JP2022099307A - 超臨界流体クロマトグラフの移動相中の添加剤濃度を制御するシステム - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、超臨界流体クロマトグラフィーにおいて移動相の組成を正確に制御し、サンプルの分離や分析を迅速かつ高精度に行うことのできる技術を提供することである。【解決手段】本発明は、（ａ）超臨界流体、モディファイア、添加剤を含有するモディファイアを混合することによって、超臨界流体とモディファイアのグラジエントを形成させる工程と、（ｂ）超臨界流体およびモディファイアを含む移動相に試料を注入してカラムに導入し、カラムを通過する間に試料中の成分を分離する工程と、を備える。本発明によれば、超臨界流体およびモディファイアを含む移動相を用いて超臨界流体クロマトグラフィーによって成分を分離することができる。【選択図】図２

Description

本発明は、超臨界流体クロマトグラフを用いて試料中の成分を分離する方法に関する。また、本発明は、超臨界流体クロマトグラフを用いて試料中の成分を分離し、試料を分析する方法に関する。

超臨界流体クロマトグラフィー（Supercritical Fluid Chromatography：ＳＦＣ）は、臨界点を超える温度および圧力を有する超臨界流体を移動相とするクロマトグラフィーである。超臨界流体は、液体に近い密度を有しているため分析対象の物質をよく溶かすことができ、また、液体よりも粘度が低く、拡散係数が高いため流速を上げた場合でも高い分解能が得られる。

超臨界流体クロマトグラフィーでは、取り扱いが容易であること、温度、圧力ともに臨界点が比較的低いこと、廉価であることなどの理由により、超臨界流体として二酸化炭素が広く利用されている。超臨界流体として二酸化炭素を用いた超臨界流体クロマトグラフでは、移動相の流速を高めることができ、従来の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に比べても短時間で分析することが可能である（特許文献１）。

超臨界状態の二酸化炭素はヘキサンと同程度の極性を有するが、二酸化炭素だけではカラムから目的成分を溶出させることができないこともある。そのため、高極性の有機溶媒をモディファイアとして超臨界流体に添加することによって移動相の極性を調整し、疎水性化合物だけでなく親水性化合物も含めた幅広い化合物の分析を行えるようにすることが一般的である。例えば、特許文献２には、ヘキサフルオロイソプロパノールを超臨界流体に添加することによってクロマトグラム上のピークをシャープにすることが記載されている。

超臨界流体クロマトグラフィーにおける移動相の制御に関して、例えば、特許文献３には、圧力トランスデューサーを用いて移動相を制御することが記載されており、特許文献４には、超臨界流体クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィーを切り替えて使用することが記載されている。

米国特許公開２０１６／０２０２２１８ 国際公開ＷＯ２０１９／０８７３９３ 特開平６－４３１４８号公報 特開２０１６－１３０６９１号公報

超臨界流体クロマトグラフィーの移動相に広く用いられる二酸化炭素は、非極性のヘキサンに類似した極性を有しているため、二酸化炭素の超臨界流体に対して溶解度の低い高極性成分については、超臨界二酸化炭素のみを用いて超臨界流体クロマトグラフィーで分析することは難しい。そこで、高極性の有機溶媒をモディファイアとして添加して移動相の極性を調整することによって、非極性物質から極性物質まで幅広い極性を持つサンプルを分離することが行われる。

また、超臨界流体クロマトグラフィーにおいても、液体クロマトグラフィーと同様に、種々の目的で、酸や塩基、塩などの各種添加剤を移動相に添加することがある。移動相に二酸化炭素を使用する超臨界流体クロマトグラフィーではこのような添加剤を二酸化炭素のボンベ内に入れることが困難であるため、モディファイアにのみ添加されることになるが、例えば、添加剤を含むモディファイアを使用して、移動相中の超臨界流体とモディファイアの組成を連続的に変化させながら試料を分離・分析する方法（グラジエント法）を実施すると、分析中に移動相中の添加剤濃度が変動するために、流路内に高濃度に残留した添加剤によって、カラムを初期状態に戻すのに時間がかかり、分析のスループットを上げることが難しくなる場合がある。さらに、超臨界流体クロマトグラフィーによる分析を中断し、流路内の加圧を解除して測定装置を停止させた場合には、移動相の二酸化炭素は超臨界流体ではなく気体となるため、移動相中の添加剤はその一部が流路内で濃縮される場合がある。濃縮された添加剤は分析再開後の分析結果に好ましくない影響を及ぼす場合があるため、通常、装置を停止させる前に流路内の添加剤を除くための洗浄操作が必要となるが、その場合においても、測定時の添加剤が高濃度になった場合、より長い洗浄時間（より多い洗浄溶媒）で流路内の添加剤を除くことが必要となる。また、移動相中の添加剤濃度の上昇に伴って、検出器による検出感度の低下を引き起こす特性を有する試料成分も存在し、そのような成分を含有する混合試料の分離・分析においては、グラジエント法による迅速かつ高精度な分離が困難になることがあった。したがって、分析精度の観点からも、装置の効率的な使用の観点からも、添加剤を移動相に添加する場合においては、その濃度は必要最小限とすることが好ましい。

このような状況に鑑み、本発明の課題は、超臨界流体クロマトグラフィーにおいて移動相の組成を正確に制御し、サンプルの分離や分析を迅速かつ高精度に行うことのできる技術を提供することである。

本発明者は、上記課題について鋭意検討したところ、超臨界流体およびモディファイアを送液するポンプに加えて、添加剤を含むモディファイアを送液するポンプを用いることによって、超臨界流体クロマトグラフィーにおける移動相の組成を制御し、サンプルの分離や分析を迅速かつ高精度に行うことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

これに限定されるものではないが、本発明は、下記の発明を包含する。
［１］ 超臨界流体およびモディファイアを含む移動相を用いて超臨界流体クロマトグラフィーによって成分を分離する方法であって、
（ａ） 超臨界流体、モディファイア、添加剤を含有するモディファイアを混合することによって、超臨界流体とモディファイアのグラジエントを形成させる工程と、
（ｂ） 超臨界流体およびモディファイアを含む移動相に試料を注入してカラムに導入し、カラムを通過する間に試料中の成分を分離する工程と、
を備えた、上記方法。
［２］ 工程ａにおいて、モディファイアと、添加剤を含有するモディファイアとを混合した後に、さらに超臨界流体を混合することによって、超臨界流体とモディファイアのグラジエントを形成させる、［１］に記載の方法。
［３］ 超臨界流体が二酸化炭素である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ モディファイアが極性溶媒を含むものである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ 極性溶媒がメタノールまたはエタノールである、［４］に記載の方法。
［６］ 添加剤が揮発性の有機化合物である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ 揮発性の有機化合物が酢酸アンモニウムを含む、［６］に記載の方法。
［８］ 添加剤としてキレート剤を用いる、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ キレート剤がアセチルアセトンを含む、［８］に記載の方法。
［１０］ 前記試料が、生体関連物質を含む試料である、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］ ［１］～［１０］のいずれかに記載の方法によって分離した成分を検出する工程を含む、試料の分析方法。
［１２］ 質量分析によって成分を検出する、［１１］に記載の分析方法。
［１３］ 超臨界流体を送液する第１のポンプと、
添加剤を含有するモディファイアを送液する第２のポンプと、
添加剤を含有しないモディファイアを送液する第３のポンプと、
それぞれのポンプから送液された流体の合流部よりも下流に配置された分離カラムと、
合流部と分離カラムとの間に配置された試料注入部と、
を備えた、超臨界流体およびモディファイアを含む移動相を用いる超臨界流体クロマトグラフィー装置であって、超臨界流体、モディファイア、添加剤を含有するモディファイアを混合することによって、超臨界流体とモディファイアのグラジエントを形成できるように構成された、上記装置。
［１４］ 第２のポンプから送液されたモディファイアと第３のポンプから送液されたモディファイアを合流させる合流部よりも下流に、第１のポンプから送液された超臨界流体と合流させるための合流部が配置されている、［１３］に記載の装置。
［１５］ 前記分離カラムの下流に配置された、前記分離カラムから溶出した成分を検出する検出器、をさらに備える、［１３］または［１４］に記載の装置。
［１６］ 前記検出器の下流に配置された、移動相を回収する容器、をさらに備える、［１５］に記載の装置。
［１７］ 移動相を回収する容器をさらに備えており、前記検出器および移動相を回収する容器が、前記分離カラムの下流に分配器を介して配置されている、［１５］に記載の装置。

本発明によれば、超臨界流体クロマトグラフィーにおいて移動相の組成を正確に制御し、サンプルの分離や分析を迅速かつ高精度に行うことが可能になる。従来の超臨界流体クロマトグラフィーでは、特に高極性の化合物の分離において、添加剤濃度の変動に由来する不都合を生じさせる場合があったところ、本発明によれば、高極性の化合物の分離においても、高い分離性能で分離・分析することができる。

また、本発明によれば、極性の異なる成分が混在する試料を高いスループットで効率良く処理することができ、分取や精製はもちろん、試料を精度良く同定したり定量したりすることが可能である。

図１は、比較例で用いた装置（２ポンプグラジエントシステム）の模式図である。 図２は、実施例で用いた装置（３ポンプグラジエントシステム）の模式図である。 図３は、デヒドロエピアンドロステロン硫酸（ＤＨＥＡ－Ｓ）の分析結果を示すチャートである（比較例の装置、上：酢酸アンモニウム無添加、下：酢酸アンモニウム添加）。 図４は、プロゲステロンの分析結果を示すチャートである（比較例の装置、上：酢酸アンモニウム無添加、下：酢酸アンモニウム添加）。 図５は、比較例と実施例の装置を用いたプロゲステロンの分析結果を示すチャートである（ａ：比較例の装置で測定、ｂ：実施例の装置で測定、ｃ：比較例の装置を用いてａの測定をした翌日に３ポンプグラジエントシステムに切替えて測定、ｄ：実施例の装置を用いてｂの測定をした翌日に同じ装置で測定）。 図６は、ＤＨＥＡ－Ｓとプロゲステロンの両方を含有する培養上清を実施例の装置で分析した結果を示すチャートである。 図７は、実施例の装置を用いて作成した検量線である（上：ＤＨＥＡ－Ｓ、下：プロゲステロン）。 図８は、実験２においてサンプル１（キレート剤を含有しない試料）を分析した結果を示すチャートである（上：サンプル調製直後に分析、下：サンプル調製から２４時間後に分析）。 図９は、実験２においてサンプル２（キレート剤を含有する試料）を分析した結果を示すチャートである（上：サンプル調製直後に分析、下：サンプル調製から２４時間後に分析）。 図１０は、実験２においてサンプル１（キレート剤を含有しない試料）を分析した際に生じるインソースフラグメントに関するチャートである（上：サンプル調製直後に分析、下：サンプル調製から２４時間後に分析）。 図１１は、実験２においてサンプル２（キレート剤を含有する試料）を分析した際に生じるインソースフラグメントに関するチャートである（上：サンプル調製直後に分析、下：サンプル調製から２４時間後に分析）。

一つの態様において、本発明は、超臨界流体クロマトグラフィー（以下、ＳＦＣともいう）によって試料を処理するための方法または装置に関する。本発明においては、超臨界流体およびモディファイアを含む移動相を用いて成分を分離する。本発明は、超臨界流体、モディファイア、添加剤を含有するモディファイアを混合することによって、超臨界流体とモディファイアの組成比に時間経過に伴う勾配（グラジエント）を形成させる工程と、超臨界流体およびモディファイアを含む移動相に試料を注入してカラムに導入し、カラムを通過する間に試料中の成分を分離する工程と、を備える。

本発明は、極性の異なる種々の成分を含有するサンプルに好適に適用できるため、従来からＳＦＣによって分離または分析されてきたものだけでなく、種々の物質を対象とすることができる。本発明は、例えば、低分子化合物だけでなく高分子化合物にも好適に適用でき、それらが混在しているような試料にも適用することができる。

本発明は、例えば、脂質やビタミン類、アミノ酸、ペプチド、たんぱく質、核酸、糖などの内因性の生体関連物質や、医薬品およびその代謝物などの生体機能に影響しうる外因性の生体関連物質に好適に適用することができる。特に本発明は、極性の異なる種々の成分を含有するサンプルに好適に適用でき、例えば、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、水酸基、糖などを含む高極性の成分についても好適に分離することが可能であり、分取や精製はもちろん、定性分析や定量分析にも好適に応用できる。

本発明は、種々の極性の異なる成分が混在する試料に好適に適用することができるため、例えば、リン脂質やリゾリン脂質などの極性脂質とアシルグリセロールなどの非極性脂質を含む試料、水溶性ビタミンと脂溶性ビタミンを含む試料、薬物と一般に極性が増すことが多いそれら薬物の代謝物または抱合体（ステロイドとその硫酸抱合体など）、糖と糖リン酸を含む試料、化合物とその配糖体を含む試料などに用いることができる。

超臨界流体
本発明においては移動相として超臨界流体を使用する。超臨界流体は液体に比べて粘性が低く、超臨界流体中の物質の拡散係数は液体中より大きくなるため、ＳＦＣでは移動相の流速を大きくしても高い分離能が得られる。超臨界流体の密度や性質は、圧力や温度によって変化するため、ＳＦＣにおいては、圧力と温度が分離を調整するための操作条件となる。

本発明の好ましい態様において、超臨界流体として二酸化炭素を使用する。二酸化炭素の極性はヘキサンと同程度であり、基本的には非極性の物質の分離に適しており、例えば、シリカゲルを充填剤としたカラムを用いると、順相クロマトグラフィーのような保持挙動を示すことになる。

モディファイア
本発明においては、モディファイアと呼ばれる補助溶媒を使用する。ＳＦＣにおいては、超臨界流体にアルコールなどの補助溶媒を混合することにより、移動相全体の性質を変化させ、保持時間や分離を調整することが行われる。

モディファイアとして使用する溶媒は特に制限されず、超臨界流体や試料に応じて公知の補助溶媒を適宜使用することができる。超臨界流体として二酸化炭素を使用する場合、極性が高い物質を分離するときにはモディファイアとして極性溶媒が用いられることが多く、特に極性の異なる成分が混在する試料を処理する場合は、超臨界流体とモディファイアでグラジエントを形成させる。

本発明に係るＳＦＣにおいては、超臨界流体とモディファイアを含む移動相を使用するが、超臨界流体とモディファイアの混合比を分析中に変化させるグラジエント法を行う。グラジエントは、試料に応じて適宜設定すればよく、本発明においては、超臨界流体、モディファイア、添加剤を含有するモディファイアを混合することによって、超臨界流体とモディファイアのグラジエントを形成させる。グラジエントパターンは、時間経過に伴って超臨界流体とモディファイアの比率を適宜変化させればよいが、例えば、モディファイアの比率を時間に対して徐々に増加させることはもちろん、モディファイアの比率を階段状に増加するように設定したり、常に一定割合になるように設定したりしてもよい。

モディファイアとして用いる補助溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール（イソプロパノール）、アセトニトリル、ｎ－ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、１，４－ジオキサン、イソオクタン、トルエン、キシレン、水などを挙げることができ、好適には、メタノールなどのアルコール類、アセトニトリルなどのニトリル類を使用することができる。また、上記の補助溶媒のうち複数を組合せた混合溶媒をモディファイアとして使用することもできる。

添加剤
一般にＳＦＣにおいては、分離した成分について、ピークのテーリングが大きく、ピーク開始点から終了点までの幅が拡がってしまったり、ピークの波形形状が悪く、シグナル／ノイズ比が低くなってしまったりすることがある。そのような場合、酢酸アンモニウムやギ酸などの揮発性の有機化合物を添加剤として添加するが、本発明においても、このような添加剤を使用する。

ＳＦＣにおいては、移動相とする超臨界流体の二酸化炭素はボンベから供給され、このボンベには添加剤を加えることが難しい。また、添加剤と試料中の特定の成分が反応性を有することなどの理由により、注入試料へ事前に添加剤を混和しておくことを避けることが望ましい場合がある。例えば、キレート剤であるアセチルアセトンは、自ら金属と配位することで試料成分の金属への吸着を抑制するため、金属への吸着性を有する成分を含む試料の分離や分析において、当該成分の検出時におけるピークテーリングを抑制するのに有効であるものの、アミノ基を有する化合物との反応性を有することから、アミノ基を有する化合物を成分として含みうる試料の分離や分析においては、アセチルアセトンと当該試料成分との共存は、濃度および時間の両観点から最小限とするのが望ましく、アセチルアセトンは注入試料へ事前に混和しておくことを避けることが望ましい添加剤に該当する。

以上のような理由から、一般にモディファイアに添加剤を加えることになるが、超臨界流体とモディファイアでグラジエント法を行う場合、モディファイアの比率の変動に伴い流路内の添加剤濃度が変動することになり、これが、カラムにおける分離能や検出器での検出感度などに影響を及ぼし、分析結果に好ましくない影響を及ぼす場合がある。本発明においては、添加剤を含有するモディファイアを独立して送液できるポンプを使用することによって、流路内の移動相における添加剤濃度を一定に保つことや、添加剤濃度の変動幅を小さく制御することが可能になり、分析を好適に実施することができる。

本発明においては、ＳＦＣで用いられる公知の添加剤を制限なく使用することができ、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、アンモニア、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸塩、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、アセチルアセトンなど）、イオンペア試薬（４級アンモニウム塩など）、ジ（２－エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウム、水などを挙げることができる。本発明においては、１つの添加剤を使用することもでき、複数の添加剤を併用することも可能である。添加剤としてキレート剤を使用する場合、質量分析の感度に悪影響を及ぼしにくいことから、エチレンジアミン四酢酸などの不揮発性のキレート剤よりも、アセチルアセトンなどの揮発性を有するキレート剤を用いることが好ましい。

分離カラム
本発明においては、超臨界流体およびモディファイアを含む移動相に試料を注入してカラムに導入し、カラムを通過する間に試料中の成分を分離する。本発明においては、公知のカラムを制限なく使用することができ、例えば、順相カラム、逆相カラム、ＨＩＬＩＣカラムのいずれも使用することができる。

本発明に係る装置においては、超臨界流体およびモディファイアを含む移動相が形成され、そこに試料が注入された後に分離カラムにおいて試料が処理される。したがって、分離カラムは、それぞれのポンプから送液された流体の合流部よりも下流に配置されることになる。

検出器
本発明においては、ＳＦＣによって処理したサンプルを検出器によって分析してもよい。検出器としては、公知の検出器を制限なく使用することができ、例えば、質量分析計（ＭＳ）はもちろんのこと、紫外／可視吸光度検出器（ＵＶ－Ｖｉｓ）、ダイオードアレイ検出などの多波長検出器、旋光度検出器、円二色性検出器（ＣＤ）、蛍光検出器、屈折率検出器、蒸発光散乱検出器などの光学的検出器、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）などを使用することができる。本発明によれば質量分析における感度低下を効果的に抑制できるため、本発明の好ましい態様において、検出器としてＭＳを使用する。本発明に係る装置においては、分離カラムから溶出した成分を検出するため、検出器は分離カラムの下流に配置されることになる。

装置構成
本発明は、一つの態様において、超臨界流体およびモディファイアを含む移動相を用いる超臨界流体クロマトグラフィー装置である。本発明に係る装置は、超臨界流体を送液する第１のポンプと、添加剤を含有するモディファイアを送液する第２のポンプと、添加剤を含有しないモディファイアを送液する第３のポンプと、それぞれのポンプから送液された流体の合流部よりも下流に配置された分離カラムと、合流部と分離カラムとの間に配置された試料注入部と、を備える。本発明に係る装置は、超臨界流体、モディファイア、添加剤を含有するモディファイアを混合することによって、超臨界流体とモディファイアのグラジエントを形成できるように構成されている。

本発明に係る超臨界流体クロマトグラフィー装置について、その一実施態様を図２に示す。移動相を供給するために、超臨界流体を送液する第１のポンプ、添加剤を含有するモディファイアを送液するための第２のポンプ、添加剤を含有しないモディファイアを送液する第３のポンプが設けられており、それぞれのポンプから送液された流体が合流して移動相を形成する。

移動相の超臨界流体として用いる二酸化炭素は、液化炭酸ボンベなどから液体状態で採取し、それを第１のポンプで加圧して送液する。また、モディファイアは、モディファイアを貯留する容器から第２のポンプおよび第３のポンプで加圧して送液され、それらが合流後にさらに超臨界流体に合流する。本発明においては、超臨界流体とモディファイアによるグラジエント法を行う場合においても添加剤を含有するモディファイアは第２のポンプによって送液され、移動相における添加剤濃度を調整することになる。

超臨界流体とモディファイアから移動相が形成されると、流路中を移動相が移動する。流路上には、移動相の流れに対する上流側から、流路に試料を注入する試料注入部、分離カラムが配置されている。試料注入部として、例えば、オートサンプラーを使用することもできる。

分離カラムはカラムオーブンに収容されて一定温度に保たれる。カラムが内装されたカラムオーブンは、移動相の主要物質である二酸化炭素の臨界温度（３１℃）を超える温度（例えば４０℃程度）に調整することができる。カラム内を通過する移動相は超臨界状態にあり、移動相の流れに乗ってカラム内に導入された試料は、カラム内に設けられた固定相との相互作用により成分ごとに分離される。成分ごとに分離された試料は、時間差を有してカラムから溶出し下流側流路に流れる。

また、分離カラムの下流には、圧力調節器が配置される。圧力調整器は、背圧（バックプレッシャー）を調整するために使用され、流路内の移動相を超臨界状態に維持するために、流路内を一定圧力（加圧状態）に保つために使用され、加圧状態と大気に解放する解放状態との間で切り換えられるように構成されたものである。

検出器は、分離カラムの下流に配置され、分離カラムで分離された試料成分を電気信号に変換する。検出器としてＭＳを使用する場合、移動相を除去してから試料成分を分析するため、検出器は圧力調整器の下流に配置する。圧力調整器の上流側の流路では移動相は超臨界状態にあるが、圧力調整器の下流側では移動相は大気圧下に放出され、試料成分は移動相とともに霧状になって放出される。検出器としてＭＳを使用する場合、ＭＳのイオン化室の前で電圧（エレクトロスプレー電圧）を印加することにより、分離した試料成分がイオン化され、ＭＳにより分析される。

本発明に係る装置においては、それぞれのポンプや圧力調整器の動作を制御するために制御部を設けてもよい。制御部は、例えば、それぞれのポンプを作動状態としたり、圧力調整器を制御し、流路を加圧状態に維持したり、解放状態に切り替えたりすることができる。一つの態様において、制御部にデータ処理部を接続し、所定のプログラムに基づいてグラジエントを形成させたり、分析結果に応じたフィードバック制御によってポンプや圧力調整器などの動作を調整したりする。制御部とデータ処理部は典型的にはコンピュータであり、ＳＦＣシステム専用のコンピュータであってもよく、汎用のコンピュータであってもよい。

圧力調整器は、流路内を一定圧力に保つことができ、かつその加圧状態と解放状態との間で切り換えるものである。一つの態様において、圧力調整器は背圧弁であり、超臨界流体クロマトグラフィーを実行する際はアクチュエータなどによって隙間の大きさを調節して移動相を超臨界流体状態に維持したり、隙間の大きさを拡げて流路を大気圧に解放したりする。特に図示しないが、圧力調整器を経た移動相は回収容器などで回収してもよい。

以下、具体例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。また、本明細書において特に記載しない限り、濃度などは質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。

実験１
１－１．装置構成および実験手順
（１）２ポンプグラジエントシステム（比較例）
図１に示す構成のシステムを使用した。具体的には、超臨界流体クロマトグラフ（Nexera UC、島津製作所）とＭＳ（API5000、SCIEX社）を組み合わせたＳＦＣ－ＭＳ／ＭＳシステムを使用した。

この装置においては、超臨界流体（二酸化炭素）が第１のポンプ、モディファイアである有機溶媒（メタノール）が第２のポンプによって送液され、サンプルを注入した上で分離カラムに送られることになる。第１のポンプとしてＣＯ_２送液ユニット（LC-30AD_SF、島津製作所）、第２のポンプとして送液ポンプ（LC-30AD、島津製作所）を使用し、背圧レギュレーター（ＢＰＲ）によって系の圧力を１０ＭＰａ以上に維持した。

グラジエントなどの分離条件は下表のとおりである。第２のポンプによって送液される移動相Ｂは、メタノールと酢酸アンモニウム溶液（１０Ｍ、遺伝子工学研究用、富士フイルム和光純薬）を１００：０．２の比率（ｖ／ｖ）で混合して調製した。

（２）３ポンプグラジエントシステム（実施例）
図２に示す構成のシステムを使用した。具体的には、超臨界流体クロマトグラフ（Nexera UC、島津製作所）とＭＳ（API5000、SCIEX社）を組み合わせたＳＦＣ－ＭＳ／ＭＳシステムを使用した。第３のポンプ（LC-30AD、島津製作所）を追加した以外は、基本的に図１のシステムと同様である。なお、図２において１１で示す試料注入部より下流側は、図１に示す２ポンプグラジエントシステムと共通であり、５で示す第３のポンプを作動させなければ２ポンプグラジエントシステムへの切り替えが可能である。

この装置においては、添加剤（酢酸アンモニウム）を含有するモディファイア（メタノール）が第２のポンプ、添加剤を含有しないモディファイアが第３のポンプによって送液され、両者をミキサーで混合した上で、第１のポンプによって送液された超臨界流体（二酸化炭素）と合流させる。

グラジエントなどの分離条件は下表のとおりである。このシステムでは、第１のポンプおよび第３のポンプによって二酸化炭素とメタノールのグラジエントを形成させ、第２のポンプによって流路内の添加剤濃度を一定に保つことにした。

（３）ＭＳ条件
２ポンプグラジエントシステムおよび３ポンプグラジエントシステムのいずれにおいても、ＭＳによって定量を行った。測定条件の詳細を下表に示す。

１－２．測定サンプルの調製
高極性の物質として、Avanti Polar Lipids社（Alabaster, AL）より入手したデヒドロエピアンドロステロン硫酸（ＤＨＥＡ－Ｓ、分子量３６８．５）を使用した。

また、低極性の物質として、東京化成工業より入手したプロゲステロン（分子量３１４．５）を使用した。

（１）検量線標準溶液の調製
ＤＨＥＡ－Ｓおよびプロゲステロンをそれぞれメタノールで溶解して１ｍＭの溶液を調製し、さらに、水／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）で１０μＭに希釈して保存溶液とした。水はMilli-Q水を用い、メタノール（LC/MSグレード）は関東化学から購入した。

次いで、この保存溶液を段階的に希釈して、下表に示す濃度の検量線作成用の標準溶液を調製した。

（２）内標準溶液（ＩＳ溶液）の調製
ｄ６－ＤＨＥＡ－Ｓ（シグマアルドリッチ社）および^１３Ｃ_３－プロゲステロン（シグマアルドリッチ社）をメタノールに溶解して希釈し、ＩＳ溶液を調製した（d6-DHEA-S濃度：５ｎｇ／ｍＬ、¹³C₃-Progesterone：８ｎＭ）
（３）測定試料の調製
培養上清または検量線用標準溶液（５０μＬ）にＩＳ溶液（５０μＬ）およびメタノール（１００μＬ）を混合し、遠心処理（５４０×ｇ、１５秒、４℃）後、その上清を測定試料とした。培養上清としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ギブコ社）に２．５％の活性炭／デキストラン処理したウシ胎児血清（ハイクロン社）とＩＴＳ液体培地サプリメント（シグマアルドリッチ社）を添加した培地を用いてＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞（ＡＴＣＣ）を培養した際の培養上清を使用した。

１－３．実験結果
（１）２ポンプグラジエントシステムによる分離および分析
ＤＨＥＡ－Ｓについては、酢酸アンモニウムを含有しないメタノールをモディファイアとして使用した場合、ピーク形状がブロードで十分な感度が得られなかった（図３上）。

一般に、ピークテーリングが起こる化合物を分析する際、酢酸アンモニウムなどの揮発性の有機酸塩を添加してピーク形状が改善することがある。そこで、酢酸アンモニウムを添加したメタノール（酢酸アンモニウム濃度：２０ｍＭ）をモディファイアとして使用したところ、ＤＨＥＡ－Ｓのピーク形状が改善され、高感度でＤＨＥＡ－Ｓを検出することが可能になった（図３下）。

一方、プロゲステロンについては、ピーク形状に対する添加剤（酢酸アンモニウム）の影響は認められなかったが、プロゲステロンのシグナル強度が低下した（図４）。これはグラジエントによって添加剤（酢酸アンモニウム）が高濃度になるに従いイオン化抑制が顕著となったと考えられた。さらに、翌日に同一の装置を使用して再度測定を実施した場合はプロゲステロンのシグナル強度が１／３以下にまで低下し、シグナル強度を回復させるために流路内の酢酸アンモニウム濃度を低くするためには長時間の平衡化が必要とされた。

このように、従来のシステムを用いた場合、極性の異なる複数の物質を好適に分離および分析することが難しかった。
（２）３ポンプグラジエントシステムによる分離および分析
３ポンプグラジエントシステムを使用したところ、２ポンプグラジエントシステムを使用した場合と比較して、イオン化抑制が抑えられ、プロゲステロンを約２倍の高感度で検出可能となった（図５ａ：比較例、図５ｂ：実施例）。

上述したように、２ポンプグラジエントシステムを用いて測定し、同一の装置を用いて翌日に再度測定を実施した場合には、プロゲステロンのシグナル強度が１／３以下にまで低下し、このシグナル強度の低下は、２ポンプグラジエントシステムを用いた測定の翌日の再測定において、第３のポンプを作動させて３ポンプグラジエントシステムに切り替えただけでは回復せず（図５ｃ）、シグナル強度を回復させるには半日以上のメタノール洗浄が必要であった。これは、装置を停止後に超臨界状態が解除されることで流路内の二酸化炭素が気化して酢酸アンモニウムの濃縮が起こること、高濃度に達した酢酸アンモニウムのカラム内や流路内の平衡化には有機溶媒濃度の平衡化に比較して長時間を要することが原因と考えられた。

それに対して、３ポンプグラジエントシステムでは、グラジエント法による分析の場合においても流路内の酢酸アンモニウム濃度を分析開始時の低いまま一定に保つことにより流路内の平衡化が不要で、超臨界状態をいったん解除した翌日の分析においても同程度の強度のシグナルが得られた（図５ｄ）。

従来の２ポンプグラジエントシステムでは、一度高濃度に達した酢酸アンモニウムの濃度が初期条件に戻らないまま次検体の測定が開始されていると考えられ、それがプロゲステロンの感度低下の一因になっていたと考察される。一方、本発明の３ポンプグラジエントシステムによれば、測定ごとの長時間の平衡化は必要なく連続分析が可能であることが示された。

（３）３ポンプグラジエントシステムによる複数化合物の同時定量
ＤＨＥＡ－Ｓとプロゲステロンの両方を含有する培養上清を３ポンプグラジエントシステムで分析した。図６に示すように、ステロイドの硫酸抱合体であるＤＨＥＡ－Ｓと非極性のステロイドであるプロゲステロンは夾雑ピークとそれぞれ明確にベースライン分離され、良好な直線性が確認された（図７、ＤＨＥＡ－Ｓ：２～１０００ｎｇ／ｍＬ、プロゲステロン：０．２～１００ｎｇ／ｍＬ）。

本実験で用いた培養上清には、細胞培養の際に細胞から分泌される種々のステロイドが含まれているところ、本発明によれば、同系統で極性の異なる複数の化合物を同時に定量することが可能だった。

（４）まとめ
本発明によって移動相中の添加剤濃度を制御することによって、ステロイドの硫酸抱合体であるＤＨＥＡ－Ｓのピーク形状を改善することができた。また、本発明によって、高濃度の添加剤（酢酸アンモニウム）によって引き起こされるプロゲステロンの検出感度低下を抑制することができた。

本発明によれば、極性の大きく異なる化合物を含有するサンプルについて、極性の異なる化合物を同時に定量することができた。
実験２
一般に、金属への吸着性を有する成分を含むサンプルの分離や分析において、当該成分がクロマトグラフィーのカラムや配管の金属に吸着してしまい、ピークテーリングを起こすことがある。例えば、リン脂質などのリン酸基を有する化合物を分析する場合であれば、リン酸基が金属に吸着してしまうことが考えられ、特に超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）では、すべての配管が金属であるため、ピークテーリングに関する強い懸念がある。

金属への吸着性を有する成分を含むサンプルの分離や分析において、アセチルアセトンやエチレンジアミン四酢酸などのキレート剤を添加して金属と配位させ、サンプルの金属への吸着を抑制することによって、当該成分のピークテーリングを抑制することが知られている。

本実験では、酢酸アンモニウムだけでなくキレート剤を添加したモディファイアを用いてリン脂質を含むサンプルを分析した。
２－１．装置構成および実験手順
図２に示す構成のシステムを使用した。具体的には、超臨界流体クロマトグラフ（Nexera UC、島津製作所）とＭＳ（API5000、SCIEX社）を組み合わせたＳＦＣ－ＭＳ／ＭＳシステムを使用した。

この装置においては、添加剤を含有するモディファイア（メタノール）が第２のポンプ、添加剤を含有しないモディファイアが第３のポンプによって送液され、両者をミキサーで混合した上で、第１のポンプによって送液された超臨界流体（二酸化炭素）と合流させる。実験１と同様に、第１のポンプとしてＣＯ２送液ユニット（LC-30AD_SF、島津製作所）、第２および第３のポンプとして送液ポンプ（LC-30AD、島津製作所）を使用し、背圧レギュレーター（ＢＰＲ）によって系の圧力を１０ＭＰａ以上に維持した。

グラジエントなどの分離条件は下表のとおりである。このシステムでは、第１のポンプおよび第３のポンプによって二酸化炭素とメタノールのグラジエントを形成させ、第２のポンプによって添加剤を含有するモディファイアを送液した。第２のポンプによって送液される移動相Ｂは、下記のＢＡとＢＢを５０：５０（ｖ／ｖ）の比率でブレンドしたものである。
（ＢＡ） メタノール（LC/MSグレード、関東化学）と酢酸アンモニウム溶液（１０Ｍ、遺伝子工学研究用、富士フイルム和光純薬）を１００：１（ｖ／ｖ）の比率で混合したもの
（ＢＢ） メタノールとアセチルアセトン（東京化成工業）を１０：２（ｖ／ｖ）の比率で混合したもの

（２）ＭＳ条件
実験２では、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン（１８：１ＰＳ）および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸（１８：１ＰＡ）の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によって検出を行った。測定条件の詳細を下表に示す。

２－２．測定サンプルの調製
１８：１ＰＳ（Avanti Polar Lipids社、Alabaster、AL）をメタノールで溶解して１０μＭの標準溶液を調製した。この標準溶液５０μＬ、メタノール１５０μＬおよび水４μＬを混合し、アセチルアセトンを含まない試料を調製した（サンプル１）。

また、標準溶液５０μＬ、メタノール５０μＬ、水４μＬおよびアセチルアセトン／メタノール（２：１００、ｖ／ｖ）１００μＬを混合し、アセチルアセトンを約１％含む試料を調製した（サンプル２）。

２－３．実験結果
図８に分析結果を示すが、本発明に係る装置を用いて、アミノ基を有するリン脂質である１８：１ＰＳを含む試料を問題なく分析することができた。すなわち、本発明を適用して、アセチルアセトンおよび酢酸アンモニウムを添加したモディファイアを供給することによって、試料の高精度な分析が実現できた。

また、アセチルアセトンを含有しない試料（サンプル１）については、サンプルを調製直後に分析した場合（図８上）とサンプルを調製してから２４時間後に分析した場合（図８下）で、１８：１ＰＳのシグナル強度に差は見られなかった。一方、アセチルアセトンを含有する試料（サンプル２）については、サンプルを調製直後に分析した場合（図９上）と比較して、サンプルを調製してから２４時間後に分析した場合、１８：１ＰＳのシグナル強度が低下した（図９下）。

ここで、ホスファチジルセリン（ＰＳ）をＭＳ測定する場合、イオン化の際にＰＳは、一定の割合でセリン部分が外れたインソースフラグメントイオン（この場合、ホスファチジン酸（ＰＡ）のイオン）となるため、ＰＳの一部がＰＡのＭＲＭによって検出される。アセチルアセトンを含有しない試料（サンプル１）についてインソースフラグメントを分析したところ、サンプルを調製直後に分析した場合（図１０上）とサンプルを調製してから２４時間後に分析した場合（図１０下）で、クロマトグラムに大きな変化は見られなかった。一方、アセチルアセトンを含有する試料（サンプル２）については、サンプルを調製直後に分析した場合、２．７分あたりに未知のピーク（unknown）が出現し（図１１上）、サンプルを調製してから２４時間後に分析した場合、インソースフラグメントのピークが減少する一方、未知ピークが増加した（図１１下）。詳細な構造は未確定ながら、この未知ピークは１８：１ＰＳのセリン部分にあるアミノ基とアセチルアセトンが反応した生成物が、イオン化の際にセリンとアセチルアセトン部分が外れたインソースフラグメントイオンとなり、１８：１ＰＳのインソースフラグメントイオンと同様に１８：１ＰＡのＭＲＭによって検出されたものであると考察された。

図８～１１に示す結果から、アミノ基を有するリン脂質を含む試料にキレート剤であるアセチルアセトンを添加すると、アセチルアセトンが試料中のアミノ基を有するリン脂質と反応してしまうことが示唆された。したがって、ピークテーリングを抑制するためにキレート剤などの添加剤を使用する場合、当該添加剤が試料中成分との反応性を有するものであるときには、添加剤は注入試料中に添加するのではなく、本発明に基づいてモディファイアに添加した上で、試料との共存時間および濃度を最小限とすることが望ましいと考えられた。

１ 第１のポンプ；
２ 二酸化炭素ボンベ；
３ 第２のポンプ；
４ モディファイア；
５ 第３のポンプ；
６ モディファイア（添加剤非含有）；
７、８ ミキサー；
１１ 試料注入部；
１２ カラムオーブン；
１３ カラム；
１４ 背圧レギュレーター；
１５ 検出器（ＭＳ）；
１６ メイクアップポンプ；
１７ メイクアップ溶液；

Claims (17)

1. 超臨界流体およびモディファイアを含む移動相を用いて超臨界流体クロマトグラフィーによって成分を分離する方法であって、
   （ａ） 超臨界流体、モディファイア、添加剤を含有するモディファイアを混合することによって、超臨界流体とモディファイアのグラジエントを形成させる工程と、
   （ｂ） 超臨界流体およびモディファイアを含む移動相に試料を注入してカラムに導入し、カラムを通過する間に試料中の成分を分離する工程と、
   を備えた、上記方法。
2. 工程ａにおいて、モディファイアと、添加剤を含有するモディファイアとを混合した後に、さらに超臨界流体を混合することによって、超臨界流体とモディファイアのグラジエントを形成させる、請求項１に記載の方法。
3. 超臨界流体が二酸化炭素である、請求項１または２に記載の方法。
4. モディファイアが極性溶媒を含むものである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 極性溶媒がメタノールまたはエタノールである、請求項４に記載の方法。
6. 添加剤が揮発性の有機化合物である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. 揮発性の有機化合物が酢酸アンモニウムを含む、請求項６に記載の方法。
8. 添加剤としてキレート剤を用いる、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
9. キレート剤がアセチルアセトンを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記試料が、生体関連物質を含む試料である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
11. 請求項１～１０のいずれかに記載の方法によって分離した成分を検出する工程を含む、試料の分析方法。
12. 質量分析によって成分を検出する、請求項１１に記載の分析方法。
13. 超臨界流体を送液する第１のポンプと、
    添加剤を含有するモディファイアを送液する第２のポンプと、
    添加剤を含有しないモディファイアを送液する第３のポンプと、
    それぞれのポンプから送液された流体の合流部よりも下流に配置された分離カラムと、
    合流部と分離カラムとの間に配置された試料注入部と、
    を備えた、超臨界流体およびモディファイアを含む移動相を用いる超臨界流体クロマトグラフィー装置であって、
    超臨界流体、モディファイア、添加剤を含有するモディファイアを混合することによって、超臨界流体とモディファイアのグラジエントを形成できるように構成された、上記装置。
14. 第２のポンプから送液されたモディファイアと第３のポンプから送液されたモディファイアを合流させる合流部よりも下流に、第１のポンプから送液された超臨界流体と合流させるための合流部が配置されている、請求項１３に記載の装置。
15. 前記分離カラムの下流に配置された、前記分離カラムから溶出した成分を検出する検出器、をさらに備える、請求項１３または１４に記載の装置。
16. 前記検出器の下流に配置された、移動相を回収する容器、をさらに備える、請求項１５に記載の装置。
17. 移動相を回収する容器をさらに備えており、前記検出器および移動相を回収する容器が、前記分離カラムの下流に分配器を介して配置されている、請求項１５に記載の装置。
    

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