JP2022044024A - Fagopyrum plant having reduced amylose content - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、デンプン特性（アミロース含有率）が改変されたソバ属植物に関する。 The present invention relates to buckwheat plants with modified starch properties (amylose content).
タデ科に分類されるソバ属植物の栽培種には、ソバ（Fagopyrum esculentum)、ダッタンソバ（F. tataricum）、宿根ソバ（F. cymosum）がある。我が国では、ソバおよびダッタンソバが主に食品として利用されている。宿根ソバの利用は少ないが、湿害抵抗性が強いこともあり今後の利用が期待されている。また、自家和合性をもつソバ野生種（F.homotropicum）の利用も始まっている。さらに、これらの品種のいずれかの雑種、例えばダッタンソバと宿根ソバの雑種（F.giganteum）、普通ソバと野生種の雑種等も利用が始まりつつある。 Cultivated species of buckwheat plants classified in the Polygonaceae family include buckwheat (Fagopyrum esculentum), buckwheat (F. tataricum), and buckwheat root (F. cymosum). In Japan, buckwheat and buckwheat are mainly used as foods. Although the use of buckwheat is small, it is expected to be used in the future due to its strong resistance to moisture damage. In addition, the use of wild buckwheat species (F.homotropicum) with self-incompatibility has begun. Furthermore, hybrids of any of these varieties, such as buckwheat and buckwheat hybrids (F.giganteum), and hybrids of ordinary buckwheat and wild buckwheat, are beginning to be used.
ソバ穀実を利用する際には、食感、および食品製造時の作業性（生地のまとまり、伸び具合等）が重要な要素であり、それらにはデンプンが大きな影響を与える。デンプンはグルコースが直鎖状に重合したアミロースと、枝分かれしたアミロペクチンに大別される。穀物においてはアミロース含有率が低くなるといわゆるモチモチ感が強くなるとともに生地がまとまりやすくなる。 When using buckwheat grain, texture and workability during food production (dough cohesion, elongation, etc.) are important factors, and starch has a great influence on them. Starch is roughly classified into amylose, which is a linear polymer of glucose, and amylopectin, which is a branch. In grains, when the amylose content is low, the so-called chewy feeling becomes stronger and the dough becomes easier to organize.
コメや小麦においては、数パーセントのアミロース含有率の低下により食感が大きく改良されることが示されている。ソバのアミロース含有率は、現在のイネやムギの主要品種より高く、全粒粉においてはおよそ20～30％である(非特許文献１)。我が国では、ソバは麺として利用されることが一般的であるが、上述のとおりアミロース含有率が高いため、生地のまとまりが悪く、食感のバリエーションが限られている。また、ロシアでは、ソバは粒（カーシャ）として利用されるが、アミロース含有率が高いため調理後の時間経過にともないデンプンが老化しやすく、食感が悪くなる（固く、もろくなる）。 In rice and wheat, a few percent reduction in amylose content has been shown to significantly improve texture. The amylose content of buckwheat is higher than that of the current main varieties of rice and wheat, and is about 20 to 30% in whole grain flour (Non-Patent Document 1). In Japan, buckwheat is generally used as noodles, but as mentioned above, the content of amylose is high, so that the dough is not well organized and the variation in texture is limited. In Russia, buckwheat is used as grains (kasha), but because of its high amylose content, starch tends to age over time after cooking, resulting in a poor texture (hard and brittle).
アミロースは顆粒性デンプン合成酵素（Granule-Bound Starch Synthase; 以下GBSS）により合成されるとされている。例えば、コメ、コムギ、オオムギ等においてはGBSSの発現が抑制されるとアミロース含有率が低下し、完全に欠失した場合にモチ性となることが示されている。 Amylose is said to be synthesized by Granule-Bound Starch Synthase (GBSS). For example, in rice, wheat, barley and the like, it has been shown that when the expression of GBSS is suppressed, the amylose content decreases, and when it is completely deleted, it becomes mochi.
ソバのアミロース含有率を低下させる技術としては、ソバのGBSSの発現を抑制またはノックアウトすることが検討されている（特許文献１～６）。しかし、ソバにおいてGBSSの発現抑制やノックアウトにより実際にアミロース含有率が低下するかどうかについての知見は存在しない。
As a technique for reducing the amylose content of buckwheat, suppression or knockout of GBSS expression in buckwheat has been studied (
また、ソバの低アミロース系統に関する報告があるが（非特許文献２）、その系統のGBSSの発現については不明であり、また採種ができず現在は失われており、再現することができない。 In addition, although there is a report on a low-amylose line of buckwheat (Non-Patent Document 2), the expression of GBSS in that line is unknown, and it cannot be sown and is currently lost and cannot be reproduced.
ソバのアミロース含有率を低下させることができれば、食感、および食品製造時の作業性を向上させることができ、また物性の改変により麺以外の食品用途にも利用を拡大できると考えられる。ソバ麺の副原料として小麦粉や加工デンプン等を配合し、物性を改変する技術はあるが、改善の程度が十分ではない。またソバが持つ特有の香りは重要な品質特性であるが、副原料の配合により食品中のソバ粉の配合割合が相対的に低下するため、ソバそのもののアミロース含有率を低下させることが求められている。 If the amylose content of buckwheat can be reduced, the texture and workability during food production can be improved, and it is considered that the use can be expanded to food applications other than noodles by modifying the physical properties. There is a technique to modify the physical properties by blending wheat flour, modified starch, etc. as an auxiliary raw material for buckwheat noodles, but the degree of improvement is not sufficient. In addition, the unique aroma of buckwheat is an important quality characteristic, but since the proportion of buckwheat flour in foods is relatively reduced due to the inclusion of auxiliary ingredients, it is required to reduce the amylose content of buckwheat itself. ing.
本発明者らは、今般、突然変異処理を行ったソバ属植物の中から、GBSS遺伝子に変異が生じたことで野生型と比較しアミロース含有率が低下しているソバ植物体を獲得し、本発明を完成した。 The present inventors have recently obtained buckwheat plants having a lower amylose content than wild-type plants due to mutations in the GBSS gene from among the buckwheat plants that have been mutated. The present invention has been completed.
本発明は以下を提供する。
［１］ 下記の少なくとも一方を満たす、ソバ属植物。
・アミロース含有率が、野生型に比較して少なくとも8.0%低い
・アミロース含有率が、26％以下である
［２］ 活性型のデンプン合成酵素（GBSS）遺伝子に変異を有する、１に記載のソバ属植物。
［３］ 変異が、スプライシング変異、ストップコドン挿入変異、およびアミノ酸置換変異からなる群より選択されるいずれかである、２に記載のソバ属植物。
［４］ GBSSが、GBSSaである、１～３のいずれか１項に記載のソバ属植物。
［５］ 以下のいずれかのポリヌクレオチドを有する、ソバ属植物。
（a）配列番号：２の配列からなるポリヌクレオチド。
（b）配列番号：２の配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の配列同一性を有し、配列番号：２の位置１８４６に相当するヌクレオチドがＡではない、ポリヌクレオチド。
［６］ ソバ属植物が、ソバ（Fagopyrum esculentum)、ダッタンソバ（F. tataricum）、宿根ソバ（F. cymosum）、もしくはソバ野生種（F.homotropicum）、又はそれらのいずれかの雑種である、１～５のいずれか１項に記載のソバ属植物。
［７］ １～６のいずれか１項に記載のソバ属植物の、植物体。
［８］ ７に記載の植物体、またはその後代を用いることを含む、ソバ属植物の育種方法。
［９］ ７に記載の植物体の、収穫物、繁殖材料または加工品。
［１０］ 以下のいずれかのタンパク質の活性を抑制することによる、ソバ属植物のアミロース含有率を低下させる方法：
（Ａ）配列番号：８～１３のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号：８～１３のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号：８～１３のいずれか１つのアミノ酸配列において１～６０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質。
［１１］ １０に記載の方法であって、タンパク質の活性を抑制することが、下記のいずれかのタンパク質の活性を抑制することである、方法：
（Ａ’）配列番号：８、１０、および１２のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ’）配列番号：８、１０、および１２のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質；
（Ｃ’）配列番号：８、１０、および１２のいずれか１つのアミノ酸配列において１～６０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質。
The present invention provides:
[1] A buckwheat plant that satisfies at least one of the following.
-The amylose content is at least 8.0% lower than that of the wild type.-The amylose content is 26% or less. [2] The buckwheat according to 1 having a mutation in the active starch synthase (GBSS) gene. Buckwheat.
[3] The buckwheat plant according to 2, wherein the mutation is one selected from the group consisting of a splicing mutation, a stop codon insertion mutation, and an amino acid substitution mutation.
[4] The buckwheat genus plant according to any one of 1 to 3, wherein GBSS is GBSSa.
[5] A buckwheat plant having any of the following polynucleotides.
(A) A polynucleotide consisting of the sequence of SEQ ID NO: 2.
(B) A polynucleotide having 80% or more sequence identity with a polynucleotide consisting of the sequence of SEQ ID NO: 2, and the nucleotide corresponding to position 1846 of SEQ ID NO: 2 is not A.
[6] The buckwheat genus plant is buckwheat (Fagopyrum esculentum), buckwheat (F. tataricum), buckwheat root (F. cymosum), or wild buckwheat (F. homotropicum), or a hybrid thereof. The buckwheat genus plant according to any one of 5 to 5.
[7] The plant body of the buckwheat genus plant according to any one of 1 to 6.
[8] A method for breeding a buckwheat genus plant, which comprises using the plant body according to 7 or its progeny.
[9] The harvested product, reproductive material or processed product of the plant according to 7.
[10] A method for reducing the amylose content of buckwheat plants by suppressing the activity of any of the following proteins:
(A) SEQ ID NO: Protein consisting of any one amino acid sequence of 8 to 13;
(B) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8 to 13 and having a function of controlling the amylose content of buckwheat plants;
(C) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 60 amino acids are deleted, substituted or added in any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to 13, and has a function of controlling the amylose content of buckwheat plants. Protein to have.
[11] The method according to 10, wherein suppressing the activity of a protein is suppressing the activity of any of the following proteins.
(A') SEQ ID NO: Protein consisting of any one of the
(B') SEQ ID NO:: A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of the
(C') SEQ ID NO:: Consists of an amino acid sequence in which 1 to 60 amino acids have been deleted, substituted or added in any one of the
本発明のアミロース含有率を低下させたソバ属植物により、小麦粉や加工デンプン等の副原料を配合しなくても、食感、および食品製造時の作業性が向上されたソバ粒・粉を得ることができる。 With the buckwheat plant having a reduced amylose content of the present invention, buckwheat grains and powders having improved texture and workability during food production can be obtained without adding auxiliary raw materials such as wheat flour and modified starch. be able to.
本発明のアミロース含有率を低下させたソバ属植物から得られたソバ粒・粉は、モチ性を活かし、様々な食品に広く用いることができる。 The buckwheat grains / powder obtained from a buckwheat plant having a reduced amylose content of the present invention can be widely used in various foods by taking advantage of its mochi property.
［新規ソバ属植物］
本発明は、下記の少なくとも一方を満たす、新規なソバ属植物を提供する。
・アミロース含有率が、野生型に比較して少なくとも8.0%低い
・アミロース含有率が、26％以下である
[New buckwheat plant]
The present invention provides a novel buckwheat plant that satisfies at least one of the following.
・ Amylose content is at least 8.0% lower than that of wild type ・ Amylose content is 26% or less
ソバ属植物とは、ソバ（Fagopyrum）属に属する植物をいう。ソバ属植物には、ソバ（Fagopyrum esculentum)、ダッタンソバ（Fagopyrum tataricum）、宿根ソバ（Fagopyrum cymosum）、シャクチリソバ（Fagopyrum dibotrys）、ソバ近縁野生種（Fagopyrum homotropicum）、ダッタンソバと宿根ソバの雑種であるFagopyrum giganteum、Fagopyrum tatari-cymosum、その他ソバ属植物として、Fagopyrum megaspartanium、Fagopyrum pillus、Fagopyrum macrocarpum、Fagopyrum callianthum、Fagopyrum urophyllum、Fagopyrum gilesii、Fagopyrum statice、Fagopyrum leptopodum、Fagopyrum gracilipes、Fagopyrum capillatum、Fagopyrum pleioramosum、Fagopyrum lineare、Fagopyrum rubifoliumが含まれる。 A buckwheat plant is a plant belonging to the genus Fagopyrum. Buckwheat plants include buckwheat (Fagopyrum esculentum), dattan buckwheat (Fagopyrum tataricum), buckwheat root (Fagopyrum cymosum), buckwheat scab (Fagopyrum dibotrys), wild species related to buckwheat (Fagopyrum homotropicum), buckwheat homotropicum, and buckwheat seeds. giganteum, Fagopyrum tatari-cymosum and other buckwheat plants such as Fagopyrum megaspartanium, Fagopyrum pillus, Fagopyrum macrocarpum, Fagopyrum callianthum, Fagopyrum urophyllum, Fagopyrum gilesii, Fagopyrum statice, Fagopyrum leptopodum Includes rubifolium.
本発明のソバ属植物の種には特に限定はないが、好ましい種の例としては、ソバ、ダッタンソバ、宿根ソバ、もしくはソバ野生種、又はそれらのいずれかの雑種（例えば、ダッタンソバと宿根ソバの雑種であるF. giganteum）を挙げることができ、より好ましい種の例としてソバが挙げられる。 The species of the buckwheat genus plant of the present invention are not particularly limited, but examples of preferred species include buckwheat, buckwheat, buckwheat root buckwheat, or wild buckwheat species, or a hybrid thereof (for example, buckwheat buckwheat and buckwheat root). F. giganteum), which is a hybrid, can be mentioned, and buckwheat is an example of a more preferable species.
本発明のソバ属植物は、既存の品種・系統から育種されたものであってもよい。このようにして得られたソバ属植物は、既存の品種・系統とは、少なくともアミロース含有率が低いという特性により区別性が認められる。育種に用いられる品種・系統は特に限定はない。ソバの品種の例として、キタワセソバ、牡丹そば、キタユキ、階上早生、岩手早生、最上早生、階上早生、常陸秋そば、信濃一号、信州大そば、しなの夏そば、福井在来種、高知在来種、宮崎大粒、AOI、KOMA、NARO-FE-1、あきあかね、ガンマの彩、キタノマシュウ、キタミツキ、グレートルビー、コバルトの力、さちいずみ、サンルチン、そば中間母本農1号、タチアカネ、でわかおり、とよむすめ、なつみ、にじゆたか、ほろみのり、みやざきおおつぶ、ルチキング、レラノカオリ、夏吉、会津のかおり、開田早生、宮崎早生かおり、高嶺ルビー、高嶺ルビー2011、山形BW5号、出雲の舞、春のいぶき、常陸秋そば、信永レッド、信州大そば、長野S11号、長野S8号、島田スカーレット、飛越 1号、北海3号が挙げられる。ダッタンソバの品種の例として、信永イエロー、北海T8号、北海T9号、北海T10号、北陸4号、気の力、気の宝、気の豊、大禅、信濃くろつぶ、ダルマだったん、イオンの黄彩、満天きらり、西のはるか、イオンの黄彩が挙げられる。これらの多くは、種苗会社、または種苗関連担体等から入手することができる。
The buckwheat plant of the present invention may be bred from an existing variety / line. The buckwheat plant thus obtained is distinguished from existing varieties and lines by the characteristic that the amylose content is at least low. The varieties and strains used for breeding are not particularly limited. Examples of buckwheat varieties include Kitawase buckwheat, Peony soba, Kitayuki, Hayao upstairs, Hayao Iwate, Hayao Mogami, Hayao upstairs, Hitachi Aki soba, Shinano No. 1, Shinshu Daisoba, Shinano Natsu soba, Fukui native species, Native Kochi species, large grain Miyazaki, AOI, KOMA, NARO-FE-1, Aki Akane, Gamma no Aya, Kitano Mashu, Kitamitsuki, Great Ruby, Cobalt Power, Sachiizumi, Sanruchin, Soba Intermediate Mother Honno No. 1, Tachiakane, Dewakaori, Toyomusume, Natsumi, Nijiyutaka, Horomi Nori, Miyazaki Otsubu, Ruchiking, Lerano Kaori, Natsuyoshi, Aizu Kaori, Kaida Hayao, Miyazaki Hayao Kaori, Takamine Ruby, Takamine Ruby 2011, Yamagata BW5 , Izumo no Mai, Spring Ibuki, Hitachi Aki Soba, Shinaga Red, Shinshu Osoba, Nagano S11, Nagano S8, Shimada Scarlet, Hietsu No. 1, Hokkai No. 3. Examples of tartary buckwheat varieties are Shinaga Yellow, Hokkai T8, Hokkai T9, Hokkai T10,
（低アミロース性）
本発明のソバ属植物は、従来のソバ属植物に比較し、アミロース含有率が低下している。
(Low amylose)
The buckwheat genus plant of the present invention has a lower amylose content than the conventional buckwheat genus plant.
本発明に関し、アミロース含有率というときは、特に記載した場合を除き、常法により製粉機でソバ種子を製粉して得たソバ粉（胚乳）のデンプン中のアミロースの割合（質量％）として示している。アミロース含有率は、場合により、全粒粉のデンプン中のアミロースの割合として表されるが、当業者であれば、適宜製粉機で製粉したソバ粉の場合として適切な計算を行って、アミロース含有率を求めることができる。なお一般的にソバ粉は、玄ソバ（子実）をロール製粉し、粉砕物をふるいで分別することにより製造される。 Regarding the present invention, the amylose content is shown as the ratio (% by mass) of amylose in the starch of buckwheat flour (endosperm) obtained by milling buckwheat seeds by a conventional method, unless otherwise specified. ing. The amylose content is sometimes expressed as the ratio of amylose in the starch of whole grain flour, but those skilled in the art can appropriately calculate the amylose content as in the case of buckwheat flour milled by a flour mill. You can ask. Generally, buckwheat flour is produced by rolling buckwheat flour (grains) and sieving the crushed product to separate them.
例えば、製粉機で製粉したソバ粉におけるデンプンの含有率が85.7％であり、全粒粉におけるデンプンの含有率が65.8％である場合（Izydorczyk, M.S. and D. Head (2010) Characterization and potential uses of functional buckwheat fractions obtained by roller milling of new Canadian buckwheat genotypes. The European Journal of Plant Science and Biotechnology 4: 71-81におけるKotoの場合）、全粒粉におけるデンプンのアミロース含有率に、85.7/65.8を乗じることにより、本願でいう製粉機で製粉した場合のソバ粉におけるアミロース含有率を求めることができる。 For example, if the starch content in buckwheat flour milled by a flour mill is 85.7% and the starch content in whole grain flour is 65.8% (Izydorczyk, MS and D. Head (2010) characterization and potential uses of functional buckwheat). Fractions obtained by roller milling of new Canadian buckwheat genotypes. (For Koto in The European Journal of Plant Science and Biotechnology 4: 71-81), by multiplying the starch amylose content in whole grains by 85.7 / 65.8, as used herein. The amylose content in buckwheat flour when milled with a flour mill can be determined.
デンプン中のアミロースは、ジメチルスルホキシドで可溶化させたデンプンに対するヨウ素-デンプン反応を比色することにより定量できる。 Amylose in starch can be quantified by colorating the iodine-starch reaction to starch solubilized in dimethyl sulfoxide.
例えば、下記のような外部標準法により定量できる。
ソバ粉約30mgを秤量し、ジメチルスルホキシド（DMSO）1mlを加え、75℃にて、16時間しんとうする。得られた上清を脱塩水で1000倍希釈する。希釈液180μLに対し20μLのヨウ素液（0.02%ヨウ素-0.2%ヨウ化カリウム溶液）を入れ、690nmの吸光度を測定する。検量線を作成する標準試料としては、市販のポテトアミロースを用いることができる。
For example, it can be quantified by the following external standard method.
Weigh about 30 mg of buckwheat flour, add 1 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO), and stir at 75 ° C for 16 hours. The obtained supernatant is diluted 1000-fold with desalinated water. Add 20 μL of iodine solution (0.02% iodine-0.2% potassium iodide solution) to 180 μL of the diluted solution, and measure the absorbance at 690 nm. Commercially available potato amylose can be used as a standard sample for preparing a calibration curve.
本発明のソバ属植物におけるアミロースの低下の程度は、当該ソバ植物を原材料に含む食品において、食感や食品製造時の作業性に影響を与える程度であることが好ましい。 The degree of reduction of amylose in the buckwheat plant of the present invention is preferably such that it affects the texture and workability at the time of food production in the food containing the buckwheat plant as a raw material.
具体的には、本発明のソバ属植物のアミロース含有率は、26％以下、好ましくは25％以下、より好ましくは24％以下、さらに好ましくは23％以下であることが好ましい。本発明者らの検討によると、野生型のソバのアミロース含有率は、全粒粉を基準にした場合は22.6％であり（実施例の項参照）、製粉機により製粉したソバ粉では29.4％（＝22.6*85.7/65.8）である。また、本発明者らが得たソバ系統18Nデ6は、全粒粉を基準にした場合は18.6％であり、製粉機により製粉したソバ粉では24.3％（＝18.6*85.7/65.8）である。
Specifically, the amylose content of the buckwheat plant of the present invention is preferably 26% or less, preferably 25% or less, more preferably 24% or less, still more preferably 23% or less. According to the study by the present inventors, the amylose content of wild-type buckwheat is 22.6% based on whole grain flour (see the section of Examples), and 29.4% (=) for buckwheat flour milled by a flour mill. 22.6 * 85.7 / 65.8). The buckwheat
また、本発明のソバ属植物のアミロース含有率は、そのソバ属植物が由来する野生型に比較して低い。本発明に関し、野生型に比較したアミロース含有率の低下を数値で表すときは、特に記載した場合を除き、計算式：野生型のアミロース含有率－変異型のアミロース含有率で求めた値である。 In addition, the amylose content of the buckwheat plant of the present invention is lower than that of the wild type from which the buckwheat plant is derived. Regarding the present invention, when the decrease in amylose content as compared with the wild type is expressed numerically, it is a value obtained by the calculation formula: wild type amylose content-mutant amylose content, unless otherwise specified. ..
本発明のソバ属植物のアミロース含有率は、具体的には少なくとも8.0％、好ましくは9.0％以上、より好ましくは10.0％以上、さらに好ましくは11.0％以上、低いことが好ましい。 The amylose content of the buckwheat plant of the present invention is preferably at least 8.0%, preferably 9.0% or more, more preferably 10.0% or more, still more preferably 11.0% or more, and low.
ムギでは、Wx-B1が欠損することによりアミロース含有率が数パーセント低下し、それにより適度な粘りが生まれ、麺に適することが知られている。小麦に関する報告（M. Yamamori & N. T. Quynh, Differential effects of Wx-A1, -B1 and -D1 protein deficiencies on apparent amylose content and starch pasting properties in common wheat. Theoretical and Applied Genetics volume 100, pages32-38(2000)）では、野生型(Type1)がWx-B1欠損型(Type3)に変異した場合、アミロース含有率が低下している。年次変動はあるが、平均すると7.7％のアミロース含有率の低下が生じている。したがって本発明のソバ属植物についても、同程度のアミロース含有率の低下があれば、目的の効果が期待できると考えられる。 It is known that in wheat, the deficiency of Wx-B1 reduces the amylose content by several percent, which results in moderate stickiness and is suitable for noodles. M. Yamamori & NT Quynh, Differential effects of Wx-A1, -B1 and -D1 protein deficiencies on apparent amylose content and starch pasting properties in common wheat. Theoretical and Applied Genetics volume 100, pages 32-38 (2000) ), The amylose content is decreased when the wild type (Type 1) is mutated to the Wx-B1 deficient type (Type 3). Although there are annual fluctuations, the average amylose content has decreased by 7.7%. Therefore, it is considered that the desired effect can be expected for the buckwheat plant of the present invention as long as the amylose content is reduced to the same extent.
なお、本発明のソバ属植物は、栽培年によっては実際のアミロース含有率が低下しない場合があり得る。コムギにおいてはGBSSアイソザイムが一つ欠損した場合にアミロース含有率が低下しない年があることが報告されているが、それを差し引いても有用であるため、普及が進んでいる。実際のアミロース含有率が低下していないソバ属植物であっても、他の栽培年には従来のソバ属植物に比較し、アミロース含有率の低下が見られる場合、本発明のソバ属植物に包含される。 The buckwheat plant of the present invention may not decrease in actual amylose content depending on the year of cultivation. It has been reported that in wheat, there are years when the amylose content does not decrease when one GBSS isozyme is deficient, but it is useful even if it is subtracted, so it is becoming more widespread. Even if the buckwheat genus plant does not actually have a decrease in amylose content, if a decrease in amylose content is observed as compared with the conventional buckwheat genus plant in other cultivation years, the buckwheat genus plant of the present invention can be used. Be included.
（GBSSの活性抑制）
アミロース含有率の低下は、デンプン合成酵素（GBSS）の活性を抑制することにより達成することができる。なお本発明に関し、ソバ属植物についてGBSSというときは、特に記載した場合を除き、GBSSaおよびGBSSbを指す。
(Suppression of GBSS activity)
The decrease in amylose content can be achieved by suppressing the activity of starch synthase (GBSS). Regarding the present invention, the term GBSS for buckwheat plants refers to GBSSa and GBSSb unless otherwise specified.
本発明に関し、GBSSの活性について抑制（する）というときは、特定のメカニズムによりGBSSの活性が抑制される場合に限られない。活性抑制は、GBSSの酵素活性の抑制のほか、GBSS遺伝子の発現抑制を包含する。より具体的には、活性抑制は、GBSSの活性が阻害されることのほか、GBSS遺伝子が変異して活性型のGBSSが産生されなくなること、GBSS遺伝子の発現調節領域（プロモーター領域、転写制御因子結合領域、等）に変異がありGBSSの産生が抑制されることを含む。 Regarding the present invention, the term "suppressing" the activity of GBSS is not limited to the case where the activity of GBSS is suppressed by a specific mechanism. Suppression of activity includes suppression of GBSS enzyme activity as well as suppression of GBSS gene expression. More specifically, suppression of activity means that the activity of GBSS is inhibited, the GBSS gene is mutated to prevent the production of active GBSS, and the expression regulatory region of the GBSS gene (promoter region, transcriptional regulator). It includes that there is a mutation in the binding region, etc.) and the production of GBSS is suppressed.
ソバ属植物が、GBSSの変異により低アミロース性となることは、本願が初めて開示する。 The present application discloses for the first time that buckwheat plants become hypoamylose due to mutation in GBSS.
ある植物においてGBSSの変異により低アミロースになるかどうかは、実際に変異させた植物においてアミロース含有率を測定してみなければ分からないといえる。例えば、複数のGBSSを持つコムギの場合、あるGBSSを欠損させてもアミロース含有率の低下が生じない、あるいはほとんど生じないことが報告されている。より詳細には、３つのGBSS、Wx-A1、-B1、および-D1の欠損型ごとのアミロース含有率のデータを提示するが、Wx-A1の欠損の場合には、アミロース含量があまり低下せず、Wx-B1のほうが欠損の影響が大きいこと（前掲 M. Yamamoriら, 2000）、Wx-A1欠損変異ではアミロース含量があまり低下しないこと（M. Yamamori, T. Nakamura, T. R. Endo & T. Nagamine. Waxy protein deficiency and chromosomal location of coding genes in common wheat. Theoretical and Applied Genetics volume 89, pages179-184(1994)）、Wx-A1が欠損した関東82号では、比較品種の「Chinese Spring（CS）」とは有意差は出ていないこと（Araki, E, Miura, Hideho, Watanabe, N, Sawada, Souhei. Variation for amylose content in wheat cultivars carrying different null alleles at the Wx loci. 帯広畜産大学学術研究報告. 自然科学, 21(1): 9-15）が報告されている。 It can be said that whether or not GBSS mutation causes low amylose in a certain plant cannot be known without actually measuring the amylose content in the mutated plant. For example, in the case of wheat having a plurality of GBSS, it has been reported that the amylose content does not decrease or hardly occurs even if a certain GBSS is deleted. More specifically, we present data on amylose content for each of the three GBSS, Wx-A1, -B1, and -D1 deficient types, but in the case of Wx-A1 deficiency, the amylose content is significantly reduced. However, Wx-B1 is more affected by the deficiency (M. Yamamori et al., 2000), and the amylose content is not significantly reduced by the Wx-A1 deficiency mutation (M. Yamamori, T. Nakamura, TR Endo & T. Nagamine. Waxy protein deficiency and chromosomal location of coding genes in common wheat. Theoretical and Applied Genetics volume 89, pages179-184 (1994)) (Araki, E, Miura, Hideho, Watanabe, N, Sawada, Souhei. Variation for amylose content in wheat cultivars carrying different null alleles at the Wx loci. Natural Sciences, 21 (1): 9-15) have been reported.
また、GBSSのなかには葉で働くものもある。葉で働くGBSSが欠損した場合、光合成生産物を蓄積できないことから、致死や重大な生育障害が生じる可能性がある。そのため、本願以前には、GBSSを変異させたソバ植物は、GBSSが葉と種子で共通である可能性があり、植物体としては作製ができない懸念があった。 Also, some GBSS work on leaves. Deficiency of GBSS, which works in the leaves, can lead to fatal and serious growth disorders due to the inability to accumulate photosynthetic products. Therefore, before the present application, there was a concern that the buckwheat plant in which GBSS was mutated could not be produced as a plant because GBSS may be common to leaves and seeds.
さらに、GBSSを変異させた植物体が報告されている穀物の多くは単子葉植物の中のイネ科作物である。具体的には、イネ、ムギ、オオムギ、トウモロコシ、モロコシ（ソルガム）、アワ、キビ、ハトムギである。双子葉植物では、唯一ヒユ科のアマランサスについてのみ報告がある（Kenji Fukunaga. Origin of waxy cereals from a genetic point of view: From cultural history to genetic history of waxy cereals. Prefectural University of Hiroshima, Shobara, Hiroshima 727-0023, Japan）。本願以前には、同じく双子葉植物の中のタデ科であるソバ属植物においてGBSS変異による結果は予想できず、致死となる懸念があった。 In addition, many of the grains in which GBSS mutated plants have been reported are gramineous crops among monocotyledonous plants. Specifically, they are rice, wheat, barley, corn, great millet (sorghum), foxtail millet, millet, and adlay. Among dicotyledonous plants, only Amaranthaceae has been reported (Kenji Fukunaga. Origin of waxy cereals from a genetic point of view: From cultural history to genetic history of waxy cereals. Prefectural University of Hiroshima, Shobara, Hiroshima 727- 0023, Japan). Prior to this application, the results of GBSS mutations were unpredictable in the Polygonaceae plant of the genus Buckwheat, which is also a dicotyledonous plant, and there was a concern that it would be fatal.
（GBSS遺伝子またはその発現調節領域の変異）
GBSSの活性の抑制のための手段の一つは、GBSS遺伝子またはその発現調節領域の変異である。好ましい態様の一つにおいては、ソバ属植物は、GBSSa遺伝子とGBSSb遺伝子の少なくとも一方において変異を有する。好ましくはGBSSa遺伝子において変異を有する。なお、配列表には、配列番号：１としてソバGBSSa（野生型）遺伝子の配列、配列番号：２として本発明者らが得たソバGBSSa（変異型）遺伝子の配列、配列番号：３ ソバGBSSb 遺伝子、配列番号：４としてダッタンソバGBSSa cDNAの配列、配列番号：５としてダッタンソバGBSSb cDNAの配列、配列番号：６として宿根ソバGBSSa cDNAの配列、配列番号：７として、宿根ソバGBSSb cDNAの配列が示されている。
(Mutation of GBSS gene or its expression regulatory region)
One of the means for suppressing the activity of GBSS is a mutation in the GBSS gene or its expression regulatory region. In one preferred embodiment, the buckwheat plant has a mutation in at least one of the GBSSa gene and the GBSSb gene. Preferably it has a mutation in the GBSSa gene. In the sequence listing, SEQ ID NO: 1 is the sequence of the buckwheat GBSSa (wild type) gene, SEQ ID NO: 2 is the sequence of the buckwheat GBSSa (variant type) gene obtained by the present inventors, and SEQ ID NO: 3 is the buckwheat GBSSb. The gene, SEQ ID NO: 4 indicates the sequence of Dattan buckwheat GBSSa cDNA, SEQ ID NO: 5 indicates the sequence of Dattan buckwheat GBSSb cDNA, SEQ ID NO: 6 indicates the sequence of the root buckwheat GBSSa cDNA, and SEQ ID NO: 7 indicates the sequence of the root buckwheat GBSSb cDNA. Has been done.
好ましい態様の一つにおいては、変異は、アミノ酸変異を伴う変異（アミノ酸置換、ストップコドン挿入）、スプライシング変異（スプライシングシグナル変異、イントロンの変異によるスプライシング変異を伴うゲノム変異）、非翻訳領域における変異（核酸のメチル化含む）による遺伝子転写産物の発現量変異等を含む。具体的な例としては、GBSSaのスプライシングシグナル部位に突然変異が生じ、遺伝子転写産物にストップコドンが挿入され、GBSSのタンパク質の蓄積が減少し、結果としてアミロース含有率低下を引き起こす遺伝子変異を上げることができる。 In one of the preferred embodiments, the mutation is a mutation with an amino acid mutation (amino acid substitution, stop codon insertion), a splicing mutation (splicing signal mutation, a genomic mutation with a splicing mutation due to an intron mutation), or a mutation in an untranslated region (a mutation in the untranslated region). Includes mutations in the expression level of gene transcripts due to (including nucleic acid methylation). As a specific example, mutations occur at the splicing signal site of GBSSa, stop codons are inserted into the gene transcript, the accumulation of GBSS protein is reduced, and as a result, the gene mutation that causes a decrease in amylose content is increased. Can be done.
好ましい態様の一つにおいては、ソバ属植物は、GBSSaにおいて、配列番号：２に示したような変異、すなわち配列番号：２の位置１８４６に相当するヌクレオチドがＡではないものに置換されている。しかし、異なる位置の変異でも、同様の効果が得られる可能性がある。例えば、活性に大きな影響を与えるタンパク質の立体構造に関するシステイン残基を欠失または他のアミノ酸に置換するような変異、活性中心のアミノ酸を欠失または異なる極性のアミノ酸に置換するような変異、植物間で高度に保存されているアミノ酸領域に１または数個のアミノ酸を欠失または極性の異なる他のアミノ酸に置換するような変異であれば、GBSSの活性が抑制されると考えられ、このような変異であれば、同様の効果が期待できる。一方、GBSSのC末側がわずかに短くなった程度の変異では、GBSSは本来の活性を発揮できるため、目的の効果がないか、または低いが、配列番号：２の配列からなるポリヌクレオチドと高い同一性（例えば、８０％以上）を有し、配列番号：２の位置１８４６に相当するヌクレオチドがＡではない配列からなるポリヌクレオチドを有するソバ属植物であれば、同様の効果が期待できる。 In one preferred embodiment, the buckwheat plant is replaced in GBSSa with a mutation as set forth in SEQ ID NO: 2, i.e., the nucleotide corresponding to position 1846 of SEQ ID NO: 2 is not A. However, mutations at different positions may have similar effects. For example, mutations such as deletion or replacement of cysteine residues related to the three-dimensional structure of proteins that have a significant effect on activity with amino acids of other amino acids, mutations of deletion or replacement of amino acids at the active center with amino acids of different polarities, plants. Mutations that delete one or several amino acids in the highly conserved amino acid region between them or replace them with other amino acids of different polarities are thought to suppress GBSS activity. If it is a mutation, the same effect can be expected. On the other hand, in a mutation in which the C-terminal side of GBSS is slightly shortened, GBSS can exert its original activity and therefore has no or low desired effect, but is high as a polynucleotide consisting of the sequence of SEQ ID NO: 2. Similar effects can be expected if the plant belongs to the genus Buckwheat, which has the same identity (for example, 80% or more) and has a polynucleotide consisting of a sequence in which the nucleotide corresponding to position 1846 of SEQ ID NO: 2 is not A.
遺伝子に変異が導入されていることは、例えば下記の方法等で確認することができる。
サンガー法あるいは次世代DNA解析技術などの塩基配列解析方法による当該変異塩基配列そのものの解読、あるいは当該塩基配列を認識部位とする制限酵素を用いたゲノムDNAあるいはPCR増幅断片等の切断状況の差異、もしくはLGC Genomics社の KASP（登録商標） (Kompetitive Allele Specific PCR) ジェノタイピングアッセイ、高分解能融解曲線（HRM）解析、等の当該塩基配列の差異を検出する技術、あるいはPCR-SSCP(Single Nucleotide Conformation Polymorphism)等が挙げられる。また、当該変異塩基部分に連鎖するDNAマーカーを用いて検出してもよい。GBSSタンパク質の欠失性を判断するためには、前記実施例に記載のGBSSタンパク質の調査方法のほかに、活性を測定する方法、免疫化学的手法（イムノブロット法、イムノクロマト法等）が挙げられる。
The fact that the mutation has been introduced into the gene can be confirmed, for example, by the following method or the like.
Decoding of the mutant base sequence itself by a base sequence analysis method such as the Sanger method or next-generation DNA analysis technology, or differences in the cleavage status of genomic DNA or PCR amplified fragments using a restriction enzyme that uses the base sequence as a recognition site. Alternatively, LGC Genomics' KASP® (Kompetitive Allele Specific PCR) genotyping assay, high-resolution melting curve (HRM) analysis, or other technology for detecting differences in the base sequence, or PCR-SSCP (Single Nucleotide Conformation Polymorphism). ) Etc. can be mentioned. Further, it may be detected by using a DNA marker linked to the mutant base portion. In order to determine the deletion property of the GBSS protein, in addition to the method for investigating the GBSS protein described in the above-mentioned Examples, a method for measuring the activity and an immunochemical method (immunoblotting method, immunochromatography method, etc.) can be mentioned. ..
GBSS遺伝子に変異が導入されていることは、種子でのGBSSタンパク質の発現により確認することもできる。具体的には、種子からタンパク質を抽出し、電気泳動によりGBSSタンパク質の発現を調査すると、GBSS遺伝子変異植物体においては、GBSSタンパク質の蓄積が欠損しているか、または野生型よりもタンパク質量が少ないことが分かる。本発明者らの検討によると、GBSS遺伝子に変異を有するソバ属植物は、栽培年によってはアミロース含有率が低下しないが、GBSSタンパク質の蓄積は欠損していた。このことからGBSS遺伝子変異は栽培環境に左右されずに発現しうるといえる。 The introduction of mutations in the GBSS gene can also be confirmed by the expression of GBSS protein in seeds. Specifically, when the protein was extracted from the seeds and the expression of the GBSS protein was investigated by electrophoresis, the GBSS gene mutant plant lacked the accumulation of GBSS protein or had a smaller amount of protein than the wild type. You can see that. According to the studies by the present inventors, the buckwheat plant having a mutation in the GBSS gene did not decrease the amylose content depending on the year of cultivation, but the accumulation of GBSS protein was deficient. From this, it can be said that the GBSS gene mutation can be expressed regardless of the cultivation environment.
本発明のソバ属植物において、GBSS遺伝子またはその発現調節領域の変異は、種々の手段により行われていてよい。GBSS遺伝子またはその発現調節領域が変異したソバ属植物の獲得方法の例として、突然変異処理株からの選抜による方法、遺伝子組換え手法、RNA干渉、ゲノム編集、人工ゲノム合成、ゲノムメチル化手法等が挙げられる。 In the buckwheat plant of the present invention, the mutation of the GBSS gene or its expression regulatory region may be carried out by various means. As an example of the acquisition method of the buckwheat genus plant in which the GBSS gene or its expression regulatory region is mutated, a method by selection from a mutation-treated strain, a gene recombination method, RNA interference, genome editing, artificial genome synthesis, genome methylation method, etc. Can be mentioned.
好ましい態様においては、突然変異処理株からの選抜による方法が用いられる。より確実に植物体が作製できるからである。なお、GBSSの発現抑制やノックアウトに関する先行技術があるが（前掲特許文献１～５、前掲非特許文献１）、植物体の作製には至っていない。
In a preferred embodiment, a method by selection from a mutation-treated strain is used. This is because a plant can be produced more reliably. Although there are prior arts related to suppression of GBSS expression and knockout (
（新規ソバ系統）
本発明のソバ属植物の例として、18Nデ6が挙げられる。18Nデ6は、本明細書の実施例に記載の方法で得られた系統であり、下記の特徴を有する。
・科学的性質（形態的、栽培上の特徴、生理学的特徴等）
分類学上の位置：普通ソバ（Fagopyrum esculentum）の系統である。
一年生の直立分枝型植物であり、播種後に双葉が展開し、その後本葉が展開し、主茎および分枝に花房が発生の後、結実する。
・原産地：北海道農業研究センターにて突然変異育種により開発した。
・栽培条件：生存確認試験のための条件（発芽試験の条件）としては、種子滅菌のため70% エタノールに1分浸し、1%（有効塩素濃度）次亜塩素酸ナトリウム溶液中で、スターラーを用いて30分間攪拌し、滅菌水で5回洗浄し、暗所25℃（許容範囲22－28℃）にてペトリ皿内の滅菌水を浸したろ紙上に播種し、冠根が伸びた状態に至った実生を発芽したと判断する。発芽試験は12日間とする。植物体の屋外での気象条件としては、日平均気温13℃－18℃、日最高気温18℃－25℃、日最低気温10℃－18℃であり、水はけがよく、降水量が月あたり200-400mmであり、日照時間が月あたり100時間以上ある条件。
・種子の保管方法：5℃
(New buckwheat system)
An example of a buckwheat plant of the present invention is 18N de6.
・ Scientific properties (morphological, cultivation characteristics, physiological characteristics, etc.)
Taxonomic location: Ordinary buckwheat (Fagopyrum esculentum) strain.
It is an annual upright branch type plant, and after sowing, the cotyledons develop, then the true leaves develop, and the main stem and branches develop flower clusters and then bear fruit.
-Origin: Developed by mutation breeding at the Hokkaido Agricultural Research Center.
・ Cultivation conditions: As conditions for the survival confirmation test (germination test conditions), soak in 70% ethanol for 1 minute for seed sterilization, and in 1% (effective chlorine concentration) sodium hypochlorite solution, stirrer. Stir for 30 minutes using, wash 5 times with sterile water, sow in a filter paper soaked with sterile water in a Petri dish in a dark place at 25 ° C (allowable range 22-28 ° C), and the crown has grown. It is judged that the seedlings that have reached the point of germination have germinated. The germination test lasts 12 days. The outdoor weather conditions for plants are an average daily temperature of 13 ° C-18 ° C, a daily maximum temperature of 18 ° C-25 ° C, and a daily minimum temperature of 10 ° C-18 ° C. -The condition is 400mm and the sunshine hours are 100 hours or more per month.
・ Seed storage method: 5 ℃
［ソバ属植物のアミロース含有率を低下させる方法］
本発明は、以下のいずれかのタンパク質の活性を抑制することによる、ソバ属植物のアミロース含有率を低下させる方法を提供する。
（Ａ）配列番号：８～１３のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号：８～１３のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号：８～１３のいずれか１つのアミノ酸配列において１～６０ 個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードし、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するポリヌクレオチド。
[Method of reducing amylose content in buckwheat plants]
The present invention provides a method for reducing the amylose content of a buckwheat plant by suppressing the activity of any of the following proteins.
(A) SEQ ID NO: Protein consisting of any one amino acid sequence of 8 to 13;
(B) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8 to 13 and having a function of controlling the amylose content of buckwheat plants;
(C) Function to encode an amino acid sequence in which 1 to 60 amino acids are deleted, substituted or added in any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to 13 and to control the amylose content of buckwheat plants. Polynucleotide with.
本発明のソバ属植物のアミロース含有率を低下させる方法の好ましい態様では、下記のいずれかのタンパク質の活性を抑制する。
（Ａ’）配列番号：８、１０、および１２ のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ’）配列番号：８、１０、および１２のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質；
（Ｃ’）配列番号：８、１０、および１２のいずれか１つのアミノ酸配列において１～６０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードし、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するポリヌクレオチド。
In a preferred embodiment of the method of reducing the amylose content of a buckwheat plant of the present invention, the activity of any of the following proteins is suppressed.
(A') SEQ ID NO: Protein consisting of any one amino acid sequence of 8, 10, and 12;
(B') SEQ ID NO:: A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of the
(C') SEQ ID NO:: An amino acid sequence in which 1 to 60 amino acids are deleted, substituted or added in any one amino acid sequence of 8, 10, and 12 is encoded, and the amylose content of a buckwheat plant. A polynucleotide having the function of controlling.
なお、配列表には、配列番号：８としてソバのGBSSaのアミノ酸配列、配列番号：９としてソバのGBSSbのアミノ酸配列、配列番号：１０としてダッタンソバのGBSSaのアミノ酸配列、配列番号：１１としてダッタンソバのGBSSbのアミノ酸配列、配列番号：１３として宿根ソバのGBSSaのアミノ酸配列、配列番号：１２として、宿根ソバのGBSSbのアミノ酸配列が示されている。 In the sequence listing, SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of GBSSa of buckwheat, SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of GBSSb of buckwheat, SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of GBSSa of Dattan buckwheat, and SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of Dattan buckwheat. The amino acid sequence of GBSSb is shown as the amino acid sequence of GBSSa of the root buckwheat as SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence of GBSSb of the root buckwheat as SEQ ID NO: 12.
本発明に関し、ポリヌクレオチドについて「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」というときは、特に記載した場合を除き、いずれのポリヌクレオチドにおいても、ハイブリダイゼーションの条件は、Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed.(Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press)およびHybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Supports(ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138,267-284(1984))の記載に従い、取得しようとするポリヌクレオチドに合わせて適宜選定することができる。例えば８５％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、２倍濃度のＳＳＣ溶液および５０％ホルムアミドの存在下、４０℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、５５℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また９０％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、２倍濃度のＳＳＣ溶液および５０％ホルムアミドの存在下、５５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液を用い、６０℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。 Regarding the present invention, when a polynucleotide is "hybridized under stringent conditions", unless otherwise specified, the hybridization condition for any polynucleotide is Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd. ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press) and Hybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Supports (ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138,267-284 (1984)). Can be done. For example, when obtaining DNA having 85% or more identity, hybridization is performed at 40 ° C. in the presence of a 2-fold concentration SSC solution and 50% formamide, and then a 0.1-fold concentration SSC solution (1-fold concentration) is obtained. The composition of the SSC solution having a concentration of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) may be used, and the conditions for washing the filter at 55 ° C. may be used. When obtaining DNA having 90% or more identity, hybridization was performed at 55 ° C. in the presence of a 2-fold concentration SSC solution and 50% formamide, and then a 0.1-fold concentration SSC solution was used. Conditions for cleaning the filter at 60 ° C. may be used.
また、本発明に関し、アミノ酸配列について「１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、１～１２０個、１～６０個、１～３０個、１～９個または１～４個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドまたはタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。 Further, regarding the present invention, the number of amino acids to be substituted when the amino acid sequence is referred to as "amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added" is not specified unless otherwise specified. The protein is not particularly limited as long as the protein consisting of the amino acid sequence has a desired function, but is about 1 to 120, 1 to 60, 1 to 30, 1 to 9 or 1 to 4. Or, if it is a substitution with an amino acid having similar properties, there may be a larger number of substitutions and the like. Means for preparing polynucleotides or proteins relating to such amino acid sequences are well known to those of skill in the art.
本発明で塩基配列（ヌクレオチド配列ということもある。）またはアミノ酸配列に関し「（配列）同一性」というときは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列またはアミノ酸配列においても、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドまたはアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215(1990)403-410に記載されるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列またはアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＣｌｕｓｔａｌＷ）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。 In the present invention, the term "(sequence) identity" with respect to a base sequence (sometimes referred to as a nucleotide sequence) or an amino acid sequence refers to two sequences in any of the base sequences or amino acid sequences, unless otherwise specified. When aligned in an optimal manner, it means the percentage of the number of matching nucleotides or amino acids shared between the two sequences. That is, it can be calculated by identity = (number of matched positions / total number of positions) × 100, and can be calculated using a commercially available algorithm. Such algorithms are also incorporated into the NBLAST and XBLAST programs described in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410. More specifically, the search / analysis regarding the identity of the base sequence or the amino acid sequence can be performed by an algorithm or program well known to those skilled in the art (for example, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW). The parameters when using the program can be appropriately set by those skilled in the art, and the default parameters of each program may be used. Specific methods of these analysis methods are also well known to those skilled in the art.
本明細書において、塩基配列またはアミノ酸配列に関し、同一性が高いというときは、特に記載した場合を除き、いずれの場合も、少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７．５％以上さらに好ましくは９９％以上の配列の同一性を指す。 In the present specification, when the identity is high with respect to a base sequence or an amino acid sequence, in any case, at least 70%, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and further, unless otherwise specified. It preferably refers to 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97.5% or more, still more preferably 99% or more sequence identity.
［育種方法、ソバ属植物の製造方法］
本発明はまた、本発明のソバ属植物を用いた、新規なソバ属植物を育種する方法を提供する。本発明の育種方法は、本発明のソバ属植物、その植物体、またはその後代を育種素材として用いることを特徴とする。育種のための手法は特に限定されず、例として、交配、変異体の選抜、戻し交雑、遺伝子組換え、細胞融合、ゲノム編集等が挙げられる。
[Breeding method, manufacturing method of buckwheat plants]
The present invention also provides a method for breeding a novel buckwheat genus plant using the buckwheat genus plant of the present invention. The breeding method of the present invention is characterized in that the buckwheat plant of the present invention, a plant body thereof, or a progeny thereof is used as a breeding material. The method for breeding is not particularly limited, and examples thereof include mating, selection of mutants, backcrossing, gene recombination, cell fusion, and genome editing.
育種の目標は特に限定されず、例えば、多収化、生態型の改良、耐倒伏性、有限伸育性、耐湿性、高品質化（ルチン等の機能性成分の改良、タンパク質の改良、香気成分の改良、穂発芽性）等が挙げられる。 Breeding goals are not particularly limited, for example, high yield, ecotype improvement, lodging resistance, finite growth resistance, moisture resistance, high quality (improvement of functional components such as rutin, improvement of protein, aroma). Improvement of ingredients, ear germination) and the like.
本発明はまた、低アミロース性ソバ属植物の製造方法を提供する。本発明のソバ属植物の製造方法は、ソバ属植物のGBSS遺伝子を変異させる工程、またはGBSS遺伝子を変異させたソバ属植物を繁殖させる工程
を含むことを特徴とする。
The present invention also provides a method for producing a low-amylose buckwheat plant. The method for producing a buckwheat genus plant of the present invention is characterized by comprising a step of mutating the GBSS gene of the buckwheat genus plant or a step of breeding a buckwheat genus plant in which the GBSS gene is mutated.
［収穫物、繁殖材料、または加工品］
本発明に関し、植物というときは、特別な場合を除き、植物体、またはその一部の意味で用いており、また「その一部」というときは、特別な場合を除き、種子（発芽種子、未熟種子を含む。）、器官またはその部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。植物には、遺伝子操作植物および形質転換植物が含まれる。植物には、収穫物および繁殖材料が含まれる。
[Harvest, breeding material, or processed product]
Regarding the present invention, the term "plant" is used to mean a plant or a part thereof, except for special cases, and the term "a part thereof" is used to mean seeds (germinated seeds, except for special cases). Includes immature seeds), organs or parts thereof (including leaves, roots, stems, flowers, stamens, stamens, pieces thereof), plant culture cells, callus, protoplasts. Plants include genetically engineered plants and transformed plants. Plants include harvested and reproductive materials.
繁殖材料は、特に記載した場合を除き、植物体の全部または一部で繁殖の用に供されるもの（種苗ということもある。）をいい、例えば、種子、苗、細胞、カルス、幼芽がある。本発明でいう収穫物とは、特別な場合を除き、通常の意味で用いており、植物体の全部または一部で繁殖の用に供されないもの、例えば、食品原材料としてのソバ種子、刈り取ったソバ 、ソバ殻、ふすまが含まれる。 Unless otherwise specified, the breeding material refers to a plant that is used for breeding in whole or in part (sometimes referred to as seedlings), for example, seeds, seedlings, cells, callus, and shoots. There is. The harvested product in the present invention is used in the usual sense except for special cases, and all or part of the plant body is not used for breeding, for example, buckwheat seed as a food raw material, cut. Includes buckwheat, buckwheat husks, and bran.
本発明に関し、加工品というときは、特に記載した場合を除き、収穫物から直接的に生産される加工品をいい、具体的には、ソバ粒、ソバ粉等である。 Regarding the present invention, the term "processed product" refers to a processed product directly produced from a harvested product, unless otherwise specified, and specifically, buckwheat grain, buckwheat flour, or the like.
ソバ粒またはソバ粉は、食品の原材料として用いることができる。そのような食品の例としては、麺、菓子類（クッキー、ビスケット、クラッカー、ボーロ、スナック、スポンジケーキ、まんじゅう、団子、せんべい、あられ、おかき等）、餅類、パン類（例えば、食パン、菓子パン、ベーグル、蒸しパン、およびバターロール等）、ピザ、酒、アイスクリーム、飴、チョコレート、）、ミックス粉（例えば、から揚げ粉、天ぷら粉、パン用ミックス粉、ホットケーキミックス粉、お好み焼きミックス粉、およびたこ焼きミックス粉等）、飲料（例えば、そば茶飲料、スープ類、青汁、スムージー）等が挙げられる、 Buckwheat grains or buckwheat flour can be used as raw materials for foods. Examples of such foods are noodles, confectionery (cookies, biscuits, crackers, bolo, snacks, sponge cakes, manju, dumplings, senbei, hail, okaki, etc.), rice cakes, breads (eg, bread, sweet bread, etc.). , Bagles, steamed bread, and butter rolls, etc.), pizza, liquor, ice cream, candy, chocolate,), mixed powder (eg, fried powder, tempura powder, bread mix powder, hot cake mix powder, okonomiyaki mix powder) , And takoyaki mixed powder, etc.), beverages (eg, buckwheat bread beverages, soups, green juice, smoothies, etc.), etc.
次に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
［１．GBSS遺伝子突然変異ソバ植物の獲得］
突然変異処理を行うため、ソバ（Fagopyrum esculentum、系統名IH3)種子100gを200mlのメタンスルホン酸エチル（0.1％～2.5％）に入れ、25℃等にて毎分150回転等の条件でかくはんした。2-16時間後に種子を取り出し、ポットや圃場（農研機構 九州沖縄農業研究センター（〒861-1192 熊本県合志市須屋2421）、または農研機構 北海道農業研究センター（〒082-0081 北海道河西郡芽室町新生南9線4番地）に播種し、結実した種子を株ごとに獲得した。株ごとに収穫した種子は再度ポットや圃場に播種し、葉や種子等からゲノムDNAを調製し、GBSS遺伝子に関するゲノムDNA配列を決定した。ゲノムDNAの調製は市販のゲノム抽出キット等を用いて実施した。
[1. Acquisition of GBSS gene mutant buckwheat plant]
For mutation treatment, 100 g of buckwheat (Fagopyrum esculentum, systematic name IH3) seeds was placed in 200 ml of ethyl methanesulfonate (0.1% to 2.5%) and stirred at 25 ° C at 150 rpm. .. After 2-16 hours, take out the seeds and take out the pots and fields (Agricultural Research Organization Kyushu Okinawa Agricultural Research Center (2421 Suya, Goshi City, Kumamoto Prefecture 861-1192), or Agricultural Research Organization Hokkaido Agricultural Research Center (〒082-0081 Kawanishi-gun, Hokkaido 082-0081). Seeds were sown in Memuro-cho Shinseiminami 9 Line 4), and seeds that set fruit were obtained for each strain. The seeds harvested for each strain were sown again in pots and fields, genomic DNA was prepared from leaves and seeds, and GBSS. The genomic DNA sequence for the gene was determined. The genomic DNA was prepared using a commercially available genome extraction kit or the like.
GBSS遺伝子に関するゲノムDNA配列は、当該遺伝子を特異的に増幅するDNAプライマーを用いてPCR法で増幅した。手法は、Katsu, K., Suzuki, T., Fujino, K., Morishita, T. and Noda, T. (2019). Development of a DNA marker for variety discrimination specific to'Manten-Kirari' based on an NGS-RNA sequence in Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum). Food Chem., 295, 51-57.を参考にした。得られた増幅DNA断片をサンガー法、または分析企業への外注により塩基配列の決定を行った。決定した塩基配列を、野生型の塩基配列、具体的にはBuckwheat Genome DataBase (BGDB)（http://buckwheat.kazusa.or.jp/index.html）から獲得した、Fes_sc0002521.1.g000007.aua.1及びFes_sc0005258.1.g000004.aua.1の配列と比較すること等により、塩基配列に変異のあった株を把握した。次に当該変異をホモに固定するため、種子を再度播種し、自殖による採種と当該遺伝子変異有無の確認を繰り返した。当該遺伝子変異をホモに固定した時点でGBSS遺伝子変異ソバ植物とした。その結果は下表のとおりである。 The genomic DNA sequence for the GBSS gene was amplified by the PCR method using a DNA primer that specifically amplifies the gene. The method is Katsu, K., Suzuki, T., Fujino, K., Morishita, T. and Noda, T. (2019). Development of a DNA marker for variety discrimination specific to'Manten-Kirari' based on an NGS -RNA sequence in Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum). Food Chem., 295, 51-57. Was referred to. The base sequence of the obtained amplified DNA fragment was determined by the Sanger method or outsourcing to an analysis company. Fes_sc0002521.1.g000007.aua obtained from the determined nucleotide sequence from the wild-type nucleotide sequence, specifically Buckwheat Genome DataBase (BGDB) (http://buckwheat.kazusa.or.jp/index.html). By comparing with the sequences of .1 and Fes_sc0005258.1.g000004.aua.1, strains with mutations in the base sequence were identified. Next, in order to fix the mutation homozygously, the seeds were sown again, and seeding by self-fertilization and confirmation of the presence or absence of the gene mutation were repeated. When the gene mutation was homozygous, it was designated as a GBSS gene-mutated buckwheat plant. The results are shown in the table below.
［２．獲得したGBSS遺伝子変異ソバ植物のGBSSタンパク質の蓄積量の確認］
当該植物体の種子を乳鉢等で2分間粉砕し、調製したソバ粉のタンパク質を2次元電気泳動に供試した。2次元電気泳動は分析企業（APPLIED BIOMICS社、https://www.appliedbiomics.com/Services/2d-dige.html）への外注等により実施した。すなわち、種子タンパク質を、尿素を含む溶液で可溶化し、蛍光色素にて標識後、等電点電気泳動およびSDS-PAGEにより分離し、各タンパク質を可視化した。当該植物体および野生型の画像を比較することでGBSSタンパク質の蓄積量を比較した。GBSSタンパク質の同定は、泳動ゲルから切り出したタンパク質スポットをトリプシンで消化し、ペプチドの精密質量をTOFMSで測定の後、精密質量をデータベースと照合することでタンパク質同定を行った（MASCOT検索）。
[2. Confirmation of the amount of GBSS protein accumulated in the acquired GBSS gene mutant buckwheat plant]
The seeds of the plant were crushed in a mortar or the like for 2 minutes, and the prepared buckwheat flour protein was subjected to two-dimensional electrophoresis. Two-dimensional electrophoresis was carried out by outsourcing to an analysis company (APPLIED BIOMICS, https://www.appliedbiomics.com/Services/2d-dige.html). That is, the seed protein was solubilized with a solution containing urea, labeled with a fluorescent dye, and then separated by isoelectric focusing and SDS-PAGE to visualize each protein. The amount of GBSS protein accumulated was compared by comparing the images of the plant and the wild type. For the identification of GBSS protein, the protein spot cut out from the migration gel was digested with trypsin, the precise mass of the peptide was measured by TOFMS, and then the precise mass was collated with the database to identify the protein (MASCOT search).
その結果は図１のとおりである。「18Nデ6」集団の遺伝子固定前の系統において、野生型（AA）の種子とSVA変異型(aa)の種子タンパク質を2D-DIGEおよびMASCOT解析に供試した。詳細には、野生型（AA）の種子とSVA変異型(aa)の種子タンパク質をそれぞれ異なる2種類の蛍光色素（緑、赤）で標識後に混合し、2次元電気泳動に供試した。目的のタンパク質と予想されるスポットを切り抜き、トリプシン消化後にTOFMSで精密質量を分析し、MASCOT解析にてタンパク質を同定した。（データベース：buckwheat）。 The results are shown in FIG. Wild-type (AA) seeds and SVA mutant (aa) seed proteins were tested for 2D-DIGE and MASCOT analysis in pre-gene-fixed strains of the "18N de 6" population. Specifically, wild-type (AA) seeds and SVA mutant (aa) seed proteins were labeled with two different fluorescent dyes (green and red) and then mixed and tested in two-dimensional electrophoresis. Spots expected to be the protein of interest were cut out, precise mass was analyzed by TOFMS after trypsin digestion, and the protein was identified by MASCOT analysis. (Database: buckwheat).
黄色のスポットは野生型とGBSSa変異型のタンパク質蓄積量が同程度であることを示す。緑色は、野生型に対しGBSSa変異型のタンパク質蓄積が少ないことを意味する。変異型(aa)におけるGBSSaのシグナル強度はバックグラウンドと同レベルに低いため欠損していると判断した。 Yellow spots indicate that wild-type and GBSSa mutants have similar protein stores. Green means less protein accumulation in the GBSSa variant than in the wild type. Since the signal intensity of GBSSa in the mutant type (aa) was as low as the background, it was judged to be deficient.
ｃDNAからの分子量と等電点（PI）の推定値（プラスチド移行部位除去後）
・GBSSa：58.27KD、PI=5.70
・GBSSb：60.44KD、PI=5.52
Estimated molecular weight and isoelectric point (PI) from cDNA (after removal of plastid transition site)
・ GBSSa: 58.27KD, PI = 5.70
・ GBSSb: 60.44KD, PI = 5.52
［３．獲得したGBSS遺伝子変異ソバ植物のゲノム上の変異部位］
野生型のGBSSa遺伝子、および本研究で得られた変異型（「18Nデ6」）のGBSSa遺伝子配列を、それぞれ配列表の配列番号１、および配列番号２、並びに図４に示した。
[3. Acquired GBSS gene mutation Mutant site on the genome of buckwheat plant]
The wild-type GBSSa gene and the mutant GBSSa gene sequence obtained in this study (“18N de 6”) are shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and FIG. 4, respectively.
［４．獲得したGBSS遺伝子変異ソバ植物のスプライシング変異］
上記ゲノム上の塩基の変異が、遺伝子転写産物のスプライシングに与える影響を調査するため、登熟過程の種子のtotalRNAを市販キットにより調製し、ソバGBSSaに関するRT-PCRにてcDNAを獲得した。手法は、M. Takagi, et al., Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR. Appl. Environ. Microbiol., 63: 4504-4510(1997)を参考にした。その後、サンガー法を用いて塩基配列を決定した。
[4. Acquired GBSS gene mutation Buckwheat plant splicing mutation]
In order to investigate the effect of the mutation of the base on the genome on the splicing of the gene transcript, total RNA of the seeds in the ripening process was prepared by a commercially available kit, and cDNA was obtained by RT-PCR on buckwheat GBSSa. The method was based on M. Takagi, et al., characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. Strain KOD1 and its application to PCR. Appl. Environ. Microbiol., 63: 4504-4510 (1997). Then, the base sequence was determined using the Sanger method.
野生型および変異型（「18Nデ6」）のGBSSa遺伝子のスプライシングの変異は図２のとおりである。野生型のGBSSが607アミノ酸残基長であるところ、変異型（「18Nデ6」）のGBSSaは226アミノ酸残基であり、途中で翻訳が終了している。 The splicing mutations in the wild-type and mutant (“18N de 6”) GBSSa genes are shown in FIG. Whereas wild-type GBSS has a 607 amino acid residue length, mutant GBSSa (“18N de 6”) has 226 amino acid residues, and translation has been completed in the middle.
［５．獲得したGBSS遺伝子変異ソバ植物（「18Nデ6」）のアミロース含有率低下程度］
上記記スプライシング変異がアミロース含有率に与える影響を調査するため、「18Nデ6」の形質固定前の系統（突然変異体と野生型が存在するソバ集団）より、当該スプライシング変異をホモで持つ株と、野生型（変異なし）をホモで持つ株について、アミロース含有率を調査した。アミロース含有率はジメチルスルホキシドで可溶化させたデンプンに対するヨウ素-デンプン反応を比色定量することで行った。
[5. Degree of decrease in amylose content of acquired GBSS gene mutant buckwheat plant ("18N de 6")]
In order to investigate the effect of the above-mentioned splicing mutation on the amylose content, a strain having the splicing mutation homozygously from the strain of "18N de 6" before immobilization (the buckwheat population in which the mutant and the wild type exist). And, the amylose content was investigated for the strain having the wild type (no mutation) homozygously. The amylose content was determined by colorimetric determination of the iodine-starch reaction to starch solubilized in dimethyl sulfoxide.
具体的には、ソバ粉約30mgを2mlチューブに秤量し、ジメチルスルホキシド（DMSO）1mlを加え、75℃にて、16時間しんとうし(200rpm)、遠心上清を脱塩水で1000倍希釈し、希釈液180μLに対し20μLのヨウ素液（0.02%ヨウ素-0.2%ヨウ化カリウム溶液）を入れ、マイクロプレートリーダー（Thermo Scientific 社：Multiskan FC）で690nmの吸光度を測定した。標準直線はポテトアミロース（Sigma-Aldrich社）を用いて作成し、外部標準法にて資料中のアミロース含有率を測定した。 Specifically, weigh about 30 mg of buckwheat flour into a 2 ml tube, add 1 ml of dimethylsulfonate (DMSO), add iodine (200 rpm) for 16 hours at 75 ° C, and dilute the centrifugal supernatant 1000 times with demineralized water. 20 μL of iodine solution (0.02% iodine-0.2% potassium iodide solution) was added to 180 μL of the diluted solution, and the absorbance at 690 nm was measured with a microplate reader (Thermo Scientific: Multiskan FC). A standard straight line was prepared using potato amylose (Sigma-Aldrich), and the amylose content in the data was measured by an external standard method.
その結果は図３のとおりである。野生型と比較し、当該スプライシング変異によりアミロース含有率が17.7％（1-(18.6/22.6)＝0.177）低下している。t検定において平均値（N=154）に0.1％水準で有意差があった。 The results are shown in FIG. Compared to the wild type, the splicing mutation reduced the amylose content by 17.7% (1- (18.6 / 22.6) = 0.177). There was a significant difference in the mean value (N = 154) at the 0.1% level in the t-test.
［６．小括］
以上の結果から、GBSS遺伝子に変異を導入することで、アミロース含有率を低下させたソバ属植物体を作製でき、生地物性改善に関連する変化が生じることがわかる。
[6. Brief Summary]
From the above results, it can be seen that by introducing a mutation into the GBSS gene, a buckwheat plant having a reduced amylose content can be produced, and changes related to improvement of dough physical characteristics occur.
［７．GBSSa遺伝子変異ソバ植物と野生型のアミロース含有率の低下程度の年次間差］
2020年春まき、2020年夏まき、および2021年春まきで、野生型ソバ系統IH3、およびGBSSa遺伝子変異ソバ系統18Nデ6を農研機構 九州沖縄農業研究センターで栽培した。GBSS遺伝子変異植物体の全粒粉におけるアミロース含有率をMEGAZYME社のキットを用いて測定した。実際の測定手順は日本バイオコン株式会社のブックレットに記載の方法
（K-AMYL (0618).pdf (biocon.co.jp)）（非特許文献3）に従った。
[7. GBSSa gene mutation Annual difference in the degree of decrease in amylose content between buckwheat plants and wild-type plants]
Wild-type buckwheat line IH3 and GBSSa gene mutant buckwheat
その結果は、図５－１～５－３のとおりである。2020年春まき栽培ではGBSSa遺伝子変異ソバ植物体（GBSSa欠損系統）は野生型と比較しアミロース含有率は低下しなかったが（A)、2020年夏まき栽培（B)、および2021年春まき栽培（D-4)においてはGBSSa遺伝子変異ソバ植物体（GBSSa欠損系統）は野生型と比較しアミロース含有率が低下していた。コムギにおいてはGBSSアイソザイムが一つ欠損した場合にアミロース含有率が低下しない年があることが報告されているが、それを差し引いても有用であるため、普及が進んでいる。 The results are shown in FIGS. 5-1 to 5-3. In the spring 2020 cultivation, the GBSSa gene-mutated buckwheat plant (GBSSa-deficient strain) did not have a lower amylose content than the wild type (A), but the 2020 summer cultivation (B), and the 2021 spring cultivation (B). In D-4), the GBSSa gene mutant buckwheat plant (GBSSa-deficient strain) had a lower amylose content than the wild type. It has been reported that in wheat, there are years when the amylose content does not decrease when one GBSS isozyme is deficient, but it is useful even if it is subtracted, so it is becoming more widespread.
なお、2020年夏まき栽培においては調整デンプンにおけるアミロース含有率（C)、2021年春まき栽培においてはソバ粉あたりのアミロース含有率（E-4)も測定している。方法は前記「５．獲得したGBSS遺伝子変異ソバ植物（「18Nデ6」）のアミロース含有率低下程度」の項に記載のとおりである。これらにおいてもGBSSa遺伝子変異ソバ植物体（GBSSa欠損系統）は野生型と比較しアミロース含有率が低下していた。 The amylose content (C) in the adjusted starch was also measured in the summer 2020 sowing cultivation, and the amylose content per buckwheat flour (E-4) was also measured in the 2021 spring sowing cultivation. The method is as described in the above section "5. Degree of decrease in amylose content of acquired GBSS gene mutant buckwheat plant (" 18N de 6 ")". In these cases as well, the GBSSa gene-mutated buckwheat plant (GBSSa-deficient strain) had a lower amylose content than the wild type.
また、GBSSa欠損遺伝子を他殖性集団（D-1,E-1）、自殖性系統（D-2,E-2）、へ交配により導入した系統においても、GBSSa遺伝子変異ソバ植物体（GBSSa欠損系統）は野生型と比較しアミロース含有率が低下していた。このことから、GBSSa遺伝子の欠損はソバのアミロース含有率を低下させる重要因子であることがわかる。 In addition, GBSSa gene-mutated buckwheat plants (GBSSa gene-mutated buckwheat plants) were also introduced into strains in which the GBSSa-deficient gene was introduced by mating into allogeneic populations (D-1, E-1) and self-fertilizing strains (D-2, E-2). The GBSSa-deficient strain) had a lower amylose content than the wild-type strain. From this, it can be seen that the deletion of the GBSSa gene is an important factor for reducing the amylose content of buckwheat.
さらに、ソバは開花受粉するため、他殖性ソバ系統は周囲に他のソバが存在する場合はその花粉が交雑してしまう。自殖性ソバ系統は他殖性ソバ系統と比較し他の花粉の交雑割合が少ないものの、他殖率が10％前後はあるとされる(非特許文献4、5）。自殖性ソバ系統を隔離栽培した場合と（D-3,E-3）、隔離栽培せずに他のソバ系統が周囲に存在する状況で栽培した場合（D-4,E-4）を比較したところ、隔離栽培を実施しない場合においてもGBSSa遺伝子変異ソバ植物体（GBSSa欠損系統）は野生型と比較しアミロース含有率が低下していた。これは、自殖性系統は他殖率が低いメリットによるものであり、自殖性系統は隔離栽培しなくともGBSSa欠損遺伝子による低アミロース化の効果を得られることを示している。
Furthermore, since buckwheat blooms and pollinates, the pollen of the allogeneic buckwheat strain is crossed when other buckwheat is present in the surrounding area. The self-fertilizing buckwheat line has a lower crossing rate of other pollen than the allogeneic buckwheat line, but the crossing rate is said to be around 10% (
2020年夏まき栽培、および2021年春まき栽培の、アミロース含有量、およびアミロース含有率の変異型における低下率を下表にまとめた。 The table below summarizes the reduction rates of amylose content and amylose content variants in summer 2020 and spring 2021 cultivation.
［８．GBSS遺伝子変異ソバ植物におけるGBSSaタンパク質の年次間差の検出］
GBSS遺伝子変異植物体(GBSSa欠損系統（系統名「18Nデ6」）および野生型植物（系統名：「IH3」）の種子からタンパク質を抽出し、2次元電気泳動によりGBSSaタンパク質の蓄積を調査した。実際の操作は、非特許文献6に従った。
[8. GBSS gene mutation Detection of annual difference in GBSSa protein in buckwheat plants]
Proteins were extracted from the seeds of GBSS gene mutant plants (GBSSa-deficient strain (strain name "18N de 6") and wild-type plants (strain name: "IH3"), and the accumulation of GBSSa protein was investigated by two-dimensional electrophoresis. The actual operation was in accordance with
結果は図６のとおりである。GBSSa遺伝子変異植物体においては、栽培年次に関わらずGBSSaタンパク質の蓄積を欠損していた。このことから当該遺伝子変異は栽培環境に左右されずに発現することが分かる。 The results are shown in FIG. GBSSa gene mutant plants lacked GBSSa protein accumulation regardless of the year of cultivation. From this, it can be seen that the gene mutation is expressed regardless of the cultivation environment.
［９．獲得したGBSSa遺伝子変異ソバ植物におけるDNAマーカーを用いた変異部位の検出］
GBSSa遺伝子変異植物体6株、野生型植物体6株、それらを交配したヘテロ促物体2株の葉より市販のゲノムDNA抽出キットにてゲノムDNAを抽出後、前記遺伝子変異部位を指標としたLGC Genomics社の KASP（登録商標）(Kompetitive Allele Specific PCR) ジェノタイピングアッセイにより遺伝子型の判別を実施した。実際の操作手順は下記HPに従った。
SNP・InDel 解析PCR試薬 KASP™ジェノタイピングアッセイ | LGC Genomics Limited | プライムテック株式会社 (primetech.co.jp)
[9. Acquisition of GBSSa gene mutation Detection of mutation site using DNA marker in buckwheat plant]
After extracting genomic DNA from the leaves of 6 GBSSa gene mutant plants, 6 wild-type plants, and 2 heteropromoting substances crossed with them using a commercially available genomic DNA extraction kit, LGC using the gene mutation site as an index. Genotyping was performed by Genomics' KASP® (Kompetitive Allele Specific PCR) genotyping assay. The actual operation procedure followed the following HP.
SNP / InDel Analytical PCR Reagent KASP ™ Genotyping Assay | LGC Genomics Limited | Primetech Co., Ltd. (primetech.co.jp)
上記操作手順で操作した後、各遺伝子型に対応した蛍光色素強度比から遺伝子型を判別した。 After the operation according to the above operation procedure, the genotype was discriminated from the fluorescent dye intensity ratio corresponding to each genotype.
その結果は図７のとおりである。GBSSa遺伝子変異植物体、ヘテロ植物体、野生型植物体が別々の場所に分かれたことから、遺伝子型の判別ができたと考えられる。 The results are shown in FIG. Since the GBSSa gene mutant plant, heterozygous plant, and wild-type plant were divided into different places, it is considered that the genotype could be discriminated.
［１０．実施例の項で引用した文献］
非特許文献3：Yun, S. H. & Matheson, N. K. (1990). Estimation of Amylose Content of Starches after Precipitation of Amylopectin by Concanavalin-A. Starch/Starke, 42, 302-305.
非特許文献4：Hayashi, H., Wang, Y., & Campbell, C. G.(2004). Gene flow in selfpollinating buckwheat. Proceedings of the 9th international symposium on buckwheat, pp. 355-359.
非特許文献5：Mukasa, Y., Suzuki, T., &Honda, Y. (2006). The degree of outcrossing in open pollinated self-pollinating buckwheat. Report of the Hokkaido Branch, Jpn. Soc. Breeding and Hokkaido Branch.Crop Science Society of Japan,47, 65-66.
非特許文献6：Klose J., From 2-D electrophoresis to proteomics, Electrophoresis, vol. 30, no. S1, S142-S149 (2009)
[10. References cited in the Examples section]
Non-Patent Document 3: Yun, SH & Matheson, NK (1990). Estimation of Amylose Content of Starches after Precipitation of Amylopectin by Concanavalin-A. Starch / Starke, 42, 302-305.
Non-Patent Document 4: Hayashi, H., Wang, Y., & Campbell, CG (2004). Gene flow in selfpollinating buckwheat. Proceedings of the 9th international symposium on buckwheat, pp. 355-359.
Non-Patent Document 5: Mukasa, Y., Suzuki, T., & Honda, Y. (2006). The degree of outcrossing in open pollinated self-pollinating buckwheat. Report of the Hokkaido Branch, Jpn. Soc. Breeding and Hokkaido Branch. Crop Science Society of Japan, 47, 65-66.
Non-Patent Document 6: Klose J., From 2-D electrophoresis to proteomics, Electrophoresis, vol. 30, no. S1, S142-S149 (2009)
本発明のデンプン合成酵素が変異したソバ属植物体は、野生型と比較し、アミロース含有率が低下する。そのため、本発明の技術を用いることによって生地物性の変化したソバ属植物体の栽培が可能となり、消費者のニーズに答えられると考えられる。 The buckwheat plant mutated with the starch synthase of the present invention has a lower amylose content than the wild type. Therefore, it is considered that by using the technique of the present invention, it becomes possible to cultivate a plant of the genus Buckwheat whose dough physical characteristics have changed, and it is possible to meet the needs of consumers.
配列番号：１ ソバGBSSa（野生型）遺伝子
配列番号：２ ソバGBSSa（変異型）遺伝子
配列番号：３ ソバGBSSb 遺伝子
配列番号：４ ダッタンソバGBSSa cDNA
配列番号：５ ダッタンソバGBSSb cDNA
配列番号：６ 宿根ソバGBSSa cDNA
配列番号：７ 宿根ソバGBSSb cDNA
配列番号：８ ソバGBSSa
配列番号：９ ソバGBSSb
配列番号：１０ ダッタンソバGBSSa
配列番号：１１ ダッタンソバGBSSb
配列番号：１２ 宿根ソバGBSSa
配列番号：１３ 宿根ソバGBSSb
SEQ ID NO: 1 Buckwheat GBSSa (wild type) gene Sequence number: 2 Buckwheat GBSSa (mutant type) gene sequence number: 3 Buckwheat GBSSb gene sequence number: 4 Tartary buckwheat GBSSa cDNA
SEQ ID NO: 5 Tartary buckwheat GBSSb cDNA
SEQ ID NO: 6 Buckwheat GBSSa cDNA
SEQ ID NO: 7 Buckwheat GBSSb cDNA
SEQ ID NO: 8 Buckwheat GBSSa
SEQ ID NO: 9 Buckwheat GBSSb
SEQ ID NO: 10 Tartary buckwheat GBSSa
SEQ ID NO: 11 Tartary buckwheat GBSSb
SEQ ID NO: 12 Buckwheat buckwheat GBSSa
SEQ ID NO: 13 Yakune buckwheat GBSSb
Claims (11)
・アミロース含有率が、野生型に比較して少なくとも8.0%低い
・アミロース含有率が、26％以下である A buckwheat plant that meets at least one of the following:
・ Amylose content is at least 8.0% lower than that of wild type ・ Amylose content is 26% or less
（a）配列番号：２の配列からなるポリヌクレオチド。
（b）配列番号：２の配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の配列同一性を有し、配列番号：２の位置１８４６に相当するヌクレオチドがＡではない、ポリヌクレオチド。 A buckwheat plant having one of the following polynucleotides:
(A) A polynucleotide consisting of the sequence of SEQ ID NO: 2.
(B) A polynucleotide having 80% or more sequence identity with a polynucleotide consisting of the sequence of SEQ ID NO: 2, and the nucleotide corresponding to position 1846 of SEQ ID NO: 2 is not A.
（Ａ）配列番号：８～１３のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号：８～１３のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号：８～１３のいずれか１つのアミノ酸配列において１～６０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質。 A method for reducing the amylose content of buckwheat plants by suppressing the activity of any of the following proteins:
(A) SEQ ID NO: Protein consisting of any one amino acid sequence of 8 to 13;
(B) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8 to 13 and having a function of controlling the amylose content of buckwheat plants;
(C) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 60 amino acids are deleted, substituted or added in any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to 13, and has a function of controlling the amylose content of buckwheat plants. Protein to have.
（Ａ’）配列番号：８、１０、および１２のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ’）配列番号：８、１０、および１２のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質；
（Ｃ’）配列番号：８、１０、および１２のいずれか１つのアミノ酸配列において１～６０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつソバ属植物のアミロース含有率を制御する機能を有するタンパク質。 The method according to claim 10, wherein suppressing the activity of a protein is suppressing the activity of any of the following proteins.
(A') SEQ ID NO: Protein consisting of any one amino acid sequence of 8, 10, and 12;
(B') SEQ ID NO:: A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of the amino acid sequences 8, 10, and 12 and having a function of controlling the amylose content of buckwheat plants;
(C') SEQ ID NO:: Consists of an amino acid sequence in which 1 to 60 amino acids have been deleted, substituted or added in any one of the amino acid sequences 8, 10, and 12, and the amylose content of buckwheat plants. A protein that has the function of controlling.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN111480570A (en) * | 2020-05-26 | 2020-08-04 | 贵州师范大学 | Crossbreeding method between wild buckwheat rhizome and tartary buckwheat rhizome and application |
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2021
- 2021-09-02 JP JP2021143245A patent/JP2022044024A/en active Pending
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