JP2022025631A - ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、抗原に対する免疫応答を改善したワクチン組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、抗原に対する免疫応答を改善する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明により、（ａ）抗原と、（ｂ）ｍｉｃｒｏＲＮＡ１－１９２（ｍｉＲ－１９２）とを含む、ワクチン組成物が提供される。また、哺乳動物への投与のためのワクチンを製造するための方法であって、（１）ｍｉＲ－１９２を発現する動物培養細胞を培養する工程、（２）前記動物培養細胞にウイルスを接種して感染させて細胞を培養することにより、細胞においてウイルスを複製する工程、および（３）ウイルスを、ｍｉＲ－１９２とともに単離してウイルス調製物を製造する工程、を含む方法が提供される。
【選択図】図２７

Description

本発明は、抗原に対する免疫応答を改善したワクチン組成物に関する。本発明はまた、抗原に対する免疫応答を改善する方法に関する。

インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶウイルス）、ＣＯＶＩＤ－１９など感染症による死亡率は６５歳以上の老齢者で著しく高くなる。これらのウイルスは、老齢者において気管支炎及び重度の呼吸器疾患を引き起こす主要な原因である。一方で、老齢者は加齢に伴い免疫が低下しているため、より一層、ウイルス感染症に対する免疫の向上が求められる。老齢者のウイルス感染症に対する免疫獲得にはワクチンが使用されるが、免疫が低下している老齢者に対しては、ワクチンによる免疫向上作用が弱く、従来のワクチンによる予防効果は、老齢者では顕著に低下することが知られている。また、ワクチン接種は感染症の予防に非常に効果的だが、免疫系への老齢の影響は免疫機能障害につながり、老齢者のワクチン接種の有効性を低下させる可能性が指摘されている。

そのため、ウイルス感染症に対するワクチンの免疫向上作用をより増強させる必要があるが、免疫賦活剤などではこの点で十分ではない。そのため、老齢者にも高い予防効果を示すワクチンの開発が求められている。

また、季節性インフルエンザワクチンは、ウイルスのＨＡタンパク質を含む画分が使用されているが、一般に予防効果が十分でなく、特に免疫向上作用が弱い老齢者においては問題となる。一方で、パンデミックインフルエンザワクチンでは、ウイルス粒子全体を用いた全粒子ワクチンが使用されている。承認を受けたワクチンの作製には鶏卵が主に用いられている。それ以外に、培養細胞、例えばＭＤＣＫなどの用いた方法も報告されており（特許文献１～４）、一部のワクチンメーカーにおいてＭＤＣＫ細胞を用いた作製が承認されている。

循環細胞外小胞（circulating extracellular vesicle：ＥＶ）は、インフルエンザに対するワクチン接種に使用される全ワクチン粒子（whole virus particle: ＷＶＰ）と呼ばれる不活化されたインフルエンザＡウイルス粒子による刺激後の免疫応答を調節できるという報告がある（非特許文献１：Okamoto et al., 2018, J Biol Chem 293, 18585-18600）。

国際公開ＷＯ１９９７／０３７０００ 国際公開ＷＯ２００８／１０５９３１ 国際公開ＷＯ２０１０／０３６７６０ 再表２００７－１３２７６３号公報

Okamoto et al., 2018, J Biol Chem 293, 18585-18600

本発明は、抗原に対する免疫応答を改善したワクチン組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、抗原に対する免疫応答を改善する方法を提供することを目的とする。

本発明者は、若齢と老齢のマウス個体から血清を採取してそこから細胞外小胞を抽出し、細胞外小胞内のｍｉｃｒｏＲＮＡについて網羅的に調べたところ、老齢個体のマウスでのみ特異的に発現量が増加するｍｉｃｒｏＲＮＡを複数同定した。これらのｍｉｃｒｏＲＮＡについて調べたところ、ｍｉＲ－１９２と呼ばれるｍｉｃｒｏＲＮＡが免疫応答を制御することを発見した。そこで、このｍｉＲ－１９２を含む細胞外小胞を調製し、老齢のマウスに投与したのちにワクチンを接種したところ、老齢のマウスは、若齢のマウスと同程度にまで免疫応答を回復させることを発見し、本発明を完成した。

本発明は以下の態様を含む。
［１］（ａ）抗原と、（ｂ）ｍｉｃｒｏＲＮＡ１－１９２（ｍｉＲ－１９２）とを含む、ワクチン組成物。
［２］前記ｍｉＲ－１９２は細胞外小胞に含まれた状態にて含有される上記［１］に記載のワクチン組成物。
［３］６５歳またはそれ以上の年齢のヒト老齢者に投与されることを特徴とする、上記［１］または［２］に記載のワクチン組成物。
［４］前記抗原は病原体由来の抗原である上記［１］～［３］のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
［５］抗インフルエンザワクチン組成物である上記［１］～［３］のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
［６］前記抗原は、腫瘍に対するＴ細胞応答を選択的に引き出す腫瘍抗原である、上記［１］～［３］のいずれか一つに記載のワクチン組成物。

［７］哺乳動物への投与のためのワクチンを製造するための方法であって、
（１）ｍｉＲ－１９２を発現する（または、ｍｉＲ－１９２をトランスフェクトして発現させた）動物培養細胞を培養する工程、
（２）前記動物培養細胞にウイルスを接種して感染させて細胞を培養することにより、細胞においてウイルスを複製する工程、および
（３）ウイルスを、ｍｉＲ－１９２とともに単離してウイルス調製物を製造する工程、
を含む方法。
［８］前記ウイルス調製物を弱毒化または不活性化する工程をさらに含む、上記［７］に記載の方法。
［９］前記工程（３）における単離を、ｍｉＲ－１９２は細胞外小胞に含まれた状態にてウイルスとともに単離される、上記［７］または［８］に記載の方法。
［１０］前記工程（３）における単離を、ウイルス粒子の大きさ(例えば直径)およびｍｉＲ－１９２を含有する細胞外小胞の大きさ(例えば直径)に基づく分離方法により行う、上記［９］に記載の方法。
［１１］前記分離方法が、約５０～約１５０ｎｍ（好ましくは約６０～約１４０ｎｍ、より好ましくは約７０～約１３０ｎｍ、さらに好ましくは約８０～約１２０ｎｍ、最も好ましくは約９０～約１１０ｎｍ）の粒子径（好ましくは直径）に基づいて行われる上記［１０］に記載の方法。
［１２］前記ウイルスがインフルエンザウイルスである上記［７］～［１１］のいずれか一つに記載の方法。
［１３］前記動物培養細胞が、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＢＨＫ細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群より選ばれる細胞である、上記［７］～［１２］のいずれか一つに記載の方法。

本発明により、抗原に対する免疫応答を改善したワクチン組成物が提供される。

図1は、若齢および老齢の、野生型マウス（ＷＴ）およびＩＬ－６ＫＯマウス（ＩＬ－６ ＫＯ）の分離された血清ＥＶ中のｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－３２２、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－２１、およびｍｉＲ－１８１ｃレベルを確認した結果である。ｎ＝６である。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 ＲＡＷ２６４．７細胞をｍｉＲＮＡ模倣ＲＮＡ（ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－３２２、およびｍｉＲ－１８１c）でトランスフェクトし、トランスフェクションの３６時間後に細胞をＲ８４８で刺激し、Ｉｌ６、Ｔｎｆａ、およびＣｃｌ２のｍＲＮＡ発現をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した結果である（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 ｍｉＲ－１９２に関してマイクロアレイ分析を行い、さらに遺伝子オントロジーと経路分析を行った結果である。 ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００によって測定した、若齢および老齢血清におけるＥＶの濃度（図４Ａ）およびＥＶのサイズ（図４Ｂ）を示す。図４Ｃは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定したＥＶ ｍｉＲ－１９２の絶対コピー数を示す（ｎ＝５）。図４Ｄは、若齢および老齢のＷＴマウスとＩＬ－６ ＫＯマウスの血漿からＥＶを収集した後、トータルＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲによりｍｉＲ－１９２レベルを測定した結果を示す（ｎ＝６）。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 図５Ａは、各抗体を投与した後に採取した血清ＥＶのｍｉＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した結果を示す（ｎ＝６）。図５Ｂは、組換えＩＬ－６、ＴＮＦ－α、又はＩＬ－１βを若齢マウスに静脈内注射した後に採取した血清ＥＶのｍｉＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲで測定した結果を示す（ｎ＝６）。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 図６Ａは、ＥＬＩＳＡで測定した若齢および老齢マウスの血清ＩＬ－６レベルを示している（ｎ＝１０）。図６Ｂは、若齢マウスにＩＬ－６を注射し、１日後および２日後に血清を採取し、血清ＩＬ－６レベルをＥＬＩＳＡで測定した結果である（ｎ＝４）。図６Ｃは、若齢および老齢のＷＴマウスにＩＬ－６を注射した後の血清ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した結果である（ｎ＝４または５）。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 コントロールまたは抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体を注射したマウスの血清から収集したＥＶのｍｉＲ－１９２レベルをＲＴ－ｑＰＣＲで評価した結果である（ｎ＝４または５）。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 骨髄由来マクロファージにコントロールまたはｍｉＲ－１９２模倣ＲＮＡをトランスフェクトし、３６時間後、ＬＰＳ、Ｒ８４８、ＣＬ０９７、およびポリＩ：Ｃで細胞を刺激した。その後、Ｉｌ６、Ｃｃｌ２、およびＴｎｆａ遺伝子の発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定した結果である（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 ＲＡＷ２６４．７細胞をコントロールまたはｍｉＲ－１９２模倣ＲＮＡでトランスフェクトし、その後ＬＰＳで刺激した後、各遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した結果である（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 ＲＡＷ２６４．７細胞およびヒトＣＤ１４＋単球由来マクロファージをコントロールまたはｍｉＲ－１９２模倣ＲＮＡでトランスフェクトした後、ＩＬ－６タンパク質レベルをＥＬＩＳＡで評価した結果である（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 図１１Ａは、コントロールまたはｍｉＲ－１９２でトランスフェクトしたＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清０．７５μＬ（ｘ１）または１５０μＬ（ｘ２）（ｘ１：１ｘ１０⁹粒子、またはｘ２；２ｘ１０⁹粒子）から回収したコントロールまたはｍｉＲ－１９２ ＥＶを用いて、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１－マクロファージを処理した後、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１０１ｃ、Ｉｌ６、およびＩｌ１ｂの発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した結果である。図１１Ｂは、ＩＬ－６産生をＥＬＩＳＡで測定した結果である。 コントロールおよびｍｉＲ－１９２ ＥＶを、ＬＰＳを腹腔内注射した若齢マウスに静脈内投与し、血清ＩＬ－６およびＴＮＦ－αのタンパク質レベルをＥＬＩＳＡで評価した結果である（ｎ＝６）。 コントロールおよびｍｉＲ－１９２ ＥＶを、ＬＰＳを腹腔内注射した若齢及び老齢マウスに静脈内投与し、血清ＩＬ－６およびＣＸＣＬ１０のタンパク質レベルをＥＬＩＳＡで評価した結果である（ｎ＝６）。 若齢および老齢マウスの鼻腔内にＷＶＰを接種し、血清中のＩＬ－６およびＣＸＣＬ１０タンパク質レベルをＥＬＩＳＡで評価した結果を示す（ｎ＝９）。データは平均±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。 若齢または老齢のマウスから回収されたＥＶ（１、３または６ｘ１０⁹粒子）でＷＶＰで刺激した脾細胞を処理した後、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－αタンパク質レベルの発現をＥＬＩＳＡで評価した結果を示す（ｎ＝４）。データは平均±ＳＥＭを表す（ｎ≧３、＊ｐ＜０．０５）。 コントロールまたはｍｉＲ－１９２ ＥＶを若齢および老齢マウスに静脈注射し、１４時間後、ＷＶＰを鼻腔内投与した。ワクチン接種６０時間後の肺におけるサイトカイン、ケモカイン、およびｍｉＲＮＡの発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した結果である（ｎ＝５）。データは平均±ＳＥＭを表す（ｎ≧３、＊ｐ＜０．０５）。 ワクチン接種の３０時間後に肺から分離されたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１－骨髄集団におけるｍｉＲ－１９２のレベルをＲＴ－ｑＰＣＲで評価した結果である（ｎ＝４）。データは平均±ＳＥＭを表します（ｎ≧３、＊ｐ＜０．０５）。 他のｍｉＲＮＡのＥＶをＷＶＰ接種の１８時間前に老齢マウスに投与し、ＷＶＰ接種の４０時間後に血清ＩＬ－６レベルをＥＬＩＳＡで測定した結果である（ｎ＝５）。データは平均±ＳＥＭである。 若齢および老齢のマウスに、対照のｍｉＲＮＡ ＥＶまたはｍｉＲ－１９２ ＥＶを静脈内投与し、投与の２４時間後、マウスにＬＰＳを腹腔内注射した。ＬＰＳ注射の４時間後に腹腔洗浄液から細胞を収集し、測定を行った。Ａ図は、腹腔洗浄液の総細胞数を、Ｂ図は、マクロファージと好中球の数を、Ｃ図は腹腔洗浄液中のＩＬ－６濃度を示している。 ＷＶＰを若齢および老齢のＷＴおよびＩＬ－６ ＫＯマウスに２回鼻腔内投与し、１４日後、血清中の抗原特異的総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃレベルを評価した結果である。（ｎ＝１０）。データは平均±ＳＥＭを表す（ｎ≧３、＊ｐ＜０．０５）。 若齢および老齢のＷＴおよびＩＬ－６ ＫＯマウスのウイルス感染による生存率を比較した結果である。 ＥＶによる治療およびＷＶＰによるワクチン接種のスケジュールを示した図である。 若齢および老齢マウスのＷＶＰによるワクチン接種の有効性に対するｍｉＲ－１９２ ＥＶの改善効果を確認した結果である。生存率を示している。非ワクチン接種（模擬） ｖｓ コントロールＥＶ処理老齢者グループ（Ｃｏｎ ＥＶ）、ｐ＞０．０１（ログランク検定）。模擬 ｖｓ ｍｉＲ－１９２ＥＶ処理老齢者グループ（ｍｉＲ－１９２ ＥＶ）、ｐ＜０．０１（ログランク検定）（ｎ＝１０－１２） 若齢および老齢マウスのＷＶＰによるワクチン接種の有効性に対するｍｉＲ－１９２ ＥＶの改善効果を確認した結果である。経時的な体重変化を示している。 若齢マウスを用いたｍｉＲ－１９２ ＥＶの有無におけるＷＶＰのワクチン接種の効果を確認した結果である。 若齢および老齢のマウスでの、ＷＶＰによるＴｈ１およびＴｈ２応答を評価した結果である。 ＷＶＰによるワクチン接種の１日前に、コントロールおよびｍｉＲ－１９２ ＥＶを若齢および老齢マウスに注射し、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２を測定した結果である（ｎ＝６－８）。

以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明するが、本発明は以下に記載の態様に限定されるものではない。なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。また、本発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書中に引用されそして本明細書の一部を構成するものである。

本明細書において、数値範囲を示す「Ａ～Ｂ」の記載は、端点であるＡおよびＢを含む数値範囲を意味する。また、「ＡないしＢ」についても同様である。また本明細書において、「約」とは、±１０％を許容する意味で用いる。
１．ワクチン組成物
本発明の一つの態様は、ワクチン組成物である。以下、本発明のワクチン組成物について説明する。

本発明のワクチン組成物の投与対象は、哺乳動物、鳥類が挙げられ、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒト、より好ましくはヒト老齢者である。具体的な実施態様において、対象は、霊長類(例えば、サル、チンパンジー、及びヒト)および非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)を含む哺乳動物である。別の実施態様において、対象は非ヒト動物である。ある実施態様において、対象は家畜又はペットである。また別の実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、対象はヒト老齢者である。本明細書においては、「対象」又は「患者」という用語は、前後の文脈から一方のみを示すと明確でない限り、互換的に使用される。

本発明のワクチン組成物をヒトに投与する場合は、老齢者に投与するのが好ましい。老齢者とは、例えば、５５歳以上、６０歳以上、６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上、または８０歳以上を言う。本発明のワクチン組成物が投与される老齢者の年齢は、対象において治療または予防する疾患および組成物に含まれる抗原により適宜選択されるが、例えば、季節性インフルエンザやコロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）の場合は、好ましくは６０歳以上、より好ましくは６５歳以上である。

本発明において「抗原」とは、免疫系によって認識され、適応免疫応答の一部としての抗体または抗原特異的なＴ細胞の形成によって、抗原特異的な免疫応答を誘起し得る物質を意味する。本発明のおいて用いられる「抗原」は、例えば、１種または複数のウイルス（不活化、弱毒化、または変性生ウイルス）、細菌、寄生虫、ヌクレオチド（これに限定されないが、核酸を基にした抗原、例えばＤＮＡワクチンを含む）、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含む）、組織、多糖、炭水化物、脂肪酸、タイコ酸、ペプチドグリカン、脂質、または糖脂質をはじめとする、対象において所望の免疫応答を生じることが可能な様々な物質のいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。

本発明において用いられる「抗原」の一つの態様は、対象に感染して疾患を引き起こす病原体由来の物質である。病原体とは、哺乳動物（好ましくはヒト）に感染した場合、哺乳動物に病気を引き起こす原因となる生物をいい、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生生物を挙げることができる。本発明のワクチン組成物において、抗原は、例えば、対象において疾患を誘発しない生ウイルス株、変性生ウイルス株、弱毒化ウイルス株、および不活化または死滅したウイルス株を挙げることができ、これらのウイルス株は、当該技術分野で公知の方法により調製できる。さらには、例えば、病原体から精製された天然の産生物、または遺伝子組換等の手法により人為的に作製されたタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、具体的には、完全ウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ビリオン構成粒子、ウイルス非構造タンパク質を挙げることができる。本発明において用いることができる抗原は、これらの組合せの形態も含む。

前記病原体ウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス（トリインフルエンザ、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、ヒトインフルエンザウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、肝炎ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス等）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ウシパピローマウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－ＩＩ、ＣＭＶ、又は、ＶＺＶ）、ライノウイルス、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス等）、エンテロウイルス、ポリオーマウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、水痘ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、アルファウイルス（例えば、チクングニアウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス等）、ブタ流行性下痢、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、および口蹄疫ウイルスを挙げることができるが、これらに限定されない

前記病原体細菌としては、例えば、緑膿菌、ペスト菌、ジフテリア菌、百日咳菌、エルシニア菌、サルモネラ菌、赤痢菌、エアロモナスヒドロフィラ菌、せっそう病原因菌、仮性結核菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・ハーベイ菌、クラミジア菌、破傷風菌、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、または髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）を挙げることができるが、これらに限定されない。

その他の前記病原体としては、哺乳動物に対して疾患を引き起こし、ワクチン療法の対象となるものであれば特に限定されないが、例えば病原体寄生虫としてはマラリア原虫を挙げることができる。

本発明のワクチン組成物に含まれる抗原は、感染能が低減された（弱毒化抗原）または感染能を喪失させた（不活化抗原）ものが望ましい。不活化抗原としては、例えば、物理的（例えば、放射線照射、加熱処理、超音波処置）、化学的（例えば、ホルマリン、水銀、アルコール、塩素、βプロプリオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）での処理）等の操作により不活化されたものが挙げられるがそれらに限定されない。

本発明のワクチン組成物において、抗原はまた、腫瘍に対するＴ細胞応答を選択的に引き出す腫瘍抗原であり得る。変異が原因で異常構造を有する、腫瘍細胞において生成された任意のタンパク質は、腫瘍抗原として作用し得る。そのような異常タンパク質は、関連する遺伝子の変異によって生成される。異常タンパク質の生成をもたらす癌原遺伝子および腫瘍抑制因子の変異は、腫瘍の原因であり、そのような異常タンパク質は腫瘍特異的抗原という。腫瘍特異的抗原の例としては、ｒａｓおよびｐ５３遺伝子の異常生成物を挙げることができる。例えば、αフェトプロテイン（胚細胞性腫瘍、肝細胞癌腫）、癌胎児性抗原（腸がん、肺がん、乳がん）、ＣＡ－１２５（卵巣がん）、ＭＵＣ－１（乳がん、上皮性腫瘍抗原（乳がん）、およびメラノーマ関連抗原（悪性メラノーマ）を挙げることができる。異常タンパク質はまた腫瘍ウイルス、例えば、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）およびヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）に感染した細胞によっても生成される。これらのウイルスに感染した細胞は、転写される潜在型ウイルス性ＤＮＡを含有し、そして得られたタンパク質は免疫応答を生じる。タンパク質に加えて、細胞表面糖脂質および糖タンパク質のような他の物質もまた、腫瘍細胞において異常構造を有する場合があり、したがって免疫系の標的となり得え、腫瘍抗原となり得る。

本発明のワクチン組成物は、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ－１９２を含むことを特徴とする。マイクロＲＮＡは、約７０ヌクレオチドの前駆体として転写され、その後、ダイサー（Dicer）酵素により切断され、約２２ヌクレオチドのＲＮＡ産物となる。成熟配列は、前駆体の５‘アームに由来し、相補的な標的ｍＲＮＡの発現制御を担い、様々な役割を果たすと考えられている。ｍｉＲ－１９２は、ヒト腫瘍抑制因子であるｐ５３の正の調節因子であると考えられており、ヒトの一部のがんにおいて過剰発現が報告されている（文献：Kim T et al., J. Exp. Med. 2011, 208: 875-883）。また、ｍｉＲ－１９２は腎臓において発現することが報告されている（文献：Baker MA et al., Hypertension 2019, 73: 399-406）。また、ｍｉＲ－１９２がＺＥＢ１およびＺＥＢ２の発現を抑制することが示されている（Putta et al., J Am Soc Nephrol 23, 458-469 2012）。ＺＥＢ１／２タンパク質は、ＩＬ－６などの炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することが報告されている（Katsura et al., 2017，Mol Oncol 11, 1241-1262）。しかしながら、ｍｉＲ－１９２が老齢に関連する免疫制御に関連しているとの報告はなく、本発明者らにより初めて見いだされたことである。

成熟したヒトｍｉＲ－１９２（has-miR-192-5p）は、CUGACCUAUGAAUUGACAGCC（配列番号１）の配列を有し、miRbase Accession Number: MIMAT0000222として登録されている。また、stem loopを含むｍｉＲ－１９２は、Homo sapiens microRNA 192 (MIR192)としてGenBank Accession number：NR_029578 で登録されており、以下の配列ＤＮＡ配列（配列番号２）：
gccgagaccg agtgcacagg gctctgacct atgaattgac agccagtgct ctcgtctccc
ctctggctgc caattccata ggtcacaggt atgttcgcct caatgccagc
を有する。成熟化したｍｉＲ－１９２の配列は、ヒト(Homo sapiens)、マウス(Mus musculus)、ラット（Rattus norvegicus）およびイヌ（Canis familiaris）で同一であると報告されている。

本発明のワクチン組成物に含まれるｍｉＲ－１９２は、安定な状態で維持される限り、いずれの形態で含まれていてもよい。例えば、ワクチンナノキャリアに含まれたまたは結合した状態で組成物中に含まれていてもよく、または、細胞外小胞に含まれた状態にて組成物中に含まれていてもよいが、好ましくは、細胞外小胞に含まれた状態にて組成物中に含まれる。

ワクチンナノキャリアとしては、例えば、ＷＯ２００９／０５１８３７やＷＯ２０１１／１５０２６４に記載のナノキャリアを挙げることができる。ｍｉＲ－１９２をワクチンナノキャリアに含ませるまたは結合させる方法は、これらの文献や公知の技術を参照して行うことができる。

ｍｉＲ－１９２を含む細胞外小胞は、公知の方法を用いて調製することができる、例えば、任意の細胞から公知の方法を用いて調製した細胞外小胞と合成したｍｉＲ－１９２を混合することにより調製することもできる。また、より簡単には、例えば、ｍｉＲ－１９２を発現する培養細胞、またはｍｉＲ－１９２をトランスフェクトして発現するようにした培養細胞を培養し、培養上清からｍｉＲ－１９２を含む細胞外小胞を調製することもできる。好ましくは、本明細書に記載のワクチンの製造において記載の方法を用いて調製できる。

本発明のワクチン組成物中に含まれるｍｉＲ－１９２の数は、ｍｉＲ－１９２を含まない場合に比べ、抗原に対する免疫応答が改善される限り特に制限がない。例えば、マウスに対するワクチン組成物を例に記載すると、抗原としてインフルエンザウイルスを用いる場合は、好ましい態様としては、１８μｇのインフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含むインフルエンザワクチンに対し、ｍｉＲ－１９２を含む細胞外小胞を少なくとも０．５ｘ１０¹⁰個以上、好ましくは１ｘ１０¹⁰個以上、より好ましくは２ｘ１０¹⁰個以上を含む組成物を挙げることができる。また、細胞外小胞におけるｍｉＲ－１９２の数としては、１ｘ１０¹⁰個の細胞外小胞に対し、少なくとも２万個以上、好ましくは３万個以上、より好ましくは５万個以上、さらに好ましくは１０万個以上のｍｉＲ－１９２が存在すれば十分な効果を発揮できる。

本発明のワクチン組成物は、さらに免疫賦活剤／アジュバントを含んでもよい。免疫賦活化剤としては、沈降性アジュバントとしてアルミニウム塩（水酸化アルミニウムゲル等）、油性アジュバントとしてスクアレン、免疫原性があるグラム陰性菌細胞壁外膜の構成成分であるリポ多糖ＬＰＳの改変体であるＭＰＬがある。また、ＣｐＧやＰｏｌｙ Ｉ：Ｃなどに由来する核酸、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を活性化するバクテリア構成成分の改変体や免疫系を刺激するサイトカイン類の改変体などを挙げることができる。さらに、ポリγ－グルタミン酸等のポリマー系アジュバント、キトサン及びイヌリン等の多糖類、カチオン性脂質など、多くの天然または合成化合物が免疫賦活剤として報告されている。本発明ではこれらの免疫賦活剤を任意に用いることができる。

例えば、本発明では、特定のグラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド又はその誘導体若しくは塩を用いることができる。リポポリサッカライド（以下、ＬＰＳと記載することがある）は、大腸菌、サルモネラ菌、百日咳菌等のグラム陰性細菌細胞壁のペプチドグリカンを囲む外膜に存在している脂質および糖からなる複合化合物であり、Ｏ抗原及びエンドトキシンの活性成分として知られている。ＬＰＳの基本構造は、特異な脂質を有するリピドＡ、それに共有結合したＲコアと呼ばれるオリゴ糖、さらにＯ特異多糖の３成分よりなっている。Ｏ特異多糖の構造は、構成成分の中で最も多様であり、菌種に特異的であって、いわゆるＯ抗原としての活性を示す。一般に数種の単糖からなるオリゴ糖の繰返し構造を特徴とするが、同一単糖からなるもの、または繰返し構造でないものも知られている。これらは、多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、これらの菌由来の抽出物又はその改変体をそのまま用いることも可能である。

本発明のワクチン組成物において、抗原は有効量含有されていればよいが、例えば、本発明のワクチン組成物中、１回投与量あたり０．０１～１００００μｇの範囲で含有されていることが好ましい。０．０１μｇ未満であると、感染症や癌の予防又は治療剤としての機能が不充分となることがあり、１００００μｇを超えると、安全性に関して問題となることがある。抗原含有量のより好ましい下限は０．１μｇ、より好ましい上限は５０００μｇである。本明細書にいう「抗原の有効量」は、特記する場合を除き、ワクチン組成物中の抗原に含まれる抗原タンパク質の質量のことである。したがって、抗原が、ウイルス等生体由来物質である場合は、その抗原に含まれる全タンパク質の質量を意味する。

より具体的には、免疫応答を誘導するのに用いられる抗原の量は、用いられる抗原、対象、および所望の応答レベルに応じてかなり変動し、当業者により決定され得る。変性生ウイルスまたは弱毒化ウイルスを含むワクチン組成物の場合、抗原の治療有効量は、一般に約１０²組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）₅₀～約１０¹⁰ＴＣＩＤ₅₀の範囲内である。多くのそのようなウイルスでは、治療有効用量は、一般に、約１０²ＴＣＩＤ₅₀～約１０⁸ＴＣＩＤ₅₀である。

不活化ウイルスを含むワクチン組成物の場合、抗原の治療有効量は、一般に、少なくとも約１００相対単位／用量であり、多くの場合、約１，０００～約４，５００相対単位／用量の範囲内である。不活化ウイルスを含むワクチン中の抗原の治療有効量はまた、１ｍＬあたりの相対効力（ＲＰ）に関して測定することができる。治療有効量は、多くの場合、約０．１～約５０ＲＰ／ｍＬの範囲内である。

ワクチン組成物中で投与される細菌抗原についての細胞数は、約１×１０⁶～約５×１０¹⁰コロニー形成単位（ＣＦＵ）／用量の範囲内である。

ワクチン組成物の剤形は、任意の形態を取り得、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態であってもよい。

ワクチン組成物は、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。担体としては、ワクチン製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができる。具体的には、担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）等が、更に適宜配合されてもよい。

ワクチン組成物の投与経路は、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。ワクチン組成物の投与方法は、例えば、シリンジ、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、又はスプレーによって投与する方法であってもよい。

本発明のワクチン組成物は、例えば、特定のワクチン接種計画の一部として、必要に応じ、複数用量で対象に投与される。例えば、組成物複数用量を、対象に、１日に約１回、２日毎に１回、３日毎に１回、４日毎に１回、５日毎に１回、６日毎に１回、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１月に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、４カ月毎に１回の頻度で複数回、またはより少ない頻度で、ワクチン接種計画に基づいて投与することができる。

抗原としてインフルエンザウイルスを含む場合を以下に記載するが、本発明のワクチン組成物および本発明のワクチンの製造方法は、インフルエンザウイルスのワクチンに限定されるものではない。

インフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、Ｂ及びＣ型に分けられる。インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシド又は核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。また、インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。なお、世界中で大流行するインフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスによるものであり、このＡ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種、ＮＡでは９種の亜型に区別されている。

本発明においては、上記病原体由来抗原としては、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス由来抗原が好適に用いられる。なお、上述したＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの亜型としては特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。

本発明において、インフルエンザウイルス由来抗原としては、上記インフルエンザウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、精製ウイルス粒子を脂質エンベロープが可溶化されるように有機溶媒／界面活性剤若しくは他の試薬で分解されたサブビリオン、又は、ＨＡ及びＮＡを始めとするウイルスサブユニットでもよく、ウイルス全粒子でもよい。免疫原性の観点から、ＨＡ又はウイルス全粒子が好ましい。上記ウイルス全粒子は、ホルマリン等により不活化されたものがより好ましい。上記インフルエンザウイルス抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物またはインフルエンザの患者から単離されたウイルス株をニワトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製する方法が挙げられる。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウイルス由来の抗原を用いてもよい。

２．ワクチンの製造方法
本発明の別の一つの態様は、ワクチンを製造するための方法である。以下、本発明のワクチン製造方法について説明する。

本発明のワクチンの製造方法は、以下の工程：
（１）ｍｉＲ－１９２を発現する（または、ｍｉＲ－１９２とトランスフェクトして発現させた）動物培養細胞を培養する工程、
（２）前記動物培養細胞にウイルスを接種して感染させて細胞を培養することにより、細胞においてウイルスを複製する工程、および
（３）ウイルスを、ｍｉＲ－１９２とともに単離してウイルス調製物を製造する工程、
を含むことを特徴とする。本発明のワクチンの製造においては、ｍｉＲ－１９２を発現する動物培養細胞を用いることにより、ウイルスをｍｉＲ－１９２とともに単離し、ｍｉＲ－１９２を含むウイルス調製物を製造することができる。

本発明のワクチンの製造において用いる動物培養細胞は、ｍｉＲ－１９２を発現する。用いる動物培養細胞自身がｍｉＲ－１９２を発現する場合はそのまま本発明の方法において用いることができるが、ｍｉＲ－１９２をさらに発現させたい場合は、常法に従い、ｍｉＲ－１９２を細胞にトランスフェクトして発現を増幅しても良い。用いる動物培養細胞自身がｍｉＲ－１９２を発現しないまたは発現量が不十分である場合は、常法に従い、ｍｉＲ－１９２を細胞にトランスフェクトして発現させることができる。

本発明のワクチンの製造において用いる動物培養細胞はウイルスの複製およびｍｉＲ－１９２の発現が可能であれば特に制限なく用いることができる。培養細胞は一般に、哺乳動物が起源の細胞株である。適当な哺乳動物起源の細胞には、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）、およびイヌの細胞が含まれるがこれらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞等の様々な細胞種が使用されてよい。適当なハムスターの細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣと呼ばれる細胞株である。適当なサルの細胞は、例えばアフリカミドリザルの細胞、例えばＶｅｒｏ細胞株のような腎細胞である。適当なイヌの細胞は、例えばＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞である。そのため、適当な細胞株には、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ‐５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ‐３８等が含まれるがこれらに限定されない。インフルエンザウイルスの増殖に使用される好ましい哺乳動物の細胞株は、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ細胞、またはヒト胎児網膜芽細胞由来のＰＥＲ．Ｃ６細胞を挙げることができる。これらの細胞株は広く入手可能であり、例えば、ＡＴＣＣコレクションまたはＥＣＡＣＣから入手できる。例えば、ＡＴＣＣはＣＣＬ－８１、ＣＣＬ－８１．２、ＣＲＬ－１５８６、およびＣＲＬ－１５８７のカタログ番号で各種のＶｅｒｏ細胞を提供しており、ＣＣＬ－３４のカタログ番号でＭＤＣＫ細胞を提供している。ＰＥＲ．Ｃ６細胞は、９６０２２９４０のデポジット番号でＥＣＡＣＣから入手可能である。

哺乳動物の細胞株でウイルスが増殖された場合、ワクチン組成物は卵タンパク質（例えば、卵白アルブミンおよびオボムコイド）や、ニワトリＤＮＡを含まなくなるため、アレルゲン性が低下するので好ましい。

なお、インフルエンザワクチンの製造においては、主としては鶏卵でウイルスを増やしている。しかし、ニワトリはｍｉＲ－１９２が保存されておらずゲノム上に存在しないため、従来の鶏卵でウイルスを増やし作成したインフルエンザワクチンはｍｉＲ－１９２を全く含まない。

ＭＤＣＫ細胞のような細胞株での増殖については、浮遊状態または接着培養液でウイルスの増殖を行うことができる。浮遊培養に適したＭＤＣＫ細胞株の１つは、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９としてデポジットされている）である。あるいは、マイクロキャリア培養を使用することも可能である。米国特許第６，８２５，０３６号、米国特許第８，８４６，９３２号、米国特許出願公開公報第２０１３／０１８３７４１号、および国際公開ＷＯ２０１７／０７２７４４は、無血清浮遊培養およびワクチン生産のための方法およびＭＤＣＫ細胞の培養を記載している。これらの記載は引用することにより本明細書の一部である。

以下、本発明のワクチンの製造方法を、インフルエンザウイルスを例に記載するが、本発明の製造方法は、インフルエンザウイルスのワクチンの製造方法に限定されるものではない。

インフルエンザウイルスの複製を行う場合、細胞株は、好ましくは無血清培養用培地および／または無タンパク質培地で増殖させる。無血清培地とは、ヒトまたは動物起源の血清由来の添加物を含まない無血清培地を意味する。無タンパク質培地とは、タンパク質、増殖因子、その他のタンパク質添加物および非血清タンパク質が存在しない状態で細胞の増殖が可能な培地を言うが、トリプシンまたはウイルスの増殖に必要なその他のプロテアーゼのようなタンパク質を場合により含むことができる培地を意味する。

本発明の製造方法における細胞の培養は、当業者に公知の通常の方法（特に、細胞培養におけるインフルエンザウイルス複製のためにすでに公知な方法）を用いて行うことができる。細胞の培養は、バッチプロセスおよび灌流系（例えば、当業者に公知の細胞貯留系（例えば、遠心分離、濾過、スピンフィルターなど）を用いる攪拌容器発酵槽において）のいずれで行ってもよい。

培養された細胞の感染は、好ましくは、バッチプロセスにおける細胞が約８～２５×１０⁵細胞／ｍｌ、または灌流系において約５～２０×１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度に達したときに行われる。接着性増殖細胞が用いられる場合、感染のために最適な細胞密度は用いる特定の細胞株に依存する。

培養細胞中でウイルスを増殖させる方法は、通常、（ｉ）培養する株を培養細胞に接種する手順と、（ii）ウイルス増殖のために感染細胞を所望の時間、例えば、接種後２４～１６８時間培養する手順（ウイルス増殖は、例えば、ウイルス力価または抗原の発現によって判定される。）と、（iii）増殖したウイルスを回収する手順とが含まれる。インフルエンザウイルスでの細胞の感染は、培養細胞に、１：５００～１：１、好ましくは１：１００～１：５、より好ましくは１：５０～１：１０の細胞比でウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ₅₀で測定）が接種される。ウイルスは、通常、細胞の浮遊液に添加されるまたは細胞の単層に加えられ、２５℃～４０℃で、好ましくは２８℃～３７℃で、少なくとも６０分間、通常は３００分未満、好ましくは９０～２４０分間、ウイルスを細胞上に吸着させる。増殖後の回収される培養液上清のウイルス含有量を増やすため、凍結融解または酵素作用のいずれかで感染細胞培養（例えば、単層）を除去してもよい。本発明の方法においては、ｍｉＲ－１９２を含む細胞外小胞は、ウイルスとともに培養液上清として回収できる。プロテアーゼ（一般にトリプシン）は、ウイルス放出が起こるように通常細胞培養の間に、任意の適切な段階において添加される。

本発明の方法における好ましい実施態様において、複製されたインフルエンザウイルスの回収または単離は、感染から２～１０日後、好ましくは３～７日後に行われる。ウイルスの単離のために、例えば、細胞または細胞残渣を、当業者に公知の方法の手段（例えば、分離器またはフィルターにより）により培養培地から分離する。これに続いて、培養培地中に存在するインフルエンザウイルスの濃縮を、当業者に公知の方法（例えば、勾配遠心分離、濾過、沈殿などのような）により行われる。

本発明の製造方法においては、インフルエンザウイルスとともに、ｍｉＲ－１９２を単離することを特徴とする。ｍｉＲ－１９２は、培養培地中に存在、好ましくは細胞外小胞の含まれた状態で培養液中に存在するので、ウイルスとともに回収または単離できる。インフルエンザウイルス粒子の直径は約１００ｎｍであり、一方、細胞外小胞の直径も約１００ｎｍであるので、ウイルス粒子とともに細胞外小胞を回収または単離できる。例えば、ウイルス粒子の直径および細胞外小胞（ｍｉＲ－１９２を含有）の直径に基づく分離方法により、具体的には、約５０～約１５０ｎｍ、好ましくは約６０～約１４０ｎｍ、より好ましくは約７０～約１３０ｎｍ、さらに好ましくは約８０～約１２０ｎｍ、最も好ましくは約９０～約１１０ｎｍの粒子径（好ましくは直径）のウイルスと細胞外小胞を回収または単離できる分離方法により、ウイルスおよびｍｉＲ－１９２を含む細胞外小胞の両者を含むウイルス調製物を容易に製造できる。上記分離方法は、当業者に公知の方法を必要に応じ適宜変更して用いることにより達成できる。

ワクチンとして得られたインフルエンザウイルスの免疫原性または効率は、当業者に公知の方法（例えば、曝露実験における保護分与の手段により、またはウイルス中和抗体の抗体力価として）により決定され得る。

本発明の製造方法においては、製造したウイルス調製物をさらに弱毒化または不活性化する工程を含むことができる。ウイルスの弱毒化または不活性化は、当該技術分野で周知の方法を利用して行うことができる。例えば、これに限定されないが、物理的（例えば、放射線照射、加熱処理、超音波処理）、化学的（例えば、ホルマリン、水銀、アルコール、塩素、ＢＰＬ、ＢＥＩでの処理）等の操作により行うことができる。

本発明の方法においてはまた、ウイルス調製物を弱毒化または不活性化する工程を含む代わりに、疾患を誘発しない生ウイルス株、変性生ウイルス株、および弱毒化ウイルス株を用いて、細胞を培養しウイルスを複製することもできる。

本発明の方法により製造されたワクチンは、本発明のワクチン組成物において記載した組成物として調製することができる。

以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．材料および方法
（１）マウス
若齢（２－３月齢）雄Ｃ５７ＢＬ／６ＪｒＳｌｃマウスは日本ＳＬＣ、Ｉｎｃ．から購入した。ＩＬ－６欠損マウスおよびＩＬ－６受容体α－ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＩＬ６Ｒｆｌ／ｆｌ）マウスはジャクソン研究所から入手した。ＩＬ６Ｒαが遍在的に欠損しているマウスは、ＩＬ６Ｒｆｌ／ｆｌマウスとＣＡＧプロモーター駆動のＣｒｅトランスジーンを発現しているマウスを交配することで作成した。それらのマウスは、老齢したマウスとして利用するために１４～１８ヶ月間飼育した。すべての実験は、熊本大学の施設内動物委員会によって承認され、ガイドラインに従って実行した。

（2）細胞株、ウイルス、ワクチン
マウスマクロファージ系統ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＡＴＣＣから入手した。マイコプラズマ試験は、e-Myco Mycoplasma PCR Detection kit（Minerva Biolabs GmbH）を使用して行った。マウス適応インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）Ｈ１Ｎ１株プエルトリコ／３４／８（ＰＲ８）は、Kouwaki et al., 2017, Sci Rep 7, 11905の記載に従い増殖し、ＭＤＣＫ細胞を使用してウイルス力価を評価しました。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９［Ｈ１Ｎ１］由来のホルマリン不活化インフルエンザ全ワクチン（ＷＶＰ）は、一般社団法人・化学及び血清療法研究所（熊本）から提供された。ヒト単球は健康な成人から分離した。

（3）ワクチン接種とウイルス接種
接種は、麻酔下で、マウスに鼻腔内に１８μｇ（／３５μＬ）のＷＶＰを接種（ワクチン接種）するか、または、致死量に相当する１ｘ１０⁶ ＰＦＵのＩＡＶに感染させた（ウイルス接種）。ワクチン接種は、ＷＶＰを１週間に１回の頻度で２回接種した。ウイルス感染させた後、１７日間、病気、体重減少、死亡の兆候について毎日マウスを監視した。一部の実験条件では、生体内マクロファージを枯渇させるために、マウスに２００μｇのコントロールＩｇＧ 抗体（ミリポア）、または抗Ｆ４／８０（ＣＩ：Ａ３－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）抗体と抗ＣＳＦ１Ｒ（ＡＦＳ９８、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）抗体を、鼻腔内接種の１日前および３日または６日後に、腹腔内注射した。インビボにおける炎症性サイトカイン活性を遮断するために、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、およびＴＮＦ－α（ＢｉｏＸCｅｌｌ）に特異的な抗体２００μｇを、分析前に２日間間隔で２回マウスに注射した。

（4）マクロファージの分化、トランスフェクション、および刺激
マウスＢＭＭとヒト単球由来マクロファージは、Ｍ－ＣＳＦ（５０ ｎｇ／ｍｌ）で４～８日間刺激することにより、それぞれ骨髄細胞とＣＤ１４＋単球から生成した。ＣＤ１４＋単球は、健康なドナーの血液から精製した分析はインフォームドコンセントを得て実施した。１００ ｐｍｏｌのｍｉＲ－１９２－５ｐ模倣ＲＮＡ、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１０１ｃの阻害剤、またはネガティブコントロールｍｉＲＮＡ模倣（すべてThermo Fisher Scientificから購入。）を使用し、ＴＲＡＮｓｉｔトランスフェクション試薬（Mirus Bio）を用い、メーカーの指示に従って、ＢＭＭ、ＲＡＷ２６４．７および単球由来マクロファージにトランスフェクトした。トランスフェクション効率は通常８５～９０％であった。トランスフェクションの２４～３６時間後、細胞を、ＷＶＰ、ＬＰＳ、Ｒ８４８（どちらもSigma-Aldrich製）、またはＣＬ０９７（Invivogen）、およびｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（GE Healthcare）で刺激した。

（5）細胞外小胞（ＥＶ）の単離、分析、ラベリング、および転送
血清由来ＥＶは、製造元の指示に従って、全エキソソーム分離試薬（Thermo Fisher Scientific）を使用し血清から分離した。一方、細胞培養培地由来ＥＶは、エクソソーム分離試薬を使用し、ｍｉＲＮＡを模倣してトランスフェクトしたＲＡＷ２６４．７細胞の４８時間培養上清から分離した。ＥＶをネガティブコントロールのｍｉＲ ｍｉｍｉｃ－またはｍｉＲ－１９２ ｍｉｍｉｃでトランスフェクトした細胞から収集する場合は、すべての実験でＦＣＳフリーの培地を使用した。ＥＶをＥＤＴＡ処理された血漿から分離する場合は、抗ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１抗体でＥＶを捕捉するＰａｎ Ｅｘｏｓｏｍｅ分離キット(Miltenyi Biotec)が利用した。一部の実験では、１００ ｎｇの組換えマウスＩＬ－１β、２００ ｎｇの組換えＩＬ－６、またはＴＮＦ－αをマウスに静脈内注射し、続いて血清ＥＶを分離した。ＥＶのサイズと濃度は、ａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００(Malvern Panalytical)で評価した。各サンプルを１万倍希釈し、５回測定した。データはＮＴＡ３．２ソフトウェアで分析した。単離したＥＶは０．４５μＭフィルターを通過した。単離したＥＶの０．５－１．０ｘ１０¹⁰のＥＶ粒子は、内毒素血症モデルにおけるＬＰＳ腹腔内投与（亜致死量；３μｇ／マウス）またはＷＶＰの鼻腔内投与の１日前に各マウスに静脈内に投与した。ＥＶの形質導入を評価するために、ＥＶに含まれるＲＮＡをメーカーの指示に従ってＳＹＴＯ ＲＮＡＳｌｅｔｃｔ Ｇｒｅｅｎ蛍光細胞染色試薬で標識し、Ｅｘｏｓｏｍｅスピンカラム（Thermo Fisher Scientific）でさらに精製しました。

（６）リアルタイムＰＣＲ
トータルＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬(Thermo Fisher Scientific)とＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（QIGEN）を使用して抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（toyobo）で逆転写した。リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬（Applied Biosystems）とＴａｑＭａｎプローブを備えたＶｉｉＡ７またはＯｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで、またはプライマーを使用してＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Applied Biosystems）で実行した。各遺伝子の発現レベルは、比較２［－ΔΔＣＴ］法を使用してＧａｐｄｈ発現に対して正規化した。ｍｉＲＮＡの発現レベルは、ｍｉＲ－Ｘ ｍｉＲＮＡ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Clontech）を使用して、ｍｉＲＮＡ生成の逆転写反応により評価した。ｍｉＲＮＡレベルはＵ６ ＲＮＡ発現に対して正規化した。ｍｉＲ－１９２コピー数の絶対定量と検量線のプロットは、既知濃度のｍｉＲ １９２ ｍｉｍｉｃの段階希釈を用いた半定量的ＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって行った。この標準曲線と血清１μｌあたりのＥＶ粒子の絶対数に基づいて、調整された容量の血清からのＥＶに含まれるｍｉＲ－１９２のコピー数を計算した。

（７）ＲＮＡディープシーケンスとマイクロアレイ分析
ＲＮＡディープシーケンスとオリゴＤＮＡマイクロアレイ分析は、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）を使用して、各グループのマウスから分離されたプールされた血清由来ＥＶから、およびプールされたｍｉＲＮＡ模倣トランスフェクトＢＭＭからそれぞれ抽出されたトータルＲＮＡに対して行った。Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリは、製造元の指示に従って、ＴｒｕＳｅｑ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキットで調製した。手短に言えば、サイズ選択を行って、トータルＲＮＡからｍｉＲＮＡフラグメントを抽出した。全ＲＮＡをアガロースゲルで泳動し、ｍｉＲＮＡのサイズに対応するバンドを切り取り、すべてのｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含むすべてのより大きなフラグメントをサンプルから除外した。シーケンシングアダプターは、選択したサイズのＲＮＡ分子にライゲーションされる。アダプターが連結されたｍｉＲＮＡフラグメントは、ｃＤＮＡフラグメントに変換される。増幅されたｃＤＮＡ断片をアガロースゲルで再度泳動し、ライゲーションされたアダプターを含むｍｉＲＮＡ断片を含む分子を含むバンドを、その後のシーケンシングのために切り取った。ＲＮＡシーケンスはＨｉＳｅｑ２０００で行った。データは、アクセッション番号ＤＲＡ００９０５４でＤＤＢＪデータベースに登録した。マイクロアレイ分析は、３Ｄ－Ｇｅｎｅマウスオリゴチップ２４ｋ（東レ株式会社）で行い、Ｃｙ５標識ａＲＮＡプールとのハイブリダイゼーションは、サプライヤーのプロトコル（www.3d-gene.com）に従って行った。ハイブリダイゼーション信号は、３Ｄ－Ｇｅｎｅ Ｓｃａｎｎｅｒで評価され、３Ｄ－Ｇｅｎｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（東レ株式会社）によって処理した。各遺伝子の検出された信号は、グローバル正規化法によって正規化した（検出された信号強度の中央値は２５に調整した）。ＩＬ－６遮断ではなく、ｍｉＲ－１９２トランスフェクションの影響を受ける遺伝子発現の差異を分離し、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（Agilent Technologies Inc.）で遺伝子オントロジー分析と経路分析を行った。ｉｃｒｏａｒｒａｙデータは、ＧＥＯアクセッション番号ＧＳＥ１３８７５８で入手できる。遺伝子発現比を示すヒートマップは、低発現レベルの遺伝子を削除し、サンプル間の各中央値を正規化した後に作成した。

（８）ＥＬＩＳＡ
インビトロ実験の細胞培養培地、マウスの血清、腹腔洗浄液、またはＢＡＬＦを、ＥＬＩＳＡアッセイキット（R&D Systems）を使用して、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＣＸＣＬ－１０のレベルについて、メーカーのプロトコルに従って分析した。ワクチン接種したマウスの血清中のＷＶＰ特異的総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ２ｃのレベルは、コーティングバッファー（Thermo Fisher Scientific）でＷＶＰをコーティングしたプレートに血清を加えることで評価し、特定の抗体は、ＨＲＰ標識抗アイソタイプ特異的抗体を使用して検出した。

（９）一次免疫細胞の分離とフローサイトメトリー分析
ＤＣのＣＤ１１ｃマイクロビーズ、骨髄細胞のＣＤ１１ｂマイクロビーズ、ＰＭＮ／好中球のＬｙ６Ｇマイクロビーズ、Ｔ細胞のＣＤ４／ＣＤ８マイクロビーズ、およびＢ細胞のＣＤ１９マイクロビーズ（すべてMiltenyi Biotec製）を用い、メーカーの指示に従って、特定の細胞集団を分離した。分離後の各細胞集団の純度は、通常８０～９５％であった。肺浸潤細胞を分析する場合、安楽死の前にＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ＣＤ４５抗体（３μｇ／マウス）を静脈内注射し、血液循環細胞の混入を検出および排除した。肺組織からの細胞は、２．５ ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤと０．１ ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉを用いて３７℃で３０分間酵素消化して調製し、フローサイトメトリーに必要な抗体で染色し、分析した。ＬＰＳによる内毒素血症モデルでは、ＰＢＳで洗浄することにより、腹腔洗浄液から細胞を回収した。Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色のために、細胞懸濁液をＢｒｅｆｅｒｄｉｎ Ａの存在下でＰＭＡ／イオノマイシンで５時間刺激した。次に細胞を固定し、透過処理し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（BD Biosciences）を使用して染色した。免疫蛍光画像およびデータは、それぞれＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（BD Biosciences）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star）を使用して分析した。血清中または培養物中のＩＬ－６、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１ｂ、およびＴＮＦ－ａのレベルを検出するためのＥＬＩＳＡキットは、R&D Systemsから購入した。

（１０）ウエスタンブロット法
ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃでトランスフェクトしたＲＡＷ２６４．７、単離したＥＶ、またはＢＭＭを、溶解バッファー（１％ＮＰ－４０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．４、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１ ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、２５ ｍＭ ｂ－グリセロリン酸、１０ ｍＭ ＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤タブレット（Roche））で溶解した。細胞溶解物を還元条件下で１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、Ｉ－κＢ、ホスホ－ＮＦ－κＢｐ６５、ＮＦ－κＢｐ６５、またはｂ－アクチンに特異的な抗体を用いてウエスタンブロットを行った。

（１１）共焦点分析
ＲＡＷ２６４．７細胞を２４ウェルプレートのカバーガラス上で１日間培養し、ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃでトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＬＰＳで１～３時間刺激した後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、透過処理し、ＰＢＳ中の０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／５％ＦＢＳでブロックした。細胞を抗ＮＦ－ｋＢ ｐ６５抗体で一晩染色した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を二次抗ウサギＩｇ抗体で染色した。染色された細胞は、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｃｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Invitrogen）で覆い、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１２００共焦点顕微鏡（Olympus）で観察した。

（１２）統計分析
多重比較は、一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ事後検定によって実行した。クラスカル・ウォリス検定は、ＡＮＯＶＡのノンパラメトリックな代替法として使用した。２つの実験グループを比較するときは、対応のないスチューデントのｔ検定を使用してデータを分析した。生存率の統計分析は、ログランク（マンテルコックス）検定とグレハンブレスローウィルコクソン検定を実行し、生存率曲線を比較した。これらの分析は、Ｐｒｉｓｍ ７ ｆｏｒ Ｍａｃ ＯＳ Ｘ（Ｖｅｒ．７．０）ソフトウェア（GraphPad Software Inc.）を使用して実行した。

結果
２．細胞外小胞中の加齢に伴うｍｉＲＮＡの検出
若齢（２～３か月）および加齢（１４～１８か月）のマウス由来の血清細胞外小胞（ＥＶ）中のｍｉＲＮＡプロファイルを比較した。トータルＲＮＡは、野生型マウス（ＷＴ）、ＩＬ－６ノックアウトマウス（ＩＬ－６ ＫＯ）、およびＩＬ－６受容体ＫＯマウス（ＩＬ－６Ｒ ＫＯ）のそれぞれの血清ＥＶから抽出し、ハイスループットＲＮＡ－Ｓｅｑ分析にかけた。ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析により、老齢のＷＴマウス血清ＥＶで発現が特異的に増加した１５のｍｉＲＮＡ（mmu-miR-19b-3p、mmu-miR-142a-3p、mmu-miR-21a-5p、mmu-miR-30e-5p、mmu-miR-322-5p、mmu-miR-30a-5p、mmu-miR-181c-5p、mmu-miR-140-3p、mmu-miR-192-5p、mmu-miR-10b-5p、mmu-miR-30b-5p、mmu-miR-126a-5p、mmu-miR-10a-5p、mmu-miR-143-3p、およびmmu-miR-215-5p）が明らかになった。ＲＴ－ｑＰＣＲを実行してＲＮＡ－Ｓｅｑデータを確認し、血清ＥＶ中のｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－３２２、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－２１、およびｍｉＲ－１８１ｃレベルが老齢のＷＴマウスで大幅に増加していることを確認した。結果を図１に示す。これにより、循環しているＥＶ中に加齢に関与する免疫調節ｍｉＲＮＡが存在することが明らかになった。また、ＩＬ－６ ＫＯのマウスでは、若齢および老齢のいずれにおいても、血清ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルの低下が確認された。

次いで、加齢に関与するｍｉＲＮＡがサイトカインの発現を調節するかどうかを確認した。各ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－３２２、およびｍｉＲ－１８１）の模倣ＲＮＡをＲＡＷ２６４．７細胞にトランスフェクトし、ＴＬＲリガンドに応答したサイトカイン発現への影響を確認した。その結果、興味深いことに、図２に示すように、ｍｉＲ－１９２はＩｌ６およびＣｃｌ２ ｍＲＮＡレベルを低下させることが確認された。

この点をさらに明確にするために、マイクロアレイ分析を実施したところ、ｍｉＲ－１９２がいくつかのサイトカインを増加させ、遺伝子オントロジーと経路分析により、ｍｉＲ－１９２が免疫システムプロセスとサイトカインシグナル伝達経路に関連していることが示唆され。遺伝子オントロジー分析の結果を図３Ａに、経路分析の結果を図３Ｂに示す。これらのデータは、ｍｉＲ－１９２が免疫調節ｍｉＲＮＡであることを示唆している。

老齢マウスの血清ＥＶの濃度は、若齢マウスのそれと同等であった（図４Ａ）。ＥＶのサイズは約１００～１５０ ｎｍで、エキソソームの基準を満たしていた。また、若齢マウスと老齢のマウスの間で直径に有意差は見られなかった（図４Ａ）。しかし、ＥＶにおけるｍｉＲ－１９２の絶対コピー数は、老齢マウスで大幅に増加していた（図４Ｃ）。収集したＥＶが、エクソソームマーカーであるＣＤ６３とＨｓｐ７０を発現していることを確認した。また、エキソソームのマーカーである抗ＣＤ９、ＣＤ８１、およびＣＤ６３抗体を使用して血漿からＥＶを収集した場合、老齢マウスのＥＶにおけるｍｉＲ－１９２レベルの増加も観察された（図４Ｄ）。

３．炎症性サイトカインのｍｉＲ－１９２レベルへの影響
炎症性サイトカインは老齢に関連していることがよく知られているため、ｍｉＲ－１９２の発現に対する炎症性サイトカインの影響を確認した。抗ＩＬ－６抗体、抗ＴＮＦ－α抗体、または抗ＩＬ－１β抗体を、血清採取の１および３日前に老齢マウスに注射し、採取した血清ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルを測定した。抗ＩＬ－６抗体の投与は、老齢マウスの血清ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルを低下させたが、抗ＴＮＦ－α抗体や抗ＩＬ－１β抗体は低下させなかった。結果を図５Ａに示す。また、組換えＩＬ－６を若齢マウスに静脈内注射し、２日後に採取した血清ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルを測定した。抗体とは逆に、組換えタンパク質ＩＬ６の投与は、若齢マウスの血清ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルを増加させたが、ＴＮＦ－αやＩＬ－１βは増加させなかった。結果を図５Ｂに示す。

４．若齢および老齢マウスの血清ＩＬ－６レベル
本実施例２で確認されたように、老齢のＩＬ－６ ＫＯマウスでは、正常な若齢のマウスのレベルに匹敵するレベルでｍｉＲ－１９２のレベルが低下した。また、以前に報告されており、図６Ａに示すように老齢マウスの血清ＩＬ－６レベルは若齢のマウスのそれよりも高い。このことは、老齢したＥＶで観察されたｍｉＲ－１９２の増加にＩＬ－６シグナリングが関係していることを示している。ＩＬ－６を静脈内に投与したところ、血清ＩＬ－６レベルが増加し、若齢マウスの血清ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルが増加することが確認された（図６ＢおよびＣ）。一方、老齢マウスでは、ＩＬ－６が連続して高レベルであってもＥＶのｍｉＲ－１９２はさらには増加しなかった（図６Ｃ）。これらのデータは、ＩＬ－６濃度の上昇が血清ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルの増加を引き起こすことを示している。

５．マクロファージのｍｉＲ－１９２への影響
マクロファージは炎症反応の強力なレギュレーターであるため、ｍｉＲ－１９２のＥＶでの増加に対する寄与を評価します。抗コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ）抗体を用いてマクロファージの枯渇を引き起こした。その結果、図７に示されるように、老齢マウスの血清ＥＶのｍｉＲ－１９２のレベルが有意に低下した。このことは、マクロファージがインビトロでｍｉＲ－１９２を含むＥＶｓを産生することを示唆している。

一方、生体内とは異なり、ＩＬ－６だけでは生体外でマクロファージから放出されたＥＶのｍｉＲ－１９２レベルを上げることができなかった。しかし、ＴＬＲ７リガンドであるＲ８４８との共刺激により、ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルが上昇した。ＣＬ０９７またはポリＩ：ＣだけではＥＶのｍｉＲ－１９２レベルを上げることができなかったが、ＬＰＳ刺激はマクロファージから放出されるｍｉＲ－１９２レベルを上げた。これらの観察結果は、宿主細胞から放出されたＤＮＡ／ＲＮＡなどのＰＡＭＰおよび／または損傷関連の分子パターンによるいくつかの種類の刺激が、ＩＬ－６がインビボで血清ＥＶのｍｉＲ－１９２レベルを増加させるために必要であることを示唆している。

６．ＥＶのｍｉＲ－１９２による炎症誘発性サイトカインの発現減衰
ｍｉＲ－１９２はＴＬＲリガンドに反応してサイトカインの発現を抑制する能力がある。そこで、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭｓ）にｍｉＲ－１９２模倣ＲＮＡを３６時間トランスフェクトし、ＬＰＳ、Ｒ８４８、ＣＬ０９７、ポリＩ：ＣなどのＴＬＲリガンドで刺激した。興味深いことに、図８に示されるように、ｍｉＲ－１９２模倣ＲＮＡは、ＬＰＳ、Ｒ８４８、およびＣＬ０９７に応答して、Ｉｌ６およびＣｃｌ２遺伝子の発現を有意に減少させた。ＬＰＳ刺激マクロファージにおけるｍｉＲ－１９２発現によって調節される遺伝子発現プロファイルを解明するマイクロアレイ分析により、いくつかのサイトカインおよびケモカインの発現がｍｉＲ－１９２によって減少することが確認された。これらの結果をＲＴ－ｑＰＣＲによって確認した結果を図９に示す。

抗ＩＬ－６抗体はｍｉＲ－１９２による抑制に影響を与えなかったため、ｍｉＲ－１９２を介したサイトカイン発現の抑制がＩＬ－６発現の低下によって引き起こされた可能性は低いと判断した。一般に、単一のｍｉＲＮＡは複数の遺伝子を標的としている。本実験によるマイクロアレイデータは１００を超える遺伝子の発現レベルがｍｉＲ－１９２によって少なくとも２倍変化することを示した。タイムコース分析では、マウスＲＡＷ２６４．７およびヒトＣＤ１４＋単球由来マクロファージの両方で、Ｒ８４８刺激後に、ｍｉＲ－１９２がＩｌ６とＣｃｌ２遺伝子の発現を減衰させることも確認されたが、Ｔｎｆａ発現への影響はわずかであった。一方、ＣＬ０９７およびＲ８４８刺激に関連するＩＬ－６産生は、ｍｉＲ－１９２によって減少した（図１０）。これらの結果は、ｍｉＲ－１９２１９２がいくつかの炎症性サイトカインとケモカインの発現を抑制することを示している。

７．ＥＶｍｉＲ－１９２の効果の確認
蛍光標識ＲＮＡを含むＥＶで処理されたマクロファージで確認されているように、ＥＶがｍｉＲＮＡをレシピエント細胞に送達することはよく知られている。そこで、ＥＶに囲まれたｍｉＲ－１９２がｍｉＲ－１９２自体と同じ効果を発揮できるかどうかを確認した。ｍｉＲ－１９２（ｍｉＲ－１９２ ＥＶｓ）を含むＥＶは、コントロールまたはｍｉＲ－１９２模倣ＲＮＡをＲＡＷ２６４．７細胞にトランスフェクトし、ＥＶを培養上清から回収した。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１－マクロファージを回収したＥＶで処理し、ＴＬＲ７リガンドであるＲ８４８で刺激した。ｍｉＲ－１９２ ＥＶは、マクロファージの細胞内ｍｉＲ－１９２レベルを有意に増加させたが、ｍｉＲ－１０１ｃ（ネガティブコントロール）などの他のｍｉＲＮＡレベルは増加させなかった。興味深いことに、ｍｉＲ－１９２ ＥＶは、Ｒ８４８刺激後に、Ｉｌ６およびＩｌ１ｂのｍＲＮＡの発現とＩＬ－６タンパク質の産生を減少させた。結果を図１１に示す。

さらに、ＬＰＳ腹腔内注射後の血清ＩＬ－６レベルは、ｍｉＲ－１９２ ＥＶの静脈内注射によって減少することが確認された。結果を図１２に示す。ｍｉＲ－１９２ ＥＶによる血清ＩＬ－６レベルの低下は、ＬＰＳで刺激された老齢マウスでも確認された。結果を図１３に示す。これらのデータは、ＥＶがｍｉＲ－１９２をレシピエント細胞に送達し、それにより、インビトロおよびインビボの両方でＩＬ－６産生を低下させることを示唆している。

８．老齢のＥＶ ｍｉＲ－１９２の効果の確認
老齢のＥＶでｍｉＲ－１９２レベルが増加したので、マクロファージにおけるＩＬ－６発現に対する老齢ＥＶの影響を確認した。ｍｉＲ－１９２およびｍｉＲ－１０１の阻害剤ＲＮＡをＢＭＭにトランスフェクトした。細胞を若齢および老齢の血清から回収したＥＶ（３ｘ１０⁹粒子）で処理し、その後Ｒ８４８で刺激した。Ｉｌ６、Ｃｃｌ２、およびＴｎｆαの発現レベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。その結果、血清から回収した若齢ＥＶは、Ｒ８４８で刺激されたマクロファージのＩｌ６遺伝子の発現に影響を与えなかったが、老齢のＥＶは、Ｉｌ６遺伝子の発現を有意に減少させた。Ｃｃｌ２遺伝子の発現もまた、老齢のＥＶによって減少した。ｍｉＲ－１９２の阻害性ＲＮＡ（ａｎｔｉ－ｍｉＲ－１９２）であるａｎｔａｇｏｍｉｒ－１９２ ＲＮＡをマクロファージにトランスフェクトすることにより、老齢のＥＶで治療する前にｍｉＲ－１９２の機能を抑制し、老齢のＥＶの内因性ｍｉＲ－１９２の特性を評価した。ａｎｔｉ－ｍｉＲ－１９２は老齢のＥＶの影響を打ち消しましたが、コントロールＲＮＡもａｎｔｉ－ｍｉＲ－１０１（ネガティブコントロール）も効果がなかった。これらのデータは、老齢のＥＶに封入されたｍｉＲ－１９２がマクロファージに転送され、それによりレシピエントのマクロファージでのサイトカイン発現を抑制することを示している。

９．老齢のＥＶ ｍｉＲ－１９２の標的
上記で同定されたサイトカインとケモカインは、どのデータベースでもｍｉＲ－１９２による潜在的な標的であると予測されていなかったため、ｍｉＲ－１９２がこれらの遺伝子を間接的に標的とする可能性がある。そこで、ｍｉＲ－１９２がサイトカインとケモカインの転写因子を標的としたかどうかを確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞にコントロールまたはｍｉＲ－１９２模倣ＲＮＡをトランスフェクトし、Ｒ８４８で刺激した。Ｒ８４８による刺激の１時間後、細胞を固定した。全細胞抽出物（ＷＣＥ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけタンパク質を分離した後、各種抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。抗ＮＦ－κＢｐ６５抗体（赤）とＤＡＰＩ（青）で染色し、細胞内局在を共焦点顕微鏡で観察しました。細胞が模倣ｍｉＲ－１９２でトランスフェクトされた場合、Ｒ８４８刺激によって引き起こされるＩκＢの分解およびｐ６５とＩＫＫβのリン酸化の両方が減少した。ＴＢＫ１リン酸化もｍｉＲ－１９２によって減少した。対照的に、ＥＲＫとｐ３８のリン酸化はｍｉＲ－１９２の影響を受けなかった。ＮＦ－κＢの核局在化は、ｍｉＲ－１９２発現によって減少した。

ＮＦ－κＢおよびＴＢＫ１転写因子は、Ｉｌ６、Ｃｃｌ２、およびＩｆｎｂ遺伝子の発現を誘導するため、これらのデータは、ｍｉＲ－１９２が転写因子経路を標的とすることにより、炎症性サイトカインおよびＩ型ＩＦＮの発現を減衰させることを示唆している。以前の研究では、ｍｉＲ－１９２が炎症性サイトカインの発現に必要な上皮細胞および糸球体細胞のＺＥＢ１／２シグナル伝達分子を抑制することが報告されている（Kim et al., 2011, J Exp Med 208, 875-883.; Putta et al., 2012, J Am Soc Nephrol 23, 458-469.）。ＺＥＢ２ノックダウンは、Ｉｌ６ ｍＲＮＡ発現を減少させたが、ｍｉＲ－１９２は、ＲＡＷ２６４．７細胞のＺＥＢ２タンパク質レベルを下げなかった。

１０．ＥＶ ｍｉＲ－１９２の役割：加齢に伴う過炎症状態で負のフィードバック
以下のようにして、ＷＶＰに対する免疫応答に対するｍｉＲ－１９２を含む老齢ＥＶの影響を確認した。最初に、若齢マウスと老齢マウスのＷＶＰ誘発免疫応答を比較した。ＷＶＰは、若齢および老齢のマウスに鼻腔内接種した。血清ＩＬ－６およびＣＸＣＬ１０タンパク質レベルをＥＬＩＳＡで評価した。ＷＶＰ鼻腔内接種は、若齢マウスでＩＬ－６やＣＸＣＬ１０などの炎症性サイトカインの一過性および全身性の増加を引き起こした。一方、老齢者のマウスの血清では、ＣＸＣＬ１０ではなくＩＬ－６のレベルの延長が確認された。結果を図１４に示す。ＷＶＰを接種した老齢マウスのＩＬ－６の全身レベルが高いことと一致して、肺の局所発現レベルは後の時点で老齢マウスでも増加していた。若齢および老齢のいずれのマウスでも同様に局所的および全身的に炎症反応を誘発し、これらの影響は老齢の動物で悪化した。

どのタイプの細胞が老齢マウスにおける炎症性サイトカインの長期発現の原因であるかを確認し、その後、インビトロでＷＶＰで刺激された老若マウスから異なるタイプの細胞を分離した。老齢のマウスから単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１－マクロファージによって有意に多くの量のＩＬ－６が産生されたのに対し、老齢のマクロファージにおけるＴＮＦ－α産生およびＣＸＣＬ１０産生のレベルは、若齢のマクロファージよりも低かった。これらのデータは、これらのマクロファージが老齢マウスにおける高ＩＬ－６産生の原因であることを示唆している。

老齢者のＥＶがＷＶＰ刺激時にサイトカインの発現を制御できるかどうかを確認した。脾細胞は若齢および老齢のＥＶで処理し、その後ＷＶＰで刺激した。若齢ＥＶは脾細胞によるＩＬ－６産生を減少させたが、老齢ＥＶは若齢ＥＶよりも顕著に減少させた。結果を図１５に示す。さらに、老齢したＥＶは、ｍｉＲ－１９２を介してマクロファージによるＩｌ６発現を抑制した。これらのデータは、老齢ＥＶがマクロファージを介した炎症誘発性サイトカインの発現を弱める可能性があることを示唆している。以上の結果より、ｍｉＲ－１９２ ＥＶは、ＩＬ－６を介して負のフィードバックループを構成することがしめされた。一方、ＴＮＦ－αまたはＩＬ－１２はループに関与していなかった。

１１．ＥＶ ｍｉＲ－１９２のＷＶＰ接種に対する免疫応答での役割
次いで、ＷＶＰ接種に対する免疫応答におけるＥＶ ｍｉＲ－１９２の役割を評価した。コントロールとｍｉＲ－１９２ ＥＶを若齢および老齢マウスに静脈注射した。１４時間後、ＷＶＰを鼻腔内投与した。ワクチン接種６０時間後の肺におけるサイトカイン、ケモカイン、およびｍｉＲＮＡの発現レベルを測定した。ＷＶＰ接種後のＩｌ６、Ｉｌ１２ｂ、Ｔｎｆａ、Ｉｆｎｇ、およびＣｃｌ２の発現レベルは、ＷＶＰ接種後６０時間の若齢マウスよりも老齢マウスの方が高かったが、サイトカインおよびケモカインの発現レベルは、ｍｉＲ－１９２ ＥＶの投与により大幅に減少した。結果を図１６に示す。また、ｍｉＲ－１９２ ＥＶの投与により、肺および肺ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１－マクロファージのｍｉＲ－１９２レベルが増加したことを確認した（図１７）。

局所炎症と一致して、ｍｉＲ－１９２ ＥＶは、老齢マウスにおけるＩＬ－６の長期の全身性増加も無効にした。接種６０時間後の肺で、組織に存在するマクロファージである肺胞マクロファージ（Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｃ＋ＳｉｇｌｅｃＦ＋細胞）の集団は、ＷＶＰの鼻腔内投与により劇的に減少したが、ＷＶＰは、単球から分化したＬｙ６Ｃ＋単球およびＦ４／８０＋ＣＤ１１ｃ－間質マクロファージの動員および蓄積を誘導した。間質性マクロファージの蓄積と動員は、老齢マウスでより明白であった。またｍｉＲ－１９２ ＥＶは、老齢マウスにおける間質性マクロファージの動員と蓄積を有意に抑制しました。肺におけるＩｌ１２ｂおよびＴｎｆａ発現のｍｉＲ－１９２ ＥＶを介した抑制は、間質性マクロファージの蓄積が低いためである可能性がある。ｍｉＲ－１９２は、インビトロでＩｌ１２ｂおよびＴｎｆａの発現を効率的に低減できなかった。これらのデータは、老齢したＥＶおよびｍｉＲ－１９２ ＥＶが、インビトロおよびインビボで、ＷＶＰ接種に応答して、老齢に関連する長期のサイトカイン発現を減衰させる可能性があることを示している。

ＣＳＦ－１Ｒが枯渇すると、間質性マクロファージは、ＷＶＰ接種後の肺で減少する。興味深いことに、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体処理は、ＷＶＰ接種後の肺におけるＩｌ６およびＣｃｌ２ ｍＲＮＡ発現を有意に減少させ、間質性マクロファージが肺におけるＩｌ６およびＣｃｌ２の発現に関与していることを示唆している。さらに、ＢＡＬＦのＩＬ－６タンパク質レベルも抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体処理により減少した。これらのデータは、間質性マクロファージが、ワクチン接種した老齢マウスで観察された増大した炎症反応の原因であることを示唆している。これらの観察結果は、ｍｉＲ－１９２ ＥＶと老齢ＥＶがマクロファージのサイトカイン発現を低下させ、老齢マウスの過炎症状態を減衰させることを裏付けている。抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体治療により脾臓マクロファージの数は減少したが、脾臓の樹状細胞、単球、ＰＭＮ／ＭＤＳＣの数は減少しなかったため、他のタイプのマクロファージが、ｍｉＲ－１９２ ＥＶを介した免疫調節に関与している可能性は排除出来ない。

１２．他のｍｉＲＮＡの評価
加齢に伴って発現が増加した他のｍｉＲＮＡの影響を評価するために、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－２１、およびｍｉＲ－３２２を含むＥＶをｍｉＲ－１９２と同様にして準備し、老齢マウスにおけるＷＶＰ誘発の血清ＩＬ－６の増加に対する影響を評価した。各ｍｉＲＮＡのＥＶは、ＷＶＰ接種の１８時間前に老齢マウスに投与し、ＷＶＰ接種の４０時間後に、血清ＩＬ－６レベルをＥＬＩＳＡで測定した。興味深いことに、ｍｉＲ－２１ ＥＶとｍｉＲ－１９２ ＥＶは、ＷＶＰ投与後にＩＬ－６レベルを抑制した（図１８）。このデータは、ｍｉＲ－１９２ ＥＶだけでなく、ｍｉＲ－２１ ＥＶなどの他の加齢に伴うＥＶも加齢に伴う炎症の抑制に寄与していることを示唆している。

１３．ＬＰＳ誘発性腹膜における免疫応答におけるＥＶ ｍｉＲ－１９２の効果
ｍｉＲ－１９２ ＥＶがＬＰＳ誘発性腹膜炎モデルである他のタイプの刺激に対する免疫応答に影響を与えるかどうかを確認した。若齢および老齢のマウスに、対照のｍｉＲＮＡ ＥＶまたはｍｉＲ－１９２ ＥＶを静脈内投与した。投与の２４時間後、マウスにＬＰＳを腹腔内注射した。ＬＰＳ注射の４時間後に腹腔洗浄液から細胞を収集した。腹腔洗浄液の総細胞数およびＩＬ－６濃度を測定した。結果を図１９に示す。ｍｉＲ－１９２ ＥＶの投与により、ＬＰＳ刺激後の老齢マウスの腹腔洗浄液に蓄積された総細胞数とＦ４／８０＋マクロファージの数が減少した。またこれらと一致して、腹腔洗浄液中のＩＬ－６レベルはｍｉＲ－１９２ ＥＶ投与により減少した。これらのデータは、ｍｉＲ－１９２ ＥＶがＷＶＰだけでなく、腹膜炎モデルのＬＰＳなどの他のタイプの刺激に対する炎症反応を低下させることを示している。

１４．自然免疫応答におけるＥＶ ｍｉＲ－１９２の効果
自然免疫応答に対するｍｉＲ－１９２ ＥＶの影響を評価するために、ｍｉＲ－１９２ ＥＶがＭＨＣおよび共刺激分子の発現を調節するかどうかを確認した。Ｒ８４８による刺激は、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、およびＣＤ８６発現を増加させた。ただし、ｍｉＲ－１９２ ＥＶは、Ｒ８４８の有無にかかわらず刺激されたＢＭＤＣのＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、およびＣＤ８６の発現レベルを変えなかった。これらのインビトロの結果は、ＷＶＰを接種した老齢マウスを用いた検討において、ｍｉＲ－１９２ ＥＶの投与が、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣにおけるＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、およびＣＤ８６の発現に影響を与えなかったという事実と整合した。これらのデータは、ｍｉＲ－１９２ ＥＶがサイトカインの発現を減衰させるが、抗原提示に必要なＭＨＣおよびＣＤ８６は減衰させないことを示唆している。

１５．老齢者におけるワクチン接種における加齢特異的ｍｉＲ－１９２ ＥＶの効果
過度の炎症がワクチンの有効性を低下させることが報告されている（Fourati et al., 2016, Nat Commun 7,10369; Park et al., 2014, Hum Mol Genet 19, R169-175）。したがって、老齢したマウスはＷＶＰに対する反応が弱まることが予想される。確認するために、ＷＶＰを、若齢および老齢のＷＴおよびＩＬ－６ ＫＯマウスに２回鼻腔内投与し、１４日後、血清中の抗原特異的総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃレベルを評価した。その結果、ＷＶＰが若齢および老齢マウスに接種された場合、抗原特異的総ＩｇＧ産生は老齢マウスで有意に減少した。結果を図２０に示す。これらのデータは、マウスモデルが老齢マウスにおけるワクチン効力の低下を反映している。興味深いことに、ＩＬ－６ ＫＯマウスでは、老齢マウスでのＷＶＰ接種における特定のＩｇＧの産生を改善し、老齢マウスでのＩＬ－６媒介炎症がＷＶＰによるワクチンの有効性の低下に関連していることが示された。

ＷＶＰをワクチン接種した後、マウスをウイルスに感染させた。ＩＬ６ ＫＯマウスでは、老齢マウスで抗体産生の増加が見られたが、若齢および老齢のＷＴおよびＩＬ－６ ＫＯマウスのウイルス感染による生存率を比較したところ、ＩＬ－６ ＫＯマウスは、ワクチン接種を受けていても野生型マウスよりもウイルス感染の影響を受けやすいこと分かった。結果を図２１に示す。これは、インフルエンザＡウイルス感染時にＩＬ－６自体が保護的な役割を果たすためだと考えられる。これらのデータは、効率的なワクチン接種とウイルス感染に対する防御のために、過度の炎症ではなく、適切な炎症が必要であることを示している。

以上の結果より、老齢マウスの肺にＷＶＰを投与した後、ｍｉＲ－１９２ ＥＶが炎症誘発性反応を調節するので、老齢マウスのＷＶＰによるワクチン接種の有効性がｍｉＲ－１９２ ＥＶによって改善すると考えられる。そこで、図２２に示すスケジュールに従い、ワクチン接種の１日前にコントロールとｍｉＲ－１９２ ＥＶをマウスに投与し、次に、ワクチン接種されたマウスをインフルエンザＡウイルス（ＰＲ８）に感染させ、生存とその体重減少を記録した。結果を図２３および図２４に示す。若齢マウスでは、ワクチン接種はウイルス感染したマウスの生存を延長し、ｍｉＲ－１９２ ＥＶはウイルス感染後の生存または体重減少に影響を与えなかった。若齢マウスを用いたｍｉＲ－１９２ ＥＶの有無におけるＷＶＰによるワクチン接種に効果を確認したところ、図２５に示すように、ＥＶ自体の投与はＷＶＰワクチン接種の防御活動に影響を及ぼさなかった。図２３に示すように、老齢マウスでは、ワクチン接種はインフルエンザ感染からの保護にわずかな影響を示したが、ワクチン接種された老齢マウスの生存は、ｍｉＲ－１９２ ＥＶの投与によって大幅に改善された。これらの結果は、老齢者のワクチン接種におけるｍｉＲ－１９２ ＥＶの治療の改善効果を示している。

若齢および老齢のマウスでＴｈ１およびＴｈ２応答を評価したところ、図２６に示すように、ＩＦＮ－γ発現などのＴｈ１応答は、老齢マウスではＷＶＰに応答して誘導されなかったが、一方、ＩＬ－５発現などのＴｈ２応答は老齢マウスでも誘導された。老齢マウスではＴｈ１応答が減衰することが示唆された。

ＷＶＰによるワクチン接種の１日前に、コントロールおよびｍｉＲ－１９２ ＥＶを若齢および老齢マウスに注射し、特異的抗体総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２を評価した。興味深いことに、図２７に示すように、ＩｇＧ１ではなく特定のＩｇＧおよびＩｇＧ２ｃが、加齢マウスへのｍｉＲ－１９２ ＥＶの投与によって著しく増加したことが確認された。ＩｇＧ２ｃ産生はＴｈ１応答を必要とすることが知られているため、これらのデータは、ｍｉＲ－１９２ ＥＶが老齢マウスのＴｈ１応答を改善したことを示している。このことは、ｍｉＲ－１９２ ＥＶが、インビボでワクチンの有効性を改善したという観察と一致している。以上の結果は、加齢に伴うＥＶ ｍｉＲ－１９２が過炎症状態を緩和し、ワクチン接種の有効性を改善することを示している。

上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。

本発明により、新規なワクチン組成物が提供された。

Claims (13)

1. （ａ）抗原と、（ｂ）ｍｉｃｒｏＲＮＡ１－１９２（ｍｉＲ－１９２）とを含む、ワクチン組成物。
2. 前記ｍｉＲ－１９２は細胞外小胞に含まれた状態にて含有される請求項１に記載のワクチン組成物。
3. ６５歳またはそれ以上の年齢のヒト老齢者に投与されることを特徴とする、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
4. 前記抗原は病原体由来の抗原である、請求項１～３のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
5. 抗インフルエンザワクチン組成物である、請求項１～３のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
6. 前記抗原は、腫瘍に対するＴ細胞応答を選択的に引き出す腫瘍抗原である、請求項１～３のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
7. 哺乳動物への投与のためのワクチンを製造するための方法であって、
   （１）ｍｉＲ－１９２を発現する動物培養細胞を培養する工程、
   （２）前記動物培養細胞にウイルスを接種して感染させて細胞を培養することにより、細胞においてウイルスを複製する工程、および
   （３）ウイルスを、ｍｉＲ－１９２とともに単離してウイルス調製物を製造する工程、
   を含む方法。
8. 前記ウイルス調製物を弱毒化または不活性化する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記工程（３）における単離を、ｍｉＲ－１９２は細胞外小胞に含まれた状態にてウイルスとともに単離される、請求項７または８に記載の方法。
10. 前記工程（３）における単離を、ウイルス粒子の大きさおよびｍｉＲ－１９２を含有する細胞外小胞の大きさに基づく分離方法により行う、請求項９に記載の方法。
11. 前記分離方法が、約５０～約１５０ｎｍの粒子径に基づいて行われる請求項１０に記載の方法。
12. 前記ウイルスがインフルエンザウイルスである請求項７～１１のいずれか一つに記載の方法。
13. 前記動物培養細胞が、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＢＨＫ細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群より選ばれる細胞である、請求項７～１２のいずれか一つに記載の方法。

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