JP2022063261A - Fmr1発現を調節するための組成物および方法 - Google Patents

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histone
epigenetic
epigenetic modulator
methyltransferase
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グリーン,マイケル,アール.
R Green Michael
ファン,ミンカン
Minggang Fang
コートニウク,ウォルター
Kowtoniuk Walter
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University of Massachusetts UMass
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    • C12Y603/02019Ubiquitin-protein ligase (6.3.2.19), i.e. ubiquitin-conjugating enzyme

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Abstract

【課題】本開示は、サイレンシングされたFMR1遺伝子を再活性化するための方法および組成物に関する。【解決手段】いくつかの側面において、本開示によって記載される方法は、FMR1不活性化に関連する異常(例えば脆弱X症候群)を処置することにとって有用である。【選択図】図5

Description

関連出願
本願は、「COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING FMR1 EXPRESSION」と題する2015年9月17日出願のU.S.仮特許出願No.62/220,202の米国特許法第119条(e)の下における優先権を請求し、その内容はそれらの全体が本願に組み込まれる。
本発明は、遺伝子発現を調節するための方法に関する。
脆弱X症候群(FXS)は、学習障害および認知障害を包含する広範な発達問題を引き起こす遺伝学的状態である。FXSは精神遅滞の最もよくある遺伝学的形態であり、4,000人の男性中およそ1人に、8,000人の女性中1人に起こる。通常は、男性はこの異常によって女性よりも重度に冒される。FXSの大多数の男性は軽度から中程度の知的障害を有し、一方で、冒された女性の約3分の1は知的障害である。
FXSは、X連鎖したFMR1遺伝子の5’非翻訳領域(UTR)内の多型CGG配列の増幅(>200リピート)によって引き起こされる。増幅したCGGリピートを負ったFMR1遺伝子は転写サイレンシングされるようになり、脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)の欠如をもたらす。FMRPはRNA結合タンパク質であり、多数のシナプスタンパク質の翻訳を調節する翻訳リプレッサーであり、シナプス可塑性に重要な役割を果たす。
FXSの底にあるメカニズムを標的化するいくつかの治療薬が開発されてきた。それらの指向性の処置のいくつかは、ノックアウトマウスモデルにおいてはFXSの複数の特徴について効能を実証している。しかしながら、有効なヒトの処置は未だ必要とされている。現在までに、FXSに特異的な治療は存在せず、現行の処置は行動症状を改善することのみを対象にしている。それゆえに、FXSを処置するための新規の組成物および方法の開発の一般的必要がある。
いくつかの側面において、本開示は、FMR1不活性化に関連する異常と結びついた疾患(例えばFXS)の処置にとって有用なエピジェネティックなモジュレーターに関する。いくつかの態様において、ここで開示されるエピジェネティックなモジュレーターは、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子のより許容的なクロマチン状態を誘導するので有用である。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、FMR1不活性化に関連する異常(例えばFXS)を有する対象のエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子に、より許容的なクロマチン状態を誘導することは、増大したFMR1発現(例えばFMR1の再活性化)をもたらし、それによって疾患症候を減少または疾患症状を後退させると予想される。いくつかの態様において、サイレンシングされたFMR1遺伝子の再活性化は疾患症状を後退させると予想される。その上に、いくつかの態様において、前変異の無症候性キャリア、および全変異を有するがFMR1がサイレンシングされていない稀な無症候性個人は、正常な個人のものよりも低い脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)レベルを有する。それゆえに、いくつかの態様においては、ここで提供される方法に従うサイレンシングされたFMR1遺伝子の控え目な再活性化でさえも、実質的な治療利益を有し得る。
本発明の側面は、エピジェネティックなモジュレーター(例えば、選択的阻害剤)によるFMR1遺伝子のある種の制御因子の阻害が、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子の再活性化をもたらすという発見に関する。例えば、DNMT1、SUV39H1、EHZ2、RING1B/RNF2、ある種のヒストンデアセチラーゼ(例えば、HDAC5、HDAC10、SIRT5)、および/またはある種のヒストンデメチラーゼ(例えば、KDM5C、KDM5D)の選択的阻害は、転写不活性なFMR1遺伝子の再活性化をもたらす。それゆえに、いくつかの態様において、FMR1遺伝子のエピジェネティックな制御因子の選択的阻害は、転写サイレンシングされたFMR1を再活性化し、それゆえに、FMR1不活性化に関連する異常、例えば脆弱X症候群(FXS)を処置するために有用である。
従って、本開示の側面は、対象のエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子を再活性化する方法に関する。いくつかの態様において、方法は、次の1つのエピジェネティックなモジュレーターを対象に投与することを包含する:DNMT1、SUV39H1、EHZ2、RING1B/RNF2、HDAC5、HDAC10、SIRT5、KDM5C、およびKDM5D。
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはDNMT1を選択的に阻害する(例えば、5-アザシチジン、F6363-1015)。
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはSUV39H1を選択的に阻害する(例えば、ケトシン(chaetocin)、F2740-0099、F6403-3095、F5599-0533)。
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはEZH2を選択的に阻害する(例えば、EPZ6438、GSK126、F2880-2560)。
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはRING1B/RNF2を選択的に阻害する(例えば、PRT4165)。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤である。いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはHDAC5(例えばF6196-0976)、HDAC10(例えばF6196-0976)、SIRT5を選択的に阻害する。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンデメチラーゼの阻害剤である。いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはKDM5CまたはKDM5Dを選択的に阻害する。
いくつかの側面において、本開示は、その必要がある対象のFMR1不活性化に関連する異常を処置するための方法を提供し、方法はFMR1のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量を対象に投与することを含み、エピジェネティックなモジュレーターは対象のFMR1を再活性化する。
いくつかの態様において、FMR1不活性化に関連する異常はFXSである。
いくつかの側面において、本開示は、細胞の転写不活性なFMR1遺伝子を再活性化するための方法を提供し、方法はFMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量と細胞を接触させることを含み、エピジェネティックなモジュレーターは細胞のFMR1を再活性化する。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはメチルトランスフェラーゼの阻害剤である。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼはDNAメチルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、DNAメチルトランスフェラーゼはDNMT1、DNMT3A、およびDNMT3Bからなる群から選択される。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼはヒストンメチルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、ヒストンメチルトランスフェラーゼはEZH2、SETDB1、EHMT1/GLP、EHMT2/G9a、SUV39H1、SUV420H1、およびSUV420H2からなる群から選択される。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンユビキチンリガーゼの阻害剤である。いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼは、ヒストンH2Aをユビキチン化するユビキチンリガーゼである。いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼはRING1B/RNF2である。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターは、FMR1遺伝子における活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾の喪失または不在と結びついたヒストン修飾因子の阻害剤である。従って、いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの使用は、FMR1遺伝子における活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾の存在をもたらす。いくつかの態様において、活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾は、H2A、H2B、H3、およびH4からなる群から選択される少なくとも1つのヒストンのアセチル化である。いくつかの態様において、ヒストン修飾はヒストンH3リジン4のトリメチル化である(H3K4me3)。いくつかの態様において、ヒストン修飾はヒストンH2Aアセチル化(例えば、リジン5における)、ヒストンH2Bアセチル化(例えば、リジン5、12、15、または20における)、ヒストンH3アセチル化(例えば、リジン4における)、ヒストンH4アセチル化(例えば、リジン8における)である。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターは次の少なくとも1つを標的化する:ヒストンデアセチラーゼ(例えば、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7)およびデメチラーゼ(例えば、KDM5A、KDM5B、KDM5C、またはKDM5D)。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターは核酸、ポリペプチド、または小分子(small molecule)である。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターは核酸である。いくつかの態様において、核酸は、二本鎖RNA(dsRNA)、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)からなる群から選択される干渉核酸である。いくつかの態様において、干渉核酸は表2にリスト化されたshRNAである。いくつかの態様において、干渉核酸は表2にリスト化された配列を有するASOである。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはポリペプチド、例えば抗体である。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターは小分子、例えば表1にリスト化された小分子である。
いくつかの態様において、対象は、転写不活性なFMR1遺伝子の存在に基づいて、エピジェネティックなモジュレーターによる処置の必要があるとして同定される。いくつかの態様において、転写不活性なFMR1遺伝子はエピジェネティックにサイレンシングされている。
いくつかの態様において、転写不活性なFMR1遺伝子は、サイレンシングされたFMR1遺伝子と結びついた少なくとも1つのエピジェネティックマークを含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのエピジェネティックマークは、DNAメチル化(DNAme)、ヒストンH3リジン27トリメチル化(H3K27me3)、ヒストンH3リジン9トリメチル化(H3K9me3)、ヒストン4リジン20トリメチル化(H4K20me3)、ヒストンH2Aユビキチン化(H2Aub)からなる群から選択される。
いくつかの態様において、対象は、FMR1遺伝子の5’UTR内の多型CGGリピートの増幅の存在に基づいて、処置の必要があるとして同定される。いくつかの態様において、増幅は、約55個のCGGリピートおよび約200個のCGGリピートの間を含む。いくつかの態様において、増幅は200個よりも多くのCGGリピートを含む。
いくつかの態様においては、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量が対象のCNS、精巣、卵巣、食道上皮、胸腺、眼、または脾臓に送達される。いくつかの態様においては、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量が対象のCNSに送達される。いくつかの態様においては、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量がニューロン細胞に送達される。いくつかの態様において、ニューロン細胞は分化したニューロン細胞である。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量は人工多能性幹細胞(iPSC)に送達される。いくつかの態様において、細胞(例えば、ニューロン細胞、iPSC、神経前駆細胞(NPC))はインビトロである。いくつかの態様において、細胞は、FMR1遺伝子の5’UTR内の多型CGGリピートの増幅、例えば約55および約200個の間のCGGリピートを含む増幅を含む。いくつかの態様において、細胞は、200個よりも多くのCGGリピートを含む増幅を含む。
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターは、FMR1遺伝子とFMR1をコードするmRNAとの間のRループの形成を阻害する。
いくつかの態様において、本開示によって記載される方法は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターを投与する前および/または後の対象のFMR1のエピジェネティックなプロファイルを評価することをさらに含み、FMR1のエピジェネティックなプロファイルの変化は処置の有効性を示す。
いくつかの側面において、本開示は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターを同定するための方法を提供し、方法は、不活性化したFMR1遺伝子を含む細胞を候補薬と接触させることと、細胞のFMR1の発現レベルを検出することと、FMR1の発現レベルが候補薬との接触後にコントロール細胞に対して増大するときに、候補薬をFMR1のエピジェネティックなモジュレーターとして同定することとを含む。
いくつかの態様において、方法は、インビトロで、例えば細胞(例えば、ニューロン細胞、iPSC、神経前駆細胞(NPC))によって実行される。いくつかの態様において、細胞はエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子を有する。いくつかの態様において、細胞は、FMR1遺伝子の5’UTR内の多型CGGリピートの増幅、例えば約55および約200個の間のCGGリピートを含む増幅を含む。いくつかの態様において、細胞は、200個よりも多くのCGGリピートを含む増幅を含む。いくつかの態様において、細胞は、サイレンシングされたFMR1遺伝子と結びついた少なくとも1つのエピジェネティックマークを含む。
いくつかの態様において、候補薬は核酸、ポリペプチド、または小分子である。いくつかの態様において、候補薬は核酸である。いくつかの態様において、核酸は、二本鎖RNA(dsRNA)、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)からなる群から選択される干渉核酸である。いくつかの態様において、候補薬は小分子である。いくつかの態様において、候補薬はポリペプチドである。いくつかの態様において、ポリペプチドは抗体である。
いくつかの態様において、候補薬は化合物ライブラリーから選択される。いくつかの態様において、ライブラリーはメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む。いくつかの態様において、ライブラリーはメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼ阻害剤はDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼ阻害剤はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。
いくつかの態様において、ライブラリーはヒストンユビキチンリガーゼ阻害剤を含む。いくつかの態様において、ライブラリーはヒストンユビキチンリガーゼ阻害剤からなる。いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼはヒストンH2Aをユビキチン化するユビキチンリガーゼである。
いくつかの態様において、候補薬は、FMR1遺伝子における活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾の喪失または不在と結びついたヒストン修飾因子の阻害剤である。いくつかの態様において、活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾は、H2A、H2B、H3、およびH4からなる群から選択される少なくとも1つのヒストンのアセチル化である。いくつかの態様において、ヒストン修飾はヒストンH3リジン4のトリメチル化(H3K4me3)である。
いくつかの態様において、候補薬は、次の少なくとも1つを標的化する(例えば、阻害する):HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、KDM5A、KDM5B、KDM5C、またはKDM5D。
いくつかの態様において、検出は、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)、クロマチン免疫沈降(ChIP)、FACS、バイサルファイトシーケンシング、免疫蛍光などによって実行される。
図1は、サイレンシングされたFMR1遺伝子と結びついたエピジェネティックマークを示している。 図2は、サイレンシングされたFMR1遺伝子と結びついたエピジェネティックマークの潜在的な標的を示している。 図3は、サイレンシングされたFMR1遺伝子のクロマチン修飾因子の阻害剤の候補に基づくスクリーニングの概略図を示している。 図4は、FXS-iPSCのFMR1発現を再活性化するshRNAおよび小分子阻害剤の同定を示している。上パネルは、示されているようにクロマチン修飾因子を対象とする2つの独立のshRNAによって処置されたFXS-iPSCのFMR1の発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。FMR1発現は、1にセットされたコントロールの非サイレンシング(NS)shRNAの発現によって得られたものに対して正規化された。下パネルは、EPZ6438またはGSK126(EZH2の阻害剤)、UNC0638(EHMT2/G9a阻害剤)、およびケトシン(SUV39H1阻害剤)によって処置されたiPSCのFMR1の発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。FMR1発現は、1にセットされた基剤DMSOによる処置によって得られたものに対して正規化された。P<0.05、**P<0.01。 図5は、FMR1遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを媒介する因子のバイアスがない大スケールスクリーニングの概略図を示している。 図6A~6Eは、小スケールの候補に基づくスクリーニングが、患者由来iPSCにおいてFMR1のサイレンシングを媒介するエピジェネティックな制御因子を同定するということを示している。図6Aは、FMR1-SFのshRNAを発現するFXS-iPSCにおいてFMR1の発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。結果は、1にセットされた野生型iPSC(BJ1-iPS4細胞)によって得られたものに対して正規化された。図6Bは、FMR1-SFのshRNAを発現するFXS-iPSCのFMRPタンパク質レベルを示すイムノブロット分析を示している。2倍(野生型の50%のFMRPのレベルを表す)、4倍(25%)、および8倍(12.5%)希釈された野生型iPSCのFMRPのレベルが示されている。チューブリンはローディングコントロールとしてモニターされた。 図6Cは、FMR1-SFのshRNAを発現するFXS-SC135-iPSCにおいてFMR1の発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。結果は、1にセットされたコントロールの非サイレンシング(NS)shRNAによって得られたものに対して正規化された。 図6Dは、FMR1-SFのshRNAを発現するFXS-SC135-iPSCのFMRPタンパク質レベルを示すイムノブロット分析を示している。8倍(12.5%)および16倍(6.25%)希釈された野生型iPSCのFMRPのレベルが示されている。図6Eは、DMSOもしくは5-アザシチジン(azacytine)(5-aza)またはNSもしくはFMR1-SFのshRNAによって処置されたFXS-iPSC(FXS848-iPS3細胞)のFMR1プロモーターのバイサルファイトシーケンシング分析を示している。(上)FMR1プロモーターの概略図。CpGの位置が垂直線によって一定の縮尺で示されている。(下)それぞれの丸はメチル化(黒色)または非メチル化(白色)CpGジヌクレオチドを表している。それぞれの行は単一のクローンを表している。データは平均±SDで表されている。 図7A~7Gは、FMR1-SFが順序立った経路によってエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1と安定に結びつくということを示している。図7Aは、野生型(WT)およびFXS-iPSC(FXS848-iPS3細胞)においてFMR1プロモーターへのFMR1-SFの結合をモニターするChIP分析を示している。ネガティブコントロールとして、結合は恒常発現したAPRTプロモーターでもまたモニターされた。結果は、1にセットされたIgGによって得られたものに対して正規化された。 図7Bは、それぞれのFMR1-SFを標的化するshRNAを発現するFXS-iPSCにおいてFMR1-SFの結合をモニターするChIP分析を示している。 図7Cは、FMR1-SFがFMR1プロモーターに結合する順序立った経路の概要を示している。コファクターの順序が見分けられ得ないステップについては、コファクターは水平に並べられている。図7Dは、FXS-iPSCにおいてサイレンシングされたFMR1プロモーター上のH3K9me3およびH3K27me3のレベルをモニターするChIP分析を示している。 図7Eは、FMR1-SFのshRNAを発現するFXS-iPSCのH3K27me3のChIP分析を示している。図7Fは、FMR1-SFのshRNAを発現するFXS-iPSCのH3K9me3のChIP分析を示している。データは平均±SDで表されている。 図8A~8Fは、FMR1-SFの小分子阻害剤によるエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1の再活性化を示している。図8Aは、5-aza、ケトシン、EPZ6438、GSK126、PRT4165、またはコントロールとしてのDMSOによって処置されたFXS-iPSCにおいてFMR1の発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。結果は、1にセットされた野生型iPSC(BJ1-iPS4細胞)で得られたものに対して正規化された。図8Bは、5-aza、ケトシン(chaetoxin)、EPZ6438、GSK126、またはPRT4165によって処置されたFXS-iPSCにおいてFMRPタンパク質レベルを示すイムノブロット分析である。野生型iPSCのFMRPのレベルが示されている。チューブリンはローディングコントロールとしてモニターされた。 図8Cは、ケトシン(chaetoxin)、EPZ6438、またはPRT4165によって、単独または対の組み合わせどちらかで処置されたFXS-iPSCにおいてFMR1の発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。結果は、1にセットされたDMSOによって得られたものに対して正規化された。図8Dは、EPZ6438の増大して行く濃度によって処置されたFXS-iPSCにおいてFMR1発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。 図8Eは、EPZ6438追加(上)または休薬(下)に引き続いてFXS-iPSCにおいてFMR1発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。 図8Fは、EPZ6438追加(上)または休薬(下)に引き続いてFXS-iPSCにおいてFMR1プロモーターへのDNMT1結合をモニターするChIP分析を示している。データは平均±SDで表されている。 図9A~9Dは、エピジェネティクス指向性ライブラリー(Life Chemicals)から、FMR1を再活性化する追加の小分子阻害剤の同定を示している。図9Aは、エピジェネティクス指向性ライブラリー(Life Chemicals)から得られたFMR1-SF阻害剤によって処置されたFXS-iPSCにおいてFMR1発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。 図9Bは、6つのポジティブな化合物のそれぞれについて再活性化曲線を示している。図9Cはポジティブな化合物の構造を示している。 図9Dは、サイレンシングされたFMR1を再活性化する現在までに同定された全ての小分子阻害剤の概要を示している。データは平均±SDで表されている。 図10A~10Dは、FMR1-SFがFXS神経前駆細胞(NPC)においてもまたFMR1のエピジェネティックなサイレンシングを媒介するということを示している。図10Aは、NSまたはFMR1-SFのshRNAを発現するFXS-NPCにおいてFMR1発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。図10Bは、NSまたはFMR1-SFのshRNAを発現するFXS-NPCにおけるFMRPレベルを示すイムノブロット分析を示している。2倍(50%)、4倍(25%)、および8倍(12.5%)希釈された野生型iPSCにおけるFMRPのレベルが示されている。チューブリンはローディングコントロールとしてモニターされた。 図10Cは、5-aza、ケトシン、EPZ6438、GSK126、PRT4165、またはコントロールとしてのDMSOによって処置されたFXS-NPCにおいてFMR1発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。図10Dは、5-aza、ケトシン、EPZ6438、GSK126、またはPRT4165によって処置されたFXS-NPCにおけるFMRPレベルを示すイムノブロット分析を示している。野生型iPSCのFMRPのレベルが示されている。データは平均±SDで表されている。 図11A~11Gは、FMR1-SFが有糸分裂後FXSニューロンにおいてもまたFMR1のエピジェネティックなサイレンシングを媒介するということを示している。図11Aは、FXS848-NPCに由来する有糸分裂後ニューロンにおけるニューロンマーカーMAP2およびNeuNの発現を示す免疫蛍光を図示している。図11Bは、有糸分裂後ニューロンにおける有糸分裂マーカーリン酸化H3を対象とする抗体による染色の欠如を示す画像を与えている。 図11Cは、NSまたはFMR1-SFのshRNAを発現するFXSニューロンにおいてFMR1発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。図11Dは、NSまたはFMR1-SFのshRNAを発現するFXSニューロンにおけるFMRPレベルを示すイムノブロット分析を示している。野生型iPSCのFMRPのレベルが示されている。 図11Eは、5-aza、ケトシン、EPZ6438、GSK126、PRT4165、またはコントロールとしてのDMSOによって処置されたFXSニューロンにおいてFMR1発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。図11Fは、5-aza、ケトシン、EPZ6438、GSK126、またはPRT4165によって処置されたFXSニューロンにおけるFMRPレベルを示すイムノブロット分析を示している。野生型iPSCのFMRPのレベルが示されている。 図11Gは、EPZ6438追加(上)または休薬(下)に引き続いてFXSニューロンにおいてFMR1発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。データは平均±SDで表されている。 図12A~12Fは、FMR1再活性化が機能異常FXSニューロン表現型を正常化し得るということを示している。図12Aは、FMR1-SFのshRNAを発現するかまたはFMR1-SF阻害剤によって処置されたFXSニューロンにおいてREST発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。野生型ニューロンのFMR1の発現が示されている。図12Bは、FMR1-SFのshRNAを発現するかまたはFMR1-SF阻害剤によって処置されたFXSニューロンにおいてREST標的遺伝子ROBO3、SLIT1、およびDCCの発現をモニターするqRT-PCR分析を示している。野生型ニューロンのそれぞれの遺伝子の発現が示されている。 図12Cは、FMR1-SFのshRNAを発現するかまたはFMR1-SF阻害剤によるFXSニューロンにおけるFMRPレベルを示すイムノブロット分析を示している。野生型ニューロンのFMRPのレベルが示されている。 図12Dは、FMR1-SFのshRNAを発現するFXSニューロンにおけるTUJ1およびFMRP染色を示す免疫蛍光を図示している。DAPI染色は青色で示されている。マージ画像が示されている。TUJ1染色の拡大画像が右に示されている。 図12Eは、FMR1-SF阻害剤によって処置されたFXSニューロンにおけるTUJ1およびFMRP染色を示す免疫蛍光を図示している。DAPI染色が示されている。マージ画像が示されている。TUJ1染色の拡大画像が右に示されている。 図12Fは、FMR1-SFのshRNAを発現するかまたはFMR1-SF阻害剤によって処置されたFXSニューロンにおける神経突起の突起長の定量を示している。結果は、1にセットされた野生型ニューロンの神経突起の突起長に対して正規化された。データは平均±SDで表されている。
いくつかの側面において、本発明は、FMR1不活性化に関連する異常(例えばFXS)を有する患者のエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子に、より許容的なクロマチン状態を誘導することが、FMR1の増大した発現と減少または後退した疾患症候とをもたらし得るという驚くべき発見に関する。いくつかの態様において、本開示によって記載される方法および組成物は、例えばRNA干渉(RNAi)によって媒介されるノックダウンまたは小分子阻害剤によって、FMR1遺伝子のエピジェネティックなサイレンシング因子を阻害する。いくつかの態様において、サイレンシングされたFMR1遺伝子の再活性化は疾患症状を後退させると予想される。その上に、いくつかの態様において、前変異(55~200個のCGGリピート)の無症候性キャリア、および全変異を有するがFMR1がサイレンシングされていない稀な無症候性の個人は、正常な個人のものの~20%であるFMRPレベルを有する。それゆえに、いくつかの態様においては、ここで提供される方法に従うサイレンシングされたFMR1遺伝子の控え目な再活性化でさえも、実質的な治療利益を有し得る。第2に、いくつかの態様において、ここで提供される方法を用いて脳の翻訳ホメオスタシスを回復または改善することは、FXSに関連する主症状を好転させ得る。いくつかの態様において、Fmr1KOマウスの脳における単なる15%のタンパク質合成の上昇は疾患の表現型を促進し、総体的な翻訳を比較的小量低減することが臨床的に有益であろうということを示している。この観察と一致して、原核生物リボソームと、それ程ではないものの真核生物リボソームとに結合し、阻害するテトラサイクリン群の抗生物質、ミノサイクリンは、化合物によって処置されたFXS患者において控え目だがポジティブなアウトカムをもたらした。
従って、いくつかの側面において、本開示は、その必要がある対象のFMR1不活性化に関連する異常を処置するための方法を提供し、方法は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量を対象に投与することを含み、エピジェネティックなモジュレーターは対象のFMR1を再活性化する。
FMR1不活性化に関連する異常
ここで用いられる用語「FMR1不活性化に関連する異常」は、FMR1遺伝子の転写不活性化からもたらされる疾患または異常を言う。一般的に、FMR1遺伝子の不活性化は脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)の産生の喪失をもたらし、学習障害および認知障害、中程度から重度の精神遅滞、運動失調(例えば、協調の喪失)、振戦、記憶喪失、下肢の感覚の喪失(例えば、末梢ニューロパチー)、精神的および行動的変化、ならびに多嚢胞性卵巣症候群を包含する広範な発達問題を引き起こす。いくつかの態様において、FMR1不活性化に関連する異常は脆弱X症候群(FXS)である。
FXSは、X連鎖したFMR1遺伝子の5’非翻訳領域(5’UTR)内の多型CGG配列の増幅によって引き起こされる。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、増幅したCGGリピートを負ったFMR1遺伝子は、阻害性のヒストン修飾およびDNA過剰メチル化が原因で転写サイレンシングされるようになり、脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)の欠如をもたらす。いくつかの態様において、FMR1遺伝子は、FMR1のmRNAの増幅したCGGリピートとFMR1遺伝子の相補的なCGGリピートとの間のmRNA-DNA二重螺旋(例えば「Rループ」)の形成が原因で、転写サイレンシングされるようになる。
FXSは精神的不全の最もよくある遺伝性の形態であり、自閉症の最も優勢な単因子性の原因であり、4,000人の男性中~1人、8,000人の女性中1人に起こる。FXSの個人は、低いIQ、言語および発達遅延、注意欠陥異常、手のフラッピング、ならびに発作を包含する広範な症状を見せる。いくつかの態様において、症候群はX連鎖したFMR1遺伝子の5’非翻訳領域内のCGGリピート増幅によって引き起こされる。増幅が200リピート以上に達するときに、FMR1は転写サイレンシングされる。いくつかの態様においては、帰結として、FMR1の産物の脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)が産生されない。FMRPは、正常では脳および他の組織におけるmRNA翻訳を抑制するRNA結合タンパク質である。その不在下においてはタンパク質合成が過剰であり、これは疾患病理をもたらす。いくつかの態様において、FMRPの欠如および上昇したタンパク質合成は原因としてシナプス弱化にリンクしており、これは長期抑圧(LTD)として電気生理学的に測定される。いくつかの態様において、抑圧されたシナプス接続性は、神経回路機能異常ならびに学習および記憶などの高次認知機能の障害を引き起こす。
一般的に、FMR1不活性化に関連する異常の重さは、対象のFMR1遺伝子の5’UTR内に存在する多型CGGリピートの数によって分類され得る。増幅中のリピートの数は様々であり得る。いくつかの態様において、増幅中のCGGリピートの数は約55から約500リピートの範囲である。いくつかの態様において、対象は「前変異」と言われ、CGGリピートの数は約55リピートから約200リピートの範囲である。前変異の対象は全変異状態への転換を受けやすく、それゆえに、正常アレルを有する(例えば6および54個の間のCGGリピートを有する)対象と比較してFXSを発生する増大したリスクがある。いくつかの態様において、CGGリピートの数は200リピート超であり、対象は「全変異」を有すると言われる。全変異の対象はFXSを有する。いくつかの態様において、FXSを有する対象におけるCGGリピートの数は約201から約500リピートの範囲である。いくつかの態様において、CGGリピートの数は500リピート超である。
典型的には、転写不活性な(例えば、サイレンシングされた)FMR1遺伝子と結びついたいくつかのエピジェネティックマークがある(図1)。ここで用いられる用語「エピジェネティックマーク」は、遺伝暗号によって直接的には支配されない遺伝子の特徴または特質、例えばDNAのメチル化およびヒストンタンパク質の共有結合的修飾を言う。一般的に、エピジェネティックマークはクロマチン状態を改変することによって遺伝子の発現に影響を及ぼす。エピジェネティックマークは活性化のマーク(例えば、遺伝子の発現を促進する)または抑制性のマーク(例えば、遺伝子の発現を阻害する)であり得る。
いくつかの側面において、本発明は、サイレンシングされたFMR1上にはいくつかの抑制性のマークの増大があるという発見に関する。サイレンシングされたFMR1上に検出される抑制性のマークの例は、DNAメチル化、ヒストンH3リジン27トリメチル化(H3K27me3)、ヒストンH3リジン9トリメチル化(H3K9me3)、およびヒストンH4リジン20トリメチル化(H4K20me3)を包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、サイレンシングされたFMR1上にはヒストンH2Aユビキチン化(H2Aub)の増大がある。
いくつかの側面において、本発明は、サイレンシングされたFMR1においては活性化のマークの減少があるという発見に関する。サイレンシングされたFMR1上に一般的に検出されない活性化のマークの例は、ヒストン(H2A/2B/3/4)アセチル化およびヒストンH3リジン4トリメチル化(H3K4me3)を包含するが、これに限定されない。
いくつかの側面において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量の投与は、対象のFMR1の再活性化をもたらす。ここで用いられる用語「FMR1の再活性化」は、転写不活性な(例えば、サイレンシングされた)状態から転写活性な(例えば、発現された)状態へのFMR1遺伝子の状態の変化を言う。例えば、転写不活性な(例えば、サイレンシングされた)FMR1遺伝子を有する対象(例えば、対象の細胞)は、FMRPを欠く。対象(例えば、対象の細胞)のFMR1の再活性化はFMRPの発現および産生に至る。FMR1の再活性化は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターによる処置に先立つ検体におけるFMR1の発現レベルに対して、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターによる処置後の検体(例えば、細胞または対象)におけるFMR1の発現レベルとして測定され得る。FMR1の再活性化は、当分野において公知のいずれかの好適な方法によって、例えばハイブリダイゼーションに基づくアッセイ(例えば、RT-PCR、qRT-PCR、ノーザンブロット)、タンパク質に基づく方法(例えばウエスタンブロット)、分光法的方法(例えば質量分析)、核酸に基づく方法(例えば、バイサルファイトシーケンシング)、および細胞に基づく方法(例えば、フローサイトメトリー、蛍光セルソーティング(FACS)、免疫蛍光)によって測定され得る。
FMR1のエピジェネティックなモジュレーター
ここで用いられる用語「FMR1のエピジェネティックなモジュレーター」は、FMR1の転写活性を改変する薬を言う。例えば、いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはFMR1の転写活性を増大させる。増大した転写活性は一般的に、mRNAの増大した産生および/または増大したタンパク質翻訳(例えば、FMRPの翻訳)をもたらす。いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはFMR1のクロマチン状態を変化させる。エピジェネティックなモジュレーターはFMR1の転写活性を直接的に改変し得るか、またはFMR1遺伝子の発現および/もしくはエピジェネティックな状態を調節する別の因子(例えばタンパク質)と相互作用することによってFMR1転写活性を間接的に改変し得る。いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターは、FMR1の転写活性を調節する別のタンパク質の発現レベルまたは活性(例えば機能)を阻害する。例えば、いくつかの態様において、サイレンシングされたFMR1はDNAメチルトランスフェラーゼ1(DNMT1)による増大したDNAメチル化を有する。それゆえに、いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはDNMT1活性または発現を阻害する薬である。いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターは、核酸、ポリペプチド、小分子、または前述のいずれかの組み合わせであり得る。エピジェネティックなモジュレーターは、ここではエピジェネティックな修飾因子ともまた言われる。
細胞のクロマチン状態(例えば、ヒストンおよび非ヒストンタンパク質によるDNAのパッケージング)は遺伝子発現に及ぼす有意な効果を有する。いくつかの態様において、本開示は、ノックダウンまたは阻害されたときに細胞(例えば、ニューロン細胞またはiPSC)のFMR1遺伝子の発現を活性化するクロマチン修飾因子に関する。いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはかかるクロマチン修飾因子を標的化する。ここで用いられる用語「クロマチン修飾因子」は、DNAを修飾するか(例えば、メチル化による)またはヒストンタンパク質を翻訳後修飾し(例えば、リン酸化、アセチル化、メチル化、もしくはユビキチン化による)、クロマチン構造の改変と、それゆえに改変された遺伝子発現とをもたらす物質(例えば、酵素または転写因子)を言う。クロマチン修飾因子の例は、DNAメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンユビキチンリガーゼ、およびヒストンアセチルトランスフェラーゼを包含するが、これに限定されない。クロマチン修飾因子のさらなる例が図2に示されている。
ここで用いられる用語「DNAメチルトランスフェラーゼ」は、DNAへのメチル基の転移を触媒する酵素を言う。DNAメチルトランスフェラーゼの例はDNMT1、DNMT3A、およびDNMT3Bを包含するが、これに限定されない(図2)。いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。DNAメチルトランスフェラーゼの小分子阻害剤の例が表1に示されている。
ここで用いられる用語「ヒストンメチルトランスフェラーゼ」は、ヒストンタンパク質へのメチル基の転移を触媒する酵素を言う。ヒストンメチルトランスフェラーゼの例は、EZH2、SETDB1、EHMT1/GLP、EHMT2/G9a、SUV39H1、SUV420H1、およびSUV420H2を包含するが、これに限定されない(図2)。いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。ヒストンメチルトランスフェラーゼの小分子阻害剤の例が表1に示されている。
ここで用いられる用語「ヒストンユビキチンリガーゼ」は、ユビキチンをローディングされたE2ユビキチン結合酵素をリクルートメントし、タンパク質基質(例えば、ヒストンタンパク質)を認識し、E2からタンパク質基質(例えばヒストンタンパク質)へのユビキチンの転移を助けるかまたは直接的に触媒する酵素を言う。いくつかの態様において、本開示はE3ユビキチンリガーゼ酵素の阻害剤に関する。E3ユビキチンリガーゼは一般的に4つのファミリーに分けられる(HECT、RINGフィンガー、Uボックス、およびPHDフィンガー)。いくつかの態様において、本開示はRINGユビキチンリガーゼ酵素の阻害剤に関する。いくつかの態様において、本開示はヒストン2A(H2A)ユビキチンリガーゼ酵素(例えばRING1B/RNF2)の阻害剤に関する。ユビキチンリガーゼ酵素の小分子阻害剤の例が表1に示されている。
Figure 2022063261000002
ここで用いられる用語「ヒストンアセチルトランスフェラーゼ」は、ヒストンタンパク質上の保存されたリジン残基へのアセチル基の転移を触媒する酵素を言う。一般的に、ヒストンアセチル化は活性なエピジェネティックマーカーとして機能する。いくつかの側面において、本発明は、ヒストンアセチル化が、サイレンシングされたFMR1では低減されているという発見に関する。それゆえに、いくつかの側面において、本発明は、ヒストンアセチル化の阻害因子を阻害するFMR1のエピジェネティックなモジュレーターに関する。例えば、ヒストンデアセチラーゼはヒストンタンパク質からアセチル基を除去する。ヒストンデアセチラーゼの例は、ヒストンデアセチラーゼ1~10(HDAC1~HDAC10)、サーチュイン1~7(SIRT1~7)、およびリジン特異的デメチラーゼ5A~5D(KDM5A~D)を包含するが、これに限定されない(図2)。いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンデアセチラーゼの阻害剤である。ヒストンデアセチラーゼの小分子阻害剤の例は表1に示されている。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターは選択的阻害剤である。ここで用いられる「選択的阻害剤」または「選択的に阻害する」と言われる阻害剤は、特定のクラスの標的分子の活性または発現を、クラスの他の分子と比較して選好的に阻害する阻害剤を言う。いくつかの態様において、特定のクラスの標的分子の選択的阻害剤は、クラスの1つ以上の他のメンバーに対するIC50よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、または少なくとも50倍低い標的分子に対する半数阻害濃度(IC50)を有する。選択的阻害剤は、メチルトランスフェラーゼ(例えば、DNAメチルトランスフェラーゼもしくはヒストンメチルトランスフェラーゼ)、ヒストンユビキチンリガーゼ(例えば、ヒストンH2Aをユビキチン化するユビキチンリガーゼ)、ヒストンデアセチラーゼ(例えば、HDAC、SIRT5)、またはヒストンデメチラーゼ(例えば、KDM5D)の阻害剤であり得る。
いくつかの態様において、選択的阻害剤はDNAメチルトランスフェラーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、DNAメチルトランスフェラーゼであるDNMT1の選択的阻害剤は、1つ以上の他のDNAメチルトランスフェラーゼに対するIC50よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、または少なくとも50倍低いDNMT1に対する半数阻害濃度(IC50)を有する。しかしながら、いくつかの態様において、DNAメチルトランスフェラーゼの阻害剤はクラスのいずれか1つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ1つよりも多くのメンバーを標的化、例えばDNAメチルトランスフェラーゼの汎阻害剤として機能する。
いくつかの態様において、選択的阻害剤はヒストンメチルトランスフェラーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、ヒストンメチルトランスフェラーゼはSUV39H1である。いくつかの態様において、ヒストンメチルトランスフェラーゼはEPZ2である。いくつかの態様において、SUV39H1の選択的阻害剤は、1つ以上の他のヒストンメチルトランスフェラーゼに対するIC50よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、または少なくとも50倍低いSUV39H1に対する半数阻害濃度(IC50)を有する。いくつかの態様において、EPZ2の選択的阻害剤は、1つ以上の他のヒストンメチルトランスフェラーゼに対するIC50よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、または少なくとも50倍低いEPZ2に対する半数阻害濃度(IC50)を有する。しかしながら、いくつかの態様において、ヒストンメチルトランスフェラーゼの阻害剤はクラスのいずれか1つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ1つよりも多くのメンバーを標的化、例えばヒストンメチルトランスフェラーゼの汎阻害剤として機能する。
いくつかの態様において、選択的阻害剤はヒストンユビキチンリガーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼであるRING1B/RNF2の選択的阻害剤は、1つ以上のヒストンユビキチンリガーゼに対するIC50よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、または少なくとも50倍低いRING1B/RNF2に対する半数阻害濃度(IC50)を有する。しかしながら、いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼの阻害剤はクラスのいずれか1つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ1つよりも多くのメンバーを標的化、例えばヒストンユビキチンリガーゼの汎阻害剤として機能する。
いくつかの態様において、選択的阻害剤はヒストンデアセチラーゼ(例えば、HDACまたはSIRT5)を選択的に阻害する。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼであるHDAC5の選択的阻害剤は、1つ以上のヒストンデアセチラーゼに対するIC50よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、または少なくとも50倍低いHDAC5に対する半数阻害濃度(IC50)を有する。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼであるHDAC10の選択的阻害剤は、1つ以上のヒストンデアセチラーゼに対するIC50よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、または少なくとも50倍低いHDAC10に対する半数阻害濃度(IC50)を有する。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼであるSIRT5の選択的阻害剤は、1つ以上のヒストンデアセチラーゼに対するIC50よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、または少なくとも50倍低いSIRT5に対する半数阻害濃度(IC50)を有する。しかしながら、いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤はクラスのいずれか1つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ1つよりも多くのメンバーを標的化、例えばヒストンデアセチラーゼの汎阻害剤として機能する。
いくつかの態様において、選択的阻害剤はヒストンデメチラーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、ヒストンデメチラーゼであるKDM5DまたはKDM5Cの選択的阻害剤は、1つ以上の他のヒストンデメチラーゼに対するIC50よりも少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、または少なくとも50倍低いKDM5DまたはKDM5Cに対する半数阻害濃度(IC50)を有する。しかしながら、いくつかの態様において、ヒストンデメチラーゼの阻害剤はクラスのいずれか1つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ1つよりも多くのメンバーを標的化、例えばヒストンデメチラーゼの汎阻害剤として機能する。
いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターは干渉RNAである。干渉RNAの例は、二本鎖RNA(dsRNA)、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を包含するが、これに限定されない。阻害性オリゴヌクレオチドは遺伝子発現、転写、および/または翻訳に干渉し得る。一般的に、阻害性オリゴヌクレオチドは相補性の領域によって標的ポリヌクレオチドに結合する。例えば、標的ポリヌクレオチドへの阻害性オリゴヌクレオチドの結合は、(dsRNA、siRNA、shRNAなどのケースにおいては)標的ポリヌクレオチドのRNAi経路によって媒介される分解の引き金になり得るか、または翻訳機構をブロックし得る(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)。阻害性オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAである。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、およびmiRNAからなる群から選択される。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは修飾核酸である。
用語「ヌクレオチドアナログ」または「改変ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを包含する非標準的なヌクレオチドを言う。いくつかの態様において、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドのある種の化学特性を改変しながらも、その意図される機能を実行するヌクレオチドアナログの能力を保持するように、いずれかの位置において修飾されている。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例は、5位、例えば5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン、5-プロピンウリジン、5-プロペニルウリジンなど;6位、例えば6-(2-アミノ)プロピルウリジン;アデノシンおよび/またはグアノシンの8位、例えば8-ブロモグアノシン、8-クロログアノシン、8-フルオログアノシンなどを包含する。ヌクレオチドアナログは、デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ-アデノシン;OおよびN修飾(例えばアルキル化、例えばN6-メチルアデノシン、または当分野において別様に公知の)ヌクレオチド;ならびに他のヘテロ環修飾されたヌクレオチドアナログ、例えばHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載されているものをもまた包含する。
ヌクレオチドアナログはヌクレオチドの糖部分の修飾をもまた含み得る。例えば、2’OH基はH、OR、R、F、Cl、Br、I、SH、SR、NH、NHR、NR、COOR、またはORから選択される基によって置き換えられ得、式中、Rは置換または無置換C.sub.1-C.sub.6アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の可能な修飾は、U.S.Pat.No.5,858,988および6,291,438に記載されているものを包含する。多くの場合にインアクセシブルRNAと言われるロックド核酸(LNA)は修飾RNAヌクレオチドである。LNAヌクレオチドのリボース部分は2’酸素および4’炭素を接続する余分の架橋によって修飾されている。
ヌクレオチドのリン酸基もまた、例えばリン酸基の酸素の1つ以上を硫黄によって置換することによって(例えば、ホスホロチオエート)、またはヌクレオチドがその意図される機能を実行することを許す他の置換をすることによって修飾され得、例えば、例えばEckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2): 117-21、Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5): 333-45、Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25、Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2): 77-85、およびU.S.Pat.No.5,684,143に記載されている。上で参照されている修飾のある種のもの(例えば、リン酸基修飾)は、好ましくは、インビボまたはインビトロにおいて例えば前記アナログを含むポリヌクレオチドの加水分解の速度を減少させる。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは阻害性の修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、阻害性の修飾オリゴヌクレオチドはロックド核酸(LNA)、ホスホロチオエートバックボーン、および/または2’-OMe修飾を含む。下の表2は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターである干渉RNAの例を提供している。
Figure 2022063261000003
処置の方法
いくつかの側面において、本開示は、FMR1不活性化に関連する異常を有する対象を処置するための方法を提供する。例えば、FMR1遺伝子の転写不活性化は対象のFXSに至り得る。ここで用いられる「対象」は「その必要がある対象」と交換可能であり、この両方は、FMR1不活性化に関連する異常を有する対象、または母集団全般に対してかかる異常を発生する増大したリスクを有する対象を言い得る。その必要がある対象は、不活性なFMR1遺伝子を有する対象であり得る。対象はヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、猫、犬、または他の哺乳動物であり得る。いくつかの態様において、FMR1不活性化に関連する異常は脆弱X症候群、脆弱X随伴振戦/失調症候群、早発性の卵巣老化、または多嚢胞性卵巣症候群である。
ここで用いられる用語「処置」、「処置する」、および「治療」は、治療処置および予防的もしくは防止的操作を言う。用語は、さらに、既存の症状を好転させること、追加の症状を防止すること、症状の底にある原因を好転させるかまたは防止すること、症状、例えばFMR1不活性化に関連する異常に関連する症状の原因を防止するかまたは後退させることを包含する。それゆえに、用語は、有益な結果が、異常(例えば、FMR1不活性化に関連する異常)を有するかまたはかかる異常を発生するポテンシャルを有する対象に授けられたということを意味する。さらにその上に、用語「処置」は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する易罹患性を治癒する、癒す、緩和する、軽減する、改変する、治す、好転させる、改善する、またはそれに影響する目的による、疾患、疾患の症状、または疾患に対する易罹患性を有し得る対象または対象からの単離された組織もしくは細胞株への薬(例えば、治療薬または治療組成物)の適用または投与として定義される。
治療薬または治療組成物は、特定の疾患(例えば、FMR1不活性化に関連する異常)の症状を防止および/または低減する医薬的に許容される形態の化合物を包含し得る。例えば、治療組成物は、FMR1不活性化に関連する異常の症状を防止および/または低減する医薬組成物であり得る。本発明の治療組成物はいずれかの好適な形態で提供されるであろうということが企図される。治療組成物の形態は、本願に記載される投与モードを包含するいくつもの因子に依存するであろう。治療組成物は本願に記載される他の成分のなかでも希釈剤、アジュバント、および賦形剤を含有し得る。
いくつかの側面において、本開示は、細胞の転写不活性なFMR1遺伝子を再活性化ための方法を提供し、方法は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量と細胞を接触させることを含み、エピジェネティックなモジュレーターは細胞のFMR1を再活性化する。いくつかの態様において、細胞はインビトロである。
FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量と接触させられる細胞は、転写不活性なFMR1遺伝子を有するいずれかの細胞であり得る。例えば、細胞は脳細胞、精巣細胞、卵巣細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、または眼細胞であり得る。いくつかの態様において、細胞は人工多能性幹細胞(iPSC)である。転写不活性なFMR1遺伝子を有する細胞は、一般的には、転写不活性な(例えば、エピジェネティックにサイレンシングされた)FMR1遺伝子を有することの指標である1つ以上のエピジェネティックマークを負っている。エピジェネティックマークは、活性化のマーク、抑制性のマーク、または活性化のマークおよび抑制性のマークであり得る。転写不活性なFMR1遺伝子と結びついたエピジェネティックな抑制性のマークの例は、DNAメチル化(DNAme)、ヒストンH3リジン27トリメチル化(H3K27me3)、ヒストンH3リジン9トリメチル化(H3K9me3)、ヒストン4リジン20トリメチル化(H4K20me3)、ヒストンH2Aユビキチン化(H2Aub)を包含する。転写不活性なFMR1上において低減されたレベルで見出される活性化のエピジェネティックマークの例は、ヒストンH2aアセチル化、ヒストンH2Bアセチル化、ヒストンH3アセチル化、ヒストンH4アセチル化、およびヒストンH3リジン4トリメチル化(H3K4me3)を包含する。
転写不活性なFMR1遺伝子を有する細胞は、FMR1遺伝子の5’UTR内の多型CGGリピートの増幅をもまた含み得る。増幅中のリピートの数は様々であり得る。いくつかの態様において、増幅中のCGGリピートの数は約55から約500リピートの範囲である。いくつかの態様において、CGGリピートの数は約55リピートから約200リピートの範囲である。いくつかの態様において、CGGリピートの数は約100から約500リピートの範囲である。いくつかの態様において、CGGリピートの数は200リピート超である。いくつかの態様において、CGGリピートの数は500リピート超である。
医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターを含む医薬組成物に関する。いくつかの態様において、組成物はFMR1のエピジェネティックなモジュレーターと医薬的に許容されるキャリアとを含む。ここで用いられる用語「医薬的に許容されるキャリア」は、医薬投与と適合性のいずれかおよび全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤、ならびに同類を包含することが意図される。医薬活性物質へのかかる媒質および薬剤の使用は当分野において周知である。いずれかの従来の媒質または薬剤が活性化合物と非適合性である限りを除いて、組成物へのその使用は企図される。補足の活性化合物もまた組成物中に組み込まれ得る。医薬組成物は下に記載されているように調製され得る。活性成分は、いずれかの従来の医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤に混ぜられるかまたはそれと調合され得る。組成物は無菌であり得る。
典型的には、医薬組成物は、薬(例えば、FMR1のエピジェネティックなモジュレーター)の有効量を送達するために製剤される。一般的に、活性薬の「有効量」は、所望の生物学的応答(例えば、不活性なFMR1遺伝子の再活性化)を誘発するために十分な量を言う。薬の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、処置されようとする疾患(例えば、FMR1不活性化に関連する異常)、投与モード、および患者などの因子に依存して様々であり得る。
組成物は、その投与がレシピエントの患者によって忍容され得る場合には「医薬的に許容されるキャリア」であると言われる。無菌のリン酸緩衝食塩水は医薬的に許容されるキャリアの1つの例である。他の好適なキャリアは当分野において周知である。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990)参照。
活性薬に対して不活性であり、かつ従来使用されているいずれかの投与モード、基剤、またはキャリアが、本開示の医薬組成物を調製および投与するために利用され得るということは当業者によって理解されるであろう。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 4th ed. (1970)に記載されているものはかかる方法、基剤、およびキャリアの実例であり、その開示は参照によって本願に組み込まれる。本開示の原理に触れた当業者は、好適および適切な基剤、賦形剤、およびキャリアを決定する上で、またはそれを活性成分と調合して本開示の医薬組成物を形成する上で困難を感じないであろう。
化合物(例えば、アンチセンス核酸(例えばオリゴヌクレオチド)または小分子のFMR1のエピジェネティックなモジュレーター)の有効量は、治療有効量ともまた言われ、かかる調節の必要がある細胞または個人において遺伝子の不活性化(例えば転写不活性化)または低減された発現に関連する少なくとも1つの有害な効果を好転させるために十分な量である。いくつかの態様において、有効量は、FMR1再活性化の必要がある細胞または個人のFMR1遺伝子を再活性化するために十分な量である。医薬組成物中に包含されるべき治療有効量は、それぞれのケースにおいて、いくつかの因子、例えば、処置されようとする患者の型、サイズ、および状態、意図される投与モード、意図される剤形を組み込む患者の受容能力などに依存する。一般的に、活性薬の量は、約0.1から約250mg/kg、好ましくは約0.1から約100mg/kgを提供するようにそれぞれの剤形中に包含される。当業者は、適切な治療有効量を経験的に決定する能力があるであろう。
ここで提供される教示と組み合わせて、種々の活性化合物および検討因子、例えば力価、相対的なバイオアベイラビリティー、患者体重、有害な副作用の重さ、および選択される投与モードから選ぶことによって、実質的な毒性を引き起こさず、それでも特定の対象を処置するために全く有効である有効な予防または治療処置レジメンが計画され得る。いずれかの特定の適用のための有効量は、処置されようとする疾患もしくは状態、投与されようとする特定の治療薬、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重さなどの因子に依存して様々であり得る。当業者は、過度の実験作業を要することなしに、特定の核酸および/または他の治療薬の有効量を経験的に決定し得る。
いくつかのケースにおいて、本開示の化合物はコロイド分散系に調製される。コロイド分散系は、水中油滴エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを包含する脂質に基づく系を包含する。いくつかの態様において、本開示のコロイド系はリポソームである。リポソームは人工の膜ベッセルであり、それらはインビボまたはインビトロの送達ベクターとして有用である。サイズが0.2~4.0μmの範囲である大型一枚膜ベシクル(LUV)が大きい高分子をカプセル化し得るということが示されている。RNA、DNA、および完全なビリオンは水系の内部にカプセル化され、生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る。Fraley et al. (1981) Trends Biochem Sci 6:77.
リポソームは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質などの特異的リガンドにリポソームをカップリングすることによって、特定の組織に標的化され得る。リポソームを例えば平滑筋細胞に標的化することにとって有用であり得るリガンドは、癌細胞の細胞表面マーカーと相互作用する抗体などの、平滑筋細胞特異的受容体および分子と相互作用する完全な分子または断片を包含するが、これに限定されない。かかるリガンドは当業者に周知の結合アッセイによって容易に同定され得る。尚他の態様において、リポソームは、当分野において公知の抗体にそれをカップリングすることによって組織に標的化され得る。
トランスフェクションのための脂質製剤はQIAGENから例えばEFFECTENE(商標)(特殊なDNA凝縮エンハンサーを有する非リポソーム系脂質)およびSUPERFECT(商標)(新規作用のデンドリマーテクノロジー)として市販されている。
リポソームはGibco BRLから例えばLIPOFECTIN(商標)およびLIPOFECTACE(商標)として市販されており、それらはN-[1-(2,3ジオレイルオキシ)-プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)などのカチオン性脂質から形成されている。リポソームを作るための方法は当分野において周知であり、多くの刊行物に記載されている。リポソームはGregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241によってもまた概説されている。
特にN-[1-(2,3ジオレイルオキシ)-プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(DOTAP)を包含するある種のカチオン性脂質は、本開示のFMR1のエピジェネティックなモジュレーター(例えば干渉RNA)と組み合わされるときに有利であり得る。
本開示のいくつかの側面においては、コンパクション剤の使用もまた望ましくあり得る。コンパクション剤は、単独で、または生物学的もしくは化学的/物理的ベクターとの組み合わせでもまた用いられ得る。ここで用いられる「コンパクション剤」は、核酸上の負電荷を中和し、それによって微粒子への核酸のコンパクションを可能にするヒストンなどの物質を言う。核酸のコンパクションは標的細胞による核酸の取り込みを容易化する。コンパクション剤は、例えば細胞によってより効率的に取り込まれる形態のFMR1のエピジェネティックなモジュレーターを送達するために単独で、または上に記載されているキャリアの1つ以上との組み合わせで用いられ得る。
FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの取り込みを容易化するために用いられ得る他の例示的な組成物は、リン酸カルシウムおよび細胞内輸送の他の化学的メディエータ、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションおよび相同組換え組成物(例えば、標的細胞の染色体内の予め選択された場所に核酸をインテグレーションするため)を包含する。
化合物は、単独で(例えば、食塩水もしくは緩衝液中で)、または当分野において公知のいずれかの送達基剤を用いて投与され得る。例えば、次の送達基剤が記載されている:コクリエート(cochleate)、Emulsome、ISCOM、リポソーム、生菌ベクター(例えば、サルモネラ、大腸菌、カルメット・ゲラン桿菌、赤痢菌、ラクトバシラス)、生ウイルスベクター(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス)、マイクロスフェア、核酸ワクチン、ポリマー(例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン)、ポリマーリング、プロテアソーム(proteosome)、フッ化ナトリウム、トランスジェニック植物、ビロソーム、およびウイルス様粒子。
本開示の製剤は医薬的に許容される溶液中で投与され、これは慣例的には塩、緩衝剤、保存料、適合性のキャリア、アジュバント、および任意に他の治療成分の医薬的に許容される濃度を含有し得る。
用語医薬的に許容されるキャリアは、ヒトまたは他の脊椎動物への投与にとって好適である1つ以上の適合性の固体もしくは液体フィラー、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語キャリアは、適用を容易化するために活性成分が組み合わされる天然または合成の有機または無機成分を意味する。医薬組成物の成分は、所望の医薬効率を実質的に損なうであろう相互作用がないような様式で、本開示の化合物とおよび互いと混ぜ合わせられることもまたできる。
糖衣錠コアは好適なコーティングを備える。この目的のためには、濃縮糖溶液が用いられ得、これは任意にアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。同定のために、または活性化合物の用量の異なる組み合わせをキャラクタリゼーションするために、染料または顔料が錠剤または糖衣錠コーティングに追加され得る。
本願に記載される製剤に加えて、化合物はデポ剤調製物としてもまた製剤され得る。かかる持続性製剤は、好適なポリマー性または疎水性材料(例えば、許容される油中エマルションとして)もしくはイオン交換樹脂によって、または難溶解性の誘導体として、例えば難溶解性の塩として製剤され得る。
医薬組成物は、好適な固体またはゲル相キャリアまたは賦形剤をもまた含み得る。かかるキャリアまたは賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを包含するが、これに限定されない。
例えば、好適な液体または固体医薬調製物形態は、吸入のための水系もしくは食塩水溶液であるか、マイクロカプセル化されるか、コクリエート化(encochleate)されるか、微視的な金粒子上にコーティングされるか、リポソーム中に含有されるか、ネブライゼーションされるか、エアロゾルであるか、皮膚へのインプラントのためのペレットであるか、または鋭利な物体上に乾燥されて皮膚に刻み込まれる。医薬組成物は、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠剤、(マイクロ)カプセル、座薬、シロップ、エマルション、懸濁液、クリーム、点薬、または活性化合物の長引く放出を有する調製物をもまた包含し、その調製においては、賦形剤ならびに添加剤および/または助剤、例えば崩壊剤、バインダー、コーティング剤、膨潤剤、滑剤、香料、甘味料、もしくは可溶化剤が上に記載されているように習慣的に用いられる。医薬組成物は種々の薬物送達系への使用にとって好適である。薬物送達のための方法の簡略な総説は、Langer R (1990) Science 249: 1527-1533参照。これは参照によって本願に組み込まれる。
化合物は、そのまま(per se)で(ニート(neat)で)または医薬的に許容される塩の形態で投与され得る。医薬品に用いられるときに、塩は医薬的に許容されるべきであるが、便利には、医薬的に許容されない塩はその医薬的に許容される塩を調製するために用いられ得る。かかる塩は次の酸から調製されるものを包含するが、これに限定されない:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。かかる塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えばカルボン酸基のナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩としてもまた調製され得る。
好適な緩衝剤は、酢酸および塩(1~2%w/v)、クエン酸および塩(1~3%w/v)、ホウ酸および塩(0.5~2.5%w/v)、ならびにリン酸および塩(0.8~2%w/v)を包含する。好適な保存料は、塩化ベンザルコニウム(0.003~0.03%w/v)、クロロブタノール(0.3~0.9%w/v)、パラベン(0.01~0.25%w/v)、およびチメロサール(0.004~0.02%w/v)を包含する。
組成物は、便利には単位剤形で与えられ得、薬学の分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。全ての方法は、1つ以上の補助的成分を構成するキャリアと化合物を結びつけるステップを包含する。一般的に、組成物は、液体キャリア、細分された固体キャリア、または両方と化合物を均一かつ密接に結びつけることと、それから、必要な場合には産物を成形することとによって調製される。液体剤形はバイアルまたはアンプルである。固体剤形は錠剤、カプセル、および座薬である。
投与モード
好ましくは、本開示の医薬組成物は、化合物または混合物を錠剤、カプセル、もしくは丸薬として経口で、または非経口で、静脈内で、皮内で、筋肉内で、もしくは皮下で、もしくは経皮で投与可能にすることにとって好適な医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含有する。
いくつかの態様においては、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量が標的組織または標的細胞に送達される。一般的に、FMR1はヒト胚において広く発現している。それゆえに、いくつかの態様においては、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量が対象の脳、精巣、卵巣、食道、上皮、胸腺、眼、および/または脾臓に送達される。いくつかの態様においては、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量が対象の中枢神経系(CNS)に送達される。いくつかの態様においては、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量が対象のニューロン細胞、例えば分化したニューロン細胞に送達される。分化したニューロン細胞の例は、運動ニューロン、感覚ニューロン、末梢ニューロン、介在ニューロン、プルキンエ細胞、顆粒細胞、三極性ニューロン、ピラミッド型細胞、シャンデリア細胞、スピンドルニューロン、星状細胞、バスケット細胞、神経節細胞、および有毛細胞を包含するが、これに限定されない。
FMR1のエピジェネティックなモジュレーターおよび/または他の化合物を含有する医薬組成物は、薬物を投与するためのいずれかの好適な経路によって投与され得る。種々の投与経路が利用可能である。選択される特定のモードは、当然のことながら、選択される特定の薬(単数または複数)、処置されようとする特定の状態、および治療効能のために要求される薬量に依存するであろう。本開示の方法は、一般的な話として、医学的に許容されるいずれかの投与モード(臨床的に許容されない有害な効果を引き起こすことなしに治療効果を生ずるいずれかのモードを意味する)を用いて実施され得る。種々の投与モードがここで論じられる。治療への使用のためには、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターおよび/または他の治療薬の有効量は、薬を所望の表面に送達するいずれかのモード、例えば粘膜、全身によって対象に投与され得る。
本開示の医薬組成物を投与することは、当業者に公知のいずれかの手段によって達成され得る。投与の経路は経口、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、皮下、経眼、膣内、および直腸を包含するが、これに限定されない。全身経路は経口および非経口を包含する。デバイスのいくつかの型は吸入による投与のために通例用いられている。デバイスのそれらの型は、定量噴霧式吸入器(MDI)、吸気作動式MDI、乾燥粉末吸入器(DPI)、MDIとの組み合わせでのスペーサー/ホールディングチャンバー、およびネブライザーを包含する。
経口投与のためには、化合物は、活性化合物(単数または複数)を当分野において周知の医薬的に許容されるキャリアと組み合わせることによってすぐに製剤され得る。かかるキャリアは、本開示の化合物が処置されるべき対象による経口摂取のための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、および同類として製剤されることを可能にする。経口使用のための医薬調製物は固体賦形剤として得られ得、任意に、所望の場合には錠剤または糖衣錠コアを得るために、好適な助剤を追加した後に、もたらされる混合物を砕き、顆粒の混合物を加工する。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトールを包含する糖などのフィラー;例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)である。所望の場合には、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが追加され得る。任意に、経口製剤は、食塩水もしくは体内の酸性条件を中和するための緩衝液中でもまた製剤され得るか、またはいずれかのキャリアなしで投与され得る。
経口的に用いられ得る医薬調製物は、ゼラチンから作られたプッシュフィットカプセル、およびゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作られた密封ソフトカプセルを包含する。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどのフィラー、デンプンなどのバインダー、および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、ならびに任意に安定化剤と混ざった活性成分を含有し得る。ソフトカプセルにおいては、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定化剤が追加され得る。経口投与のために製剤されたマイクロスフェアもまた用いられ得る。かかるマイクロスフェアは当分野において良く定義されている。経口投与のための全ての製剤はかかる投与にとって好適な薬量であるべきである。
バッカル投与のためには、組成物は従来の様式で製剤された錠剤またはトローチの形態をとり得る。
吸入による投与のためには、本開示に従う使用のための化合物は、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー形式の形態で、好適なプロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適な気体の使用によって便利に送達され得る。加圧エアロゾルのケースにおいては、薬量単位は、定量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。化合物と好適な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンとの粉末ミックスを含有する、吸入器またはインサフレーターへの使用のための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤され得る。
化合物は、それらを全身送達することが望ましい場合には、注射による、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与のために製剤され得る。注射のための製剤は、追加される保存料を有する単位剤形で、例えばアンプルで、またはマルチドーズ容器で与えられ得る。組成物は、油系または水系基剤中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとり得、懸濁、安定化、および/または分散剤などの製剤用薬剤を含有し得る。
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性の形態の活性化合物の水系溶液を包含する。加えて、活性化合物の懸濁液は適切な油系注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒または基剤は、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。水系注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。任意に、懸濁液は、好適な安定化剤、または化合物の溶解性を増大させて高濃縮溶液の調製を許す薬剤をもまた含有し得る。
代替的に、活性化合物は、使用前の好適な基剤、例えば無菌のパイロジェン不含水による戻しのための粉末形態であり得る。
化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を含有する座薬または停留浣腸などの直腸または膣内組成物にもまた製剤され得る。
他の送達系は、時間放出、遅延放出、または持続放出送達系を包含し得る。かかる系は化合物の繰り返しの投与を回避し得、対象および医師の便宜を増大させる。放出送達系の多くの型が利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリ(ラクチド-グリコリド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ酸無水物などのポリマーベース系を包含する。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは例えばU.S.Pat.No.5,075,109に記載されている。送達系は非ポリマー系をもまた包含し、それらは、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステル、および脂肪酸、または中性脂肪、例えばモノ、ジ、およびトリグリセリドを包含する脂質;ハイドロゲル放出系;シラスティック系;ペプチドに基づく系;ワックスコーティング;従来のバインダーおよび賦形剤を用いる圧縮錠剤;部分癒合インプラント;ならびに同類である。具体的な例は、(a)本開示の薬がマトリックス中の形態で含有される浸食型の系、例えばU.S.Pat.No.4,452,775、4,675,189、および5,736,152に記載されているもの、ならびに(b)活性成分がコントロールされた速度でポリマーから透過する拡散型の系、例えばU.S.Pat.No.3,854,480、5,133,974、および5,407,686に記載されているものを包含するが、これに限定されない。加えて、ポンプに基づくハードウェア送達系が用いられ得、それらのいくつかはインプラントのために適用される。
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチド(例えば干渉RNA)は、阻害剤オリゴヌクレオチドを発現するように操作された発現ベクターによって細胞に送達され得る。発現ベクターは、所望の配列が例えば制限処理およびライゲーションによって挿入され得、その結果、それが作動可能に制御配列に連結され、RNA転写物として発現され得るものである。典型的には、発現ベクターは、タンパク質の、またはshRNA、miRNA、もしくはmiRNAなどの阻害性オリゴヌクレオチドのコード配列である挿入物を含有する。ベクターは、さらに、ベクターによって形質転換もしくはトランスフェクションされたかまたはされなかった細胞の同定への使用にとって好適な1つ以上のマーカー配列を含有し得る。例えば、マーカーは、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性を増大または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が標準的なアッセイによって検出可能である酵素または蛍光タンパク質をコードする遺伝子などを包含する。
ここで用いられるコード配列(例えば、タンパク質コード配列、miRNA配列、shRNA配列)および制御配列は、コード配列の発現または転写を制御配列の影響またはコントロール下に置くようなやり方でそれらが共有結合的にリンクされているときに、「作動可能に」連結されていると言われる。コード配列が機能的なタンパク質に翻訳されることが所望である場合には、2つのDNA配列は、5’制御配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合に、かつ2つのDNA配列間のリンク部分の性質が(1)フレームシフト変異の導入をもたらさず、(2)コード配列の転写を命令するプロモーター領域の能力に干渉せず、(3)タンパク質に翻訳される対応するRNA転写物の能力に干渉しない場合には、作動可能に連結されていると言われる。それゆえに、プロモーター領域は、プロモーター領域がそのDNA配列の転写をもたらすことができ、その結果、もたらされる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合には、作動可能にコード配列に連結されている。コード配列がmiRNA、shRNA、またはmiRNAをコードし得るということは理解されるであろう。
遺伝子発現のために必要とされる制御配列の厳密な性質は、生物種または細胞型間において様々であり得るが、一般的には、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関わる5’非転写および5’非翻訳配列、例えばTATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列、および同類を包含する。かかる5’非転写制御配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写コントロールのためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を包含するであろう。制御配列は、所望に応じてエンハンサー配列または上流アクティベーター配列をもまた包含し得る。本開示のベクターは任意に5’リーダーまたはシグナル配列を包含し得る。
いくつかの態様において、核酸分子を送達するためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを包含するポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、およびTyウイルス様粒子からなる群から選択される。外因性核酸を送達するために用いられているウイルスおよびウイルス様粒子の例は、複製不能アデノウイルス、改変レトロウイルス、非複製レトロウイルス、複製不能セムリキ森林ウイルス、カナリア痘ウイルス、および高度弱毒化ワクシニアウイルス誘導体、非複製型ワクシニアウイルス、複製型ワクシニアウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、レンチウイルスベクター、およびTyウイルス様粒子を包含する。ある種の適用にとって有用な別のウイルスはアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは細胞型および生物種の広範囲に感染することができ、複製欠損であるように操作され得る。さらに、これは熱および脂質溶媒安定性、造血細胞を包含する多様な系列の細胞への高い形質導入頻度、ならびに重複感染阻害の欠如などの利点を有し、それゆえに複数の一連の形質導入を許す。アデノ随伴ウイルスは部位特異的な様式でヒト細胞DNA中にインテグレーションし得、それによって、挿入変異導入の可能性と挿入遺伝子の発現の変動性とを最小化する。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は組織培養において選択圧の不在下において100継代超に渡って追跡されており、アデノ随伴ウイルスのゲノムインテグレーションが比較的安定なイベントであるということを暗示している。アデノ随伴ウイルスは染色体外的な様式でもまた機能し得る。
一般的に、他の有用なウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子によって置き換えられた非細胞変性性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性性のウイルスはある種のレトロウイルスを包含し、そのライフサイクルは、ウイルスゲノムRNAからDNAへの逆転写と、宿主細胞DNA中への爾後のプロウイルスインテグレーションを包含する。一般的に、レトロウイルスは複製欠損である(例えば、所望の転写物の合成を命令することができるが、感染性粒子を生産することができない)。かかる遺伝子改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボの遺伝子の高効率形質導入にとって一般的な実用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール(プラスミド中への外因性遺伝子材料の組み込み、プラスミドによるパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、およびウイルス粒子による標的細胞の感染のステップを包含する)はKriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual," W.H. Freeman Co., New York (1990)およびMurry, E.J. Ed. "Methods in Molecular Biology," vol. 7, Humana Press, Inc., Clifton, New Jersey (1991)において提供されている。
核酸分子が宿主にインビトロでまたはインビボで導入されるかどうかに依存して、種々の技術が、本開示の核酸分子を細胞内に導入するために使用され得る。かかる技術は、核酸分子-リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、DEAEと結びついた核酸分子のトランスフェクション、目的の核酸分子を包含する前述のウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソームによって媒介されるトランスフェクション、および同類を包含する。他の例は、Sigma-AldrichによるN-TER(商標)ナノ粒子トランスフェクション系、Polyplus Transfectionによる昆虫細胞のためのFectoFly(商標)トランスフェクション試薬、Polysciences, Inc.によるポリエチレンイミン「Max」、Cosmo Bio Co., Ltd.による独自の非ウイルス系トランスフェクションツール、InvitrogenによるLipofectamine(商標)LTXトランスフェクション試薬、StratageneによるSatisFection(商標)トランスフェクション試薬、InvitrogenによるLipofectamine(商標)トランスフェクション試薬、Roche Applied ScienceによるFuGENE(登録商標)HDトランスフェクション試薬、Polyplus TransfectionによるGMP準拠のin vivo-jetPEI(商標)トランスフェクション試薬、およびNovagenによるInsect GeneJuice(登録商標)トランスフェクション試薬を包含する。
スクリーニング方法
いくつかの側面において、本開示は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターとして機能する薬を同定する方法に関する。従って、いくつかの態様において、本開示はFMR1のエピジェネティックなモジュレーターを同定するための方法を提供し、方法は、不活性化したFMR1遺伝子を含む細胞を候補薬と接触させることと、細胞のFMR1発現レベルを検出することと、FMR1の発現レベルが候補薬との接触後にコントロール細胞に対して増大するときに、候補薬をFMR1のエピジェネティックなモジュレーターとして同定することとを含む。
ここで用いられる用語「候補薬」は、サイレンシングされたFMR1遺伝子を再活性化する化合物の能力のキャラクタリゼーションが望ましい、いずれかの薬(例えば化合物)を言う。例示的な候補薬は、小分子、抗体、抗体コンジュゲート、ペプチド、タンパク質、および/またはアンチセンス分子(例えば、干渉RNA)を包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、本開示によって記載される方法は、候補化合物の大きいライブラリー(例えば、化合物ライブラリー)をスクリーニングしてFMR1の新たなエピジェネティックなモジュレーターを同定するために有用である。いくつかの態様において、化合物ライブラリーは、特定の標的、例えば活性化のマーク、抑制性のマーク、またはユビキチンリガーゼに特異的な候補薬からなる。化合物ライブラリーは、特定のタンパク質標的、例えばDNAメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ユビキチンリガーゼ、および/またはヒストンアセチルトランスフェラーゼに特異的である候補薬からもまたなり得る。いくつかの態様において、候補薬はDNAメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ユビキチンリガーゼ、および/またはヒストンアセチルトランスフェラーゼの阻害剤である。
当業者は、不活性化したFMR1遺伝子を有する細胞を候補化合物と接触させるためのいくつかの方法を認識する。例えば、自動液体ハンドリング系は、ハイスループット薬物スクリーニングのために一般的に利用されている。自動液体ハンドリング系は、ロボットアームによってコントロールされる液体分注ベッセルのアレイを利用して、液体の一定体積をアッセイプレートのウェルに分配する。一般的に、アレイは96、384、または1536個の液体分注チップを含む。自動液体ハンドリング系の限定しない例は、デジタルディスペンサー(例えば、HP-D300デジタルディスペンサー)およびピンニング装置(例えば、MULTI-BLOT(商標)レプリケータ系、CyBio、Perkin Elmer Janus)を包含する。非自動の方法もまた本開示によって企図され、マニュアルデジタル連続分注マルチチャンネルピペットを包含するが、これに限定されない。
いくつかの態様において、本開示によって記載されるスクリーニング方法はハイスループットモードで実施される。いくつかの態様において、ハイスループットスクリーニングはマルチウェル細胞培養プレートで実施される。いくつかの態様において、マルチウェルプレートはプラスチックまたはガラスである。いくつかの態様において、マルチウェルプレートは6、24、96、384、または1536ウェルのアレイを含む。しかしながら、当業者は、マルチウェルプレートが、6、24、96、384、または1536の倍数であるウェルの数を有するマルチウェルプレートなどの種々の他の許容される構成で組み立てられ得るということを認識する。例えば、いくつかの態様において、マルチウェルプレートは3072ウェル(これは1536の倍数である)のアレイを含む。
細胞のFMR1発現レベルは当分野において公知のいずれかの好適な手段によって測定され得る。例えば、細胞のFMR1の発現レベルはハイブリダイゼーションに基づく方法によって測定され得る。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイの例は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、定量的RT-PCR(qRT-PCR)、ノーザンブロット、およびサザンブロットを包含する。いくつかの態様において、細胞のFMR1発現レベルはタンパク質に基づく方法によって測定される。タンパク質に基づくアッセイの例は、ウエスタンブロット、ブラッドフォードアッセイ、ローリータンパク質アッセイ、および分光法的方法(例えば、質量分析、高圧液体クロマトグラフィーなど)を包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、細胞のFMR1発現レベルは細胞に基づく方法によって決定される。細胞に基づくアッセイの例は、免疫蛍光、フローサイトメトリー、蛍光セルソーティング(FACS)、磁気セルソーティング(MACS)を包含する。いくつかの態様において、細胞は、FMR1活性化が作動可能に耐性遺伝子の発現にリンクされるように改変され、それゆえに、サイレンシングされたFMR1の再活性化は選択培地の存在下における細胞の生育および選択を許す(図5参照)。いくつかの態様において、細胞は、FMR1活性化が作動可能に蛍光タンパク質の発現にリンクされるように改変され、それゆえに、サイレンシングされたFMR1の再活性化は蛍光タンパク質の発現を許し、これは免疫蛍光またはFACSによって検出され得る。細胞のFMR1発現レベルを定量する追加の方法は、当業者にはすぐに明らかであろう。
候補化合物は、候補化合物の存在下において発言されるFMR1の量が候補化合物の不在下において発現される量よりも多い場合に、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターとして同定され得る。FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの存在下において発現されるFMR1の量は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの不在下において発現されるFMR1の量よりも約2倍多くから約500倍多く、5倍多くから約250倍多く、10倍多くから約150倍多く、または約20倍多くから約100倍多くの範囲であり得る。いくつかの態様において、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの存在下において発現されるFMR1の量は、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの不在下において発現されるFMR1の量よりも約1%から約1000%多く、約10%から約500%多く、約20%から約250%多く、約50%から約500%多く、約100%から約750%多くの範囲であり得る。いくつかの態様において、FMR1はFMR1のエピジェネティックなモジュレーターの存在下において発現され、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの不在下においては発現されない(例えば、転写不活性であるかまたはサイレンシングされている)。
例1.
抑制性のマークを蓄積することまたは活性化のマークを除去することを担う因子は、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子を再活性化するための潜在的な標的である(図2)。次の表(表3)は、サイレンシングされたFMR1遺伝子上のエピジェネティックマークを蓄積または除去することを担う因子の非網羅的なリストである。
Figure 2022063261000004
上の表において挙げられたエピジェネティックマークを蓄積または除去するために要求される因子の全てを、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を用いて体系的にノックダウンした(図3)。これらの実験はFXS患者に由来する人工多能性幹細胞(iPSC)において実行した。FXS-iPSCは抑制されたFMR1遺伝子を宿し、ゆえに、疾患メカニズムを研究することおよび薬物スクリーニングアプローチにとって有用なモデル系としての用をなす。
この指向性アプローチを用いて、ノックダウンされたときにiPSC細胞におけるFMR1遺伝子の発現を活性化する9つのクロマチン修飾因子を同定した。9つの修飾因子はDNMT1、EZH2、SUV39H1、RING1B/RNF2、HDAC5、HDAC10、SIRT5、KDM5C、およびKDM5Dである(図4上)。これらの因子の多く(SUV420H1およびSUV420H2を除く全て)では、小分子阻害剤が利用可能である(表1)。ゆえに、小分子阻害剤がRNAiノックダウンと同様にFMR1遺伝子を脱抑制し得るかどうかを試験した。4つの化合物、EZH2阻害剤EPZ6438(Cayman Chemical)およびGSK126(Apexbio Technology)、G9a(EHMT2としてもまた公知)阻害剤UNC0638(Sigma-Aldrich)、ならびにSUV39H1阻害剤ケトシン(Tocris Bioscience)を試験した。加えて、DNMT阻害剤5-アザシチジンをポジティブコントロールとして分析した。5-アザシチジン、EPZ6438、GSK126、およびケトシンはFMR1を再活性化するが、一方でUNC0638はせず(図4下)、対応する遺伝子のshRNAによって媒介されるノックダウンの結果と一致している(図4上参照)。G9aは、Rループによって開始されるエピジェネティックなサイレンシングに関わるH3K9メチルトランスフェラーゼであるということが以前に示唆されているので、これは重要な結果である。]
FMR1遺伝子を脱抑制することは、FXS症状を後退させるための新規の治療アプローチを表す。サイレンシングされたFMR1遺伝子を再活性化するであろう生物学的または小分子阻害剤の発見のための標的であるいくつもの因子が同定された。加えて、以前に記載された小分子阻害剤のケトシンでは、FMR1遺伝子の発現を脱抑制することに果たす新規の生物学的役割が発見された。
例2.
ゲノムワイドなライブラリーおよび/またはキナーゼもしくは転写因子サブライブラリーを用いる大スケールRNAiスクリーニングを実行して、FMR1のエピジェネティックなサイレンシングを媒介する新たな因子を同定する(図5)。このスクリーニングのために、不活性化したFMR1遺伝子の下流に位置するブラストサイジン(blasticidine)レポーター遺伝子(Blast)を含有するレポーター細胞株を作製する。FMR1のエピジェネティックなモジュレーターによるFMR1遺伝子の再活性化は、Blast遺伝子の発現を誘導し、薬物選択によるポジティブな候補の単離を可能にする。図5に示されているように、Blast遺伝子はCRISPR/Cas9系を用いてFMR1遺伝子に挿入され得る。
例3.候補に基づくスクリーニングは、患者由来人工多能性幹細胞(iPSC)においてFMR1のサイレンシングを媒介するエピジェネティックな制御因子を同定する
FMR1のサイレンシングを媒介するエピジェネティックな制御因子を同定するために、転写抑制を媒介する33個の良くキャラクタリゼーションされたエピジェネティックな制御因子を対象とする162個のshRNAを含む小スケール短鎖ヘアピンRNA(shRNA)ライブラリーを構築した。それぞれのshRNAをレンチウイルスにパッケージングし、未分化のFXS-iPSC株(FXS848-iPS3細胞)に形質導入した。トランスフェクションの20日後に、mRNAを調製し、FMR1発現を定量的RT-PCR(qRT-PCR)によって分析した。ポジティブな結果は、コントロールの非サイレンシング(NS)shRNAによって得られたものと比較して、同じ標的を対象とする少なくとも2つの無関係なshRNAによるFMR1発現の統計的に有意な増大であると考えられる。図4Aの結果は、サイレンシングされたFMR1遺伝子の9つのエピジェネティックな制御因子を同定した:DNMT1、EZH2、RNF2(RING1Bともまた呼ばれる)、SUV39H1、KDM5C、KDM5D、HDAC5、HDAC10、およびSIRT5。これらの機能は表4に簡略に記載されている。便宜のために、FMR1サイレンシングを促進する下の因子はFMR1サイレンシング子(FMR1-SF)と言う。
Figure 2022063261000005
FMR1-SFのshRNAによって媒介されるノックダウンに引き続いて得られるFMR1再活性化のレベルを決定するために、正常な個人に由来するiPSC株(BJ1-iPS4)を平行して分析した。図6AのqRT-PCR結果は、FMR1-SFのshRNAによって媒介されるノックダウンがエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子を正常レベルの~20%に再活性化したということを示しており、これは臨床的な利益を有すると予測される範囲内である。図6Bのイムノブロットの結果は、FXS848-iPS3細胞におけるFMR1-SFのノックダウンがFMRPタンパク質をもまた正常レベルの15~20%に回復したということを示している。9つのFMR1-SFのノックダウンに引き続いてのエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1の再活性化は、第2の無関係なFXS-iPSC細胞株、SC135細胞におけるqRT-PCRおよびイムノブロッティングによって確認した(図6C~6D)。
上に記載されているように、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1の特質的な特徴はDNA過剰メチル化の存在である。図6Eのバイサルファイトシーケンシング実験は、FXS-iPSC細胞株FXS848-iPS3においてFMR1プロモーターのDNA過剰メチル化を確認している。以前の研究と一致して、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤5-アザシチジンによるFXS848-iPS3細胞の処置はDNA過剰メチル化の実質的な減少に至った。特に、9つのFMR1-SFの1つのノックダウンに引き続いて、DNA過剰メチル化の類似の減少があった。
例4.FMR1-SFは、順序立った経路によってエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1と安定に結びつく
典型的には、エピジェネティックな制御因子は、それらが作用するプロモーターおよび/または遺伝子と安定に結びついている。9つのFMR1-SFがエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1プロモーターと安定に結びついているかどうかを決定するために、一連のクロマチン免疫沈降(ChIP)実験を実行した。図7AのChIP実験は、9つのFMR1-SFの8つがFXS-iPSCにおいてはエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1プロモーターに結合しているが、正常iPSCにおいてはしていないということを示している。FMR1-SFは恒常的に活性な遺伝子APRTのネガティブコントロールのプロモーターには結合していなかった。エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1プロモーターに結びついていない単一のFMR1-SFはSIRT5であり、これはミトコンドリアに局在することが公知である。それゆえに、SIRT5はFMR1サイレンシングを促進するが、他のFMR1-SFとは違って、間接的に機能する。
抑制性のエピジェネティックな制御因子は順序立った経路でプロモーターにリクルートメントされるということが以前に示されている。FMR1-SFがある経路でFMR1にリクルートメントされるかどうかを決定するために、単一の各FMR1-SFをノックダウンし、それから全てのFMR1-SF(SIRT5を除く)の結合をChIPアッセイによって分析した。図7Bに与えられているこれらの結果は、FMR1-SFが図7Cに要約されている経路でFMR1プロモーターに順次リクルートメントされるということを示している。例えば、FMR1と結びつく第1のFMR1-SF、EZH2のノックダウンは、全ての他のFMR1-SFのリクルートメントの喪失をもたらす。対照的に、FMR1に結びつく最後のFMR1-SF、DNMT1のノックダウンは、他のFMR1-SFのリクルートメントに影響しない。特に、他のエピジェネティックにサイレンシングされた遺伝子の以前の研究の全てにおいて、DNMTは、リクルートメントされる最後の抑制性のエピジェネティックな制御因子であるということが見出されている。
FMR1サイレンシングがFMR1プロモーター上のヒストンH3リジン9トリメチル化(H3K9me3)およびヒストンH3リジン27トリメチル化(H3K27me3)の蓄積を伴うということが以前に示されている。図7Dは、FXS-iPSCにおいて、H3K9me3およびH3K27me3はFMR1プロモーター上に検出され得たが、コントロールのプロモーター(APRT)上にはされなかったということを示している。図7Eは、予想されたように、H3K27me3を触媒するEZH2のノックダウンがFMR1プロモーターにおけるH3K27me3の減少したレベルをもたらしたということを示している。対照的に、他のFMR1-SFのいずれか1つのノックダウンはH3K27me3に影響しなかった。図7Fは、予想されたように、H3K9メチルトランスフェラーゼのSUV39H1のノックダウンがFMR1プロモーターにおけるH3K9me3の減少したレベルをもたらしたということを示している。加えて、EZH2のノックダウンもまた低減されたH3K9me3レベルをもたらしており、EZH2リクルートメントがSUV39H1結合のために要求されるという知見と一致する(図7C参照)。
例5.FMR1-SFの小分子阻害剤によるエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1の再活性化
FMR1-SFのいくつかには、良く記載された小分子阻害剤がある。図8Aは、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1が、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤5-アザシチジンによる処置によってFXS848-iPS3細胞において再活性化され得たということを示しており、いくつかの以前の研究の結果と一致する。特に、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1は、EZH2(EPZ6438、GSK126)、SUV39H1(ケトシン(chaeotocin))、およびRNF2(PRT4165)の小分子阻害剤による処置に引き続いてもまた再活性化された。再活性化はFMR1のmRNA(図8A)およびタンパク質(図8B)レベル両方の分析によって観察され、再び野生型レベルの~15~20%であった。興味深いことに、ケトシン(chaeotocin)およびEPZ6438、ケトシン(chaeotocin)およびPRT4165、またはEPZ6438およびPRT4165などの2つの阻害剤による同時処置は、単一の阻害剤単独による処置と比較して、FMR1の増強された再活性化をもたらすということが見出された(図8C)。
現在いくつかの治験中であるEZH2阻害剤EPZ6483によるいくつかの追加の実験.図8DのEPZ6483タイトレーション実験は、EZH2酵素活性の喪失とFMR1再活性化との間には非常に良好な相関があるということを示している。図8Eのタイムコース実験は、EPZ6483の追加に引き続いて、FMR1再活性化は96時間に渡って増大し、この時点でプラトーになり始めたということを示している。EPZ6483の休薬はFMR1の再サイレンシングをもたらし、これは再び~96時間のタイムコースに渡って起こった。まとめると、これらの結果は、FMR1のサイレンシングおよび再活性化両方が可逆的なプロセスであるということを示している。最後に、図8FのChIP実験は、FMR1プロモーターとのDNMT1の結びつきが、EPZ6483追加に引き続いてのFMR1サイレンシングおよびEPZ6483休薬に引き続いてのFMR1再活性化の動態と良く相関しているということを示している。
FMR1を再活性化する追加の小分子阻害剤を同定するために、バーチャルドッキングおよび類似性検索に基づいて選ばれたエピジェネティクス指向性ライブラリー(Life Chemicals)からの化合物のパネルをスクリーニングした。図9Aは、EZH2(F2880-2560)、SUV39H1(F2740-0099、F6403-3095、F5599-0533)、HDAC10(F6196-0976)、およびDNMT1(F6363-1015)を標的化する合計6つの化合物が、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子を再活性化したということを示している。図9BのタイトレーションアッセイはFMR1の再活性化が用量依存的であるということを示している。同定された化合物の構造は互いに近くはない(図9C)。サイレンシングされたFMR1を再活性化し得る小分子の例が図9Dに示されている。
例6.FMR1-SFは、FXS神経前駆細胞(NPC)および有糸分裂後ニューロンにおいてもまたFMR1のエピジェネティックなサイレンシングを媒介する
上に記載されている実験は未分化のFXS-iPSCにおいて実行した。次に、FMR1-SFの同じセットの拮抗作用が、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1をFXS-NPCおよび有糸分裂後ニューロンにおいてもまた再活性化するかどうかを調べた。これらの後者は、FXSの特に妥当な細胞型である。それらの実験のために、上に記載されているFXS848-iPS3細胞に由来するFXS-NPC細胞株を用いた。9つのFMR1-SFのいずれか1つのノックダウンは、mRNA(図10A)およびタンパク質(図10B)レベル両方で、FXS848-NPCにおいてエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1を再活性化した。エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1は、mRNAおよびタンパク質レベルで、FXS848-NPCにおいて、5-アザシチジン、ケトシン、EPZ6483、GSK126、およびPRT4165を包含するFMR1-SFの小分子阻害剤によってもまた再活性化された(図10C~10D)。
有糸分裂後FXSニューロンを作製するために、FXS848-NPCをマイトジェンEGFおよびbFGFの不在下において培養した。ニューロン分化は、ニューロンマーカーMAP2およびNeuNによる染色によって確認された(図11A)。予想されたように、FXS848-NPC由来ニューロンは、有糸分裂マーカーリン酸化H3を対象とする抗体による染色の欠如によって証明されるように、有糸分裂後であった(図11B)。9つのFMR1-SFのノックダウンは、FXS848-NPC由来の有糸分裂後ニューロンにおいて、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1をmRNA(図11C)およびタンパク質(図11D)レベル両方で再活性化した。エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1は、FXS848-NPC由来の有糸分裂後ニューロンにおいて、5-アザシチジン、ケトシン、EPZ6483、GSK126、およびPRT4165を包含するFMR1-SFの小分子阻害剤によってもまた、mRNA(図11E)およびタンパク質(図11F)レベルで再活性化された。FXS-iPSCにおいて見出されたものと類似に、FXS848-NPC由来の有糸分裂後ニューロンにおいて、EZH2阻害剤EPZ6483によるエピジェネティックにサイレンシングされたFMR1の再活性化は~96時間のタイムコースに渡って起こり、可逆的であった(図11G)。
例7.FMR1再活性化は機能異常FXSニューロン表現型を正常化し得る
次に、shRNAまたは小分子阻害剤によるFMR1の部分的な再活性化が、機能異常FXSニューロン表現型を「正常化する」ために十分であるかどうかを調べた。結果の生理的妥当性は、FXS-iPSC由来ニューロンにおけるFXSニューロン表現型のいくつかの定量可能な尺度を用いて決定した。
第1に、神経転写リプレッサーRESTおよびその標的軸索誘導遺伝子の遺伝子発現の改変を測定した。RESTは神経発生の負のマスター制御因子であり、異なる神経系列のプールサイズおよび分化のタイミングを制御する。RESTは胚性幹細胞(ESC)、NPC、および非ニューロン細胞において発現し、そこでは、それがサイレンシングされる分化したニューロンとは対照的に、ニューロン特異的遺伝子を抑制する。しかしながら、FXS由来ニューロンにおいてはRESTレベルが高く、軸索誘導遺伝子および正しい軸索発達にとって重要な他の遺伝子の抑制をもたらす。FXS-iPSC由来ニューロンにおいては、FMR1-SFのshRNAまたは阻害剤による処置は、コントロール処置に対してREST発現の減少(図12A)およびREST標的軸索誘導遺伝子ROBO3、SLIT1、およびDCCの増大(図12B)をもたらした。
第2に、ジアシルグリセロールおよびホスファチジン酸シグナル伝達経路の間の切り替えをコントロールするマスター制御因子、ジアシルグリセロールキナーゼカッパ(DGKκ)のタンパク質レベルを測定した。FXSニューロンにおけるFMRPの不在はDGKκの減少したレベルをもたらし、これはFXSマウスモデルにおいて観察されるものに類似の樹状突起スパイン異常、シナプス可塑性改変、および行動異常を引き起こすために十分である。その上に、DGKκの異所発現はFMR1KOニューロンの樹状突起スパイン欠陥を救済する。図12Cは、FMR1-SFのshRNAまたは阻害剤によるFXS-iPSC由来ニューロンの処置が、野生型ニューロンにおいて見出されるものに匹敵するレベルへのDGKκの増大をもたらしたということを示している。
最後に、FMR1-SFのshRNAおよび阻害剤が、FXSニューロンにおいて異常であるニューロンの形態の各側面(細胞体面積、細胞体周長、神経突起の突起長、神経突起の分岐点、二次突起)を救済し得るかどうかを決定するための研究を実行した。第1のステップとして、細胞をニューロンマーカーTUJ1によって染色し、これは神経突起の突起長の測定を許した。免疫蛍光分析は、TUJ1およびFMRP染色がFXS-iPSC由来ニューロンにおいてFMR1-SFのノックダウン(図12D)またはFMR1-SF阻害剤による処置(図12E)によって回復したということを示している。さらにその上に、FMR1-SFのshRNAまたは阻害剤による処置は、野生型iPSC由来ニューロンのもののおよそ25~45%のレベルへの神経突起の突起長の増大をもたらした(図12F)。
本開示のいくつかの態様をここで記載および例解してきたが、当業者は、本願に記載される機能を実行し、ならびに/または結果および/もしくは利点の1つ以上を得るための、種々の他の手段および/または構造をすぐに想像するであろう。かかる変形および/または改変のそれぞれは本開示の範囲内であると見なされる。より一般的に、当業者は、本願に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成は例示的であることが意味されているということと、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成は本開示の教示が用いられる具体的な適用(単数または複数)に依存するであろうということとをすぐに理解するであろう。当業者は、本願に記載される本開示の具体的な態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめる能力があるであろう。ゆえに、前述の態様が例としてのみ与えられているということと、添付の請求項およびその均等物の範囲内で、本開示は具体的に記載および請求されるものとは別様に実施され得るということとは理解されるべきである。本開示は、本願に記載されるそれぞれの個々の特徴、系、成形品、材料、および/または方法を対象とする。加えて、2つ以上のかかる特徴、系、成形品、材料、および/または方法のいずれかの組み合わせは、かかる特徴、系、成形品、材料、および/または方法同士が相反しない場合には、本開示の範囲内に包含される。
ここで明細書および請求項において用いられる不定冠詞「a」および「an」は、明瞭に反対に示されない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
ここで明細書および請求項において用いられる句「および/または」は、そのように接続された要素の「どちらかまたは両方」、すなわち、いくつかのケースにおいては連接的に存在し他のケースにおいては離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。明瞭に反対に示されない限り、具体的に同定されているそれらの要素と関係があるかまたは無関係であるかにかかわらず、任意に、「および/または」節によって具体的に同定されている要素以外の他の要素が存在し得る。それゆえに、限定しない例として、「含む」などの開放的な言葉と連接して用いられるときの「Aおよび/またはB」と言うことは、1つの態様においてはBなしのA(任意にB以外の要素を包含する)を、別の態様においてはAなしのB(任意にA以外の要素を包含する)を、尚も別の態様においてはAおよびB両方(任意に他の要素を包含する)などを言い得る。
ここで明細書および請求項において用いられる「または」は、上で定義されている「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目同士を分離するときに、「または」または「および/または」は、包括的であるとして、すなわちいくつもの要素または要素のリストの少なくとも1つ(しかし、1つよりも多くをもまた包含する)と任意に追加のリスト化されていない項目との包含として解釈される。明瞭に反対に示されている用語、例えば「の1つのみ」もしくは「の正確に1つ」または請求項に用いられるときの「からなる」のみが、いくつもの要素または要素のリストの正確に1つの要素の包含を言う。一般的に、ここで用いられる用語「または」は、「どちらか」、「の1つ」、「の1つのみ」、または「の正確に1つ」などの排他性の用語によって先行されるときにのみ、排他的な代替物(すなわち「両方ではなく1つまたは他方」)を示すと解釈される。「から本質的になる」は、請求項において用いられるときには、特許法の分野において用いられるその普通の意味を有する。
ここで明細書および請求項において用いられる句「少なくとも1つ」は、1つ以上の要素のリストの参照において、要素のリスト中の要素のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト中の具体的にリスト化されているあらゆる要素の少なくとも1つを必ずしも包含せず、かつ要素のリスト中の要素のいずれかの組み合わせを排除しない。この定義は、具体的に同定されているそれらの要素と関係があるかまたは無関係であるかにかかわらず、句「少なくとも1つ」が言う要素のリスト中の具体的に同定されている要素以外の要素が任意に存在し得ることをもまた許す。それゆえに、限定しない例として、「AおよびBの少なくとも1つ」(または同義で「AまたはBの少なくとも1つ」もしくは同義で「Aおよび/またはBの少なくとも1つ」)は、1つの態様においてはBが存在しない(かつ任意にB以外の要素を包含する)少なくとも1つのA(任意に1つよりも多くを包含する)を、別の態様においてはAが存在しない(かつ任意にA以外の要素を包含する)少なくとも1つのB(任意に1つよりも多くを包含する)を、尚も別の態様においては(任意に他の要素を包含する)少なくとも1つのA(任意に1つよりも多くを包含する)および少なくとも1つのB(任意に1つよりも多くを包含する)などを言い得る。
請求項および上の明細書において、「含む」、「包含する」、「抱える」、「有する」、「含有する」、「関わる」、「持つ」および同類などの全ての移行句は、開放的であると、すなわち包含するが限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみが、米国特許庁特許審査便覧セクション2111.03に定められるようにそれぞれ閉鎖的または半閉鎖的な移行句である。
請求項の要素を修飾するための請求項における順序数用語、例えば「第1」、「第2」、「第3」などの使用は、別のものに対する1つの請求項の要素のいずれかの優先権、重要度、もしくは順序、または方法の各行為が実行される時間的順序をそれ自体で含意することはなく、単に、請求項の要素同士を見分けるためにある種の名を有する1つの請求項の要素を(順序数用語の使用を除けば)同じ名を有する別の要素から見分けるための標識として用いられる。

Claims (113)

  1. 方法が、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量を対象に投与することを含み、エピジェネティックなモジュレーターが対象のFMR1を再活性化する、
    その必要がある対象のFMR1不活性化に関連する異常を処置するための方法。
  2. FMR1不活性化に関連する異常が、脆弱X症候群、脆弱X随伴振戦/失調症候群、早発性の卵巣老化、または多嚢胞性卵巣症候群である、請求項1に記載の方法。
  3. FMR1不活性化に関連する異常が、脆弱X症候群である、請求項1または2に記載の方法。
  4. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、メチルトランスフェラーゼの阻害剤である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  5. メチルトランスフェラーゼが、DNAメチルトランスフェラーゼである、請求項4に記載の方法。
  6. DNAメチルトランスフェラーゼが、DNMT1、DNMT3A、およびDNMT3Bからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
  7. DNAメチルトランスフェラーゼがDNMT1であり、エピジェネティックなモジュレーターがDNMT1を選択的に阻害する、請求項5に記載の方法。
  8. エピジェネティックなモジュレーターが、5-アザシチジンである、請求項5に記載の方法。
  9. メチルトランスフェラーゼが、ヒストンメチルトランスフェラーゼである、請求項4に記載の方法。
  10. ヒストンメチルトランスフェラーゼが、EZH2、SETDB1、EHMT1/GLP、EHMT2/G9a、SUV39H1、SUV420H1、およびSUV420H2からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
  11. ヒストンメチルトランスフェラーゼがSUV39H1であり、エピジェネティックなモジュレーターがSUV39H1を選択的に阻害する、請求項7に記載の方法。
  12. エピジェネティックなモジュレーターがケトシンである、請求項7に記載の方法。
  13. ヒストンメチルトランスフェラーゼがEZH2であり、エピジェネティックなモジュレーターがEZH2を選択的に阻害する、請求項7に記載の方法。
  14. エピジェネティックなモジュレーターが、EPZ6438またはGSK126である、請求項7に記載の方法。
  15. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンユビキチンリガーゼの阻害剤である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  16. ヒストンユビキチンリガーゼが、ヒストンH2Aをユビキチン化するユビキチンリガーゼである、請求項15に記載の方法。
  17. ヒストンユビキチンリガーゼが、RING1B/RNF2である、請求項15または16に記載の方法。
  18. エピジェネティックなモジュレーターが、RING1/RNF2を選択的に阻害する、請求項17に記載の方法。
  19. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  20. エピジェネティックなモジュレーターが、HDAC5、HDAC10、またはSIRT5を選択的に阻害する、請求項19に記載の方法。
  21. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンデメチラーゼの阻害剤である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  22. エピジェネティックなモジュレーターが、KDM5Dを選択的に阻害する、請求項21に記載の方法。
  23. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、活性なマークの阻害因子を標的化する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  24. 活性なマークが、H2A、H2B、H3、およびH4からなる群から選択される少なくとも1つのヒストンのアセチル化である、請求項23に記載の方法。
  25. 活性なマークが、ヒストンH3リジン4のトリメチル化(H3K4me3)である、請求項23に記載の方法。
  26. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが次:
    HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、KDM5A、KDM5B、KDM5C、またはKDM5D
    の少なくとも1つを標的化する、請求項23~25のいずれか一項に記載の方法。
  27. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、核酸、ポリペプチド、または小分子である、請求項1~26のいずれか一項に記載の方法。
  28. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが核酸である、請求項1~27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 核酸が、二本鎖RNA(dsRNA)、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)からなる群から選択される干渉核酸である、請求項28に記載の方法。
  30. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、表2に定められている配列(例えばガイド配列)を含む干渉核酸である、請求項1~29のいずれか一項に記載の方法。
  31. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターがポリペプチドである、請求項1~27のいずれか一項に記載の方法。
  32. ポリペプチドが抗体である、請求項31に記載の方法。
  33. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが小分子である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
  34. 小分子が表1にリスト化された小分子である、請求項33に記載の方法。
  35. 対象が、転写不活性なFMR1遺伝子の存在に基づいて、必要があるとして同定される、請求項1~34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 転写不活性なFMR1遺伝子が、エピジェネティックにサイレンシングされている、請求項35に記載の方法。
  37. 転写不活性なFMR1遺伝子が、サイレンシングされたFMR1遺伝子と結びついた少なくとも1つのエピジェネティックマークを含む、請求項35または36に記載の方法。
  38. 少なくとも1つのエピジェネティックマークが、DNAメチル化(DNAme)、ヒストンH3リジン27トリメチル化(H3K27me3)、ヒストンH3リジン9トリメチル化(H3K9me3)、ヒストン4リジン20トリメチル化(H4K20me3)、ヒストンH2Aユビキチン化(H2Aub)、ヒストンH2aアセチル化、ヒストンH2Bアセチル化、ヒストンH3アセチル化、ヒストンH4アセチル化、およびヒストンH3リジン4トリメチル化(H3K4me3)からなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
  39. 対象が、FMR1遺伝子の5’UTR内の多型CGGリピートの増幅の存在に基づいて、必要があるとして同定される、請求項1~38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 増幅が、約55個のCGGリピートおよび約200個のCGGリピートの間を含む、請求項39に記載の方法。
  41. 増幅が、200個よりも多くのCGGリピートを含む、請求項39に記載の方法。
  42. 有効量が、対象のCNS、精巣、卵巣、食道上皮、胸腺、眼、または脾臓に送達される、請求項1~41のいずれか一項に記載の方法。
  43. 有効量が対象のCNSに送達される、請求項42に記載の方法。
  44. 有効量がニューロン細胞に送達される、請求項43に記載の方法。
  45. ニューロン細胞が分化したニューロン細胞である、請求項44に記載の方法。
  46. エピジェネティックなモジュレーターが、FMR1とFMR1をコードするmRNAとの間のRループの形成を阻害する、請求項1~45のいずれか一項に記載の方法。
  47. 投与前および/または後の対象のFMR1のエピジェネティックなプロファイルを評価することをさらに含み、FMR1のエピジェネティックなプロファイルの変化が処置の有効性を示す、請求項1~45のいずれか一項に記載の方法。
  48. 方法が、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量と細胞を接触させることを含み、エピジェネティックなモジュレーターが細胞のFMR1を再活性化する、
    細胞の転写不活性なFMR1遺伝子を再活性化するための方法。
  49. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターがメチルトランスフェラーゼの阻害剤である、請求項48に記載の方法。
  50. メチルトランスフェラーゼがDNAメチルトランスフェラーゼである、請求項49に記載の方法。
  51. DNAメチルトランスフェラーゼが、DNMT1、DNMT3A、およびDNMT3Bからなる群から選択される、請求項50に記載の方法。
  52. DNAメチルトランスフェラーゼがDNMT1であり、エピジェネティックなモジュレーターがDNMT1を特異的に阻害する、請求項51に記載の方法。
  53. エピジェネティックなモジュレーターが5-アザシチジンである、請求項50に記載の方法。
  54. メチルトランスフェラーゼがヒストンメチルトランスフェラーゼである、請求項49に記載の方法。
  55. ヒストンメチルトランスフェラーゼが、EZH2、SETDB1、EHMTl/GLP、EHMT2/G9a、SUV39H1、SUV420H1、およびSUV420H2からなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
  56. ヒストンメチルトランスフェラーゼがSUV39H1であり、エピジェネティックなモジュレーターがSUV39H1を特異的に阻害する、請求項54に記載の方法。
  57. エピジェネティックなモジュレーターがケトシンである、請求項54に記載の方法。
  58. ヒストンメチルトランスフェラーゼがEZH2であり、エピジェネティックなモジュレーターがEZH2を特異的に阻害する、請求項54に記載の方法。
  59. エピジェネティックなモジュレーターが、EPZ6438またはGSK126である、請求項54に記載の方法。
  60. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンユビキチンリガーゼの阻害剤である、請求項48に記載の方法。
  61. ヒストンユビキチンリガーゼが、ヒストンH2Aをユビキチン化するユビキチンリガーゼである、請求項60に記載の方法。
  62. ヒストンユビキチンリガーゼが、RING1B/RNF2である、請求項60または61に記載の方法。
  63. エピジェネティックなモジュレーターが、RING1/RNF2を選択的に阻害する、請求項62に記載の方法。
  64. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤である、請求項48に記載の方法。
  65. エピジェネティックなモジュレーターが、HDAC5、HDAC10、SIRT5を選択的に阻害する、請求項64に記載の方法。
  66. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンデメチラーゼの阻害剤である、請求項48に記載の方法。
  67. エピジェネティックなモジュレーターが、KDM5DまたはKDM5Cを選択的に阻害する、請求項66に記載の方法。
  68. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、活性なマークの阻害因子を標的化する、請求項48に記載の方法。
  69. 活性なマークが、H2A、H2B、H3、およびH4からなる群から選択される少なくとも1つのヒストンのアセチル化である、請求項68に記載の方法。
  70. 活性なマークが、ヒストンH3リジン4のトリメチル化(H3K4me3)である、請求項68に記載の方法。
  71. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、次:
    HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、KDM5A、KDM5B、KDM5C、またはKDM5D
    の少なくとも1つを標的化する、請求項68~70のいずれか一項に記載の方法。
  72. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、核酸、ポリペプチド、または小分子である、請求項48~71のいずれか一項に記載の方法。
  73. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが核酸である、請求項48~72のいずれか一項に記載の方法。
  74. 核酸が、二本鎖RNA(dsRNA)、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)からなる群から選択される干渉核酸である、請求項73に記載の方法。
  75. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが、表2にリスト化された干渉核酸である、請求項48~74のいずれか一項に記載の方法。
  76. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターがポリペプチドである、請求項48~72のいずれか一項に記載の方法。
  77. ポリペプチドが抗体である、請求項76に記載の方法。
  78. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターが小分子である、請求項48~72のいずれか一項に記載の方法。
  79. 小分子が、表1にリスト化された小分子である、請求項78に記載の方法。
  80. 細胞が、ニューロン細胞または人工多能性幹細胞(iPSC)である、請求項48~79のいずれか一項に記載の方法。
  81. 細胞がインビトロである、請求項48~80のいずれか一項に記載の方法。
  82. 細胞が、FMR1遺伝子の5’UTR内の多型CGGリピートの増幅を含む、請求項48~81のいずれか一項に記載の方法。
  83. 増幅が、約55および約200個のCGGリピートの間を含む、請求項82に記載の方法。
  84. 増幅が、200個よりも多くのCGGリピートを含む、請求項82に記載の方法。
  85. FMR1のエピジェネティックなモジュレーターの有効量との接触に先立って、転写不活性なFMR1遺伝子が、サイレンシングされたFMR1遺伝子と結びついた少なくとも1つのエピジェネティックマークを含む、請求項48~84のいずれか一項に記載の方法。
  86. 少なくとも1つのエピジェネティックマークが、DNAメチル化(DNAme)、ヒストンH3リジン27トリメチル化(H3K27me3)、ヒストンH3リジン9トリメチル化(H3K9me3)、ヒストン4リジン20トリメチル化(H4K20me3)、ヒストンH2Aユビキチン化(H2Aub)、ヒストンH2aアセチル化、ヒストンH2Bアセチル化、ヒストンH3アセチル化、ヒストンH4アセチル化、およびヒストンH3リジン4トリメチル化(H3K4me3)からなる群から選択される、請求項85に記載の方法。
  87. エピジェネティックなモジュレーターが、FMR1とFMR1から転写されたmRNAとの間のRループの形成を阻害する、請求項48~86のいずれか一項に記載の方法。
  88. 方法が、
    (i)不活性化したFMR1遺伝子を含む細胞を候補薬と接触させることと、
    (ii)細胞のFMR1発現レベルを検出することと、
    (iii)FMR1の発現レベルが候補薬との接触後にコントロール細胞に対して増大するときに、候補薬をFMR1のエピジェネティックなモジュレーターとして同定することと、
    を含む、FMR1のエピジェネティックなモジュレーターを同定するための方法。
  89. 細胞が人工多能性幹細胞(iPSC)またはニューロン細胞である、請求項88に記載の方法。
  90. 不活性化したFMR1遺伝子が、エピジェネティックにサイレンシングされたFMR1遺伝子である、請求項88または89に記載の方法。
  91. 細胞が、サイレンシングされたFMR1遺伝子と結びついた少なくとも1つのエピジェネティックマークを含む、請求項88~90のいずれか一項に記載の方法。
  92. 少なくとも1つのエピジェネティックマークが、DNAメチル化(DNAme)、ヒストンH3リジン27トリメチル化(H3K27me3)、ヒストンH3リジン9トリメチル化(H3K9me3)、ヒストン4リジン20トリメチル化(H4K20me3)、ヒストンH2Aユビキチン化(H2Aub)、ヒストンH2aアセチル化、ヒストンH2Bアセチル化、ヒストンH3アセチル化、ヒストンH4アセチル化、およびヒストンH3リジン4トリメチル化(H3K4me3)からなる群から選択される、請求項91に記載の方法。
  93. 細胞が、FMR1遺伝子の5’UTR内の多型CGGリピートの増幅を含む、請求項88~92のいずれか一項に記載の方法。
  94. 候補薬が、化合物ライブラリーから選択される、請求項88~93のいずれか一項に記載の方法。
  95. ライブラリーがメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、請求項94に記載の方法。
  96. ライブラリーがメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる、請求項94に記載の方法。
  97. メチルトランスフェラーゼ阻害剤が、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項95または96に記載の方法。
  98. メチルトランスフェラーゼ阻害剤が、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項95または96に記載の方法。
  99. ライブラリーがヒストンユビキチンリガーゼ阻害剤を含む、請求項94に記載の方法。
  100. ライブラリーがヒストンユビキチンリガーゼ阻害剤からなる、請求項94に記載の方法。
  101. ヒストンユビキチンリガーゼが、ヒストンH2Aをユビキチン化するユビキチンリガーゼである、請求項99または100に記載の方法。
  102. 候補薬が、活性なマークの阻害因子を標的化する、請求項88~93のいずれか一項に記載の方法。
  103. 活性なマークが、H2A、H2B、H3、およびH4からなる群から選択される少なくとも1つのヒストンのアセチル化である、請求項102に記載の方法。
  104. 活性なマークが、ヒストンH3リジン4のトリメチル化(H3K4me3)である、請求項102に記載の方法。
  105. 候補薬が、次:
    HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7、KDM5A、KDM5B、KDM5C、またはKDM5D
    の少なくとも1つを標的化する、請求項102~104のいずれか一項に記載の方法。
  106. 候補薬が、核酸、ポリペプチド、または小分子である、請求項88~105のいずれか一項に記載の方法。
  107. 候補薬が核酸である、請求項88~106のいずれか一項に記載の方法。
  108. 核酸が、二本鎖RNA(dsRNA)、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)からなる群から選択される干渉核酸である、請求項107に記載の方法。
  109. 候補薬がポリペプチドである、請求項88~106のいずれか一項に記載の方法。
  110. ポリペプチドが抗体である、請求項109に記載の方法。
  111. 候補薬が小分子である、請求項88~106のいずれか一項に記載の方法。
  112. 検出が、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)またはFACSによって実行される、請求項88~111のいずれか一項に記載の方法。
  113. エピジェネティックなモジュレーターが、図9Cに示されている化合物またはそれらのいずれか1つの誘導体である、請求項1に記載の方法。
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