JP2022103174A - TGFβR2エンドヌクレアーゼバリアント、組成物、および使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】TGFβR2エンドヌクレアーゼバリアント、組成物、および使用方法の提供。【解決手段】本開示は、改善されたゲノム編集組成物、およびTGFβR2遺伝子を編集するための方法を提供する。本開示は、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも1つの症状の予防、治療、または緩和のためのゲノム編集された細胞をさらに提供する。本開示は、概して、ヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびmegaTALを含む組成物、ならびにその使用方法に部分的に関する。【選択図】図11
Description
関連出願の相互参照
本出願は、35U.S.C.§119(e)の下で、2016年10月28日出願の米国出願第62/414,260号、および2016年10月17日出願の米国仮出願第62/409,163号の利益を主張するものであり、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、35U.S.C.§119(e)の下で、2016年10月28日出願の米国出願第62/414,260号、および2016年10月17日出願の米国仮出願第62/409,163号の利益を主張するものであり、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むこのテキストファイルの名前は、BLBD_078_02WO_ST25.txtである。本テキストファイルは79KBであり、2017年10月17日に作成され、本明細書の出願と同時に、EFS-Webを介して電子的に提出されている。
背景
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むこのテキストファイルの名前は、BLBD_078_02WO_ST25.txtである。本テキストファイルは79KBであり、2017年10月17日に作成され、本明細書の出願と同時に、EFS-Webを介して電子的に提出されている。
背景
本開示は、改善されたゲノム編集組成物に関する。より具体的には、本開示は、ヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子を編集するための、ヌクレアーゼバリアント、組成物、およびそれらの使用方法に関する。
癌の世界的な負担は、1975年~2000年の間に2倍となった。癌は、世界中の疾病率および死亡率の2番目に高い要因であり、2012年において新たな症例はおよそ1410万件、癌関連死は820万件となっている。最も一般的な癌は、乳癌、肺および気管支癌、前立腺癌、結腸および直腸癌、膀胱癌、皮膚の黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂癌、子宮内膜癌、白血病、ならびに膵臓癌である。新たな癌症例件数は、今後20年以内で2200万件に上昇すると予想される。
免疫系は、ヒト癌の検出および撲滅において主要な役割を有する。形質転換された細胞の大部分は、免疫センチネルによって迅速に検出され、クローン的に発現されたT細胞受容体(TCR)を介した抗原特異的T細胞の活性化を通して破壊される。したがって、癌は、免疫学的障害、すなわち、この疾患を恒久的に抑制および排除するために必要な抗腫瘍応答を開始する免疫系の機能障害とみなすことができる。癌をより有効に撲滅するために、過去数十年間にわたって開発されたある特定の免疫療法介入は、T細胞免疫性を強化することに特に注力してきた。これらの治療は、疾患寛解の孤発例をもたらしてきたのみであり、実質的な全体的奏功は達成していない。CTLA-4またはPD-1などのT細胞活性化を阻害する分子を標的とするモノクローナル抗体を使用するより最近の療法は、より実質的な抗腫瘍効果を示してきたが、これらの治療はまた、全身免疫活性化に起因する実質的な毒性にも関連する。
より最近では、T細胞の単離、修飾、増大、および再注入に基づく養子細胞免疫療法戦略が探索されており、早期段階の臨床試験で試験されている。T細胞はしばしば、それらの選択的認識および強力なエフェクター機構に起因して、癌免疫療法のための一般的に好まれるエフェクター細胞となっている。これらの治療は、まちまちな奏効率を示してきたが、少数の患者は、恒久的な寛解を経験しており、T細胞ベースの免疫療法の未だ実現されていない可能性を強調している。
細胞溶解性T細胞による腫瘍細胞関連抗原の成功裏の認識は、標的とする腫瘍の溶解を惹起し、任意の有効な癌免疫療法手法を実証する。腫瘍浸潤T細胞(TIL)は、腫瘍関連抗原に特異的に指向されたTCRを発現するが、実質的な数のTILは、少数のヒト癌のみに限定される。遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)およびキメラ抗原受容体(CAR)は、多くの癌および他の免疫障害に対するT細胞ベースの免疫療法の適用性を増加させる可能性がある。
その上、最新技術による遺伝子操作されたT細胞は依然として、癌細胞、炎症性細胞、間質細胞、およびサイトカインからなる複雑な免疫抑制腫瘍微小環境によって調節される。これらの構成要素のうち、癌細胞、炎症性細胞、および抑制性サイトカインがT細胞表現型および機能に不利に影響する。集合的に、腫瘍微小環境は、T細胞が疲弊したT細胞へと最終的に分化するよう駆り立てる。
T細胞疲弊は、阻害性受容体の増加した発現または阻害性受容体による増加したシグナル伝達、低減されたエフェクターサイトカイン産生、および持続して癌を排除する能力の減少によって特徴付けられる慢性的環境における、T細胞機能不全の状態である。疲弊したT細胞はまた、階層的様式で機能喪失を示し、すなわち、減少したIL-2産生およびエクスビボでの殺傷能力が疲弊の早期段階で喪失され、TNF-α産生が中期段階で喪失され、IFN-γおよびGzmB産生が疲弊の後期段階で喪失される。腫瘍微小環境におけるほとんどのT細胞は、疲弊したT細胞へと分化し、癌を排除する能力を喪失し、最終的には取り除かれる。
TGFβは、腫瘍微小環境において免疫抑制シグナル伝達分子として関連している多面性サイトカインである。TGFβは、TGFβR1およびTGFβR2セリン/スレオニンキナーゼ受容体複合体に結合し、下流転写因子Smad2およびSmad3の受容体媒介性リン酸化をもたらす。多くの腫瘍は、TGFβR2受容体および/または下流Smadシグナル伝達タンパク質中の変異を獲得することによって、TGFβの細胞静止性および抗増殖性効果から逃れる。TGFβは、IFNγ分泌を含む、インビトロのT細胞のエフェクターおよび細胞溶解性活性に関与する重要な分子を抑制する。
現在まで、中和Absまたはキナーゼ阻害剤を使用するTGFβシグナル伝達の阻害に指向された臨床試験は、残念な結果をもたらしており、著しい療法的利益は報告されていない。
本開示は、概して、ヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびmegaTALを含む組成物、ならびにその使用方法に部分的に関する。
種々の実施形態において、本開示は、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)バリアントを含むポリペプチドを部分的に企図する。
特定の実施形態において、HEバリアントは、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)バリアントである。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、HEバリアントの生物学的に活性な断片を含む。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、5、6、7、または8個のN末端アミノ酸を欠いている。
追加の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、4個のN末端アミノ酸を欠いている。
ある特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、8個のN末端アミノ酸を欠いている。
特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、または5個のC末端アミノ酸を欠いている。
特定の実施形態において、ここで、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、C末端アミノ酸を欠いている。
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型HEと比較して、2個のC末端アミノ酸を欠いている。
さらなる実施形態において、HEバリアントは、I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、およびI-Vdi141Iからなる群から選択されるLHEのバリアントである。
特定の実施形態において、HEバリアントは、I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEのバリアントである。
さらなる実施形態において、HEバリアントは、I-OnuI LHEバリアントである。
追加の実施形態において、HEバリアントは、配列番号:1~5に記載のI-OnuI
LHEアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて1つ以上のアミノ酸置換を含む。
LHEアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて1つ以上のアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号:1~5に記載のI-OnuI
LHEアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を含む。
LHEアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの位置:26、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、75、76、78、80、116、138、143、159、168、178、180、182、184、188、190、192、193、195、197、199、203、207、223、225、227、232、240、および264からなる位置群から選択される少なくとも1つの位置において少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態において、HEバリアントは、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190RもしくはS190G、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223R、Y223H、K225Y、K227R、F232N、T240R、およびE264Kのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む。
いくつかの実施形態において、HEバリアントは、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190R、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225Y、K227R、F232N、およびT240Rのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190R、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227R、F232N、T240R、およびE264Kのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む。
追加の実施形態において、HEバリアントは、配列番号:6もしくは7に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性な断片と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、またはさらにより好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号:6に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、配列番号:7に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号:11に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、DNA結合ドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態において、DNA結合ドメインは、TALE DNA結合ドメインおよび亜鉛フィンガーDNA結合ドメインからなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、約9.5のTALE繰り返し単位~約15.5のTALE繰り返し単位を含む。
追加の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、TGFβR2遺伝子内のポリヌクレオチド配列に結合する。
特定の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、配列番号:12に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号:13に記載されるポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
ある特定の実施形態において、亜鉛フィンガーDNA結合ドメインは、2、3、4、5、6、7、または8つの亜鉛フィンガーモチーフを含む。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ペプチドリンカーおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ウイルス自己切断型2Aペプチドおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む。
追加の実施形態において、エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片は、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、3´-5´エクソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性DNAポリメラーゼ活性を有する。
特定の実施形態において、エンドプロセシング酵素は、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号:8~9のいずれか1つに記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号:8に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号:9に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号:11または13に記載されるポリヌクレオチド配列でヒトTGFβR2遺伝子を切断する。
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを部分的に企図する。
特定の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするmRNAを部分的に企図する。
特定の実施形態において、mRNAは、配列番号:20に記載される配列を含む。
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするcDNAを部分的に企図する。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを部分的に企図する。
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドを含む細胞を部分的に企図する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を部分的に企図する。
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるベクターを含む細胞を部分的に企図する。
追加の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドによって導入された1つ以上のゲノム修飾を含む細胞を部分的に企図する。
特定の実施形態において、本細胞は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターをさらに含む。
特定の実施形態において、RNAポリメラーゼIIプロモーターは、短EF1αプロモーター、長EF1αプロモーター、ヒトROSA26遺伝子座、ユビキチンC(UBC)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーター、β-アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および/またはそれらに隣接する1つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする。
いくつかの実施形態において、自己切断型ウイルスペプチドは、2Aペプチドである。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む。
いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む。
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む。
ある特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーの細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインは、TGFβR2細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインである。
いくつかの実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性T細胞エンゲイジャー分子(BiTE)、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される。
特定の実施形態において、免疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。
追加の実施形態において、フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインのC末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む。
ある特定の実施形態において、フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインと、CD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、TGFβR2細胞外ドメインのC末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む。
特定の実施形態において、フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインと、TGFβR2細胞外ドメインのC末端終端にフレーム内で融合されたCD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む。
追加の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたTCR、CAR、Daric、またはゼータカイン(zetakine)からなる群から選択される。
特定の実施形態において、遺伝子操作された受容体は、TGFβR2遺伝子に一体化されない。
ある特定の実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードするポリヌクレオチドは、TGFβR2遺伝子に一体化される。
さらなる実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートは、本明細書で企図されるポリペプチドによって導入されたDNA2本鎖の破断部位でTGFβR2遺伝子に一体化される。
いくつかの実施形態において、本細胞は、造血細胞である。
追加の実施形態において、本細胞は、T細胞である。
特定の実施形態において、本細胞は、CD3+、CD4+、および/またはCD8+細胞である。
特定の実施形態において、本細胞は、免疫エフェクター細胞である。
さらなる実施形態において、本細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞である。
ある特定の実施形態において、本細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞またはナチュラルキラーT(NKT)細胞である。
特定の実施形態において、本細胞の源は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
特定の実施形態において、本開示は、本明細書で企図される1つ以上の細胞を含む複数の細胞を部分的に企図する。
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図される1つ以上の細胞を含む組成物を部分的に企図する。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で企図される1つ以上の細胞と、生理学的に許容可能な担体と、を含む組成物を部分的に企図する。
種々の実施形態において、本開示は、細胞内に本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、ここで、ポリペプチドの発現が、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位で2本鎖の破断を作成する、細胞内のヒトTGFβR2遺伝子を編集する方法を部分的に企図する。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞内に本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、ここで、ポリペプチドの発現が、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位で2本鎖の破断を作成し、破断が、非相同末端結合(NHEJ)によって修復される、細胞内のヒトTGFβR2遺伝子を編集する方法を部分的に企図する。
種々の実施形態において、本開示は、細胞内に本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびドナー修復テンプレートを導入することを含み、ここで、ポリペプチドの発現が、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位で2本鎖の破断を作成し、ドナー修復テンプレートが、2本鎖の破断(DSB)の部位で相同組換え修復(HDR)によってヒトTGFβR2遺伝子内に組み込まれる、細胞内のヒトTGFβR2遺伝子を編集する方法を部分的に企図する。
さらなる実施形態において、本細胞は、造血細胞である。
特定の実施形態において、本細胞は、T細胞である。
特定の実施形態において、本細胞は、CD3+、CD4+、および/またはCD8+細胞である。
ある特定の実施形態において、本細胞は、免疫エフェクター細胞である。
いくつかの実施形態において、本細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞である。
特定の実施形態において、本細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞またはナチュラルキラーT(NKT)細胞である。
ある特定の実施形態において、本細胞の源は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
特定の実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、mRNAである。
追加の実施形態において、5´-3´エクソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、本細胞内に導入されている。
いくつかの実施形態において、Trex2またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、本細胞内に導入されている。
さらなる実施形態において、ドナー修復テンプレートは、TGFβR2遺伝子、または野生型TGFβR2遺伝子と比較して、1つ以上の変異を含むその部分をコードする。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードする。
追加の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターをさらに含む。
さらなる実施形態において、RNAポリメラーゼIIプロモーターは、短EF1αプロモーター、長EF1αプロモーター、ヒトROSA26遺伝子座、ユビキチンC(UBC)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーター、β-アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターからなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および/またはそれらに隣接する1つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする。
追加の実施形態において、自己切断型ウイルスペプチドは、2Aペプチドである。
いくつかの実施形態において、ドナー修復テンプレートは、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
ある特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む。
さらなる実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む。
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む。
追加の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーの細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインは、TGFβR2細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインである。
ある特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性T細胞エンゲイジャー分子(BiTE)、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される。
さらなる実施形態において、疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。
特定の実施形態において、フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインのC末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む。
追加の実施形態において、フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインと、CD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、TGFβR2細胞外ドメインのC末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む。
さらなる実施形態において、フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインと、TGFβR2細胞外ドメインのC末端終端にフレーム内で融合されたCD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む。
追加の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたTCR、CAR、Daric、またはゼータカイン(zetakine)からなる群から選択される。
追加の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、DSBのヒトTGFβR2遺伝子配列5´に対して相同な5´相同アームと、DSBのヒトTGFβR2遺伝子配列3´に対して相同な3´相同アームと、を含む。
特定の実施形態において、5´および3´相同アームの長さは独立して、約100bp~約2500bpから選択される。
いくつかの実施形態において、5´および3´相同アームの長さは独立して、約600bp~約1500bpから選択される。
いくつかの実施形態において、5´相同アームは約1500bpであり、3´相同アームは約1000bpである。
ある特定の実施形態において、5´相同アームは約600bpであり、3´相同アームは約600bpである。
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、本細胞内にドナー修復テンプレートを導入するために使用される。
追加の実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)またはレトロウイルスである。
さらなる実施形態において、rAAVは、AAV2由来の1つ以上のITRを有する。
ある特定の実施形態において、rAAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、およびAAV10からなる群から選択される血清型を有する。
追加の実施形態において、rAAVは、AAV2またはAAV6血清型を有する。
いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
特定の実施形態において、レンチウイルスは、インテグラーゼ欠損レンチウイルス(IDLV)である。
種々の実施形態において、本開示は、有効量の本明細書で企図される組成物を対象に投与することを含む、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも1つの症状を治療、予防、または緩和する方法を部分的に企図する。
種々の実施形態において、本開示は、有効量の本明細書で企図される組成物を対象に投与することを含む、固形癌を治療する方法を部分的に企図する。
さらなる実施形態において、固形癌は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む。
種々の実施形態において、本開示は、有効量の本明細書で企図される組成物を対象に投与することを含む、血液学的悪性腫瘍を治療する方法を部分的に企図する。
追加の実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
ヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)バリアントを含む、ポリペプチド。
(項目2)
前記HEバリアントが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)バリアントである、項目1に記載のポリペプチド。
(項目3)
前記ポリペプチドが、前記HEバリアントの生物学的に活性な断片を含む、項目1または項目2に記載のポリペプチド。
(項目4)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、5、6、7、または8個のN末端アミノ酸を欠いている、項目3に記載のポリペプチド。
(項目5)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、4個のN末端アミノ酸を欠いている、項目4に記載のポリペプチド。
(項目6)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、8個のN末端アミノ酸を欠いている、項目4に記載のポリペプチド。
(項目7)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、または5個のC末端アミノ酸を欠いている、項目3に記載のポリペプチド。
(項目8)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、C末端アミノ酸を欠いている、項目7に記載のポリペプチド。
(項目9)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、2個のC末端アミノ酸を欠いている、項目7に記載のポリペプチド。
(項目10)
前記HEバリアントが、I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、およびI-Vdi141Iからなる群から選択されるLHEのバリアントである、項目1~9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目11)
前記HEバリアントが、I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEのバリアントである、項目1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目12)
前記HEバリアントが、I-OnuI LHEバリアントである、項目1~11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目13)
前記HEバリアントが、配列番号:1~5に記載のI-OnuI LHEアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目14)
前記HEバリアントが、配列番号:1~5に記載のI-OnuI LHEアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を含む、項目1~13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目15)
前記HEバリアントが、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの位置:26、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、75、76、78、80、116、138、143、159、168、178、180、182、184、188、190、192、193、195、197、199、203、207、223、225、227、232、240、および264からなる位置群から選択される少なくとも1つの位置において少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を含む、項目1~14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目16)
前記HEバリアントが、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190RもしくはS190G、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223R、Y223H、K225Y、K227R、F232N、T240R、およびE264Kのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む、項目1~15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目17)
前記HEバリアントが、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190R、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225Y、K227R、F232N、およびT240Rのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む、項目1~15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目18)
前記HEバリアントが、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190R、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227R、F232N、T240R、およびE264Kのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む、項目1~15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目19)
前記HEバリアントが、配列番号:6もしくは7に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性な断片と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、またはさらにより好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、項目1~18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目20)
前記HEバリアントが、配列番号:6に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目1~19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目21)
前記HEバリアントが、配列番号:7に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目1~19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目22)
前記ポリペプチドが、配列番号:11に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する、項目1~21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目23)
DNA結合ドメインをさらに含む、項目1~22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目24)
前記DNA結合ドメインが、TALE DNA結合ドメインおよび亜鉛フィンガーDNA結合ドメインからなる群から選択される、項目23に記載のポリペプチド。
(項目25)
前記TALE DNA結合ドメインが、約9.5のTALE繰り返し単位~約15.5のTALE繰り返し単位を含む、項目24に記載のポリペプチド。
(項目26)
前記TALE DNA結合ドメインが、前記TGFβR2遺伝子内のポリヌクレオチド配列に結合する、項目24または項目25に記載のポリペプチド。
(項目27)
前記TALE DNA結合ドメインが、配列番号:12に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する、項目24~26のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目28)
前記ポリペプチドが、配列番号:13に記載されるポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する、項目27に記載のポリペプチド。
(項目29)
前記亜鉛フィンガーDNA結合ドメインが、2、3、4、5、6、7、または8つの亜鉛フィンガーモチーフを含む、項目24に記載のポリペプチド。
(項目30)
ペプチドリンカーおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む、項目1~29のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目31)
ウイルス自己切断型2Aペプチドおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む、項目1~30のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目32)
前記エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片が、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、3´-5´エクソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性DNAポリメラーゼ活性を有する、項目30または項目31に記載のポリペプチド。
(項目33)
前記エンドプロセシング酵素が、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む、項目30~32のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目34)
前記ポリペプチドが、配列番号:8もしくは配列番号:9に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目1~33のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目35)
前記ポリペプチドが、配列番号:8に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目34に記載のポリペプチド。
(項目36)
前記ポリペプチドが、配列番号:9に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目34に記載のポリペプチド。
(項目37)
前記ポリペプチドが、配列番号:11または13に記載されるポリヌクレオチド配列で前記ヒトTGFβR2遺伝子を切断する、項目1~36のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目38)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
(項目39)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、mRNA。
(項目40)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、cDNA。
(項目41)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目42)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、細胞。
(項目43)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
(項目44)
項目41に記載のベクターを含む、細胞。
(項目45)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入された1つ以上のゲノム修飾を含む、細胞。
(項目46)
前記細胞が、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む、項目42~45のいずれか一項に記載の細胞。
(項目47)
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターをさらに含む、項目46に記載の細胞。
(項目48)
前記RNAポリメラーゼIIプロモーターが、短EF1αプロモーター、長EF1αプロモーター、ヒトROSA26遺伝子座、ユビキチンC(UBC)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーター、β-アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターからなる群から選択される、項目47に記載の細胞。
(項目49)
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および/またはそれらに隣接する1つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする、項目46~48のいずれか一項に記載の細胞。
(項目50)
前記自己切断型ウイルスペプチドが、2Aペプチドである、項目49に記載の細胞。
(項目51)
前記ポリヌクレオチドが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目46~50のいずれか一項に記載の細胞。
(項目52)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目53)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、項目52に記載の細胞。
(項目54)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
(a)免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、
(b)免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または
(c)免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目55)
前記免疫抑制シグナルダンパーの前記細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインが、前記TGFβR2細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインである、項目54に記載の細胞。
(項目56)
前記免疫力エンハンサーが、二重特異性T細胞エンゲイジャー分子(BiTE)、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目57)
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、項目56に記載の細胞。
(項目58)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインと、前記TGFβR2膜貫通ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目56に記載の細胞。
(項目59)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、CD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、前記TGFβR2細胞外ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目56に記載の細胞。
(項目60)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、前記TGFβR2細胞外ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む、項目56に記載の細胞。
(項目61)
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたTCR、CAR、Daric、またはゼータカイン(zetakine)からなる群から選択される、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目62)
前記遺伝子操作された受容体が、前記TGFβR2遺伝子に一体化されない、項目61に記載の細胞。
(項目63)
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドが、前記TGFβR2遺伝子に一体化される、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目64)
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートが、項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入されたDNA2本鎖の破断部位で前記TGFβR2遺伝子に一体化される、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目65)
前記細胞が、造血細胞である、項目42~64のいずれか一項に記載の細胞。
(項目66)
前記細胞が、T細胞である、項目42~65のいずれか一項に記載の細胞。
(項目67)
前記細胞が、CD3+、CD4+、および/またはCD8+細胞である、項目42~66のいずれか一項に記載の細胞。
(項目68)
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、項目42~67のいずれか一項に記載の細胞。
(項目69)
前記細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞である、項目42~68のいずれか一項に記載の細胞。
(項目70)
前記細胞が、ナチュラルキラー(NK)細胞またはナチュラルキラーT(NKT)細胞である、項目42~68のいずれか一項に記載の細胞。
(項目71)
前記細胞の源が、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、項目42~70のいずれか一項に記載の細胞。
(項目72)
前記細胞が、1つ以上の修飾されたTGFβR2対立遺伝子を含む、項目42~71のいずれか一項に記載の細胞。
(項目73)
前記1つ以上の修飾されたTGFβR2対立遺伝子が、機能不全であるか、または実質的に低減されたTGFβR2機能および/もしくは細胞内シグナル伝達を有する、項目72に記載の細胞。
(項目74)
前記細胞が、前記1つ以上の修飾されたTGFβR2対立遺伝子内に導入された免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする核酸を含み、かつ前記細胞が、前記1つ以上の修飾TGFβR2対立遺伝子内に導入されていない遺伝子操作された抗原受容体をさらに含む、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目75)
項目42~74のいずれか一項に記載の1つ以上の細胞を含む、複数の細胞。
(項目76)
項目42~74のいずれか一項に記載の1つ以上の細胞を含む、組成物。
(項目77)
項目42~74のいずれか一項に記載の1つ以上の細胞と、生理学的に許容可能な担体と、を含む、組成物。
(項目78)
細胞内のヒトTGFβR2遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位で2本鎖の破断を作成する、方法。
(項目79)
細胞内のヒトTGFβR2遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位で2本鎖の破断を作成し、前記破断が、非相同末端結合(NHEJ)によって修復される、方法。
(項目80)
細胞内のヒトTGFβR2遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびドナー修復テンプレートを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位で2本鎖の破断を作成し、前記ドナー修復テンプレートが、前記2本鎖の破断(DSB)の前記部位で相同組換え修復(HDR)によって前記ヒトTGFβR2遺伝子内に組み込まれる、方法。
(項目81)
前記細胞が、造血細胞である、項目78~80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
前記細胞が、T細胞である、項目78~81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記細胞が、CD3+、CD4+、および/またはCD8+細胞である、項目78~82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、項目78~83のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞である、項目78~84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
前記細胞が、ナチュラルキラー(NK)細胞またはナチュラルキラーT(NKT)細胞である、項目78~84のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記細胞の源が、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、項目78~86のいずれか一項に記載の方法。
(項目88)
前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、mRNAである、項目78~87のいずれか一項に記載の方法。
(項目89)
5´-3´エクソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記細胞内に導入されている、項目78~88のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
Trex2またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、前記細胞内に導入されている、項目78~89のいずれか一項に記載の方法。
(項目91)
前記ドナー修復テンプレートが、TGFβR2遺伝子、または前記野生型TGFβR2遺伝子と比較して、1つ以上の変異を含むその部分をコードする、項目80~90のいずれか一項に記載の方法.
(項目92)
前記ドナー修復テンプレートが、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードする、項目80~91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターをさらに含む、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記RNAポリメラーゼIIプロモーターが、短EF1αプロモーター、長EF1αプロモーター、ヒトROSA26遺伝子座、ユビキチンC(UBC)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーター、β-アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターからなる群から選択される、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および/またはそれらに隣接する1つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする、項目92~94のいずれか一項に記載の方法。
(項目96)
前記自己切断型ウイルスペプチドが、2Aペプチドである、項目95に記載の方法。
(項目97)
前記ドナー修復テンプレートが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目92~96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、項目92~97のいずれか一項に記載の方法。
(項目99)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、項目98に記載の方法。
(項目100)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
(a)免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、
(b)免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または
(c)免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む、項目92~97のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記免疫抑制シグナルダンパーの前記細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインが、前記TGFβR2細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインである、項目100に記載の方法。
(項目102)
前記免疫力エンハンサーが、二重特異性T細胞エンゲイジャー分子(BiTE)、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、項目92~97のいずれか一項に記載の方法。
(項目103)
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインと、前記TGFβR2膜貫通ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目102に記載の方法。
(項目105)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、CD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、前記TGFβR2細胞外ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目102に記載の方法。
(項目106)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、前記TGFβR2細胞外ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む、項目102に記載の方法。
(項目107)
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたTCR、CAR、Daric、またはゼータカインからなる群から選択される、項目92~97のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記ドナー修復テンプレートが、前記DSBのヒトTGFβR2遺伝子配列5´に対して相同な5´相同アームと、前記DSBのヒトTGFβR2遺伝子配列3´に対して相同な3´相同アームと、を含む、項目80~107のいずれか一項に記載の方法。
(項目109)
前記5´および3´相同アームの長さが、約100bp~約2500bpから独立して選択される、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記5´および3´相同アームの長さが、約600bp~約1500bpから独立して選択される、項目108または項目109に記載の方法。
(項目111)
前記5´相同アームが約1500bpであり、前記3´相同アームが約1000bpである、項目108~110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
前記5´相同アームが約600bpであり、前記3´相同アームが約600bpである、項目108~111のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
ウイルスベクターが、前記細胞内に前記ドナー修復テンプレートを導入するために使用される、項目80~112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)またはレトロウイルスである、項目113に記載の方法。
(項目115)
前記rAAVが、AAV2由来の1つ以上のITRを有する、項目114に記載の方法。
(項目116)
前記rAAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、およびAAV10からなる群から選択される血清型を有する、項目114または項目115に記載の方法。
(項目117)
前記rAAVが、AAV2またはAAV6血清型を有する、項目114~116のいずれか一項に記載の方法。
(項目118)
前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、項目114に記載の方法。
(項目119)
前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルス(IDLV)である、項目118に記載の方法。
(項目120)
有効量の項目76または項目77に記載の組成物を対象に投与することを含む、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも1つの症状を治療、予防、または緩和する、方法。
(項目121)
有効量の項目76または項目77に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、固形癌を治療する方法。
(項目122)
前記固形癌が、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む、項目121に記載の方法。
(項目123)
有効量の項目76または項目77に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、血液学的悪性腫瘍を治療する方法。
(項目124)
前記血液学的悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、項目123に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
ヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)バリアントを含む、ポリペプチド。
(項目2)
前記HEバリアントが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)バリアントである、項目1に記載のポリペプチド。
(項目3)
前記ポリペプチドが、前記HEバリアントの生物学的に活性な断片を含む、項目1または項目2に記載のポリペプチド。
(項目4)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、5、6、7、または8個のN末端アミノ酸を欠いている、項目3に記載のポリペプチド。
(項目5)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、4個のN末端アミノ酸を欠いている、項目4に記載のポリペプチド。
(項目6)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、8個のN末端アミノ酸を欠いている、項目4に記載のポリペプチド。
(項目7)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、1、2、3、4、または5個のC末端アミノ酸を欠いている、項目3に記載のポリペプチド。
(項目8)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、C末端アミノ酸を欠いている、項目7に記載のポリペプチド。
(項目9)
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型HEと比較して、2個のC末端アミノ酸を欠いている、項目7に記載のポリペプチド。
(項目10)
前記HEバリアントが、I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、およびI-Vdi141Iからなる群から選択されるLHEのバリアントである、項目1~9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目11)
前記HEバリアントが、I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI、およびSmaMIからなる群から選択されるLHEのバリアントである、項目1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目12)
前記HEバリアントが、I-OnuI LHEバリアントである、項目1~11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目13)
前記HEバリアントが、配列番号:1~5に記載のI-OnuI LHEアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目14)
前記HEバリアントが、配列番号:1~5に記載のI-OnuI LHEアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を含む、項目1~13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目15)
前記HEバリアントが、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの位置:26、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、75、76、78、80、116、138、143、159、168、178、180、182、184、188、190、192、193、195、197、199、203、207、223、225、227、232、240、および264からなる位置群から選択される少なくとも1つの位置において少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を含む、項目1~14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目16)
前記HEバリアントが、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190RもしくはS190G、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223R、Y223H、K225Y、K227R、F232N、T240R、およびE264Kのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む、項目1~15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目17)
前記HEバリアントが、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190R、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225Y、K227R、F232N、およびT240Rのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む、項目1~15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目18)
前記HEバリアントが、TGFβR2標的部位を切断し、配列番号:1~5またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか1つの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190R、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227R、F232N、T240R、およびE264Kのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む、項目1~15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目19)
前記HEバリアントが、配列番号:6もしくは7に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性な断片と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、またはさらにより好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、項目1~18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目20)
前記HEバリアントが、配列番号:6に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目1~19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目21)
前記HEバリアントが、配列番号:7に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目1~19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目22)
前記ポリペプチドが、配列番号:11に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する、項目1~21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目23)
DNA結合ドメインをさらに含む、項目1~22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目24)
前記DNA結合ドメインが、TALE DNA結合ドメインおよび亜鉛フィンガーDNA結合ドメインからなる群から選択される、項目23に記載のポリペプチド。
(項目25)
前記TALE DNA結合ドメインが、約9.5のTALE繰り返し単位~約15.5のTALE繰り返し単位を含む、項目24に記載のポリペプチド。
(項目26)
前記TALE DNA結合ドメインが、前記TGFβR2遺伝子内のポリヌクレオチド配列に結合する、項目24または項目25に記載のポリペプチド。
(項目27)
前記TALE DNA結合ドメインが、配列番号:12に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する、項目24~26のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目28)
前記ポリペプチドが、配列番号:13に記載されるポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する、項目27に記載のポリペプチド。
(項目29)
前記亜鉛フィンガーDNA結合ドメインが、2、3、4、5、6、7、または8つの亜鉛フィンガーモチーフを含む、項目24に記載のポリペプチド。
(項目30)
ペプチドリンカーおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む、項目1~29のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目31)
ウイルス自己切断型2Aペプチドおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む、項目1~30のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目32)
前記エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片が、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、3´-5´エクソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性DNAポリメラーゼ活性を有する、項目30または項目31に記載のポリペプチド。
(項目33)
前記エンドプロセシング酵素が、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む、項目30~32のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目34)
前記ポリペプチドが、配列番号:8もしくは配列番号:9に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目1~33のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目35)
前記ポリペプチドが、配列番号:8に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目34に記載のポリペプチド。
(項目36)
前記ポリペプチドが、配列番号:9に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、項目34に記載のポリペプチド。
(項目37)
前記ポリペプチドが、配列番号:11または13に記載されるポリヌクレオチド配列で前記ヒトTGFβR2遺伝子を切断する、項目1~36のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目38)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
(項目39)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、mRNA。
(項目40)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、cDNA。
(項目41)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目42)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、細胞。
(項目43)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
(項目44)
項目41に記載のベクターを含む、細胞。
(項目45)
項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入された1つ以上のゲノム修飾を含む、細胞。
(項目46)
前記細胞が、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む、項目42~45のいずれか一項に記載の細胞。
(項目47)
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターをさらに含む、項目46に記載の細胞。
(項目48)
前記RNAポリメラーゼIIプロモーターが、短EF1αプロモーター、長EF1αプロモーター、ヒトROSA26遺伝子座、ユビキチンC(UBC)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーター、β-アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターからなる群から選択される、項目47に記載の細胞。
(項目49)
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および/またはそれらに隣接する1つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする、項目46~48のいずれか一項に記載の細胞。
(項目50)
前記自己切断型ウイルスペプチドが、2Aペプチドである、項目49に記載の細胞。
(項目51)
前記ポリヌクレオチドが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目46~50のいずれか一項に記載の細胞。
(項目52)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目53)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、項目52に記載の細胞。
(項目54)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
(a)免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、
(b)免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または
(c)免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目55)
前記免疫抑制シグナルダンパーの前記細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインが、前記TGFβR2細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインである、項目54に記載の細胞。
(項目56)
前記免疫力エンハンサーが、二重特異性T細胞エンゲイジャー分子(BiTE)、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目57)
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、項目56に記載の細胞。
(項目58)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインと、前記TGFβR2膜貫通ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目56に記載の細胞。
(項目59)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、CD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、前記TGFβR2細胞外ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目56に記載の細胞。
(項目60)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、前記TGFβR2細胞外ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む、項目56に記載の細胞。
(項目61)
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたTCR、CAR、Daric、またはゼータカイン(zetakine)からなる群から選択される、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目62)
前記遺伝子操作された受容体が、前記TGFβR2遺伝子に一体化されない、項目61に記載の細胞。
(項目63)
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドが、前記TGFβR2遺伝子に一体化される、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目64)
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートが、項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入されたDNA2本鎖の破断部位で前記TGFβR2遺伝子に一体化される、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目65)
前記細胞が、造血細胞である、項目42~64のいずれか一項に記載の細胞。
(項目66)
前記細胞が、T細胞である、項目42~65のいずれか一項に記載の細胞。
(項目67)
前記細胞が、CD3+、CD4+、および/またはCD8+細胞である、項目42~66のいずれか一項に記載の細胞。
(項目68)
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、項目42~67のいずれか一項に記載の細胞。
(項目69)
前記細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞である、項目42~68のいずれか一項に記載の細胞。
(項目70)
前記細胞が、ナチュラルキラー(NK)細胞またはナチュラルキラーT(NKT)細胞である、項目42~68のいずれか一項に記載の細胞。
(項目71)
前記細胞の源が、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、項目42~70のいずれか一項に記載の細胞。
(項目72)
前記細胞が、1つ以上の修飾されたTGFβR2対立遺伝子を含む、項目42~71のいずれか一項に記載の細胞。
(項目73)
前記1つ以上の修飾されたTGFβR2対立遺伝子が、機能不全であるか、または実質的に低減されたTGFβR2機能および/もしくは細胞内シグナル伝達を有する、項目72に記載の細胞。
(項目74)
前記細胞が、前記1つ以上の修飾されたTGFβR2対立遺伝子内に導入された免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする核酸を含み、かつ前記細胞が、前記1つ以上の修飾TGFβR2対立遺伝子内に導入されていない遺伝子操作された抗原受容体をさらに含む、項目46~51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目75)
項目42~74のいずれか一項に記載の1つ以上の細胞を含む、複数の細胞。
(項目76)
項目42~74のいずれか一項に記載の1つ以上の細胞を含む、組成物。
(項目77)
項目42~74のいずれか一項に記載の1つ以上の細胞と、生理学的に許容可能な担体と、を含む、組成物。
(項目78)
細胞内のヒトTGFβR2遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位で2本鎖の破断を作成する、方法。
(項目79)
細胞内のヒトTGFβR2遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位で2本鎖の破断を作成し、前記破断が、非相同末端結合(NHEJ)によって修復される、方法。
(項目80)
細胞内のヒトTGFβR2遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に項目1~37のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびドナー修復テンプレートを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位で2本鎖の破断を作成し、前記ドナー修復テンプレートが、前記2本鎖の破断(DSB)の前記部位で相同組換え修復(HDR)によって前記ヒトTGFβR2遺伝子内に組み込まれる、方法。
(項目81)
前記細胞が、造血細胞である、項目78~80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
前記細胞が、T細胞である、項目78~81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記細胞が、CD3+、CD4+、および/またはCD8+細胞である、項目78~82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、項目78~83のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞である、項目78~84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
前記細胞が、ナチュラルキラー(NK)細胞またはナチュラルキラーT(NKT)細胞である、項目78~84のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記細胞の源が、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、項目78~86のいずれか一項に記載の方法。
(項目88)
前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、mRNAである、項目78~87のいずれか一項に記載の方法。
(項目89)
5´-3´エクソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記細胞内に導入されている、項目78~88のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
Trex2またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、前記細胞内に導入されている、項目78~89のいずれか一項に記載の方法。
(項目91)
前記ドナー修復テンプレートが、TGFβR2遺伝子、または前記野生型TGFβR2遺伝子と比較して、1つ以上の変異を含むその部分をコードする、項目80~90のいずれか一項に記載の方法.
(項目92)
前記ドナー修復テンプレートが、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの1つ以上をコードする、項目80~91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターをさらに含む、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記RNAポリメラーゼIIプロモーターが、短EF1αプロモーター、長EF1αプロモーター、ヒトROSA26遺伝子座、ユビキチンC(UBC)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーター、β-アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターからなる群から選択される、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および/またはそれらに隣接する1つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする、項目92~94のいずれか一項に記載の方法。
(項目96)
前記自己切断型ウイルスペプチドが、2Aペプチドである、項目95に記載の方法。
(項目97)
前記ドナー修復テンプレートが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目92~96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、項目92~97のいずれか一項に記載の方法。
(項目99)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、項目98に記載の方法。
(項目100)
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
(a)免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、
(b)免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または
(c)免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む、項目92~97のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記免疫抑制シグナルダンパーの前記細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインが、前記TGFβR2細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメインである、項目100に記載の方法。
(項目102)
前記免疫力エンハンサーが、二重特異性T細胞エンゲイジャー分子(BiTE)、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、項目92~97のいずれか一項に記載の方法。
(項目103)
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインと、前記TGFβR2膜貫通ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目102に記載の方法。
(項目105)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、CD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、前記TGFβR2細胞外ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインと、を含む、項目102に記載の方法。
(項目106)
前記フリップ受容体が、TGFβR2細胞外ドメインと、前記TGFβR2細胞外ドメインの前記C末端終端にフレーム内で融合されたCD3ポリペプチド、CD4、CD8α、CD28、CD134、またはCD137から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む、項目102に記載の方法。
(項目107)
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたTCR、CAR、Daric、またはゼータカインからなる群から選択される、項目92~97のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記ドナー修復テンプレートが、前記DSBのヒトTGFβR2遺伝子配列5´に対して相同な5´相同アームと、前記DSBのヒトTGFβR2遺伝子配列3´に対して相同な3´相同アームと、を含む、項目80~107のいずれか一項に記載の方法。
(項目109)
前記5´および3´相同アームの長さが、約100bp~約2500bpから独立して選択される、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記5´および3´相同アームの長さが、約600bp~約1500bpから独立して選択される、項目108または項目109に記載の方法。
(項目111)
前記5´相同アームが約1500bpであり、前記3´相同アームが約1000bpである、項目108~110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
前記5´相同アームが約600bpであり、前記3´相同アームが約600bpである、項目108~111のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
ウイルスベクターが、前記細胞内に前記ドナー修復テンプレートを導入するために使用される、項目80~112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)またはレトロウイルスである、項目113に記載の方法。
(項目115)
前記rAAVが、AAV2由来の1つ以上のITRを有する、項目114に記載の方法。
(項目116)
前記rAAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、およびAAV10からなる群から選択される血清型を有する、項目114または項目115に記載の方法。
(項目117)
前記rAAVが、AAV2またはAAV6血清型を有する、項目114~116のいずれか一項に記載の方法。
(項目118)
前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、項目114に記載の方法。
(項目119)
前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルス(IDLV)である、項目118に記載の方法。
(項目120)
有効量の項目76または項目77に記載の組成物を対象に投与することを含む、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも1つの症状を治療、予防、または緩和する、方法。
(項目121)
有効量の項目76または項目77に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、固形癌を治療する方法。
(項目122)
前記固形癌が、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む、項目121に記載の方法。
(項目123)
有効量の項目76または項目77に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、血液学的悪性腫瘍を治療する方法。
(項目124)
前記血液学的悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、項目123に記載の方法。
配列識別子の簡単な説明
配列番号:1は、野生型I-OnuI LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)のアミノ酸配列である。
配列番号:1は、野生型I-OnuI LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)のアミノ酸配列である。
配列番号:2は、野生型I-OnuI LHのアミノ酸配列である。
配列番号:3は、野生型I-OnuI LHEの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
配列番号:4は、野生型I-OnuI LHEの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
配列番号:5は、野生型I-OnuI LHEの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
配列番号:6は、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するように再プログラミングされたI-OnuI LHEバリアントのアミノ酸配列である。
配列番号:7は、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するように再プログラミングされたI-OnuI LHEバリアントのアミノ酸配列である。
配列番号:8は、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するmegaTALのアミノ酸配列である。
配列番号:9は、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するmegaTALのアミノ酸配列である。
配列番号:10は、マウスTrex2に融合されたヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するmegaTALのアミノ酸配列である。
配列番号:11は、ヒトTGFβR2遺伝子のエクソン6におけるI-OnuI LHEバリアント標的部位である。
配列番号:12は、ヒトTGFβR2遺伝子のエクソン6におけるTALE DNA結合ドメイン標的部位である。
配列番号:13は、ヒトTGFβR2遺伝子のエクソン6におけるmegaTAL標的部位である。
配列番号:14は、ヒトTGFβR2遺伝子のエクソン6におけるI-OnuI LHEバリアントN末端ドメイン標的部位である。
配列番号:15は、ヒトTGFβR2遺伝子のエクソン6におけるI-OnuI LHEバリアントN末端ドメイン標的部位である。
配列番号:16は、ヒトTGFβR2遺伝子のエクソン6におけるI-OnuI LHEバリアントN末端ドメイン標的部位である。
配列番号:17は、ヒトTGFβR2遺伝子のエクソン6におけるI-OnuI LHEバリアントN末端ドメイン標的部位である。
配列番号:18は、ヒトTGFβR2遺伝子のエクソン6におけるI-OnuI LHEバリアントC末端ドメイン標的部位である。
配列番号:19は、TGFβR2.B3.F8表面ディスプレイプラスミドのポリヌクレオチド配列である。
配列番号:20は、TGFβR2.B3.F8megaTALをコードするmRNA配列である。
配列番号:21は、マウスTrex2をコードするmRNA配列である。
配列番号:22は、マウスTrex2をコードするアミノ酸配列である。
配列番号:23~33は、種々のリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号:34~58は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を記載する。
前述の配列において、Xは、存在する場合、任意のアミノ酸またはアミノ酸の不在を指す。
[発明を実施するための形態]
[発明を実施するための形態]
A概観
本開示は、概して、改善されたゲノム編集組成物およびその使用方法に部分的に関する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、種々の実施形態において企図されるゲノム編集組成物は、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、もしくはそれらに関連する状態を予防もしくは治療するために、またはそれらの少なくとも1つの症状を緩和するために使用され得る。既存の養子細胞療法を悩ませるある制限または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊に起因する免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したT細胞は、ナイーブ、エフェクター、またはメモリーT細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するT細胞として定義される。TGFβシグナル伝達は、腫瘍微小環境におけるT細胞疲弊と関連しており、TGFβR1/TGFβR2を通る増加したTGFβシグナル伝達は、減少したT細胞増殖およびIFN-γの低減した産生に関連する。
本開示は、概して、改善されたゲノム編集組成物およびその使用方法に部分的に関する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、種々の実施形態において企図されるゲノム編集組成物は、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、もしくはそれらに関連する状態を予防もしくは治療するために、またはそれらの少なくとも1つの症状を緩和するために使用され得る。既存の養子細胞療法を悩ませるある制限または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊に起因する免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したT細胞は、ナイーブ、エフェクター、またはメモリーT細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するT細胞として定義される。TGFβシグナル伝達は、腫瘍微小環境におけるT細胞疲弊と関連しており、TGFβR1/TGFβR2を通る増加したTGFβシグナル伝達は、減少したT細胞増殖およびIFN-γの低減した産生に関連する。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、TGFβR2発現および/またはTGFβを介するシグナル伝達を排除、減少、または減衰させることによって疲弊に対してより耐性を有するように作製される。
種々の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するように設計されたヌクレアーゼバリアントを含む。特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントを使用して、標的ポリヌクレオチド配列における2本鎖の破断を導入することができ、これは、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの不在下で非相同末端結合(NHEJ)によって、またはドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復(HDR)、すなわち相同組換えによって修復され得る。ある特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントはまた、ニッカーゼとして設計され得、これは、ドナー修復テンプレートの存在下で細胞の塩基除去修復(BER)機構または相同組換えを使用して修復され得る、1本鎖DNAの破断を生成する。NHEJは、遺伝子機能を撹乱する小さな挿入および欠失の形成を頻繁にもたらす、エラーの起こりやすいプロセスである。相同組換えは、修復用のテンプレートとして相同DNAを必要とし、これを活用して、標的部位に隣接する領域に対して相同性を有する配列が両側に隣接する、標的部位における所望の配列を含有するドナーDNAの導入によって指定される限りなく多様な修飾を作成することができる。
1つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ヒトTGFβR2遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALを含む。
1つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALおよびエンドプロセシング酵素、例えば、Trex2を含む。
種々の実施形態において、ゲノム編集された細胞が企図される。ゲノム編集された細胞は、編集されたTGFβR2遺伝子を含み、ここで、編集戦略は、TGFβR2の細胞外リガンド結合ドメインを発現させるが、それが免疫抑制細胞内シグナルを伝達する能力を撹乱することによって、TGFβR2発現を減少もしくは排除するように、および/または優性阻害として機能するようにTGFβR2を取り入れるように設計される。
種々の実施形態において、DNA破断は、T細胞、例えば、免疫エフェクター細胞内のTGFβR2遺伝子の標的部位において生成され、切断されたゲノム配列の終端のNHEJは、細胞にTGFβR2発現をほとんどまたは全くもたらさず、好ましくは、機能的TGFβR2発現および/またはシグナル伝達を欠いているかまたは実質的に欠いている、例えば、T細胞疲弊を増加させる能力を欠いているT細胞をもたらし得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、機能的TGFβR2発現を欠いているT細胞は、免疫抑制およびT細胞疲弊に対してより耐性を有し、したがって、より持続性があり、かつ療法的に有効である。
種々の他の実施形態において、切断されたTGFβR2ゲノム配列の修復用のドナーテンプレートが提供される。TGFβR2遺伝子は、DNA破断部位での相同組換えによってテンプレートの配列で修復される。特定の実施形態において、修復テンプレートは、機能的TGFβR2発現を撹乱、および好ましくは実質的に減少または排除するポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、TGFβR2遺伝子は、TGFβR2細胞外ドメインのリガンドに対して増加した親和性を有するTGFβR2細胞外ドメインをコードするテンプレートで修復される。
特定の実施形態において、TGFβR2遺伝子は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドで修復される。
特定の実施形態において、TGFβR2遺伝子は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドで修復され、内因性TGFβR2プロモーターを採用して、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体の発現を転写的に制御するようにTGFβR2遺伝子内に導入される。
好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヒトTGFβR2遺伝子を編集するために使用される。
したがって、本明細書で企図される方法および組成物は、既存の養子細胞療法と比較して飛躍的改善を表す。
特定の実施形態の実践は、特にそれとは反対の指定がない限り、当業者の技能の範囲内にある、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用いることになり、これらの多くが例示説明の目的で下記に記載される。かかる技法は、文献で完全に説明される。例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)、Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,updated
July 2008)、Short Protocols in Molecular
Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience、Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)、Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)、Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)、Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)、Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,eds.,1991)、Annual Review of Immunology、ならびにAdvances in Immunologyなどの定期刊行物における論文を参照されたい。
July 2008)、Short Protocols in Molecular
Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience、Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)、Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)、Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)、Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)、Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,eds.,1991)、Annual Review of Immunology、ならびにAdvances in Immunologyなどの定期刊行物における論文を参照されたい。
B.定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等のいずれの方法および材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用され得るが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示の目的において、次の用語が下記で定義される。
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等のいずれの方法および材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用され得るが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示の目的において、次の用語が下記で定義される。
冠詞「a」、「an」、および「the」は、その冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つよりも多く(すなわち、少なくとも1つ、または1つ以上)を指すように本明細書で使用される。例として、「(an)要素」は、1つの要素または1つ以上の要素を意味する。
二者択一(例えば、「または」)の使用は、その二者択一対象の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するように理解されるべきである。
「および/または」という用語は、その二者択一対象の一方、または両方のいずれかを意味するように理解されるべきである。
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して最大15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%異なる、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、または±1%の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
一実施形態において、範囲、例えば、1~5、約5~1、または約1~約5は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、1つの非限定的かつ単に例示的な実施形態において、範囲「1~5」は、1、2、3、4、5、または1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、もしくは5.0、または1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、もしくは5.0という表現と同等である。
本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上である数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同じである効果、例えば、生理学的効果を生み出す、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
本明細書全体を通して、文脈上他の解釈を要する場合を除き、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、および「含むこと(comprising)」という語は、述べられるステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を暗示するが、任意の他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の排除を暗示しないことが理解されよう。「~からなる(consisting of)」は、何であれ「~からなる」という語句に続くものを含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、「~からなる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、かつ他の要素が何ら存在してはならないことを示す。「~から本質的になる(consisting essentially of)」は、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、その列挙される要素に関して本開示で指定される活性または作用に干渉しないか、または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「~から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、ただし、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が何ら存在しないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通した種々の箇所での前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、それらの特定の特徴、構造、または特性は、1つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされ得る。一実施形態におけるある特徴の肯定的列挙が、特定の実施形態におけるその特徴の除外の根拠として機能することも理解される。
「エクスビボ」という用語は、概して、好ましくは自然条件を最小限に改変した生物の外側の人口的環境において、生体組織内もしくは生体組織上で行われる実験または測定などの、生物の外側で起こる活性を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、実験室装置において、通常は滅菌条件下で、典型的には、数時間または最大約24時間であるが、状況に応じて最大48もしくは72時間を含む期間、培養または調節された、生体細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、かかる組織または細胞は、収集および凍結され、後にエクスビボ処理のために解凍され得る。生体細胞または組織を使用した数日よりも長く持続する組織培養実験または手順は、典型的には、「インビトロ」とみなされるが、ある特定の実施形態において、この用語は、エクスビボと互換的に使用され得る。
「インビボ」という用語は、概して、生物の内側で起こる活性を指す。一実施形態において、細胞ゲノムは、遺伝子操作、編集、または修飾されたインビボである。
「強化する」または「促進する」または「増加する」または「増大させる」または「増強する」は、概して、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、ビヒクルまたは対照物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より高い応答(すなわち、生理的応答)を産生するか、引き出すか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答には、当該技術分野における理解から明らかであり、かつ本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、触媒活性、結合親和性、結合部位特異性、結合部位選択性、持続性、細胞溶解活性の増加、および/または炎症促進性サイトカインの増加が含まれ得る。「増加した」または「強化された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照物によって産生される応答の1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍以上の倍率(例えば、500、1000倍)(それらの間の、かつ1を超える全ての整数および小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8などを含む)である増加を含み得る。
「減少させる」または「低下させる」または「減らす」または「低減する」または「弱める」または「破壊する」または「阻害する」または「減衰する」は、概して、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、ビヒクルまたは対照物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より低い応答(すなわち、生理的応答)を産生するか、引き出すか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答には、目標ではない結合親和性、目標ではない切断特異性、T細胞疲弊などの減少が含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照物によって産生される応答(参照応答)の1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍以上の倍率(例えば、500、1000倍)(それらの間の、かつ1を超える全ての整数および小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8など)である減少を含み得る。
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」は、概して、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、ビヒクルまたは対照物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、実質的に類似しているか、または同等の生理的応答(すなわち、下流効果)を産生するか、引き出すか、または引き起こす能力を指す。同等の応答は、参照応答と著しく異なるか、または測定可能な異なり(measurable different)がないものである。
本明細書で使用されるとき、「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりもより高い結合親和性での1つの分子の、別の分子への結合、例えば、DNAへのポリペプチド結合のDNA結合ドメインを説明する。結合ドメインは、それが、例えば、約105M-1以上の親和性またはKa(すなわち、1/Mの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数)で標的部位に結合するか、またはそれと会合する場合、標的部位に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメインは、約106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1、または1013M-1以上のKaで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも1013M-1以上のKaを有する結合ドメインを指す。
あるいは、親和性は、Mの単位での特定の結合相互作用(例えば、10-5M~10-13M以下)の平衡解離定数(Kd)として定義され得る。特定の実施形態において企図されるDNA標的部位に対する1つ以上のDNA結合ドメインを含むヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来の技法、例えば、酵母細胞表面ディスプレイを使用して、または結合会合もしくは標識リガンドを使用する置換アッセイによって容易に決定され得る。
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約2倍高いか、バックグラウンド結合よりも約5倍高いか、バックグラウンド結合よりも約10倍高いか、バックグラウンド結合よりも約20倍高いか、バックグラウンド結合よりも約50倍高いか、バックグラウンド結合よりも約100倍高いか、またはバックグラウンド結合よりも約1000倍以上高い。
「に選択的に結合する」または「に選択的に結合された」または「に選択的に結合すること」または「を選択的に標的とする」、およびは、複数の目標ではない分子の存在下での1つの分子の標的分子への好ましい結合(目標結合)を説明する。特定の実施形態において、HEまたはmegaTALは、HEまたはmegaTALが目標ではないDNA標的結合部位に結合するよりも約5、10、15、20、25、50、100、または1000倍多い頻度で目標DNA結合部位に選択的に結合する。
「目標」は、標的部位配列を指す。
「目標ではない」は、標的部位配列と類似しているが、同一ではない配列を指す。
「標的部位」または「標的配列」は、結合および/または切断に十分な条件が存在することを条件として結合分子が結合および/または切断する核酸の部分を規定する、染色体核酸配列または染色体外核酸配列である。ポリヌクレオチド配列、または標的部位もしくは標的配列の1本鎖のみを参照する配列番号に言及するとき、ヌクレアーゼバリアントによって結合および/または切断された標的部位または標的配列は、2本鎖であり、参照配列およびその補体を含むことが理解されるであろう。好ましい実施形態において、標的部位は、ヒトTGFβR2遺伝子内の配列である。
「組換え」は、非相同末端結合(NHEJ)および相同組換えによるドナー捕捉を含むがこれらに限定されない、2つのポリヌクレオチド間での遺伝子情報の交換プロセスを指す。本開示の目的に関して、「相同組換え(HR)」は、例えば、相同組換え修復(HDR)機構を介した細胞における2本鎖の破断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子をテンプレートとして使用して、「標的」分子(すなわち、2本鎖の破断を経験したもの)を修復し、それがドナーから標的への遺伝子情報の移入につながることから「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる移入は、破損した標的とドナーとの間で形成するヘテロ2本鎖DNAのミスマッチ補正、および/またはドナーを使用して、標的の一部となる遺伝子情報を再合成する「合成依存的単鎖アニーリング」、および/または関連するプロセスを伴い得る。かかる特殊なHRはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド内に組み込まれるような標的分子の配列の改変をもたらす。
「NHEJ」または「非相同末端結合」は、ドナー修復テンプレートまたは相同配列の不在下での2本鎖の破断の回復を指す。NHEJは、破断の部位に挿入および欠失をもたらし得る。NHEJは、いくつかの下位経路によって媒介され、これらの各々は、固有の変異結果を有する。典型的なNHEJ経路(cNHEJ)は、KU/DNA-PKcs/Lig4/XRCC4複合体を必要とし、最小プロセシングと共に終端バックにライゲーションし、しばしば破断の精密な修復をもたらす。代替的なNHEJ経路(altNHEJ)も、dsDNA破断の回復において活性であるが、これらの経路は、著しくより変異原性であり、しばしば、挿入および欠失によって特徴付けられる破断の精密ではない修復をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、例えば、エクソヌクレアーゼ、例えば、Trex2などのエンドプロセシング酵素によるdsDNA破断の修飾により、精密ではない修復の可能性が増加され得ることが企図される。
「切断」は、DNA分子の共有結合性骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含むがこれらに限定されない、多様な方法によって惹起され得る。1本鎖切断および2本鎖切断の両方が可能である。2本鎖切断は、2つの固有の1本鎖切断事象の結果として起こり得る。DNA切断は、平滑終端または段違い終端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドおよびヌクレアーゼバリアント、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTALなどは、標的2本鎖DNA切断のために使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、いずれかのDNA鎖上にあり得る。
「外因性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、1つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞内に導入される分子である。代表的な外因性分子には、小有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾された誘導体、または上記の分子のうちの1つ以上を含む任意の複合体が含まれるが、これらに限定されない。外因性分子を細胞内に導入するための方法は当業者には知られており、脂質媒介移入(すなわち、中性およびカチオン性脂質を含む、リポソーム)、電気穿孔、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈降、DEAE-デキストラン媒介移入、およびウイルスベクター媒介移入が含まれるが、これらに限定されない。
「内因性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階で特定の細胞内に通常存在するものである。追加の内因性分子には、タンパク質が含まれ得る。
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするDNA領域、ならびに調節配列がコード配列および/または転写配列に隣接するか否かにかかわらず遺伝子産物の産生を調節する全てのDNA領域を指す。遺伝子は、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答要素、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、複製起源、マトリックス結合部位、ならびに遺伝子座制御領域を含むが、これらに限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物(例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造的RNA、または任意の他の種類のRNA)、またはmRNAの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるRNA、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADP-リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子操作された」または「遺伝子修飾された」という用語は、DNAまたはRNAの形態での外部遺伝物質の、細胞内の総遺伝物質への染色体付加または染色体外付加を指す。遺伝子修飾は、細胞のゲノム内の特定の部位に対して標的とされても標的とされなくてもよい。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的ではない。
本明細書で使用されるとき、「ゲノム編集」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復、補正、撹乱、および/または修飾する、細胞のゲノム内の標的部位での遺伝子物質の置換、欠失、および/または導入を指す。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、細胞のゲノム内の標的部位でまた標的部位に近接してDNA損傷を生成するために、任意に、ドナー修復テンプレートの存在下で細胞内に1つ以上のヌクレアーゼバリアントを導入することを含む。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、もしくは修飾するか、または療法的なポリペプチドを発現させる目的のための細胞内の総遺伝子物質中への余分な遺伝子物質の導入を指す。特定の実施形態において、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、撹乱、もしくは修飾するか、または療法的なポリペプチドを発現させる目的のためのゲノム編集による細胞のゲノム内への遺伝子物質の導入が、考慮される遺伝子療法である。
「免疫障害」は、免疫系からの応答を喚起する疾患を指す。特定の実施形態において、「免疫障害」という用語は、癌、移植片対宿主疾患、自己免疫疾患、または免疫不全を指す。一実施形態において、免疫障害は、感染性疾患を包含する。
本明細書で使用されるとき、「癌」という用語は、概して、異常な細胞が制限なく分裂し、近隣組織に浸潤し得る、疾患または病態の分類を指す。
本明細書で使用されるとき、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が無制限の成長(すなわち、正常な限度を超えた分裂)、浸潤(すなわち、隣接組織への侵入およびその破壊)、および転移(すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の場所への広がり)のうちの1つ以上を示す癌を指す。
本明細書で使用されるとき、「転移する」という用語は、身体の1つの部分から別の部分への癌の広がりを指す。広がった細胞によって形成される腫瘍は、「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、原発(一次)腫瘍と同様である細胞を含有する。
本明細書で使用されるとき、「良性」または「非悪性」という用語は、より大きく成長し得るが、身体の他の部分には広がらない腫瘍を指す。良性腫瘍は、自己制限的であり、典型的には、浸潤または転移しない。
「癌細胞」または「腫瘍細胞」は、癌性成長または組織の個々の細胞を指す。腫瘍は、概して、良性、前悪性、または悪性であり得る細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変を指す。ほとんどの癌が腫瘍を形成するが、一部、例えば、白血病は、必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成する癌に関して、癌(細胞)および腫瘍(細胞)という用語は、互換的に使用される。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。
「移植片対宿主疾患」または「GVHD」は、細胞、組織、または固形臓器の移植後に起こり得る合併症を指す。GVHDは、移植したドナー細胞が移植受容者の身体を攻撃する幹細胞移植後または骨髄移植後に起こり得る。ヒトにおける急性GVHDは、移植後約60日以内に起こり、細胞溶解性リンパ球の作用によって皮膚、肝臓、および内臓に損傷をもたらす。慢性的なGVHDは後に起こり、主に皮膚に影響を及ぼす全身性自己免疫疾患であり、B細胞のポリクローナル活性化、ならびにIgおよび自己抗体の過剰産生をもたらす。固形臓器移植片対宿主疾患患(SOT-GVHD)は、2つの形態で起こる。より一般的な種類のものは、抗体による媒介であり、ここで、血液型がOであるドナーからの抗体が、血液型がA、B、またはABである受容者における受容者の赤血球細胞を攻撃し、軽度かつ一過性の溶血性貧血をもたらす。SOT-GVHDの第2の形態は、高い死亡率に関連する細胞型であり、ここで、ドナー由来のT細胞が、ほとんどの場合、皮膚、肝臓、胃腸管、および骨髄において免疫学的に異種の宿主組織に対する免疫学的攻撃を生み出し、これらの臓器において合併症をもたらす。
「移植片対白血病」または「GVL」は、ドナーの移植組織、例えば、骨髄または末梢血液に存在する免疫細胞による人の白血病細胞に対する免疫応答を指す。
「自己免疫疾患」は、身体がその自己の組織の一部の構成要素に対する免疫原性(すなわち、免疫系)応答を生み出す疾患を指す。換言すると、免疫系は、体内の一部の組織または系を「自己」として認識するその能力を喪失し、それをあたかも異物であるかのように標的とし攻撃する。自己免疫疾患の例示的な例には、関節炎、炎症性腸疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫(anti-immune)甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが含まれるが、これらに限定されない。
「免疫不全」は、疾患によってまたは化学物質の投与によって免疫系が損なわれた患者の状態を意味する。この病態では、系は、異物に対して防御するのに必要とされる血球の数および種類が欠損するようになる。免疫不全病態または疾患は当該技術分野において知られており、例えば、AIDS(後天性免疫不全症候群)、SCID(重症複合免疫不全疾患)、選択的IgA欠損症、分類不能型免疫不全症、X連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患、高IgM症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群(WAS)、および糖尿病が含まれる。
「感染性疾患」は、人から人へと、または生物から生物へと伝染し得、微生物またはウイルス因子によって引き起こされる疾患(例えば、感冒)を指す。感染性疾患は当該技術分野において知られており、例えば、肝炎、性行為感染症(例えば、クラミジア感染症、淋病)、結核症、HIV/AIDS、ジフテリア、肝炎B、肝炎C、コレラ、およびインフルエンザが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「個体」および「対象」という用語はしばしば互換的に使用され、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法を用いて治療され得る免疫障害の症状を呈する任意の動物を指す。好適な対象(例えば、患者)には、実験動物(マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど)、家畜、および飼育動物またはペット(ネコまたはイヌなど)が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくは、ヒト対象が含まれる。典型的な対象には、免疫障害を有するか、それを有すると診断されているか、またはそれを有する危険性があるヒト患者が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「患者」という用語は、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法を用いて治療され得る免疫障害と診断されている対象を指す。
本明細書で使用されるとき、「治療」または「治療すること」は、疾患または病理学的状態の症状または病理に対するいずれの有益または望ましい効果も含み、治療されている疾患または病態、例えば、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全のうちの1つ以上の測定可能マーカーにおける最小限の低減さえも含み得る。治療は、任意に、疾患または病態の進行を遅延させることを伴い得る。「治療」は必ずしも、疾患もしくは病態、またはその関連する症状の完全な撲滅または治癒を指すものではない。
本明細書で使用されるとき、「予防する」、および「予防」、「予防される」、「予防すること」などといった類似の語は、疾患または病態、例えば、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全の発生または再発の可能性を予防、阻害、または低減するための手法を示す。それはまた、疾患もしくは病態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用されるとき、「予防」および類似の語は、疾患または病態の発症または再発前に疾患または病態の強度、影響、症状、および/または負荷を低減することも含む。
本明細書で使用されるとき、「~の少なくとも1つの症状を改善すること」という語句は、対象が治療されている疾患または病態、例えば、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全のうちの1つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療されている疾患または病態は癌であり、ここで、緩和される1つ以上の症状には、衰弱、疲労、息切れ、打撲および出血の起こりやすさ、頻繁な感染、腫脹したリンパ節、膨張したまたは痛みのある腹部(肥大した腹部臓器に起因)、骨または関節痛、骨折、意図しない体重減少、食欲不振、寝汗、持続する微熱、ならびに減少した排尿(腎機能不全に起因)が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「量」という用語は、臨床結果を含む有益または所望の予防結果または療法結果を達成するのに十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「有効な量」または「有効量」を指す。
「予防上有効量」は、所望の予防結果を達成するのに十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の量を指す。必須ではないが典型的には、疾患の前またはその早期に予防的用量が対象において使用されるため、予防上有効量は、治療上有効量よりも少ない。
ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて異なり得る。治療上有効量はまた、治療上有益な効果が、任意の毒性効果または有害効果を上回るものでもある。「治療上有効量」という用語は、対象(例えば、患者)を「治療」するのに有効である量を含む。療法量が示されるとき、特定の実施形態において企図される組成物の投与されるべき正確な量は、医師によって、規格に鑑みて、かつ患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および病態における個体差を考慮して決定され得る。
Cヌクレアーゼバリアント
本明細書の特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、TGFβR2遺伝子内の標的部位を編集するゲノムに好適であり、1つ以上のDNA結合ドメインと、1つ以上のDNA切断ドメイン(例えば、1つ以上のエンドヌクレアーゼおよび/またはエクソヌクレアーゼドメイン)と、任意に、本明細書で企図される1つ以上のリンカーとを含む。「再プログラミングされたヌクレアーゼ」、「遺伝子操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」という用語は互換的に使用され、1つ以上のDNA結合ドメインと1つ以上のDNA切断ドメインとを含むヌクレアーゼを指し、ここで、ヌクレアーゼは、TGFβR2遺伝子内の2本鎖DNA標的配列に結合し、それを切断するように親ヌクレアーゼまたは自然発生するヌクレアーゼから設計および/または修飾されている。
本明細書の特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、TGFβR2遺伝子内の標的部位を編集するゲノムに好適であり、1つ以上のDNA結合ドメインと、1つ以上のDNA切断ドメイン(例えば、1つ以上のエンドヌクレアーゼおよび/またはエクソヌクレアーゼドメイン)と、任意に、本明細書で企図される1つ以上のリンカーとを含む。「再プログラミングされたヌクレアーゼ」、「遺伝子操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」という用語は互換的に使用され、1つ以上のDNA結合ドメインと1つ以上のDNA切断ドメインとを含むヌクレアーゼを指し、ここで、ヌクレアーゼは、TGFβR2遺伝子内の2本鎖DNA標的配列に結合し、それを切断するように親ヌクレアーゼまたは自然発生するヌクレアーゼから設計および/または修飾されている。
特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、TGFβR2遺伝子のエクソン6において、好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11で、およびより好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11内の配列「ATCC」で標的配列に結合し、それを切断する。
ヌクレアーゼバリアントは、自然発生するヌクレアーゼからか、または前のヌクレアーゼバリアントから設計および/または修飾され得る。特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、1つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、3´-5´エクソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性DNAポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
TGFβR2遺伝子内の標的配列に結合し、それを切断するヌクレアーゼバリアントの例示的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼ)バリアントおよびmegaTALが含まれるが、これらに限定されない。
1.ホーミングエンドヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼ)バリアント
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、TGFβR2遺伝子内の標的部位に2本鎖の破断(DSB)を導入するように再プログラミングされる。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、TGFβR2遺伝子のエクソン6において、好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11で、およびより好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11内の配列「ATCC」で2本鎖の破断を導入する。
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、TGFβR2遺伝子内の標的部位に2本鎖の破断(DSB)を導入するように再プログラミングされる。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、TGFβR2遺伝子のエクソン6において、好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11で、およびより好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11内の配列「ATCC」で2本鎖の破断を導入する。
「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は互換的に使用され、12~45個の塩基対切断部位を認識し、一般的に配列および構造モチーフに基づいて5つのファミリー、すなわちLAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cysボックス、およびPD-(D/E)XKに分類される、自然発生するホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、自然界で見出される野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態において、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、修飾されて、基礎活性を増加させる野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
「遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「再プログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント」、「遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ」、「再プログラミングされたメガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼバリアント」は、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、ここで、ホーミングエンドヌクレアーゼは、TGFβR2遺伝子内のDNA標的配列に結合し、それを切断するように親ホーミングエンドヌクレアーゼまたは自然発生するホーミングエンドヌクレアーゼから設計および/または修飾されている。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、自然発生するホーミングエンドヌクレアーゼまたは別のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントから設計および/または修飾され得る。特定の実施形態において企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、1つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、3´-5´エクソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性DNAポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)バリアントは、自然界に存在せず、組換えDNA技術によってまたはランダム変異誘発によって得ることができる。HEバリアントは、自然発生するHEまたはHEバリアントにおいて、1つ以上のアミノ酸改変を行う、例えば、1つ以上のアミノ酸を変異、置換、付加、または欠失させることによって得ることができる。特定の実施形態において、HEバリアントは、DNA認識インターフェースに対する1つ以上のアミノ酸改変を含む。
特定の実施形態において企図されるHEバリアントは、1つ以上のリンカーおよび/または追加の機能的ドメイン、例えば、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、3´-5´エクソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性DNAポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、HEバリアントは、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、3´-5´エクソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性DNAポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共にT細胞内に導入される。HEバリアントおよび3´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のmRNAにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、あるいはウイルス自己切断型ペプチドもしくはIRES要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
「DNA認識インターフェース」は、核酸標的塩基と相互作用するHEアミノ酸残基、ならびに隣接している残基を指す。各HEに関して、DNA認識インターフェースは、側鎖-側鎖間および側鎖-DNA接触点間の広範囲のネットワークを含み、これらのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するために必然的に固有である。したがって、特定の核酸配列に対応するDNA認識インターフェースのアミノ酸配列は、著しく異なり、任意の天然またはHEバリアントの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態において企図されるHEバリアントは、天然HE(または以前に生成されたHEバリアント)のDNA認識インターフェースに局在する1つ以上のアミノ酸残基が変化に富む、HEバリアントのライブラリを構築することによってもたらされ得る。ライブラリは、切断アッセイを使用して、各々予測されるTGFβR2標的部位に対する標的切断活性に関してスクリーニングされ得る(例えば、Jarjour et al.,2009.Nuc.Acids Res.37(20):6871-6880を参照されたい)。
LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)は、最も詳細に研究されているホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーであり、主に古細菌においてならびに緑藻類および真菌類のオルガネラDNAにおいてコードされ、最も高い全体的なDNA認識特異性を示す。LHEは、タンパク質鎖1つあたり1つまたは2つのLAGLIDADG触媒モチーフを含み、それぞれホモ二量体または単鎖単量体として機能する。LAGLIDADGタンパク質の構造的研究により、αββαββα折り畳みによって特徴付けられる、高度に保存されたコア構造が特定され(Stoddard 2005)、このうちLAGLIDADGモチーフは、この折り畳みの第1のヘリックスに属する。LHEによる高度に効率的および特異的な切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを得るためのタンパク質足場を表す。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合し、それを切断するようにLHEを遺伝子操作することは、適切なLHE足場の選択、標的遺伝子座の検査、推定標的部位の選択、ならびに標的部位における塩基対位置のうちの最大3分の2でのそのDNA接触点および切断特異性を改変するためのLHEの大規模な改変を必要とする。
一実施形態において、再プログラミングされたLHEまたはLHEバリアントが設計され得るLHEには、I-CreIおよびI-SceIが含まれるが、これらに限定されない。
再プログラミングされたLHEまたはLHEバリアントが設計され得るLHEの例示的な例には、I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、およびI-Vdi141Iが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、再プログラミングされたLHEまたはLHEバリアントは、I-CpaMIバリアント、I-HjeMIバリアント、I-OnuIバリアント、I-PanMIバリアント、およびI-SmaMIバリアントからなる群から選択される。
一実施形態において、再プログラミングされたLHEまたはLHEバリアントは、I-OnuIバリアントである。例えば、配列番号:6~7を参照されたい。
一実施形態において、TGFβR2遺伝子を標的とする再プログラミングされたI-OnuI LHEまたはI-OnuIバリアントは、天然I-OnuIまたはその生物学的に活性な断片(配列番号:1~5)から生成された。好ましい実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子を標的とする再プログラミングされたI-OnuI LHEまたはI-OnuIバリアントは、既存のI-OnuIバリアントから生成された。一実施形態において、再プログラミングされたI-OnuI LHEは、配列番号:11に記載されるヒトTGFβR2遺伝子標的部位に対して生成された。
特定の実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断する再プログラミングされたI-OnuI LHEまたはI-OnuIバリアントは、DNA認識インターフェースにおいて1つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断するI-OnuI LHEは、I-OnuI(Taekuchi et al.2011.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011 Aug 9;108(32):13077-13082)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuI LHEバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントのDNA認識インターフェースとの少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。
一実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断するI-OnuI
LHEは、I-OnuI(Taekuchi et al.2011.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011 Aug 9;108(32):13077-13082)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuI LHEバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントのDNA認識インターフェースとの少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を含む。
LHEは、I-OnuI(Taekuchi et al.2011.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011 Aug 9;108(32):13077-13082)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuI LHEバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントのDNA認識インターフェースとの少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を含む。
特定の実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断するI-OnuI LHEバリアントは、配列番号:1~7のいずれか1つに記載のI-OnuI、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントのDNA認識インターフェースにおいて1つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
特定の実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断するI-OnuI LHEバリアントは、I-OnuI(配列番号1~5)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuIバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントのDNA認識インターフェース、特に、位置24~50、68~82、180~203、および223~240に位置するサブドメインにおいて1つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
特定の実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断するI-OnuI LHEは、I-OnuI(配列番号:1~5)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuIバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントの、19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて1つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
特定の実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断するI-OnuI LHEバリアントは、I-OnuI(配列番号:1~5)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuIバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントのDNA認識インターフェース、特に、位置24~50、68~82、180~203、および223~240に位置するサブドメインにおいて5、10、15、20、25、30、35、または40個以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
特定の実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断するI-OnuI LHEバリアントは、I-OnuI(配列番号:1~5)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuIバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントの、19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、59、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、および240からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるDNA認識インターフェースにおいて5、10、15、20、25、30、35、または40個以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
一実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断するI-OnuI
LHEバリアントは、I-OnuI配列全体のどこにでも位置する追加の位置に1つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。置換および/または修飾され得る残基は、核酸標的に接触するか、または核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と、直接もしくは水分子を介して相互作用するアミノ酸が含まれるが、これに限定されない。1つの非限定的な例において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断する本明細書で企図されるI-OnuI LHEバリアントは、I-OnuI(配列番号:1~5)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuIバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントの、位置:26、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、75、76、78、80、116、138、143、159、168、178、180、182、184、188、190、192、193、195、197、199、203、207、223、225、227、232、240、および264からなる位置群から選択される少なくとも1つの位置に1つ以上の置換および/または修飾、好ましくは少なくとも5、好ましくは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、好ましくは少なくとも20、より好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも30、さらにより好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を含む。
LHEバリアントは、I-OnuI配列全体のどこにでも位置する追加の位置に1つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。置換および/または修飾され得る残基は、核酸標的に接触するか、または核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と、直接もしくは水分子を介して相互作用するアミノ酸が含まれるが、これに限定されない。1つの非限定的な例において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断する本明細書で企図されるI-OnuI LHEバリアントは、I-OnuI(配列番号:1~5)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuIバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントの、位置:26、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、75、76、78、80、116、138、143、159、168、178、180、182、184、188、190、192、193、195、197、199、203、207、223、225、227、232、240、および264からなる位置群から選択される少なくとも1つの位置に1つ以上の置換および/または修飾、好ましくは少なくとも5、好ましくは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、好ましくは少なくとも20、より好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも30、さらにより好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上のアミノ酸置換を含む。
ある特定の実施形態において、HEバリアントは、TGFβR2エクソン6標的部位を切断し、I-OnuI(配列番号:1~5)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuIバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190RまたはS190G、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223R、Y223H、K225Y、K227R、F232N、T240R、およびE264Kのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む。
いくつかの実施形態において、HEバリアントは、TGFβR2標的部位を切断し、I-OnuI(配列番号:1~5)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuIバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190R、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223R、K225Y、K227R、F232N、およびT240Rのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む。
特定の実施形態において、HEバリアントは、TGFβR2標的部位を切断し、I-OnuI(配列番号:1~5)、または配列番号:6もしくは7に記載のI-OnuIバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および/またはそれらのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換:L26M、N32R、K34Q、S35R、S36K、V37A、G38N、S40G、E42S、G44V、Q46E、T48G、V68K、A70R、N75G、A76S、S78R、K80S、V116L、L138M、T143N、S159P、F168L、E178D、C180S、F182G、N184D、S188R、S190R、L192T、G193T、Q195G、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227R、F232N、T240R、およびE264Kのうちの少なくとも5、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、またはさらにより好ましくは少なくとも40個以上を含む。
特定の実施形態において、ヒトTGFβR2遺伝子に結合し、それを切断するI-OnuI LHEバリアントは、配列番号:6もしくは7に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性な断片と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、もしくはさらにより好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、I-OnuI LHEバリアントは、配列番号:6もしくは7に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I-OnuI LHEバリアントは、配列番号:6に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、I-OnuI LHEバリアントは、配列番号:7に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
2.MEGATAL
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むmegaTALは、TGFβR2遺伝子内の標的部位に2本鎖の破断(DSB)を導入するように再プログラミングされる。特定の実施形態において、megaTALは、TGFβR2遺伝子のエクソン6において、好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11で、およびより好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11内の配列「ATCC」でDSBを導入する。
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むmegaTALは、TGFβR2遺伝子内の標的部位に2本鎖の破断(DSB)を導入するように再プログラミングされる。特定の実施形態において、megaTALは、TGFβR2遺伝子のエクソン6において、好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11で、およびより好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11内の配列「ATCC」でDSBを導入する。
「megaTAL」は、TALE DNA結合ドメインと、TGFβR2遺伝子内のDNA標的配列に結合し、それを切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むポリペプチドを指し、任意に、1つ以上のリンカーおよび/または追加の機能的ドメイン、例えば、5´-3´エキソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´-5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。
特定の実施形態において、megaTALは、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、3´-5´エクソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性DNAポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性DNAポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共に、細胞内に導入され得る。megaTALおよび3´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のmRNAにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、あるいはウイルス自己切断型ペプチドもしくはIRES要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
「TALE DNA結合ドメイン」は、植物の転写物を操作するために植物の転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター(TALEまたはTAL-エフェクター)のDNA結合部分である(例えば、Kay et al.,2007.Science 318:648-651を参照されたい)。特定の実施形態において企図されるTALE DNA結合ドメインは、デノボで、または自然発生するTALE、例えば、Xanthomonas campestris pv.vesicatoria、Xanthomonas gardneri、Xanthomonas translucens、Xanthomonas axonopodis、Xanthomonas perforans、Xanthomonas alfalfa、Xanthomonas citri、Xanthomonas euvesicatoria、およびXanthomonas oryzae由来のAvrBs3から、ならびにRalstonia solanacearum由来のbrg11およびhpx17から遺伝子操作される。DNA結合ドメインを誘導および設計するためのTALEタンパク質の例示的な例は、米国特許第9,017,967号、および同特許で引用される参考文献に開示されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、megaTALは、TALE DNA結合ドメインの、その対応する標的DNA配列への結合に関与する1つ以上の繰り返し単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。単一の「繰り返し単位」(「繰り返し」とも称される)は、典型的には、33~35アミノ酸長である。各TALE DNA結合ドメイン繰り返し単位は、典型的には、繰り返しの位置12および/または13に、繰り返し可変Di-残基(Repeat Variable Di-Residue)(RVD)を構成する1つまたは2つのDNA結合残基を含む。これらのTALE DNA結合ドメインのDNA認識のための天然(標準的)コードは、位置12および13のHD配列がシトシン(C)への結合をもたらし、NGがTに結合し、NIがAに、NNがGまたはAに結合し、NGがTに結合するように、決定されている。ある特定の実施形態において、非標準的(非典型)RVDが企図される。
特定の実施形態において企図される特定のmegaTALにおいて使用するのに好適な非標準的RVDの例示的な例には、グアニン(G)の認識のためのHH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN;アデニン(A)の認識のためのNI、KI、RI、HI、SI;チミン(T)の認識のためのNG、HG、KG、RG;シトシン(C)の認識のためのRD、SD、HD、ND、KD、YG;AまたはGの認識のためのNV、HN;およびAまたはTまたはGまたはCの認識のためのH*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*[(*)は、位置13にアミノ酸が不在であることを意味する]が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において企図される特定のmegaTALにおいて使用するのに好適なRVDの追加の例示的な例には、米国特許第8,614,092号に開示されるものがさらに含まれ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、3~30個の繰り返し単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、megaTALは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30のTALE DNA結合ドメイン繰り返し単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、5~15個の繰り返し単位、より好ましくは7~15個の繰り返し単位、より好ましくは9~15個の繰り返し単位、およびより好ましくは9、10、11、12、13、14、または15個の繰り返し単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、3~30個の繰り返し単位を含むTALE DNA結合ドメインと、1組のTALE繰り返し単位のC末端に位置する20個のアミノ酸を含む追加の単一の切断短縮型TALE繰り返し単位、すなわち、追加のC末端ハーフTALE DNA結合ドメイン繰り返し単位(本明細書の他の箇所で開示される(下記を参照)Cキャップのアミノ酸-20~-1)とを含む。したがって、特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、3.5~30.5個の繰り返し単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、megaTALは、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5、21.5、22.5、23.5、24.5、25.5、26.5、27.5、28.5、29.5、または30.5のTALE DNA結合ドメイン繰り返し単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、5.5~15.5個の繰り返し単位、より好ましくは7.5~15.5個の繰り返し単位、より好ましくは9.5~15.5個の繰り返し単位、およびより好ましくは9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、または15.5個の繰り返し単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、megaTALは、「N末端ドメイン(NTD)」ポリペプチドと、1つ以上のTALE繰り返しドメイン/単位と、「C末端ドメイン(CTD)」ポリペプチドと、およびホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むTALエフェクター構成を含む。いくつかの実施形態において、NTD、TALE繰り返し、および/またはCTDドメインは、同じ種由来である。他の実施形態において、NTD、TALE繰り返し、および/またはCTDドメインのうちの1つ以上は、異なる種由来である。
本明細書で使用されるとき、「N末端ドメイン(NTD)」ポリペプチドという用語は、自然発生するTALE DNA結合ドメインのN末端部分または断片に隣接する配列を指す。NTD配列は、存在する場合、TALE DNA結合ドメイン繰り返し単位がDNAに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインに対してN末端側に少なくとも120個~少なくとも140個以上のアミノ酸を含む(0は、最もN末端側の繰り返し単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインに対してN末端側に少なくとも約120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、または少なくとも140個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、Xanthomonas TALEタンパク質の少なくともアミノ酸約+1~+122から少なくとも約+1~+137のNTDポリペプチドを含む(0は、最もN末端側の繰り返し単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、Xanthomonas TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインに対してN末端側に少なくとも約122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、または137個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、Ralstonia TALEタンパク質の少なくともアミノ酸+1~+121のNTDポリペプチドを含む(0は、最もN末端側の繰り返し単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、Ralstonia TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインに対してN末端側に少なくとも約121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、または137個のアミノ酸を含む。
本明細書で使用されるとき、「C末端ドメイン(CTD)」ポリペプチドという用語は、自然発生するTALE DNA結合ドメインのC末端部分または断片に隣接する配列を指す。CTD配列は、存在する場合、TALE DNA結合ドメイン繰り返し単位がDNAに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してC末端側に少なくとも20~少なくとも85個以上のアミノ酸を含む(最初の20個のアミノ酸は、最後のC末端完全繰り返し単位に対してC末端側のハーフ繰り返し単位である)。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してC末端側に少なくとも約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、443、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、または少なくとも85個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、Xanthomonas TALEタンパク質の少なくともアミノ酸約-20~-1のCTDポリペプチドを含む(-20は、最後のC末端完全繰り返し単位に対してC末端側のハーフ繰り返し単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、Xanthomonas TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してC末端側に少なくとも約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、Ralstonia TALEタンパク質の少なくともアミノ酸約-20~-1のCTDポリペプチドを含む(-20は、最後のC末端完全繰り返し単位に対してC末端側のハーフ繰り返し単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、Ralstonia TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してC末端側に少なくとも約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個のアミノ酸を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、標的配列に結合するように遺伝子操作されたTALE DNA結合ドメインを含む融合ポリペプチドと、標的配列に結合し、それを切断するように再プログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼと、任意に、本明細書の他の箇所で企図される1つ以上のリンカーポリペプチドと任意に互いに結合するNTDおよび/またはCTDポリペプチドとを含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、TALE DNA結合ドメインと、任意に、NTDおよび/またはCTDポリペプチドとを含むmegaTALが、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントにさらに融合されるリンカーポリペプチドに融合されることが企図される。したがって、TALE DNA結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのDNA結合ドメインが結合した標的配列から約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチド以内離れているDNA標的配列に結合する。このようにして、本明細書で企図されるmegaTALは、ゲノム編集の特異性および効率を増加させる。
一実施形態において、megaTALは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、再プログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼの結合部位の約4、5、または6ヌクレオチド以内、好ましくは、5または6ヌクレオチド上流であるヌクレオチド配列に結合するTALE DNA結合ドメインとを含む。
一実施形態において、megaTALは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントが結合および切断するヌクレオチド配列(配列番号:11)の6ヌクレオチド上流である(すなわち、TALE結合部位とHE結合部位との間に5個のヌクレオチドが存在する)、配列番号:12に記載されるヌクレオチド配列に結合するTALE DNA結合ドメインとを含む。好ましい実施形態において、megaTAL標的配列は、配列番号:13である。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、1つ以上のTALE DNA結合繰り返し単位と、I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、I-Vdi141I、およびそれらのバリアント、または好ましくはI-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI、SmaMI、およびそれらのバリアント、より好ましくはI-OnuIおよびそのバリアントからなる群から選択されるLHEから設計または再プログラミングされたLHEバリアントとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、NTDと、1つ以上のTALE DNA結合繰り返し単位と、CTDと、I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、I-Vdi141I、およびそれらのバリアント、または好ましくはI-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI、SmaMI、およびそれらのバリアント、より好ましくはI-OnuIおよびそのバリアントからなる群から選択されるLHEバリアントとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、NTDと、約9.5~約15.5のTALE DNA結合繰り返し単位と、I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI、I-Vdi141I、およびそれらのバリアント、または好ましくはI-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI、SmaMI、およびそれらのバリアント、より好ましくはI-OnuIおよびそのバリアントからなる群から選択されるLHEバリアントとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、約122個のアミノ酸~137個のアミノ酸のNTDと、約9.5、約10.5、約11.5、約12.5、約13.5、約14.5、または約15.5個の結合繰り返し単位と、約20個のアミノ酸~約85個のアミノ酸のCTDと、I-OnuI LHEバリアントとを含む。特定の実施形態において、NTD、DNA結合ドメイン、およびCTDのいずれか1つ、2つ、または全ては、任意の好適な組み合わせで同じ種または異なる種から設計され得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTALは、配列番号:8または9に記載されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmegaTAL-Trex2融合タンパク質は、配列番号:10に記載されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、megaTALは、TALE DNA結合ドメインに結合し、I-OnuI LHEバリアントは、配列番号:13に記載されるヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
3.エンドプロセッシング酵素
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素の1つ以上のコピーを使用して細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態において、単一のポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断型ペプチド配列、例えば、2A配列によって、またはIRES配列によって分離されたホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと、エンドプロセシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドとを含む。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、自己切断型ペプチドによって分離されたエンドプロセシング酵素のタンデムコピーに加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントエンドプロセシング酵素の単一のポリペプチド融合をコードするポリヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素の1つ以上のコピーを使用して細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態において、単一のポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断型ペプチド配列、例えば、2A配列によって、またはIRES配列によって分離されたホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと、エンドプロセシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドとを含む。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、自己切断型ペプチドによって分離されたエンドプロセシング酵素のタンデムコピーに加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントエンドプロセシング酵素の単一のポリペプチド融合をコードするポリヌクレオチドを含む。
「エンドプロセシング酵素」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の曝露された終端を修飾する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、2本鎖DNA(dsDNA)、1本鎖DNA(ssDNA)、RNA、DNAおよびRNAの2本鎖ハイブリッド、ならびに合成DNA(例えば、A、C、G、およびT以外の塩基を含有する)であり得る。エンドプロセシング酵素は、1つ以上のヌクレオチドを付加すること、1つ以上のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去するかもしくは修飾すること、および/またはヒドロキシル基を除去するかもしくは修飾することによって、曝露されたポリヌクレオチド鎖終端を修飾し得る。エンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位の終端、または他の化学的もしくは機械的手段、例えば、せん断(例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱すること、超音波処理すること、小型ビーズ振とう、および噴霧することによる)、電離化放射、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤によって生成された終端で修飾し得る。
特定の実施形態において、特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTAL、およびDNAエンドプロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。
「DNAエンドプロセシング酵素」という用語は、DNAの曝露された終端を修飾する酵素を指す。DNAエンドプロセシング酵素は、平滑終端または段違い終端(5´または3´の突出を有する終端)を修飾し得る。DNAエンドプロセシング酵素は、単鎖または2本鎖DNAを修飾し得る。DNAエンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位の終端、または他の化学的もしくは機械的手段、例えば、せん断(例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱すること、超音波処理すること、小型ビーズ振とう、および噴霧することによる)、電離化放射、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤によって生成された終端で修飾し得る。DNAエンドプロセシング酵素は、1つ以上のヌクレオチドを付加すること、1つ以上のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去するかもしくは修飾すること、および/またはヒドロキシル基を除去するかもしくは修飾することによって、曝露されたDNA終端を修飾し得る。
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なDNAエンドプロセシング酵素の例示的な例には、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、3´-5´エクソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、およびテンプレート非依存性DNAポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なDNAエンドプロセシング酵素の追加の例示的な例には、Trex2、Trex1、膜貫通ドメイン無しのTrex1、Apollo、Artemis、DNA2、Exo1、ExoT、ExoIII、Fen1、Fan1、MreII、Rad2、Rad9、TdT(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)、PNKP、RecE、RecJ、RecQ、ラムダエクソヌクレアーゼ、Sox、ワクシニアDNAポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼI、エクソヌクレアーゼIII、エクソヌクレアーゼVII、NDK1、NDK5、NDK7、NDK8、WRN、T7-エクソヌクレアーゼ遺伝子6、トリ骨髄芽球症ウイルス組み込みタンパク質(IN)、Bloom、南極ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)、ApeI、マングビーンヌクレアーゼ、Hex1、TTRAP(TDP2)、Sgs1、Sae2、CUP、Pol mu、Polラムダ、MUS81、EME1、EME2、SLX1、SLX4、およびUL-12が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物および細胞ゲノムを編集するための方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTAL、およびエクソヌクレアーゼを含むポリペプチドを含む。「エクソヌクレアーゼ」という用語は、3´または5´終端のいずれかでホスホジエステル結合を破断する加水分解反応を介してポリヌクレオチド鎖の終端でホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なエクソヌクレアーゼの例示的な例には、hExoI、酵母ExoI、大腸菌ExoI、hTREX2、マウスTREX2、ラットTREX2、hTREX1、マウスTREX1、ラットTREX1、およびRat TREX1が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、DNAエンドプロセシング酵素は、3´~5´エクソヌクレアーゼ、好ましくはTrex1またはTrex2、より好ましくはTrex2、およびさらにより好ましくはヒトまたはマウスTrex2である。
D標的部位
特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、任意の好適な標的配列に結合するように設計され得、かつ自然発生するヌクレアーゼと比較して、新規の結合特異性を有し得る。特定の実施形態において、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、抑制要素などを含むがこれらに限定されない遺伝子の調節領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライス部位である。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、遺伝子の発現を下方調節または減少するように設計される。特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復テンプレートは、所望の標的配列を修復または欠失するように設計され得る。
特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、任意の好適な標的配列に結合するように設計され得、かつ自然発生するヌクレアーゼと比較して、新規の結合特異性を有し得る。特定の実施形態において、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、抑制要素などを含むがこれらに限定されない遺伝子の調節領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライス部位である。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、遺伝子の発現を下方調節または減少するように設計される。特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復テンプレートは、所望の標的配列を修復または欠失するように設計され得る。
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβ2)遺伝子内の標的配列に結合し、それを切断する。TGFβ2は、TGF-ベータ受容体タイプIIB、TGF-ベータタイプII受容体、TGFベータ-RII、TGFR-2、TGFR2、形質転換成長因子ベータ受容体II、形質転換成長因子、ベータ受容体II(70/80kDa)、AAT3、FAA3、HNPCC6、MFS2、RIIC、およびTAAD2とも称される。TGFβは、TGFβR1およびTGFβR2セリン/スレオニンキナーゼ受容体複合体に結合し、下流転写因子Smad2およびSmad3の受容体媒介性リン酸化をもたらす。TGFβR2シグナル伝達は、IFNγおよび他の細胞溶解性分子の低減した分泌を含む、インビトロのT細胞のエフェクターおよび細胞溶解性活性に関与する重要な分子を抑制することによって、TGFβの細胞静止性および抗増殖性効果を生成する。
特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALは、TGFβR2遺伝子内の標的部位に2本鎖の破断(DSB)を導入する。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALは、TGFβR2遺伝子のエクソン6において、好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11で、およびより好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11内の配列「ATCC」でDSBを導入する。
好ましい実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTALは、2本鎖DNAを切断し、かつ配列番号:11または13に記載されるポリヌクレオチド配列内にDSBを導入する。
好ましい実施形態において、TGFβR2遺伝子は、ヒトTGFβR2遺伝子である。
E.ドナー修復テンプレート
ヌクレアーゼバリアントは、標的配列にDSBを導入するために使用され得、DSBは、1つ以上のドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復(HDR)機構を通して修復され得る。
ヌクレアーゼバリアントは、標的配列にDSBを導入するために使用され得、DSBは、1つ以上のドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復(HDR)機構を通して修復され得る。
種々の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
種々の実施形態において、異なる免疫抑制経路を標的とする免疫力エンハンサーおよび/または免疫抑制シグナルダンパーを独立してコードする複数のドナー修復テンプレートの存在下で、細胞に遺伝子操作されたヌクレアーゼを提供することによって、療法的有効性および持続性の増加を有するゲノム編集されたT細胞をもたらすことが企図される。例えば、PD-1、LAG-3、CTLA-4、TIM3、IL-10R、TIGIT、およびTGFβR2経路の組み合わせを標的とする免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルは、特定の実施形態において好ましい場合がある。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ゲノムに配列を挿入するために使用される。特定の好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ゲノム内の配列を修復または修飾するために使用される。
種々の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、IDLVなど、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはドナー修復テンプレートを含むワクシニアウイルスベクターで細胞を形質導入することによって、造血細胞、例えば、T細胞内に導入される。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、DSB部位に隣接する1つ以上の相同アームを含む。
本明細書で使用されるとき、「相同アーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されたDNA破断に隣接するDNA配列と同一、またはほぼ同一であるドナー修復テンプレート内の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、DNA破断部位のDNA配列5´と同一、またはほぼ同一である核酸配列を含む5´相同アームを含む。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、DNA破断部位のDNA配列3´と同一、またはほぼ同一である核酸配列を含む3´相同アームを含む。好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、5´相同アームおよび3´相同アームを含む。ドナー修復テンプレートは、DSB部位の直近のゲノム配列に対する相同性、またはDSB部位からの任意の数の塩基対内のゲノム配列に対する相同性を含み得る。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、相同配列の任意の介在する長さを含む、約5bp、約10bp、約25bp、約50bp、約100bp、約250bp、約500bp、約1000bp、約2500bp、約5000bp、約10000bp以上のゲノム配列に対して相同な核酸配列を含む。
特定の実施形態において企図される相同アームの好適な長さの例示的な例は、独立して選択され得、相同アームの全ての介在する長さを含む、約100bp、約200bp、約300bp、約400bp、約500bp、約600bp、約700bp、約800bp、約900bp、約1000bp、約1100bp、約1200bp、約1300bp、約1400bp、約1500bp、約1600bp、約1700bp、約1800bp、約1900bp、約2000bp、約2100bp、約2200bp、約2300bp、約2400bp、約2500bp、約2600bp、約2700bp、約2800bp、約2900bp、または約3000bp以上の相同アームが含まれるが、これらに限定されない。
好適な相同アーム長さの追加の例示的な例には、相同アームの全ての介在する長さを含む、約100bp~約3000bp、約200bp~約3000bp、約300bp~約3000bp、約400bp~約3000bp、約500bp~約3000bp、約500bp~約2500bp、約500bp~約2000bp、約750bp~約2000bp、約750bp~約1500bp、または約1000bp~約1500bpが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、5´および3´相同アームの長さは、独立して、約500bp~約1500bpから選択される。一実施形態において、5´相同アームは約1500bpであり、3´相同アームは約1000bpである。一実施形態において、5´相同アームは約200bp~約600bpであり、3´相同アームは約200bp~約600bpである。一実施形態において、5´相同アームは約200bpであり、3´相同アームは約200bpである。一実施形態において、5´相同アームは約300bpであり、3´相同アームは約300bpである。一実施形態において、5´相同アームは約400bpであり、3´相同アームは約400bpである。一実施形態において、5´相同アームは約500bpであり、3´相同アームは約500bpである。一実施形態において、5´相同アームは約600bpであり、3´相同アームは約600bpである。
ドナー修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に企図される、プロモーターおよび/またはエンハンサー、非翻訳領域(UTR)、Kozak配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位(IRES)、リコンビナーゼ認識部位(例えば、LoxP、FRT、およびAtt部位)、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの1つ以上のポリヌクレオチドをさらに含み得る。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、TGFβR2遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはその部分を含み、かつ変異体TGFβR2遺伝子産物が発現されるように、ゲノムTGFβR2配列に1つ以上の変異を導入するように設計される。一実施形態において、変異体TGFβR2は、リガンド結合の減少および/または細胞内シグナル伝達の低減を有する。
種々の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、5´相同アームと、RNAポリメラーゼIIプロモーターと、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、3´相同アームとを含む。
種々の実施形態において、標的部位は、5´相同アームと、自己切断型ウイルスペプチド、例えば、T2A、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体、任意に、ポリ(A)シグナルもしくは自己切断型ペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドと、3´相同アームとを含むドナー修復テンプレートで修飾され、ここで、1つ以上のポリヌクレオチドの発現は、内因性TGFβR2プロモーターによって支配される。
1.免疫力エンハンサー
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫力エンハンサーをコードするドナー修復テンプレートの存在下でTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって免疫抑制因子に対してより強力および/または耐性を有するように作製される。本明細書で使用されるとき、「免疫力エンハンサー」という用語は、T細胞の活性化および/または機能を刺激および/または増強する非天然分子、免疫賦活因子、ならびにT細胞または他の免疫細胞内に腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルを免疫刺激シグナルに変換する非天然ポリペプチドを指す。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫力エンハンサーをコードするドナー修復テンプレートの存在下でTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって免疫抑制因子に対してより強力および/または耐性を有するように作製される。本明細書で使用されるとき、「免疫力エンハンサー」という用語は、T細胞の活性化および/または機能を刺激および/または増強する非天然分子、免疫賦活因子、ならびにT細胞または他の免疫細胞内に腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルを免疫刺激シグナルに変換する非天然ポリペプチドを指す。
特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性T細胞エンゲイジャー(BiTE)分子;サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、および/またはサイトカイン受容体を含むがこれらに限定されない免疫賦活因子;ならびにフリップ受容体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫賦活因子、またはフリップ受容体は、タンパク質不安定化ドメインを含む融合ポリペプチドである。
a.二重特異性T細胞エンゲイジャー(BiTE)分子
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、二重特異性T細胞エンゲイジャー(BiTE)分子をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、TGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによってより強力になるように作製される。BiTE分子は、本明細書の他の箇所で企図される、標的抗原、リンカー、またはスペーサーに結合する第1の結合ドメインと、免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子に結合する第2の結合ドメインとを含む二分分子である。第1および第2の結合ドメインは、独立して、リガンド、受容体、抗体またはその抗原結合断片、レクチン、および炭水化物から選択され得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、二重特異性T細胞エンゲイジャー(BiTE)分子をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、TGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによってより強力になるように作製される。BiTE分子は、本明細書の他の箇所で企図される、標的抗原、リンカー、またはスペーサーに結合する第1の結合ドメインと、免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子に結合する第2の結合ドメインとを含む二分分子である。第1および第2の結合ドメインは、独立して、リガンド、受容体、抗体またはその抗原結合断片、レクチン、および炭水化物から選択され得る。
特定の実施形態において、第1および第2の結合ドメインは、抗原結合ドメインである。
特定の実施形態において、第1および第2の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態において、第1および第2の結合ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である。
特定の実施形態において第1の結合ドメインによって認識および結合され得る標的抗原の例示的な例には、アルファ葉酸受容体、5T4、αvβ6インテグリン、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、ErbB2(HER2)を含むEGFRファミリー、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎児AchR、FRα、GD2、GD3、グリピカン-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、ラムダ、ルイス-Y、カッパ、メソテリン、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、サバイビン、TAG72、TEM、VEGFR2、およびWT-1が含まれるが、これらに限定されない。
標的抗原の他の例示的な実施形態は、MHC-ペプチド複合体を含み、任意に、ここで、ペプチドは、アルファ葉酸受容体、5T4、αvβ6インテグリン、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、ErbB2(HER2)を含むEGFRファミリー、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎児AchR、FRα、GD2、GD3、グリピカン-3(GPC3)、MAGE1、NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、ラムダ、ルイス-Y、カッパ、メソテリン、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2Dリガンド、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、サバイビン、TAG72、TEM、VEGFR2、およびWT-1から処理される。
特定の実施形態において第2の結合ドメインによって認識および結合される免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子の例示的な例には、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD134、CD137、およびCD278が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、DSBは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってTGFβR2遺伝子において誘導され、BiTEを含むドナー修復テンプレートは細胞内に導入され、相同組換えによってTGFβR2遺伝子内に挿入される。
b.免疫賦活因子
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、ゲノム編集された細胞または腫瘍微小環境における細胞のいずれかにおいて免疫賦活因子を増加させることによってより強力になるように作製される。免疫賦活因子は、免疫エフェクター細胞における免疫応答を増強する特定のサイトカイン、ケモカイン、サイトキシン、およびサイトカイン受容体を指す。一実施形態において、T細胞は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、またはサイトカイン受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、TGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、ゲノム編集された細胞または腫瘍微小環境における細胞のいずれかにおいて免疫賦活因子を増加させることによってより強力になるように作製される。免疫賦活因子は、免疫エフェクター細胞における免疫応答を増強する特定のサイトカイン、ケモカイン、サイトキシン、およびサイトカイン受容体を指す。一実施形態において、T細胞は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、またはサイトカイン受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、TGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、IL-2、インスリン、IFN-γ、IL-7、IL-21、IL-10、IL-12、IL-15、およびTNF-αからなる群から選択されるサイトカインをコードする。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3、およびRANTESからなる群から選択されるケモカインをコードする。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、パーフォリン、グランザイムA、およびグランザイムBからなる群から選択される細胞毒素をコードする。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、IL-2受容体、IL-7受容体、IL-12受容体、IL-15受容体、およびIL-21受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードする。
c.フリップ受容体
さらなる実施形態において、ドナー修復テンプレートは、フリップ受容体またはその部分をコードする。本明細書で使用されるとき、「フリップ受容体」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをT細胞内の免疫刺激シグナルに変換する非天然ポリペプチドを指す。特定の実施形態において、TGFβR2フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそれらのバリアントと、膜貫通ドメインと、T細胞に免疫刺激シグナルを伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、TGFβR2フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそれらのバリアントと、TGFβR2膜貫通ドメインと、T細胞に免疫刺激シグナルを伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、TGFβR2フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそれらのバリアントと、膜貫通ドメインと、T細胞に免疫刺激シグナルを伝達するタンパク質からの細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、TGFβR2細胞外ドメインバリアントは、TGFβ-1に対する増加した結合親和性を有する。
さらなる実施形態において、ドナー修復テンプレートは、フリップ受容体またはその部分をコードする。本明細書で使用されるとき、「フリップ受容体」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをT細胞内の免疫刺激シグナルに変換する非天然ポリペプチドを指す。特定の実施形態において、TGFβR2フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそれらのバリアントと、膜貫通ドメインと、T細胞に免疫刺激シグナルを伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、TGFβR2フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそれらのバリアントと、TGFβR2膜貫通ドメインと、T細胞に免疫刺激シグナルを伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、TGFβR2フリップ受容体は、TGFβR2細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそれらのバリアントと、膜貫通ドメインと、T細胞に免疫刺激シグナルを伝達するタンパク質からの細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、TGFβR2細胞外ドメインバリアントは、TGFβ-1に対する増加した結合親和性を有する。
一実施形態において、膜貫通は、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、AMN、PD-1、およびTGFβR2から単離される。
一実施形態において、膜貫通は、CD4、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD134、CD137、またはCD3ポリペプチドから単離される。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、TGFβR2フリップ受容体を含み、TGFβR2細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインと、1つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび/または主要シグナル伝達ドメインとを含む。膜貫通および細胞内ドメインは、同じタンパク質または異なるタンパク質から単離され得る。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、TGFβR2フリップ受容体を含み、TGFβR2細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインのC末端終端にフレーム内で融合されたCD28、CD134、CD137、CD278、および/またはCD3ζからの細胞内ドメインとを含む。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、TGFβR2フリップ受容体を含み、TGFβR2細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインと、1つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび/または主要シグナル伝達ドメインとを含む。
2.免疫抑制シグナルダンパー
既存の養子細胞療法を悩ませるある制限または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊に起因する免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したT細胞は、ナイーブ、エフェクター、またはメモリーT細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するT細胞として定義される。
既存の養子細胞療法を悩ませるある制限または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊に起因する免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したT細胞は、ナイーブ、エフェクター、またはメモリーT細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するT細胞として定義される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫抑制因子によるシグナル伝達を減少または減衰することによって疲弊に対してより耐性を有するように作製される。一実施形態において、T細胞は、免疫抑制シグナルダンパーをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、TGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。
本明細書で使用されるとき、「免疫抑制シグナルダンパー」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルのT細胞への伝達を減少させる非天然ポリペプチドを指す。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片である。好ましい実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ダンパーが、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、任意に、膜貫通ドメインと、任意に、修飾細胞内ドメイン(例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン)とを含むため、特定の免疫抑制因子またはシグナル伝達経路への抑制、減衰、または優性阻害効果を引き出すポリペプチドを指す。
特定の実施形態において、細胞外ドメインは、および免疫抑制因子を認識および結合する細胞外結合ドメインである。
特定の実施形態において、修飾細胞内ドメインは、免疫抑制シグナルを減少または阻害するように変異される。好適な変異戦略には、アミノ酸置換、付加、または欠失が含まれるが、これらに限定されない。好適な変異には、さらに、シグナル伝達ドメインを除去するための細胞内ドメイン切断短縮、シグナル伝達モチーフ活性にとって重要な残基を除去するための変異細胞内ドメイン、および受容体循環を遮断するための変異細胞内ドメインが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、細胞内ドメインは、存在するとき、免疫抑制シグナルを伝達しないか、または実質的に低減されたシグナル伝達を有する。
したがって、いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、腫瘍微小環境から1つ以上の免疫抑制因子のためのシンクの役割を果たし、T細胞において対応する免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する。
1つの免疫抑制シグナルは、トリプトファン異化によって媒介される。癌細胞においてインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)によるトリプトファン異化は、腫瘍微小環境におけるT細胞への免疫抑制効果を有することが示されているキヌレニンの産生をもたらす。例えば、Platten et al.(2012)Cancer Res.72(21):5435-40を参照されたい。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、キヌレニナーゼ活性を有する酵素を含む。
特定の実施形態において使用するのに好適なキヌレニナーゼ活性を有する酵素の例示的な例には、L-キヌレニンヒドロラーゼが含まれるが、これに限定されない。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制因子によって媒介される免疫抑制シグナル伝達を減少または遮断する免疫抑制シグナルダンパーをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において企図される免疫抑制シグナルダンパーによって標的とされる免疫抑制因子の例示的な例には、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、形質転換成長因子β(TGFβ)、マクロファージコロニー刺激因子1(M-CSF1)、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、SiSo細胞リガンド上で発現される受容体結合癌抗原(RCAS1)、Fasリガンド(FasL)、CD47、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-10(IL-10)、およびインターロイキン-13(IL-13)が含まれるが、これらに限定されない。
種々の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
種々の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインを含む。
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとを含む。
別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを伝達しないかまたは免疫抑制シグナルを伝達する実質的に低減された能力を有する修飾細胞内ドメインとを含む。
本明細書で使用されるとき、「細胞外ドメイン」という用語は、抗原結合ドメインを指す。一実施形態において、細胞外ドメインは、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをT細胞に伝達する免疫抑制受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。特定の実施形態において、細胞外ドメインは、免疫受容体阻害性チロシンモチーフ(ITIM)および/または免疫受容体チロシンスイッチモチーフ(ITSM)を含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを指す。
免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態において使用するのに好適な細胞外ドメインの例示的な例には、抗体もしくはその抗原結合断片、または以下のポリペプチド:プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、リンパ球活性化遺伝子3タンパク質(LAG-3)、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメインタンパク質3(TIM3)、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)、バンドTリンパ球減弱因子(BTLA)、T細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシン依存性阻害性モチーフドメイン(TIGIT)、形質転換成長因子β受容体2(TGFβR2)、マクロファージコロニー刺激因子1受容体(CSF1R)、インターロイキン4受容体(IL4R)、インターロイキン6受容体(IL6R)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体1(CXCR1)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体2(CXCR2)、インターロイキン10受容体サブユニットアルファ(IL10R)、インターロイキン13受容体サブユニットアルファ2(IL13Rα2)、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAILR1)、SiSo細胞上で発現される受容体結合癌抗原(RCAS1R)、ならびにFas細胞表面死受容体(FAS)から単離された細胞外リガンド結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、細胞外ドメインは、PD-1、LAG-3、TIM3、CTLA-4、IL10R、TIGIT、CSF1R、およびTGFβR2からなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
多くの膜貫通ドメインは、特定の実施形態において使用され得る。特定の実施形態において企図される免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態において使用するのに好適な膜貫通ドメインの例示的な例には、以下のタンパク質:T細胞受容体、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD-1のアルファまたはベータ鎖の膜貫通ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書で企図される養子細胞療法は、TGFβR2を通る腫瘍微小環境からの免疫抑制TGFβシグナルの伝達を阻害または遮断する免疫抑制シグナルダンパーを含む。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、TGFβR2細胞外リガンド結合を含む細胞外ドメインと、TGFβR2膜貫通ドメインと、切断短縮された、機能不全TGFβR2細胞内ドメインとを含む。別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、TGFβR2細胞外リガンド結合を含む細胞外ドメイン、TGFβR2膜貫通ドメインを含み、細胞内ドメインを欠いている。
3.遺伝子操作された抗原受容体
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作された抗原受容体を含む。一実施形態において、T細胞は、遺伝子操作された抗原受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作された抗原受容体を含む。一実施形態において、T細胞は、遺伝子操作された抗原受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。
特定の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体である。
a.遺伝子操作されたTCR
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作されたTCRを含む。一実施形態において、T細胞は、遺伝子操作されたTCRをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、遺伝子操作されたTCRは、単一のTGFβR2遺伝子においてDSBで挿入される。別の実施形態、遺伝子操作されたTCRのアルファ鎖は、1つのTGFβR2遺伝子においてDSBに挿入され、遺伝子操作されたTCRのベータ鎖は、他のTGFβR2遺伝子においてDSBに挿入される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作されたTCRを含む。一実施形態において、T細胞は、遺伝子操作されたTCRをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、遺伝子操作されたTCRは、単一のTGFβR2遺伝子においてDSBで挿入される。別の実施形態、遺伝子操作されたTCRのアルファ鎖は、1つのTGFβR2遺伝子においてDSBに挿入され、遺伝子操作されたTCRのベータ鎖は、他のTGFβR2遺伝子においてDSBに挿入される。
一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたT細胞は、TGFβR2遺伝子で挿入されていない遺伝子操作されたTCRを含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)のアルファおよび/もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの1つ以上が、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBに挿入される。
自然発生するT細胞受容体は、2つのサブユニットであるアルファ鎖およびベータ鎖サブユニットを含み、これらの各々は、各T細胞のゲノムにおいて組換え事象によって産生される固有のタンパク質である。TCRのライブラリは、特定の標的抗原に対するそれらの選択性に関してスクリーニングされ得る。このように、標的抗原に対して高い結合活性および反応性を有する天然TCRが選択され、クローン化され、その後、養子免疫療法のために使用されるT細胞の集団内に導入され得る。
一実施形態において、T細胞は、1つ以上のTGFβR2遺伝子において、DSBでTCRのサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートに導入することによって修飾され、ここで、TCRサブユニットは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対してT細胞への特異性を付与するTCRを形成する能力を有する。特定の実施形態において、サブユニットは、サブユニットがTCRを形成する能力を保持し、トランスフェクトされたT細胞が標的細胞に誘導される能力を付与し、免疫学的に関連するサイトカインシグナル伝達に関与する限り、自然発生するサブユニットと比較して、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、または修飾を有する。遺伝子操作されたTCRはまた、好ましくは、高い活性を有する関連のある腫瘍関連ペプチドを表示する標的細胞に結合し、および任意に、インビボで関連ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷を媒介する。
遺伝子操作されたTCRをコードする核酸は、好ましくは、T細胞の(自然発生する)染色体においてそれらの天然の状況から単離され、本明細書の他の箇所で記載される、好適なベクター内に組み込まれ得る。それらを含む核酸およびベクターの両方が、細胞に、好ましくは、特定の実施形態において、T細胞内に移入され得る。次いで、修飾T細胞は、形質導入された核酸(複数可)によってコードされるTCRのうちの1つ以上の鎖を発現することができる。好ましい実施形態において、遺伝子操作されたTCRは、特定のTCRを正常に発現しないT細胞内に導入されるため、外因性TCRである。遺伝子操作されたTCRの本質的態様は、主要組織適合複合体(MHC)または類似の免疫学的構成要素によって提示される腫瘍抗原に対して高い結合力を有することである。遺伝子操作されたTCRとは対照的に、CARは、MHCの独立した様式で標的抗原に結合するように遺伝子操作される。
TCRは、結合した追加のポリペプチドが、機能的T細胞受容体およびMHC依存性抗原認識を形成するアルファ鎖またはベータ鎖の能力に干渉しない限り、TCRの本発明のアルファ鎖またはベータ鎖のアミノ末端またはカルボキシル末端部分に結合する追加のポリペプチドで発現され得る。
特定の実施形態において企図される遺伝子操作されたTCRによって認識される抗原には、血液癌および固形腫瘍の両方における抗原を含む、癌抗原が含まれるが、これに限定されない。例示的な抗原には、アルファ葉酸受容体、アルファ葉酸受容体、5T4、αvβ6インテグリン、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、ErbB2(HER2)を含むEGFRファミリー、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎児AchR、FRα、GD2、GD3、グリピカン-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、ラムダ、Lewis-Y、カッパ、メソテリン、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、サバイビン、TAG72、TEM、VEGFR2、およびWT-1が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、RNAポリメラーゼIIプロモーターまたは第1の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、1つの修飾および/または機能不全TGFβR2遺伝子に一体化された遺伝子操作されたTCRのアルファ鎖および/またはベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、RNAポリメラーゼIIプロモーターまたは第1の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、1つの修飾および/または機能不全TGFβR2遺伝子に一体化された遺伝子操作されたTCRのアルファ鎖およびベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、5´~3´の、第1の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、遺伝子操作されたTCRのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドと、第2の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、1つの修飾および/または機能不全TGFβR2遺伝子に一体化された遺伝子操作されたTCRのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。このような場合には、他のTGFβR2遺伝子は、機能的であり得るか、またはDSBによって機能を減少させるかもしく機能不全を与えられ、NHEJによって修復され得る。一実施形態において、他のTGFβR2遺伝子は、本明細書で企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼによって修飾され、機能を減少させるかまたは機能不全を与えられる。
ある特定の実施形態において、両方のTGFβR2遺伝子が修飾され、機能を減少するかまたは機能不全であり、第1の修飾TGFβR2遺伝子は、第1の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、遺伝子操作されたTCRのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む核酸を含み、第2の修飾TGFβR2遺伝子は、第2の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと遺伝子操作されたTCRのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
b.キメラ抗原受容体(CAR)
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、1つ以上のキメラ抗原受容体(CAR)を含む。一実施形態において、T細胞は、CARをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、CARは、単一のTGFβR2遺伝子においてDSBで挿入される。
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、1つ以上のキメラ抗原受容体(CAR)を含む。一実施形態において、T細胞は、CARをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、CARは、単一のTGFβR2遺伝子においてDSBで挿入される。
一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたT細胞、TGFβR2遺伝子で挿入されていないCAR、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)のアルファおよび/もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの1つ以上が、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBに挿入される。
種々の実施形態において、ゲノム編集されたT細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するCARを発現する。CARは、特異的抗腫瘍細胞性免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成するために、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインを有する標的抗原(例えば、腫瘍抗原)に対する抗体系特異性を組み合わせる分子である。本明細書で使用されるとき、「キメラ」という用語は、異なるタンパク質の部分または異なる起源からのDNAからなっていることを説明する。
種々の実施形態において、CARは、特異的標的抗原(結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される)に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。CARの主な特性は、免疫エフェクター細胞特異性を再指向するそれらの能力であり、それによって、主要組織適合性(MHC)の独立した様式で、標的抗原を発現する細胞の細胞死を媒介し得る、分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を引き起こし、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的能力を利用する。
特定の実施形態において、CARは、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍細胞上で発現される標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用されるとき、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、互換的に使用され、キメラ受容体、例えば、目的となる標的抗原に特異的に結合する能力を有するCARまたはDaricを提供する。結合ドメインは、生物学的分子(例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、脂質、多糖、または他の細胞表面標的分子もしくはその構成要素)に特異的に認識および結合する能力を有する、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含み得る。結合ドメインは、目的となる生物学的分子に対する、任意に自然発生する、合成、半合成、または組換え技術によって産生された結合パートナーを含む。
特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
「抗体」は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものなどの、標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダIg(ラクダ科抗体またはそのVHH断片)、Ig NAR、Fab断片、Fab’断片、F(ab)’2断片、F(ab)’3断片、Fv、単鎖Fv抗体(「scFv」)、ビス-scFv、(scFv)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)、および単一ドメイン抗体(sdAb、Nanobody)またはその他の抗体断片が含まれる。この用語はまた、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、ヘテロ共役抗体(二重特異性抗体など)、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)、Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997も参照されたい。
1つの好ましい実施形態において、結合ドメインは、scFvである。
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
特定の実施形態において、CARは、アルファ葉酸受容体、5T4、αvβ6インテグリン、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、ErbB2(HER2)を含むEGFRファミリー、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎児AchR、FRα、GD2、GD3、グリピカン-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、ラムダ、Lewis-Y、カッパ、メソテリン、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、サバイビン、TAG72、TEM、VEGFR2、およびWT-1からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
特定の実施形態において、CARは、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで、抗原は、クラスI MHC-ペプチド複合体またはクラスII MHC-ペプチド複合体などのMHC-ペプチド複合体である。
ある特定の実施形態において、CARは、種々のドメイン間のリンカー残基を含む。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的結合親和性を保持するように、2つのサブ結合ドメインの相互作用に適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、CARは、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約1~約25個のアミノ酸、約5~約20個のアミノ酸、もしくは約10~約20個のアミノ酸、またはアミノ酸の任意の介在する長さである。いくつかの実施形態において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上のアミノ酸長である。
特定の実施形態において、CARの結合ドメインの後ろに、1つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して適切な細胞/細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にする領域を指す(Patel et al.,Gene Therapy,1999;6:412-419)。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ある特定の実施形態において、スペーサードメインは、1つ以上の重鎖定常領域、例えば、CH2およびCH3を含むが、これらに限定されない、免疫グロブリンの部分である。スペーサードメインは、自然発生する免疫グロブリンヒンジ領域または改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態において、スペーサードメインは、IgG1、IgG4、またはIgDのCH2およびCH3を含む。
一実施形態において、CARの結合ドメインは、エフェクター細胞表面から離して抗原結合ドメインを位置決めて、適切な細胞/細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にする役割を果たす、1つ以上の「ヒンジドメイン」に連結される。CARは、概して、結合ドメインと膜貫通ドメイン(TM)との間に1つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、自然発生する免疫グロブリンヒンジ領域または改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
本明細書に記載されるCARにおいて使用するのに好適な例示的なヒンジドメインは、CD8α、およびCD4などの1型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であり得るか、または改変され得る。別の実施形態において、ヒンジドメインは、CD8αヒンジ領域を含む。
一実施形態において、ヒンジは、PD-1ヒンジまたはCD152ヒンジである。
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分および細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、CARを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するCARの部分である。TMドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。
例示的なTMドメインは、T細胞受容体、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、AMN、およびPD-1のアルファまたはベータ鎖の少なくとも膜貫通領域(複数可)に由来し得る(すなわち、それらを含み得る。
一実施形態において、CARは、CD8αに由来するTMドメインを含む。別の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、CD8αに由来するTMドメインと、好ましくは、TMドメインおよびCARの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン-セリンリンカーは、特定の好適なリンカーを提供する。
特定の実施形態において、CARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原への有効なCAR結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、CAR結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外CARドメインへの抗原結合で引き出される他の細胞応答を含む、活性化、サイトカイン産生、増殖、および細胞傷害性活性を引き出すことに関与するCARの部分を指す。
「エフェクター機能」という用語は、本細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解性活性もしくは補助、またはサイトカインの分泌を含む活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を行うように細胞を指向するタンパク質の部分を指す。通常は、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断短縮部分を使用する範囲内で、かかる切断短縮部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、それをドメイン全体の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断短縮部分を含むことを意味する。
TCR単独によって生成されるシグナルは、T細胞の完全な活性化に不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、T細胞活性化は、2つの固有のクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン:TCR(例えば、TCR/CD3複合体)によって抗原依存性一次活性化を惹起する主要シグナル伝達ドメイン、および抗原非依存性様式で作用して、二次または共刺激シグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態において、CARは、1つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」と「主要シグナル伝達ドメイン」とを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
主要シグナル伝達ドメインは、TCR複合体の一次活性化を刺激性に、または阻害性に調節する。刺激様式に作用する主要シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフまたはITAMとして既知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
特定の実施形態において企図されるCARにおいて使用するのに好適な主要シグナル伝達ドメインを含有するITAMの例示的な例には、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれる。特に好ましい実施形態において、CARは、CD3ζ主要シグナル伝達ドメインと1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内主要シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結され得る。
特定の実施形態において、CARは、CAR受容体を発現するT細胞の有効性および増大を強化するための1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用されるとき、「共刺激シグナル伝達ドメイン」、または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
特定の実施形態において企図されるCARにおいて使用するのに好適なかかる共刺激分子の例示的な例には、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、およびZAP70が含まれる。一実施形態において、CARは、CD28、CD137、およびCD134からなる群から選択される1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。
種々の実施形態において、CARは、BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1、およびTAG72からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、CD4、CD8α、CD154、およびPD-1からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、CD28、CD134、およびCD137からなる群から選択されるポリペプチドから単離された1つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインとを含む。
c.Daric受容体
特定の実施形態において、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、1つ以上のDaric受容体を含む。本明細書で使用されるとき、「Daric受容体」という用語は、多鎖遺伝子操作された抗原受容体を指す。一実施形態において、T細胞は、Daricの1つ以上の構成要素をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、Daricまたはその1つ以上の構成要素は、単一のTGFβR2遺伝子においてDSBで挿入される。
特定の実施形態において、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、1つ以上のDaric受容体を含む。本明細書で使用されるとき、「Daric受容体」という用語は、多鎖遺伝子操作された抗原受容体を指す。一実施形態において、T細胞は、Daricの1つ以上の構成要素をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、Daricまたはその1つ以上の構成要素は、単一のTGFβR2遺伝子においてDSBで挿入される。
一実施形態において、遺伝子操作されたT細胞は、TGFβR2遺伝子、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)のアルファおよび/もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体(CAR)のうちの1つ以上で挿入されないDaricを含むか、またはDaric受容体もしくはその構成要素は、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBに挿入される。
Daric構成および構成要素の例示的な例は、PCT公開第WO2015/017214号および米国特許公開第2015/0266973号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、以下のDaric構成要素:第1の多量体化ドメイン、第1の膜貫通ドメイン、ならびに1つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび/または主要シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ポリペプチドと、結合ドメイン、第2の多量体化ドメイン、および任意に、第2の膜貫通ドメインを含む結合ポリペプチドとを含む。機能的Daricは、シグナル伝達ポリペプチドおよび結合ポリペプチドの多量体化ドメインに関連し、かつそれらの間に配置される架橋因子を有する細胞表面上にDaric受容体複合体の形成を促進する架橋因子を含む。
特定の実施形態において、第1および第2の多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログ、クーママイシンまたはその誘導体、ジベレリンまたはその誘導体、アブシジン酸(ABA)またはその誘導体、メトトレキサートまたはその誘導体、シクロスポリンAまたはその誘導体、FKCsAまたはその誘導体、FKBP(SLF)のためのトリメトプリム(Tmp)-合成リガンドまたはその誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される架橋因子と関連する。
ラパマイシン類似体(ラパログ)の例示的な例には、米国特許第6,649,595号に開示されているものが含まれ、そのラパログ構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、架橋因子は、ラパマイシンと比較して、実質的に低減された免疫抑制効果を有するラパログである。「実質的に低減された免疫抑制効果」は、臨床的にソフトバンクまたはヒト免疫抑制活性の適切なインビトロ(例えば、T細胞増殖の阻害)もしくはインビボでのサロゲートで測定される、等モル量のラパマイシンに観察されるかまたは期待される免疫抑制効果を少なくとも0.1未満~0.005倍有するラパログを指す。一実施形態において、「実質的に低減された免疫抑制効果」は、同じアッセイにおいてラパマイシンに関して観察されるEC50値よりも少なくとも10~250倍大きいかかるインビトロアッセイにおいてEC50値を有するラパログを指す。
ラパログの他の例示的な例には、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、およびゾタロリムスが含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログである架橋因子と関連があるであろう。例えば、第1および第2の多量体化ドメインは、FKBPおよびFRBから選択される対である。FRBドメインは、FKBPタンパク質およびラパマイシンまたはそのラパログと共に三部分複合体を形成することができるポリペプチド領域(タンパク質「ドメイン」)である。FRBドメインは、ヒトおよび他の種からのmTORタンパク質(文献においてFRAP、RAPT1、またはRAFTとも称される)、Tor1およびTor2を含む酵母タンパク質、ならびにカンジダFRAPホモログを含む、多くの自然発生するタンパク質中に存在する。ヌクレオチド配列、クローニング、およびこれらのタンパク質の他の態様に関する情報は、既に当該技術分野において知られている。例えば、ヒトmTORにおけるタンパク質配列受託番号は、GenBank受託番号L34075.1である(Brown et al.,Nature369:756,1994)。
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なFRBドメインは、概して、少なくとも約85~約100個のアミノ酸残基を含有する。ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質において使用するためのFRBアミノ酸配列は、GenBank受託番号L34075.1のアミノ酸配列に基づいて、93アミノ酸配列Ile-2021~Lys-2113およびT2098Lの変異を含むであろう。特定の実施形態において企図されるDaricにおいて使用するためのFRBドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合したFKBPタンパク質の複合体に結合することができるであろう。ある特定の実施形態において、FRBドメインのペプチド配列は、(a)相同タンパク質のヒトmTORの少なくとも示された93アミノ酸領域または対応する領域に及ぶ自然発生するペプチド配列、(b)自然発生するペプチドの、最大約10個のアミノ酸、または約1~約5個のアミノ酸もしくは約1~約3個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか1個のアミノ酸が、欠失、挿入、または置換されている自然発生するFRBのバリアント、あるいは(c)自然発生するFRBドメインをコードするDNA分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝子コードの縮重がなかったら、自然発生するFRBドメインをコードするDNA分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るDNA配列によってコードされるペプチドを含む。
FKBP(FK506結合タンパク質)は、FK506、FK520、およびラパマイシンなどのマクロライドの細胞質受容体であり、種線にわたって高度に保存される。FKBPは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、FRBを含有するタンパク質または融合タンパク質を用いて三部分複合体をさらに形成することができるタンパク質またはタンパク質ドメインである。FKBPドメインはまた、「ラパマイシン結合ドメイン」とも称され得る。ヌクレオチド配列、クローニング、および種々のFKBP種の他の態様に関連する情報は、当該技術分野において知られている(例えば、Staendart et
al.,Nature 346:671,1990(human FKBP12)、Kay,Biochem.J.314:361,1996を参照されたい)。他の哺乳動物種、酵母、および他の生物における相同FKBPタンパク質もまた、当該技術分野において知られており、本明細書に開示される融合タンパク質において使用され得る。特定の実施形態において企図されるFKBPドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、FRBを含有するタンパク質を用いて三部分複合体に関与することができるであろう(かかる結合を検出するために、任意の手段によって、直接または間接的に決定され得るように)。
al.,Nature 346:671,1990(human FKBP12)、Kay,Biochem.J.314:361,1996を参照されたい)。他の哺乳動物種、酵母、および他の生物における相同FKBPタンパク質もまた、当該技術分野において知られており、本明細書に開示される融合タンパク質において使用され得る。特定の実施形態において企図されるFKBPドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、FRBを含有するタンパク質を用いて三部分複合体に関与することができるであろう(かかる結合を検出するために、任意の手段によって、直接または間接的に決定され得るように)。
特定の実施形態において企図されるDaricにおいて使用するのに好適なFKBPドメインの例示的な例には、好ましくはヒトFKBP12タンパク質(GenBank受託番号AAA58476.1)から単離された自然発生するFKBPペプチド配列、あるいはそこから、別のヒトFKBPから、マウスもしくは他の哺乳動物FKBPから、またはいくつかの他の動物、酵母、もしくは真菌FKBPから単離されたペプチド配列;自然発生するペプチドの、最大約10個のアミノ酸、または約1~約5個のアミノ酸もしくは約1~約3個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか1個のアミノ酸が、欠失、挿入、もしくは置換されている自然発生するFKBP配列のバリアント;あるいは自然発生するFKBPをコードするDNA分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝子コードの縮重がなかったら、自然発生するFKBPをコードするDNA分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るDNA配列によってコードされるペプチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において企図されるDaricにおいて使用するのに好適な多量体化ドメイン対の他の例示的な例には、FKBPおよびFRB、FKBPおよびカルシニューリン、FKBPおよびシクロフィリン、FKBPおよび細菌DHFR、カルシニューリンおよびシクロフィリン、PYL1およびABI1、またはGIB1およびGAI、またはそれらのバリアントが含まれるが、これらから含まれることに限定されない。
さらに他の実施形態において、抗架橋因子は、シグナル伝達ポリペプチドおよび結合ポリペプチドと架橋因子との会合を遮断する。例えば、シクロスポリンまたはFK506は、ラパマイシンを滴定するための抗架橋因子として使用され、したがって、1つの多量体化ドメインのみが結合するため、シグナル伝達を停止し得る。ある特定の実施形態において、抗架橋因子(例えば、シクロスポリン、FK506)は、免疫抑制剤である。例えば、免疫抑制抗架橋因子は、特定の実施形態において企図されるDaric構成要素の機能を遮断または最小限に抑え、同時に、臨床設定において望ましくないかまたは病理学的炎症応答を阻害または遮断するために使用され得る。
一実施形態において、第1の多量体化ドメインはFRB T2098Lを含み、第2の多量体化ドメインはFKBP12を含み、架橋因子はラパログAP21967である。
別の実施形態において、第1の多量体化ドメインはFRBを含み、第2の多量体化ドメインはFKBP12を含み、架橋因子はラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
特定の実施形態において、シグナル伝達ポリペプチド、第1の膜貫通ドメイン、および結合ポリペプチドは、第2の膜貫通ドメインまたはGPIアンカーを含む。第1および第2の膜貫通ドメインの例示的な例は、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、AMN、およびPD-1からなる群から独立して選択されるポリペプチドから単離される。
一実施形態において、シグナル伝達ポリペプチドは、1つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび/または主要シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態において企図されるDaricシグナル伝達構成要素において使用するのに好適な主要シグナル伝達ドメインの例示的な例には、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれる。特定の好ましい実施形態において、Daricシグナル伝達構成要素は、CD3ζ主要シグナル伝達ドメインと、1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内主要シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結され得る。
特定の実施形態において企図されるDaricシグナル伝達構成要素において使用するのに好適なかかる共刺激分子の例示的な例には、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、およびZAP70が含まれる。一実施形態において、Daricシグナル伝達構成要素は、CD28、CD137、およびCD134からなる群から選択される1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。
特定の実施形態において、Daric結合構成要素は、結合ドメインを含む。一実施形態において、結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。
抗体またはその抗原結合断片は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものなどの標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含む。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダIg(ラクダ科抗体またはそのVHH断片)、Ig
NAR、Fab断片、Fab’断片、F(ab)’2断片、F(ab)’3断片、Fv、単鎖Fv抗体(「scFv」)、ビス-scFv、(scFv)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)、および単一ドメイン抗体(sdAb、Nanobody)またはその他の抗体断片が含まれる。この用語はまた、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、ヘテロ共役抗体(二重特異性抗体など)、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)、Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997も参照されたい。
NAR、Fab断片、Fab’断片、F(ab)’2断片、F(ab)’3断片、Fv、単鎖Fv抗体(「scFv」)、ビス-scFv、(scFv)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)、および単一ドメイン抗体(sdAb、Nanobody)またはその他の抗体断片が含まれる。この用語はまた、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、ヘテロ共役抗体(二重特異性抗体など)、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)、Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997も参照されたい。
1つの好ましい実施形態において、結合ドメインは、scFvである。
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
特定の実施形態において、Daric結合構成要素は、アルファ葉酸受容体、5T4、αvβ6インテグリン、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、ErbB2(HER2)を含むEGFRファミリー、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎児AchR、FRα、GD2、GD3、グリピカン-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、ラムダ、Lewis-Y、カッパ、メソテリン、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、サバイビン、TAG72、TEM、VEGFR2、およびWT-1からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
一実施形態において、Daric結合構成要素は、細胞外ドメイン、例えば、クラスI
MHC-ペプチド複合体またはクラスII MHC-ペプチド複合体などのMHC-ペプチド複合体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
MHC-ペプチド複合体またはクラスII MHC-ペプチド複合体などのMHC-ペプチド複合体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるDaric構成要素は、2つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、またはモチーフを接続するリンカーまたはスペーサーを含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、約2~約35個のアミノ酸、または約4~約20個のアミノ酸、または約8~約15個のアミノ酸、または約15~約25個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、スペーサーは、抗体CH2CH3ドメイン、ヒンジドメインなどの特定の構造を有し得る。一実施形態において、スペーサーは、IgG1、IgG4、またはIgDのCH2およびCH3ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるDaric構成要素は、ドメインを位置決めて、適切な細胞/細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にする役割を果たす、1つ以上の「ヒンジドメイン」を含む。Daricは、結合ドメインと、多量体化ドメインおよび/もしくは膜貫通ドメイン(TM)との間、または多量体化ドメインと膜貫通ドメインとの間に1つ以上のヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、自然発生する免疫グロブリンヒンジ領域または改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、ヒンジは、CD8αヒンジまたはCD4ヒンジである。
一実施形態において、Daricは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、FRB T2098Lの第1の多量体化ドメインと、CD8膜貫通ドメインと、4-1BB共刺激ドメインと、CD3ζ主要シグナル伝達ドメインとを含み、結合ポリペプチドは、CD19に結合するscFvと、FKBP12の第2の多量体化ドメインと、CD4膜貫通ドメインとを含み、架橋因子は、ラパログAP21967である。
一実施形態において、Daricは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、FRBの第1の多量体化ドメインと、CD8膜貫通ドメインと、4-1BB共刺激ドメインと、CD3ζ主要シグナル伝達ドメインとを含み、結合ポリペプチドは、CD19に結合するscFvと、FKBP12の第2の多量体化ドメインと、CD4膜貫通ドメインとを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
d.ゼータカイン
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、1つ以上のキメラサイトカイン受容体を含む。一実施形態において、T細胞は、CARをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、単一のTGFβR2遺伝子においてDSBで挿入される。
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、1つ以上のキメラサイトカイン受容体を含む。一実施形態において、T細胞は、CARをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、単一のTGFβR2遺伝子においてDSBで挿入される。
一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたT細胞、TGFβR2遺伝子で挿入されていないキメラサイトカイン受容体、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)のアルファおよび/もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの1つ以上が、1つ以上のTGFβR2遺伝子においてDSBに挿入される。
種々の実施形態において、ゲノム編集されたT細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するキメラサイトカイン受容体を発現する。ゼータカインは、細胞外ドメインを細胞表面に連結することができる支援領域に連結された可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ膜貫通免疫受容体である。ゼータカインは、Tリンパ球の表面上で発現されるとき、可溶性受容体リガンドが特異的である受容体を発現するような細胞に、T細胞活性を指向する。ゼータカインキメラ免疫受容体は、様々な癌の治療への適用と共に、特に、ヒト悪性腫瘍によって利用される自己分泌/傍分泌サイトカイン系を介してT細胞の抗原特異性を再指向する。
特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、免疫抑制サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアント、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアントは、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-10(IL-10)、およびインターロイキン-13(IL-13)からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、リンカーは、CH2CH3ドメイン、ヒンジドメインなどを含む。一実施形態において、リンカーは、IgG1、IgG4、またはIgDのCH2およびCH3ドメインを含む。一実施形態において、リンカーは、CD8αまたはCD4ヒンジドメインを含む。
特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、T細胞受容体、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、AMN、およびPD-1のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択される。
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、主要シグナル伝達ドメインおよび/または共刺激ドメインを含有するITAMからなる群から選択される。
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dからなる群から選択される。
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、およびZAP70からなる群から選択される。
一実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、CD28、CD137、およびCD134からなる群から選択される1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。
F.ポリペプチド
ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、および融合ポリペプチドを含むがこれらに限定されない種々のポリペプチドが本明細書で企図される。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号:1~10に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として互換的に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、多様な周知の組換えおよび/または合成技法のうちのいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに自然発生するかまたは自然発生しない両方の、当該技術分野において既知の他の修飾を含み得る。
ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、および融合ポリペプチドを含むがこれらに限定されない種々のポリペプチドが本明細書で企図される。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号:1~10に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として互換的に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、多様な周知の組換えおよび/または合成技法のうちのいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに自然発生するかまたは自然発生しない両方の、当該技術分野において既知の他の修飾を含み得る。
本明細書で使用されるとき、「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、または「単離されたポリペプチド」などは、ペプチドまたはポリペプチド分子の、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からのインビトロ合成、単離、および/または精製を指し、すなわち、それは、インビボ物質と強く会合していない。
特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、エンドプロセシングヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、およびそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、および/または挿入において自然発生するポリペプチドとは異なり得る。かかるバリアントは、自然発生し得るか、または例えば、上述のポリペプチド配列の1つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成的に生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチド内に1つ以上の置換、欠失、付加、および/または挿入を導入することによって、ヒトTGFβR2遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するホーミングエンドヌクレアーゼ、megaTALなどの生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書で企図される参照配列のいずれかに対して少なくとも約65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、ここで、バリアントは、参照配列の少なくとも1つの生物学的活性を維持する。
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なポリペプチド断片の例示的な例には、DNA結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどが含まれる。本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」は、少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも40%、少なくとも30%、少なくとも20%、少なくとも10%、または少なくとも5%の自然発生するポリペプチド活性を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態において、生物学的活性は、標的配列に対する結合親和性および/または切断活性である。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも5~約1700のアミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片が、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700以上のアミノ酸長であることが理解されるであろう。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、「X」として示される1つ以上のアミノ酸を含み得る。「X」は、アミノ酸配列番号に存在する場合、任意のアミノ酸を指す。1つ以上の「X」残基は、特に本明細書で企図される配列番号に記載されるアミノ酸配列のN末端およびC末端に存在し得る。「X」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に記載される残りのアミノ酸配列は、生物学的に活性な断片とみなされる。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、例えば、配列番号:3~7、またはmegaTAL(配列番号:8~9)の生物学的に活性な断片を含む。生物学的に活性な断片は、N末端切断短縮および/またはC末端切断短縮を含み得る。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの1、2、3、4、5、6、7、または8個のN末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの4個のN末端アミノ酸の欠失を欠いているかまたは含む。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの1、2、3、4、または5個のC末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの2個のC末端アミノ酸の欠失を欠いているかまたは含む。特に好ましい実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの4個のN末端アミノ酸および2個のC末端アミノ酸の欠失を欠いているかまたは含む。
特定の実施形態において、I-OnuIバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個の、以下のN末端アミノ酸:M、A、Y、M、S、R、R、Eの欠失、および/または1、2、3、4、もしくは5個の、以下のC末端アミノ酸:R、G、S、F、Vの欠失を含む。
特定の実施形態において、I-OnuIバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個の、以下のN末端アミノ酸:M、A、Y、M、S、R、R、Eの欠失もしくは置換、および/または1、2、3、4、もしくは5個の、以下のC末端アミノ酸:R、G、S、F、Vの欠失もしくは置換を含む。
特定の実施形態において、I-OnuIバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個の、以下のN末端アミノ酸:M、A、Y、M、S、R、R、Eの欠失、および/または1もしくは2個の、以下のC末端アミノ酸:F、Vの欠失を含む。
特定の実施形態において、I-OnuIバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個の、以下のN末端アミノ酸:M、A、Y、M、S、R、R、Eの欠失もしくは置換、および/または1もしくは2個の、以下のC末端アミノ酸:F、Vの欠失もしくは置換を含む。
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断短縮、および挿入を含む種々の方法で改変され得る。かかる操作のための方法は、概して、当該技術分野において知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、DNAにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法が当該技術分野において良く知られている。例えば、Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488-492)、Kunkel et al.,(1987,Methods in Enzymol.154:367-382)、米国特許第4,873,192号、Watson,J.D.et al.,(Molecular Biology of the Gene,Fourth Edition,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)、およびそこに引用される参考文献を参照されたい。目的となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に対するガイダンスは、Dayhoff et al.,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)のモデルにおいて見出され得る。
ある特定の実施形態において、バリアントは、1つ以上の保存的置換を含有するであろう。「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換である。修飾は、特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われ得、ポリペプチドは、少なくとも約を有するポリペプチドを含み、依然として望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を得る。同等の、またはさらに改善された、バリアントポリペプチドを作成するためポリペプチドのアミノ酸配列を改変することが所望されるとき、当業者は、例えば、表1に従って、例えば、コードするDNA配列のコドンのうちの1つ以上を変化させ得る。
どのアミノ酸残基が、生物学的活性を廃止することなく、置換、挿入、または欠失され得るかを決定するためのガイダンスは、DNASTAR、DNA Strider、Geneious、Macベクター、またはベクターNTIソフトウェアなどの当該技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用して見出され得る。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電されたアミノ酸または非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの1つの置換を伴う。自然発生するアミノ酸は、概して、4つのファミリー:酸性(アスパルテート、グルタメート)、塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、および非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)アミノ酸に分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換が当業者に知られており、概して、得られる分子の生物学的活性を改変することなく行われ得る。当業者は、概して、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する(例えば、Watson et al.Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224を参照されたい)。
一実施形態において、2つ以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所で開示されるIRES配列によって分離され得る。
特定の実施形態において企図されるポリペプチドには、融合ポリペプチドが含まれる。特定の実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10個のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
別の実施形態において、2つ以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所で開示される1つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、1つ以上のDNA結合ドメインと、1つ以上のヌクレアーゼと、1つ以上のリンカーおよび/または自己切断型ポリペプチドと含む。
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアントと、リンカーまたは自己切断型ペプチドと、5´-3´エクソヌクレアーゼ、5´-3´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、および3´-5´エクソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)を含むが、これらに限定されないエンドプロセシング酵素とを含む。
融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン(CPP)、DNA結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなど、エピトープタグ(例えば、マルトース結合タンパク質(「MBP」)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、HIS6、MYC、FLAG、V5、VSV-G、およびHA)、ポリペプチドリンカー、およびポリペプチド切断シグナルを含むが、これらに限定されない1つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントを含み得る。融合ポリペプチドは、C末端からC末端、N末端からN末端、またはN末端からC末端に連結することも可能であるが、それらは、典型的には、C末端からN末端に連結される。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存されている限り、保守的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、および種間ホモログも含み得る。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、もしくは2つの部分間の化学結合によって産生され得るか、または、概して、他の標準の技法を使用して調製され得る。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたDNA配列は、本明細書の他の箇所で開示されるように、好適な転写または翻訳制御要素に作動可能に連結されている。
融合ポリペプチドは、任意に、1つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを連結させるために使用され得るリンカーを含む。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮することができるように、各ポリペプチドがその適切な二次および三次構造に折り畳むのを確実にするのに十分な距離によって、任意の2つ以上のポリペプチド構成要素を分離するために用いられ得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該技術分野において標準的な技法を使用して融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の要因:(1)可撓性延長配座を採用する能力、(2)第1および第2のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用できない能力、ならびに(3)ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、Asn、およびSer残基を含有する。ThrおよびAlaなどの他の近い中性アミノ酸もまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Maratea et al.,Gene40:39-46,1985、Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8258-8262,1986、米国特許第4,935,233号、および米国特許第4,751,180号に開示されているものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐために使用され得る非必須N末端アミノ酸領域を含有するとき、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、1~200アミノ酸長、1~100アミノ酸長、または1~50アミノ酸長であり得、その間の全ての整数値を含む。
代表的なリンカーには、以下のアミノ酸配列:グリセリンポリマー(G)n、グリセリン-セリンポリマー(G1~5S1~5)n(式中、nは、少なくとも1、2、3、4、または5の整数である)、グリセリン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、GGG(配列番号:23)、DGGGS(配列番号:24)、TGEKP(配列番号:25)(例えば、Liu et al.,PNAS 5525-5530(1997)を参照されたい)、GGRR(配列番号:26)(Pomerantz et al.1995(上記参照))、(GGGGS)n(式中、n=1、2、3、4、または5)(配列番号:27)(Kim et al.,PNAS 93,1156-1160(1996.)、EGKSSGSGSESKVD(配列番号:28)(Chaudhary et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070);KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号:29)(Bird et al.,1988,Science 242:423-426)、GGRRGGGS(配列番号:30)、LRQRDGERP(配列番号:31)、LRQKDGGGSERP(配列番号:32)、LRQKD(GGGS)2ERP(配列番号:33)が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、可撓性リンカーは、DNA結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングすることができるコンピュータプログラム(Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256-2260(1993)、PNAS91:11099-11103(1994)を使用して、またはファージディスプレイ方法によって理性的に設計され得る。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインの各々の間または内在性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。その上、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。代表的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位(例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位)、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる(deFelipe and Ryan,2004Traffic,5(8);616-26を参照されたい)。
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドが当業者に知られている(例えば、Ryan et al.,1997.J.Gener.Virol.78,699-722、Scymczak et al.(2004)Nature Biotech.5,589-594を参照されたい)。代表的なプロテアーゼ切断部位には、ポチウイルスNIaプロテアーゼ(例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ)、ポチウイルスHCプロテアーゼ、ポチウイルスP1(P35)プロテアーゼ、ビオウイルス(byovirus)NIaプロテアーゼ、ビオウイルスRNA-2-エンコードプロテアーゼ、アフトウイルスLプロテアーゼ、エンテロウイルス2Aプロテアーゼ、ライノウイルス2Aプロテアーゼ、ピコルナ3Cプロテアーゼ、コモウイルス24Kプロテアーゼ、ネポウイルス24Kプロテアーゼ、RTSV(イネツングロスフェリカルウイルス)3C様プロテアーゼ、PYVF(パースニップ黄斑ウイルス)3C様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Xa因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が含まれるが、これらに限定されない。その高い切断厳密性に起因して、TEV(タバコエッチウイルス)プロテアーゼ切断部位は、一実施形態において、例えば、EXXYXQ(G/S)(配列番号:34)、例えば、ENLYFQG(配列番号:35)、およびENLYFQS(配列番号:36)(式中、Xは、任意のアミノ酸を表す)(TEVによる切断は、QとGまたはQとSとの間に起こる)が好ましい。
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、2Aまたは2A様部位、配列またはドメインを含む(Donnelly et al.,2001.J.Gen.Virol.82:1027-1041)。特定の実施形態において、ウイルス2Aペプチドは、アフトウイルス2Aペプチド、ポチウイルス2Aペプチド、またはカルジオウイルス2Aペプチドである。
一実施形態において、ウイルス2Aペプチドは、口蹄疫ウイルス(FMDV)(F2A)ペプチド、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)(E2A)ペプチド、ゾーシーアシグナウイルス(TaV)(T2A)ペプチド、ブタテッショウウイルス-1(PTV-1)(P2A)ペプチド、タイロウイルス2Aペプチド、および脳心筋炎ウイルス2Aペプチドからなる群から選択される。
G.ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書で企図される1つ以上のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、エンドプロセシング酵素、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびDNA/RNAハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、1本鎖もしくは2本鎖、および組換え、合成、または単離のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドには、プレ-メッセンジャーRNA(プレ-mRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、RNA、短干渉RNA(siRNA)、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、ゲノムRNA(gRNA)、プラス鎖RNA(RNA(+))、マイナス鎖RNA(RNA(-))、tracrRNA、crRNA、単一ガイドRNA(sgRNA)、合成RNA、合成mRNA、ゲノムDNA(gDNA)、PCR増幅DNA、相補的DNA(cDNA)、合成DNA、または組換えDNAが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、少なくとも10000、または少なくとも15000以上のヌクレオチド長、ならびに全ての中間の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド、もしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの多量体型、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、6、7、8、9などの、101、102、103などの、151、152、153などの、201、202、203などの引用された値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくともまたは約50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。
特定の実施形態において、本明細書で企図される1つ以上のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、エンドプロセシング酵素、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびDNA/RNAハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、1本鎖もしくは2本鎖、および組換え、合成、または単離のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドには、プレ-メッセンジャーRNA(プレ-mRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、RNA、短干渉RNA(siRNA)、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、ゲノムRNA(gRNA)、プラス鎖RNA(RNA(+))、マイナス鎖RNA(RNA(-))、tracrRNA、crRNA、単一ガイドRNA(sgRNA)、合成RNA、合成mRNA、ゲノムDNA(gDNA)、PCR増幅DNA、相補的DNA(cDNA)、合成DNA、または組換えDNAが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、少なくとも10000、または少なくとも15000以上のヌクレオチド長、ならびに全ての中間の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド、もしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの多量体型、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、6、7、8、9などの、101、102、103などの、151、152、153などの、201、202、203などの引用された値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくともまたは約50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。本明細書で使用されるとき、「コドン最適化される」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性、および/または活性を増加させるためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいてコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす要因には、(i)2つ以上の生物もしくは遺伝子もしくは合成的に構築されたバイアステーブル間のコドンバイアスの変形、(ii)生物、遺伝子、もしくは遺伝子の組におけるコドンバイアスの角度の変動、(iii)文脈を含むコドンの系統的変形、(iv)それらのデコードtRNAに応じたコドンの変形、(v)三つ組の全体もしくは1つの位置のいずれかにおけるGC%に従ったコドンの変形、(vi)参照配列、例えば、自然発生する配列に対する類似性の程度の変動、(vii)コドン周波数遮断の変動、(viii)DNA配列から転写されるmRNAの構造特性、(ix)コドン置換セットの設計が基になる際のDNA配列の機能に関する予備知識、(x)各アミノ酸に関するコドンセットの系統的変形、および/または(xi)偽の翻訳惹起部位の単離除去のうちの1つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、リン酸化糖とのN-グリコシド連結における複素環窒素塩基を指す。ヌクレオチドは、天然塩基、および幅広く多様な当該技術分野において認識された修飾塩基を含むと理解される。かかる塩基は、概して、ヌクレオチド糖部分の1´位に位置する。ヌクレオチドは、概して、塩基、糖、およびリン酸基を含む。リボ核酸(RNA)において、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸(DNA)において、糖はデオキシリボース、すなわち、リボースに存在するヒドロキシル基を欠いている糖である。代表的な天然窒素塩基には、プリン、アデノシン(A)およびグアニジン(G)、ならびにピリミジン、シチジン(C)、およびチミジン(T)(または、RNAの文脈で、ウラシル(U))が含まれる。デオキシリボースのC-1原子は、ピリミジンのN-1またはプリンのN-9に結合する。ヌクレオチドは、通常、モノ、ジ、またはトリホスフェートである。ヌクレオチドは、糖、ホスフェート、および/または塩基部分で修飾されていなくても、修飾されていてもよい(互換的に、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、および非標準ヌクレオチドとも称され、例えば、WO92/07065およびWO93/15187を参照されたい)。修飾された核酸塩基の例は、Limbach et al.,(1994,Nucleic Acids Res.22,2183-2196)によって要約されている。
ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルとも認識され得、エステル化は、糖のC-5に結合したヒドロキシル基上で起こる。本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」という用語は、糖とのN-グリコシド連結における複素環窒素塩基を指す。ヌクレオシドは、当該技術分野において、天然塩基を含み、かつ周知の修飾塩基を含むとも認識される。かかる塩基は、概して、ヌクレオシド糖部分の1´位に位置する。ヌクレオシドは、概して、塩基および糖基を含む。ヌクレオシドは、糖および/または塩基部分で修飾されていなくても、修飾されていてもよい(互換的に、ヌクレオシド類似体、ヌクレオシド誘導体、修飾ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、または非標準ヌクレオシドとも称される)。上記にも述べられているように、修飾核酸塩基の例は、Limbach et al.,(1994,Nucleic Acids Res.22,2183-2196)によって要約されている。
ポリヌクレオチドの例示的な例には、配列番号:1~10をコードするポリヌクレオチド、および配列番号:11~20に記載されるポリヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
種々の例示的な実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドには、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、エンドプロセシング酵素、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および発現ベクター、ウイルスベクター、および本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含む移入プラスミドが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、以下に定義される厳密な条件下で、参照配列とハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも1つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語には、1つ以上のヌクレオチドが、付加もしくは欠失されるか、または修飾されるか、または異なるヌクレオチドで置き換えられるポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失、および置換を含む、ある特定の改変が、参照ポリヌクレオチドに対して行われ得、それによって、改変されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当該技術分野において十分に理解される。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「厳密な条件」下でハイブリダイズすることは、互いに少なくとも60%同一であるヌクレオチド配列がハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。概して、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびpHで特異的な配列に対して熱融解点(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度(規定されたイオン強度、pH、および核酸濃度下で)である。概して、標的配列が過剰に存在するため、Tmでは、プローブの50%が平衡状態で占有されている。
本明細書で使用されるとき、「配列同一性」または、例えば、「~に対して50%の配列同一性」を含む記述は、配列が比較ウィンドウ上のヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ上の2つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、I)または同一のアミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMet)が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウィンドウ(すなわち、ウィンドウサイズ)中の位置の総数で割り、その結果に100を乗じることによって計算し、配列同一性のパーセンテージを得ることができる。典型的には、ポリペプチドバリアントが、参照ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を維持する場合に、本明細書に記載される参照配列のうちのいずれかに対して少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも12個、しばしば、15~18個、多くの場合、少なくとも25個のモノマー単位である。2つのポリヌクレオチドは、各々、(1)2つのポリヌクレオチド間で類似性がある配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ)、および(2)2つのポリヌクレオチド間で多様性がある配列を含み得るため、2つ(またはそれ以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を特定および比較するために、「比較ウィンドウ」上の2つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、2つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも6個の連続した位置、通常、約50~約100個、より一般的には約100~約150個の概念セグメントを指す。比較ウィンドウは、2つの配列の最適な整列のために、(付加または欠失を含まない)参照配列と比較して約20%以下の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、アルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0、Genetics Computer Group、575 Science Drive Madison,WI,USAのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)のコンピュータ実装によって、または検査、および選択された種々の方法のいずれかによって生成された最良の整列(すなわち、比較ウィンドウ上で最も高いパーセンテージの相同性をもたらすこと)によって行われ得る。例えば、Altschul et al.,1997,Nucl.Acids Res.25:3389によって開示されているようなプログラムのBLASTファミリーも参照することができる。配列分析の詳細な議論は、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc.,1994-1998,Chapter15のユニット19.3に見出すことができる。
本明細書で使用されるとき、「単離ポリヌクレオチド」は、自然発生する状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されているDNA断片を指す。特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、自然には存在せず、人間の手によって作製された、相補的DNA(cDNA)、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。
種々の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、およびエンドプロセシング酵素を含むがこれらに限定されない、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするmRNAを含む。ある特定の実施形態において、mRNAは、キャップ、1つ以上のヌクレオチド、およびポリ(A)尾部を含む。
本明細書で使用されるとき、「5´キャップ」または「5´キャップ構造」または「5´キャップ部分」という用語は、mRNAの5´終端で組み込まれている化学的修飾を指す。5´キャップは、核外搬出、mRNA安定性、および翻訳に関与する。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmRNAは、mRNA分子の末端グアノシンキャップ残基と5´末端転写センスヌクレオチドとの間に5´-ppp-5´-トリホスフェート連結を含む5´キャップを含む。次いで、この5´-グアニレートキャップは、N7-メチル-グアニレート残基を生成するためにメチル化され得る。
本明細書で企図されるmRNAポリヌクレオチドの特定の実施形態において使用するのに好適な5´キャップの例示的な例には、未メチル化5´キャップ類似体、例えば、G(5´)ppp(5´)G、G(5´)ppp(5´)C、G(5´)ppp(5´)A;メチル化5´キャップ類似体、例えば、m7G(5´)ppp(5´)G、m7G(5´)ppp(5´)C、およびm7G(5´)ppp(5´)A;ジメチル化5´キャップ類似体、例えば、m2,7G(5´)ppp(5´)G、m2,7G(5´)ppp(5´)C、およびm2,7G(5´)ppp(5´)A;トリメチル化5´キャップ類似体、例えば、m2,2,7G(5´)ppp(5´)G、m2,2,7G(5´)ppp(5´)C、およびm2,2,7G(5´)ppp(5´)A;ジメチル化対称5´キャップ類似体、例えば、m7G(5´)pppm7(5´)G、m7G(5´)pppm7(5´)C、およびm7G(5´)pppm7(5´)A;ならびに抗逆5´キャップ類似体、例えば、抗逆方向キャップ類似体(ARCA)キャップ、指定3´O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G、2´O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G、2´O-Me-m7G(5´)ppp(5´)C、2´O-Me-m7G(5´)ppp(5´)A、m72´d(5´)ppp(5´)G、m72´d(5´)ppp(5´)C、m72´d(5´)ppp(5´)A、3´O-Me-m7G(5´)ppp(5´)C、3´O-Me-m7G(5´)ppp(5´)A、m73´d(5´)ppp(5´)G、m73´d(5´)ppp(5´)C、m73´d(5´)ppp(5´)A、およびそれらのテトラホスフェート誘導体)(例えば、Jemielity et al.,RNA,9:1108-1122(2003)を参照されたい)が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、mRNAは、トリホスフェート架橋を介して、第1の転写ヌクレオチドの5´-終端に連結されて、m7G(5´)ppp(5´)N(式中、Nは、任意のヌクレオシドである)をもたらす7-メチルグアニレート(「m7G」)である5´キャップを含む。
いくつかの実施形態において、mRNAは、5´キャップを含み、ここで、キャップは、Cap0構造(Cap0構造は、塩基1および2に結合したリボースの2´-O-メチル残基を欠いている)、Cap1構造(Cap1構造は、塩基2で2´-O-メチル残基を有する)、またはCap2構造(Cap2構造は、塩基2および3の両方に結合した2´-O-メチル残基を有する)である。
一実施形態において、mRNAは、m7G(5´)ppp(5´)Gキャップを含む。
一実施形態において、mRNAは、ARCAキャップを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmRNAは、1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、シュードウリジン、ピリジン(pyridin)-4-ワンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオウリジン、4-チオ-シュードウリジン、2-チオ-シュードウリジン、5-ヒドロキシウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチル-ウリジン、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-シュードウリジン、5-タウリノメチルウリジン、1-タウリノメチル-シュードウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、5-メチル-ウリジン、1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、5-アザ-シチジン、シュードイソシチジン、3-メチル-シチジン、N4-アセチルシチジン、5-ホルミルシチジン、N4-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、1-メチル-シュードイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-シュードイソシチジン、2-チオ-シチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-シュードイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-シュードイソシチジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、7-メチルアデニン、2-メチルチオ-アデニン、2-メトキシ-アデニン、イノシン、1-メチル-イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7-デアザ-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチルイノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、およびN2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、シュードウリジン、ピリジン(pyridin)-4-ワンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオウリジン、4-チオ-シュードウリジン、2-チオ-シュードウリジン、5-ヒドロキシウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチル-ウリジン、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-シュードウリジン、5-タウリノメチルウリジン、1-タウリノメチル-シュードウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、5-メチル-ウリジン、1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、および4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、5-アザ-シチジン、シュードイソシチジン、3-メチル-シチジン、N4-アセチルシチジン、5-ホルミルシチジン、N4-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、1-メチル-シュードイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-シュードイソシチジン、2-チオ-シチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-シュードイソシチジン、および4-メトキシ-1-メチル-シュードイソシチジンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、7-メチルアデニン、2-メチルチオ-アデニン、および2-メトキシ-アデニンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、イノシン、1-メチル-イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7-デアザ-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチルイノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、およびN2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシンからなる群から選択される1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、mRNAは、1つ以上のシュードウリジン、1つ以上の5-メチル-シトシン、および/または1つ以上の5-メチル-シチジンを含む。
一実施形態において、mRNAは、1つ以上のシュードウリジンを含む。
一実施形態において、mRNAは、1つ以上の5-メチル-シチジンを含む。
一実施形態において、mRNAは、1つ以上の5-メチル-シトシンを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるmRNAは、mRNAをエクソヌクレアーゼ分解から保護し、mRNAを安定化させ、翻訳を促進するのを補助するためのポリ(A)尾部を含む。ある特定の実施形態において、mRNAは、3´ポリ(A)尾部構造を含む。
特定の実施形態において、ポリ(A)尾部の長さは、少なくとも約10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、もしくは少なくとも約500以上のアデニンヌクレオチド、または任意の介在する数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリ(A)尾部の長さは、少なくとも約125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、202、203、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、または275以上のアデニンヌクレオチドである。
特定の実施形態において、ポリ(A)尾部の長さは、約10~約500アデニンヌクレオチド、約50~約500アデニンヌクレオチド、約100~約500アデニンヌクレオチド、約150~約500アデニンヌクレオチド、約200~約500アデニンヌクレオチド、約250~約500アデニンヌクレオチド、約300~約500アデニンヌクレオチド、約50~約450アデニンヌクレオチド、約50~約400アデニンヌクレオチド、約50~約350アデニンヌクレオチド、約100~約500アデニンヌクレオチド、約100~約450アデニンヌクレオチド、約100~約400アデニンヌクレオチド、約100~約350アデニンヌクレオチド、約100~約300アデニンヌクレオチド、約150~約500アデニンヌクレオチド、約150~約450アデニンヌクレオチド、約150~約400アデニンヌクレオチド、約150~約350アデニンヌクレオチド、約150~約300アデニンヌクレオチド、約150~約250アデニンヌクレオチド、約150~約200アデニンヌクレオチド、約200~約500アデニンヌクレオチド、約200~約450アデニンヌクレオチド、約200~約400アデニンヌクレオチド、約200~約350アデニンヌクレオチド、約200~約300アデニンヌクレオチド、約250~約500アデニンヌクレオチド、約250~約450アデニンヌクレオチド、約250~約400アデニンヌクレオチド、約250~約350アデニンヌクレオチド、もしくは約250~約300アデニンヌクレオチドまたは任意の介在する範囲のアデニンヌクレオチドである。
ポリヌクレオチドの方向を説明する用語には、5´(通常は、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの終端)および3´(通常は、遊離ヒドロキシル(OH)基を有するポリヌクレオチドの終端)が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、5´から3´の方向または3´から5´の方向で注記され得る。DNAおよびmRNAに関して、5´から3´の鎖は、「センス」、「プラス」、または「コード」鎖と呼ばれ、これは、その配列が、[DNAのチミン(T)の代わりに、RNAのウラシル(U)を除いて]プレメッセンジャー(プレmRNA)の配列と同一であるからである。DNAおよびmRNAに関して、RNAポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な3´から5´の鎖は、「テンプレート」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、「逆方向」という用語は、3´から5´の方向で書かれた5´から3´の配列または5´から3´の方向で書かれた3´から5´の配列を指す。
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)を指す。例えば、DNA配列5´A G T C
A T G 3´の相補的鎖は、3´T C A G T A C 5´である。後者の配列は、左に5´終端および右に3´終端を有する逆補体、5´C A T G A C T 3´として書かれることが多い。その逆補体に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従って一致している、「部分的」であり得る。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。
A T G 3´の相補的鎖は、3´T C A G T A C 5´である。後者の配列は、左に5´終端および右に3´終端を有する逆補体、5´C A T G A C T 3´として書かれることが多い。その逆補体に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従って一致している、「部分的」であり得る。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。
本明細書で使用されるとき、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、RNAを発現し、その後ポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的となる遺伝子(複数可)、例えば、目的となるポリヌクレオチド(複数可)を含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、1つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ(A)配列、および目的となる遺伝子(複数可)、例えば、目的となるポリヌクレオチド(複数可)を含有する。ベクターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がRNAに転写され、必要であればタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、かつ、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物学的活性のために適した区画に転位置され得るような位置および配列でベクター内に方向付けられる。好ましくは、カセットは、ベクターへの即座の挿入に適合されたその3´および5´終端を有し、例えば、それは、各終端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝的障害を治療、予防、または改善するために使用される療法遺伝子の配列を含有する。カセットは除去され、単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入され得る。
ポリヌクレオチドは、目的となるポリヌクレオチド(複数可)を含む。本明細書で使用されるとき、「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で企図されるように、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または阻害性ポリヌクレオチドの転写のためのテンプレートとして機能するポリペプチドを指す。
さらに、本明細書で企図されるように、遺伝子コードの縮重の結果として、ポリペプチドをコードし得る多くのヌクレオチド配列またはそのバリアントの断片があることが、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いかなるネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用における相違に起因して異なるポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび/または霊長類コドン選択に最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態で具体的に企図される。一実施形態において、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換などの1つ以上の変異の結果として改変される内因性ポリヌクレオチド配列である。
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ドナー修復テンプレートを含む。
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、siRNA、miRNA、shRNA、リボザイム、または別の阻害性RNAを含むがこれらに限定されない阻害性ポリヌクレオチドを含む。
一実施形態において、阻害性RNAを含むドナー修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、強力な構造的なpol III、例えば、ヒトもしくはマウスU6 snRNAプロモーター、ヒトおよびマウスH1 RNAプロモーター、またはヒトtRNA-valプロモーター、または強力な構造的なpol IIプロモーターなどの1つ以上の調節配列を含む。
コード配列それ自体の長さにかかわらず、特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で開示されるか、または当該技術分野において知られているように、プロモーターおよび/またはエンハンサー、非翻訳領域(UTR)、Kozak配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位(IRES)、リコンビナーゼ認識部位(例えば、LoxP、FRT、およびAtt部位)、終止コドン、転写終結シグナル、翻訳後応答要素、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のDNA配列と組み合わされ得、それにより、それらの全体的な長さが、著しく異なり得る。したがって、ほとんどのいかなる長さのポリヌクレオチド断片も用いられ得、合計の長さは、好ましくは調製の容易さおよび意図される組換えDNAプロトコルの使用によって制限されることが特定の実施形態において企図される。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知の入手可能な多様な十分に確立された技法のいずれかを使用して、調製、操作、発現、および/または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、適切なベクターに挿入され得る。所望のポリペプチドはまた、ポリペプチドをコードするmRNAを細胞内に送達することによっても発現され得る。
ベクターの例示的な例には、プラスミド、自律的に複製する配列、および置き換え可能な要素、例えば、Sleeping Beauty、PiggyBacが含まれるが、これらに限定されない。
ベクターの追加の例示的な例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、またはP1由来の人工染色体(PAC)などの人工染色体、ラムダファージまたはM13ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例には、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス(例えば、SV40)が含まれるが、これらに限定されない。
発現ベクターの例示的な例には、哺乳動物細胞における発現のためのpClneoベクター(Promega)、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子移入および発現のためのpLenti4/V5-DEST(商標)、pLenti6/V5-DEST(商標)、およびpLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのかかる発現ベクターにライゲーションされ得る。
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外で維持されるベクターである。本明細書で使用されるとき、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体DNAに一体化することなしに、および宿主細胞の分裂により徐々に喪失されることなく複製することができるベクターを指し、該ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。
発現ベクター中に存在する「発現制御配列」、「制御要素」、または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する、複製のベクター起点のそれらの非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル(Shine Dalgarno配列またはKozak配列)イントロン、転写後調節要素、ポリアデニル化配列、5´および3´非翻訳領域である。かかる要素は、それらの強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写および翻訳要素を使用され得る。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されないベクターを含む。ベクターは、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどの1つ以上の外因性、内因性、または異種制御配列を含み得る。「内因性制御配列」は、ゲノムにおいて所与の遺伝子と自然に連結するものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー/プロモーターによって指向されるように、遺伝子操作の手段(すなわち、分子生物学的技法)によって遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種からの外因性配列である。「合成」制御配列は、もう1つの内因性および/もしくは外因性配列、ならびに/またはインビトロもしくはシリコン内で特定の療法のための最適なプロモーターおよび/もしくはエンハンサー活性を提供することが決定された配列の要素を含み得る。
本明細書で使用されるとき、「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)の認識部位を指す。RNAポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを惹起および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動されるプロモーターは、転写が惹起される部位からおよそ25~30塩基上流に位置するATが豊富な領域を含み、および/または転写の開始から70~80塩基上流に見出される別の配列は、CNCAAT領域であり、式中、Nは、任意のヌクレオチドであり得る。
「エンハンサー」という用語は、強化された転写を提供することができる配列を含有し、いくつかの場合において、別の制御配列に対するその方向とは独立して機能し得るDNAのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび/または他のエンハンサー要素と協同的または相加的に機能し得る。「プロモーター/エンハンサー」という用語は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するDNAのセグメントを指す。
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成要素が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列(プロモーター、および/またはエンハンサーなど)と第2のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、ここで、発現制御配列によって、第2の配列に対応する核酸の転写が指向される。
本明細書で使用されるとき、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、幅広い多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター/エンハンサーであり得るか、または制限された多様な細胞および組織型それぞれにおける発現を可能にする、「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター/エンハンサーであり得る。
特定の実施形態において使用するのに好適な例示的な遍在発現制御配列には、サイトメガロウイルス(CMV)最早期プロモーター、ウイルスシリアンウイルス40(SV40)(例えば、早期または後期)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)LTRプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTR、単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーター、ワクシニアウイルスからのH5、P7.5、およびP11プロモーター、短伸長因子1-アルファ(EF1a-短)プロモーター、長伸長因子1-アルファ(EF1a-長)プロモーター、早期成長応答1(EGR1)、フェリチンH(FerH)、フェリチンL(FerL)、グリセルアルデヒド3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)、真核生物翻訳惹起因子4A1(EIF4A1)、熱ショック70kDaタンパク質5(HSPA5)、熱ショックタンパク質90kDaベータ、メンバー1(HSP90B1)、熱ショックタンパク質70kDa(HSP70)、β-キネシン(β-KIN)、ヒトROSA 26遺伝子座(Irions et al.,Nature Biotechnology 25,1477-1482(2007))、ユビキチンCプロモーター(UBC)、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーター、β-アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失した、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーター(Challita et al.,J Virol.69(2):748-55(1995))が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、細胞系列特異的、または組織特異的な発現を達成するために(例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、もしくは組織のサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階に発現させるために)細胞、細胞型、細胞系列、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。
本明細書で使用されるとき、「条件発現」は、誘導性発現、抑圧可能な発現、特定の生理学的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などが含まれるが、これらに限定されない任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増大もしくは減少を引き起こす処理もしくは条件に供することによって発現が制御される、目的となるポリヌクレオチドの条件発現を提供する。
誘導性プロモーター/系の例示的な例には、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど(対応するホルモンで処理することによって誘導される)、メタロチオネイン(metallothionine)プロモーター(種々の重金属で処理することによって誘導される)、MX-1プロモーター(インターフェロンによって誘導される)、「遺伝子スイッチ」ミフェプリストン調節可能系(Sirin et al.,2003,Gene,323:67)、クメート(cumate)誘導性遺伝子スイッチ(WO2002/088346)、テトラサイクリン依存性調節系などが含まれるが、これらに限定されない。
条件発現はまた、部位特異的DNAリコンビナーゼを使用することによっても達成され得る。ある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも1つの(典型的には、2つの)部位(複数可)を含む。本明細書で使用されるとき、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であり得る、1つ以上の組換え部位(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個以上)を伴う組換え反応に関与する切除的または一体化的なタンパク質、酵素、補因子もしくは関連するタンパク質(Landy,Current Opinion in Biotechnology3:699-707(1993)を参照されたい)、またはそれらの変異体、誘導体(例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質)、断片、およびバリアントを含む。特定の実施形態において使用するのに好適なリコンビナーゼの例示的な例には、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3リゾルバーゼ、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1、およびParAが含まれるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドは、幅広い多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための1つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼの標的部位が、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの一体化のために必要とされる任意の部位(複数可)に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Creリコンビナーゼのための1つの組換え部位は、8塩基対コア配列と隣接した2つの13塩基対の逆方向繰り返し(リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす)を含む34塩基対の配列であるloxPである(Sauer,B.,Current Opinion in Biotechnology5:521~527(1994)の図1を参照されたい)。他の代表的なloxP部位には、lox511(Hoess et al.,1996;Bethke and Sauer,1997)、lox5171(Lee and Saito,1998)、lox2272(Lee and Saito,1998)、m2(Langer et al.,2002)、lox71(Albert et al.,1995)、およびlox66(Albert et al.,1995)が含まれるが、これらに限定されない。
FLPリコンビナーゼのために好適な認識部位には、FRT(McLeod,et al.,1996)、F1、F2、F3(Schlake and Bode,1994)、F4、F5(Schlake and Bode,1994)、FRT(LE)(Senecoff et al.,1988)、FRT(RE)(Senecoff et al.,1988)が含まれるが、これらに限定されない。
認識配列の他の例は、attB、attP、attL、およびattR配列であり、これらは、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、phi-c31によって認識される。φC31SSRは、ヘテロタイプの部位attB(長さ34bp)とattP(長さ39bp)との間のみの組換えを媒介する(Groth et al.,2000)。attBおよびattPは、それぞれ、細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの結合部位に対して名づけられ、両方とも、φC31ホモ二量体が結合する可能性がある不完全な逆方向繰り返しを含有する(Groth et al.,2000)。産物の部位であるattLおよびattRは、さらなるφC31媒介性組換えに対して有効に不活性であり(Belteki et al.,2003)、それによって反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのattP部位へのattBを有するDNAの挿入が、ゲノムのattB部位へのattP部位の挿入よりも容易であることが見出されている(Thyagarajan et al.,2001;Belteki et al.,2003)。したがって、典型的な戦略では、相同組換えによってattPを有する「ドッキング部位」を定義された遺伝子座に位置付け、次いで、それを挿入のために、attBを有する入ってくる配列とパートナーにする。
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位に隣接したドナー修復テンプレートポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復テンプレートポリヌクレオチドは、LoxP部位、FRT部位、またはatt部位に隣接する。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の目的となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断型ポリペプチドをコードする1つ以上のIRES配列またはポリヌクレオチド配列によって分離され得る。
本明細書で使用されるとき、「内部リボソーム侵入部位」または「IRES」は、ATGなどの惹起コドンへのシストロン(タンパク質をコードする領域)の直接内部リボソーム侵入を促進し、それによって、キャップに依存しない遺伝子の翻訳をもたらす要素を指す。例えば、Jackson et al.,1990.Trends Biochem
Sci 15(12):477-83)およびJackson and Kaminski.1995.RNA1(10):985-1000を参照されたい。概して当業者によって用いられるIRESの例は、米国特許第6,692,736号に記載されるものを含む。当該技術分野において既知の「IRES」のさらなる例には、ピコルナウイルスから得られるIRES(Jackson et al.,1990)およびウイルスまたは細胞mRNA源から得られるIRES、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)、血管内皮成長因子(VEGF)(Huez et al.1998.Mol.Cell.Biol.18(11):6178-6190)、線維芽細胞成長因子2(FGF-2)、およびインスリン様成長因子(IGFII)、翻訳惹起因子eIF4Gおよび酵母転写因子TFIIDおよびHAP4、Novagenから市販されている脳心筋炎(encephelomycarditis)ウイルス(EMCV)(Duke et al.,1992.J.Virol 66(3):1602-9)、ならびにVEGF IRES(Huez et al.,1998.Mol Cell Biol18(11):6178-90)が含まれるが、これらに限定されない。IRESはまた、Picornaviridae、Dicistroviridae、およびFlaviviridae種のウイルスゲノム、ならびにHCV、フレンドマウス白血病ウイルス(FrMLV)およびモロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)において報告されている。
Sci 15(12):477-83)およびJackson and Kaminski.1995.RNA1(10):985-1000を参照されたい。概して当業者によって用いられるIRESの例は、米国特許第6,692,736号に記載されるものを含む。当該技術分野において既知の「IRES」のさらなる例には、ピコルナウイルスから得られるIRES(Jackson et al.,1990)およびウイルスまたは細胞mRNA源から得られるIRES、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)、血管内皮成長因子(VEGF)(Huez et al.1998.Mol.Cell.Biol.18(11):6178-6190)、線維芽細胞成長因子2(FGF-2)、およびインスリン様成長因子(IGFII)、翻訳惹起因子eIF4Gおよび酵母転写因子TFIIDおよびHAP4、Novagenから市販されている脳心筋炎(encephelomycarditis)ウイルス(EMCV)(Duke et al.,1992.J.Virol 66(3):1602-9)、ならびにVEGF IRES(Huez et al.,1998.Mol Cell Biol18(11):6178-90)が含まれるが、これらに限定されない。IRESはまた、Picornaviridae、Dicistroviridae、およびFlaviviridae種のウイルスゲノム、ならびにHCV、フレンドマウス白血病ウイルス(FrMLV)およびモロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)において報告されている。
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドで使用されるIRESは、EMCV IRESである。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスKozak配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「Kozak配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットに対するmRNAの初期結合を大幅に促進し、翻訳を増加させる、短ヌクレオチド配列を指す。コンセンサスKozak配列は、(GCC)RCCATGG(配列番号:59)であり、式中、Rは、プリン(AまたはG)である(Kozak,1986.Cell.44(2):283-92,and Kozak,1987.Nucleic Acids Res.15(20):8125-48)。
異種核酸転写物の効率的な終止およびポリアデニル化を指向する要素は、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、概して、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列3’を含む。本明細書で使用されるとき、「ポリA部位」または「ポリA配列」という用語は、RNAポリメラーゼIIによって発生期のRNA転写物の終止およびポリアデニル化の両方を指向するDNA配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリA尾部からコード配列の3´終端の付加によってmRNAの安定性を促進し、したがって、翻訳効率の増加に寄与し得る。切断およびポリアデニル化は、RNAにおいてポリ(A)配列によって指向される。哺乳動物pre-mRNAのコアポリ(A)配列は、切断-ポリアデニル化部位に隣接する2つの認識要素を有する。典型的には、ほとんどのインバリアントなAAUAAA六量体は、UまたはGU残基が豊富なより可変性である要素の20~50ヌクレオチド上流にある。発生期の転写物の切断は、これらの2つの要素間で起こり、5´切断産物への最大250アデノシンの付加に連結する。特定の実施形態において、コアポリ(A)配列は、理想的なポリA配列(例えば、AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)である。特定の実施形態において、ポリ(A)配列は、SV40ポリA配列、ウシ成長ホルモンポリA配列(BGHpA)、ウサギβ-グロビンポリA配列(rβgpA)、または当該技術分野において既知の別の好適な異種もしくは内因性ポリA配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む細胞は、直接毒性および/または制御されていない増殖の危険性を低減させるために、誘導性自殺遺伝子を含む、自殺遺伝子を利用する。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を含む宿主に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ-9またはカスパーゼ-8またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ-9は、二量化の特定の化学誘導物質(CID)を使用して活性化され得る。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、インビボで負の選択の影響を受けやすい本明細書で企図される遺伝子修飾細胞を引き起こす遺伝子セグメントを含む。「負の選択」は、個体のインビボでの状態の変化の結果として排除され得る注入された細胞を指す。負の選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から生じ得る。負の選択遺伝子は当該技術分野において知られており、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-I TK)遺伝子;細胞ヒポキサンチンホスフリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(APRT)遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、遺伝子修飾細胞は、インビトロで負の選択可能表現型の細胞の選択を可能にする正のマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。正の選択可能マーカーは、宿主細胞内に導入されたとき、その遺伝子を運搬する細胞の正の選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この型の遺伝子は当技術分野において知られており、ハイグロマイシンBに対する耐性を付与する、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子(hph)、抗生物質G418に対する耐性をコードするTn5からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neoまたはaph)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子(ADA)、および多剤耐性(MDR)遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、正の選択可能マーカーおよび負の選択可能要素は、負の選択可能要素の喪失がまた必ず、正の選択可能マーカーの喪失を伴うように連結される。特定の実施形態において、正のおよび負の選択可能マーカーは、一方の喪失が、義務的に、他方の喪失をもたらすように融合される。発現産物として、上述の所望の正の選択特徴および負の選択特徴の両方を付与するポリペプチドをもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子(HyTK)である。この遺伝子の発現は、インビトロでの正の選択のためのハイグロマイシンB耐性、およびインビボでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドもたらす。優性正の選択可能マーカーを負の選択可能マーカーと融合することに由来する二機能性選択可能融合遺伝子の使用に関して記載する、S.D.LuptonによるPCT US91/08442およびPCT/US94/05601の刊行物も参照されたい。
好ましい正の選択可能マーカーは、hph、nco、およびgptからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい負の選択可能マーカーは、シトシンデアミナーゼ、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT、およびgptからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態において企図される代表的な二機能性選択可能融合遺伝子には、正の選択可能マーカーが、hphまたはneoに由来し、負の選択可能マーカーが、シトシンデアミナーゼ、またはTK遺伝子もしくは選択可能マーカーに由来する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼバリアント、megaTAL、エンドプロセシング酵素、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルス方法およびウイルス方法の両方によって、造血細胞、例えば、T細胞内に導入され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする1つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはドナー修復テンプレートの送達は、同じ方法によってもしくは異なる方法によって、および/または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すように本明細書で使用される。移入された核酸は、概して、ベクター核酸分子に連結され、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞中に自律複製を指向する配列を含み得るか、または宿主細胞DNAへの一体化を可能にするのに十分な配列を含み得る。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図される1つ以上のポリヌクレオチドをT細胞に送達するために使用される。
非ウイルスベクターの例示的な例には、プラスミド(例えば、DNAプラスミドまたはRNAプラスミド)、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法には、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ウイロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオン、または脂質:核酸共役体、裸のDNA、人工ビリオン、DEAE-デキストラン媒介移入、遺伝子銃、および熱ショックが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態において使用するのに好適なポリヌクレオチド送達系の例示的な例には、Amaxa Biosystems、Maxcyte,Inc.、BTX Molecular Delivery Systems、およびCopernicus Therapeutics Incによって提供されるものが含まれるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質が文献に記載されている。例えば、Liu et al.(2003)Gene Therapy.10:180-187、およびBalazs et al.(2011)Journal of Drug Delivery.2011:1-12を参照されたい。抗体標的のバクテリア由来の非生存のナノ細胞系送達もまた、特定の実施形態において企図される。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、以下に記載されるように、個別の患者への投与によって、典型的には、全身投与(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入)または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個別の患者から外植された細胞(例えば、動員された末梢血液、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検)などの細胞にエクスビボで、または万能ドナー造血幹細胞に送達され得、続いて、患者に細胞を再移植することができる。
一実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび/またはドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、裸のDNAを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔が含まれるが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路による。かかる核酸を投与する好適な方法は、利用可能でかつ当業者に良く知られており、1つを超える経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりもより即時的かつより有効な反応を提供し得る場合が多い。
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なウイルスベクター系の例示的な例には、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする1つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはドナー修復テンプレートは、1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)で細胞を形質導入することによって、造血細胞、例えば、T細胞内に導入される。
AAVは、小さな(約26nm)複製欠損、主に、エピソーム非エンベロープで覆われたウイルスである。AAVは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えAAV(rAAV)は、典型的には、最低限、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに5´および3´AAV逆方向末端繰り返し(ITR)からなる。ITR配列は、長さが約145bpである。特定の実施形態において、rAAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10から単離される、ITRおよびカプシド配列を含む。
いくつかの実施形態において、キメラrAAVが使用され、ITR配列は、1つのAAV血清型から単離され、カプシド配列は、異なるAAV血清型から単離される。例えば、AAV2に由来するITR配列およびAAV6に由来するカプシド配列を有するrAAVは、AAV2/AAV6と称される。特定の実施形態において、rAAVベクターは、AAV2からのITR、およびAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10のいずれか1つからのカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、rAAVは、AAV2に由来するITR配列およびAAV6に由来するカプシド配列を含む。好ましい実施形態において、rAAVは、AAV2に由来するITR配列およびAAV2に由来するカプシド配列を含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作方法および選択方法を、AAVカプシドに適用して、それが目的となる細胞を形質移入させる可能性を高める。
rAAVベクターの構築、産生、およびその精製は、例えば、米国特許第9,169,494号、同第9,169,492号、同第9,012,224号、同第8,889,641号、同第8,809,058号、および同第8,784,799号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする1つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはドナー修復テンプレートは、1つ以上のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えば、レンチウイルスで細胞を形質導入することによって、造血細胞内に導入される。
本明細書で使用されるとき、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムRNAを直鎖2本鎖DNAコピーに逆転写し、その後、そのゲノムDNAを宿主ゲノムに共有一体化するRNAウイルスを指す。特定の実施形態において使用するのに好適な例示的なレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MuLV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(MoMSV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ネコ白血病ウイルス(FLV)、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV))、ならびにレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群(または族)を指す。例示的なレンチウイルスには、HIV(ヒト免疫不全ウイルス、HIV1型およびHIV2型を含む)、ビスナ-マエディウイルス(VMV)ウイルス、ヤギ関節炎-脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、HIVを基にしたベクター骨格(すなわち、HIVシス作用配列要素)が好ましい。
種々の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、本明細書の他の箇所で議論されるように、1つ以上のLTR、および以下のアクセサリー要素:cPPT/FLAP、プシー(Ψ)パッケージングシグナル、搬出要素、ポリ(A)配列のうちの1つ以上または全てを含み、任意に、WPREまたはHPRE、絶縁体要素、選択可能なマーカー、および細胞自殺遺伝子を含み得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、一体化または非一体化または一体化欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用されるとき、「一体化欠損レンチウイルス」または「IDLV」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに一体化する能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。一体化-インコンピテントウイルスベクターは、特許出願第WO2006/010834号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インテグラーゼ活性を低減させるために好適なHIV-1 pol遺伝子における例示的な変異には、H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A、およびK264Hが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、HIV-1インテグラーゼ欠損pol遺伝子は、D64V、D116I、D116A、E152G、もしくはE152A変異;D64V、D116I、およびE152G変異;またはD64V、D116A、およびE152A変異を含む。
一実施形態において、HIV-1インテグラーゼ欠損pol遺伝子は、D64V変異を含む。
「長い末端繰り返し(LTR)」という用語は、レトロウイルスDNAの終端に位置する塩基対のドメインを指し、それらの天然の配列の状況では、直接繰り返しであり、U3、R、およびU5領域を含有する。
本明細書で使用されるとき、「FLAP要素」または「cPPT/FLAP」という用語は、配列が、レトロウイルス、例えば、HIV-1またはHIV-2の中央ポリプリン区域および中央終止配列(cPPTおよびCTS)を含む核酸を指す。好適なFLAP要素は、米国特許第6,682,907号およびZennou,et al.,2000,Cell,101:173に記載されている。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、cPPTおよび/またはCTS要素内で1つ以上の変異を有するFLAP要素を含有する。さらに別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、cPPTまたはCTS要素のいずれかを含む。さらに別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、cPPTまたはCTS要素を含まない。
本明細書で使用されるとき、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子へのウイルスRNAの挿入に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置するプシー[Ψ]配列を指し、例えば、Clever et al.,1995.J.of Virology,Vol.69,No.4;pp.2101-2109を参照されたい。
「搬出要素」という用語は、核から細胞の細胞質へのRNA転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節要素を指す。RNA搬出要素の例には、ヒト免疫不全ウィルスウイルス(HIV)rev応答要素(RRE)(例えば、Cullen et al.,1991.J.Virol.65:1053、およびCullen et al.,1991.Cell 58:423を参照されたい)、およびB型肝炎ウイルス転写後調節要素(HPRE)が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、および任意に、転写終止シグナルをベクターに組み込むことによって増加される。多様な転写後調節要素は、タンパク質での異種核酸の発現、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE;Zufferey et al.,1999,J.Virol.,73:2886)、B型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素(HPRE)(Huang et al.,Mol.Cell.Biol.,5:3864)、および同様のもの(Liu et al.,1995,Genes Dev.,9:1766)を増加し得る。
レンチウイルスベクターは、好ましくは、LTRの修飾の結果としていくつかの安全性の強化を含有する。「自己不活性化」(SIN)ベクターは、例えば、1回目のウイルス複製を上回ってウイルスが転写されることを防ぐために、U3領域として既知の右側の(3´)LTRエンハンサー-プロモーター領域が修飾された(例えば、欠失または置換によって)複製欠損性ベクターを指す。追加の安全性の強化は、ウイルス粒子の産生時にウイルスゲノムの転写を駆り立てるために、5´LTRのU3領域を異種プロモーターで置き換えることによって提供される。使用され得る異種プロモーターの例には、例えば、ウイルスサルウイルス40(SV40)(例えば、早期または後期)、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、最早期)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、および単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーターが含まれ得る。
本明細書で使用されるとき、「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、HIVは、水疱性口内炎ウイルスG-タンパク質(VSV-G)エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングされ得、これにより、HIVがより広い範囲の細胞に感染することが可能になるが、これは、HIVエンベロープタンパク質(env遺伝子によってコードされる)が、通常、ウイルスの標的をCD4+提示細胞とするためである。
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って産生される。例えば、Kutner et al.,BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10、Kutner et al.Nat.Protoc.2009;4(4):495-505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
本明細書で企図されるあるある特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全てが、レンチウイルス、例えば、HIV-1に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび/もしくはレンチウイルス配列の多くの異なる源を使用することができるか、またはある特定のレンチウイルス配列の組み合わせられた多数の置換および改変が、移入ベクターの本明細書に記載される機能を行う能力を損なうことなく適応され得ることが理解されるべきである。さらに、多様なレンチウイルスベクターが当該技術分野で知られており、Naldini et al.,(1996a、1996b、および1998)、Zufferey et al.,(1997)、Dull et al.,1998、米国特許第6,013,516号、および同第5,994,136号を参照されたく、これらの多くは、本明細書で企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを産生するために適合され得る。
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする1つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはドナー修復テンプレートは、1つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで細胞を形質導入することによって、造血細胞内に導入される。
アデノウイルスを基にしたベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に産生され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターが、導入遺伝子がAd E1a、E1b、および/またはE3遺伝子を置き換えるように遺伝子操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞において増殖される。Adベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入し得る。従来のAdベクターは、高い運搬能力を有する。
複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換されて、E1タンパク質を構造的に発現する293と呼ばれる固有のヘルパー細胞株を利用し得る(Graham et al.,1977)。E3領域は、アデノウイルスゲノムには不必要であるため(Jones&Shenk,1978)、現行のアデノウイルスベクターは、293細胞を利用して、E1、D3、または両方のいずれかの領域に外来DNAを運搬する(Graham&Prevec,1991)。アデノウイルスベクターは、真核性遺伝子発現(Levrero et al.,1991、Gomez-Foix et al.,1992)およびワクチン開発(Grunhaus&Horwitz,1992、Graham&Prevec,1992)において使用されている。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与した研究には、気管点滴(Rosenfeld et al.,1991、Rosenfeld et
al.,1992)、筋肉注射(Ragot et al.,1993)、末梢静脈内注入(Herz&Gerard,1993)、および脳内への定位接種(Le Gal La Salle et al.,1993)が含まれる。臨床試験におけるAdベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を伴った(Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。
al.,1992)、筋肉注射(Ragot et al.,1993)、末梢静脈内注入(Herz&Gerard,1993)、および脳内への定位接種(Le Gal La Salle et al.,1993)が含まれる。臨床試験におけるAdベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を伴った(Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする1つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはドナー修復テンプレートは、1つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス、例えば、HSV-1、HSV-2で細胞を形質導入することによって、造血細胞内に導入される。
成熟HSVビリオンは、152kbである直鎖2本鎖DNA分子からなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、HSVを基にしたウイルスベクターは、1つ以上の必須または非必須HSV遺伝子において欠損している。一実施形態において、HSVを基にしたウイルスベクターは、複製欠損である。ほとんどの複製欠損HSVベクターは、複製を防ぐために1つ以上の最早期、早期、または後期HSV遺伝子を除去するための欠失を含有する。例えば、HSVベクターは、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最早期遺伝子において欠損であり得る。HSVベクターの利点は、長期間のDNA発現をもたらし得る潜伏期に入る能力、および最大25kbの外因性DNAを収容し得るその大きなウイルスDNAゲノムである。HSVを基にしたベクターは、例えば、米国特許第5,837,532号、同第5,846,782号、および同第5,804,413号、ならびに国際特許出願第WO91/02788号、同第WO96/04394号、同第WO98/15637号、および同第WO99/06583号において記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
H.ゲノム編集された細胞
特定の実施形態において企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、TGFβR2遺伝子において1つ以上の遺伝子編集を含み、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも1つの症状の予防、治療、または緩和のための改善された細胞を基にした療法を提供する。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、部分的に、療法的な細胞を免疫抑制シグナルおよび疲弊に対してより耐性を有するようにすることによって、養子細胞療法の有効性を増加させると考えられる。
特定の実施形態において企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、TGFβR2遺伝子において1つ以上の遺伝子編集を含み、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも1つの症状の予防、治療、または緩和のための改善された細胞を基にした療法を提供する。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、部分的に、療法的な細胞を免疫抑制シグナルおよび疲弊に対してより耐性を有するようにすることによって、養子細胞療法の有効性を増加させると考えられる。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたT細胞は、自己移植/自源(「自己(self)」)または非自己移植(「非自己」、例えば、同種、同系、または異種)であり得る。本明細書で使用されるとき、「自己移植」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「同種」は、相対的に遺伝的に細胞とは異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「同系」は、相対的に遺伝的に細胞と同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「異種」は、相対的に細胞に対して異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類対象、任意に、非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞は、ヒト対象から得られる。
「単離された細胞」は、インビボ組織または臓器から得られたもので、細胞外マトリックスを実質的に含まない、自然発生しない細胞、例えば、自然には存在しない細胞、修飾細胞、遺伝子操作された細胞などを指す。
本明細書で使用されるとき、「細胞の集団」という用語は、本明細書の他の箇所に記載される同種または異種細胞型の任意の数および/または組み合わせから構成され得る複数の細胞を指す。例えば、T細胞の形質導入のために、細胞の集団は、末梢血液から単離され得るか、または得ることができる。細胞の集団は、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%の編集される標的細胞型を含み得る。ある特定の実施形態において、T細胞は、当該技術分野において既知の方法を使用して、異種細胞の集団から単離または精製され得る。
ゲノムが本明細書で企図される組成物および方法を使用して編集され得る細胞型の例示的な例には、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞、ならびにそれらの混合細胞が含まれるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物および方法は、造血細胞、より好ましくは免疫細胞、およびさらにより好ましくはT細胞を編集するために使用される。
「T細胞」または「Tリンパ球」という用語は、当該技術分野で認識されており、胸腺細胞、免疫エフェクター細胞、調節T細胞、ナイーブTリンパ球、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止Tリンパ球、または活性化Tリンパ球を含むことを意図する。T細胞は、Tヘルパー(Th)細胞、例えば、Tヘルパー1(Th1)またはTヘルパー2(Th2)細胞であり得る。T細胞は、ヘルパーT細胞(HTL、CD4+T細胞)CD4+T細胞、細胞傷害性T細胞(CTL、CD8+T細胞)、腫瘍浸潤細胞傷害性T細胞(TIL、CD8+T細胞)、CD4+CD8+T細胞、CD4-CD8-T細胞、またはT細胞の任意の他のサブセットであり得る。一実施形態において、T細胞は、免疫エフェクター細胞である。一実施形態において、T細胞は、NKT細胞である。特定の実施形態において使用するのに好適なT細胞の他の例示的な集団には、ナイーブT細胞およびメモリーT細胞が含まれる。
種々の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、本明細書で企図される組成物および方法によって編集されたTGFβR2遺伝子を含む免疫エフェクター細胞を含む。「免疫エフェクター細胞」は、1つ以上のエフェクター機能(例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ADCCおよび/またはCDCの誘導)を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態において企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Tリンパ球、特に、細胞傷害性T細胞(CTL、CD8+T細胞)、TIL、およびヘルパーT細胞(HTL、CD4+T細胞)である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーT(NKT)細胞を含む。
「強力なT細胞」および「幼若T細胞」は、特定の実施形態において互換的に使用され、T細胞が増殖と同時に分化の減少が可能であるT細胞表現型を指す。特定の実施形態において、幼若T細胞は、「ナイーブT細胞」の表現型を有する。特定の実施形態において、幼若T細胞は、以下の生物学的マーカー:CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197、およびCD38のうちの1つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若T細胞は、以下の生物学的マーカー:CD62L、CD127、CD197、およびCD38のうちの1つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若T細胞は、CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、PD-1、およびLAG3の発現を欠いている。
T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むがこれらに限定されない多くの源から得ることができる。
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはT細胞を含む細胞の集団は、編集されたTGFβR2遺伝子を含み、ここで、編集は、NHEJによって修復されたDSBである。特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはT細胞は、編集されたTGFβR2遺伝子を含み、ここで、編集は、NHEJによって修復されたDSBである。特定の実施形態において、編集は、TGFβR2遺伝子のコード配列における、好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6において、より好ましくはTGFβR2遺伝子のエクソン6における配列番号:11(または、配列番号:13)での約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上のヌクレオチドの挿入または欠失(INDEL)である。
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはT細胞を含む細胞の集団は、HDRによって修復されたDSBで組み込まれたドナー修復テンプレートを含む編集されたTGFβR2遺伝子を含む。
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはT細胞を含む細胞の集団は、TGFβR2遺伝子またはその部分を含むドナー修復テンプレートを含む編集されたTGFβR2遺伝子を含み、ゲノムTGFβR2配列において1つ以上の変異を導入して、TGFβR2発現またはシグナル伝達を修飾し、好ましくはTGFβR2発現および/またはシグナル伝達を減少させるかまたは排除するように設計される。
種々の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、TGFβR2遺伝子における編集を含み、TGFβR2フリップ受容体、二重特異性T細胞エンゲイジャー(BiTE)分子をコードするポリヌクレオチド;サイトカイン(例えば、IL-2、インスリン、IFN-γ、IL-7、IL-21、IL-10、IL-12、IL-15、およびTNF-α)、ケモカイン(例えば、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3、およびRANTES)、細胞毒素(例えば、パーフォリン、グランザイムA、およびグランザイムB)、サイトカイン受容体(例えば、IL-2受容体、IL-7受容体、IL-12受容体、IL-15受容体、およびIL-21受容体)、または遺伝子操作された抗原受容体(例えば、遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、Daric受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体)をさらに含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドおよびヌクレアーゼバリアントを含むドナー修復テンプレートは、細胞内に導入され、ポリヌクレオチドは、HDR修復によってTGFβR2遺伝子におけるDSB部位で細胞のゲノム内に組み込まれる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、ポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を形質導入することによって、TGFβR2遺伝子以外の部位でも細胞内に導入され得る。
I.組成物および製剤
特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書で企図されるような、1つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクタ-、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞組成物を含み得る。特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団においてヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子内の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物は、造血細胞、例えば、T細胞または免疫エフェクター細胞内のTGFβR2遺伝子を編集するために使用される。
特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書で企図されるような、1つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクタ-、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞組成物を含み得る。特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団においてヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子内の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物は、造血細胞、例えば、T細胞または免疫エフェクター細胞内のTGFβR2遺伝子を編集するために使用される。
種々の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意に、エンドプロセシング酵素、例えば、3´-5´エクソヌクレアーゼ(Trex2)を含む。ヌクレアーゼバリアントは、開示されるポリヌクレオチド送達方法(上記参照)、例えば、電気穿孔、脂質ナノ粒子などを介して細胞内に導入されるmRNAの形態であり得る。一実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTAL、および任意に、3´-5´エクソヌクレアーゼをコードするmRNAを含む組成物は、開示されるポリヌクレオチド送達方法(上記参照)を介して細胞において導入される。本組成物は、エラープローンNHEJによってゲノム編集された細胞またはゲノム編集された細胞の集団を生成するために使用され得る。
種々の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ドナー修復テンプレートを含む。本組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意に、エンドプロセシング酵素を発現させるかまたは発現させるであろう細胞に送達され得る。一実施形態において、本組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTAL、および任意に、3´-5´エクソヌクレアーゼを発現させるかまたは発現させるであろう細胞に送達され得る。ドナー修復テンプレートの存在下での遺伝子編集酵素の発現は、HDRによってゲノム編集された細胞またはゲノム編集された細胞の集団を生成するために使用され得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、エンドプロセシング酵素、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。ヌクレアーゼバリアントおよび/またはエンドプロセシング酵素は、開示されるポリヌクレオチド送達方法(上記参照)を介して細胞内に導入されるmRNAの形態であり得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTAL、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはmegaTAL、3´-5´エクソヌクレアーゼ、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、megaTAL、および/または3´-5´エクソヌクレアーゼは、開示されるポリヌクレオチド送達方法(上記参照)を介して細胞内に導入されるmRNAの形態であり得る。
特定の実施形態において、細胞の集団は、遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞を含む。
組成物には、薬学的組成物が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的組成物」は、単独でまたは療法の1つ以上の他のモダリティと組み合わせて、細胞または動物への投与のために、薬学的に許容可能なまたは生理学的に許容可能な溶液中に製剤化される組成物を指す。所望される場合、本組成物が、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤と組み合わせて投与され得ることも理解されよう。本組成物に含めてよい他の構成成分に対する限定は実質的に存在しないが、但し、追加の薬剤が、本組成物に悪影響を及ぼさないことを条件とする。
「薬学的に許容可能な」という語句は、適切な医学的判断の範囲内において、妥当な利益/危険性比に釣り合った、過度の毒性、炎症、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症などを伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適である化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すように本明細書で用いられる。
「薬学的に許容可能な担体」は、療法細胞と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体の例示的な例は、細胞培養培地、水、ならびに石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む油などの滅菌液体であり得る。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注入可能溶液用の液体担体として用いられ得る。特定の実施形態において好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。任意の従来の培地または薬剤が活性な成分と適合しないということを除いて、療法的組成物においてその使用が企図される。補足的活性成分も、本組成物中に組み込まれ得る。
一実施形態において、薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、対象への投与に好適である。特定の実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内(静脈内または動脈内)、腹腔内、または筋肉内投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、脳室内、脊髄内、または髄腔内投与に好適である。薬学的に許容可能な担体には、減菌水溶液、細胞培養培地、または分散液が含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる培地および薬剤の使用は、当該技術分野において良く知られている。任意の従来の培地または薬剤が形質導入された細胞と適合しないということを除いて、薬学的組成物においてその使用が企図される。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、遺伝子修飾されたT細胞および薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で企図される細胞を基にした組成物を含む組成物は、所望の治療ゴールを有効にするために、腸内もしくは非経口投与方法によって別個に、または他の好適な化合物と組み合わせて投与され得る。
薬学的に許容可能な担体は、治療されるヒト対象への投与にそれを好適にするために、十分に高純度のものおよび十分に低毒のものであるべきである。それはさらに、本組成物の安定性を維持または増加させるべきである。薬学的に許容可能な担体は、液体または固形であり得、本組成物の他の構成要素と組み合わされたときに所望の嵩、粘度などを提供するために、念頭に計画された投与の様式を以って選択される。例えば、薬学的に許容可能な担体は、結合薬剤(例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、充填剤(例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど)、崩壊剤(例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど)、または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)であり得るが、これらに限定されない。本明細書で企図される組成物のための他の好適な薬学的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘着性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
かかる担体溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。本明細書で使用されるとき、「緩衝剤」という用語は、化学的構成物質がpHの著しい変化を伴うことなく、酸または塩基を中和する溶液または液体を指す。本明細書で企図される緩衝剤の例には、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、リンガー溶液、水中の5%デキストロース(D5W)、通常の生理食塩水(0.9%NaCl)が含まれるが、これらに限定されない。
薬学的に許容可能な担体は、約7の組成物のpHを維持するのに十分な量で存在し得る。あるいは、本組成物は、約6.8~約7.4、例えば、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、および7.4の範囲のpHを有する。さらに別の実施形態において、本組成物は、約7.4のpHを有する。
本明細書で企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容可能な培地を含み得る。本組成物は、懸濁液であり得る。本明細書で使用されるとき、「懸濁」という用語は、細胞が固形支持体に結合しない非粘着性状態を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、攪拌または扇動され得、培養皿などの支持体に粘着しない。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、懸濁液中で製剤化され、ここで、ゲノム編集されたT細胞が静脈注射用(IV)袋などの中で、許容可能な液体培地または溶液、例えば、生理食塩水または血清不含培地中に分散される。許容可能な希釈剤には、水、PlasmaLyte、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム(生理食塩水)溶液、血清不含細胞培養培地、および極低温保存に好適な培地、例えば、Cryostor(登録商標)培地が含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集されたT細胞の集団を含む組成物を保存するのに好適である。療法的組成物は、ヒト患者に投与されることが意図され、したがって、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、および胎児ウシ血清などの細胞培養構成要素を実質的に含まない。
いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な細胞培養培地中で製剤化される。かかる組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容可能な細胞培養培地は、血清不含培地である。
血清不含培地は、単純化組成物およびより良好な規定組成物、低度の汚染物質、感染剤の潜在源の排除、およびより低費用を含む、血清含有培地を上回るいくらかの利点を有する。種々の実施形態において、血清不含培地は、動物質を含まず、任意に、タンパク質を含み得ない。任意に、培地は、生物薬学的に許容可能な組換えタンパク質を含有し得る。「動物質を含まない」培地は、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質に置き換わり、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。
特定の組成物において使用される血清不含培地の例示的な例には、QBSF-60(Quality Biological,Inc.)、StemPro-34(Life Technologies)、およびX-VIVO10が含まれるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、ゲノム編集されたT細胞を含む組成物は、PlasmaLyte中で製剤化される。
種々の実施形態において、ゲノム編集されたT細胞を含む組成物は、凍結保存培地中で製剤化される。例えば、凍結保存薬剤を有する凍結保存培地は、解凍後に高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示的な例には、CryoStor CS10、CryoStor CS5、およびCryoStor CS2が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本組成物は、50:50でPlasmaLyte A対CryoStor CS10を含む溶液中で製剤化される。
特定の実施形態において、本組成物は、マイコプラズマ、内毒素、および微生物汚染を実質的に含まない。内毒素に対する「実質的に含まない」は、生物製剤に関してFDAによって承認されている内毒素よりも細胞の1用量当たりの内毒素が少なく、これは、総内毒素が1日当たり5EU/体重kgであり、平均70kgの人は350EU/総用量の細胞であることを意味する。特定の実施形態において、本明細書で企図されるレトロウイルスベクターで形質導入された造血性幹細胞または前駆細胞を含む組成物は、約0.5EU/mL~約5.0EU/mL、または約0.5EU/mL、1.0EU/mL、1.5EU/mL、2.0EU/mL、2.5EU/mL、3.0EU/mL、3.5EU/mL、4.0EU/mL、4.5EU/mL、または5.0EU/mLを含有する。
ある特定の実施形態において、1つ以上の再プログラミングされたヌクレアーゼをコードする1つ以上のmRNA、および任意に、エンドプロセシング酵素を含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドの送達に好適な組成物および製剤が企図される。
エクスビボ送達のための代表的な製剤には、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショック、および種々のリポソーム製剤(すなわち、脂質媒介性トランスフェクション)などの当該技術分野において既知の種々のトランスフェクション薬剤の使用も含まれ得る。下記でより詳細に記載のリポソームは、水性流体の画分を封入する脂質二重層である。DNAは、カチオン性リポソームの外表面に(その荷電に基づいて)自発的に会合し、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用する。
特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体溶液の製剤は、例えば、腸内および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、および髄内投与および製剤を含む、多様な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するのに好適な投薬および治療レジメンの開発であるとして当業者に良く知られている。本明細書で企図される特定の実施形態が薬学的分野で良く知られており、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,volume I and volume II.22nd Edition.Edited by Loyd V.Allen Jr.Philadelphia,PA:Pharmaceutical Press;2012に記載されているものなどの他の製剤を含み得ることが当業者によって理解され得、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
J.ゲノム編集された細胞療法
本明細書で企図される組成物および方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも1つの症状の予防、治療、または緩和において使用するための改善された製剤を提供する。本明細書で使用されるとき、「製剤」という用語は、本明細書で企図される組成物および方法を使用して産生された遺伝子修飾された細胞を指す。特定の実施形態において、製剤は、遺伝子的に編集された免疫エフェクター細胞またはT細胞を含む。さらに、特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたT細胞は、T細胞疲弊に対して耐性を有し、かつ腫瘍微小環境において増加した耐久性および持続性を示し、持続的な療法をもたらし得るため、より安全かつより有効である養子細胞療法を提供する。
本明細書で企図される組成物および方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも1つの症状の予防、治療、または緩和において使用するための改善された製剤を提供する。本明細書で使用されるとき、「製剤」という用語は、本明細書で企図される組成物および方法を使用して産生された遺伝子修飾された細胞を指す。特定の実施形態において、製剤は、遺伝子的に編集された免疫エフェクター細胞またはT細胞を含む。さらに、特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたT細胞は、T細胞疲弊に対して耐性を有し、かつ腫瘍微小環境において増加した耐久性および持続性を示し、持続的な療法をもたらし得るため、より安全かつより有効である養子細胞療法を提供する。
特定の実施形態において、編集されたTGFβR2遺伝子を含む有効量のゲノム編集された免疫エフェクター細胞またはT細胞は、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも1つの症状を予防、治療、または緩和するために対象に投与される。
特定の実施形態において、TGFβR2で編集された細胞は、TGFβR2を実質的に発現しないか、またはその発現を欠いており、したがって、機能的TGFβR2発現を欠いているか、または実質的に欠いており、例えば、T細胞疲弊を増加させ、炎症促進性サイトカインの発現を阻害する能力を欠いている。特定の実施形態において、TGFβR2を欠いているゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルに対してより耐性を有しており、増加した持続性およびT細胞疲弊に対する耐性を示す。
特定の実施形態において、癌の少なくとも1つの症状を予防、治療、または緩和する方法は、編集されたTGFβR2遺伝子および遺伝子操作されたTCR、CAR、もしくはDaric、または他の療法的な導入遺伝子を含む有効量のゲノム編集された免疫エフェクター細胞またはT細胞を対象に投与して、細胞を腫瘍または癌に再指向させることを含む。遺伝子修飾された細胞は、TGFβR2遺伝子を編集することに基づいて腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルに対してより耐性を有して、TGFβR2発現を減少または排除するため、より耐久性および持続性がある製剤である。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、固形腫瘍または癌の治療において使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたT細胞は、副腎癌、副腎皮質癌腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、基底細胞癌腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳/CNS癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌腫、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌腫(DCIS)子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、頭頸部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌腫、髄芽細胞腫、髄膜腫(menangioma)、黒色腫、メルケル細胞癌腫、正中管細胞癌腫、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口腔癌(oral cancer)、口腔癌(oral cavity cancer)、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌腫、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌腫、腎盂および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、脂腺癌腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌腫、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌腫、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管の癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない、固形腫瘍または癌の治療において使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない固形腫瘍または癌の治療において使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、膵臓、膀胱、および肺が含まれるが、これらに限定されない種々の癌の治療において使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、液体癌または血液癌の治療において使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されないB細胞悪性腫瘍の治療において使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫:急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞性白血病(HCL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、および慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌性骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫が含まれるが、これらに限定されない、液体癌の治療において使用される。
本明細書で企図されるゲノム編集方法において使用するのに好ましい細胞には、自己移植/自源(「自己」)細胞、好ましくは造血細胞、より好ましくはT細胞、およびより好ましくは免疫エフェクター細胞またはTreg細胞が含まれる。
特定の実施形態において、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞またはそれを含む組成物を、単独でまたは1つ以上の療法剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態において、本細胞は、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の進展の危険性のある患者の治療において使用される。したがって、特定の実施形態は、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも1つの症状の治療または予防または緩和を含む。
一実施形態において、癌、GVHD、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全を治療する方法は、それを必要とする対象において、有効量、例えば、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を含む組成物を投与することを含む。適切な投与量が臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の病態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるであろう。
1つの例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、少なくとも2x106細胞/kg、少なくとも3x106細胞/kg、少なくとも4x106細胞/kg、少なくとも5x106細胞/kg、少なくとも6x106細胞/kg、少なくとも7x106細胞/kg、少なくとも8x106細胞/kg、少なくとも9x106細胞/kg、または少なくとも10x106細胞/kg以上の細胞/kgである。
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、約2x106細胞/kg、約3x106細胞/kg、約4x106細胞/kg、約5x106細胞/kg、約6x106細胞/kg、約7x106細胞/kg、約8x106細胞/kg、約9x106細胞/kg、または約10x106細胞/kg以上の細胞/kgである。
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、約2x106細胞/kg~約10x106細胞/kg、約3x106細胞/kg~約10x106細胞/kg、約4x106細胞/kg~約10x106細胞/kg、約5x106細胞/kg~約10x106細胞/kg、2x106細胞/kg~約6x106細胞/kg、2x106細胞/kg~約7x106細胞/kg、2x106細胞/kg~約8x106細胞/kg、3x106細胞/kg~約6x106細胞/kg、3x106細胞/kg~約7x106細胞/kg、3x106細胞/kg~約8x106細胞/kg、4x106細胞/kg~約6x106細胞/kg、4x106細胞/kg~約7x106細胞/kg、4x106細胞/kg~約8x106細胞/kg、5x106細胞/kg~約6x106細胞/kg、5x106細胞/kg~約7x106細胞/kg、5x106細胞/kg~約8x106細胞/kg、または6x106細胞/kg~約8x106細胞/kgである。
当業者は、特定の実施形態において企図される組成物の複数回投与が所望の療法に影響を及ぼすために必要とされ得ることを認識するであろう。例えば、組成物は、1週間、2週間、3週間、1カ月間、2カ月間、3カ月間、4カ月間、5カ月間、6カ月間、1年間、2年間、5年間、10年間以上の間にわたって、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回以上投与され得る。
ある特定の実施形態において、対象に活性化されたT細胞を投与し、その後、再採血し(またはアフェレーシスを行い)、その血液からT細胞を活性化し、これらの活性化し、増大させたT細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実行され得る。ある特定の実施形態において、T細胞は、10cc~400ccの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態において、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc、または400cc以上の採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、この複数の採血/複数の再注入プロトコルを使用することは、ある特定のT細胞の集団を選択するように機能し得る。
特定の実施形態において企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込み、または移植によるものを含む、任意の都合のよい様式で実行され得る。好ましい実施形態において、組成物は、非経口に投与される。本明細書で使用されるとき、「非経口投与」および「非経口に投与される」という語句は、腸内および局所投与以外の投与形式、通常は注射によるものを指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書で企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射することによって対象に投与される。
一実施形態において、癌と診断された対象を治療する方法は、対象から免疫エフェクター細胞を除去することと、該免疫エフェクター細胞のゲノムを編集することと、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を産生することと、同じ対象にゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を投与することと、を含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、T細胞を含む。
特定の実施形態において企図される細胞組成物を投与するための方法には、エクスビボでゲノム編集された免疫エフェクター細胞の再導入、または対象に導入されると、成熟免疫エフェクター細胞に分化する、免疫エフェクター細胞のゲノム編集された前駆体の再導入をもたらすのに有効である任意の方法が含まれる。1つの方法は、エクスビボにおいて末梢血T細胞をゲノム編集することと、形質導入された細胞を対象に戻すこととを含む。
本明細書で引用される刊行物、特許出願、および発行特許は全て、個別の刊行物、特許出願、または発行された特許の各々が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
前述の実施形態は、明瞭な理解のために図解および実施例により少し詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化および修正を行うことができることが当業者には容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定としては提供されない。基本的に類似した結果をもたらすために変化または修正され得る多様な重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
実施例1
ヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子を撹乱するための再プログラミングI-ONUI
DNA認識インターフェースにおいて可変アミノ酸残基を含有するモジュラーライブラリを構築することによって、I-OnuIを、TGFβR2遺伝子のエクソン6を標的とするように再プログラミングした(図1)。バリアントを構築するために、オリゴヌクレオチドを使用して縮重コドンをI-OnuI DNA結合ドメイン内に組み込んだ。縮重コドンをコードするオリゴヌクレオチドをPCRテンプレートとして使用して、酵母菌株S.cerevisiaeにおけるギャップ組換えによってバリアントライブラリを生成した。各バリアントライブラリは、N-またはC末端I-OnuI DNA認識ドメインのいずれかにおよび、約107~108の固有の形質転換体を含有した。図2に示すように、得られた表面ディスプレイライブラリを、対応するドメインの「ハーフ部位」(配列番号:14~18)を含む標的部位に対する切断活性に関してフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
ヒト形質転換成長因子ベータ受容体2(TGFβR2)遺伝子を撹乱するための再プログラミングI-ONUI
DNA認識インターフェースにおいて可変アミノ酸残基を含有するモジュラーライブラリを構築することによって、I-OnuIを、TGFβR2遺伝子のエクソン6を標的とするように再プログラミングした(図1)。バリアントを構築するために、オリゴヌクレオチドを使用して縮重コドンをI-OnuI DNA結合ドメイン内に組み込んだ。縮重コドンをコードするオリゴヌクレオチドをPCRテンプレートとして使用して、酵母菌株S.cerevisiaeにおけるギャップ組換えによってバリアントライブラリを生成した。各バリアントライブラリは、N-またはC末端I-OnuI DNA認識ドメインのいずれかにおよび、約107~108の固有の形質転換体を含有した。図2に示すように、得られた表面ディスプレイライブラリを、対応するドメインの「ハーフ部位」(配列番号:14~18)を含む標的部位に対する切断活性に関してフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
N-およびC末端ドメインで再プログラミングされたI-OnuI HEを示す酵母を精製し、プラスミドDNAを抽出した。PCR反応を行って、再プログラミングされたドメインを増幅し、これは、後に、S.cerevisiaeに融合および形質転換されて、再プログラミングされたドメインの組み合わせのライブラリを作成した。TGFβR2遺伝子のエクソン6に存在する完全な標的部位(配列番号:11)を認識する完全に再プログラミングされたI-OnuIバリアントをこのライブラリから特定し、精製した。
実施例2
TGFβR2遺伝子のエクソン6を標的とする再プログラミングされたMED I-ONUIホーミングエンドヌクレアーゼ
染色体に一体化された蛍光レポーター系を使用して、TGFβR2遺伝子のエクソン6を標的とする再プログラミングされたI-OnuI HEの活性を測定した(Certo
et.al.,2011)。TGFβR2標的配列(配列番号:11)に結合し、それを切断する完全に再プログラミングされたI-OnuI HEを、哺乳動物発現プラスミドにクローン化し、次いで、蛍光iRFPタンパク質をコードするフレーム外遺伝子の上流にTGFβR2標的配列を含有したHEK293T線維芽細胞細胞株に個別にトランスフェクトした。非相同末端結合(NHEJ)経路を介するDNA修復後のHEによって埋め込まれた標的部位および挿入欠失の蓄積の切断は、「インフレーム」の後方に蛍光レポーター遺伝子を配置する3つの修復された遺伝子座のうちのおよそ1つをもたらす。したがって、染色体に埋め込まれた標的配列におけるエンドヌクレアーゼ活性の読み出しに、iRFP蛍光性HEK293T細胞のパーセンテージを使用する。TGFβR2標的配列に結合し、それを切断する完全に再プログラミングされたI-OnuI HEは、細胞染色体コンテクスト(chromosomal context)において、中程度のiRFP発現の効率を示した。図3(上のグラフ)。
TGFβR2遺伝子のエクソン6を標的とする再プログラミングされたMED I-ONUIホーミングエンドヌクレアーゼ
染色体に一体化された蛍光レポーター系を使用して、TGFβR2遺伝子のエクソン6を標的とする再プログラミングされたI-OnuI HEの活性を測定した(Certo
et.al.,2011)。TGFβR2標的配列(配列番号:11)に結合し、それを切断する完全に再プログラミングされたI-OnuI HEを、哺乳動物発現プラスミドにクローン化し、次いで、蛍光iRFPタンパク質をコードするフレーム外遺伝子の上流にTGFβR2標的配列を含有したHEK293T線維芽細胞細胞株に個別にトランスフェクトした。非相同末端結合(NHEJ)経路を介するDNA修復後のHEによって埋め込まれた標的部位および挿入欠失の蓄積の切断は、「インフレーム」の後方に蛍光レポーター遺伝子を配置する3つの修復された遺伝子座のうちのおよそ1つをもたらす。したがって、染色体に埋め込まれた標的配列におけるエンドヌクレアーゼ活性の読み出しに、iRFP蛍光性HEK293T細胞のパーセンテージを使用する。TGFβR2標的配列に結合し、それを切断する完全に再プログラミングされたI-OnuI HEは、細胞染色体コンテクスト(chromosomal context)において、中程度のiRFP発現の効率を示した。図3(上のグラフ)。
次に、TGFβR2.B3HEバリアント(例えば、配列番号:6)上でランダム変異誘発を行うことによって、二次I-OnuIバリアントライブラリを生成した。改善された触媒効率でバリアントを単離するために、より厳密な切断条件下でディスプレイに基づく流動選別を行った。このプロセスは、染色体蛍光レポーター遺伝子アッセイにおいてiRFP発現細胞の生成率がおよそ4倍高かったI-OnuIバリアントTGFβR2.B3.F8(配列番号:7)を特定した。図3(下のグラフ)。
TGFβR2.B3.F8は、親バリアントに対して2つのアミノ酸変異を有し、そのうちの1つがDNA認識インターフェース内に位置する。TGFβR2.B3.F8は、エクソン6標的部位に対してサブナノモル親和性を有する。図4。図5は、代表的なI-OnuIバリアントの相対整列、ならびにDNA認識インターフェースを含む残基の位置情報を示す。
実施例3
TGFβR2エクソン6を標的とするMEGATALの特徴付け
メガヌクレアーゼドメインのN末端に、11塩基対TALアレイ標的部位(配列番号:12)に対応する、5-メチルシトシン寛容10.5単位TALアレイを付加することによって、TGFβR2.B3.F8megaTAL(配列番号:9)として、TGFβR2.B3.F8HEバリアントをフォーマット化した(Boissel et al.,2013に記載)。図6。megaTAL標的部位配列は、配列番号:13に記載される。リンカー配列(配列番号:10)を介するTrex2へのC末端融合としても、TGFβR2.B3.F8megaTALをフォーマット化した。
TGFβR2エクソン6を標的とするMEGATALの特徴付け
メガヌクレアーゼドメインのN末端に、11塩基対TALアレイ標的部位(配列番号:12)に対応する、5-メチルシトシン寛容10.5単位TALアレイを付加することによって、TGFβR2.B3.F8megaTAL(配列番号:9)として、TGFβR2.B3.F8HEバリアントをフォーマット化した(Boissel et al.,2013に記載)。図6。megaTAL標的部位配列は、配列番号:13に記載される。リンカー配列(配列番号:10)を介するTrex2へのC末端融合としても、TGFβR2.B3.F8megaTALをフォーマット化した。
megaTALの編集効率を、48~72時間、サイトカインで補足された培地において抗CD3および抗CD28抗体を用いて刺激前初代ヒトT細胞によって評価し、次いで、インビトロで転写し(IVT)、キャップし、かつポリアデニル化した、TGFβR2.B3.F8megaTALをコードするmRNAを用いてこの細胞を電気穿孔した。さらに、3´~5´エクソヌクレアーゼTrex2をコードするIVT-mRNAを付加して、非相同末端結合(NHEJ)経路によって破断プロセスを強化した(Certo et al.,2012を参照されたい)。電気穿孔後、細胞を7~10日間、サイトカインで補足された培地において培養し、その間、ゲノムDNA単離のために分割量を取り出し、その後、TGFβR2エクソン6標的部位にわたって、PCR増幅した。
Tracking of Indels by DEcomposition(TIDE、Brinkman et al.,2014を参照されたい)を使用して挿入欠失の頻度を測定した。Trex2の存在下でのTGFβR2.B3.F8megaTALの編集効率は、およそ65%であった。図7。標的部位で観察された優位な挿入欠失型は、-1bpであったが、-2、-3、または-4bp挿入欠失も観察された。図7。この分析により、TGFβR2.B3.F8megaTALが、megaTALで処理したヒトT細胞のかなりの部分において、TGFβR2標的部位を撹乱したことが確認された。
実施例4
TGFβR2MEGATALは、TGFβ-1で誘導されたシグナル伝達を撹乱する。
TGFβR2に結合するTGFβ-1は、SMAD2およびSMAD3のリン酸化を含む下流シグナル伝達カスケードを誘導する。初代ヒトT細胞を、実施例3に記載されるように、CD3およびCD28で活性化した。活性化された初代ヒトT細胞を、インビトロで転写した、TGFβR2.B3.F8megaTALをコードするmRNAで電気穿孔した。トランスフェクトしたT細胞をさらに7~10日間増大させ、TGFβR2標的部位にわたってTIDEを使用して編集効率を測定した。
TGFβR2MEGATALは、TGFβ-1で誘導されたシグナル伝達を撹乱する。
TGFβR2に結合するTGFβ-1は、SMAD2およびSMAD3のリン酸化を含む下流シグナル伝達カスケードを誘導する。初代ヒトT細胞を、実施例3に記載されるように、CD3およびCD28で活性化した。活性化された初代ヒトT細胞を、インビトロで転写した、TGFβR2.B3.F8megaTALをコードするmRNAで電気穿孔した。トランスフェクトしたT細胞をさらに7~10日間増大させ、TGFβR2標的部位にわたってTIDEを使用して編集効率を測定した。
10日目に、megaTALで処理したT細胞および対照ドナーT細胞の両方を組換えTGFβ-1で刺激し、フローサイトメトリーを使用して、SMAD2/3リン酸化を検査することによって、TGFβR2シグナル伝達能力を分析した。対照細胞は、rTGFβ-1刺激後にリン酸化SMAD2/3の増加を示した。対照的に、megaTALを標的とするTGFβR2で処理したT細胞は、rTGFβ-1刺激後に最小のpSMAD2/3シグナルを呈し、これは、TGFβR2遺伝子の撹乱が細胞内シグナル伝達事象を実質的に低減し、そうでない場合、この事象がTGFβR2シグナル伝達の下流で起こるであろうことを提示する。図8。
実施例5
TGFβR2MEGATALは、抗GD2CAR T細胞においてTGFβ-1で誘導されたシグナル伝達を撹乱する。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をCD3およびCD28で活性化した。活性化の24時間後、細胞を偽形質導入するか、または抗GD2CARをコードするレンチウイルスで形質導入した。活性化の72時間後、偽形質導入された細胞および抗GD2CARで形質導入された細胞を各々、3つの条件:非電気穿孔、偽電気穿孔、またはTGFβR2.B3.F8megaTALをコードするインビトロで転写したmRNAを用いた電気穿孔に分けた。T細胞をさらに7日間増大させ、TGFβR2標的部位にわたってTIDEを使用して編集効率を測定した。図9。
TGFβR2MEGATALは、抗GD2CAR T細胞においてTGFβ-1で誘導されたシグナル伝達を撹乱する。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をCD3およびCD28で活性化した。活性化の24時間後、細胞を偽形質導入するか、または抗GD2CARをコードするレンチウイルスで形質導入した。活性化の72時間後、偽形質導入された細胞および抗GD2CARで形質導入された細胞を各々、3つの条件:非電気穿孔、偽電気穿孔、またはTGFβR2.B3.F8megaTALをコードするインビトロで転写したmRNAを用いた電気穿孔に分けた。T細胞をさらに7日間増大させ、TGFβR2標的部位にわたってTIDEを使用して編集効率を測定した。図9。
ヒトPBMCをCD3およびCD28で活性化した。活性化の24時間後、細胞を偽形質導入するか、または抗GD2CARをコードするレンチウイルスで形質導入した。活性化の72時間後、偽形質導入された細胞および抗GD2CARで形質導入された細胞を各々、2つの条件:偽電気穿孔、またはTGFβR2.B3.F8megaTALをコードするインビトロで転写したmRNAを用いた電気穿孔に分けた。T細胞をさらに7日間増大させた。10日目に、megaTALで処理したT細胞および対照T細胞の両方を組換えTGFβ-1で刺激し、フローサイトメトリーを使用して、SMAD2/3リン酸化を検査することによって、TGFβR2シグナル伝達能力を分析した。megaTALで処理したT細胞を標的とするTGFβR2とは対照的に、対照細胞は、rTGFβ-1刺激後にリン酸化SMAD2/3の増加を示した。図10。
ヒトPBMCをCD3およびCD28で活性化した。活性化の24時間後、細胞を偽形質導入するか、または抗GD2CARをコードするレンチウイルスで形質導入した。活性化の72時間後、偽形質導入された細胞および抗GD2CARで形質導入された細胞を各々、抗体刺激の72時間後、100x106の形質導入された3つの条件:非電気穿孔、偽電気穿孔、またはTGFβR2.B3.F8megaTALをコードするインビトロで転写したmRNAを用いた電気穿孔に分けた。T細胞をさらに7日間増大させた。10日目に、組換えTGFβ-1の存在下または不在下で、megaTALで処理したT細胞および対照T細胞を、癌細胞を発現するGD2と培養した。IFNγおよびIL-2分泌を24時間後に測定した。megaTALで処理したT細胞を標的とするTGFβR2は、TGFβ-1の存在下で、対照の処理された細胞と比較して、サイトカイン分泌の劇的な増加を示した。図11。
全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
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- 明細書に記載の発明。
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