JP2022157032A - Walnut protein test kit and test method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、食品中のくるみタンパク質を検出するための技術に関する。 The present invention relates to techniques for detecting walnut protein in foods.
食物アレルギーは、身体が摂取した食物に含まれる特定のタンパク質（食物アレルゲン）を異物として認識し、過敏な免疫学的機序を介して、皮膚のかゆみ、じんましん、せきなど様々な症状が引き起こされる症状であり、重症の場合は、意識の喪失、血圧低下・ショック症状など、生命にかかわる深刻なものとなる。食物アレルギーの患者は、全人口の１～２％（乳児に限定すると約１０％）になると推定されている。食物アレルギーの患者が、原因となる食物アレルゲンを含む食品、特に外観的に判別しにくい加工品を摂取しないよう、食物アレルゲンを含む原材料を食品が含む場合は、その旨を表示することが食品衛生法により義務または推奨とされている。現在、「卵、乳、小麦、えび、かに」（発症件数が多いもの）および「そば、落花生」（症状が重くなることが多く、生命に関わるもの）の７品目は、表示義務がある「特定原材料」に指定されており、「あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン、アーモンド」（過去に一定の頻度で発症が報告されたもの）の２１品目は、表示が推奨されている「特定原材料に準ずるもの」に指定されている。消費者庁（以前は厚生労働省）は、食物アレルギーの全国的な実態把握のために３年毎に調査を行っており、その結果を踏まえて特定原材料等の見直しを行っている。 In food allergies, the body recognizes specific proteins (food allergens) contained in ingested foods as foreign substances, and various symptoms such as itching of the skin, hives, and coughing are induced through hypersensitivity immunological mechanisms. It is a symptom, and in severe cases, it becomes life-threatening, such as loss of consciousness, hypotension, and shock symptoms. Food allergies are estimated to affect 1-2% of the general population (about 10% if limited to infants). In order to prevent food allergy patients from ingesting foods containing food allergens, especially processed foods that are difficult to distinguish from their appearance, it is necessary to label foods that contain raw materials that contain food allergens. Mandatory or recommended by law. At present, labeling is obligatory for 7 items: "egg, milk, wheat, shrimp, and crab" (those with many cases) and "buckwheat and peanuts" (those that often cause severe symptoms and are life-threatening). It is designated as a "specified raw material" and includes "abalone, squid, salmon roe, oranges, cashew nuts, kiwifruit, beef, walnuts, sesame, salmon, mackerel, soybeans, chicken, bananas, pork, matsutake mushrooms, peaches, yams, apples. , gelatin, and almonds” (those whose onset has been reported with a certain frequency in the past) are designated as “compliance with specified raw materials” for which labeling is recommended. The Consumer Affairs Agency (formerly the Ministry of Health, Labor and Welfare) conducts surveys every three years to grasp the nationwide situation of food allergies, and based on the results, it is reviewing specified raw materials.
上記のような食物アレルゲンに関する制度の運用のために、食品メーカーや公的な検査機関等において、食物アレルゲンを含む食品が加工品中に原材料として含まれていないか、キット等を使用して検査されている。近年、「くるみ」に対してアレルギーをもつ患者が急速に増加してきており、くるみを特定原材料（表示義務あり）の品目に追加することが検討されていることから、加工品中のくるみを検出することのできるキットを早急に開発する必要性が高まっている。 In order to operate the system related to food allergens as described above, food manufacturers, public inspection institutions, etc. use kits to check whether foods containing food allergens are included as raw materials in processed products. It is In recent years, there has been a rapid increase in the number of patients with allergies to walnuts. There is an urgent need to develop a kit that can
加工品中に含まれる特定原材料等の検出技術としては、一般的に、スクリーニング検査として抗原抗体反応を用いたＥＬＩＳＡ法、および確定検査としてＤＮＡの増幅反応を用いたＰＣＲ法が存在している。このうちＥＬＩＳＡ法は、くるみ特有のタンパク質を認識する抗体を用いることで、加工品中にくるみが原材料として含まれているかどうかを検査する。 ELISA methods using antigen-antibody reactions as screening tests and PCR methods using DNA amplification reactions are generally used as techniques for detecting specific raw materials contained in processed products. Among these methods, the ELISA method uses an antibody that recognizes walnut-specific proteins to test whether walnuts are included as raw materials in processed products.
抗原抗体反応に基づく検出の標的とするくるみ特有のタンパク質としては、くるみアレルギーの主な原因である、くるみアレルゲンＪｕｇ ｒ １～８が第一候補となる。そのようなくるみ特有のタンパク質を対象として、抗原抗体反応により食品中の「くるみ」を検出するための手段としては、例えば、くるみアレルゲンＪｕｇ ｒ １（２Ｓ－アルブミン）タンパク質を標的とするポリクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡにより検出する方法およびそのためのキットが提案されている（非特許文献１）。また、くるみ以外の特定原材料等を検出するための手段としては、例えば、大豆アレルゲン（Gly m Bd 30Kタンパク質）の未変性物に対するポリクローナル抗体と、加熱変性物に対するポリクローナル抗体とを併用して、食品中の「大豆」を検出する方法が提案されている（特許文献１）。 Walnut allergens Jug r 1-8, which are the main causes of walnut allergy, are the first candidates for walnut-specific proteins to be targeted for detection based on antigen-antibody reaction. As a means for detecting "walnuts" in foods by antigen-antibody reaction targeting such walnut-specific proteins, for example, a polyclonal antibody targeting the walnut allergen Jug r 1 (2S-albumin) protein is used. A method for detection by ELISA and a kit therefor have been proposed (Non-Patent Document 1). In addition, as a means for detecting specific raw materials other than walnuts, for example, polyclonal antibodies against undenatured soybean allergen (Gly m Bd 30K protein) and polyclonal antibodies against heat-denatured soybean allergen are used in combination to A method for detecting "soybean" inside has been proposed (Patent Document 1).
食品中に原材料としてくるみが含まれているかを検査するためのスクリーニング検査としては、くるみアレルゲンの一つ、Ｊｕｇ ｒ １タンパク質を検出対象とする検査方法や検査キットしか、これまでに実用化されていない。また、くるみに含まれるタンパク質のうち、くるみアレルゲン以外のタンパク質を対象として、食品中のくるみを検出するための手段も、これまでに実用化されていない。なお、食品からくるみアレルゲン以外のくるみタンパク質が検出されれば、その食品の原材料にはくるみが含まれており、自ずとくるみアレルゲンも含まれている蓋然性が高い（くるみアレルギーを発症するおそれがある）といえる。
As a screening test to check whether walnuts are contained as raw materials in foods, only test methods and test kits for detecting
本発明は、食品中のくるみタンパク質を検出するための新たな手段を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a new means for detecting walnut protein in foods.
本発明者らは、これまで活用されていなかったくるみに含まれる２種類のタンパク質（以下「本発明のくるみタンパク質」と総称する。）を、それらのタンパク質に対する抗体（以下「本発明の抗体」と総称する。）を作製して利用することで、食品中に原材料としてくるみが含まれているかを検査できることを見出した。本発明により見出された第１のくるみタンパク質は「legmin B like protein」であり、第２のくるみタンパク質は「Ｊｕｇ ｒ ６」（ビシリン）である。それらのタンパク質と特異的に結合する本発明の抗体は、特定原材料（表示義務のある７品目）に対する交差反応性が低く（つまり、上記２種の本発明のくるみタンパク質に対する特異性が高く）、かつ加工品中から抽出した、一定程度変性している本発明の標的タンパク質にも反応することができることから、食品が原材料としてくるみを含むかを検査するための手段として好適なものとなることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors discovered two types of proteins contained in walnuts that have not been utilized so far (hereinafter collectively referred to as "walnut proteins of the present invention"), antibodies against these proteins (hereinafter "antibodies of the present invention"). (collectively referred to as )), it was found that it is possible to inspect whether walnuts are contained as a raw material in foods. The first walnut protein discovered by the present invention is "legmin B like protein" and the second walnut protein is "Jug r 6" (vicillin). The antibodies of the present invention that specifically bind to these proteins have low cross-reactivity to specific raw materials (7 items that must be labeled) (that is, have high specificity to the above two types of walnut proteins of the present invention), Moreover, since it can also react with the target protein of the present invention that has been extracted from the processed product and has been denatured to a certain degree, it is expected that it will be suitable as a means for inspecting whether a food contains walnuts as a raw material. This led to the completion of the present invention.
すなわち、本発明は一側面において、下記の発明を提供する。
［１］
（Ａ）legmin B like protein（以下「第１くるみタンパク質」と呼ぶ。）および／またはＪｕｇ ｒ ６（以下「第２くるみタンパク質」と呼ぶ。）を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための、第１くるみタンパク質に対して特異的な抗体（以下「第１抗体」と呼ぶ。）および／または第２くるみタンパク質に対して特異的な抗体（以下「第２抗体」と呼ぶ。）と、（Ｂ）抽出用試薬とを含む、食品中のくるみタンパク質の検査用キット。
［２］
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡであり、前記第１抗体等および／または第２抗体等が、固相化用の第１抗体等および／または第２抗体等と、酵素標識用の第１抗体等および／または第２抗体等とを含む、項１に記載の検査用キット。
［３］
前記免疫学的測定法がイムノクロマトグラフィーであり、前記第１抗体等および／または第２抗体等が、発色標識用の第１抗体等および／または第２抗体等を含む、項１に記載の検査用キット。
［４］
前記抽出用試薬が、界面活性剤としてアルキル硫酸塩を含む、項１～３のいずれか一項に記載の検査用キット。
［５］
前記抽出用試薬が、還元剤として、メルカプトアルカノールおよび／または亜硫酸塩を含む、項１～４のいずれか一項に記載の検査用キット。
［６］
前記抽出が振盪法または高速剪断・撹拌処理法により行われる、項１～５のいずれか一項に記載の検査用キット。
［７］
（１）食品中の第１くるみタンパク質および／または第２くるみタンパク質を抽出する工程、および
（２）第１くるみタンパク質に対して特異的な第１抗体等および／または第２くるみタンパク質に対して特異的な第２抗体等を用いた免疫学的測定法により、第１くるみタンパク質および／または第２くるみタンパク質を定量的または定性的に検出する工程
を含む、食品中のくるみタンパク質の検査方法。
［８］
前記免疫学的測定法がＥＬＩＳＡであり、前記第１抗体等および／または第２抗体等が、固相化用の第１抗体等および／または第２抗体等と、酵素標識用の第１抗体等および／または第２抗体等とを含む、項７に記載の検査方法。
［９］
前記免疫学的測定法がイムノクロマトグラフィーであり、前記第１抗体等および／または第２抗体等が、発色標識用の第１抗体等および／または第２抗体等を含む、項７に記載の検査方法。
［１０］
前記工程（１）および（２）の間に、抽出された第１くるみタンパク質および／または第２くるみタンパク質を精製する工程をさらに含む、項７～９のいずれか一項に記載の検査方法。
［１１］
前記抽出用試薬が、界面活性剤としてアルキル硫酸塩を含む、項７～１０のいずれか一項に記載の検査方法。
［１２］
前記抽出用試薬が、還元剤として、メルカプトアルカノールおよび／または亜硫酸塩を含む、項７～１１のいずれか一項に記載の検査方法。
［１３］
前記抽出が振盪法により行われる、項７～１２のいずれか一項に記載の検査方法。
Specifically, in one aspect, the present invention provides the following inventions.
[1]
(A) legmin B like protein (hereinafter referred to as "first walnut protein") and/or Jug r 6 (hereinafter referred to as "second walnut protein") is quantitatively or qualitatively determined by immunoassay An antibody specific for the first walnut protein (hereinafter referred to as "first antibody") and/or an antibody specific for the second walnut protein (hereinafter referred to as "second antibody") for detection .) and (B) an extraction reagent.
[2]
The immunoassay method is ELISA, and the first antibody etc. and/or the second antibody etc. are the first antibody etc. and/or the second antibody etc. for immobilization and the first antibody for enzyme labeling.
[3]
[4]
[5]
[6]
Item 6. The test kit according to any one of
[7]
(1) extracting the first walnut protein and/or the second walnut protein in the food; and (2) a first antibody or the like specific for the first walnut protein and/or for the second walnut protein. A method for testing walnut protein in food, comprising the step of quantitatively or qualitatively detecting the first walnut protein and/or the second walnut protein by immunoassay using a specific second antibody or the like.
[8]
The immunoassay method is ELISA, and the first antibody etc. and/or the second antibody etc. are the first antibody etc. and/or the second antibody etc. for immobilization and the first antibody for enzyme labeling. Item 8. The test method according to Item 7, which includes, etc. and/or a second antibody, etc.
[9]
Item 8. The test according to item 7, wherein the immunoassay method is immunochromatography, and the first antibody etc. and/or the second antibody etc. comprises a first antibody etc. and/or a second antibody etc. for a chromogenic label. Method.
[10]
[11]
Item 11. The inspection method according to any one of Items 7 to 10, wherein the extraction reagent contains an alkyl sulfate as a surfactant.
[12]
Item 12. The test method according to any one of Items 7 to 11, wherein the extraction reagent contains a mercaptoalkanol and/or a sulfite as a reducing agent.
[13]
Item 13. The inspection method according to any one of Items 7 to 12, wherein the extraction is performed by a shaking method.
なお、当業者であれば、本発明の技術的思想、本明細書の記載事項および技術常識に基づき、上記の各項に記載の発明に関する事項を、他のカテゴリーの発明に関する事項に変換する（読み替える）ことが可能である。 A person skilled in the art can convert the matters related to the invention described in each of the above items into matters related to the invention of other categories based on the technical idea of the present invention, the matters described in the specification and common general technical knowledge ( It is possible to change the reading).
本発明により、新たな標的タンパク質を検出対象に加えて、食品中にくるみが含まれているかを検査することが可能となる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to test whether walnuts are contained in food by adding a new target protein to the detection target.
―検査用キット―
本発明の「検査用キット」は、食品中のくるみタンパク質を検査するためのキットであって、（Ａ）第１くるみタンパク質および／または第２くるみタンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するための、第１くるみタンパク質に対して特異的な第１抗体等および／または第２くるみタンパク質に対して特異的な第２抗体等と、（Ｂ）抽出用試薬とを含む。以下、第１くるみタンパク質および第２くるみタンパク質を「第１／第２くるみタンパク質」と総称し、第１くるみタンパク質に対して特異的な第１抗体等および第２くるみタンパク質に対して特異的な第２抗体等を「第１／第２抗体等」と総称する。
―Examination kit―
The "test kit" of the present invention is a kit for testing walnut protein in food, comprising: (A) the first walnut protein and/or the second walnut protein quantitatively or qualitatively by an immunoassay; a first antibody, etc., specific for the first walnut protein and/or a second antibody, etc., specific for the second walnut protein for specific detection; and (B) an extraction reagent. Hereinafter, the first walnut protein and the second walnut protein are collectively referred to as "first/second walnut protein", and the first antibody specific to the first walnut protein and the like and the second walnut protein specific The second antibody etc. are collectively referred to as "first/second antibody etc.".
（Ａ）第１／第２抗体等（第１／第２くるみタンパク質）
本発明において、「第１くるみタンパク質」とは、「legmin B like protein」を指し、「第２くるみタンパク質」とは、「Ｊｕｇ ｒ ６」（ビシリン）を指す。本発明において、「第１抗体等」とは、第１くるみタンパク質に対して特異的な抗体（抗legmin B like protein抗体）またはその抗原結合性断片を指し、「第２抗体等」とは、第２くるみタンパク質に対して特異的な抗体（抗Ｊｕｇ ｒ ６抗体）またはその抗原結合性断片を指す。「抗原結合性断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ
、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディー（二重特異性抗体）、ナノボディーなどが挙げられる。本明細書中の「第１くるみタンパク質」および「第２くるみタンパク質」は、それぞれ「legmin B like protein」および「Ｊｕｇ ｒ ６」に読み替えることができる。また、特に断らない限り、本明細書における「抗体」を「抗原結合性断片」または「抗体等」に読み替える、つまり「抗体」を用いる実施形態を「抗原結合性断片」または「抗体等」を用いる実施形態に置き換えることができる。
(A) Primary/secondary antibodies, etc. (first/secondary walnut proteins)
In the present invention, "first walnut protein" refers to "legmin B like protein" and "second walnut protein" refers to "Jug r 6" (vicillin). In the present invention, the "first antibody, etc." refers to an antibody specific to the first walnut protein (anti-legmin B like protein antibody) or an antigen-binding fragment thereof, and the "second antibody, etc." Refers to an antibody specific for the second walnut protein (anti-Jug r 6 antibody) or an antigen-binding fragment thereof. Examples of "antigen-binding fragments" include Fab, Fab', F(ab')2, Fv
, scFv, dsFv, diabodies (bispecific antibodies), nanobodies and the like. The terms "first walnut protein" and "second walnut protein" herein can be read as "legmin B like protein" and "Jug r 6", respectively. In addition, unless otherwise specified, "antibody" in the present specification should be read as "antigen-binding fragment" or "antibody etc." It can be replaced by the embodiment used.
本発明の検査用キットにおいて、第１抗体等および第２抗体等は、いずれか一方を使用してもよいし、両方を使用してもよい。例えば、後述するような実施形態の免疫学的測定法において、第１／第２くるみタンパク質を捕捉するための抗体（ＥＬＩＳＡにおける固相化用第１／第２抗体等、イムノクロマトグラフィーにおける固定化用第１／第２抗体等、以下「捕捉用抗体等」と総称する。）として、第１抗体等または第２抗体等のいずれかを使用して、それぞれ第１くるみタンパク質または第２くるみタンパク質のいずれかを捕捉し、検出するようにしてもよいし、第１抗体等および第２抗体等を併用して、第１くるみタンパク質または第２くるみタンパク質の両方を捕捉し、検出するようにしてもよい。また、捕捉用抗体等として、第１抗体等または第２抗体等のいずれかを使用した場合は、捕捉された第１くるみタンパク質または第２くるみタンパク質を検出するための抗体等（ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用第１／第２抗体等、イムノクロマトグラフィーにおける発色標識用第１／第２抗体等、以下「検出用抗体等」と総称する。）としても、それぞれ第１抗体等または第２抗体等のいずれかを使用すればよい。捕捉用抗体等として、第１抗体等および第２抗体等の併用した場合は、検出用抗体等としても、第１抗体等および第２抗体等を併用すればよい。 In the test kit of the present invention, either one or both of the first antibody and the like and the second antibody and the like may be used. For example, in the immunoassay method of the embodiments described later, antibodies for capturing the first/second walnut proteins (first/second antibodies for immobilization in ELISA, etc., immobilization in immunochromatography As the first/second antibodies, etc., hereinafter collectively referred to as "capturing antibodies, etc."), either the first antibody, etc. or the second antibody, etc. is used to capture the first or second walnut protein, respectively. Either of them may be captured and detected, or both the first and second walnut proteins may be captured and detected by using a combination of the first antibody and the like and the second antibody and the like. good. In addition, when either the first antibody or the like or the second antibody or the like is used as the capturing antibody or the like, an antibody or the like for detecting the captured first or second walnut protein (enzyme labeling in ELISA first/second antibodies, etc. for immunochromatography, first/second antibodies, etc. for chromogenic labeling in immunochromatography, hereinafter collectively referred to as "detection antibodies, etc."), either the first antibody, etc. or the second antibody, etc. or should be used. When the first antibody or the like and the second antibody or the like are used together as the capture antibody or the like, the first antibody or the like and the second antibody or the like may be used together as the detection antibody or the like.
「第１くるみタンパク質」は、くるみまたはくるみを原材料に含む加工品に含まれ、（Ａ１１）界面活性剤を含む抽出用試薬を用いた抽出およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により約３０ｋＤａのタンパク質として単離可能なタンパク質、あるいは（Ａ１２）界面活性剤および還元剤を含む抽出用試薬を用いた抽出およびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより約１９ｋＤａのタンパク質として単離可能なタンパク質である。第１くるみタンパク質（Ａ１２）は、第１くるみタンパク質（Ａ１１）に含まれるＳＳ結合が還元剤により切断され、断片化することにより生じたタンパク質であると推定される。第１くるみタンパク質（Ａ１２）も、断片化される前の、第１くるみタンパク質（Ａ１１）の一部を構成している状態で、くるみまたはくるみを原材料に含む加工品に含まれていると解する。 The "first walnut protein" is contained in walnuts or processed products containing walnuts as a raw material, and (A11) extracts with an extraction reagent containing a surfactant and SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protein that is isolatable as a 30 kDa protein, or (A12) a protein that is isolatable as a protein of about 19 kDa by extraction and SDS-PAGE using an extraction reagent containing a detergent and a reducing agent. The first walnut protein (A12) is presumed to be a protein produced by cleavage of the SS bond contained in the first walnut protein (A11) with a reducing agent and fragmentation. It is understood that the first walnut protein (A12) is also contained in walnuts or processed products containing walnuts as a raw material in a state that constitutes a part of the first walnut protein (A11) before being fragmented. do.
「第２くるみタンパク質」は、くるみまたはくるみを原材料に含む加工品に含まれ、界面活性剤を含む抽出用試薬を用いた抽出およびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより約５０ｋＤａのタンパク質として単離可能なタンパク質である。 The "second walnut protein" is contained in walnuts or processed products containing walnuts as a raw material, and is a protein that can be isolated as a protein of about 50 kDa by extraction using an extraction reagent containing a surfactant and SDS-PAGE. .
なお、「第１／第２くるみタンパク質」自体の定義との関係で上述した「抽出用試薬」としては、本発明の検査用キットに含まれる抽出用試薬（Ｂ）と同じもの、例えば同じ界面活性剤および／または還元剤を含む実施形態のものとすることができる。抽出用試薬（Ｂ）、界面活性剤、還元剤等の詳細は後述する。 In relation to the definition of the "first/second walnut protein" itself, the "extraction reagent" mentioned above is the same as the extraction reagent (B) contained in the test kit of the present invention, for example, the same interface Embodiments can include an activator and/or a reducing agent. The details of the extraction reagent (B), the surfactant, the reducing agent, etc. will be described later.
第１／第２抗体等は、その用途に応じて必要な特異性でもって、第１／第２くるみタンパク質を認識して結合できる抗体またはその抗原結合性断片であればよい。第１／第２抗体等は、食品に含まれる各種のタンパク質およびくるみ以外の食物アレルゲンと結合しないこと（少なくとも、本発明の検査方法による結果に影響しない程度の結合に留まること）が好ましいが、用途や程度に応じて、第１／第２くるみタンパク質以外のタンパク質と一定程度結合する（交差反応する）ことや、抗体の性質上不可避的なタンパク質またはその他の物質に対して非特異的に吸着することは許容される。 The first/second antibody or the like may be an antibody or an antigen-binding fragment thereof capable of recognizing and binding to the first/second walnut protein with the necessary specificity according to its use. It is preferable that the first/second antibody and the like do not bind to various proteins contained in foods and food allergens other than walnuts (at least, binding to the extent that the results of the test method of the present invention are not affected), Depending on the application and degree, binding (cross-reacting) with proteins other than primary/secondary walnut proteins to some extent, or non-specific adsorption to proteins or other substances that are unavoidable due to the nature of antibodies is allowed.
第１／第２抗体は、検査用キットの用途や実施形態に応じて、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とでは、特異性（第１／第２くるみタンパク質のみに反応し、それ以外のタンパク質とは反応（交差）しないか）、再現性（製造ロットにより検査結果に差が生じないか）、安定性（キットにおける抗体の固相化処理、標識処理等により、抗原への結合性が失われないか）などが異なるため、検査用キットの用途や実施形態によっては好ましい抗体が変動する場合もあるので、そのことを考慮してポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のどちらを用いるか、またはその両方を組み合わせて用いるかを選択することができる。 The first/second antibodies may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, depending on the application and embodiment of the test kit. For polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, specificity (whether it reacts only with the first and second walnut proteins and does not react (cross) with other proteins), reproducibility (there is no difference in test results depending on the production lot) ), stability (whether the binding to the antigen is lost due to immobilization treatment, labeling treatment, etc. of the antibody in the kit), etc. In consideration of this, it is possible to select whether to use a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, or to use a combination of both.
本発明の一実施形態において、検査用キットは、第１／第２抗体としてポリクローナル抗体を含む。加工食品等の食品に由来する第１／第２くるみタンパク質は、製造過程や保存過程により、また食品から抽出する際に可溶化剤が添加された抽出用試薬を用いた場合はその抽出工程により、一定程度変性した第１／第２くるみタンパク質になっている、また様々な変性第１／第２くるみタンパク質を含む混合物になっていると考えられる。そのような変性第１／第２くるみタンパク質は、変性していない天然の第１／第２くるみタンパク質とは異なる部位（アミノ酸配列）もエピトープとなっている可能性がある。検査用キットが含む第１／第２抗体をモノクローナル抗体とした場合は、加工食品等の食品に含まれる変性第１／第２くるみタンパク質のうち一部のものとしか反応せず、くるみタンパク質の検出感度が不十分なものとなるおそれがある。したがって、多様なエピトープに対応したポリクローナル抗体を用いることにより、加工品等の様々な食品に含まれる変性第１／第２くるみタンパク質に対して一定の検出感度を有する（食品によって検出感度が低下することを防止できる）検査用キットを製造することができる。 In one embodiment of the present invention, the test kit contains polyclonal antibodies as primary/secondary antibodies. The first and second walnut proteins derived from foods such as processed foods are affected by the manufacturing process and storage process, and by the extraction process when using an extraction reagent to which a solubilizer is added when extracting from the food. , to a certain degree of denatured primary/secondary walnut protein, and to mixtures containing various denatured primary/secondary walnut proteins. Such denatured primary/secondary walnut proteins may also have epitopes at sites (amino acid sequences) that differ from those of undenatured natural primary/secondary walnut proteins. When the first/second antibody contained in the test kit is a monoclonal antibody, it reacts only with some of the denatured first/second walnut proteins contained in foods such as processed foods, and does not react with walnut proteins. Detection sensitivity may be insufficient. Therefore, by using polyclonal antibodies that correspond to various epitopes, it has a certain detection sensitivity for denatured primary/secondary walnut proteins contained in various foods such as processed foods (detection sensitivity decreases depending on the food). It is possible to manufacture a test kit that can prevent this.
本発明の一実施形態において、検出用キットは、第１／第２抗体として、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。例えば、後述するような実施形態の免疫学的測定法において、第１／第２くるみタンパク質に対する捕捉用抗体（ＥＬＩＳＡにおける固相化用第１／第２抗体、イムノクロマトグラフィーにおける固定化用第１／第２抗体）としてモノクローナル抗体を使用し、捕捉された第１／第２くるみタンパク質に対する検出用抗体（ＥＬＩＳＡにおける酵素標識用第１／第２抗体、イムノクロマトグラフィーにおける金コロイド標識用もしくはラテックス粒子標識用第１／第２抗体）としてポリクローナル抗体を使用することができる。捕捉用抗体としてモノクローナル抗体を用いることで第１／第２くるみタンパク質に対する特異性を高め、検出用抗体としてポリクローナル抗体を用いることで捕捉した第１／第２くるみタンパク質を高感度で検出することができる。 In one embodiment of the invention, the detection kit contains both polyclonal and monoclonal antibodies as primary/secondary antibodies. For example, in the immunoassay method of the embodiment as described later, capture antibodies against the first/second walnut proteins (first/second antibodies for immobilization in ELISA, first/second antibodies for immobilization in immunochromatography) Using a monoclonal antibody as the secondary antibody), the detection antibody against the captured primary/secondary walnut protein (primary/secondary antibody for enzyme labeling in ELISA, colloidal gold labeling or latex particle labeling in immunochromatography) Polyclonal antibodies can be used as primary/secondary antibodies). By using a monoclonal antibody as a capturing antibody, the specificity for the first/second walnut proteins is increased, and by using a polyclonal antibody as a detecting antibody, the captured first/second walnut proteins can be detected with high sensitivity. can.
第１／第２抗体は、第１／第２くるみタンパク質を免疫学的測定法により定量的または定性的に検出するのに適した形態のものとする、例えば各種の修飾をしたり、改変をしたりすること、特に抗原結合断片とすることができる。 The first/second antibody is in a form suitable for quantitatively or qualitatively detecting the first/second walnut protein by immunoassay, for example, various modifications or alterations or, in particular, an antigen-binding fragment.
「免疫学的測定法」は、第１／第２くるみタンパク質と第１／第２抗体等との反応を利用することにより、第１／第２くるみタンパク質を定量的または定性的に検出することを可能とする方法であればとくに限定されず、公知の様々な方法を利用することができる。また、各種の免疫学的測定法に対応した検査用キットも公知で、市販もされており、本発明の検査用キットも、抽出用試薬として本発明の特定のものを使用するよう変更すること以外は、公知の検査用キットに準じて製造することができる。 "Immunological assay" is to quantitatively or qualitatively detect the first/second walnut protein by utilizing the reaction between the first/second walnut protein and the first/second antibody, etc. It is not particularly limited as long as it is a method that enables, and various known methods can be used. In addition, test kits compatible with various immunoassay methods are known and commercially available, and the test kit of the present invention can also be modified to use the specific one of the present invention as an extraction reagent. Other than that, it can be manufactured according to a known test kit.
本発明の一実施形態において、免疫学的測定法は、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay、エライザ法）である。ＥＬＩＳＡは、各種のタンパク質を高い精度で定量的に検出することが可能で、加熱等した加工品から食物アレルゲンを検出するために好適な測定法であり、消費者庁ガイドラインに準拠している。 In one embodiment of the present invention, the immunological assay is ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). ELISA can quantitatively detect various proteins with high accuracy, is a suitable measurement method for detecting food allergens from processed products that have been heated, etc., and complies with the guidelines of the Consumer Affairs Agency.
ＥＬＩＳＡ用の第１／第２抗体等は、例えば、固相化用の第１／第２抗体等および酵素標識用の第１／第２抗体等を含む。固相化用の第１／第２抗体等は、ＥＬＩＳＡを行う部材の表面、例えばプレート（ウェル）の底部に固相化するためのものである。酵素標識用の第１／第２抗体等は、固相化された抗体に補足された第１／第２くるみタンパク質に結合し、その後基質と反応することで、第１／第２くるみタンパク質の量に応じた強度で発色させるためのものである。酵素標識用の第１／第２抗体等は、直接的に酵素で標識された第１／第２抗体等、すなわち抗体等自体に共有結合により（例えばリンカーを介して）あらかじめ酵素が結合している第１／第２抗体等であってもよいが、間接的に酵素で標識されることとなる第１／第２抗体等、例えば「検査方法」との関係で後述する手順に例示した、ストレプトアビジンと結合した酵素とさらに反応することによって酵素標識された第１／第２抗体等を完成させることができる、ビオチンが結合した第１／第２抗体等のようなものであってもよい。 The first/second antibodies etc. for ELISA include, for example, first/second antibodies etc. for immobilization and first/second antibodies etc. for enzyme labeling. The first/second antibodies for immobilization are intended to be immobilized on the surface of the member on which ELISA is performed, such as the bottom of a plate (well). The first/second antibodies for enzymatic labeling bind to the first/second walnut proteins captured by the immobilized antibodies, and then react with the substrate to produce the first/second walnut proteins. It is for coloring with intensity according to the amount. The first/second antibody or the like for enzyme labeling is a first/second antibody or the like that is directly labeled with an enzyme, that is, the antibody or the like itself is covalently bound to the enzyme (for example, via a linker) in advance. It may be a first/second antibody etc. that are labeled with an enzyme indirectly, such as a first/second antibody etc. Such as biotin-conjugated primary/secondary antibodies, etc., which can be further reacted with streptavidin-conjugated enzymes to complete enzyme-labeled primary/secondary antibodies, etc. .
本発明の一実施形態において、免疫学的測定法はイムノクロマトグラフィー（immunochromatography、イムノクロマト法）である。イムノクロマトグラフィーは、簡便な操作により、比較的短時間で、各種のタンパク質を定性的に検出することができる測定法である。 In one embodiment of the invention, the immunoassay is immunochromatography. Immunochromatography is a measurement method capable of qualitatively detecting various proteins in a relatively short period of time with simple operations.
イムノクロマトグラフィー用の第１／第２抗体等は、例えば、固定化用の第１／第２抗体等および発色標識（例、金コロイド標識、ラテックス粒子標識、白金粒子標識）用の第１／第２抗体等を含む。発色標識用の第１／第２抗体等は、一般的に、テストストリップの所定の位置（試料滴下部）に含ませる、あらかじめ発色標識と結合している第１／第２抗体等であり、第１／第２くるみタンパク質と複合体を形成した状態で固定化抗体等に捕捉された後、基質と反応することで、標的タンパク質の存在を示すよう発色させるための抗体である。固定化用の第１／第２抗体等は、一般的に、テストストリップの所定の位置（テストライン）に含ませる第１／第２抗体等であり、毛細管現象により移動してきた第１／第２くるみタンパク質と発色標識用の第１／第２抗体等との複合体を捕捉するための抗体である。
The first/second antibodies and the like for immunochromatography are, for example, the first/second antibodies and the like for immobilization and the first/second antibodies for chromogenic labels (e.g., colloidal gold labels, latex particle labels, platinum particle labels). 2 antibodies, etc. The first/second antibody or the like for the color-developing label is generally a first/second antibody or the like that is preliminarily bound to the color-developing label and is contained in a predetermined position (sample drop portion) of the test strip, After being captured by an immobilized antibody or the like in a state of forming a complex with the first/second walnut protein, the antibody reacts with a substrate to develop a color indicating the presence of the target protein. The first/second antibody etc. for immobilization is generally the first/second antibody etc. contained in a predetermined position (test line) of the test strip, and the first/second antibody etc. which has migrated due to capillary action. It is an antibody for capturing a complex of
本発明の検査用キットは、少なくとも本発明の抽出用試薬および第１／第２抗体等を含むが、必要により、実施形態に応じた、その他の試薬、部材等の任意の内容物を含むことができる。ＥＬＩＳＡ用のキットであれば、例えば、ウェルを備えたプレート、標的タンパク質の溶液を調製するための希釈液、各工程を行った後にプレート（ウェル）を洗浄するための洗浄液、ＥＬＩＳＡにおける酵素反応停止液、抽出されたタンパク質を分解から保護するためのＢＳＡＥＬＩＳＡによる検査方法の手順を記載した取扱説明書などが、本発明の抽出用試薬および第１／第２抗体等とともに、キットの内容物に含めることができる。イムノクロマトグラフィー用のキットであれば、例えば、毛細管現象により各種の溶液および試薬を展開させることができるテストストリップ、標的タンパク質の溶液を調製するための希釈液、イムノクロマトグラフィーによる検査方法の手順を記載した取扱説明書などが、本発明の抽出用試薬および第１／第２抗体等とともに、キットの内容物に含めることができる。 The test kit of the present invention contains at least the extraction reagent and the first/second antibodies of the present invention, but if necessary, it may contain other optional contents such as other reagents and members according to the embodiment. can be done. In the case of an ELISA kit, for example, a plate with wells, a diluent for preparing a target protein solution, a washing solution for washing the plate (well) after each step, and an enzymatic reaction stop in ELISA The contents of the kit include the extraction reagents and the first/second antibodies of the present invention, etc. be able to. In the case of immunochromatographic kits, for example, test strips that can develop various solutions and reagents by capillary action, diluents for preparing target protein solutions, and procedures for testing methods by immunochromatography are described. Instruction manuals and the like can be included in the contents of the kit along with the extraction reagents, first/second antibodies, etc. of the present invention.
本発明のキットは、必要に応じて、第１／第２抗体等以外の抗体等を含むことができる。例えば、本発明のキットは、上述したような捕捉用抗体等および検出用抗体等として、第１／第２くるみタンパク質以外のタンパク質を標的とする抗体等、例えばくるみアレルゲンタンパク質を標的とする抗体等や、くるみアレルゲンタンパク質以外のタンパク質であって第１／第２くるみタンパク質とは異なるタンパク質を標的とする抗体等を、さらに含んでいてもよい。 The kit of the present invention can contain antibodies and the like other than the first/second antibodies and the like, if necessary. For example, in the kit of the present invention, antibodies targeting proteins other than the first/second walnut proteins, such as antibodies targeting walnut allergen proteins, etc., can be used as the capturing antibody and the like and the detecting antibodies and the like as described above. Alternatively, an antibody or the like that targets a protein other than the walnut allergen protein that is different from the first/second walnut proteins may be further included.
（Ｂ）抽出用試薬
本発明における「抽出用試薬」は、食品中の各種のタンパク質を抽出するために一般的に用いられている試薬（溶液）を指す。抽出用試薬は、各種の食物アレルゲンを抽出するために一般的に用いられており、また各種の抽出用試薬が公知となっており、本発明でもそれらと同様の抽出用試薬を用いることができる。
(B) Extraction Reagent The “extraction reagent” in the present invention refers to a reagent (solution) generally used for extracting various proteins in foods. Extraction reagents are commonly used to extract various food allergens, and various extraction reagents are known, and the same extraction reagents as those can be used in the present invention. .
抽出用試薬は一般的に、適切なｐＨを有する緩衝液に、食品中の各種のタンパク質を抽出するための剤として「可溶化剤」を添加することにより調製される溶液である。 An extraction reagent is generally a solution prepared by adding a "solubilizing agent" as an agent for extracting various proteins in foods to a buffer solution having an appropriate pH.
抽出用試薬を調製するための緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＥＤＴＡ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液が挙げられる。本発明における緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液およびリン酸緩衝液が好ましい。緩衝液のｐＨは、一般的には４．５～８．０（生体内で起こりうる範囲のｐＨ）、例えば６．０～８．０である。当業者であれば、適切な化合物を適量用いる（複数の化合物を、それぞれ適量、水に添加して溶解する）ことにより、所望の濃度の、所望のｐＨを有する緩衝液を調製することができる。 Buffers for preparing the extraction reagent include, for example, Tris buffer, phosphate buffer, citrate buffer, EDTA buffer, HEPES buffer, and acetate buffer. Preferred buffers in the present invention are, for example, Tris buffers and phosphate buffers. The pH of the buffer solution is generally 4.5 to 8.0 (the range of pH that can occur in vivo), for example 6.0 to 8.0. A person skilled in the art can prepare a buffer solution having a desired concentration and a desired pH by using an appropriate amount of an appropriate compound (adding an appropriate amount of each of a plurality of compounds to water and dissolving them). .
抽出用試薬を調製するための可溶化剤としては、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤および還元剤が挙げられる。抽出用試薬は、いずれか１つの種類を単独で含んでいてもよいし、複数の種類を組み合わせて含んでいてもよい。 Solubilizing agents for preparing extraction reagents include, for example, surfactants, chaotropic agents and reducing agents. The extraction reagent may contain any one type alone, or may contain a combination of a plurality of types.
界面活性剤としては、例えば、陰イオン性（アニオン性）界面活性剤、陽イオン性（カチオン性）界面活性剤、非イオン性（ノニオン性）界面活性剤が挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩が挙げられる。アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩等の「アルキル」は、例えば、ドデシル、デシル、ノニル、オクチルである。アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩等の「塩」は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩である。アルキル硫酸塩の具体例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられ、アルキルベンゼンスルホン酸塩の具体例としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。陽イオン性界面活性剤の具体例としては、塩化ヘキサデシルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムが挙げられる。非イオン性界面活性剤の具体例としては、「Tween 20」（ポリオキシエチレンソルビタンモノララウレート）、「Tween 40」（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）、「Tween 60」（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、「Tween 80」（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。
Examples of surfactants include anionic (anionic) surfactants, cationic (cationic) surfactants, and nonionic (nonionic) surfactants. Anionic surfactants include, for example, alkyl sulfates and alkylbenzene sulfonates. "Alkyl" in alkylsulfates, alkylbenzenesulfonates and the like is, for example, dodecyl, decyl, nonyl, octyl. "Salts" such as alkylsulfates and alkylbenzenesulfonates are, for example, sodium salts, potassium salts and ammonium salts. A specific example of the alkylsulfate is sodium dodecylsulfate (SDS), and a specific example of the alkylbenzenesulfonate is sodium dodecylbenzenesulfonate. Specific examples of cationic surfactants include hexadecylpyridinium chloride, hexadecyltrimethylammonium bromide, and hexadecyltrimethylammonium chloride. Specific examples of nonionic surfactants include "
抽出用試薬が界面活性剤を含む場合、界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類およびその作用効果や、必要に応じて抽出用試薬中のその他の成分（例えばカオトロピック剤、還元剤）の有無、種類および濃度などを考慮して、適宜調節することができる。例えば、抽出用試薬が界面活性剤としてＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤またはその他の界面活性剤を含む場合、その濃度の下限値は、例えば０．００５、０．０１または０．０５％（ｗ／ｖ）とすることができ、上限値は、例えば５．０、３．０または２．０％（ｗ／ｖ）とすることができ、これらの上限値および下限値は任意に組みあわせることができる。 When the extraction reagent contains a surfactant, the concentration of the surfactant depends on the type of surfactant and its effects, and if necessary other components (e.g., chaotropic agent, reducing agent) in the extraction reagent. The presence/absence, type, concentration, and the like can be taken into account and adjusted as appropriate. For example, when the extraction reagent contains an anionic surfactant such as SDS or other surfactant as a surfactant, the lower limit of the concentration is, for example, 0.005, 0.01 or 0.05% ( w/v), the upper limit can be, for example, 5.0, 3.0 or 2.0% (w/v), and these upper and lower limits can be combined arbitrarily be able to.
「カオトロピック剤」としては、例えば、尿素、ホルムアミド、塩溶効果のある陰イオンまたは陽イオンを含む塩（例：グアニジニウムイオンを含む塩酸グアニジン、ナトリウムイオンを含む塩化ナトリウム、カリウムイオンを含む塩化カリウム等）が挙げられる。 The "chaotropic agent" includes, for example, urea, formamide, salts containing anions or cations with a salt-solubilizing effect (e.g., guanidine hydrochloride containing guanidinium ions, sodium chloride containing sodium ions, potassium chloride containing potassium ions, etc.).
抽出用試薬がカオトロピック剤を含む場合、カオトロピック剤の濃度は、カオトロピック剤の種類およびその作用効果（本発明の作用効果への影響）や、必要に応じて抽出用試薬中のその他の成分（例えば界面活性剤、還元剤）の有無、種類および濃度などを考慮して、適宜調節することができる。例えば、抽出用試薬がカオトロピック剤として尿素を含む場合、その濃度の下限値は、例えば０．０１、０．０５または０．１（ｗ／ｖ）とすることができ、上限値は、例えば１０、５．０または３．０％（ｗ／ｖ）とすることができ、これらの上限値および下限値は任意に組みあわせることができる。 When the extraction reagent contains a chaotropic agent, the concentration of the chaotropic agent depends on the type of chaotropic agent and its effect (influence on the effect of the present invention) and, if necessary, other components in the extraction reagent (e.g. It can be appropriately adjusted in consideration of the presence, type and concentration of surfactants, reducing agents). For example, when the extraction reagent contains urea as a chaotropic agent, the lower limit of its concentration can be, for example, 0.01, 0.05 or 0.1 (w/v), and the upper limit is, for example, 10 , 5.0 or 3.0% (w/v), and these upper and lower limits can be combined arbitrarily.
還元剤としては、例えば、メルカプトアルカノールおよび／または亜硫酸塩が挙げられる。メルカプトアルカノールとしては、例えば、チオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトールが挙げられる。亜硫酸塩としては、例えば、アルカリ金属亜硫酸塩が挙げられ、そのアルカリ金属としては、例えば、ナトリウム、カリウムが挙げられる。亜硫酸塩の具体例としては、亜硫酸ナトリウムが挙げられる。 Reducing agents include, for example, mercaptoalkanols and/or sulfites. Mercaptoalkanols include, for example, thioglycerol, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol. Examples of sulfites include alkali metal sulfites, and examples of alkali metals include sodium and potassium. Specific examples of sulfites include sodium sulfite.
抽出用試薬が還元剤を含む場合、還元剤の濃度は、還元剤の種類およびその作用効果や、必要に応じて抽出用試薬中のその他の成分（例えば界面活性剤、カオトロピック剤）の有無、種類および濃度などを考慮して、適宜調節することができる。抽出用試薬が還元剤としてチオグリセロールを含む場合、その濃度の下限値は、例えば０．００１、０．００５、０．０１または０．０２％（ｗ／ｖ）とすることができ、上限値は、例えば１０、５．０、３．０、２．０または１．０％（ｗ／ｖ）とすることができ、これらの上限値および下限値は任意に組みあわせることができる。抽出用試薬が還元剤として２－メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールを含む場合、その濃度の下限値は、例えば０．０５、０．１または０．５％（ｗ／ｖ）とすることができ、上限値は、例えば５．０、２．０または１．０％（ｗ／ｖ）とすることができ、これらの上限値および下限値は任意に組みあわせることができる。 When the extraction reagent contains a reducing agent, the concentration of the reducing agent depends on the type of reducing agent and its effect, and if necessary, the presence or absence of other components (e.g., surfactants, chaotropic agents) in the extraction reagent. It can be appropriately adjusted in consideration of the type, concentration, and the like. When the extraction reagent contains thioglycerol as a reducing agent, the lower limit of its concentration can be, for example, 0.001, 0.005, 0.01 or 0.02% (w/v), and the upper limit can be, for example, 10, 5.0, 3.0, 2.0 or 1.0% (w/v), and these upper and lower limits can be combined arbitrarily. When the extraction reagent contains 2-mercaptoethanol or dithiothreitol as a reducing agent, the lower limit of its concentration can be, for example, 0.05, 0.1 or 0.5% (w/v), The upper limit can be, for example, 5.0, 2.0 or 1.0% (w/v), and these upper and lower limits can be combined arbitrarily.
本明細書の記載において、「抗体」または「抗体等」（抗体およびその抗原結合性断片）はさらに、タンパク質に結合することのできる公知の各種の「検出分子」に拡張して読み替える（実施形態において置き換える）ことが可能である。抗体および抗原結合性断片（抗体等）以外の「検出分子」としては、例えば、アプタマー、レセプター、抗菌ペプチドまたはその他のペプチドなどが挙げられる。抗体等を用いる抗原抗体反応に基づく実施形態と同様に、検出分子を用いる特異的な反応に基づく実施形態によっても、本発明を実施することが可能である。 In the description of the present specification, "antibodies" or "antibodies and the like" (antibodies and antigen-binding fragments thereof) are further extended to various known "detection molecules" capable of binding to proteins (embodiments ) is possible. "Detection molecules" other than antibodies and antigen-binding fragments (such as antibodies) include, for example, aptamers, receptors, antimicrobial peptides or other peptides. Similar to the embodiment based on antigen-antibody reaction using antibodies and the like, the present invention can also be implemented by embodiments based on specific reactions using detection molecules.
―検査方法―
本発明の「検査方法」は、第１／第２くるみタンパク質を標的とすることにより、食品中のくるみタンパク質を検出するための方法であって、（１）食品中の第１／第２くるみタンパク質を抽出する工程（本明細書において「抽出工程」と呼ぶ。）、および（２）第１／第２くるみタンパク質に対して特異的な抗体等（第１／第２抗体等）を用いた免疫学的測定法により、抽出された第１／第２くるみタンパク質を定量的または定性的に検出する工程（本明細書において「検出工程」と呼ぶ。）を含む。
-Inspection methods-
The "testing method" of the present invention is a method for detecting walnut protein in food by targeting primary/secondary walnut proteins, comprising: (1) primary/secondary walnuts in food; A step of extracting the protein (referred to herein as an “extraction step”), and (2) using an antibody or the like (first/second antibody or the like) specific for the first/second walnut protein A step of quantitatively or qualitatively detecting the extracted first/second walnut protein by an immunoassay (herein referred to as a “detection step”) is included.
「食品」は、原材料としてのくるみ自体（例えば素焼きのくるみ）であってもよいし、原材料としてくるみを含む（かどうかの検査対象とする）加工品であってもよい。食品（加工品）の形態は特に限定されるものではないが、例えば、加熱および／または加圧条件下で行われる工程を経て製造されることにより、一般的にアレルゲンタンパク質が不溶化して難抽出状態となる傾向にある加工品であってもよい。食品は、例えば、固形状、半固形状、ゼリー状、液状、乳化液状のいずれであってもよい。 The “food” may be walnuts themselves (for example, unglazed walnuts) as a raw material, or processed products containing walnuts as a raw material (to be inspected for whether or not). The form of the food (processed product) is not particularly limited, but generally allergen proteins are insolubilized and difficult to extract, for example, by being produced through a process performed under heating and/or pressurized conditions. It may also be a work piece that tends to be in a state. The food may be, for example, solid, semi-solid, jelly, liquid, or emulsion.
「免疫学的測定法」は、食品から抽出された食物アレルゲン等のタンパク質を検出できるものであれば、特に限定されるものではなく、公知の各種の方法から選択することができる。 The "immunological assay" is not particularly limited as long as it can detect proteins such as food allergens extracted from foods, and can be selected from various known methods.
本発明の一実施形態において、検出工程における免疫学的測定法は、ＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡは、例えば下記のような手順により、検体中の標的タンパク質（本発明では食品中の第１／第２くるみタンパク質）およびそれと結合する抗体等を用いて行うことができる。
１）固相化抗体を備えたプレートのウェルに、標的タンパク質の溶液を添加し、固相化抗体等と標的タンパク質とを接触させ、抗原抗体反応により結合させることで、第１の複合体を形成する。
２）上記ウェルを洗浄後、ビオチン結合抗体の溶液を添加し、第１の複合体中の標的タンパク質とビオチン結合抗体等とを接触させ、抗原抗体反応により結合させることで、第２の複合体を形成する。
３）上記ウェルを洗浄後、ストレプトアビジン結合酵素の溶液を添加し、第２の複合体中のビオチン結合抗体等とストレプトアビジン結合酵素とを接触させ、ビオチン－ストレプトアビジン反応により結合させることで、第３の複合体を形成する。
４）上記ウェルを洗浄後、基質の溶液（発色剤）を添加し、第３の複合体中の酵素と基質とを反応させ、発色させる。
５）発色反応を停止させた後、プレートリーダーで所定の波長における吸光度を測定する。
６）別途標準溶液を測定して得られた吸光度から標準曲線グラフを作成しておき、５）で測定した吸光度および標準曲線グラフから、標的タンパク質の量（溶液の濃度）を読み取り、溶液の希釈倍率を乗じて、検体中の標的タンパク質の量を算出する。
In one embodiment of the invention, the immunoassay in the detecting step is ELISA. ELISA can be performed, for example, by using the target protein in the sample (in the present invention, the first/second walnut protein in the food) and the antibody that binds thereto, etc., by the following procedure.
1) A solution of the target protein is added to the wells of the plate provided with the immobilized antibody, the immobilized antibody or the like is brought into contact with the target protein, and the first complex is formed by binding through antigen-antibody reaction. Form.
2) After washing the wells, a biotin-conjugated antibody solution is added, and the target protein in the first complex is brought into contact with the biotin-conjugated antibody or the like, and bound by an antigen-antibody reaction to form a second complex. to form
3) After washing the wells, a solution of a streptavidin-binding enzyme is added, and the biotin-binding antibody or the like in the second complex is brought into contact with the streptavidin-binding enzyme and bound by a biotin-streptavidin reaction. A third complex is formed.
4) After washing the wells, a substrate solution (coloring agent) is added to allow the enzyme in the third complex to react with the substrate to develop color.
5) After stopping the coloring reaction, measure the absorbance at a predetermined wavelength with a plate reader.
6) Separately prepare a standard curve graph from the absorbance obtained by measuring the standard solution, read the amount of target protein (solution concentration) from the absorbance measured in 5) and the standard curve graph, and dilute the solution. Multiply the scale factor to calculate the amount of target protein in the sample.
本発明の一実施形態において、検出工程における免疫学的測定法は、イムノクロマトグラフィーである。イムノクロマトグラフィーは、例えば下記の手順により、検体中の標的タンパク質（本発明では食品中の第１／第２くるみタンパク質）およびそれと結合する抗体等を用いて行うことができる。
１）発色標識抗体等が含まれているテストストリップ上の所定の部位（試料滴下部）に、標的タンパク質を含む試料溶液を滴下し、発色標識抗体等と標的タンパク質とを接触させ、抗原抗体反応により結合させることで、第１の複合体を形成する。
２）第１の複合体や未反応の発色標識抗体等を含む試料溶液は、テストストリップ上の所定の部位（展開部）を展開していき、それに伴い第１の複合体等も毛細管現象によって移動する。
３）第１の複合体が、固定化抗体等が含まれている所定の部位（テストライン部）に到達し、固定化抗体等に捕捉されると、発色標識により発色したライン（例えば、金コロイドによる赤紫色のライン）が出現する。テストラインが出現した場合、試料溶液中に標的タンパク質が含まれていたことを示す。
４）未反応の金コロイド標識抗体等が、抗免疫グロブリン抗体が含まれている所定の部位（コントロールライン部、テストラインより下流側）に到達し、抗免疫グロブリン抗体等に捕捉されると、金コロイドによる赤紫色のラインが出現する。コントロールラインが出現しなかった場合、試料中に標的タンパク質が含まれていたか否かにかかわらず、試料溶液の展開に異常があったことが示唆される（再検査が必要となる）。
In one embodiment of the invention, the immunoassay in the detecting step is immunochromatography. Immunochromatography can be performed, for example, using the target protein in the sample (in the present invention, the first/second walnut protein in the food) and an antibody that binds thereto, etc., according to the following procedure.
1) A sample solution containing the target protein is dropped onto a predetermined site (sample dropping part) on the test strip containing the color-developing labeled antibody, etc., and the target protein is brought into contact with the color-developing labeled antibody, etc., causing an antigen-antibody reaction. to form a first complex.
2) The sample solution containing the first complex, unreacted color-developing labeled antibody, etc. develops at a predetermined site (development part) on the test strip, and along with this, the first complex, etc. Moving.
3) When the first complex reaches a predetermined site (test line portion) containing an immobilized antibody or the like and is captured by the immobilized antibody or the like, a line colored by a chromogenic label (for example, gold A reddish-purple line due to colloids) appears. Appearance of the test line indicates that the sample solution contained the target protein.
4) When the unreacted colloidal gold-labeled antibody or the like reaches a predetermined site containing the anti-immunoglobulin antibody (control line part, downstream from the test line) and is captured by the anti-immunoglobulin antibody or the like, A reddish-purple line appears due to gold colloid. If the control line does not appear, it is suggested that there was an abnormality in the development of the sample solution, regardless of whether the sample contained the target protein (requires retesting).
・抽出工程
「抽出工程」は、抽出用試薬を用いて食品中の各種のタンパク質を抽出する処理として行われている、一般的な抽出工程と同様に行うことができ、さらに必要に応じて本発明に適合するよう適宜改変することができる。
・Extraction process The “extraction process” can be performed in the same way as a general extraction process, which is performed as a process for extracting various proteins in foods using an extraction reagent. Appropriate modifications may be made to suit the invention.
抽出工程に供する食品は、食品の形態に応じて、フードカッター、ミルサー、ミキサー、ホモジナイザー等を用いた高速剪断・撹拌処理により、均質な状態に微細化または乳化すること（高速剪断・撹拌処理法）ができる。このような微細化等の処理は、抽出工程の前にあらかじめ食品等に対して行い、得られた微細化等された食品と本発明の抽出用試薬とを混合するようにしてもよいし、食品と本発明の抽出用試薬の混合物に対して行い、微細化等の処理と同時に抽出処理が行われるようにしてもよい。微細化等の処理条件（時間、温度、回転数（ｒｐｍ）または遠心力（×ｇ）等）は、選択した微細化等の処理方法や用いる処理装置に応じて、また本発明の作用効果を考慮して、適宜調節することができる。また、抽出工程に供する食品は、必要に応じて、例えば脱脂処理など、第１／第２くるみタンパク質の抽出および／または抽出後の検出などを考慮した処理がさらに行われていてもよい。 Depending on the form of the food to be subjected to the extraction process, food cutters, millers, mixers, homogenizers, etc., should be used for high-speed shearing and stirring to make it finer or emulsify to a homogeneous state (high-speed shearing and stirring method ) can be done. Such a treatment such as micronization may be performed on the food or the like in advance before the extraction step, and the obtained micronized food and the extraction reagent of the present invention may be mixed, A mixture of the food and the extraction reagent of the present invention may be subjected to the extraction treatment at the same time as the treatment such as miniaturization. Processing conditions such as micronization (time, temperature, number of revolutions (rpm) or centrifugal force (x g), etc.) are determined according to the selected processing method such as micronization and the processing apparatus used, and the effects of the present invention. It can be adjusted accordingly. In addition, the food to be subjected to the extraction step may be further subjected to a treatment, such as defatting treatment, in consideration of extraction and/or detection after extraction of the first/second walnut protein, if necessary.
上記のように微細化等した食品、またはしていない食品と、本発明の抽出用試薬とを混合した後、その混合物を振盪処理することにより、抽出処理を行うこと（振盪法）もできる。振盪の処理条件（時間、温度、振盪数もしくは回転数（ｒｐｍ）等）は、選択した振盪処理方法や用いる処理装置に応じて、また本発明の作用効果を考慮して、適宜調節することができる。振盪処理の時間は、通常１２時間以上、２４時間未満（例えば一晩）である。振盪処理の温度は、通常は室温であるが、必要であれば加熱した温度であってもよい。 After mixing the food that has been or has not been micronized as described above with the extraction reagent of the present invention, the mixture can be shaken for extraction (shaking method). Shaking treatment conditions (time, temperature, number of shaking or number of rotations (rpm), etc.) can be adjusted as appropriate depending on the selected shaking treatment method and treatment equipment used, and in consideration of the effects of the present invention. can. The shaking treatment time is usually 12 hours or more and less than 24 hours (for example, overnight). The temperature of the shaking treatment is usually room temperature, but may be a heated temperature if necessary.
・回収工程
本発明では、抽出用試薬を用いて高速剪断・撹拌処理または振盪処理を行った後、得られた処理物を用いて、さらに遠心分離を行って上清を回収する、または濾過を行って濾液を回収する工程（本明細書において「回収工程」と呼ぶ。）を行うことができる。回収工程により得られた上清または濾液に、食品から抽出された第１／第２くるみタンパク質が含まれている。遠心分離、濾過等による回収処理の処理条件（時間、温度、遠心分離の回転数（ｒｐｍ）または遠心力（×ｇ）、濾過のフィルター孔径等）は、選択した回収処理の方法や用いる処理装置などに応じて、適宜調節することができる。
Recovery step In the present invention, after performing high-speed shearing/stirring treatment or shaking treatment using an extraction reagent, the resulting treated product is further centrifuged to recover the supernatant, or filtered. and recovering the filtrate (referred to herein as the “recovery step”). The supernatant or filtrate obtained by the recovery step contains the first/second walnut protein extracted from the food. The treatment conditions (time, temperature, centrifugal rotation speed (rpm) or centrifugal force (x g), filtration filter pore size, etc.) for recovery treatment by centrifugation, filtration, etc. are determined by the selected recovery treatment method and the treatment equipment used. etc., it can be adjusted as appropriate.
・精製工程
本発明では、さらに抽出工程および回収工程の後に、得られた回収液に含まれている第１／第２くるみタンパク質を精製する工程（本明細書において「精製工程」と呼ぶ。）を行うことができる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに代表されるゲル濾過クロマトグラフィーや、イオン交換クロマトグラフィーのような適切な手段を用いることにより、回収液に含まれている第１／第２くるみタンパク質およびその他のタンパク質の混合物の中から第１／第２くるみタンパク質を単離して精製することができる。ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の精製処理の処理条件は、選択した精製処理の方法や用いる処理装置などに応じて、適宜調節することができる。
Purification step In the present invention, after the extraction step and the recovery step, a step of purifying the first/second walnut proteins contained in the obtained recovered liquid (referred to herein as the “purification step”). It can be performed. By using an appropriate means such as gel filtration chromatography typified by SDS-PAGE or ion exchange chromatography, the mixture of primary/secondary walnut proteins and other proteins contained in the recovery solution can be isolated and purified from primary/secondary walnut proteins. The treatment conditions for purification treatments such as gel filtration chromatography and ion exchange chromatography can be appropriately adjusted according to the selected purification treatment method, the treatment apparatus used, and the like.
なお、回収工程により得られる回収液に含まれている第１／第２くるみタンパク質は、それを抽出した食品がどのようなものかによって、例えば、どのような製造過程や保存過程（混捏、成形、加圧、加熱、乾燥、酵素処理、冷凍、解凍など処理の有無や処理条件）を経た加工食品であるかによって、天然の第１／第２くるみタンパク質とは物理的および／または化学的に相違しているタンパク質、つまり一定程度変性しているタンパク質である可能性がある。あるいは、回収される第１／第２くるみタンパク質は、変性の程度が様々な第１／第２くるみタンパク質の混合物である可能性もある。 In addition, the first/second walnut protein contained in the recovered liquid obtained by the recovery process depends on what kind of food it is extracted from, for example, what kind of manufacturing process or storage process (kneading, molding, , pressurization, heating, drying, enzyme treatment, freezing, thawing, etc. and processing conditions), the natural primary / secondary walnut protein is physically and / or chemically It may be a different protein, ie a protein that is denatured to some extent. Alternatively, the recovered primary/secondary walnut proteins may be a mixture of primary/secondary walnut proteins with varying degrees of denaturation.
－抽出処理物－
本発明は別の側面において、抽出用試薬と、食品に由来する可溶化している第１／第２くるみタンパク質を含む抽出処理物が提供される。このような抽出処理物は、後述するような、本発明の検査方法の工程（１）として行われる抽出工程により得られるものや、本発明の抗体製造方法の工程（１）として行われる抽出工程により得られるものを包含する。
-extracted product-
In another aspect, the present invention provides an extraction product comprising an extraction reagent and solubilized food-derived first/second walnut proteins. Such an extracted product is obtained by the extraction step performed as step (1) of the inspection method of the present invention, as described later, or the extraction step performed as step (1) of the antibody production method of the present invention. including those obtained by
本発明の抽出処理物は、濾過処理により上清を抽出処理液として分離する前は、さらに抽出残渣としての食品など、抽出用試薬および可溶化した第１／第２くるみタンパク質以外の物質を含んでいてもよい。 The extracted product of the present invention contains substances other than the extraction reagent and the solubilized first/second walnut proteins, such as food as extraction residue, before the supernatant is separated as an extraction solution by filtration. You can stay.
なお、抽出処理物に含まれる第１／第２くるみタンパク質は、従来技術では、少なくとも食品中のくるみタンパク質の検査における検出対象とするという目的で、また抗体を作製するという目的で、食品から単離されることがなった、食品の実施形態に応じた様々な変性第１／第２くるみタンパク質を含む混合物となっており、物質としての構成（例えば混合物に含まれる変性第１／第２くるみタンパク質の組成、すなわちどのように変性したものを、どのような割合で含んでいるか）を一概に特定することは困難である。 In the prior art, the first/second walnut proteins contained in the extracted product were at least isolated from food for the purpose of detection in the inspection of walnut protein in food and for the purpose of producing antibodies. It is a mixture comprising various denatured primary/secondary walnut proteins according to the embodiment of the food product to be separated, and the composition as a substance (e.g. the denatured primary/secondary walnut protein contained in the mixture It is difficult to categorically specify the composition of (i.e., what is modified and in what proportion).
―抗体等製造方法―
本発明の「抗体等製造方法」は、第１／第２くるみタンパク質に対して特異的な抗体等（第１／第２抗体等）を製造するための方法であって、（１）食品中の第１／第２くるみタンパク質を抽出する工程（前述した「検査方法」における「抽出工程」に相当する。）、および（２）抽出された第１／第２くるみタンパク質を用いて、第１／第２くるみタンパク質に対して特異的な抗体（第１／第２抗体等）を作製する工程（本明細書において「抗体等作製工程」と呼ぶ。）を含む。
―Method for producing antibodies, etc.―
The "method for producing an antibody, etc." of the present invention is a method for producing an antibody, etc. (first/second antibody, etc.) specific to the first/second walnut protein, comprising: (1) The step of extracting the first / second walnut protein of (corresponding to the "extraction step" in the "test method" described above), and (2) using the extracted first / second walnut protein, the first A step of producing an antibody (first/second antibody, etc.) specific to the /second walnut protein (referred to herein as an “antibody, etc. producing step”).
抗体等製造方法における抽出工程は、検査方法における「抽出工程」と同様に、例えば前述したような抽出用試薬を用いて行うことができるが、必要に応じて抗体の製造に適するように改変する（例えばスケールアップする）ことができる。 The extraction step in the antibody manufacturing method can be performed using, for example, an extraction reagent as described above in the same manner as the "extraction step" in the test method, but if necessary, it is modified so as to be suitable for antibody manufacturing. (e.g. scaled up).
・抗体等作製工程
抗体等作製工程は、少なくとも前述したような抽出工程の後で、通常はさらに抽出工程に後に行われる精製工程の後で、得られた第１／第２くるみタンパク質の精製物を用いて第１／第２くるみタンパク質に対して特異的な抗体等（第１／第２抗体等）を作製する工程である。一旦、食品中の第１／第２くるみタンパク質を抽出して入手することができれば、その第１／第２くるみタンパク質を用いること以外は、従来の食物アレルゲンタンパク質に対して特異的な抗体等を作製する工程と同様にして、さらに必要に応じて本発明に適合するよう適宜改変して、第１／第２抗体を得たり、さらにその抗原結合性断片を得たりすることができる。
Antibody, etc. production step The antibody, etc. production step is the purification of the first/second walnut protein obtained at least after the extraction step as described above, and usually after the purification step that is further performed after the extraction step. This is a step of producing antibodies (first/second antibodies, etc.) specific to the first/second walnut proteins using. Once the primary/secondary walnut proteins in the food can be extracted and obtained, antibodies or the like specific to conventional food allergen proteins can be produced, except that the primary/secondary walnut proteins are used. In the same manner as in the production step, it is possible to obtain primary/secondary antibodies and antigen-binding fragments thereof by appropriately modifying them so as to conform to the present invention as necessary.
作製する第１／第２抗体等は、抗体等作製工程の目的に応じて（例えば作製した抗体が用いられる本発明の検査用キットの実施形態等に応じて）、ポリクローナルな抗体等であってもよいし、モノクローナルな抗体等であってもよい。 The first/second antibody etc. to be produced are polyclonal antibodies etc. depending on the purpose of the antibody etc. producing step (for example, according to the embodiment of the test kit of the present invention in which the produced antibody is used). Alternatively, it may be a monoclonal antibody or the like.
本発明の一実施形態において、抗体等作製工程では、前述したような一実施形態の本発明の検査用キットを製造するために、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を作製する。抽出工程により得られた変性第１／第２くるみタンパク質（の混合物）を用いることにより、未変性の第１／第２くるみタンパク質を用いた場合より、さらに多様なエピトープに対応した、または未変性の第１／第２くるみタンパク質が有さないエピトープに対応した、加工食品等の食品に含まれる変性第１／第２くるみタンパク質の検出に適したポリクローナル抗体（抗体の混合物）および／またはモノクローナル抗体が得られる。 In one embodiment of the present invention, in the step of producing antibodies and the like, polyclonal antibodies and/or monoclonal antibodies are produced in order to produce the test kit of one embodiment of the present invention as described above. By using (a mixture of) denatured primary/secondary walnut proteins obtained by the extraction step, more diverse epitopes are addressed than when native primary/secondary walnut proteins are used, or native polyclonal antibody (mixture of antibodies) and/or monoclonal antibody suitable for detecting denatured primary/secondary walnut proteins contained in foods such as processed foods, corresponding to epitopes not possessed by primary/secondary walnut proteins of is obtained.
ポリクローナル抗体の作製方法としては、免疫動物を用いる方法や、ファージディスプレイ法が一般的である。免疫動物を用いる方法の手順の概略は次の通りである。適量の標的タンパク質（本発明では第１／第２くるみタンパク質）の精製物を、必要に応じてアジュバンドと混合して免疫原とし、その免疫原を動物（ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウス、ニワトリ等）に注射する（免疫する）ことにより、その動物の血液中に抗体を産生させることができる。適当な間隔および回数で繰り返し免疫した後、血液（血漿、血清）を回収し、そこに含まれる抗体を精製する、例えば標的タンパク質（本発明では第１／第２くるみタンパク質）を固定化したアフィニティーカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー、および必要に応じてさらにゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することで、ポリクローナル抗体が得られる。また、ファージディスプレイ法の手順の概略は次の通りである。バクテリオファージに抗体の遺伝子を導入し、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域が連結したタンパク質をバクテリオファージのコートタンパク質上に発現させる（提示する）ようにする。得られた抗体ファージライブラリーを用いて、標的タンパク質（本発明では第１／第２くるみタンパク質）に対して親和性を有する抗体を選択する。その抗体を産生するバクテリオファージを大腸菌に感染させて増殖させた後に回収し、そこに含まれる抗体を精製することで、ポリクローナル抗体が得られる。 As methods for producing polyclonal antibodies, methods using immunized animals and phage display methods are generally used. The outline of the procedure of the method using immunized animals is as follows. An appropriate amount of purified target protein (first/second walnut protein in the present invention) is mixed with an adjuvant if necessary to form an immunogen. , mice, chickens, etc.) can be injected (immunized) to produce antibodies in the animal's blood. After repeated immunization at appropriate intervals and times, blood (plasma, serum) is collected, and antibodies contained therein are purified, for example, affinity immobilized target protein (first/second walnut protein in the present invention) Affinity chromatography using a column and, if necessary, further purification by gel filtration chromatography yields polyclonal antibodies. The outline of the procedure of the phage display method is as follows. An antibody gene is introduced into a bacteriophage so that a protein in which the variable regions of the H and L chains are linked is expressed (displayed) on the coat protein of the bacteriophage. The resulting antibody phage library is used to select antibodies that have affinity for the target protein (first/secondary walnut protein in the present invention). A polyclonal antibody can be obtained by infecting Escherichia coli with the bacteriophage that produces the antibody, proliferating the bacteriophage, recovering the bacteriophage, and purifying the antibody contained therein.
モノクローナル抗体の作製方法としては、ハイブリドーマを用いる方法が一般的である。ハイブリドーマを用いる方法の概略は次の通りである。ポリクローナル抗体を作製する場合と同様にして、免疫原を動物に注射し、抗体を産生させる。その免疫動物の脾臓からＢ細胞を採取し、ミエローマ細胞（不死化したがん細胞）と融合して、ハイブリドーマ（融合細胞）を作製する。ハイブリドーマの中から、標的タンパク質（本発明では第１／第２くるみタンパク質）への結合親和性や特異性に優れた抗体を産生するものを選択（スクリーニング）する。そのハイブリドーマを培養し、培養上清中に単一の抗体を産生させる。培養上清を回収し、そこに含まれる抗体を精製することで、モノクローナル抗体が得られる。 As a method for producing a monoclonal antibody, a method using a hybridoma is generally used. The outline of the method using hybridomas is as follows. An animal is injected with the immunogen and allowed to produce antibodies in the same manner as polyclonal antibodies are produced. B cells are collected from the spleen of the immunized animal and fused with myeloma cells (immortalized cancer cells) to produce hybridomas (fused cells). Hybridomas that produce antibodies with excellent binding affinity and specificity to the target protein (first/second walnut protein in the present invention) are selected (screened) from among the hybridomas. The hybridoma is cultured to produce a single antibody in the culture supernatant. A monoclonal antibody is obtained by collecting the culture supernatant and purifying the antibody contained therein.
また、第１／第２抗体が得られた後は、そのアミノ酸配列を決定したり、常法に従って各種の抗原結合性断片（ポリクローナルまたはモノクローナル）を作製したりすることができる。 After the first/second antibodies are obtained, their amino acid sequences can be determined, and various antigen-binding fragments (polyclonal or monoclonal) can be prepared according to conventional methods.
－抗体等－
本発明は別の側面において、本発明の抗体等製造方法により得られる、食品に由来する第１／第２くるみタンパク質に対して特異的な抗体およびその抗原結合性断片（第１／第２抗体等）が提供される。
－Antibodies, etc.－
In another aspect of the present invention, an antibody specific to the food-derived first/second walnut protein and an antigen-binding fragment thereof (first/second antibody etc.) are provided.
本発明の抗体等は、従来技術では、少なくとも食品中のくるみタンパク質の検査における検出対象とするという目的で、食品から単離されることがなかった、食品の実施形態に応じた様々な変性第１／第２くるみタンパク質を含む混合物を用いて（例えば免疫原として）得られるものであり、物質としての構成（例えば、ポリクローナル抗体の組成、すなわちどのようなアミノ酸配列を有する抗体が含まれているか）を一概に特定することは困難である。 The antibody, etc. of the present invention has not been isolated from food in the prior art, at least for the purpose of detection in tests for walnut protein in food. / obtained using a mixture containing the second walnut protein (e.g., as an immunogen), and the composition of the substance (e.g., the composition of the polyclonal antibody, i.e., what amino acid sequence the antibody contains) It is difficult to specify categorically.
以下、実施例を通じて、本発明の実施形態をより具体的に開示するが、本発明の技術的範囲は実施例として開示した実施形態に限定されるものではない。当業者であれば、目的とする本発明の用途や作用効果に適応するよう、本発明の技術的思想ならびに本明細書および図面の内容を全体的に考慮して、実施例として開示した実施形態を拡張したり、他の様々な実施形態に改変したりすること、あるいは必要に応じて、従来技術（公知の発明）が備える技術的特徴をさらに組み合わせたりできることを、当業者は理解することができる。本明細書に記載したもの以外の、本発明を実施するために必要な事項は、本発明の属する技術分野における技術常識や従来技術を適宜参酌することができる。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be disclosed more specifically through examples, but the technical scope of the present invention is not limited to the embodiments disclosed as examples. A person skilled in the art can fully consider the technical idea of the present invention and the contents of the specification and drawings, and the embodiments disclosed as examples, so as to adapt to the intended use and effect of the present invention. can be expanded, modified into various other embodiments, or, if necessary, technical features of the prior art (known inventions) can be further combined. can. Matters necessary for carrying out the present invention other than those described in this specification can appropriately refer to common general technical knowledge and prior art in the technical field to which the present invention belongs.
［実施例１］第２くるみタンパク質および第２抗体
［１－１］第２くるみタンパク質の抽出
素焼きのくるみを粉砕し、ヘキサン中で撹拌し、次いでアセトン中で撹拌した。ヘキサン中での撹拌およびアセトン中での撹拌をさらに３回繰り返した（合計４回行った）後、風乾して、脱脂くるみを得た。
[Example 1] Second Walnut Protein and Second Antibody [1-1] Extraction of Second Walnut Protein Unglazed walnuts were pulverized and stirred in hexane and then in acetone. Stirring in hexane and stirring in acetone were repeated three more times (a total of four times) followed by air drying to yield defatted walnuts.
未加熱もしくは加熱の脱脂くるみ１ｇと、「ＦＡＳＴＫＩＴエライザＶｅｒ．ＩＩＩ」（日本ハム株式会社）の検体抽出液１９ｍＬとを混合し、室温で一晩振盪して、表１に示す抽出液を調製した。得られた抽出液を室温で遠心分離し（３０００×ｇ、２０分）、上澄みを濾過し、濾液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。その後、後記［１－２］により得られた第２抗体の一種を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。 1 g of unheated or heated defatted walnuts and 19 mL of sample extract of “FASTKIT Eliza Ver. . The resulting extract was centrifuged at room temperature (3000×g, 20 min), the supernatant was filtered, and the filtrate was subjected to SDS-PAGE. Then, Western blotting was performed using one of the secondary antibodies obtained in [1-2] below.
結果を図１に示す。図１（Ａ）において、Ｎｏ．１～４の抽出用試薬それぞれについて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて約５０ｋＤａの位置にバンドが認められる。図１（Ｂ）において、そのバンドに含まれているタンパク質は、別途作製された第２抗体と反応するタンパク質、すなわち第２くるみタンパク質であることがわかる。第２くるみタンパク質は、Ｊｕｇ ｒ ６と同定された。 The results are shown in FIG. In FIG. 1(A), No. A band is observed at approximately 50 kDa in SDS-PAGE for each of extraction reagents 1-4. In FIG. 1(B), it can be seen that the protein contained in that band is a protein that reacts with the second antibody prepared separately, that is, the second walnut protein. A second walnut protein was identified as Jug r6.
［１－２］第２抗体の作製
前記［１－１］と同様にして別途ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、得られた約５０ｋＤａのバンドを切り出し、タンパク質（第２くるみタンパク質）を単離および精製した。常法に従って、得られたタンパク質精製物をマウスに投与して免疫した後、産生されたポリクローナル抗体（抗第２くるみタンパク質抗体）を血清から回収した。また、得られたポリクローナル抗体を用いて、常法に従って、モノクローナル抗体も作製した。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はそれぞれ複数の種類のものが得られた。
[1-2] Preparation of second antibody SDS-PAGE was performed separately in the same manner as in [1-1] above, and the obtained band of about 50 kDa was excised, and the protein (second walnut protein) was isolated and purified. . After immunization by administering the resulting purified protein to mice according to a conventional method, the produced polyclonal antibody (anti-secondary walnut protein antibody) was recovered from the serum. Moreover, using the obtained polyclonal antibody, a monoclonal antibody was also produced according to a conventional method. A plurality of types of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies were obtained.
［実施例２］第１くるみタンパク質および第１抗体
［２－１］第１くるみタンパク質（Ａ１１）の抽出
素焼きのくるみを粉砕し、ヘキサン中で撹拌し、次いでアセトン中で撹拌した。ヘキサン中での撹拌およびアセトン中での撹拌をさらに３回繰り返した（合計４回行った）後、風乾して、脱脂くるみを得た。
[Example 2] First Walnut Protein and First Antibody [2-1] Extraction of First Walnut Protein (A11) Unglazed walnuts were pulverized and stirred in hexane and then in acetone. Stirring in hexane and stirring in acetone were repeated three more times (a total of four times) followed by air drying to yield defatted walnuts.
脱脂くるみ１ｇと、常法に従って調製した表２に示す各抽出用試薬を１９ｍＬとを混合し、室温で一晩振盪した。得られた抽出処理物を室温で遠心分離し（３０００×ｇ、２０分）、上澄みを濾過し、濾液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。その後、後記［２－２］により得られた第１抗体の一種を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。 1 g of defatted walnuts and 19 mL of each extraction reagent shown in Table 2 prepared according to a conventional method were mixed and shaken overnight at room temperature. The resulting extract was centrifuged at room temperature (3000×g, 20 minutes), the supernatant was filtered, and the filtrate was subjected to SDS-PAGE. Then, Western blotting was performed using one of the first antibodies obtained in [2-2] below.
結果を表２および図２に示す。図２（Ａ）において、Ｎｏ．２および３の抽出用試薬を用いた場合、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて約３０ｋＤａの位置にバンドが認められる。図２（Ｂ）において、そのバンドに含まれているタンパク質は、別途作製された第１抗体と反応するタンパク質、すなわち第１くるみタンパク質であることがわかる。第１くるみタンパク質は、legmin B like proteinと同定された。
Results are shown in Table 2 and FIG. In FIG. 2(A), No. A band is observed at approximately 30 kDa in SDS-PAGE using
［２－２］第１抗体の作製
前記［２－１］と同様にして別途ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、得られた約３０ｋＤａのバンドを切り出し、タンパク質（第１タンパク質）を単離および精製した。常法に従って、得られたタンパク質精製物をマウスに投与して免疫した後、産生されたポリクローナル抗体（抗第１くるみタンパク質抗体）を血清から回収した。また、得られたポリクローナル抗体を用いて、常法に従って、モノクローナル抗体も作製した。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はそれぞれ複数の種類のものが得られた。
[2-2] Preparation of first antibody SDS-PAGE was performed separately in the same manner as in [2-1] above, the resulting band of about 30 kDa was excised, and the protein (first protein) was isolated and purified. After immunization by administering the resulting purified protein to mice according to a conventional method, the produced polyclonal antibody (anti-first walnut protein antibody) was recovered from the serum. Moreover, using the obtained polyclonal antibody, a monoclonal antibody was also produced according to a conventional method. A plurality of types of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies were obtained.
Claims (13)
（２）第１くるみタンパク質に対して特異的な第１抗体および／または第２くるみタンパク質に対して特異的な第２抗体等を用いた免疫学的測定法により、第１くるみタンパク質および／または第２くるみタンパク質を定量的または定性的に検出する工程
を含む、食品中のくるみタンパク質の検査方法。 (1) extracting the first walnut protein and/or the second walnut protein in the food product; and (2) a first antibody specific for the first walnut protein and/or specific for the second walnut protein. A method for testing walnut protein in food, comprising the step of quantitatively or qualitatively detecting the first walnut protein and/or the second walnut protein by an immunoassay method using a specific second antibody or the like.
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