JP2022044568A - マイクロプレート及び培養細胞の観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】観察時に各ウェルの培養細胞を順に捉えていくことが容易であり、自動観察に適用した場合の観察効率に優れるマイクロプレートを提供することを目的とする。【解決手段】複数のウェル１４が平面視で四角形状に配列されているマイクロプレート１において、４つの角に位置する４つのウェル１４の中心を各頂点とする四角形Ｓの対向する辺の中点同士を結ぶ２本の直線の交点を原点Ｏとして、２本の直線のうち長いほうの直線をｘ軸とし、原点Ｏを通るｘ軸に垂直な線をｙ軸とするｘｙ座標で、各ウェル１４の中心のｘ座標とｙ座標の理論値と実測値を求めたとき、ｘ座標とｙ座標のそれぞれで、実測値の理論値からのズレの割合の最大値と最小値との差を２．００％以下とする。【選択図】図１

Description

本発明は、マイクロプレート及び培養細胞の観察方法に関する。

生命現象を解明する基礎研究、創薬研究等には検体として培養細胞が多く用いられており、大量の検体を得るための培養容器が広く利用されている。従来の培養細胞の評価は、ＭＴＴ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）等、細胞代謝もしくは代謝物による特性評価が主であった。一方、３次元培養で得られる、細胞が凝集した３次元細胞塊（スフェロイド）は、生体内と同様に立体的な構造を有している。そのため、近年では細胞塊を用いた形態観察の重要性が増している。

３次元培養に用いる培養容器としては、複数のウェルが縦横にマトリックス状に配列されたマイクロプレートが知られている（特許文献１）。各ウェルに培養液を分注して大量培養することで、各ウェルで形成される多くの細胞塊を効率良く観察できる。マイクロプレートの基準としては、ＡＮＳＩ（American National Standards Institute）／ＳＢＳ規格が知られている。ＡＮＳＩ／ＳＢＳ規格では、平面視でプレートの最も外周側に配置されているウェル同士のピッチが規定されている。

特開平１１－１２７８４３号公報

細胞観察としては、自動観察装置を用いて大量の細胞をハイスループットに観察する方法が開発されている。しかし、従来のマイクロプレートでは、ＡＮＳＩ／ＳＢＳ規格に合うものであっても各ウェルの培養細胞を順に正確に捉えていくことが難しく、自動観察の効率が低下しやすい。

本発明は、観察時に各ウェルの培養細胞を順に捉えていくことが容易であり、自動観察に適用した場合の観察効率に優れるマイクロプレートを提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を有する。
［１］複数のウェルが平面視で四角形状に配列されているマイクロプレートであって、
平面視で、４つの角に位置する４つのウェルの中心を各頂点とする四角形における、対向する辺の中点同士を結ぶ２本の直線の交点を原点Ｏとして、２本の直線のうち長いほうの直線をｘ軸とし、前記原点Ｏを通る前記ｘ軸に垂直な線をｙ軸として、
予め設定されている各ウェルのピッチから算出される各ウェルの中心のｘ座標とｙ座標の理論値を求め、各ウェルの中心のｘ座標とｙ座標の実測値と比較したとき、
（ｘ－ｘ_０）／ｘ_０×１００（ただし、ｘはウェルの中心のｘ座標の実測値であり、ｘ_０はウェルの中心のｘ座標の理論値である。）で表される各ウェルのｘ軸方向のズレの割合の最大値と最小値との差が２．００％以下であり、
かつ、（ｙ－ｙ_０）／ｙ_０×１００（ただし、ｙはウェルの中心のｙ座標の実測値であり、ｙ_０はウェルの中心のｙ座標の理論値である。）で表される各ウェルのｙ軸方向のズレの割合の最大値と最小値との差が２．００％以下である、マイクロプレート。
［２］複数のウェルが平面視で四角形状に配列されているマイクロプレートであって、
平面視で、４つの角に位置する４つのウェルの中心を各頂点とする四角形における、対向する辺の中点同士を結ぶ２本の直線の交点を原点Ｏとして、２本の直線のうち長いほうの直線をｘ軸とし、前記原点Ｏを通る前記ｘ軸に垂直な線をｙ軸として、
予め設定されている各ウェルのピッチから算出される各ウェルの中心のｘ座標とｙ座標の理論値を求め、各ウェルの中心のｘ座標とｙ座標の実測値と比較したとき、
（ｘ－ｘ_０）／ｘ_０×１００（ただし、ｘはウェルの中心のｘ座標の実測値であり、ｘ_０はウェルの中心のｘ座標の理論値である。）で表される各ウェルのｘ軸方向のズレの割合が－１．００％以上１．００％以下であり、
かつ、（ｙ－ｙ_０）／ｙ_０×１００（ただし、ｙはウェルの中心のｙ座標の実測値であり、ｙ_０はウェルの中心のｙ座標の理論値である。）で表される各ウェルのｙ軸方向のズレの割合が－１．００％以上１．００％以下である、マイクロプレート。
［３］各ウェルの直径の予め設定されている直径に対するズレの割合の最大値と最小値との差が２．００％以下である、［１］又は［２］のマイクロプレート。
［４］各ウェルの直径の予め設定されている直径に対するズレの割合が－１．００％以上１．００％以下である、［１］～［３］のいずれかのマイクロプレート。
［５］［１］～［４］のいずれかのマイクロプレートのみを用い、各ウェルで培養した培養細胞を自動観察する、培養細胞の観察方法。

本発明によれば、観察時に各ウェルの培養細胞を順に捉えていくことが容易であり、自動観察に適用した場合の観察効率に優れるマイクロプレートを提供できる。

実施形態のマイクロプレートの平面図である。 図１のマイクロプレートのＩ－Ｉ断面図である。 ウェルの中心を説明する平面図である。 マイクロプレートの各ウェルの底面を拡大して示した断面図である。 他の実施形態のマイクロプレートの断面図である。 他の実施形態のマイクロプレートの断面図である。

本明細書における用語の意味及び定義は以下である。
「～」で表される数値範囲は、～の前後の数値を下限値及び上限値とする数値範囲を意味する。
「ウェルの予め設定されているピッチ」とは、マイクロプレートを製造する際に各ウェルのピッチとして設定されている値（設計値）を意味する。例えば、マイクロプレートの製品図面に記載されているピッチを「予め設定されているピッチ」として採用できる。
「ウェルの予め設定されている直径」とは、マイクロプレートを製造する際に各ウェルの直径として設定されている値（設計値）を意味する。例えば、マイクロプレートの製品図面に記載されている直径を「予め設定されている直径」として採用できる。
「ウェルの直径」とは、平面視におけるウェルの開口端の直径を意味する。ウェルの開口端の平面視形状が正円でない場合、ウェルの開口端の平面視形状の内接円の直径とする。

［マイクロプレート］
以下、本発明のマイクロプレートの実施形態の一例を示し、図面に基づいて説明する。なお、以下の説明において例示される図の寸法等は一例であって、本発明はそれらに必ずしも限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施できる。

図１及び図２に示すように、本実施形態のマイクロプレート１は、平面視形状が略矩形の上面部１０と、上面部１０の外縁部から垂直に垂下された周壁部１２と、上面部１０の上面１０ａに円形の開口が形成される有底筒状の複数のウェル１４と、を備えている。

マイクロプレート１では、各ウェル１４の底面１６が培養面となる。この例のウェル１４は、底面１６が平坦な平底になっている。なお、ウェル１４の底面１６は平坦な平底には限定されず、例えば、底面１６が下方に半球状に凹む凹面であってもよく、下方に円錐状に凹む凹面等であってもよい。

ウェル１４の平面視の開口形状は、円形には限定されず、例えば、矩形や多角形であってもよい。ウェル１４の数は、特に限定されず、例えば、４～１５３６個が挙げられる。
この例のマイクロプレート１では、９６個のウェル１４が平面視で縦横に８×１２個の矩形のマトリックス状に配列されている。なお、１６×２４の３８４個のウェルとしてもよく、３２×４８の１５３６個のウェルとしてもよい。

マイクロプレート１は、平面視での各ウェル１４の位置が以下に説明する条件を満たす。
図１に示すように、平面視で、４つの角に位置する４つのウェル１４ａ～１４ｄの中心を各頂点とする四角形Ｓにおいて、対向する辺の中点同士を結ぶ２本の直線の交点を原点Ｏとする。また、２本の直線のうち長いほうの直線をｘ軸とし、原点Ｏを通るｘ軸に垂直な線をｙ軸とする。

ただし、図３に示すように、ウェル１４の中心は、平面視で、ウェル１４の開口端１４ｅの円周上で等角度間隔の４つの点ａ１～ａ４を決め、対向する２点を結ぶ直交する２本の直線の交点とする。例えば、観察装置によって上方からウェル１４を観察し、ウェル１４の開口端１４ｅの円周上で等角度間隔の任意の４つの点ａ１～ａ４にピントを合わせ、対向する２点を結ぶ直交する２本の直線（点ａ１と点ａ３を結ぶ直線と、点ａ２と点ａ４を結ぶ直線）の交点をウェル１４の中心とする。
なお、ウェル１４の開口端１４ｅの平面視形状が正円でない場合、ウェル１４の開口端１４ｅの平面視での内接円上で等角度間隔の４つの点ａ１～ａ４を決め、対向する２点を結ぶ直交する２本の直線の交点をウェル１４の中心とする。

次いで、平面視での原点Ｏを基準点とするｘｙ座標上で、予め設定されているピッチから理論的に算出される各ウェル１４の中心のｘ座標とｙ座標の理論値を求める。また、前記ｘｙ座標上での各ウェル１４の中心のｘ座標とｙ座標を実測する。例えば、観察装置により上方からマイクロプレート１を観察し、その観察画像において任意の地点を基準とする各ウェル１４の中心のｘ軸方向の位置とｙ軸方向の位置をそれぞれ測定する。その後、それらの位置の測定値を、原点Ｏを基準点としたときのｘ座標及びｙ座標に換算し、各ウェル１４の中心のｘ座標とｙ座標の実測値とする。

各ウェル１４の中心のｘ座標の実測値の理論値からのズレの割合（以下、「割合Ｑ_ｘ」とも記す。）は、下記式１で表される。
（ｘ－ｘ_０）／ｘ_０×１００ ・・・式１
ただし、前記式１中、ｘはウェル１４の中心のｘ座標の実測値である。ｘ_０はウェル１４の中心のｘ座標の理論値である。

各ウェル１４の中心のｙ座標の実測値の理論値からのズレの割合（以下、「割合Ｑ_ｙ」とも記す。）は、下記式２で表される。
（ｙ－ｙ_０）／ｙ_０×１００ ・・・式２
ただし、前記式２中、ｙはウェル１４の中心のｙ座標の実測値である。ｙ_０はウェル１４の中心のｙ座標の理論値である。

マイクロプレート１では、各ウェル１４の中心の位置が下記条件１及び条件２の少なくとも一方を満たす。
条件１：各ウェル１４について求めた割合Ｑ_ｘの最大値と最小値との差が２．００％以下であり、かつ各ウェル１４について求めた割合Ｑ_ｙの最大値と最小値との差が２．００％以下である。
条件２：各ウェル１４について求めた割合Ｑ_ｘが－１．００％以上１．００％以下の範囲内であり、かつ各ウェル１４について求めた割合Ｑ_ｙが－１．００％以上１．００％以下の範囲内である。
条件２は、すべてのウェル１４の割合Ｑ_ｘと割合Ｑ_ｙが－１．００％以上１．００％以下の範囲内であることを意味する。

マイクロプレート１は、条件１のみを満たしていてもよく、条件２のみを満たしていてもよく、条件１と条件２の両方を満たしていてもよい。これにより、各ウェル１４で培養した培養細胞が平面視で縦方向（ｙ軸方向）と横方向（ｘ軸方向）に等間隔に並びやすくなる。そのため、自動観察装置を用いたハイスループットな観察においても各培養細胞を順に捉えることが容易になり、観察効率が高くなるうえ、培養細胞の見落としも抑制できる。マイクロプレート１は、本発明の効果が得られやすい点から、条件１と条件２の両方を満たしていることが好ましい。

割合Ｑ_ｘの最大値と最小値との差は、２．００％以下が好ましく、１．５０％以下がより好ましく、１．００％以下がさらに好ましく、０．８０％以下が特に好ましい。
割合Ｑ_ｘは、－１．００％以上１．００％以下が好ましく、－０．６０％以上０．９０％以下がより好ましく、－０．２０％以上０．８０％以下がさらに好ましく、－０．２０％以上０．６０％以下が特に好ましい。

割合Ｑ_ｙの最大値と最小値との差は、２．００％以下が好ましく、１．５０％以下がより好ましく、１．００％以下がさらに好ましく、０．８０％以下が特に好ましい。
割合Ｑ_ｙは、－１．００％以上１．００％以下が好ましく、－０．７０％以上０．８０％以下がより好ましく、－０．６０％以上０．４５％以下がさらに好ましく、－０．３５％以上０．４０％以下が特に好ましい。

各ウェル１４の予め設定されている直径をＤ（ｍｍ）、各ウェル１４の直径の実測値をｄ（ｍｍ）とすると、各ウェル１４の直径の実測値の設計値からのズレの割合（以下、「割合Ｑ_ｄ」とも記す。）は、（ｄ－Ｄ）／Ｄ×１００で表される。マイクロプレート１は、下記条件３及び下記条件４の少なくとも一方を満たすことが好ましい。
条件３：各ウェル１４について求めた割合Ｑ_ｄの最大値と最小値との差が２．００％以下である。
条件４：各ウェル１４について求めた割合Ｑ_ｄが－１．００％以上１．００％以下である。
条件４は、すべてのウェル１４の割合Ｑ_ｄが－１．００％以上１．００％以下の範囲内であることを意味する。

マイクロプレート１は、条件３と条件４のうちの一方のみを満たしていてもよく、条件３と条件４の両方を満たしていてもよい。各ウェル１４で培養した培養細胞が平面視でさらに等間隔に並びやすくなるため、多量の培養細胞のハイスループットな自動観察がさらに容易になる。マイクロプレート１は、本発明の効果が得られやすい点から、条件３と条件４の両方を満たしていることが好ましい。

割合Ｑ_ｄの最大値と最小値との差は、２．００％以下が好ましく、１．００％以下がより好ましく、０．５０％以下がさらに好ましく、０．２０％以下が特に好ましい。
割合Ｑ_ｄは、－１．００％以上１．００％以下が好ましく、－０．５０％以上０．５０％以下がより好ましく、－０．４０％以上０．１０％以下がさらに好ましく、－０．３０％以上－０．１０％以下が特に好ましい。

ウェル１４の開口の平均直径は、１．５ｍｍ以上４０ｍｍ以下が好ましく、１．７ｍｍ以上３５ｍｍ以下がより好ましい。ウェル１４の開口の平均直径が前記範囲の下限値以上であれば、形成したスフェロイドの創薬スクリーニングに適するため好ましい。ウェル１４の開口の平均直径が前記範囲の上限値以下であれば、培地の揺れが抑えられるためスフェロイドの飛び出しを防ぐことができる。

ウェル１４の平均深さは、４．０ｍｍ以上２０ｍｍ以下が好ましく、５．０ｍｍ以上１８ｍｍ以下がより好ましい。ウェル１４の平均深さが前記範囲の下限値以上であれば、培養に必要最低限の量の培地を十分に入れることができる。ウェル１４の平均深さが前記範囲の上限値以下であれば、ウェル内でスフェロイドを取り出しやすい。

図４に示すように、サイズが均一な細胞塊が得られやすい点から、ウェル１４の底面１６には、サイズが均一な複数の微細ウェル１９が形成されていることが好ましい。
微細ウェル１９の開口形状は、特に限定されず、例えば、円形、楕円形、多角形、不規則な形状を例示できる。微細ウェル１９の開口の平均直径、開口面積、平均深さ、数等の寸法は、特に限定されず、適宜設定すればよい。例えば、微細ウェル１９の開口の平均直径は２０～２０００μｍ、開口面積は、０．１５ｍｍ^２以上０．５０ｍｍ^２以下、平均深さは１０～１５００μｍに設定できる。底面１６に形成される微細ウェル１９の数は、単位面積あたり、１０～２００００個／ｃｍ^２に設定できる。

微細ウェル１９の開口の平均直径は、所望のスフェロイドの大きさに合わせて適宜調整でき、２０μｍ以上２０００μｍ以下が好ましく、１００μｍ以上１５００μｍ以下がより好ましく、２００μｍ以上１０００μｍ以下がさらに好ましい。微細ウェル１９の開口の平均直径が前記範囲の下限値以上であれば、所望の大きさのスフェロイドを形成しやすい。微細ウェル１９の開口の平均直径が前記範囲の上限値以下であれば、微細ウェル１９から細胞がこぼれることを抑制しやすく、均一な大きさのスフェロイドを形成しやすい。
なお、微細ウェル１９の開口の直径は、レーザ顕微鏡（キーエンス社製）等によって測定される。

微細ウェル１９の開口面積は、０．１５ｍｍ^２以上０．５０ｍｍ^２以下が好ましく、０．２０ｍｍ^２以上０．３５ｍｍ^２以下がより好ましく、０．２４ｍｍ^２以上０．３０ｍｍ^２以下がさらに好ましい。微細ウェル１９の開口面積が前記範囲の下限値以上であれば、所望の大きさのスフェロイドを形成しやすい。微細ウェル１９の開口面積が前記範囲の上限値以下であれば、微細ウェル１９から細胞がこぼれることを抑制しやすく、均一な大きさのスフェロイドを形成しやすい。
なお、微細ウェル１９の開口面積は、レーザ顕微鏡（キーエンス社製）等によって測定される。

微細ウェル１９の平均深さは、１０μｍ以上１５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上１０００μｍ以下がより好ましく、１００μｍ以上６００μｍ以下がさらに好ましい。微細ウェル１９の平均深さが前記範囲の下限値以上であれば、所望の大きさのスフェロイドを形成しやすい。微細ウェル１９の平均深さが前記範囲の上限値以下であれば、微細ウェル１９から細胞がこぼれることを抑制しやすく、均一な大きさのスフェロイドを形成しやすい。
なお、微細ウェル１９の深さは、レーザ顕微鏡（キーエンス社製）等によって測定される。

培養領域における微細ウェル１９の単位面積当たりの平均数は、１０個／ｃｍ^２以上が好ましく、１５個／ｃｍ^２以上がより好ましく、２０個／ｃｍ^２以上がさらに好ましい。また、培養領域における微細ウェル１９の単位面積当たりの平均数は、２００００個／ｃｍ^２以下が好ましく、１００００個／ｃｍ^２以下がより好ましく、５０００個／ｃｍ^２以下がさらに好ましい。微細ウェル１９の単位面積当たりの平均数が前記下限値以上であれば、所望の大きさのスフェロイドを形成しやすい。

微細ウェル１９の配置パターンは、特に限定されず、規則的なパターンで形成してもよく、不規則に形成してもよく、規則的な部分と不規則な部分が混在していてもよい。規則的な配置パターンとしては、例えば、隙間なく並べた正方形の各頂点に微細ウェルを配置するパターン、隙間なく並べた正六角形の各頂点と中央に微細ウェルを配置するパターン、千鳥状のパターンを例示できる。

マイクロプレート１の材質としては、樹脂又はガラスが好ましい。
樹脂としては、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ塩化ビニル、高密度ポリエチレン、ポリエーテルサルファン、ＰＥＴ共重合体、パーマノックス（サーモフィッシャーサイエンティフィック商標）、シクロオレフィンポリマー樹脂、サイトップ（ＡＧＣ商標）、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂及びシリコーン樹脂から選ばれる１種が好ましく、透明性が高く、薬剤吸着性が低いという点から、ポリスチレン樹脂が特に好ましい。マイクロプレート１を構成する樹脂は、１種でもよく、２種以上でもよい。

ガラスとしては、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、リン酸ガラス、化学強化ガラス等を例示できる。マイクロプレート１を構成するガラスは、１種でもよく、２種以上でもよい。

マイクロプレート１の周壁部１２は、透明でも不透明でもよく、観察性の観点から不透明が好ましい。周壁部１２を不透明とする場合、色調としては黒や白などとすると、蛍光・発光を遮断できるためより好ましい。周壁部１２を不透明にする方法としては、特に限定されず、例えば、微粒子を添加する方法、顔料等の着色料を添加する方法等を用いることができる。黒の場合はカーボン等、白の場合は酸化チタン等を用いることができる。

マイクロプレート１の製造方法は、特に限定されず、例えば、射出成形法、圧縮成形法によって成形できる。なかでも、条件１又は条件２を満たす複数のウェル１４を有するマイクロプレート１を製造しやすい点から、射出成形法が好ましい。

微細ウェル１９を形成する方法としては、例えば、レーザ照射を例示できる。樹脂製のマイクロプレート１の場合、ウェル１４の底面１６である培養面にレーザ光が照射されると、培養面を構成する樹脂が溶解及び気化して、非常に滑らかな表面を持つ微細ウェル１９が形成される。微細ウェル１９の開口周辺には、溶解した樹脂が盛り上がって土手部が形成されてもよい。

レーザ光源としては、特に限定されず、ＣＯ_２レーザを例示できる。微細ウェル１９の配置及びサイズは、レーザ光の照射位置や出力、時間等の照射条件を調節することによって調節できる。
レーザ出力は、例えば、１～１００Ｗの範囲で固定し、レーザ照射時間は、例えば、０．１～１００μｓの範囲で固定してレーザ照射を行うことで、各微細ウェル１９のサイズを均一にできる。

培養面であるウェル１４の底面１６には、細胞の接着を抑制する低接着コート膜を形成してもよい。低接着コート膜が形成されることで、培養細胞を取り出しやすくなる。低接着コート膜は、例えば、細胞接着抑制剤を塗布することによって形成できる。細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等）、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、フッ素含有化合物、ポリエチレングリコールを例示できる。細胞接着抑制剤としては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
なお、マイクロプレート１全体又は底面１６をシリコーン樹脂等の細胞接着抑制効果のある樹脂や、前記細胞接着抑制剤を配合した合成樹脂等で成形すれば、低接着コート膜を形成しなくても底面１６に細胞が接着することを抑制できる。

ウェル１４の底面１６には、細胞を接着させやすくする易接着コート膜を形成してもよい。易接着コート膜を形成する材料としては、コラーゲン、ゼラチンを例示できる。易接着コート膜を形成する材料としては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
なお、マイクロプレート１全体又は底面１６を細胞接着効果のある樹脂や、細胞易接着コート剤を配合した合成樹脂で成形してもよい。また、コート剤以外でも、プラズマ処理、コロナ放電等の物理的処理を行い、細胞を接着しやすくしてもよい。

以上説明したように、本発明のマイクロプレートにおいては、各ウェルが条件１及び条件２の少なくとも一方を満たす。これにより、各ウェル１４で培養した培養細胞が平面視で等間隔に並びやすくなる。そのため、自動観察装置を用いたハイスループットな観察においても各ウェルの培養細胞を順に捉えることが容易になり、観察効率が高くなるうえ、培養細胞の見落としも抑制できる。

なお、本発明のマイクロプレートは、前記した態様には限定されない。
例えば、本発明のマイクロプレートは、図５に例示したマイクロプレート２であってもよい。マイクロプレート２は、ウェル１４が底面１６の代わりに底面１６Ａを有する以外はマイクロプレート１と同様の態様である。図５における図２と同じ部分は同符号を付して説明を省略する。

マイクロプレート２のウェル１４の底面１６Ａは、下方に半球状に凹む凹面である。マイクロプレート２においても、条件１及び条件２の少なくとも一方を満たすことで、自動観察装置であっても各ウェル１４で培養した培養細胞を捉えることが容易になる。

本発明のマイクロプレートは、図６に例示したマイクロプレート３であってもよい。図６における図２と同じ部分は同符号を付して説明を省略する。
マイクロプレート３は、枠体２０と、平板基材２２とを備えている。枠体２０は、上面部１０と、上面部１０の外縁部から垂直に垂下された周壁部１２と、上面部１０の上面１０ａに円形の開口が形成され、かつ下端が開口した複数の筒部２４とを備えている。そして、複数の筒部２４の下端側に平板基材２２が取り付けられることで、複数のウェル１４が形成されている。

このように、マイクロプレート３は、別部材である平板基材２２が各筒部２４の下端側に取り付けられて各々のウェル１４が形成されている以外は、マイクロプレート１と同様の態様である。マイクロプレート３においても、条件１及び条件２の少なくとも一方を満たすことで、自動観察装置であっても各ウェル１４で培養した培養細胞を捉えることが容易になる。

その他、本発明の趣旨に逸脱しない範囲で、前記実施形態における構成要素を周知の構成要素に置き換えることは適宜可能であり、また、前記した変形例を適宜組み合わせてもよい。

［培養細胞の観察方法］
本発明の培養細胞の観察方法は、本発明のマイクロプレートのみを用いて、各ウェルで培養した培養細胞を自動観察する方法である。例えば、条件１及び条件２の少なくとも一方を満たすマイクロプレート１のみを用い、各ウェル１４に培養液を分注して細胞を培養し、自動観察装置によって各ウェル１４の培養細胞を自動観察する。

培養細胞の自動観察に用いるマイクロプレート１は、条件１及び条件２の少なくとも一方を満たすため、自動観察装置を用いたハイスループットな観察においても各ウェル１４の培養細胞を捉えることが容易であり、観察効率が高い。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。

［例１、２、３］
各ウェルのピッチの設定値（隣り合ったウェル間のｘ方向およびｙ方向の距離）を９ｍｍ、直径の予め設定されている直径（Ｄ）を７ｍｍとして、図１及び図２に例示したような態様の９６ウェル（８×１２）のマイクロプレートを作製した。
マイクロプレートの四隅のウェルによって得られる中心位置を基準原点（ｘ＝０，ｙ＝０）とし、各ウェルのピッチの設定値が９ｍｍであることをもとに各ウェルの中心のｘ座標及びｙ座標の理論値（ｘ_０，ｙ_０）を求めた。画像測定機（ＮＥＸＩＶ ＶＭＺ－Ｒ４５４０、ニコン社製）によって観察し実測値（ｘ，ｙ）を求め、割合Ｑ_ｘ及びＱ_ｙを算出した。割合Ｑ_ｘ及びＱ_ｙの最大値、最小値、及び最大値と最小値との差を表１に示す。また、各ウェルの直径ｄを測定し、設定値（Ｄ）との割合Ｑ_ｄを算出した。割合Ｑ_ｄの最大値、最小値、及び最大値と最小値との差を表１に示す。

［例４、５、６］
各ウェルのピッチの設定値（隣り合ったウェル間のｘ方向およびｙ方向の距離）を９ｍｍ、直径の予め設定されている直径（Ｄ）を６．８５８ｍｍとして、図１及び図２に例示したような態様の９６ウェル（８×１２）のマイクロプレートを作製した。
マイクロプレートの四隅のウェルによって得られる中心位置を基準原点（ｘ＝０，ｙ＝０）とし、各ウェルのピッチの設定値が９ｍｍであることをもとに各ウェルの中心のｘ座標及びｙ座標の理論値（ｘ_０，ｙ_０）を求めた。画像測定機（ＮＥＸＩＶ ＶＭＺ－Ｒ４５４０、ニコン社製）によって観察し実測値（ｘ，ｙ）を求め、割合Ｑ_ｘ及びＱ_ｙを算出した。割合Ｑ_ｘ及びＱ_ｙの最大値、最小値、及び最大値と最小値との差を表２に示す。また、各ウェルの直径ｄを測定し、設定値（Ｄ）との割合Ｑ_ｄを算出した。割合Ｑ_ｄの最大値、最小値、及び最大値と最小値との差を表２に示す。

［ウェル位置の均一性］
各例のマイクロプレートについて、画像測定機（ＮＥＸＩＶ ＶＭＺ－Ｒ４５４０、ニコン社製）によって観察し、各ウェルの割合Ｑ_ｘ及びＱ_ｙ測定して、ウェル位置の均一性を以下の基準で評価した。結果を表１及び表２に示す。
◎（優良）：割合Ｑ_ｘ及びＱ_ｙの最大値と最小値との差がいずれも１．００％以下。
○（良）：割合Ｑ_ｘ及びＱ_ｙの最大値と最小値との差がいずれも２．００％以下、かつ、少なくとも一方が１．００％超。
×（不良）：割合Ｑ_ｘ及びＱ_ｙの最大値と最小値との差の少なくとも一方が２．００％超。

［ウェル直径の均一性］
各例のマイクロプレートについて、画像測定機（ＮＥＸＩＶ ＶＭＺ－Ｒ４５４０、ニコン社製）によって観察し、各ウェルの割合Ｑｄを測定して、ウェル直径の均一性を以下の基準で評価した。結果を表３に示す。
◎（優良）：割合Ｑ_ｄの最大値と最小値との差が１．００％以下。
〇（良）：割合Ｑ_ｄの最大値と最小値との差が１．００％超、２．００％以下。
×（不良）：割合Ｑ_ｄの最大値と最小値との差が２．００％超。

１～３…マイクロプレート、１０…上面部、１０ａ…上面、１２…周壁部、１４…ウェル、１６，１６Ａ…底面、１９…微細ウェル、２０…枠体、２２…平板基材、２４…筒部。

Claims (5)

1. 複数のウェルが平面視で四角形状に配列されているマイクロプレートであって、
   平面視で、４つの角に位置する４つのウェルの中心を各頂点とする四角形における、対向する辺の中点同士を結ぶ２本の直線の交点を原点Ｏとして、２本の直線のうち長いほうの直線をｘ軸とし、前記原点Ｏを通る前記ｘ軸に垂直な線をｙ軸として、
   予め設定されている各ウェルのピッチから算出される各ウェルの中心のｘ座標とｙ座標の理論値を求め、各ウェルの中心のｘ座標とｙ座標の実測値と比較したとき、
   （ｘ－ｘ_０）／ｘ_０×１００（ただし、ｘはウェルの中心のｘ座標の実測値であり、ｘ_０はウェルの中心のｘ座標の理論値である。）で表される各ウェルのｘ軸方向のズレの割合の最大値と最小値との差が２．００％以下であり、
   かつ、（ｙ－ｙ_０）／ｙ_０×１００（ただし、ｙはウェルの中心のｙ座標の実測値であり、ｙ_０はウェルの中心のｙ座標の理論値である。）で表される各ウェルのｙ軸方向のズレの割合の最大値と最小値との差が２．００％以下である、マイクロプレート。
2. 複数のウェルが平面視で四角形状に配列されているマイクロプレートであって、
   平面視で、４つの角に位置する４つのウェルの中心を各頂点とする四角形における、対向する辺の中点同士を結ぶ２本の直線の交点を原点Ｏとして、２本の直線のうち長いほうの直線をｘ軸とし、前記原点Ｏを通る前記ｘ軸に垂直な線をｙ軸として、
   予め設定されている各ウェルのピッチから算出される各ウェルの中心のｘ座標とｙ座標の理論値を求め、各ウェルの中心のｘ座標とｙ座標の実測値と比較したとき、
   （ｘ－ｘ_０）／ｘ_０×１００（ただし、ｘはウェルの中心のｘ座標の実測値であり、ｘ_０はウェルの中心のｘ座標の理論値である。）で表される各ウェルのｘ軸方向のズレの割合が－１．００％以上１．００％以下であり、
   かつ、（ｙ－ｙ_０）／ｙ_０×１００（ただし、ｙはウェルの中心のｙ座標の実測値であり、ｙ_０はウェルの中心のｙ座標の理論値である。）で表される各ウェルのｙ軸方向のズレの割合が－１．００％以上１．００％以下である、マイクロプレート。
3. 各ウェルの直径の予め設定されている直径に対するズレの割合の最大値と最小値との差が２．００％以下である、請求項１又は２に記載のマイクロプレート。
4. 各ウェルの直径の予め設定されている直径に対するズレの割合が－１．００％以上１．００％以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載のマイクロプレート。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載のマイクロプレートのみを用い、各ウェルで培養した培養細胞を自動観察する、培養細胞の観察方法。

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