JP2022101790A - 細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための手段を提供することを目的とする。【解決手段】細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための方法であって、アルブミン含有組成物を前記基材の表面に接触させることによって前記基材の表面をアルブミンで被覆するステップ、および細胞を前記基材の表面に接触させるステップを含む、前記方法等を提供することにより、上記課題が達成された。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための方法等に関する。

近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞等の虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（非特許文献２）。

シート状細胞培養物は、所望の細胞を大量に損傷部位に定着させることができることに加え、レシピエント組織の特性に合わせて、適度に組織化させた細胞集団を移植することができるため、損傷した組織等の修復に極めて有用である。
シート状細胞培養物は、所望の細胞を細胞培養基材の表面上で培養し、細胞による層構造を形成させて得られるシート状の培養物を、その構造を壊さないように細胞培養基材から剥離することによって調製される。

他方、損傷した組織等の修復のために、人工心臓、カテーテル等の医療用器具は医療現場において既に広く利用されている。かかる医療用器具は、血液に接触して使用されるため、抗血栓性の付与が重要な課題とされている。かかる課題を解決するために、組換えヒト血清アルブミンをエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）で架橋し、これを乾燥させて架橋アルブミンフィルムを調製し、かかるフィルムで医療用器具またはその部材の表面を被覆することにより、その表面に抗血栓性を付与する試みが報告されている（特許文献１）。

特開２０１０－０６９３０６号公報

Haraguchi Y. et al., Stem Cells Transl. Med., 1(2), 136-141 (2012) Sawa Y. et al., Surg. Today, 42(2), 181-184 (2012)

本発明は、細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための手段を提供することを目的とする。

本発明者は、シート状細胞培養物を調製するための方法を研究する中で、細胞の複数回の継代培養を行う過程で、遠沈管等のシート状細胞培養物調製用基材に吸着した細胞集団の一部を回収できず、失ってしまうことがあり得ると考えた。そして、細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための手段を提供すべく鋭意研究を進めたところ、シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆することにより、細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制できることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を続けた結果、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は、以下に関する。
［１］細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための方法であって、アルブミン含有組成物を前記基材の表面に接触させることによって前記基材の表面をアルブミンで被覆するステップ、および細胞を前記基材の表面に接触させるステップを含む、前記方法。
［２］アルブミン含有組成物が、アルブミンを０．２％（ｗ／ｖ）以上で含む、［１］の方法。
［３］シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆するステップが、３７℃の静置条件下でアルブミン含有組成物を前記基材の表面に接触させることによってなされる、［１］または［２］の方法。
［４］細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップが、細胞を前記基材の湿潤状態の表面に接触させるステップである、［１］～［３］の方法。
［５］細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップが、細胞を前記基材の乾燥状態の表面に接触させるステップである、［１］～［３］の方法。

［６］シート状細胞培養物調製用基材の表面が、垂直状態である、［１］～［５］の方法。
［７］細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップが、遠心分離によってなされる、［１］～［６］の方法。
［８］細胞が、筋芽細胞である、［１］～［７］の方法。
［９］アルブミンが、無架橋アルブミンである、［１］～［８］の方法。
［１０］アルブミンが、ヒト由来の血清アルブミンである、［１］～［９］の方法。

本発明によれば、細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための手段を提供することができる。特に、本発明によれば、シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆することにより、細胞の前記基材の表面への吸着を抑制できるため、簡便に利用可能な、細胞の前記基材の表面への吸着を抑制するための手段を提供することができる。また、本発明によれば、細胞の複数回の継代培養を行う過程で、遠沈管等のシート状細胞培養物調製用基材に吸着した細胞集団の一部を回収できず、失ってしまうことを抑制できるため、効率良く細胞を回収して、かかる細胞からシート状細胞培養物等を調製することができる。これにより、シート状細胞培養物等を調製する手間、コスト等を低減することができ、特に希少な細胞を取り扱う場合、初期段階の継代時で元の細胞数が少ない場合等に極めて有用である。

図１は、アルブミンによる細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着の抑制効果を示す。シート状細胞培養物調製用基材の表面は、アルブミンで被覆されている。また、細胞は、シート状細胞培養物調製用基材の湿潤状態の表面に接触させている。 図２は、乾燥または湿潤条件でのアルブミンによる細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着の抑制効果を示す。シート状細胞培養物調製用基材の表面は、アルブミンで被覆されている。また、細胞は、シート状細胞培養物調製用基材の乾燥状態または湿潤状態の表面に接触させている。

本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。

［細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための方法］
本発明の一側面は、細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための方法であって、アルブミン含有組成物を前記基材の表面に接触させることによって前記基材の表面をアルブミンで被覆するステップ、および細胞を前記基材の表面に接触させるステップを含む、前記方法（「本発明の方法」と記す場合がある）に関する。
本発明の方法において、シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆するステップは、前記基材の表面をアルブミンのみで被覆するステップであり得る。また、細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップは、細胞を前記基材の湿潤状態の表面に接触させるステップであり得る。また、細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップは、細胞を前記基材の乾燥状態の表面に接触させるステップであり得る。

一態様において、アルブミンは、架橋アルブミンである。一態様において、アルブミンは、無架橋アルブミンである。一態様において、シート状細胞培養物調製用基材の表面は、垂直状態である。
シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆するステップは、アルブミン含有組成物を前記基材の表面に接触させること、および／または、前記基材の表面を湿潤状態で維持することを含み得る。
本発明の方法において、細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップは、遠心分離によってなされてもよい。また、細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップは、前記基材の表面を一旦乾燥させ、次いで前記基材の表面を湿潤状態にすることの後になされてもよい。

本発明において、「細胞」とは、生体由来組織から分離された任意の細胞を指し、非限定的に、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞等および幹細胞（例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、筋衛星細胞、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のもの等）、心臓幹細胞等の組織幹細胞、胚性幹細胞等）が挙げられる。細胞は、平面で接触する複数の膜の間において複数の膜と直接接触または複数の膜に隣接するようにして膜に取り囲まれるようにして局在する細胞であってよい。細胞は、好ましくは骨格筋芽細胞等の筋芽細胞、筋衛星細胞等の骨格筋組織中のＣＤ５６陽性細胞または骨髄、脂肪組織、末梢血由来の間葉系幹細胞が挙げられる。

本発明において、「生体由来組織」とは、生体由来であれば特に限定されず、例えば筋組織、脂肪組織、皮膚組織、軟骨組織、腱組織、靭帯組織、間柔組織、血管組織、脳組織、循環器系組織、消化器系組織、代謝系組織、リンパ系組織、骨髄組織、血液等であり、好ましくは筋組織、脂肪組織、骨髄組織、血液であり、さらに好ましくは骨格筋組織である。
生体由来組織は、任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が含まれる。本発明で用いる生体由来組織は、生体由来組織から分離した細胞を移植に用いる場合には、移植対象（レシピエント）自身から採取された生体由来組織を用いて分離された自家細胞を用いることにより、拒絶反応を回避することができる。しかしながら、異種や同種非自己の生体由来組織を用いて分離された異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。

本発明において、「シート状細胞培養物調製用基材」とは、シート状細胞培養物を調製するために用いられ、細胞がその上で吸着し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質および／または形状の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面等を含む。一態様において、シート状細胞培養物調製用基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るもの、すなわち細胞培養基材ではない。一態様において、シート状細胞培養物調製用基材は、継代培養用基材でもある。
シート状細胞培養物調製用基材は、培養液等の液体を透過させないものであれば任意の材料からなるものであってよい。例えば、シート状細胞培養物調製用基材は、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、および金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）からなる群から選択される１以上のものからなる。

一態様において、シート状細胞培養物調製用基材は、細胞の取得、分取、回収、移送、輸送、運搬、搬送、添加、注入、分注、希釈、濃縮、混合、分離（遠心分離を含む）、精製、保存（一時的保存を含む）等の任意の細胞に関する実験操作のための容器である。容器は、試験管、マイクロチューブ、遠沈管等であり得る。一態様において、容器は、細胞の培養に使用されるものではない。細胞に関する実験操作の観点から、容器は、底部が平坦なもの、底部が湾曲しているもの、底部が円錐状で尖っているもの等が好ましい。容器は、容器が自立するように、その底部に足場を有してもよい。容器内への汚染を防ぐ観点から、容器には蓋をすることが好ましい。蓋は、容器と同じ材質であってもよいし、容器と異なる材質であってもよい。蓋は容器に連結されているものでもよく、容器から分離されているものでもよい。

一態様において、シート状細胞培養物調製用基材は、遠沈管である。遠沈管は、遠心分離機で固体と液体、液体中の固体同士、または液体同士を密度の違いにより分離するために使用されるものである。遠心分離の観点から、遠沈管の底部は円錐状で尖っているものが好ましい。遠沈管は、液性等の用途、最高回転数等の耐圧性能等に依存して、材料および形状が異なるものであり得る。例えば、遠沈管は、蓋をしたままで遠心分離ができるねじ口のものである。

容器の容量は、細胞に関する実験操作の種類に合わせて任意に変化し得る。例えば、容器を、細胞の取得、分取、回収、移送、輸送、運搬、搬送、添加、注入、分注、希釈、濃縮、混合、分離（遠心分離を含む）、精製、保存（一時的保存を含む）等に使用する場合は、容器の容量は、０．２ｍＬ～１０００ｍＬ（例えば、０．２ｍＬ～０．５ｍＬ、０．５ｍＬ～１ｍＬ、１ｍＬ～２ｍＬ、２ｍＬ～１５ｍＬ、１５ｍＬ～５０ｍＬ、５０ｍＬ～１００ｍＬ、１００ｍＬ～２００ｍＬ、２００ｍＬ～３００ｍＬ、３００ｍＬ～５００ｍＬ、または５００ｍＬ～１０００ｍＬ）であり得る。

シート状細胞培養物調製用基材への細胞の添加は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。シート状細胞培養物調製用基材への細胞の添加は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を前記基材に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペット等、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
添加される細胞集団は、所望の細胞を含んでいれば、他の細胞（線維芽細胞）を含んでいてもよく、所望の細胞が骨格筋芽細胞または筋衛星細胞である場合は、例えば線維芽細胞や血管内皮細胞等がさらに含まれ得る。細胞集団は、組織から採取した細胞集団をそのまま用いてもよいし、凍結保存やプレ培養、線維芽細胞の除去等を実施した後に用いてもよい。好ましい一態様において、添加される細胞集団は、生体由来組織からの分離後、培養を行い、その後回収された細胞集団である。かかる培養の前または後に、凍結保存および解凍を実施してもよい。

本発明において、「アルブミン」とは、任意のアルブミンであり、特に限定されないが、例えば、卵白を構成する卵アルブミン、脊椎動物の血液の血漿に含まれる血清アルブミン、または乳汁に含まれる乳アルブミンを指す。
アルブミンは、任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が含まれる。また、アルブミンは遺伝子組換え体であってもよい。
本発明において、アルブミンは、回収した細胞を臨床応用する観点から、ヒト由来の血清アルブミンであることが好ましい。

本発明において、「架橋アルブミン」とは、架橋されているアルブミンを指し、「無架橋アルブミン」とは、架橋されていないアルブミンを指す。架橋とは、アルブミン同士を連結し、複数のアルブミン（またはアルブミン集団）の物理的および／または化学的性質を変化させる反応を指し、架橋はアルブミンと任意の架橋剤との間の化学反応によってなされ得る。すなわち、「架橋アルブミン」とは、アルブミン同士が連結し、物理的および／または化学的性質に変化した、複数のアルブミン（またはアルブミン集団）を指し、「無架橋アルブミン」とは、アルブミン同士が連結しておらず、物理的および／または化学的性質に変化のない、複数のアルブミン（またはアルブミン集団）を指す。

本発明において、「シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆する」とは、シート状細胞培養物調製用基材またはその部材の表面の少なくとも一部をアルブミンで被覆することを指し、前記基材またはその部材の表面の半分、過半、または全体をアルブミンで被覆することを含む。シート状細胞培養物調製用基材からの細胞の回収効率の観点から、前記基材またはその部材の表面の過半または全体をアルブミンで被覆することが好ましい。
本発明において、「湿潤状態の表面」とは、乾燥しておらず、水分が存在する状態の表面を指す。水分の存在は、任意の水分測定方法（例えば、カールフィッシャー法、乾燥法、赤外線吸収法、誘電率法等）に基づく水分計、含水計等を用いて確認できる。完全に乾燥した状態のものをコントロールとして重量で水分の存在を確認することができる。
本発明において、「乾燥状態の表面」とは、湿っておらず、水分が存在しない状態の表面を指す。

本発明において、「シート状細胞培養物調製用基材の表面が垂直状態である」とは、シート状細胞培養物調製用基材の表面が、水平面に対して垂直方向を向いている状態（もしくは鉛直方向を向いている状態）、またはかかる垂直方向（もしくは鉛直方向）に対して一定の傾斜角度に向いている状態であることを指す。一定の傾斜角度とは、シート状細胞培養物調製用基材の表面が水平にならないものであれば任意の角度であってよく、特に限定されないが、例えば、上記の垂直方向（もしくは鉛直方向）に対して５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、または８０°である。

一態様において、シート状細胞培養物調製用基材は、遠心分離に用いられる容器（例えば、試験管、マイクロチューブ、遠沈管等）であり、かかる容器の内側の側壁表面は、アルブミンで被覆されたものである。かかる容器に細胞懸濁液を添加し、上記の垂直方向（もしくは鉛直方向）に対して一定の傾斜角度で遠心分離を行った場合、同容器の側壁に向かって、かつ同側壁に沿って下方へ遠心力が生じることにより、細胞は同容器の側壁表面に接触するところ、本発明によれば、このとき細胞の同容器の側壁表面への吸着を抑制することができる。

本発明において、「アルブミン含有組成物」とは、アルブミンを含む組成物を指し、シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆することができる組成物であるならば任意の組成物であってよく、特に限定されないが、例えばアルブミン溶液を指す。
本発明において、アルブミン含有組成物をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させることによって前記基材の表面をアルブミンで被覆した後、前記基材の湿潤状態の表面を１０時間程度維持することができる。
本発明において、アルブミン含有組成物をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させることによって前記基材の表面をアルブミンで被覆した後、一晩室温で風乾することによって前記基材の湿潤状態の表面を、乾燥状態の表面とすることができる。

アルブミン含有組成物は、アルブミンを任意の濃度で含み得、特に限定されないが、かかる濃度は、シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆する効率性の観点から、０．２％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、例えば、０．２～２０％（ｗ／ｖ）、０．２～１０％（ｗ／ｖ）、０．２～５％（ｗ／ｖ）、または０．２％以上２％（ｗ／ｖ）未満である。
アルブミン溶液の溶媒は、少なくとも１種の成分から構成され、その成分としては特に限定されないが、例えば、水、水溶液、非水溶液、懸濁液、乳液等が挙げられる。溶媒を構成する成分は、細胞に与える影響が少ないものであれば特に限定されない。溶媒を構成する成分は、生体適合性のもの、すなわち、生体組織や細胞に対して炎症反応、免疫反応、中毒反応等の望まない作用を起こさないか、少なくともかかる作用が小さいものが好ましい。
本発明において、アルブミン含有組成物は、回収した細胞を臨床応用する観点から、アルブミン水溶液であることが好ましい。

本発明において、シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆するステップは、任意の温度の条件下でなされ、特に限定されないが、かかる温度は、前記基材の表面をアルブミンで被覆する効率性の観点から、室温（１～３０℃）よりも高い温度、すなわち３１～４０℃が好ましく、３３～３８℃がより好ましく、３５～３７℃が特に好ましく、とりわけ生体の至適温度の観点から、３７℃が好ましい。一態様において、シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆するステップは、３７℃の静置条件下でアルブミン含有組成物を前記基材の表面に接触させることによってなされる。

本発明において、シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆するステップは、前記基材の表面をアルブミンで被覆することができる任意の時間なされ、かかる時間は、特に限定されないが、前記基材の表面をアルブミンで被覆する効率性の観点から、少なくとも１０分間が好ましい。一態様において、かかる時間は、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、８時間、１２時間、２４時間、２日間、４日間、６日間、８日間、または１０日間である。

本発明において、シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆するステップは、適切なＣＯ_２濃度の条件下でなされ、例えば、５％ＣＯ_２濃度の条件下でなされる。
本発明において、「遠心分離」とは、細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるのに適切な遠心力（×ｇ）または回転速度（ｒｐｍ）および時間で溶液中の細胞を沈降させることを指す。細胞の活性を維持するために、遠心分離は低温（例えば４℃）条件下で行うことが好ましい。

本発明において、シート状細胞培養物調製用基材から細胞を回収した後に、かかる細胞を用いて移植片を調製してもよい。
本発明において、「移植片」とは、生体内へ移植するための構造物を意味し、特に生細胞を構成成分として含む移植用構造物を意味する。好ましくは、移植片は、生細胞および生細胞由来の物質以外の構造物（例えばスキャフォールド等）を含まない移植用構造物である。本発明の移植片としては、これに限定するものではないが、例えばシート状細胞培養物、スフェロイド、細胞凝集塊等が挙げられ、好ましくはシート状細胞培養物またはスフェロイド、より好ましくはシート状細胞培養物である。

本発明において、「シート状細胞培養物」とは、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子等の細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックス等が挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）体、例えば、２層、３層、４層、５層、６層等）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。

シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、シート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、シート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。

シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞等）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞等の組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）等を含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたもの（ｉＰＳ細胞由来接着細胞）であってもよい。シート状細胞培養物を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞等）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のもの等）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞等）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞等）、肝細胞（例えば、肝実質細胞等）、膵細胞（例えば、膵島細胞等）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞等が挙げられる。

［シート状細胞培養物調製用基材］
本発明の別の側面は、アルブミンで被覆された表面を備える、シート状細胞培養物調製用基材（「本発明の基材」と記す場合がある）に関する。
本発明の基材において、表面はアルブミンのみで被覆され得る。また、表面は湿潤状態または乾燥状態であり得る。

［シート状細胞培養物調製用基材の製造方法］
本発明の別の側面は、細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制することができる前記基材の製造方法であって、アルブミン含有組成物を前記基材の表面に接触させることを含む、前記方法（「本発明の製造方法」と記す場合がある）に関する。
本発明の製造方法は、アルブミン含有組成物のみをシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させることを含み得る。また、本発明の製造方法は、シート状細胞培養物調製用基材の表面を湿潤状態または乾燥状態で維持することをさらに含み得る。
本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。

例１．アルブミンによる細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着の抑制効果
［ヒト骨格筋芽細胞の調製］
ヒト骨格筋から定法により得たヒト骨格筋芽細胞を２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＭＣＤＢ１３１培地（ライフテクノロジーズ株式会社）でインキュベート（３７℃、５％ＣＯ_２濃度）して増殖させた。次いで細胞解離試薬で細胞を回収し平衡塩溶液に懸濁し、細胞懸濁液を得た。このようにして得た細胞懸濁液を以下の実験に用いた。
［シート状細胞培養物調製用基材の表面のアルブミンによる被覆］
２２５ｍLボトル（本体：ポリエチレンテレフタレート、蓋：ポリエチレン）に２％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液を１４０ｍＬ加え、１０日間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ_２濃度、静置条件）し、その表面をアルブミンで被覆した。その後、２２５ｍLボトル内のアルブミン水溶液を廃棄し、２２５ｍLボトル内の湿潤状態を維持したまま、直ちに細胞解離試薬および平衡塩溶液で懸濁したヒト骨格筋芽細胞を含む細胞懸濁液を２２５ｍLボトルに加えた。また、コントロールとしてアルブミン水溶液を加えていない、すなわちその表面をアルブミンで被覆していない２２５ｍLボトルも用意し、細胞解離試薬および平衡塩溶液で懸濁したヒト骨格筋芽細胞を含む細胞懸濁液を同２２５ｍLボトルに同様に加えた。なお、アルブミンは、ヒト由来の血清アルブミンを用いた。
［シート状細胞培養物調製用基材から回収した細胞の数の計測］
ヒト骨格筋芽細胞を含む細胞懸濁液を加えた２２５ｍLボトルを遠心分離後、上清を廃棄した。次いで細胞を２％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液に懸濁し、細胞懸濁液に含まれるヒト骨格筋芽細胞の数を、血球計算盤を用いて計測した。

［実験結果］
その結果、回収したヒト骨格筋芽細胞の数は、表面をアルブミンで被覆していない２２５ｍLボトルでは８，１７，Ｅ＋０５個であったが、表面をアルブミンで被覆している２２５ｍLボトルでは１，４３，Ｅ＋０６個であった。すなわち、表面をアルブミンで被覆している２２５ｍLボトルから回収したヒト骨格筋芽細胞の数は、表面をアルブミンで被覆していない２２５ｍLボトルから回収したヒト骨格筋芽細胞の数よりも、約１．８倍多かった（図１）。

これは、シート状細胞培養物調製用基材の表面のアルブミンによる被覆が、細胞の前記基材の表面への吸着を抑制できることを示す。すなわち、シート状細胞培養物調製用基材の表面のアルブミンによる被覆により、前記基材から細胞を効率的に回収できることが示された。

例２．乾燥または湿潤条件での効果の比較
［ヒト骨格筋芽細胞の調製］
ヒト骨格筋から定法により得たヒト骨格筋芽細胞を２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＭＣＤＢ１３１培地（ライフテクノロジーズ株式会社）でインキュベート（３７℃、５％ＣＯ_２濃度）して増殖させた。次いで細胞解離試薬で細胞を回収し平衡塩溶液に懸濁し、細胞懸濁液を得た。このようにして得た細胞懸濁液を以下の実験に用いた。
［シート状細胞培養物調製用基材の表面のアルブミンによる被覆］
２２５ｍLボトル（本体：ポリエチレンテレフタレート、蓋：ポリエチレン）に０．２％、２．０％または１０．０％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液を１４０ｍＬ加え、１０分間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ_２濃度、静置条件）し、その表面をアルブミンで被覆した。その後、２２５ｍLボトル内のアルブミン水溶液を廃棄し、２２５ｍLボトル内の湿潤状態を維持したもの、または一晩室温で風乾して２２５ｍLボトル内を乾燥状態にしたものを用意し、細胞解離試薬および平衡塩溶液で懸濁したヒト骨格筋芽細胞を含む細胞懸濁液を２２５ｍLボトルに加えた。また、コントロールとしてアルブミン水溶液を加えていない、すなわちその表面をアルブミンで被覆していない２２５ｍLボトルも用意し、細胞解離試薬および平衡塩溶液で懸濁したヒト骨格筋芽細胞を含む細胞懸濁液を同２２５ｍLボトルに同様に加えた。なお、アルブミンは、ヒト由来の血清アルブミンを用いた。
［シート状細胞培養物調製用基材から回収した細胞の数の計測］
ヒト骨格筋芽細胞を含む細胞懸濁液を加えた２２５ｍLボトルを遠心分離後、上清を廃棄した。次いで細胞を２％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液に懸濁し、細胞懸濁液に含まれるヒト骨格筋芽細胞の数を、血球計算盤を用いて計測した。

［実験結果］
その結果、回収したヒト骨格筋芽細胞の数は、表面をアルブミンで被覆していない２２５ｍLボトルでは２,２８,Ｅ＋０６個であったが、表面をアルブミンで被覆している２２５ｍLボトルでは、２,７９,Ｅ＋０６個（０．２％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液、乾燥条件）、３,２９,Ｅ＋０６個（２．０％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液、乾燥条件）、３,３３,Ｅ＋０６個（１０．０％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液、乾燥条件）、２,７４,Ｅ＋０６個（０．２％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液、湿潤条件）、２,７３,Ｅ＋０６個（２．０％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液、湿潤条件）、３,０７,Ｅ＋０６個（１０．０％（ｗ／ｖ）アルブミン水溶液、湿潤条件）であった。すなわち、乾燥または湿潤条件に関わらず、表面をアルブミンで被覆している２２５ｍLボトルから回収したヒト骨格筋芽細胞の数は、表面をアルブミンで被覆していない２２５ｍLボトルから回収したヒト骨格筋芽細胞の数よりも、約１．２～１．５倍多かった（図２）。

これは、シート状細胞培養物調製用基材の表面のアルブミンによる被覆が、乾燥または湿潤条件に関わらず、細胞の前記基材の表面への吸着を抑制できることを示す。すなわち、シート状細胞培養物調製用基材の表面のアルブミンによる被覆により、乾燥または湿潤条件に関わらず、前記基材から細胞を効率的に回収できることが示された。

本発明を図示の実施態様について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明においては、各構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成を付加することもできる。

Claims (10)

1. 細胞のシート状細胞培養物調製用基材の表面への吸着を抑制するための方法であって、アルブミン含有組成物を前記基材の表面に接触させることによって前記基材の表面をアルブミンで被覆するステップ、および細胞を前記基材の表面に接触させるステップを含む、前記方法。
2. アルブミン含有組成物が、アルブミンを０．２％（ｗ／ｖ）以上で含む、請求項１に記載の方法。
3. シート状細胞培養物調製用基材の表面をアルブミンで被覆するステップが、３７℃の静置条件下でアルブミン含有組成物を前記基材の表面に接触させることによってなされる、請求項１または２に記載の方法。
4. 細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップが、細胞を前記基材の湿潤状態の表面に接触させるステップである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップが、細胞を前記基材の乾燥状態の表面に接触させるステップである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
6. シート状細胞培養物調製用基材の表面が、垂直状態である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 細胞をシート状細胞培養物調製用基材の表面に接触させるステップが、遠心分離によってなされる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 細胞が、筋芽細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. アルブミンが、無架橋アルブミンである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. アルブミンが、ヒト由来の血清アルブミンである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

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