CN110072536B - 丝状病毒共有抗原、核酸构建体和由其制成的疫苗及其使用方法 - Google Patents

丝状病毒共有抗原、核酸构建体和由其制成的疫苗及其使用方法 Download PDF

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Abstract

公开了包含一个或多个编码共有埃博拉病毒糖蛋白免疫原的核酸序列的核酸分子和组合物。所述编码序列任选地包括编码信号肽的可操作连接的编码序列。公开了免疫调节方法和诱导针对埃博拉病毒的免疫应答的方法。公开了预防埃博拉病毒的方法和治疗感染埃博拉病毒的个体的方法。公开了共有埃博拉病毒蛋白。

Description

丝状病毒共有抗原、核酸构建体和由其制成的疫苗及其使用 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月5日提交的美国临时申请号62/332,372，2016年9月30日提交的美国临时申请号62/402,519，以及2017年4月11日提交的美国临时申请号62/483,979的优先权，每个临时申请均特此通过引用整体并入。
技术领域
本发明涉及用于诱导免疫应答和预防丝状病毒感染和/或治疗感染丝状病毒的个体，特别是埃博拉病毒(Ebolavirus)感染的疫苗。本发明涉及共有埃博拉病毒蛋白和编码所述蛋白的核酸分子。
背景技术
丝状病毒科(Filoviridae)是非分段的单链RNA病毒，其含有两个不同的属，马尔堡病毒(Marburgvirus)(MARV)和埃博拉病毒(EBOV)。来自每个属的成员都可以引起严重且高致命性的出血热病，对于这些疾病没有治愈或许可疫苗(Bradfute S.B.等人(2011)Filovirus vaccines.Hum Vaccin 7:701-711；Falzarano D.等人(2011)Progress infilovirus vaccine development:evaluating the potential for clinicaluse.Expert Rev Vaccines 10:63-77；Fields B.N.等人(2007)Fields’virology.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins.2 v.(xix,3091,I-3086 p.)；Richardson J.S.等人(2009)Enhanced protection against Ebola virus mediated byan improved adenovirus-based vaccine.PLoS One 4:e5308；及Towner J.S.等人(2006)Marburgvirus genomics and association with a large hemorrhagic fever outbreakin Angola.J Virol 80:6497-6516)。
由于致死率高达90％，它们被世界卫生组织描述为“人类已知的最致命的病毒性疾病之一”。美国疾病控制和预防中心将其归类为“A类生物恐怖剂”，部分原因是如果它们被武器化对国家安全有潜在威胁(Burki T.K.(2011)USA focuses on Ebola vaccine butresearch gaps remain.Lancet 378:389)。理论上，这些“高优先级”剂很容易传播，导致高死亡率，引起重大公共卫生影响和恐慌，并且需要对公共卫生的准备采取特别措施(CDC(2011)Bioterrorism Agents/Diseases.Atlanta:Centers for Disease Control andPrevention)。
虽然它们易于在人和非人灵长类动物中通过直接接触受污染的体液、血液和组织而传播，但出血热疾病为急性感染性，无携带状态(Feldmann H.等人(2003)Ebola virus:from discovery to vaccine.Nat Rev Immunol 3:677-685)。在爆发情况期间，医疗设备的重复使用，资源有限的医疗机构以及预防措施的不及时应用会加剧疾病的传播，从而使医疗环境中的感染率扩大。
由于这些动物传染性病原体的天然储库很可能是非洲蝙蝠和猪(Kobinger G.P.等人(2011)Replication,pathogenicity,shedding,and transmission of Zaireebolavirus in pigs.J Infect Dis 204:200-208)，后者可能更多地是扩增宿主，病毒在爆发开始时首次出现的方式被认为是通过人与受感染动物的接触而发生的。这种疾病在菲律宾，可能在欧洲，并且主要是在非洲的不可预测的地方性疾病出现进一步构成了主要的公共卫生问题(Outbreak news.(2009)Ebola Reston in pigs and humans,Philippines.Wkly Epidemiol Rec 84:49-50)。
已经进行了实验以确定疫苗诱导保护效力和广泛CTL的能力，包括在啮齿动物临床前研究中的实验。(Fenimore PW等人(2012).Designing and testing broadly-protective filoviral vaccines optimized for cytotoxic T-lymphocyte epitopecoverage.PLoS ONE 7:e44769；Hensley LE等人，(2010).Demonstration of cross-protective vaccine immunity against an emerging pathogenic EbolavirusSpecies.PLoS Pathog 6:el000904；Zahn R等人，(2012).Ad35 and ad26 vaccinevectors induce potent and cross-reactive antibody and T-cell responses tomultiple filovirus species.PLoS ONE 7:e44115；Geisbert TW,Feldmann H(2011).Recombinant vesicular stomatitis virus-based vaccines against Ebola andMarburg virus infections.J Infect Dis 204增刊3:S1075-1081；及Grant-Klein RJ,Van Deusen NM,Badger CV,Hannaman D,Dupuy LC,Schmaljohn CS(2012).A multiagentfilovirus DNA vaccine delivered by intramuscular electroporation completelyprotects mice from ebola and Marburg virus challenge.Hum Vaccin Immunother 8；Grant-Klein RJ,Altamura LA,Schmaljohn CS(2011).Progress in recombinant DNA-derived vaccines for Lassa virus and filoviruses.Virus Res 162:148-161)。
已经描述了在许多临床前动物模型中疫苗诱导的适应性免疫应答(Blaney JE等人(2011).Inactivated or live-attenuated bivalent vaccines that conferprotection against rabies and Ebola viruses.J Virol 85:10605-10616；Dowling W等人(2007).Influences of glycosylation on antigenicity,immunogenicity,andprotective efficacy of ebola virus GP DNA vaccines.J Virol 81:1821-1837；JonesSM等人(2005).Live attenuated recombinant vaccine protects nonhuman primatesagainst Ebola and Marburg viruses.Nat Med 11:786-790；Kalina WV,Warfield KL,Olinger GG,Bavari S(2009).Discovery of common marburgvirus protectiveepitopes in a BALB/c mouse model.Virol J 6:132；Kobinger GP等人(2006).Chimpanzee adenovirus vaccine protects against Zaire Ebola virus.Virology346:394-401；Olinger GG等人(2005).Protective cytotoxic T-cell responsesinduced by Venezuelan equine encephalitis virus replicons expressing Ebolavirus proteins.J Virol 79:14189-14196；Rao M,Bray M,Alving CR,Jahrling P,Matyas GR(2002).Induction of immune responses in mice and monkeys to Ebolavirus after immunization with liposome-encapsulated irradiated Ebola virus:protection in mice requires CD4(+)T cells.J Virol 76:9176-9185；Rao M,MatyasGR,Grieder F,Anderson K,Jahrling PB,Alving CR(1999).Cytotoxic T lymphocytesto Ebola Zaire virus are induced in mice by immunization with liposomescontaining lipid A.Vaccine 17:2991-2998；Richardson JS等人(2009).Enhancedprotection against Ebola virus mediated by an improved adenovirus-basedvaccine.PLoS One 4:e5308；Vanderzanden L等人(1998).DNA vaccines expressingeither the GP or NP genes of Ebola virus protect mice from lethalchallenge.Virology 246:134-144；Warfield KL，等人(2005).Induction of humoraland CD8+T cell responses are required for protection against lethal Ebolavirus infection.J Immunol 175:1184-1191；Jones SM等人，(2007).Assessment of avesicular stomatitis virus-based vaccine by use of the mouse model of Ebolavirus hemorrhagic fever.J Infect Dis 196增刊2:S404-412 Grant-Klein RJ,VanDeusen NM,Badger CV,Hannaman D,Dupuy LC,Schmaljohn CS(2012).A multiagentfilovirus DNA vaccine delivered by intramuscular electroporation completelyprotects mice from ebola and Marburg virus challenge.Hum Vaccin Immunother8.；Geisbert TW等人(2010).Vector choice determines immunogenicity and potency ofgenetic vaccines against Angola Marburg virus in nonhuman primates.J Virol84:10386-10394。)病毒疫苗已显示出前景，并且主要包括重组腺病毒和水疱性口炎病毒。诸如重组DNA和Ag偶联病毒样颗粒(VLP)疫苗的非感染性策略也已经展示出临床前功效水平，并且通常被认为比基于病毒的平台更安全。当被动施加时，病毒特异性Ab在感染之前或之后立即施加时可以具保护性(Gupta M,Mahanty S,Bray M,Ahmed R,Rollin PE(2001).Passive transfer of antibodies protects immunocompetent and immunodeficientmice against lethal Ebola virus infection without complete inhibition ofviral replication.J Virol 75:4649-4654；Marzi A等人(2012).Protective efficacyof neutralizing monoclonal antibodies in a nonhuman primate model of Ebolahemorrhagic fever.PLoS ONE7:e36192；Parren PW,Geisbert TW,Maruyama T,JahrlingPB,Burton DR(2002).Pre-and postexposure prophylaxis of Ebola virus infectionin an animal model by passive transfer of a neutralizing human antibody.JVirol 76:6408-6412；Qiu X等人(2012).Ebola GP-Specific Monoclonal AntibodiesProtect Mice and Guinea Pigs from Lethal Ebola Virus Infection.PLoSNegl TropDis 6:el575；Wilson JA等人(2000).Epitopes involved in antibody-mediatedprotection from Ebola virus.Science 287:1664-1666；Sullivan NJ等人(2011).CD8(+)cellular immunity mediates rAd5 vaccine protection against Ebola virusinfection of nonhuman primates.Nat Med 17:1128-1131；Bradfute SB,Warfield KL,Bavari S(2008).Functional CD8+T cell responses in lethal Ebola virusinfection.J Immunol 180:4058-4066；Warfield KL,Olinger GG(2011).Protectiverole of cytotoxic T lymphocytes in filovirus hemorrhagic fever.J BiomedBiotechnol 2011:984241)。基于在敲除小鼠中进行的研究，NHP的耗竭研究和鼠过继转移研究还证实T细胞会提供保护作用，其中功效与过继转移的CD8+T细胞的溶解功能密切相关。然而，很少报道对由保护性疫苗驱动的这种应答的详细分析。
对策开发最终将会需要更好地了解保护性免疫相关性以及在感染过程中对其进行调节的方式。当患上丝状病毒疾病的受感染个体未能启动早期免疫应答时，这证明是困难的。这些扩散迅速的出血热疾病导致免疫失调，正如缺乏病毒特异性Ab应答和总T细胞数量大量减少所证明的那样，导致不受控制的病毒复制及多器官感染和衰竭。相反，埃博拉病毒(EBOV)疾病的幸存者表现出早期和短暂的IgM反应，随后病毒特异性IgG和CTL水平快速递增。这些观察结果表明，体液和细胞介导的免疫应答在赋予疾病防御方面起作用。许多临床前功效研究也支持这些数据，证明了疫苗诱导的适应性免疫对防御致死性攻击的贡献。然而，越来越多的证据证明T细胞在提供保护作用方面的关键作用，其中功效与CD8+T细胞的功能表型密切相关。虽然最近这些研究突出了T细胞在提供保护作用方面的重要性，但其确切贡献仍然没有得到表征且存在争议。此外，很少报道对由保护性疫苗驱动的这种应答的详细分析。
发明内容
提供了分离的核酸分子，其包含一个或多个编码第一共有扎伊尔埃博拉病毒(Zaire ebolavirus)包膜糖蛋白免疫原(ZEBOVCON)的核酸序列，编码第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原(ZEBOVCON2)的核酸，或编码ZEBOV几内亚2014爆发包膜糖蛋白免疫原(ZEBOVGUI)的核酸。
在一个实施方案中，ZEBOVCON包含与SEQ ID NO:1至少95％同源的氨基酸序列、与SEQ ID NO:1至少95％同源的氨基酸序列的片段、与SEQ ID NO:1至少99％同源的氨基酸序列、与SEQ ID NO:1至少99％同源的氨基酸序列的片段、SEQ ID NO:1的氨基酸序列、或SEQID NO:1的片段。
在一个实施方案中，ZEBOVCON2包含与SEQ ID NO:68至少95％同源的氨基酸序列、与SEQ ID NO:68至少95％同源的氨基酸序列的片段、与SEQ ID NO:68至少99％同源的氨基酸序列、与SEQ ID NO:68至少99％同源的氨基酸序列的片段、SEQ ID NO:68的氨基酸序列、或SEQ ID NO:68的片段。
在一个实施方案中，ZEBOVGUI包含与SEQ ID NO:67至少95％同源的氨基酸序列、与SEQ ID NO:67至少95％同源的氨基酸序列的片段、与SEQ ID NO:67至少99％同源的氨基酸序列、与SEQ ID NO:67至少99％同源的氨基酸序列的片段、SEQ ID NO:67的氨基酸序列、或SEQ ID NO:67的片段。
在一些实施方案中，片段包含至少600个氨基酸、至少630个氨基酸或至少660个氨基酸。
在一个实施方案中，ZEBOVCON与IgE信号肽连接。在一个实施方案中，ZEBOVCON2与IgE信号肽连接。在一个实施方案中，ZEBOVGUI与IgE信号肽连接。
在一个实施方案中，编码ZEBOVCON的核酸包含与SEQ ID NO:64至少95％同源的核酸序列，或其片段。在一个实施方案中，编码ZEBOVGUI的核酸包含与SEQ ID NO:69或SEQ IDNO:72至少95％同源的核酸序列，或其片段。在一个实施方案中，编码ZEBOVCON2的核酸包含与SEQ ID NO:70至少95％同源的核酸序列，或其片段。
在一个实施方案中，编码ZEBOVCON的核酸包含由与SEQ ID NO:64至少95％同源的DNA序列或其片段转录的核酸。在一个实施方案中，编码ZEBOVGUI的核酸包含由与SEQ IDNO:69或SEQ ID NO:72至少95％同源的DNA序列或其片段转录的核酸。在一个实施方案中，编码ZEBOVCON2的核酸包含由与SEQ ID NO:70至少95％同源的DNA序列或其片段转录的核酸。
还提供了包含一个或多个编码ZEBOVCON、ZEBOVCON2和ZEBOVGUI中的一种或多种的核酸序列的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含两个或更多个编码ZEBOVCON、ZEBOVCON2和ZEBOVGUI中的两种或更多种的核酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含两种核酸分子。在一个实施方案中，所述组合物包含三个或更多个编码ZEBOVCON、ZEBOVCON2和ZEBOVGUI的核酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含三种核酸分子。
本发明还提供了用于在哺乳动物细胞或病毒载体中产生免疫原的新型序列。
提供了一种组合物，其包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、编码共有苏丹埃博拉病毒(Sudan ebolavirus)包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、以及编码马尔堡马尔堡病毒(Marburg marburgvirus)安哥拉(Angola)2005包膜糖蛋白免疫原的核酸序列。共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:1(ZEBOV CON)、SEQ ID NO:1的片段、与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列的片段。与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:1 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:1的片段或与SEQID NO:1同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、630个或更多个、或660个或更多个氨基酸。共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:2(SUDVCON)、SEQ ID NO:2的片段、与SEQ ID NO:2同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2同源的氨基酸序列的片段。与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:2 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:2的片段或与SEQ ID NO:2同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、630个或更多个、或660个或更多个氨基酸。马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:3(MARVANG)、SEQ ID NO:3的片段、与SEQ ID NO:3同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3同源的氨基酸序列的片段。与SEQ ID NO:3同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:3 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:3的片段或与SEQ ID NO:3同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、637个或更多个、或670个或更多个氨基酸。氨基酸序列可任选地包含前导序列，诸如IgE前导序列。
还提供了一种组合物，其包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、编码共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、编码马尔堡马尔堡病毒第一共有包膜糖蛋白的核酸序列、编码马尔堡马尔堡病毒第二共有包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、以及编码马尔堡马尔堡病毒第三共有包膜糖蛋白免疫原的核酸序列。共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:1(ZEBOV CON)、SEQ ID NO:1的片段、与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列的片段。与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:1 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:1的片段或与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、630个或更多个、或660个或更多个氨基酸。共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:2(SUDV CON)、SEQ ID NO:2的片段、与SEQ ID NO:2同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2同源的氨基酸序列的片段。与SEQID NO:1同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:2 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:2的片段或与SEQ ID NO:2同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、630个或更多个、或660个或更多个氨基酸。马尔堡马尔堡病毒第一共有包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:4(MARV RAV)、SEQ ID NO:4的片段、与SEQ ID NO:4同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4同源的氨基酸序列的片段。与SEQ ID NO:4同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:4 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:4的片段或与SEQ ID NO:4同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、637个或更多个、或670个或更多个氨基酸。马尔堡马尔堡病毒第二共有包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:5(MARV OZO)、SEQ ID NO:5的片段、与SEQ ID NO:5同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:5同源的氨基酸序列的片段。与SEQ ID NO:5同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:495％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:5的片段或与SEQ ID NO:5同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、637个或更多个、或670个或更多个氨基酸。马尔堡马尔堡病毒第三共有包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:6(MARV MUS)、SEQ ID NO:6的片段、与SEQ ID NO:6同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6同源的氨基酸序列的片段。与SEQ ID NO:6同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:6 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:6的片段或与SEQ ID NO:6同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、637个或更多个、或670个或更多个氨基酸。氨基酸序列可任选地包含前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，组合物还包含编码马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的核酸序列。马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:3(MARV ANG)、SEQ ID NO:3的片段、与SEQ IDNO:3同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3同源的氨基酸序列的片段。与SEQ ID NO:3同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:395％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:3的片段或与SEQ ID NO:3同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、637个或更多个、或670个或更多个氨基酸。氨基酸序列可任选地包含前导序列，诸如IgE前导序列。
还提供了一种组合物，其包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列和编码共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列。共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:1(ZEBOV CON)、SEQ ID NO:1的片段、与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列的片段。与SEQ IDNO:1同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:1 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:1的片段或与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、630个或更多个、或660个或更多个氨基酸。共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列可为SEQ ID NO:2(SUDV CON)、SEQ ID NO:2的片段、与SEQID NO:2同源的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2同源的氨基酸序列的片段。与SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列通常与SEQ ID NO:2 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:2的片段或与SEQ ID NO:2同源的氨基酸序列的片段通常为600个或更多个、630个或更多个、或660个或更多个氨基酸。氨基酸序列可任选地包含前导序列，诸如IgE前导序列。
提供了一种组合物，其包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、编码共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、以及编码马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的核酸序列。编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列可为SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:64的片段、与SEQ ID NO:64同源的核酸序列、或与SEQ ID NO:64同源的核苷酸序列的片段。与SEQ ID NO:64同源的核酸序列通常与SEQID NO:64 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ IDNO:64的片段或与SEQ ID NO:64同源的氨基酸序列的片段通常编码由SEQ ID NO:64编码的共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的600个或更多个、630个或更多、或660个或更多个氨基酸。编码共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列可为SEQ ID NO:65、SEQID NO:65的片段、与SEQ ID NO:65同源的核酸序列、或与SEQ ID NO:65同源的核苷酸序列的片段。与SEQ ID NO:65同源的核酸序列通常与SEQ ID NO:65 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:65的片段或与SEQ ID NO:65同源的氨基酸序列的片段通常编码由SEQ ID NO:65编码的共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的600个或更多个、630个或更多、或660个或更多个氨基酸。编码马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的核酸序列可为SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:66的片段、与SEQID NO:66同源的核酸序列，或与SEQ ID NO:66同源的核苷酸序列的片段。与SEQ ID NO:66同源的核酸序列通常与SEQ ID NO:66 95％或更多、96％或更多、97％或更多、99％或更多、或99％或更多同源。SEQ ID NO:66的片段或与SEQ ID NO:66同源的氨基酸序列的片段通常编码由SEQ ID NO:66编码的马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的600个或更多个、630个或更多、或670个或更多个氨基酸。核酸序列可任选地包括编码前导序列的序列，所述前导序列诸如与编码免疫原的序列连接的IgE前导序列。
不同的核酸序列中的每种可以在单个核酸分子上，可以各自在单独的核酸分子上或各种排列上。核酸分子可为质粒。
可以配制组合物用于使用电穿孔向个体递送。
所述组合物还可包含编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的核酸序列：IL-12、IL-15和IL-28。
所述组合物可用于诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法中。丝状病毒可以选自由以下组成的组：马尔堡病毒、苏丹埃博拉病毒和扎伊尔埃博拉病毒。
提供了一种治疗已诊断有丝状病毒的个体的方法，其包括向个体施用治疗有效量的组合物。丝状病毒可以选自由以下组成的组：马尔堡病毒、苏丹埃博拉病毒和扎伊尔埃博拉病毒。
提供了预防个体的丝状病毒感染的方法。该方法包括向个体施用预防有效量的组合物。丝状病毒可以选自由以下组成的组：马尔堡病毒、苏丹埃博拉病毒和扎伊尔埃博拉病毒。
提供了包含两种或更多种选自由以下组成的组的蛋白质的组合物：共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原。
附图说明
图1A-1C涉及实施例1中的多价疫苗构建策略和表达实验。图1A显示了MGP(上)，SGP(右下)和ZGP(左下)的系统发育树。通过靴值分析(bootstrap analysis)验证，示出显著性支持值(*)。ZGP和SGP免疫原(CON VACCINE)采用共有策略。比例尺表示每个位点的氨基酸距离，并使用MEGA第5版软件进行分析。GP转基因商业合成，经遗传优化，并亚克隆到经修饰的pVAX1哺乳动物表达载体中。在转染HEK 293T细胞后通过Western免疫印迹和FACS分析抗原表达。Western免疫印迹结果示于图1B中而FACS示于图1C中。对于比较对照，表达MGP、SGP或ZGP的rVSV与每个GP样品同时进行，并且使用物种特异性抗GP1 mAb进行检测。大小表示为(kDa)。对于FACS，用小鼠来源的GP特异性血清试剂对转染的细胞间接染色，接着进行大量洗涤并用山羊抗小鼠IgG和MHC I类实验。Western免疫印迹和FACS实验重复至少三次，结果相似。通过最大似然法确定无根系统发育树的显著性并通过靴值分析检验，并且显著性支持值(≥80％；1,000个靴值重复)通过MEGA第5版软件测定。
图2A-2H显示实施例1中的实验结果，其中观察到针对MARV和ZEBOV攻击的完全防御。图2A和图2E中示出了动物存活数据。图2A显示MARV攻击后存活的三价疫苗接种动物，而对照动物全部在第10天死亡。图2E显示ZEBOV攻击后存活的三价疫苗接种动物，而对照动物全部在第7天死亡。对于疫苗接种的用MARV进行攻击，图2B中示出了疫苗接种动物和对照动物的体重变化％数据。y轴表示体重变化，如图2F所示。浅色实线表示三价疫苗接种动物。浅色虚线表示TriAVE，即三价疫苗接种动物的平均结果。深色实线表示对照动物。深色虚线表示对照AVE，即对照动物的平均结果。图表上在攻击后的数天内，浅色实线和浅色虚线保持稳定，表明疫苗接种动物中没有显著的体重减轻。图表上从攻击后第0-9天，深色实线和深色虚线下降，以剑号(dagger)结束表示动物在第10天死于疾病。对于疫苗接种的用ZEBOV进行攻击，图2F中示出了疫苗接种动物和对照动物的体重变化％数据。y轴显示体重变化百分比。浅色实线表示三价疫苗接种动物。浅色虚线表示TriAVE，即三价疫苗接种动物的平均结果。深色实线表示对照动物。深色虚线表示对照AVE，即对照动物的平均结果。图表上在攻击后的数天内，浅色实线和浅色虚线保持稳定，表明疫苗接种动物中没有显著的体重减轻。图表上从攻击后第0-6天，深色实线和深色虚线下降，以剑号结束表示动物在第8天之前死于疾病。(gpMARV，n＝3，而gpZEBOV，n＝6)。在免疫之前(Pre)和在第一次(1X)和第二次(2X)免疫之后，测量来自疫苗接种动物的血清中的结合Ab(图2C和图2G)和NAb(图2D和图2H)。对混合血清进行分析(图2H)。*p<0.1；***p<0.001；****p<0.0001。
图3A-3C显示实施例1的结果，证明了对中和Ab的诱导。在两次疫苗接种的每一次后20天，评估小鼠(n＝5只/组)中的B细胞应答，疫苗接种注射40μg的E-DNA疫苗，间隔3周。图3A显示通过ELISA测量来自接种疫苗的(实线)小鼠或预先放血(虚线)的小鼠的血清GP特异性IgG应答。数据汇总于图3B中。因为SGP不可用于该研究，所以针对蔗糖纯化的ZGP测量来自pEBOS-和pEBOZ-免疫动物的所有应答。针对MARV-Ozolin GP或使用阴性对照蔗糖纯化的Nipah G蛋白测量来自pMARV免疫小鼠的IgG应答。在BSL-4设施中针对ZEBOV-EGFP、SUDV-博尼法斯和MARV-安哥拉测量血清样品的中和活性并且在图3C中示出了NAb效价。基于对CV-1细胞的细胞病变效应(CPE)测定针对SUDV-博尼法斯的NAb，并使用免疫荧光测定法测定针对MARV-安哥拉的那些NAb。图3B和图3C中示出了平均值，误差线表示SEM。通过匹配、双尾、非配对的t检验完成群组分析。重复实验至少两次，结果相似且*p<0.1；**p<0.01；***p<0.001。
图4A-4D显示了通过疫苗接种产生的广泛T细胞应答。在图4A中，H-2b(浅色条)和H-2d(深色条)小鼠(n＝5只/组)用pMARV、pEBOS或pEBOZ DNA免疫两次，并且通过IFNγELISPOT测定法测量IFNγ应答。将在第二次免疫后8天收获的脾细胞在单独GP肽(重叠9个氨基酸的15-mer)的存在下孵育，结果以堆叠条形图示出。鉴定含表位的肽(≥平均10个斑点和≥80％应答率)，通过流式细胞术确认并在活化的IFNγ+和CD44+CD4+和/或CD8+T细胞总群体中进行表征(表1-6)，并且在条上方示出了阳性诱导物的肽数目。对单独含有CD4+表位、单独含有CD8+表位(*)及含有CD4+和CD8+双重表位(**)的肽编号。研究了推定的共用和/或部分表位的连续阳性肽应答(表1-6)。图4B显示了比较来自图1A中显示的MARV、SUDV和ZEBOV病毒的GP序列的氨基酸相似性图。图4C是显示ZEBOV GP(GenBank#VGP_EBOZM)内的推定结构域的图。SP，信号肽；RB，受体结合；MUC，粘蛋白样区；FC，弗林蛋白酶切割位点；TM，跨膜区。在图4D中，总亚显性(较深色阴影)和免疫显性(较浅色阴影)T细胞表位应答显示为每种疫苗产生的总IFNγ应答的百分比。重复实验至少两次，结果相似。
图5A-5D显示了评估保护性‘单剂量’疫苗诱导的中和Ab和CTL的实验数据。H-2k小鼠(n＝10只/组)肌内接种pEBOZ E-DNA一次，然后在28天后在BSL-4设施中用1,000LD50的mZEBOV进行攻击。每天为小鼠称重并监测疾病进展。动物存活数据见图5A。疫苗接种动物在攻击中存活，而对照动物到第7天死亡。图5B显示了受攻击动物体重变化％的数据。来自免疫动物的数据显示为浅色实线；免疫动物的平均数据显示为浅色虚线。来自对照动物的数据显示为深色实线；对照动物的平均数据显示为深色虚线。图表上在攻击后的数天内，浅色实线和浅色虚线保持稳定在约85％-120％的范围内，表明疫苗接种动物中没有显著的体重减轻。图表上从攻击后第0-6天，深色实线和深色虚线下降，以剑号结束表示动物在第7天死于疾病。在攻击前测量NAb；数据如图5C所示。通过FACS测量的单次pEBOZ免疫后的T细胞应答汇总为图5D中的总CD44+/IFNγ+CD4+(深色)或CD8+(浅色)细胞的AVE％。评估Thl型效应标记物(TNF和T-bet)，并将CD44+/IFNγ+CD4+和CD8+T细胞的数据与总T细胞数据进行比较，总T细胞数据如下：总细胞：TNF 2.9±0.8，Tbet 13.0±1.1。CD4+/CD44+/IFNγ+细胞：TNF 61.4±3.1，Tbet 72.6±2.0。CD8+/CD44+/IFNγ+细胞：TNF 33.0±3.3，Tbet 992.1±1.4(*p<0.1；***p<0.001；****p<0.0001)。通过匹配、双尾、非配对的t检验完成群组分析，并通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析存活曲线。实验进行两次，结果相似且误差线表示SEM。
图6显示了实施例1中公开的GP特异性T细胞设门。
图7A和7B显示实施例1中的疫苗接种实验产生稳健的T细胞。
图8A和8B显示了通过实施例1中公开的‘单剂量’疫苗接种进行的T细胞诱导。
图9描绘了针对埃博拉病毒的疫苗接种策略。埃博拉病毒糖蛋白是疫苗的主要靶标。目前，三种疫苗目前处于临床试验中，其在非人灵长类动物(NHP)中具有免疫原性保护作用并具有单剂量保护作用。然而，这些疫苗产生抗载体免疫，在人类临床试验中显示不良反应，具有不确定的记忆应答持续时间并且可能不适合所有人群。
图10涉及实施例7中的EBOV糖蛋白疫苗构建及配制策略和表达实验。
图11显示来自实施例7中实验的结果，展示DNA疫苗的单次免疫在小鼠中具有免疫原性。
图12显示来自实施例7的结果，展示单次免疫在小鼠中针对致死的小鼠适应型埃博拉病毒攻击具有完全保护作用。
图13显示来自实施例7的结果，展示各个GP DNA疫苗构建体在小鼠中诱导稳健的记忆应答。
图14显示了来自实施例7的结果，展示了GP DNA疫苗在非人灵长类动物中的功效。
图15显示来自实施例7的结果，展示GP DNA疫苗制剂在NHP中具有免疫原性。
图16显示来自实施例7的结果，展示GP DNA制剂疫苗防御致命的扎伊尔埃博拉病毒(Makona)攻击。
图17显示了EBOV-001I期临床(NCT02464670)研究策略。
图18显示来自实施例7的结果，展示了在I期临床试验中的EBOV-001血清转化。
图19显示来自实施例7的结果，展示了在代表性患者中对埃博拉GP特异性T细胞应答(ELISpot)的诱导。
图20显示来自实施例7的结果，展示了与目前临床试验中的其他埃博拉疫苗平台的比较。
图21显示来自实施例8的ELISA实验的群组描述和群组人口统计资料。
图22显示来自实施例8的结果，展示了针对群组1-3根据群组和时间点的ELISA效价。
图23显示来自实施例8的结果，展示针对群组4和5根据群组和时间点的ELISA效价。
图24显示来自实施例8的结果，展示了所有群组的ELISA汇总。
图25显示来自实施例8的ELISpot实验的群组描述和群组人口统计资料。
图26显示来自实施例8的结果，展示了针对群组1的根据肽库的受试者应答。
图27显示来自实施例8的结果，展示了针对群组2的根据肽库的受试者应答。
图28显示来自实施例8的结果，展示了针对群组3的根据肽库的受试者应答。
图29显示来自实施例8的结果，展示了针对群组4的根据肽库的受试者应答。
图30显示来自实施例8的结果，展示了针对群组5的根据肽库的受试者应答。
图31显示来自实施例8的结果，展示了群组的ELISpot汇总。
图32显示来自实施例8的结果，展示了群组的ELISpot汇总。
图33显示来自实施例8的结果，展示了对所有受试者的疫苗应答者的分析。
图34显示来自实施例8的结果，展示了对于去除的基线离群值的受试者的疫苗应答者的分析。
图35显示来自实施例8的ICS实验的群组描述和群组人口统计资料。
图36显示来自实施例8的结果，展示了ICS实验基于群组的Wilcoxon配对分析。
图37显示来自实施例8的结果，展示了群组3(INO4201 ID)的CD4+T细胞中的细胞因子的ICS分析。
图38显示来自实施例8的结果，展示了群组3的CD8+T细胞中细胞因子的ICS分析。
图39显示来自实施例8的结果，展示了对于群组1-3中的每名受试者的疫苗应答者的详细分析。
图40显示来自实施例8的结果，展示了对于群组4-5中的每名受试者的疫苗应答者的详细分析。
图41显示来自实施例8的结果，展示了群组和库的中值应答。
图42显示来自实施例8的结果，展示了群组和库的平均应答。
图43显示了展示二价和三价DNA疫苗在食蟹猴(cynomolgus macaques)体内引发长期免疫应答的结果。在每次DNA注射后2周和最后一次注射后每月收集血清和外周血单核细胞(PBMC)。通过ELISA测定针对几内亚GP和马英嘉-GP的总IgG终点效价。DNA免疫后针对埃博拉GP的细胞免疫应答。在用GP肽库刺激后，从NHP收集PMBC并通过ELISPOT-IFNγ测定T细胞应答。
图44，包括图44A至图44C，显示了证明在食蟹猴中二价和三价DNA疫苗针对致死性EBOV攻击的保护作用的结果。图44A)存活率。用1000TCID50的致死性几内亚Makona C07EBOV攻击动物，并在攻击后监测存活率28天，图44B)临床评分。在整个感染过程中监测疾病的临床体征。图44C)病毒载量。通过TCID50测定从血液中测定感染过程中的病毒血症。
图45显示使用ADI人抗扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白IgG试剂盒进行定量ELISA，以在研究开始和每次免疫后2周评估每个接种疫苗的受试者的血清中的ZEBOV特异性IgG抗体的量。使用双尾威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon Sign Rank test)进行统计学分析。
图46显示了干扰素γELISpot应答。在研究开始时和每次免疫后2周从接种疫苗的受试者中分离PBMC，并在IFNg ELISpot测定中用跨越全长GP的埃博拉肽刺激。该图表示每百万个PBMC的EBOV-GP特异性斑点形成单位。方框内的线表示中值应答。各个点表示离群数据。
图47描绘了证明在非人灵长类动物(NHP)中使用埃博拉GP DNA疫苗制剂的长期免疫原性的实验结果。在疫苗接种后大于6个月观察到强烈的抗体应答。
图48描绘了肌内递送EBOV GP DNA疫苗的记忆研究。NHP在3个月内免疫接种二价或三价EBOV GP DNA疫苗制剂。在最终剂量后12个月内跟踪免疫应答。在第13个月给予1年加强。
图49描绘了接受三价DNA GP制剂的动物的总IgG终点效价。在1年加强后观察到总IgG抗体应答增加。
图50描绘了接受二价或三价DNA GP制剂的动物的总IgG终点效价。在1年加强后观察到总IgG抗体应答增加。
图51描绘了三价DNA GP制剂的ELISPOT。在1年加强后IFNγELISPOT应答增加。注射3次的组的加强幅度不是很高。
图52描绘了二价或三价DNA GP制剂的ELISPOT。在1年加强后IFNγELISPOT应答增加。单一免疫组有显著加强。
图53描绘了IFNγELISPOT结果的汇总。17/19的动物在加强后具有增加的T细胞应答。1/19的动物保持相同水平的T细胞应答。1/19的动物在加强后具有较弱的T细胞应答，然而该动物在过去一年中在注射3次的组中始终较高。
图54描绘了在1年加强之前的12个月时间点，单次免疫组中动物的示例性IFNγELISPOT。
图55描绘了在1年加强之后，单次免疫组中动物的示例性IFNγELISPOT。
图56描绘了IM记忆研究的结果。EBOV GP DNA疫苗引发长期免疫应答，在1年加强后具有强烈回忆应答。进行皮内递送研究以研究皮内EBOV GP DNA疫苗的免疫应答。
图57描绘了EBOV DNA疫苗临床试验(EBOV-001)的汇总。健康志愿者接受INO-4201、INO-4202、INO-4212或INO-4212和INO-9021的3剂量方案。
图58描绘了EBOV-001与rVSV EBOV中的结合抗体的比较。与第0周相比，所有EBOV-001群组在第6周和第14周均显著增加。
图59描绘了EBOV GP DNA疫苗研究的皮内递送的汇总。添加群组以探索IL-12DNA的给药、剂量方案及其作为免疫佐剂的用途。
图60描绘了第14周的皮内群组的结果。在所有皮内群组中，在125/127(98.4％)受试者中观察到血清反应性。
具体实施方式
在本发明的一个方面，期望共有抗原提供改善的转录和翻译，包括具有以下一种或多种：低GC含量的前导序列以增加转录；mRNA稳定性和密码子优化；尽可能消除顺式作用序列基序(即内部TATA盒)。
在本发明的一些方面，期望产生共有抗原，其在多种毒株中产生广泛的免疫应答，包括具有以下一项或多项：掺入所有可用的全长序列；计算机产生利用每个位置最常出现的氨基酸的序列；及增加菌株之间的交叉反应性。
丝状病毒科之间的多样性相对较高。已经进行了大量努力，旨在开发通用且广泛反应的丝状病毒疫苗，该疫苗理想地提供针对造成最高人类病死率的多种物种的保护。然而，由于丝状病毒科之间相对较高的多样性水平，这证明是困难的。EBOV目前分为五个不同的种，即扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(SUDV)、雷斯顿埃博拉病毒(RESTV)、本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo ebolavirus)(BDBV)和塔伊森林埃博拉病毒(Forest ebolavirus)(TAFV；以前称为科特迪瓦埃博拉病毒(Cote d’Ivoireebolavirus))，前两种造成最高致死率并且是最有可能的武器化的候选物。马尔堡病毒(MARV)之间的多样性较低，其中也可达到90％的致死率。目前，只有一个分类的种，即马尔堡马尔堡病毒(以前称为维多利亚湖马尔堡病毒(Lake Victoria marburgvirus))，尽管最近的一项修正案提出它含有两种病毒，包括Ravn病毒(RAVV)。增加多价疫苗开发的复杂性，MARV和EBOV高度不同，其中核苷酸水平存在约67％的差异。此外，丝状病毒GP之间的系统发育多样性也非常高(总体上为82％)。这些暗示了丝状病毒的进化潜力，正如2007年近期出现的BDBV所证明的那样。因此，由于丝状病毒科之间的相对差异，我们假设开发有效的多价丝状病毒疫苗可能会需要一种免疫原性组分的混合物。
开发了针对马尔堡马尔堡病毒(MARV)、扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)和苏丹埃博拉病毒(SUDV)的合成多价丝状病毒DNA疫苗。新型多价丝状病毒疫苗由三种DNA质粒组成，这三种DNA质粒编码马尔堡马尔堡病毒(MARV)、苏丹埃博拉病毒(SUDV)或扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)的包膜糖蛋白(GP)基因，其采用多试剂方案。作为丝状病毒疫苗候选物，鉴于遗传优化和递送技术的最新进展，基于增强型DNA(DNA)的平台表现出许多优势(Bagarazzi ML等人，(2012).Immunotherapy Against HPV16/18Generates Potent TH1 and CytotoxicCellular Immune Responses.Sci Transl Med 4:155ral38；Kee ST,Gehl J,W.LE(2011).Clinical Aspects of Electroporation,Springer,New York,NY.；Hirao LA等人，(2011).Multivalent smallpox DNA vaccine delivered by intradermalelectroporation drives protective immunity in nonhuman primates againstlethal monkeypox challenge.J Infect Dis 203:95-102)。因此，每种GP都经过遗传优化，亚克隆到经修饰的哺乳动物表达载体中，然后使用体内电穿孔(EP)进行递送。
使用啮齿动物适应的病毒在豚鼠和小鼠中进行临床前功效研究，而使用本文所述的新型改进测定法对鼠T细胞应答进行广泛分析。广泛分析T细胞应答，包括使用本文所述的新型表位鉴定和表征方法。这种模型提供了一种用于研究保护性免疫相关性的重要临床前工具，其可应用于现有平台。
临床前啮齿动物研究中的疫苗接种非常有效，引发强大的中和抗体(NAb)和表达Thl型标记物的CTL，并完全防御MARV和ZEBOV攻击。正如使用本文所述的新型改进测定法进行广泛分析那样(Shedlock DJ等人，(2012).Vaccination with synthetic constructsexpressing cytomegalovirus immunogens is highly T cell immunogenic inmice.Hum Vaccin Immunother 8:1668-1681)，综合T细胞分析揭示了具有大幅度、表位广度和Th1型标记物表达的细胞毒性T淋巴细胞。总共鉴定了52个来自两个不同小鼠遗传背景的新型T细胞表位(20个MARV表位中的19个，16个SUDV中的15个和22个ZEBOV中的18个)并且主要出现在其各自的糖蛋白(GP)的高度保守区域中。这些数据代表了迄今为止最全面的临床前糖蛋白表位报告。
在制定提供针对造成最高人类病死率的多个种的保护的战略时，我们专注于MARV、SUDV和ZEBOV。由于其相对差异，我们假设多价丝状病毒疫苗的开发将会需要能够响应于未来爆发毒株和/或种而快速且容易地适应的组分的混合物。虽然EBOV之间总体多样性为约33％，但在单独分析SUDV和ZEBOV时，氨基酸同一性大幅增加(每个种内约94％同一性)。因此，如图1A所示，设计了覆盖最致命的EBOV的双组分策略，一种是针对SUDV的质粒GP疫苗和另一种是针对ZEBOV的质粒GP疫苗。由于每个种间的GP多样性相对较低(SUDV为5.6％而ZEBOV为7.1％)，因此开发了共有免疫原，增加了种间覆盖率，这是先前证实会加强对流感和HIV不同菌株的保护的策略。这些GP序列是报道的所有爆发序列(GenBank)的共有序列，如通过使用Vector NTI软件(Invitrogen,CA,USA)进行比对所确定。非共有残基，SUDV(95、203、261和472)和ZEBOV(314、377、430和440)各自的4个氨基酸分别偏重于古卢和Mbomo/Mbanza。选择古卢是因为它造成任何丝状病毒爆发的最高人类病死率(n＝425)，而选择Mbomo/Mbanza是因为它们是最新和致命的爆发，有已发表的序列数据。SUDV(SUDV CON疫苗)和ZEBOV(ZEBOV CON疫苗)的共有GP在系统发育上介于其亲本比对菌株中间。
图1A中的蛋白质鉴定如下：MARV杜尔巴(Durba)(05DRC99)'99:ABE27085；乌干达(Uganda)(01Uga07)'07:ACT79229；杜尔巴(07DRC99)'99:ABE27078；Ozolin'75:VGP_MABVO；Musoke'80:VGP_MABVM；Popp'67:VGP_MABVP；莱顿(Leiden)'08:AEW11937；安哥拉'05:VGP_MABVA；Ravn'87:VGP_MABVR；杜尔巴(09DRC99)'99；ABE27092；乌干达(02Uga07)'07:ACT79201.SUDV:博尼法斯(Boniface)'76:VGP_EBOSB；马莱奥(Maleo)'79:VGP_EBOSM；延比奥(Yambio)'04:ABY75325；古卢(Gulu)'00:VGP_EBOSU.ZEBOV:布于(Booue)'96:AAL25818；Mayibout'96:AEK25495；Mekouka'94:AAC57989,VGP_EBOG4；基奎特(Kikwit)'95:VGP_EBOZ5；亚布库(Yambuku)(以革伦(Ekron))'76:VGP_EBOEC；亚布库(马英嘉(Mayinga))'76:VGP_EBOZM；开赛(Kasai)'08:AER59712；Kassai'07:AER59718；埃通比(Etoumbi)'05:ABW34742；Mbomo/Mbandza'03:ABW34743。
随本文提供的序列表含72个序列的列表，包括以下序列：
SEQ ID NO:1是ZEBOV CON(CONGP1)的氨基酸序列，其是共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:2是SUDV CON的氨基酸序列，其是共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:3是MARV或MARV ANG的氨基酸序列，其是马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白和马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是MARV CON1的氨基酸序列，其是第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:5是MARV CON2的氨基酸序列，其是第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:6是MARV CON3的氨基酸序列，其是第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:7-25是源自MARV ANG的肽。
SEQ ID NO:26-41是源自SUDV CON的肽。
SEQ ID NO:42-62是源自ZEBOV CON的肽。
SEQ ID NO:63是IgE信号肽的序列：MDWTWILFLVAAATRVHS。
SEQ ID NO:64是质粒pEBOZ中的核苷酸序列插入物，其编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:65是质粒pEBOS中的核苷酸序列插入物，其编码共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:66是质粒pMARZ ANG中的核苷酸序列插入物，其编码马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白。
SEQ ID NO:67是ZEBOVGUI(几内亚GP)的氨基酸序列，其是从2014年几内亚爆发分离出的共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:68是ZEBOVCON2(CONGP2)的氨基酸序列，其是第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白。
SEQ ID NO:69是质粒pZEBOVGUI中的核苷酸序列插入物，其编码从2014年几内亚爆发分离出的共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:70是质粒pEBOZCON2中的核苷酸序列插入物，其编码第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白。
SEQ ID NO:71是质粒pEBOZCON2中的核苷酸序列插入物，其编码第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白。
SEQ ID NO:72是质粒pZEBOVGUI中的核苷酸序列插入物，其编码从2014年几内亚爆发分离出的扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原。
在一些实施方案中，该策略采用选自以下的三种丝状病毒免疫原的编码序列：MARV、SUDV、ZEBOV、ZEBOVGUI和ZEBOVCON2。MARV免疫原是安哥拉2005分离株的糖蛋白。对于SUDV ZEBOV、ZEBOVGUI和ZEBOVCON2，设计了共有糖蛋白序列。
在一些实施方案中，该策略采用五种丝状病毒免疫原的编码序列。提供了三种MARV免疫原。设计了源自三个集群的共有糖蛋白Ozolin、Musoke或Ravn。这三种MARV免疫原是设计的SUDV、ZEBOV或ZEBOVCON2、ZEBOVGUI共有糖蛋白序列共同的免疫应答的靶标。
在一些实施方案中，该策略采用六种丝状病毒免疫原的编码序列。提供了四种MARV免疫原：设计了三种源自三个集群的共有糖蛋白。这三种MARV免疫原是设计的SUDV、ZEBOV和ZEBOVCON2、ZEBOVGUI共有糖蛋白序列共同的免疫应答的靶标，MARV免疫原是安哥拉2005分离株的糖蛋白。
作为丝状病毒疫苗的候选者，DNA疫苗表现出多种优势，包括快速和廉价的大规模生产，室温下的稳定性和易于运输，所有这些都从经济和地理角度进一步增强了这个平台。由于质粒的合成性质，Ag序列可以响应于新出现的种而受到快速且容易地修饰和/或扩展为包括附加疫苗组分和/或在爆发环境期间用于快速响应的方案。例如，通过共同施用编码其他系统发育群的共有MARV GP(MGP)免疫原的附加质粒，可以容易地扩展本文的MARV策略以获得更大的覆盖率。
虽然‘第一代’DNA疫苗的免疫原性很差，但最近的技术进展大大提高了它们在临床试验中的免疫原性。优化质粒DNA载体及其编码的Ag基因导致体内免疫原性增加。当高度浓缩的质粒疫苗制剂与体内电穿孔一起施用时，细胞摄取和后续Ag表达基本上增强，体内电穿孔是一种在接种部位内使用短暂的方波电脉冲将质粒驱入瞬时透化细胞内的技术。理论上，可以组装DNA质粒混合物以指导针对任何数量的可变Ag的高度特化免疫应答。可以通过与编码物种特异性细胞因子基因的质粒分子佐剂共同递送以及Ag氨基酸序列的“共有工程改造”来进一步指导免疫，以帮助使疫苗诱导的免疫偏向特定菌株。已证明该策略可以增强流感病毒和HIV的不同菌株之间的保护。部分由于这些技术进步的原因，包括这些DNA疫苗的免疫方案具有高度通用性和极易定制性。
1.定义
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在为限制性。如说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。
对于本文中数值范围的叙述，其间具有相同精确度的每一个中间数被明确考虑。举例来说，对于6-9的范围，除了6和9之外，还考虑了数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6,9、以及7.0被明确考虑。
a.佐剂
如本文所用的“佐剂”可以指添加到本文所述的DNA质粒疫苗中以增强由DNA质粒和下文所述的编码核酸序列编码的所述一种或多种共有丝状病毒免疫原的抗原性的任何分子。
b.抗体
“抗体”可以指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类抗体或其片段、片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离的抗体、多克隆抗体、亲和力纯化抗体或它们的混合物，它对所期望的表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。
c.编码序列
如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”可以意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包括编码RNA序列的DNA序列。编码序列还可以包括与调控元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够指导在接受核酸施用的个体或哺乳动物的细胞中表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，编码序列可任选地进一步包含编码N端甲硫氨酸或信号肽，诸如IgE或IgG信号肽的起始密码子。
d.遗传构建体
如本文所用，“遗传构建体”是指包含编码蛋白质，诸如免疫原的核苷酸序列的DNA分子或RNA分子。遗传构建体还可以指转录RNA的DNA分子。编码序列包括与调控元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够指导在接受核酸分子施用的个体的细胞中的表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“可表达形式”指的是含有必要调控元件的基因构建体，所述调控元件与编码蛋白质的编码序列可操作地连接以使得当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。
e.互补序列
如本文所用，“互补序列”或“互补”可以意指核酸，可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
f.共有或共有序列
如本文所用的“共有”或“共有序列”可以意指合成的核酸序列或相应的多肽序列，其基于对特定丝状病毒抗原的多个亚型比对的分析而构建，其可以用于诱导针对特定丝状病毒抗原的多个亚型或血清型的广泛免疫。
共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原是指SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的片段、SEQ ID NO:1的变体和SEQ ID NO:1的变体的片段。(ZEBOV或ZEBOV CON或ZEBOV CON疫苗)。包含SEQ ID NO:1的编码序列的质粒可称为pZEBOV或pEBOZ。共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的编码序列包括SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:64的片段、SEQ ID NO:64的变体和SEQ ID NO:64的变体的片段。质粒pEBOZ包含SEQ ID NO:64。
共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原是指SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的片段、SEQ ID NO:2的变体和SEQ ID NO:2的变体的片段。(SUDV或SUDV CON或SUDV CON疫苗)包含SEQ ID NO:2的编码序列的质粒可称为pSUDV或pEBOS。共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的编码序列包括SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:65的片段、SEQ ID NO:65的变体和SEQ IDNO:65的变体的片段。质粒pEBOS包含SEQ ID NO:65。
马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白不是共有的，而是源自分离株的蛋白质序列。它具有序列SEQ ID NO:3。马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原是指SEQID NO:3、SEQ ID NO:3的片段、SEQ ID NO:3的变体和SEQ ID NO:3的变体片段。(MARV或MARV ANG或MARV ANG或MARV ANG疫苗)包含SEQ ID NO:3的编码序列的质粒可称为pMARV或pMARV-ANG。马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的编码序列包括SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:66的片段、SEQ ID NO:66的变体和SEQ ID NO:66的变体的片段。质粒pMARVANG包含SEQ ID NO:66。
第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原是指SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:4的片段、SEQ ID NO:4的变体和SEQ ID NO:4的变体的片段。SEQ ID NO:4是来自Ravn集群共有序列(Ravn、杜尔巴(09DRC99)和乌干达(02Uga07Y)的马尔堡马尔堡病毒共有序列。(MARVCON1或MARV-RAV CON或MARV-RAV CON疫苗)包含SEQ ID NO:4的编码序列的质粒可称为pMARV-RAV。
第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原是指SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:5的片段、SEQ ID NO:5的变体和SEQ ID NO:5的变体的片段。SEQ ID NO:5是来自Ozolin集群共有序列(Ozolin、乌干达(01Uga07)和杜尔巴(05和07DRC99))的马尔堡马尔堡病毒共有序列。(MARV CON2或MARV-OZO CON或MARV-OZO CON疫苗)包含SEQ ID NO:5的编码序列的质粒可称为pMARV-OZO。
第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原是指SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:6的片段、SEQ ID NO:6的变体和SEQ ID NO:6的变体的片段。SEQ ID NO:6是来自Musoke集群共有序列(Musoke、Popp和莱顿)的马尔堡马尔堡病毒共有序列。(MARV CON1或MARV-MUS CON或MARV-MUS CON疫苗)包含SEQ ID NO:6的编码序列的质粒可称为pMARV-MUS。
共有扎伊尔埃博拉病毒GP包膜糖蛋白免疫原是指SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:67的片段、SEQ ID NO:67的变体和SEQ ID NO:67的变体的片段。(ZEBOVGUI或ZEBOVGUI疫苗)。包含SEQ ID NO:67的编码序列的质粒可称为pZEBOVGUI或pEBOZGUI。共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚2014包膜糖蛋白免疫原的编码序列包括SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:69的片段、SEQID NO:69的变体和SEQ ID NO:69的变体的片段。质粒pEBOZGUI包含SEQ ID NO:69。
第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原是指SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:68的片段、SEQ ID NO:68的变体和SEQ ID NO:68的变体的片段。(ZEBOV2或ZEBOVCON2或ZEBOVCON2疫苗)包含SEQ ID NO:68的编码序列的质粒可称为pEBOVCON2。第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的编码序列包括SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:70的片段、SEQID NO:70的变体和SEQ ID NO:70的变体的片段。质粒pEBOVCON2包含SEQ ID NO:70。
g.恒定电流
如本文所用，“恒定电流”定义了在向组织递送电脉冲的持续时间内同一组织或限定所述组织的细胞接受或经历的电流。电脉冲是从本文所述的电穿孔装置递送的。因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈，所以该电流在所述组织中在电脉冲的寿命内保持在恒定的安培数。反馈元件可以在整个脉冲的持续时间内测量组织(或细胞)的电阻，并且使电穿孔装置改变它的电能输出(例如，增加电压)，以使同一组织中的电流在整个电脉冲期间(约几微秒)和脉冲间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。
h.电流反馈或反馈
如本文所用，“电流反馈”或“反馈”可以互换使用并且可以意指所提供的电穿孔装置的主动响应，所述主动响应包括测量电极之间组织中的电流以及相应地改变由EP装置递送的能量输出，以将电流维持在恒定水平。在开始脉冲序列或电处理之前，由使用者预设该恒定水平。反馈可以通过电穿孔装置的电穿孔部件，例如控制器完成，这是因为其中的电路能够连续地监测电极之间组织中的电流，并且将该所监测的电流(或组织内的电流)与预设电流相比较，并且连续地进行能量输出调整以将所监测的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为它是模拟闭环反馈。
i.分散电流
如本文所用，“分散电流”可以意指从本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流模式，其中所述模式使正被电穿孔的组织的任何区域上电穿孔相关热应激的发生减到最低限度或优选地消除所述电穿孔相关热应激的发生。
j.电穿孔
如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)可以指使用跨膜电场脉冲诱导生物膜中的微观途径(孔)；其存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧穿到另一侧。
k.反馈机制
如本文所用，“反馈机制”可以指由软件或硬件(或固件)执行的过程，所述过程接收所期望的组织的阻抗并且将其与预设值，优选地电流相比较(在递送能量脉冲之前、期间和/或之后)，并且调整所递送的能量脉冲以达到所述预设值。反馈机制可以由模拟闭环电路执行。
l.片段
“片段”可以意指丝状病毒免疫原的多肽片段，其能够在哺乳动物中通过识别特定丝状病毒抗原引发针对丝状病毒的免疫应答。所述丝状病毒包膜糖蛋白免疫原可任选地包括位置1处的信号肽和/或甲硫氨酸；在位置1处有或无信号肽和/或甲硫氨酸的每种情况下，与本文所述的共有序列98％或更多同源的蛋白质、与本文所述的共有序列99％或更多同源的蛋白质、和与本文所述的共有序列100％同一的蛋白质。片段可以或可以不(例如)包括与信号肽连接的丝状病毒免疫原片段，信号肽诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE信号肽或IgG信号肽。
ZEBOV CON、SUDV CON、MARV ANG、MARV-RAV CON、MARV-OZO CON、MARV-MUS CON、ZEBOVGUI或ZEBOVCON2中任一个或其变体的片段，在位置1处有或无信号肽和/或甲硫氨酸每种情况下，可包含特定全长ZEBOV CON、SUDV CON、MARV ANG、MARV-RAV CON、MARV-OZOCON、MARV-MUS CON、ZEBOVGUI或ZEBOVCON2或其变体的长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比。片段是指在位置1处有或无信号肽和/或甲硫氨酸的每种情况下与序列ZEBOV CON、SUDV CON、MARV ANG、MARV-RAV CON、MARV-OZO CON、MARV-MUS CON、ZEBOVGUI或ZEBOVCON2 100％同一的片段多肽。片段还指变体的片段，即在位置1处有或无信号肽和/或甲硫氨酸的每种情况下与序列ZEBOV CON、SUDV CON、MARV ANG、MARV-RAV CON、MARV-OZOCON、MARV-MUS CON、ZEBOVGUI或ZEBOVCON295％或更多、98％或更多或99％或更多同源的多肽。片段可以包括与SEQ ID NO:1-6、67-68中所示的丝状病毒免疫原98％或更多同源，99％或更多同源或100％同一的多肽的片段，并且另外包含信号肽，诸如在计算同源性百分比时未包括在内的免疫球蛋白信号肽。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-6、67-68的片段与信号肽连接，诸如免疫球蛋白信号肽例如IgE信号肽或IgG信号肽。片段可SEQ ID NO:1-6、67-68的片段，包括N端甲硫氨酸。片段还指与SEQ ID NO:1-6、67-68中公开的序列95％或更多、98％或更多，或99％或更多同源的多肽的片段。如果存在信号肽，则在计算同源性百分比时不将其包括在内。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-6、67-68的片段或其变体可包含SEQ ID NO:1-6中任一个或其变体的10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、610、620、630、640、650、660、670个或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，SEQID NO:1-6的片段或其变体可包含SEQ ID NO:1-6、67-68中任一个或其变体的15、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、610、620、630、640、650、660、670、675个或更少连续氨基酸。
“片段”还可以意指编码丝状病毒免疫原的核酸序列的片段，该核酸片段编码丝状病毒免疫原的片段，所述丝状病毒免疫原的片段能够在哺乳动物中通过识别特定丝状病毒抗原引发针对丝状病毒的免疫应答。编码丝状病毒免疫原或其变体的核酸片段的片段，在位置1处有或无信号肽和/或甲硫氨酸的每种情况下，可以包含编码丝状病毒免疫原或其变体的核酸的特定全长核酸序列的长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比。片段可以包含编码与SEQ ID NO:1-6、67-68中所示的丝状病毒免疫原98％或更多同源，99％或更多同源或100％同一的多肽的核苷酸序列的片段，并且另外包含信号肽，诸如在计算同源性百分比时未包括在内的免疫球蛋白信号肽。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO:1-6、67-68的片段的核苷酸序列片段与信号肽连接，诸如免疫球蛋白信号肽例如IgE信号肽或IgG信号肽。如果存在信号肽的编码序列，则在计算同源性百分比时不将其包括在内。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO:1-6的片段或其变体的核苷酸序列的片段可包含编码SEQID NO:1-6、67-68中任一个或其变体的10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、610、620、630、640、650、660、670个或更多连续氨基酸的序列。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO:1-6、67-68的片段或其变体的核苷酸序列的片段可包含编码SEQ ID NO:1-6、67-68中任一个或其变体的15、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、610、620、630、640、650、660、670、675个或更少连续氨基酸的序列。
在一些实施方案中，片段是SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72的片段。SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72的片段，在位置1处有或无信号肽和/或甲硫氨酸的每种情况下，可以包含编码丝状病毒免疫原或其变体的核酸序列的特定全长核酸序列的长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比。SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72的片段可以包含编码与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72所编码的丝状病毒免疫原98％或更多同源，99％或更多同源或100％同一的多肽的核苷酸序列的片段，并且另外包含信号肽，诸如在计算同源性百分比时未包括在内的免疫球蛋白信号肽。SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72的片段可包含编码SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72或其变体的10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、610、620、630、640、650、660、670个或更多连续氨基酸的序列。SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ IDNO:72的片段可包含编码SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQID NO:70或SEQ ID NO:72或其变体的15、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、610、620、630、640、650、660、670、675个或更少连续氨基酸的序列。在一些实施方案中，片段是由SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72转录或编码的RNA的片段。
m.同一
如本文所用，“同一”或“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下可以意指所述序列在指定区域中具有指定百分比的相同残基。所述百分比可以通过最佳地比对这两个序列，在指定区域中比较这两个序列，确定这两个序列中存在相同残基的位置数量以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中位置的总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算。在这两个序列具有不同的长度或比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基被包括在计算的分母中，但是不包括在分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动或通过使用计算机序列算法，诸如BLAST或BLAST 2.0来进行。
n.阻抗
如本文所用，“阻抗”可以在论述反馈机制时使用并且可以根据欧姆定律(Ohm'slaw)转换成电流值，从而使得能够与预设电流相比较。
o.免疫应答
如本文所用，“免疫应答”可以意指响应于经由提供的DNA质粒疫苗将一种或多种丝状病毒共有抗原引入，宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统的活化。所述免疫应答可以呈细胞应答或体液应答或这两者的形式。
p.核酸
如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘还限定了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖基本上相同的核酸和其互补序列。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链的或双链的，或可以含有双链序列和单链序列二者的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA、或杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合、以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
q.可操作地连接
如本文所用，“可操作地连接”可以意指基因的表达处在与它在空间上连接的启动子的控制之下。启动子可以位于处在它的控制之下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以与作为该启动子来源的基因中该启动子与它控制的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的那样，可以调节该距离的变化而不会丧失启动子功能。
r.启动子
如本文所用，“启动子”可以意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可以包含一个或多个特定的转录调控序列，以进一步增强其表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏子元件，它们可以位于与转录起始位点相距多达数千个碱基对的位置处。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。对于其中发生表达的细胞、组织或器官，或对于发生表达的发育阶段，或响应于外部刺激，诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，启动子可以组成型地或差异性地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子以及CMV IE启动子。
s.严格杂交条件
如本文所用，“严格杂交条件”可以意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)，诸如核酸的复杂混合物中的第二核酸序列杂交的条件。严格条件具有序列依赖性并且在不同的情况下将是不同的。严格条件可选择为在限定离子强度pH下比特定序列的热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm可以是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡时50％与靶标互补的探针与靶序列杂交时的温度(因为靶序列过量存在，在Tm下，在平衡时50％的探针被占据)。严格条件可以是如下的那些条件，其中在pH 7.0至8.3下，盐浓度低于约1.0M钠离子，诸如约0.01M-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如约10个-50个核苷酸)，温度为至少约30℃，对于长探针(例如大于约50个核苷酸)，为至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂，诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2倍至10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％的甲酰胺、5×SSC和1％的SDS，在42℃孵育；或5×SSC、1％的SDS，在65℃孵育，以及在65℃下在0.2×SSC和0.1％ SDS中洗涤。
t.基本上互补
如本文所用，“基本上互补”可以意指第一序列在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或这两个序列在严格杂交条件下杂交。
u.基本同一
如本文所用，“基本同一”可以意指第一和第二序列在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或对于核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补序列基本上互补。
v.变体
本文关于核酸使用的“变体”可以指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列基本相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其基本相同的序列杂交的核酸。
关于肽或多肽的“变体”在氨基酸序列上由于氨基酸的插入、缺失、或保守取代而不同，但是保留至少一种生物学活性。变体还可以意指具有这样的氨基酸序列的蛋白质：其与具有保留至少一种生物学活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同。氨基酸的保守取代，即将氨基酸用具有相似特性(例如带电荷的区域的亲水性、程度以及分布)的不同氨基酸置换，在本领域中通常被认为涉及微小变化。如本领域所理解的，通过考虑氨基酸的亲水指数可以部分地鉴定这些微小变化。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于它的疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍保留蛋白质功能。在一个方面，具有相差±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将产生保留生物学功能的蛋白质的取代。在肽的背景下氨基酸的亲水性的考虑容许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已经被报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用的量度。美国专利号4,554,101以引用的方式整体并入本文。如本领域所理解的，取代具有相似亲水性值的氨基酸可产生保留生物活性，例如免疫原性的肽。可以用亲水性值在彼此±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水指数和亲水值这两者都受该氨基酸的特定侧链的影响。与该观测结果相一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示。变体优选与SEQ ID NO:1-6、67-68 95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多或99％或更多同源。
关于编码相同特定氨基酸序列的核酸序列的“变体”在核苷酸序列上因使用不同密码子而不同。编码与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:70或SEQ ID NO:72所编码的那些相同的氨基酸序列的SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72变体可为任何同源性程度，优选为80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高或99％或更高。编码与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72所编码的那些相同的氨基酸序列的由SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72转录的RNA变体可为任何同源性程度，优选为80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高或99％或更高。变体也可以是SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72的变体，其编码的蛋白质是SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72所编码的蛋白质的变体，其氨基酸序列与氨基酸序列保持至少一种生物活性的参考蛋白基本同一，通常所述氨基酸序列95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多或99％或更多同源。变体也可以是由SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:70或SEQ ID NO:72转录的RNA的变体，其编码的蛋白质是由SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72转录的RNA所编码的蛋白质的变体，其氨基酸序列与氨基酸序列保持至少一种生物活性的参考蛋白基本同一，通常所述氨基酸序列95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多或99％或更多同源。
w.载体
如本文所用，“载体”可以意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌、病毒载体、人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA载体或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。
2.蛋白质
本文提供了可用于诱导针对特定丝状病毒抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫的丝状病毒免疫原。共有丝状病毒抗原可分别包括马尔堡病毒丝状病毒糖蛋白MARV RAV免疫原的共有氨基酸序列、马尔堡病毒丝状病毒糖蛋白MARV OZO免疫原的共有氨基酸序列、马尔堡病毒丝状病毒糖蛋白MARV MUS免疫原的共有氨基酸序列、马尔堡病毒丝状病毒糖蛋白MARV ANG免疫原的分离氨基酸序列、扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白ZEBOV免疫原的共有氨基酸序列、扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白ZEBOV2014免疫原的共有氨基酸序列、扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白ZEBOVCON2免疫原的分离氨基酸序列、以及苏丹埃博拉病毒糖蛋白SUDV免疫原的共有氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原可包含来自不同蛋白质(诸如免疫球蛋白)的信号肽，例如IgE信号肽或IgG信号肽。
免疫原的氨基酸序列包括其SEQ ID NO:1-6、67-68变体和SEQ ID NO:1-6、67-68的片段及其变体，任选地包括信号肽，例如IgE或IgG信号肽。
3.编码蛋白质的编码序列
编码本文阐述的蛋白质的编码序列可以使用常规方法产生。提供了包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物，其包括编码第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、编码共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、编码共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、编码马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的核酸序列；并且基于公开的氨基酸序列可以产生编码第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、编码第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列、以及编码第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列。
核酸序列可以编码全长共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、全长第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、全长共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原包膜糖蛋白免疫原、全长共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、全长马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原、全长第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、全长第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、或全长第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原。核酸序列可以包括编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的序列。核酸序列可以包含SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ IDNO:72。在一个实施方案中，所述核苷酸序列包括由本文所述的DNA序列转录的RNA序列。例如，核酸可以包括由SEQ ID NO:64、65、66、69、70或72的DNA序列、其片段或其变体转录的RNA序列。核酸序列可任选地包含编码信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。
核酸序列可以编码全长共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的片段、全长第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的片段、全长共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原包膜糖蛋白免疫原的片段、全长共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的片段、全长马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的片段、全长第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的片段、全长第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的片段、或全长第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的片段。核酸序列可以包括编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的片段的序列。核酸序列可以包含SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72的片段。片段大小如在本文标题为“片段”的部分中所述公开。核酸序列可任选地包含编码信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。
核酸序列可以编码与全长共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、全长第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、全长共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原包膜糖蛋白免疫原同源的蛋白质；与全长共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原同源的蛋白质；与全长马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原同源的蛋白质；与全长第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原同源的蛋白质；与全长第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原同源的蛋白质；或与全长第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原同源的蛋白质。核酸序列可以包括编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68同源的蛋白质的序列。核酸序列可与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:70或SEQ ID NO:72同源。本文如在涉及变体的部分中讨论了同源性程度。核酸序列可任选地包含编码信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。
核酸序列可以编码与全长共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的片段同源的蛋白质、与全长第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的片段同源的蛋白质、与全长共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原包膜糖蛋白免疫原的片段同源的蛋白质、与全长共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的片段同源的蛋白质、与全长马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白免疫原的片段同源的蛋白质、与全长第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的片段同源的蛋白质、与全长第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的片段同源的蛋白质、或与全长第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的片段同源的蛋白质。核酸序列可以包括编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的片段同源的蛋白质的序列。核酸序列可以包含与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:72同源的片段。本文如在涉及变体的部分中讨论了同源性程度。核酸序列可任选地包含编码信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。
SEQ ID NO:64是质粒pEBOZ中的核苷酸序列插入物，其编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:65是质粒pEBOS中的核苷酸序列插入物，其编码共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:66是质粒pMARZ ANG中的核苷酸序列插入物，其编码马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白。
SEQ ID NO:69是质粒pEBOZGUI中的核苷酸序列插入物，其编码共有扎伊尔埃博拉病毒GP包膜糖蛋白免疫原。
SEQ ID NO:70是质粒pEBOZCON2中的核苷酸序列插入物，其编码第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白。
4.载体
载体包括但不限于质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等等。“载体”包含可以感染、转染、瞬时或永久转导细胞的核酸。应认识到，载体可以是裸核酸，或与蛋白质或脂质复合的核酸。载体任选地包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜等)。载体包括但不限于DNA片段可以附接和复制的复制子(例如，RNA复制子、噬菌体)。因此，载体包括但不限于RNA、自主自我复制的环状或线性DNA或RNA(例如，质粒、病毒等，参见，例如美国专利第5,217,879号)，并且包括表达和非表达质粒。当重组微生物或细胞培养物被描述为具有“表达载体”时，这包括染色体外环状和线性DNA以及已整合进一条或多条宿主染色体的DNA二者。当载体由宿主细胞维持时，载体可以在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定复制，或整合在宿主的基因组内。
a.质粒
质粒可包含编码上文公开的各种免疫原中的一种或多种的核酸序列，包括编码能够引发针对丝状病毒蛋白(filoprotein)的免疫应答的合成、共有抗原的编码序列。
单个质粒可含有单一丝状病毒蛋白免疫原的编码序列、两种丝状病毒蛋白免疫原的编码序列、三种丝状病毒蛋白免疫原的编码序列、四种丝状病毒蛋白免疫原的编码序列、五种丝状病毒蛋白免疫原的编码序列或六种丝状病毒蛋白免疫原的编码序列。单个质粒可含有可配制在一起的单一丝状病毒蛋白免疫原的编码序列。在一些实施方案中，质粒可包含编码IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列。
质粒还可包含可以在编码序列上游的起始密码子和可以在编码序列下游的终止密码子。起始和终止密码子可与编码序列同框。
质粒还可以包含与编码序列可操作地连接的启动子。与编码序列可操作地连接的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子(诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV立即早期启动子)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子也可以是来自人基因的启动子，诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子也可以是天然或合成的组织特异性启动子，诸如肌肉或皮肤特异性启动子。这些启动子的实例描述于美国专利申请公开号US20040175727中，该美国专利申请公开的内容整体并入本文。
质粒还可以包含多聚腺苷酸化信号序列，其可以在编码序列的下游。多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号、或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(Invitrogen,San Diego,CA)的多聚腺苷酸化信号。
质粒还可以包含在编码序列上游的增强子。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。在美国专利第5,593,972、5,962,428和WO94/016737号中描述了多核苷酸功能增强，每个专利的内容通过引用全部并入本文。
质粒还可以包含哺乳动物复制起点，以在染色体外维持质粒并且在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAX1、pCEP4或pREP4，它们可以包含爱泼斯坦-巴尔病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝游离型复制。质粒的骨架可以是pAV0242。质粒可以是复制缺陷型5型腺病毒(Ad5)质粒。
质粒还可以包含调控序列，所述调控序列可以非常适合于其中施用质粒的细胞中的基因表达。编码序列可以包含可以允许编码序列在宿主细胞中更有效地转录的密码子。
编码序列还可包含Ig前导序列。前导序列可以在编码序列的5’。该序列编码的共有抗原可包含N端Ig前导序列，接着是共有抗原蛋白质。N端Ig前导序列可以是IgE或IgG。
质粒可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，可以用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。质粒也可以是pYES2(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株中产生蛋白质。质粒也可以是MAXBACTM完整杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒也可以是pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。
b.RNA载体
在一个实施方案中，所述核酸为RNA分子。因此，在一个实施方案中，本发明提供了编码马尔堡马德哥病毒(MARV)、苏丹埃博拉病毒(SUDV)或扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)的包膜糖蛋白(GP)基因中的一种或多种的RNA分子。RNA可以是正链。因此，在一些实施方案中，RNA分子可以由细胞翻译，而不需要任何中间重复步骤，诸如逆转录。本发明所用的RNA分子可以具有5′帽(例如7-甲基鸟苷)。该帽可以增加RNA的体内翻译。本发明所用的RNA分子的5′核苷酸可以具有5′三磷酸基团。在加帽RNA中，这可以通过5′至5′桥连接至7-甲基鸟苷。RNA分子可以具有3′多聚腺苷酸尾。它还可包括其3′末端附近的多聚腺苷酸聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。本发明使用的RNA分子可以是单链的。
c.线性载体
本文还提供了线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效递送至受试者并表达一种或多种所需抗原。LEC可以是缺乏任何磷酸骨架的任何线性DNA。DNA可以编码一种或多种抗原。LEC可含有启动子、内含子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号。抗原的表达可以受启动子控制。LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可以不含与所需抗原基因表达无关的其他核酸序列。
LEC可以来源于能够线性化的任何质粒。质粒可能能够表达抗原。质粒可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达DNA并且使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。
LEC可以来源于能够线性化的任何质粒。质粒可能能够表达抗原。质粒可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达DNA并且使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。
d.病毒载体
在一个实施方案中，本文提供病毒载体，它们能够将本发明的核酸递送至细胞。表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域中公知的，并且例如在Sambrook等人(2001年)和在在Ausubel等人(1997)，以及其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来讲，合适的载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、简便限制性核酸内切酶位点以及一个或多个选择性标记。(参见，例如WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利第6,326,193号。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物(例如人)细胞的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等等。参见例如，美国专利第5,350,674和5,585,362号。
5.组合物
提供了包含核酸分子的组合物。所述组合物可包含单一核酸分子(诸如单个质粒)的多个拷贝、两种或更多种不同核酸分子(诸如两种或更多种不同质粒)的多个拷贝。例如，组合物可包含多种，即两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种不同的核酸分子。此类组合物可包含多种，即两种、三种、四种、五种、六种或更多种不同的质粒。
组合物可以包含核酸分子，诸如质粒，其共同包含选自由以下组成的组的单一丝状病毒蛋白免疫原的编码序列：一种或多种共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原。
组合物包含编码以下的组合的核酸序列：共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原。
优选在单独的质粒上包括每种丝状病毒蛋白免疫原的每个编码序列。
因此，包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原；共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上，但优选处于两个单独的质粒上。
包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原；或共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，但优选处于三个单独的质粒上。
包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，或处于呈任何排列的三个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上，但优选处于五个单独的质粒上。
包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，或处于呈任何排列的三个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上，但优选处于五个单独的质粒上。
包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，或处于呈任何排列的三个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上，但优选处于五个单独的质粒上。
包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，或处于呈任何排列的三个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上但优选处于六个单独的质粒上。
包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，或处于呈任何排列的三个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上但优选处于六个单独的质粒上。
包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，或处于呈任何排列的三个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上，或处于呈任何排列的五个质粒上但优选处于六个单独的质粒上。
包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，或处于呈任何排列的三个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上，或处于呈任何排列的五个质粒上，或处于呈任何排列的六个质粒上，但优选处于七个单独的质粒上。
包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，或处于呈任何排列的三个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上，或处于呈任何排列的五个质粒上，或处于呈任何排列的六个质粒上，但优选处于七个单独的质粒上。
同样，包含编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸序列的组合物可以处于单个质粒上或处于呈任何排列的两个质粒上，或处于呈任何排列的三个质粒上，或处于呈任何排列的四个质粒上，或处于呈任何排列的五个质粒上，或处于呈任何排列的六个质粒上，或处于呈任何排列的七个质粒上，但优选处于八个单独的质粒上。
6.疫苗
本文提供了能够在哺乳动物中产生针对丝状病毒，特别是马尔堡病毒、苏丹埃博拉病毒和/或扎伊尔埃博拉病毒的免疫应答的疫苗。疫苗可包含如上所述的每种质粒。疫苗可包含多种质粒或其组合。可以提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫应答。
疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原和马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原和马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、扎伊尔埃博拉病毒2014包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗可用于递送编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、共有扎伊尔埃博拉病毒几内亚包膜糖蛋白免疫原、共有苏丹埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原、马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005包膜糖蛋白、第一共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原、第二共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原和第三共有马尔堡马尔堡病毒包膜糖蛋白免疫原的核酸分子。疫苗优选为包含质粒的组合物。
疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂(Freunds incompleteadjuvant)；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物；囊泡，诸如鲨烯和角鲨烯；透明质酸；脂质；脂质体；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子或纳米颗粒或者其他已知的转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子；聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)；或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸，更优选地，聚-L-谷氨酸以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物以及囊泡，诸如鲨烯和角鲨烯，并且还可以使用与遗传构建体结合施用的透明质酸。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂，诸如脂质；脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)；钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或者其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子；聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)；或脂质。疫苗中转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可以是一种或多种佐剂。佐剂可以是由其或由替代质粒表达的，或者作为蛋白质与疫苗中的上述质粒组合递送的其他基因。所述一种或多种佐剂可以是选自由以下组成的组的蛋白质和/或编码选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15(包括信号序列或编码信号序列的编码序列缺失并且任选地包括不同的信号肽，诸如来自IgE的信号肽或编码差异信号肽诸如来自IgE的差异信号肽的编码序列的IL-15)、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段或其组合。在一些实施方案中，佐剂可以是选自由以下组成的组的一种或多种蛋白质和/或编码选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子：CCL-20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES。IL-12构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US1997/019502和相应的美国申请序列号08/956,865，以及2011年12月12日提交的美国临时申请序列号61/569600中，所述申请各自通过引用并入本文。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US04/18962和相应的美国申请序列号10/560,650，及PCT申请号PCT/US07/00886和相应的美国申请序列号12/160,766以及PCT申请号PCT/US10/048827中，所述申请各自通过引用并入本文。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US09/039648和相应的美国申请序列号12/936,192中，所述申请各自通过引用并入本文。RANTES及其他构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US1999/004332和相应的美国申请序列号09/622452中，所述申请各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其他实例公开于PCT申请号PCT/US11/024098中，该申请通过引用并入本文。RANTES及其他构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US1999/004332和相应的美国申请序列号09/622452中，所述申请各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其他实例公开于PCT申请号PCT/US11/024098中，该申请通过引用并入本文。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US2005/042231和相应的美国申请序列号11/719,646中，所述申请各自通过引用并入本文。OX40和其他免疫调节剂的实例公开于美国申请序列号10/560,653中，其通过引用并入本文。DR5和其他免疫调节剂的实例公开于美国申请序列号09/622452中，其通过引用并入本文。
疫苗还可以包含1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所述的遗传疫苗促进剂，该专利以引用的方式整体并入。
疫苗可包含共有抗原和质粒，其量为约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；或优选约0.1微克至约10毫克；或更优选约1毫克至约2毫克。在一些优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物可以含有约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物可以含有约0.1至约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物可以含有约1至约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克；约1微克到约10毫克；约0.1微克到约10毫克；约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克的共有抗原或其质粒。
疫苗可以根据要使用的施用模式来配制。可注射的疫苗药物组合物可以是无菌的、无热原的和无颗粒的。可以使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗还可包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定可以允许制剂在室温或环境温度下稳定一段较长的时间，诸如用于疫苗制剂的LGS或聚阳离子或聚阴离子。
疫苗可在室温(25℃)下稳定超过1周、在一些实施方案中超过2周、在一些实施方案中超过3周、在一些实施方案中超过4周、在一些实施方案中超过5周、并且在一些实施方案中超过6周。在一些实施方案中，疫苗稳定超过一个月、超过2个月、超过3个月、超过4个月、超过5个月、超过6个月、超过7个月、超过8个月、超过9个月、超过10个月、超过11个月、或超过12个月。在一些实施方案中，疫苗稳定超过1年、超过2年、超过数年或超过5年。在一个实施方案中，疫苗在冷藏(2-8℃)下是稳定的。因此，在一个实施方案中，疫苗不需要冷冻冷链。如果疫苗保持其生物活性持续足够的时间以允许实现其预期用途(例如，在受试者中产生免疫应答)，则疫苗是稳定的。例如，为了储存、运输疫等苗，可能希望疫苗保持稳定数月至数年。
7.递送疫苗的方法
本文提供了递送用于提供共有抗原的遗传构建体和蛋白质的疫苗的方法，所述抗原包含使其对丝状病毒，特别是马尔堡病毒、苏丹埃博拉病毒和/或扎伊尔埃博拉病毒的免疫原特别有效的表位，可以诱导针对所述免疫原的免疫应答。可以提供递送疫苗或疫苗接种的方法以诱导治疗性和预防性免疫应答。疫苗接种过程可在哺乳动物中产生针对丝状病毒，特别是马尔堡病毒、苏丹埃博拉病毒和/或扎伊尔埃博拉病毒的免疫应答。可以将疫苗递送给个体以调节哺乳动物免疫系统的活性并增强免疫应答。疫苗的递送可以是共有抗原作为核酸分子转染，所述核酸分子在细胞中表达并递送至免疫系统识别的细胞表面并诱导细胞、体液或细胞和体液应答。通过向哺乳动物施用如上所述的疫苗，疫苗的递送可用于在哺乳动物中诱导或引发针对丝状病毒，尤其是马尔堡病毒、苏丹埃博拉病毒和/或扎伊尔埃博拉病毒的免疫应答。
在将疫苗和质粒递送到哺乳动物细胞内之后，转染的细胞将会表达并分泌从疫苗注射的每种质粒的共有抗原。这些蛋白质将被免疫系统识别为外来物，并且将会针对其产生抗体。这些抗体将由免疫系统维持，并允许对后续丝状病毒感染，特别是马尔堡病毒，苏丹埃博拉病毒和/或扎伊尔埃博拉病毒感染的有效应答。
疫苗可以施用给哺乳动物以在哺乳动物中引发免疫应答。哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、奶牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。
a.联合治疗
疫苗可以与其他蛋白质和/或编码以下物质的基因组合施用：CCL20、α-干扰素、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15(包括信号序列缺失并且任选地包括不同的信号肽，诸如IgE信号肽的IL-15)、MHC、CD80、CD86、IL-28、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段或其组合。在一些实施方案中，疫苗与一种或多种下列核酸分子和/或蛋白质组合施用：选自由以下组成的组的核酸分子：包含编码CCL20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC和RANTES中的一种或多种或其功能片段的编码序列的核酸分子；以及选自由以下组成的组的蛋白质：CCL02、IL-12蛋白、IL-15蛋白、IL-28蛋白、CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白或RANTES蛋白或其功能片段。
疫苗可以通过不同的途径施用，包括口服、肠胃外、舌下、透皮、经直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经由颊面施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内以及关节内或它们的组合。对于兽医用途，组合物可以根据正常的兽医实践作为可适当接受的制剂施用。兽医可以容易地确定最适合于具体动物的给药方案和施用途径。疫苗可以通过传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其他物理方法，诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来施用。
疫苗的质粒可以通过几种公知的技术递送给哺乳动物，所述技术包括用和不用体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA疫苗接种)、脂质体介导、纳米颗粒促进、重组载体(诸如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒)和重组痘苗。共有抗原可以通过DNA注射，连同体内电穿孔递送。
b.电穿孔
经由疫苗质粒的电穿孔而施用疫苗可以使用电穿孔装置来完成，所述电穿孔装置可以被配置成向哺乳动物的所期望的组织递送能够有效引起在细胞膜中形成可逆性孔隙能量脉冲，并且优选的是，能量脉冲是与使用者输入的预设电流相似的恒定电流。电穿孔装置可以包括电穿孔部件和电极组件或柄部组件。电穿孔部件可以包括和结合电穿孔装置的各种元件中的一种或多种，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储部件、电源和电源开关。电穿孔可以使用体内电穿孔装置完成，例如CELLECTRA EP系统(VGX Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)或Elgen电穿孔仪(Genetronics,San Diego,CA)，以促进质粒对细胞的转染。
电穿孔部件可以充当电穿孔装置的一个元件，并且其他元件是与电穿孔部件通信的单独元件(或部件)。电穿孔部件可以充当电穿孔装置的多于一个元件，其可以与和电穿孔部件分开的电穿孔装置的另外其他元件通信。作为一个机电装置或机械装置的零件存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为元件可以充当一个装置或彼此通信的单独元件。电穿孔部件可能能够在所期望的组织中递送产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件可以包括具有空间排列的多个电极的电极阵列，其中电极组件从电穿孔部件接收能量脉冲并且将其经由电极递送至所期望的组织。多个电极中的至少一个在递送能量脉冲期间是中性的，并且测量所期望组织中的阻抗，并且将阻抗传送给电穿孔部件。反馈机制可以接收所测量的阻抗并且可以调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。多个电极可以经由按照编程序列控制电极以分散模式来递送能量脉冲，并且编程序列是由使用者输入到电穿孔部件。编程序列可以包括按顺序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每一个脉冲是由至少两个有源电极递送的，其中一个中性电极测量阻抗，并且其中多个脉冲的后续脉冲由至少两个有源电极中不同的电极递送，其中一个中性电极测量阻抗。
反馈机制可以通过硬件或软件执行。反馈机制可以通过模拟闭环电路执行。反馈每50微秒、20微秒、10微秒或1微秒发生一次，但优选地是实时反馈或瞬时的(即基本上瞬时的，如通过用于确定响应时间的可用技术确定)。中性电极可以测量所期望的组织中的阻抗并且将阻抗传送给反馈机制，并且反馈机制对阻抗作出响应并且调整能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值。反馈机制可以在递送能量脉冲期间连续地并且瞬时地维持恒定电流。
可以促进本发明的DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963、Smith等人递交的美国专利公开2005/0052630中所述的那些，这些文献的内容据此以引用的方式整体并入本文。可以用于促进DNA疫苗的递送的其他电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未决的和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的那些，该美国专利申请依照美国法典第35篇第119条(e)款要求保护2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982的权益，所有申请均据此整体并入。
Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963描述了模块化电极系统和它们用于促进将生物分子引入到身体或植物中所选择的组织的细胞中的用途。模块化电极系统可包括多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；和电源。操作人员可以抓住安装在支撑结构上的多个针电极并且将它们牢固地插入到身体或植物中所选择的组织中。然后经由皮下注射针将生物分子递送到所选择的组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器并且将恒定电流电脉冲施加到多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容据此以引用的方式并入。
Smith等人递交的美国专利公开2005/0052630描述了一种电穿孔装置，其可以用于有效地促进生物分子引入到身体或植物中所选择的组织的细胞中。电穿孔装置包括电动装置(“EKD装置”)，其操作由软件或固件指定。EKD装置基于使用者对脉冲参数的控制和输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲图形，并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包括可更换的电极盘，所述电极盘具有针电极的阵列、用于注射针的中心注射通道以及可移除的引导盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容在此以引用的方式并入。
美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/0052630中所述的电极阵列和方法可以适用于不仅深度穿透到诸如肌肉的组织中，而且还深度穿透到其他组织或器官中。由于电极阵列的配置，因此注射针(递送所选择的生物分子)也完全插入到靶器官中，并且在由电极预先界定的区域中垂直于靶组织施用注射。美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/005263中所述的电极优选地为20mm长和21号。
此外，在包括电穿孔装置和其用途的一些实施方案中考虑，电穿孔装置是以下专利中所述的那些：1993年12月28日公布的美国专利5,273,525、2000年8月29日公布的美国专利6,110,161、2001年7月17日公布的美国专利6,261,281、和2005年10月25日公布的美国专利6,958,060、以及2005年9月6日公布的美国专利6,939,862。此外，本文考虑了涵盖2004年2月24日公布的美国专利6,697,669(涉及使用多种装置中的任一种递送DNA)和2008年2月5日公布的美国专利7,328,064(涉及注射DNA的方法)中提供的主题的专利。上述专利以引用的方式整体并入。
c.制备DNA质粒的方法
本文提供了用于制备包含本文讨论的DNA疫苗的DNA质粒的方法。在最终亚克隆到哺乳动物表达质粒中之后，可以使用本领域已知的方法，使用DNA质粒来接种大规模发酵罐中的细胞培养物。
可以使用已知装置和技术的组合配制或制造用于随本发明的EP装置一起使用的DNA质粒，但优选地，它们使用2007年5月23日提交、批准的、共同未决的美国临时专利申请美国序列号60/939,792中描述的质粒制造技术来制造。在一些实例中，这些研究中使用的DNA质粒可以以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除了美国序列号60/939792中所述的那些装置和方案之外，制造技术还包括或结合了本领域的普通技术人员通常已知的多种装置和方案，包括2007年7月3日公布的许可专利美国专利号7,238,522中所述的那些。上文引用的申请和专利美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522分别据此整体并入本文。
实施例
在以下实施例中进一步说明本发明。应当了解的是，这些实施例虽然表明了本发明的优选的实施方案，但是仅通过说明方式给出。从上述论述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改以使它适应各种用途和条件。因此，根据上述说明，除本文所示和所述的那些之外，本发明的多种修改对本领域技术人员来说将是显而易见的。这些修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
实施例1
方法
质粒疫苗构建
pMARV、pEBOS和pEBOZ质粒DNA构建体编码全长GP蛋白。对于pEBOS和pEBOZ而言使用氨基酸共有策略，而对于pMARV而言使用来自2005年安哥拉爆发毒株的类型匹配序列(GenBank#VGP_MABVR)(Towner JS等人，(2006).Marburgvirus genomics andassociation with a large hemorrhagic fever outbreak in Angola.J Virol 80:6497-6516)。通过比对主要的ZEBOV和SUDV GP氨基酸序列并为每个氨基酸序列产生共有序列来确定共有序列。每种疫苗GP基因经遗传优化用于在人体中表达(包括用于增强蛋白质表达的密码子和RNA优化(GenScript,Piscataway,NJ))，商业合成，然后亚克隆(GenScript,Piscataway,NJ)到经修饰的pVAX1哺乳动物表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中受巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子的控制；修饰包括2A>C、3C>T、4T>G、241C>G、1,942C>T、2,876A>-、3,277C>T和3,753G>C。通过使用MEGA第5版软件，用ClustalW进行多重比对来进行系统发育分析。或者，相比之下MARV中的GP多样性要高得多(约70％同一性)，因此不采用共有策略。为了覆盖MARV，我们选择利用来自2005年安哥拉爆发的MGP序列(GenBank#VGP_MABVR)，因为它是迄今为止独自造成最大和最致命的MARV爆发的原因。该序列与其最接近的相关毒株集群的差异大于10％，最接近的相关毒株集群包括Musoke、Popp和莱顿(10.6％差异)，或乌干达(01Uga07)、杜尔巴(05DRC99和07DRC99)和Ozolin(10.3％差异)。总的来说，三质粒策略为我们的新型三价多价丝状病毒疫苗策略奠定了基础。
转染和免疫印迹
培养、转染并收获人胚肾(HEK)293T细胞。简言之，使细胞在含有10％FBS、1％Pen-strep、丙酮酸钠和L-谷氨酰胺的DMEM中生长。细胞在150毫米Corning培养皿中培养并在含有5％ CO2的37°培养箱中生长过夜至70％汇合。使用CalphosTM哺乳动物转染试剂盒方案(Clonetech)或LipofectamineTM2000试剂(Invitrogen)按照制造商的方案，用10-25μg丝状病毒pDNA转染培养皿，然后孵育24-48小时。用冰冷的PBS收获细胞，离心并洗涤，然后沉淀用于Western免疫印迹或FACS分析。使用标准Western印迹法，产生用于GP1检测的GP特异性MAb。图1B中示出了来自Western免疫印迹实验的数据。图1C中示出了来自FACS分析的数据。
动物、疫苗接种和攻击
成年雌性C57BL/6(H-2b)、BALB/cJ(H-2d)和Bl0.Br(H-2k)小鼠购自The JacksonLaboratory(Bar Harbor,ME)，而Hartley豚鼠来自于Charles River(Wilmington,MA)。所有动物实验均遵循UPenn IACUC和医学院动物设施，或PHAC的NML机构动物护理委员会和加拿大动物管理委员会关于实验动物饲养和护理的指导原则进行，并在上述机构进行相关审查和批准后，根据NIH实验室动物护理和使用指南中的建议来执行。UPenn和NML遵守NIH关于动物福利、动物福利法案以及所有其他适用的联邦、州和地方法律的政策。
通过针头注射40μg重新悬浮于水中的质粒对小鼠进行肌内接种免疫，同时对豚鼠皮内接种各200μg到三个单独的疫苗接种部位。疫苗接种后立即在同一部位进行EP。简言之，三管齐下的自适应恒定电流微创装置插入皮内大约2mm(InovioPharmaceuticals,Inc.,Blue Bell,PA)。通过由26号实心不锈钢电极组成的三角形3电极阵列传送方波脉冲，并且传送两个0.1安培的恒定电流脉冲，52毫秒/脉冲，间隔1秒延迟。
对于致命性攻击研究，攻击限于啮齿动物适应型ZEBOV和MARV。在最后一次疫苗接种后28天通过腹膜内注射1,000LD50豚鼠适应型ZEBOV(21.3FFU/只动物)(Richardson JS,Abou MC,Tran KN,Kumar A,Sahai BM,Kobinger GP(2011).Impact of systemic ormucosal immunity to adenovirus on ad-based Ebola virus vaccine efficacy inguinea pigs.J Infect Dis 204Suppl 3:S1032-1042)或1,000LD50 MARV-安哥拉(681TCID50/只动物)对豚鼠进行攻击。简言之，通过野生型MARV-安哥拉在远交成年雌性Hartley豚鼠中连续传代来制备豚鼠适应型MARV。接种后7天，使动物安乐死，收获肝脏并匀浆。然后将这种匀浆经腹膜内注射到初次实验的成年豚鼠中并重复该过程，直到动物体重减轻，失去毛发光泽，并且死于和豚鼠EBOV适应相似的感染。对于小鼠致死性攻击研究(Kobinger GP等人，(2006).Chimpanzee adenovirus vaccine protects against ZaireEbola virus.Virology 346:394-401)，对小鼠经腹腔内注射200μ1的1,000LD50(10FFU/只动物)小鼠适应型ZEBOV。对所有动物每天称重并使用批准的评分表监测疾病进展，监测小鼠持续至少18天而监测豚鼠持续22天。所有感染性工作均在PHAC的NML’4级生物安全’(BSL4)设施中进行。
ELISA和中和测定
使用包被有浓度为1:2,000的蔗糖纯化的MARV Ozolin GP或ZGP或阴性对照蔗糖纯化的Nipah G蛋白的96孔ELISA板测定抗体(Ab)效价。简言之，然后将板在4℃孵育18小时，用PBS和0.1％Tween-20洗涤，并且一式三份测试100μl/血清样品(在含有5％脱脂乳和0.5％Tween-20的PBS中稀释1:100、1:400、1:1,600和1:6,400)。在潮湿容器中于37℃孵育1小时后，将板洗涤，然后添加100μl山羊抗小鼠IgG偶联的HRP抗体(Cedarlane)(1:2,000稀释)并在潮湿容器中于37℃再孵育1小时。洗涤后，添加100μl的ABST(2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和过氧化物酶底物(Cedarlane)以使Ab结合可视化。再在潮湿容器中，将板在37℃下孵育30分钟，然后在405nm下读取。阳性结合结果的特征在于从阴性对照血清中减去阳性对照时>3SD。
进行ZEBOV中和测定。简言之，将从免疫小鼠和豚鼠收集的血清在56℃下灭活45分钟并将每个样品的连续稀释液(在50μl的DMEM中，对于小鼠而言稀释1:20、1:40等......，而对于豚鼠而言稀释1:50)与等体积的表达EGFP报告基因的ZEBOV(ZEBOV-EGFP)(根据EGFP表达，为100个转导单位/孔)混合，并在37℃下孵育90分钟。然后将混合物转移到96孔平底板中的亚汇合VeroE6细胞上，并在室温下孵育5-10分钟。用等量ZEBOV-EGFP病毒感染对照孔，不添加血清或用非免疫血清。然后向每个孔中添加100μl补充有20％FBS的DMEM，并将板在37℃、5％CO2中孵育48小时。
或者，使用免疫荧光测定评估MARV-安哥拉368的中和。使用兔抗MARV一抗和山羊抗兔二抗IgG FITC偶联抗体进行检测。基于CV-1细胞上的细胞病变效应(CPE)测定针对SUDV博尼法斯的中和抗体(NAb)。将细胞与等份的免疫血清和SUDV博尼法斯孵育10天，之后用10％缓冲福尔马林(formalin)固定24小时，并在光学显微镜下进行检查。对每个孔中的EGFP和FITC阳性细胞计数，并且样品稀释液显示与对照相比NAb评分为正的绿色细胞数量减少>50％。或者，基于CV-1细胞上的细胞病变效应(CPE)测定针对SUDV-博尼法斯的NAb。所有感染性工作均在PHAC的NML的BSL4实验室中进行。
脾细胞分离
在最后一次免疫8-11天后处死小鼠并收获脾脏。简言之，将脾脏放入补充有10％FBS、1X ka(Invitrogen)和1Xβ-ME(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Mediatech Inc.,Manassas,VA)中。使用Stomacher机器(Seward Laboratory Systems Inc.,Bohemia,NY)，通过机械破坏脾脏来分离脾细胞，并使用40μm细胞滤网(BD Falcon)过滤所得产物。然后用ACK裂解缓冲液(Lonza,Switzerland)处理细胞5分钟以裂解RBC，在PBS中洗涤，然后重悬于RPMI培养基中用于ELISPOT或FACS测定。
ELISPOT测定
进行标准IFNγELISPOT测定。简言之，用抗小鼠IFN-γ捕获抗体包被96孔板(Millipore,Billerica,MA)，并在4℃下孵育24小时(R&DSystems,Minneapolis,MN)。第二天，将板用PBS洗涤，然后用封闭缓冲液(1％BSA和5％蔗糖的PBS溶液)将板封闭2小时。接种脾细胞(1-2x105个细胞/孔)，一式三份，并在37℃、5％CO2下并在RPMI1640(阴性对照)、ConA(阳性对照)或单独的(9个氨基酸重叠且跨越各自GP的长度的15-mer)或完全合并(最终2.5μg/ml)的GP肽的存在下刺激过夜。刺激18-24小时后，将板在PBS中洗涤，然后在4℃下与生物素化的抗小鼠IFN-γmAb(R&D Systems,Minneapolis,MN)孵育24小时。接下来，将板再次在PBS中洗涤，并向每个孔中添加链霉亲和素-碱性磷酸酶(MabTech,Sweden)并在室温下孵育2小时。最后，将板再次在PBS中洗涤，然后向每个孔中添加BCIP/NBT Plus底物(MabTech)，保持5-30分钟以进行斑点显影。一旦目视检查显影过程完成，就将板用蒸馏水冲洗，然后在室温下干燥过夜。使用自动ELISPOT读数器(Cellular Technology Ltd.,Shaker Heights,OH)对斑点进行计数。
对于T细胞宽度的综合分析，如先前在Shedlock DJ等人，(2012).SUPRA中所述，本文对标准IFNγELISPOT进行了改进。通过用单个肽刺激脾细胞相对于整个或矩阵肽库来评估亚显性和免疫显性T细胞表位的鉴定和测量；为了保存样品而合并肽的传统做法，例如使用矩阵阵列库，导致测定灵敏度降低，因为含有多个表位展示肽的库中的总功能反应会有效降低测定分辨率，即‘淹没(drown-out)’那些较低等级的肽。因此，改进的ELISPOT用跨越每种GP免疫原的单个肽(9个氨基酸重叠的15-mer；最终2.5μg/ml)进行。鉴定出含有T细胞表位的肽(≥10AVE IFNγ+斑点和≥80％动物应答率；汇总于表1-6中)，然后通过FACS在功能和表型上进行确认。没有鉴定出共享或部分表位，基于FACS数据或网络的表位预测软件也未表明存在连续肽内保留的CD4+或CD8+T细胞表位。此处，对于通过改进的ELISPOT测定鉴定的所有连续肽应答实例，寻找可能的共享/部分T细胞表位。用每种连续肽单独刺激细胞，并且组合配对用于直接比较，并且如果组合应答不比两个单独应答中的任一个强，则定义为‘共享/部分’。同样，必须注意的是，本文提供的表位应答可能尚不完全全面，因为用于产生肽的‘9个氨基酸重叠的15-mer’算法偏向于完全覆盖CD8 T细胞表位，其由于II类限制性表位长于15个氨基酸的性质而对CD4 T细胞应答估计不足。最后，使用Vector NTI软件生成氨基酸相似性图，结果显示在图4B中。
流式细胞术
将脾细胞添加到96孔板(lxl06个细胞/孔)中并用单个肽或‘最小肽库’(最终2.5μg/ml)刺激5-6小时。使用单个肽刺激对通过改进的ELISPOT鉴定的所有肽(表1-6)进行功能确认以及表型表征。首先用固定紫死细胞染色试剂盒(Invitrogen)对脾细胞和经转染的293T进行预染色。对于脾细胞而言，将细胞针对CD19(V450；克隆1D3)、CD4(PE-Cy7；克隆RM4-5)、CD8α(APC-Cy7；克隆53-6.7)和CD44(PE-Cy5；克隆IM7)(BDBiosciences,San Jose,CA)进行表面染色，在PBS+1％ FBS中洗涤三次，用BD Cytofix/CytopermTM试剂盒透化，然后用IFNγ(APC；克隆XMG1.2)、TNF(FITC；克隆MP6-XT22)、CD3(PE-cy5.5；克隆145-2C11)和T-bet(PE；克隆4B10)(eBioscience,San Diego,CA)进行细胞内染色。转染24小时后评估经转染的293T细胞中的GP表达。在4℃下在含有指定的小鼠来源的GP特异性多克隆血清试剂(1:200稀释)的PBS+1％FBS中孵育30分钟后进行间接染色，每种血清试剂通过合并来自经其各自的DNA疫苗或pVAX1空载体对照免疫接种三次的H-2b小鼠的血清产生。然后将细胞用FITC偶联的山羊抗小鼠IgG(BioLegend,San Diego,CA)染色，充分洗涤，然后针对MHC I类(HLA-ABC；PE-Cy7；克隆G46-2.6；BD)染色。将所有细胞在1％多聚甲醛中固定。所有数据均使用LSRII流式细胞仪(BD)收集，并使用FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR)进行分析。针对激活的产生IFNγ的T细胞，对脾细胞进行设门，所述T细胞是CD3+CD44+、CD4+或CD8+，并且对于B细胞标记物CD19和活力染料为阴性。
图6显示了GP特异性T细胞设门。对于通过ELISPOT鉴定的含有T细胞表位的肽的功能和表型分析通过总淋巴细胞、CD 19和LIVE-DEAD(转储通道)阴性的活(LD)CD3+细胞、单管(不包括细胞双管)、CD4+和CD8+细胞、活化细胞(CD44+)和产生肽特异性IFNγ的T细胞的FACS设门来进行。
统计分析
通过最大似然法确定无根系统发育树的显著性并通过靴值分析检验，并且显著性支持值(≥80％；1,000个靴值重复)通过MEGA第5版软件测定。通过匹配、双尾、非配对的t检验完成群组分析，并通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析存活曲线。所有值均为平均值±SEM，并且通过GraphPad Prism(La Jolla，CA)进行统计分析。
结果
疫苗构建和表达
系统发育分析揭示了EBOV GP之间的相对保守性(SUDV为94.4％而ZEBOV为92.9％)，而MARV GP(MGP)有更多不同(约70％保守)。因此，对于EBOV GP采用了正如通过主要ZEBOV和SUDV GP氨基酸序列比对确定的共有策略，而对于MARV使用类型匹配策略，采用独自造成最大和最致命的MARV爆发的2005年安哥拉爆发序列。对每个GP转基因进行遗传优化，商业合成，然后亚克隆到经修饰的pVAX1哺乳动物表达载体中。总的来说，三质粒策略为我们的新型多价丝状病毒疫苗策略奠定了基础。
用每种质粒单独转染HEK 293T细胞，并通过Western免疫印迹和FACS评估GP表达。使用物种特异性抗GP1 mAb进行检测，在转染后48小时收获的每种细胞裂解物中观察到约130kDa蛋白质。结果示于图1B中。对于比较对照，将表达相应GP的重组水泡性口炎病毒(rVSV)上样到并行泳道中。接下来，在转染后24小时用GP特异性或对照多克隆血清间接染色，通过FACS分析细胞表面上的GP表达。结果示于图1C中。检测所有疫苗质粒的细胞表面表达，同时观察到很少的非特异性结合；对照血清不与GP转染的细胞反应，含有经pVAX1转染的细胞的阳性血清也不反应(显示了pEBOZ的数据)。正如对EBOV GP所预期的那样，细胞表面表达在空间上阻止表面MHC I类以及β1整联蛋白的识别(Francica JR,Varela-RohenaA,Medvec A,Plesa G,Riley JL,Bates P(2010).Steric shielding of surfaceepitopes and impaired immune recognition induced by the ebola virusglycoprotein.PLoS Pathog 6:e1001098)。
对MARV和ZEBOV攻击的完全防护
为了确定防护功效，我们采用了豚鼠临床前攻击模型。本文使用豚鼠和小鼠模型进行临床前免疫原性和功效研究。豚鼠临床前模型已被广泛用作筛选和＇概念验证＇工具用于丝状病毒疫苗开发。尽管MARV和EBOV的原代分离株在豚鼠中引起非致命疾病，但该宿主中的少量传代导致选择能够引起致命疾病的变体，其病理特征类似于在感染丝状病毒的灵长类动物中所见的病理特征。类似地，小鼠也已广泛用于丝状病毒疫苗开发，然而，与豚鼠模型不同，用于评估免疫和T细胞应答的免疫检测试剂可广泛获得。感染鼠适应型ZEBOV(mZEBOV)导致疾病，所述疾病特征在于靶器官中的高水平病毒及肝脏和脾脏中的病理变化类似于在感染EBOV的灵长类动物中发现的那些。
豚鼠(n＝24)用各200μg质粒(pEBOZ、pEBOS和pMARV)向三个单独的疫苗接种部位或用pVAX1空载体对照(n＝9)皮内免疫两次，然后在一个月后用相同的疫苗加强免疫。在第二次免疫后28天，在BSL-4设施中用1,000LD50豚鼠适应型MARV-安哥拉(gpMARV)(n＝9)或ZEBOV(gpZEBOV)(n＝15)攻击动物，然后每天观察和称重。结果示于图2A-2H中。疫苗接种动物受到完全保护，而对照疫苗接种动物在攻击后第10天死于gpMARV(n＝3；P＝0.0052)或在攻击后第7天死于gpZEBOV(n＝6；P＝0.0008)(图2A和图2E)。另外，疫苗接种动物被保护免于体重减轻(图2B和图2F；P<0.0001)。疫苗诱导的Ab可能有助于保护，因为混合血清中的GP特异性Ab在结合(图2C和图2G)和中和(图2D和图2H)效价方面显示出显著增加。实验在BSL-4设施中进行并重复两次，结果相似，图A-2H中的误差线表示SEM。通过匹配、双尾、非配对的t检验完成群组分析，并通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析存活曲线。
质粒疫苗具有高度免疫原性
为了更好地表征由保护性DNA疫苗(质粒pEBOZ、pEBOS和pMARV，也称为三价DNA疫苗)驱动的免疫相关性，接下来我们采用小鼠模型，该模型已广泛用作筛选和‘概念验证’工具用于丝状病毒疫苗开发并且其中大量的免疫检测试剂可用。首先，在两次疫苗接种的每一次后20天，评估H-2d小鼠(n＝5只/组)中的B细胞应答，疫苗接种注射40μg的相应单价DNA疫苗的间隔为3周。来自这些实验的数据示于图3A-3C中。虽然在放血前对照样品中观察到很少的GP特异性IgG，如图3A和图3B所示，但是疫苗接种后在所有动物中均检测到显著增加。由于无法获得纯化SGP，因此使用纯化ZGP作为替代物。SUDV接种小鼠中的IgG结合ZGP，证明了产生疫苗诱导Ab的能力及其跨物种识别的能力。另外，仅一次免疫后100％疫苗接种动物中就发生血清转化，之后通过同源加强免疫使应答显著增加；AVE终点稀释效价倒数在pMARV免疫小鼠中增加了22.1倍，在pEBOS和pEBOZ疫苗接种动物中分别增加3.4倍和8.6倍。接下来，在BSL-4设施中测定样品中ZEBOV、SUDV-博尼法斯和MARV-安哥拉的中和。中和测定的结果示于图3C中。疫苗接种后在所有动物中检测到NAb效价的显著增加。
来自两种不同遗传背景的小鼠(H-2d和H-2b；n＝5只/组)用40μg相应质粒pEBOZ、pEBOS和pMARV免疫，两周后同源加强，然后在8天后处死用于T细胞分析。图4A中显示了来自评估疫苗诱导的综合T细胞应答的新型改进ELISPOT测定的结果，其中使用单个肽相对于矩阵库刺激脾细胞。DNA疫苗接种诱导了稳健的IFNγ+应答，其识别多种T细胞表位(表1-6)。随后对所有包含阳性表位的肽进行设门(参见图6)，确认并通过FACS进一步表征。经证明这种改进的ELISPOT方法极其灵敏，因为来自对照孔的背景应答低(在H-2b小鼠中7.2±0.2产生IFNγ的SFC/106个脾细胞，而在H-2d小鼠中为9.2±0.5)。如图4A所示的结果揭示，接种pMARV在H-2b小鼠中诱导9个可测量的表位并且在H-2d中诱导11个，在这些相应品系中pEBOS诱导9个和8个，并且pEBOZ产生10个和12个。虽然来自pMARV免疫的H-2b小鼠的9个表位中有5个(55.6％)为CD8+，但正如通过ELISPOT和FACS确认及表型分析所测量的那样，它们占总MGP特异性IFNγ+应答的约57.3％。类似地，在pEBOS免疫的H-2b和H-2d小鼠中，分别仅有33％和38％的确认表位受CD8限制。然而，这些表位大致占总应答的50-90％；估计在两个小鼠品系中CD8+T细胞应答大约为56％，而在H-2b和H-2d小鼠中FACS估计值分别为51％和90％。在pEBOZ疫苗接种动物中总CD8+应答较低，并且测量为介于33％和57％之间(通过ELISPOT测量两个品系均为33％，并且通过FACS测量H-2b和H-2d小鼠分别为6％和57％)。
在接受pEBOS的两个小鼠品系中均检测到单一免疫显性表位，其中免疫显性表位被大致定义为产生比最高亚显性表位高至少2倍的IFNγ应答；pMARV诱导肽MGP25-39(#5)、MGP67-81(#12)、MGP181-195(#31)和MGP385-399(#65)中的4个H-2b限制性免疫显性CD8+表位，和MGP151-171(#27)中的H-2d限制性CD4+表位。这些表位中的四个存在于MARV GP1的高度保守性区域内，包括其中三个位于推定的受体结合结构域内，而只有一个存在于可变粘蛋白样区域内(MGP385-399(#65))，如图4B和图4C所示。pEBOS刺激分别存在于H-2b和H-2d小鼠的SUDVGP(SGP)19-33(#4)和SGP241-255(#41)中，均处于GP1高度保守性区域中的CD8+表位。然而，pEBOZ免疫揭示H-2d小鼠中的三个免疫显性表位(位于ZEBOV GP受体结合结构域中的一个CD8限制性表位(GP)139-153(#24)，和两个CD4限制性表位ZGP175-189(#30)和ZGP391-405(#66))，分别存在于受体结合域和粘蛋白样区域内。在含有CD4+和CD8+表位(#89)的H-2b小鼠中仅定义了一个免疫显性表位，并且存在于GP2的高度保守性区域内。总体而言，在每个疫苗组中不同的表位层次结构是一致且可重复的。此外，如图4D所示，亚显性应答占总应答的很大比例；在pMARV、pEBOS和pEBOZ免疫的H-2b小鼠中通过改进的ELISPOT测定法测得的总AVE亚显性应答分别约为12％、62％和74％，而H-2d小鼠中的应答分别为47％、50％和34％。
最后，使用最小肽库刺激通过FACS测量总GP特异性T细胞应答，所述最小肽库仅含有鉴定的包含确认表位的肽。在每只疫苗接种动物中检测到稳健应答，并且在大多数情况下，由活化CD4+和CD8+T细胞组成。应答具GP特异性，因为用对照肽(h-Clip)观察到很少的IFNγ产生，并且与ELISPOT数据密切相关。如通过FACS测量，免疫接种未诱导显著CTL的唯一情况是在接种了pMARV的H-2d小鼠中，其中确认没有经ELISPOT鉴定的表位受CD8限制。总的来说，这些数据显示每种疫苗质粒在小鼠中具有高度免疫原性，并产生稳健的GP特异性T细胞应答，识别T细胞表位多样性阵列，包括GP高度保守性区域内的免疫显性表位。此外，使用传统的矩阵阵列肽库进行表位鉴定可能会忽略本文表征的高度多样化的亚显性T细胞应答。
通过FACS测量T细胞应答对由每种相应GP的所有阳性鉴定肽所组成的最小肽库的反应性。图7A显示了来自代表性动物的DNA疫苗诱导的T细胞应答，对产生IFNγ的CD4+细胞(右)和CD8+(左)细胞设门。显示了FACS图。与h-CLIP肽孵育作为阴性对照(对照)。图7B显示图7A中的设门细胞的结果，汇总为总CD44+/IFNγ+CD4+或CD8+细胞的平均％，误差线表示SEM。重复实验至少两次，结果相似。
小鼠中的＇单剂量＇保护
接下来在临床前鼠模型中评估针对ZEBOV攻击的疫苗功效。由于NAb诱导强烈，小鼠仅接种一次并观察保护数据。小鼠(H-2k；n＝10只/组)用40μg的pEBOZ DNA免疫，并在28天后通过在BSL4设施中用1,000LD50的小鼠适应型ZEBOV(mZEBOV)攻击来评价保护作用。虽然所有对照动物在攻击后第7天都死于感染，但图5A显示接种DNA的小鼠受到完全保护(P＝0.0002)。另外，如图5B所示，对照小鼠表现出体重逐渐减轻直至死亡(P<0.0001)。
为了更好地理解‘单剂量’模型中DNA诱导保护的机制，接下来我们评估了NAb和T细胞的产生。在疫苗接种后25天，在攻击天3前评估NAb，并且如图5C所示，在所有疫苗接种动物中检测到显著(P<0.0001)增加(n＝10只/组)；终点稀释效价倒数范围为19至42，27.3±2.5。
接下来我们评估了ZGP特异性T细胞的产生，并增大了我们的分析范围以比较单独用pEBOZ或三价制剂免疫的小鼠中的应答。在11天后使用完整ZGP肽库通过FACS评估IFN-γ产生(n＝5)；数据如图5D所示。产生IFNγ的T细胞在所有动物中均检测到并且对ZGP肽具有特异性，因为用对照肽刺激未诱导细胞因子产生。使用单价或三价制剂进行免疫均可诱导强烈的IFNγT细胞应答，相比之下，无显著差异P＝0.0920)。
因为CTL在消除病毒感染细胞方面可能很重要(Warfield KL等人，(2005).Induction of humoral and CD8+T cell responses are required for protectionagainst lethal Ebola virus infection.J Immunol 175:1184-1191；Kalina WV,Warfield KL,Olinger GG,Bavari S(2009).Discovery of common marburgvirusprotective epitopes in a BALB/cmouse model.Virol J 6:132；Olinger GG等人，(2005).Protective cytotoxic T-cell responses induced by venezuelan equineencephalitis virus replicons expressing Ebola virus proteins.J Virol 79:14189-14196；Sullivan NJ等人，(2011).CD8(+)cellular immunity mediatesrAd5vaccine protection against Ebola virus infection of nonhuman primates.NatMed 17:1128-1131；和Geisbert TW等人，(2010).Vector choice determinesimmunogenicity and potency of genetic vaccines against Angola Marburg virusin nonhuman primates.J Virol 84:10386-10394)，所以测量已知与Thl型CTL免疫和细胞毒性相关的附加效应细胞因子TNF，以及发育限制因子即T-box转录因子TBX21(T-bet)的产量，结果如下。总细胞：TNF 2.9±0.8，Tbet 13.0±1.1。CD4+/CD44+/IFNγ+细胞：TNF 61.4±3.1，Tbet 72.6±2.0。CD8+/CD44+/IFNγ+细胞：TNF 33.0±3.3，Tbet 992.1±1.4(*p<0.1；***p<0.001；****p<0.0001)。我们发现，除IFNγ外，约61％和约33％的活化CD4+和CD8+T细胞还分别产生TNF。此外，大多数产生IFNγ的T细胞表达高水平的T-bet；分别约73％和92％的CD8+和CD4+T细胞是CD44+并且在ZGP肽刺激后产生IFNγ。
图8A和8B显示了通过‘单剂量’疫苗接种进行的T细胞诱导。显示了(a)通过FACS测量的H-2k小鼠中在单次pEBOZ免疫或单次三价疫苗接种(由单独部位的三种疫苗质粒组成)后的T细胞应答并汇总(b)为总CD44+/IFNγ+CD4+(紫色)或CD8+(橙色)细胞的平均％。伪彩色FACS图来自代表性动物，并且对产生IFNγ的CD4+细胞(右)和CD8+(左)细胞设门。与h-CLIP肽孵育作为阴性对照(对照)。实验进行两次，结果相似且误差线表示SEM。ns，无显著性。
讨论
我们报告了在临床前啮齿动物免疫原性和功效研究中对多价丝状病毒疫苗的开发和评价。在豚鼠中两次DNA疫苗剂量，以及在小鼠中针对mZEBOV的“单剂量”DNA疫苗后，观察到针对gpMARV和gpZEBOV攻击的完全保护。迄今为止，豚鼠的基因疫苗接种包括注射裸DNA(Sullivan NJ,Sanchez A,Rollin PE,Yang ZY,Nabel GJ(2000).Development of apreventive vaccine for Ebola virus infection in primates.Nature 408:605-609)或用基因枪递送DNA(Dowling W等人(2006).The influences of glycosylation on theantigenicity,immunogenicity,and protective efficacy of Ebola virus GP DNAvaccines.J Virol 81:1821-1837；Vanderzanden L等人(1998).DNA vaccinesexpressing either the GP or NP genes of Ebola virus protect mice from lethalchallenge.Virology 246:134-144；和Riemenschneider J等人(2003).Comparison ofindividual and combination DNA vaccines for B.anthracis,Ebola virus,Marburgvirus and Venezuelan equine encephalitis virus.Vaccine 21:4071-4080)，然而，任何一种方法都需要疫苗接种进行至少三次才能实现完全保护。本文中改进的保护可能是由于诱导了稳健的Ab，因为单次DNA疫苗接种产生的GP特异性IgG结合物效价与在基因枪施用后在受保护动物中的效价大小相当；DNA疫苗接种在单次施用后分别诱导3.85和2.18log10的ZGP和MGP特异性Ab效价，而在三次基因枪接种后分别诱导2.7和3.0。为了与豚鼠中的替代“单剂量”保护策略进行比较，Ag偶联病毒样颗粒(VLP)平台产生的抗体效价仅略高于DNA疫苗接种后观察到的效价(Swenson DL,Warfield KL,Negley DL,Schmaljohn A,Aman MJ,Bavari S(2005).Virus-like particles exhibit potential as a pan-filovirusvaccine for both Ebola and Marburg viral infections.Vaccine 23:3033-3042)。此外，重组腺病毒(rAd)方法诱导的ZGP特异性NAb效价低于单次DNA疫苗接种的那些效价(53终点稀释效价倒数相对于本文的88)(Kobinger GP等人，(2006).Chimpanzee adenovirusvaccine protects against Zaire Ebola virus.Virology 346:394-401)。接种rVSV疫苗(Jones SM等人，(2007).Assessment of a vesicular stomatitis virus-based vaccineby use of the mouse model of Ebola virus hemorrhagic fever.J Infect Dis 196增刊2:S404-412)产生了与当前平台类似的ZGP特异性抗体效价。总的来说，这些数据证明DNA疫苗接种能够诱导与非复制型病毒平台相当的结合和中和Ab，并且这些数据可能部分有助于解释本文中强大的豚鼠存活数据。
通过保护性DNA疫苗接种产生NAb可能受益于转基因表达的成熟GP结构。体外转染研究证实，疫苗编码的GP高度表达，经翻译后切割(图1B)，转运到细胞表面，并在空间上阻断细胞表面分子的免疫检测(图1C)。因此，本文形成的疫苗免疫原很可能成熟为异三聚体刺突，其在感染期间在病毒粒子组装后将具有功能性。这对于病毒学相关的中和决定簇的产生和展示可能很重要，中和决定簇随后对于诱导依赖构象的Nab来说至关重要(DowlingW等人，(2007).Influences of glycosylation on antigenicity,immunogenicity,andprotective efficacy of ebola virus GP DNA vaccines.J Virol 81:1821-1837；Shedlock DJ,Bailey MA,Popernack PM,Cunningham JM,Burton DR,Sullivan NJ(2010).Antibody-mediated neutralization of Ebola virus can occur by two distinctmechanisms.Virology 401:228-235)。因此，就这一点而言，在产生NAb的能力方面天然锚定结构的表达可能优于可溶性衍生物(Sullivan NJ等人，(2006).Immune protection ofnonhuman primates against Ebola virus with single low-dose adenovirus vectorsencoding modified GPs.PLoS Med 3:el77；Xu L等人，(1998).Immunization for Ebolavirus infection.Nat Med 4:37-42)。
为了更好地表征由保护性疫苗驱动的T细胞应答，我们在小鼠中进行了免疫原性和功效研究，并通过DNA疫苗接种确定了针对mZEBOV的‘单剂量’完全保护(图5A-5D)。到目前为止，在这个模型中赋予完全保护的最有效的平台是VLP，有(Warfield KL等人，(2005).Induction of humoral and CD8+T cell responses are required for protectionagainst lethal Ebola virus infection.J Immunol 175:1184-1191；Warfield KL,Swenson DL,Olinger GG,Kalina WV,Aman MJ,Bavari S(2007).Ebola virus-likeparticle-based vaccine protects nonhuman primates against lethal Ebola viruschallenge.J Infect Dis 196增刊2:S430-437)或无(Sun Y等人，(2009).Protectionagainst lethal challenge by Ebola virus-like particles produced in insectcells.Virology383:12-21)佐剂，rAd疫苗接种((Kobinger GP等人，(2006)SUPRA；Choi JH等人，(2012).A single sublingual dose of an adenovirus-based vaccine protectsagainst lethal Ebola challenge in mice and guinea pigs.Mol Pharm 9:156-167；Richardson JS等人(2009).Enhanced protection against Ebola virus mediated byan improved adenovirus-based vaccine.PLoS One4:e5308)，或rRABV疫苗接种(BlaneyJE等人，(2011).Inactivated or live-attenuated bivalent vaccines that conferprotection against rabies and Ebola viruses.J Virol 85:10605-10616)。然而，T细胞应答的表征在这些研究中受到严重限制，并限于用两种(Warfield KL,(2007),SUPRA)或一种(Warfield KL等人(2005)SUPRA)肽进行脾细胞刺激，所述肽先前描述为含有ZGP T细胞表位(Warfield KL等人，(2005)SUPRA.Olinger GG等人，(2005)SUPRA；Kobinger GP等人(2006),SUPRA；Sun Y等人，(2009).Choi,JH等人，(2012)。在本文中，我们报道了如通过新型改进T细胞测定法广泛分析的那样，通过保护性疫苗接种诱导稳健且广泛的CTL(图4A和表1-6)。总共鉴定了52个新型T细胞表位，包括主要存在于GP高度保守性区域中的许多免疫显性表位。在鉴定的总共22个ZGP表位中，仅4个是先前报道的。而且，20个MGP中仅一个(Kalina WV,Warfield KL,Olinger GG,Bavari S(2009).Discovery of commonmarburgvirus protective epitopes in a BALB/c mouse model.Virol J 6:132)和16个SGP表位中的一个是先前描述的。因此，这是迄今为止最全面的临床前GP表位报告，描述了来自两种不同小鼠遗传背景的多种丝状病毒的GP表位。
由这些分析得到的另一个新发现是对疫苗诱导的亚显性T细胞应答的评估，我们证实亚显性T细胞应答占总T细胞应答的很大百分比，广泛范围在12％-74％之间(图4D)。这可能特别重要，因为亚显性应答可以显著促进保护。因此，可以证明确定亚显性和免疫显性表位T细胞应答对保护作用的具体贡献未来是有益的。值得注意的是，使用传统的矩阵阵列肽库进行表位鉴定可能忽略了这些应答。因此，先前研究中有限的表位检测可能与疫苗诱导的较低水平免疫，使用较不灵敏的标准测定法，和/或使用肽排列和/或有利于检测免疫显性CD8+表位的算法直接相关。
虽然针对丝状病毒的保护作用的免疫相关性仍然存在争议，但由这种高免疫原性方法生成的数据提供了研究保护性疫苗所驱动的T细胞免疫的独特机会。本文的DNA疫苗接种诱导了强ZGP特异性T细胞，其大部分特征在于表达高水平T-bet的Thl型多功能CTL，也证实与人的T细胞毒性相关。很明显，能够产生主要体液免疫应答和偏向CD4+T细胞的细胞免疫的先前独立DNA疫苗平台，可能受益于体内EP递送，最近已经证明体内EP递送会在NHP和临床中诱导有效的CD8+T细胞。因此，作为NHP免疫原性和功效研究中的独立或初免-加强形式，本文的数据与该方法一致。这种方法提供了一种有吸引力的疫苗接种策略，其可以快速且低成本地改进和/或产生，以便在丝状病毒生物威胁情况和爆发期间快速应答。另外，该模型方法提供了研究针对丝状病毒疾病的保护性免疫相关性的重要工具，并且可以应用于现有平台以指导未来的策略。
实施例2
提供了一种含有三种质粒的三价疫苗。第一质粒包含编码基于ZEBOV CON，SEQ IDNO:1，经修饰为在扎伊尔埃博拉病毒共有免疫原的N末端包含IgE信号肽的扎伊尔埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第二质粒包含编码基于SUDV CON，SEQ ID NO:2，经修饰为在苏丹埃博拉病毒共有免疫原的N末端包含IgE信号肽的苏丹埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第三质粒包含编码基于MARV ANG，SEQ ID NO:3，经修饰为在马尔堡马尔堡病毒安哥拉免疫原的N末端包含IgE信号肽的马尔堡马尔堡病毒安哥拉(MARV)免疫原的核酸序列。
实施例3
提供了一种五质粒疫苗。第一质粒包含编码为ZEBOV CON，SEQ ID NO:1的扎伊尔埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第二质粒包含编码为SUDV CON，SEQ ID NO:2的苏丹埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第三质粒包含编码SEQ ID NO:4，即使用马尔堡马尔堡病毒Ravn、杜尔巴(09DRC99)和乌干达(02Uga07Y)的马尔堡马尔堡病毒-Ravn集群共有序列(MARV-RAV CON)的核酸序列。第四质粒包含编码SEQ ID NO:5，即使用Ozolin、乌干达(01Uga07)和杜尔巴(05和07DRC99)的马尔堡马尔堡病毒-Ozolin集群共有序列(MARV-OZOCON)的核酸序列。第五质粒包含编码SEQ ID NO:6，即使用(Musoke、Popp和莱顿)的马尔堡马尔堡病毒-Musoke集群共有序列(MARV-MUS CON)的核酸序列。
实施例4
提供了一种五质粒疫苗。第一质粒包含编码基于ZEBOV CON，SEQ ID NO:1，经修饰为在扎伊尔埃博拉病毒共有免疫原的N末端包含IgE信号肽的扎伊尔埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第二质粒包含编码基于SUDV CON，SEQ ID NO:2，经修饰为在苏丹埃博拉病毒共有免疫原的N末端包含IgE信号肽的苏丹埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第三质粒包含编码基于SEQ ID NO:4，即使用马尔堡马尔堡病毒Ravn杜尔巴(09DRC99)和乌干达(02Uga07Y)的马尔堡马尔堡病毒-Ravn集群共有序列(MARV-RAV CON)并修饰为在共有马尔堡马尔堡病毒-Rav免疫原的N末端包括IgE信号肽的马尔堡马尔堡病毒Rav共有序列的核酸序列。第四质粒包含编码基于SEQ IDNO:5，即使用Ozolin、乌干达(01Uga07)和杜尔巴(05和07DRC99)的马尔堡马尔堡病毒-Ozolin集群共有序列(MARV-OZO CON)并修饰为在共有马尔堡马尔堡病毒-Ozo免疫原的N末端包括IgE信号肽的马尔堡马尔堡病毒Ozo共有序列的核酸序列。第五质粒包含编码基于SEQ ID NO:6，即使用(Musoke、Popp和莱顿)的马尔堡马尔堡病毒-Musoke集群共有序列(MARV-MUS CON)并修饰为在共有马尔堡马尔堡病毒-Mus免疫原的N末端包括IgE信号肽的马尔堡马尔堡病毒Mus共有序列的核酸序列。
实施例5
提供了一种六质粒疫苗。第一质粒包含编码为ZEBOV CON，SEQ ID NO:1的扎伊尔埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第二质粒包含编码为SUDV CON，SEQ ID NO:2的苏丹埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第三质粒包含编码SEQ ID NO:4，即使用马尔堡马尔堡病毒Ravn、杜尔巴(09DRC99)和乌干达(02Uga07Y)的马尔堡马尔堡病毒-Ravn集群共有序列(MARV-RAV CON)的核酸序列。第四质粒包含编码SEQ ID NO:5，即使用Ozolin、乌干达(01Uga07)和杜尔巴(05和07DRC99)的马尔堡马尔堡病毒-Ozolin集群共有序列(MARV-OZOCON)的核酸序列。第五质粒包含编码SEQ ID NO:6，即使用(Musoke、Popp和莱顿)的马尔堡马尔堡病毒-Musoke集群共有序列(MARV-MUS CON)的核酸序列。第六质粒包含编码SEQ IDNO:3，即马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005分离株糖蛋白免疫原的核酸序列。
实施例6
提供了一种五质粒疫苗。第一质粒包含编码基于ZEBOV CON，SEQ ID NO:1，经修饰为在扎伊尔埃博拉病毒共有免疫原的N末端包含IgE信号肽的扎伊尔埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第二质粒包含编码基于SUDV CON，SEQ ID NO:2，经修饰为在苏丹埃博拉病毒共有免疫原的N末端包含IgE信号肽的苏丹埃博拉病毒共有免疫原的核酸序列。第三质粒包含编码基于SEQ ID NO:4，即使用马尔堡马尔堡病毒Ravn杜尔巴(09DRC99)和乌干达(02Uga07Y)的马尔堡马尔堡病毒-Ravn集群共有序列(MARV-RAV CON)并修饰为在共有马尔堡马尔堡病毒-Rav免疫原的N末端包括IgE信号肽的马尔堡马尔堡病毒Rav共有序列的核酸序列。第四质粒包含编码基于SEQ ID NO:5，即使用Ozolin、乌干达(01Uga07)和杜尔巴(05和07DRC99)的马尔堡马尔堡病毒-Ozolin集群共有序列(MARV-OZO CON)并修饰为在共有马尔堡马尔堡病毒-Ozo免疫原的N末端包括IgE信号肽的马尔堡马尔堡病毒Ozo共有序列的核酸序列。第五质粒包含编码基于SEQ ID NO:6，即使用(Musoke、Popp和莱顿)的马尔堡马尔堡病毒-Musoke集群共有序列(MARV-MUS CON)并修饰为在共有马尔堡马尔堡病毒-Mus免疫原的N末端包括IgE信号肽的马尔堡马尔堡病毒Mus共有序列的核酸序列。第六质粒包含编码基于MARV ANG，SEQ ID NO:3，经修饰为在马尔堡马尔堡病毒安哥拉免疫原的N末端包含IgE信号肽的马尔堡马尔堡病毒安哥拉2005分离株糖蛋白免疫原的核酸序列。
实施例7
本文描述了表达3种合成扎伊尔埃博拉病毒(EBOV)糖蛋白(GP)的DNA疫苗制剂：2个是基于GP序列比对(1976-2014)设计的而第3构建体与2014年爆发毒株匹配。还包括质粒IL-12(pIL-12)作为佐剂以进一步增强细胞免疫应答。在DNA-DNA初免-加强免疫方案后，在食蟹猴中施用多价GP DNA疫苗制剂。食蟹猴(n＝3或4只/组)通过肌内递送然后电穿孔接受多价GP DNA制剂+pIL-12。测定免疫原性的差异，并监测不同剂量、方案(注射2、3、4和5次)和后续剂量不同间隔时间之间的保护作用。在第一次注射后2周，在83％的动物中观察到抗体和T细胞应答，并且在第二次注射后在100％的动物中观察到抗体和T细胞应答。用致死剂量的EBOV几内亚-Makona爆发毒株(1000pfu，7-U病毒)攻击食蟹猴并在感染后监测28天。以4周间隔接受至少3次注射的动物100％在致死攻击中存活。动物受到完全保护免于病征，并且没有表现出升高的血液化学性质。有趣的是，50％接受2次注射的动物在致死性攻击中存活。存活的动物表现出最小的病征，表明通过进一步优化，可以实现经2次注射的完全保护。在小鼠的其他优化研究中，发现单次注射具100％保护性，并且诱导疫苗接种后8个月的长期免疫应答。
方法
开发EBOV GP DNA疫苗制剂
目前处于临床试验中的疫苗包括rVSVΔG/ZEBOVGP、ChAd3初免+MVA加强免疫和MVA泛-丝状病毒。虽然这些疫苗在非人灵长类动物(NHP)中具有免疫原性、保护性，并提供单剂量保护，但它们会产生抗载体免疫，记忆应答持续时间不确定，在人体临床试验中产生不良反应，可能并不适合所有群体。因此，具有更清洁的安全性，可以诱导针对异源扎伊尔埃博拉病毒的强烈免疫应答的另外平台将是非常有益的(图9)。
设计了三种EBOV DNA构建体：ZEBOV(1976-1996)(ConEBOVGP#1)的共有序列、ZEBOV(2002-2008)(ConEBOVGP#2)，以及来自2014年几内亚爆发的匹配ZEBOV序列。(几内亚-GP)。开发了五种疫苗，仅包含单一DNA构建体的单价疫苗、包含ConEBOVGP#1与几内亚GP的二价疫苗制剂和包含ConEBOVGP#1、ConEBOVGP#2和几内亚GP全部三种的三价制剂(图10)。
结果
DNA疫苗的单次免疫在小鼠中具有免疫原性
BALB/c小鼠接受单次肌内(IM)免疫，然后进行疫苗制剂的电穿孔(EP)。在第28天，测定总IgG抗体效价和ELISPOT-IFNγ。每种疫苗制剂产生稳健的IgG应答。分泌IFNγ、IL2和TNFα的多功能CD4+和CD8+T细胞对于所有疫苗和制剂是相似的。(图11)。
单次免疫在小鼠中针对致死的小鼠适应型埃博拉病毒攻击具有完全保护性
对用二价或三价疫苗制剂免疫的BALB/c小鼠用1000LD50的异源埃博拉病毒进行致死攻击。攻击毒株是小鼠适应型马英嘉埃博拉病毒1976。接种对照质粒pVax1的小鼠很快体重减轻并且没有存活过第7天。然而，接种二价疫苗制剂的小鼠和接种三价疫苗制剂的小鼠都保持其体重并且到第20天没有小鼠死亡(图12)。
单个GP DNA疫苗构建体在小鼠中诱导稳健的记忆应答。
BALB/c小鼠接受3次肌内40μg单价疫苗免疫，然后在第0、28和84天进行电穿孔。测量IgG抗体效价、INFγ、CD4+CD44+记忆T细胞和CD8+CD44+记忆T细胞。最后一次注射后数月可检测到稳健的免疫应答(图13)。
GP DNA疫苗制剂在NHP中具有免疫原性
食蟹猴用作NHP，因为它们是埃博拉疫苗功效和致死性攻击的模型。经肌内注射向食蟹猴施用含Rhesus pIL12佐剂的二价制剂或含Rhesus pIL12佐剂的三价制剂，然后进行EP。为了了解免疫原性的不同注射方案。第1组接受2次二价制剂肌内-EP注射，间隔为4周。第2组接受2次三价制剂肌内-EP注射，间隔为4周。第3组接受3次三价制剂肌内-EP注射。每月取用于免疫原性研究的样品，并在最后一个剂量后再进行一个月。(图6)。每种DNA疫苗制剂均诱导稳健的抗埃博拉病毒GP抗体应答(GMT>103)和抗GP T细胞应答。免疫应答在每次注射后加强(图14)。
GP DNA制剂疫苗防御致死性扎伊尔埃博拉病毒(Makona)攻击
来自第1、2和3组的食蟹猴在最终DNA免疫后28天用1000TCID50几内亚-Makona2014C07病毒(7-U参考毒株)剂量进行攻击。攻击后监测动物28天。虽然没有对照动物在攻击后存活过第10天，但4/4组中3只动物在攻击后存活28天，4/8组中2只动物在攻击后存活28天，且3/4组中1只动物在攻击后存活28天(图15)。存活动物没有任何显著病征。它们还维持正常的CBC和酶水平。通过肌内注射-EP递送的二价和三价DNA疫苗引发长期抗体和T细胞应答，这在最终DNA注射后>3个月可被检测到(图43)。
三个剂量的三价EBOV GP DNA疫苗对100％致死性EBOV攻击具有100％保护性。两个剂量的二价EBOV GP DNA疫苗提供75％保护作用。总体而言，该数据支持进一步研究通过肌内注射-EP递送的DNA疫苗用于对抗埃博拉病毒和其他感染性病原体的可能施用。
EBOV-001I期临床
对INO-4212(有或无INO-9012进行开放标签研究。在健康志愿者中经肌内或皮内施用INO-4212，然后进行电穿孔。监测安全性和免疫学评估。比较皮内递送和肌内递送。总共有69名受试者。在免疫前(基线)和第2、6和14周进行ELISA分析。血清阳性定义为对扎伊尔埃博拉糖蛋白的IgG抗体应答为阳性。
INO-4201是一种用扎伊尔埃博拉病毒(ConEBOVGP#1)的共有包膜糖蛋白配制的DNA疫苗，所述包膜糖蛋白使用1976、1994、1995、1996、2003、2005、2007和2008爆发毒株的包膜糖蛋白序列，由人CMV启动子(hCMV启动子)驱动而产生，具有牛生长激素3'末端多聚腺苷酸化信号序列(bGH polyA)。通过将扎伊尔埃博拉病毒的合成共有包膜糖蛋白基因克隆到pGX0001中的BamHI和XhoI位点来制备pGX4201。
通过使用1976、1994、1995、1996、2003、2005、2007和2008爆发毒株的包膜糖蛋白序列产生扎伊尔埃博拉病毒的共有包膜糖蛋白序列来构建ConEBOVGP#1(ConGP1)序列。简言之，首先基于1976、1994、1995、1996、2003和2005爆发毒株的六个包膜序列产生共有GP序列。然后，使在377、430和440位置的三个非共有残基偏重于2003、2005、2007和2008毒株，因为它们是已公开序列数据的最近和最致命的爆发。所选爆发毒株GP序列的GenBank登录号是：Q05320、P87671、AAC57989、AEK25495、ABW34743、P87666、AER59718、AER59712、ABW34742、AAL25818。一旦获得共有GP1序列，就将上游Kozak序列添加到N末端。此外，为了具有更高水平的表达，使该基因的密码子使用适应于智人基因的密码子偏倚。另外，还进行了RNA优化：避开了GC含量极高(>80％)或极低(<30％)的区域和顺式作用序列基序诸如内部TATA盒、chi位点和核糖体进入位点。用BamHI和XhoI消化合成的ConGP1，并克隆到表达载体中。
INO-4202是一种用DNA质粒配制的DNA疫苗，所述DNA质粒受人CMV启动子(hCMV启动子)驱动，表达从2014年几内亚爆发中分离出的扎伊尔埃博拉病毒的包膜糖蛋白(几内亚GP)，具有牛生长激素3'末端多聚腺苷酸化信号(bGH polyA)。
INO-4212是INO-4201和INO-4202的二价疫苗。
图17描绘了每个群组的疫苗制剂计划、途径和剂量。在第一次注射后，15％或更少的患者是呈血清阳性。在第二次注射后，50-100％的患者呈血清阳性。在第三次注射后，79-100％的患者呈血清阳性(图18)。具有中度IFNγELISpot或高IFNγELISpot的两个代表性患者显示出特异性T细胞应答(图19)。
虽然其他埃博拉疫苗平台，包括NIAID VRC/GSK和rVSV/ZEBOVGP，目前正处于临床试验中，但本文所述的本发明的二价和三价疫苗具有在其他疫苗平台中未观察到的优点。例如，二价或三价疫苗可以经肌内或皮内施用，而其他疫苗平台仅经肌内施用。重要的是，NIAID VRC/GSK和rVSV/ZEBOVGP显示出副作用，包括发烧、疲劳、关节痛和淋巴细胞减少，而二价和三价疫苗未显示出任何副作用。然而，应该注意的是，rVSV/ZEBOVGP和ChAd3/MVAGP的一些副作用与埃博拉的症状相一致。此外，二价和三价疫苗产生的抗体效价比rVSV/ZEBOVGP和ChAd3/MVAGP大一至两个数量级(图20)。
指定受试者(n＝15)接受2mg DNA/剂的INO-4201，作为两次单独的1mg(0.1mL)ID(Mantoux)注射给予，然后用装置进行EP。受试者在0、4周和12周(0-4-12周计划)接受3剂量系列免疫接种。使用结合ELISA从疫苗接种受试者的血清测量对EBOV糖蛋白(GP)有特异性的抗体。在每次免疫两周后显示高于第0天的终点效价倒数(图22)。在2次免疫后，100％接种INO-4201的受试者发生血清转化(图22，群组3和图24)。
实施例8
本文描述了实施例7中描述的三种EBOV DNA构建体的免疫应答数据：ZEBOV(1976-1996)(ConEBOVGP#1或INO-4201)的共有序列、ZEBOV(2002-2008)(ConEBOVGP#2)，以及来自2014年几内亚爆发的匹配ZEBOV序列。(几内亚-GP)。开发了五种疫苗：仅包含单一DNA构建体的单价疫苗、包含ConEBOVGP#1与几内亚GP的二价疫苗制剂和包含ConEBOVGP#1、ConEBOVGP#2和几内亚GP全部三种的三价制剂。来自群组1-5的69名受试者被包括在通过ELISA进行的免疫应答分析中，并且来自群组1-5的75名受试者被包括在通过ELISpot进行的免疫应答分析中(图21、25)。
根据群组和时间点的ELISA效价
在第2、6和14周测定每个群组的抗EBOVR效价。到第6周，每个群组看到抗体效价增加高于第0天(图22-23)。每个群组中第一剂量几乎没有反应性。剂量2开始驱动血清转化，群组3和5看到最大频率。在4/5群组中剂量3驱动>90％血清转化。群组3和5在该时间点显示100％血清转化(图24)
根据肽库的受试者应答
根据肽库分析群组应答(图26-33)。为了分析ELISpot离群值，使用每个库第0天值和总EBOV应答创建离群值阈值(第0天平均值+(第0天值的3x标准偏差))。该阈值应涵盖99％的正态分布群体。去除显示基线值大于离群阈值的任何受试者，并与剩余受试者一起生成应答者标准。
ICS分析
分析中包括来自所有群组的47名受试者，但是群组5的代表性不足(图35)。在基线和第14周进行ICS分析。使用由库1-4组成的单个EBOV肽库进行刺激。以来自CD4和CD8区室的IFNg或TNFα产生形式的T细胞活性的分析表明CD4和CD8区室中TNFα显著升高以及仅群组3中TNFα和/或IFNg升高(Wilcoxon匹配配对分析，双尾)
免疫学总结
在2个剂量后，100％的群组3(皮内)患者发生血清转化。92％的群组5(IM+IL12)患者在2个剂量后发生血清转化，在3个剂量后100％发生血清转化。其他群组在2个剂量后最多显示67％，并且在3个剂量后范围高达93％。
在分析所有患者时：最佳应答频率为群组2和群组4分别为53％和57％。群组3显示40％的应答者。在群组5组中添加IL-12似乎不影响应答率(47％)。当分析去除了8个离群值的患者时，应答频率为群组2和群组4分别为84.6％和76.9％。群组3显示64.3％的应答者。在群组5组中添加IL-12似乎不影响应答率(53.3％)。
群组3中CD4和CD8 T细胞均显示TNFα和TNFα和/或IFNg的高表达(对基线具有统计学显著性，Wilcoxon匹配配对检验，双尾)。
在没有记录到3级或4级SAE的健康志愿者中，用INO-4201免疫耐受良好。INO-4201诱导稳健的埃博拉GP特异性抗体(GMT46,968)，并且仅在两个剂量的INO-4201后通过结合ELISA测量，产生100％血清转化。正如通过干扰素γ(IFNγ)ELISpot(295.3SFU/106PBMC)评估的那样，施用INO-4201产生EBOV GP特异性T细胞应答，并且CD8+T和CD4+T细胞区室中IFNγ或TNFα的产生显著增加。正如通过体液和细胞EBOV GP特异性免疫测定所评估的那样，使用Cellectra装置皮内施用INO-4201具有良好的耐受性和免疫原性。这些结果表明，INO-4201是用于进一步临床开发预防性埃博拉疫苗的有力候选物。
实施例9-通过肌内电穿孔递送的扎伊尔埃博拉病毒(EBOV)GP DNA疫苗施用后食蟹猴中的持久体液和细胞免疫应答
本文提出了新型埃博拉病毒疾病(EVD)DNA疫苗，其具有清洁安全性并且是血清学独立的，允许可能重复施用载体。设计了三种新型合成扎伊尔埃博拉病毒(EBOV)GP DNA疫苗，并开发了二价或三价制剂。两种EBOV-GP DNA疫苗都对食蟹猴中的致死性EBOV MakonaC07攻击具有高度保护性(75-100％)。跟踪使用不同方案的动物(n＝4-5只/组)以监测DNA免疫后的长期免疫原性。所有NHP迅速发生血清转化。NHP具有持久的总IgG抗体效价和对EBOV GP抗原的T细胞应答，包括表达IFNγ、IL2和TNFα的多功能CD4和CD8 T细胞以及记忆亚群中的应答(图47-59)。总的来说，数据强有力地支持EBOV-GP DNA疫苗递送用于保护和产生稳健的记忆免疫应答。
EBOV-GP Dan疫苗引发长期免疫应答，并在1年加强免疫后具有强烈的回忆应答(图49-50)。在接受单次肌内注射的组中，回忆应答非常高(图50)。
实施例10
本文提供了肽序列和肽的核酸序列。
表1
质粒疫苗pMARV
GP序列MARV ANG
通过IFNγELISPOT(≥10SFC/106个脾细胞和≥80％应答率)鉴定“含有表位的肽，然后通过FACS确认(获得≥3-5x104个CD3+细胞)。通过FACS进一步表征各自的应答(CD3+/CD44+/IFNγ+细胞对CD4和/或CD8的表达)。预测的CD8+表位标有下划线(IEDB的最佳共有％等级)，并且参考先前描述的表位。展示免疫显性表位(*)。
表2
质粒疫苗pEBOS
GP序列SUDV CON
通过IFNγELISPOT(≥10SFC/106个脾细胞和≥80％应答率)鉴定“含有表位的肽，然后通过FACS确认(获得≥3-5x104个CD3+细胞)。通过FACS进一步表征各自的应答(CD3+/CD44+/IFNγ+细胞对CD4和/或CD8的表达)。预测的CD8+表位标有下划线(IEDB的最佳共有％等级)，并且参考先前描述的表位。展示免疫显性表位(*)。
表3
质粒疫苗pEBOZ
GP序列ZEBOV CON
通过IFNγELISPOT(≥10SFC/106个脾细胞和≥80％应答率)鉴定“含有表位的肽，然后通过FACS确认(获得≥3-5x104个CD3+细胞)。通过FACS进一步表征各自的应答(CD3+/CD44+/IFNγ+细胞对CD4和/或CD8的表达)。预测的CD8+表位标有下划线(IEDB的最佳共有％等级)，并且参考先前描述的表位。展示免疫显性表位(*)。
表4
质粒疫苗pMARV
GP序列MARV ANG
通过IFNγELISPOT(≥10SFC/106个脾细胞和≥80％应答率)鉴定“含有表位的肽，然后通过FACS确认(获得≥3-5x104个CD3+细胞)。通过FACS进一步表征各自的应答(CD3+/CD44+/IFNγ+细胞对CD4和/或CD8的表达)。预测的CD8+表位标有下划线(IEDB的最佳共有％等级)，并且参考先前描述的表位。展示免疫显性表位(*)。
表5
质粒疫苗pEBOS
GP序列SUDV CON
通过IFNγELISPOT(≥10SFC/106个脾细胞和≥80％应答率)鉴定“含有表位的肽，然后通过FACS确认(获得≥3-5x104个CD3+细胞)。通过FACS进一步表征各自的应答(CD3+/CD44+/IFNγ+细胞对CD4和/或CD8的表达)。预测的CD8+表位标有下划线(IEDB的最佳共有％等级)，并且参考先前描述的表位。展示免疫显性表位(*)。
表6
质粒疫苗pEBOZ
GP序列ZEBOV CON
/>
通过IFNγELISPOT(≥10SFC/106个脾细胞和≥80％应答率)鉴定“含有表位的肽，然后通过FACS确认(获得≥3-5x104个CD3+细胞)。通过FACS进一步表征各自的应答(CD3+/CD44+/IFNγ+细胞对CD4和/或CD8的表达)。预测的CD8+表位标有下划线(IEDB的最佳共有％等级)，并且参考先前描述的表位。展示免疫显性表位(*)。
序列表
<110> 大卫·B·韦纳(Weiner, David B.)
阿米·帕特尔(Patel, Ami)
严健(Yan, Jian)
<120> 丝状病毒共有抗原、核酸构建体和由其制成的疫苗及其使用方法
<130> 206108-0059-00-WO.606355
<150> 62/332,372
<151> 2016-05-05
<150> 62/402,519
<151> 2016-09-30
<150> 62/483,979
<151> 2017-04-11
<160> 72
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成共有扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白，pGX4201
<400> 1
Met Gly Val Thr Gly Ile Leu Gln Leu Pro Arg Asp Arg Phe Lys Arg
1 5 10 15
Thr Ser Phe Phe Leu Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val Ser Asp Val
35 40 45
Asp Lys Leu Val Cys Arg Asp Lys Leu Ser Ser Thr Asn Gln Leu Arg
50 55 60
Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Asn Gly Val Ala Thr Asp Val Pro
65 70 75 80
Ser Ala Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val
85 90 95
Val Asn Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Ala Ala Pro Asp Gly
115 120 125
Ile Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Val Ser Gly Thr
130 135 140
Gly Pro Cys Ala Gly Asp Phe Ala Phe His Lys Glu Gly Ala Phe Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Thr Thr Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Val Val Ala Phe Leu Ile Leu Pro Gln Ala Lys Lys Asp
180 185 190
Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu Pro Val Asn Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Pro Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Tyr Gln Ala Thr Gly
210 215 220
Phe Gly Thr Asn Glu Thr Glu Tyr Leu Phe Glu Val Asp Asn Leu Thr
225 230 235 240
Tyr Val Gln Leu Glu Ser Arg Phe Thr Pro Gln Phe Leu Leu Gln Leu
245 250 255
Asn Glu Thr Ile Tyr Thr Ser Gly Lys Arg Ser Asn Thr Thr Gly Lys
260 265 270
Leu Ile Trp Lys Val Asn Pro Glu Ile Asp Thr Thr Ile Gly Glu Trp
275 280 285
Ala Phe Trp Glu Thr Lys Lys Asn Leu Thr Arg Lys Ile Arg Ser Glu
290 295 300
Glu Leu Ser Phe Thr Ala Val Ser Asn Arg Ala Lys Asn Ile Ser Gly
305 310 315 320
Gln Ser Pro Ala Arg Thr Ser Ser Asp Pro Gly Thr Asn Thr Thr Thr
325 330 335
Glu Asp His Lys Ile Met Ala Ser Glu Asn Ser Ser Ala Met Val Gln
340 345 350
Val His Ser Gln Gly Arg Glu Ala Ala Val Ser His Leu Thr Thr Leu
355 360 365
Ala Thr Ile Ser Thr Ser Pro Gln Ser Pro Thr Thr Lys Pro Gly Pro
370 375 380
Asp Asn Ser Thr His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu
385 390 395 400
Ala Thr Gln Val Glu Gln His His Arg Arg Thr Asp Asn Asp Ser Thr
405 410 415
Ala Ser Asp Thr Pro Pro Ala Thr Thr Ala Ala Gly Pro Pro Lys Ala
420 425 430
Glu Asn Thr Asn Thr Ser Lys Ser Thr Asp Leu Leu Asp Pro Ala Thr
435 440 445
Thr Thr Ser Pro Gln Asn His Ser Glu Thr Ala Gly Asn Asn Asn Thr
450 455 460
His His Gln Asp Thr Gly Glu Glu Ser Ala Ser Ser Gly Lys Leu Gly
465 470 475 480
Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Gly Leu Ile Thr Gly Gly
485 490 495
Arg Arg Thr Arg Arg Glu Ala Ile Val Asn Ala Gln Pro Lys Cys Asn
500 505 510
Pro Asn Leu His Tyr Trp Thr Thr Gln Asp Glu Gly Ala Ala Ile Gly
515 520 525
Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala Glu Gly Ile Tyr Thr
530 535 540
Glu Gly Leu Met His Asn Gln Asp Gly Leu Ile Cys Gly Leu Arg Gln
545 550 555 560
Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr
565 570 575
Thr Glu Leu Arg Thr Phe Ser Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe
580 585 590
Leu Leu Gln Arg Trp Gly Gly Thr Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys
595 600 605
Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asp
610 615 620
Gln Ile Ile His Asp Phe Val Asp Lys Thr Leu Pro Asp Gln Gly Asp
625 630 635 640
Asn Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile
645 650 655
Gly Val Thr Gly Val Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Phe Cys Ile Cys
660 665 670
Lys Phe Val Phe
675
<210> 2
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成共有苏丹埃博拉病毒糖蛋白
<400> 2
Met Glu Gly Leu Ser Leu Leu Gln Leu Pro Arg Asp Lys Phe Arg Lys
1 5 10 15
Ser Ser Phe Phe Val Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Lys Ala Phe Ser
20 25 30
Met Pro Leu Gly Val Val Thr Asn Ser Thr Leu Glu Val Thr Glu Ile
35 40 45
Asp Gln Leu Val Cys Lys Asp His Leu Ala Ser Thr Asp Gln Leu Lys
50 55 60
Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Ser Gly Val Ser Thr Asp Ile Pro
65 70 75 80
Ser Ala Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val
85 90 95
Val Ser Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Pro Pro Pro Asp Gly
115 120 125
Val Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Ala Gln Gly Thr
130 135 140
Gly Pro Cys Pro Gly Asp Tyr Ala Phe His Lys Asp Gly Ala Phe Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Val Asn Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Val Ile Ala Phe Leu Ile Leu Ala Lys Pro Lys Glu Thr
180 185 190
Phe Leu Gln Ser Pro Pro Ile Arg Glu Ala Val Asn Tyr Thr Glu Asn
195 200 205
Thr Ser Ser Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Leu Glu Tyr Glu Ile Glu Asn
210 215 220
Phe Gly Ala Gln His Ser Thr Thr Leu Phe Lys Ile Asn Asn Asn Thr
225 230 235 240
Phe Val Leu Leu Asp Arg Pro His Thr Pro Gln Phe Leu Phe Gln Leu
245 250 255
Asn Asp Thr Ile His Leu His Gln Gln Leu Ser Asn Thr Thr Gly Lys
260 265 270
Leu Ile Trp Thr Leu Asp Ala Asn Ile Asn Ala Asp Ile Gly Glu Trp
275 280 285
Ala Phe Trp Glu Asn Lys Lys Asn Leu Ser Glu Gln Leu Arg Gly Glu
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Glu Leu Ser Phe Glu Thr Leu Ser Leu Asn Glu Thr Glu Asp Asp Asp
305 310 315 320
Ala Thr Ser Ser Arg Thr Thr Lys Gly Arg Ile Ser Asp Arg Ala Thr
325 330 335
Arg Lys Tyr Ser Asp Leu Val Pro Lys Asp Ser Pro Gly Met Val Ser
340 345 350
Leu His Val Pro Glu Gly Glu Thr Thr Leu Pro Ser Gln Asn Ser Thr
355 360 365
Glu Gly Arg Arg Val Asp Val Asn Thr Gln Glu Thr Ile Thr Glu Thr
370 375 380
Thr Ala Thr Ile Ile Gly Thr Asn Gly Asn Asn Met Gln Ile Ser Thr
385 390 395 400
Ile Gly Thr Gly Leu Ser Ser Ser Gln Ile Leu Ser Ser Ser Pro Thr
405 410 415
Met Ala Pro Ser Pro Glu Thr Gln Thr Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Lys
420 425 430
Leu Pro Val Met Thr Thr Glu Glu Pro Thr Thr Pro Pro Arg Asn Ser
435 440 445
Pro Gly Ser Thr Thr Glu Ala Pro Thr Leu Thr Thr Pro Glu Asn Ile
450 455 460
Thr Thr Ala Val Lys Thr Val Leu Pro Gln Glu Ser Thr Ser Asn Gly
465 470 475 480
Leu Ile Thr Ser Thr Val Thr Gly Ile Leu Gly Ser Leu Gly Leu Arg
485 490 495
Lys Arg Ser Arg Arg Gln Val Asn Thr Arg Ala Thr Gly Lys Cys Asn
500 505 510
Pro Asn Leu His Tyr Trp Thr Ala Gln Glu Gln His Asn Ala Ala Gly
515 520 525
Ile Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Gly Ala Glu Gly Ile Tyr Thr
530 535 540
Glu Gly Leu Met His Asn Gln Asn Ala Leu Val Cys Gly Leu Arg Gln
545 550 555 560
Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr
565 570 575
Thr Glu Leu Arg Thr Tyr Thr Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe
580 585 590
Leu Leu Arg Arg Trp Gly Gly Thr Cys Arg Ile Leu Gly Pro Asp Cys
595 600 605
Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asn
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Gln Ile Ile His Asp Phe Ile Asp Asn Pro Leu Pro Asn Gln Asp Asn
625 630 635 640
Asp Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile
645 650 655
Gly Ile Thr Gly Ile Ile Ile Ala Ile Ile Ala Leu Leu Cys Val Cys
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Lys Leu Leu Cys
675
<210> 3
<211> 681
<212> PRT
<213> 马尔堡病毒
<400> 3
Met Lys Thr Thr Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Gly Val
1 5 10 15
Lys Thr Leu Pro Ile Leu Glu Ile Ala Ser Asn Ile Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Val Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His
35 40 45
Leu Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu
50 55 60
Glu Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Ala Gly Val Pro Pro Lys Asn
65 70 75 80
Val Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser
85 90 95
Val Thr Asp Pro Ser Gly Lys Ser Leu Leu Leu Asp Pro Pro Thr Asn
100 105 110
Ile Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Ile His His Ile Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe
130 135 140
Leu Tyr Asp Arg Ile Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Lys Val Phe
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Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys
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Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr
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Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Gly Thr Gln Thr Asn Asp
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Thr Gly Cys Phe Gly Thr Leu Gln Glu Tyr Asn Ser Thr Lys Asn Gln
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Thr Cys Ala Pro Ser Lys Lys Pro Leu Pro Leu Pro Thr Ala His Pro
225 230 235 240
Glu Val Lys Leu Thr Ser Thr Ser Thr Asp Ala Thr Lys Leu Asn Thr
245 250 255
Thr Asp Pro Asn Ser Asp Asp Glu Asp Leu Thr Thr Ser Gly Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Glu Gln Glu Pro Tyr Thr Thr Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gln
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Thr Met Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gln Pro Ser Thr
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305 310 315 320
Glu Pro Gly Lys Thr Asn Thr Thr Ala Gln Pro Ser Met Pro Pro His
325 330 335
Asn Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asn Asn Thr Ser Lys His Asn Leu Ser
340 345 350
Thr Pro Ser Val Pro Ile Gln Asn Ala Thr Asn Tyr Asn Thr Gln Ser
355 360 365
Thr Ala Pro Glu Asn Glu Gln Thr Ser Ala Pro Ser Lys Thr Thr Leu
370 375 380
Leu Pro Thr Glu Asn Pro Thr Thr Ala Lys Ser Thr Asn Ser Thr Lys
385 390 395 400
Ser Pro Thr Thr Thr Val Pro Asn Thr Thr Asn Lys Tyr Ser Thr Ser
405 410 415
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Arg Lys Arg Asn Ile Leu Trp Arg Glu Gly Asp Met Phe Pro Phe Leu
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Asp Gly Leu Ile Asn Ala Pro Ile Asp Phe Asp Pro Val Pro Asn Thr
450 455 460
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Lys Val Asn Glu Asn Thr Ala His Ser Gly Glu Asn Glu Asn Asp Cys
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Gly Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr
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Thr Ala Gly Leu Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg
545 550 555 560
Arg Leu Ala Asn Gln Thr Ala Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Arg Val
565 570 575
Thr Thr Glu Glu Arg Thr Phe Ser Leu Ile Asn Arg His Ala Ile Asp
580 585 590
Phe Leu Leu Ala Arg Trp Gly Gly Thr Cys Lys Val Leu Gly Pro Asp
595 600 605
Cys Cys Ile Gly Ile Glu Asp Leu Ser Arg Asn Ile Ser Glu Gln Ile
610 615 620
Asp Gln Ile Lys Lys Asp Glu Gln Lys Glu Gly Thr Gly Trp Gly Leu
625 630 635 640
Gly Gly Lys Trp Trp Thr Ser Asp Trp Gly Val Leu Thr Asn Leu Gly
645 650 655
Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ile Ala Leu Ser Cys Ile
660 665 670
Cys Arg Ile Phe Thr Lys Tyr Ile Gly
675 680
<210> 4
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒糖蛋白的合成共有序列1
<400> 4
Met Lys Thr Ile Tyr Phe Leu Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Ser Ile
1 5 10 15
Lys Thr Leu Pro Val Leu Glu Ile Ala Ser Asn Ser Gln Pro Gln Asp
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Val Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His
35 40 45
Leu Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu
50 55 60
Glu Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Thr Gly Val Pro Pro Lys Asn
65 70 75 80
Val Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser
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100 105 110
Ile Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Val His His Ile Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe
130 135 140
Leu Tyr Asp Arg Val Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Lys Val Phe
145 150 155 160
Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Arg
165 170 175
Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr
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Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Glu Thr Arg Arg Asn Asp
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225 230 235 240
Ser Ile His Ser Thr Asn Thr Gln Ile Asn Thr Ala Lys Ser Gly Thr
245 250 255
Met Asn Pro Ser Ser Asp Asp Glu Asp Leu Met Ile Ser Gly Ser Gly
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Ser Gln His Glu Gln Asn Ser Thr Asn Pro Ser Arg His Ala Val Thr
305 310 315 320
Glu His Asn Gly Thr Asp Pro Thr Thr Gln Pro Ala Thr Leu Leu Asn
325 330 335
Asn Thr Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Asn Thr Leu Lys Tyr Asn Leu Ser
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355 360 365
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370 375 380
Asp Pro Thr Glu Asn Pro Thr Thr Ala Gln Asp Thr Asn Ser Thr Thr
385 390 395 400
Asn Ile Ile Met Thr Thr Ser Asp Ile Thr Ser Lys His Pro Thr Asn
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Ser Ser Pro Asp Ser Ser Pro Thr Thr Arg Pro Pro Ile Tyr Phe Arg
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Lys Lys Arg Ser Ile Phe Trp Lys Glu Gly Asp Ile Phe Pro Phe Leu
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Asp Gly Leu Ile Asn Thr Glu Ile Asp Phe Asp Pro Ile Pro Asn Thr
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485 490 495
Asp Lys Asn Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gly Glu Asn Glu Asn Asp Cys
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Asp Ala Glu Leu Arg Ile Trp Ser Val Gln Glu Asp Asp Leu Ala Ala
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Gly Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr
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545 550 555 560
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580 585 590
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Asp Lys Ile Arg Lys Asp Glu Gln Lys Glu Glu Thr Gly Trp Gly Leu
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Gly Gly Lys Trp Trp Thr Ser Asp Trp Gly Val Leu Thr Asn Leu Gly
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Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ile Ala Leu Ser Cys Ile
660 665 670
Cys Arg Ile Phe Thr Lys Tyr Ile Gly
675 680
<210> 5
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒糖蛋白的合成共有序列2
<400> 5
Met Arg Thr Thr Cys Phe Phe Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Gly Ile
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Lys Thr Leu Pro Ile Leu Glu Ile Ala Ser Asn Asp Gln Pro Gln Asn
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Val Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His
35 40 45
Leu Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu
50 55 60
Glu Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Thr Gly Val Pro Pro Lys Asn
65 70 75 80
Val Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser
85 90 95
Val Thr Asp Pro Ser Gly Lys Ser Leu Leu Leu Asp Pro Pro Thr Asn
100 105 110
Val Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Ile His His Ile Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe
130 135 140
Leu Tyr Asp Arg Ile Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Lys Val Phe
145 150 155 160
Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys
165 170 175
Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr
180 185 190
Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Gly Thr Gln Thr Asn Asp
195 200 205
Thr Gly Cys Phe Gly Thr Leu Gln Glu Tyr Asn Ser Thr Lys Asn Gln
210 215 220
Thr Cys Ala Pro Ser Lys Thr Pro Pro Pro Pro Pro Thr Ala Arg Pro
225 230 235 240
Glu Ile Lys Pro Thr Ser Thr Pro Thr Asp Ala Thr Arg Leu Asn Thr
245 250 255
Thr Asn Pro Asn Ser Asp Asp Glu Asp Leu Thr Thr Ser Gly Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Glu Gln Glu Pro Tyr Thr Thr Ser Asp Ala Val Thr Lys Gln
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Thr Met Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gln Pro Gly Thr
290 295 300
Pro Gln Gln Gly Gly Asn Asn Thr Asn His Ser Gln Asp Ala Ala Thr
305 310 315 320
Glu Leu Asp Asn Thr Asn Thr Thr Ala Gln Pro Pro Thr Pro Ser His
325 330 335
Asn Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asn Asn Thr Ser Lys His Asn Leu Ser
340 345 350
Thr Leu Ser Glu Pro Pro Gln Asn Thr Thr Asn Pro Asn Thr Gln Ser
355 360 365
Met Ala Thr Glu Asn Glu Lys Thr Ser Ala Pro Pro Lys Thr Thr Leu
370 375 380
Pro Pro Thr Glu Ser Pro Thr Thr Glu Lys Ser Thr Asn Asn Thr Lys
385 390 395 400
Ser Pro Thr Thr Met Glu Pro Asn Thr Thr Asn Gly His Phe Thr Ser
405 410 415
Pro Ser Ser Thr Pro Asn Ser Thr Thr Gln His Leu Ile Tyr Phe Arg
420 425 430
Arg Lys Arg Ser Ile Leu Trp Arg Glu Gly Asp Met Phe Pro Phe Leu
435 440 445
Asp Gly Leu Ile Asn Ala Pro Ile Asp Phe Asp Pro Val Pro Asn Thr
450 455 460
Lys Thr Ile Phe Asp Glu Ser Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ala Glu Glu
465 470 475 480
Asp Gln His Ala Ser Ser Asn Ile Ser Leu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro
485 490 495
His Thr Ser Glu Asn Thr Ala Tyr Ser Gly Glu Asn Glu Asn Asp Cys
500 505 510
Asp Ala Glu Leu Arg Ile Trp Ser Val Gln Glu Asp Asp Leu Ala Ala
515 520 525
Gly Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr
530 535 540
Thr Ala Gly Leu Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg
545 550 555 560
Arg Leu Ala Asn Gln Thr Ala Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Arg Val
565 570 575
Thr Thr Glu Glu Arg Thr Phe Ser Leu Ile Asn Arg His Ala Ile Asp
580 585 590
Phe Leu Leu Thr Arg Trp Gly Gly Thr Cys Lys Val Leu Gly Pro Asp
595 600 605
Cys Cys Ile Gly Ile Glu Asp Leu Ser Arg Asn Ile Ser Glu Gln Ile
610 615 620
Asp Gln Ile Lys Lys Asp Glu Gln Lys Glu Gly Thr Gly Trp Gly Leu
625 630 635 640
Gly Gly Lys Trp Trp Thr Ser Asp Trp Gly Val Leu Thr Asn Leu Gly
645 650 655
Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ile Ala Leu Ser Cys Ile
660 665 670
Cys Arg Ile Phe Thr Lys Tyr Ile Gly
675 680
<210> 6
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒糖蛋白的合成共有序列3
<400> 6
Met Lys Thr Thr Cys Leu Phe Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Gly Ile
1 5 10 15
Lys Thr Leu Pro Ile Leu Glu Ile Ala Ser Asn Asn Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Val Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His
35 40 45
Leu Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu
50 55 60
Glu Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Thr Gly Val Pro Pro Lys Asn
65 70 75 80
Val Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser
85 90 95
Val Thr Asp Pro Ser Gly Lys Ser Leu Leu Leu Asp Pro Pro Thr Asn
100 105 110
Ile Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Ile His His Ile Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe
130 135 140
Leu Tyr Asp Arg Ile Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Arg Val Phe
145 150 155 160
Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys
165 170 175
Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr
180 185 190
Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Asn Asn Gly Thr Gln Thr Asn Asp
195 200 205
Thr Gly Cys Phe Gly Ala Leu Gln Glu Tyr Asn Ser Thr Lys Asn Gln
210 215 220
Thr Cys Ala Pro Ser Lys Ile Pro Ser Pro Leu Pro Thr Ala Arg Pro
225 230 235 240
Glu Ile Lys Pro Thr Ser Thr Pro Thr Asp Ala Thr Lys Leu Asn Thr
245 250 255
Thr Asp Pro Asn Ser Asp Asp Glu Asp Leu Ala Thr Ser Gly Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Glu Gln Glu Pro His Thr Thr Ser Asp Ala Val Thr Lys Gln
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Thr Met Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gln Pro Ser Thr
290 295 300
Pro Gln Gln Glu Gly Asn Asn Thr Asp His Ser Gln Asp Ala Val Thr
305 310 315 320
Glu Pro Asn Lys Thr Asn Thr Thr Ala Gln Pro Ser Met Pro Pro His
325 330 335
Asn Thr Thr Ala Ile Ser Thr Asn Asn Thr Ser Lys His Asn Phe Ser
340 345 350
Thr Leu Ser Ala Pro Leu Gln Asn Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Gln Ser
355 360 365
Thr Ala Thr Glu Asn Glu Gln Thr Ser Ala Pro Ser Lys Thr Thr Leu
370 375 380
Pro Pro Thr Gly Asn Leu Thr Thr Ala Lys Ser Thr Asn Asn Thr Lys
385 390 395 400
Gly Pro Thr Thr Thr Ala Pro Asn Met Thr Asn Gly His Leu Thr Ser
405 410 415
Pro Ser Pro Thr Pro Asn Pro Thr Thr Gln His Leu Val Tyr Phe Arg
420 425 430
Lys Lys Arg Ser Ile Leu Trp Arg Glu Gly Asp Met Phe Pro Phe Leu
435 440 445
Asp Gly Leu Ile Asn Ala Pro Ile Asp Phe Asp Pro Val Pro Asn Thr
450 455 460
Lys Thr Ile Phe Asp Glu Ser Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ala Glu Glu
465 470 475 480
Asp Gln His Ala Ser Pro Asn Ile Ser Leu Thr Leu Ser Tyr Phe Pro
485 490 495
Asn Ile Asn Glu Asn Thr Ala Tyr Ser Gly Glu Asn Glu Asn Asp Cys
500 505 510
Asp Ala Glu Leu Arg Ile Trp Ser Val Gln Glu Asp Asp Leu Ala Ala
515 520 525
Gly Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr
530 535 540
Thr Ala Gly Leu Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg
545 550 555 560
Arg Leu Ala Asn Gln Thr Ala Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Arg Val
565 570 575
Thr Thr Glu Glu Arg Thr Phe Ser Leu Ile Asn Arg His Ala Ile Asp
580 585 590
Phe Leu Leu Thr Arg Trp Gly Gly Thr Cys Lys Val Leu Gly Pro Asp
595 600 605
Cys Cys Ile Gly Ile Glu Asp Leu Ser Arg Asn Ile Ser Glu Gln Ile
610 615 620
Asp Gln Ile Lys Lys Asp Glu Gln Lys Glu Gly Thr Gly Trp Gly Leu
625 630 635 640
Gly Gly Lys Trp Trp Thr Ser Asp Trp Gly Val Leu Thr Asn Leu Gly
645 650 655
Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ile Ala Leu Ser Cys Ile
660 665 670
Cys Arg Ile Phe Thr Lys Tyr Ile Gly
675 680
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段1
<400> 7
Ile Gln Gly Val Lys Thr Leu Pro Ile Leu Glu Ile Ala Ser Asn
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段2
<400> 8
Ala Ser Asn Ile Gln Pro Gln Asn Val Asp Ser Val Cys Ser Gly
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段3
<400> 9
Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Ala Gly Val Pro Pro Lys Asn Val
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段4
<400> 10
Gly Lys Val Phe Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段5
<400> 11
Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys Met
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段6
<400> 12
Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys Met
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段7
<400> 13
Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段8
<400> 14
His Lys Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段9
<400> 15
Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr Ser Thr Asn
1 5 10 15
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段10
<400> 16
Arg His Met Asn Leu Thr Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段11
<400> 17
Leu Pro Thr Glu Asn Pro Thr Thr Ala Lys Ser Thr Asn Ser Thr
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段12
<400> 18
Pro Asn Ser Thr Ala Gln His Leu Val Tyr Phe Arg Arg Lys Arg
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段13
<400> 19
His Leu Val Tyr Phe Arg Arg Lys Arg Asn Ile Leu Trp Arg Glu
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段14
<400> 20
Gly Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段15
<400> 21
Gly Leu Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg Arg
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段16
<400> 22
Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg Arg Leu Ala Asn Gln Thr Ala
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段17
<400> 23
Thr Thr Glu Glu Arg Thr Phe Ser Leu Ile Asn Arg His Ala Ile
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段18
<400> 24
His Ala Ile Asp Phe Leu Leu Ala Arg Trp Gly Gly Thr Cys Lys
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马尔堡病毒表位片段19
<400> 25
Thr Cys Lys Val Leu Gly Pro Asp Cys Cys Ile Gly Ile Glu Asp
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段1
<400> 26
Phe Phe Val Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Lys Ala Phe Ser Met
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段2
<400> 27
Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val Val Ser Tyr
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段3
<400> 28
Tyr Asn Leu Glu Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段4
<400> 29
His Lys Ala Gln Gly Thr Gly Pro Cys Pro Gly Asp Tyr Ala Phe
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段5
<400> 30
Gly Ala Phe Phe Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段6
<400> 31
Asn Phe Ala Glu Gly Val Ile Ala Phe Leu Ile Leu Ala Lys Pro
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段7
<400> 32
Ser Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Leu Glu Tyr Glu Ile Glu Asn Phe
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段8
<400> 33
Phe Val Leu Leu Asp Arg Pro His Thr Pro Gln Phe Leu Phe Gln
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段9
<400> 34
Asn Ile Thr Thr Ala Val Lys Thr Val Leu Pro Gln Glu Ser Thr
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段10
<400> 35
Thr Gly Ile Leu Gly Ser Leu Gly Leu Arg Lys Arg Ser Arg Arg
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段11
<400> 36
Leu Gly Leu Arg Lys Arg Ser Arg Arg Gln Val Asn Thr Arg Ala
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段12
<400> 37
Ile Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Gly Ala Glu Gly Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段13
<400> 38
Thr Glu Leu Arg Thr Tyr Thr Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段14
<400> 39
Cys Arg Ile Leu Gly Pro Asp Cys Cys Ile Glu Pro His Asp Trp
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段15
<400> 40
Gln Ile Ile His Asp Phe Ile Asp Asn Pro Leu Pro Asn Gln Asp
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 苏丹埃博拉病毒肽片段16
<400> 41
Gly Ile Gly Ile Thr Gly Ile Ile Ile Ala Ile Ile Ala Leu Leu
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段1
<400> 42
Phe Ser Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段2
<400> 43
Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val Val Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段3
<400> 44
Tyr Asn Leu Glu Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段4
<400> 45
Gly Ala Phe Phe Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段5
<400> 46
Gly Ala Phe Phe Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段6
<400> 47
Thr Phe Ala Glu Gly Val Val Ala Phe Leu Ile Leu Pro Gln Ala
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段7
<400> 48
Pro Gln Ala Lys Lys Asp Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段8
<400> 49
Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu Pro Val Asn Ala Thr Glu
1 5 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段9
<400> 50
Glu Val Asp Asn Leu Thr Tyr Val Gln Leu Glu Ser Arg Phe Thr
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段10
<400> 51
Tyr Val Gln Leu Glu Ser Arg Phe Thr Pro Gln Phe Leu Leu Gln
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段11
<400> 52
Thr Thr Ile Gly Glu Trp Ala Phe Trp Glu Thr Lys Lys Asn Leu
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段12
<400> 53
Ala Phe Trp Glu Thr Lys Lys Asn Leu Thr Arg Lys Ile Arg Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段13
<400> 54
Lys Asn Leu Thr Arg Lys Ile Arg Ser Glu Glu Leu Ser Phe Thr
1 5 10 15
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段14
<400> 55
Ser Gln Gly Arg Glu Ala Ala Val Ser His Leu Thr Thr Leu Ala
1 5 10 15
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段15
<400> 56
Asp Asn Ser Thr His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser
1 5 10 15
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段16
<400> 57
Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ala Thr Gln Val Glu
1 5 10 15
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段17
<400> 58
Pro Pro Ala Thr Thr Ala Ala Gly Pro Pro Lys Ala Glu Asn Thr
1 5 10 15
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段18
<400> 59
Thr Arg Arg Glu Ala Ile Val Asn Ala Gln Pro Lys Cys Asn Pro
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段19
<400> 60
Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala Glu Gly Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段20
<400> 61
Thr Glu Leu Arg Thr Phe Ser Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 扎伊尔埃博拉病毒共有片段21
<400> 62
Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys Cys Ile Glu Pro His Asp Trp
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人
<400> 63
Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys Cys Ile Glu Pro His Asp Trp
1 5 10 15
<210> 64
<211> 2034
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白共有序列，pGX4201
<400> 64
atgggggtca ctgggattct gcagctgcct agagatcgct tcaagcgaac ctctttcttt 60
ctgtgggtca tcattctgtt ccagaggact tttagtatcc ctctgggcgt cattcacaat 120
tctaccctgc aggtgagtga cgtcgataag ctggtgtgtc gggacaaact gagctccacc 180
aaccagctga gatctgtcgg cctgaatctg gaggggaacg gagtggctac cgatgtccca 240
agtgcaacaa agagatgggg gtttcgctca ggagtgcccc ctaaagtggt caattacgag 300
gccggggaat gggctgagaa ttgctataac ctggaaatca agaaacccga cggatcagag 360
tgtctgccag ccgctcccga tgggattcgc ggattcccta gatgcagata cgtgcacaag 420
gtcagcggca ccgggccatg tgcaggagac ttcgcctttc ataaagaagg cgccttcttt 480
ctgtacgata gactggcttc caccgtgatc tataggggga ccacattcgc cgagggagtg 540
gtcgcttttc tgattctgcc tcaggccaag aaagacttct tttctagtca tcctctgcgg 600
gaaccagtga acgctaccga ggaccccagc agcggctact attccactac catcagatac 660
caggccacag gattcggcac caatgagaca gaatacctgt ttgaagtgga caacctgaca 720
tatgtccagc tggagtctag gttcactccc cagtttctgc tgcagctgaa tgaaactatc 780
tataccagtg gcaagcgctc aaatacaact gggaagctga tttggaaagt gaaccctgag 840
atcgatacca caattggcga atgggccttt tgggagacca agaaaaacct gacacggaag 900
atcagaagcg aggaactgtc cttcaccgca gtgagtaata gggccaaaaa catttcaggc 960
cagagcccag cacgaacttc ctctgacccc gggaccaata ctaccacaga agatcacaag 1020
atcatggcca gcgagaacag ttcagctatg gtgcaggtcc actcccaggg aagggaggca 1080
gccgtgtctc atctgactac cctggccaca atctctacta gtccccagag ccccacaact 1140
aagcccgggc ctgacaatag cacccataac acacctgtgt acaaactgga tatctccgaa 1200
gccacccagg tcgagcagca ccatcggaga acagacaatg attccactgc atctgacacc 1260
cctccagcaa ccacagctgc aggacccccc aaggctgaga atactaacac cagcaaaagc 1320
accgacctgc tggaccccgc aactaccaca tcaccacaga accacagcga gacagccggg 1380
aacaataaca ctcaccatca ggacaccgga gaggaatccg ccagctccgg caagctgggg 1440
ctgatcacaa atactattgc tggagtggca ggactgatca caggcgggag gcgaactcga 1500
cgagaagcta ttgtgaacgc acagcccaaa tgcaatccta acctgcacta ttggactacc 1560
caggacgagg gagcagctat cggactggca tggattccat actttgggcc cgcagccgaa 1620
ggaatctata ccgagggcct gatgcataat caggatggac tgatctgtgg cctgcggcag 1680
ctggctaacg aaacaactca ggcactgcag ctgttcctgc gagctaccac agagctgcgg 1740
acctttagca tcctgaatcg caaggcaatt gacttcctgc tgcagcgatg gggaggcaca 1800
tgccacatcc tgggaccaga ctgctgtatt gagcctcatg attggacaaa gaacatcact 1860
gacaaaattg atcagatcat tcacgacttc gtggataaaa cactgccaga tcagggggac 1920
aatgataact ggtggactgg atggagacag tggattcccg ccggcattgg cgtcaccggc 1980
gtcattattg ccgtcattgc tctgttctgt atttgtaagt tcgtgttctg ataa 2034
<210> 65
<211> 2034
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成苏丹埃博拉病毒糖蛋白共有序列
<400> 65
atggagggac tgtcactgct gcagctgcct agagataagt tcaggaaaag ctccttcttt 60
gtgtgggtca tcattctgtt ccagaaggcc ttttcaatgc ccctgggcgt ggtcactaat 120
agcaccctgg aagtgacaga gatcgatcag ctggtctgta aggaccacct ggcttcaact 180
gatcagctga aaagcgtggg gctgaacctg gagggatcag gcgtcagcac tgatattcct 240
tctgcaacca agagatgggg atttcgcagc ggagtgcccc ctaaagtggt ctcctacgaa 300
gcaggggagt gggccgaaaa ttgctataac ctggagatca agaaaccaga tggcagcgaa 360
tgtctgccac cccctccaga cggggtgcgc ggattcccca gatgcagata cgtccacaag 420
gcccagggga ccggaccttg tccaggagac tatgcctttc ataaagatgg cgctttcttt 480
ctgtacgacc gcctggctag tacagtgatc tatcgaggcg tcaatttcgc cgagggcgtg 540
atcgcttttc tgattctggc aaagccaaaa gaaaccttcc tgcagagccc tcccattagg 600
gaggccgtga actacacaga aaacacttct agttactacg ctacatccta cctggagtat 660
gaaatcgaga actttggcgc tcagcactct accacactgt tcaagattaa caataacacc 720
tttgtgctgc tggatcgccc tcatacacca cagttcctgt ttcagctgaa cgacactatc 780
cacctgcatc agcagctgag caatactacc ggaaaactga tttggacact ggacgctaat 840
atcaacgcag atattggcga gtgggccttc tgggaaaata agaaaaacct gtccgagcag 900
ctgcggggag aggaactgag ctttgaaaca ctgtccctga atgaaactga ggacgatgac 960
gccacctcaa gccgaacaac taagggccgg atctctgatc gggctaccag aaagtacagt 1020
gatctggtgc caaaagactc tcccggcatg gtgagtctgc acgtccctga aggggagacc 1080
acactgccat cccagaactc tactgagggc cggagagtgg acgtcaatac ccaggagact 1140
atcaccgaaa ctaccgcaac aatcattggc actaacggga ataacatgca gatcagcacc 1200
attggcacag ggctgtcctc tagtcagatt ctgtcaagct cccctaccat ggccccctcc 1260
cctgagacac agacttctac aacttataca cccaagctgc ctgtgatgac cacagaggaa 1320
cccactaccc cacccagaaa cagtcctggg tcaacaactg aggcacccac cctgaccaca 1380
cctgaaaata tcactaccgc cgtgaaaaca gtcctgcctc aggagtctac tagtaacgga 1440
ctgatcacca gcacagtgac tggaattctg ggcagtctgg ggctgcgcaa gcgatcaagg 1500
cgccaagtga atactcgggc taccggcaaa tgcaatccaa acctgcacta ctggaccgca 1560
caggagcagc ataacgccgc tgggatcgct tggattcctt acttcggacc aggcgcagag 1620
gggatctata ccgaaggact gatgcataat cagaacgccc tggtgtgtgg cctgagacag 1680
ctggcaaatg agacaactca ggccctgcag ctgttcctga gagcaaccac agaactgagg 1740
acctatacaa tcctgaaccg gaaggccatt gattttctgc tgcgacgatg gggcgggacc 1800
tgcagaatcc tgggaccaga ctgctgtatt gagccccacg attggaccaa gaacatcaca 1860
gacaagatca accagatcat tcatgatttc atcgacaacc cactgcccaa tcaggacaac 1920
gatgacaatt ggtggaccgg atggcgacag tggattcccg caggaattgg aatcaccgga 1980
attattattg ccattattgc tctgctgtgt gtctgtaagc tgctgtgttg ataa 2034
<210> 66
<211> 2049
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成马尔堡病毒糖蛋白共有序列
<400> 66
atgaaaacca cttgtctgct gatctcactg attctgattc agggcgtcaa aacactgccc 60
attctggaaa ttgcctctaa catccagcca cagaacgtgg actccgtctg ttctgggacc 120
ctgcagaaga cagaggatgt gcacctgatg ggcttcaccc tgagcgggca gaaggtcgca 180
gactcacccc tggaagccag caaacgatgg gcatttcggg ccggagtgcc ccctaagaac 240
gtcgagtaca ccgaaggcga ggaagccaaa acatgctata atatctccgt gactgatcct 300
agtggcaagt cactgctgct ggacccaccc accaacatta gggattaccc taagtgtaaa 360
acaatccacc atattcaggg ccagaatcca cacgctcagg ggatcgcact gcatctgtgg 420
ggagccttct ttctgtacga caggattgct agcaccacaa tgtatcgcgg gaaagtgttc 480
accgagggaa acatcgccgc tatgattgtg aataagacag tccacaaaat gatcttttct 540
cgccagggcc aggggtaccg acatatgaac ctgaccagta caaataagta ttggaccagc 600
tccaacggca ctcagaccaa tgacactggg tgcttcggaa ccctgcagga gtacaacagt 660
actaaaaatc agacctgtgc tccatcaaag aaaccactgc cactgcctac cgcacaccca 720
gaggtgaagc tgacaagtac ttcaaccgac gccacaaaac tgaacactac cgaccccaat 780
agtgacgatg aagatctgac aactagcgga tccggctctg gggagcagga accttatacc 840
acatccgatg cagccaccaa gcagggcctg tctagtacaa tgcctccaac tccatctccc 900
cagcctagta ctccccagca gggcgggaac aataccaacc attcccaggg cgtggtcaca 960
gagccaggga agactaacac taccgcccag ccctctatgc cccctcacaa tacaactacc 1020
atctccacca acaatacatc taaacataac ctgagcacac cttccgtgcc aatccagaac 1080
gctactaact acaacactca gtctaccgca cccgagaatg aacagacttc tgcccctagt 1140
aagacaactc tgctgcccac cgagaaccct accacagcca agtcaacaaa tagcactaaa 1200
tcccctacta ccacagtgcc aaacactacc aataagtaca gtacctcacc aagccccacc 1260
cctaactcca cagcacagca cctggtctat ttccggagaa aaagaaatat cctgtggagg 1320
gagggcgaca tgttcccttt tctggatggg ctgatcaacg ctccaattga cttcgatcca 1380
gtgcccaata caaagactat ctttgacgaa tcaagctcct ctggcgcctc tgctgaggaa 1440
gatcagcacg cctcacccaa cattagcctg acactgtcct actttcctaa agtgaacgag 1500
aatactgccc atagcgggga gaacgaaaat gactgcgatg ctgagctgcg gatctggagc 1560
gtccaggaag acgatctggc tgcaggactg tcctggatcc cattctttgg acccggcatt 1620
gagggactgt ataccgccgg cctgattaag aaccagaaca acctggtgtg cagactgagg 1680
cgcctggcca atcagaccgc taaatcactg gaactgctgc tgcgggtcac aactgaggaa 1740
agaacattca gcctgatcaa ccgacatgct attgactttc tgctggcacg ctggggaggc 1800
acctgcaagg tgctgggacc agactgctgt atcggcattg aggatctgtc tcgcaatatc 1860
agtgaacaga tcgaccagat taagaaagat gagcagaagg aaggaaccgg atggggactg 1920
ggcggcaagt ggtggaccag cgattggggc gtgctgacaa acctgggaat cctgctgctg 1980
ctgtccatcg ccgtcctgat tgctctgtcc tgtatttgtc ggattttcac taagtatatt 2040
gggtgataa 2049
<210> 67
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZEBOV GUI，pGX4202
<400> 67
Met Gly Val Thr Gly Ile Leu Gln Leu Pro Arg Asp Arg Phe Lys Arg
1 5 10 15
Thr Ser Phe Phe Leu Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val Ser Asp Val
35 40 45
Asp Lys Leu Val Cys Arg Asp Lys Leu Ser Ser Thr Asn Gln Leu Arg
50 55 60
Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Asn Gly Val Ala Thr Asp Val Pro
65 70 75 80
Ser Ala Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val
85 90 95
Val Asn Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Ala Ala Pro Asp Gly
115 120 125
Ile Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Val Ser Gly Thr
130 135 140
Gly Pro Cys Ala Gly Asp Phe Ala Phe His Lys Glu Gly Ala Phe Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Thr Thr Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Val Val Ala Phe Leu Ile Leu Pro Gln Ala Lys Lys Asp
180 185 190
Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu Pro Val Asn Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Pro Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Tyr Gln Ala Thr Gly
210 215 220
Phe Gly Thr Asn Glu Thr Glu Tyr Leu Phe Glu Val Asp Asn Leu Thr
225 230 235 240
Tyr Val Gln Leu Glu Ser Arg Phe Thr Pro Gln Phe Leu Leu Gln Leu
245 250 255
Asn Glu Thr Ile Tyr Ala Ser Gly Lys Arg Ser Asn Thr Thr Gly Lys
260 265 270
Leu Ile Trp Lys Val Asn Pro Glu Ile Asp Thr Thr Ile Gly Glu Trp
275 280 285
Ala Phe Arg Glu Thr Lys Lys Asn Leu Thr Arg Lys Ile Arg Ser Glu
290 295 300
Glu Leu Ser Phe Thr Ala Val Ser Asn Gly Pro Lys Asn Ile Ser Gly
305 310 315 320
Gln Ser Pro Ala Arg Thr Ser Ser Asp Pro Glu Thr Asn Thr Thr Asn
325 330 335
Glu Asp His Lys Ile Met Ala Ser Glu Asn Ser Ser Ala Met Val Gln
340 345 350
Val His Ser Gln Gly Arg Lys Ala Ala Val Ser His Leu Thr Thr Leu
355 360 365
Ala Thr Ile Ser Thr Ser Pro Gln Pro Pro Thr Thr Lys Thr Gly Pro
370 375 380
Asp Asn Ser Thr His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu
385 390 395 400
Ala Thr Gln Val Gly Gln His His Arg Arg Ala Asp Asn Asp Ser Thr
405 410 415
Ala Ser Asp Thr Pro Pro Ala Thr Thr Ala Ala Gly Pro Leu Lys Ala
420 425 430
Glu Asn Thr Asn Thr Ser Lys Ser Ala Asp Ser Leu Asp Leu Ala Thr
435 440 445
Thr Thr Ser Pro Gln Asn Tyr Ser Glu Thr Ala Gly Asn Asn Asn Thr
450 455 460
His His Gln Asp Thr Gly Glu Glu Ser Ala Ser Ser Gly Lys Leu Gly
465 470 475 480
Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Gly Leu Ile Thr Gly Gly
485 490 495
Arg Arg Thr Arg Arg Glu Val Ile Val Asn Ala Gln Pro Lys Cys Asn
500 505 510
Pro Asn Leu His Tyr Trp Thr Thr Gln Asp Glu Gly Ala Ala Ile Gly
515 520 525
Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala Glu Gly Ile Tyr Ile
530 535 540
Glu Gly Leu Met His Asn Gln Asp Gly Leu Ile Cys Gly Leu Arg Gln
545 550 555 560
Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr
565 570 575
Thr Glu Leu Arg Thr Phe Ser Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe
580 585 590
Leu Leu Gln Arg Trp Gly Gly Thr Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys
595 600 605
Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asp
610 615 620
Gln Ile Ile His Asp Phe Val Asp Lys Thr Leu Pro Asp Gln Gly Asp
625 630 635 640
Asn Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile
645 650 655
Gly Val Thr Gly Val Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Phe Cys Ile Cys
660 665 670
Lys Phe Val Phe
675
<210> 68
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZEBOV CON2，pGX4203
<400> 68
Met Gly Ile Thr Gly Ile Leu Gln Leu Pro Arg Asp Arg Phe Lys Arg
1 5 10 15
Thr Ser Phe Phe Leu Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val Ser Asp Val
35 40 45
Asp Lys Leu Val Cys Arg Asp Lys Leu Ser Ser Thr Asn Gln Leu Arg
50 55 60
Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Asn Gly Val Ala Thr Asp Val Pro
65 70 75 80
Ser Ala Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val
85 90 95
Val Asn Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Ala Ala Pro Asp Gly
115 120 125
Ile Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Val Ser Gly Thr
130 135 140
Gly Pro Cys Ala Gly Asp Phe Ala Phe His Lys Glu Gly Ala Phe Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Thr Thr Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Val Val Ala Phe Leu Ile Leu Pro Gln Ala Lys Lys Asp
180 185 190
Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu Pro Val Asn Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Pro Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Tyr Gln Ala Thr Gly
210 215 220
Phe Gly Thr Asn Glu Thr Glu Tyr Leu Phe Glu Val Asp Asn Leu Thr
225 230 235 240
Tyr Val Gln Leu Glu Ser Arg Phe Thr Pro Gln Phe Leu Leu Gln Leu
245 250 255
Asn Glu Thr Ile Tyr Ala Ser Gly Lys Arg Ser Asn Thr Thr Gly Lys
260 265 270
Leu Ile Trp Lys Val Asn Pro Glu Ile Asp Thr Thr Ile Gly Glu Trp
275 280 285
Ala Phe Trp Glu Thr Lys Lys Thr Ser Leu Gly Lys Ile Arg Ser Glu
290 295 300
Glu Leu Ser Phe Thr Ala Val Ser Asn Gly Ala Lys Asp Ile Ser Gly
305 310 315 320
Gln Ser Pro Ala Arg Thr Ser Ser Asp Pro Glu Thr Tyr Thr Thr Thr
325 330 335
Glu Asp His Lys Ile Met Ala Ser Glu Asn Ser Ser Thr Met Val Gln
340 345 350
Val His Asn Gln Gly Arg Glu Ala Ala Val Ser His Leu Ile Thr Leu
355 360 365
Ala Thr Ile Ser Thr Ser Pro Gln Ser Pro Thr Thr Lys Pro Gly Gln
370 375 380
Asp Asn Ser Thr His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu
385 390 395 400
Ala Thr Gln Val Glu Gln His His Arg Arg Thr Asp Asn Asp Ser Thr
405 410 415
Ala Ser Asp Thr Pro Pro Ala Thr Thr Ala Ala Gly Pro Pro Lys Ala
420 425 430
Glu Asn Ile Asn Thr Ser Lys Ser Ala Asp Ser Leu Asp Pro Ala Thr
435 440 445
Thr Thr Ser Pro Gln Asn Tyr Ser Glu Thr Ala Gly Asn Asn Asn Thr
450 455 460
His His Gln Asp Thr Gly Glu Glu Ser Ala Gly Ser Gly Lys Leu Gly
465 470 475 480
Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Gly Leu Ile Thr Gly Gly
485 490 495
Arg Arg Thr Arg Arg Glu Ala Ile Val Asn Ala Gln Pro Lys Cys Asn
500 505 510
Pro Asn Leu His Tyr Trp Thr Thr Gln Asp Glu Gly Ala Ala Ile Gly
515 520 525
Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala Glu Gly Ile Tyr Thr
530 535 540
Glu Gly Leu Met His Asn Gln Asp Gly Leu Ile Cys Gly Leu Arg Gln
545 550 555 560
Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr
565 570 575
Thr Glu Leu Arg Thr Phe Ser Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe
580 585 590
Leu Leu Gln Arg Trp Gly Gly Thr Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys
595 600 605
Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asp
610 615 620
Gln Ile Ile His Asp Phe Val Asp Lys Thr Leu Pro Asp Gln Gly Asp
625 630 635 640
Asn Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile
645 650 655
Gly Val Thr Gly Val Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Phe Cys Ile Cys
660 665 670
Lys Phe Val Phe
675
<210> 69
<211> 4991
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pZEBOV-GUI，pGX4202
<400> 69
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
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ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accgagctcg gatccgccgc caccatgggg gtcaccggga ttctgcagct gccaagagat 780
agattcaagc gcacctcctt tttcctgtgg gtcatcatcc tgtttcagag aaccttttct 840
atccccctgg gagtgattca caattcaaca ctgcaggtga gcgacgtcga taagctggtg 900
tgtcgcgaca aactgagctc caccaaccag ctgcgaagcg tcgggctgaa tctggaggga 960
aacggagtgg caaccgatgt cccaagcgca acaaagagat ggggctttag atccggagtg 1020
ccccctaaag tggtcaacta cgaggcaggc gaatgggccg agaattgcta taacctggaa 1080
atcaagaaac ctgacggatc agagtgtctg cccgccgctc ctgatggcat taggggattc 1140
ccaagatgca gatacgtgca caaggtcagc ggcacaggac cctgtgctgg cgacttcgca 1200
tttcataaag aaggagcttt ctttctgtac gatcgactgg caagcaccgt gatctatagg 1260
ggcaccacat tcgccgaggg agtggtcgct tttctgattc tgccccaggc taagaaagac 1320
ttcttttcta gtcacccact gagggaaccc gtgaacgcca cagaggaccc cagcagcggc 1380
tactatagta ctaccatcag ataccaggcc actgggttcg gcactaatga gaccgaatac 1440
ctgtttgaag tggacaacct gacatatgtc cagctggaga gccggttcac tcctcagttt 1500
ctgctgcagc tgaatgaaac catctatgct agcggaaagc gctccaatac aactgggaag 1560
ctgatttgga aagtgaaccc agagatcgat accacaattg gcgaatgggc ctttcgggag 1620
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aatgggccaa aaaacatttc cggccagtct cctgctagga cttcctctga cccagaaacc 1740
aatactacca acgaggatca caagatcatg gcttccgaga acagttcagc aatggtgcag 1800
gtccacagtc agggcagaaa agcagccgtg tcacatctga caactctggc cacaatctct 1860
actagtcctc agccacccac cacaaagaca gggcccgaca attctaccca taacacacct 1920
gtgtacaaac tggatatcag tgaggccacc caggtcggcc agcaccatag gagagccgac 1980
aatgatagta ctgcttcaga cacccctcca gcaactaccg ctgcaggccc actgaaggcc 2040
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atcacaggag gacgacgaac tcgaagagaa gtgattgtca acgctcagcc taaatgcaat 2280
ccaaacctgc actactggac aactcaggac gagggagcag ctatcggact ggcatggatt 2340
ccctacttcg gccctgcagc cgaaggaatc tatattgagg ggctgatgca taatcaggat 2400
ggactgatct gtgggctgcg gcagctggca aacgaaacca cacaggccct gcagctgttc 2460
ctgcgggcaa ctaccgagct gcgcacattt tccatcctga atagaaaggc cattgacttc 2520
ctgctgcagc gatggggagg aacctgccac atcctgggac cagactgctg tattgagccc 2580
catgattgga caaagaacat cactgacaaa attgatcaga tcattcacga ctttgtggat 2640
aagactctgc ctgatcaggg ggacaatgat aactggtgga ccggatggcg acagtggatt 2700
cccgcaggaa ttggggtgac cggcgtcatc attgccgtga tcgctctgtt ctgcatttgt 2760
aagttcgtct tttgataact cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg 2820
actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 2880
ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 2940
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 3000
tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tactgggcgg 3060
ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga 3120
agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat 3180
caagctctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc 3240
acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga 3300
caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt 3360
ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat 3420
cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg 3480
gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg 3540
ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc 3600
cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga 3660
tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag 3720
ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc 3780
atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg 3840
actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata 3900
ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg 3960
ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgaattatta 4020
acgcttacaa tttcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 4080
gcatcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 4140
atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatag 4200
cacgtgctaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 4260
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 4320
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 4380
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 4440
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 4500
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 4560
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 4620
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 4680
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 4740
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 4800
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 4860
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 4920
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 4980
cacatgttct t 4991
<210> 70
<211> 2034
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pEBOZ CON2 DNA编码序列，pGX4203
<400> 70
atggggatta ctgggattct gcagctgccc cgagataggt tcaagcgcac ttcattcttc 60
ctgtgggtca ttattctgtt tcagagaacc tttagcatcc ccctgggagt gattcacaat 120
tcaacactgc aggtgagcga cgtcgataag ctggtgtgta gagacaaact gagctccacc 180
aaccagctgc gatccgtcgg cctgaatctg gagggaaacg gggtggccac agatgtccca 240
agtgctacta agcgctgggg ctttcgatca ggagtgcccc ctaaagtggt caactacgag 300
gcaggcgaat gggccgagaa ttgctataac ctggaaatca agaaacctga cggcagcgag 360
tgtctgccag cagctcctga tgggattcgg ggattcccca gatgcagata tgtgcacaag 420
gtctctggca caggaccttg tgctggcgac ttcgcatttc ataaagaagg agcattcttt 480
ctgtacgatc ggctggccag caccgtgatc tatcgcggca ccacattcgc agagggagtg 540
gtcgcctttc tgattctgcc tcaggcaaag aaagacttct tttctagtca ccctctgcgc 600
gaaccagtga atgctacaga ggaccccagc agcggctact atagtactac catccgatac 660
caggccactg ggttcggcac taatgagacc gaatacctgt ttgaagtgga caacctgact 720
tatgtccagc tggagagcag gttcaccccc cagtttctgc tgcagctgaa cgaaaccatc 780
tatgccagcg gaaagagatc caatacaact gggaagctga tttggaaagt gaaccctgag 840
atcgacacca caattggaga atgggctttt tgggagacaa agaaaacttc tctggggaag 900
atccggtctg aggaactgag tttcacagct gtgagtaacg gggcaaaaga tatctcagga 960
cagagcccag cacgaacctc ctctgacccc gaaacataca ctaccacaga ggatcacaag 1020
atcatggctt cagaaaatag ttcaaccatg gtgcaggtcc acaaccaggg acgagaggca 1080
gccgtgagcc atctgatcac cctggccaca attagcactt ccccacagag ccccactacc 1140
aagcctggcc aggacaattc cacccataac acaccagtgt ataaactgga tatctctgaa 1200
gccacacagg tcgagcagca ccataggaga actgacaatg attccactgc atctgacacc 1260
ccaccagcaa caactgctgc aggacctcca aaggccgaga atatcaacac ttctaaaagt 1320
gctgacagcc tggaccccgc aaccacaact tccccacaga actactctga gaccgccgga 1380
aacaataaca cccaccatca ggacacaggg gaagaaagtg ctggatcagg gaagctgggc 1440
ctgatcacca atacaattgc tggagtggca ggactgatca ctggaggacg acgaacccga 1500
agggaagcca ttgtgaacgc tcagcccaaa tgcaatccta acctgcacta ctggaccaca 1560
caggacgagg gagcagctat cggactggca tggattccat acttcggccc cgcagccgaa 1620
ggaatctata cagaggggct gatgcataat caggatggac tgatttgtgg gctgaggcag 1680
ctggccaacg aaactaccca ggctctgcag ctgttcctga gggctacaac tgagctgaga 1740
accttttcca tcctgaatcg aaaggcaatt gacttcctgc tgcagagatg gggaggaaca 1800
tgccacatcc tgggaccaga ctgctgtatt gagcctcatg attggacaaa gaacatcact 1860
gacaaaattg atcagatcat tcacgacttt gtggataaga ctctgccaga tcagggggac 1920
aatgataact ggtggaccgg ctggagacag tggattcccg ccggcattgg agtgaccggc 1980
gtcatcattg ccgtgatcgc tctgttctgc atttgtaagt tcgtcttttg ataa 2034
<210> 71
<211> 4991
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pEBOZ CON2，pGX4203
<400> 71
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accgagctcg gatccgccgc caccatgggg attactggga ttctgcagct gccccgagat 780
aggttcaagc gcacttcatt cttcctgtgg gtcattattc tgtttcagag aacctttagc 840
atccccctgg gagtgattca caattcaaca ctgcaggtga gcgacgtcga taagctggtg 900
tgtagagaca aactgagctc caccaaccag ctgcgatccg tcggcctgaa tctggaggga 960
aacggggtgg ccacagatgt cccaagtgct actaagcgct ggggctttcg atcaggagtg 1020
ccccctaaag tggtcaacta cgaggcaggc gaatgggccg agaattgcta taacctggaa 1080
atcaagaaac ctgacggcag cgagtgtctg ccagcagctc ctgatgggat tcggggattc 1140
cccagatgca gatatgtgca caaggtctct ggcacaggac cttgtgctgg cgacttcgca 1200
tttcataaag aaggagcatt ctttctgtac gatcggctgg ccagcaccgt gatctatcgc 1260
ggcaccacat tcgcagaggg agtggtcgcc tttctgattc tgcctcaggc aaagaaagac 1320
ttcttttcta gtcaccctct gcgcgaacca gtgaatgcta cagaggaccc cagcagcggc 1380
tactatagta ctaccatccg ataccaggcc actgggttcg gcactaatga gaccgaatac 1440
ctgtttgaag tggacaacct gacttatgtc cagctggaga gcaggttcac cccccagttt 1500
ctgctgcagc tgaacgaaac catctatgcc agcggaaaga gatccaatac aactgggaag 1560
ctgatttgga aagtgaaccc tgagatcgac accacaattg gagaatgggc tttttgggag 1620
acaaagaaaa cttctctggg gaagatccgg tctgaggaac tgagtttcac agctgtgagt 1680
aacggggcaa aagatatctc aggacagagc ccagcacgaa cctcctctga ccccgaaaca 1740
tacactacca cagaggatca caagatcatg gcttcagaaa atagttcaac catggtgcag 1800
gtccacaacc agggacgaga ggcagccgtg agccatctga tcaccctggc cacaattagc 1860
acttccccac agagccccac taccaagcct ggccaggaca attccaccca taacacacca 1920
gtgtataaac tggatatctc tgaagccaca caggtcgagc agcaccatag gagaactgac 1980
aatgattcca ctgcatctga caccccacca gcaacaactg ctgcaggacc tccaaaggcc 2040
gagaatatca acacttctaa aagtgctgac agcctggacc ccgcaaccac aacttcccca 2100
cagaactact ctgagaccgc cggaaacaat aacacccacc atcaggacac aggggaagaa 2160
agtgctggat cagggaagct gggcctgatc accaatacaa ttgctggagt ggcaggactg 2220
atcactggag gacgacgaac ccgaagggaa gccattgtga acgctcagcc caaatgcaat 2280
cctaacctgc actactggac cacacaggac gagggagcag ctatcggact ggcatggatt 2340
ccatacttcg gccccgcagc cgaaggaatc tatacagagg ggctgatgca taatcaggat 2400
ggactgattt gtgggctgag gcagctggcc aacgaaacta cccaggctct gcagctgttc 2460
ctgagggcta caactgagct gagaaccttt tccatcctga atcgaaaggc aattgacttc 2520
ctgctgcaga gatggggagg aacatgccac atcctgggac cagactgctg tattgagcct 2580
catgattgga caaagaacat cactgacaaa attgatcaga tcattcacga ctttgtggat 2640
aagactctgc cagatcaggg ggacaatgat aactggtgga ccggctggag acagtggatt 2700
cccgccggca ttggagtgac cggcgtcatc attgccgtga tcgctctgtt ctgcatttgt 2760
aagttcgtct tttgataact cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg 2820
actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 2880
ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 2940
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 3000
tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tactgggcgg 3060
ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga 3120
agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat 3180
caagctctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc 3240
acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga 3300
caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt 3360
ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat 3420
cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg 3480
gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg 3540
ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc 3600
cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga 3660
tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag 3720
ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc 3780
atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg 3840
actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata 3900
ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg 3960
ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgaattatta 4020
acgcttacaa tttcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 4080
gcatcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 4140
atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatag 4200
cacgtgctaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 4260
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 4320
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 4380
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 4440
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 4500
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 4560
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 4620
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 4680
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 4740
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 4800
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 4860
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 4920
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 4980
cacatgttct t 4991
<210> 72
<211> 2036
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pZEBOV-GUI DNA编码序列，pGX4202
<400> 72
atgggggtca ccgggattct gcagctgcca agagatagat tcaagcgcac ctcctttttc 60
ctgtgggtca tcatcctgtt tcagagaacc ttttctatcc ccctgggagt gattcacaat 120
tcaacactgc aggtgagcga cgtcgataag ctggtgtgtc gcgacaaact gagctccacc 180
aaccagctgc gaagcgtcgg gctgaatctg gagggaaacg gagtggcaac cgatgtccca 240
agcgcaacaa agagatgggg ctttagatcc ggagtgcccc ctaaagtggt caactacgag 300
gcaggcgaat gggccgagaa ttgctataac ctggaaatca agaaacctga cggatcagag 360
tgtctgcccg ccgctcctga tggcattagg ggattcccaa gatgcagata cgtgcacaag 420
gtcagcggca caggaccctg tgctggcgac ttcgcatttc ataaagaagg agctttcttt 480
ctgtacgatc gactggcaag caccgtgatc tataggggca ccacattcgc cgagggagtg 540
gtcgcttttc tgattctgcc ccaggctaag aaagacttct tttctagtca cccactgagg 600
gaacccgtga acgccacaga ggaccccagc agcggctact atagtactac catcagatac 660
caggccactg ggttcggcac taatgagacc gaatacctgt ttgaagtgga caacctgaca 720
tatgtccagc tggagagccg gttcactcct cagtttctgc tgcagctgaa tgaaaccatc 780
tatgctagcg gaaagcgctc caatacaact gggaagctga tttggaaagt gaacccagag 840
atcgatacca caattggcga atgggccttt cgggagacca agaaaaacct gacacgcaag 900
atccgatctg aggaactgag tttcaccgcc gtgagcaatg ggccaaaaaa catttccggc 960
cagtctcctg ctaggacttc ctctgaccca gaaaccaata ctaccaacga ggatcacaag 1020
atcatggctt ccgagaacag ttcagcaatg gtgcaggtcc acagtcaggg cagaaaagca 1080
gccgtgtcac atctgacaac tctggccaca atctctacta gtcctcagcc acccaccaca 1140
aagacagggc ccgacaattc tacccataac acacctgtgt acaaactgga tatcagtgag 1200
gccacccagg tcggccagca ccataggaga gccgacaatg atagtactgc ttcagacacc 1260
cctccagcaa ctaccgctgc aggcccactg aaggccgaaa atacaaacac ttcaaaaagc 1320
gccgactccc tggatctggc tacaactacc tccccccaga actattctga gaccgctgga 1380
aacaataaca ctcaccatca ggacaccggg gaggaatctg caagctccgg gaagctgggc 1440
ctgatcacca atacaattgc tggagtggca ggactgatca caggaggacg acgaactcga 1500
agagaagtga ttgtcaacgc tcagcctaaa tgcaatccaa acctgcacta ctggacaact 1560
caggacgagg gagcagctat cggactggca tggattccct acttcggccc tgcagccgaa 1620
ggaatctata ttgaggggct gatgcataat caggatggac tgatctgtgg gctgcggcag 1680
ctggcaaacg aaaccacaca ggccctgcag ctgttcctgc gggcaactac cgagctgcgc 1740
acattttcca tcctgaatag aaaggccatt gacttcctgc tgcagcgatg gggaggaacc 1800
tgccacatcc tgggaccaga ctgctgtatt gagccccatg attggacaaa gaacatcact 1860
gacaaaattg atcagatcat tcacgacttt gtggataaga ctctgcctga tcagggggac 1920
aatgataact ggtggaccgg atggcgacag tggattcccg caggaattgg ggtgaccggc 1980
gtcatcattg ccgtgatcgc tctgttctgc atttgtaagt tcgtcttttg ataact 2036

Claims (12)

1.一种编码共有扎伊尔埃博拉病毒包膜糖蛋白免疫原(ZEBOVCON2)的分离的核酸分子，其中：
所述ZEBOVCON2如SEQ ID NO:68所示。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中，所述ZEBOVCON2与IgE信号肽连接。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中编码ZEBOVCON2的所述核酸如SEQ IDNO:70所示。
4.一种组合物，其包含权利要求1至3中任一项的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物进一步包含编码ZEBOVGUI的核酸或编码ZEBOVCON的核酸分子，其中所述ZEBOVCON如SEQ ID NO:1所示，并且所述ZEBOVGUI如SEQ ID NO:67所示。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含编码ZEBOVCON、ZEBOVCON2和ZEBOVGUI的组合的三种核酸分子。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述核酸分子为质粒。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的组合物，其中，所述组合物被配制用于使用电穿孔向个体递送。
9.根据权利要求4-7中任一项所述的组合物，其还包含含有编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的序列的核酸分子：IL-12、IL-15和IL-28。
10.权利要求4-9中任一项所述的组合物在制备用于诱导针对埃博拉病毒的免疫应答的药物中的应用。
11.权利要求4-9中任一项所述的组合物在制备用于治疗已诊断有埃博拉病毒的个体的药物中的应用。
12.权利要求4-9中任一项所述的组合物在制备用于预防个体中的埃博拉病毒感染的药物中的应用。
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