JP2022018280A - Agent for suppressing inhibition of excretion action of cat - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、猫の排泄行動の阻害を抑制するための猫の排泄行動阻害抑制剤に関する。 The present invention relates to a cat excretory behavior inhibitory inhibitor for suppressing the inhibition of cat excretory behavior.
猫は概してきれい好きであり、排泄物等により汚れたトイレを嫌う傾向がある。猫にとって不快なトイレ環境であると、トイレ以外の場所に粗相をしたり、或いは猫がトイレを我慢して膀胱炎を起こしたりすることがある。例えば、２つの異なる環境における猫の排泄行動を観察したところ、狭い室内に小さなトイレ（悪い環境）では、広い室内に大きなトイレ（良い環境）に比べて、排尿回数が少なく、排尿１回あたりの所要時間は長くなるといった行動が観察されたことが報告されている（非特許文献１）。猫自身が不快に感じることなく安心して排泄するためには、猫尿臭等の猫が忌避する要素をトイレ環境から排除することが望まれる。 Cats generally like cleanliness and tend to dislike toilets that are polluted with excrement. If the toilet environment is unpleasant for the cat, it may make a rough appearance in a place other than the toilet, or the cat may endure the toilet and cause cystitis. For example, when observing the excretory behavior of cats in two different environments, a small toilet in a small room (bad environment) urinates less frequently than a large toilet in a large room (good environment), and each urination is performed. It has been reported that behavior such as an increase in the required time was observed (Non-Patent Document 1). In order for the cat to excrete without feeling uncomfortable, it is desirable to eliminate elements such as cat urine odor that the cat avoids from the toilet environment.
一方、ペット等の排泄物を処理する処理具において、飼い主に排泄物から生じる臭気が知覚されないようにする目的で、消臭を該処理具に配することが行われている。例えば、特許文献１には、特定の化学式で表されるアルミノシリケートを含有するペット用消臭剤が開示されている。また特許文献２には、フェノール性化合物及び／又はメディエータと、それらを酸化することができる酵素とを含む消臭剤を含有する消臭剤含有製品が開示されている。特許文献１及び２には、アセチルセドレン等の香料をペット用の消臭剤に用いることが開示されている。
しかしながら、これまでにアセチルセドレン及びフロルヒドラルの猫の排泄行動に及ぼす影響を検討した報告例はない。
On the other hand, in a treatment tool for treating excrement such as pets, deodorization is arranged in the treatment tool for the purpose of preventing the owner from perceiving the odor generated from the excrement. For example,
However, there have been no reports on the effects of acetylsedrene and florhydral on the excretory behavior of cats.
本発明は、猫の排泄行動の阻害を抑制することができる猫の排泄行動阻害抑制剤を提供することに関する。 The present invention relates to providing a cat excretory behavior inhibitory inhibitor capable of suppressing the inhibition of cat excretory behavior.
本発明者は、アセチルセドレン及びフロルヒドラルによって、猫の排泄行動の阻害を抑制し得ることを見出した。 The present inventor has found that acetylsedrene and florhydral can suppress the inhibition of excretory behavior in cats.
すなわち、本発明は以下の１）～２）に係るものである。
１）アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、猫の排泄行動阻害抑制剤。
２）アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも１種を、猫が排泄する環境にある対象物に適用することを含む、猫の排泄行動阻害の抑制方法。
That is, the present invention relates to the following 1) to 2).
1) A cat excretory behavior inhibitory inhibitor containing at least one selected from the group consisting of acetylsedrene and florhydral as an active ingredient.
2) A method for suppressing inhibition of excretory behavior in cats, which comprises applying at least one selected from the group consisting of acetylsedrene and florhydral to an object in an environment excreted by cats.
本発明によれば、猫の排泄行動の阻害を抑制することができ、猫が我慢をすることなく排泄可能な快適なトイレ環境を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to suppress the inhibition of the excretory behavior of the cat, and it is possible to provide a comfortable toilet environment in which the cat can excrete without patience.
本発明で用いられるアセチルセドレンは、メチルセドリルケトンとも称される化合物であり、１－［（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ，７Ｓ）－２，６，６，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｔｒｉｃｙｃｌｏ［５．３．１．０1,5］ｕｎｄｅｃ－８－ｅｎ－９－ｙｌ］ｅｔｈａｎｏｎｅ、ＣＡＳ登録番号：３２３８８－５５－９である。
フロルヒドラルは、β－Ｍｅｔｈｙｌ－３－（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｐｒｏｐａｎａｌ、ＣＡＳ登録番号：１２５１０９－８５－５である。
アセチルセドレン及びフロルヒドラルは、いずれも市販のものを購入することができる。例えば、これらの化合物は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．やＧｉｖａｕｄａｎ ＳＡ等から入手することが可能である。或いは、化学合成によって、該市販品と同一物質又はそれを含む組成物を製造することが可能である。
The acetyl sedrene used in the present invention is a compound also called a methyl sedrill ketone, which is 1-[(1S, 2R, 5R, 7S) -2,6,6,8-tetramethyltriclo [5.3.1]. .0 1,5 ] undec-8-en-9-yl] acetone, CAS Registry Number: 32388-55-9.
Florhydral is β-Methyl-3- (1-methylthyl) bendenepropanal, CAS Registry Number: 125109-85-5.
Both acetyl sedrene and flor hydral can be purchased commercially. For example, these compounds are described in International Flavors & Fragrances, Inc. It can be obtained from Givaudan SA and the like. Alternatively, it is possible to produce the same substance as the commercially available product or a composition containing the same by chemical synthesis.
本発明では、アセチルセドレン及びフロルヒドラルのいずれか一方又は両方を用いる。好ましくはアセチルセドレン及びフロルヒドラルの両方を用いる。この場合、アセチルセドレンとフロルヒドラルの比率は、質量比で１：０．００１～１：１が好ましく、１：０．００５～１：０．５がより好ましく、さらに、１：０．０１～１：０．２が最も好ましい。 In the present invention, either one or both of acetylsedren and florhydral are used. Preferably both acetylsedren and florhydral are used. In this case, the ratio of acetylsedrene to florhydral is preferably 1: 0.001 to 1: 1 by mass ratio, more preferably 1: 0.005 to 1: 0.5, and further preferably 1: 0.01 to 1: 0.5. 1: 0.2 is the most preferable.
アセチルセドレン及びフロルヒドラルは、猫嗅覚受容体であるＦｃＯＲ２Ｍ３及びＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅの活性化を阻害する物質として機能するアンタゴニスト香料である。ＦｃＯＲ２Ｍ３は、猫嗅細胞で発現している嗅覚受容体であり、ＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＸＰ＿０１１２８１３７２として登録されている。ＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅは、ＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＸＰ＿００３９８０５９３として登録されている、推定猫嗅覚受容体である。
本発明者の研究によって、ＦｃＯＲ２Ｍ３及びＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅが、猫尿臭に特徴的な成分であるチオール類、３－メルカプト－３－メチルブチルフォルメート（ＭＭＦ）と３－メルカプト－３－メチル－１－ブタノール（ＭＭＢ）に応答する猫嗅覚受容体であること、さらに、アセチルセドレン及びフロルヒドラルが、当該ＦｃＯＲ２Ｍ３及びＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅの活性化を阻害する物質として機能することが見出された（後記参考例を参照）。アセチルセドレン及びフロルヒドラルは、これまで香料素材として知られていたが、ＦｃＯＲ２Ｍ３及びＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅに対するアンタゴニスト作用を有することや、チオール類に起因する猫尿臭に対する猫の嗅覚を抑制する機能があることは知られていなかった。
Acetylsedren and florhydral are antagonist fragrances that function as substances that inhibit the activation of the cat olfactory receptors FcOR2M3 and FcOR2M3-like. FcOR2M3 is an olfactory receptor expressed in cat olfactory cells and is registered in GenBank as Accession number: XP_011281372. FcOR2M3-like is a putative cat olfactory receptor registered in GenBank as Accession number: XP_003980593.
According to the research of the present inventor, FcOR2M3 and FcOR2M3-like are thiols characteristic of cat urine odor, 3-mercapto-3-methylbutylformate (MMF) and 3-mercapto-3-methyl-1. -It was found that it is a cat olfactory receptor that responds to butanol (MMB), and that acetylsedrene and florhydral function as substances that inhibit the activation of the FcOR2M3 and FcOR2M3-like (see below). See example). Acetyl sedrene and florhydral, which have been known as fragrance materials, have an antagonistic effect on FcOR2M3 and FcOR2M3-like, and have a function of suppressing the sense of smell of cat urine caused by thiols. Was not known.
本明細書において、アンタゴニストとは、受容体に結合するが、受容体を活性化しないか、又はアゴニストに対する受容体の応答を抑制する（或いは受容体活性を阻害する）物質をいい、アンタゴニスト香料とは、結合部位が嗅覚受容体である場合に、目的の匂い分子が嗅覚受容体に結合して該受容体が活性化して匂い情報が伝達されるときに、目的の匂い分子を他の分子とともに適用することにより、当該他の分子によって目的の匂い分子に対する嗅覚受容体の活性化を阻害し、結果的に個体に認識される匂いを抑制するために用いられる当該他の分子のことである。つまり、アンタゴニスト香料を用いることで、嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂いの抑制を達成することができる。嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂いの抑制は、目的の匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し、結果的に個体に認識される匂い（悪臭を含む）を抑制する手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂い抑制は、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段（いわゆる香りによるマスキング）とは区別される。
このように、アセチルセドレンやフロルヒドラルにより、チオール類臭を嗅覚受容体アンタゴニズムによる匂いの抑制によって抑えることで、猫個体における猫尿臭の認識を抑制できる。
As used herein, an antagonist refers to a substance that binds to a receptor but does not activate the receptor or suppresses the response of the receptor to an agonist (or inhibits the receptor activity), and is referred to as an antagonist fragrance. When the binding site is an olfactory receptor, when the target odorant molecule binds to the olfactory receptor and the receptor is activated to transmit odor information, the target odor molecule is transferred together with other molecules. By application, it is the other molecule used to inhibit the activation of olfactory receptors for the odor molecule of interest by the other molecule and, as a result, suppress the odor perceived by the individual. That is, the suppression of odor by the olfactory receptor antagonism can be achieved by using the antagonist fragrance. Smell suppression by the olfactory receptor antagonism, by applying both the target odor molecule and other odor molecules, inhibits the receptor response to the target odor molecule by the other odor molecules, resulting in an individual. It is a means of suppressing perceived odors (including foul odors). Smell suppression by the olfactory receptor antagonism is distinguished from means such as fragrances that cancel out the desired odor with another strong odor (so-called scent masking), even if it is a means using other odor molecules as well. To.
As described above, by suppressing the thiol odor by suppressing the odor by the olfactory receptor antagonism by acetylsedren and florhydral, the recognition of the cat urine odor in the individual cat can be suppressed.
猫は排泄後、自身の排泄物の匂いを隠そうとする性質がある。例えば、猫は、排尿後に自身の尿を砂で埋めて、敵や捕食動物から自分の存在を隠すためのものとして排尿後の砂かきを位置づけている（Spooner, S. K., 1990, Determination of the Normal Ethogram of Feline Urinary Behavior. University of Montreal Masters Thesis.）。猫自身の排泄物の匂いが消えにくいと、排泄後の砂かき時間が延び、且つ、排泄回数自体も少なくなる。すなわち、猫にとって尿臭等の排泄物の匂いは、自身の排泄行動を阻害する要因であり、他方、猫が排泄後に排泄物の匂いを認識しなければ、排泄後の滞在時間は短くなり、且つ、排泄回数は多く、これは猫にとって快適なトイレ環境であるといえる（非特許文献１；Anim. Behav. Sci., 2017, 194,: 67-78）。
After excretion, cats have the property of trying to hide the smell of their excrement. For example, cats fill their urine with sand after urination and position post-urination sanding as a way to hide their presence from enemies and predators (Spooner, SK, 1990, Determination of the Normal). Ethogram of Feline Urinary Behavior. University of Montreal Masters Thesis.). If the odor of the cat's own excrement is hard to disappear, the sanding time after excretion is extended and the number of excretion itself is reduced. That is, the odor of excrement such as urine odor is a factor that hinders the excretion behavior of the cat, and on the other hand, if the cat does not recognize the odor of excrement after excretion, the staying time after excretion becomes short. Moreover, the number of excretion is large, which can be said to be a comfortable toilet environment for cats (
後記実施例に示すように、アセチルセドレン及びフロルヒドラルにより、猫の排尿後の滞在時間が短縮され、且つ、排尿回数は多くなる。すなわち、アセチルセドレン及びフロルヒドラルは、嗅覚受容体アンタゴニズムによって猫における猫尿臭の認識を抑制することができ、猫の排泄行動の阻害を抑制する作用を有する。
従って、アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも１種（以下、本明細書においては「アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも１種」を「アセチルセドレン等」と記載することがある）は、猫の排泄行動の阻害を抑制する排泄行動阻害抑制剤となり得、また、猫の排泄行動阻害抑制剤を製造するために使用することができる。また、アセチルセドレン等は、猫の排泄行動の阻害を抑制するために使用することができる。排泄行動の阻害が抑制されることにより、猫は安心して排泄可能となり、猫にとって快適なトイレ環境となる。
本明細書において、猫の排泄行動は、好ましくは猫の排尿である。
As shown in the examples below, acetylsedrene and florhydral shorten the residence time after urination of the cat and increase the number of times of urination. That is, acetylsedren and florhydral can suppress the recognition of cat urine odor in cats by the olfactory receptor antagonism, and have an action of suppressing the inhibition of excretory behavior in cats.
Therefore, at least one species selected from the group consisting of acetylsedren and florhydral (hereinafter, "at least one species selected from the group consisting of acetylsedren and florhydral" is referred to as "acetylsedren and the like" in the present specification. (May be described) can be an excretory behavior inhibitory inhibitor that suppresses the inhibition of excretory behavior in cats, and can also be used to produce an excretory behavior inhibitory inhibitor in cats. In addition, acetylsedrene and the like can be used to suppress the inhibition of excretory behavior in cats. By suppressing the inhibition of excretion behavior, the cat can excrete with peace of mind, and the toilet environment becomes comfortable for the cat.
As used herein, the cat's excretory behavior is preferably cat's urination.
本発明の猫の排泄行動阻害抑制剤は、アセチルセドレン及びフロルヒドラルからなる群より選択される少なくとも１種を猫の排泄行動阻害を抑制するための有効成分とし、該化合物から本質的に構成されていてもよいが、さらに他の成分を含む組成物であってもよい。
他の成分としては、例えば、抗菌剤、界面活性剤、消臭剤、キレート剤、水溶性溶剤、油分、ｐＨ調整剤、保湿剤、増粘剤、安定剤、防腐剤、天然抽出物、色素、アセチルセドレン及びフロルヒドラル以外の香料、有機溶剤等が挙げられ、なかでも、抗菌の観点、均一配合の観点から、抗菌剤、界面活性剤、消臭剤を含むことが好ましい。
The cat excretion behavior inhibitory agent of the present invention is essentially composed of at least one selected from the group consisting of acetylsedrene and florhydral as an active ingredient for suppressing cat excretion behavior inhibition. However, it may be a composition containing other components.
Other ingredients include, for example, antibacterial agents, surfactants, deodorants, chelating agents, water-soluble solvents, oils, pH adjusters, moisturizers, thickeners, stabilizers, preservatives, natural extracts, pigments. , Aromas other than acetylsedrene and florhydral, organic solvents and the like, and among them, it is preferable to include an antibacterial agent, a surfactant and a deodorant from the viewpoint of antibacterial and uniform formulation.
抗菌剤は、ウレアーゼ活性を持つ菌の増殖を抑えるものであることが好ましい。本明細書において、ウレアーゼ活性を持つ菌とは、尿に含まれる尿素を加水分解により二酸化炭素とアンモニアに分解する酵素（ウレアーゼ）を産生し尿中で増殖することによりアンモニアを発生させる菌を意味し、そのような菌としては、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｕｒｅａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ等が挙げられる。ウレアーゼ活性を持つ菌の増殖を抑える抗菌剤を含んでいることにより、ウレアーゼ活性を持つ菌の増殖を抑え、該菌の作用により非常に強い刺激臭を有するアンモニアが発生することを抑えることができるため、猫尿臭を一層効果的に抑制することが可能になる。
抗菌剤としては、ピロクトンオラミン、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸エステル、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、イソプロピルメチルフェノール等が挙げられる。尚、フロルヒドラルは当該抗菌剤でもあるが、本明細書においては抗菌剤に含めないものとする。
抗菌剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、低い濃度で効果が期待される観点から、ピロクトンオラミン、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウムが好ましい。
The antibacterial agent preferably suppresses the growth of bacteria having urease activity. As used herein, the term "urease-active" means a bacterium that produces ammonia by producing an enzyme (urease) that decomposes urea contained in urine into carbon dioxide and ammonia by hydrolysis and proliferating in urine. Examples of such bacteria include Brevundimas intermedia, Sporosarcina urea, Proteus mirabilis, Psedomonas ammonia, Klebsiella, Morganella morganii, Coryne and the like. By containing an antibacterial agent that suppresses the growth of bacteria having urease activity, it is possible to suppress the growth of bacteria having urease activity and suppress the generation of ammonia having a very strong pungent odor due to the action of the bacteria. Therefore, it becomes possible to suppress the cat urine odor more effectively.
Examples of the antibacterial agent include piroctone olamine, didecyldimethylammonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, paraoxybenzoic acid ester, alkyltrimethylammonium chloride, isopropylmethylphenol and the like. Although Florhydral is also the antibacterial agent, it is not included in the antibacterial agent in the present specification.
The antibacterial agent may be used alone or in combination of two or more. Of these, piroctone olamine, didecyldimethylammonium chloride, and benzalkonium chloride are preferable from the viewpoint that the effect is expected at a low concentration.
界面活性剤は、イオン性界面活性剤（アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤）、非イオン性界面活性剤、高分子界面活性剤等が挙げられる。界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、均一配合の観点から、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が好ましい。
アニオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸又はその塩、エーテルカルボン酸又はその塩、Ｎ－アシルアミノ酸塩等のカルボン酸基を有するアニオン性界面活性剤が好ましい。
Examples of the surfactant include an ionic surfactant (anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant), a nonionic surfactant, a polymer surfactant and the like. As the surfactant, one type may be used alone or two or more types may be used in combination. Of these, anionic surfactants, nonionic surfactants, and amphoteric surfactants are preferable from the viewpoint of uniform blending.
As the anionic surfactant, for example, an anionic surfactant having a carboxylic acid group such as a fatty acid or a salt thereof, an ether carboxylic acid or a salt thereof, or an N-acylamino acid salt is preferable.
非イオン性界面活性剤としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルケニルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルポリグルコシド、ポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。 Examples of the nonionic surfactant include glycerin fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, and poly. Oxyethylene alkenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene alkenyl ether, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene castor oil, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, alkyl Examples thereof include polyglucoside and polyglycerin fatty acid ester.
両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルジメチルアミンオキサイド、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルヒドロキシスルホベタイン等が挙げられる。 Examples of the amphoteric tenside include alkyldimethylaminoacetic acid betaine, alkyldimethylamine oxide, alkylamide propylbetaine, and alkylhydroxysulfobetaine.
カチオン界面活性剤（但し、上記抗菌剤を除く）は、親水性部位として正電荷の親水基を有する。親水基としては、例えば、第一級、第二級又は第三級アミン塩、第四級アンモニウム塩等が挙げられる。 Cationic surfactants (excluding the antibacterial agents mentioned above) have positively charged hydrophilic groups as hydrophilic moieties. Examples of the hydrophilic group include primary, secondary or tertiary amine salts, quaternary ammonium salts and the like.
消臭剤は、それ自体が臭気（臭気物質）に直接作用して、臭気（臭気物質）を吸着、中和、分解等して、消臭効果を発現し得る物質であり、消臭用途に汎用されているものを用いることができる。消臭剤としては、例えば、多孔性粒子や、水溶性のｐＨ緩衝剤が挙げられる。
多孔性粒子は、少なくとも粒子表面に多数の細孔を有する粒子であって、揮発する臭い成分をその孔に捕集、吸着及び／又は包摂できるものである。例えば、活性炭、シリカ、二酸化ケイ素（シリカゲル）、ケイ酸カルシウム、ハイシリカゼオライト（疎水性ゼオライト）、セピオライト、カンクリナイト、ゼオライト、水和酸化ジルコニウム等の無機多孔質物質等が挙げられる。
水溶性のｐＨ緩衝剤は、猫の排尿等により発生した酸性やアルカリ性の臭い成分を中和し、ｐＨの変化を小さくする剤である。例えば、クエン酸等の弱酸やその共役塩基、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンといったポリヒドロキシアミン化合物等の弱塩基やその共役酸、或いはそれらの混合物、それらの塩等が挙げられる。
A deodorant is a substance that can exert a deodorizing effect by directly acting on an odor (odor substance) by itself, adsorbing, neutralizing, decomposing, etc. of the odor (odor substance), and is used for deodorizing applications. A general-purpose one can be used. Examples of the deodorant include porous particles and a water-soluble pH buffer.
Porous particles are particles having at least a large number of pores on the surface of the particles, and can collect, adsorb, and / or include volatile odorous components in the pores. Examples thereof include inorganic porous substances such as activated carbon, silica, silicon dioxide (silica gel), calcium silicate, high silica zeolite (hydrophobic zeolite), sepiolite, canclinite, zeolite, and hydrated zirconium oxide.
The water-soluble pH buffer is an agent that neutralizes acidic and alkaline odorous components generated by urination of cats and reduces changes in pH. Examples thereof include weak acids such as citric acid and conjugate bases thereof, weak bases such as polyhydroxyamine compounds such as tris (hydroxymethyl) aminomethane, conjugate acids thereof, mixtures thereof, salts thereof and the like.
本発明の猫の排泄行動阻害抑制剤は、猫を飼育する室内や施設といった猫が生活する環境、特に猫が排泄する環境にある対象物に対して適用され得る。
猫が排泄する環境にある対象物としては、特に限定するものではなく、猫が排泄する環境に備わる床、壁、家具、カーテン、カーペット等のインテリア、トイレ、該トイレ用品（トイレ用砂やシート）、ケージ、ハウス、ベッド等が挙げられる。
好適には、本発明の猫の排泄行動阻害抑制剤は、猫のトイレ用品に使用される製品や製剤に配合して使用される。
当該製品や製剤の形態としては、用途に応じて適宜選択することができ、例えば、液状、ゲル状、ペースト状、固形状とすることができる。
また、紙、天然繊維、再生繊維（レーヨン等）及び／又は合成繊維（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル等）の織布又は不織布に、アセチルセドレン及びフロルヒドラルを塗布、或いは含浸した形態とすることができる。
具体的な製品や製剤の形態としては、例えば、洗浄剤、消臭剤、防臭剤、芳香剤、ウェット拭き取り用品が挙げられる。
The agent for inhibiting the excretion behavior of a cat of the present invention can be applied to an object in an environment where the cat lives, particularly an environment in which the cat excretes, such as a room or a facility where the cat is bred.
The objects in the environment excreted by cats are not particularly limited, and the interiors such as floors, walls, furniture, curtains, carpets, etc. provided in the environment excreted by cats, toilets, and the toilet products (sand and sheets for toilets). ), Cages, houses, beds, etc.
Preferably, the cat excretion behavior inhibitory inhibitor of the present invention is used in combination with products and formulations used for cat toilet products.
The form of the product or pharmaceutical product can be appropriately selected depending on the intended use, and may be, for example, liquid, gel-like, paste-like, or solid-like.
Further, acetylsedrene and florhydral may be applied or impregnated into a woven fabric or non-woven fabric of paper, natural fiber, recycled fiber (rayon, etc.) and / or synthetic fiber (polyethylene, polypropylene, polyester, etc.). ..
Specific forms of products and formulations include, for example, detergents, deodorants, deodorants, air fresheners, and wet wipes.
本発明の猫の排泄行動阻害抑制剤におけるアセチルセドレン等の含有量は、その形態により異なるが、合計で０．０１～１０質量％が好ましく、０．０５～５質量％がより好ましく、さらに０．１～３質量％が最も好ましい。 The content of acetylsedren and the like in the cat excretion behavior inhibitory agent of the present invention varies depending on the form, but is preferably 0.01 to 10% by mass, more preferably 0.05 to 5% by mass, and further. Most preferably 0.1 to 3% by mass.
さらなる態様として、本発明は、アセチルセドレン等を猫が排泄する環境にある対象物に適用することを含む、猫の排泄行動阻害の抑制方法を提供する。猫が排泄する環境にある対象物は、好ましくは猫のトイレ用品である。
チオール類は猫尿に元々含まれるため、チオール類臭は排尿直後から発生し、また、そのまま時間が経過しても発生し続ける。そのため、アセチルセドレン等は、猫が排泄する前、或いは排泄後に適用することが好ましい。
猫の排泄行動の阻害を抑制するためには、猫が排泄する環境にある対象物にアセチルセドレン等を接触させればよい。接触は、特に限定するものではなく、塗布又は噴霧する、浸漬する、添加する、揮散する等が挙げられる。
本発明のアセチルセドレン等の使用量は、猫個体における猫尿臭の認識を抑制でき、猫の排泄行動の阻害を抑制し得る量であればよく、その使用形態により適宜決定することができる。
As a further aspect, the present invention provides a method for suppressing inhibition of excretory behavior in cats, which comprises applying acetylsedrene or the like to an object in an environment where cats excrete. Objects in the environment that cats excrete are preferably cat litter.
Since thiols are originally contained in cat urine, the thiol odor is generated immediately after urination and continues to be generated even after a lapse of time. Therefore, it is preferable to apply acetyl sedrene or the like before or after excretion by the cat.
In order to suppress the inhibition of the excretory behavior of the cat, acetylsedrene or the like may be brought into contact with the object in the environment excreted by the cat. The contact is not particularly limited, and examples thereof include coating or spraying, dipping, adding, and volatilizing.
The amount of acetylsedrene or the like used in the present invention may be any amount as long as it can suppress the recognition of cat urine odor in individual cats and suppress the inhibition of excretory behavior of cats, and can be appropriately determined depending on the mode of use thereof. ..
下記の試験で用いたアンタゴニスト香料と猫尿臭原因物質の詳細を次に示す。
（アンタゴニスト香料）
アセチルセドレン（メチルセドリルケトン；［１－［（１Ｓ，２Ｒ，５Ｒ，７Ｓ）－２，６，６，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｔｒｉｃｙｃｌｏ［５．３．１．０1,5］ｕｎｄｅｃ－８－ｅｎ－９－ｙｌ］ｅｔｈａｎｏｎｅ）；（ＣＡＳ登録番号：３２３８８－５５－９；商品名：Ｖｅｒｔｏｆｉｘ；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｌａｖｏｒｓ＆Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）
フロルヒドラル（β－Ｍｅｔｈｙｌ－３－（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｐｒｏｐａｎａｌ）；（登録商標（国際登録０５３４８７９））（ＣＡＳ登録番号：１２５１０９－８５－５）（Ｇｉｖａｕｄａｎ ＳＡ）
アセチルセドレンとフロルヒドラルを、質量比９８：２の割合で混合し、アンタゴニスト香料として用いた。
（猫尿臭原因物質）
３－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－３－ｍｅｔｈｙｂｕｔｙｌ Ｆｏｒｍａｔｅ（ＭＭＦ）（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）
３－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－３－ｍｅｔｈｙ－１－ｂｕｔａｎｏｌ（ＭＭＢ）（東京化成工業（株））
Details of the antagonist fragrance and the causative agent of cat urine odor used in the following tests are shown below.
(Antagonist fragrance)
Acetyl Cedren (Methyl Sedrill Ketone; [1-[(1S, 2R, 5R, 7S) -2,6,6,8-tetramerytricyclo [5.3.1.0 1,5 ] undec-8-en- 9-yl] ethhanone); (CAS Registry Number: 32388-55-9; Trade Name: Vertofix; International Flavors & Fragrances, Inc.)
Florhydral (β-Methyl-3- (1-methylly) bendenepropanal); (Registered Trademark (International Registration 0534879)) (CAS Registry Number: 125109-85-5) (Givaudan SA)
Acetyl sedrene and florhydral were mixed at a mass ratio of 98: 2 and used as an antagonist fragrance.
(Cat urine odor causative substance)
3-Mercapto-3-methybutyl Formate (MMF) (Sigma-Aldrich Co.)
3-Mercapto-3-methy-1-butanol (MMB) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
試験例１
表１の処方に従って液剤を配合した。この液剤を図１に示すシート１に１０ｇ／シートの量でスプレーし５０℃で２時間乾燥を行った。
Test Example 1
The liquid preparation was blended according to the formulation shown in Table 1. This liquid was sprayed on the
シート１は長手方向４５ｃｍ幅方向３５ｃｍで吸収体４の大きさはそれぞれ４０ｃｍ、３０ｃｍであった。構成は次のとおりである。
・表面シート２ ：ポリオレフィン系不織布、２０ｇｓｍ
・裏面シート３ ：ポリエチレン系シート、２０ｇｓｍ
・表面側のコアラップシート４４ａ：薄葉紙、１６ｇｓｍ
・裏面側のコアラップシート４４ｂ：薄葉紙、１６ｇｓｍ
・吸液性材料４６上層部 ：パルプ、１００ｇｓｍ
・高吸収性ポリマー４７ ：ポリアクリル酸ナトリウムの架橋体の吸水性樹脂、１１７ｇｓｍ
・吸液性材料４６下層部 ：パルプ、１００ｇｓｍ
シート１の表面材側から全体にスプレーされた液剤は吸収体４の表面側すなわち、４４ａの薄葉紙に多くが吸収される。
The
-Surface sheet 2: Polyolefin-based non-woven fabric, 20 gsm
-Back sheet 3: Polyethylene sheet, 20 gsm
-
・
-Liquid
Highly absorbent polymer 47: Water-absorbent resin of crosslinked sodium polyacrylate, 117 gsm
-Liquid
Most of the liquid agent sprayed from the surface material side of the
乾燥後のシート１を図２～４のように、システムトイレ１０のシート格納トレー１６に収納し、スノコ１２の上に木製のチップ３２を配置した。
木製のチップ３２は植物由来の素材の粉砕物と結合剤とを固めたもので、植物由来の素材の粉砕物として、針葉樹の粉砕物等を用いた。結合剤としては、合成樹脂を用いることで、チップの撥水性を高め、そうすることで、尿はチップでは吸収されず、下部に配置したシートに吸収される。
実施例１又は比較例１の液剤をスプレーしたシートをそれぞれ、シート格納部１６に配置した２台のシステムトイレセットを用いて下記実験を行った。
The dried
The
The following experiment was carried out using two system toilet sets in which the sheets sprayed with the liquid agent of Example 1 or Comparative Example 1 were arranged in the
確認事項：トイレでの排尿回数及びトイレの中での滞在時間（排泄前、排泄、排泄後）
実施場所：猫とのふれあい施設（室内）
広さ：５０ｍ2
猫の数：１５頭
トイレ配置：３０ｃｍ間隔で左右にトイレを並べて配置、左右の配置を３０分間隔で入れ替え
実施時間：ＡＭ９時～ＰＭ１６時（７時間）
Items to check: Number of urinations in the toilet and time spent in the toilet (before, excretion, and after excretion)
Location: Facility for interacting with cats (indoors)
Area: 50m 2
Number of cats: 15 Toilet arrangements: Toilet arrangements are arranged side by side at 30 cm intervals, and the left and right arrangements are exchanged at 30 minute intervals. Implementation time: 9:00 AM to 16:00 PM (7 hours)
試験結果を図５に示す。
図５に示すとおり、アセチルセドレン及びフロルヒドラルを含む液剤をスプレーした実施例のトイレでは、比較例のトイレに比べて排尿回数が多くなり、また、排尿後の滞在時間が短くなった。この結果は、実施例がより猫にとって好ましいトイレ環境になっていることを示している（非特許文献１）。
The test results are shown in FIG.
As shown in FIG. 5, in the toilet of the example sprayed with the liquid agent containing acetylsedrene and florhydral, the number of urination was larger and the staying time after urination was shorter than that of the toilet of the comparative example. This result indicates that the examples have a more favorable toilet environment for cats (Non-Patent Document 1).
試験例２
（１）猫の尿添加シートに対する行動試験
実施例１で製造した実施例１液剤添加シート及び比較例１液剤添加シートの中央直径５ｃｍの領域に、滅菌ろ過した雄猫（年齢１～１０）の尿混合物を５ｍＬ滴下した。２４頭の猫（年齢３～１３、雌雄１２頭ずつ）を自由行動下で飼育している環境下に、該猫尿を滴下した実施例１液剤添加シート及び比較例１液剤添加シートを載置した。猫は猫尿臭を認識すると好奇心をもって嗅ぎ行動を示す。猫による猫尿臭の認識が実施例１液剤により抑制されたならば、その猫の猫尿臭に対する嗅ぎ行動は減少するはずである。本試験では、６０分間の試験時間内にいずれかのシート中央部の尿添加部分に到達及び匂い嗅ぎ行動を示した猫を解析対象とした。
Test Example 2
(1) Behavioral test on cat urine-added sheet A male cat (
７頭の猫がいずれかのシート中央部に嗅ぎ行動を示した。それらの猫のシートに対する嗅ぎ行動の回数及び総時間を図６Ａに示す。猫の尿添加部分に対する嗅ぎ行動は、主に比較例１液剤添加シート上の尿臭に向けられ、実施例１液剤添加シートに対してはほとんど観察されなかった（図６Ａ左）、実施例１液剤添加シート及び比較例１液剤添加シートに対する嗅ぎ行動の回数には、統計学的な有意差がみられた（ｐ＝０．００８２，Ｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）。猫が嗅ぎを行った総時間についても、実施例１液剤添加シートでは短い傾向がみられた（図６Ａ右）。したがって、アンタゴニスト香料が猫尿臭に対する猫の嗅覚を抑制することが実証され、アンタゴニスト香料によって、猫に快適なトイレ環境をもたらすことが示された。 Seven cats showed sniffing behavior in the center of one of the seats. The number of sniffing behaviors and the total time for those cat sheets are shown in FIG. 6A. The sniffing behavior of the cat's urine-added portion was mainly directed to the urine odor on the comparative example 1 liquid-added sheet, and was hardly observed for the example 1 liquid-added sheet (FIG. 6A left), Example 1. There was a statistically significant difference in the number of sniffing behaviors between the liquid-added sheet and Comparative Example 1 liquid-added sheet (p = 0.0082, Paired t-test). The total time that the cat sniffed also tended to be shorter in the liquid agent-added sheet of Example 1 (Fig. 6A right). Therefore, it was demonstrated that the antagonist fragrance suppresses the cat's sense of smell for cat urine odor, and it was shown that the antagonist fragrance provides a comfortable toilet environment for the cat.
（２）猫の実施例液剤添加シートに対する嗜好性
上記（１）における実施例１液剤添加シートでの猫の尿臭嗅ぎ行動の減少が、アンタゴニスト香料による猫尿臭抑制効果によるものであることを確認する試験を行った。すなわち、シートから発せられたアンタゴニスト香料の匂いが猫にとって不快なものであったために、猫が尿臭を認識してもシートの嗅ぎ行動を控えた可能性が考えられた。本試験では、そのような可能性を検証した。試験例２と同じ２４頭の猫を自由行動下で飼育している環境下に、実施例１液剤添加シート及び比較例１液剤添加シートを載置した。３０分間の試験時間内にいずれかのシートに到達及び滞在した猫を解析対象とした。
(2) Preference for the cat urine-added sheet in Example 1 of the cat The decrease in the cat's urine odor sniffing behavior in the example 1 liquid-added sheet in (1) above is due to the effect of the antagonist fragrance on suppressing the cat urine odor. A test was conducted to confirm. That is, since the odor of the antagonist fragrance emitted from the sheet was unpleasant for the cat, it is possible that the cat refrained from sniffing the sheet even if it recognized the urine odor. In this study, such a possibility was verified. The Liquid Additive Addition Sheet of Example 1 and the Liquid Additive Addition Sheet of Comparative Example 1 were placed in an environment in which the same 24 cats as in Test Example 2 were bred under free movement. Cats that reached and stayed in any of the sheets within the 30-minute test time were included in the analysis.
１２頭の猫がいずれかのシートに到達した。それらの猫のシートに対する到達回数及び滞在時間を図６Ｂに示す。猫は、比較例１液剤添加シートよりも実施例１液剤添加シートに高頻度に到達し、且つ長く滞在した。これらの結果から、アンタゴニスト香料の匂いが猫にとって忌避行動を引き起こすような不快な匂いではないことが示された。したがって、上記（１）で認められた猫の尿臭嗅ぎ行動の減少は、アンタゴニスト香料による猫尿臭抑制によるものであることが確認された。 Twelve cats reached either sheet. The number of arrivals and the length of stay of these cats on the sheet are shown in FIG. 6B. The cats reached the Example 1 liquid addition sheet more frequently and stayed longer than the Comparative Example 1 liquid addition sheet. These results indicate that the odor of the antagonist fragrance is not an unpleasant odor that causes repellent behavior for cats. Therefore, it was confirmed that the decrease in cat urine odor sniffing behavior observed in (1) above was due to the suppression of cat urine odor by the antagonist fragrance.
試験例３
表２の処方に従って液剤を配合した。
本試験では、カーペットの切れはし（３０ｃｍ×３０ｃｍ）の中央部に試験例２と同じ尿混合物５ｍＬを添加した。その後、同じ場所に１０ｍＬの液剤をスプレーした。その後の処理を下記液剤のタイプ別にＡ，Ｂ，Ｃとして表２に記載した。
後処理直後とそのまま１週間放置した後の評価を表２に示した。評価方法並びに評価の基準としては次のとおりである。
（後処理方法）
Ａ：なし
Ｂ：ふき取る
Ｃ：水で洗い流す
（評価方法）
それぞれの後処理をしたカーペットを試験例２と同様の方法で猫飼育施設に並べて設置して、猫の行動を観察した。評価の基準は、猫が匂いを嗅ぎに行った回数がそれぞれのタイプの比較例に対して三分の一以下であれば◎、二分の一以下であれば〇、二分の一より大きければ×とした。
Test Example 3
The liquid preparation was blended according to the formulation shown in Table 2.
In this test, 5 mL of the same urine mixture as in Test Example 2 was added to the central part of the carpet scrap (30 cm × 30 cm). Then, 10 mL of the liquid was sprayed on the same place. Subsequent treatments are listed in Table 2 as A, B, and C for each type of liquid below.
Table 2 shows the evaluation immediately after the post-treatment and after leaving it as it is for one week. The evaluation method and evaluation criteria are as follows.
(Post-processing method)
A: None B: Wipe off C: Rinse with water (evaluation method)
The post-treated carpets were placed side by side in a cat breeding facility in the same manner as in Test Example 2, and the behavior of the cat was observed. The criteria for evaluation are ◎ if the number of times the cat went to sniff is one-third or less for each type of comparative example, 〇 if it is less than one-half, and × if it is greater than one-half. And said.
表２に示すとおり、実施例の液剤をスプレーしたカーペットに対しては猫の嗅ぎ行動の回数は少なく、アンタゴニスト香料が猫尿臭に対する猫の嗅覚を抑制することが実証された。 As shown in Table 2, the number of cat sniffing behaviors was small for the carpet sprayed with the liquid agent of the example, and it was demonstrated that the antagonist fragrance suppresses the cat's sense of smell for cat urine odor.
参考例１ 猫尿臭原因物質に応答する嗅覚受容体ポリペプチドの同定
１）嗅覚受容体ポリペプチド遺伝子の合成
ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、猫嗅覚受容体ポリペプチドＦｃＯＲ２Ｍ３及びＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅをコードする遺伝子（それぞれ配列番号１及び２）を合成した。遺伝子の合成には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＤＮＡ合成サービスを利用した。またＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、猫尿臭原因物質に応答するヒト嗅覚受容体ＨｓＯＲ２Ｍ３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＫＰ２９０１４７、特願２０１９－００５５５０参照）をコードする遺伝子をｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）よりクローニングした。各遺伝子をｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ－Ｒｈｏタグ配列の下流に組込んだ。
Reference Example 1 Identification of the olfactory receptor polypeptide that responds to the substance that causes the odor of cat urine 1) Synthesis of the olfactory receptor polypeptide gene Based on the sequence information registered in GenBank, the cat olfactory receptor polypeptides FcOR2M3 and FcOR2M3- The genes encoding the like (SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively) were synthesized. For gene synthesis, a DNA synthesis service by Thermo Fisher Scientific was used. In addition, based on the sequence information registered in GenBank, a gene encoding the human olfactory receptor HsOR2M3 (GenBank Accession number: KP290147, see Japanese Patent Application No. 2019-005550) that responds to cat urine odor-causing substances is a human genome DNA female (see Japanese Patent Application No. 2019-005550). It was cloned from G1521: Promega). Each gene was integrated downstream of the Flag-Rho tag sequence on the pME18S vector.
２）ｐＭＥ１８Ｓ－ヒトＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ヒトＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子（配列番号３）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組み込んだ。
2) Preparation of pME18S-human RTP1S vector The gene encoding human RTP1S (SEQ ID NO: 3) was incorporated into the EcoRI and XhoI sites of the pME18S vector.
３）嗅覚受容体発現細胞の作製
各嗅覚受容体ポリペプチドをそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表３に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分間静置した。マルチウェルプレート（９６ウェルプレート、ＢｉｏＣｏａｔ）の各ウェルに反応液１０μＬを添加し、次いでＨＥＫ２９３細胞（２×１０5細胞／ｃｍ2）９０μＬを添加して細胞を播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。対照として、嗅覚受容体を発現させない細胞（ｍｏｃｋ）を用意した。
3) Preparation of olfactory receptor-expressing cells HEK293 cells expressing each olfactory receptor polypeptide were prepared. A reaction solution having the composition shown in Table 3 was prepared and allowed to stand in a clean bench for 15 minutes. 10 μL of the reaction solution was added to each well of the multi-well plate (96-well plate, BioCoat), and then 90 μL of HEK293 cells (2 × 10 5 cells / cm 2 ) were added to seed the cells. The cells were cultured at 37 ° C. in an incubator holding 5% CO 2 for 24 hours. As a control, cells (mock) that do not express the olfactory receptor were prepared.
４）嗅覚受容体応答のルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体ポリペプチドは、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本実施例での猫尿臭原因物質に対する細胞の応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ－ＣＲＥ－ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ－ＣＭＶ）を同時に細胞に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ－ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。３）の操作後、嗅覚受容体発現細胞の培養物から培地を取り除き、各ウェルに猫尿臭原因物質を含む培地又は含まない培地を７５μＬずつ添加した。培地には、３００μＭ ＣｕＣｌ2を含むＤＭＥＭ溶液を用いた。猫尿臭原因物質としては、ＭＭＦ（最終濃度０～０．０３ｍＭ）又はＭＭＢ（最終濃度０～０．１ｍＭ）を用いた。猫尿臭原因物質添加の４時間後に、製品の操作マニュアルに従って発光を測定し、ホタルルシフェラーゼ由来の発光値をウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値で除した値［ｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ］を算出した。猫尿臭原因物質刺激に対する嗅覚受容体の応答性の指標として、下記式に従ってＦｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅを算出した。
Ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ＝Ｘ／Ｙ
Ｘ：猫尿臭原因物質刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
Ｙ：猫尿臭原因物質刺激なしの場合のｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
4) Luciferase assay of olfactory receptor response The olfactory receptor polypeptide expressed in HEK293 cells increases the amount of intracellular cAMP by activating adenylate cyclase in combination with intracellular Gαs. To measure the response of cells to the causative agent of feline urine odor in this example, a luciferase reporter gene assay that monitors an increase in intracellular cAMP amount as a luminescence value derived from the firefly luciferase gene (fluc2P-CRE-hygro) was used. In addition, a gene fused with the sea luciferase gene downstream of the CMV promoter (hRluc-CMV) was simultaneously introduced into cells and used as an internal standard for correcting errors in gene transfer efficiency and cell number. A Dual-Glo TM luciferase assay system (Promega) was used to measure the activity of luciferase. After the operation of 3), the medium was removed from the culture of the cells expressing the olfactory receptor, and 75 μL of the medium containing or not containing the cat urine odor-causing substance was added to each well. As the medium, a DMEM solution containing 300 μM CuCl 2 was used. As a substance causing cat urine odor, MMF (
Folder increment = X / Y
X: fLuc / hRluc induced by stimulation of cat urine odor-causing substance
Y: fLuc / hRluc when there is no stimulation of the causative substance of cat urine odor
結果を図７に示す。ｍｏｃｋにおいてはＭＭＦ及びＭＭＢに対する応答が観察されなかったのに対し、ＦｃＯＲ２Ｍ３及びＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅを発現した細胞においては、ＭＭＦ及びＭＭＢのいずれに対しても濃度依存的な応答が観察された（図７Ａ及びＢ）。これらの応答は、ヒトのＭＭＦ及びＭＭＢ受容体ＨｓＯＲ２Ｍ３（本出願人による特願２０１９－００５５５０）と同様であった（図７Ｃ）。
以上の結果から、ＦｃＯＲ２Ｍ３及びＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅは、猫尿臭の成分であるＭＭＦ及びＭＭＢを認識する猫由来嗅覚受容体ポリペプチドであることが示された。
The results are shown in FIG. No response to MMF and MMB was observed in mock, whereas concentration-dependent responses to both MMF and MMB were observed in cells expressing FcOR2M3 and FcOR2M3-like (FIG. 7A). And B). These responses were similar to human MMF and MMB receptor HsOR2M3 (Applicants' Japanese Patent Application No. 2019-005550) (FIG. 7C).
From the above results, it was shown that FcOR2M3 and FcOR2M3-like are cat-derived olfactory receptor polypeptides that recognize MMF and MMB, which are components of cat urine odor.
参考例２ アセチルセドレン及びフロルヒドラルによる嗅覚受容体ポリペプチド応答の抑制活性
アセチルセドレン又はフロルヒドラル存在下でのＭＭＦ又はＭＭＢに対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定し、応答強度の変化を調べた。参考例１と同様の手順に従って、嗅覚受容体ポリペプチド発現ＨＥＫ２９３細胞のルシフェラーゼアッセイを行った。ＭＭＦの最終濃度は０．０１ｍＭ、ＭＭＢの最終濃度は０．０３ｍＭに調整した。アセチルセドレン及びフロルヒドラルの最終濃度は０～０．３ｍＭの範囲で調整した。ＭＭＦ又はＭＭＢ単独刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｘ）、ＭＭＦ又はＭＭＢで刺激しなかった細胞でのｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｙ）、及び、ＭＭＦ又はＭＭＢとアセチルセドレン又はフロルヒドラルとの共刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｚ）を求めた。下記式により、アセチルセドレン又はフロルヒドラル存在下での嗅覚受容体ポリペプチドのＭＭＦ又はＭＭＢに対する応答強度（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（％））を求めた。
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（％）＝（Ｚ－Ｙ）／（Ｘ－Ｙ）×１００
独立した実験を３回行い、各回の実験で得られた応答強度の平均値を求めた。
Reference Example 2 Suppressive activity of the olfactory receptor polypeptide response by acetylsedren and florhydral The response of the olfactory receptor polypeptide to MMF or MMB in the presence of acetylsedren or florhydral was measured, and the change in response intensity was investigated. A luciferase assay was performed on HEK293 cells expressing the olfactory receptor polypeptide according to the same procedure as in Reference Example 1. The final concentration of MMF was adjusted to 0.01 mM, and the final concentration of MMB was adjusted to 0.03 mM. The final concentrations of acetylsedrene and florhydral were adjusted in the range of 0-0.3 mM. The fLuc / hRluc value (X) induced by MMF or MMB monostimulation, the fLuc / hRluc value (Y) in cells not stimulated by MMF or MMB, and the combination of MMF or MMB with acetylsedren or florhydral. The fLuc / hRluc value (Z) induced by the stimulus was determined. The response intensity (Response (%)) of the olfactory receptor polypeptide to MMF or MMB in the presence of acetylsedren or florhydral was determined by the following formula.
Response (%) = (ZY) / (XY) x 100
Three independent experiments were performed, and the average value of the response intensities obtained in each experiment was calculated.
結果を図８及び９に示す。アセチルセドレン（図８）及びフロルヒドラル（図９）のいずれも、濃度依存的にＭＭＦ及びＭＭＢに対するＦｃＯＲ２Ｍ３及びＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅの応答を抑制した。以上の結果から、これら２つの化合物がＦｃＯＲ２Ｍ３及びＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅのアンタゴニスト香料であることが確認された。またこれらの化合物は、従来の知見（特願２０１９－００５５５０）と同様に、ＭＭＦ及びＭＭＢに対するＨｓＯＲ２Ｍ３の応答を抑制した。
以上の結果から、嗅覚受容体ＦｃＯＲ２Ｍ３又はＦｃＯＲ２Ｍ３－ｌｉｋｅのアンタゴニストであるアセチルセドレン及びフロルヒドラルにより、ＭＭＦやＭＭＢ等による猫尿臭に対する猫の嗅覚が抑制されることが示された。
The results are shown in FIGS. 8 and 9. Both Acetyl Sedren (FIG. 8) and Florhydral (FIG. 9) suppressed the response of FcOR2M3 and FcOR2M3-like to MMF and MMB in a concentration-dependent manner. From the above results, it was confirmed that these two compounds are the antagonist fragrances of FcOR2M3 and FcOR2M3-like. In addition, these compounds suppressed the response of HsOR2M3 to MMF and MMB, as in the conventional findings (Japanese Patent Application No. 2019-005550).
From the above results, it was shown that acetylsedren and florhydral, which are antagonists of the olfactory receptors FcOR2M3 or FcOR2M3-like, suppress the olfactory odor of cats due to MMF, MMB and the like.
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