JP2022151973A - ３次元ｐｃｒスクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、多数検体のＰＣＲ判定を、少数のＰＣＲ反応数でスクリーニングする方法を提供することである。【解決手段】前記課題は、本発明の（１）Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の３次元に配置した試料を、Ｘ軸の１つに相当するＹ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｘ軸のａの数の混合試料を作製し、Ｙ軸の１つに相当するＸ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｙ軸のｂの数の混合試料を作製し、そしてＺ軸の１つに相当するＸ軸及びＹ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｚ軸のｃの数の混合試料を作製する工程、（２）前記ａの数の混合試料、ｂの数の混合試料、及びｃの数の混合試料のＰＣＲを行う工程、及び（３）ＰＣＲの混合試料の判定結果から、陽性試料又は陽性の候補試料の３次元のＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の位置を特定する工程、を含む、３次元ＰＣＲスクリーニング法によって解決することができる。【選択図】なし
Description
本発明は、３次元ＰＣＲスクリーニング法に関する。本発明によれば、多数検体のＰＣＲ判定を、少数のＰＣＲ反応数でスクリーニングし、陽性検体を絞り込むことができる。
ＰＣＲにより、多数の検体群からそれに含まれる少数の陽性検体を特定する場合、多数の陰性検体についても個別にＰＣＲを行う必要がある。従って費用の点からも、操作の点からも非効率的である。
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」２０２１年（英国）５８９巻、ｐ．２７６－２８０
前記の問題を解決するために、例えば新型コロナウイルスのＰＣＲによるウイルスＲＮＡの検出において、いくつかの工夫がされている。
例えば、５サンプル程度をプールして検査する「プールＰＣＲ検査」が、実際に実施されている。また、特許文献１には、検査対象者をグループに分け、個別に混合してサンプリングし、定量的に検査する方法が開示されており、陽性の場合は、検証のために層別化され、最終的に新型コロナウイルスの核酸が陽性の患者を検出している。また非特許文献１には、３サンプルを混合し、３ｎの検体群を測定する方法が開示されている。しかしながら、これらの方法は、プールサイズが小さかったり、サンプルの混合等の操作性が複雑であった。
従って、本発明の目的は、多数検体のＰＣＲ判定を、少数のＰＣＲ反応数でスクリーニングする方法を提供することである。
例えば、５サンプル程度をプールして検査する「プールＰＣＲ検査」が、実際に実施されている。また、特許文献１には、検査対象者をグループに分け、個別に混合してサンプリングし、定量的に検査する方法が開示されており、陽性の場合は、検証のために層別化され、最終的に新型コロナウイルスの核酸が陽性の患者を検出している。また非特許文献１には、３サンプルを混合し、３ｎの検体群を測定する方法が開示されている。しかしながら、これらの方法は、プールサイズが小さかったり、サンプルの混合等の操作性が複雑であった。
従って、本発明の目的は、多数検体のＰＣＲ判定を、少数のＰＣＲ反応数でスクリーニングする方法を提供することである。
本発明者は、多数試料のＰＣＲ判定を、少数のＰＣＲ反応数でスクリーニングする方法ついて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の３次元に配置した試料を１次元、２次元、及び３次元ごとに混合することにより、少ないＰＣＲ反応数で、多数のプールサイズの試料をスクリーニング可能であることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（１）Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の３次元に配置した試料を、Ｘ軸の１つに相当するＹ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｘ軸のａの数の混合試料を作製し、Ｙ軸の１つに相当するＸ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｙ軸のｂの数の混合試料を作製し、そしてＺ軸の１つに相当するＸ軸及びＹ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｚ軸のｃの数の混合試料を作製する工程、（２）前記ａの数の混合試料、ｂの数の混合試料、及びｃの数の混合試料のＰＣＲを行う工程、及び（３）ＰＣＲの混合試料の判定結果から、陽性試料又は陽性の候補試料の３次元のＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の位置を特定する工程、を含む、３次元ＰＣＲスクリーニング法、
［２］（４）前記陽性の候補試料の個別の２次ＰＣＲを行う工程、を更に含む、［１］に記載の３次元ＰＣＲスクリーニング法、
［３］前記工程（２）のＰＣＲがＲＴ－ＰＣＲであり、試料からのＲＮＡ抽出、逆転写反応、及びＰＣＲ反応を行う、［１］又は［２］に記載の３次元ＰＣＲスクリーニング法、及び
［４］前記Ｘ軸の数ａが１２であり、前記Ｙ軸の数ｂが８であり、前記Ｚ軸の数ｃが１０である、［１］～［３］のいずれかに記載の３次元ＰＣＲスクリーニング法、
に関する。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（１）Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の３次元に配置した試料を、Ｘ軸の１つに相当するＹ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｘ軸のａの数の混合試料を作製し、Ｙ軸の１つに相当するＸ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｙ軸のｂの数の混合試料を作製し、そしてＺ軸の１つに相当するＸ軸及びＹ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｚ軸のｃの数の混合試料を作製する工程、（２）前記ａの数の混合試料、ｂの数の混合試料、及びｃの数の混合試料のＰＣＲを行う工程、及び（３）ＰＣＲの混合試料の判定結果から、陽性試料又は陽性の候補試料の３次元のＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の位置を特定する工程、を含む、３次元ＰＣＲスクリーニング法、
［２］（４）前記陽性の候補試料の個別の２次ＰＣＲを行う工程、を更に含む、［１］に記載の３次元ＰＣＲスクリーニング法、
［３］前記工程（２）のＰＣＲがＲＴ－ＰＣＲであり、試料からのＲＮＡ抽出、逆転写反応、及びＰＣＲ反応を行う、［１］又は［２］に記載の３次元ＰＣＲスクリーニング法、及び
［４］前記Ｘ軸の数ａが１２であり、前記Ｙ軸の数ｂが８であり、前記Ｚ軸の数ｃが１０である、［１］～［３］のいずれかに記載の３次元ＰＣＲスクリーニング法、
に関する。
本発明の３次元ＰＣＲスクリーニング法によれば、少ないＰＣＲ反応数で、多数のプールサイズの試料をスクリーニングすることができる。
本発明の３次元ＰＣＲスクリーニング法は、（１）Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の３次元に配置した試料を、Ｘ軸の１つに相当するＹ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｘ軸のａの数の混合試料を作製し、Ｙ軸の１つに相当するＸ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、そしてＹ軸のｂの数の混合試料を作製し、Ｚ軸の１つに相当するＸ軸及びＹ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｚ軸のｃの数の混合試料を作製する工程、（２）前記ａの数の混合試料、ｂの数の混合試料、及びｃの数の混合試料のＰＣＲを行う工程、及び（３）ＰＣＲの混合試料の判定結果から、陽性試料又は陽性の候補試料の３次元のＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の位置を特定する工程、を含む。
《混合試料作製工程（１）》
前記混合工程（１）においては、Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の３次元に配置した試料を、Ｘ軸の１つに相当するＹ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｘ軸のａの数の混合試料を作製し、Ｙ軸の１つに相当するＸ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｙ軸のｂの数の混合試料を作製し、Ｚ軸の１つに相当するＸ軸及びＹ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｚ軸のｃの数の混合試料を作製する。
前記混合工程（１）においては、Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の３次元に配置した試料を、Ｘ軸の１つに相当するＹ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｘ軸のａの数の混合試料を作製し、Ｙ軸の１つに相当するＸ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｙ軸のｂの数の混合試料を作製し、Ｚ軸の１つに相当するＸ軸及びＹ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｚ軸のｃの数の混合試料を作製する。
本明細書において「３次元に配置した試料」は、図１等に示すように、実際に３次元に配置してもよく、概念的に３次元に配置したものを混合してもよい。実際に３次元に配置する場合は、後述するが、Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸ごとに試料を混合する。一方、概念的に３次元に配置する場合は、１次元（１列）に配置した試料を、１つの試料ごとに３回、別の混合容器に分注し、あたかも３次元のＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸ごとに試料を混合することができる。例えば後者の場合、分注装置にプログラミングし、実施することができる。しかしながら、ヒトが分注する場合は、混合のミスをなくす観点から、図１等に示したように実際に３次元に配置してから、試料を混合するのが好ましい。
実際に９６ウェルプレートを用い、９６０試料を３次元に配置して、混合する操作を、図１を用いて説明する。
図１に示すように、９６ウェルのプレートには、Ｘ軸（横軸）に１２列、Ｙ軸（縦軸）に８列があるため、９６の試料が含まれている。この９６ウェルのプレートを、Ｚ軸（垂直軸）方向に１０枚重ねている。
まず、Ｘ軸の１２列の列ごとに、ｘ＝１～ｘ＝１２の混合試料を作製する。具体的には、１列目のｘ＝１の混合試料は、Ｙ軸の８試料とＺ軸の１０試料とを乗じた８ｘ１０＝８０試料を混合してｘ＝１の混合試料を作製する。同様に２列目について、８０試料を混合してｘ＝２の混合試料を作製する。このようにしてｘ＝１２までの１２の混合試料を作製する。実際の分注操作は、図３に示すように、１０枚の９６ウェルプレートから一旦新しい９６ウェルプレートに分注し、Ｚ軸に沿った１０試料を混合することにより、ｘ＝１～ｘ＝１２の混合試料をｙ＝１～ｙ＝８の混合試料とともに効率的に作製することができる。
次に、Ｙ軸の８列の列ごとに、ｙ＝１～ｙ＝８の混合試料を作製する。具体的には、１列目のｙ＝１の混合試料は、Ｘ軸の１２試料とＺ軸の１０試料とを乗じた１２ｘ１０＝１２０試料を混合してｙ＝１の混合試料を作製する。同様に２列目について、１２０試料を混合してｙ＝２の混合試料を作製する。このようにしてｙ＝８までの８の混合試料を作製する。実際の分注操作は、図３に示すように、１０枚の９６ウェルプレートから一旦新しい９６ウェルプレートに分注し、Ｚ軸に沿った１０試料を混合することにより、ｙ＝１～ｙ＝８の混合試料をｘ＝１～ｘ＝１２の混合試料とともに効率的に作製することができる。
次に、Ｚ軸の１０枚のプレートごとに、ｚ＝１～ｚ＝１０の混合試料を作製する。具体的には、ｚ＝１の混合試料は、１枚目の９６ウェルプレートのＸ軸の１２試料とＹ軸の８試料とを乗じた１２ｘ８＝９６試料を混合して作製する。同様に２枚目について、９６試料を混合してｚ＝２の混合試料を作製する。このようにしてｚ＝１０までの１０の混合試料を作製する。実際の分注操作は、図３に示すように、９６チャンネルピペットを用い、１０枚の９６ウェルプレートから、それぞれ仕切りのないリザーバーに分注することによって、ｚ＝１～ｚ＝１０の混合試料を作製することができる。
前記のように混合することによって、ｘ＝１～ｘ＝１２の１２の混合試料、ｙ＝１～ｙ＝８の８の混合試料、ｚ＝１～ｚ＝１０の１０の混合試料が作製できる。すなわち３０の混合試料が作製できる。すなわち、９６０の個別の試料を、３０の混合試料に集約することができる。
図１に示すように、９６ウェルのプレートには、Ｘ軸（横軸）に１２列、Ｙ軸（縦軸）に８列があるため、９６の試料が含まれている。この９６ウェルのプレートを、Ｚ軸（垂直軸）方向に１０枚重ねている。
まず、Ｘ軸の１２列の列ごとに、ｘ＝１～ｘ＝１２の混合試料を作製する。具体的には、１列目のｘ＝１の混合試料は、Ｙ軸の８試料とＺ軸の１０試料とを乗じた８ｘ１０＝８０試料を混合してｘ＝１の混合試料を作製する。同様に２列目について、８０試料を混合してｘ＝２の混合試料を作製する。このようにしてｘ＝１２までの１２の混合試料を作製する。実際の分注操作は、図３に示すように、１０枚の９６ウェルプレートから一旦新しい９６ウェルプレートに分注し、Ｚ軸に沿った１０試料を混合することにより、ｘ＝１～ｘ＝１２の混合試料をｙ＝１～ｙ＝８の混合試料とともに効率的に作製することができる。
次に、Ｙ軸の８列の列ごとに、ｙ＝１～ｙ＝８の混合試料を作製する。具体的には、１列目のｙ＝１の混合試料は、Ｘ軸の１２試料とＺ軸の１０試料とを乗じた１２ｘ１０＝１２０試料を混合してｙ＝１の混合試料を作製する。同様に２列目について、１２０試料を混合してｙ＝２の混合試料を作製する。このようにしてｙ＝８までの８の混合試料を作製する。実際の分注操作は、図３に示すように、１０枚の９６ウェルプレートから一旦新しい９６ウェルプレートに分注し、Ｚ軸に沿った１０試料を混合することにより、ｙ＝１～ｙ＝８の混合試料をｘ＝１～ｘ＝１２の混合試料とともに効率的に作製することができる。
次に、Ｚ軸の１０枚のプレートごとに、ｚ＝１～ｚ＝１０の混合試料を作製する。具体的には、ｚ＝１の混合試料は、１枚目の９６ウェルプレートのＸ軸の１２試料とＹ軸の８試料とを乗じた１２ｘ８＝９６試料を混合して作製する。同様に２枚目について、９６試料を混合してｚ＝２の混合試料を作製する。このようにしてｚ＝１０までの１０の混合試料を作製する。実際の分注操作は、図３に示すように、９６チャンネルピペットを用い、１０枚の９６ウェルプレートから、それぞれ仕切りのないリザーバーに分注することによって、ｚ＝１～ｚ＝１０の混合試料を作製することができる。
前記のように混合することによって、ｘ＝１～ｘ＝１２の１２の混合試料、ｙ＝１～ｙ＝８の８の混合試料、ｚ＝１～ｚ＝１０の１０の混合試料が作製できる。すなわち３０の混合試料が作製できる。すなわち、９６０の個別の試料を、３０の混合試料に集約することができる。
本明細書において、ａは特に限定されるものではないが、下限は例えば４以上であり、ある態様では５以上であり、ある態様では６以上であり、ある態様では７以上であり、ある態様では８以上であり、ある態様では９以上であり、ある態様では１０以上である。上限は、例えば５０以下であり、ある態様では４５以下であり、ある態様では４０以下であり、ある態様では３５以下であり、ある態様では３０以下であり、ある態様では２５以下であり、ある態様では２０以下であり、ある態様では１９以下であり、ある態様では１８以下であり、ある態様では１７以下であり、ある態様では１６以下であり、ある態様では１５以下であり、ある態様では１４以下であり、ある態様では１３以下であり、ある態様では１２以下であり、ある態様では１１以下であり、ある態様では１０以下である。ａの数は、理論的にどの数でも実施できることから、前記下限及び上限は、適宜組み合わせることができる。
本明細書において、ｂは特に限定されるものではないが、下限は例えば４以上であり、ある態様では５以上であり、ある態様では６以上であり、ある態様では７以上であり、ある態様では８以上であり、ある態様では９以上であり、ある態様では１０以上である。上限は、例えば５０以下であり、ある態様では４５以下であり、ある態様では４０以下であり、ある態様では３５以下であり、ある態様では３０以下であり、ある態様では２５以下であり、ある態様では２０以下であり、ある態様では１９以下であり、ある態様では１８以下であり、ある態様では１７以下であり、ある態様では１６以下であり、ある態様では１５以下であり、ある態様では１４以下であり、ある態様では１３以下であり、ある態様では１２以下であり、ある態様では１１以下であり、ある態様では１０以下である。ｂの数は、理論的にどの数でも実施できることから、前記下限及び上限は、適宜組み合わせることができる。
本明細書において、ｃは特に限定されるものではないが、下限は例えば４以上であり、ある態様では５以上であり、ある態様では６以上であり、ある態様では７以上であり、ある態様では８以上であり、ある態様では９以上であり、ある態様では１０以上である。上限は、例えば５０以下であり、ある態様では４５以下であり、ある態様では４０以下であり、ある態様では３５以下であり、ある態様では３０以下であり、ある態様では２５以下であり、ある態様では２０以下であり、ある態様では１９以下であり、ある態様では１８以下であり、ある態様では１７以下であり、ある態様では１６以下であり、ある態様では１５以下であり、ある態様では１４以下であり、ある態様では１３以下であり、ある態様では１２以下であり、ある態様では１１以下であり、ある態様では１０以下である。ｃの数は、理論的にどの数でも実施できることから、前記下限及び上限は、適宜組み合わせることができる。
本明細書において、「Ｘ軸のａの数」は特に限定されるものではないが、前記９６ウェルプレートを使用した場合はａ＝１２である。しかしながら、９６ウェルプレートを小区画に分けａ＝４，６とすることや、一部の列に試料を充填せず、例えばａ＝８、１０などとすることもできる。また、よりウェル数の多い３８４ウェルプレートを使用した場合にはａは２４を上限とする任意の数とすることができ、１５３６ウェルプレートを使用した場合にはａは４８を上限とする任意の数とすることができる。また、試料を３次元に配置するために９６、３８４、１５３６ウェルプレートを用いる必然性はなく、例えばａ＝５、７、１３など任意の値とすることができる。
本明細書において、「Ｘ軸のｂの数」は特に限定されるものではないが、前記９６ウェルプレートを使用した場合はｂ＝８である。しかしながら、９６ウェルプレートを小区画に分けｂ＝４とすることや、一部の列に試料を充填せず、例えばｂ＝６などとすることもできる。また、よりウェル数の多い３８４ウェルプレートを使用した場合にはｂは１６を上限とする任意の数とすることができ、１５３６ウェルプレートを使用した場合にはｂは３２を上限とする任意の数とすることができる。また、試料を３次元に配置するために９６、３８４、１５３６ウェルプレートを用いる必然性はなく、例えばｂ＝５、７、９など任意の値とすることができる。
本明細書において、「Ｚ軸のｃの数」は特に限定されるものではないが、図１で示した例ではｃ＝１０としている。しかしながら、９６ウェルプレートを重ねる枚数をこれより少なくし、ｃ＝４、５、６、７、８、９とすることもできる。逆に、重ねる枚数を多くし、例えばｃ＝１１、１２、５０などとすることもできる。よりウェル数の多い３８４ウェルプレートや１５３６ウェルプレートを使用した場合にも同様にｃとして４－５０程度の間の任意の値とすることができる。
例えば、前記の９６ウェルプレートを１０枚用いた場合は、１２ｘ８ｘ１０＝９６０の試料を１２＋８＋１０＝３０反応でスクリーニングできる。また、Ｘ軸が１０、Ｙ軸が１０、及びＺ軸が１０の場合、１０ｘ１０ｘ１０＝１０００の試料を１０＋１０＋１０＝３０反応でスクリーニングできる。例えば、Ｘ軸が１５、Ｙ軸が１５、及びＺ軸が１５の場合、１５ｘ１５ｘ１５＝３３７５の試料を１５＋１５＋１５＝４５反応でスクリーニングできる。
後述のＰＣＲがＲＴ－ＰＣＲの場合、ＲＮＡ抽出前の試料を混合試料作製工程（１）において混合することが効率がよい。しかしながら、ＲＮＡを抽出したＲＮＡ試料、又はＲＮＡから逆転写酵素によいｃＤＮＡを合成したｃＤＮＡ試料を混合してもよい。
後述のＰＣＲがＲＴ－ＰＣＲの場合、ＲＮＡ抽出前の試料を混合試料作製工程（１）において混合することが効率がよい。しかしながら、ＲＮＡを抽出したＲＮＡ試料、又はＲＮＡから逆転写酵素によいｃＤＮＡを合成したｃＤＮＡ試料を混合してもよい。
本明細書において「試料」は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む限りにおいて、特に限定されるものではなく、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、又は細胞などが挙げられる。更に、ヒト又は動物などの具体的な試料としては、前記細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、又は細胞などを含むものが挙げられるが、具体的には血液、血清、血漿、組織、唾液、リンパ液、髄液、唾液、尿、組織液、ぬぐい液、尿、又は汗などが挙げられる。
《ＰＣＲ工程（２）》
前記ＰＣＲ工程（２）においては、前記ａの数の混合試料、ｂの数の混合試料、及びｃの数の混合試料のＰＣＲを実施する。ＰＣＲは、本分野で公知の方法によって実施することができる。
プライマーセットは、増幅するＤＮＡによって適宜選択することができ、標的ＤＮＡを増幅できるセンスプライマー（フォワードプライマー）及びアンチセンスプライマー（リバースプライマー）を用いればよい。例えば新型コロナウイルスの場合、例えば以下の公知のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
すなわち、
センスプライマー：５’－ＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＣＡＡＴＣ－３’（配列番号１）及び
アンチセンスプライマー：５’－ＧＡＧＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＴＧ－３’（配列番号２）
のプライマーセット、又は
センスプライマー：５’－ＡＡＡＴＴＴＴＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣ－３’（配列番号３）及び
アンチセンスプライマー：５’－ＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＧＧＴＣＡＡＣ－３’（配列番号４）
のプライマーセットを用いることができる。
前記ＰＣＲ工程（２）においては、前記ａの数の混合試料、ｂの数の混合試料、及びｃの数の混合試料のＰＣＲを実施する。ＰＣＲは、本分野で公知の方法によって実施することができる。
プライマーセットは、増幅するＤＮＡによって適宜選択することができ、標的ＤＮＡを増幅できるセンスプライマー（フォワードプライマー）及びアンチセンスプライマー（リバースプライマー）を用いればよい。例えば新型コロナウイルスの場合、例えば以下の公知のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
すなわち、
センスプライマー：５’－ＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＣＡＡＴＣ－３’（配列番号１）及び
アンチセンスプライマー：５’－ＧＡＧＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＴＧ－３’（配列番号２）
のプライマーセット、又は
センスプライマー：５’－ＡＡＡＴＴＴＴＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣ－３’（配列番号３）及び
アンチセンスプライマー：５’－ＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＧＧＴＣＡＡＣ－３’（配列番号４）
のプライマーセットを用いることができる。
前記のプライマーセットを用い、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩをＰＣＲの反応系に加えるインターカレーター法、又はプライマーセットと５’末端をレポーター色素で、３’末端をクエンチャー色素で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）とをＰＣＲの反応系に加えるＴａｑＭａｎ法等などによって増幅されたＤＮＡを検出することができる。例えば、ＴａｑＭａｎ法に用いられるプローブは、レポーター色素及びクエンチャー色素で標識されており、オリゴヌクレオチドの一端、例えば５’－末端にレポーター色素を結合させ、他端、例えば３’－末端にクエンチャー色素を結合させて標識したプローブを使用する。色素としては、ＰＣＲ法において従来より使用されている色素を特に限定せずに用いることができ、レポーター色素としては、例えば、６－カルボキシ－フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ－６－カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７－ジメトキシ－４，５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ－６－カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）等を挙げることができる。また、クエンチャー色素の例としては、例えば、６－カルボキシ－テトラメチル－ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、蛍光を発しないブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）等を挙げることができる。このようなリアルタイムＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されている。
ＤＮＡを増幅させるＰＣＲプロファイル（増幅サイクル）は、特に限定されないが、例えば（ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃～９５℃、約１５秒～１分間）、（ｉｉ）１本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマーとのアニーリング工程（約３７℃～７０℃、約２０秒～１分間）、及び（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約６５℃～８０℃、約２０秒～２分間）で実施することができる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、およびＳｅｑｕｉｔｈｅｒｍ ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
ＰＣＲ装置も、特に限定されるものではなく、ロックタイプ、キャピラリータイプの市販の装置を使用できるが、例えばＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライド・バイオシステムズ社）、又はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ II（タカラバイオ製）などを使用すればよい。
ＰＣＲ装置も、特に限定されるものではなく、ロックタイプ、キャピラリータイプの市販の装置を使用できるが、例えばＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライド・バイオシステムズ社）、又はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ II（タカラバイオ製）などを使用すればよい。
更に、試料中のＤＮＡのコピー数が少ない標的遺伝子の場合は、Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲによって、ＤＮＡを増幅して検出することもできる。
（ＲＴ－ＰＣＲ）
ＰＣＲの標的遺伝子がＲＮＡの場合は、ＲＴ－ＰＣＲを実施する。ＲＴ－ＰＣＲにおいては、試料からのＲＮＡ抽出、逆転写反応、及びＰＣＲ反応を行う。
ＲＮＡ抽出は、本分野で公知の方法を用いることができる。例えば、ホットフェノール法、グアニジンチオシアネート・ホット・フェノール法、又はグアニジンチオシアネート－グアニジン・塩酸法などが挙げられる。これらの原理を用いた市販のキットを用いてもよい。例えばカラムと抽出キットを組み合わせた、ＦａｓｔＰｕｒｅＴＭ ＲＮＡ Ｋｉｔ（タカラ社）、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＲＮＡｓｐｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）、ＦａｓｔＲＮＡ Ｐｒｏ Ｋｉｔ（キューバイオジーン社）、ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、アイソジェン（株式会社ニッポンジーン製）、トライゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＲＮＥａｓｙ Ｋｉｔシリーズ（キアゲン社）等を用いることができる。
ＲＮＡ抽出は、混合前の試料から実施してもよいが、効率を考えると、混合試料からＲＮＡ抽出することが好ましい。
ＰＣＲの標的遺伝子がＲＮＡの場合は、ＲＴ－ＰＣＲを実施する。ＲＴ－ＰＣＲにおいては、試料からのＲＮＡ抽出、逆転写反応、及びＰＣＲ反応を行う。
ＲＮＡ抽出は、本分野で公知の方法を用いることができる。例えば、ホットフェノール法、グアニジンチオシアネート・ホット・フェノール法、又はグアニジンチオシアネート－グアニジン・塩酸法などが挙げられる。これらの原理を用いた市販のキットを用いてもよい。例えばカラムと抽出キットを組み合わせた、ＦａｓｔＰｕｒｅＴＭ ＲＮＡ Ｋｉｔ（タカラ社）、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＲＮＡｓｐｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）、ＦａｓｔＲＮＡ Ｐｒｏ Ｋｉｔ（キューバイオジーン社）、ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、アイソジェン（株式会社ニッポンジーン製）、トライゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＲＮＥａｓｙ Ｋｉｔシリーズ（キアゲン社）等を用いることができる。
ＲＮＡ抽出は、混合前の試料から実施してもよいが、効率を考えると、混合試料からＲＮＡ抽出することが好ましい。
逆転写反応も、本分野で公知の方法を用いることができる。逆転写酵素としては、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、ＥＩＡＶ－ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）、又はその変異体が挙げられる。
逆転写反応に用いるプライマーは、特に限定されるものではないが、ランダムプライマー（例えば、ランダムヘキサマー）又はＰＣＲ用のアンチセンスプライマーを用いることができるが、特異性を向上させるためには、ＰＣＲ用のアンチセンスプライマーが好ましい。
逆転写反応に用いるプライマーは、特に限定されるものではないが、ランダムプライマー（例えば、ランダムヘキサマー）又はＰＣＲ用のアンチセンスプライマーを用いることができるが、特異性を向上させるためには、ＰＣＲ用のアンチセンスプライマーが好ましい。
逆転写反応で得られたｃＤＮＡをＰＣＲ反応に用いるが、ＰＣＲ反応は、前記のとおり実施することができる。しかしながら、ＲＴ－ＰＣＲの反応の場合、逆転写反応と、ＰＣＲ反応とをＰＣＲ装置で、連続し実施する市販のＲＴ－ＰＣＲキットを用いてもよい。
《位置特定工程（３）》
位置特定工程（３）においては、ＰＣＲの混合試料の判定結果から、陽性試料又は陽性の候補試料の３次元のＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の位置を特定する。
例えば、９６０試料に１つの陽性試料が含まれていた場合、第１段階のＰＣＲスクリーニングで１つの陽性試料を特定することができる。図１を用いて説明する。
９６０試料のそれぞれは、Ｘ軸の１つの混合試料、Ｙ軸の１つの混合試料、及びＺ軸の１つの試料に混合されている。従って、例えばｘ＝４の混合試料が陽性、ｙ＝４の混合試料が陽性、そしてｚ＝７の混合試料が陽性を示した場合、Ｘ軸の４の位置、Ｙ軸の４の位置、及びＺ軸の７の位置、（Ｘ、Ｙ、Ｚ）＝（４、４、７）の位置の試料が陽性であることが特定できる。
位置特定工程（３）においては、ＰＣＲの混合試料の判定結果から、陽性試料又は陽性の候補試料の３次元のＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の位置を特定する。
例えば、９６０試料に１つの陽性試料が含まれていた場合、第１段階のＰＣＲスクリーニングで１つの陽性試料を特定することができる。図１を用いて説明する。
９６０試料のそれぞれは、Ｘ軸の１つの混合試料、Ｙ軸の１つの混合試料、及びＺ軸の１つの試料に混合されている。従って、例えばｘ＝４の混合試料が陽性、ｙ＝４の混合試料が陽性、そしてｚ＝７の混合試料が陽性を示した場合、Ｘ軸の４の位置、Ｙ軸の４の位置、及びＺ軸の７の位置、（Ｘ、Ｙ、Ｚ）＝（４、４、７）の位置の試料が陽性であることが特定できる。
また、９６０試料に２つの陽性試料が含まれていた場合について、図２を用いて説明する。９６０試料に２つの陽性試料が含まれていた場合、最大で６つの混合試料が陽性となる。例えば、ｘ＝４の混合試料、ｘ＝８の混合試料、Ｙ＝４の混合試料、Ｙ＝７の混合試料、ｚ＝３の混合試料、及びｚ＝７の混合試料が陽性となった場合、（Ｘ、Ｙ、Ｚ）＝（４、４、３）、（４、４、７）、（４、７、３）、（４、７、７）、（８、４、３）、（８、４、７）、（８、７、３、）、及び（８、７、７）の８つの位置の試料が陽性である可能性がある。すなわち、これらの８つの位置の試料が陽性候補試料となる。従って、これらの８つの陽性候補試料について、２次ＰＣＲを行い、２つの陽性試料を特定すればよい。
更に、９６０試料に３つの陽性試料が含まれていた場合、２７の陽性候補試料（３６分の１）に絞り込むことができる。９６０試料に４つの陽性試料が含まれていた場合、６４の陽性候補試料（１５分の１）に絞り込むことができる。
９６０試料に５つの陽性試料が含まれていた場合、１２５の陽性候補試料（８分の１）に絞り込むことができる。これらの陽性候補試料について、２次ＰＣＲを行い、陽性試料を特定することができる。
９６０試料に５つの陽性試料が含まれていた場合、１２５の陽性候補試料（８分の１）に絞り込むことができる。これらの陽性候補試料について、２次ＰＣＲを行い、陽性試料を特定することができる。
《２次ＰＣＲ工程（４）》
２次ＰＣＲ工程（４）においては、前記位置特定工程（３）において、陽性候補試料として特定された試料について、個別の２次ＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応は、前記ＰＣＲ工程（２）に記載の操作で実施することができる。また、ＲＴ－ＰＣＲについても、前記ＰＣＲ工程（２）に記載の操作で実施することができる。２次ＰＣＲの実施によって、陽性候補試料から、陽性試料を特定することができる。
２次ＰＣＲ工程（４）においては、前記位置特定工程（３）において、陽性候補試料として特定された試料について、個別の２次ＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応は、前記ＰＣＲ工程（２）に記載の操作で実施することができる。また、ＲＴ－ＰＣＲについても、前記ＰＣＲ工程（２）に記載の操作で実施することができる。２次ＰＣＲの実施によって、陽性候補試料から、陽性試料を特定することができる。
《作用》
本発明の３次元ＰＣＲスクリーニング法は、プールＰＣＲ又は特許文献１のＰＣＲと比較して、大きなプールサイズの群のスクリーニングを効率的に実施することができる。特に大きなプールサイズに少数の陽性試料が含まれている場合に、非常に効率的にスクリーニングできる。従って、新型コロナウイルスの網羅的なＰＣＲにおいて、症状のない陽性試料を特定し、その陽性試料からの感染を防ぐことに有用に使用できる。また、非特許文献３に記載のＰＣＲ法と比較して、大きなプールサイズの群であっても分注操作が単純であり、容易にスクリーニングが実施できる。
本発明の３次元ＰＣＲスクリーニング法は、プールＰＣＲ又は特許文献１のＰＣＲと比較して、大きなプールサイズの群のスクリーニングを効率的に実施することができる。特に大きなプールサイズに少数の陽性試料が含まれている場合に、非常に効率的にスクリーニングできる。従って、新型コロナウイルスの網羅的なＰＣＲにおいて、症状のない陽性試料を特定し、その陽性試料からの感染を防ぐことに有用に使用できる。また、非特許文献３に記載のＰＣＲ法と比較して、大きなプールサイズの群であっても分注操作が単純であり、容易にスクリーニングが実施できる。
本発明の３次元ＰＣＲスクリーニング法は、大きなプールサイズの群から陽性試料をスクリーニングする方法として、効率的に用いることができる。
Claims (4)
- （１）Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の３次元に配置した試料を、
Ｘ軸の１つに相当するＹ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｘ軸のａの数の混合試料を作製し、
Ｙ軸の１つに相当するＸ軸及びＺ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｙ軸のｂの数の混合試料を作製し、そして
Ｚ軸の１つに相当するＸ軸及びＹ軸の試料を１つの混合試料とし、Ｚ軸のｃの数の混合試料を作製する工程、
（２）前記ａの数の混合試料、ｂの数の混合試料、及びｃの数の混合試料のＰＣＲを行う工程、及び
（３）ＰＣＲの混合試料の判定結果から、陽性試料又は陽性の候補試料の３次元のＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸の位置を特定する工程、
を含む、
３次元ＰＣＲスクリーニング法。 - （４）前記陽性の候補試料の個別の２次ＰＣＲを行う工程、を更に含む、請求項１に記載の３次元ＰＣＲスクリーニング法。
- 前記工程（２）のＰＣＲがＲＴ－ＰＣＲであり、試料からのＲＮＡ抽出、逆転写反応、及びＰＣＲ反応を行う、請求項１又は２に記載の３次元ＰＣＲスクリーニング法。
- 前記Ｘ軸の数ａが１２であり、前記Ｙ軸の数ｂが８であり、前記Ｚ軸の数ｃが１０である、請求項１～３のいずれか一項に記載の３次元ＰＣＲスクリーニング法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021054551A JP2022151973A (ja) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | ３次元ｐｃｒスクリーニング法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021054551A JP2022151973A (ja) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | ３次元ｐｃｒスクリーニング法 |
Publications (1)
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|---|---|
| JP2022151973A true JP2022151973A (ja) | 2022-10-12 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2021054551A Pending JP2022151973A (ja) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | ３次元ｐｃｒスクリーニング法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2022151973A (ja) |
-
2021
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