JP2022078067A

JP2022078067A - フィロウイルスコンセンサス抗原、核酸構築物及びそれを用いたワクチン、ならびにその使用方法

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Publication number: JP2022078067A
Application number: JP2022019743A
Authority: JP
Inventors: ビー．ウェイナーデイビッド; B Weiner David; パテルアミ; Patel Ami; イェンチエン; Jian Yan
Original assignee: University of Pennsylvania Penn; Wistar Institute of Anatomy and Biology; Inovio Pharmaceuticals Inc
Current assignee: University of Pennsylvania Penn; Wistar Institute of Anatomy and Biology; Inovio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-05-05
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2022-05-24
Also published as: SG11201809780WA; MX2023003934A; US20190153040A1; MX2018013524A; CA3023098A1; AU2017261306A1; AU2017261306B2; JP2019516400A; US11091518B2; JP7029756B2; WO2017192947A1; CN110072536A; BR112018072719A2; US20210388033A1; CN110072536B; SG10202011017RA; EP3452068A4; CN117887735A; EP3452068A1; KR20190037200A

Abstract

【課題】コンセンサスエボラウイルス糖タンパク質免疫原をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸分子及び組成物を開示する。【解決手段】コード配列は、場合により、シグナルペプチドをコードする作動可能な連結コード配列を含む。免疫調節方法及びエボラウイルスに対する免疫応答の誘導方法を開示する。エボラウイルスの予防方法及びエボラウイルスに感染した個体の治療方法を開示する。コンセンサスエボラウイルスタンパク質を開示する。【選択図】図１Ａ－１Ｃ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３３２，３７２号、２０１６年９月３０日に出願された米国仮出願第６２／４０２，５１９号、及び２０１７年４月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／４８３，９７９号の優先権を主張し、その各々を、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。

本発明は、免疫応答を誘導し、フィロウイルス感染を予防し、及び／またはフィロウイルスに感染した、特にエボラウイルスに感染した個体を治療するためのワクチンに関する。本発明は、コンセンサスエボラウイルスタンパク質及びそれをコードする核酸分子に関する。

フィロウイルス科は、２つの異なる属、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）及びエボラウイルス（ＥＢＯＶ）を含む非分節型一本鎖ＲＮＡウイルスである。それぞれのメンバーは、治癒または認可されたワクチンが存在しない、重篤で非常に致命的な出血熱疾患を引き起こす可能性がある（ＢｒａｄｆｕｔｅＳ．Ｂ．，ｅｔａｌ．（２０１１）Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｓ．ＨｕｍＶａｃｃｉｎ７：７０１－７１１；ＦａｌｚａｒａｎｏＤ．，ｅｔａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｆｉｌｏｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｅｖａｌｕａｔｉｎｇｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｕｓｅ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＶａｃｃｉｎｅｓ１０：６３－７７；ＦｉｅｌｄｓＢ．Ｎ．，ｅｔａｌ．（２００７）Ｆｉｅｌｄｓ’ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．２ｖ．（ｘｉｘ，３０９１，Ｉ－３０８６ｐ．）；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＪ．Ｓ．，ｅｔａｌ．（２００９）ＥｎｈａｎｃｅｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙａｎｉｍｐｒｏｖｅｄａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅ．ＰＬｏＳＯｎｅ４：ｅ５３０８；及びＴｏｗｎｅｒＪ．Ｓ．，ｅｔａｌ．（２００６）ＭａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｉｃｓａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈａｌａｒｇｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒｏｕｔｂｒｅａｋｉｎＡｎｇｏｌａ．ＪＶｉｒｏｌ８０：６４９７－６５１６）。

致死率が最大９０％であるため、これらの疾患は、世界保健機関（ＷＨＯ）により、「人類に知られている最も有毒なウイルス性疾患の１つ」と言われている。アメリカ疾病管理予防センターは、それらが兵器利用された場合には国家安全保障への一定程度の潜在的な脅威を有することから、それらを「カテゴリーＡ生物テロリズム兵器」と分類している（ＢｕｒｋｉＴ．Ｋ．（２０１１）ＵＳＡｆｏｃｕｓｅｓｏｎＥｂｏｌａｖａｃｃｉｎｅｂｕｔｒｅｓｅａｒｃｈｇａｐｓｒｅｍａｉｎ．Ｌａｎｃｅｔ３７８：３８９）。これらの「高優先度の」兵器は、理論上容易に伝播し、高い死亡率をもたらし、公衆衛生に多大な影響を与え、パニックを引き起こし、公衆衛生への備えに対して特別な措置を必要とする可能性がある（ＣＤＣ（２０１１）ＢｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍＡｇｅｎｔｓ／Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｔｌａｎｔａ：ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）。

出血熱病は、感染した体液、血液、及び組織との直接接触によって、ヒト及び非ヒト霊長類間で容易に伝播し得るが、保菌状態の存在しない急性感染症である（ＦｅｌｄｍａｎｎＨ．，ｅｔａｌ．（２００３）Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ：ｆｒｏｍｄｉｓｃｏｖｅｒｙｔｏｖａｃｃｉｎｅ．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ３：６７７－６８５）。アウトブレイク発生状況下では、医療機器の再利用、リソースの限られた医療施設、及び時期を逸した予防対策の適用は、疾患の伝播を増大させ、医療環境における感染の増幅を招き得る。

これらの人獣共通感染症の病原体の天然の保菌宿主はアフリカのコウモリとブタである可能性が高く（ＫｏｂｉｎｇｅｒＧ．Ｐ．，ｅｔａｌ．（２０１１）Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｓｈｅｄｄｉｎｇ，ａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＺａｉｒｅｅｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｐｉｇｓ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２０４：２００－２０８）、おそらく後者はいっそう増幅させる宿主であることから、ウイルスがアウトブレイクの開始時に最初に出現する様式は、ヒトが感染動物と接触することによって起こると考えられる。フィリピン、潜在的にヨーロッパ、及び主としてはアフリカにおける、この疾患の予測不能な風土病の出現は、さらなる主要な公衆衛生上の懸念事項である（Ｏｕｔｂｒｅａｋｎｅｗｓ．（２００９）ＥｂｏｌａＲｅｓｔｏｎｉｎｐｉｇｓａｎｄｈｕｍａｎｓ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ．ＷｋｌｙＥｐｉｄｅｍｉｏｌＲｅｃ８４：４９－５０）。

げっ歯類前臨床試験における実験を含む保護効率及び広範なＣＴＬを誘導するためのワクチンの能力を測定するための実験が行われている（ＦｅｎｉｍｏｒｅＰＷ，ｅｔａｌ．（２０１２）．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇａｎｄｔｅｓｔｉｎｇｂｒｏａｄｌｙ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｆｉｌｏｖｉｒａｌｖａｃｃｉｎｅｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｆｏｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｅｐｉｔｏｐｅｃｏｖｅｒａｇｅ．ＰＬｏＳＯＮＥ７：ｅ４４７６９；ＨｅｎｓｌｅｙＬＥ，ｅｔａｌ．（２０１０）．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｒｏｓｓ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｉｍｍｕｎｉｔｙａｇａｉｎｓｔａｎｅｍｅｒｇｉｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥｂｏｌａｖｉｒｕｓＳｐｅｃｉｅｓ．ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ６：ｅｌ０００９０４；ＺａｈｎＲ，ｅｔａｌ（２０１２）．Ａｄ３５ａｎｄａｄ２６ｖａｃｃｉｎｅｖｅｃｔｏｒｓｉｎｄｕｃｅｐｏｔｅｎｔａｎｄｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄＴ－ｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｍｕｌｔｉｐｌｅｆｉｌｏｖｉｒｕｓｓｐｅｃｉｅｓ．ＰＬｏＳＯＮＥ７：ｅ４４１１５；ＧｅｉｓｂｅｒｔＴＷ，ＦｅｌｄｍａｎｎＨ（２０１１）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔＥｂｏｌａａｎｄＭａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２０４Ｓｕｐｐｌ３：Ｓ１０７５－１０８１；及びＧｒａｎｔ－ＫｌｅｉｎＲＪ，ＶａｎＤｅｕｓｅｎＮＭ，ＢａｄｇｅｒＣＶ，ＨａｎｎａｍａｎＤ，ＤｕｐｕｙＬＣ，ＳｃｈｍａｌｊｏｈｎＣＳ（２０１２）．ＡｍｕｌｔｉａｇｅｎｔｆｉｌｏｖｉｒｕｓＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｄｅｌｉｖｅｒｅｄｂｙｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｐｒｏｔｅｃｔｓｍｉｃｅｆｒｏｍｅｂｏｌａａｎｄＭａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｃｈａｌｌｅｎｇｅ．ＨｕｍＶａｃｃｉｎＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ８；Ｇｒａｎｔ－ＫｌｅｉｎＲＪ，ＡｌｔａｍｕｒａＬＡ，ＳｃｈｍａｌｊｏｈｎＣＳ（２０１１）．ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ－ｄｅｒｉｖｅｄｖａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＬａｓｓａｖｉｒｕｓａｎｄｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ．ＶｉｒｕｓＲｅｓ１６２：１４８－１６１）。

ワクチン誘発性適応免疫応答が、多数の前臨床動物モデルに記載されている（ＢｌａｎｅｙＪＥ，ｅｔａｌ．（２０１１）．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｏｒｌｉｖｅ－ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｂｉｖａｌｅｎｔｖａｃｃｉｎｅｓｔｈａｔｃｏｎｆｅｒｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｒａｂｉｅｓａｎｄＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｅｓ．ＪＶｉｒｏｌ８５：１０６０５－１０６１６；ＤｏｗｌｉｎｇＷ，ｅｔａｌ．（２００７）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｎａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｅｂｏｌａｖｉｒｕｓＧＰＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓ．ＪＶｉｒｏｌ８１：１８２１－１８３７；ＪｏｎｅｓＳＭ，ｅｔａｌ．（２００５）．ＬｉｖｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓａｇａｉｎｓｔＥｂｏｌａａｎｄＭａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｅｓ．ＮａｔＭｅｄ１１：７８６－７９０；ＫａｌｉｎａＷＶ，ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ＯｌｉｎｇｅｒＧＧ，ＢａｖａｒｉＳ（２００９）．ＤｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｃｏｍｍｏｎｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎａＢＡＬＢ／ｃｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌ．ＶｉｒｏｌＪ６：１３２；ＫｏｂｉｎｇｅｒＧＰ，ｅｔａｌ．（２００６）．ＣｈｉｍｐａｎｚｅｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔＺａｉｒｅＥｂｏｌａｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３４６：３９４－４０１；ＯｌｉｎｇｅｒＧＧ，ｅｔａｌ．（２００５）．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ－ｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＶｅｎｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃｏｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＪＶｉｒｏｌ７９：１４１８９－１４１９６；ＲａｏＭ，ＢｒａｙＭ，ＡｌｖｉｎｇＣＲ，ＪａｈｒｌｉｎｇＰ，ＭａｔｙａｓＧＲ（２００２）．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｍｉｃｅａｎｄｍｏｎｋｅｙｓｔｏＥｂｏｌａｖｉｒｕｓａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｉｒｒａｄｉａｔｅｄＥｂｏｌａｖｉｒｕｓ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅｒｅｑｕｉｒｅｓＣＤ４（＋）Ｔｃｅｌｌｓ．ＪＶｉｒｏｌ７６：９１７６－９１８５；ＲａｏＭ，ＭａｔｙａｓＧＲ，ＧｒｉｅｄｅｒＦ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＫ，ＪａｈｒｌｉｎｇＰＢ，ＡｌｖｉｎｇＣＲ（１９９９）．ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｔｏＥｂｏｌａＺａｉｒｅｖｉｒｕｓａｒｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｍｉｃｅｂｙｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｌｉｐｏｓｏｍｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌｉｐｉｄＡ．Ｖａｃｃｉｎｅ１７：２９９１－２９９８；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＪＳ，ｅｔａｌ．（２００９）．ＥｎｈａｎｃｅｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙａｎｉｍｐｒｏｖｅｄａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅ．ＰＬｏＳＯｎｅ４：ｅ５３０８；ＶａｎｄｅｒｚａｎｄｅｎＬ，ｅｔａｌ（１９９８）．ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｉｔｈｅｒｔｈｅＧＰｏｒＮＰｇｅｎｅｓｏｆＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｃｔｍｉｃｅｆｒｏｍｌｅｔｈａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２４６：１３４－１４４；ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ｅｔａｌ．（２００５）．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍｏｒａｌａｎｄＣＤ８＋ＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７５：１１８４－１１９１；ＪｏｎｅｓＳＭ，ｅｔａｌ．（２００７）．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆａｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅｂｙｕｓｅｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１９６Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ４０４－４１２Ｇｒａｎｔ－ＫｌｅｉｎＲＪ，ＶａｎＤｅｕｓｅｎＮＭ，ＢａｄｇｅｒＣＶ，ＨａｎｎａｍａｎＤ，ＤｕｐｕｙＬＣ，ＳｃｈｍａｌｊｏｈｎＣＳ（２０１２）．ＡｍｕｌｔｉａｇｅｎｔｆｉｌｏｖｉｒｕｓＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｄｅｌｉｖｅｒｅｄｂｙｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｐｒｏｔｅｃｔｓｍｉｃｅｆｒｏｍｅｂｏｌａａｎｄＭａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｃｈａｌｌｅｎｇｅ．ＨｕｍＶａｃｃｉｎＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ８．；ＧｅｉｓｂｅｒｔＴＷ，ｅｔａｌ．（２０１０）．ＶｅｃｔｏｒｃｈｏｉｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｐｏｔｅｎｃｙｏｆｇｅｎｅｔｉｃｖａｃｃｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔＡｎｇｏｌａＭａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｉｎｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓ．ＪＶｉｒｏｌ８４：１０３８６－１０３９４．）。ウイルスワクチンの有望性が示されてきたが、これらには、主に組換えアデノウイルス及び水疱性口内炎ウイルスが含まれる。組換えＤＮＡ及びＡｇ結合ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンなどの非感染的戦略も、前臨床効果のレベルを実証しており、一般的にウイルスベースのプラットフォームよりも安全であると考えられている。ウイルス特異的抗体は、受動的に投与すると、感染前または感染直後のいずれかにおいて投与した場合に保護的であり得る（ＧｕｐｔａＭ，ＭａｈａｎｔｙＳ，ＢｒａｙＭ，ＡｈｍｅｄＲ，ＲｏｌｌｉｎＰＥ（２００１）．ＰａｓｓｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｒｏｔｅｃｔｓｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔａｎｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅａｇａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｏｕｔｃｏｍｐｌｅｔｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ＪＶｉｒｏｌ７５：４６４９－４６５４；ＭａｒｚｉＡ，ｅｔａｌ．（２０１２）．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎａｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｍｏｄｅｌｏｆＥｂｏｌａｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒ．ＰＬｏＳＯＮＥ７：ｅ３６１９２；ＰａｒｒｅｎＰＷ，ＧｅｉｓｂｅｒｔＴＷ，ＭａｒｕｙａｍａＴ，ＪａｈｒｌｉｎｇＰＢ，ＢｕｒｔｏｎＤＲ（２００２）．Ｐｒｅ－ａｎｄｐｏｓｔｅｘｐｏｓｕｒｅｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓｏｆＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎａｎａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｂｙｐａｓｓｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆａｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｙ．ＪＶｉｒｏｌ７６：６４０８－６４１２；ＱｉｕＸ，ｅｔａｌ．（２０１２）．ＥｂｏｌａＧＰ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＰｒｏｔｅｃｔＭｉｃｅａｎｄＧｕｉｎｅａＰｉｇｓｆｒｏｍＬｅｔｈａｌＥｂｏｌａＶｉｒｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳＮｅｇｌＴｒｏｐＤｉｓ６：ｅｌ５７５；ＷｉｌｓｏｎＪＡ，ｅｔａｌ．（２０００）．Ｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍＥｂｏｌａｖｉｒｕｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７：１６６４－１６６６；ＳｕｌｌｉｖａｎＮＪ，ｅｔａｌ．（２０１１）．ＣＤ８（＋）ｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｉｔｙｍｅｄｉａｔｅｓｒＡｄ５ｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓ．ＮａｔＭｅｄ１７：１１２８－１１３１；ＢｒａｄｆｕｔｅＳＢ，ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ＢａｖａｒｉＳ（２００８）．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣＤ８＋ＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｌｅｔｈａｌＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８０：４０５８－４０６６；ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ＯｌｉｎｇｅｒＧＧ（２０１１）．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｒｏｌｅｏｆｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎｆｉｌｏｖｉｒｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒ．ＪＢｉｏｍｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１１：９８４２４１）。Ｔ細胞はまた、ノックアウトマウスで行われた試験、ＮＨＰにおける枯渇試験、及び養子移入したＣＤ８＋Ｔ細胞の溶解機能に効力が大きく関連するマウス養子移入試験に基づく保護を提供することも示されている。しかしながら、保護ワクチンによって引き起こされるこの応答の詳細な解析はほとんど報告されていない。

対応策の開発には、最終的に、保護免疫相関と、感染時にそれらをいかにして調節するかについての理解の向上が必要となる。これは、フィロウイルス疾患に罹患した感染者が早期の免疫応答を達成できない場合には困難であることが証明されている。これらの急速な出血性疾患は、ウイルス特異的Ａｂ応答の欠如及び総Ｔ細胞数の大幅な減少によって示されるように、免疫調節不全をもたらし、制御不能なウイルス複製及び多臓器感染及び障害をもたらす。逆に、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）疾患の生存者は、早期かつ一時的なＩｇＭ応答を示し、続いて迅速にウイルス特異的ＩｇＧ及びＣＴＬのレベルが上昇する。これらの所見は、体液性及び細胞性の免疫応答が疾患に対する保護を付与する役割を果たすことを示唆している。これらのデータは、致死的攻撃に対する保護へのワクチン誘発性適応免疫の寄与を実証する、多数の前臨床有効性試験によっても支持されている。しかしながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的表現型に効力が大きく関連する保護の提供において、Ｔ細胞が重要な役割を果たしているとのエビデンスが数多く示されている。これらの最近の研究は、保護を提供する上でのＴ細胞の重要性を強調しているものの、それらの正確な寄与は未だ特徴付けられておらず、議論の余地が残されている。さらに、保護ワクチンによるこの応答の詳細な解析はほとんど報告されていない。

第１コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原（ＺＥＢＯＶＣＯＮ）をコードする１つ以上の核酸配列、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原（ＺＥＢＯＶＣＯＮ２）をコードする核酸、またはＺＥＢＯＶギニア２０１４アウトブレイクエンベロープ糖タンパク質免疫原（ＺＥＢＯＶＧＵＩ）をコードする核酸を含む単離された核酸分子を提供する。

一実施形態では、ＺＥＢＯＶＣＯＮには、配列番号１と少なくとも９５％相同なアミノ酸配列、配列番号１と少なくとも９５％相同なアミノ酸配列の断片、配列番号１と少なくとも９９％相同なアミノ酸配列、配列番号１と少なくとも９９％相同なアミノ酸配列の断片、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１の断片が含まれる。

一実施形態では、ＺＥＢＯＶＣＯＮ２には、配列番号６８と少なくとも９５％相同なアミノ酸配列、配列番号６８と少なくとも９５％相同なアミノ酸配列の断片、配列番号６８と少なくとも９９％相同なアミノ酸配列、配列番号６８と少なくとも９９％相同なアミノ酸配列の断片、配列番号６８のアミノ酸配列、または配列番号６８の断片が含まれる。

一実施形態では、ＺＥＢＯＶＧＵＩには、配列番号６７と少なくとも９５％相同なアミノ酸配列、配列番号６７と少なくとも９５％相同なアミノ酸配列の断片、配列番号６７と少なくとも９９％相同なアミノ酸配列、配列番号６７と少なくとも９９％相同なアミノ酸配列の断片、配列番号６７のアミノ酸配列、または配列番号６７の断片が含まれる。

いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも６００個のアミノ酸、少なくとも６３０個のアミノ酸、または少なくとも６６０個のアミノ酸を含む。

一実施形態では、ＺＥＢＯＶＣＯＮをＩｇＥシグナルペプチドに連結させる。一実施形態では、ＺＥＢＯＶＣＯＮ２をＩｇＥシグナルペプチドに連結させる。一実施形態では、ＺＥＢＯＶＧＵＩをＩｇＥシグナルペプチドに連結させる。

一実施形態では、ＺＥＢＯＶＣＯＮをコードする核酸には、配列番号６９と少なくとも９５％相同な核酸配列、またはその断片が含まれる。一実施形態では、ＺＥＢＯＶＧＵＩをコードする核酸には、配列番号７２と少なくとも９５％相同な核酸配列、またはその断片が含まれる。一実施形態では、ＺＥＢＯＶＣＯＮ２をコードする核酸には、配列番号７０と少なくとも９５％相同な核酸配列、またはその断片が含まれる。

一実施形態では、ＺＥＢＯＶＣＯＮをコードする核酸には、配列番号６９と少なくとも９５％相同なＤＮＡ配列またはその断片から転写された核酸が含まれる。一実施形態では、ＺＥＢＯＶＧＵＩをコードする核酸には、配列番号７２と少なくとも９５％相同なＤＮＡ配列またはその断片から転写された核酸が含まれる。一実施形態では、ＺＥＢＯＶＣＯＮ２をコードする核酸には、配列番号７０と少なくとも９５％相同なＤＮＡ配列またはその断片から転写された核酸が含まれる。

また、ＺＥＢＯＶＣＯＮ、ＺＥＢＯＶＣＯＮ２及びＺＥＢＯＶＧＵＩの１つ以上をコードする１つ以上の核酸配列を含む組成物も提供する。一実施形態では、組成物は、ＺＥＢＯＶＣＯＮ、ＺＥＢＯＶＣＯＮ２及びＺＥＢＯＶＧＵＩの２つ以上をコードする２つ以上の核酸配列を含む。一実施形態では、組成物は２つの核酸分子を含む。一実施形態では、組成物は、ＺＥＢＯＶＣＯＮ、ＺＥＢＯＶＣＯＮ２及びＺＥＢＯＶＧＵＩをコードする３つ以上の核酸配列を含む。一実施形態では、組成物は、３つの核酸分子を含む。

本発明はまた、哺乳類細胞またはウイルスベクターにおいて免疫原を産生するための新規配列を提供する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、及びマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物を提供する。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶＣＯＮ）、配列番号１の断片、配列番号１と相同なアミノ酸配列、または配列番号１と相同なアミノ酸配列の断片を含む。配列番号１と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号１に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号１の断片または配列番号１と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３０残基以上、または６６０残基以上のアミノ酸である。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶＣＯＮ）、配列番号２の断片、配列番号２と相同なアミノ酸配列、または配列番号２と相同なアミノ酸配列の断片を含む。配列番号１と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号２に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号２の断片または配列番号２と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３０残基以上、または６６０残基以上のアミノ酸である。マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号３（ＭＡＲＶＡＮＧ）、配列番号３の断片、配列番号３と相同なアミノ酸配列、または配列番号３と相同なアミノ酸配列の断片であってもよい。配列番号３と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号３に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号３の断片または配列番号３と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３７残基以上、または６７０残基以上のアミノ酸である。アミノ酸配列は、場合により、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含んでいてもよい。

また、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、マールブルグマールブルグウイルス第１コンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、マールブルグマールブルグウイルス第２コンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、及びマールブルグマールブルグウイルス第３コンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物も提供する。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶＣＯＮ）、配列番号１の断片、配列番号１と相同なアミノ酸配列または配列番号１と相同なアミノ酸配列の断片であってもよい。配列番号１と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号１に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号１の断片または配列番号１と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３０残基以上、または６６０残基以上のアミノ酸である。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶＣＯＮ）、配列番号２の断片、配列番号２と相同なアミノ酸配列、または配列番号２と相同なアミノ酸配列の断片であってもよい。配列番号１と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号２に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号２の断片または配列番号２と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３０残基以上、または６６０残基以上のアミノ酸である。マールブルクマールブルウイルスの第１コンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号４（ＭＡＲＶＲＡＶ）、配列番号４の断片、配列番号４と相同なアミノ酸配列、または配列番号４と相同なアミノ酸配列の断片であってもよい。配列番号４と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号４に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号４の断片または配列番号４と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３７残基以上、または６７０残基以上のアミノ酸である。マールブルグマールブルグウイルス第２コンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号５（ＭＡＲＶＯＺＯ）、配列番号５の断片、配列番号５と相同なアミノ酸配列、または配列番号５と相同なアミノ酸配列の断片であってもよい。配列番号５と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号４に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号５の断片または配列番号５と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３７残基以上、または６７０残基以上のアミノ酸である。マールブルグマールブルグウイルス第３コンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号６（ＭＡＲＶＭＵＳ）、配列番号６の断片、配列番号６と相同なアミノ酸配列、または配列番号６と相同なアミノ酸配列の断片であってもよい。配列番号６と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号６に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号６の断片または配列番号６と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３７残基以上、または６７０残基以上のアミノ酸である。アミノ酸配列は、場合により、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列をさらに含む。マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号３（ＭＡＲＶＡＮＧ）、配列番号３の断片、配列番号３と相同なアミノ酸配列、または配列番号３と相同なアミノ酸配列の断片であってもよい。配列番号３と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号３に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号３の断片または配列番号３と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３７残基以上、または６７０残基以上のアミノ酸である。アミノ酸配列は、場合により、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含んでいてもよい。

また、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、及びコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物も提供する。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶＣＯＮ）、配列番号１の断片、配列番号１と相同なアミノ酸配列、または配列番号１と相同なアミノ酸配列の断片であってもよい。配列番号１と相同なアミノ酸配列は、一般的には、配列番号１に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号１の断片または配列番号１と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３０残基以上、または６６０残基以上のアミノ酸である。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶＣＯＮ）、配列番号２の断片、配列番号２と相同なアミノ酸配列、または配列番号２と相同なアミノ酸配列の断片であってもよい。配列番号１と相同なアミノ酸配列は、一般的には配列番号２に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号２の断片または配列番号２と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、６００残基以上、６３０残基以上、または６６０残基以上のアミノ酸である。アミノ酸配列は、場合により、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含んでいてもよい。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、及びマーブルグマーブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物を提供する。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列は、配列番号６４、配列番号６４の断片、配列番号６４と相同な核酸配列、または配列番号６４と相同な核酸配列の断片であってもよい。配列番号６４と相同な核酸配列は、一般的には、配列番号６４に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号６４の断片、または配列番号６４と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、配列番号６４によってコードされる６００残基以上、６３０残基以上、または６６０残基以上のコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列は、配列番号６５、配列番号６５の断片、配列番号６５と相同な核酸配列、または配列番号６５と相同な核酸配列の断片を含む。配列番号６５と相同な核酸配列は、一般的には、配列番号６５に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号６５の断片または配列番号６５に対して相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、配列番号６５によってコードされる６００残基以上、６３０残基以上、または６６０残基以上のコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸をコードする。マーブルグマーブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列は、配列番号６６、配列番号６６の断片、配列番号６６と相同な核酸配列、または配列番号６６と相同な核酸配列の断片であってもよい。配列番号６６と相同な核酸配列は、一般的には、配列番号６６に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号６６の断片または配列番号６６と相同なアミノ酸配列の断片は、一般的には、配列番号６６によってコードされる６００残基以上、６３０残基以上、または６７０残基以上のマーブルグマーブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸をコードする。核酸配列は、場合により、免疫原をコードする配列に連結したＩｇＥリーダーなどのリーダー配列をコードする配列を含む場合がある。

異なる核酸配列の各々は、単一の核酸分子上にあってもよく、それぞれが別個の核酸分子上に、または様々な順列で存在してもよい。核酸分子は、プラスミドであってもよい。

組成物を、電気穿孔法を用いた個体への送達のために製剤化してもよい。

組成物は：ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２８からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み得る。

組成物は、フィロウイルスに対する免疫応答を誘導する方法において使用してもよい。フィロウイルスは：マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン及びエボラウイルス・ザイールからなる群から選択され得る。

個体に治療有効量の組成物を投与することを含む、フィロウイルスと診断された個体の治療方法を提供する。フィロウイルスは、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン及びエボラウイルス・ザイールからなる群から選択され得る。

個体におけるフィロウイルス感染の予防方法を提供する。方法は、予防有効量の組成物を個体に投与することを含む。フィロウイルスは、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン及びエボラウイルス・ザイールからなる群から選択され得る。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルクマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルクマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルクマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原からなる群から選択される２つ以上のタンパク質を含む組成物を提供する。

実施例１における多価ワクチン構築戦略及び発現実験を示す。ＭＧＰ（上）、ＳＧＰ（右下）、及びＺＧＰ（左下）の系統樹を示す。ブートストラップ解析によって検証されるように、有意なサポート値を示す（^＊）。ＺＧＰ及びＳＧＰ免疫原（ＣＯＮＶＡＣＣＩＮＥ）に対して、コンセンサス戦略を採用した。スケールバーは部位当たりのアミノ酸の距離を示し、分析はＭＥＧＡバージョン５ソフトウェアを用いて行った。ＧＰ導入遺伝子を商業的に合成し、遺伝子最適化を行い、改変ｐＶＡＸ１哺乳類発現ベクターにサブクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質移入後、ウエスタンイムノブロッティング及びＦＡＣＳによって抗原発現を分析した。ウエスタンイムノブロッティングの結果を図１Ｂに示し、そしてＦＡＣＳの結果を図１Ｃに示す。比較対照として、ＭＧＰ、ＳＧＰ、またはＺＧＰを発現するｒＶＳＶを各ＧＰ試料と同時に実施し、種特異的抗ＧＰ１ｍＡｂを検出に使用した。サイズを（ｋＤａ）で示す。ＦＡＣＳの結果を図１Ｃに示す。ＦＡＣＳについては、形質移入した細胞を、マウス由来ＧＰ特異的血清試薬で間接的に染色し、続いて広範な洗浄及びヤギ抗マウスＩｇＧ及びＭＨＣクラスＩで染色した。ウエスタンイムノブロッティング及びＦＡＣＳ実験は少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。無根系統樹の有意性は最尤法によって判定し、ブートストラップ解析によって検証し、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウェアによって有意な支持値（≧８０％；１，０００回のブートストラップ反復）を決定した。ＭＡＲＶ及びＺＥＢＯＶチャレンジに対する完全な保護が観察された実施例１の実験の結果を示す。動物の生存データを図２Ａ及び図２Ｅに示す。図２Ａは、３価ワクチン接種動物がＭＡＲＶチャレンジ後に生存し、一方、対照動物はすべて１０日目までに死亡したことを示す。図２Ｅは、３価ワクチン接種動物がＺＥＢＯＶチャレンジ後に生存し、対照動物はすべて７日目までに死亡したことを示す。ワクチン接種に対してＭＡＲＶでチャレンジした場合の、ワクチン接種動物及び対照動物に対する体重変化率のデータを図２Ｂに示す。ｙ軸は、図２Ｆに示すように、体重の変化を示す。明るい実線は３価ワクチン接種動物を示す。明るい破線は、三価ワクチン接種動物の平均結果であるＴｒｉＡＶＥを示す。暗い実線は対照動物を示す。暗い破線は対照動物の平均結果であるＣｏｎｔｒｏｌＡＶＥを示す。明るい実線及び明るい破線は、チャレンジ後の日にグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種動物間で有意な体重減少を示していない。ダガーで終了するチャレンジ後の０～９日目のグラフの暗い実線及び黒い破線は、１０日目までに疾患により死亡した動物を示す。ワクチン接種に対してＺＥＢＯＶでチャレンジした場合の、ワクチン接種動物及び対照動物に対する体重変化率のデータを図２Ｆに示す。ｙ軸は、体重の変化を％で示す。明るい実線は３価ワクチン接種動物を示す。明るい破線は３価ワクチン接種動物の平均結果であるＴｒｉＡＶＥを示す。暗い実線は対照動物を示す。暗い破線は対照動物の平均結果であるＣｏｎｔｒｏｌＡＶＥを示す。明るい実線及び明るい破線は、チャレンジ後の日にグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種動物間で有意な体重減少を示さなかった。ダガーで終了するチャレンジ後の０～６日目のグラフの暗い実線及び黒い破線は、８日目までに疾患により死亡した動物を示す（ｇｐＭＡＲＶについてはｎ＝３、ｇｐＺＥＢＯＶについてはｎ＝６）。第１回（１×）及び第２回（２×）の予防接種前及び接種後のワクチン接種動物由来血清中の結合Ａｂｓ（図２Ｃ及び図２Ｇ）、及びＮＡｂｓ（図２Ｄ及び図２Ｈ）を測定した。分析はプールした血清において実施した。^＊ｐ＜０．１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。中和抗体の誘導を示す実施例１の結果を示す。４０μｇのＥ－ＤＮＡワクチン接種の間に３週間間隔を空けた２回のワクチン接種のそれぞれ２０日後に、マウス（ｎ＝５／群）においてＢ細胞応答を評価した。図３Ａは、ワクチン接種した（実線）マウスまたはプレブレッド（点線）マウス由来血清ＧＰ特異的ＩｇＧ応答をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す。データを図３Ｂにまとめた。本試験にＳＧＰが利用できなかったため、ｐＥＢＯＳ及びｐＥＢＯＺで免疫した動物からのすべての応答を、スクロース精製ＺＧＰに対して測定した。ｐＭＡＲＶ免疫マウスのＩｇＧ応答をＭＡＲＶ－オゾリンＧＰまたは陰性対照スクロース精製ニパＧタンパク質で測定した。血清試料の中和活性を、ＢＳＬ－４施設で、ＺＥＢＯＶ－ＥＧＦＰ、ＳＵＤＶ－ボニファス及びＭＡＲＶ－アンゴラに対して測定し、ＮＡｂ力価を図３Ｃに示す。ＳＵＤＶ－ボニファスに対するＮＡｂｓを、ＣＶ－１細胞に対する細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づいてアッセイし、ＭＡＲＶ－アンゴラに対するＮＡｂｓを、免疫蛍光アッセイを用いてアッセイした。平均を図３Ｂ及び３Ｃ中に示し、エラーバーはＳＥＭを表す。整合両側独立ｔ検定によって、グループの分析を完了した。実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。^＊ｐ＜０．１；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１。ワクチン接種によって生成した広範なＴ細胞応答を示す。ｐＭＡＲＶ、ｐＥＢＯＳまたはｐＥＢＯＺＤＮＡのいずれかを用いてＨ－２^ｂ（明るいバー）及びＨ－２^ｄ（暗いバー）マウス（ｎ＝５／群）を２回免疫化し、ＩＦＮγ応答をＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。２回目の免疫化の８日後に採取した脾細胞を、個々のＧＰペプチド（９アミノ酸がオーバーラップする１５量体）の存在下でインキュベートし、結果を積み重ね棒グラフで示す。フローサイトメトリーによって確認し、総活性化ＩＦＮγ＋及びＣＤ４４＋ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞（表１～６）の集団を特徴とするエピトープ含有ペプチドを同定し（≧１０ＡＶＥスポット及び≧８０％応答率）、正の誘導物質のペプチド番号をバーの上に示す。ＣＤ４＋エピトープのみ、ＣＤ８＋エピトープのみ（^＊）、及び二重ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エピトープ（^＊＊）を含むペプチドには番号が付けられている。推定上の共有及び／または部分エピトープを、連続した陽性ペプチド応答について調べた（表１～６）。図４Ｂは、ワクチン接種によって生成した広範なＴ細胞応答を示す。図１Ａに示すＭＡＲＶ、ＳＵＤＶ、及びＺＥＢＯＶウイルス由来のＧＰ配列を比較するアミノ酸類似性プロットを示す。図４Ｃは、ワクチン接種によって生成した広範なＴ細胞応答を示す。ＺＥＢＯＶＧＰ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＶＧＰ＿ＥＢＯＺＭ）内の推定ドメインを示す図である。ＳＰ、シグナルペプチド；ＲＢ、受容体結合；ＭＵＣ、ムチン様領域；ＦＣ、フリン切断部位；ＴＭ、膜貫通領域。図４Ｄにおいて、ワクチン接種によって生成した広範なＴ細胞応答を示す。各準優位（濃い影）及び免疫優性（薄い影）Ｔ細胞エピトープ応答を、各ワクチンによって生成した全ＩＦＮγ応答の割合として示す。実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。保護「単回投与」ワクチン接種誘発性中和Ａｂ及びＣＴＬを評価する実験からのデータを示す。Ｈ－２^ｋマウス（ｎ＝１０／群）を、ｐＥＢＯＺＥ－ＤＮＡを用いて筋肉内に１回ワクチン接種し、次いで２８日後にＢＳＬ－４施設でｍＥＤＢＯＶ１，０００ＬＤ_５０をチャレンジした。マウスの体重を毎日測定し、疾患の進行をモニタリングした。図５Ａの動物生存データ。ワクチン接種した動物はチャレンジを生き延びたが、対照動物は７日目までに死亡した。図５Ｂはチャレンジした動物における体重変化率のデータを示す。免疫した動物由来のデータを実線で示し；免疫した動物の平均データを破線で示す。対照動物由来のデータを実線で示し；対照動物の平均データを破線で示す。明るい実線及び明るい破線は、チャレンジ後の日のグラフ上で約８５％～１２０％の範囲内で安定したままであり、ワクチン接種した動物の間で有意な体重減少を示していない。ダガーで終了するチャレンジ後の０～６日目のグラフの暗い実線及び暗い破線は、７日目までに疾患により死亡した動物を示す。チャレンジ前に測定したＮａｂｓ；図５Ｃに示すデータ。ＦＡＣＳによって測定される単一のｐＥＢＯＺ免疫化後のＴ細胞応答を、図５Ｄの全ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋（暗い）またはＣＤ８＋（明るい）細胞のＡＶＥ％としてまとめる。Ｔ_ｈ１型エフェクターマーカーを評価し（ＴＮＦ及びＴ－ｂｅｔ）、ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のデータを、以下のような全Ｔ細胞データと比較した：総細胞について：ＴＮＦ２．９±０．８、Ｔｂｅｔ１３．０±１．１。ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞の場合：ＴＮＦ６１．４±３．１、Ｔｂｅｔ７２．６±２．０。ＣＤ８＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞について：ＴＮＦ３３．０±３．３、Ｔｂｅｔ９９２．１±１．４（^＊ｐ＜０．１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。整合両側独立ｔ検定によって、グループの分析を完了し、生存曲線を対数ランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって分析した。実験を２回繰り返し、同様の結果を得た。エラーバーはＳＥＭを表す。実施例１で開示したＧＰ特異的Ｔ細胞ゲーティングを示す。実施例１のワクチン接種実験がロバストなＴ細胞を生成したことを示す。実施例１で開示した「単回投与」ワクチン接種によるＴ細胞誘導を示す。エボラに対するワクチン接種戦略を示す。エボラウイルス性糖タンパク質はワクチンの主要な標的である。現在、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において保護性の免疫原性であり、単回投与保護を有する３つのワクチンが現在臨床試験中である。しかしながら、これらのワクチンは、抗ベクター免疫を発達させ、ヒト臨床試験において有害反応を示し、記憶応答の持続時間が不確定であり、すべての集団に適していない可能性がある。実施例７におけるＥＢＯＶ糖タンパク質ワクチン構築及び製剤戦略及び発現実験を示す。マウスにおいて免疫原性であるＤＮＡワクチンの単回免疫化を示す実施例７の実験結果を示す。マウスにおける致死的なマウス適合エボラウイルスチャレンジに対して、単一の免疫感作が完全に保護的であることを示す実施例７の結果を示す。実施例７の結果を示し、個々のＧＰＤＮＡワクチン構築物がマウスにおいて強い記憶応答を誘導することを示す。非ヒト霊長類におけるＧＰＤＮＡワクチンの有効性を示す実施例７の結果を示す。ＧＰＤＮＡワクチン製剤がＮＨＰにおいて免疫原性であることを示す実施例７の結果を示す。ＧＰＤＮＡ製剤ワクチンが致死的なザイールエボラウイルス（Ｍａｋｏｎａ）チャレンジに対して保護することを示す実施例７の結果を示す。ＥＢＯＶ－００１第Ｉ相臨床（ＮＣＴ０２４６４６７０）試験戦略を示す。第Ｉ相臨床試験におけるＥＢＯＶ－００１抗体陽転を示す実施例７の結果を示す。代表的な患者におけるエボラＧＰ特異的Ｔ細胞応答（ＥＬＩＳｐｏｔ）の誘導を示す実施例７の結果を示す。現在臨床試験中の他のエボラワクチンプラットフォームとの比較を示す実施例７の結果を示す。実施例８のＥＬＩＳＡ実験についてのコホートの説明及びコホートの対象者属性を示す。コホートによるＥＬＩＳＡ力価及びコホート１～３の時間点を示す実施例８の結果を示す。コホート別のＥＬＩＳＡ力価及びコホート４及び５の時間点を示す実施例８の結果を示す。すべてのコホートについてのＥＬＩＳＡ要約を示す実施例８の結果を示す。実施例８のＥＬＩＳｐｏｔ実験のコホートの説明及びコホートの対象者属性を示す。コホート１のペプチドプールによる被験者応答を示す実施例８の結果を示す。コホート２のペプチドプールによる被験者応答を示す実施例８の結果を示す。コホート３のペプチドプールによる被験者応答を示す実施例８の結果を示す。コホート４のペプチドプールによる被験者応答を示す実施例８の結果を示す。コホート５のペプチドプールによる被験者応答を示す実施例８の結果を示す。コホートによるＥＬＩＳｐｏｔの要約を示す実施例８の結果を示す。コホートによるＥＬＩＳｐｏｔの要約を示す実施例８の結果を示す。すべての被験者に対するワクチン応答者の分析を示す実施例８の結果を示す。ベースライン異常値を除去した被験者に対するワクチン応答者の分析を示す実施例８の結果を示す。実施例８のＩＣＳ実験のコホートの説明及びコホートの対象者属性を示す。ＩＣＳ実験のコホートに基づくＷｉｌｃｏｘｏｎ対分析を示す実施例８の結果を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるコホート３（ＩＮＯ４２０１ＩＤ）サイトカインのＩＣＳ分析を示す実施例８の結果を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるコホート３サイトカインのＩＣＳ分析を示す実施例８の結果を示す。コホート１～３における各被験者についてのワクチン応答者の詳細な分析を示す実施例８の結果を示す。コホート４～５における各被験者についてのワクチン応答者の詳細な分析を示す実施例８の結果を示す。コホート及びプールによる中央値応答を示す実施例８の結果を示す。コホート及びプールによる平均応答を示す実施例８の結果を示す。二価及び三価ＤＮＡワクチンが、カニクイザルにおけるｉｎｖｉｖｏでの長期間の免疫応答を誘発することを示す結果を示す。血清及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、各ＤＮＡ注射の２週間後に採取し、最終注射後に毎月採取した。ギニアＧＰ及びメイインガＧＰに対する全ＩｇＧ終点力価をＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＤＮＡ免疫後のエボラＧＰに対する細胞性免疫応答。ＰＭＢＣをＮＨＰから回収し、ＧＰペプチドのプールによる刺激後にＴ細胞応答についてＥＬＩＳＰＯＴ－ＩＦＮγによってアッセイした。致死的ＥＢＯＶチャレンジに対する二価及び三価ＤＮＡワクチンによるカニクイザルにおける保護を示す結果を示す。（図４４Ａ）：生存。動物に１０００ＴＣＩＤ５０の致死的なギニア・マコーナＣ０７ＥＢＯＶをチャレンジし、チャレンジ後２８日間生存をモニタリングした。（図４４Ｂ）：臨床スコア。感染の経過を通じて、疾患の臨床的徴候をモニタリングした。（図４４Ｃ）：ウイルス負荷。感染過程におけるウイルス血症を、血液からのＴＣＩＤ５０アッセイによってアッセイした。ＡＤＩヒト抗ザイールエボラウイルス糖タンパク質ＩｇＧキットを用いて、試験開始時及び各免疫化の２週間後に各ワクチン接種被験体の血清中のＺＥＢＯＶ特異的ＩｇＧ抗体の量を評価する定量ＥＬＩＳＡを示す。統計解析は、両側ウィルコクソン符号順位検定を用いて行った。インターフェロンγＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す。試験登録時及び各免疫の２週間後に、ワクチン接種した被験体からＰＢＭＣを単離し、ＩＦＮｇＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、全長ＧＰにわたるエボラペプチドで刺激した。グラフは、１００万個のＰＢＭＣ当たりのＥＢＯＶ－ＧＰ特異的スポット形成単位を表す。ボックス内の線は応答の中央値を表す。個々のドットは異常値データを表す。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるエボラＧＰＤＮＡワクチン製剤による長期間の免疫原性を示す実験結果を示す。ワクチン接種後６か月以上にわたって強力な抗体応答が観察される。ＥＢＯＶＧＰＤＮＡワクチンの筋肉内送達の記憶試験を示す。ＮＨＰを、２価または３価のＥＢＯＶＧＰＤＮＡワクチン製剤で３か月間にわたって免疫化した。免疫応答を、最終投与後１２か月にわたって追跡した。１３か月目に１年間の追加免疫を行った。３価ＤＮＡＧＰ製剤を投与した動物の全ＩｇＧ終点力価を示す。１年間の追加免疫後に全ＩｇＧ抗体応答の増加が観察された。２価または３価のＤＮＡＧＰ製剤を投与した動物の全ＩｇＧ終点力価を示す。１年間の追加免疫後に全ＩｇＧ抗体応答の増加が観察された。３価ＤＮＡＧＰ製剤のＥＬＩＳＰＯＴを示す。１年間の追加投与後のＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ反応の増加。追加免疫の強さは３注射群ほど高くはない。２価または３価ＤＮＡＧＰ製剤のＥＬＩＳＰＯＴを示す。１年間の追加投与後のＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ反応の増加。単一の免疫化群において非常に強力な追加免疫を行った。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴの結果の要約を示す。追加免疫後、１７／１９匹の動物がＴ細胞応答を増加させた。１／１９の動物が同レベルのＴ細胞応答を維持した。１／１９の動物は追加免疫後のＴ細胞反応が悪かったが、この動物は３注射群において過去１年間にわたって一貫して高かった。１年間の追加免疫前の１２か月の時点での単一免疫群の動物についての例示的なＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴを示す。１年間の追加免疫後の単一免疫群の動物についての例示的なＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴを示す。ＩＭ記憶試験の結果を示す。ＥＢＯＶＧＰＤＮＡワクチンは、長期免疫応答を誘発し、１年間の追加免疫後に強いリコールを伴う。皮内送達試験を行い、皮内ＥＢＯＶＧＰＤＮＡワクチンの免疫応答を試験する。ＥＢＯＶＤＮＡワクチン臨床試験（ＥＢＯＶ－００１）の概要を示す。健康なボランティアに、ＩＮＯ－４２０１、ＩＮＯ－４２０２、ＩＮＯ－４２１２またはＩＮＯ－４２１２及びＩＮＯ－９０２１の３回投与レジメンを適用する。ＥＢＯＶ－００１とｒＶＳＶＥＢＯＶの結合抗体の比較を示す。すべてのＥＢＯＶ－００１コホートは、第０週と比較して第６週及び第１４週の両方で有意な増加を示した。ＥＢＯＶＧＰＤＮＡワクチン試験の皮内送達の概要を示す。コホートを添加して、投与、投与レジメン、及び免疫アジュバントとしてのＩＬ－１２ＤＮＡの使用を検討した。１４週目のＩＤコホートの結果を示す。すべてのＩＤコホートにおいて、１２５／１２７（９８．４％）の被験者において、血清反応性が観察された。

好ましい実施形態の詳細な説明
本発明の一態様において、コンセンサス抗原は、以下を１つ以上有することを含む、転写及び翻訳の改善を提供することが望ましい：転写を増加させる低ＧＣ含量リーダー配列；ｍＲＮＡ安定性及びコドン最適化；可能なシス作用配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の除去。

本発明のいくつかの態様では、以下の１つ以上を有することを含む、複数の株にわたる広範な免疫応答を生成するコンセンサス抗原を生成することが望ましい：すべての利用可能な全長配列を組み込み；コンピュータは、各位置で最も一般的に生じるアミノ酸を利用する配列を生成し；菌株間の交差反応性を増加させる。

フィロウイルス科間の多様性は比較的高い。最も高いヒト死亡率をもたらす複数の種に対して理想的に保護する普遍的かつ広範な反応性のフィロウイルスワクチンを開発することを目指して集中的な努力がなされてきた。しかしながら、これはフィロウイルス科の多様性が相対的に高いため困難であることが判明している。ＥＢＯＶは現在、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）、レストンエボラウイルス（ＲＥＳＴＶ）、ブンディブギョエボラウイルス（ＢＤＢＶ）及びタイフォレストエボラウイルス（ＴＡＦＶ；以前はコートジボワールエボラウイルス）の５つの異なる種に分類され、最初の２つは最も高い致死率と兵器化される最も高い可能性を有する候補となっている。マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）の間の多様性は低く、また、最大９０％の致死性に及ぶ可能性もある。現在は、１つの分類種、マールブルグマールブルグウイルス（旧ビクトリア湖マールブルグウイルス）しか存在しないが、最近の改正では、ラビンウイルス（ＲＡＶＶ）を含む２種類のウイルスを含めることが提案されている。多価ワクチン開発の複雑さに加えて、ＭＡＲＶ及びＥＢＯＶは高度に多様であり、ヌクレオチドレベルで約６７％の多様性が存在する。さらに、フィロウイルスＧＰの系統多様性も非常に高い（全体的に８２％）。これらは、２００７年のＢＤＢＶの最近の出現によって示されるように、フィロウイルスの進化の可能性を示唆している。したがって、フィロウイルス科間に相対的な多様性が存在するため、効果的な多価フィロウイルスワクチンの開発には、免疫原性の成分を混合する必要があるように思われる。

マールブルグマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、及びスーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）に対する合成多価フィロウイルスＤＮＡワクチンを開発した。新規多価フィロウイルスワクチンは、多剤アプローチを採用し、マールブルグマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）またはザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）のエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子をコードする３種類のＤＮＡプラスミドで構成される。フィロウイルスワクチン候補として、ＤＮＡ（ＤＮＡ）ベースの強化されたプラットフォームは、遺伝子最適化及び送達技術の進歩により、多くの利点を示す（ＢａｇａｒａｚｚｉＭＬ，ｅｔａｌ．（２０１２）．ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙＡｇａｉｎｓｔＨＰＶ１６／１８ＧｅｎｅｒａｔｅｓＰｏｔｅｎｔＴＨ１ａｎｄＣｙｔｏｔｏｘｉｃＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅｓ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ４：１５５ｒａｌ３８；ＫｅｅＳＴ，ＧｅｈｌＪ，Ｗ．ＬＥ（２０１１）．ＣｌｉｎｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓｏｆＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ．；ＨｉｒａｏＬＡ，ｅｔａｌ．（２０１１）．ＭｕｌｔｉｖａｌｅｎｔｓｍａｌｌｐｏｘＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｄｅｌｉｖｅｒｅｄｂｙｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｄｒｉｖｅｓｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓａｇａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌｍｏｎｋｅｙｐｏｘｃｈａｌｌｅｎｇｅ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２０３：９５－１０２）。したがって、各ＧＰを遺伝子最適化し、改変哺乳類発現ベクターにサブクローニングし、次いでｉｎｖｉｖｏ電気穿孔法（ＥＰ）を用いて送達した。

げっ歯類適応ウイルスを用いてモルモット及びマウスにおいて前臨床効果試験を実施し、一方、本明細書に記載の新規修飾アッセイを用いてマウスＴ細胞応答を広範に分析した。本明細書に記載のエピトープ同定及び特徴決定のための新規方法の使用を含む、Ｔ細胞応答を広範囲に分析した。本モデルは、既存のプラットフォームに適用することができる保護免疫相関を試験するための重要な前臨床ツールを提供する。

前臨床げっ歯類試験におけるワクチン接種は、強力であり、ロバストな中和抗体（ＮＡｂ）及びＣＴＬ発現Ｔ_ｈ１型マーカーを誘発し、ＭＡＲＶ及びＺＥＢＯＶチャレンジを完全に保護した。本明細書に記載の新規改変アッセイを用いて広範に分析した包括的Ｔ細胞分析（ＳｈｅｄｌｏｃｋＤＪ，ｅｔａｌ．（２０１２）．ＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｙｎｔｈｅｔｉｃｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓｉｓｈｉｇｈｌｙＴｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｎｍｉｃｅ．ＨｕｍＶａｃｃｉｎＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ８：１６６８－１６８１）は、大多数の細胞傷害性Ｔリンパ球、エピトープ幅、及びＴ_ｈ１型マーカー発現を表す。遺伝的バックグラウンドの異なる２種類のマウスから、合計５２の新規Ｔ細胞エピトープを同定し（２０個のＭＡＲＶエピトープのうち１９個、１６個のＳＵＤＶのうち１５個、及び２２個のＺＥＢＯＶのうち１８個）、それらは主としてそれぞれの糖タンパク質（ＧＰ）の高度保存領域で生じていた。これらのデータは、これまでの前臨床糖タンパク質エピトープの中で、最も包括的な報告を表す。

ヒト死亡率が最も高い複数の種に対して保護を提供する戦略の策定に際して、ＭＡＲＶ、ＳＵＤＶ、ＺＥＢＯＶに焦点を当てた。それらの相対的な多様性のために、多価フィロウイルスワクチンの開発は、将来のアウトブレイク株及び／または種に応じて迅速かつ容易に適合させることができる成分のカクテルが必要になるであろうと仮定した。ＥＢＯＶの全体的な多様性は約３３％であるが、ＳＵＤＶとＺＥＢＯＶを別々に分析するとアミノ酸の同一性は実質的に上昇する（各種内で約９４％の同一性）。したがって、図１Ａに示すように、最も致死的なＥＢＯＶをカバーするための２成分戦略、ＳＵＤＶのためのプラスミドＧＰワクチン及びＺＥＢＯＶのための別のプラスミドＧＰワクチンを設計した。各種間のＧＰ多様性は比較的低い（ＳＵＤＶで５．６％、ＺＥＢＯＶで７．１％）ため、インフルエンザとＨＩＶの多様な系統間の保護を強化するために以前に示された戦略であるコンセンサス免疫原を開発した。これらのＧＰ配列は、ベクターＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたアライメントによって決定されるように、報告されたすべてのアウトブレイク配列（ＧｅｎＢａｎｋ）についてコンセンサスであった。ＳＵＤＶ（９５、２０３、２６１、及び４７２）及びＺＥＢＯＶ（３１４、３７７、４３０、及び４４０）におけるそれぞれ４個のアミノ酸の非コンセンサス残基をＧｕｌｕ及びＭｂｏｍｏ／Ｍｂａｎｚａにそれぞれ重み付けした。Ｇｕｌｕはフィロウイルス科アウトブレイク（ｎ＝４２５）のヒト死亡率が最も高いことから選択し、一方、Ｍｂｏｍｏ／Ｍｂａｎｚａは公表された配列データの最新かつ致死的なアウトブレイクであったことから選択した。ＳＵＤＶ（ＳＵＤＶＣＯＮＶＡＣＣＩＮＥ）及びＺＥＢＯＶ（ＺＥＢＯＶＣＯＮＶＡＣＣＩＮＥ）のコンセンサスＧＰは、系統樹的に中間のそれらの親にアラインメントした株であった。

図１Ａのタンパク質の同定は以下の通りである：ＭＡＲＶＤｕｒｂａ（０５ＤＲＣ９９）’９９：ＡＢＥ２７０８５；Ｕｇａｎｄａ（０１Ｕｇａ０７）’０７：ＡＣＴ７９２２９；Ｄｕｒｂａ（０７ＤＲＣ９９）’９９：ＡＢＥ２７０７８；Ｏｚｏｌｉｎ’７５：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＯ；Ｍｕｓｏｋｅ’８０：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＭ；Ｐｏｐｐ’６７：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＰ；Ｌｅｉｄｅｎ’０８：ＡＥＷ１１９３７；Ａｎｇｏｌａ’０５：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＡ；Ｒａｖｎ’８７：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＲ；Ｄｕｒｂａ（０９ＤＲＣ９９）’９９；ＡＢＥ２７０９２；Ｕｇａｎｄａ（０２Ｕｇａ０７）’０７：ＡＣＴ７９２０１．ＳＵＤＶ：Ｂｏｎｉｆａｃｅ’７６：ＶＧＰ＿ＥＢＯＳＢ；Ｍａｌｅｏ’７９：ＶＧＰ＿ＥＢＯＳＭ；Ｙａｍｂｉｏ’０４：ＡＢＹ７５３２５；Ｇｕｌｕ’００：ＶＧＰ＿ＥＢＯＳＵ．ＺＥＢＯＶ：Ｂｏｏｕｅ’９６：ＡＡＬ２５８１８；Ｍａｙｉｂｏｕｔ’９６：ＡＥＫ２５４９５；Ｍｅｋｏｕｋａ’９４：ＡＡＣ５７９８９，ＶＧＰ＿ＥＢＯＧ４；Ｋｉｋｗｉｔ’９５：ＶＧＰ＿ＥＢＯＺ５；Ｙａｍｂｕｋｕ（Ｅｋｒｏｎ）’７６：ＶＧＰ＿ＥＢＯＥＣ；Ｙａｍｂｕｋｕ（Ｍａｙｉｎｇａ）’７６：ＶＧＰ＿ＥＢＯＺＭ；Ｋａｓａｉ’０８：ＡＥＲ５９７１２；Ｋａｓｓａｉ’０７：ＡＥＲ５９７１８；Ｅｔｏｕｍｂｉ’０５：ＡＢＷ３４７４２；Ｍｂｏｍｏ／Ｍｂａｎｄｚａ’０３：ＡＢＷ３４７４３。

本明細書で提供する配列リストは、以下を含む７２の配列のリストを含む

配列番号１は、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原であるＺＥＢＯＶＣＯＮ（ＣＯＮＧＰ１）のアミノ酸配列である。

配列番号２は、ＳＵＤＶＣＯＮのアミノ酸配列であり、これはコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である。

配列番号３は、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質及びマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列であるＭＡＲＶまたはＭＡＲＶＡＮＧのアミノ酸配列である。

配列番号４は、ＭＡＲＶＣＯＮ１のアミノ酸配列であり、これは、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である。

配列番号５は、ＭＡＲＶＣＯＮ２のアミノ酸配列であり、これは、第２コンセンサスマールブルクマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である。

配列番号６は、ＭＡＲＶＣＯＮ３のアミノ酸配列であり、これは、第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である。

配列番号７～２５は、ＭＡＲＶＡＮＧ由来のペプチドである。

配列番号２６～４１は、ＳＵＤＶＣＯＮ由来のペプチドである。

配列番号４２～６２は、ＺＥＢＯＶＣＯＮ由来のペプチドである。

配列番号６３は、ＩｇＥシグナルペプチド：ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳの配列である。

配列番号６４は、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードするプラスミドｐＥＢＯＺ中のヌクレオチド配列挿入物である。

配列番号６５は、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードするプラスミドｐＥＢＯＳ中のヌクレオチド配列挿入物である。

配列番号６６は、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドｐＭＡＲＺＡＮＧ中のヌクレオチド配列挿入物である。

配列番号６７は、ＺＥＢＯＶＧＵＩ（ギニアＧＰ）のアミノ酸配列であり、これは、ギニアでの２０１４年のアウトブレイクから単離されたコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である。

配列番号６８は、ＺＥＢＯＶＣＯＮ２（ＣＯＮＧＰ２）のアミノ酸配列であり、これは、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質である。

配列番号６９は、ギニアでの２０１４年のアウトブレイクから単離されたコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードするプラスミドｐＺＥＢＯＶＧＵＩ中のヌクレオチド配列挿入物である。

配列番号７０は、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドｐＥＢＯＺＣＯＮ２のヌクレオチド配列挿入物である。

配列番号７１は、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドｐＥＢＯＺＣＯＮ２のヌクレオチド配列である。

配列番号７２は、ギニアの２０１４大発生から単離されたザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードするプラスミドｐＺＥＢＯＶＧＵＩのヌクレオチド配列挿入物である。

いくつかの実施形態では、戦略は：ＭＡＲＶ、ＳＵＤＶ、ＺＥＢＯＶ、ＺＥＢＯＶＧＵＩ及びＺＥＢＯＶＣＯＮ２から選択される３種のフィロウイルス免疫原のコード配列を用いる。ＭＡＲＶ免疫原はアンゴラ２００５分離株の糖タンパク質である。ＳＵＤＶＺＥＢＯＶ、ＺＥＢＯＶＧＵＩ、及びＺＥＢＯＶＣＯＮ２コンセンサス糖タンパク質配列について設計した。

いくつかの実施形態では、戦略は５つのフィロウイルス免疫原のコード配列を用いる。３つのＭＡＲＶ免疫原を提供する。３つのクラスターに由来するコンセンサス糖タンパク質オゾリン、ムソケ、またはラビンを設計した。これらの３つのＭＡＲＶ免疫原は、設計したＳＵＤＶ、ＺＥＢＯＶまたはＺＥＢＯＶＣＯＮ２、ＺＥＢＯＶＧＵＩコンセンサス糖タンパク質配列と共に、免疫応答の標的である。

いくつかの実施形態では、戦略は、６つのフィロウイルス免疫原のコード配列を用いる。４つのＭＡＲＶ免疫原を提供し、３つのクラスターに由来する３つのコンセンサス糖タンパク質を設計した。これらの３つのＭＡＲＶ免疫原は、設計したＳＵＤＶ、ＺＥＢＯＶ及びＺＥＢＯＶＣＯＮ２、ＺＥＢＯＶＧＵＩコンセンサス糖タンパク質配列と共に、免疫応答の標的であり、ＭＡＲＶ免疫原はアンゴラ２００５分離株の糖タンパク質である。

フィロウイルスワクチンの候補として、ＤＮＡワクチンは迅速かつ安価なアップスケール生産、室温での安定性、及び輸送の容易性を含む多数の利点を示し、これらのすべてが経済的及び地理的観点からこのプラットフォームをさらに強化する。プラスミドは合成可能な性質を有するため、Ａｇ配列は、新たに出現した種に応じて迅速かつ容易に改変し、及び／または追加のワクチン成分及び／またはアウトブレイク状況下での迅速な応答のためのレジメンを含むように拡張することができる。例えば、本明細書中のＭＡＲＶ戦略は、他の系統クラスターに対するコンセンサスＭＡＲＶＧＰ（ＭＧＰ）免疫原をコードする追加のプラスミドの同時投与によって、より広い適用範囲で容易に拡張することができる。

「第１世代」のＤＮＡワクチンは免疫原性が低いが、最近の技術的進歩は臨床試験で免疫原性を劇的に改善した。プラスミドＤＮＡベクター及びそれらがコードするＡｇ遺伝子の最適化は、ｉｎｖｉｖｏ免疫原性の増加を導いた。一時的に透過処理した細胞内に、ワクチン接種部位内での短い方形波の電気パルスを用いてプラスミドを駆動する技術であるｉｎｖｉｖｏ電気穿孔法で、高度に濃縮したプラスミドワクチン製剤を投与する場合、細胞取り込み及びその後のＡｇ発現は実質的に増幅される。理論的には、任意の数の可変Ａｇに対する高度に特殊化された免疫応答を指向するために、ＤＮＡプラスミドのカクテルを組み立てることができる。種特異的サイトカイン遺伝子をコードするプラスミド分子アジュバントとＡｇアミノ酸配列の「コンセンサスエンジニアリング」との同時送達によって、特定の株に対するワクチン誘発性免疫を指向しやすくするように、免疫をさらに誘導することができる。この戦略は、インフルエンザウイルス及びＨＩＶの多様な系統間の保護を強化することが示されている。部分的にはこれらの技術的進歩により、これらのＤＮＡワクチンを含む免疫化は、非常に多用途であり、きわめてカスタマイズ可能なものである。

１．定義
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものに過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書の数値範囲を詳述するために、同程度の精度でその間に介在する各数字を明示的に検討する。例えば、６～９の範囲の場合、６と９に加えて７と８の数値が想定され、６．０～７．０の範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０の数値が明示的に想定される。

ａ．アジュバント
本明細書中で使用する「アジュバント」とは、本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加し、ＤＮＡプラスミドによってコードされる１つ以上のコンセンサスフィロウイルス免疫原の抗原性を増強し、また、以下に記載する核酸配列をコードする任意の分子を意味し得る。

ｂ．抗体
「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、または、ＩｇＥの抗体、または、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む、その断片もしくは誘導体、ならびに、その一本鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二価抗体及び、誘導体を意味し得る。当該抗体は、哺乳類の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、または、これらの混合物のうち、所望のエピトープ、または、それに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すものであり得る。

ｃ．コード配列
本明細書中で使用する「コード配列」または「コード核酸」とは、タンパク質をコードするヌクレオチドを含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味し得る。コード配列はまた、ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。当該コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳類の細胞での発現を誘導できるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始及び終止シグナルをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、当該コード配列は、必要に応じて、Ｎ末端メチオニンまたはＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードする開始コドンをさらに含み得る。

ｄ．遺伝子構築物
本明細書中で使用する「遺伝子構築物」とは、免疫原などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のことを指す。当該遺伝子構築物は、ＲＮＡ分子から転写されたＤＮＡ分子のことも指す場合がある。当該コード配列は、核酸分子の投与先である個体の細胞で発現を誘導できるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと作動可能に連結した、開始及び終止シグナルを含む。本明細書中で使用する場合、用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞に存在している場合にコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結した必要な調節エレメントを含んでいる遺伝子構築物のことを指す。

ｅ．相補体
本明細書中で使用する「相補体」または「相補的」とは、ある核酸が、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間に、ワトソン・クリック（例えば、Ａ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）、または、フーグスティーン塩基対を表わすことを意味し得る。

ｆ．コンセンサスまたはコンセンサス配列
本明細書中で使用する「コンセンサス」または「コンセンサス配列」とは、特定のフィロウイルス抗原の複数のサブタイプのアラインメントの分析に基づいて構築した合成核酸配列、または対応するポリペプチド配列を意味し得、これを用いて、特定のフィロウイルス抗原のサブタイプまたは血清型に対する広範な免疫を誘導することができる。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号１、配列番号１の断片、配列番号１の変異体及び配列番号１の変異体の断片を指す。（ＺＥＢＯＶまたはＺＥＢＯＶＣＯＮまたはＺＥＢＯＶＣＯＮＶＡＣＣＩＮＥ）。配列番号１のコード配列を含むプラスミドは、ｐＺＥＢＯＶまたはｐＥＢＯＺと呼ばれる場合がある。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のコード配列には、配列番号６４、配列番号６４の断片、配列番号６４の変異体及び配列番号６４の変異体の断片が含まれる。プラスミドｐＥＢＯＺは、配列番号６４を含む。

コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号２、配列番号２の断片、配列番号２の変異体及び配列番号２の変異体の断片を指す。（ＳＵＤＶまたはＳＵＤＶＣＯＮまたはＳＵＤＶＣＯＮワクチン）。配列番号２のコード配列を含むプラスミドは、ｐＳＵＤＶまたはｐＥＢＯＳと呼ばれる場合がある。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のコード配列には、配列番号６５、配列番号６５の断片、配列番号６５の変異体及び配列番号６５の変異体の断片が含まれる。プラスミドｐＥＢＯＳは、配列番号６５を含む。

マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質はコンセンサスではなく、単離物に由来するタンパク質配列である。このタンパク質は配列番号３の配列を有する。マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号３、配列番号３の断片、配列番号３の変異体及び配列番号３の変異体の断片を指す。（ＭＡＲＶまたはＭＡＲＶＡＮＧまたはＭＡＲＶＡＮＧまたはＭＡＲＶＡＮＧワクチン）。配列番号３のコード配列を含むプラスミドは、ｐＭＡＲＶまたはｐＭＡＲＶ－ＡＮＧと呼ばれる場合がある。マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のコード配列には、配列番号６６、配列番号６６の断片、配列番号６６の変異体及び配列番号６６の変異体の断片が含まれる。プラスミドｐＭＡＲＶＡＮＧは配列番号６６を含む。

第１コンセンサスマールブルグマールブルウィルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号４、配列番号４の断片、配列番号４の変異体及び配列番号４の変異体の断片を指す。配列番号４は、ラビンクラスターコンセンサス（ラビン、ダーバ（０９ＤＲＣ９９）及びウガンダ（０２Ｕｇａ０７Ｙ））由来のマールブルグマールブルグウイルスコンセンサス配列である（ＭＡＲＶＣＯＮ１またはＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮまたはＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮＶＡＣＣＩＮＥ）。配列番号４のコード配列を含むプラスミドは、ｐＭＡＲＶ－ＲＡＶと呼ばれる場合がある。

第２コンセンサスマールブルグマールブルウィルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号５、配列番号５の断片、配列番号５の変異体及び配列番号５の変異体の断片を指す。配列番号５は、オゾリンクラスターコンセンサス（オゾリン、ウガンダ（０１Ｕｇａ０７）、及びダーバ（０５及び０７ＤＲＣ９９））由来のマールブルグマールブルグウイルスコンセンサス配列である。（ＭＡＲＶＣＯＮ２またはＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮまたはＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮワクチン）。配列番号５のコード配列を含むプラスミドは、ｐＭＡＲＶ－ＯＺＯと呼ばれる場合がある。

第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号６、配列番号６の断片、配列番号６の変異体及び配列番号６の変異体の断片を指す。配列番号６は、Ｍｕｓｏｋｅクラスターコンセンサス（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、及びＬｅｉｄｅｎ）のマールブルグマールブルグウイルスコンセンサス配列である。（ＭＡＲＶＣＯＮ１またはＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮまたはＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮワクチン）。配列番号６のコード配列を含むプラスミドは、ｐＭＡＲＶ－ＭＵＳと呼ばれる場合がある。

コンセンサスザイールエボラウイルスＧＰエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号６７、配列番号６７の断片、配列番号６７の変異体及び配列番号６７の変異体の断片を指す。（ＺＥＢＯＶＧＵＩまたはＺＥＢＯＶＧＵＩＶＡＣＣＩＮＥ）。配列番号６７のコード配列を含むプラスミドは、ｐＺＥＢＯＶＧＵＩまたはｐＥＢＯＺＧＵＩと呼ばれる場合がある。コンセンサスザイールエボラウイルスギニア２０１４エンベロープ糖タンパク質免疫原のコード配列は、配列番号６９、配列番号６９の断片、配列番号６９の変異体及び配列番号６９の変異体の断片を含む。プラスミドｐＥＢＯＺＧＵＩは配列番号６９を含む。

第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号６８、配列番号６８の断片、配列番号６８の変異体及び配列番号６８の変異体の断片を指す。（ＺＥＢＯＶ２またはＺＥＢＯＶＣＯＮ２またはＺＥＢＯＶＣＯＮ２ＶＡＣＣＩＮＥ）。配列番号６８のコード配列を含むプラスミドは、ｐＥＢＯＶＣＯＮ２と呼ばれる場合がある。第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のコード配列は、配列番号７０、配列番号７０の断片、配列番号７０の変異体及び配列番号７０の変異体の断片を含む。プラスミドｐＥＢＯＶＣＯＮ２は配列番号７０を含む。

ｇ．定電流
本明細書中で使用する「定電流」とは、組織、または、当該組織を規定する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間中に受容する、または、経験する電流を定義する。当該電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。この電流は、電気パルスの寿命期間中、当該組織に定電流量で留まるが、それは、本明細書で提供される電気穿孔装置が、好ましくは、瞬間的フィードバックを有しているフィードバック素子を具備しているからである。当該フィードバック素子は、パルスの持続期間中の組織（または、細胞）の抵抗を測定し、及び、電気穿孔装置に自身の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上げる）ようにすることができるため、同組織での電流は、電気パルスの間ずっと（マイクロ秒のオーダーで）、及び、パルス間において、一定であり続ける。いくつかの実施形態では、フィードバック素子は、制御器を含む。

ｈ．電流フィードバックまたはフィードバック
本明細書中で使用する「電流フィードバック」または「フィードバック」は、互換的に使用されており、及び、提供される電気穿孔装置の活発な応答を意味し得るが、これは、電極間の組織の電流を測定することと、電流を一定レベルで維持するために、ＥＰ装置が送達するエネルギー出力を適宜変化させることとを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処理を開始する前に、使用者が予め設定する。電気穿孔装置内の電気回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニタリングし、そのモニタリングした電流（または、組織内の電流）を予め設定された電流と比較し、連続的にエネルギー出力の調整を行なって、モニタリングした電流を予め設定されたレベルで維持することができるように、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えば、制御器によって達成され得る。当該フィードバックループは、瞬時のものであり得るものであり、それは、フィードバックループが、アナログ閉ループフィードバックであるからである。

ｉ．分散電流
本明細書中で使用する「分散電流」とは、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得るものであり、これらのパターンは、電気穿孔される組織のあらゆる領域に対する電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、または、好ましくは、消失させる。

ｊ．電気穿孔法
本明細書中で互換的に使用する「電気穿孔」、「電気透過処理」、または「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味し得る。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、及び、水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。

ｋ．フィードバック機構
本明細書中で使用する「フィードバック機構」とは、ソフトウェアまたはハードウェア（または、ファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスであって、（エネルギーパルスの送達前、送達中、及び／または、送達後の）所望の組織のインピーダンスを受容し、それを現在値、好ましくは、電流と比較して、送達されるエネルギーパルスを調整して、予め設定された値を達成するプロセスのことを指し得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施され得る。

ｌ．断片
「断片」は、特定のフィロウイルス抗原を認識することによってフィロウイルスに対する免疫応答を哺乳類において誘起することができるフィロウイルス免疫原のポリペプチド断片を意味し得る。フィロウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、場合により、１位にシグナルペプチド及び／またはメチオニン、いずれの場合にも１位にシグナルペプチド及び／またはメチオニンを有するかまたは有さない本明細書に記載のコンセンサス配列に９８％以上の相同性を有するタンパク質、本明細書に記載のコンセンサス配列に９９％以上の相同性を有するタンパク質、及び本明細書に記載のコンセンサス配列に１００％の相同性を有するタンパク質を含む場合がある。断片は、例えば、シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えばＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドに連結したフィロウイルス免疫原の断片を含んでも含まなくてもよい。

いずれの場合にも１位にシグナルペプチド及び／またはメチオニンを有するかまたは有さないＺＥＢＯＶＣＯＮ、ＳＵＤＶＣＯＮ、ＭＡＲＶＡＮＧ、ＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮ、ＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮ、ＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮ、ＺＥＢＯＶＧＵＩもしくはＺＥＢＯＶＣＯＮ２またはその変異体のいずれかの断片は、特定の全長ＺＥＢＯＶＣＯＮ、ＳＵＤＶＣＯＮ、ＭＡＲＶＡＮＧ、ＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮ、ＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮ、ＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮ、ＺＥＢＯＶＧＵＩもしくはＺＥＢＯＶＣＯＮ２またはその変異体の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の長さを含み得る。断片は、いずれの場合にも１位にシグナルペプチド及び／またはメチオニンを有するかまたは有さない配列ＺＥＢＯＶＣＯＮ、ＳＵＤＶＣＯＮ、ＭＡＲＶＡＮＧ、ＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮ、ＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮ、ＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮ、ＺＥＢＯＶＧＵＩまたはＺＥＢＯＶＣＯＮ２と１００％同一である断片のポリペプチドを指す。断片はまた、変異体の断片、すなわち、いずれの場合にも１位にシグナルペプチド及び／またはメチオニンを有するかまたは有さない配列ＺＥＢＯＶＣＯＮ、ＳＵＤＶＣＯＮ、ＭＡＲＶＡＮＧ、ＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮ、ＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮ、ＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮ、ＺＥＢＯＶＧＵＩまたはＺＥＢＯＶＣＯＮ２に対して９５％以上、９８％以上、または９９％以上相同であるポリペプチドを指す。この断片は、配列番号１～６、６７～６８に記載のフィロウイルス免疫原と９８％以上の相同性、９９％以上の相同性、または１００％同一であるポリペプチドの断片を含む場合があり、さらに相同率を計算する際に含まれない免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含む場合がある。いくつかの実施形態では、配列番号１～６、６７～６８の断片を、シグナルペプチド、例えばＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドに連結させた。断片は、Ｎ末端メチオニンを含む配列番号１～６、６７～６８の断片を含み得る。断片はまた、配列番号１～６、６７～６８に開示する配列に対して９５％以上、９８％以上、または９９％以上相同であるポリペプチドの断片を指す。シグナルペプチドが存在する場合、それは相同率を計算する際には含めない。

いくつかの実施形態では、配列番号１～６、６７～６８またはその変異体の断片は、配列番号１～６またはその変異体のいずれかの１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０個またはそれ以上の連続アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、配列番号１～６またはその変異体の断片は、配列番号１～６、６７～６８またはその変異体のいずれかの１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５またはそれ未満の連続アミノ酸を含み得る。

「断片」はまた、フィロウイルス免疫原をコードする核酸配列の断片を意味し、特定のフィロウイルス抗原を認識することによって哺乳類においてフィロウイルスに対する免疫応答を誘発することができるフィロウイルス免疫原の断片をコードする。いずれの場合にも１位にシグナルペプチド及び／またはメチオニンを有するかまたは有さない、フィロウイルス免疫原またはその変異体をコードする核酸断片の断片は、フィロウイルス免疫原またはその変異体をコードする特定の完全長核酸配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上を含む。断片は、配列番号１～６、６７～６８に記載のフィロウイルス免疫原と９８％以上、９９％以上、または１００％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の断片を含む場合があり、さらに、相同率を計算する際に含まれない免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含む場合がある。いくつかの実施形態では、配列番号１～６、６７～６８の断片をコードするヌクレオチド配列の断片を、シグナルペプチド、例えばＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドに連結させた。シグナルペプチドのコード配列は存在するが、相同率を計算する際には含まれない。いくつかの実施形態では、配列番号１～６またはその変異体の断片をコードするヌクレオチド配列の断片は、配列番号１～６、６７～６８またはその変異体のいずれかの１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０またはそれ以上の連続アミノ酸をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態では、配列番号１～６、６７～６８またはその変異体の断片をコードするヌクレオチド配列の断片は、配列番号１～６、６７～６８またはその変異体のいずれかの１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５またはそれ未満の連続アミノ酸をコードする配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、断片は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２の断片である。いずれの場合にも１位にシグナルペプチド及び／またはメチオニンを有するかまたは有さない、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２の断片は、フィロウイルス免疫原またはその変異体をコードする特定の完全長核酸配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２の断片は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２によってコードされるフィロウイルス免疫原に対して、９８％以上の相同性、９９％以上の相同性、または１００％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の断片を含む場合があり、相同率を計算する際に含まれない免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含む。配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２の断片は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、もしくは配列番号７２またはその変異体の１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０またはそれ以上の連続アミノ酸をコードする配列を含み得る。配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２の断片は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、もしくは配列番号７２またはその変異体の１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５またはそれ未満の連続アミノ酸コードする配列を含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２から転写されるかまたはコードされるＲＮＡの断片である。

ｍ．「同一の」
本明細書中で、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の関係で使用する「同一の」または「同一性」とは、当該配列が、指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味し得る。この割合を計算するには、２つの配列を好適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、双方の配列間で同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致した位置の個数を指定領域の合計位置数で割り、計算結果に１００を掛けることで、配列同一性のパーセント値を算出し得る。２つの配列の長さが異なるか、あるいは、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じて、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を、計算の分母には含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなし得る。同一性は、筆算で求めてもよく、あるいは、ＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ２．０等のコンピュータ配列アルゴリズムを使用して計算することもできる。

ｎ．インピーダンス
本明細書中で使用する「インピーダンス」は、フィードバック機構を論ずる際に利用し得るものであり、かつ、オームの法則に従って電流値に変換することができるため、予め設定された電流と比較が可能である。

ｏ．免疫応答
本明細書中で使用する「免疫応答」とは、１つ以上の提供するＤＮＡプラスミドワクチンを介したフィロウイルスコンセンサス抗原の導入に応答して、宿主の免疫系、例えば、哺乳類の免疫系が活性化することを意味し得る。この免疫応答は、細胞性応答または体液性応答、または、その両方であり得る。

ｐ．核酸
本明細書中で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖を表現することで、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所定の核酸として同一目的で使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸、及び、その相補体も含む。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも含む。

核酸は、一本鎖または二本鎖とし得るものであり、あるいは、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含み得る。当該核酸は、ＤＮＡ、双方のゲノム、及び、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ハイブリッドとし得るものであり、当該核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組み合わせを含み得るものであり、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及び、イソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。核酸は、化学合成法、または、組換え法により取得し得る。

ｑ．作動可能に連結した
本明細書中で使用する「作動可能に連結した」は、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。当該プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子において当該プロモーターを制御する遺伝子とプロモーターとの間の距離とほぼ同一とし得る。当該技術分野で周知の通り、プロモーター機能を喪失させずに、この距離の変化に適応し得る。

ｒ．プロモーター
本明細書中で使用する「プロモーター」とは、核酸の細胞での発現を、実現し、活性化し、または、増強することのできる合成分子または天然由来分子のことを意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強し、及び／または、空間的発現、及び／または、その一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターは、遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このものは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び、動物を含む起源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子成分の発現を調節し得るものであり、発現が起こる細胞、組織、もしくは、臓器、あるいは、発現が起こる発生段階については、恒常的もしくは差次的に、または、例えば、生理的ストレス、病原体、金属イオン、あるいは、誘発剤などの外部刺激に応答して同発現を調節し得る。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、及び、ＣＭＶＩＥプロモーターなどがある。

ｓ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書中で使用する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えば、核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が、第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズする際の条件のことを意味し得る。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況に応じて変化する。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔ_ｍ）より約５～１０℃低くなるように選択される。このＴ_ｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、及び、核酸濃度下で）標的に対して相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度のことである（この標的配列は、過剰に存在するので、Ｔ_ｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０～８．３において、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１～１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または、その他の塩）であり、及び、温度が、短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）では、低くとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドを超えるもの）では、低くとも約６０℃とし得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加しても実現し得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の条件を含む。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び、１％ＳＤＳを用いて、４２℃でのインキュベート、あるいは、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いて、６５℃でのインキュベートと、０．２×ＳＳＣ、及び、０．１％ＳＤＳを用いて、６５℃での洗浄を含む。

ｔ．実質的に相補的
本明細書中で使用する「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上の個数のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列が、第２の配列の相補体と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であること、あるいは、２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。

ｕ．実質的に同一
本明細書中で使用する「実質的に同一」とは、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個またはそれ以上の個数のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列と第２の配列が、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であること、あるいは、核酸に関して、当該第１の配列が、当該第２の配列の相補体と実質的に相補的であることを意味し得る。

ｖ．変異体
核酸に関して本明細書で使用する「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部または断片、（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列またはその一部の相補体、（ｉｉｉ）基準核酸またはその相補体と実質的に同一の核酸、または、（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、または、それらと実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸のことを意味し得る。

ペプチドまたはポリペプチドに関して使用する「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または、保存的置換によってアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているものを意味し得る。また、変異体は、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を、類似する特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、及び、分布）の別のアミノ酸に置換することは、当該技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当該技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水親水度指数を検討することで、部分的に同定できる。Ｋｙｔｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水親水度指数は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水親水度指数を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持する、ことが当該技術分野において公知である。ある態様において、±２の疎水親水度指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することで、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性と免疫原性に対して良好に相関すると報告された有用な尺度となる。本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する米国特許第４，５５４，１０１号。当該技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば、免疫原性などの生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸の置換とは、当該アミノ酸の相対的類似性、特に、当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、このことは、疎水性、親水性、電荷、大きさ、及び、その他の特性から明らかになる。「変異体」は、好ましくは配列番号１～６、６７～６８の９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同である。

同じ特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列に関する「変異体」は、異なるコドンの使用によってヌクレオチド配列が異なる。配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２の変異体は、好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の任意の程度の相同性であり得る。配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２によりコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２によって転写されるＲＮＡの変異体は、好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の任意の程度の相同性であり得る。変異体はまた、参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有し、通常、そのアミノ酸配列が、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同である、配列番号６４、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０または配列番号７２によって転写されるＲＮＡによってコードされるタンパク質の変異体であるタンパク質をコードする、配列番号６４、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２によって転写されるＲＮＡの変異体であってもよい。変異体はまた、参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有し、通常、そのアミノ酸配列が、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同である、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２によって転写されるＲＮＡによってコードされるタンパク質の変異体である、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２によって転写されるＲＮＡの変異体であってもよい。

ｗ．ベクター
本明細書中で使用する「ベクター」とは、複製起点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌、ウイルスベクター、人工染色体または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよいし、宿主ゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。

２．タンパク質
本明細書において、特定のフィロウイルス抗原の複数のサブタイプまたは血清型に対して幅広い免疫を誘導するために使用することができるフィロウイルス免疫原を提供する。コンセンサスフィロウイルス抗原として、それぞれ、マールブルグウイルスフィロウイルス糖タンパク質ＭＡＲＶＲＡＶ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列、マールブルグウイルスフィロウイルス糖タンパク質ＭＡＲＶＯＺＯ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列、マールブルグウイルスフィロウイルス糖タンパク質ＭＡＲＶＭＵＳ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列、マールブルグウイルスフィロウイルス糖タンパク質ＭＡＲＶＡＮＧの単離アミノ酸配列、ザイールエボラウイルス糖タンパク質ＺＥＢＯＶ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列、ザイールエボラウイルス糖タンパク質ＺＥＢＯＶ２０１４免疫原のコンセンサスアミノ酸配列、ザイールエボラウイルス糖タンパク質ＺＥＢＯＶＣＯＮ２免疫原の単離アミノ酸配列、及びスーダンエボラウイルス糖タンパク質ＳＵＤＶ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、免疫原は、免疫グロブリンタンパク質、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの異なるタンパク質に由来するシグナルペプチドを含み得る。

免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１～６、６７～６８及びその変異体ならびに配列番号１～６、６７～６８及びその変異体の断片を含み、場合により、シグナルペプチド、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドを含む。

３．タンパク質をコードするコード配列
本明細書に記載のタンパク質をコードするコード配列は、日常的な方法を用いて生成し得る。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、開示するアミノ酸配列に基づいて生成してもよい。

核酸配列は、完全長コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、完全長第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、完全長コンセンサスコンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原エンベロープ糖タンパク質免疫原、完全長コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、完全長マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原、完全長第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、完全長第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、または完全長第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードし得る。核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号６７、または配列番号６８をコードする配列を含み得る。核酸配列は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２を含み得る。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に記載のＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ配列を含む。例えば、核酸は、配列番号６４、６５、６６、６９、７０または７２のＤＮＡ配列、その断片またはその変異体によって転写されるＲＮＡ配列を含み得る。核酸配列は、場合により、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を含み得る。

核酸配列は、完全長コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片、完全長第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片、完全長コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原エンベロープ糖タンパク質免疫原の断片、完全長コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片、完全長マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原の断片、完全長第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片、完全長第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片、または完全長第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片をコードし得る。核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号６７または配列番号６８の断片をコードする配列を含み得る。核酸配列は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２の断片を含み得る。断片サイズは、本明細書において「断片」と題する節に記載するように開示する。核酸配列は、場合により、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を含んでいてもよい。

核酸配列は、完全長コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、完全長第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、完全長コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原エンベロープ糖タンパク質免疫原、完全長コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質、完全長マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質、完全長第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質、完全長第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質、及び完全長第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質をコードし得る。核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号６７、または配列番号６８に相同なタンパク質をコードする配列を含み得る。核酸配列は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２に相同であってもよい。相同性の程度については、本明細書中で、変異体に言及する節などにおいて論じる。核酸配列は、場合により、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を含み得る。

核酸配列は、完全長コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片に相同なタンパク質、完全長第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片に相同なタンパク質、完全長コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原エンベロープ糖タンパク質免疫原の断片に相同なタンパク質、完全長コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片に相同なタンパク質、完全長マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原の断片に相同なタンパク質、完全長第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片に相同なタンパク質、完全長第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片に相同なタンパク質、または完全長第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の断片に相同なタンパク質をコードし得る。核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号６７、または配列番号６８の断片に相同なタンパク質をコードする配列を含み得る。核酸配列は、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、または配列番号７２に相同な断片を含み得る。相同性の程度については、本明細書において変異体に言及する節などにおいて論じる。核酸配列は、場合により、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を含み得る。

配列番号６９は、コンセンサスザイールエボラウイルスＧＰエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードするプラスミドｐＥＢＯＺＧＵＩ中のヌクレオチド配列挿入物である。

４．ベクター
ベクターとして、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸のＤＮＡ」ベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。「ベクター」は、細胞を、感染、形質移入、一時的または永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターを、裸の核酸、または、タンパク質または脂質と複合体を形成した核酸とすることができることは認識されるであろう。当該ベクターは、ウイルスまたは細菌の核酸、及び／または、タンパク質、及び／または、膜（例えば、細胞膜、ウイルス性脂質エンベロープなど）を任意に含む。ベクターとして、ＤＮＡの断片が付着して複製され得るレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）などが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、ベクターとして、ＲＮＡ、自律的自己複製環状または線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルスなど、米国特許第５，２１７，８７９号を参照されたい）などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、また、発現プラスミドと非発現プラスミドの双方が含まれる。組換え微生物または細胞培養物が、「発現ベクター」を保有しているとの記載がある場合、それは、染色体外の環状及び線状ＤＮＡ、ならびに宿主染色体（複数可）に取り込まれたＤＮＡの双方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持される場合、当該ベクターは、有糸分裂中に自律的構造として安定に複製されるか、あるいは、宿主のゲノム内に組み込まれ得る。

ａ．プラスミド
プラスミドは、フィロタンパク質に対する免疫応答を誘発することができる合成コンセンサス抗原をコードするコード配列を含む、上記に開示される１つ以上の様々な免疫原をコードする核酸配列を含み得る。

単一のプラスミドは、単一のフィロプロテイン免疫原のコード配列、２つのフィロタンパク質免疫原のコード配列、３つのフィロタンパク質免疫原のコード配列、４つのフィロタンパク質免疫原のコード配列、５つのフィロタンパク質免疫原のコード配列または６つのフィロタンパク質免疫原のコード配列を含み得る。単一のプラスミドは、一緒に製剤化できる単一のフィロプロテイン免疫原のコード配列を含み得る。いくつかの実施形態では、プラスミドは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－２８をコードするコード配列を含み得る。

プラスミドは、コード配列の上流にあり得る開始コドン、及びコード配列の下流にあり得る終止コドンをさらに含み得る。開始コドン及び終止コドンは、コード配列とインフレームで存在し得る。

プラスミドはまた、コード配列に作動可能に連結したプロモーターを含み得る。コード配列に作動可能に連結したプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーターなど、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、または、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであってもよい。また、当該プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ヒトポリヘドリン、または、ヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターであってもよい。また、当該プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、筋肉または皮膚特異的プロモーター、天然または合成のものであってもよい。そのようなプロモーターの例は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する米国特許出願公開公報第ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載されている。

当該プラスミドはまた、当該コード配列の下流に位置させ得るポリアデニル化シグナルを含み得る。当該ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、または、ヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。当該ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであってもよい。

当該プラスミドは、当該コード配列の上流のエンハンサーを含み得る。当該エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、または、ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、または、ＥＢＶに由来するウイルスエンハンサーとし得る。ポリヌクレオチド機能増強は、本明細書の一部を構成するものとしてそれぞれの全内容を援用する米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、及び、ＷＯ９４／０１６７３７に記載されている。

当該プラスミドは、当該プラスミドを染色体外で維持し、かつ、細胞内で当該プラスミドの複数のコピーを産生するために、哺乳類の複製起点をも含み得る。当該プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）のｐＶＡＸ－１、ｐＣＥＰ４、または、ｐＲＥＰ４であってもよく、それらは、エプスタインバーウイルス複製起点、及び、核内抗原ＥＢＮＡ－１コード領域を含み得るものであり、組み込みをしなくとも、高コピーエピソーム複製を生じ得る。当該プラスミドの主鎖は、ｐＡＶ０２４２であってもよい。当該プラスミドは、複製欠損型アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであってもよい。

プラスミドはまた、プラスミドの投与先の細胞における遺伝子発現に十分に適合し得る調節配列を含み得る。コード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含み得る。

コード配列はまた、Ｉｇリーダー配列を含み得る。リーダー配列は、コード配列の５’であり得る。この配列によってコードされるコンセンサス抗原は、Ｎ末端Ｉｇリーダーと、それに続くコンセンサス抗原タンパク質を含み得る。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであってもよい。

当該プラスミドを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生のために使用され得る、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）としてもよい。また、当該プラスミドは、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生のために使用され得る、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）としてもよい。また、当該プラスミドを、昆虫細胞におけるタンパク質産生のために使用され得る、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）のプラスミドとしてもよい。また、当該プラスミドを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生のために使用され得る、ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）としてもよい。

ｂ．ＲＮＡベクター
一実施形態では、核酸はＲＮＡ分子である。したがって、一実施形態では、本発明は、マールブルグマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）またはザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）のエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子の１つ以上をコードするＲＮＡ分子を提供する。当該ＲＮＡは、プラス鎖であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、当該ＲＮＡ分子は、逆転写などの介在性複製ステップを必要とせずに、細胞によって翻訳することができる。本発明に有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７－メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、ＲＮＡのｉｎｖｉｖｏでの翻訳を促すことができる。本発明に有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有し得る。キャップされたＲＮＡにおいて、これは、５’から５’への架橋を介して７－メチルグアノシンに連結され得る。ＲＮＡ分子は、３’ポリＡテールを有し得る。また、ポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を、その３’末端の近傍に有し得る。本発明に有用なＲＮＡ分子は、一本鎖であってもよい。

ｃ．線状ベクター
本明細書において、電気穿孔法によって対象に対して効率的に送達され、及び、１つ以上の所望の抗原を発現することができる、線状核酸ワクチンまたは線状発現カセット（「ＬＥＣ」）も提供する。このＬＥＣは、あらゆるリン酸主鎖を欠いた線状ＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは、１つ以上の抗原をコードし得る。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルを含み得る。抗原の発現は、プロモーターによって制御され得る。このＬＥＣは、抗生物質耐性遺伝子、及び／または、リン酸主鎖を含まなくともよい。このＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現と無関係の他の核酸配列を含有していなくともよい。

当該ＬＥＣは、線状化可能な任意のプラスミドに由来し得る。当該プラスミドは、抗原を発現可能であってもよい。プラスミドは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、またはＤＮＡを発現し、細胞がその配列を、免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にする任意の他の発現ベクターであってもよい。

ｄ．ウイルスベクター
一実施形態では、本明細書において、本発明の核酸を細胞に送達することができるウイルスベクターを提供する。当該発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（２００１）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９９７）、及び、その他のウイルス学、及び、分子生物学のマニュアルに記載がされている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び、レンチウイルスなどがあるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１つ以上の選択マーカーを含む。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び、米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。）ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号、及び、第５，５８５，３６２号を参照されたい。

５．組成物
核酸分子を含む組成物を提供する。組成物は、単一のプラスミドのような単一の核酸分子の複数のコピー、２つ以上の異なるプラスミドのような２つ以上の異なる核酸分子の複数のコピーを含み得る。例えば、組成物は、複数の２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の異なる核酸分子を含み得る。そのような組成物は、複数の２、３、４、５、６、またはそれ以上の異なるプラスミドを含み得る。

組成物は、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の１つ以上からなる群から選択される単一のフィロタンパク質抗原のコード配列を集合的に含むプラスミドなどの核酸分子を含み得る。

組成物は、以下の組み合わせをコードする核酸配列を含む：コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びコンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びコンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原。

各フィロプロテイン免疫原の各コード配列は、好ましくは別々のプラスミドに含まれる。

したがって、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びコンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは２つの別々のプラスミド上に存在する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びコンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原；をコードする核酸配列を含む組成物は、１つのプラスミド上に存在してもよく、または任意の順列の２つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは３つの別々のプラスミド上に存在する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に、または任意の順列の２つのプラスミド上に、または任意の順列の３つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは５つの別々のプラスミド上に存在する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に、または任意の順列の２つのプラスミド上に、または任意の順列の３つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは５つの別々のプラスミド上に存在する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に、または任意の順列の２つのプラスミド上に、または任意の順列の３つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは５つの別々のプラスミド上に存在する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に、または任意の順列の２つのプラスミド上に、または任意の順列の３つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは６つの別々のプラスミド上に存在する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に、または任意の順列の２つのプラスミド上に、または任意の順列の３つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは６つの別々のプラスミド上に存在する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に、または任意の順列の２つのプラスミド上に、または任意の順列の３つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に、または任意の順列の５つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは６つの別々のプラスミド上に存在する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に、または任意の順列の２つのプラスミド上に、任意の順列の３つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に、または任意の順列の５つのプラスミド上に、または任意の順列の６つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは７つの別個のプラスミド上に存在する。

コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に、または任意の順列の２つのプラスミド上に、任意の順列の３つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に、または任意の順列の５つのプラスミド上に、または任意の順列の６つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは７つの別個のプラスミド上に存在する。

同様に、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１マールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２マールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上に、または任意の順列の２つのプラスミド上に、または任意の順列の３つのプラスミド上に、または任意の順列の４つのプラスミド上に、または任意の順列の５つのプラスミドに、または任意の順列の６つのプラスミドに、または任意の順列の７つのプラスミド上に存在してもよいが、好ましくは８つの別個のプラスミド上に存在する。

６．ワクチン
本明細書において、フィロウイルス、特にマールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン及び／またはエボラウイルス・ザイールに対する免疫応答を哺乳類において生成可能なワクチンを提供する。ワクチンは、上記のように各プラスミドを含み得る。ワクチンは、複数のプラスミド、またはそれらの組み合わせを含み得る。ワクチンは、治療的または予防的免疫応答を誘導するために提供してもよい。

ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びコンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びコンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及びマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原及びマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスをコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、ザイールエボラウイルス２０１４エンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサスザイールエボラウイルスギニアエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５、第１コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原及び第３コンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用してもよい。ワクチンは、好ましくは、プラスミドを含む組成物である。

当該ワクチンは、医薬として許容される賦形剤をさらに含み得る。医薬として許容される当該賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能分子であってもよい。医薬として許容される当該賦形剤を、界面活性剤を含み得る形質移入促進剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡなどのＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、または、ナノ粒子、または、その他の公知の形質移入促進剤としてもよい。

当該形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）など、または、脂質である。当該形質移入促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩であり、より好ましくは、当該ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩は、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で当該ワクチンに存在する。当該形質移入促進剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡなどのＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、及び、スクアレン及びスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、そして、ヒアルロン酸を用いて、遺伝子構築物と共に投与してもよい。いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、形質移入促進剤、例えば、脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）などの当該技術分野で周知のその他のリポソームなどのリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、または、ナノ粒子、または、その他の公知の形質移入促進剤も含み得る。好ましくは、当該形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）など、または、脂質である。当該ワクチンでの当該形質移入剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または、０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。

医薬として許容される賦形剤は、１つ以上のアジュバントであってもよい。アジュバントは、同一または代替プラスミドから発現されるか、またはワクチン中の上記プラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であってもよい。１つ以上のアジュバントを、以下からなる群から選択されるタンパク質及び／またはタンパク質をコードする核酸としてもよい：ＣＣＬ２０、α－インターフェロン（ＩＦＮ－α）、β－インターフェロン（ＩＦＮ－β）、γ－インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、例えば、シグナル配列またはシグナル配列をコードするコード配列が削除されており、場合により、ＩｇＥ由来などの異なるシグナルペプチド、またはＩｇＥ、ＩＬ－２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－ｌα、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－８、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、変異型ＩＬ－１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ－７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性型ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びその機能的断片またはその組み合わせに由来する異なるシグナルペプチドを有するＩＬ－１５。いくつかの実施形態では、アジュバントを：ＣＣＬ－２０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣまたはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される１つ以上のタンパク質及び／またはタンパク質をコードする核酸分子としてもよい。ＩＬ－１２構築物及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号及び対応する米国特許出願第０８／９５６，８６５号、ならびに２０１１年１２月１２日に出願された米国仮出願第６１／５６９６００号に記載されている。ＩＬ－１５構築物及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号及び対応する米国特許出願第１０／５６０，６５０号、及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６及び対応する米国特許出願第１２／１６０，７６６号、及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４８８２７に開示されており、前記文献はそれぞれ参照として本明細書に援用する。ＩＬ－２８構築物及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号及び対応する米国特許出願第１２／９３６，１９２号に開示されており、前記文献はそれぞれ参照として本明細書に援用する。ＲＡＮＴＥＳ及び他の構築物及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号及び対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示されており、前記文献はそれぞれ参照として本明細書に援用する。ＲＡＮＴＥＳ構築物及び配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８に開示されており、前記文献は参照として本明細書に援用する。ＲＡＮＴＥＳ及び他の構築物及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号及び対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示されており、前記文献はそれぞれ参照として本明細書に援用する。ＲＡＮＴＥＳ構築物及び配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、前記文献は参照として本明細書に援用する。ＲＡＮＴＥＳ及び他の構築物及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号及び対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示されており、前記文献はそれぞれ参照として本明細書に援用する。ＲＡＮＴＥＳ構築物及び配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、前記文献は参照として本明細書に援用する。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ及びＭＥＣ構築物及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号及び対応する米国特許出願第１１／７１９，６４６号に開示されており、前記文献はそれぞれ参照として本明細書に援用する。ＯＸ４０及び他の免疫調節剤の例は、米国特許出願第１０／５６０，６５３号に開示されており、前記文献は参照として本明細書に援用する。ＤＲ５及び他の免疫調節剤の例は、米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示されており、前記文献は参照として本明細書に援用する。

ワクチンは、１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０２１，５７９号に記載されているような遺伝子ワクチン促進剤をさらに含んでもよく、前記文献はその全内容を参照として援用する。

当該ワクチンは、約１ｎｇ～１００ｍｇ、約１μｇ～約１０ｍｇ、または、好ましくは、約０．１μｇ～約１０ｍｇ、または、より好ましくは、約１ｍｇ～約２ｍｇの量のコンセンサス抗原及びプラスミドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、約５ｎｇ～約１０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１０ｎｇ～約８００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約０．１～約５００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１～約３５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約２５～約２５０μｇ、約１００～約２００μｇ、約１ｎｇ～１００ｍｇ、約１μｇ～約１０ｍｇ、約０．１μｇ～約１０ｍｇ、約１ｍｇ～約２ｍｇ、約５ｎｇ～約１０００μｇ、約１０ｎｇ～約８００μｇ、約０．１～約５００μｇ、約１～約３５０μｇ、約２５～約２５０μｇ、約１００～約２００μｇのコンセンサス抗原またはそのプラスミドを含む。

当該ワクチンは、用いられる投与様式にしたがって製剤化してもよい。注射可能なワクチン医薬組成物は、滅菌された発熱物質不含のもの、及び、微粒子不含のものとしてもよい。等張性製剤または溶液を用いてもよい。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及び、ラクトースが挙げられ得る。当該ワクチンは、血管収縮剤を含み得る。当該等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。当該ワクチンは、ゼラチンやアルブミンなどの安定化剤をさらに含み得る。ワクチン製剤に対するＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンなどによる安定化は、製剤を、室温または周囲温度で、長時間安定にすることができる。

ワクチンは、室温（２５℃）で１週間より長く、いくつかの実施形態では２週間より長く、いくつかの実施形態では３週間より長く、いくつかの実施形態では４週間より長く、いくつかの実施形態では、５週間より長く、いくつかの実施形態では、６週間より長くにわたって安定である。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１か月より長く、２か月より長く、３か月より長く、４か月より長く、５か月より長く、６か月より長く、７か月より長く、８か月より長く、９か月より長く、１０か月より長く、１１か月より長く、または１２か月より長くにわたって安定である。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１年超、２年超、数年超、または５年超にわたって安定である。一実施形態では、ワクチンは冷蔵下で安定である（２～８℃）。したがって、一実施形態では、ワクチンは冷凍鎖を必要としない。ワクチンは、その意図された使用（例えば、被験体における免疫応答の生成）を可能にするのに十分な期間、その生物学的活性を保持するならば、安定である。例えば、保存され出荷されるなどのワクチンについては、ワクチンが数か月～数年間安定していることが望ましい場合がある。

７．ワクチンの送達方法
本明細書において、免疫応答を誘発することができる、フィロウイルス、特にマールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン及び／またはエボラウイルス・ザイールの免疫原に対して、それらを特に効果的なものとするエピトープを含むコンセンサス抗原の遺伝子構築物及びタンパク質を提供するためのワクチンの送達方法を提供する。ワクチンまたはワクチン接種の送達方法は、治療的免疫応答及び予防的免疫応答を誘導するために提供してもよい。ワクチン接種プロセスは、哺乳類において、フィロウイルス、特にマールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン及び／またはエボラウイルス・ザイールに対する免疫応答を生じ得る。ワクチンを個体に送達し、哺乳類の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強してもよい。ワクチンの送達は、細胞内で発現させ、細胞の表面に送達し、そこにおいて免疫系が認識し、細胞性、体液性、または細胞性及び体液性の応答を誘導する核酸分子としてのコンセンサス抗原の形質移入であってもよい。ワクチンの送達は、哺乳類に上記のワクチンを投与することによって、フィロウイルス、特にマールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン及び／またはエボラウイルス・ザイールに対する免疫応答を哺乳類において誘導または誘発するために使用してもよい。

哺乳類の細胞へのワクチン及びプラスミドの送達において、形質移入細胞は、ワクチンから注入されたプラスミドの各々についてコンセンサス抗原を発現し分泌する。これらのタンパク質は、免疫系によって異物として認識され、それらに対して抗体が生成される。これらの抗体は、免疫系によって維持され、フィロウイルス、特にマールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン及び／またはエボラウイルス・ザイールによるその後の感染に対する有効な応答を可能にする。

ワクチンを哺乳類に投与し、哺乳類において免疫応答を誘発してもよい。哺乳類は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、及びニワトリであってもよい。

ａ．併用治療
ワクチンは、ＣＣＬ２０、α－インターフェロン、γ－インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、例えば、シグナル配列が削除され、場合により、ＩｇＥシグナルペプチド、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－２８、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、変異型ＩＬ－１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ－７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びそれらの機能的断片またはそれらの組み合わせなどの異なるシグナルペプチドを含むＩＬ－１５をコードする遺伝子及び／または他のタンパク質と併用して投与してもよい。いくつかの実施形態では、ワクチンを、以下の核酸分子及び／またはタンパク質の１つ以上と併用して投与してもよい：ＣＣＬ２０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ及びＲＡＮＴＥＳまたはその機能的断片の１つ以上をコードするコード配列を含む核酸分子からなる群から選択される核酸分子、及び：ＣＣＬ０２、ＩＬ－１２タンパク質、ＩＬ－１５タンパク質、ＩＬ－２８タンパク質、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質もしくはＲＡＮＴＥＳタンパク質またはその機能的断片からなる群から選択されるタンパク質。

ワクチンを、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、頬側投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、及び、関節内、または、それらの組み合わせなどの異なる経路で投与し得る。獣医学的使用については、通常の獣医学的実施に従って、当該組成物を、適切に許容しうる製剤として投与し得る。獣医師は、特定の動物に対して最も適切な投与計画、及び、投与経路を、容易に決定することができる。当該ワクチンを、伝統的なシリンジ、無針注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または、その他の物理的方法、例えば、電気穿孔法（ＥＰ）、「流体力学的方法」、または、超音波によって投与し得る。

ワクチンのプラスミドは、ｉｎｖｉｖｏ電気穿孔法、リポソーム媒介、ナノ粒子促進、組換えベクター、例えば、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス関連ウイルス、及び組換えワクシニアなどを用いてまたは用いずに、ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含むいくつかの周知の技術によって哺乳類に送達してもよい。コンセンサス抗原は、ＤＮＡ注射及びｉｎｖｉｖｏ電気穿孔法により送達してもよい。

ｂ．電気穿孔法
ワクチンのプラスミドの電気穿孔法による当該ワクチンの投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳類の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得るものであり、及び、好ましくは、当該エネルギーパルスは、使用者が入力したプリセット電流に近い定電流である。当該電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント、及び電極組立体またはハンドル組立体を含み得る。電気穿孔コンポーネントは、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリーコンポーネント、電源、及び、電源スイッチなどの当該電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、及び、組み込み得る。当該電気穿孔法は、ｉｎｖｉｖｏ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡＥＰシステム（ＶＧＸＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＢｌｕｅＢｅｌｌ，ＰＡ）、または、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、プラスミドによる細胞の形質移入を容易にし得る。

当該電気穿孔コンポーネントは、当該電気穿孔装置の１つの要素として機能し得るものであり、及び、その他の要素は、当該電気穿孔コンポーネントと連絡する別々の要素（または、コンポーネント）である。当該電気穿孔コンポーネントは、当該電気穿孔装置の１つを超える個数の要素として機能し得るものであり、当該電気穿孔コンポーネントとはなおも別の当該電気穿孔装置のその他の要素とも連絡し得る。１つの電気機械的、または、機械的装置の一部として存在する当該電気穿孔装置の要素は、それらの要素が、１つの装置として、または、互いに連絡する別の要素として機能することができるものに限定しなくともよい。当該電気穿孔コンポーネントは、所望の組織内で定電流を生成するエネルギーパルスを送達し得るものであり、及び、フィードバック機構を含む。当該電極組立体は、空間的配置内に複数の電極を有する電極アレイを含み得るものであり、当該電極組立体は、当該電気穿孔コンポーネントからエネルギーパルスを受け、そして、電極を介して所望の組織に向けて同パルスを送達する。複数の当該電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達期間ではニュートラルであり、及び、所望の組織でのインピーダンスを測定して、そのインピーダンスを、当該電気穿孔コンポーネントに連絡する。当該フィードバック機構は、測定された当該インピーダンスを受けてもよく、また、当該電気穿孔コンポーネントによって送達されたエネルギーパルスを調整して、当該定電流を維持することができる。

複数の電極は、分散パターンでエネルギーパルスを送達し得る。複数の当該電極は、プログラムされたシーケンス下の当該電極の制御を介して、当該分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよく、そして、プログラムされたシーケンスは、使用者によって、電気穿孔コンポーネントに入力される。プログラムされた当該シーケンスは、順に送達された複数のパルスを含んでいてもよく、複数の当該パルスの各々のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を備えた少なくとも２つの活性電極によって送達されており、複数の当該パルスの次のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を備えた少なくとも２つの活性電極の異なる１つによって送達される。

当該フィードバック機構は、ハードウェア、または、ソフトウェアのいずれかで実施し得る。当該フィードバック機構は、アナログ閉回路によって実施し得る。当該フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または、１μｓごとに起こるが、好ましくは、実時間フィードバック、または、瞬時（すなわち、応答時間を決定するための入手可能な技術によって決定した実質的な瞬時）である。当該ニュートラル電極で、所望の組織でのインピーダンスを測定してもよく、そして、そのインピーダンスをフィードバック機構に連絡し、次いで、当該フィードバック機構が同インピーダンスに応答してエネルギーパルスを調整し、及び、プリセット電流と同様の値の定電流を維持する。当該フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達期間内に定電流を連続的かつ瞬時的に維持し得る。

本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進しうる電気穿孔装置及び電気穿孔法の例として、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する、Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ，ｅｔａｌ．，の米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔａｌ．，が出願した米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたものがある。当該ＤＮＡワクチンの送達を促進するために用い得るその他の電気穿孔装置及び電気穿孔法として、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する、２００６年１０月１７日に出願した米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号、及び、２００７年１０月１０日に出願した同第６０／９７８，９８２号に対して３５ＵＳＣ１１９（ｅ）による利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願した、同時係属中で、かつ、共有にかかる米国特許出願第１１／８７４０７２号で提供されたものがある。

Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ，ｅｔａｌ．，の米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システム、及び、その使用が記載している。このモジュラー電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクタ、及び、電源を含み得る。使用者は、支持構造上に搭載された複数の針電極を掴み、そして、体内または植物内の選択された組織に同電極をしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な当該定電流パルス制御器を活性化して、定電流の電気パルスを、複数の針電極に印加する。印加された当該定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞内への生体分子の導入を促進する。本明細書の一部を構成するものとして米国特許第７，２４５，９６３号の全内容を援用する。

Ｓｍｉｔｈ，ｅｔａｌ．，が出願した米国特許公開第２００５／００５２６３０号には、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために用い得る電気穿孔装置が記載されている。当該電気穿孔装置は、その操作が、ソフトウェアまたはファームウェアで指定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。このＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づく一列の電極とパルスパラメータ入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、そして、電流波形データの保存と取得を可能にする。当該電気穿孔装置は、針電極、注射針用の中央注入チャネル、及び、取り外し可能なガイドディスクのアレイを有する交換可能な電極ディスクも含む。本明細書の一部を構成するものとして米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容を援用する。

米国特許第７，２４５，９６３号、及び、米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイ及び方法は、筋肉などの組織だけでなく、その他の組織または臓器にも深く浸透させるように適合し得る。電極アレイの形態によって、注射針（選択された生体分子を送達する）が、標的臓器にも完全に挿入され、そして、電極によって、あらかじめ描かれた領域の標的組織に対して垂直に注射投与される。米国特許第７，２４５，９６３号、及び、米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは、長さが２０ｍｍで、２１ゲージのものである。

加えて、電気穿孔装置、及び、その使用を組み込んだ幾つかの実施形態で予期されるように、以下の特許、１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、及び、２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載された電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを用いてＤＮＡを送達することに関係している２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、及び、ＤＮＡ注入の方法に関する２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に開示された発明を含む特許は、本明細書において企図している。本明細書の一部を構成するものとして上記した全特許の内容を援用する。

ｃ．ＤＮＡプラスミドの調製方法
本明細書で論じるＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドの調製方法を本明細書において提供する。哺乳類発現プラスミドへの最終サブクローニング工程の後のＤＮＡプラスミドを用いて、当該分野で公知の方法を用いて、大規模発酵タンクに細胞培養物を播種することができる。

本発明のＥＰ装置とともに使用するためのＤＮＡプラスミドは、公知の装置及び技術の組み合わせを用いて製剤化または製造することができるが、好ましくは、２００７年５月２３日に出願された許諾対象である同時係属中の米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載された最適化されたプラスミド製造技術を用いて製造する。いくつかの例では、これらの試験に使用するＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。その製造技術は、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されたものに加えて、２００７年７月３日に発行された許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されたものをはじめとする、当業者に概ね公知の様々な装置、及び、プロトコールをも含み、かつ、取り入れている。上記した参照出願及び特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号、及び、米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する。

以下の例において、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであって、例示目的のみで記載しているものと理解すべきである。上記した説明、及び、これらの実施例から、当業者であれば、本発明に必須の特徴を確認することができ、また、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な変更や改変を加えて、様々な用途や条件に適合させることができる。したがって、本明細書で説明した発明に加えて、本発明に対して様々な改変を加えることが当業者に自明であることは、上記した説明からも明らかである。そのような改変も、特許請求の範囲に属していることも意図をしている。

実施例１
方法
プラスミドワクチン構築
ｐＭＡＲＶ、ｐＥＢＯＳ、及びｐＥＢＯＺプラスミドＤＮＡ構築物は、全長ＧＰタンパク質をコードする。ｐＥＢＯＳ及びｐＥＢＯＺに対して、アミノ酸コンセンサス戦略を使用し、一方、ｐＭＡＲＶには、２００５年のアンゴラ流行株由来の型適合配列（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＲ）を使用した（ＴｏｗｎｅｒＪＳ，ｅｔａｌ．（２００６）．ＭａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｉｃｓａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈａｌａｒｇｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒｏｕｔｂｒｅａｋｉｎＡｎｇｏｌａ．ＪＶｉｒｏｌ８０：６４９７－６５１６）。コンセンサス配列は、優勢なＺＥＢＯＶ及びＳＵＤＶＧＰアミノ酸配列のアラインメント及びそれぞれについてコンセンサスを生成することによって決定した。各ワクチンＧＰ遺伝子を、ヒトにおける発現のために遺伝子最適化し（タンパク質発現を強化するためのコドン及びＲＮＡの最適化を含む（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、商業的に合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）その後、サイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で、改変ｐＶＡＸ１哺乳類発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングした（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；修飾は、２Ａ＞Ｃ、３Ｃ＞Ｔ、４Ｔ＞Ｇ、２４１Ｃ＞Ｇ、１，９４２Ｃ＞Ｔ、２，８７６Ａ＞－、３，２７７Ｃ＞Ｔ、及び３，７５３Ｇ＞Ｃを含む。系統発生解析は、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウェアを使用してＣｌｕｓｔａｌＷを用いた多重アラインメントによって行った。あるいは、ＭＡＲＶ間のＧＰ多様性は、比較してはるかに高い（約７０％の同一性）ため、コンセンサス戦略は採択しなかった。ＭＡＲＶの適用範囲については、現在までに最大級の最も致命的なＭＡＲＶ流行の原因となったことから、２００５年のアンゴラ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＲ）でのアウトブレイクに由来するＭＧＰの配列を利用することを選択した。この配列は、Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ及びＬｅｉｄｅｎ（１０．６％の多様性）、またはウガンダ（０１Ｕｇａ０７）、ダーバ（０５ＤＲＣ９９及び０７ＤＲＣ９９）及びオゾリン（１０．３％の多様性）を含む関連株の最も近いクラスターのいずれかから１０％より大きく異なっていた。３プラスミド戦略は、新規３価多価－フィロウイルスワクチン戦略の基盤を形成した。

形質移入及びイムノブロッティング
ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を培養し、形質移入し、回収した。簡潔に述べると、細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ、ピルビン酸ナトリウム、及びＬ－グルタミンを含むＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞を１５０ｍｍＣｏｒｎｉｎｇディッシュで培養し、５％ＣＯ_２を含む３７℃インキュベーター中で一晩７０％コンフルエンスまで増殖させた。Ｃａｌｐｈｏｓ（商標）哺乳類形質移入キットプロトコール（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを使用して製造業者のプロトコールに従って１０～２５μｇのフィロウイルス科ｐＤＮＡでディッシュを形質移入し、次いで２４～４８時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで回収し、遠心分離して洗浄し、次いでウェスタンイムノブロットまたはＦＡＣＳ分析のためにペレット化した。標準的なウエスタンブロッティングを使用し、ＧＰ１検出のためのＧＰ特異的ＭＡｂを生成した。ウエスタンイムノブロッティング実験のデータを図１Ｂに示す。ＦＡＣＳ分析からのデータを図１Ｃに示す。

動物、ワクチン接種及びチャレンジ
成体雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２^ｂ）、ＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｈ－２^ｄ）、及びＢｌ０．Ｂｒ（Ｈ－２^ｋ）マウスをジャクソン研究室から購入し（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）、一方、Ｈａｒｔｌｅｙモルモットはチャールズ川（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。すべての動物実験は、ＵＰｅｎｎＩＡＣＵＣ及びＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅＡｎｉｍａｌＦａｃｉｌｉｔｙ、またはＰＨＡＣのＮＭＬＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ及び実験動物の住居及びケアに関するカナダ動物衛生委員会のガイドラインに従って実施し、上記の機関による適切なレビュー及び承認の後にＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓｏｆＮＩＨの推奨に従って行った。ＵＰｅｎｎ及びＮＭＬは、動物福祉、動物福祉法、及びその他すべての該当する連邦、州及び地方の法律に関するＮＩＨ方針を遵守する。

水に再懸濁した４０μｇのプラスミドをマウスの筋肉内にニードル注射して免疫化し、一方、モルモットの３つの別々のワクチン接種部位にそれぞれ２００μｇを接種して皮内で免疫化した。ワクチン接種の直後に同じ部位へのＥＰを行った。簡潔に述べると、三つ又のＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応定電流最小侵襲デバイスを、皮内におよそ２ｍｍ挿入した（ＩｎｏｖｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＢｌｕｅＢｅｌｌ，ＰＡ）。２６ゲージの固体ステンレススチール電極からなる三角形の３電極アレイを通して方形波パルスを送達し、０．１Ａの２つの定電流パルスを、１秒の遅延によって分離した５２ｍ秒／パルスで送達した。

致死的チャレンジ試験では、チャレンジは、げっ歯類適応ＺＥＢＯＶ及びＭＡＲＶに限定した。モルモットを、最終ワクチン接種の２８日後に、１，０００ＬＤ_５０のモルモット適応ＺＥＢＯＶ（２１．３ＦＦＵ／動物）（ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＪＳ，ＡｂｏｕＭＣ，ＴｒａｎＫＮ，ＫｕｍａｒＡ，ＳａｈａｉＢＭ，ＫｏｂｉｎｇｅｒＧＰ（２０１１）．Ｉｍｐａｃｔｏｆｓｙｓｔｅｍｉｃｏｒｍｕｃｏｓａｌｉｍｍｕｎｉｔｙｔｏａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｏｎａｄ－ｂａｓｅｄＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｉｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｓ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２０４Ｓｕｐｐｌ３：Ｓ１０３２－１０４２）または１，０００ＬＤ_５０ＭＡＲＶ－アンゴラ（６８１ＴＣＩＤ５０／動物）を用いた腹腔内注射によりチャレンジした。簡潔に述べると、モルモット適応ＭＡＲＶを、非近交系の成体雌Ｈａｒｔｌｅｙモルモットにおける野生型ＭＡＲＶ－アンゴラの連続継代によって作製した。接種の７日後、動物を安楽死させ、肝臓を回収し、均質化した。次いで、このホモジネートをナイーブな成体モルモットに腹腔内注射し、動物が体重、髪の毛を失い、モルモットのＥＢＯＶ適応と同様の感染に至るまで、このプロセスを繰り返した。マウス致死チャレンジ試験（ＫｏｂｉｎｇｅｒＧＰ，ｅｔａｌ．（２００６）．ＣｈｉｍｐａｎｚｅｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔＺａｉｒｅＥｂｏｌａｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３４６：３９４－４０１）については、マウス適応ＺＥＢＯＶの１，０００ＬＤ_５０（１０ＦＦＵ／動物）２００μｌを用いてマウスに腹腔内注射した。すべての動物の体重を毎日測定し、承認されたスコアシートを用いてマウスの場合は少なくとも１８日間、モルモットの場合は２２日間、疾患の進行をモニタリングした。すべての感染作業は、ＮＭＬ、ＰＨＡＣの「ＢｉｏｓａｆｅｔｙＬｅｖｅｌ４」（ＢＳＬ４）施設で行った。

ＥＬＩＳＡ及び中和アッセイ
スクロース精製ＭＡＲＶオゾリンＧＰまたはＺＧＰのいずれかでコーティングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを用いて、または陰性対照スクロース精製ニパＧタンパク質を１：２，０００の濃度で用いて、抗体（Ａｂ）力価を測定した。簡潔に述べると、プレートを４℃で１８時間インキュベートし、ＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄し、１００μｌ／試料の血清を３回（５％スキムミルク及び０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ中、１：１００、１：４００、１：１，６００、及び１：６，４００の希釈率で）試験した。湿った容器中、３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ結合ＨＲＰ抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）１００μｌを添加し（１：２，０００希釈）、さらに湿った容器中、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＡＢＳＴ（２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンザゾリン－６－スルホン酸）及びペルオキシダーゼ基質（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）１００μｌを添加し、Ａｂ結合を可視化した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後４０５ｎｍで読み取った。陰性対照血清から陽性対照を差し引くと＞３ＳＤであることをもって、陽性結合結果を特徴付けた。

ＺＥＢＯＶ中和アッセイを行った。簡潔に述べると、免疫したマウスから血清を採取し、モルモットを５６℃で４５分間不活性化し、各試料（５０μｌのＤＭＥＭ中で、マウスの場合１：２０、１：４０など、モルモットの場合は１：５０）を、ＥＧＦＰレポーター遺伝子（ＺＥＢＯＶ－ＥＧＦＰ）を発現する等量のＺＥＢＯＶと混合し（ＥＧＦＰ発現に従って１００形質導入ユニット／ウェル）、３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、混合物を９６ウェル平底プレート中の準コンフルエントＶｅｒｏＥ６細胞に移し、室温で５～１０分間インキュベートした。対照ウェルに、血清または非免疫血清を添加することなく、等量のＺＥＢＯＶ－ＥＧＦＰウイルスに感染させた。次いで、２０％ＦＢＳを補充した１００μｌのＤＭＥＭを各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。

あるいは、ＭＡＲＶ－アンゴラ３６８の中和を、免疫蛍光アッセイを用いて評価した。一次ウサギ抗ＭＡＲＶＡｂ及び二次ヤギ抗ウサギＩｇＧＦＩＴＣ結合Ａｂを検出に使用した。ＳＵＤＶボニファスに対する中和抗体（ＮＡｂｓ）を、ＣＶ－１細胞上の細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づいてアッセイした。細胞を等量の免疫血清及びＳＵＤＶボニファスと共に１０日間インキュベートした後、１０％緩衝ホルマリンで２４時間固定し、光学顕微鏡下で調べた。ＥＧＦＰ及びＦＩＴＣ陽性細胞を各ウェルで計数し、対照と比較して、緑色細胞の数において＞５０％の減少を示す試料希釈を、ＮＡｂについて陽性と判定した。あるいは、ＳＵＤＶ－ボニファスに対するＮＡｂｓをＣＶ－１細胞上の細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づいてアッセイした。すべての感染性の試験は、ＮＭＬ、ＰＨＡＣのＢＳＬ４研究室で行った。

脾細胞の単離
最終免疫の８～１１日後にマウスを殺処分し、脾臓を採取した。簡潔に述べると、１０％ＦＢＳ、１×抗－抗（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１×β－ＭＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＭｅｄｉａｔｅｃｈＩｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に脾臓を入れた。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒｍａｃｈｉｎｅ（ＳｅｗａｒｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を用いて脾臓の機械的破壊により脾細胞を単離し、得られた産物を、４０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤＦａｌｃｏｎ）を用いてろ過した。次いで、細胞を、ＲＢＣの溶解のためにＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ、スイス）で５分間処理し、ＰＢＳで洗浄し、次いでＥＬＩＳＰＯＴまたはＦＡＣＳアッセイで使用するためにＲＰＭＩ培地に再懸濁した。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
標準的なＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。簡潔に述べると、９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を抗マウスＩＦＮ－γ捕捉抗体でコーティングし、４℃で２４時間インキュベートした（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、次いでブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ及び５％スクロース）で２時間ブロッキングした。脾細胞（１～２×１０^５細胞／ウェル）を三連でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で、及びＲＰＭＩ１６４０（陰性対照）、ＣｏｎＡ（陽性対照）、またはＧＰペプチドのいずれかの存在下で、個々に（それぞれのＧＰの長さにまたがって、９アミノ酸をオーバーラップさせた１５量体）または全体をプールして一晩刺激した（終濃度２．５μｇ／ｍｌ）。刺激の１８～２４時間後、プレートをＰＢＳで洗浄し、次いでビオチン化抗マウスＩＦＮ－γｍＡｂ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と共に４℃で２４時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで再度洗浄し、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（ＭａｂＴｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。最後に、プレートをＰＢＳ中で再び洗浄し、次いでＢＣＩＰ／ＮＢＴＰｌｕｓ基質（ＭａｂＴｅｃｈ）を各ウェルにスポット現像のために５～３０分間添加した。現像プロセスが目視検査で完了するとすぐに、プレートを蒸留水ですすぎ、次に室温で一晩乾燥させた。スポットは、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（ＣｅｌｌｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｔｄ．，ＳｈａｋｅｒＨｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ）を用いて計数した。

Ｔ細胞の幅の包括的分析のために、標準的なＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴを、ＳｈｅｄｌｏｃｋＤＪ，ｅｔａｌ．（２０１２）において以前に記載されたように本明細書において改変した。上記。準優位Ｔ細胞エピトープ及び免疫優性Ｔ細胞エピトープの同定及び測定は、全ペプチドプールまたはマトリックスペプチドプールとは対照的に、脾細胞を個々のペプチドで刺激することによって評価した；マトリックスアレイプールの使用のような試料保存のためのペプチドをプールする伝統的な実行は、複数のエピトープディスプレイペプチドを含有するプールにおける全機能応答がアッセイ分解能を効果的に低下させる、すなわち、より低い規模を「ドローンアウト」するため、アッセイ感度を低下させる。したがって、改変ＥＬＩＳＰＯＴを、各ＧＰ免疫原にわたって個々のペプチド（９アミノ酸でオーバーラップする１５量体；終濃度２．５μｇ／ｍｌ）を用いて行った。Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを同定し（≧１０のＡＶＥＩＦＮγ＋スポット及び≧８０％の動物応答率；表１～６にまとめる）、その後、ＦＡＣＳによって機能及び表現型を確認した。共有または部分エピトープは同定されず、ＦＡＣＳデータまたはウェブベースのエピトープ予測ソフトウェアも、連続ペプチド内に保存されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの存在を示唆しなかった。ここでは、改変ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって同定されるように、可能な共有／部分Ｔ細胞エピトープを、連続ペプチド応答のすべての場合について取り扱った。細胞を、連続ペプチドのそれぞれで個々に刺激し、及び直接比較のために組み合わせてペアにし、組み合わせた応答が２つの個々の応答のいずれよりも大きくない場合、「共有／部分的」と定義した。また、ペプチドを生成するための「９アミノ酸がオーバーラップした１５量体」アルゴリズムは、ＣＤ８Ｔ細胞エピトープを完全にカバーすることに偏っており、１５アミノ酸より長いクラスＩＩ拘束性エピトープの性質に起因して、ＣＤ４Ｔ細胞を過小評価し得るため、本明細書に提示するエピトープ応答は、完全に包括的ではなかった可能性があることには留意しなければならない。最後に、ベクターＮＴＩソフトウェアを用いてアミノ酸類似性プロットを生成し、その結果を図４Ｂに示す。

フローサイトメトリー
脾細胞を９６ウェルプレートに添加し（１×１０^６細胞／ウェル）、個々のペプチドまたは「最小ペプチドプール」（終濃度２．５μｇ／ｍｌ）のいずれかで５～６時間刺激した。個々のペプチド刺激を、改変ＥＬＩＳＰＯＴ（表１～６）によって同定したすべてのペプチドの機能的確認及び表現型の特徴付けに用いた。脾細胞及び形質移入した２９３Ｔを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＦｉｘａｂｌｅＶｉｏｌｅｔＤｅａｄＣｅｌｌＳｔａｉｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で最初に予め染色した。脾臓については、ＣＤ１９（Ｖ４５０；クローン１Ｄ３）、ＣＤ４（ＰＥ－Ｃｙ７；クローンＲＭ４－５）、ＣＤ８α（ＡＰＣ－Ｃｙ７；クローン５３－６．７）及びＣＤ４４（ＰＥ－Ｃｙ５；クローンＩＭ７）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）について、細胞を表面染色し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで３回洗浄し、ＢＤＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットで透過処理し、次いでＩＦＮγ（ＡＰＣ；クローンＸＭＧ１．２）、ＴＮＦ（ＦＩＴＣ；クローンＭＰ６－ＸＴ２２）、ＣＤ３（ＰＥ－ｃｙ５．５；クローン１４５－２Ｃ１１）、及びＴ－ｂｅｔ（ＰＥ；クローン４Ｂ１０）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で細胞内染色した。形質移入した２９３Ｔ細胞におけるＧＰ発現を、形質移入の２４時間後に評価した。３回免疫化したＨ－２^ｂマウス由来の血清を、それらのそれぞれのＤＮＡワクチンまたはｐＶＡＸ１空ベクター対照を用いてプールすることにより産生した、示したマウス由来ＧＰ特異的ポリクローナル血清試薬（１：２００希釈）を含有するＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中、４℃で３０分間のインキュベーション後に間接染色を行った。次いで、細胞をＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、広範囲に洗浄し、次いでＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ－ＡＢＣ；ＰＥ－Ｃｙ７；クローンＧ４６－２．６；ＢＤ）で染色した。すべての細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を用いてすべてのデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析した。脾細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４４＋、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９及び生存性色素について陰性である活性化ＩＦＮγ産生Ｔ細胞に関してゲーティングした。

図６は、ＧＰ特異的Ｔ細胞ゲーティングを示す。ＥＬＩＳＰＯＴによって同定したＴ細胞エピトープを含むペプチドの機能的及び表現型解析を、全リンパ球、ＣＤ１９及びＬＩＶＥ－ＤＥＡＤ（ダンプチャネル）について陰性であった生存（ＬＤ）ＣＤ３＋細胞、シングレット（細胞ダブレットを除く）、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞、活性化細胞（ＣＤ４４＋）、ならびにペプチド特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞のＦＡＣＳゲーティングによって行った。

統計解析
無根系統樹の有意性を最大尤度法によって決定し、ブートストラップ解析によって検証し、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウェアによって有意な支持値（≧８０％；１，０００回のブートストラップ反復）を決定した。グループの解析は、整合両側独立ｔ検定によって完了し、生存曲線は対数ランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって解析した。すべての値は平均±ＳＥＭであり、統計解析はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）により実施した。

結果
ワクチンの構築と発現
系統発生解析により、ＥＢＯＶＧＰ（ＳＵＤＶでは９４．４％、ＺＥＢＯＶでは９２．９％）が相対的に保存され、ＭＡＲＶＧＰ（ＭＧＰ）はより多様性が高い（約７０％の保存）。したがって、優勢なＺＥＢＯＶ及びＳＵＤＶＧＰアミノ酸配列のアラインメントによって決定されるコンセンサス戦略をＥＢＯＶＧＰに採用し、一方、ＭＡＲＶには最大級で最も致命的なＭＡＲＶアウトブレイクである２００５年のアンゴラアウトブレイク配列を用いた型適合戦略を用いた。各ＧＰ導入遺伝子を遺伝子最適化し、商業的に合成し、次いで改変ｐＶＡＸ１哺乳類発現ベクターにサブクローニングした。まとめると、３プラスミド戦略が、新規多価－フィロウイルスワクチン戦略の基礎を形成した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を各プラスミドと別々に形質移入し、ＧＰ発現をウエスタンイムノブロッティング及びＦＡＣＳによって評価した。検出のための種特異的抗ＧＰ１ｍＡｂを用いて形質移入の４８時間後に採取した細胞溶解物中に、各々、約１３０ｋＤａのタンパク質が観察された。結果を図１Ｂに示す。比較対照として、それぞれのＧＰを発現する組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）を並行レーンにロードした。次に、細胞表面上のＧＰ発現を、ＦＡＣＳによるＧＰ特異的または対照ポリクローナル血清による間接的染色により形質移入の２４時間後に分析した。結果を図１Ｃに示す。すべてのワクチンプラスミドについて細胞表面発現が検出されたが、非特異的結合はほとんど観察されなかった。対照血清はＧＰ形質移入細胞と反応せず、陽性血清もｐＶＡＸ１形質移入細胞と反応しなかった（データはｐＥＢＯＺについて示した）。ＥＢＯＶＧＰについて予想されたように、細胞表面発現は、表面ＭＨＣクラスＩ、ならびにβ１インテグリンの立体的に閉塞した認識を引き起こす（ＦｒａｎｃｉｃａＪＲ，Ｖａｒｅｌａ－ＲｏｈｅｎａＡ，ＭｅｄｖｅｃＡ，ＰｌｅｓａＧ，ＲｉｌｅｙＪＬ，ＢａｔｅｓＰ（２０１０）Ｓｔｅｒｉｃｓｈｉｅｌｄｉｎｇｏｆｓｕｒｆａｃｅｅｐｉｔｏｐｅｓａｎｄｉｍｐａｉｒｅｄｉｍｍｕｎｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｅｂｏｌａｖｉｒｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ６：ｅ１００１０９８）。

ＭＡＲＶ及びＺＥＢＯＶチャレンジに対する完全な保護
保護の有効性を判定するために、モルモット前臨床チャレンジモデルを採用した。前臨床免疫原性及び有効性試験は、本明細書においてモルモット及びマウスモデルを用いて実施した。モルモット前臨床モデルは、フィロウイルスワクチン開発のためのスクリーニング及び「概念実証」ツールとして広く使用されている。モルモットではＭＡＲＶ及びＥＢＯＶの一次単離株は非致死的な病気を引き起こすが、この宿主では少数の継代により、フィロウイルス感染霊長類に認められる病理学的特徴と同様の病理学的特徴を有する致死的疾患を引き起こし得る変異体が選択される。同様に、マウスもまた、フィロウイルスワクチンの開発に広く使用されているが、モルモットモデルとは異なり、免疫及びＴ細胞応答を評価するための免疫検出試薬が広く入手可能である。マウス適応ＺＥＢＯＶ（ｍＺＥＢＯＶ）による感染は、ＥＢＯＶに感染した霊長類に認められるものに類似した、標的器官における高レベルのウイルスによって特徴付けられる疾患ならびに肝臓及び脾臓における病的変化をもたらす。

３つの別々のワクチン接種部位またはｐＶＡＸ１空ベクター対照（ｎ＝９）に２００μｇの各プラスミド（ｐＥＢＯＺ、ｐＥＢＯＳ及びｐＭＡＲＶ）を用いてモルモット（ｎ＝２４）を皮内で２回免疫し、その後１か月後に同じワクチンで追加免疫した。動物を、ＢＳＬ－４施設においてモルモット適応ＭＡＲＶ－アンゴラ（ｇｐＭＡＲＶ）（ｎ＝９）またはＺＥＢＯＶ（ｇｐＺＥＢＯＶ）（ｎ＝１５）の１０００ＬＤ_５０を用いて２回目の免疫の２８日後にチャレンジし、毎日観察及び体重測定した。結果を図２Ａ～２Ｈに示す。ワクチン接種した動物は完全に保護され、一方、対照をワクチン接種した動物は、ｇｐＭＡＲＶによりチャレンジ後１０日目（ｎ＝３；Ｐ＝０．００５２）までに、またはｇｐＺＥＢＯＶによりチャレンジ後７日目（ｎ＝６；Ｐ＝０．０００８）までに死亡した（図２Ａ及び図２Ｅ）。さらに、ワクチン接種した動物は体重減少から保護された（図２Ｂ及び図２Ｆ；Ｐ＜０．０００１）。プールした血清中のＧＰ特異的Ａｂが結合（図２Ｃ及び図２Ｇ）及び中和（図２Ｄ及び図２Ｈ）力価の有意な増加を示したため、ワクチン誘導Ａｂが保護に寄与した可能性が高い。ＢＳＬ－４施設で実験を行い、同様の結果を２回繰り返し、図Ａ～２Ｈの誤差バーはＳＥＭを表す。グループの解析は、整合両側独立ｔ検定によって完了し、生存曲線は対数ランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって解析した。

プラスミドワクチンは高度に免疫原性であった
保護ＤＮＡワクチン（プラスミドｐＥＢＯＺ、ｐＥＢＯＳ及びｐＭＡＲＶ、三価ＤＮＡワクチンとも呼ばれる）によって促進される免疫相関をよりよく特徴づけるために、フィロウイルスワクチン開発のためのスクリーニング及び「概念証明」ツールとして広く使用されているマウスモデルを採用した広範囲の免疫検出試薬が利用可能である。最初に、Ｂ細胞応答を、２回のワクチン接種のそれぞれ２０日後、各一価ＤＮＡワクチン４０μｇの注射の間の３週間、Ｈ－２^ｄマウス（ｎ＝５／群）で評価した。これらの実験からのデータを図３Ａ～３Ｃに示す。図３Ａ及び図３Ｂに示すように、プレブリード対照試料ではＧＰ特異的ＩｇＧはほとんど観察されなかったが、ワクチン接種後のすべての動物において有意な増加が検出された。精製ＳＧＰは利用できなかったため、精製ＺＧＰを代理として用いた。ＳＵＤＶワクチン接種したマウスのＩｇＧは、ＺＧＰに結合し、ワクチン誘発性のＡｂ生成能力、及び異種間認識能力を実証した。さらに、１回の免疫化の後にワクチン接種した動物の１００％において抗体陽転が起こり、その後、応答は同種のブーストによって有意に増加した；ＡＶＥ逆エンドポイント希釈力価は、ｐＭＡＲＶ免疫マウスでは２２．１倍、ｐＥＢＯＳ及びｐＥＢＯＺワクチン接種動物ではそれぞれ３．４倍及び８．６倍に増加した。ＢＳＬ－４施設でＺＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ－ボニファス、及びＭＡＲＶ－Ａｎｇｏｌａの中和について試料を次にアッセイした。中和アッセイの結果を図３Ｃに示す。すべての動物においてワクチン接種後にＮＡｂ力価の有意な増加が検出された。

２つの異なる遺伝的バックグラウンドのマウス（Ｈ－２^ｄ及びＨ－２^ｂ；ｎ＝５／群）を、４０μｇの各プラスミドｐＥＢＯＺ、ｐＥＢＯＳ及びｐＭＡＲＶで免疫し、２週間後に相同的にブーストし、８日後、Ｔ細胞分析のために殺処分した。マトリックスプールとは対照的に個々のペプチドを用いて脾細胞を刺激した包括的なワクチン誘発性Ｔ細胞応答を評価するための新規改変ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図４Ａに示す。ＤＮＡワクチン接種は、多様なＴ細胞エピトープを認識するロバストなＩＦＮγ＋応答を誘導した（表１～６）。続いて、すべての陽性エピトープ含有ペプチドをゲーティングし（図６参照）、確認し、さらにＦＡＣＳによって特徴付けた。この改変ＥＬＩＳＰＯＴアプローチは、対照ウェルからのバックグラウンド応答が低かった（Ｈ－２^ｂでは７．２±０．２ＩＦＮγ産生ＳＦＣ／１０^６脾臓細胞及びＨ－２^ｄマウスでは９．２±０．５）ことから、極めて感度が高いことが判明した。図４Ａに示す結果は、ｐＭＡＲＶを用いたワクチン接種が、Ｈ－２^ｂマウスにおいて９個の測定可能なエピトープを誘導し、Ｈ－２^ｄでは１１個、ｐＥＢＯＳは９及び８個を誘導し、ｐＥＢＯＺはこれらの各株において１０及び１２個を生成した。ｐＭＡＲＶで免疫化したＨ－２^ｂマウス由来のエピトープ９個のうち５個（５５．６％）はＣＤ８＋であったが、これらはＥＬＩＳＰＯＴ及びＦＡＣＳ確認及び表現型分析の両方によって測定した合計ＭＧＰ特異的ＩＦＮγ＋応答の約５７．３％を占めていた。同様に、確認したエピトープの３３％及び３８％のみが、それぞれｐＥＢＯＳ免疫化Ｈ－２^ｂ及びＨ－２^ｄマウスにおいてＣＤ８拘束性であった。しかしながら、これらのエピトープは総応答のおよそ５０～９０％を占めていた；両方のマウス株でＣＤ８＋Ｔ細胞応答はおよそ５６％であると推定されたが、ＦＡＣＳ推定値は、Ｈ－２^ｂ及びＨ－２^ｄマウスでそれぞれ５１％及び９０％であった。総ＣＤ８＋応答は、ｐＥＢＯＺワクチン接種動物においてより低く、３３％～５７％（ＥＬＩＳＰＯＴにより両株とも３３％、ＦＡＣＳによりＨ－２^ｂ及びＨ－２^ｄマウスでそれぞれ６％及び５７％）と測定された。

最も高い準優位エピトープに対して少なくとも２倍のＩＦＮγ応答を生成したものを免疫優性エピトープと大まかに定義した場合、ｐＥＢＯＳを与えた両マウス株において単一の免疫優性エピトープが検出され；ｐＭＡＲＶは、ペプチドＭＧＰ_{２５－３９}（＃５）、ＭＧＰ_{６７－８１}（＃１２）、ＭＧＰ_{１８１－１９５}（＃３１）及びＭＧＰ_{３８５－３９９}（＃６５）内の４つのＨ－２^ｂ制限免疫優性ＣＤ８＋エピトープ、ならびにＭＧＰ_{１５１－１７１}（＃２７）内のＨ－２^ｄ制限ＣＤ４＋エピトープを誘導した。図４Ｂ及び図４Ｃに示すように、これらのエピトープのうちの４つは、ＭＡＲＶＧＰ１の高度保存領域内に存在し、そのうちの３つは推定受容体結合ドメイン内に位置し、１つのみが可変ムチン様領域（ＭＧＰ_{３８５－３９９}（＃６５））内に存在していた。ｐＥＢＯＳは、いずれもＧＰ１の高度保存領域である、Ｈ－２^ｂマウス及びＨ－２^ｄマウスにおけるそれぞれＳＵＤＶＧＰ（ＳＧＰ）_{１９－３３}（＃４）及びＳＧＰ_{２４１－２５５}（＃４１）に存在するＣＤ８＋エピトープを刺激した。しかしながら、ｐＥＢＯＺ免疫感作は、Ｈ－２^ｄマウスにおいて、それぞれ受容体結合ドメイン及びムチン様領域内に存在する３つの免疫優勢エピトープ（ＺＥＢＯＶＧＰ受容体結合ドメイン（ＧＰ）_{１３９－１５３}（＃２４）に位置するＣＤ８拘束エピトープ、ならびに２つのＣＤ４拘束エピトープＺＧＰ_{１７５－１８９}（♯３０）及びＺＧＰ_{３９１－４０５}（＃６６））を明らかにした。Ｈ－２^ｂマウスでは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エピトープ（＃８９）の両方を含み、ＧＰ２の高度保存領域内に存在する１つの免疫優勢エピトープのみが定義された。全体として、多様なエピトープ階層は、各ワクチン群において一貫性及び再現性があった。さらに、図４Ｄに示すように、準優位応答は総応答のかなりの割合を占めていた；改変ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した全ＡＶＥ準優位応答は、ｐＭＡＲＶ、ｐＥＢＯＳ及びｐＥＢＯＺで免疫化したＨ－２^ｂマウスではそれぞれおよそ１２％、６２％及び７４％であり、Ｈ－２^ｄマウスにおける応答ではそれぞれ４７％、５０％及び３４％であった。

最後に、同定したエピトープ含有ペプチドのみを含む最小限のペプチドプールでの刺激を用いて、ＦＡＣＳにより全ＧＰ特異的Ｔ細胞応答を測定した。ワクチン接種した動物のそれぞれにおいてロバストな応答が検出され、大部分の場合、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が含まれていた。応答は、対照ペプチド（ｈ－Ｃｌｉｐ）でＩＦＮγ産生がほとんど観察されず、ＥＬＩＳＰＯＴデータとよく相関したため、ＧＰ特異的であった。免疫化が、ＦＡＣＳによって測定されるＣＴＬを顕著に誘導しなかった唯一の例は、ＥＬＩＳＰＯＴによって同定したエピトープがＣＤ８拘束性でないことが確認されたｐＭＡＲＶでワクチン接種したＨ－２^ｄマウスであった。全体として、これらのデータは、各ワクチンプラスミドが、マウスにおいて高度に免疫原性であり、ＧＰの高度保存領域内の免疫優性エピトープを含む多様なＴ細胞エピトープのアレイを認識するロバストなＧＰ特異的Ｔ細胞応答を生じたことを示す。さらに、エピトープ同定のための伝統的なマトリックスアレイペプチドプールを用いることで、本明細書で特徴づけられる高度に多様な準優位Ｔ細胞応答が見過ごされてきた可能性がある。

ＦＡＣＳにより、それぞれのＧＰに対してすべての陽性に同定されたペプチドを含む最小限のペプチドプールに対する反応性について、Ｔ細胞応答を測定した。図７Ａは、代表的な動物のＤＮＡワクチン誘発性Ｔ細胞応答を示し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋（右）及びＣＤ８＋（左）細胞はゲーティングされていることを示す。ＦＡＣＳプロットを示す。ｈ－ＣＬＩＰペプチド存在下でのインキュベーションは陰性対照（対照）として利用した。図７Ｂは、図７Ａのゲーティング細胞の結果を総ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の平均％としてまとめたものであり、エラーバーはＳＥＭを表す。実験を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。

マウスにおける「単回投与」の保護
次に、ＺＥＢＯＶチャレンジに対するワクチン効力を、前臨床マウスモデルにおいて評価した。強力なＮＡｂ誘導及び保護データが観察されたため、マウスには１回のみワクチン接種を行った。マウス（Ｈ－２^ｋ；ｎ＝１０／群）を４０μｇのｐＥＢＯＺＤＮＡで免疫化し、２８日後にＢＳＬ４施設において１，０００ＬＤ_５０のマウス適合ＺＥＢＯＶ（ｍＺＥＢＯＶ）でチャレンジして保護を評価した。チャレンジ後７日目までにすべての対照動物が感染により死亡したが、図５ＡはＤＮＡワクチン接種したマウスが完全に保護されたことを示している（Ｐ＝０．０００２）。さらに、図５Ｂに示すように、対照マウスは、死亡まで体重の進行性の喪失を示した（Ｐ＜０．０００１）。

「単回投与」モデルにおけるＤＮＡ誘導保護の機構をよりよく理解するために、次にＮＡｂ及びＴ細胞の生成を評価した。ワクチン接種の２５日後、チャレンジの３日前に評価し、図５Ｃに示すように、すべてのワクチン接種動物（ｎ＝１０／群）において有意な（Ｐ＜０．０００１）増加が検出された。逆エンドポイント希釈力価は、１９～４２、２７．３±２．５の範囲であった。

次に、ＺＧＰ特異的Ｔ細胞の生成を評価し、ｐＥＢＯＺ単独、または３価製剤で免疫したマウスにおける応答を比較するために分析の範囲を広げた。全ＺＧＰペプチドプールを使用するＦＡＣＳにより、１１日後にＩＦＮ－γ産生（ｎ＝５）を評価した；データを図５Ｄに示す。ＩＦＮγ産生Ｔ細胞はすべての動物で検出され、対照ペプチドによる刺激はサイトカイン産生を誘導しなかったため、ＺＧＰペプチドに特異的であった。一価または三価製剤のいずれかによる免疫化は、ロバストなＩＦＮγＴ細胞応答を誘導し、これらは比較した場合、有意には異ならないＰ＝０．０９２０。

ＣＴＬはウイルス感染細胞を除去する上で重要である可能性があるため（ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ｅｔａｌ．（２００５）．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍｏｒａｌａｎｄＣＤ８＋ＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７５：１１８４－１１９１；ＫａｌｉｎａＷＶ，ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ＯｌｉｎｇｅｒＧＧ，ＢａｖａｒｉＳ（２００９）．ＤｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｃｏｍｍｏｎｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎａＢＡＬＢ／ｃｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌ．ＶｉｒｏｌＪ６：１３２；ＯｌｉｎｇｅｒＧＧ，ｅｔａｌ．（２００５）．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ－ｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｖｅｎｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃｏｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＪＶｉｒｏｌ７９：１４１８９－１４１９６；ＳｕｌｌｉｖａｎＮＪ，ｅｔａｌ．（２０１１）．ＣＤ８（＋）ｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｉｔｙｍｅｄｉａｔｅｓｒＡｄ５ｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓ．ＮａｔＭｅｄ１７：１１２８－１１３１；及びＧｅｉｓｂｅｒｔＴＷ，ｅｔａｌ．（２０１０）．ＶｅｃｔｏｒｃｈｏｉｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｐｏｔｅｎｃｙｏｆｇｅｎｅｔｉｃｖａｃｃｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔＡｎｇｏｌａＭａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｉｎｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓ．ＪＶｉｒｏｌ８４：１０３８６－１０３９４）、さらなるエフェクターサイトカイン、ＴＮＦ、ならびに発育制限因子、Ｔ_ｈ１型ＣＴＬ免疫及び細胞傷害性と相関することが知られているＴボックス転写因子ＴＢＸ２１（Ｔ－ｂｅｔ）を測定し、その結果は以下の通りであった。総細胞について：ＴＮＦ２．９±０．８，Ｔｂｅｔ１３．０±１．１。ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞の場合：ＴＮＦ６１．４±３．１、Ｔｂｅｔ７２．６±２．０。ＣＤ８＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞の場合：ＴＮＦ３３．０±３．３、Ｔｂｅｔ９９２．１±１．４（^＊ｐ＜０．１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれ約６１％及び約３３％がＩＦＮγに加えてＴＮＦも産生することを見出した。さらに、大部分のＩＦＮγ産生Ｔ細胞は高レベルのＴ－ｂｅｔを発現した；ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞のそれぞれ約７３％及び９２％がＣＤ４４＋であり、ＺＧＰペプチド刺激後にＩＦＮγを産生した。

図８Ａ及び８Ｂは、「単回投与」ワクチン接種によるＴ細胞誘導を示す。ＦＡＣＳによって測定されるように、単一のｐＥＢＯＺ免疫化、または別々の部位における３つのワクチンプラスミドが含まれる単一の３価ワクチン接種後のＨ－２^ｋマウスにおけるＴ細胞応答を（ａ）に示し、（ｂ）ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋（紫色）またはＣＤ８＋（橙色）細胞のＡＶＥ％としてまとめる。擬似カラーＦＡＣＳプロットは代表的な動物に由来し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋（右）及びＣＤ８＋（左）細胞をゲーティングする。ｈ－ＣＬＩＰペプチドとのインキュベーションは陰性対照（対照）として機能した。実験は２回行い、同様の結果が得られた。エラーバーはＳＥＭを表す；ｎｓ、有意性なし。

考察
本発明者らは、前臨床げっ歯類の免疫原性及び有効性試験における多価－フィロウイルスワクチンの開発及び評価を報告する。モルモットでの２回のＤＮＡワクチン接種及びｍＺＥＢＯＶに対するマウスでの「単回投与」ＤＮＡワクチン接種後に、ｇｐＭＡＲＶ及びｇｐＺＥＢＯＶによるチャレンジに対する完全な保護が観察された。今日まで、モルモットの遺伝子ワクチン接種には、裸のＤＮＡの注射が含まれていた（ＳｕｌｌｉｖａｎＮＪ，ＳａｎｃｈｅｚＡ，ＲｏｌｌｉｎＰＥ，ＹａｎｇＺＹ，ＮａｂｅｌＧＪ（２０００）．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｆｏｒＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ４０８：６０５－６０９）ｏｒＤＮＡｄｅｌｉｖｅｒｅｄｂｙｇｅｎｅｇｕｎ（ＤｏｗｌｉｎｇＷ，ｅｔａｌ．（２００６）．Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｎｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆＥｂｏｌａｖｉｒｕｓＧＰＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓ．ＪＶｉｒｏｌ８１：１８２１－１８３７；ＶａｎｄｅｒｚａｎｄｅｎＬ，ｅｔａｌ．（１９９８）．ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｉｔｈｅｒｔｈｅＧＰｏｒＮＰｇｅｎｅｓｏｆＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｃｔｍｉｃｅｆｒｏｍｌｅｔｈａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２４６：１３４－１４４；及びＲｉｅｍｅｎｓｃｈｎｅｉｄｅｒＪ，ｅｔａｌ（２００３）．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ，ＭａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓａｎｄＶｅｎｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ２１：４０７１－４０８０）が、いずれの方法でも完全な保護を達成するために少なくとも３回のワクチン接種が必要であった。単一のＤＮＡワクチン接種により、遺伝子銃投与後の保護動物の力価に匹敵するＧＰ特異的ＩｇＧ結合剤力価が生じたため、本明細書における保護の改善は、強力なＡｂの誘導によるものであり得る；ＤＮＡワクチン接種は、３回の遺伝子銃ワクチン接種後、２．７及び３．０に対して、単回投与後、それぞれ３．８５及び２．１８ｌｏｇ１０のＺＧＰ及びＭＧＰ特異的Ａｂ力価を誘導した。モルモットにおける代替の「単回投与」保護戦略との比較のために、Ａｇ－結合ウイルス様粒子（ＶＬＰ）プラットフォームは、ＤＮＡワクチン接種後に観察されたものよりもわずかに高いＡｂ力価を生成した（ＳｗｅｎｓｏｎＤＬ，ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ＮｅｇｌｅｙＤＬ，ＳｃｈｍａｌｊｏｈｎＡ，ＡｍａｎＭＪ，ＢａｖａｒｉＳ（２００５）Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｅｘｈｉｂｉｔｐｏｔｅｎｔｉａｌａｓａｐａｎ－ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｆｏｒｂｏｔｈＥｂｏｌａａｎｄＭａｒｂｕｒｇｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ２３：３０３３－３０４２）。ウイルス様粒子は、エボラウイルス及びマールブルグウイルス感染の両方のための汎フィロウイルスワクチンとしての可能性を示す（Ｖａｃｃｉｎｅ２３：３０３３－３０４２）。さらに、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）アプローチは、単一のＤＮＡワクチン接種からのものよりも低いＺＧＰ特異的ＮＡｂ力価を誘発した（エンドポイント希釈力価が、本明細書中の８８に対して５３個）（ＫｏｂｉｎｇｅｒＧＰ，ｅｔａｌ．（２００６）．ＣｈｉｍｐａｎｚｅｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔＺａｉｒｅＥｂｏｌａｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３４６：３９４－４０１）。ｒＶＳＶを用いたワクチン接種（ＪｏｎｅｓＳＭ，ｅｔａｌ（２００７）．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆａｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅｂｙｕｓｅｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１９６Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ４０４－４１２）は、現在のプラットフォームに類似したＺＧＰ特異的Ａｂ力価を生成した。全体として、これらのデータは、ＤＮＡワクチン接種が、非複製ウイルスプラットフォームに匹敵するＡｂｓの結合及び中和を誘導することができ、これらのデータが本明細書中の強いモルモット生存データを部分的に説明するのに役立ち得ることを示す。

保護ＤＮＡワクチン接種によるＮＡｂの生成は、導入遺伝子を発現した成熟ＧＰ構造によって恩恵を受けていた可能性がある。ｉｎｖｉｔｒｏ形質移入試験により、ワクチンにコードされたＧＰは高度に発現し、翻訳後に切断され（図１Ｂ）、細胞表面に輸送され、細胞表面分子の免疫検出を立体的に閉塞したことが確認された（図１Ｃ）。したがって、本明細書において形成されたワクチン免疫原は、他の点では感染時にビリオン集合体上で機能するであろうヘテロ三量体スパイクに成熟した可能性が高い。これは、コンホーメーション依存性Ｎａｂの誘導にその後重要であるウイルス学的に関連する中和決定基の生成及び表示にとって重要であり得る（ＤｏｗｌｉｎｇＷ，ｅｔａｌ．（２００７）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｎａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｅｂｏｌａｖｉｒｕｓＧＰＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓ．ＪＶｉｒｏｌ８１：１８２１－１８３７；ＳｈｅｄｌｏｃｋＤＪ，ＢａｉｌｅｙＭＡ，ＰｏｐｅｒｎａｃｋＰＭ，ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍＪＭ，ＢｕｒｔｏｎＤＲ，ＳｕｌｌｉｖａｎＮＪ（２０１０）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｃａｎｏｃｃｕｒｂｙｔｗｏｄｉｓｔｉｎｃｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４０１：２２８－２３５）。したがって、この点に関して、ネイティブのアンカー構造の発現は、ＮＡｂを生成する能力において、可溶性誘導体よりも優れている可能性がある（ＳｕｌｌｉｖａｎＮＪ，ｅｔａｌ．（２００６）．ＩｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓａｇａｉｎｓｔＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｗｉｔｈｓｉｎｇｌｅｌｏｗ－ｄｏｓｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｅｎｃｏｄｉｎｇｍｏｄｉｆｉｅｄＧＰｓ．ＰＬｏＳＭｅｄ３：ｅｌ７７；ＸｕＬ，ｅｔａｌ．（１９９８）．ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｆｏｒＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＮａｔＭｅｄ４：３７－４２）。

保護ワクチンによって駆動されるＴ細胞応答をよりよく特徴づけるために、マウスで免疫原性及び有効性試験を行い、ＤＮＡワクチン接種によるｍＺＥＢＯＶに対する完全な「単回投与」保護を決定した（図５Ａ～５Ｄ）。今日まで、このモデルにおいて完全な保護を与える最も有効なプラットフォームは、アジュバントあり（ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ｅｔａｌ．（２００５）．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍｏｒａｌａｎｄＣＤ８＋ＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７５：１１８４－１１９１；ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ＳｗｅｎｓｏｎＤＬ，ＯｌｉｎｇｅｒＧＧ，ＫａｌｉｎａＷＶ，ＡｍａｎＭＪ，ＢａｖａｒｉＳ（２００７）．Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅ－ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓａｇａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｃｈａｌｌｅｎｇｅ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１９６Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ４３０－４３７）、またはアジュバントなし（ＳｕｎＹ，ｅｔａｌ．（２００９）．ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅｂｙＥｂｏｌａｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３８３：１２－２１）のＶＬＰ、ｒＡｄワクチン接種（（ＫｏｂｉｎｇｅｒＧＰ，ｅｔａｌ．（２００６）上記；ＣｈｏｉＪＨ，ｅｔａｌ．（２０１２）．Ａｓｉｎｇｌｅｓｕｂｌｉｎｇｕａｌｄｏｓｅｏｆａｎａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｌｅｔｈａｌＥｂｏｌａｃｈａｌｌｅｎｇｅｉｎｍｉｃｅａｎｄｇｕｉｎｅａｐｉｇｓ．ＭｏｌＰｈａｒｍ９：１５６－１６７；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＪＳ，ｅｔａｌ．（２００９）．ＥｎｈａｎｃｅｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙａｎｉｍｐｒｏｖｅｄａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅ．ＰＬｏＳＯｎｅ４：ｅ５３０８）、またはｒＲＡＢＶワクチン接種（ＢｌａｎｅｙＪＥ，ｅｔａｌ．（２０１１）．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｏｒｌｉｖｅ－ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｂｉｖａｌｅｎｔｖａｃｃｉｎｅｓｔｈａｔｃｏｎｆｅｒｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｒａｂｉｅｓａｎｄＥｂｏｌａｖｉｒｕｓｅｓ．ＪＶｉｒｏｌ８５：１０６０５－１０６１６）である。しかしながら、Ｔ細胞応答の特徴付けは、これらの研究では著しく制限されており、上記のＺＧＰＴ細胞エピトープを含むことが以前に記載された２つ（ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，（２００７）、上記）または１つ（ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ｅｔａｌ．（２００５）上記）のいずれかのペプチドの脾細胞刺激に限定されていた。（ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ｅｔａｌ．（２００５）上記。ＯｌｉｎｇｅｒＧＧ，ｅｔａｌ．（２００５）上記；ＫｏｂｉｎｇｅｒＧＰ，ｅｔａｌ．（２００６），上記；ＳｕｎＹ，ｅｔａｌ．（２００９）．Ｃｈｏｉ，ＪＨ，ｅｔａｌ．（２０１２）。本明細書では、新規改変Ｔ細胞アッセイ（図４Ａ及び表１～６）によって広範に分析されるように、保護ワクチン接種によるロバストで広範なＣＴＬの誘導を報告する。ＧＰの高度保存領域に主に存在する多数の免疫優性エピトープを含む、合計５２の新規Ｔ細胞エピトープを同定した。同定した全２２個のＺＧＰエピトープのうち、わずか４個のみが以前に報告されたものであった。さらに、２０個のＭＧＰのうち１つ（ＫａｌｉｎａＷＶ，ＷａｒｆｉｅｌｄＫＬ，ＯｌｉｎｇｅｒＧＧ，ＢａｖａｒｉＳ（２００９）．ＤｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｃｏｍｍｏｎｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎａＢＡＬＢ／ｃｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌ．ＶｉｒｏｌＪ６：１３２）及び１６のＳＧＰエピトープのうちの１つが以前に記載されたものであった。このように、本明細書は現在までの前臨床ＧＰエピトープの最も包括的な報告であり、２つの異なる遺伝的バックグラウンドのマウスの複数のフィロウイルス由来のＧＰエピトープを記載している。

これらの分析から得られた別の新規な知見は、ワクチン誘導性の副甲状腺Ｔ細胞応答の評価であり、これは広範なＴ細胞応答のかなりの割合を占め、広範に１２％～７４％の範囲であった（図４Ｄ）。準優位応答は、保護に大きく貢献することができるため、これは特に重要であり得る。したがって、保護に対する準優位及び免疫優性のエピトープＴ細胞応答の特異的寄与を決定することは将来的に有益であることを示している可能性がある。注目すべきことに、エピトープ同定のための伝統的なマトリックスアレイペプチドプールを使用して、これらの応答が見過ごされてきた可能性がある。したがって、以前の研究における限定されたエピトープ検出は、低レベルのワクチン誘発免疫、低感度標準アッセイの使用、及び／または免疫優性ＣＤ８＋エピトープの検出に有利なペプチド配列及び／またはアルゴリズムの使用に直接関連している可能性がある。

フィロウイルスに対する免疫相関の議論は依然として議論の余地があるが、この高度に免疫原性のアプローチによって生成されるデータは、保護ワクチンによって引き起こされるＴ細胞免疫を研究するユニークな機会を提供する。本明細書のＤＮＡワクチン接種は、強力なＺＧＰ特異的Ｔ細胞を誘導し、その大部分は、ヒトにおいてＴ細胞の細胞傷害性と相関することが示された高レベルのＴ－ｂｅｔを発現するＴ_ｈ１型多機能性ＣＴＬを特徴とする。主に液性免疫応答及びＣＤ４＋Ｔ細胞に偏った細胞性免疫を生成することができる以前のスタンドアローンＤＮＡワクチンプラットフォームは、ＮＨＰ及び臨床において強力なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することが最近示されたｉｎｖｉｖｏＥＰ送達の利点を得られる可能性がある。したがって、本明細書のデータは、ＮＨＰ免疫原性及び有効性試験におけるスタンドアローンまたはプライムブースト様式としての本アプローチと一致する。本アプローチは、フィロウイルス科の生物脅威の状況及びアウトブレイク中の迅速な対応のために、迅速かつ安価に改変及び／または生産することができる、魅力的なワクチン接種戦略を提供する。さらに、本モデルアプローチは、フィロウイルス疾患に対する保護免疫相関を研究するための重要なツールを提供し、既存のプラットフォームに適用して将来の戦略を導くことができる。

実施例２
３つのプラスミドを含む３価ワクチンを提供する。第１のプラスミドは、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変した、ＺＥＢＯＶＣＯＮ（配列番号１）に基づくザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変した、ＳＵＤＶＣＯＮ（配列番号２）に基づくスーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ（ＭＡＲＶＡＮＧ（配列番号３）に基づくＭＡＲＶ免疫原であって、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変したＭＡＲＶ免疫原）をコードする核酸配列を含む。

実施例３
５つのプラスミドワクチンを提供する。第１のプラスミドは、ＺＥＢＯＶＣＯＮ、配列番号１であるザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、ＳＵＤＶＣＯＮ、配列番号２であるスーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、マーブルグマーブルグウイルスラビン、ダーバ（０９ＤＲＣ９９）及びウガンダ（０２Ｕｇａ０７Ｙ）を用いる、配列番号４、マールブルグマールブルグウイルス－ラビンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第４のプラスミドは、オゾリン、ウガンダ（０１Ｕｇａ０７）、及びダーバ（０５及び０７ＤＲＣ９９）を用いる、配列番号５、マールブルグマールブルグウイルス－オゾリンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第５のプラスミドは、（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、及びＬｅｉｄｅｎ）を用いる、配列番号６、マールブルグマールブルグウイルス－Ｍｕｓｏｋｅクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。

実施例４
５つのプラスミドワクチンを提供する。第１のプラスミドは、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変した、ＺＥＢＯＶＣＯＮ（配列番号１）に基づくザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変したＳＵＤＶＣＯＮ（配列番号２）に基づくスーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、配列番号４に基づくマールブルグマールブルグウイルスＲａｖコンセンサスをコードする核酸配列、マールブルグマールブルグウイルスラビンダーバ（０９ＤＲＣ９９）及びウガンダ（０２Ｕｇａ０７Ｙ）を用い、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス－Ｒａｖ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変した、マールブルグマールブルグウイルス－ラビンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮ）を含む。第４のプラスミドは、オゾリン、ウガンダ（０１Ｕｇａ０７）、及びダーバ（０５及び０７ＤＲＣ９９）を用いるマールブルグマールブルグウイルス－オゾリンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮ）である配列番号５に基づくマールブルグマールブルグウイルスＯｚｏコンセンサスをコードし、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス－Ｏｚｏ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変した核酸配列を含む。第５のプラスミドは、配列番号６に基づくマールブルグマールブルグウイルスＭｕｓコンセンサス、（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、及びＬｅｉｄｅｎ）を用い、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス－Ｍｕｓ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変したマールブルグマールブルグウイルス－Ｍｕｓｏｋｅクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。

実施例５
６つのプラスミドワクチンを提供する。第１のプラスミドは、ＺＥＢＯＶＣＯＮ、配列番号１であるザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、ＳＵＤＶＣＯＮ、配列番号２であるスーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、マールブルグマールブルグウイルス－ラビン、ダーバ（０９ＤＲＣ９９）及びウガンダ（０２Ｕｇａ０７Ｙ）を用いる、配列番号４、マールブルグマールブルグウイルス－ラビンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第４のプラスミドは、オゾリン、ウガンダ（０１Ｕｇａ０７）、及びダーバ（０５及び０７ＤＲＣ９９）を用いる、配列番号５、マールブルグマールブルグウイルス－オゾリンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第５のプラスミドは、（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、及びＬｅｉｄｅｎ）を用いる、配列番号６、マールブルグマールブルグウイルス－Ｍｕｓｏｋｅクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第６のプラスミドは、配列番号３、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５単離糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む。

実施例６
５つのプラスミドワクチンを提供する。第１のプラスミドは、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変した、配列番号１のＺＥＢＯＶＣＯＮに基づくザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変した、配列番号２のＳＵＤＶＣＯＮに基づくスーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、配列番号４に基づくマールブルグマールブルグウイルスＲａｖコンセンサス、マールブルグマールブルグウイルスラビンダーバ（０９ＤＲＣ９９）及びウガンダ（０２Ｕｇａ０７Ｙ）を用いるマールブルグマールブルグウイルス－ラビンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＲＡＶＣＯＮ）をコードし、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス－Ｒａｖ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変した核酸配列を含む。第４のプラスミドは、配列番号５に基づくマールブルグマールブルグウイルスＯｚｏコンセンサス、オゾリン、ウガンダ（０１Ｕｇａ０７）、及びダーバ（０５及び０７ＤＲＣ９９）を使用するマールブルグマールブルグウイルス－オゾリンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＯＺＯＣＯＮ）をコードし、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス－Ｏｚｏ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された核酸配列を含む。第５のプラスミドは、配列番号６に基づくマールブルグマールブルグウイルスＭｕｓコンセンサス、（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、及びＬｅｉｄｅｎ）を用いる、マールブルグマールブルグウイルス－Ｍｕｓｏｋｅクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ－ＭＵＳＣＯＮ）をコードし、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス－Ｍｕｓ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された核酸配列を含む。第６のプラスミドは、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変したＭＡＲＶＡＮＧ、配列番号３に基づくマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５単離糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む。

実施例７
本明細書において、３つの合成ザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）糖タンパク質（ＧＰ）を発現するＤＮＡワクチン製剤を記載する：ＧＰ配列アラインメント（１９７６－２０１４）に基づいて設計した２つと、２０１４のアウトブレイク株に適合する第３のコンストラクト。プラスミドＩＬ－１２（ｐＩＬ－１２）もまた、細胞性免疫応答をさらに増強するためのアジュバントとして含めた。多価ＧＰＤＮＡワクチン製剤を、ＤＮＡ－ＤＮＡプライムブースト免疫化レジメンに従ってマカクに投与した。マカク（ｎ＝３または４／群）には、筋肉内送達及びその後の電気穿孔法によって多価ＧＰＤＮＡ製剤＋ｐＩＬ－１２を与えた。免疫原性の差異をアッセイし、異なる用量、レジメン（２、３、４、及び５回の注射）、及びその後の投与の間の異なる間隔での保護をモニタリングした。抗体及びＴ細胞応答の両方が、第１回注射の２週間後の動物の８３％及び第２回注射後の動物の１００％で観察された。マカクに、致死量のＥＢＯＶギニア・マコーナアウトブレイク株（１０００ｐｆｕ、７－Ｕウイルス）をチャレンジし、感染後２８日間モニタリングした。４週間の間隔で少なくとも３回の注射を受けた動物の１００％が致命的なチャレンジを生き延びた。動物は病気の徴候から完全に保護され、血液化学の上昇を示さなかった。興味深いことに、２回の注射を受けた動物の５０％が致命的なチャレンジで生き残った。生存動物は病気の徴候を最小限に抑え、さらなる最適化により、２回の注射による完全な保護が潜在的に達成可能であることが示唆された。マウスにおけるさらなる最適化研究では、単回注射が１００％保護的であり、ワクチン接種後８か月の長期免疫反応を誘発したことが判明した。

方法
ＥＢＯＶＧＰＤＮＡワクチン製剤の開発
現在臨床試験中のワクチンには、ｒＶＳＶΔＧ／ＺＥＢＯＶＧＰ、ＣｈＡｄ３プライム＋ＭＶＡブースト、及びＭＶＡ汎フィロウイルスが含まれる。これらのワクチンは免疫原性であり、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で保護され、単回投与保護を提供するが、抗ベクター免疫を発達させ、記憶応答の持続時間が不確定であり、ヒト臨床試験において有害反応をもたらし、すべての集団に適してはいない可能性がある。したがって、異種ザイールエボラウイルスに対する強い免疫応答を誘導することができる、よりクリーンな安全特性を有する追加のプラットフォームは、非常に有益であろう（図９）。

３つのＥＢＯＶＤＮＡ構築物を設計した：ＺＥＢＯＶ（１９７６－１９９６）（ＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃１）、ＺＥＢＯＶ（２００２－２００８）（ＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃２）、及び２０１４年のギニアアウトブレイク（ギニアＧＰ）からの一致したＺＥＢＯＶ配列のコンセンサス配列。５つのワクチン、単一のＤＮＡ構築物のみを含む一価ワクチン、ＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃１とギニアＧＰの二価ワクチン製剤、ならびにＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃１、ＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃２、及びギニアＧＰの３つすべてを含む三価製剤（図１０）。

結果
ＤＮＡワクチンの単回免疫化はマウスにおいて免疫原性である
ワクチン製剤の電気穿孔（ＥＰ）に続いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスに単一の筋肉内（ＩＭ）免疫化を与えた。２８日目に、全ＩｇＧ抗体価及びＥＬＩＳＰＯＴ－ＩＦＮγを測定した。各ワクチン製剤は、ロバストなＩｇＧ応答を生じた。ＩＦＮγ、ＩＬ２、及びＴＮＦαを分泌する多機能ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、すべてのワクチン及び製剤について同様であった（図１１）。

マウスの致死的マウス適応エボラウイルスチャレンジに対して、単一免疫化は完全に保護的である
二価または三価のワクチン製剤で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０００ＬＤ_５０の異種エボラウイルスで致死的チャレンジを行った。チャレンジ株はマウス適応型ＥｂｏｌａＭａｙｉｎｇａ１９７６であった。対照プラスミドｐＶａｘ１でワクチン接種したマウスは急速に体重を減少させ、７日目には生存していなかった。しかしながら、２価ワクチン製剤接種マウス及び３価ワクチン製剤接種マウスは、最大２０日目まで死亡したマウスはなかった（図１２）。

個々のＧＰＤＮＡワクチン構築物は、マウスにおいてロバストな記憶応答を誘導する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、一価ワクチンの３ｘＩＭ４０μｇ免疫化、続いて０、２８及び８４日の電気穿孔を与えた。ＩｇＧ抗体価、ＩＮＦγ、ＣＤ４＋ＣＤ４４＋記憶Ｔ細胞、及びＣＤ８＋ＣＤ４４＋記憶Ｔ細胞を測定した。ロバストな免疫応答は、最後の注射後数か月で検出可能であった（図１３）。

ＧＰＤＮＡワクチン製剤は、ＮＨＰにおいて免疫原性である
カニクイザルは、エボラワクチンの有効性と致死的チャレンジのモデルであるため、これをＮＨＰとして使用した。カニクイザルには、ＲｈｅｓｕｓｐＩＬ１２アジュバントとともに二価製剤、またはＲｈｅｓｕｓｐＩＬ１２アジュバントＩ．Ｍ．とともに三価製剤のいずれかを投与し、続いてＥＰを投与した。免疫原性を理解するための異なる注射レジメン。グループ１には、４週間間隔で２価製剤の２回のＩＭ－ＥＰ注射を与えた。グループ２には、４週間間隔で３価製剤の２回のＩＭ－ＥＰ注射を与えた。グループ３には３価製剤の３回のＩＭ－ＥＰ注射を与えた。免疫原性試験のための試料は、毎月採取し、最後の投与後１か月間採取した。（図６）。各ＤＮＡワクチン製剤は、ロバストな抗エボラＧＰ抗体応答（ＧＭＴ＞１０^３）及び抗ＧＰＴ細胞応答を誘導した。各注射後に免疫応答を増強した（図１４）。

ＧＰＤＮＡ製剤ワクチンは、致命的なザイールエボラウイルス（マコーナ）チャレンジから保護する
グループ１、２及び３由来のカニクイザルに、最終的なＤＮＡ免疫化から投与２８日後の１０００ＴＣＩＤ５０ギニア－マコーナ２０１４Ｃ０７ウイルス（７－Ｕ参照株）をチャレンジした。チャレンジ後２８日間、動物をモニタリングした。チャレンジ後１０日目に、対照動物が生存していなかったのに対し、チャレンジ後２８日目にグループ３動物の４／４が生存し、チャレンジ後２８日目にグループ２動物の４／８が生存し、チャレンジ後２８日目にグループ１動物の３／４が生存した。（図１５）。生存動物には重大な疾患の徴候はなかった。それらはまた、正常なＣＢＣ及び酵素レベルを維持していた。ＩＭ－ＥＰによって送達される二価及び三価のＤＮＡワクチンは、最終的なＤＮＡ注射後３か月以上検出可能な長期抗体及びＴ細胞応答を誘発する（図４３）。

三価ＥＢＯＶＧＰＤＮＡワクチンの３用量は、致死的ＥＢＯＶチャレンジに対して１００％保護性である。２価のＥＢＯＶＧＰＤＮＡワクチンを２回投与すると７５％の保護効果が得られる。全体として、データは、エボラ及び他の感染性病原体に対する可能な投与のために、ＩＭ－ＥＰによって送達されるＤＮＡワクチンのさらなる研究を支持する。

ＥＢＯＶ－００１相Ｉ臨床
ＩＮＯ－４２１２の非盲検試験（ＩＮＯ－９０１２の存在下または非存在下）を実施した。ＩＮＯ－４２１２をＩＭまたはＩＤで投与した後、健康なボランティアで電気穿孔を行った。安全性及び免疫学的評価をモニタリングした。皮内送達及び筋肉内送達を比較した。被験者は合計６９人であった。免疫化の前、ならびに２、６、及び１４週において、ＥＬＩＳＡ分析を行った（ベースライン）。血清学的検査は、エボラ・ザイール糖タンパク質に対する陽性ＩｇＧ抗体応答として定義される。

ＩＮＯ－４２０１は、１９７６年、１９９４年、１９９５年、１９９６年、２００３年、２００５年、２００７年及び２００８年のアウトブレイク株のエンベロープ糖タンパク質配列を用いて生成され、ウシ成長ホルモンの３’末端ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）を有するヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動されるザイールエボラウイルス（ＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃１）のコンセンサスエンベロープ糖タンパク質で製剤化したＤＮＡワクチンである。ｐＧＸ４２０１は、ザイールエボラウイルスの合成コンセンサスエンベロープ糖タンパク質遺伝子をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位でｐＧＸ０００１にクローニングすることによって作製した。

１９７６年、１９９４年、１９９５年、１９９６年、２００３年、２００５年、２００７年及び２００８年のアウトブレイク株のエンベロープ糖タンパク質配列を用いて、ザイールエボラウイルスのコンセンサスエンベロープ糖タンパク質配列を生成することにより、ＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃１（ＣｏｎＧＰ１）配列を構築した。簡潔に述べると、１９７６年、１９９４年、１９９５年、１９９６年、２００３年及び２００５年のアウトブレイク株の６つのエンベロープ配列に基づいて、コンセンサスＧＰ配列を最初に生成した。２００３年、２００５年、２００７年及び２００８年の株が、公開された配列データで最も最近の致死的なアウトブレイクであったため、その後、これらにおいて、３７７、４３０及び４４０位の３つの非コンセンサス残基を加重した。選択したアウトブレイク株ＧＰ配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は：Ｑ０５３２０、Ｐ８７６７１、ＡＡＣ５７９８９、ＡＥＫ２５４９５、ＡＢＷ３４７４３、Ｐ８７６６６、ＡＥＲ５９７１８、ＡＥＲ５９７１２、ＡＢＷ３４７４２、ＡＡＬ２５８１８である。コンセンサスＧＰ１配列を得た後、上流のコザック配列をＮ末端に付加した。さらに、より高いレベルで発現させるために、この遺伝子のコドン使用を、ホモサピエンス遺伝子のコドンバイアスに適合させた。さらに、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量及び内部ＴＡＴＡボックス、カイサイト及びリボソーム進入部位などのシス作用配列モチーフを回避したＲＮＡ最適化もまた実施した。合成したＣｏｎＧＰ１をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、発現ベクターにクローニングした。

ＩＮＯ－４２０２は、ヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）により駆動され、ウシ成長ホルモンの３’末端アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）ポリ－ＨＣＭＶプロモーターによって駆動され、ギニア（ギニアＧＰ）における２０１４アウトブレイクから単離したザイールエボラウイルスのエンベロープ糖タンパク質を発現するＤＮＡプラスミドで製剤化したＤＮＡワクチンである。

ＩＮＯ－４２１２は、ＩＮＯ－４２０１及びＩＮＯ－４２０２の二価ワクチンである。

図１７は、各コホートのワクチン製剤スケジュール、経路及び用量を示す。最初の注射後、患者の１５％以下が血清陽性であった。２回目の注射後、患者の５０～１００％が血清陽性であった。３回目の注射後、患者の７９～１００％が血清陽性であった（図１８）。中等度ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔまたは高度ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔを有する２人の代表的な患者が特異的なＴ細胞応答を示した（図１９）。

ＮＩＡＩＤＶＲＣ／ＧＳＫ及びｒＶＳＶ／ＺＥＢＯＶＧＰを含む他のエボラワクチンプラットフォームは現在臨床試験中であるが、本明細書に記載される現在の二価及び三価ワクチンは、他のワクチンプラットフォームでは認められない利点を有する。例えば、二価または三価のワクチンはＩＭまたはＩＤで投与することができ、他のワクチンプラットフォームはＩＭのみを投与する。重要なことに、ＮＩＡＩＤＶＲＣ／ＧＳＫ及びｒＶＳＶ／ＺＥＢＯＶＧＰは、発熱、疲労、関節痛及びリンパ球減少を含む副作用を示すが、二価及び三価ワクチンは副作用を示さない。しかしながら、ｒＶＳＶ／ＺＥＢＯＶＧＰ及びＣｈＡｄ３／ＭＶＡＧＰの副作用のいくつかは、エボラの症状と重複することに留意すべきである。さらに、二価及び三価のワクチンは、ｒＶＳＶ／ＺＥＢＯＶＧＰ及びＣｈＡｄ３／ＭＶＡＧＰより１～２桁大きい抗体力価を与える（図２０）。

ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）－３Ｐ装置を用いて、２ｍｇＤＮＡ／用量で２回の別々の１ｍｇ（０．１ｍＬ）ＩＤ（Ｍａｎｔｏｕｘ）注射としてＩＮＯ－４２０１を投与し、続いてＥＰを投与するように被験者（ｎ＝１５）を割り当てた。被験者には、０週目、４週目、及び１２週目（０－４－１２週スケジュール）に免疫化する３回投与系列を与えた。ＥＢＯＶ糖タンパク質（ＧＰ）に特異的な抗体を、ワクチン接種した被験者の血清から結合ＥＬＩＳＡで測定した。０日目を上回る逆エンドポイント力価を、各免疫化の２週間後に示す（図２２）。ＩＮＯ－４２０１でワクチン接種した被験者の１００％が、２回の免疫化の後に抗体陽転した（図２２、コホート３及び図２４）。

実施例８
実施例７に記載の３つのＥＢＯＶＤＮＡ構築物に対する免疫応答データを記載する：ＺＥＢＯＶ（１９７６－１９９６）（ＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃１またはＩＮＯ－４２０１）、ＺＥＢＯＶ（２００２－２００８）（ＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃２）のコンセンサス配列、及び２０１４年のギニアアウトブレイクからのマッチＺＥＢＯＶ配列（ギニアＧＰ）。５つのワクチン、単一のＤＮＡ構築物のみを含む一価ワクチン、いずれかのＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃１とギニアＧＰを含む二価ワクチン製剤、ならびにＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃１、ＣｏｎＥＢＯＶＧＰ＃２、及びギニアＧＰの３つすべてを含む三価製剤を開発した。コホート１～５の６９名の被験者を、ＥＬＩＳＡによる免疫応答の分析に含め、コホート１～５の７５名の被験者を、ＥＬＩＳｐｏｔによる免疫応答の分析に含めた（図２１、２５）。

コホート及び時間点によるＥＬＩＳＡ力価
抗ＥＢＯＶＲの力価を、第２、６及び１４週で各コホートについて測定した。第６週までに、各コホートは、０日目を上回る抗体力価の増加が認められた（図２２～２３）。各コホートの初回投与の反応性はほとんどまたは全くなかった。用量２は抗体陽転を開始し、コホート３及び５は最大の頻度を示す。３投与は４／５コホートを＞９０％抗体陽転させる。コホート３及び５は、この時点で１００％の抗体陽転を示す（図２４）。

ペプチドプールによる被験者応答
コホート応答をペプチドプールによって分析した（図２６～３３）。ＥＬＩＳｐｏｔ異常値を分析するために、各プールの第０日の値及び総ＥＢＯＶ応答を使用して異常値の閾値（平均日０値＋（０日の３×ＳＴＤＥＶ））を作成した。この閾値は、正規分布した母集団の９９％を包含すべきである。異常値の閾値より大きいベースライン値を表示した被験者はすべて除去し、残りの被験者とともに応答基準を生成した。

ＩＣＳ分析
全コホートからの４７人の被験者を分析に含めたが、コホート５は不十分であった（図３５）。ベースライン及び１４週目にＩＣＳ分析を行った。プール１～４からなる単一のＥＢＯＶペプチドプールを刺激に使用する。ＣＤ４及びＣＤ８区画の両方からのＩＦＮｇまたはＴＮＦａ産生の形態でのＴ細胞活性の分析は、コホート３のみでのＴＮＦα及び／またはＩＦＮｇの上昇と同様にＣＤ４及びＣＤ８区画の両方におけるＴＮＦαの有意な上昇を示唆する（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ整合ペア分析、両側）。

免疫のまとめ
コホート３（ＩＤ）患者の１００％が、２回の投与後に抗体陽転した。コホート５（ＩＭ＋ＩＬ１２）患者の９２％が２回投与後に抗体陽転し、３回投与後に１００％抗体陽転した。他のコホートは、２回の投与後には最高で６７％を示し、３回の投与後には９３％の高さに及んだ。

すべての患者を分析すると：最良の応答頻度はコホート２及び４であり、それぞれ５３％及び５７％であった。コホート３は４０％の反応を示した。コホート５におけるＩＬ－１２の添加は応答率（４７％）に影響しないようであった。外れた８個の異常値を除外した患者を分析すると、応答頻度は、コホート２及びコホート４で、それぞれ８４．６％及び７６．９％であった。コホート３は６４．３％の反応を示した。コホート５におけるＩＬ－１２の添加は、奏効率に影響しないようであった（５３．３％）。

ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の両方は、コホート３においてＴＮＦａ及びＴＮＦａ及び／またはＩＦＮｇの高い発現を示した（ベースラインに対して統計学的に有意であり、Ｗｉｌｃｏｘｏｎマッチペア試験、両側）。

ＩＮＯ－４２０１による免疫化は健康なボランティアで十分に許容され、グレード３またはグレード４のＳＡＥは認められなかった。ＩＮＯ－４２０１はロバストなエボラＧＰ特異的抗体（ＧＭＴ４６，９６８）を誘導し、ＩＮＯ－４２０１の２回の投与の後の結合ＥＬＩＳＡ測定による１００％の抗体陽転をもたらした。ＩＮＯ－４２０１の投与は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳｐｏｔ（１０^６個のＰＢＭＣ当たり２９５．３ＳＦＵ）によって評価されるＥＢＯＶＧＰ特異的Ｔ細胞応答を生じ、ＣＤ８＋Ｔ及びＣＤ４＋Ｔ細胞区画の両方におけるＩＦＮγまたはＴＮＦαの産生の有意な増加を生じた。Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ装置を用いたＩＮＯ－４２０１の皮内投与は、液性及び細胞性ＥＢＯＶＧＰ特異的イムノアッセイの両方によって評価されるように、忍容性及び免疫原性の両方が優れている。これらの結果は、ＩＮＯ－４２０１が予防的エボラワクチンのさらなる臨床開発の強力な候補であることを示している。

実施例９－筋内電気穿孔により送達するザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）ＧＰＤＮＡワクチンの投与後のカニクイザルにおける持続的な液性及び細胞性免疫応答
本明細書において、清潔な安全性特性を有し、かつ血清に依存せず、可能な反復ベクター投与を可能にする新規エボラウイルス疾患（ＥＶＤ）ＤＮＡワクチンを提示する。３つの新規合成ザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）ＧＰＤＮＡワクチンを設計し、２価または３価製剤を開発した。両方のＥＢＯＶ－ＧＰＤＮＡワクチンは、カニクイザルにおける致死的ＥＢＯＶマコーナＣ０７チャレンジに対して高度に保護的（７５～１００％）であった。異なるレジメンの動物（ｎ＝４～５／群）を追跡し、ＤＮＡ免疫後の長期間の免疫原性をモニタリングした。すべてのＮＨＰは迅速に抗体陽転した。ＮＨＰは、ＩＦＮγ、ＩＬ２、及びＴＮＦαを発現する多機能性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞及び記憶サブセット集団（図４７～５９）における応答を含むＥＢＯＶＧＰ抗原に対する耐性全ＩｇＧ抗体力価及びＴ細胞応答を有する。同時に、データは強力な記憶免疫応答の生成と保護のためのＥＢＯＶ－ＧＰＤＮＡワクチンの供給を強く支持している。

ＥＢＯＶ－ＧＰＤａｎワクチンは、長期免疫応答を誘発し、１年間の追加免疫後に強いリコール応答を示す（図４９～５０）。単回のＩＭ注射を与えた群では、リコール反応が顕著に高かった（図５０）。

実施例１０
ペプチド配列及びペプチドの核酸配列をここに提示する。

エピトープ含有ペプチドを、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ（≧１０のＳＦＣ／１０^６脾細胞及び≧８０の応答率）によって同定し、ＦＡＣＳにより確認した（≧３～５×１０^４ＣＤ３＋細胞を獲得した）。それぞれの応答を、ＦＡＣＳによってさらに特徴づけた（ＣＤ３＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞によるＣＤ４及び／またはＣＤ８の発現）。予想されるＣＤ８＋エピトープに下線を付し（ＩＥＤＢによる最も高いコンセンサス％ランク）、前述のエピトープを参照する。免疫優勢エピトープを示す（^＊）。

［１］
第１コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原（ＺＥＢＯＶＣＯＮ）をコードする核酸、第２コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原（ＺＥＢＯＶＣＯＮ２）をコードする核酸、及びＺＥＢＯＶギニア２０１４アウトブレイクエンベロープ糖タンパク質免疫原（ＺＥＢＯＶＧＵＩ）をコードする核酸からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮが、配列番号１と少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列の断片を含み；
前記ＺＥＢＯＶＧＵＩが、配列番号６７と少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６７と少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列の断片を含み；ならびに
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮ２が、配列番号６８と少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６８と少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列の断片を含む、前記単離核酸分子。
［２］
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮが、配列番号１と少なくとも９９％相同であるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも９９％相同であるアミノ酸配列の断片を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［３］
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮが、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１の断片を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［４］
前記ＺＥＢＯＶＧＵＩが、配列番号６７と少なくとも９９％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６７と少なくとも９９％相同であるアミノ酸配列の断片を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［５］
前記ＺＥＢＯＶＧＵＩが、配列番号６７のアミノ酸配列または配列番号６７の断片を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［６］
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮ２が、配列番号６８に対して少なくとも９９％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６８に対して少なくとも９９％相同であるアミノ酸配列の断片を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［７］
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮ２が、配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の断片を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［８］
前記配列番号１と少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列の断片が、少なくとも６００個のアミノ酸、少なくとも６３０個のアミノ酸、または少なくとも６６０個のアミノ酸を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［９］
前記配列番号６７と少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列の断片が、少なくとも６００個のアミノ酸、少なくとも６３０個のアミノ酸、または少なくとも６６０個のアミノ酸を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［１０］
前記配列番号６８に対して少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列の断片が、少なくとも６００個のアミノ酸、少なくとも６３０個のアミノ酸、または少なくとも６６０個のアミノ酸を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［１１］
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮがＩｇＥシグナルペプチドに連結している、項目１に記載の単離核酸分子。
［１２］
前記ＺＥＢＯＶＧＵＩがＩｇＥシグナルペプチドに連結している、項目１に記載の単離核酸分子。
［１３］
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮ２がＩｇＥシグナルペプチドに連結している、項目１に記載の単離核酸分子。
［１４］
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮをコードする核酸が、少なくとも９５％相同な配列番号６９の核酸配列、またはその断片を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［１５］
前記ＺＥＢＯＶＧＵＩをコードする核酸が、少なくとも９５％相同な配列番号７２の核酸配列またはその断片を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［１６］
前記ＺＥＢＯＶＣＯＮ２をコードする核酸が、少なくとも９５％相同な配列番号７０の核酸配列またはその断片を含む、項目１に記載の単離核酸分子。
［１７］
項目１に記載の核酸分子を含む組成物。
［１８］
前記組成物が２つの核酸分子を含む、項目１８に記載の組成物。
［１９］
前記組成物が３つの核酸分子を含む、項目１８に記載の組成物。
［２０］
前記核酸分子がプラスミドである、項目１に記載の組成物。
［２１］
電気穿孔法を用いて個体に送達するように製剤化した、項目１～２０のいずれかに記載の組成物。
［２２］
ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２８からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、項目１～２０のいずれかに記載の組成物。
［２３］
フィロウイルスに対する免疫応答の誘導方法であって、項目１～２０のいずれかに記載の組成物を前記個体に免疫応答を誘導するのに有効な量で個体に投与することを含む、前記誘導方法。
［２４］
項目１～２０のいずれかに記載の組成物を個体に、前記個体に免疫応答を誘発するのに有効な量で投与することを含む、エボラウイルスに対する免疫応答の誘導方法。
［２５］
治療有効量の項目１～２０のいずれかに記載の組成物を個体に投与することを含む、エボラウイルスと診断された個体の治療方法。
［２６］
エボラウイルスを有すると診断された個体の治療方法であって、項目１～２０のいずれかに記載の組成物の治療有効量を個体に投与することを含む、前記治療方法。
［２７］
項目１～２０のいずれかに記載の組成物の予防有効量を個体に投与することを含む、個体におけるエボラウイルス感染の予防方法。
［２８］
個体におけるエボラウイルス感染の予防方法であって、項目１～２０のいずれかに記載の組成物の予防有効量を個体に投与することを含む、前記予防方法。

Claims

明細書に記載の発明。