体を混合及び撹拌することができる。
（第５実施形態）
第５実施形態の流路構造体は、図９に示す流路構造体６０のように、合流ユニット２１の第３の流路７及び第１の流路２は一体の直線状の流路を成している。第２の流路３は、第１の流路２に対して直角に合流している（即ち、図４の（ａ）と同様の流路構造）。
また、第１の混合ユニット２２ａの合流部２３ｃは、第４の流路２５に直列に接続し、第４の流路２５と一体の直線の流路を成している。合流部２４ｃは、第４の流路２５に対して直角に合流している。第２の混合ユニット２２ｂでは、第１の分岐合流路２３と第２の分岐合流路２４とが反転して配置されているが、同様に合流部２３ｃと第４の流路２５とが直線の流路を成し、そこに合流部２４ｃが直角に合流している。
第１の流路２及び第４の流路２５は、次の分岐の直前で２つの分岐流路の対称軸に沿うように屈曲している。或いは、第１の流路２及び第４の流路２５を屈曲させずにそのまま次の分岐部２３ａに直列に連結してもよい。
この例において混合ユニット２２はいくつ連結してもよく、例えば、１つ若しくは３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上連結してもよい。
このように２つの浅部を有する流路を直角に合流させることによって、流体がより早く混合及び撹拌され得る。これは、合流時に流れの乱れが大きくなることが一因と考えらえる。流れの乱れは、混合の均一性の効果は少ないものの、攪拌の効果を高め得る。そのため、均一性よりも攪拌の早さを求める場合には、このような流路構造とすることが好ましい。
（流路構造体の製造方法）
以上に説明した流路構造体（以下、まとめて「流路構造体１００」と記す）の製造方法について、以下図１０を用いて説明する。図１０の（ａ）に示すように、流路構造体１００は、例えば流路として機能する溝１０１が形成された基板１０２と、溝１０１の天面を塞ぐように基板１０２に接合された板状の蓋部１０３とを備える。
基板１０２の材料は、アクリル、ポリエチレン、ポリプロピレン等の樹脂、ガラス、セラミックス又は金属等から用途によって適切なものを選択すればよい。例えば、流路構造体が医療用途であるならば、シクロオレフィンポリマー等も好ましい例である。何度も再利用するのであればガラス、石英などのセラミックスが安定性から好ましく、温度などの調整を図るのであれば、表面に耐食性の処理を施した金属を用いてもよい。溝１０１は、例えば金型を用いたプレス加工又は切削により形成することができる。浅部に相当する箇所は、他の部分よりも溝１０１を浅く形成又は切削すればよい。
蓋部１０３の材料は、例えば、基板１０２で説明したものと同様の材料を使用することができる。蓋部１０３は、例えば板状であり得る。又は、図１０の（ｂ）に示すように薄いフィルム状の蓋部１０４を用いてもよい。
フィルム状の蓋部１０４は、流体の状態を監視するためのセンサー端子１０５を取り付けることも可能である。又は蓋部１０４に高い熱伝導性若しくは特定の物質に対して特定の処理を行う機能（図示せず）等、様々な機能又は特性を付与することも可能である。
蓋部１０４が内圧により膨らむことが懸念される場合には、図１０の（ｃ）に示すように、押さえ板１０６を蓋部１０４の上から押し付けることで膨らみを抑制してもよい。押さえ板１０６は、その内部に配置された熱交換用の熱媒流路１０７、又はセンサー機能を有する電気端子（図示せず）等を備えてもよい。
このように基板１０２に溝１０１を形成して蓋部１０３又は１０４を接合するという単純な手順で流路構造体１００を製造することができる。したがって、例えば基板１０２と蓋部１０３の両方に溝を形成すること、また、それによる両者の精密な位置合わせが不要であるため、量産性が非常に高い。
更なる実施形態によれば、浅部の溝１０１の深さを他の部分と同じ深さとしておき、対応する箇所に凸部を有する蓋部１０４を取り付けることで形成されてもよい。即ち、このように形成された浅部４の流路内腔は、上から凹むことによって流路が狭くなっている。このような構造は、上記のような底が突出する構造と比較して蓋部の形成、位置合わせ等の製造の手順は増えるが、同様に横渦を発生させることは可能である。
（流体撹拌方法）
実施形態によれば、流体撹拌方法が提供される。流体撹拌方法は、実施形態の流路構造体に撹拌したい流体を流すことを含む。流体撹拌方法によれば、実施形態の流路構造体を用いることにより、流体をより混合及び撹拌することができる。
本方法は、第１実施形態の流路構造体を用いる場合、第２の流路３から第１の流路２に第１の流体を流すことを含む。また、本方法は、第２～第５実施形態の流路構造体を用いる場合、第３の流路７に第２の流体を流すことを更に含む。第１の流体と第２の流体とは、互に異なる種類の流体であってもよく、第２～第５実施形態の流路構造体によれば、第１の流体と第２の流体とをより混合及び撹拌することができる。また、より均一な混合が可能である。
（薬剤を内包する脂質粒子の製造方法）
以下、実施形態の流路構造体を用いて薬剤を内包する脂質粒子を製造する方法について説明する。
まず、本方法で製造される脂質粒子について説明する。図１１に示すように、脂質粒子２００は脂質分子が配列して形成された脂質膜からなり、中空の略球状である。脂質粒子２００の内腔２０１に薬剤２０２が内包されている。脂質粒子２００は例えば薬剤２０２を細胞内に送達するために用いられ得る。
製造方法は、例えば図１２に示すように次の工程を含む：
薬剤（核酸の場合）を凝縮すること（凝縮工程Ｓ１）、
実施形態の流路構造体を用いて、第２の流路３及び第３の流路７の何れか一方から、有機溶媒中に脂質粒子の材料の脂質を含む第１溶液を流し、他方から水性溶媒中に薬剤を含む第２溶液を流して第１溶液と前記第２溶液とを混合し、混合液を得ること（混合工程Ｓ２）、
混合液の有機溶媒の濃度を低下させることで脂質を粒子化して薬剤を内包した脂質粒子を生成すること（粒子化工程Ｓ３）、及び
脂質粒子溶液を濃縮すること（濃縮工程Ｓ４）。
本製造方法は、例えば図１３に示す流路構造体を用いて行うことができる。図１３の（ａ）は凝縮工程Ｓ１を行うための構成を有する凝集用流路構造体３０１を示し、（ｂ）は混合工程Ｓ２を行うため実施形態の流路構造体３０２を示し、（ｃ）は粒子化工程Ｓ３を行うための構成を有する粒子化用流路構造体３０３を示し、（ｄ）は濃縮工程Ｓ４を行うための構成を有する濃縮用流路構造体３０４を示す。
以下、本製造方法の手順の例について説明する。
まず第１溶液と第２溶液とを用意する。第１溶液は、有機溶媒中に脂質を含む。脂質は、脂質粒子２００を構成する材料となる脂質である。第２溶液は、水性溶媒中に薬剤２０２を含む。
・凝縮工程Ｓ１
薬剤２０２は、限定されるものではないが、例えば核酸である。核酸の薬剤２０２は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又は他のヌクレオチドを含む核酸等であり、例えば特定の遺伝子のｍＲＮＡ、遺伝子をコードするＤＮＡ、遺伝子とプロモーター等の遺伝子を発現するためのその他の配列とを含む遺伝子発現カセットを含むＤＮＡ、ベクター等であり得る。薬剤２０２が核酸である場合、まず核酸（薬剤２０２）を凝集する凝集工程Ｓ１を行ってもよい。
核酸の凝縮は、例えば核酸凝縮ペプチドを用いて行われる。核酸凝縮ペプチドは、核酸を小さく凝縮することにより、脂質粒子２００の粒径をより小さくすることができ、また脂質粒子２００内により多くの核酸を内包することができる。その結果、脂質粒子２００の凝集の原因となり得る脂質粒子２００外に残留する核酸がより少なくなり得る。
好ましい核酸凝縮ペプチドは、例えば、カチオン性のアミノ酸を全体の４５％以上含むペプチドである。より好ましい核酸凝縮ペプチドは、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有し、他方の端が配列ＲＱＲＱＲ（第２のアミノ酸配列）を有する。第１のアミノ酸配列と第２アミノ酸配列との間には、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。中性アミノ酸は、例えば、Ｇ又はＹである。他方の端は第２のアミノ酸配列に変えて、ＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有してもよい。
上記核酸凝縮ペプチドは、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号２）
ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号３）。
更に、次のようなアミノ酸配列を有する核酸凝縮ペプチドを上記の何れかの核酸凝縮ペプチドと組み合わせて用いることもできる。このペプチドは、上記核酸凝縮ペプチドで凝縮した核酸凝縮体を更に凝縮することができる。
ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ
（Ｍ９）（配列番号４）
図１３の（ａ）に示す通り、凝集工程Ｓ１を行うための凝集用流路構造体３０１は、例えばＹ字型の流路である。Ｙ字型の分岐した一方の流路３１１の上流の端には例えば凝集剤流入口３１２が設けられ、そこから核酸凝縮ペプチドを含む凝集剤を流す。他方の流路３１３の上流の端には薬剤流入口３１４が設けられ、そこから核酸（薬剤２０２）を水性溶媒中に含む溶液を流す。水性溶媒は、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液又は緩衝液等である。その結果、流路３１１と流路３１３とが合流する流路３１５内で凝縮剤と薬剤２０２を含む溶液とが混合される。混合により、凝縮された薬剤２０２を含む第２溶液が得られる。
凝縮工程Ｓ１は必ずしも流路を用いて行う必要はなく、凝集剤と、核酸（薬剤２０２）を水性溶媒中に含む溶液とを混合及び撹拌すればよい。
以上の効果を奏することから薬剤２０２が核酸である場合は凝縮工程Ｓ１を行うことが好ましい。しかしながら薬剤２０２が核酸でない場合、又は核酸であるが凝縮する必要のない場合等は凝縮工程Ｓ１を行う必要はない。
・混合工程Ｓ２
次に、第１溶液及び第２溶液を混合する。
第２溶液は薬剤２０２が核酸である場合上記のように作製されたものであってもよい。又は凝縮しない核酸若しくは核酸でない薬剤２０２を使用する場合は、その種類に応じて選択された上記の何れかの水性溶媒に薬剤２０２を混合することで第２溶液を作製することができる。核酸でない薬剤２０２は、例えば、活性成分としてタンパク質、ペプチド、アミノ酸、他の有機化合物又は無機化合物等を含む。薬剤２０２は、例えば疾患の治療薬又は診断薬等であってもよい。しかしながら薬剤２０２はこれらに限定されるものではなく、脂質粒子２００に内包することができれば何れの物質であってもよい。
薬剤２０２は必要に応じて、例えばｐＨ調整剤、浸透圧調整剤及び／又は薬剤活性化剤等の試薬を更に含んでもよい。ｐＨ調整剤は、例えば、クエン酸等の有機酸及びその塩等である。浸透圧調整剤は、糖又はアミノ酸等である。薬剤活性化剤は、例えば活性成分の活性を補助する試薬である。これらは凝縮工程Ｓ１を行う場合、その後に添加してもよい。
薬剤２０２は、１種類の物質であってもよく、複数の物質を含んでもよい。第２溶液中の薬剤２０２の濃度は、例えば０．０１％～１．０％（重量）であることが好ましい。
第１溶液は、脂質と有機溶媒とを混合することで製造され得る。脂質は、例えば生体膜の主成分の脂質であってもよい。また、脂質は人工的に合成したものであってもよい。脂質は、例えば、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等のベース脂質を含み得る。
例えば、ベース脂質として、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデシル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０ ＤＡＰ）、
Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、又は
コレステロール、
或いはこれらの何れかの組み合わせ等を用いることが好ましい。特にＤＯＴＡＰ及び／又はＤＯＰＥを用いることが好ましい。
脂質は、生分解性脂質である第１の脂質化合物及び／又は第２の脂質化合物を更に含むことが好ましい。第１の脂質化合物はＱ－ＣＨＲ２の式で表すことができる。
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。
第１の脂質化合物は、例えば下記式で表される構造を有する脂質である。
Figure 2022167074000002
Figure 2022167074000003
Figure 2022167074000004
Figure 2022167074000005
特に、式（１－０１）の脂質化合物及び／又は式（１－０２）の脂質化合物を用いることが好ましい。
第２の脂質化合物は、Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２の式で表すことができる。
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）。
第２の脂質化合物は、例えば下記式で表される構造を有する脂質である。
Figure 2022167074000006
Figure 2022167074000007
Figure 2022167074000008
特に、式（２－０１）の化合物を用いることが好ましい。
第１の脂質化合物及び第２の脂質化合物を含む場合、脂質粒子２００への薬剤２０２の内包量を増加させ、薬剤２０２の細胞への導入効率を高めることが可能である。また、導入した細胞の細胞死も低減することができる。
ベース脂質は、脂質材料の全体に対して３０％～約８０％（モル比）含まれることが好ましい。或いは、１００％近くがベース脂質から構成されていてもよい。第１及び第２の脂質化合物は、脂質材料の全体に対して約２０％～約７０％（モル比）で含まれることが好ましい。
脂質は、脂質粒子２００同士の凝集を防止する脂質を含むこともまた好ましい。例えば、凝集を防止する脂質は、ＰＥＧ修飾した脂質、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、オメガ－アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）又はモノシアロガングリオシド等を更に含むことが好ましい。このような脂質は、脂質粒子２００の脂質材料全体に対して約１％～約１０％（モル比）で含まれることが好ましい。
脂質は、毒性を調整するための相対的に毒性の低い脂質；脂質粒子２００に配位子を結合させる官能基を有する脂質；ステロール、例えばコレステロール等の内包物の漏出を抑制するための脂質等の脂質を更に含んでもよい。特に、コレステロールを含ませることが好ましい。
例えば、脂質粒子２００は、式（１－０１）若しくは式（１－０２）の化合物及び／又は式（２－０１）の化合物と、ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＴＡＰと、コレステロールと、ＤＭＧ－ＰＥＧとを含むことが好ましい。
脂質の種類及び組成は、目的とする脂質粒子２００の酸解離定数（ｐＫａ）若しくは脂質粒子２００のサイズ、内包物の種類、或いは導入する細胞中での安定性等を考慮して適切に選択される。例えば脂質粒子２００を構成する脂質を所望の組成とするためには、第１溶液に含まれる脂質の組成を同じ比率に設定すればよい。
第１溶液の有機溶媒は、例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、エーテル、クロロホルム、ベンゼン又はアセトン等である。有機溶媒中の脂質の濃度は、例えば０．１％～０．５％（重量）であることが好ましい。
第１溶液と第２溶液との混合は、図１３の（ｂ）に示すように実施形態の流路構造体３０２を用いて行われる。ここでは、流路構造体３０２として第４実施形態の流路構造体を示すが、流路構造体３０２はそれに限定されるものではなく、例えば第２、第３又は第５実施形態の流路構造体を使用することも可能である。
凝集工程Ｓ１を行う場合は、凝集用流路構造体３０１の流路３１５の下流の端が実施形態の流路構造体３０２の第２の流路３の上流の端に連結されており、第２の流路３に第２溶液が供給される。凝縮工程Ｓ１を行わない場合は、第２の流路３の上流の端に第２溶液流入口（図示せず）が設けられ、そこから第２溶液が供給される。第３の流路７は、例えばその上流の端に第１溶液流入口３２１を備え、そこから第１溶液を供給する。その結果第１溶液及び第２溶液が混合され、混合液８が得られる。そして混合ユニット２２を備える場合はそこで混合液８が更に混合及び撹拌される。例えば、凝縮工程Ｓ１を行わない場合は第２の流路３に第１溶液を流し、第３の流路７に第２溶液を流してもよい。
・粒子化工程Ｓ３
次に粒子化工程Ｓ３において混合液８の有機溶媒の濃度を低下させる。例えば、混合液８に水溶液を多量に添加することにより有機溶媒濃度を相対的に低下させることが好ましい。例えば、混合液８の３倍量の水溶液を混合液８に添加する。水溶液として、第１溶液に用いられる水性溶媒と同じものを用いることができる。有機溶媒濃度を低下させることによりにより脂質が粒子化し、薬剤２０２を内包する脂質粒子２００が生成し得る。その結果、脂質粒子２００を含む脂質粒子溶液９が得られる。
図１３の（ｃ）に示すように粒子化工程Ｓ３を行う粒子化用流路構造体３０３は、例えばＹ字型の流路である。Ｙ字型の分岐した一方の流路３３１の上流の端は例えば流路構造体３０２の最下流の端（この例においては第４の流路２５）と連結し、そこから混合液８が供給される。他方の流路３３２の上流の端は、例えば水溶液流入口３３３を備え、そこから水溶液を流す。その結果、流路３３１と流路３３２とが合流する流路３３４内で混合液８に水溶液が混合される。その結果、脂質が粒子化し、薬剤２０２が内包された脂質粒子２００が生成し、脂質粒子２００を含む脂質粒子溶液９が得られる。
粒子化工程Ｓ３は必ずしも流路を用いて行う必要はなく、例えば容器に回収された混合液８に水溶液を添加してもよい。
このようにして、脂質粒子２００を製造することができる。
・濃縮工程Ｓ４
実施形態の脂質粒子製造方法は、必要に応じて脂質粒子溶液９を濃縮すること（濃縮工程Ｓ４）を更に含んでもよい。濃縮は、例えば脂質粒子溶液９から溶媒の一部及び／又は余った脂質と薬剤２０２とを除去することにより行われる。濃縮は、例えば限外ろ過により行うことができる。限外ろ過には、例えば細孔径２ｎｍ～１００ｎｍの限外ろ過フィルタを用いることが好ましい。例えばフィルタとしてＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５（メルク）等を用いることができる。濃縮工程Ｓ４を行うことにより純度及び濃度の高い脂質粒子溶液９を得ることができる。濃縮後の脂質粒子溶液９の脂質粒子２００の濃度は１×１０１３個/ｍＬ～５×１０１３個/ｍＬ程度であることが好ましい。しかしながら濃縮工程Ｓ４は必ずしも行う必要はない。
図１３の（ｄ）に示すように、濃縮工程Ｓ４を行う濃縮用流路構造体３０４は、流路３４１と、流路３４１の壁面に設けられたフィルタ３４２とを備える。流路３４１の上流の端は、例えば粒子化用流路構造体３０３の流路３３５と連結している。
フィルタ３４２は例えば流路３４１の一部の壁面に代えて設けられている。フィルタ３４２として上で説明した何れかの限外ろ過用のフィルタを用いることができる。
脂質粒子溶液９を流路３４１に流すことによって、残留した材料及び余分な溶媒等がフィルタ３４２を通過して流路３４１外に排出されて脂質粒子２００は流路３４１内に残り、下流へと流れることで脂質粒子溶液９が濃縮される。流路３４１の下流の端は、濃縮後の脂質粒子溶液９を回収するための排出口３４３を備えるか、又は脂質粒子溶液９を回収するためのタンクと連結されていてもよい。
濃縮工程Ｓ４は必ずしも流路を用いて行う必要はなく、例えば容器に回収された脂質粒子溶液９をフィルタでろ過してもよい。
また、実施形態の脂質粒子製造方法は、必要に応じて脂質粒子２００の品質を向上するための処理を更に行ってもよい。品質の向上とは、例えば薬剤２０２の脂質粒子２００からの漏出の防止、薬剤２０２の脂質粒子２００への内包量の向上、薬剤２０２を内包する脂質粒子２００の割合（内包率）の向上、脂質粒子２００同士の凝集の低減及び防止、及び／又は脂質粒子のサイズのばらつきの軽減等であり得る。例えば、脂質粒子溶液９を冷却する処理を行ってもよい。このような処理もまた流路を用いて行ってもよい。
以上に説明した上記の各流路は、例えばマイクロ流路である。流路内の流体の流れ、流体の流路内への注入、タンクからの流体の取り出し及び／又は脂質粒子溶液９の容器への収容等は、例えばこれらの操作が自動的に行われるように構成され及び制御されたポンプ又は押し出し機構等により行われ得る。
実施形態の脂質粒子の製造方法は、上記したように凝縮工程Ｓ１、濃縮工程Ｓ４を必ずしも行う必要はなく、少なくとも混合工程Ｓ２及び粒子化工程Ｓ３を含めばよい。
実施形態の脂質粒子の製造方法によれば、混合工程Ｓ２を実施形態の流路構造体を用いて行うため、第１溶液と第２溶液とを均一によく混合及び撹拌することができ、より高品質な脂質粒子２００を製造することが可能である。例えば、薬剤２０２の内包量の向上、脂質粒子２００の平均粒子径の低減、及び薬剤２０２が内包されている脂質粒子の割合の向上等の効果が得られ得る。
［例］
例１
図４の（ａ）に示すものと同様の流路構造体を製造した。第１の流路２の断面の幅×深さは０．３ｍｍ×０．３ｍｍとし、浅部４の深さを１／３（０．１ｍｍ）とした。第３の流路７の上流（図中向かって右側）から、図中向かって左側方向に水を流し、第２の流路３から蛍光色素を含む水を流し、流路構造体を蛍光顕微鏡で撮影した。各流路での流量は同じであり、第１の流路２の線速はレイノルズ数が５０以上となるよう設定した。
撮影した画像を図１４に示す。第１の流路２で混合領域６から数ｍｍに亘って横渦が生成することが明らかとなった。
例２
図４の（ｂ）に示すものと同様のＹ字型の流路構造体を製造した。第３の流路７及び第１の流路２は、一辺０．３ｍｍ角とした。第２の流路３は、混合領域６の直前の深さを１／３（０．１ｍｍ）とした。
第３の流路７から水を流し、第２の流路３から蛍光色素を含む水を流し、光顕微鏡で撮影した。各流路での流量は同じである。また例１で製造した流路構造体で同様に実験を行い、両者を比較した。
撮影した例１の流路構造体の画像を図１５の（ａ）に、例２の流路構造体の画像を図１５の（ｂ）に示す。例２の流路構造体では、例１の流路構造体よりも合流直後の流れの乱れが少なく、均一な混合に好ましいことが明らかとなった。
また、図４の（ｂ）の流路構造体における横渦発生をシミュレーションした。シミュレーションは、流体解析ソフトウェアであるＡＮＳＹＳ（登録商標）Ｆｌｕｅｎｔ（登録商標）を用いて行った。シミュレーション画像を図１６に示す。画像から混合領域６において横渦が発生することが明らかとなった。
例３
例２の流路構造体（合流ユニット２１）の下流に混合ユニット２２を結合して図５に示すものと同様の流路構造体を製造した。浅部以外の流路は一辺０．３ｍｍ角とし、浅部は深さを１／３（０．１ｍｍ）とした。合流ユニット２１の第２の流路３から蛍光色素を含む流体を流し、第３の流路７から水を流した。
合流ユニット２１の第１の流路２から混合ユニット２２の写真を図１７に示す。第２の浅部４ｂの直後の合流部２４ｃと、第３の浅部４ｃの直後の第４の流路２５とにおいて１ｍｍ程度に亘り横渦が観察され、そこで混合が促進されていることが明らかとなった。この結果から、混合ユニット２２を設けることにより、更に混合できることが示された。
例４
例２の流路（合流ユニット２１）の下流に３つの混合ユニット２２を直列に配置して図６の（ａ）に示すものと同様の流路構造体を製造した。浅部以外の通常流路は一辺０．３ｍｍ角とし、浅部は深さを１／３（０．１ｍｍ）とした。合流ユニットの第２の流路３からエタノールを流し、第３の流路７から水を流した。合流ユニット、第１の混合ユニットの合流部、第２の混合ユニットの合流部及び第３の混合ユニットの合流部のシュリーレン像を撮影した。
撮影した画像を図１８に示す。各ユニットの浅部の下流で横渦の発生が観察された。また、合流ユニットから第３の混合ユニットへと流れるにしたがって、水及びエタノールの屈折率の違いから観察されるムラ（白濁部）がなくなり、よく混合されることが示された。
また、同様の構成の流路構造体で、合流ユニットの一方の流路に蛍光色素を含む水、他方に水を流し、蛍光顕微鏡で撮影した。撮影した画像を図１９に示す。画像から、第１の混合ユニットから第３の混合ユニットへと流れるにしたがって、蛍光色素と水とが混ざり合う際にできる筋状の影が無くなり、均等に混合されていることが示された。
また、第１の混合ユニットの分岐点（図１９の（ａ））、第１の混合ユニットと第２の混合ユニットとを結合する流路（図１９の（ｂ））、第２の混合ユニットの分岐点（図１９の（ｃ））、第２の混合ユニットと第３の混合ユニットとを結合する流路（図１９の（ｄ））、第３の混合ユニットの分岐点（図１９の（ｅ））、第３の混合ユニットの最下流の流路（図１９の（ｆ））の蛍光強度（規格化値）を示すグラフを図２０に示し、輝度分散（規格化値）、即ち蛍光強度の平均値からの差分を二乗した値を示すグラフを図２１に示す。
図２０から、（ａ）から（ｆ）に流れるにつれて蛍光強度のバラつきが軽減されていくことが明らかとなった。
また、図２１に示す通り輝度分散は（ａ）点では約０．４６、（ｂ）点及び（ｃ）点では約０．０５、（ｄ）点及び（ｅ）点では約０．０２、（ｆ）点では約０．０５であった。これらの結果から（ａ）点から（ｆ）点に流れるにつれ、蛍光強度が平均値に近づいていくことが明らかとなった。
したがって、第１の混合ユニットから第３の混合ユニットに流れるにつれて２液が均一に混合されていくことが明らかとなった。
例５
例１～例４における浅部は、それ以外の流路の深さに対して深さを１／３に設定したが、例５においては例１と同じ形状の流路構造体について浅部の深さを１／１、１／２、１／３又は１／６に設定し、浅部の深さに対する横渦発生の依存性をシミュレーションした。
シミュレーション画像を図２２に示す。１／１において、横渦はほとんど発生しなかった。１／２では横渦の発生は非常に少なかった。１／３から顕著な横渦が発生し、さらに薄い１／６ではより強い横渦が発生した。
したがって、浅部の深さは１／２未満、好ましくは１／３以下であることが好ましいことが明らかとなった。
例６
図２３に示す流路構造体Ａ（実施例１）及び流路構造体Ｂ（実施例２）を製造し、これらの流路構造体を用いて２液混合をシミュレーションして比較した。
流路構造体Ａは、合流ユニット２１の下流に２つの混合ユニット２２が直列に配置されている。流路構造体Ａの合流ユニットの第１の流路をα１、第１の混合ユニットと第２の混合ユニットとを結合する流路をα２、第２の混合ユニットの合流後の流路（第４の流路）をα３とする。
流路構造体Ｂは、合流ユニット２１の下流に２つの混合ユニット２２が、合流ユニット及び混合ユニットの合流部において２つの流路が直角に交わるように構成されている（図９に示す流路構造と同様）。流路構造体Ｂの合流ユニットの第１の流路をβ１、第１の混合ユニットの合流部の合流後の流路をβ２、第２の混合ユニットの合流部の合流後の流路をβ３とする。また流路β１の下流の屈曲後（第１の混合ユニットの分岐部の直前）の流路をγ１、流路β２の下流の屈曲後（第２の混合ユニットの分岐部の直前）の流路をγ２、第流路β３の下流の屈曲後の流路をγ３とする。
レイノルズ数が少なくとも５０以上になる条件にしてそれぞれの合流ユニットからエタノールと水を同量で導入し、流路α１～３、β１～５、γ１～３の各位置でのエノタール濃度をシミュレーションした。結果を図２４に示す。α、β、γそれぞれでのエタノールの最大濃度は、１～３に進むにつれて混合が進み、最終的に完全に混合された濃度である約４４％に収束したが、流路構造体Ｂ（β、γ）においては、流路構造体Ａ（α）よりも明らかに早く収束した。
これは、通常流路に対して浅部付き流路を直角に合流させた場合に流れの乱れが大きくなることが一因と考えらえる。流れの乱れは攪拌の効果を期待できるため、均一性よりも攪拌の早さを求めるのであれば、流路構造体Ｂのように通常流路に対して浅部付き流路を直角に合流させる構造が望ましい。
例７
例７においては、実施形態の流路構造体を用いてＤＮＡ内包脂質粒子を製造し、脂質粒子のＤＮＡ内包量の測定した実験について説明する。
図２５に示すように、浅部を含まないＹ字の構造を有する流路構造体Ｃ（比較例１）、合流ユニットに３つの混合ユニットを直列に配置した流路構造体Ｄ（実施例３）、及び合流ユニットに６つの混合ユニットを直列に配置した流路構造体Ｅ（実施例４）を製造した。
０．１ｍｇ／ｍｌのｎＬｕｃプラスミドＤＮＡ１８０μｌを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）１６２０μｌに溶解し、ＤＮＡ溶液（第２溶液）を得た。脂質粒子材料として６種類の脂質を、ＦＦＴ１０：ＦＦＴ２０：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＤＮＧ－ＰＥＧ２０００＝３５：７０：２１：９．４：８８．５：９．４（モル比）で混合し、１８００μｌのエタノールに溶解し、脂質溶液（第１溶液）を得た。
ＤＮＡ溶液（第２溶液）及び脂質溶液（第１溶液）をそれぞれシリンジに充填し、シリンジポンプに接続した。シリンジポンプに接続した各シリンジには送液チューブを接続し、送液チューブを流路構造体Ｃ～Ｅの合流ユニットの２つの入力口にそれぞれ接続した。出力口にも送液チューブを接続し、混合された溶液を回収するチューブに接続した。その後、シリンジポンプを用いて送液し流路内で混合した。出力口から回収された流体のうち、最初の８００μｌは廃棄し、最終的にＤＮＡ－脂質混合液として２４００μｌを回収した。このＤＮＡ－脂質混合液２．４ｍｌに、７．２ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を添加し粒子化して希脂質粒子溶液を得た。９．６ｍｌの希脂質粒子溶液を、限外ろ過フィルタ （Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ１５，Ｍｅｒｃｋ社）を用いて２４０μｌになるまで遠心濃縮し、脂質粒子溶液とした。
精製水（注射用水、大塚製薬社製）８９０μｌと脂質粒子溶液１０μｌとを混合し、得られた混合液を粒子径測定専用キュベットに入れ、Ｚｅｔａｓａｉｚｅｒ（登録商標）Ｎａｎｏ ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）の粒子径測定モードで、粒子径及び多分散指数（ｐｄｉ）を測定した。次に、同希釈液について、ゼータ電位測定専用キュベットを用いてゼータ電位測定モードにて、ゼータ電位を測定した。
また、Ｑｕａｎｔ－ｉＴＴＭＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓ ＤＮＡ Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて脂質粒子溶液の脂質粒子に内包されたＤＮＡの濃度を測定した。あらかじめ脂質粒子溶液０．５μｌと１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）９９．５μｌとを混合した溶液（Ａ液）を作製した。また、脂質粒子溶液０．５μｌと１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）８４．５μｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＴＭ－Ｘ １００ １０μｌ、ヘパリン５μｌを混合し、脂質粒子からＤＮＡを溶出させた溶液（Ｂ液）を作製した。
それぞれを室温で３０分静置したのち、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液１００μｌを添加し、ＱｕａｎｔｉＦｌｏｕｒ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で蛍光量を測定した。検量線サンプルを同時に測定し、それぞれのＤＮＡ量を算出した。Ｂ液のＤＮＡ量とＡ液のＤＮＡ量との差分を脂質粒子の内包ＤＮＡ量とした。測定結果を表１に示した。
Figure 2022167074000009
浅部を持たないＹ字の流路構造体Ｃに比べて、実施形態の流路構造体Ｄ及びＥを使用することによりＤＮＡ内包量は約１９０％向上した。また、実施形態の流路構造体Ｄ及びＥを使用した場合、より平均粒子径を低減させることができ、６つの混合ユニットを有する流路構造体Ｅではより平均粒子径の小さな脂質粒子が得られた。
例８
例８においては、実施形態の流路構造体を用いてｍＲＮＡ内包脂質粒子を製造し、脂質粒子のｍＲＮＡ内包量の測定した実験について説明する。
０．１ｍｇ／ｍｌのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）をコードするｍＲＮＡ １８０μｌを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）１６２０μｌに溶解し、ｍＲＮＡ溶液（第２溶液）を得た。脂質粒子作製用に６種類の脂質を、ＦＦＴ１０：ＦＦＴ２０：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＤＮＧ－ＰＥＧ２０００＝３５：７０：２１：９．４：８８．５：９．４（モル比）で混合し、１８００μｌのエタノールに溶解し、脂質溶液を得た（第１溶液）。
ｍＲＮＡ溶液（第２溶液）及び脂質溶液（第１溶液）をそれぞれシリンジに充填し、シリンジポンプに接続した。シリンジポンプに接続した各シリンジには送液チューブを接続し、送液チューブは例７で製造した流路構造体Ｄ及びＥの２か所の入力口にそれぞれ接続した。出力口にも送液チューブを接続し、混合された溶液を回収するチューブに接続した。その後、シリンジポンプを用いて送液し流路内で混合した。出力口から回収された流体のうち、最初の８００μｌは廃棄し、最終的にｍＲＮＡ－脂質混合液として２４００μｌを回収した。このｍＲＮＡ－脂質混合液２．４ｍｌに、７．２ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を添加して粒子化し、希脂質粒子溶液を得た。９．６ｍｌの希脂質粒子溶液を、限外ろ過フィルタ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５）を用いて２４０μｌになるまで遠心濃縮し、脂質粒子溶液とした。
精製水（注射用水、大塚製薬社製）８９０μｌと脂質粒子溶液１０μｌとを混合して、粒子径測定専用キュベットに入れ、Ｚｅｔａｓａｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳＰの粒子径測定モードで、粒子径と多分散指数（ｐｄｉ）を測定した。次に、同希釈液について、ゼータ電位測定専用キュベットを用いてゼータ電位測定モードにて、ゼータ電位を測定した。結果を表２に示した。
Figure 2022167074000010
３つの混合ユニットを有する流路構造体Ｄに比べ、６つの混合ユニットを有する流路構造体Ｅによって製造された脂質粒子は、より平均粒子径が小さく、混合が更に進んだことが明らかとなった。
例９
例９においては、実施形態の流路構造体を用いて作製した脂質粒子において、ｍＲＮＡを内包する脂質粒子の存在率を測定した実験について説明する。
０．１ｍｇ／ｍｌのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）をコードするｍＲＮＡ １８０μｌを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）１６２０μｌに溶解し、ｍＲＮＡ溶液（第２溶液）を得た。脂質粒子作製用に６種類の脂質を、ＦＦＴ１０：ＦＦＴ２０：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＤＮＧ－ＰＥＧ２０００＝３５：７０：２１：９．４：８８．５：９．４（モル比）で混合し、１８００μｌのエタノールに溶解し、脂質溶液（第１溶液）を得た。
ｍＲＮＡ溶液（第２溶液）及び脂質溶液（第１溶液）をそれぞれシリンジに充填し、シリンジポンプに接続した。シリンジポンプに接続した各シリンジには送液チューブを接続し、送液チューブは例７で製造した流路構造体Ｃ～Ｅの２か所の入力口にそれぞれ接続した。出力口にも送液チューブを接続し、混合された溶液を回収するチューブに接続した。その後、シリンジポンプを用いて送液し流路内で混合した。出力口から回収された流体のうち、最初の８００μｌは廃棄し、最終的にｍＲＮＡ－脂質混合液として２４００μｌを回収した。このｍＲＮＡ－脂質混合液２．４ｍｌに、７．２ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を添加して粒子化し、希脂質粒子溶液を得た。９．６ｍｌの希脂質粒子溶液を、限外ろ過フィルタ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ１５）を用いて２４０μｌになるまで遠心濃縮し、脂質粒子溶液とした。
ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用いてｍＲＮＡを内包している脂質粒子の存在率を測定した。脂質粒子溶液１０μｌと１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）９９０μｌとを混合し希釈した。希脂質粒子溶液１０μｌにＱａｎｔｉＦｌｏｕｒ（ＲＮＡｄｙｅ）５μｌ、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）９８５μｌを混合し、ボルテックス後、３０分間遮光して室温で静置した。その後、ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００を用いて脂質粒子染色液にレーザーを照射し、側方散乱光の一定以上の強度が得られた粒子数を総脂質粒子数（Ｃ）とした。さらに同サンプルをレーザー照射により蛍光励起し、蛍光強度が一定以上の粒子数を、ｍＲＮＡが内包された内包脂質粒子数（Ｄ）とした。ＤのＣに対する割合を算出し、核酸内包脂質粒子の存在率とした。結果を表３に示した。
Figure 2022167074000011
浅部を持たない流路構造体Ｃに比べ、実施形態の流路構造体Ｄ及びＥではｍＲＮＡが内包されている脂質粒子の存在率が大きく向上することが明らかとなった。この結果は、実施形態の流路構造体Ｄ及びＥによればｍＲＮＡ溶液と脂質溶液とが均一に混合されることを示している。
例１０
合流ユニット２１の後に混合ユニット２２を多数直列に連結した流路構造体の渦発生をシミュレーションした。シミュレーション画像を図２６に示す。この画像から、各混合ユニットの浅部の下流で横渦が発生していることが明らかとなった。
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
１、１０、１１、２０、３０、３１、４０、５０、６０、１００…流路構造体、
２…第１の流路、３…第２の流路、
４、４ａ…第１の浅部、４ｂ…第２の浅部、４ｃ…第３の浅部、
７…第３の流路、８…混合液、９…脂質粒子溶液、
２１…合流ユニット、２２…混合ユニット、
２２ａ…第１の混合ユニット、
２２ｂ…第２の混合ユニット、
２２ｃ…第３の混合ユニット、
２３…第１の分岐合流路、２４…第２の分岐合流路、
２５…第４の流路、
２００…脂質粒子、２０２…薬剤。

Claims (25)

  1. 第１の流路と、前記第１の流路に合流する第２の流路とを備え、
    前記第２の流路の前記第１の流路側の端は、前記第１の流路より深さが浅い第１の領域を有する、流路構造体。
  2. 前記第１の流路及び第２の流路は、前記流路構造体内部に形成された空洞である請求項１に記載の流路構造体。
  3. 前記第１の領域の深さは、前記第１の流路の深さの１／２未満である、請求項１又は２に記載の流路構造体。
  4. 前記第２の流路は、前記第１の流路に対して直角に合流する、請求項１～３の何れか１項に記載の流路構造体。
  5. 前記第１の流路の、前記第２の流路との合流点のすぐ上流に直列に接続する第３の流路を更に備える、請求項１～４の何れか１項に記載の流路構造体。
  6. 前記第３の流路は、前記流路構造体内部に形成された空洞である請求項５に記載の流路構造体。
  7. 前記第３の流路及び前記第１の流路は一体の直線状の流路を成し、前記第２の流路は、前記第１の流路に対して直角に合流する、請求項５又は６に記載の流路構造体。
  8. 前記第２の流路と前記第３の流路とは、前記第１の流路の長軸に対して互いに対称に前記第１の流路に接続し、前記第２の流路と前記第３の流路とがなす角は直角である、請求項５又は６に記載の流路構造体。
  9. 前記第１の流路の下流の端に接続された混合ユニットを更に備え、
    前記混合ユニットは、前記第１の流路から流入する流体を２つに分岐させて２つの分流を形成し、前記２つの分流を第４の流路に合流させる第１の分岐合流路及び第２の分岐合流路を含み、
    前記第２の分岐合流路はその中間部に、その上流側及び下流側よりも深さが浅い第２の領域を有し、その下流は屈曲して前記第４の流路に合流する、
    前記第１の分岐合流路の前記第４の流路側の端は、前記第４の流路よりも深さが浅い第３の領域を有し、
    請求項１～８の何れか１項に記載の流路構造体。
  10. 前記第４の流路は、前記流路構造体内部に形成された空洞である請求項９に記載の流路構造体。
  11. 前記第２の領域の深さは、その上流側及び下流側の流路の深さの１／２未満であり、
    前記第３の領域の深さは、前記第４の流路の深さの１／２未満である、
    請求項９又は１０に記載の流路構造体。
  12. 前記第１の分岐合流路及び前記第２の分岐合流路の前記第４の流路への合流部は、前記第４の流路の長軸に対して互いに対称な角度で前記第４の流路に接続する、請求項９～１１の何れか１項に記載の流路構造体。
  13. 前記第２の分岐合流路の前記第４の流路への合流部は、前記第４の流路に直列に接続し、前記第４の流路と一体の直線の流路を成し、前記第１の分岐合流路の前記合流部は、前記第４の流路に対して直角に合流する、請求項９～１１の何れか１項に記載の流路構造体。
  14. 直列に接続された複数の前記混合ユニットを備える請求項９～１３の何れか１項に記載の流路構造体。
  15. 並列に接続された複数の前記混合ユニットを備える請求項９～１３の何れか１項に記載の流路構造体。
  16. 流路構造体を用いて流体を撹拌する方法であって、
    前記流路構造体は、第１の流路と、前記第１の流路に合流する第２の流路とを備え、前記第２の流路の前記第１の流路側の端は、前記第１の流路より深さが浅い第１の領域を有し、
    前記第２の流路から前記第１の流路に第１の流体を流すことを含む、
    流体撹拌方法。
  17. 前記第１の領域の深さは、前記第１の流路の深さの１／２未満である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記流路構造体は、前記第１の流路の、前記第２の流路との合流点のすぐ上流に直列に接続する第３の流路を更に備え、
    前記第３の流路から前記第１の流路に第２の流体を更に流すことを更に含む、
    請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 前記流路構造体は、第１の流路の下流に、混合ユニットを更に備え、
    前記混合ユニットは、前記第１の流路から流入する流体を２つに分岐させて２つの分流を形成し、前記２つの分流を第４の流路に合流させる第１の分岐合流路及び第２の分岐合流路を含み、
    前記第１の分岐合流路の前記第４の流路側の端は、前記第４の流路よりも深さが浅い第２の領域を有し、
    前記第２の分岐合流路はその中間部に、その上流側及び下流側よりも深さが浅い第３の領域を有し、その下流は屈曲して前記第４の流路に合流する、
    請求項１６～１８の何れか１項に記載の方法。
  20. 前記第２の領域の深さは、その上流側及び下流側の流路の深さの１／２未満であり、
    前記第３の領域の深さは、前記第４の流路の深さの１／２未満である、
    請求項１９に記載の方法。
  21. 前記流路構造体は、直列に接続された複数の前記混合ユニットを備える、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 前記流路構造体は、並列に接続された複数の前記混合ユニットを備える、請求項１９又は２０に記載の方法。
  23. 請求項５～１５の何れか１項に記載の流路構造体を用いて薬剤を内包する脂質粒子を製造する方法であって、
    前記第２の流路及び前記第３の流路の何れか一方から、有機溶媒中に前記脂質粒子の材料の脂質を含む第１溶液を流し、他方から水性溶媒中に前記薬剤を含む第２溶液を流して前記第１溶液と前記第２溶液とを混合し、混合液を得ること、及び
    前記混合液の前記有機溶媒の濃度を低下させることで前記脂質を粒子化して前記薬剤を内包した前記脂質粒子を生成すること
    を含む、
    脂質粒子の製造方法。
  24. 前記薬剤は核酸であり、前記第１溶液と前記第２溶液とを混合する前に、前記核酸を凝集することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記粒子化後に、前記脂質粒子を含む脂質粒子溶液を濃縮する工程を更に含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
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