JP2022032228A - 粒子分離装置及び分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、ＰＦＦにおける粒子分離処理用を向上させる粒子分離装置および粒子分離方法を提供することにある。【解決手段】流路の流れ方向（長手方向）をｘ軸とし、サンプル液とシース液の界面に対して垂直方向をｚ軸とし、ｘ軸とｚ軸に直交する方向をｙ軸とした場合に、狭隘部のｙ軸方向の流路幅５１を長くすることで、粒子分離処理量がｙ軸方向の流路幅５１に略比例して向上することを見出した。また、狭隘部のｚ軸方向の流路幅５０の長さのばらつきを抑制することで、処理量と共に分離能が向上することを見出した。さらに、狭隘部に流入するサンプル液とシース液の流量比が、狭隘部内で一定となるよう流入させることでも、処理量と共に分離能が向上することを見出した。【選択図】図４

Description

本発明は、流体中に含まれる粒子の分離装置及び前記装置を用いた流体中に含まれる粒子を操作する方法に関するものである。

マイクロスケール又はそれ以下の粒子や細胞を大きさごとに分離する技術は、生化学、診断医療や様々な工業分野で用いられる技術である。例えば、他の細胞に分化する造血幹細胞や、ＥＳ細胞のような幹細胞は、細胞分化の研究のために多くの細胞群から幹細胞のみを分離する必要がある。また、がんを診断するために、患者の血液中に循環腫瘍癌細胞（ＣＴＣ）が含まれるかどうかの検査はがん検診の新たな方法で着目されている。一般にこれらの幹細胞やＣＴＣは他の細胞とそのサイズが異なっているため、そのサイズ差を利用して他の細胞群から分離することが期待できるため、マイクロスケールまたはそれ以下のサイズ差で粒子や細胞を分離する技術は極めて重要な技術である。

それらの粒子や細胞を分離する技術として、比較的操作が簡便なものでは遠心分離やフィルトレーションといった手法、外力を利用する電場や磁場を用いた手法などが知られている。しかしながら、遠心分離やフィルトレーションは細胞分離に用いると物理的な刺激を与えてしまうため、生存率の低下につながることに加え、分離精度が低いといった問題点がある。また、電場や磁場を用いる手法は、サンプルを修飾するといった操作が必要である場合があることに加え、外力を負荷する装置や設備が必要となるため操作が煩雑になるといった問題がある。

一方、近年フォトリソグラフィーや３Ｄプリンティングといった微細加工技術を利用して、幅が数ミクロン～数百ミクロンの微小な流路（マイクロ流路）を用いた粒子や細胞の分離技術が広く研究、開発されている（非特許文献１乃至３）。マイクロ流路内では層流が安定的に保たれるため、流路内の流体を精密に制御でき、流体に懸濁した粒子や細胞を高精度に分離することができる。

例えば、特許文献１に、ピンチドフローフラクショネーション（Ｐｉｎｃｈｅｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）（以下ＰＦＦと記載）という手法が報告されている。この手法は複雑な機器・装置を必要とせず、マイクロチップ中の流路内に流体を導入することで、サイズによって粒子や細胞を連続的に分離でき、複数のフラクションへの分離も可能となる。つまり、例えば大きさで分離する場合、大きいものと小さいものという２段階だけではなく、大きさによる３グループ以上の集団へと分離することができる。

ＰＦＦは、流路幅が局所的に細くなっている構造（以下、狭隘部とする）に複数の分岐から流体を導入し、流れに対して垂直な方向における粒子の位置を制御し、その後、狭隘部内における粒子の位置に応じて流れが粒子に与える力の方向が異なることに着目した分離方法であり、連続的にかつ精密に分離が可能な技術である。ＰＦＦでは、特許文献１に記載のように、２つのインレットを持つ構造を用いることができ、例えば一方のインレットから目的の粒子を含む液（以下、サンプル液）、他方のインレットから目的の粒子を含まない液（以下、シース液）を流し、粒子をシース液によって狭隘部壁面へ押し付けて整列させることで粒子分離を実施することができる。

ここで、俯瞰図（図１（ａ））の狭隘部において、流路の流れ方向（長手方向）をｘ軸とし、サンプル液とシース液の界面に対して垂直方向をｚ軸とし、ｘ軸とｚ軸に直交する方向をｙ軸とした場合に、ｚ軸方向の流路幅５０、ｙ軸方向の流路幅５１とすると、ＰＦＦにおける粒子分離能は一般に、ｚ軸方向の流路幅５０やサンプル液とシース液の流量比によって定まり、処理量はサンプル液とシース液の流量、またはマイクロチップを並列化することによって向上する。

特開２００５－２０５３８７号公報

Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７６、５４６５-５４７１、２００４． Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ、５、１２３３-１２３９、２００５． Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ、９、９３９-９４８、２００９． Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ、５、７７８-７８４、２００５．

しかしながら、処理量を向上させるためにサンプル液、シース液の流量を増大させた場合、圧損の上昇による影響で流路の破断や配管接続部からの液漏れが問題となる。また流路の材質が可撓性材料の場合は、流量増加に伴うせん断力の上昇により狭隘部のｚ軸方向の流路幅５０が拡幅し、分離能が低下することも懸念されるなど、流量の増大による処理量の増加には限界がある。一方でマイクロチップを並列化した場合、並列数に比例して処理量が増大するものの、マイクロチップの材料、製造コストもこれに比例して増加することになり、産業利用上の障壁となりうる。

本発明は、ＰＦＦと同様の分離原理を利用し、より簡便で低コストでありながら、単位時間当たりの粒子分離処理量を向上させるための粒子分離装置及びその方法を提供する。

本発明者らは上記課題を鑑み、狭隘部のｙ軸方向の流路幅５１（すなわち、流路の２組の対向する壁面の内、前記流路内で形成される流体の界面に対して垂直に対向する壁面間の距離）を長くすることで、粒子分離処理量がｙ軸方向の流路幅５１の長さに略比例して向上することを見出した。また、特に流路が可撓性の材料で構成される場合、狭隘部のｚ軸方向の流路幅５０（すなわち、流路の２組の対向する壁面の内、前記流路内で形成される流体の界面に対して平行方向に対向する壁面間の距離）の長さのばらつきを抑制することで、処理量と共に分離能が向上することを見出した。さらに、狭隘部に流入するサンプル液とシース液の流量比が、狭隘部内で一定となるよう流入させることでも、処理量と共に分離能が向上することを見出した。

従って、前記観点において、本発明は以下のものに関する。
［１］１の末端に流体導入口を備える２以上の分岐流路、及び当該分岐流路が合流して形成される流路を含み、少なくとも１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入される、粒子分離装置であって、
（１）合流して形成される流路の末端側の拡大開始点より下流側が拡大し、拡大された流路の末端に少なくとも１の回収口が備えられ、
（２）前記合流して形成される流路の２組の対向する壁面の内、前記流路内で形成される少なくとも２以上の流体の界面に対して垂直に対向する壁面間の距離が、水平に対向する壁面間の距離よりも長く、
（３）前記壁面を構成する材料が可撓性材料で構成され、前記合流して形成される流路の２組の対向する壁面の内、前記流路内で形成される少なくとも２以上の流体の界面に対して、平行に対向する壁面に接するように載置された１又は複数のピラー構造をもつことを特徴とする、前記粒子分離装置。
［２］前記界面に対して垂直の対向する壁面間の距離が、水平に対向する壁面間の距離よりも３倍以上長いことを特徴とする、前記記載の粒子分離装置。
［３］複数のピラー構造が載置される場合に、前記合流して形成される流路の２組の対向する壁面の内、前記流路内で形成される少なくとも２以上の流体の界面に対して、垂直に対向する壁面付近において、前記ピラー構造の間隔が相対的に狭くなっている、および／または１もしくは２のピラー構造が前記壁面からの突出構造であることを特徴とする、前記記載の粒子分離装置。
［４］前記合流して形成される流路が２以上の層で形成される多層構造体であって、前記流路内で形成される少なくとも２以上の流体の界面が、前記２以上の層に平行であることを特徴とする、前記記載の粒子分離装置。
［５］一方の流体導入口から分離対象の粒子が懸濁した流体を導入し、もう一方の導入口からは粒子を含まない流体を導入し、前記流体が合流した流路内において、前記粒子を前記流路の壁面に滑流させることで行う粒子分離方法であって、
前記流体が合流した流路内において、前記流体が合流して形成される界面方向に対して平行方向の各流体の長さが、前記流体が合流して形成される界面方向に対して垂直方向の各流体の長さに対して長いことを特徴とする、粒子分離方法。

本発明により、ＰＦＦと同様の分離原理を利用しながら、より簡便で低コストかつ高い粒子分離処理量を達成した粒子分離装置及びその方法を提供することができる。これにより、従来では困難であった、粒子サイズによる精密な分離と高い粒子分離処理量の両立が可能となる。

ＰＦＦにおける粒子分離の原理を示す図であり、図１（ａ）は流路の俯瞰図、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ―Ａ’線における断面から、粒子を観察した図である。 本発明の一実施形態における粒子分離装置及びその方法の実施形態を備えた３つの構造の斜視概要図である。図２（ａ）は１段目の構造、図２（ｂ）は２段目の構造、図２（ｃ）は３段目の構造をそれぞれ示す。 図３（ａ）は図２に示した１段目構造に、２段目及び３段目構造をそれぞれ反転して重ねて形成される構造の斜視概要図である。図３（ｂ）は図３（ａ）のｘ－ｚ断面図の概略図であり、太線で囲まれた部分が流路構造を表す。図３（ｃ）は図３（ｂ）の点線で囲まれた領域のｙ－ｚ断面図の概略図である。 図４（ａ）は図３（ｂ）で示した断面図において、２つの導入口から導入された流体の挙動と粒子の分離の様子を示す説明概略図であり、図４（ｂ）は図４（ａ）の点線で囲まれた領域を拡大し、分離の様子を詳細に示した概略図である。 本発明の別の一実施形態における粒子分離装置及びその方法の実施形態を備えた３つの構造の断面概要図である。 本発明の別の一実施形態における粒子分離装置及びその方法の実施形態を備えた２つの構造の断面概要図である。粒子を含まない流体１００Ｎと粒子を含む流体１００Ｐを導入するインレット３０ａ／ｂを入れ替えることでアウトレット３２ａ／ｂから流出する粒子サイズを調整することができることを示す（図６（ａ），（ｂ））。 本発明の別の一実施形態における粒子分離装置及びその方法の実施形態を備えたピラー突出構造の概要図である。図７（ａ）は本発明の別の一実施形態における粒子分離装置及びその方法の実施形態を備えたピラー突出構造の概要図である。図７（ｂ）は、図７（ａ）の領域Ａを上面から参照した拡大図である。 アウトレット３２ａ、ｂの流体流出比を調整するための実験系を示した模式図である。 ピラー構造の有無による粒子分離性能を比較した実験で、図９（ａ）はピラー構造有の場合の各出口からの粒子の回収率（実施例１）、図９（ｂ）はピラー構造なしの場合の各出口からの粒子の回収率（比較例１）を示したグラフである。 ピラー構造が無い場合に狭隘部内の界面に対して平行に対向する壁３４ａ、３４ｂが接着してしまうことにより発生した閉塞の様子を示した蛍光顕微鏡画像である（比較例３）。

以下、本発明を実施するための形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでは無い。

図２に、本発明における粒子分離装置及び方法の実施形態を備えた、３段構造からなるマイクロチップの各段の流路構造の概略図をそれぞれ示している。図２に示すｘ軸方向は流れ（長手）方向を示し、ｚ軸方向はサンプル液とシース液の界面に対して垂直方向とし、ｘ軸とｚ軸に直交する方向をｙ軸として示す。これにより、ｙ軸方向の流路幅は、壁３５ａ、３５ｂにより規定され、ｚ軸方向の流路幅（深さ）は、図２（ｂ）のピラー構造１９の高さと一致する。本発明において、「界面に対して垂直に対向する壁面」とは、界面に対し垂直に位置し、かつ対向している壁面を意味する。同様に「界面に対して平行に対向する壁面」とは、界面に対して平行に位置し、かつ対向している壁面を意味する。なお、本発明において、「垂直」及び「水平」は、発明の本質を逸脱しない限りにおいて、厳密に垂直及び水平として解釈すべきではなく、略垂直及び略水平と解釈すべきである。

図２における流路基板１０、１６、２２に形成された構造は、どの地点においても断面形状が矩形であり、流路深さは均一である。このように断面形状は、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、円形や楕円形、多角形などの断面であってもよく、また部分的に矩形以外の形状であってもよい。同様に流路構造の深さはその作製上の容易さから一定であることが好ましいが、部分的に深さが異なっていてもよい。一方で、より正確に流体を下流へ送りたい場合は、部分的に深さが異なる構造を設けて圧損を調整することで、サンプル液が導入される流路への逆流を抑制する、またはヘッド圧等の外的要因により引き起こされる流量変動を抑制することが可能となるため、部分的に深さが異なる構造を設けた方が好ましい場合もある。

図２に示した３段積層マイクロチップ２９を構成するための１、２、３段目流路基板は、流路基板１０に流路基板１６を反転して重ね、さらに流路基板２２を反転して重ねることで形成される。流路基板１０の土手構造１３部分に２段目のピラー構造１９が重なることで、ピラー間の隙間を局所的に流路幅が小さくなった狭隘構造として利用する。狭隘構造のｚ軸方向の幅（深さ）は２段目のピラー構造の高さに依存する。ピラー構造を備えることで、狭隘部の壁３４ａ、３４ｂが接することによる流路の閉塞を防止することができる。また、可撓性の材料で流路の壁面が形成されていた場合、ピラー構造を備えることで、狭隘部のｚ軸方向の流路幅５０の拡幅を抑制することができ、それにより分離能の低下を抑制することができる。粒子が滑流する壁面において拡幅を抑制する観点から、ピラー構造は、粒子が滑流する壁面と一体に成形されていることが好ましい。なお、本装置及び手法による分離粒子サイズは２段目のピラーの高さに依存するため、その均一性が低下すると、場所によって分離粒子サイズが異なり、全体として分離能も低下する。従って、前述の３段積層マイクロチップにおいて形成される狭隘構造（狭隘部３１）内における、各インレットから導入された流体で形成される界面は、各層の面に平行に形成されることになる。

マイクロ流路に用いる可撓性材料としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、環状ポリオレフィンなどの樹脂や、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーンゴム、ウレタンゴムなどが使用されうる。これらの可撓性材料は、本発明にかかる粒子分離装置のように、マイクロ流路の狭溢部において、せん断力を生じ、流路の拡幅を引き起こしうる。

図２（ａ）に、本発明における３段積層流路の１段目の流路構造の概略図を示す。１２と１４に示す枝分かれの構造は、マイクロチップ内の流路に（特に狭隘部３１へ）流体を均一に導入するための１以上の分岐部からなる構造であり、分岐部が多い方が流路に均一に流体を導入することができるため、流路幅に合わせて分岐の数を調整することが好ましい。これは、一般に、図２のｘ、ｙ、ｚ軸方向の少なくとも１つ以上の長さがマイクロ～ミリレベルの構造をもつ流路において、流速分布が壁面近傍と流路中央で異なる現象に基づく施策であり、流体を均一に導入するという目的を達成するものであれば必ずしも前記枝分かれ構造を用いる必要はなく、他の構造を用いても良く、例えば１以上のピラー構造を設ける態様としてもよい。

ここで、土手構造１３は、狭隘部を構成する構造の一つであるため、土手構造１３のｘｙ平面は平坦であることが好ましく、このｘｙ平面が狭隘部の流路のｚ軸方向の壁３４ａとなる。

図２（ｂ）に、３段積層流路の２段目の流路構造の概略図を示す。１８及び２０に示す貫通部のｚ軸方向の幅（深さ）は、積層流路内の層流を安定的に保つために数百マイクロメートル以下であることが好ましい。また、同貫通孔部のｘ軸方向の長さも、同様の理由で数百マイクロメートル以下であることが好ましい。ピラー構造１９のｘ軸方向の長さは、貼り合わせや接着力といった作製の都合上、１３の土手構造のｘ軸方向の長さと同程度が望ましい。図２（ｂ）のｘｚ面の壁３５ａ及び３５ｂが狭隘部のｙ軸の流路幅を規定する。

図２（ｃ）に、本発明における微粒子分離で用いる３段積層マイクロチップの３段目の流路構造の概略図を示す。２５と２６に示す枝分かれの構造は、マイクロチップ内の流路に流体を均一に導入するための構造であり、分岐部が多い方が流路に均一に流体を導入することができるため、流路幅に合わせて分岐の数を調整するとよい。また、１２と１４に示す枝分かれの構造と同様に、流体を均一に導入するという目的を達成するものであれば必ずしも前記枝分かれ構造を用いる必要はなく、他の構造を用いても良い。

図３（ａ）に、図２に示す３段構造を統合した、本発明で用いるマイクロチップ２９を示す。マイクロチップ２９は、粒子をその大きさにより分離し、適当な回収系を用いることにより、サンプル液中の粒子を粒径ごとに分取するためのマイクロチップであり、例えば、ＰＤＭＳなどの高分子（ポリマー）材料やガラスや金属等の硬く撓みが少ない材料により形成された微細構造を有する３つの流路基板１０、１６及び２２によって形成される平板上の構造を有していてよい。

ここで回収系とは、分離した粒子を回収するために用いられる構造ないし機構であり、例えば図３（ｂ）のアウトレット３２ａ、３２ｂが該当し、前記アウトレットへ接続する樹脂製または金属製等の配管や、分離した粒子を回収する容器も含まれる。さらに前記配管の下流側の出口へ、分離した粒子を回収する容器を準備してもよい。この時、前記アウトレットや配管内を通過する流体の抵抗により、前記２つのアウトレットへ流入してくる流体の分配比が変化する可能性があるため、前記アウトレットや配管の内径、長さを適宜調整することが好ましい。

マイクロチップ２９を作製する場合に用いる技術としては、例えば、モールディングやエンボッシングといった鋳型を用いる作製技術は、流路構造を正確かつ容易に作製可能であるという点において好ましいが、その他にも、フォトリソグラフィー、ソフトリソグラフィー、ウェットエッチング、ドライエッチング、ナノインプリンティング、レーザー加工、電子線直接描画、機械加工等、３Ｄプリンターの作製技術を用いることも可能である。但し、一般的なフォトリソグラフィーにより鋳型、流路を作製する場合、作製可能なアスペクト比（構造深さ／構造幅；但しここでの構造深さとは、フォトリソグラフィーにおいてレジストを感光させる紫外光の進行方向の構造長さを構造深さ、前記進行方向に対して垂直方向の構造長さを構造幅とする）３以上の構造の作製には、高精度な微細加工技術が必要であり、流路作製の操作が煩雑化し、コストの増加にもつながってしまうため、低アスペクト比の構造でも狭隘部３１を構成できるよう、前述の積層構造を用いる方が好ましい。

また、マイクロチップ２９を作製する場合の材質としては、ＰＤＭＳ、アクリル等の各種ポリマー材料を用いることができ、また、これらの材料のうち、任意の２種類の基板を組み合わせて用いることも可能である。ただし、流路自体を安価に作製し、ディスポーザブルな装置を提供するためには、ポリマー材料を用いることが好ましい。

図３（ｂ）にマイクロチップ２９のｘ－ｚ断面図の概略図を示す。３０ａは図２の１１、１７及び２３から、３０ｂは図２の２４からなるそれぞれインレットである。３１は図２の１３の土手構造により局所的にｚ軸方向の流路幅（深さ）が小さくされた狭隘部、３２ａは図２の１５、２１及び２８から、３２ｂは図２の２７からなるそれぞれアウトレットである。インレット３０ａ、３０ｂは、それぞれ測定対象の粒子を含む流体と測定対象の粒子を含まない流体の流体導入口であり、アウトレット３２ａ、３２ｂは流体の出口である。なお、測定対象の粒子を含む流体（またはサンプル液）は、インレット３０ａ、３０ｂ何れかから導入されることが好ましいが、インレット３０ｂから導入されることが好ましい。また、測定対象の粒子を含まない流体（またはシース液）は、インレット３０ａ、３０ｂ何れかから導入されることが好ましいが、インレット３０ａから導入されることが好ましい。狭隘部３１において、導入されたサンプル液とシース液との間に界面が形成される。界面に対して平行方向（ｙ軸方向）に対向する壁３４ａ、３４ｂの距離は、狭隘部３１のｚ軸方向の流路幅（深さ）に該当する。さらに、インレット３０ａ、３０ｂは、図２、３では同じ高さに設けられているが、異なる高さに各々設けても良い。

図３（ｃ）に、狭隘部３１のｙ－ｚ断面図を示す。図２の土手構造１３及び、ピラー構造１９が重なり、その隙間を狭隘部の流路として利用する。この狭隘部３１のｚ軸方向の流路幅（深さ）は、ピラー構造１９の高さに依存するため、任意の値に設定することが出来るが、マイクロスケールの粒子を分離する際は数十ミクロン以下の高さである方が好ましい。土手構造１３と重なった際に接着の強度を保つために、ピラー構造１９のｙ軸方向の幅は数マイクロメートル以上であるとよく、各ピラー間の距離はピラー幅の数倍程度であるとよい。なお、ピラー構造１９は、図３のｚ軸方向の狭隘部の幅を一定とすることで粒子分離能が狭隘部３１において均一となることを目的として設けられているものであり、例えばマイクロチップ２９を構成する材質がガラスや可撓性の少ない高分子材料の場合、ピラー構造１９は必ずしも必要ではない。しかしながら、ＰＤＭＳ等の可撓性の材質の場合は、前記ピラー構造１９により、狭隘部を形成する構造の撓みを抑制することが可能となるため、好ましい。また、一般にマイクロ～ミリレベルの長さや幅、高さをもつ流路での壁面近傍では流速が少なくなる傾向にあるため、ピラー構造１９のうち、壁面近傍における各ピラー間の間隔を相対的に短くすることで、狭隘部３１内でのサンプル液とシース液の流量比が、図３のｙ軸方向において均一となるよう調整してもよい。また、前述のサンプル液とシース液の流量比を図３のｙ軸方向において均一となるよう調整するという思想のもと、前記ピラー構造１９中の各ピラーの間隔を、局所的に狭める、または拡げる、もしくは壁３５ａ、ｂ付近のピラー構造を連結する、または壁面へと接続することで部分的な突出構造を形成することがより好ましい。狭隘部３１において、導入されたサンプル液とシース液との間に界面が形成される。界面は、土手構造１３と平行方向に形成される。界面に対して垂直に対向する壁３５ａ、３５ｂの距離は、狭隘部３１のｙ軸方向の流路幅に該当する。狭隘部３１のｚ軸方向の流路幅（深さ）に対して、狭隘部３１のｙ軸方向の流路幅は、一例として３倍以上長く、好ましくは１０倍以上長く、さらに好ましくは５０倍以上長く、さらにより好ましくは１００倍以上長く、さらに一層好ましくは２５０倍以上長く、さらにより一層好ましくは５００倍以上長く設定することができる。

流路の全体の長さ、つまり、インレット３０ａのある一方の端から、アウトレット３２ａのあるもう一方の端までの長さは１μｍ以上の任意の値に設定することが可能であるが、流路作製の容易さと圧力損失の観点から数μｍ～数百ｍｍ程度に設定することが好ましい。
また狭隘部３１は、粒子の整列を達成する観点から、長さの下限が１００ｎｍ以上であることが好ましく、１μｍ以上がさらに好ましく、長さの上限が１０ｍｍ以下であることが好ましく、５００μｍ以下がさらに好ましい。

続いて、本発明の分離原理について図４を用いて詳しく説明する。図４（ａ）は、マイクロチップ２９のインレット３０ａから分離対象の粒子を含まない流体である斜線で示した流体１００Ｎを、インレット３０ｂから分離対象の粒子を含む流体である流体１００Ｐを導入した際の、粒子分離の概略図を示す。図４（ｂ）は領域３３の拡大図である。粒子３００ａ、３００ｂは、それぞれ相対的に大きな粒子と相対的に小さな粒子を示している。図４（ｂ）において、矢印４００ａ、４００ｂは、それぞれ大きな粒子３００ａと小さな粒子３００ｂの運動ベクトルを示している。

粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎを、シリンジポンプなどの送液機構を用いて２つのインレット（流体導入口）３０ｂ、３０ａからそれぞれ連続的に供給する。この時、狭隘部３１内では、それぞれの流体が安定な層流を保ちながら流れ、界面を形成する。そして、粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎの流量を調節することで、狭隘部３１における流体１００Ｐのｚ軸方向の深さが、分離対象とする最小の粒子の粒径よりも小さくなるようにする。この操作により、分離対象とする全ての粒子は、狭隘部３１上面に沿って滑流するようになり、粒子が滑流する狭隘部３１上面に対して垂直方向における粒子の位置を、粒子の大きさによって一定にすることができる。

そして狭隘部３１を通過した粒子は、粒子の中心位置と狭隘部３１上面からの距離は粒径によって異なるため、中心位置が狭隘部上面に近いものほど狭隘部３１下流の流路深さが拡大した領域において流路の浅い位置（図４上側）に、中心位置が狭隘部底面に近いものほど流路の深い位置（図４下側）に流出する。したがってその粒子の粒径によって流出する深さが決定する。浅い位置に流出した粒子と、深い位置に流出した粒子を各アウトレットの流出比を調整することで、分級が可能となる。

また、前記流路深さが拡大した領域は、狭隘部３１よりも深さが大きくなっている領域を指す。より一般的には、図１に示すように、狭隘部下流の流路との拡大角度２００ａ、２００ｂの少なくともいずれか一方が１８０°未満である領域を指す。

ここで粒子が壁面に沿って滑流するとは、粒子が壁面付近を流れることをいい、必ずしも壁面に接触していることを意図するものではない。また、粒子は壁面付近で回転や跳躍する場合も含まれるものとする。サンプル液とシース液の流量は、シース液流量の方が大きい方が好ましく、２倍以上大きい方がさらに好ましく、１０倍以上大きい場合が最も好ましい。
なお、分離した粒子を「非対称ピンチドフローフラクショネーション（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｐｉｎｃｈｅｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（ＡｓＰＦＦ）（非特許文献４）の原理に基づいて、一方のアウトレットに多量の流体を流すことで分離能を調整させることもできる。より具体的には、流路の抵抗値を適切に設計し、また、狭隘部３１の流路幅および粒子径の関係から、ある特定のサイズの粒子を、特定のアウトレットにのみ導入できる、という原理である。本発明にＡｓＰＦＦの概念を適用する場合、例えば、３２ｂのアウトレットへ多量の流体が流れるよう各流路の抵抗値を適切に設計してもよく、適宜アウトレットの数を増やしてもよい。
なお、分離対象の粒子を含まない流体１００Ｎが流れる空間が１の分岐流路、分離対象の粒子を含む流体１００Ｐが流れる空間が別の１の分岐流路であり、前述の２つの分岐流路が合流することで形成された流体１００Ｎ、流体１００Ｐとの界面が存在する空間で、前述の界面が存在する空間の何れかの面または辺で分離対象とする粒子が滑流する流路が狭隘部３１となる。但し、前述の各分岐流路は、狭隘部よりも上流に存在する空間のことを指す。

流路内部における流量条件を達成するための導入量の調節方法として、導入口からシリンジポンプ等を用いて溶液を導入することが操作上簡便であり好ましいが、ペリスタポンプ等の他のポンプを用いる手法、ボンベ、圧力装置等を用いた定圧送液方法、液面差を用いる方法、電気浸透流や遠心力等を用いた送液方法などを用いることも可能である。また、アウトレットから陰圧を付す圧力装置を用いることもできる。

なお、粒子の安定的かつ効率的な分離を達成するためには、流路内で安定な層流が保たれることが望ましく、具体的には、レイノルズ数が２３００以下になる条件下で送液操作を行うことが好ましく、１０００以下になる条件がさらに好ましい。

分離を行う粒子としては、直径３．２μｍ及び９．９μｍの蛍光ポリスチレンビーズを用いたが、目的に応じて、ポリスチレン等のポリマー粒子、金属微粒子、セラミックス粒子、またはそれらの表面に物理的あるいは化学的な処理を施した粒子を用いることができる。また、本発明では、粒子にかかる外圧や変形を及ぼす力が少ないため、従来の分離方法であるフィルターなどでは、破裂や破壊が生じてしまう微粒子や細胞、その構成要素であるオルガネラなどの生物粒子、ウイルス、細菌、エクソソーム等の細胞外小胞、タンパク質、タンパク質凝集体を処理できる、という優れた効果を発揮する。分級対象とする粒子の最大直径はマイクロチップ２９における狭隘部３１の深さ未満であれば、任意の大きさの粒子を分離することができる。例えば、狭隘部３１の深さが１００μｍである流路を用いる場合、分離される粒子の直径は、１００μｍ未満である。

粒子を懸濁させた流体としては、０．５％（ｖ／ｖ）ツイーン８０水溶液を用いたが、任意の液体または気体を用いることができ、目的に応じて様々な溶液を用いることができる。例えば、粒子としてポリマー粒子や金属粒子を用いる場合には、各種化学物質を含む水溶液の他、有機溶液、イオン性流体等を用いることができる。さらに、粒子として細胞等の生物粒子を用いる場合には、細胞培養液や生理緩衝液などの細胞と等張の水溶液を用いるのが好ましい。ただし、例えばバクテリアや植物細胞のような比較的低張あるいは高張溶液に対し耐性をもつ細胞の場合には、必ずしも等張である必要はない。また、操作の都合上、溶液の密度と粒子の密度の差が大きくない系がより好ましい。サンプル液、シース液の粘度に関しては、これらの粘度における差が小さい系がより好ましいが、粒子の処理を可能とするシステムであれば、粘度に差があってもよい。なお、粒子を含む流体と粒子を含まない流体は、どちらも同じ流体から構成されていてもよく、また、それぞれ２種類以上の異なる流体から構成されていてもよい。サンプル液とシース液の密度は、同等であってもよいし、異なってもよい。サンプル液とシース液とが上下に積層した層流を形成する観点から、下側の層流を形成する液体の密度を重くすることができる。

また、本発明は図５に示すように、土手構造１３を用いずに狭隘部３１を形成する構造を用いてもよい。この時、２段目流路構造中の狭隘部の壁３４ｂは、平坦な構造である３段目流路構造の表面（壁３４ａ)とともに狭隘部３１の流路を構成し、ピラー構造１９の厚みに対応するｚ軸方向の流路幅（深さ）を狭隘部３１に与える。この場合、ＰＦＦの原理に基づいて粒子が押しつけられる壁面を、より平坦な面を持つガラス等の材料を用いることが出来る。
さらに、本発明は図６に示すように、枝分かれ構造１２、１４、２５、２６、貫通構造１８、２０を用いずに２段積層マイクロチップとなる態様を用いてもよい。
なお、これまでに記載した３段積層マイクロチップは、一般的なフォトリソグラフィーの技術に基づいて３つの層状の流路構造を有する流路基板（１０、１６、２２）を作製し、前記各層の面同士を貼り合せることで作製したが、３Ｄプリンティングの技術で図３（ａ）や図５に示す構造を一括で作製してもよい。従って、本発明は複数の層を積層させることで作製しなくてもよく、流路製造プロセスにかかる人件費等のコストを低減できる点では、こちらの方が好ましい。一方、大量生産により部材のコストを低減する点では、前述のフォトリソグラフィーや金属加工、微細加工技術により作製した金属金型を用いたソフトリソグラフィー、射出成形を用いて、２層以上の多層構造とすることが好ましい。

製造実施例：積層流路の作製
本発明による連続分級方法の実施形態を備えた３段構造のマイクロチップ２９の各段の微細構造は、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。具体的な手順を以下の通り示す。

４インチベアシリコンウェハ（株式会社フィルテック）上へ、フォトレジストＳＵ－８ ３０００シリーズ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。マスクアライナー（ウシオ電機社）と、任意のパターンを形成したフィルムマスクを用いて流路パターンをフォトレジスト膜へ形成し、ＳＵ－８Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、用いたい流路の鋳型を作製した。
続いて、作製した鋳型へ、ＳＩＬＰＯＴ１８４（東レ・ダウコーニング社）を用いて調製した未硬化のシロキサンモノマーと重合開始剤の混合物（重量比１０：１）を流し込み、８５℃で３０分間加熱することで、流路の形状を転写されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭS）を作製した。硬化したＰＤＭＳを鋳型から慎重に剥がし、カッターで任意の大きさに成形後、パンチャーを用いて流路の入り口側ポート、アウトレットを形成した。剥離したそれぞれのＰＤＭＳ同士を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、アライメント調整して各段のＰＤＭＳ同士を貼り合わせることでマイクロチップ２９を作製した。作製したマイクロチップの構造は図２、３に示した通りである。

また、用いたマイクロチップ２９の各構造の大きさを、図２に示すｘ軸方向を長さ、ｙ軸方向を幅、ｚ軸方向を深さとして表す。土手構造１３は、長さ３００μｍ、幅１ｃｍ、深さ３００μｍとし、貫通構造１８、２０はともに長さ３００μｍ、幅１ｃｍ、深さ３００μｍとし、枝分かれ構造１２、１４は幅５００μｍ、深さ３２０μｍの流路が、２５、２６は幅５００μｍ、深さ８０μｍの流路が２つに枝分かれする構造をそれぞれ４回繰り返し、最終的に１６本の流路に分岐する構造とした。さらに、ピラー構造１９は長さ５０μｍ、幅５０μｍ、深さ２０μｍ、ピラー間の壁面の距離７５μｍとした。

連続微粒子分離実験
ピラー構造有無による粒子分離能への影響
実施例１
粒子の入っている流体１００Ｐは１８ｗｔ％スクロース、０．５ｗｔ％ツイーン８０水溶液を用いて、直径３．２μｍの蛍光ポリスチレン（Ｆｌｕｏｒｏ－Ｍａｘ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１．２×１０＾６個／ｍＬに、直径９．９μｍの蛍光ポリスチレン－ジビニルベンゼン粒子（Ｆｌｕｏｒｏ－Ｍａｘ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を７．６×１０＾５個／ｍＬにそれぞれ希釈し用いた。粒子の入っていない流体１００Ｎは１８ｗｔ％スクロース、０．５ｗｔ％ツイーン８０水溶液を用いた。
製造実施例で作製したマイクロチップ２９（図２、３）を用い、流体１００Ｎをインレット３０ａから、流体１００Ｐをインレット３０ｂからシリンジポンプにより流量を調節してそれぞれ流体１００Ｎと流体１００Ｐの流量をそれぞれ２０００、１００μＬ／ｍｉｎの流量で送液した。アウトレット３２ｂへはＬ字型の金属パイプのみを接続し、アウトレット３２aへはＬ字型の金属パイプを介して外径３ｍｍ、内径２ｍｍのシリコンチューブ２００ｍｍを接続し、シリコンチューブ末端から１０ｍｍをジャッキへテープで固定し、前記ジャッキの高さを２．５ｃｍへ調節することでシリコンチューブの位置エネルギーを利用したアウトレット３２ａ、ｂの流体流出比の調整を行い（アウトレット３２ｂへ流体が流れる割合（回収口１流出率）を８．３％とした；図８）、流出した液体をマイクロチューブに回収し、風袋と回収後の質量の差から流出した液量の測定をそれぞれ行った。その後、血球計算盤を用いて２つの回収液中の蛍光粒子濃度の測定を行った。流出した液量と濃度から、各出口から流出した各サイズの粒子の回収率を算出した。
図９（ａ）に回収率を示したグラフを示す。９．９μｍ粒子の９７％以上はアウトレット３２ａから、３．２μｍ粒子の９５％以上はアウトレット３２ｂからそれぞれ流出し、比較例１と比較して、高精度な分離を達成した。

比較例１
ピラー構造を持たない点以外は実施例１と同様のマイクロチップを用い、直径３．２μｍの蛍光ポリスチレン粒子を２．６×１０＾６個／ｍＬに、直径９．９μｍの蛍光ポリスチレン－ジビニルベンゼン粒子を９．２×１０＾５個／ｍＬにそれぞれ希釈した点以外の実験条件は実施例１と同様にして粒子の分離実験を行った。図９（ｂ）に回収率を示したグラフを示す。３．２μｍ粒子の９９％はアウトレット３２ｂから流出した一方、９．９μｍ粒子の８４％以上が同じアウトレット３２ｂからそれぞれ流出し、粒子分離が出来ないことを確認した。
これは、粒子分離が行われる狭隘部３１が図３のｚ軸方向に拡大し、設定した回収口１流出率では粒子分離が出来なかったためと推測される。

比較例２
比較例１で用いたマイクロチップを複数個作製した際、いくつかのマイクロチップでは部分的に狭隘部３１が閉塞してしまい、一部の狭隘部にしか粒子が通過しない現象が確認された。その様子を図１０に示す。図１０は、図３における狭隘部３１をｚ軸方向から蛍光顕微鏡にて蛍光粒子（比較例１と同様に希釈した各蛍光粒子）を蛍光観察した様子を示しているが、図１０に示した閉塞部分では粒子が通過していない様子が確認される。
以上から、ＰＤＭＳのような可撓性の素材でマイクロチップが構成される場合、作製時における流路内の閉塞が見られる場合があるため、マイクロチップの量産性の観点でも、ピラー構造を有している方が好ましいといえる。

１０ １段目流路基板
１１ インレット３０ａの一部
１２ 枝分かれ構造
１３ 土手構造
１４ 枝分かれ構造
１５ アウトレット３２ａの一部
１６ ２段目流路基板
１７ インレット３０ａの一部
１８ 貫通構造
１９ ピラー構造
２０ 貫通構造
２１ アウトレット３２ａの一部
２２ ３段目流路基板
２３ インレット３０ａの一部
２４ インレット３０ｂの一部
２５ 枝分かれ構造
２６ 枝分かれ構造
２７ アウトレット３２ｂの一部
２８ アウトレット３２ａの一部
２９ ３段積層マイクロチップ
３０ａ、３０ｂ インレット
３１ 狭隘部
３２ａ アウトレット（回収口２）
３２ｂ アウトレット（回収口１）
３３ 図４（ｂ）の部分
３４ａ、ｂ 界面に対して平行に対向する壁
３５ａ、ｂ 界面に対して垂直に対向する壁
５０ 狭隘部のｚ軸方向の流路幅
５１ 狭隘部のｙ軸方向の流路幅
６０ 領域Ａ
６１ ピラー突出構造
７０ 拡大流路構造
８０ 基板
１００Ｎ 粒子を含まない流体
１００Ｐ 粒子を含む流体
２００ａ、２００ｂ 拡大角度
３００ａ、３００ｂ 粒子
４００ａ、４００ｂ 粒子３００ａと粒子３００ｂの運動ベクトル

Claims (5)

1. １の末端に流体導入口を備える２以上の分岐流路、及び当該分岐流路が合流して形成される流路を含み、少なくとも１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入される、粒子分離装置であって、
   （１）合流して形成される流路の末端側の拡大開始点より下流側が拡大し、拡大された流路の末端に少なくとも１の回収口が備えられ、
   （２）前記合流して形成される流路の２組の対向する壁面の内、前記流路内で形成される少なくとも２以上の流体の界面に対して垂直に対向する壁面間の距離が、水平に対向する壁面間の距離よりも長く、
   （３）前記壁面を構成する材料が可撓性材料で構成され、前記合流して形成される流路の２組の対向する壁面の内、前記流路内で形成される少なくとも２以上の流体の界面に対して、平行方向に対向する壁面に接するように載置された１又は複数のピラー構造をもつことを特徴とする、前記粒子分離装置。
2. 前記界面に対して垂直に対向する壁面間の距離が、水平に対向する壁面間の距離よりも３倍以上長いことを特徴とする、請求項１に記載の粒子分離装置。
3. 複数のピラー構造が載置される場合に、前記合流して形成される流路の２組の対向する壁面の内、前記流路内で形成される少なくとも２以上の流体の界面に対して、垂直に対向する壁面付近において、前記ピラー構造の間隔が相対的に狭くなっている、および／または１もしくは２のピラー構造が前記壁面からの突出構造であることを特徴とする、請求項１に記載の粒子分離装置。
4. 前記合流して形成される流路が２以上の層で形成される多層構造体であって、前記流路内で形成される少なくとも２以上の流体の界面が、前記２以上の層に平行であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の粒子分離装置。
5. 一方の流体導入口から分離対象の粒子が懸濁した流体を導入し、もう一方の導入口からは粒子を含まない流体を導入し、前記流体が合流した流路内において、前記粒子を前記流路の壁面に滑流させることで行う粒子分離方法であって、
   前記流体が合流した流路内において、前記流体が合流して形成される界面方向に対して平行方向の各流体の長さが、前記流体が合流して形成される界面方向に対して垂直方向の各流体の長さに対して長いことを特徴とする、粒子分離方法。

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