JP2021535761A - ｓＰＤ−１バリアント−Ｆｃ融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は新規sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質に関する。
Description
I. 関連出願の相互参照
本願は、2018年9月14日に出願された米国仮特許出願第62/731,488号および2019年8月16日に出願された米国仮特許出願第62/888,320号に基づく優先権を主張し、これらの仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本願は、2018年9月14日に出願された米国仮特許出願第62/731,488号および2019年8月16日に出願された米国仮特許出願第62/888,320号に基づく優先権を主張し、これらの仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
II. 発明の分野
本発明は、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法、および例えばがん、感染症などの疾患の処置などにおいてsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を使用する方法に関する。
本発明は、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法、および例えばがん、感染症などの疾患の処置などにおいてsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を使用する方法に関する。
III. 発明の背景
PD-1（プログラム細胞死1）は活性化したT細胞およびB細胞によって発現される重要な免疫チェックポイント受容体である。これは免疫抑制を媒介するように機能する。PD-1は活性化したT細胞、B細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞上に発現する。PD-1のリガンドは、プログラム細胞死1リガンド1（PD-L1、別名B7-H1）およびプログラム細胞死1リガンド2（PD-L2、別名B7-DC）であり、これらは多くの腫瘍細胞ならびに抗原提示細胞、例えば単球、樹状細胞（DC）およびマクロファージ上に発現する。
PD-1（プログラム細胞死1）は活性化したT細胞およびB細胞によって発現される重要な免疫チェックポイント受容体である。これは免疫抑制を媒介するように機能する。PD-1は活性化したT細胞、B細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞上に発現する。PD-1のリガンドは、プログラム細胞死1リガンド1（PD-L1、別名B7-H1）およびプログラム細胞死1リガンド2（PD-L2、別名B7-DC）であり、これらは多くの腫瘍細胞ならびに抗原提示細胞、例えば単球、樹状細胞（DC）およびマクロファージ上に発現する。
PD-1は、免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーのメンバーであり、その細胞外領域に単一のIg V様ドメインを含有する。PD-1の細胞質ドメインは2つのチロシンを含有し、最も膜に近いチロシンは免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motif:ITIM）内に位置する。PD-1は、その細胞質ドメインを介して細胞質ホスファターゼをリクルートすることによって、抗原受容体シグナリングを弱める。ヒトとマウスのPD-1タンパク質は、約60％のアミノ酸同一性を有し、4つの潜在的N-グリコシル化部位とIg-Vドメインを規定する残基とが保存されている。
PD-1は、T細胞中で誘導されると、負の免疫応答シグナルを送達するように作用する。PD-1がそのリガンドの1つに選択的に結合することによって活性化されると、抑制性免疫応答が活性化され、それがT細胞の増殖ならびに/またはT細胞応答の強さおよび/もしくは持続時間を減少させる。PD-1は、感染または腫瘍進行に呼応して、末梢組織におけるエフェクターT細胞活性も調節する（Pardoll,Nat Rev Cancer,2012,12（4）:252-264（非特許文献1））。
通常は付随組織の損傷（collateral tissue damage）を軽減するために免疫応答を終結させるPD-1シグナリング経路などの内在性免疫チェックポイントは、腫瘍により、免疫破壊を免れるために利用されうる。がんにおけるPD-L1とPD-1の間の相互作用は、腫瘍浸潤性免疫細胞の数を減少させ、がん細胞に対する免疫応答を抑制することができる。PD-1に結合した後のT細胞活性化とサイトカイン分泌のダウンレギュレーションは、いくつかのヒトがんにおいて観察されている（Freeman et al. ,J Exp Med,2000,192（7）:1027-34（非特許文献2）、Latchman et al,Nat Immunol,2001,2（3）:261-8（非特許文献3））。加えて、PD-1リガンドPD-L1は、乳がん、大腸がん、食道がん、胃がん、神経膠腫、白血病、肺がん、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、膵がん、腎細胞癌および尿路上皮がんを含む多くのがんにおいて過剰発現している。がん患者は、免疫細胞によるPD-1/PD-L1相互作用の増加により、適応免疫応答が限定されまたは低減していることも示されている。活性化されたPD-1シグナリングのこの増加はウイルス感染患者でも見られている。例えばB型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルスは、肝細胞でのPD-1リガンドの過剰発現を誘導し、エフェクターT細胞におけるPD-1シグナリングを活性化することができる。これが、結果として、T細胞疲弊およびウイルス感染に対する免疫寛容につながる（Boni et al. ,J Virol,2007,81:4215-4225（非特許文献4）、Golden-Mason et al,J Immunol,2008,180:3637-3641（非特許文献5））。
最新のPD-1拮抗薬、例えばピディリズマブ、ペンブロリズマブ（キイトルーダ（Keytruda（登録商標）））およびニボルマブ（オプジーボ（Opdivo（登録商標）））は、身体のすべてのリンパ細胞上のPD-1を標的とする抗体である。これらの抗体はPD-1に対してナノモル濃度域のアフィニティーを有するが、これは、免疫シナプス内での、例えば抗原提示細胞とリンパ球との境界面での、PD-1とそのリガンドとの間の相互作用よりも弱い。
当技術分野では、がん患者または感染症患者における適応免疫の抑制を緩和しまたは反転させることができる効果的なタンパク質ベースの治療的処置が必要とされている。本発明はこの必要性および他の必要性を満たす。
改良された特性（例えばPD-L1および/またはPD-L2に対する結合アフィニティーの増加、ならびにタンパク質安定性の増加など）を有するsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供すること、ならびにがんおよび/または感染症を持つ患者の処置において、そのようなsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製し、使用する方法を提供することが、本発明の目的である。
Pardoll,Nat Rev Cancer,2012,12（4）:252-264
Freeman et al. ,J Exp Med,2000,192（7）:1027-34
Latchman et al,Nat Immunol,2001,2（3）:261-8
Boni et al. ,J Virol,2007,81:4215-4225
Golden-Mason et al,J Immunol,2008,180:3637-3641
IV. 発明の概要
本発明は、なかんずく、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法、およびsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を、特に適応免疫系が抑制される疾患もしくは障害または免疫応答の強さもしくはレベルの増加が必要な疾患もしくは障害を処置するために、使用する方法を提供する。いくつかの態様において、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、がんまたは慢性ウイルス感染症を処置するために使用することができる。他の態様において、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質はがんの処置にアジュバント治療として使用することができる。
本発明は、なかんずく、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法、およびsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を、特に適応免疫系が抑制される疾患もしくは障害または免疫応答の強さもしくはレベルの増加が必要な疾患もしくは障害を処置するために、使用する方法を提供する。いくつかの態様において、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、がんまたは慢性ウイルス感染症を処置するために使用することができる。他の態様において、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質はがんの処置にアジュバント治療として使用することができる。
一局面において、本発明は、
a）SEQ ID NO:1との比較で、120、112、107、104、67、69、96および42からなる群より選択される位置番号にあるアミノ酸置換を含む、可溶性PD-1（sPD-1）バリアントドメイン、
b）任意選択のリンカー、ならびに
c）Fcドメイン
を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
a）SEQ ID NO:1との比較で、120、112、107、104、67、69、96および42からなる群より選択される位置番号にあるアミノ酸置換を含む、可溶性PD-1（sPD-1）バリアントドメイン、
b）任意選択のリンカー、ならびに
c）Fcドメイン
を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、N末端からC末端に向かって、
a）sPD-1バリアントドメイン、
b）任意選択のリンカー、および
c）Fcドメイン
を含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
a）sPD-1バリアントドメイン、
b）任意選択のリンカー、および
c）Fcドメイン
を含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、N末端からC末端に向かって、
a）Fcドメイン
b）任意選択のリンカー、および
c）sPD-1バリアントドメイン
を含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
a）Fcドメイン
b）任意選択のリンカー、および
c）sPD-1バリアントドメイン
を含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:1に対して少なくとも95％の同一性を示す、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインが前記位置のうちの1つ、該位置のうちの2つ、該位置のうちの3つ、該位置のうちの4つ、該位置のうちの5つ、該位置のうちの6つ、該位置のうちの7つまたは該位置のうちの8つにアミノ酸置換を有する、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがA120V、A112I、S107V、G104S、S67G、P69L、N96SおよびS42Gからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがS42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V、P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、S67G/G104S/S107V/A112I/A120V、S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、G104S/S107V/A112I/A120VおよびG104S/S107V/A112Iからなる群より選択されるアミノ酸置換のセットを含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがS42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがS42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがP69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがS67G/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがS67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがG104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがG104S/S107V/A112Iのアミノ酸置換のセットを含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:2を有する、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:3を有する、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:72を有する、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:110を有する、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:130を有する、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:131を有する、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:138を有する、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、FcドメインがヒトIgG FcドメインまたはバリアントヒトIgG Fcドメインである、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、ヒトIgG FcドメインがヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、FcドメインがバリアントヒトIgG Fcドメインである、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、バリアントヒトIgG Fcドメインが、EUナンバリングインデックスでS228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、リンカーが(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択され、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、リンカーがGGGGSである、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、SEQ ID NO:5を有する上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:6を有する上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、上述の核酸を含む発現ベクターを提供する。
さらなる一局面において、本発明は、上述の核酸または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法であって、a）Fc融合タンパク質が発現される条件下で上述の宿主細胞を培養する工程およびb）Fc融合タンパク質を回収する工程を含む方法を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、がんを持つ対象における腫瘍の転移または浸潤を処置、低減、または防止する方法であって、治療有効用量の1種または複数種の上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、がんを持つ対象における腫瘍の転移または浸潤を処置、低減、または防止する上述の方法であって、がんが、黒色腫、神経膠腫、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部がん、食道がん、腎がん、肺がん、乳がん、肝がん、結腸直腸がん、胆嚢がん、胃がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、および他の任意の固形腫瘍がんからなる群より選択される、方法を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、感染症を持つ対象を処置する方法であって、治療有効用量の1種または複数種の上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、感染症を持つ対象を処置する上述の方法であって、感染症が真菌感染症、細菌感染症またはウイルス感染症である、方法を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、感染症を持つ対象を処置する上述の方法であって、ウイルス感染症が、B型肝炎ウイルス感染症、C型肝炎ウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）感染症、エプスタイン・バー・ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、および他の任意の慢性ウイルス感染症からなる群より選択される、方法を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、がんを持つ対象における腫瘍の転移または浸潤を処置、低減、または防止する上述の方法、あるいは感染症を持つ対象を処置する上述の方法であって、有効用量の1種または複数種のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質が、対象において野生型PD-1によって媒介されるシグナル伝達を抑制、低減、または調整する、方法を提供する。
さらなる一局面において、本発明は、がんを持つ対象における腫瘍の転移または浸潤を処置、低減、または防止する上述の方法、あるいは感染症を持つ対象を処置する上述の方法であって、有効用量の1種または複数種のFc融合タンパク質が対象におけるT細胞応答を増加させる、方法を提供する。
V. 図面の簡単な説明
野生型PD-1ポリペプチド（PD1 WT）、sPD-1バリアントバージョン1（PD1 V1）、sPD-1バリアントバージョン2（PD1 V2）およびIgG4のドメインの図解である。シグナルペプチド領域は残基1〜20のイタリック体であり、細胞外ドメイン（ECD）は残基21〜170である。変異したN-グリコシル化部位はボールド体かつ下線付きである。他の変異残基はボールド体である。リンカーは二重下線付きである。配列ナンバリングはシグナルペプチド領域の第1アミノ酸から始まる。
ヒトPD-1、4ZQKのB鎖および5IUSのA鎖の配列アラインメントの結果である。同一残基は青で表示され、どちらの結晶構造でも欠落している（missing）残基は赤で表示され、4ZQKだけで欠落している残基はシアンで表示されている。
ヒトPD-1モデルとヒトPD-1/PD-L1の結晶構造（PDBID:4ZQK）とのオーバーレイである。4ZQKにおけるPD-1とPD-L1の結晶構造がそれぞれ青および緑で表示されている。変異に関してPD-1上の7つの残基（シグナル領域から始まる位置ナンバリングでSer62、Ser87、Pro89、Gly124、Ser127、Ala132およびAla140）がオレンジのスティックで表示され、N-グリコシル化部位（Asn116）はマゼンタのスティックで表示されている。位置ナンバリングはシグナルペプチド領域の第1アミノ酸から始まっている。
WT PD-1/PD-L1（青）、3つの境界面変異を持つPD-1/PD-L1（赤）および8つすべての境界面変異を持つPD-1/PD-L1（緑）に関するバックボーン原子位置RMSDの時間発展を示す。
ヒトPD-L2とマウスPD-L2（PDBID:3RNQ、3BP6および3BP5）の配列アラインメントの結果を表す。ヒトPD-L2とマウスPD-L2の配列同一性は約72％である。
ヒトPD-L2のコンセンサスモデルを表す。一致残基は青で表示されている。欠落ループ（missing loop）中の残基は赤で表示されている。
ヒトPD-L2モデルとマウスPD-L2結晶構造（PDBID:3BP5）とのPD-1結合境界面の比較である。境界面残基は線で表示されている。ヒトPD-L2モデル（ダークブルーで示されている）では境界面残基が緑で表示されている。マウスPD-L2の結晶構造はピンクで表示されている。
ヒトPD-1/PD-L2モデルとマウスPD-1/PD-L2結晶構造（PDBID:3BP5）のオーバーレイである。ヒトPD-1モデルとヒトPD-L2モデルはそれぞれシアンおよびダークブルーで表示され、マウスPD-1構造とマウスPD-L2構造はそれぞれ黄およびピンクで表示されている。
PD-L1およびPD-L2に対するsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の結合アフィニティーを表す。sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、WT PD-1-Fc融合タンパク質（「親Fc融合タンパク質」）と比べてPD-L1結合に約10,000倍の改良を、また親Fc融合タンパク質と比べてPD-L2結合に約200倍の改良を示す。
MC38 hPD-L1ノックイン細胞でのsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質（すなわちsPD-1バリアントバージョン1-Fc融合タンパク質およびsPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質）の結合活性を表す。MC38-PD-L1ノックイン細胞では、どちらのsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質も、野生型の群（すなわち野生型PD-1-Fc融合タンパク質の群）よりもはるかに良好に結合する。
MC38親細胞でのsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質（すなわちsPD-1バリアントバージョン1-Fc融合タンパク質およびsPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質）の結合活性を表す。sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は親MC38細胞にも結合するが、低い。
さまざまな濃度のsPD-1変異体、sPD-1野生型およびhIgG4と共にインキュベートした時のHep3B-hPD-L1細胞存在下でのT細胞活性化を表す。T細胞活性はIFN-γによって測定される。エラーバーは技術的三重実験の平均および標準偏差を表す。実験は、異なるドナーから単離されたPBMCを使って、独立に2回行った。
陽性対照（すなわち抗PD-L1抗体の群）と比べてPD-1-ECD-Fcの群（すなわちsPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質の群）における腫瘍体積の減少によって証明されるとおり、sPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質が抗PD-L1抗体と比較して優れた抗腫瘍活性を示すことを表している。
陽性対照（すなわち抗PD-L1抗体の群）と比べてPD-1-ECD-Fcの群（すなわちsPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質の群）における腫瘍成長抑制の増加によって証明されるとおり、sPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質が抗PD-L1抗体と比較して優れた抗腫瘍活性を示すことを表している。
陽性対照（すなわち抗PD-L1抗体の群）と比べてPD-1-ECD-Fcの群（すなわちsPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質の群）における生存率の増加によって証明されるとおり、sPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質が抗PD-L1抗体と比較して優れた抗腫瘍活性を示すことを表している。
媒体対照の群、PD-1-ECD-Fcの群（すなわちsPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質の群）、および陽性対照（すなわち抗PD-L1抗体の群）における体重の相対的変化を表している。
ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のヒンジ配列を表す。
ヒトPD-L2がHep3B細胞株およびMC38細胞株において過剰発現したことを表す。蛍光活性化細胞選別法（FACS）によって陽性クローンを選択した。
Hep3b-hPDL2細胞でのPD1タンパク質とPDL2 tab1の結合試験において、sPD-1バリアント2-Fc融合タンパク質がHep3b-hPDL2細胞に強く結合することを表す。
PBMCとHep3B-OS8-PDL2 4B9の共培養物におけるT細胞活性化試験を表す。
MC38-hPDL2結腸直腸腫瘍細胞株を使ったインビボ腫瘍モデルにおいて、媒体対照、sPD-1バリアント2-Fc融合タンパク質またはペンブロリズマブを投与した後のさまざまな日数での腫瘍体積を表す。
図17A〜17Oは、PD1 WT（SEQ ID NO:11）と、PD1 WTとの比較でさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:12〜139）の、成熟細胞外ドメイン（ECD）のアミノ酸配列を表す。シグナルペプチド領域、例えばSEQ ID NO:7に記載するものを、図17A〜17Oに示す配列のそれぞれの前に付加することができる。リンカードメイン、例えばGGGGSを、図17A〜17Oに示す配列のそれぞれの後に付加することができる。変異したN-グリコシル化部位はボールド体かつ下線付きである。他の変異残基はボールド体である。各コロニーにおける変異を、その成熟領域から始まる配列ナンバリングで、表10に要約する。図17AはPD1 WT（SEQ ID NO:11）とさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:12〜19）のアミノ酸配列を表す。
図17BはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:20〜28）のアミノ酸配列を表す。
図17CはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:29〜37）のアミノ酸配列を表す。
図17DはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:38〜46）のアミノ酸配列を表す。
図17EはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:47〜55）のアミノ酸配列を表す。
図17FはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:56〜64）のアミノ酸配列を表す。
図17GはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:65〜73）のアミノ酸配列を表す。
図17HはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:74〜82）のアミノ酸配列を表す。
図17IはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:83〜91）のアミノ酸配列を表す。
図17JはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:92〜100）のアミノ酸配列を表す。
図17KはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:101〜109）のアミノ酸配列を表す。
図17LはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:110〜118）のアミノ酸配列を表す。
図17MはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:119〜127）のアミノ酸配列を表す。
図17NはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:128〜136）のアミノ酸配列を表す。
図17OはさまざまなsPD-1バリアント（SEQ ID NO:137〜139）のアミノ酸配列を表す。
図18A〜18Fは、卵巣腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍および脳腫瘍のヒト組織マイクロアレイにおけるPD-L2、PD-L1およびCD8＋T細胞発現を表す。図18Aは、正常試料と悪性試料をどちらも含んでいる卵巣がん組織マイクロアレイ（N＝156）の代表的画像が、蛍光免疫組織化学により、抗ヒトPD-L2（灰色）、抗ヒトPD-L1（Latchman,Wood et al. ）およびサイトケラチン（赤）で染色されたことを表す。染色された各試料の強度がスコア化され、腫瘍悪性度に従って定量された（右上PD-L2、右下PD-L1）。図18Bは、正常食道組織およびがん食道組織（N＝72）の代表的画像が、蛍光免疫組織化学により、抗ヒトPD-L2（灰色）、抗ヒトPD-L1（Latchman,Wood et al. ）およびサイトケラチン（赤）で染色されたことを表す。腫瘍悪性度分類に従って腫瘍のPD-L2発現（右上）およびPD-L1発現（右下）の両方を示すために、各試料がスコア化され、定量された。図18Cは、胃がん組織マイクロアレイ（N＝76）の代表的画像が染色され、次に、腫瘍悪性度分類に基づいてPD-L2発現（右上）およびPD-L1発現（右下）の両方について定量されたことを示す。図18Dは、膠芽腫組織マイクロアレイ（N＝152）の代表的画像が染色され、次に、腫瘍悪性度分類に基づいてPD-L2発現（右上）およびPD-L1発現（右下）について定量されたことを示す。DAPI染色は核の存在を表している。図18Eは、図18Aで調べられた試料と同じ試料を含む卵巣がん組織マイクロアレイが抗ヒトCD8（赤）およびDAPI（青）について染色されたことを示し、代表的画像がここに示されている。陽性CD8細胞には矢印で注釈を付け、スケールバーは100μMを表す。図18Fは、図18Bで調べられた試料と同じ試料を含む食道がん組織マイクロアレイが抗ヒトCD8（赤）およびDAPI（青）について染色されたことを示し、代表的画像が示されている。陽性CD8細胞には矢印で注釈を付け、スケールバーは100μmを表す。各試料を定量して、1視野あたりの陽性核の数を示し、腫瘍悪性度分類に従ってグラフ化した（右）。すべての定量データをプロットして患者試料あたりのスコアまたは陽性核の数を示し、平均および標準偏差を計算した。統計解析は処置群間を比較する一元配置ANOVAで行った。P値＊≦0.05、＊＊≦0.01および＊＊＊≦0.001。
図18Aの説明を参照のこと。
図18Aの説明を参照のこと。
図18Aの説明を参照のこと。
図18Aの説明を参照のこと。
図18Aの説明を参照のこと。
図19A〜19Dは、PD-L1およびPD-L2に対して優れた結合アフィニティーを持つsPD-1変異体の工学的作出を表す。図19Aは、PD-1シグナリングを抑制するための3つの異なる戦略の図解を表す。
図19Bは、PD-L1に結合する酵母ディスプレイsPD-1変異体ライブラリーを示す代表的フローサイトメトリードットプロットを表す。PD-L1に最も強く結合するクローンを、PD-L1濃度を逐次的に減少させ（ソート（sort）1〜ソート4）、次にインキュベーション時間を増加させること（ソート5およびソート6）によって選択した。
図19Cは、ヒトPD-L1に対するsPD-1変異体バージョン1（Topalian,Hodi et al. 2012,N Engl J Med 366（26）:2443-2454、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）および野生型PD-1（下）の結合の動態が、BIAcore表面プラズモン共鳴システムによって決定されたことを表す。各曲線は単一濃度の分析物を表す。
図19Dは、ヒトPD-L2に対するsPD-1変異体バージョン1（Topalian,Hodi et al. 2012,N Engl J Med 366（26）:2443-2454、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）および野生型PD-1（下）の結合の動態が、BIAcore表面プラズモン共鳴システムによって決定されたことを表す。各曲線は単一濃度の分析物を表す。
図20A〜20Cは、ヒトPD-L1およびヒトPD-L2と共複合体（co-complex）を形成しているsPD-1変異体のコンピュータモデリングベースの構造解析を表す。図20Aにおいて、左側の図は、sPD-1変異G124S（オレンジ）がPD-L1 Tyr123（緑および赤のスティック）との水素結合を作ることを示している。野生型PD-1構造はシアンで表示されている。右側の図は、変異A132IがPD-L1 Gln166ともう一つの水素結合を作ることを示している。野生型PD-1構造（シアン）、変異型PD-1構造（オレンジ）。結晶PD-L1構造はピンクで表示され、sPD-1変異体とのPD-L1共複合体は緑で表示されている。
図20Bは変異A132Iの表面相補性の比較を示している。PD-L1結合部位は静電ポテンシャル表面がわかるように表示されている。赤は負の静電ポテンシャルを示し、青は正の静電ポテンシャルを示し、灰色は疎水性領域を示す。野生型PD-1はシアンの描画とボールで表示され（左側の図）、変異型PD-1はオレンジの描画とボールで表示されている（右側の図）。
図20Cは、変異A132IのPD-L2との表面相補性の比較を図20Bと同じカラーアノテーションで示している。
図21A〜21Cは、sPD-1変異体が、PD-L1およびPD-L2が媒介する活性の遮断において、T細胞の生存能に影響を及ぼすことなく、リガンド依存的に、優れた能力を示したことを表している。図21Aは、PD-1野生型、hIgG4およびsPD-1変異体と競合するビオチンコンジュゲートPD-1野生型へのHep3B-hPD-L1結合の阻害パーセントを示す細胞ベースの受容体遮断アッセイを示している。2回の独立した実験のうちの1つがここに示されており、個々のポイントは2回の技術的反復の平均を表す。図21Bは、sPD-1野生型、hIgG4ならびにsPD-1変異体バージョン1およびバージョン2と競合するビオチンコンジュゲートPD-1野生型へのHep3B-hPD-L2細胞結合の阻害パーセントを示す細胞ベースの受容体遮断アッセイを示している。2回の独立した実験のうちの1つがここに示されており、個々のポイントは2回の技術的反復の平均を表す。図21Cは、sPD-1変異体バージョン2およびaPD-1抗体の存在下、組換えPD-L1の添加ありまたはなしでの、経時的なT細胞増殖を示している。CD3/CD28抗原で処理したT細胞を陽性対照として使用し、無処理のT細胞を陰性対照とした。各データポイントは技術的二重実験の平均および標準偏差を表す。異なるドナーから単離されたT細胞を使って実験を繰り返した。統計解析は、処理群間の比較については一元配置ANOVAで行い、経時的変化については反復ANOVAで行った。P値＊≦0.05、＊＊≦0.01。
図21Aの説明を参照のこと。
図21Aの説明を参照のこと。
図22A〜22Hは、sPD-1変異体が、結腸直腸がん、黒色腫および卵巣がんのマウス腫瘍モデルにおける腫瘍成長を抑制することを示している。図22Aは、Alexa Fluor（登録商標）488で標識されたsPD-1変異体の生体内分布が経時的に撮像されたことを示している。図22Bは、ヒトIgG4に対するELISAを使って検出された、10mg/kgでの分子の単回投与後の、マウス血清におけるsPD-1変異体の生体内分布を示している。各データポイントは、同じ時点で収集された2匹の動物の平均を表す。図22Cは、MC39-hPD-L2結腸直腸がんを接種した後、媒体対照、sPD-1変異体10mg/kgまたはペンブロリズマブ10mg/kgに割り当てたC57B/6マウスにおける経時的な腫瘍成長を表す。各データポイントは経時的に測定された個々の腫瘍の平均およびSEMを表す。図22Dは、B16/OVA黒色腫細胞を接種した後、媒体対照またはsPD-1変異体10mg/kgで処置したC57B/6マウスにおける経時的な腫瘍成長を示している。各線は経時的な個々の腫瘍成長を表している。図22Eは、ID8マウス卵巣腫瘍細胞を同所性に接種して媒体対照、抗マウスαPD-1遮断抗体10mg/kgおよびsPD-1変異体10mg/kgで処置したC57B/6マウスのカプラン・マイヤー生存率プロットを示している。腹水が発生したら動物を屠殺した。図22Fは、媒体対照、抗マウスαPD-1遮断抗体10mg/kgおよびsPD-1変異体10mg/kgで処置されたB16/OVA黒色腫腫瘍の腫瘍（上図）および脾臓（下図）から単離されたCD4＋およびCD8＋細胞傷害性T細胞の代表的フローサイトメトリードットプロットを示している。図22Gは、媒体対照、抗マウスαPD-1遮断抗体10mg/kgおよびsPD-1変異体10mg/kgで処置されたMC38-hPD-L2腫瘍から単離され解析されたCD8＋T細胞を示している。図22Hは、媒体対照、抗マウスαPD-1遮断抗体10mg/kgおよびsPD-1変異体10mg/kgで処置されたMC38-hPD-L2腫瘍から単離され解析されたCD4＋T細胞を示している。統計解析は、処置群間の比較については一元配置ANOVAを使って行い、経時的に起こる変化については反復ANOVAを使って行った。生存曲線のためにカプラン・マイヤー推定量を計算した。P値＊≦0.05、＊＊≦0.01、＊＊＊≦0.001。
図22Aの説明を参照のこと。
図22Aの説明を参照のこと。
図22Aの説明を参照のこと。
図22Aの説明を参照のこと。
図22Aの説明を参照のこと。
図22Aの説明を参照のこと。
図22Aの説明を参照のこと。
図23A〜23Eは、sPD-1変異体が、PD-L2依存的である卵巣がんモデルにおける腫瘍成長を抑制する能力を有することを示している。図23Aは、PD-L1 KOマウスに接種され、PD-L1発現およびPD-L2発現について染色された、ID8 PD-L1 CRSIPR KO腫瘍を示している。スケールバー100μm。図23Bは、ID8 PD-L1 CRSIPR KO腫瘍を接種した後、媒体対照、抗マウスαPD-L1遮断抗体10mg/kgおよびsPD-1変異体10mg/kgで処置された、C57B/6 PD-L1 KOマウスにおける経時的な皮下腫瘍成長を示している。図23Cは、屠殺時のID8 PD-L1 CRISPR KO腫瘍の総腫瘍重量を表している。図23Dは、ID8 PD-L1 CRISPR KOマウス卵巣腫瘍細胞を同所性に接種して媒体対照、抗マウスαPD-L1遮断抗体10mg/kgおよびsPD-1変異体10mg/kgで処置したC57B/6 PD-L1 KOマウスのカプラン・マイヤー生存解析を表している。腹水が発生したら動物を屠殺した。図23Eは、媒体対照、抗マウスαPD-L1遮断抗体10mg/kgおよびsPD-1変異体10mg/kgで処置されたID8腫瘍におけるPD-L1およびPD-L2のIHC染色。スケールバー100μm。統計解析は、処置群間の比較については一元配置ANOVAを使って行い、経時的に起こる変化については反復ANOVAを使って行った。生存曲線のためにカプラン・マイヤー推定量を計算した。P値＊≦0.05、＊＊≦0.01、＊＊＊≦0.001。
図23Aの説明を参照のこと。
図23Aの説明を参照のこと。
図23Aの説明を参照のこと。
図23Aの説明を参照のこと。
図24A〜24Eは、PD-L1の発現とPD-L2の発現が患者の腫瘍試料において正に相関することを示している。図24Aは卵巣がんにおけるPD-L1発現とPD-L2発現のピアソン相関を表す。
図24Bは食道がんにおけるPD-L1発現とPD-L2発現のピアソン相関を表す。
図24Cは胃がんにおけるPD-L1発現とPD-L2発現のピアソン相関を表す。
図24Dは膠芽腫におけるPD-L1発現とPD-L2発現のピアソン相関を表す。
図24Eは、特異的染色パターンを示す正常扁桃組織上のヒトPD-L1およびヒトPD-L2のIHC染色を示している。
図25A〜25Bは、卵巣がん患者試料および食道がん患者試料におけるCD8発現を表している。図25Aは、卵巣がん標本が1視野あたりのCD8陽性核の数で定量され、腫瘍悪性度分類に従ってグラフ化されたことを示している。
図25Bは、食道がん標本が1視野あたりのCD8陽性核の数で定量され、腫瘍悪性度分類に従ってグラフ化されたことを示している。
優れた結合特徴を呈する変異体クローンの指向的進化ベースのソーティングを表している。最初の2つの選別は、ライブラリーと共にインキュベートするPD-L1の量を逐次的に減少させることによって行った。ソート3からソート6までは、リガンド濃度の減少と速度論的オフ速度（kinetics off-rate）選別戦略との両方の組合せに基づいてスクリーニングされ、ここでは、より低いリガンド濃度の存在下で、および競合物質の存在下、より長いインキュベーション時間で、PD-L1に結合する能力に基づいて、クローンが単離された。各図中のパーセンテージは、ゲートをかけて収集された亜集団に対応する。
図27Aおよび27BはPD-L1およびPD-L2に対するsPD-1変異体V2結合動態の解析を表す。図27Aは、BIAcore T200による、25℃での、PD-L1に対するsPD-1変異体バージョン2結合動態の結合解析を表す。
図27Bは、BIAcore T200による、25℃での、PD-L2に対するsPD-1変異体バージョン2結合動態の結合解析を表す。
図28A〜28FはsPD-1変異体の組換えタンパク質生産を表す。図28Aは、精製された野生型sPD-1 FcのSDS-PAGEを表し、レーン1は還元、レーン2は非還元である。
図28Bは、精製された野生型sPD-1 FcのSEC-HPLC分析を表し、下の表にはエンドトキシンレベルが示されている。
図28Cは、精製されたsPD-1変異体バージョン1のSDS-PAGEを表し、レーン1は還元、レーン2は非還元である。
図28Dは、精製されたsPD-1変異体バージョン1のSEC-HPLC分析を表し、下の表にはエンドトキシンレベルが示されている。
図28Eは、精製されたsPD-1変異体バージョン2のSDS-PAGEを表し、レーン1は還元、レーン2は非還元である。
図28Fは、精製されたsPD-1変異体バージョン2のSEC-HPLC分析を表し、下の表にはエンドトキシンレベルが示されている。
sPD-1変異体とPD-L1の間のタンパク質相互作用ならびにPD-1とPD-L1の結合境界面内の3つの変異のそれぞれについて表面相補性と水素結合の解析を表す。
野生型と変異型のヒトPD-1/PD-L2モデルについてタンパク質相互作用を比較して、PD-1とPD-L2の結合境界面内の2つの変異について表面相補性の解析結果および水素結合を示している。
PD-L2を過剰発現するHep3B細胞に対する野生型sPD-1、PD-1変異体バージョン2およびIgG4の間のFACsベースの解析を表す。
図32A〜32EはMC38細胞におけるヒトPD-L2過剰発現の検証を表す。図32Aは、21のヒトPD-L2個別クローンを発現するMC38細胞のパーセントおよび平均蛍光強度を表す表を示している。
図32Bは30％未満のhPD-L2陽性集団を示すMC38-hPDL2細胞を示している。
図32Cは30％〜50％未満のhPD-L2陽性集団を示すMC38-hPD-L2細胞を示している。
図32Dは50％〜60％のhPD-L2陽性集団を示すMC38-hPD-L2細胞を示している。
図32Eは60％超のhPD-L2陽性集団を示すMC38-hPD-L2細胞を示している。
図33Aおよび33BはHep3B-OS8細胞およびMC38細胞におけるヒトPD-L2発現の検証を表す。図33Aは、ヒトPD-L2過剰発現について陽性である16のcDNAクローンをトランスフェクトしたHep3B-OS8細胞の平均蛍光強度およびパーセントを表す表を示している。右側に陽性クローンを最も低い効率から最も高い効率へと選別した。Ab1は抗ヒトPD-L2抗体であり、Ab2は対照IgGである。
図33Bは、Hep3B親細胞、Hep3B-OS8ベクターのみの細胞、Hep3B-OS8-hPD-L1細胞およびHep3B-OS8-hPD-L2細胞でのPD-L2発現（上図）ならびにMC38親細胞、MC38-hPD-L細胞およびMC38-hPD-L2細胞でのPD-L2発現（下図）を表す。オレンジのヒストグラムは陽性PD-L2発現を表す。
実験の間、媒体対照、sPD-1変異体およびアテゾルズマブ（Atezoluzumab）で処置したMC38-hPD-L1腫瘍を持つマウスの総重量。各処置群についてN＝10。エラーバーは平均および標準偏差を表す。
図35A〜35Bは、抗マウスPD-1抗体およびsPD-1変異体で処置されたMC38親腫瘍モデルにおける腫瘍関連NK細胞およびマクロファージの免疫プロファイルを表す。図35Aは、媒体対照（N＝8）、抗マウスαPD-1抗体（N＝8）およびsPD-1変異体抗体（N＝10）で処置された各動物の腫瘍における陽性NK細胞パーセントを表す。個々のデータポイント、平均および標準偏差が示されている。
図35Bは、媒体対照（N＝8）、抗マウスαPD-1抗体（N＝8）およびsPD-1変異体抗体（N＝10）で処置された各動物の腫瘍における陽性マクロファージパーセントを表す。個々のデータポイント、平均および標準偏差が示されている。
図36Aおよび36Bは、PD-L1 CRISPRトランスフェクション後のPD-L1陰性細胞の単離を表している。図36Aは、PD-L1 CRISPRクローン4（左）およびクローン5（右）トランスフェクション後に選別および収集されたPD-L1陰性ID8細胞を表す。
図36Bは、PD-L1 CRISPRクローン4（左）およびクローン5（右）トランスフェクション後に選別および収集されたPD-L1陰性MC38 PD-L2過剰発現細胞を表す。
各連続選別ラウンドからの濃縮sPD-1ライブラリープールのシーケンシングを表す。最上部に残基番号を列挙し、対応する野生型アミノ酸が与えられている。
最初の変異体PD-1クローン中に存在するアミノ酸変異のイラストマップを表す。すべての変異を使って、それら7つの変異の考えうるパーミュテーション（permutation）を含む128のsPD-1変異体クローンのライブラリーを作製した。
128のsPD-1変異体クローンライブラリーからさらなる結合解析のために選択された上位5つの変異体クローンのリストである。
PD-L1に対する元の変異体sPD-1の用量依存的結合曲線およびKdを表す。
PD-L1に対するクローン＃1の用量依存的結合曲線およびKdを表す。
PD-L1に対するクローン＃2の用量依存的結合曲線およびKdを表す。
PD-L1に対するクローン＃3の用量依存的結合曲線およびKdを表す。
クローン＃4の用量依存的結合曲線およびKdを表す。
PD-L1に対するクローン＃5の用量依存的結合曲線およびKdを表す。
最初の変異体PD-1クローン中に存在するアミノ酸変異のイラストマップを表す。すべての変異を使って、それら7つの変異の考えうるパーミュテーションを含む128のsPD-1変異体クローンのライブラリーを作製した。
128のsPD-1変異体クローンライブラリーから選択された上位5つの変異体クローンのリストであり、ヒトPD-L1に対するKdが列挙されている。
PD-L2に対する元の変異体sPD-1の用量依存的結合曲線、KdおよびBmaxを表す。
PD-L2に対するクローン＃1の用量依存的結合曲線、KdおよびBmaxを表す。
PD-L2に対するクローン＃2の用量依存的結合曲線、KdおよびBmaxを表す。
PD-L2に対するクローン＃3の用量依存的結合曲線、KdおよびBmaxを表す。
PD-L2に対するクローン＃4の用量依存的結合曲線、KdおよびBmaxを表す。
PD-L2に対するクローン＃5の用量依存的結合曲線、KdおよびBmaxを表す。
最初の変異体PD-1クローン中に存在するアミノ酸変異のイラストマップを表す。すべての変異を使って、それら7つの変異の考えうるパーミュテーションを含む128のsPD-1変異体クローンのライブラリーを作製した。
128のsPD-1変異体クローンライブラリーから選択された上位5つの変異体クローンのリストであり、ヒトPD-L2に対するKdが列挙されている。
VI. 発明の詳細な説明
A. 序論
PD-1は免疫および寛容におけるT細胞機能の制御に関与する抑制性細胞表面受容体である。PD-1は、そのリガンド、例えばPD-L1またはPD-L2に結合すると、T細胞エフェクター機能を抑制する。PD-1の構造は1回膜貫通1型膜タンパク質のものである。PD-1はプログラム細胞死1受容体遺伝子（Entrez Gene ID:5133）によってコードされている。ヒトPD-1 mRNA（コード）配列は、例えばGenbankアクセッション番号NM 005018に記載されている。ヒトPD-1ポリペプチド配列は、例えばGenbankアクセッション番号NP＿005009またはUniProt No. Q15116に記載されている。PD-1は、プログラム細胞死1、PDCD1、PD1、CD279、SLEB2、hPD-1およびhSLE-1としても公知である。野生型ヒトPD-1ポリペプチドは288アミノ酸である。シグナルペプチド配列は残基1〜20（図1）であり、ECDは残基21〜170（図1）であり、膜貫通ドメインは残基171〜191であり、細胞内ドメインは残基192〜288である（これはシグナルペプチド領域から始まるナンバリングを使用している。当業者には理解されるであろうが、ナンバリングは、表1のSEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:6に見られるように、成熟配列の最初のアミノ酸を第1アミノ酸位置として使用することに基づくこともできる。すなわちECDドメインが1〜150である場合などもある）。
A. 序論
PD-1は免疫および寛容におけるT細胞機能の制御に関与する抑制性細胞表面受容体である。PD-1は、そのリガンド、例えばPD-L1またはPD-L2に結合すると、T細胞エフェクター機能を抑制する。PD-1の構造は1回膜貫通1型膜タンパク質のものである。PD-1はプログラム細胞死1受容体遺伝子（Entrez Gene ID:5133）によってコードされている。ヒトPD-1 mRNA（コード）配列は、例えばGenbankアクセッション番号NM 005018に記載されている。ヒトPD-1ポリペプチド配列は、例えばGenbankアクセッション番号NP＿005009またはUniProt No. Q15116に記載されている。PD-1は、プログラム細胞死1、PDCD1、PD1、CD279、SLEB2、hPD-1およびhSLE-1としても公知である。野生型ヒトPD-1ポリペプチドは288アミノ酸である。シグナルペプチド配列は残基1〜20（図1）であり、ECDは残基21〜170（図1）であり、膜貫通ドメインは残基171〜191であり、細胞内ドメインは残基192〜288である（これはシグナルペプチド領域から始まるナンバリングを使用している。当業者には理解されるであろうが、ナンバリングは、表1のSEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:6に見られるように、成熟配列の最初のアミノ酸を第1アミノ酸位置として使用することに基づくこともできる。すなわちECDドメインが1〜150である場合などもある）。
当技術分野では公知のとおり、PD-1に結合してPD-L1受容体またはPD-L2受容体のどちらかへのPD-1の結合を遮断し、免疫抑制の低減をもたらして免疫活性化を達成する治療用抗体は、いくつかある。これらの抗体には、キイトルーダ（KEYTRUDA（登録商標））およびオプジーボ（OPDIVO（登録商標））があり、他にもいくつかが臨床において試験されている。同様に、類似する機序および治療効果をもたらすことが認められているテセントリク（TECENTRIQ（登録商標））などの抗PD-L1抗体もある。
本発明は、類似する生物学的機能および治療効果を達成するためにバリアントを含むヒトPD-1のECDを使用する新規な機序に関する。したがって本発明は融合タンパク質を提供する。本明細書記載の融合タンパク質は2つの一般的機能成分を含む。第1成分は、ヒトPD-1の可溶性ECDのバリアント（以下「sPD-1バリアント」という）を含む。sPD-1バリアントは、PD-L1および/またはPD-L2に対する結合アフィニティーならびにタンパク質の安定性を増加させるのに役立つ。第2成分は、ヒトIgGタンパク質、例えばヒトIgG4の、融合タンパク質としてのsPD-1バリアントの半減期を有意に増加させるための、Fcドメインである。これらの2つの成分またはドメインを、一般に、例えば本明細書に概説するグリシン-セリンリンカーなどのドメインリンカーを使って連結することで、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質が形成される。
本明細書において、sPD-1バリアントドメインは、PD-1リガンド、すなわちPD-L1および/またはPD-L2に結合してそれらを遮断/拮抗し、ヒトIgGタンパク質のヒンジドメイン（ヒンジドメインおよび他の任意選択のリンカーを含んでもよい）に連結される。sPD-1バリアントは、PD-L1および/またはPD-L2の競合的拮抗薬として作用し、免疫チェックポイントPD-1経路を遮断し、PD-1受容体を介したシグナル伝達を妨げることができる。したがって、本明細書において提供する組成物および方法は、T細胞抑制性シグナルを遮断し、免疫が媒介する抗腫瘍活性につながる。また、本組成物および方法は、感染症、例えば慢性感染症を患っている対象における免疫応答を活性化し、強化しまたは増加させることができる。本発明は、がんまたは感染症を持つ患者におけるT細胞応答を刺激するための、例えばT細胞増殖を刺激し、T細胞活性化を増加させ、および/またはT細胞抑制性シグナルを低減するための、組成物および方法を提供する。
B. 定義
本明細書において使用する場合、以下の用語は、別段の指定がある場合を除き、それらに割り当てられた意味を有する。
本明細書において使用する場合、以下の用語は、別段の指定がある場合を除き、それらに割り当てられた意味を有する。
本明細書において使用する「a」、「an」または「the」という用語は、メンバーが1つである局面を包含するだけでなく、メンバーが2つ以上である局面も包含する。例えば、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞」（a cell）と書いた場合、それは複数のそのような細胞を包含し、「作用物質」（the agent）と書いた場合、それは、当業者に公知の1つまたは複数の作用物質を包含する、などとなる。
本明細書において使用する場合、「タンパク質」とは、本明細書では、共有結合された少なくとも2つのアミノ酸を意味し、これにはタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。
「単離された」という用語はその自然環境を本質的に伴わない分子を指す。例えば、単離されたタンパク質は、それが由来する細胞源または組織源からの細胞性の物質または他のタンパク質を本質的に含まない。「単離された」という用語は、単離されたタンパク質が薬学的組成物として投与するのに十分な純度を有する、または少なくとも約70〜80％、80〜90％もしくは90〜95％（w/w）純粋な、または少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％（w/w）純粋な、調製物も指す。
「リガンド」という用語は、標的細胞の表面に存在する受容体などといった第2の生体分子に結合して、それとの複合体を形成することで、生物学的目的に役立つことができる生体分子を指す。リガンドは一般に、標的タンパク質上の部位に、例えばイオン結合、水素結合、疎水性相互作用、双極子-双極子結合、またはファンデルワールス力などといった分子間力によって結合するエフェクター分子である。本発明のsPD-1バリアントは、PD-L1および/またはPD-L2などのPD-1リガンドに結合し、それとの複合体を形成することができる。
「受容体」という用語は、標的細胞の表面に存在する生体分子であって、リガンドなどといった第2の生体分子に結合し、それとの複合体を形成することができるものを指す。受容体は一般に特異的シグナル伝達経路を活性化する。PD-L1およびPD-L2は細胞表面受容体の例である。
本明細書にいう「位置」とはタンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、逐次的に、または確立された方式、例えばEUインデックスに従って、ナンバリングされうる。本発明のいくつかの態様において、位置は、成熟タンパク質の最初のアミノ酸から出発して逐次的にナンバリングされる。
本明細書において「アミノ酸改変」（amino acid modification）とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入および/または欠失を意味する。
本明細書において「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定位置にあるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味する。特に、いくつかの態様では、置換が、その特定位置に天然には存在しないアミノ酸、その生物内では天然に存在しないかまたはどの生物においても天然には存在しないアミノ酸への置換である。例えば置換S228Pとは、バリアントポリペプチド、この場合は位置228のセリンがプロリンで置き換えられているヒトIgG4のFcバリアントを指す。明確な説明のために述べると、核酸コード配列は変化させるが出発アミノ酸を変化させないように工学的に操作されたタンパク質（例えば宿主生物発現レベルを増加させるためにCGG（アルギニンをコードする）をCGA（やはりアルギニンをコードする）と交換する）は「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の作出にもかかわらず、タンパク質がその特定位置において元のタンパク質と同じアミノ酸を有するのであれば、それはアミノ酸置換ではない。
本明細書において使用する「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定位置におけるアミノ酸配列の付加を意味する。例えば-233Eまたは233Eは、位置233の後かつ位置234の前へのグルタミン酸の挿入を意味する。さらに、-233ADEまたはA233ADEは、位置233の後かつ位置234の前へのAlaAspGluの挿入を意味する。
本明細書において使用する「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定位置におけるアミノ酸配列の除去を意味する。例えばE233-またはE233＃、E233（）またはE233delは、位置233におけるグルタミン酸の欠失を意味する。さらに、EDA233-またはEDA233＃は、位置233で始まる配列GluAspAlaの欠失を意味する。
本明細書において使用する「親ポリペプチド」とは、バリアントを生成させるためにこれから改変される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドのバリアントもしくは工学的に操作されたバージョンでありうる。親ポリペプチドとは、ポリペプチドそのもの、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指しうる。したがって本明細書にいう「親免疫グロブリン」は、バリアントを生成させるために改変される無改変免疫グロブリンポリペプチドを意味する。この文脈において「親Fcドメイン」とは具陳したバリアントとの対比であり、したがって「バリアントヒトIgG Fcドメイン」はヒトIgGの親Fcドメインと比較され、例えば「バリアントヒトIgG4 Fcドメイン」はヒトIgG4の親Fcドメインと比較される、などである。
本明細書にいう「野生型またはWT」は、自然界に見いだされるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、アレルバリアントを含む。WTタンパク質は意図的には改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
本明細書にいう「バリアントタンパク質」または「タンパク質バリアント」または「バリアント」は、少なくとも1つのアミノ酸改変ゆえに親タンパク質とは異なっているタンパク質を意味する。いくつかの態様において、親タンパク質はヒト野生型配列である。いくつかの態様において、親タンパク質はバリアントを持つヒト配列である。タンパク質バリアントとは、タンパク質そのもの、そのタンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指しうる。好ましくは、タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変、例えば親と比較して約1個〜約20個のアミノ酸改変、好ましくは約1個〜約8個のアミノ酸改変を有する。本明細書におけるタンパク質バリアント配列は、親タンパク質配列に対して、好ましくは少なくとも約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有し、最も好ましくは少なくとも約90％の同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約95％/97％/98％/99％の同一性を有する。2つの類似する配列（例えばsPD-1可変ドメイン）間の配列同一性は、Smith,T.F.＆Waterman,M.S.（1981）「Comparison Of Biosequences」Adv. Appl. Math. 2:482のアルゴリズム［局所相同性アルゴリズム］、Needleman,S.B.＆Wunsch,CD.（1970）「A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins」J. Mol. Biol. 48:443のアルゴリズム［相同性アラインメントアルゴリズム］、Pearson,W.R.＆Lipman,D.J.（1988）「Improved Tools For Biological Sequence Comparison」Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）85:2444のアルゴリズム［類似性検索法（search for similarity method）］またはAltschul,S.F.et al,（1990）「Basic Local Alignment Search Tool」J. Mol. Biol. 215:403-10のアルゴリズム、すなわち「BLAST」アルゴリズム、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi参照、などといったアルゴリズムによって測定することができる。前述のアルゴリズムはどれを使用する場合も、デフォルトのパラメータ（Window length、gap penaltyなどについて）を使用する。一態様において、配列同一性は、BLASTアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使って行われる。
本明細書にいう「IgGバリアント」または「バリアントIgG」は、少なくとも1つのアミノ酸改変により、親IgG（多くの場合、これもヒトIgG配列に由来する）とは相違する抗体を意味する。
本明細書にいう「Fcバリアント」または「バリアントFc」は、親Fcドメインとの比較で少なくとも1つのアミノ酸改変を含むタンパク質を意味する。いくつかの態様において、親Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4由来のFc領域など、ヒト野生型Fc配列である。したがって「バリアントヒトIgG4 Fcドメイン」とは、ヒトIgG4 Fcドメインとの比較でアミノ酸改変（一般的にはアミノ酸置換）を含有しているものであり、例えばS241PまたはS228Pは親IgG4ヒンジポリペプチドに対して位置228に置換プロリンを持つヒンジバリアントであり、ここで、S228PというナンバリングはEUインデックスに従っており、S241PはKabatナンバリングである。EUインデックス、すなわちKabatナンバリングスキームもしくはEUナンバリングスキームなどにいうEUインデックスは、EUナンバリングを指す（参照により本明細書に完全に組み入れられるSEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5th edition,NIH publication,No. 91-3242,E. A. Kabat et alを参照されたい。また、参照により本明細書に組み入れられるEdelman et al. ,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85も参照されたい）。いくつかの態様において、親Fcドメインは、バリアントを持つヒトFc配列である。ヒトIgGのFcドメインに関して本発明で議論する位置のいずれについても、別段の注記がある場合を除き、アミノ酸位置ナンバリングはEUインデックスに従う。改変は、本明細書において概説するように、付加、欠失、置換またはそれらの任意の組合せであることができる。あるいは、バリアントFcドメインは、親Fcドメインとの比較で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変を有することができる。加えて、本明細書において述べるとおり、本明細書におけるバリアントFcドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書記載の公知の技法を使って測定した場合に、もう一つのFcドメインと二量体を形成する能力およびFcRn受容体に結合する能力を依然として保っている。
本明細書において、「可溶性PD-1」または「sPD-1」という用語は、プログラム細胞死1（PD-1）ポリペプチドの可溶性部分であって、細胞外ドメイン（ECD）またはそのフラグメントもしくはトランケートされたバージョンを含有するが、PD-1の膜貫通ドメインや細胞質（細胞内）ドメインは含有しないものを意味する。ヒト野生型PD-1のECDは図1の残基21〜170で示され、表1にSEQ ID NO:1としても示されている。いくつかの態様において、親野生型sPD-1ドメインは、トランケートされた野生型sPD-1が生物学的活性、例えばPD-L1および/またはPD-L2への結合を保持している限り、N末端および/またはC末端トランケーションを有することができる。
「sPD-1バリアント」という用語は野生型sPD-1のバリアントを指す。sPD-1バリアントは、PD-L1および/またはPD-L2などのPD-1リガンドに対する特異的結合を保っているが、アミノ酸置換を有し、野生型sPD-1との比較でN末端またはC末端トランケーションを有することができる。この場合、特異的結合は、ELISA、Biacore、Sapidyne KinExAまたはフローサイトメトリー結合アッセイなど、標準的結合アッセイによって決定されるものであり、これらのアッセイは結合アフィニティーを決定するためにも使用することができる。本明細書において述べるように、sPD-1バリアントは、場合によっては、野生型sPD-1との比較で増加した結合アフィニティーを有しうる。
「結合アフィニティー」という用語は、あるタンパク質、例えば受容体またはそのバリアントとの協調的結合（coordinated bond）を形成するリガンドまたはそのバリアントの能力を指す。リガンドとタンパク質の間の結合アフィニティーは、リガンドとタンパク質（例えば受容体またはそのバリアント）の間のkoff/konの比である平衡解離定数（KD）によって表される。KDと結合アフィニティーは逆相関する。例えばKD値は、PD-1リガンドに結合するのに必要なsPD-1バリアントの濃度を説明し、低いKD値（低いPD-1バリアント濃度）ほど、PD-1リガンドに対する高い結合アフィニティーに対応する。高い結合アフィニティーは、リガンドとタンパク質の間の、より強い分子間力に対応する。低い結合アフィニティーは、リガンドとタンパク質の間の、より弱い分子間力に対応する。場合によっては、リガンド結合アフィニティーの増加が、オフ速度の減少、例えば少なくとも10分の1、少なくとも20分の1、少なくとも50分の1、少なくとも100分の1、少なくとも200分の1、少なくとも500分の1への、またはそれ以上の減少として表されることもある。
PD-L1および/またはPD-L2に結合するsPD-1バリアントの能力は、例えばアッセイプレート上にコーティングされたPD-L1および/またはPD-L2に結合する推定上のリガンドの能力によって決定することができる。一態様において、PD-L1および/またはPD-L2に対するsPD-1バリアントの結合活性は、リガンド、例えばPD-L1および/またはPD-L2を固定化するか、sPD-1バリアントを固定化することによって、アッセイすることができる。例えばアッセイでは、Hisタグに融合されたPD-L1および/またはPD-L2を、Ni活性化NTA樹脂ビーズに固定化することができる。作用物質を適当な緩衝液に入れて加え、ビーズを所与の温度で、ある期間にわたってインキュベートすることができる。未結合の材料を除去するための洗浄後に、結合しているタンパク質を、例えばSDS、高いpHを持つ緩衝液などで遊離させて、解析することができる。
あるいは、PD-L1および/またはPD-L2に対するsPD-1バリアントの結合アフィニティーは、sPD-1バリアントを微生物細胞表面、例えば酵母細胞表面にディスプレイし、結合した複合体を例えばフローサイトメトリーで検出することによって、決定することができる。PD-1リガンドに対するsPD-1の結合アフィニティーは、当技術分野において認識されている任意の公知の方法、例えば限定するわけではないが、実施例に記載する方法、放射性リガンド結合アッセイ、非放射性（蛍光）リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴（SPR）、例えばBiacore（商標）、Octet（商標）、プラズモン導波路共鳴（PWR）、熱力学的結合アッセイ、全細胞リガンド結合アッセイおよび構造ベースのリガンド結合アッセイ（structure-based ligand binding assay）などを使って決定することができる。
特定リガンドまたはそのバリアントに対する「特異的結合」、特定リガンドまたはそのバリアントに「特異的に結合する」、特定リガンドまたはそのバリアントに対して「特異的である」とは、非特異的相互作用とは測定可能に相違する結合を意味する。特異的結合は、例えば、ある分子の結合を、一般に構造は類似しているが結合活性を有しない分子である対照分子の結合と比較して決定することによって測定することができる。例えば特異的結合は標的に似た対照分子との競合によって決定することができる。いくつかの態様において、結合アフィニティーは、上述のように当技術分野におけるアッセイ、例えば標準的Biacoreアッセイを使って測定される。
特定リガンドまたはそのバリアントに対する特異的結合は、別のリガンドタンパク質に対して少なくとも約10-4M、少なくとも約10-5M、少なくとも約10-6M、少なくとも約10-7M、少なくとも約10-8M、少なくとも約10-9M、あるいは少なくとも約10-10M、少なくとも約10-11M、少なくとも約10-12M、またはそれを超えるKDを有するタンパク質が呈するものであることができ、ここでKDは特定タンパク質-リガンド相互作用の解離速度を表す。典型的には、リガンドに特異的に結合するタンパク質は、当該タンパク質と比較して、対照分子に対して20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍またはそれを超えるKDを有するだろう。
本明細書にいう使用する「残基」とは、タンパク質中の位置およびそれに関連するアミノ酸の実体を意味する。例えばアスパラギン297（Asn297またはN297ともいう）は、ヒト抗体IgG1中の位置297にある残基である。
本明細書にいう「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、抗体の第1定常ドメインと第2定常ドメインとの間にあるアミノ酸を含むフレキシブルなポリペプチドを意味する。構造的には、IgG CH1ドメインはEU位置215で終わり、IgG CH2ドメインは残基EU位置231から始まる。したがってIgGの場合、抗体ヒンジは、本明細書では、位置216（IgG1ではE216）から位置230（IgG1ではp230）までを含むと定義され、ここでナンバリングはKabatなどでいうEUインデックスによる。場合により、ヒンジドメインのN末端およびC末端のどちらか一方または両方に含まれるアミノ酸数が少ない「ヒンジフラグメント」が使用される。本明細書において概説するように、場合によっては、ヒンジを含むFcドメインが使用され、その場合、ヒンジは一般にフレキシブルなリンカーとして使用される。（さらに、本明細書においてさらに記載するとおり、さらなるフレキシブルなリンカー成分をヒンジと共にまたはヒンジなしで使用することができる）。
本明細書にいう「Fc」または「Fc領域」または「Fcドメイン」は、IgG分子のCH2-CH3ドメインを含み、場合によってはヒンジを含む、ポリペプチドを意味する。ヒトIgG1のEUナンバリングでは、CH2-CH3ドメインはアミノ酸231〜447を含み、ヒンジは216〜230である。したがって「Fcドメイン」の定義には、アミノ酸231〜447（CH2-CH3）またはアミノ酸216〜447（ヒンジ-CH2-CH3）の両方、またはそれらのフラグメントが含まれる。したがってFcとは、IgA、IgDおよびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、IgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、場合によっては、これらのドメインのN末端側にあるフレキシブルなヒンジを含む。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含みうる。IgGの場合、Fcドメインは免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3を含み、場合によっては、Cγ1とCγ2の間に下部ヒンジ領域（lower hinge region）を含む。この文脈において「Fcフラグメント」は、N末端およびC末端のどちらか一方または両方に含まれるアミノ酸が少なくてもよいが、それでもなお、標準的な方法、一般的にはサイズに基づく方法（例えば非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を使って検出することができるように、もう一つのFcドメインまたはFcフラグメントとの二量体を形成する能力を保つ。ヒトIgG Fcドメインは本発明では特に有用であり、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4からのFcドメインであることができる。一般に、IgG3よりもIgG1、IgG2およびIgG4の方がよく使用される。いくつかの態様では、例えば1つもしくは複数のFcγR受容体またはFcRn受容体への結合を改変するために、および/またはインビボでの半減期を増加させるために、Fc領域にはアミノ酸改変が加えられる。
本明細書にいう「IgGサブクラス改変」または「アイソタイプ改変」とは、あるIgGアイソタイプのあるアミノ酸を、アラインメントされた異なるIgGアイソタイプ中の対応するアミノ酸に変換するアミノ酸改変を意味する。例えばEU位置296にIgG1はチロシンを含み、IgG2はフェニルアラニンを含むので、IgG2におけるF296Y置換は、IgGサブクラス改変であるとみなされる。同様に、IgG1は位置241にプロリンを有し、IgG4はそこにセリンを有するので、S241Pを持つIgG4分子はIgGサブクラス改変とみなされる。サブクラス改変は本明細書ではアミノ酸置換とみなされることに留意されたい。
本明細書にいう「天然には存在しない改変」とはアイソタイプ改変ではないアミノ酸改変を意味する。例えば、位置297にアスパラギンを含むIgGはないので、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4（またはそれらのハイブリッド）における置換N297Aは、天然には存在しない改変とみなされる。
本明細書にいう「アミノ酸」および「アミノ酸の実体（amino acid identity）」は、DNAおよびRNAによってコードされている20種の天然に存在するアミノ酸のうちの1つを意味する。
本明細書にいう「エフェクター機能」は、抗体Fc領域とFc受容体またはリガンドとの相互作用に起因する生化学的イベントを意味する。エフェクター機能としてはADCC、ADCPおよびCDCが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。多くの場合、異なるIgGアイソタイプ（例えばIgG4）を使用するか、Fcドメイン中のアミノ酸置換を使って、エフェクター機能の大半またはすべてを除去することが望ましいが、FcRn受容体への結合は残しておくことが望ましい。というのも、これはヒト血清における融合タンパク質の半減期に寄与するからである。
本明細書にいう「Fcガンマ受容体」、「FcγR」または「FcガンマR」は、FcγR遺伝子によってコードされていてIgG抗体Fc領域に結合するタンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトの場合、このファミリーには、限定するわけではないが、アイソフォームFcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）;アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131およびR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）;ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIb-NA1およびFcγRIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）（Jefferis et al. ,2002,Immunol Lett 82:57-65、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、ならびに未発見のヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはFcγRアロタイプが含まれる。FcγRは、限定するわけではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む任意の生物に由来しうる。マウスFcγRには、限定するわけではないが、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）およびFcγRIII-2（CD16-2）、ならびに未発見の任意のマウスFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはFcγRアロタイプが含まれる。
本明細書にいう「FcRn」または「新生児型Fc受容体」は、IgG抗体Fc領域に結合し、少なくとも一部はFcRn遺伝子によってコードされているタンパク質を意味する。
本明細書にいう「リンカー」または「リンカーペプチド」は、2つの分子を、それらが所望の活性を保持するように、それらが互いに対して正しいコンフォメーションをとるような形で連結するのに十分である長さを有する。リンカーまたはリンカーペプチドは、主として、以下のアミノ酸残基を含みうる:Gly、Ser、AlaまたはThr。一態様において、リンカーは約1〜50アミノ酸長、好ましくは約1〜30アミノ酸長である。一態様では、1〜20アミノ酸長のリンカーを使用することができ、いくつかの態様では約4〜約10アミノ酸が有用である。有用なリンカーとして、グリシン-セリンポリマー、例えば(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nであって、nが少なくとも1（一般的には3〜4）の整数であるもの、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および他のフレキシブルなリンカーが挙げられる。あるいは、さまざまな非タンパク質性ポリマー、例えば限定するわけではないが、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーも、リンカーとして役立ちうる。
いくつかの態様において、リンカーは、例えばsPD-1バリアントドメインを（バリアント）Fcドメインに連結するためなど、本明細書において概説する任意の2つのドメインを一つに連結するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの態様が、グリシン-セリンポリマー、例えば(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nであって、nが少なくとも1（一般的には3から4〜5）の整数であるもの、ならびに2つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列であって、各ドメインがその生物学的機能を保つことが可能であるように十分な長さと柔軟性を持つものを利用する。本明細書において述べるとおり、特に有用なドメインリンカーは、IgG4のヒンジドメインに接合されるGGGGSリンカーである。
本明細書にいう「標的細胞」は、標的ポリペプチドまたは標的タンパク質を発現する細胞を意味する。
本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の生産に関連して「宿主細胞」とは、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の成分をコードする外因性核酸を含有し、適切な条件下でそのようなFc融合タンパク質を発現する能力を有する細胞を意味する。適切な宿主細胞については後述する。
本明細書にいう「改良された活性」または「改良された機能」とは、少なくとも1つの生化学的特性の望ましい変化を意味する。この文脈における改良された機能は、望ましい特性の増加（例えばPD-L1および/またはPD-L2に対する増加した結合アフィニティーおよび/または特異性、融合タンパク質の増加した安定性、インビボでの増加した半減期など）に伴って、特定の活性の増加パーセントもしくは減少パーセントとして、または「倍率」変化として、測定することができる。一般に、パーセント変化は100％未満の生化学的活性の変化を記述するために使用され、倍率変化は（親タンパク質との比較で）100％を上回る生化学的活性の変化を記述するために使用される。本発明では、生化学的活性の少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％および99％の変化（通常は増加）パーセントを達成することができる。本発明において、「倍率増加」（または減少）は親タンパク質との比較で測定される。多くの態様において、改良は、少なくとも1と10分の1倍（1.1）、1と0.5倍（1.5倍）、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、200倍またはそれ以上である。例えば図8に示すように、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、親WT PD-1-Fc融合タンパク質（「親Fc融合タンパク質」）と比べてPD-L1結合に約10,000倍の改良を、また親Fc融合タンパク質と比べてPD-L2結合に約200倍の改良を示した。
C. 可溶性PD-1バリアント-Fc融合タンパク質
本明細書に記載するとおり、本発明の可溶性PD-1バリアント-Fc融合タンパク質（「sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質」）は、sPD-1バリアントドメイン、Fcドメイン、および任意でsPD-1バリアントドメインをFcドメインと連結するリンカーを含む。
本明細書に記載するとおり、本発明の可溶性PD-1バリアント-Fc融合タンパク質（「sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質」）は、sPD-1バリアントドメイン、Fcドメイン、および任意でsPD-1バリアントドメインをFcドメインと連結するリンカーを含む。
本明細書に記載するとおり、融合タンパク質のフォーマットは、成分ドメインが（N末端からC末端に向かって）タンパク質内での順序を入れ替えることで、いくつかの構成をとることができる。一態様において、融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、sPD-1バリアントドメイン-ドメインリンカー-Fcドメインを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、Fcドメイン-ドメインリンカー-sPD-1バリアントドメインを含む。いくつかの態様では、リンカーが使用されず、その場合、融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、sPD-1バリアントドメイン-FcドメインまたはFcドメイン-sPD-1バリアントドメインのどちらか一方を含む。場合によっては、同じ融合タンパク質でも多少異なる分類が可能であることに留意されたい。例えばFcドメインがヒンジドメインを含む場合には、sPD-1バリアントドメイン-Fcドメインを含む融合タンパク質であっても、ヒンジドメインの形態でリンカーを含む。あるいは、これと同じタンパク質がFcドメイン中に含まれるヒンジドメインを有しない場合もあり、その場合、融合タンパク質はsPD-1バリアントドメイン-CH2-CH3を含む。
このように、いくつかの態様において本発明は、本明細書記載のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質であって、Fcドメインがヒンジドメインを含み、sPD-1バリアントドメインがヒンジドメインによってFcドメインと連結されているもの、すなわちsPD-1バリアントドメイン-ヒンジドメイン-CH2-CH3を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質であって、Fcドメインがヒンジドメインを含み、sPD-1バリアントドメインが本明細書に記載する追加のリンカーによってFcドメインと連結されているものを提供する。すなわち、融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、sPD-1バリアントドメイン-ドメインリンカー-ヒンジドメイン-CH2-CH3、sPD-1バリアントドメイン-ドメインリンカー-CH2-CH3、ヒンジドメイン-CH2-CH3-ドメインリンカー-sPD-1バリアントドメインまたはCH2-CH3-ドメインリンカー-sPD-1バリアントであることができる。
いくつかの態様において、本発明は、上述のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質であって、Fcドメインがヒンジドメインを含まず、sPD-1バリアントドメインが本明細書記載のドメインリンカー（例えば非ヒンジ）によってFcドメインと連結されているものを提供する。
1. sPD-1バリアントドメイン
本発明のsPD-1バリアントドメインはバリアントを持つヒトPD-1の可溶性ECDを含む。sPD-1バリアントは、Biacoreアッセイなどの当技術分野における結合アフィニティーアッセイで決定した場合に、野生型PD-1と比較してPD-L1および/またはPD-L2に対する結合アフィニティーおよび/または特異性を増加させるのに役立つ。
本発明のsPD-1バリアントドメインはバリアントを持つヒトPD-1の可溶性ECDを含む。sPD-1バリアントは、Biacoreアッセイなどの当技術分野における結合アフィニティーアッセイで決定した場合に、野生型PD-1と比較してPD-L1および/またはPD-L2に対する結合アフィニティーおよび/または特異性を増加させるのに役立つ。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアントは、PD-1リガンド（例えばPD-L1および/またはPD-L2）に結合してそれを遮断し、それによってその受容体PD-1に対するリガンドの結合を妨害または阻害する拮抗薬である。これらの拮抗薬は、PD-1受容体への結合に利用することができるリガンドの量を低減することで、PD-1によって媒介されるシグナル伝達経路を抑制することにより、免疫応答を強化することができる。したがって、対象は、より頑健な免疫応答を生じさせることができる。
場合により、有用なsPD-1バリアントドメインは、標的細胞上の、例えばがん細胞上の、PD-L1および/またはPD-L2に特異的に結合し、それによって、PD-L1/PD-L2とPD-1（例えば免疫細胞上の、例えばT細胞上の、野生型PD-1）との間の相互作用を低減（例えば遮断、防止など）する。したがって、本明細書において提供されるsPD-1バリアントは、PD-L1および/またはPD-L2に対して、工学的に操作されたデコイ受容体として作用することができる。sPD-1バリアントドメインは、PD-L1および/またはPD-L2と野生型PD-1との間の相互作用を低減することにより、PD-L/PD-1相互作用によって生じる免疫抑制性シグナルを減少させることができ、それゆえに、免疫応答を（例えばT細胞活性化を増加させることによって）増加させることができる。適切なsPD-1バリアントドメインは、通常はシグナル配列と膜貫通ドメインとの間にある、PD-1リガンドに認識可能なアフィニティーで、例えば高いアフィニティーで結合するのに十分なPD-1の部分を含むか、または結合活性を保っているそのフラグメントを含むことができる。
指定されたタンパク質/タンパク質ドメインの名前および対応するSEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を、それぞれ表1に列挙する。
（表１）配列番号、説明および対応するアミノ酸配列
いくつかの態様において、sPD-1バリアントは、SEQ ID NO:1に記載するWT PD-1ドメインに対して、野生型PD-1との比較でPD-L1、PD-L2のどちらかまたはその両方へのその結合を増加させまたは強化するアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入またはそれらの任意の組合せを含む。
本発明は、成熟領域から始まる配列ナンバリングを使って、SEQ ID NO:1のヒト野生型親PD-1ドメインとの比較で、位置120、112、107、104、67、69、96および42に対応する1つまたは複数の（例えば数個の）位置に、少なくとも1つのアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメインを提供する。いくつかの態様において、sPD-1バリアントは、親PD-1ドメインに対して、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％かつ100％未満である配列同一性を有する。いくつかの態様において、親PD-1ドメインはSEQ ID NO:1である。好ましい一態様において、sPD-1バリアントドメインは、SEQ ID NO:1に対して、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％かつ100％未満である配列同一性を有する。いくつかの態様において、本明細書に注記するように、バリアントsPD-1ドメインは、トランケートされたバリアントsPD-1が生物学的活性（例えばPD-L1および/またはPD-L2への結合）を保っている限り、野生型sPD-1と比較してN末端トランケーションおよび/またはC末端トランケーションを有することができる。明確に述べると、本発明のsPD-1バリアントは少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、したがってSEQ ID NO:1を有しない。
本発明は、SEQ ID NO:1のヒト野生型親PD-1 ECDドメインとの比較で、位置42、67、69、96、104、107、112および120に対応する1つまたは複数の（例えば数個の）位置に少なくとも1つのアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメインを提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントドメインは、表10に示すように、該位置のうちの1つ、該位置のうちの2つ、該位置のうちの3つ、該位置のうちの4つ、該位置のうちの5つ、該位置のうちの6つ、該位置のうちの7つまたは該位置のうちの8つに、アミノ酸置換を有する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較で、A120V、A112I、S107V、G104S、S67G、P69L、N96SおよびS42Gからなる群より選択されるアミノ酸置換のうちの1つまたは複数を含むsPD-1バリアントドメインを提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較で以下からなる群より選択されるアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメインを提供する:
。いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較で、S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V、P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、S67G/G104S/S107V/A112I/A120V、S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、G104S/S107V/A112I/A120VおよびG104S/S107V/A112Iからなる群より選択されるアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメインを提供する。いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較でS42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメイン、および本明細書に開示するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較でS42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメイン、および本明細書に開示するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較でP69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメイン、および本明細書に開示するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較でS67G/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメイン、および本明細書に開示するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較でS67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメイン、および本明細書に開示するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較でG104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメイン、および本明細書に開示するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1との比較でG104S/S107V/A112Iのアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメイン、および本明細書に開示するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:2を有するsPD-1バリアントドメイン、およびSEQ ID NO:2と、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:3を有するsPD-1バリアントドメイン、およびSEQ ID NO:3と、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:5を有するsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO:6を有するsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントドメインは、成熟領域から始まる位置ナンバリングで位置42におけるセリンのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、置換は、他の19種の天然アミノ酸スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシンのうちのいずれかによる置換であり、いくつかの態様ではシステイン（ジスルフィド形成が考えられるため）またはプロリン（立体効果のため）を利用しない。いくつかの態様において、アミノ酸置換はS42Gである。いくつかの態様において、本発明は、本明細書記載のsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントドメインは、成熟領域から始まる位置ナンバリングで位置67におけるセリンのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、置換は、他の19種の天然アミノ酸スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシンのうちのいずれかによる置換であり、いくつかの態様ではシステイン（ジスルフィド形成が考えられるため）またはプロリン（立体効果のため）を利用しない。いくつかの態様において、アミノ酸置換はS67Gである。いくつかの態様において、本発明は、本明細書記載のsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントドメインは、成熟領域から始まる位置ナンバリングで位置69におけるプロリンのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、置換は、他の19種の天然アミノ酸セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシンのうちのいずれかによる置換であり、いくつかの態様ではシステイン（ジスルフィド形成が考えられるため）を利用しない。いくつかの態様において、アミノ酸置換はP69Lである。いくつかの態様において、本発明は、本明細書記載のsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントドメインは、成熟領域から始まる位置ナンバリングで位置96におけるアスパラギンのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、置換は、他の19種の天然アミノ酸セリン、スレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシンのうちのいずれかによる置換であり、いくつかの態様ではシステイン（ジスルフィド形成が考えられるため）またはプロリン（立体効果のため）を利用しない。いくつかの態様において、アミノ酸置換はN96Sである。いくつかの態様において、本発明は、本明細書記載のsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントドメインは、成熟領域から始まる位置ナンバリングで位置104におけるグリシンのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、置換は、他の19種の天然アミノ酸セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシンのうちのいずれかによる置換であり、いくつかの態様ではシステイン（ジスルフィド形成が考えられるため）またはプロリン（立体効果のため）を利用しない。いくつかの態様において、アミノ酸置換はG104Sである。いくつかの態様において、本発明は、本明細書記載のsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントドメインは、成熟領域から始まる位置ナンバリングで位置107におけるセリンのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、置換は、他の19種の天然アミノ酸スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシンのうちのいずれかによる置換であり、いくつかの態様ではシステイン（ジスルフィド形成が考えられるため）またはプロリン（立体効果のため）を利用しない。いくつかの態様において、アミノ酸置換はS107Vである。いくつかの態様において、本発明は、本明細書記載のsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントドメインは、成熟領域から始まる位置ナンバリングで位置112におけるアラニンのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、置換は、他の19種の天然アミノ酸セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシンのうちのいずれかによる置換であり、いくつかの態様ではシステイン（ジスルフィド形成が考えられるため）またはプロリン（立体効果のため）を利用しない。いくつかの態様において、アミノ酸置換はA112Iである。いくつかの態様において、本発明は、本明細書記載のsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントドメインは、成熟領域から始まる位置ナンバリングで位置120におけるアラニンのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、置換は、他の19種の天然アミノ酸セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシンのうちのいずれかによる置換であり、いくつかの態様ではシステイン（ジスルフィド形成が考えられるため）またはプロリン（立体効果のため）を利用しない。いくつかの態様において、アミノ酸置換はA120Vである。いくつかの態様において、本発明は、本明細書記載のsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を提供する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントタンパク質は完全長ECDより短い。いくつかの態様において、sPD-1バリアントは、本明細書において概説する結合アッセイのうちの1つによって測定した場合に、トランケートされた形態がヒトPD-L1および/またはヒトPD-L2に結合する能力を保っている限りにおいて、ECDのトランケートされたバージョンを含みうる。当技術分野において公知であるように、N末端トランケーションおよびC末端トランケーションはどちらも可能であり、例えばSEQ ID NO:1の残基1、5、10、15、20、25、30、33、35、40、45または50前後から残基130、135、140、145、149または150前後まで、例えば残基33〜150である。場合によっては、数個のアミノ酸（例えば1、2、3、4、5または6個）だけが、活性が保持される限りにおいて、N末端およびC末端のどちらか一方または両方から除去される。
いくつかの態様において、本明細書記載のsPD-1バリアントは、PD-1リガンド（すなわちPD-L1および/またはPD-L2）に対して、野生型PD-1ポリペプチド/ドメインよりも良い結合アフィニティーを有する。いくつかの態様において、sPD-1バリアントは、PD-L1および/またはPD-L2に対して、野生型PD-1の結合アフィニティーの少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍またはそれ以上である結合アフィニティーを有する。いくつかの態様において、sPD-1バリアントは、PD-L1に対して、野生型PD-1の結合アフィニティーの少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍またはそれ以上である結合アフィニティーを有することができる。いくつかの態様において、sPD-1バリアントは、PD-L2に対して、野生型PD-1の結合アフィニティーの少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍またはそれ以上である結合アフィニティーを有することができる。
一定の態様において、PD-L1もしくはPD-L2またはその両方に対するsPD-1バリアントの結合アフィニティーは、野生型PD-1の結合アフィニティーとの比較で、少なくとも約0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％またはそれ以上増加している。別の態様において、本発明のsPD-1バリアントは、PD-L1および/またはPD-L2に対して約1×10-8M、1×10-9M、1×10-10Mまたは1×10-12M未満の結合アフィニティーを有する。本発明のsPD-1バリアントは、PD-L1に対して約1×10-8M、1×10-9M、1×10-10Mまたは1×10-12M未満の結合アフィニティーを有することができる。本発明のsPD-1バリアントは、PD-L2に対して約1×10-8M、1×10-9M、1×10-10Mまたは1×10-12M未満の結合アフィニティーを有することができる。さらに別の態様において、sPD-1バリアントは、インビボもしくはインビトロまたはその両方で、PD-L1および/またはPD-L2に対する野生型PD-1の結合を阻害しまたはその結合と競合する。
いくつかの態様において、sPD-1バリアントは、PD-L1および/またはPD-L2に対して、PD-L1に対する野生型PD-1の解離半減期の2倍以上（例えば5倍以上、10倍以上、100倍以上、500倍以上、1000倍以上、5000倍以上、10000倍以上など）の解離半減期を有する。
2. Fcドメイン
本明細書において述べるとおり、上述のsPD-1バリアントドメインに加えて、本発明の融合タンパク質は、一般的にはIgGクラスに基づく抗体のFcドメインも含み、IgGクラスは、限定するわけではないがIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む、いくつかのサブクラスを有する。本明細書に記載するとおり、Fcドメインは任意でIgG抗体のヒンジドメインを含む。
本明細書において述べるとおり、上述のsPD-1バリアントドメインに加えて、本発明の融合タンパク質は、一般的にはIgGクラスに基づく抗体のFcドメインも含み、IgGクラスは、限定するわけではないがIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む、いくつかのサブクラスを有する。本明細書に記載するとおり、Fcドメインは任意でIgG抗体のヒンジドメインを含む。
ヒトIgG Fcドメインは本発明では特に有用であり、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4からのFcドメインであることができる。一般に、IgG3よりもIgG1、IgG2およびIgG4の方がよく使用される。
本発明の融合タンパク質に含まれるヒトIgGタンパク質のFcドメインは、融合タンパク質の半減期を有意に増加させ、Ig分子とのさらなる結合または相互作用を提供する。いくつかの態様において、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、単量体型sPD-バリアントポリペプチドとの比較で、精製、多量体化、他の分子の結合および中和を容易にすることができる。
本発明に役立つFcドメインは、必要に応じて機能を改変するために、Fcバリアントも含有することができる。しかし、どのFcバリアントも、一般に、二量体を形成する能力およびFcRnに結合する能力をどちらも保持している必要がある。したがって、本明細書における態様の多くはエフェクター機能を回避するためにヒトIgG4ドメインの使用に依拠するが、他のIgGドメインにおける機能を増強しまたは抑止するFcバリアントを作製することもできる。したがって、当業者には理解されるであろうとおり、例えばIgG1またはIgG2におけるエフェクター機能を低減しまたは排除するアブレーションバリアントを使用することができ、かつ/またはFcRnへのより強固な結合を付与するFcバリアントを使用することができる。
a. IgG4 Fcドメイン
IgG4サブクラスは、C1qタンパク質複合体への結合が無視できるほど小さく、古典的補体経路を活性化することができないので、他のIgGサブクラスとは区別される（A. Nirula et al. ,2011,Current Opinion in Rheumatology 23:119-124、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。結果として、IgG4は、有意なエフェクター機能を有さず、したがって細胞枯渇を伴わずに受容体-リガンド結合を遮断するために使用されるので、本発明において有用である。
IgG4サブクラスは、C1qタンパク質複合体への結合が無視できるほど小さく、古典的補体経路を活性化することができないので、他のIgGサブクラスとは区別される（A. Nirula et al. ,2011,Current Opinion in Rheumatology 23:119-124、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。結果として、IgG4は、有意なエフェクター機能を有さず、したがって細胞枯渇を伴わずに受容体-リガンド結合を遮断するために使用されるので、本発明において有用である。
別の一態様において、本発明のFcドメインはヒトIgG4 Fcドメインである。
いくつかの態様において、本発明のFcドメインはヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。
いくつかの態様において、本発明のFcドメインはヒトIgG4のCH2-CH3を含む。
別の一態様において、本発明のFcドメインはバリアントヒトIgG4 Fcドメインである。しかし、本明細書におけるバリアントFcドメインは、公知の方法を使って測定されるもう一つのFcドメインとの二量体を形成する能力、ならびにFcRnに結合する能力は依然として保っている。これは、本明細書における融合タンパク質の血清中半減期の増加に有意に寄与するからである。
バリアントIgG4 Fcドメインは、親ヒトIgG4 Fcドメインと比べて、付加、欠失、置換またはそれらの任意の組合せを含むことができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG4 Fcドメインは、（上述の同一性アルゴリズムを使って、一態様では当技術分野において公知のBLASTアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使って）対応する親ヒトIgG4 Fcドメインに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％または99％の同一性を有することができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG4 Fcドメインは、親ヒトIgG4 Fcドメインとの比較で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変を有することができる。
いくつかの態様において、バリアントヒトIgG4 Fcドメインは、EUナンバリングインデックスで位置228における、セリンからプロリンへのアミノ酸置換を含む。
b. 他のIgG Fcドメイン
いくつかの態様において、本発明のFcドメインは、IgG4以外のIgG、例えばヒトのIgG1、IgG2またはIgG3からのFcドメインであることができる。一般に、IgG3よりもIgG1およびIgG2の方がよく使用される。
いくつかの態様において、本発明のFcドメインは、IgG4以外のIgG、例えばヒトのIgG1、IgG2またはIgG3からのFcドメインであることができる。一般に、IgG3よりもIgG1およびIgG2の方がよく使用される。
いくつかの態様において、本発明のFcドメインはヒトIgG1のFcドメインである。
いくつかの態様において、本発明のFcドメインはヒトIgG2のFcドメインである。
いくつかの態様において、本発明のFcドメインはバリアントヒトIgG1 Fcドメインである。
いくつかの態様において、本発明のFcドメインはバリアントヒトIgG2 Fcドメインである。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG1 Fcドメインは、（上述の同一性アルゴリズムを使って、一態様では当技術分野において公知のBLASTアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使って）対応する親ヒトIgG1 Fcドメインに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％または99％の同一性を有することができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG2 Fcドメインは、（上述の同一性アルゴリズムを使って、一態様では当技術分野において公知のBLASTアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使って）対応する親ヒトIgG2 Fcドメインに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％または99％の同一性を有することができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG3 Fcドメインは、（上述の同一性アルゴリズムを使って、一態様では当技術分野において公知のBLASTアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使って）対応する親ヒトIgG3 Fcドメインに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％または99％の同一性を有することができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG1 Fcドメインは、親ヒトIgG1 Fcドメインとの比較で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変を有することができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG2 Fcドメインは、親ヒトIgG2 Fcドメインとの比較で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変を有することができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG3 Fcドメインは、親ヒトIgG3 Fcドメインとの比較で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変を有することができる。
3. リンカー
上述した2つのドメイン（すなわちsPD-1バリアントドメインおよびFcドメイン）は一般に本明細書記載のドメインリンカーを使って連結される。本発明に関連して、重要なことは、2つのドメインが、フレキシブルなリンカーを使って、2つのドメインが独立して作用することができるような形で結合されることである。これは、伝統的なリンカーおよび/またはヒンジリンカーを使って、さまざまな方法で達成することができる。
上述した2つのドメイン（すなわちsPD-1バリアントドメインおよびFcドメイン）は一般に本明細書記載のドメインリンカーを使って連結される。本発明に関連して、重要なことは、2つのドメインが、フレキシブルなリンカーを使って、2つのドメインが独立して作用することができるような形で結合されることである。これは、伝統的なリンカーおよび/またはヒンジリンカーを使って、さまざまな方法で達成することができる。
任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの態様が、グリシン-セリンポリマー、例えば(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nであって、nが少なくとも1（一般的には3から4〜5）の整数であるもの、ならびに2つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列であって、各ドメインがその生物学的機能を保つことが可能であるように十分な長さと柔軟性を持つものを利用する。
いくつかの態様では、ヒトIgG抗体のヒンジドメインが使用される。ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のヒンジドメインを図12に示す。場合により、ヒンジドメインはアミノ酸置換も含有することができる。例えば図1および表1に示すように、S228Pバリアントを含むIgG4由来のヒンジドメインが使用される。
いくつかの態様において、ドメインリンカーはヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
一態様において、リンカーは約1〜50アミノ酸長、好ましくは約1〜30アミノ酸長である。
別の一態様において、リンカーは1〜20アミノ酸長、好ましくは約5〜約10アミノ酸である。
4. 本発明の特定態様
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を示すsPD-1バリアントドメインを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を示すsPD-1バリアントドメインを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、a）SEQ ID NO:1との比較で、42、67、69、96、104、107、112および120からなる群より選択される位置番号にあるアミノ酸置換を含む、可溶性PD-1（sPD-1）バリアントドメイン、b）リンカー、ならびにc）Fcドメインを含む。いくつかの態様において、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、a）sPD-1バリアントドメイン、b）リンカー、およびc）Fcドメインを含む。いくつかの態様において、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、a）Fcドメイン、b）リンカー、およびc）sPD-1バリアントドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1との比較で、42、67、69、96、104、107、112および120からなる群より選択される位置番号にあるアミノ酸置換を含む、可溶性PD-1（sPD-1）バリアントドメイン、およびFcドメインを含む。いくつかの態様において、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、a）sPD-1バリアントドメインおよびb）Fcドメインを含む。いくつかの態様において、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、a）Fcドメインおよびb）sPD-1バリアントドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、a）SEQ ID NO:1との比較でS42G、S67G、P69L、N96S、G104S、S107V、A112IおよびA120Vからなる群より選択されるアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメイン、b）リンカーおよびc）Fcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1との比較でS42G、S67G、P69L、N96S、G104S、S107V、A112IおよびA120Vからなる群より選択されるアミノ酸置換を含むsPD-1バリアントドメイン、およびFcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、a）SEQ ID NO:1との比較で、
のうちのアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメイン、b）任意選択のリンカー、ならびにc）Fcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1との比較でS42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメイン、任意選択のリンカー、およびFcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1との比較でS42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメイン、任意選択のリンカー、およびFcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1との比較でP69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメイン、任意選択のリンカー、およびFcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1との比較でS67G/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメイン、任意選択のリンカー、およびFcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1との比較でS67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメイン、任意選択のリンカー、およびFcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1との比較でG104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメイン、任意選択のリンカー、およびFcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:1との比較でG104S/S107V/A112Iのアミノ酸置換のセットを含むsPD-1バリアントドメイン、任意選択のリンカー、およびFcドメインを含む。いくつかの態様において、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGのFcドメインである。いくつかの態様において、FcドメインはバリアントヒトIgG Fcドメインであり、ヒトIgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示するバリアントヒトIgG Fcドメインは、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるドメインリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーはGGGGSである。いくつかの態様において、ドメインリンカーは、ヒンジドメインとフレキシブルなリンカーとの組合せ、例えばS228Pを持つIgG4ヒンジとGGGGSリンカーとの組合せでもある。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、sPD-1バリアントドメイン、任意選択のリンカーおよびFcドメインを含み、sPD-1バリアントドメインはSEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138およびSEQ ID NO:139からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:2に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:3に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:72に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:110に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:130に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:131に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:138に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:12に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:13に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:14に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:15に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:16に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:17に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:18に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:19に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:20に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:21に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:22に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:23に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:24に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:25に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:26に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:27に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:28に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:29に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:30に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:31に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:32に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:33に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:34に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:35に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:36に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:37に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:38に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:39に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:40に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:41に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:42に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:43に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:44に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:45に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:46に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:47に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:48に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:49に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:50に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:51に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:52に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:53に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:54に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:55に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:56に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:57に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:58に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:59に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:60に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:61に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:62に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:63に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:64に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:65に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:66に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:67に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:68に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:69に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:70に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:71に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:73に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:74に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:75に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:76に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:77に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:78に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:79に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:80に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:81に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:82に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:83に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:84に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:85に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:86に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:87に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:88に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:89に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:90に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:91に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:92に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:93に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:94に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:95に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:96に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:97に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:98に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:99に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:100に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:101に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:102に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:103に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:104に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:105に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:106に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:107に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:108に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:109に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:111に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:112に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:113に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:114に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:115に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:116に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:117に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:118に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:119に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:120に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:121に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:122に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:123に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:124に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:125に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:126に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:127に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:128に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:129に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:132に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:133に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:134に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:135に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:136に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:137に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:139に記載するsPD-1バリアントドメインと、任意選択のリンカーと、Fcドメインとを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質はヒトIgG FcドメインまたはバリアントヒトIgG Fcドメインを含む。
好ましい一態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質はバリアントヒトIgG Fcドメインを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含むヒトIgG Fcドメインを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、ヒトIgG4のCH2-CH3を含むヒトIgG Fcドメインを含む。
好ましい一態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、EUナンバリングインデックスでS228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含むバリアントヒトIgG Fcドメインを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択されるリンカーを含み、ここで、nは1、2、3、4および5からなる群より選択される。
好ましい一態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質はGGGGSのリンカーを含む。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質はSEQ ID NO:5に記載するアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質はSEQ ID NO:6に記載するアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、PD-1リガンドに対して、親Fc融合タンパク質（例えばSEQ ID NO:4に記載するWT PD-1-Fc融合タンパク質）の結合アフィニティーの少なくとも約1.1倍以上（例えば5倍以上、10倍以上、100倍以上、500倍以上、1000倍以上、5000倍以上、10000倍以上など）である結合アフィニティーを有する。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、PD-1リガンドに対して、親融合タンパク質の結合アフィニティーより少なくとも約100倍強い結合アフィニティーを有する。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、PD-1リガンドに対して、親融合タンパク質の結合アフィニティーより少なくとも約200倍強い結合アフィニティーを有する。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、PD-1リガンドに対して、親融合タンパク質の結合アフィニティーより少なくとも約10,000倍強い結合アフィニティーを有する。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、PD-1リガンドに対して、KDが10-8Mである結合アフィニティーまたはそれより強いアフィニティーを有し、ここでアフィニティーは標準的Biacoreアッセイによって測定される。
いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、インビトロまたはインビボで、野生型PD-1ポリペプチドとPD-1リガンドの間の結合を阻害し、または妨げる。
sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質のsPD-1バリアントドメインは、PD-L1および/またはPD-L2に対する結合アフィニティーを増加させるのに役立つ。ヒトIgGタンパク質の（バリアント）Fcドメインは、融合タンパク質の半減期を有意に増加させる。本発明の融合タンパク質は、適応免疫系が抑制される疾患もしくは障害または免疫応答のレベルの強さの増加が必要とされる疾患もしくは障害を処置するのに、とりわけ有用である。いくつかの態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、がんまたは感染症を処置するために使用することができる。
D. 核酸
本発明は、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質コード核酸を含む組成物も提供する。そのような核酸は、本願において具陳するsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をどれでもコードすることができる。
本発明は、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質コード核酸を含む組成物も提供する。そのような核酸は、本願において具陳するsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をどれでもコードすることができる。
本発明の核酸は、実質的に純粋な状態で単離し入手することができる。通常、核酸は、DNAまたはRNAのどちらか一方として、天然に存在する他の核酸配列を実質的に含まない状態で入手され、一般的には少なくとも約50％、通常は少なくとも約90％純粋であり、典型的には「組換え」体、例えば天然に存在する染色体上では通常それに付随することのない1つまたは複数のヌクレオチドが隣接しているものである。
いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO:5のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの態様において、組成物はSEQ ID NO:6のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードする核酸を含む。
いくつかの態様において、核酸は、シグナル配列を含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードする。当技術分野において公知であるように、シグナル配列は、発現産物を細胞の外側に向かわせるために使用される。この場合、本発明の融合タンパク質の発現にとって適切なシグナル配列は、イタリック体で図1に示し、表1のSEQ ID NO:7に示す、野生型PD-1のシグナル配列である。当業者には理解されるであろうとおり、本発明の融合タンパク質の発現にとって適切なシグナル配列は、発現に使用される宿主細胞に「適合（match）」させることができる。すなわち、例えば、本発明の融合タンパク質をCHO細胞などの哺乳動物宿主細胞中で発現させる場合は、CHO細胞由来のシグナル配列を使用することができる。
いくつかの態様において、組成物はSEQ ID NO:9のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの態様において、組成物はSEQ ID NO:10のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードする核酸を含む。
いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138およびSEQ ID NO:139からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードする核酸を含む。
いくつかの態様において、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質コード核酸は、コドン最適化されたバージョンまたはバリアントを含む。
この文脈において「コドン最適化」は、特定の宿主生物およびそれが一般に好むアミノ酸コドンとの関連において行われる。すなわち、宿主生産生物、例えばアスペルギルス属（Aspergillus）の種は、酵母生産生物との比較でアスペルギルスが好むコドンを使用することで、より高い翻訳および/または分泌をもたらしうる。
コドン最適化は、使用する宿主細胞における発現を最適化するために、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質のいずれでも使用することができる。
sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、一般に、親遺伝子の指定部位変異導入および合成遺伝子の構築を含む周知の技法を使って、融合タンパク質配列をコードする遺伝子を構築することによって、調製することができる。
本発明の核酸の発現は、それら自身の調節配列によって、または当技術分野において公知の他の調節配列によって、調節することができる。
1. 調節配列
本発明は、制御配列と適合する条件下で適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指示する1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトにも関係する。制御配列は、ポリヌクレオチド発現用の宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモーターを含みうる。プロモーターはFc融合タンパク質の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異型プロモーター、トランケートされたプロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってよく、宿主細胞にとって同種または異種のどちらかである細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
本発明は、制御配列と適合する条件下で適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指示する1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトにも関係する。制御配列は、ポリヌクレオチド発現用の宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモーターを含みうる。プロモーターはFc融合タンパク質の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異型プロモーター、トランケートされたプロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってよく、宿主細胞にとって同種または異種のどちらかである細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
いくつかの態様において、制御配列は、バリアントのN末端に連結されたシグナルペプチドをコードして、発現中のバリアントフィターゼを細胞の分泌経路に向かわせる、シグナルペプチドコード領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の5'端は、バリアントフィターゼをコードするコード配列のセグメントと同じ翻訳読み枠で天然に連結されているシグナルペプチドコード配列を、固有に含有しうる。あるいは、コード配列の5'端は、コード配列にとって外来であるシグナルペプチドコード配列を含有しうる。コード配列がシグナルペプチドコード配列を天然に含有しない場合には、外来シグナルペプチドコード配列が必要になりうる。あるいは、バリアントフィターゼの分泌を強化するために、天然シグナルペプチドコード配列を単に外来シグナルペプチドコード配列で置き換えてもよい。ただし、発現したバリアントを宿主細胞の分泌経路へと向かわせるシグナルペプチドコード配列はどれでも使用しうる。
E. 発現ベクター
1つまたは複数の本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を、構成的に、または1つもしくは複数の調節要素下でインビトロ発現またはインビボ発現させるための発現ベクターも、本明細書において提供される。いくつかの態様において、本発明は、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。1つまたは複数の好都合な制限部位を含んでいて、Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをそのような部位に挿入するかそのような部位で置換することが可能な組換え発現ベクターを生産するために、さまざまなヌクレオチド配列および制御配列を一つに接合しうる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを適当な発現用ベクターに挿入することによって発現させうる。発現ベクターの作製では、コード配列が適当な発現用制御配列と機能的に連結されるようにコード配列をベクターに配置する。
1つまたは複数の本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を、構成的に、または1つもしくは複数の調節要素下でインビトロ発現またはインビボ発現させるための発現ベクターも、本明細書において提供される。いくつかの態様において、本発明は、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。1つまたは複数の好都合な制限部位を含んでいて、Fc融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをそのような部位に挿入するかそのような部位で置換することが可能な組換え発現ベクターを生産するために、さまざまなヌクレオチド配列および制御配列を一つに接合しうる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを適当な発現用ベクターに挿入することによって発現させうる。発現ベクターの作製では、コード配列が適当な発現用制御配列と機能的に連結されるようにコード配列をベクターに配置する。
組換え発現ベクターは、組換えDNA手法に便利に付すことができ、ポリヌクレオチドの発現を引き起こすことができる任意のベクター（例えばプラスミドまたはウイルス）でありうる。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、そのベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存することになる。ベクターは線状のプラスミドまたは閉じた環状のプラスミドであることができる。
ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体の複製とは独立している染色体外実体（extrachromosomal entity）として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体でありうる。ベクターは自己複製を保証するための任意の手段を含有しうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入した場合にゲノムに組み込まれて、ベクターが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。さらにまた、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入しようとするDNAのすべてを全体として含有する2つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを使用しうる。本発明の方法での使用が考えられるベクターには、組込み型ベクターと非組込み型ベクターの両方が含まれる。
F. 宿主細胞および生産株
当業者には理解されるであろうとおり、本発明のバリアントsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を組換え生産するには、限定するわけではないが細菌細胞、哺乳動物細胞および酵母を含む真菌細胞など、多種多様な生産宿主生物がある。
当業者には理解されるであろうとおり、本発明のバリアントsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を組換え生産するには、限定するわけではないが細菌細胞、哺乳動物細胞および酵母を含む真菌細胞など、多種多様な生産宿主生物がある。
本発明の核酸は、トランスフェリンポリカチオンによるDNA移入、裸の核酸またはカプセル化された核酸によるトランスフェクション、リポソームによるDNA移入、DNA被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウムによるトランスフェクションなど、当技術分野において利用可能なさまざまな技法を使って、適切な宿主細胞に導入することができる。
G. 融合タンパク質を作製する方法
本発明は、（a）本発明の宿主細胞をsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、および（b）任意でsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を回収する工程を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法に関する。
本発明は、（a）本発明の宿主細胞をsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、および（b）任意でsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を回収する工程を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法に関する。
H. 処置の方法
1. 処置を受けることができる対象
本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を使用した結果として達成されるT細胞応答の増加は、限定するわけではないが、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症および寄生虫感染症を含む疾患または障害を処置するのに十分である。
1. 処置を受けることができる対象
本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を使用した結果として達成されるT細胞応答の増加は、限定するわけではないが、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症および寄生虫感染症を含む疾患または障害を処置するのに十分である。
本発明の方法は、処置を必要とする対象に、治療有効量の本明細書記載の1種または複数種のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を投与する工程を含む。いくつかの態様において、対象はがんを有し、治療有効量の1種または複数種のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の投与は、対象における腫瘍の転移または浸潤を処置、低減または防止することができる。別の態様において、本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、がんを持つ対象における固形腫瘍の成長を低減または抑制することができる。
いくつかの態様では、感染症を有する対象、例えば局所感染または全身感染を有する対象に、治療有効量の本明細書記載の1種または複数種のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質が、感染症を処置するために投与される。別の態様では、対象が、細菌、ウイルス、原生動物、寄生虫、または他の微生物病原体によって引き起こされる慢性感染性疾患を有する。
2. 治療的投与
一定の態様において、1種または複数種の本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を含む治療的に有効な組成物または製剤は、それを必要とする個体に全身性に投与するか、当技術分野において公知の他の任意の投与経路によって投与されうる。
一定の態様において、1種または複数種の本発明のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を含む治療的に有効な組成物または製剤は、それを必要とする個体に全身性に投与するか、当技術分野において公知の他の任意の投与経路によって投与されうる。
3. 投薬
いくつかの態様において、転移がんまたは感染症の処置のための本発明の治療実体の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与されている他の医薬、および処置が予防的処置であるか治療的処置であるかを含む数多くの異なる因子に依存して変動する。処置投薬量はタイトレートして安全性および効力を最適化することができる。
いくつかの態様において、転移がんまたは感染症の処置のための本発明の治療実体の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与されている他の医薬、および処置が予防的処置であるか治療的処置であるかを含む数多くの異なる因子に依存して変動する。処置投薬量はタイトレートして安全性および効力を最適化することができる。
VII. 実施例
A. 実施例1:ヒトPDL1およびPDL2複合体によるsPD1バリアントのモデリング
1. 方法
ヒトPD-1/PD-L1複合体構造はタンパク質データバンクから入手することができ、PDBIDは4ZQKおよび5IUSである。しかし、どちらのPDB構造でも、ループ領域においていくつかのPD-1残基が欠落しており、一部の残基は野生型PD-1と比べて変異していた。結合アフィニティーおよびタンパク質安定性に対する影響をより良く調べるために、まず欠落ループを修復（fix）し、残基を結晶構造4ZQKに基づいて野生型PD-1に戻した。Schrodinger SuiteのResidue Scanningモジュールを使って変異PD-1構造をモデリングした。変異残基の5.0Å以内の残基を側鎖予測（side-chain prediction）およびバックボーンサンプリング（backbone sampling）によって精密化した。WT PD-1/PD-L1複合体構造とsPD-1バリアント/PD-L1複合体構造の両方についてタンパク質相互作用解析を行った。3つのPD-1/PD-L1複合体モデル、すなわちWTモデル、3つの境界面変異を持つモデル、8つすべての変異を持つモデルを、さらなる精密化および最適化のために、OPLS3力場を用いて10ns分子動力学（MD）シミュレーションに供した。SPC水を溶媒とし、周期的直方晶ボックス（periodic,orthorhombic box）内で各複合体を溶媒和させた。任意の複合体原子からボックス壁（box wall）までの最小距離を10Åに設定した。3つのMDシミュレーションはすべて300Kの定温および1atmの定圧で実行した。1ps間隔で保存されたトラジェクトリー座標を解析に使用した。
A. 実施例1:ヒトPDL1およびPDL2複合体によるsPD1バリアントのモデリング
1. 方法
ヒトPD-1/PD-L1複合体構造はタンパク質データバンクから入手することができ、PDBIDは4ZQKおよび5IUSである。しかし、どちらのPDB構造でも、ループ領域においていくつかのPD-1残基が欠落しており、一部の残基は野生型PD-1と比べて変異していた。結合アフィニティーおよびタンパク質安定性に対する影響をより良く調べるために、まず欠落ループを修復（fix）し、残基を結晶構造4ZQKに基づいて野生型PD-1に戻した。Schrodinger SuiteのResidue Scanningモジュールを使って変異PD-1構造をモデリングした。変異残基の5.0Å以内の残基を側鎖予測（side-chain prediction）およびバックボーンサンプリング（backbone sampling）によって精密化した。WT PD-1/PD-L1複合体構造とsPD-1バリアント/PD-L1複合体構造の両方についてタンパク質相互作用解析を行った。3つのPD-1/PD-L1複合体モデル、すなわちWTモデル、3つの境界面変異を持つモデル、8つすべての変異を持つモデルを、さらなる精密化および最適化のために、OPLS3力場を用いて10ns分子動力学（MD）シミュレーションに供した。SPC水を溶媒とし、周期的直方晶ボックス（periodic,orthorhombic box）内で各複合体を溶媒和させた。任意の複合体原子からボックス壁（box wall）までの最小距離を10Åに設定した。3つのMDシミュレーションはすべて300Kの定温および1atmの定圧で実行した。1ps間隔で保存されたトラジェクトリー座標を解析に使用した。
ヒトPD-L2構造はタンパク質データバンクから入手できないので、ヒトPD-1とPD-L2の間の相互作用を調べるために、PD-L2のホモロジーモデルを構築した。PDB非冗長データセットにおけるホモロジー検索後に、マウスPD-L2の3つのPDB構造をテンプレートとして選んだ。前述のように、WTおよびsPD-1バリアント/PD-L2モデルについてもタンパク質相互作用解析を行った。
2. ヒトPD-1/PD-L1複合体のモデリング
WT PD-1、4ZQKおよび5IUSの配列アラインメントの結果を図2に示す。同一残基は青で表示され、どちらの結晶構造でも欠落している残基は赤で表示され、4ZQKだけで欠落している残基はシアンで表示されている。
WT PD-1、4ZQKおよび5IUSの配列アラインメントの結果を図2に示す。同一残基は青で表示され、どちらの結晶構造でも欠落している残基は赤で表示され、4ZQKだけで欠落している残基はシアンで表示されている。
欠落ループを修復し、残基93をCysに戻したPD-1のモデルが、図3ではシアンで表示されている。4ZQKにおけるPD-1とPD-L1の結晶構造はそれぞれ青および緑で表示されている。変異に関してPD-1上の7つの残基（シグナル領域から始まるナンバリングでSer62、Ser87、Pro89、Gly124、Ser127、Ala132およびAla140;これらは成熟領域から始まる配列ナンバリングでのSer42、Ser67、Pro69、Gly104、Ser107、Ala112およびAla120にそれぞれ等しい）がオレンジのスティックで表示され、N-グリコシル化部位（Asn116）はマゼンタのスティックで表示されている。
Schrodinger SuiteのResidue Scanningモジュールを使って変異PD-1構造をモデリングした。変異残基の5.0Å以内の残基を側鎖予測およびバックボーンサンプリングによって精密化した。WT PD-1/PD-L1複合体構造と、8つの残基すべてを変異させた変異型PD-1/PD-L1複合体構造の両方について、タンパク質相互作用解析を行った。解析結果を表2および表3にそれぞれ列挙する。シグナル領域から始まる位置ナンバリングで変異G124S、S127VおよびA132Iは境界面変異とみなされる。また、シグナル領域から始まる位置ナンバリングで変異S62G、S86G、P89LおよびA140Vは境界面外変異とみなされる。変異G124SはPD-L1との水素結合を1つ増やし、変異A132IはPD-L1との水素結合を維持して、表面相補性を増加させる。
変異がPD-1/PD-L1結合にどのような影響を及ぼすかをさらに調べるために、各変異前後の結合アフィニティーおよびタンパク質安定性の変動を計算した。結果を表4に列挙する。複数の変異についても結合アフィニティーおよびタンパク質安定性の変動の計算を行った。結果を表5に列挙する。結合アフィニティーまたは安定性の値は、それが負であるほど、それらの増加が大きいことを示す。一般に、境界面変異は結合アフィニティーとタンパク質安定性をどちらも増加させ、境界面外変異は、基本的に安定性だけに寄与する。8つすべての変異では、結合アフィニティーが19.03kcal/mol増加し、タンパク質安定性が69.92kcal/mol増加する。
3つのPD-1/PD-L1複合体モデル、すなわちWTモデル、3つの境界面変異を持つモデル、8つすべての変異を持つモデルを、さらなる精密化および最適化のために、OPLS3力場を用いて10ns分子動力学（MD）シミュレーションに供した。SPC水を溶媒とし、周期的直方晶ボックス内で各複合体を溶媒和させた。任意の複合体原子からボックス壁までの最小距離を10Åに設定した。3つのMDシミュレーションはすべて300Kの定温および1atmの定圧で実行した。1ps間隔で保存されたトラジェクトリー座標を解析に使用した。バックボーン原子位置RMSDの時間発展を図4に示す。MDの結果も変異がモデルの安定性を増加させることを示している。
（表２）WTヒトPD-1/PD-L1モデルのタンパク質相互作用解析
（表３）変異型（シグナル領域から始まる位置ナンバリングでS62G、S87G、P89L、G124S、S127V、A132I、A140VおよびN116S）ヒトPD-1/PD-L1モデルのタンパク質相互作用解析
（表４）各単一変異についてのヒトPD-1/PD-L1の結合アフィニティーおよびタンパク質安定性の変動（単位:kcal/mol）
（表５）複数の変異についてのヒトPD-1/PD-L1の結合アフィニティーおよびタンパク質安定性の変動（単位:kcal/mol）。結合アフィニティーまたは安定性の値は、負であるほど、それらの増加が大きいことを示す。
3. ヒトPD-1/PD-L2複合体のモデリング
配列アラインメントの結果を図5Aに示す。ヒトPD-L2とマウスPD-L2の配列同一性は約72％である。ヒトPD-L2のコンセンサスモデルを図5Bに示す。一致残基は青で表示されている。欠落ループ中の残基は赤で表示されている。
配列アラインメントの結果を図5Aに示す。ヒトPD-L2とマウスPD-L2の配列同一性は約72％である。ヒトPD-L2のコンセンサスモデルを図5Bに示す。一致残基は青で表示されている。欠落ループ中の残基は赤で表示されている。
ヒトPD-L2モデルとマウスPD-L2結晶構造（PDBID:3BP5）とのPD-1結合境界面の比較を図6に示す。境界面残基は線で表示されている。ヒトPD-L2モデル（ダークブルーで示されている）では境界面残基が緑で表示されている。マウスPD-L2の結晶構造はピンクで表示されている。境界面での配列同一性は66％である。ヒトPD-1モデル（パートIに記載）とコンセンサスヒトPD-L2モデルとに基づき、マウスPD-1/PD-L2結晶構造（PDBID:3BP5）に重ねることによって、ヒトPD-1/PD-L2複合体モデルを構築した。ヒトPD-1/PD-L2モデルとマウスPD-1/PD-L2結晶構造（PDBID:3BP5）のオーバーレイを図7に示す。ヒトPD-1モデルとヒトPD-L2モデルはそれぞれシアンおよびダークブルーで表示され、マウスPD-1構造とマウスPD-L2構造はそれぞれ黄およびピンクで表示されている。
方法の項で述べるように、WTおよび変異型ヒトPD-1/PD-L2モデルについても、タンパク質相互作用解析を行った。結果を表6および表7に列挙する。変異G124Sおよび変異A132Iは表面相補性をわずかに増加させる。各単一変異および複数の変異について結合アフィニティーおよびタンパク質安定性の変動の計算も行った。結果を表8および表9に列挙する。一般に、境界面変異は結合アフィニティーを増加させ、境界面外変異は安定性を増加させる。8つすべての変異では、結合アフィニティーが10.62kcal/mol増加し、タンパク質安定性が10.7kcal/mol増加する。PD-1/PD-L2の結合アフィニティーおよび安定性の変動は、PD-1/PD-L1の場合ほど有意ではなかった。これはホモロジーモデルと結晶構造との構造精度差によるのかもしれない。
（表６）WTヒトPD-1/PD-L2モデルのタンパク質相互作用解析
（表７）変異型（シグナル領域から始まる位置ナンバリングでS62G、S87G、P89L、G124S、S127V、A132I、A140VおよびN116S、これらは成熟領域から始まる位置ナンバリングでそれぞれS42G、S67G、P69L、G104S、S107V、A112I、A120VおよびN96Sに等しい）ヒトPD-1/PD-L2モデルのタンパク質相互作用解析
（表８）各単一変異についてのヒトPD-1/PD-L2の結合アフィニティーおよびタンパク質安定性の変動（単位:kcal/mol）
（表９）複数の変異についてのヒトPD-1/PD-L2の結合アフィニティーおよびタンパク質安定性の変動（単位:kcal/mol）
（表１０）コロニー追跡番号、配列番号、および野生型（配列番号11）に対するさまざまなコロニー中のアミノ酸変異。シグナルペプチド領域は残基1〜20であり、成熟細胞外ドメイン（ECD）は残基21から始まって残基170までである。リンカードメインは残基171から始まって残基175までである。各配列中のアミノ酸変異に関する配列ナンバリングはその成熟領域から始まる。
B. 実施例2:PD-L1およびPD-L2に対するsPD-1バリアントの結合アフィニティー
結合アフィニティーアッセイは製造者のアッセイプロトコールに従って行った。装置モデルはBiacore T200（GE Healthcare Life sciences）である。実験は25℃で行った。分析物はヒトPD-L1およびヒトPD-L2とした。ランニング緩衝液はHBS-EP＋とした。簡単に述べると、抗ヒトFc IgGをCM5センサーチップ上に固定化した。sPD-1バリアントを固定化センサーチップに捕捉させた。一連の希釈分析物の注入でマルチサイクルカイネティクス（multiple cycle kinetics）を行った。
結合アフィニティーアッセイは製造者のアッセイプロトコールに従って行った。装置モデルはBiacore T200（GE Healthcare Life sciences）である。実験は25℃で行った。分析物はヒトPD-L1およびヒトPD-L2とした。ランニング緩衝液はHBS-EP＋とした。簡単に述べると、抗ヒトFc IgGをCM5センサーチップ上に固定化した。sPD-1バリアントを固定化センサーチップに捕捉させた。一連の希釈分析物の注入でマルチサイクルカイネティクス（multiple cycle kinetics）を行った。
sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は、WT PD-1-Fc融合タンパク質（「親Fc融合タンパク質」）と比べてPD-L1結合に約10,000倍の改良を、また親Fc融合タンパク質と比べてPD-L2結合に約200倍の改良を示した（図8）。
C. 実施例3:MC38細胞上でのsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の結合活性
MC38マウス結腸直腸がん細胞株およびヒトPD-1がノックインされたMC38細胞を使ってsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の結合活性を評価するためにFACS結合解析を行った。
MC38マウス結腸直腸がん細胞株およびヒトPD-1がノックインされたMC38細胞を使ってsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の結合活性を評価するためにFACS結合解析を行った。
簡単に述べると、細胞を37℃、5％CO2で培養した。細胞を標準的手順に従って収穫し、上清を捨てた。細胞を1ウェルにつき30万細胞ずつ染色プレートに分配した。プレートを4℃において300gで5分間、遠心分離した。2％FBSを含有するFACS緩衝液中の、一連の濃度のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質および陰性対照を、500ug/mlから1:5でタイトレートした。100ulを各ウェルに加え、細胞を4℃で1時間インキュベートした。細胞を200ulのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離し、各洗浄の前と後に上清を捨てた。次に細胞を抗ヒトIgG-Alexa 488と共に再懸濁した。プレートを4℃で1時間インキュベートした。次に、FACS解析のために、細胞を2回洗浄した。FACS解析は製造者の説明書に従ってFACS Canto II（BD Biosciences）で行った。
sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質（例えばsPD-1バリアントバージョン1-Fc融合タンパク質およびsPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質）は、MC38-PD-L1ノックイン細胞に対して、野生型PD-1群（すなわちSEQ ID NO:4に記載する野生型PD-1-Fc融合タンパク質）よりも高い結合アフィニティーを示した（図9A）。ただし、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質は親MC38にも結合するが、その程度は低い（図9B）。
D. 実施例4:T細胞活性化アッセイ
PBMCの単離:個別ドナーからの血液試料を同じ体積の滅菌PBSで希釈した。例えば25mlの滅菌PBSを25mlの新鮮全血に加え、穏やかに振とうすることによって十分に混合した。15mlのFicoll-Pague媒体を新しい50ml遠心チューブに移して、Ficollと血液の体積比が3:4になるようにした後、前記希釈血液試料をFicoll媒体の表面に注意深く加え、2種の液状物の層をはっきり見ることができるように可能な限り静かに加えることによって、混合が起こることを避けた。チューブを静かに移動させて、遠心分離中は最大加速および最小減速の設定で、400×g、30分、20℃の遠心分離にかけた。単核球の層を注意深く吸い上げて、新しい別の滅菌遠心チューブに移した。収集したPBMCに洗浄のために滅菌PBS緩衝液を3:1の体積比で加え、300×g、10分間、20℃で遠心分離した。次に、細胞をアッセイ用に10％FBS＋RPMI 1640で再懸濁した。
PBMCの単離:個別ドナーからの血液試料を同じ体積の滅菌PBSで希釈した。例えば25mlの滅菌PBSを25mlの新鮮全血に加え、穏やかに振とうすることによって十分に混合した。15mlのFicoll-Pague媒体を新しい50ml遠心チューブに移して、Ficollと血液の体積比が3:4になるようにした後、前記希釈血液試料をFicoll媒体の表面に注意深く加え、2種の液状物の層をはっきり見ることができるように可能な限り静かに加えることによって、混合が起こることを避けた。チューブを静かに移動させて、遠心分離中は最大加速および最小減速の設定で、400×g、30分、20℃の遠心分離にかけた。単核球の層を注意深く吸い上げて、新しい別の滅菌遠心チューブに移した。収集したPBMCに洗浄のために滅菌PBS緩衝液を3:1の体積比で加え、300×g、10分間、20℃で遠心分離した。次に、細胞をアッセイ用に10％FBS＋RPMI 1640で再懸濁した。
Hep3BヒトPD-L1ノックイン細胞の調製:マイコプラズマフリーHep3b-hPDL1-OS8細胞を15cmディッシュに調製し、使用前のコンフルエンシーを60〜80％に保った。細胞をTrypLE（商標）Express Enzymeでトリプシン処理した後、トリプシンを中和し、1000rpmで5分間遠心分離することにより、細胞を50ml遠心チューブに収集した。上清を捨て、細胞をマイトマイシン10ug/ml（5〜10mlの10％FBS＋RPMI1640培地中）と共に再懸濁した。細胞を37℃で1時間インキュベートした。細胞を15〜20mlのPBSで4回洗浄してから血球計数器で細胞をカウントし、次に20℃において1000rpmで5分間遠心分離した。細胞をアッセイ用に10％FBS＋RPMI 1640で再懸濁した。
PBMC刺激:50,000細胞/ウェル、100ul/ウェルでPBMCを加え、次に一連の5×sPD-1バリアントバージョン2（PD1 V2）、5×PD1 WTまたはhIgG4タンパク質溶液50ul/ウェルを加えてから、Hep3b-hPDL1細胞を5000細胞/ウェルで50ul/ウェルずつ加えた。混合した溶液を37℃のインキュベーターで72時間インキュベートした。上清を収穫し、ELISA試験の前に、-20℃未満に凍結した。IFN-ガンマ濃度をELISAキットで試験した。IFN-γの定量は、R＆Dから購入したQuantifkine ELISAキットで決定した。手順は、ヒトIFN-γ ELISAキット、R＆D、カタログ番号DY285のアッセイ手順に従って行った。
図10は、sPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質がヒトPBMCから単離されたT細胞を活性化する能力を有することを示している。
E. 実施例5:MC38-hPD-L1結腸直腸腫瘍細胞株を用いたインビボ腫瘍研究
すべての動物を購入し、AAALC認証済の温度制御された病原体フリーの環境に収容した。腫瘍サイズが倫理的限界に達したら、動物を研究から除外した。C57/B6マウスにMC38-hPD-L1腫瘍細胞を接種し、腫瘍成長を確認するために5日間観察してから、各群10匹の3つの処置群、すなわち媒体対照、抗PD-L1抗体10mg/kg（陽性対照群）およびsPD-1バリアント2-Fc融合タンパク質10mg/kg（PD1-ECD-Fc 10mg/kg群）のそれぞれに割り当てた。腫瘍接種後6日目に処置を開始し、腫瘍サイズが2000mm3を超えたら動物を研究から除外した。経時的腫瘍成長と生存率を実験エンドポイントとして記録した。
すべての動物を購入し、AAALC認証済の温度制御された病原体フリーの環境に収容した。腫瘍サイズが倫理的限界に達したら、動物を研究から除外した。C57/B6マウスにMC38-hPD-L1腫瘍細胞を接種し、腫瘍成長を確認するために5日間観察してから、各群10匹の3つの処置群、すなわち媒体対照、抗PD-L1抗体10mg/kg（陽性対照群）およびsPD-1バリアント2-Fc融合タンパク質10mg/kg（PD1-ECD-Fc 10mg/kg群）のそれぞれに割り当てた。腫瘍接種後6日目に処置を開始し、腫瘍サイズが2000mm3を超えたら動物を研究から除外した。経時的腫瘍成長と生存率を実験エンドポイントとして記録した。
sPD-1バリアント2-Fc融合タンパク質は、抗PD-L1抗体群の場合と比較してsPD-1バリアント2-Fc融合タンパク質群（すなわちPD-1-ECD-Fc群）における腫瘍体積の低減、腫瘍成長抑制の増加、生存率の増加および体重の低減によって証明されるとおり、陽性対照群（すなわち抗PD-L1抗体）と比較して優れた抗腫瘍活性を示した。
F. 実施例6:レンチウイルスで形質導入されたHep3B-OS8細胞およびMC38細胞におけるPD-L2の発現
Hep3B-OS8細胞およびMC38細胞に、レンチウイルスプラスミドで、ヒトPD-L2発現を形質導入した。
Hep3B-OS8細胞およびMC38細胞に、レンチウイルスプラスミドで、ヒトPD-L2発現を形質導入した。
Hep3B-OS8細胞およびMC38細胞の単一クローンにおけるPDL2の発現は、FACSを使って解析した。簡単に述べると、標準的手順で細胞を収穫し、上清を捨てた。染色プレートに細胞を1ウェルにつき30万細胞ずつ分配し、プレートを4℃、300gで5分間遠心分離した。100ul/ウェルのウサギ抗hPD-L2（1ug/試験）抗体をFACS緩衝液にタイトレートして加え、4℃で1時間インキュベートした。細胞を200μlのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離し、各洗浄の前と後に上清を捨てた。細胞を100μl/ウェルになるように二次抗体の1:1000希釈液で再懸濁した。プレートを4℃で30分間インキュベートした。細胞を200μlのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離し、各洗浄の前と後に上清を捨てた。細胞を100μlのPBSに再懸濁した。細胞を暗所に保ち、FACS解析に供した。FACS解析は製造者の説明書に従ってFACS Canto II（BD Biosciences）で行った。
図13はヒトPD-L2がHep3B細胞株およびMC38細胞株において過剰発現したことを示している。
G. 実施例7:ヒトPD-L2過剰発現Hep3b細胞（Hep3B-hPDL2）上でのsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の結合活性
ヒトPD-L2を過剰発現するヒト肝細胞がん細胞株Hep3b細胞（Hep3B-hPDL2）を使ってsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の結合活性を評価するためにFACS結合解析を行った。
ヒトPD-L2を過剰発現するヒト肝細胞がん細胞株Hep3b細胞（Hep3B-hPDL2）を使ってsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質の結合活性を評価するためにFACS結合解析を行った。
簡単に述べると、細胞を37℃、5％CO2で培養した。細胞を標準的手順に従って収穫し、上清を捨てた。細胞を1ウェルにつき30万細胞ずつ染色プレートに分配した。プレートを4℃において300gで5分間、遠心分離した。2％FBSを含有するFACS緩衝液中の、一連の濃度のsPD-1バリアント-Fc融合タンパク質、野生型PD-1、PDL2 tab1および陰性対照ヒトIgG4を、500μg/mlから1:5でタイトレートした。各ウェルに100μlを加え、細胞を4℃で1時間インキュベートした。細胞を200μlのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離し、各洗浄の前と後に上清を捨てた。次に細胞を抗ヒトIgG-Alexa 488と共に再懸濁した。プレートを4℃で1時間インキュベートした。次に、FACS解析のために、細胞を2回洗浄した。FACS解析は製造者の説明書に従ってFACS Canto II（BD Biosciences）で行った。
図14は、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質（例えばsPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質）が、Hep3B-hPDL2細胞に対して、野生型PD-1群より高い結合アフィニティーを示したことを表している。
H. 実施例8:PBMCとHep3B-OS8-PDL2 4B9の共培養物におけるT細胞活性化アッセイ
PBMCの単離:個別ドナーからの血液試料を同じ体積の滅菌PBSで希釈した。例えば25mlの滅菌PBSを25mlの新鮮全血に加え、穏やかに振とうすることによって十分に混合した。15mlのFicoll-Pague媒体を新しい50ml遠心チューブに移して、Ficollと血液の体積比が3:4になるようにした後、前記希釈血液試料をFicoll媒体の表面に注意深く加え、2種の液状物の層をはっきり見ることができるように可能な限り静かに加えることによって、混合が起こることを避けた。チューブを静かに移動させて、遠心分離中は最大加速および最小減速の設定で、400×g、30分、20℃の遠心分離にかけた。単核球の層を注意深く吸い上げて、新しい別の滅菌遠心チューブに移した。収集したPBMCに洗浄のために滅菌PBS緩衝液を3:1の体積比で加え、300×g、10分間、20℃で遠心分離した。次に、細胞をアッセイ用に10％FBS＋RPMI 1640で再懸濁した。
PBMCの単離:個別ドナーからの血液試料を同じ体積の滅菌PBSで希釈した。例えば25mlの滅菌PBSを25mlの新鮮全血に加え、穏やかに振とうすることによって十分に混合した。15mlのFicoll-Pague媒体を新しい50ml遠心チューブに移して、Ficollと血液の体積比が3:4になるようにした後、前記希釈血液試料をFicoll媒体の表面に注意深く加え、2種の液状物の層をはっきり見ることができるように可能な限り静かに加えることによって、混合が起こることを避けた。チューブを静かに移動させて、遠心分離中は最大加速および最小減速の設定で、400×g、30分、20℃の遠心分離にかけた。単核球の層を注意深く吸い上げて、新しい別の滅菌遠心チューブに移した。収集したPBMCに洗浄のために滅菌PBS緩衝液を3:1の体積比で加え、300×g、10分間、20℃で遠心分離した。次に、細胞をアッセイ用に10％FBS＋RPMI 1640で再懸濁した。
Hep3B hPD-L2細胞の調製:マイコプラズマフリーHep3b-hPDL2-OS8細胞を15cmディッシュに調製し、使用前のコンフルエンシーを60〜80％に保った。細胞をTrypLE（商標）Express Enzymeでトリプシン処理した後、トリプシンを中和し、1000rpmで5分間遠心分離することにより、細胞を50ml遠心チューブに収集した。上清を捨て、細胞をマイトマイシン10μg/ml（5〜10mlの10％FBS＋RPMI1640培地中）と共に再懸濁した。細胞を37℃で1時間インキュベートした。細胞を15〜20mlのPBSで4回洗浄してから血球計数器で細胞をカウントし、次に20℃において1000rpmで5分間遠心分離した。細胞をアッセイ用に10％FBS＋RPMI 1640で再懸濁した。
PBMC刺激:50,000細胞/ウェル、100μl/ウェルでPBMCを加え、次に一連の5×sPD-1バリアントバージョン2（PD1 V2）、5×PD1 WTまたはhIgG4タンパク質溶液50μl/ウェルを加えてから、Hep3b-hPDL2細胞を5000細胞/ウェルで50μl/ウェルずつ加えた。混合した溶液を37℃のインキュベーターで72時間インキュベートした。上清を収穫し、ELISA試験の前に、-20℃未満に凍結した。IFN-ガンマ濃度をELISAキットで試験した。IFN-γの定量は、R＆Dから購入したQuantifkine ELISAキットで決定した。手順は、ヒトIFN-γ ELISAキット、R＆D、カタログ番号DY285のアッセイ手順に従って行った。
図15は、sPD-1バリアントバージョン2-Fc融合タンパク質が、PBMCとHep3B-OS8-PDL2 4B9との共培養物を使ったT細胞活性化試験においてT細胞を活性化する能力を有することを示している。
I. 実施例9:MC38-hPDL2結腸直腸腫瘍細胞株を用いたインビボ腫瘍研究
すべての動物を購入し、AAALC認証済の温度制御された病原体フリーの環境に収容した。腫瘍サイズが倫理的限界に達したら、動物を研究から除外した。C57/B6マウスにMC38-hPD-L2腫瘍細胞を接種し、腫瘍成長を確認するために5日間観察してから、各群10匹の3つの処置群、すなわち媒体対照、抗PD-1抗体10mg/kg（陽性対照群）およびsPD-1バリアント2-Fc融合タンパク質10mg/kg（PD1-ECD-Fc 10mg/kg群）のそれぞれに割り当てた。腫瘍接種後6日目に処置を開始し、腫瘍サイズが2000mm3を超えたら動物を研究から除外した。経時的腫瘍成長と生存率を実験エンドポイントとして記録した。
すべての動物を購入し、AAALC認証済の温度制御された病原体フリーの環境に収容した。腫瘍サイズが倫理的限界に達したら、動物を研究から除外した。C57/B6マウスにMC38-hPD-L2腫瘍細胞を接種し、腫瘍成長を確認するために5日間観察してから、各群10匹の3つの処置群、すなわち媒体対照、抗PD-1抗体10mg/kg（陽性対照群）およびsPD-1バリアント2-Fc融合タンパク質10mg/kg（PD1-ECD-Fc 10mg/kg群）のそれぞれに割り当てた。腫瘍接種後6日目に処置を開始し、腫瘍サイズが2000mm3を超えたら動物を研究から除外した。経時的腫瘍成長と生存率を実験エンドポイントとして記録した。
図16は、sPD-1バリアント2-Fc融合タンパク質が、腫瘍体積の低減によって証明されるとおり、陽性対照群（すなわち抗PD-1抗体ペンブロリズマブ）と比較して等価な抗腫瘍活性を示したことを表している。
J. 実施例10:免疫チェックポイント阻害剤の効力を強化するためのPD-L1およびPD-L2の中和
1. 概要
PD-1およびPD-L1を標的とする免疫チェックポイント阻害剤は、がんの処置に著しく貢献していて、最も広く使用される免疫治療の一つになっている。残念なことに、低い患者奏効率が大きな臨床上の難題となっており、そのような短所に対処するために多くの研究努力が、免疫チェックポイント治療を受ける患者にとっての効力および奏効率を改良することに注がれてきた。この研究において、本発明者らは、いずれもPD-1阻害剤とPD-L1阻害剤の両方に対して低応答性である卵巣がん、胃がんおよび食道がんなどのがんタイプにおいて、PD-L2が高度に発現していることの臨床的証拠と生物学的証拠の両方を提示した。本発明者らは、そのような効力の欠如が、一つには、腫瘍中に存在するPD-L2のレベルが圧倒的であることによるのだという仮説を設けた。PD-L2がPD-1に対してPD-L1と比べて10倍高いネイティブ結合アフィニティーを有するという以前の所見と合致して、高レベルのPD-L2は、PD-1シグナリング経路の不十分な遮断につながる。この臨床上の短所を克服するために、本発明者らは、PD-L1にもPD-L2にも、それぞれの野生型相互作用と比較した場合にそれぞれ10000倍および200倍の改良された結合アフィニティーで結合し、それらを中和する変異体可溶性PD-1デコイ分子を工学的に作出した。結合アフィニティーのそのような強化には、一つには、結合境界面内および結合境界面外の両方の保存されたアミノ酸変異が寄与している。さらにまた、本発明者らは、sPD-1変異体分子が、T細胞が媒介するキリング（T-cell mediated killing）を、T細胞の生存能に影響を及ぼすことなく刺激する能力を有し、結果として、PD-L2とPD-L1の両方によって駆動される複数の同系がんモデルにおいて、優れたインビボ効力をもたらすことを実証した。
1. 概要
PD-1およびPD-L1を標的とする免疫チェックポイント阻害剤は、がんの処置に著しく貢献していて、最も広く使用される免疫治療の一つになっている。残念なことに、低い患者奏効率が大きな臨床上の難題となっており、そのような短所に対処するために多くの研究努力が、免疫チェックポイント治療を受ける患者にとっての効力および奏効率を改良することに注がれてきた。この研究において、本発明者らは、いずれもPD-1阻害剤とPD-L1阻害剤の両方に対して低応答性である卵巣がん、胃がんおよび食道がんなどのがんタイプにおいて、PD-L2が高度に発現していることの臨床的証拠と生物学的証拠の両方を提示した。本発明者らは、そのような効力の欠如が、一つには、腫瘍中に存在するPD-L2のレベルが圧倒的であることによるのだという仮説を設けた。PD-L2がPD-1に対してPD-L1と比べて10倍高いネイティブ結合アフィニティーを有するという以前の所見と合致して、高レベルのPD-L2は、PD-1シグナリング経路の不十分な遮断につながる。この臨床上の短所を克服するために、本発明者らは、PD-L1にもPD-L2にも、それぞれの野生型相互作用と比較した場合にそれぞれ10000倍および200倍の改良された結合アフィニティーで結合し、それらを中和する変異体可溶性PD-1デコイ分子を工学的に作出した。結合アフィニティーのそのような強化には、一つには、結合境界面内および結合境界面外の両方の保存されたアミノ酸変異が寄与している。さらにまた、本発明者らは、sPD-1変異体分子が、T細胞が媒介するキリング（T-cell mediated killing）を、T細胞の生存能に影響を及ぼすことなく刺激する能力を有し、結果として、PD-L2とPD-L1の両方によって駆動される複数の同系がんモデルにおいて、優れたインビボ効力をもたらすことを実証した。
2. 序論
PD-1シグナリング経路の治療的抑制は、悪性疾患の処置において奏効する戦略であることが判明しており（Berger and Pu 2018,Gene 638:20-25、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、臨床においてかつてない持続的応答を示す（Abdel-Rahman 2016,Immunotherapy 8（12）:1383-1391、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。PD-1およびPD-L1に対する治療用抗体はさまざまながんタイプの処置について、単独治療として、または現行の標準治療との併用治療として、承認されている（Abdel-Rahman 2016,Immunotherapy 8（12）:1383-1391、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。残念なことに、PD-1/PD-L1阻害剤に対する臨床応答は、悪性疾患そのものの不均一性と同じぐらい多様であって、がんの進行に関連する免疫調節と調節不全の複雑さをさらに露呈している（Ruiz de Galarreta,Bresnahan et al. 2019,Cancer Discov 9（8）:1124-1141、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。PD-1シグナリング経路の活性化にPD-L1およびPD-L2の結合と活性化が必要であることは明確に実証されている（Latchman,Wood et al. 2001,Nat Immunol 2（3）:261-268、Ishida,Iwai et al. 2002,Immunol Lett 84（1）:57-62、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。PD-L1はPD-1に対する主要リガンドであり、よく研究されていて、PD-1に対する治療的応答のバイオマーカーであると認識されている（Freeman,Long et al. 2000,J Exp Med 192（7）:1027-1034、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。しかし腫瘍免疫生物学におけるPD-L2の役割は不明瞭なままである（Bardhan,Anagnostou et al. 2016,Front Immunol 7:550、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
PD-1シグナリング経路の治療的抑制は、悪性疾患の処置において奏効する戦略であることが判明しており（Berger and Pu 2018,Gene 638:20-25、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、臨床においてかつてない持続的応答を示す（Abdel-Rahman 2016,Immunotherapy 8（12）:1383-1391、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。PD-1およびPD-L1に対する治療用抗体はさまざまながんタイプの処置について、単独治療として、または現行の標準治療との併用治療として、承認されている（Abdel-Rahman 2016,Immunotherapy 8（12）:1383-1391、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。残念なことに、PD-1/PD-L1阻害剤に対する臨床応答は、悪性疾患そのものの不均一性と同じぐらい多様であって、がんの進行に関連する免疫調節と調節不全の複雑さをさらに露呈している（Ruiz de Galarreta,Bresnahan et al. 2019,Cancer Discov 9（8）:1124-1141、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。PD-1シグナリング経路の活性化にPD-L1およびPD-L2の結合と活性化が必要であることは明確に実証されている（Latchman,Wood et al. 2001,Nat Immunol 2（3）:261-268、Ishida,Iwai et al. 2002,Immunol Lett 84（1）:57-62、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。PD-L1はPD-1に対する主要リガンドであり、よく研究されていて、PD-1に対する治療的応答のバイオマーカーであると認識されている（Freeman,Long et al. 2000,J Exp Med 192（7）:1027-1034、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。しかし腫瘍免疫生物学におけるPD-L2の役割は不明瞭なままである（Bardhan,Anagnostou et al. 2016,Front Immunol 7:550、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
臨床では、PD-1/PD-L1阻害剤の奏効率を高めようとする不断の努力が、管理しやすい毒性プロファイルを維持しつつ治療効力を改良することを目指して、これらの阻害剤を細胞毒性薬のカクテル、標的治療および放射線処置と組み合わせて試験することによってなされてきた（Sullivan,Hamid et al. 2019,Nat Med 25（6）:929-935、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。しかし、あらゆる努力にもかかわらず、卵巣がん、食道がんおよび胃がんなどの一定のがんタイプでは、得られる臨床応答が今も最適ではなく、CD8＋細胞傷害性T細胞の浸潤はごくわずかであり、T細胞活性も限定的であることは、依然として不可解である（Meza-Perez and Randall 2017,Trends Immunol 38（7）:526-536、Sato,Olson et al. 2005,Proc Natl Acad Sci U S A 102（51）:18538-18543、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。興味深いことに、患者腫瘍の免疫組織化学的分析により、腫瘍におけるPD-L1発現とPD-L2発現の両方に関する追加情報が明らかになった。多くの悪性腫瘍においてPD-L1の発現は依然として高いものの、PD-1/PD-L1阻害剤に対して低応答性であることが公知であるこれらのがんでは、PD-1の多分に研究不十分である第2のリガンドPD-L2も高度に発現していることが報告されている（Mak,Tong et al. 2016,Clin Cancer Res 22（3）:609-620、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。一般的には、αPD-1抗体の処置はPD-L1とPD-L2が媒介するPD-1の活性化をどちらも遮断するのに十分であると認識されているが（Garon,Rizvi et al. 2015,N Engl J Med 372（21）:2018-2028、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、本発明者らや他の研究者によって行われた結合研究では、PD-1とPD-L2の間の結合アフィニティーは、PD-1とPD-L1の間の結合アフィニティーと比較して有意に高く（Lazar-Molnar,Yan et al. 2008,Proc Natl Acad Sci U S A 105（30）:10483-10488、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、受容体結合に関してPD-1抗体と競合する場合に、PD-L2は著しく有利になることが示された。
この研究において本発明者らは、PD-L2の過剰発現が、卵巣がん、食道がんおよび胃がんにおける臨床上重要な知見であること、そして高いPD-L1発現およびCD8＋細胞傷害性T細胞の排除と相関することを実証する。この知見を得て、本発明者らは、PD-L1とPD-L2に対して強化された結合アフィニティーを持つ可溶性PD-1リガンドトラップを開発することにした。可溶性PD-1変異体は、PD-L1およびPD-L2それぞれとの野生型結合と比較した場合に、PD-1受容体に対して10,000倍および200倍の結合アフィニティーの改良を示した。受容体-リガンド複合体の構造モデリングにより、結合境界面でも非結合部位でも、そのようなアフィニティー強化に寄与するユニークな変異が明らかになった。結合アフィニティーのこの強化は、インビトロでもインビボでもPD-1受容体活性の抑制の改良につながり、複数のがんタイプにおいてPD-L1およびPD-1を標的とする抗体を上回る性能を示した。さらに重要なことに、遺伝学的アプローチと薬理学的アプローチの両方によって、本発明者らは、PD-1シグナリングに対する独立した寄与因子としてのPD-L2の生物学的必要性を強固なものにし、高アフィニティー可溶性PD-1変異体の使用がPD-L1とPD-L2の両方を発現させるがんを標的とするための臨床的に実行可能な戦略であることを実証した。
3. 結果
PD-L2は、ヒトの卵巣腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍および脳腫瘍において豊富に発現される
PD-L1が媒介するPD-1シグナリングは免疫腫瘍学の分野における広範な研究の対象となってきたが、PD-L2の状況については、とりわけ抗PD-1/PD-L1治療に対して低応答性であるがんでは、それほどわかっていない（Derks,Nason et al. 2015,Cancer Immunol Res 3（10）:1123-1129、Lingohr,Dohmen et al. 2019,Epigenomics 11（6）:639-653、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。本研究において本発明者らは、腫瘍進行中の、特にチェックポイント阻害剤に対して最適でない抗腫瘍効果を示すがんタイプにおける、PD-L2の臨床的関連性を検討したいと考えた。本発明者らは、卵巣がん（n＝156）、食道がん（n＝72）、胃がん（n＝76）および膠芽腫（n＝152）からのヒトがんTMAを選んだ。各標本をPD-L1（Latchman,Wood et al. ）、PD-L2（灰色）および上皮細胞のマーカーとしての汎サイトケラチン（赤）で共染色した。抗PD-L1抗体と抗PD-L2抗体の間の考えうる交差反応性を避けるために、これら2つの抗体の特異性をヒト扁桃組織で検証した（図24E）。PD-L1とPD-L2の発現レベルを染色強度に従ってスコア化し、さらに腫瘍悪性度に従って層別化した。卵巣がん、食道がんおよび胃がんにおいて、PD-L1の発現は、がん性組織では上昇しているが、非悪性標本では有意に低かった（図18A〜18C）。興味深いことに、PD-L2の発現レベルもがんでは有意に増加しており、その発現パターンは、膠芽腫（図18D）を除いて、卵巣がん、胃がんおよび食道がんでのPD-L1（図18A〜18C）と一致する。膠芽腫では、腫瘍において、その悪性度とは無関係に、PD-L2発現が有意に上昇していた。膠芽腫標本の正常とさまざまな悪性度との間にPD-L1発現の変化は検出されなかった（図18D、定量は右側に示されている）。非悪性脳組織の細胞は標本では極めて少なかったが、これらの細胞はPD-L1に関して強いシグナルを有したので、正常組織におけるPD-L1のスコアは高かった。PD-L1とPD-L2のピアソン相関も計算して、各がんタイプについてプロットした（図24A〜24D）。免疫染色での所見と合致して、本発明者らは、4つのがんタイプのすべてにわたってPD-L1とPD-L2の間に正の相関を見いだし、免疫チェックポイント治療に対する応答性が低い腫瘍にはPD-L2が豊富に存在するという本発明者らの仮説を裏付けた（図24A〜24D）。機能面では、PD-L1発現およびPD-L2発現の存在が浸潤性CD8＋T細胞を変化させるかどうかを調べた。本発明者らは、同じTMAからの卵巣がん（図18E）と食道がん（図18F）の標本を染色し、ここでも、腫瘍悪性度に従って層別化されたCD8＋細胞を定量した。卵巣がんでは、血管を伴う非悪性卵巣組織を、CD8＋T細胞の大半が血流に限局している陽性対照として含めた（図18E、上図）。CD8＋T細胞の浸潤について陽性および陰性である卵巣がんの代表的写真を図18Eに示し、ここでも腫瘍悪性度に従って定量した（図25A）。食道がんTMAでは、高いCD8細胞を示す少数の例外を除いて、大半の食道がん試料が低いCD8＋T細胞染色を有した（図18Fおよび図25B）。炎症性食道炎組織を陽性対照としてTMAに含めた。腫瘍におけるCD8＋T細胞の欠如は、PD-L1とPD-L2の両方の存在が、T細胞排除に対する寄与因子でありうることを示唆している。要約すると、本発明者らの結果は、PD-1/PD-L1治療に対する臨床応答が最適でないことが公知である複数のがんタイプにおけるPD-L1とPD-L2の両方の高い発現を実証した。そして、これも、がん組織におけるCD8＋細胞傷害性T細胞の免疫排除に役割を果たしているのかもしれない。
PD-L2は、ヒトの卵巣腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍および脳腫瘍において豊富に発現される
PD-L1が媒介するPD-1シグナリングは免疫腫瘍学の分野における広範な研究の対象となってきたが、PD-L2の状況については、とりわけ抗PD-1/PD-L1治療に対して低応答性であるがんでは、それほどわかっていない（Derks,Nason et al. 2015,Cancer Immunol Res 3（10）:1123-1129、Lingohr,Dohmen et al. 2019,Epigenomics 11（6）:639-653、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。本研究において本発明者らは、腫瘍進行中の、特にチェックポイント阻害剤に対して最適でない抗腫瘍効果を示すがんタイプにおける、PD-L2の臨床的関連性を検討したいと考えた。本発明者らは、卵巣がん（n＝156）、食道がん（n＝72）、胃がん（n＝76）および膠芽腫（n＝152）からのヒトがんTMAを選んだ。各標本をPD-L1（Latchman,Wood et al. ）、PD-L2（灰色）および上皮細胞のマーカーとしての汎サイトケラチン（赤）で共染色した。抗PD-L1抗体と抗PD-L2抗体の間の考えうる交差反応性を避けるために、これら2つの抗体の特異性をヒト扁桃組織で検証した（図24E）。PD-L1とPD-L2の発現レベルを染色強度に従ってスコア化し、さらに腫瘍悪性度に従って層別化した。卵巣がん、食道がんおよび胃がんにおいて、PD-L1の発現は、がん性組織では上昇しているが、非悪性標本では有意に低かった（図18A〜18C）。興味深いことに、PD-L2の発現レベルもがんでは有意に増加しており、その発現パターンは、膠芽腫（図18D）を除いて、卵巣がん、胃がんおよび食道がんでのPD-L1（図18A〜18C）と一致する。膠芽腫では、腫瘍において、その悪性度とは無関係に、PD-L2発現が有意に上昇していた。膠芽腫標本の正常とさまざまな悪性度との間にPD-L1発現の変化は検出されなかった（図18D、定量は右側に示されている）。非悪性脳組織の細胞は標本では極めて少なかったが、これらの細胞はPD-L1に関して強いシグナルを有したので、正常組織におけるPD-L1のスコアは高かった。PD-L1とPD-L2のピアソン相関も計算して、各がんタイプについてプロットした（図24A〜24D）。免疫染色での所見と合致して、本発明者らは、4つのがんタイプのすべてにわたってPD-L1とPD-L2の間に正の相関を見いだし、免疫チェックポイント治療に対する応答性が低い腫瘍にはPD-L2が豊富に存在するという本発明者らの仮説を裏付けた（図24A〜24D）。機能面では、PD-L1発現およびPD-L2発現の存在が浸潤性CD8＋T細胞を変化させるかどうかを調べた。本発明者らは、同じTMAからの卵巣がん（図18E）と食道がん（図18F）の標本を染色し、ここでも、腫瘍悪性度に従って層別化されたCD8＋細胞を定量した。卵巣がんでは、血管を伴う非悪性卵巣組織を、CD8＋T細胞の大半が血流に限局している陽性対照として含めた（図18E、上図）。CD8＋T細胞の浸潤について陽性および陰性である卵巣がんの代表的写真を図18Eに示し、ここでも腫瘍悪性度に従って定量した（図25A）。食道がんTMAでは、高いCD8細胞を示す少数の例外を除いて、大半の食道がん試料が低いCD8＋T細胞染色を有した（図18Fおよび図25B）。炎症性食道炎組織を陽性対照としてTMAに含めた。腫瘍におけるCD8＋T細胞の欠如は、PD-L1とPD-L2の両方の存在が、T細胞排除に対する寄与因子でありうることを示唆している。要約すると、本発明者らの結果は、PD-1/PD-L1治療に対する臨床応答が最適でないことが公知である複数のがんタイプにおけるPD-L1とPD-L2の両方の高い発現を実証した。そして、これも、がん組織におけるCD8＋細胞傷害性T細胞の免疫排除に役割を果たしているのかもしれない。
PD-L1およびPD-L2に対して優れた結合アフィニティーを持つsPD-1変異体の工学的作出
生物系においてPD-L1とPD-L2の両方を拮抗する洗練された方法は、PD-1受容体の可溶性成分を利用することである（図19A）。残念なことに、野生型可溶性PD-1とその両リガンドとのネイティブアフィニティーは、マイクロモル濃度域にあって低く、そのことが、野生型sPD-1を、PD-1/PD-L1/PD-L2シグナリング軸の遮断には無効な拮抗薬にしている（Lazar-Molnar,Yan et al. 2008,Proc Natl Acad Sci U S A 105（30）:10483-10488、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。PD-L1とPD-L2の両方を中和するための高い結合アフィニティーを持つ拮抗薬を開発する試みとして、本発明者らは、PD-1分子の細胞外成分（可溶性PD-1）全体にランダム変異を導入することによって、変異体のライブラリーを作製した。本発明者らが以前に公表したもの（Kariolis,et al. 2014,Nat Chem Biol 10（11）:977-983、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）と同様の戦略を採用することにより、変異体ライブラリーを酵母細胞表面上に融合タンパク質としてディスプレイし、PD-L1への結合が強化されているクローンをさらに濃縮した（図19Bおよび図26）。6ラウンドの選別後に、優れた結合アフィニティーを持つクローンを、さらなる特徴づけおよび解析のために配列決定した（図37）。シグナル領域から始まる位置ナンバリングでSer62、Ser87、Pro89、Asn116、Gly124、Ser127、Ala132およびAla140に対応するsPD-1ドメイン上の8つの残基を変異させた（表４）。N-グリコシル化部位の変異を回避するためにAsn116上の変異を取り除くことにより、sPD-1変異体の最新バージョン（バージョン2）を作製した。安定性と見かけのアフィニティーを改良するために、両バージョンの変異体をヒトIgG4のFcドメインに融合した。ヒトPD-L1およびヒトPD-L2に対する両変異体V1 IgG4およびV2 IgG4の見かけのアフィニティーを、BIAcore（登録商標）表面プラズモン共鳴技術を使って定量的に測定し、野生型sPD-1 IgG4と比較した。野生型sPD-1と比較した場合にヒトPD-L1およびヒトPD-L2に対する結合アフィニティーの有意な改良が、変異体V1にも変異体V2にも検出され、PD-L1およびPD-L2に対してそれぞれ約10,000倍および200倍の結合アフィニティーの改良を呈した（図8）。どちらの場合も、アフィニティーのこの改良は、主として、解離速度が遅くなったことによって推進された（図19Cおよび19D）。sPD-1変異体V1とsPD-1変異体V2の間でKDに有意な相違を認めなかったので、sPD-1変異体V2を使って、全細胞ベースの研究とインビボ研究を行った。総合すると、本発明者らは、酵母表面ディスプレイに基づく技術を使って、PD-L1およびPD-L2に対して高い結合アフィニティーを呈するsPD-1変異体クローンを同定した。これらのクローンは、部位特異的変異の結果としての構造的強化と生物学的強化を評価するために、さらに特徴づけられることになる。
生物系においてPD-L1とPD-L2の両方を拮抗する洗練された方法は、PD-1受容体の可溶性成分を利用することである（図19A）。残念なことに、野生型可溶性PD-1とその両リガンドとのネイティブアフィニティーは、マイクロモル濃度域にあって低く、そのことが、野生型sPD-1を、PD-1/PD-L1/PD-L2シグナリング軸の遮断には無効な拮抗薬にしている（Lazar-Molnar,Yan et al. 2008,Proc Natl Acad Sci U S A 105（30）:10483-10488、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。PD-L1とPD-L2の両方を中和するための高い結合アフィニティーを持つ拮抗薬を開発する試みとして、本発明者らは、PD-1分子の細胞外成分（可溶性PD-1）全体にランダム変異を導入することによって、変異体のライブラリーを作製した。本発明者らが以前に公表したもの（Kariolis,et al. 2014,Nat Chem Biol 10（11）:977-983、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）と同様の戦略を採用することにより、変異体ライブラリーを酵母細胞表面上に融合タンパク質としてディスプレイし、PD-L1への結合が強化されているクローンをさらに濃縮した（図19Bおよび図26）。6ラウンドの選別後に、優れた結合アフィニティーを持つクローンを、さらなる特徴づけおよび解析のために配列決定した（図37）。シグナル領域から始まる位置ナンバリングでSer62、Ser87、Pro89、Asn116、Gly124、Ser127、Ala132およびAla140に対応するsPD-1ドメイン上の8つの残基を変異させた（表４）。N-グリコシル化部位の変異を回避するためにAsn116上の変異を取り除くことにより、sPD-1変異体の最新バージョン（バージョン2）を作製した。安定性と見かけのアフィニティーを改良するために、両バージョンの変異体をヒトIgG4のFcドメインに融合した。ヒトPD-L1およびヒトPD-L2に対する両変異体V1 IgG4およびV2 IgG4の見かけのアフィニティーを、BIAcore（登録商標）表面プラズモン共鳴技術を使って定量的に測定し、野生型sPD-1 IgG4と比較した。野生型sPD-1と比較した場合にヒトPD-L1およびヒトPD-L2に対する結合アフィニティーの有意な改良が、変異体V1にも変異体V2にも検出され、PD-L1およびPD-L2に対してそれぞれ約10,000倍および200倍の結合アフィニティーの改良を呈した（図8）。どちらの場合も、アフィニティーのこの改良は、主として、解離速度が遅くなったことによって推進された（図19Cおよび19D）。sPD-1変異体V1とsPD-1変異体V2の間でKDに有意な相違を認めなかったので、sPD-1変異体V2を使って、全細胞ベースの研究とインビボ研究を行った。総合すると、本発明者らは、酵母表面ディスプレイに基づく技術を使って、PD-L1およびPD-L2に対して高い結合アフィニティーを呈するsPD-1変異体クローンを同定した。これらのクローンは、部位特異的変異の結果としての構造的強化と生物学的強化を評価するために、さらに特徴づけられることになる。
高アフィニティー結合の構造的根拠を同定するためのコンピュータベースのモデリング
PD-1/PD-L1およびPD-L2間のそのようなアフィニティー増加をもたらす構造コンフォメーション（structural confirmation）の変化を決定するために、本発明者らは、sPD-1変異体と共複合体を形成しているヒトPD-L1とヒトPD-L2を比較するコンピュータモデリングを行った。野生型ヒトPD-1/PD-L1複合体構造はPDBから入手できる（4ZQKおよび5IUS）。しかし、PD-1のループ領域には欠落残基と変異残基があるので、本発明者らはまず欠落ループを修復し、4ZQKに基づいて残基を野生型PD-1に戻した。4ZQKと5IUSの配列アラインメントを図2に示す。Schrodinger SuiteのResidue Scanningモジュールを使ってsPD-1構造をモデリングした。PD-1とPD-L1の結晶構造をそれぞれ青および緑で表示し、8つの変異（シグナル領域から始まる位置ナンバリングでSer62、Ser87、Pro89、Asn116、Gly124、Ser127、Ala132およびAla140）をオレンジのスティックで表示する（図3）。先に公表された文献からの知識と本発明者らの構造モデリングデータを組み合わせることにより、本発明者らは、残基G124S、S127VおよびA132Iを結合境界面内の変異と同定し、S62G、S87G、P89LおよびA140Vは結合境界面外にあると同定した。G124SおよびA132Iは、それぞれPD-L1のTyr123およびGln66と、それぞれ1つの追加水素結合を作る（図20Aの左右の図）。変異A132Iにより、PD-L1との表面相補性も、0.72から0.85に増加した（図20B、図29）。これらの変異がPD-1とPD-L1の間の全体的な結合にどのように影響するかをさらに調べるために、個々の変異の前後での結合アフィニティーおよび複合体安定性の変動を計算した。その結果を表4に列挙する。結合アフィニティーと複合体安定性の変動の計算を、結合境界面内および結合境界面外のグループ化した変異についても行った（表５）。負の値が大きいほど、それは、結合アフィニティーと安定性が増加したことを示す。総体的に、境界面変異は、予想どおり結合アフィニティーとタンパク質安定性の両方に寄与しており、結合境界面外の変異は安定性の増加につながる。興味深いことに、結合境界面外の変異A140Vによる複合体安定性の改良は、25.89kcal/molと著しい。この知見により、共複合体の全体的安定性を改良する結合境界面外の変異を同定するための偏りのないスクリーニングアプローチ（non-biased screening approach）の重要性が、さらに補強された。
PD-1/PD-L1およびPD-L2間のそのようなアフィニティー増加をもたらす構造コンフォメーション（structural confirmation）の変化を決定するために、本発明者らは、sPD-1変異体と共複合体を形成しているヒトPD-L1とヒトPD-L2を比較するコンピュータモデリングを行った。野生型ヒトPD-1/PD-L1複合体構造はPDBから入手できる（4ZQKおよび5IUS）。しかし、PD-1のループ領域には欠落残基と変異残基があるので、本発明者らはまず欠落ループを修復し、4ZQKに基づいて残基を野生型PD-1に戻した。4ZQKと5IUSの配列アラインメントを図2に示す。Schrodinger SuiteのResidue Scanningモジュールを使ってsPD-1構造をモデリングした。PD-1とPD-L1の結晶構造をそれぞれ青および緑で表示し、8つの変異（シグナル領域から始まる位置ナンバリングでSer62、Ser87、Pro89、Asn116、Gly124、Ser127、Ala132およびAla140）をオレンジのスティックで表示する（図3）。先に公表された文献からの知識と本発明者らの構造モデリングデータを組み合わせることにより、本発明者らは、残基G124S、S127VおよびA132Iを結合境界面内の変異と同定し、S62G、S87G、P89LおよびA140Vは結合境界面外にあると同定した。G124SおよびA132Iは、それぞれPD-L1のTyr123およびGln66と、それぞれ1つの追加水素結合を作る（図20Aの左右の図）。変異A132Iにより、PD-L1との表面相補性も、0.72から0.85に増加した（図20B、図29）。これらの変異がPD-1とPD-L1の間の全体的な結合にどのように影響するかをさらに調べるために、個々の変異の前後での結合アフィニティーおよび複合体安定性の変動を計算した。その結果を表4に列挙する。結合アフィニティーと複合体安定性の変動の計算を、結合境界面内および結合境界面外のグループ化した変異についても行った（表５）。負の値が大きいほど、それは、結合アフィニティーと安定性が増加したことを示す。総体的に、境界面変異は、予想どおり結合アフィニティーとタンパク質安定性の両方に寄与しており、結合境界面外の変異は安定性の増加につながる。興味深いことに、結合境界面外の変異A140Vによる複合体安定性の改良は、25.89kcal/molと著しい。この知見により、共複合体の全体的安定性を改良する結合境界面外の変異を同定するための偏りのないスクリーニングアプローチ（non-biased screening approach）の重要性が、さらに補強された。
ヒトPD-L2タンパク質構造はPDBから入手できないので、利用可能なマウスPD-L2構造をテンプレートとして使用することにより、ヒトPD-L2のモデルを構築した（図5A）。ヒトPD-L2とマウスPD-L2の配列同一性は約72％である（図6および図5A）。提案されたヒトPD-1/PD-L2モデルとマウスPD-1/PD-L2結晶構造（PDBID:3BP5）のオーバーレイを図6および図5Bに示す。変異体sPD-1と提案されたヒトPD-L2との共複合体の結晶構造を図7に示す。提案された野生型ヒトPD-1/PD-L2と比べた場合、PD-1/PD-L1結合と同様に、変異A132IはPD-L2とも同じ追加水素結合を保っていて、表面相補性の増加をもたらした（図20Cおよび図30）。結合アフィニティーの変動と複合体安定性の計算を、結合境界面内および結合境界面外の単一変異およびグループ化した変異についても行った（表8および表9）。構造シミュレーション解析に基づいて、本発明者らは、結合境界面内の変異と結合境界面外の変異がどちらも全体的な結合アフィニティーと安定性の改良に寄与することを明らかにした。
sPD-1変異体はPD-L1とPD-L2が媒介するPD-1活性化を遮断し、T細胞活性化を誘導する
本sPD-1変異体がPD-L1/PD-L2とPD-1の間の相互作用を効果的に破壊できることを実証するために、本発明者らはまず、ヒトPD-L1がノックインされたMC38細胞（ChemPartner（上海）によって提供されたもの）を使って、PD-L1に対するsPD-1変異体の結合活性を評価した。FACSベースの結合解析を使って、sPD-1変異体の両バージョン、野生型sPD-1およびhIgG4対照を試験した。野生型sPD-1およびhIgG4対照（野生型sPD-1の場合はμM域まで蛍光シグナルを検出することができない）と比べて、sPD-1変異体のどちらのバージョンでも、結合シグナルの有意な改良が観察された（図9A）。後続のインビボ試験を実行するにあたってマウスPD-L1に対するsPD-1の結合を検証するために、本発明者らは、マウスPD-L1およびマウスPD-L2を発現する野生型親MC38に対するsPD-1変異体結合も解析した。バージョン1とバージョン2の両方で、野生型sPD-1と比較して、全体的に低い強度の結合シグナルの増加も検出された（図9B）。結合解析を、肝細胞癌細胞株Hep3B-OS8-hPD-L1（ChemPartner、上海）でも繰り返して、同様の結果を得た（図31）。sPD-1変異体がPD-L1とPD-1の間の受容体媒介相互作用を遮断する能力を有するかどうかを試験するために、本発明者らは、sPD-1変異体、野生型sPD-1およびhIgG4対照を使った受容体結合アッセイ（RBA）を行った。野生型sPD-1およびhIgG4と比較した場合、どちらのsPD-1変異体も、PD-1に対するPD-L1媒介受容体結合の優れた阻害を示した（図21A）。sPD-1変異体がPD-L2に結合してPD-L2が媒介するPD-1活性化を遮断する能力を有することを実証するために、本発明者らは、MC38細胞とHep3B細胞の両方において、ヒトPD-L2を過剰発現させた（図32および33）。結合解析のために、本発明者らはsPD-1変異体V2を、野生型sPD-1、陽性対照としてのαPD-L2抗体、および陰性対照としてのhIgG4と共に試験した。sPD-1変異体は、MC38-PD-L2に対してより良い結合を示し、野生型sPD-1およびαPD-L2抗体はMC38-PD-L2に対してそれより低い力価で結合する（図14）。同様にsPD-1変異体は、受容体結合アッセイにおいてPD-L2が媒介するPD-1の活性化を遮断する能力の強化も呈した（図21B）。sPD-1変異体が、PD-L1またはPD-L2が媒介するシグナリングを遮断することによって、ヒト細胞傷害性T細胞を活性化する能力を有するかどうかを検証するために、ヒトPBMCを健常ドナーから収集し、Hep3B-OS8-hPDL1細胞およびHep3B-OS8-hPDL2細胞と共にインキュベートした。sPD-1変異体、野生型PD-1およびIgG4を加え、傷害性T細胞活性をインターフェロン-γレベルによって測定した。sPD-1変異体は、PD-L1およびPD-L2のそれぞれの存在下でT細胞を活性化する能力が、用量依存的に、野生型sPD-1およびIgG4のどちらと比較した場合にも高く（図10および15）、本sPD-1変異体はPD-L1/PD-L2とPD-1の間の相互作用を遮断することによってT細胞活性を機能的に刺激することができるという主張が裏付けられる。αPD-1抗体とT細胞上のPD-1受容体とを使ったT細胞活性の長期間にわたる刺激は、潜在的に、T細胞の機能性および生存能に経時的に影響を及ぼしうるので、本発明者らのsPD-1変異体は、T細胞の寿命および機能性を保つことを目指して、PD-L1およびPD-L2を発現するがん細胞のみを標的とするように設計された。この仮説を検証するために、本発明者らはまず、いずれもヒトIgG4 Fcに融合されたsPD-1変異体（V1およびV2）と野生型sPD-1の両方を、高純度かつ低エンドトキシンとなるように製造し（図28）、次に、活性化ヒトT細胞（CD3/CD28カクテルでの刺激によるもの）を、PD-L1の存在下または非存在下、αPD-1抗体またはsPD-1変異体のいずれか一方で、12日間にわたって処理した。αPD-1による継続的処理は経時的にT細胞増殖を減速したが、sPD-1変異体処理はT細胞成長に影響を及ぼさず、CD3/CD28刺激T細胞と同様の成長速度を示した。予想どおり、ネイティブT細胞はCD3/CD28刺激の非存在下では増殖しなかった（図21C）。これらの知見により、本sPD-1変異体は、T細胞の生存能および機能性を保ったまま、PD-1/PD-L1およびPD-L2シグナリングカスケードに結合してそれを遮断し、T細胞活性を刺激する能力を有するという概念が補強された。
本sPD-1変異体がPD-L1/PD-L2とPD-1の間の相互作用を効果的に破壊できることを実証するために、本発明者らはまず、ヒトPD-L1がノックインされたMC38細胞（ChemPartner（上海）によって提供されたもの）を使って、PD-L1に対するsPD-1変異体の結合活性を評価した。FACSベースの結合解析を使って、sPD-1変異体の両バージョン、野生型sPD-1およびhIgG4対照を試験した。野生型sPD-1およびhIgG4対照（野生型sPD-1の場合はμM域まで蛍光シグナルを検出することができない）と比べて、sPD-1変異体のどちらのバージョンでも、結合シグナルの有意な改良が観察された（図9A）。後続のインビボ試験を実行するにあたってマウスPD-L1に対するsPD-1の結合を検証するために、本発明者らは、マウスPD-L1およびマウスPD-L2を発現する野生型親MC38に対するsPD-1変異体結合も解析した。バージョン1とバージョン2の両方で、野生型sPD-1と比較して、全体的に低い強度の結合シグナルの増加も検出された（図9B）。結合解析を、肝細胞癌細胞株Hep3B-OS8-hPD-L1（ChemPartner、上海）でも繰り返して、同様の結果を得た（図31）。sPD-1変異体がPD-L1とPD-1の間の受容体媒介相互作用を遮断する能力を有するかどうかを試験するために、本発明者らは、sPD-1変異体、野生型sPD-1およびhIgG4対照を使った受容体結合アッセイ（RBA）を行った。野生型sPD-1およびhIgG4と比較した場合、どちらのsPD-1変異体も、PD-1に対するPD-L1媒介受容体結合の優れた阻害を示した（図21A）。sPD-1変異体がPD-L2に結合してPD-L2が媒介するPD-1活性化を遮断する能力を有することを実証するために、本発明者らは、MC38細胞とHep3B細胞の両方において、ヒトPD-L2を過剰発現させた（図32および33）。結合解析のために、本発明者らはsPD-1変異体V2を、野生型sPD-1、陽性対照としてのαPD-L2抗体、および陰性対照としてのhIgG4と共に試験した。sPD-1変異体は、MC38-PD-L2に対してより良い結合を示し、野生型sPD-1およびαPD-L2抗体はMC38-PD-L2に対してそれより低い力価で結合する（図14）。同様にsPD-1変異体は、受容体結合アッセイにおいてPD-L2が媒介するPD-1の活性化を遮断する能力の強化も呈した（図21B）。sPD-1変異体が、PD-L1またはPD-L2が媒介するシグナリングを遮断することによって、ヒト細胞傷害性T細胞を活性化する能力を有するかどうかを検証するために、ヒトPBMCを健常ドナーから収集し、Hep3B-OS8-hPDL1細胞およびHep3B-OS8-hPDL2細胞と共にインキュベートした。sPD-1変異体、野生型PD-1およびIgG4を加え、傷害性T細胞活性をインターフェロン-γレベルによって測定した。sPD-1変異体は、PD-L1およびPD-L2のそれぞれの存在下でT細胞を活性化する能力が、用量依存的に、野生型sPD-1およびIgG4のどちらと比較した場合にも高く（図10および15）、本sPD-1変異体はPD-L1/PD-L2とPD-1の間の相互作用を遮断することによってT細胞活性を機能的に刺激することができるという主張が裏付けられる。αPD-1抗体とT細胞上のPD-1受容体とを使ったT細胞活性の長期間にわたる刺激は、潜在的に、T細胞の機能性および生存能に経時的に影響を及ぼしうるので、本発明者らのsPD-1変異体は、T細胞の寿命および機能性を保つことを目指して、PD-L1およびPD-L2を発現するがん細胞のみを標的とするように設計された。この仮説を検証するために、本発明者らはまず、いずれもヒトIgG4 Fcに融合されたsPD-1変異体（V1およびV2）と野生型sPD-1の両方を、高純度かつ低エンドトキシンとなるように製造し（図28）、次に、活性化ヒトT細胞（CD3/CD28カクテルでの刺激によるもの）を、PD-L1の存在下または非存在下、αPD-1抗体またはsPD-1変異体のいずれか一方で、12日間にわたって処理した。αPD-1による継続的処理は経時的にT細胞増殖を減速したが、sPD-1変異体処理はT細胞成長に影響を及ぼさず、CD3/CD28刺激T細胞と同様の成長速度を示した。予想どおり、ネイティブT細胞はCD3/CD28刺激の非存在下では増殖しなかった（図21C）。これらの知見により、本sPD-1変異体は、T細胞の生存能および機能性を保ったまま、PD-1/PD-L1およびPD-L2シグナリングカスケードに結合してそれを遮断し、T細胞活性を刺激する能力を有するという概念が補強された。
sPD-1変異体は同系マウスがんモデルにおいて優れた抗腫瘍効力を示す
いくつかの同系マウス腫瘍モデルにおいてsPD-1変異体の治療力価を評価した。N-グリコシル化部位（Asn116）に変異を持たないsPD-1変異体をすべてのインビボ研究に使用した。sPD-1変異体の投与計画とインビボでの薬物動態を決定するために、分子を蛍光色素で標識し、10mg/kgの単回投与をマウスに注射して、処置の30分後、8時間後、24時間後および72時間後に撮像した（図22A）。加えて、同じ投薬で処置された動物から経時的に採取した血清に対して、sPD-1変異体分子のヒトIgG4部分を検出するELISAも行った（図22B）。蛍光イメージング解析とELISA解析はどちらも、sPD-1変異体分子の半減期が投与後約24時間であるという同様の結論に達し、48時間ごとに10mg/kgのインビボ投与に関する理論的根拠を与えた。MC38-hPDL1結腸直腸がんを皮下に接種したマウスを、媒体対照、sPD-1変異体またはアテゾリズマブで処置した。sPD-1変異体で処置した腫瘍でも、アテゾリズマブで処置した腫瘍でも、腫瘍成長の有意な低減が観察された（図11A）。アテゾリズマブ処置と比較して、sPD-1変異体で処置した腫瘍は、腫瘍成長を抑制する優れた効力と、体重の変化によって定義される重篤な毒性を伴わない生存期間の延長を示し（図11C、35、11B）、最適な抗腫瘍活性のためにPD-L1とPD-L2の両方を標的とすることの理論的根拠をさらに与えた（図11B）。PD-L2が媒介する腫瘍成長を拮抗するsPD-1変異体の能力は、ヒトPD-L2を過剰発現するMC38腫瘍が接種されたインビボモデルで実証された（図22C）。腫瘍成長の有意な遅延が、sPD-1変異体またはαPD-1抗体ペンブロリズマブで処置された腫瘍担持マウスにおいて観察された。統計的に有意ではなかったものの、sPD-1変異体処置群では、ペンブロリズマブ処置群と比較して、腫瘍成長がよりよく抑制される傾向があった。これはさらなる研究の理由となりうる（図22C）。sPD-1変異体の抗腫瘍効力をマウスB16/OVA黒色腫モデルおよびID8卵巣がんモデルでも試験した。sPD-1変異体で処置された黒色腫腫瘍は、媒体処置群と比較した場合に、腫瘍成長を維持することができない（図22D）。臨床的に卵巣がん患者はPD-1阻害に対して低応答性であることが公知である。この研究において本発明者らは、同系卵巣がんモデルにおけるsPD-1変異体の効力を試験したいと考えた。ID8卵巣腫瘍細胞を同所性に接種した動物を、媒体対照、sPD-1変異体またはマウスαPD-1抗体で処置し、腹水が発生したら動物を屠殺した。カプラン-マイヤー生存解析は、マウスαPD-1抗体処置群でもsPD-1変異体処置群でも、全生存の改善を示した。しかし、最も有意な延命効果はsPD-1変異体で処置された動物群に見られ、sPD-1変異体は、卵巣がんを標的とするのに、PD-1受容体の遮断よりも有効であることが示唆された（図22E）。αPD-1抗体またはsPD-1変異体で処置したB16/OVA腫瘍（図22F）およびMC38腫瘍（図22Gおよび22H）を担持するマウスにおいて、腫瘍浸潤性T細胞（TIL）を解析した。両阻害剤による処置はCD4＋、CD8＋細胞傷害性T細胞の浸潤の増加をもたらし、ここでも最も有意な変化はsPD-1変異体処置群で観察された。他の腫瘍関連免疫細胞もプロファイリングしたが、処置群間で有意差は検出されなかった（図36）。総合すると、本発明者らは、複数の同系マウス腫瘍モデルにおいて試験されたsPD-1変異体の優れた抗腫瘍効力を実証した。これは、一つにはTILのより良い浸潤によるものであり、新しい形態のチェックポイント阻害剤として、αPD-L1抗体とαPD-1抗体のどちらにも取って代わる可能性を有する。
いくつかの同系マウス腫瘍モデルにおいてsPD-1変異体の治療力価を評価した。N-グリコシル化部位（Asn116）に変異を持たないsPD-1変異体をすべてのインビボ研究に使用した。sPD-1変異体の投与計画とインビボでの薬物動態を決定するために、分子を蛍光色素で標識し、10mg/kgの単回投与をマウスに注射して、処置の30分後、8時間後、24時間後および72時間後に撮像した（図22A）。加えて、同じ投薬で処置された動物から経時的に採取した血清に対して、sPD-1変異体分子のヒトIgG4部分を検出するELISAも行った（図22B）。蛍光イメージング解析とELISA解析はどちらも、sPD-1変異体分子の半減期が投与後約24時間であるという同様の結論に達し、48時間ごとに10mg/kgのインビボ投与に関する理論的根拠を与えた。MC38-hPDL1結腸直腸がんを皮下に接種したマウスを、媒体対照、sPD-1変異体またはアテゾリズマブで処置した。sPD-1変異体で処置した腫瘍でも、アテゾリズマブで処置した腫瘍でも、腫瘍成長の有意な低減が観察された（図11A）。アテゾリズマブ処置と比較して、sPD-1変異体で処置した腫瘍は、腫瘍成長を抑制する優れた効力と、体重の変化によって定義される重篤な毒性を伴わない生存期間の延長を示し（図11C、35、11B）、最適な抗腫瘍活性のためにPD-L1とPD-L2の両方を標的とすることの理論的根拠をさらに与えた（図11B）。PD-L2が媒介する腫瘍成長を拮抗するsPD-1変異体の能力は、ヒトPD-L2を過剰発現するMC38腫瘍が接種されたインビボモデルで実証された（図22C）。腫瘍成長の有意な遅延が、sPD-1変異体またはαPD-1抗体ペンブロリズマブで処置された腫瘍担持マウスにおいて観察された。統計的に有意ではなかったものの、sPD-1変異体処置群では、ペンブロリズマブ処置群と比較して、腫瘍成長がよりよく抑制される傾向があった。これはさらなる研究の理由となりうる（図22C）。sPD-1変異体の抗腫瘍効力をマウスB16/OVA黒色腫モデルおよびID8卵巣がんモデルでも試験した。sPD-1変異体で処置された黒色腫腫瘍は、媒体処置群と比較した場合に、腫瘍成長を維持することができない（図22D）。臨床的に卵巣がん患者はPD-1阻害に対して低応答性であることが公知である。この研究において本発明者らは、同系卵巣がんモデルにおけるsPD-1変異体の効力を試験したいと考えた。ID8卵巣腫瘍細胞を同所性に接種した動物を、媒体対照、sPD-1変異体またはマウスαPD-1抗体で処置し、腹水が発生したら動物を屠殺した。カプラン-マイヤー生存解析は、マウスαPD-1抗体処置群でもsPD-1変異体処置群でも、全生存の改善を示した。しかし、最も有意な延命効果はsPD-1変異体で処置された動物群に見られ、sPD-1変異体は、卵巣がんを標的とするのに、PD-1受容体の遮断よりも有効であることが示唆された（図22E）。αPD-1抗体またはsPD-1変異体で処置したB16/OVA腫瘍（図22F）およびMC38腫瘍（図22Gおよび22H）を担持するマウスにおいて、腫瘍浸潤性T細胞（TIL）を解析した。両阻害剤による処置はCD4＋、CD8＋細胞傷害性T細胞の浸潤の増加をもたらし、ここでも最も有意な変化はsPD-1変異体処置群で観察された。他の腫瘍関連免疫細胞もプロファイリングしたが、処置群間で有意差は検出されなかった（図36）。総合すると、本発明者らは、複数の同系マウス腫瘍モデルにおいて試験されたsPD-1変異体の優れた抗腫瘍効力を実証した。これは、一つにはTILのより良い浸潤によるものであり、新しい形態のチェックポイント阻害剤として、αPD-L1抗体とαPD-1抗体のどちらにも取って代わる可能性を有する。
sPD-1変異体はPD-L2が駆動するヒトがんの動物モデルにおいて有効である（図23）
PD-L2がPD-1の機能的に重要なリガンドであること、およびとりわけPD-L1阻害に対して低応答性であるがんタイプにおいて、PD-L2は単独で、PD-1が媒介する腫瘍成長を促進する能力を有することを実証するために、本発明者らは、CRISPR-CAS9技術を使って、ID8卵巣腫瘍細胞中のPD-L1を遺伝子レベルで除去し、腫瘍細胞をPD-L1ノックアウトマウスに接種することで、腫瘍と宿主の両方におけるPD-L1発現を排除した（図23Aおよび37A）。興味深いことに、PD-L1の完全な喪失は、正常C57/B6マウス中で成長する野生型ID8腫瘍と比較して、低下した腫瘍成長速度と、小さな腫瘍形成とをもたらした。それでも、より多数のID8細胞をマウスに接種すると、おそらく上昇したPD-L2発現により、十分な腫瘍成長が起こった（図2）。sPD-1変異体で処置した腫瘍は成長することができず、一部の処置動物では有意な腫瘍退縮を示した。αPD-L1抗体で処置した腫瘍は、予想どおり、大部分が非応答性のままである（図23Bおよび23C）。ID8 PD-L1 CRISPR細胞を同所性にi.p.接種した別の研究では、αPD-L1処置群がマウス8匹のうちの7匹に腹水が発生したのに対し、sPD-1変異体処置群はマウス8匹のうち3匹だけに腹水が発生し、PD-L2のみによって駆動される卵巣がんを担持するマウスの生存率アウトカムを有意に向上させた（図23D）。最後に、ID8腫瘍をPD-L2発現およびCD8発現の両方について染色した。予想どおり、処置群とは無関係にすべての腫瘍が陽性のPD-L2発現を示したが、腫瘍へのCD8＋T細胞の浸潤は、PD-L1とPD-L2がどちらも失われたことにより、sPD-1変異体で処置した腫瘍だけに見られた（図23E）。
PD-L2がPD-1の機能的に重要なリガンドであること、およびとりわけPD-L1阻害に対して低応答性であるがんタイプにおいて、PD-L2は単独で、PD-1が媒介する腫瘍成長を促進する能力を有することを実証するために、本発明者らは、CRISPR-CAS9技術を使って、ID8卵巣腫瘍細胞中のPD-L1を遺伝子レベルで除去し、腫瘍細胞をPD-L1ノックアウトマウスに接種することで、腫瘍と宿主の両方におけるPD-L1発現を排除した（図23Aおよび37A）。興味深いことに、PD-L1の完全な喪失は、正常C57/B6マウス中で成長する野生型ID8腫瘍と比較して、低下した腫瘍成長速度と、小さな腫瘍形成とをもたらした。それでも、より多数のID8細胞をマウスに接種すると、おそらく上昇したPD-L2発現により、十分な腫瘍成長が起こった（図2）。sPD-1変異体で処置した腫瘍は成長することができず、一部の処置動物では有意な腫瘍退縮を示した。αPD-L1抗体で処置した腫瘍は、予想どおり、大部分が非応答性のままである（図23Bおよび23C）。ID8 PD-L1 CRISPR細胞を同所性にi.p.接種した別の研究では、αPD-L1処置群がマウス8匹のうちの7匹に腹水が発生したのに対し、sPD-1変異体処置群はマウス8匹のうち3匹だけに腹水が発生し、PD-L2のみによって駆動される卵巣がんを担持するマウスの生存率アウトカムを有意に向上させた（図23D）。最後に、ID8腫瘍をPD-L2発現およびCD8発現の両方について染色した。予想どおり、処置群とは無関係にすべての腫瘍が陽性のPD-L2発現を示したが、腫瘍へのCD8＋T細胞の浸潤は、PD-L1とPD-L2がどちらも失われたことにより、sPD-1変異体で処置した腫瘍だけに見られた（図23E）。
この研究において、本発明者らは、免疫チェックポイント阻害剤に対して低応答性であるとみなされるがんにおけるPD-L2の臨床的関連性を実証し、PD-L1とPD-L2の両方を極めて高いアフィニティーで優先的に標的とする治療戦略を提示した。sPD-1変異体の構造解析および生物学的解析は、結合アフィニティーの改良が、そのリガンドの両方を遮断することにより、PD-1経路の優れた抑制につながるという、本発明者らの仮説を強く裏付けた。強化された抗腫瘍効果を実証するインビボデータと共に、sPD-1変異体は、高いPD-L2発現の結果としてPD-1/PD-L1阻害剤に対して十分な応答を欠くがんタイプを標的とするための、実行可能な臨床アプローチになる。
4. 考察
PD-1シグナリング経路の阻害剤などの免疫治療は、がん処置の現況を一変させ、処置に対する持続的応答を享受するがん患者の生存率アウトカムを劇的に改善した（Topalian,Hodi et al. 2012,N Engl J Med 366（26）:2443-2454、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。しかし、免疫治療はがんとの戦いにおける「ブレークスルー」と名付けるに真に値するものの、この処置を受けるすべての患者において十分な免疫応答を促進する「万能（one-size-fits-all）」のアプローチが存在しないことも確かである。PD-1/PD-L1阻害剤に対する応答は、悪性疾患の免疫原性に依存して、がんタイプの間でも同じ処置コホート内の個々の患者の間でも異なる（Pitt,Vetizou et al. 2016,Immunity 44（6）:1255-1269、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。チェックポイント阻害剤に見られる不均一性は、次に挙げるものを含むいくつかの因子に原因があると考えうる。1）マイクロ不安定性（MSI-H）を引き起こす一定のがん細胞内の遺伝的変異は免疫原性が高くなっているので、PD-1阻害剤に対してより良い応答を示す（Diaz and Le 2015,N Engl J Med 373（20）:1979、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。2）腫瘍微小環境内でがんとがん関連間質細胞とによって分泌される因子、例えばPD-L1およびPD-L2が、がん細胞を免疫監視機構から保護して、細胞傷害性T細胞のリクルートメントおよび活性化を防止する（Tumeh,Harview et al. 2014,Nature 515（7528）:568-571、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。総合すると、がん細胞を標的とする宿主免疫応答を促進することができる戦略は、免疫チェックポイント治療の成功にとって不可欠である。
PD-1シグナリング経路の阻害剤などの免疫治療は、がん処置の現況を一変させ、処置に対する持続的応答を享受するがん患者の生存率アウトカムを劇的に改善した（Topalian,Hodi et al. 2012,N Engl J Med 366（26）:2443-2454、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。しかし、免疫治療はがんとの戦いにおける「ブレークスルー」と名付けるに真に値するものの、この処置を受けるすべての患者において十分な免疫応答を促進する「万能（one-size-fits-all）」のアプローチが存在しないことも確かである。PD-1/PD-L1阻害剤に対する応答は、悪性疾患の免疫原性に依存して、がんタイプの間でも同じ処置コホート内の個々の患者の間でも異なる（Pitt,Vetizou et al. 2016,Immunity 44（6）:1255-1269、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。チェックポイント阻害剤に見られる不均一性は、次に挙げるものを含むいくつかの因子に原因があると考えうる。1）マイクロ不安定性（MSI-H）を引き起こす一定のがん細胞内の遺伝的変異は免疫原性が高くなっているので、PD-1阻害剤に対してより良い応答を示す（Diaz and Le 2015,N Engl J Med 373（20）:1979、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。2）腫瘍微小環境内でがんとがん関連間質細胞とによって分泌される因子、例えばPD-L1およびPD-L2が、がん細胞を免疫監視機構から保護して、細胞傷害性T細胞のリクルートメントおよび活性化を防止する（Tumeh,Harview et al. 2014,Nature 515（7528）:568-571、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。総合すると、がん細胞を標的とする宿主免疫応答を促進することができる戦略は、免疫チェックポイント治療の成功にとって不可欠である。
この研究において本発明者らは、PD-1チェックポイント治療に対して臨床的に低応答性であるがんタイプにおけるPD-L1とPD-L2の発現レベルおよび相関を理解することに焦点を合わせている（Imai,Hasegawa et al. 2018,Oncol Lett 15（5）:6457-6468、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。PD-1のより良く知られるリガンドであるPD-L1とは対照的に、がん処置におけるPD-L2の役割は依然として理解しにくい（Yearley,Gibson et al. 2017,Clin Cancer Res 23（12）:3158-3167、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。興味深いことに、PD-L1が、がん細胞によってアップレギュレートされる主要PD-1リガンドであるという一般的な考えとは対照的に、本発明者らは、本発明者らが調べた患者試料のすべてにおいて、PD-L2発現の上昇を有意に観察した。そしてその発現レベルはPD-L1発現と高い相関関係にある。興味深いことに、本発明者らは、がんと非がん性組織の両方でPD-L1が発現することも観察したが、上昇したPD-L2発現はがん組織に限定されるようであり、PD-L2発現は悪性疾患中に誘導されうることが示唆される。これらの知見に基づいて、本発明者らは、PD-L2発現は、PD-1阻害剤に対して低応答性であるがんにおいて高度に発現し、PD-L1とPD-L2の両方を十分に阻害することがPD-1シグナリング経路の最適な拮抗には必要であると考える。
PD-1とPD-L1/L2の間の受容体リガンド相互作用を破壊することによってPD-1シグナリング経路の最適な抑制を達成することが可能である。PD-1抗体を使ったT細胞上のPD-1受容体の遮断は、患者の部分集合に対して持続的な臨床応答をもたらしたが、本発明者らの患者データは、PD-1/PD-L1阻害に対して奏効率が低いがんにおける高レベルのPD-L2発現を示し、PD-L2の存在がPD-1阻害の努力を潜在的に損ないうることが示唆された。事実、本発明者らのデータは、PD-L2とPD-1との間のネイティブ結合アフィニティーがPD-L1とPD-1との間の結合アフィニティーの10倍であることを示した。大半のαPD-1抗体は親和性成熟を起こして、PD-1にそのリガンドの存在下で結合する能力を強化するが、がん細胞によって発現される高レベルのPD-L2は、PD-1結合に関して競合するαPD-1抗体の能力を有意に妨げうる。T細胞上のPD-1受容体を遮断する代わりに、本発明者らは、PD-L1とPD-L2に対する結合アフィニティーがどちらも有意に強化されているsPD-1変異体を作製した。酵母表面ディスプレイプラットフォームを指向的進化アプローチと共に利用して（Kariolis,et al. 2014,Nat Chem Biol 10（11）:977-983、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、PD-L1とPD-L2の両方に対する結合アフィニティーの有意な強化を示す変異体クローンを選択し、そのような高アフィニティー結合を付与する構造的根拠を、コンピュータ構造モデリングによって解析した。野生型sPD-1と変異型sPD-1のPD-L1とのタンパク質相互作用を比較したところ、結合アフィニティーの変化は、シグナル領域から始まる位置ナンバリングで、Ala132における追加の水素結合の獲得と、Ser127およびAla140における変異の結果としての共複合体の安定性の改良との結果であることが明らかになった。同様の所見は、野生型PD1/PD-L2複合体と変異型PD1/PD-L2複合体のタンパク質相互作用を比較した場合にも観察されたことから、結合境界面に生じた変異は受容体-リガンド結合アフィニティーを改良することができ、一方、結合境界面外に存在する変異も全体的構造の安定性を助長するのに同様に重要でありうるという概念が、さらに補強された。興味深いことに、高アフィニティー結合性sPD-1クローンを作製した研究の報告が他にも2つある（Maute,Gordon et al. 2015,Proc Natl Acad Sci U S A 112（47）:E6506-6514、Li,Liang et al. 2018,Cancer Sci 109（8）:2435-2445、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。どちらの研究も、それらの強化された結合アフィニティーに寄与するユニークな変異部位であって、本発明者らの本研究とはオーバラップしないものを報告していることから、望ましい生物学的特性を持つアフィニティー強化型治療薬の作製には偏りのないアプローチが極めて重要であることが、ここでも裏付けられた。
sPD-1変異体が結合アフィニティーを強化すること、およびPD-1とPD-L1/L2の間の相互作用を遮断するそれらの能力が、インビトロFACS結合解析およびRBAアッセイによって明確に実証されたことで、強化されたアフィニティーは優れた生物学的活性につながるという概念が補強される。機能面では、sPD-1変異体は、免疫チェックポイント阻害の特徴であるT細胞活性化の増大ももたらした。すべてのシナリオにおいて、PD-L1だけでも、PD-L2だけでも、PD-1経路を活性化するには十分であり、sPD-1変異体の添加が両リガンドによって媒介されるシグナリングを効果的に破壊することは、明らかであった。本発明者らの研究において、本発明者らは、αPD-1抗体による連続的処理後にT細胞の生存率の低減を観察したが、sPD-1処理されたT細胞は細胞成長に影響がなかった。αPD-1処理後のT細胞生存率の低減がT細胞疲弊の結果であったかどうかを確証することは難しいが、αPD-1抗体はT細胞に直接結合してT細胞を刺激することが公知であるのに対して、sPD-1変異体はがん細胞上のPD-L1/L2を標的とするに過ぎないことから、T細胞との直接的相互作用を回避することは、T細胞の生存能および機能性を維持するのに有益でありうる。
本研究では、次に挙げる2つの疑問に対処するために、αPD-L1抗体またはαPD-1抗体の両方との対比で、sPD-1変異体の抗腫瘍活性を評価した。1）sPD-1変異体は、PD-L1およびPD-L2を遮断する能力が強化されていることで、αPD-L1抗体とαPD-1抗体のどちらをも凌ぐ性能を示すことができるか。2）sPD-1変異体は、PD-L2のみによって駆動される腫瘍モデルにおける腫瘍成長に影響を及ぼすことができるか。事実、sPD-1変異体は、複数の同系マウス腫瘍モデルにおいて、αPD-L1抗体とαPD-1抗体のどちらをも凌ぐ性能を示したことから、受容体-リガンド結合アフィニティーの向上がPD-1阻害の治療アウトカムを改善するという主張が肯定された。さらに重要なことに、腫瘍成長におけるPD-L2の寄与はまだ明確でないので、本発明者らは、PD-L1 CRISPR腫瘍を接種したPD-L1ノックアウトマウスを使って、PD-L2の機能的関連性を評価することで、PD-L2が単独で、PD-L1の非存在下での腫瘍成長を促進する能力を有し、sPD-1変異体を使えば、これをうまく標的とすることができるが、αPD-L1抗体ではうまくいかないことを証明した。ただし、PD-L1を欠く腫瘍モデルでは腫瘍細胞数の増加と腫瘍成長の遅延がどちらも観察されたことは注目に値する。それでも、最終的には、PD-L2の存在は腫瘍成長を維持する能力を有し、その腫瘍成長は、sPD-1変異体を使って効果的に標的とすることができる。
要約すると、この研究により、PD-L2は、複数のがんタイプにおけるPD-1阻害剤に対する不十分な臨床応答と関連する潜在的リスク因子であると同定された。この知見は、本発明者らに、PD-1とPD-L1/L2との間の相互作用を無効にする戦略として、PD-L1とPD-L2の両方に対して優れた結合アフィニティーを持つsPD-1変異体の開発を促す。結合境界面内の変異と結合境界面外の変異が結合アフィニティーの強化に寄与し、αPD-L1抗体とαPD-1抗体のどちらと比べても、優れた抗腫瘍活性をもたらした。さらにまた、PD-L2を発現する腫瘍がPD-L1非依存的にインビボで成長することができ、その成長はsPD-1変異体では抑制されたが、aPD-L1抗体では抑制されなかったという知見は、がんにおけるPD-L2の腫瘍保護的役割をさらに強固にした。これらのデータは全体として、sPD-1変異体を、PD-L1および/またはPD-L2を発現するがんの処置におけるPD-1阻害剤の代替物として評価することを、正当化した。
5. 材料および方法
研究計画
この研究は、インビボモデルおよびヒト臨床標本の両方でPD-L2の関与を評価し、PD-L1とPD-L2の両方に対して極めて高い結合アフィニティーを持つ可溶性PD-1変異体の構造的、生化学的、機能的および治療的効力を特徴づけるために計画された。腫瘍マイクロアレイ標本はすべてUS Biomax（メリーランド州ダーウッド）から購入した。認定獣医病理学者が染色された腫瘍マイクロアレイ標本の免疫組織化学的スコアリングを行った。マウスインビボ試験は、スタンフォード大学およびChemPartner（上海）において、AAAPLACの承認を受けて行われた。動物研究のサンプルサイズは同様のインビボ研究での以前の経験に基づいた。すべての動物を処置群にランダムに割り当てた。サンプルは、研究とは無関係な病気で早期に屠殺する必要があった場合を除き、研究から排除しなかった。実験のエンドポイントは各実験について前もって規定しておいた。腫瘍成長が測定可能な研究では腫瘍成長曲線を提示し、ID8同所性卵巣がんモデルについてはカプラン-マイヤー曲線を使用した。各実験研究について適当な統計解析を使用した。
研究計画
この研究は、インビボモデルおよびヒト臨床標本の両方でPD-L2の関与を評価し、PD-L1とPD-L2の両方に対して極めて高い結合アフィニティーを持つ可溶性PD-1変異体の構造的、生化学的、機能的および治療的効力を特徴づけるために計画された。腫瘍マイクロアレイ標本はすべてUS Biomax（メリーランド州ダーウッド）から購入した。認定獣医病理学者が染色された腫瘍マイクロアレイ標本の免疫組織化学的スコアリングを行った。マウスインビボ試験は、スタンフォード大学およびChemPartner（上海）において、AAAPLACの承認を受けて行われた。動物研究のサンプルサイズは同様のインビボ研究での以前の経験に基づいた。すべての動物を処置群にランダムに割り当てた。サンプルは、研究とは無関係な病気で早期に屠殺する必要があった場合を除き、研究から排除しなかった。実験のエンドポイントは各実験について前もって規定しておいた。腫瘍成長が測定可能な研究では腫瘍成長曲線を提示し、ID8同所性卵巣がんモデルについてはカプラン-マイヤー曲線を使用した。各実験研究について適当な統計解析を使用した。
細胞株
MC38、ID8、ID8-PDL1 CRISPR、B16/OVA、MC38-hPD-L1、MC38-hPD-L2、MC38-hPD-L2-PD-L1 CRISPR、Hep3B-OS8-hPD-L1、Hep3B-OS8-hPD-L2は、加湿37℃、5％CO2インキュベーター中、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質を補足したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で維持した。80％コンフルエントで細胞をトリプシン処理し、継代した。
MC38、ID8、ID8-PDL1 CRISPR、B16/OVA、MC38-hPD-L1、MC38-hPD-L2、MC38-hPD-L2-PD-L1 CRISPR、Hep3B-OS8-hPD-L1、Hep3B-OS8-hPD-L2は、加湿37℃、5％CO2インキュベーター中、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質を補足したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で維持した。80％コンフルエントで細胞をトリプシン処理し、継代した。
酵母ディスプレイsPD-1ライブラリーの合成
ヒトPD-1細胞外ドメイン、アミノ酸Leu25〜Val170をコードするDNAを、NheI制限部位およびBamHI制限部位を使って、pCT酵母ディスプレイプラスミドにクローニングした。配列ナンバリングは、Mihalis S.Kariolisら（Kariolis,et al. 2014,Nat Chem Biol 10（11）:977-983、これは参照により本明細書に完全に組み入れられる）において使用されたものと対応するように行うことで、野生型タンパク質での彼らの研究との比較が容易になるようにした。PD-1細胞外ドメインDNAをテンプレートとして使用してエラープローンライブラリーを作出し、低忠実度Taqポリメラーゼ（Invitrogen）とヌクレオチドアナログ8-オキソ-dGTPおよびdPTP（TriLink Biotech）を使用することによって変異を導入した。ある範囲の変異頻度が得られるようにアナログの濃度とサイクル数を変えて、6回の独立したPCR反応を行った:5サイクル（200μM）、10サイクル（2、20または200μM）、および20サイクル（2または20μM）。これらの反応からの産物を、pCTプラスミドに対してそれぞれ50bpのホモロジーを持つフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使って、ヌクレオチドアナログの非存在下で増幅した。増幅されたDNAはゲル電気泳動を使って精製し、pCTプラスミドをNheIおよびBamHIで消化した。精製された変異体cDNAと直線化されたプラスミドを5:1の重量比でEBY100酵母にエレクトロポレートすることで、それらを、相同組換えにより、インビボで組み立てた（Kariolis,et al. 2014,Nat Chem Biol 10（11）:977-983、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。ライブラリーサイズは希釈平板法により7.4×107であると見積もられた。
ヒトPD-1細胞外ドメイン、アミノ酸Leu25〜Val170をコードするDNAを、NheI制限部位およびBamHI制限部位を使って、pCT酵母ディスプレイプラスミドにクローニングした。配列ナンバリングは、Mihalis S.Kariolisら（Kariolis,et al. 2014,Nat Chem Biol 10（11）:977-983、これは参照により本明細書に完全に組み入れられる）において使用されたものと対応するように行うことで、野生型タンパク質での彼らの研究との比較が容易になるようにした。PD-1細胞外ドメインDNAをテンプレートとして使用してエラープローンライブラリーを作出し、低忠実度Taqポリメラーゼ（Invitrogen）とヌクレオチドアナログ8-オキソ-dGTPおよびdPTP（TriLink Biotech）を使用することによって変異を導入した。ある範囲の変異頻度が得られるようにアナログの濃度とサイクル数を変えて、6回の独立したPCR反応を行った:5サイクル（200μM）、10サイクル（2、20または200μM）、および20サイクル（2または20μM）。これらの反応からの産物を、pCTプラスミドに対してそれぞれ50bpのホモロジーを持つフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使って、ヌクレオチドアナログの非存在下で増幅した。増幅されたDNAはゲル電気泳動を使って精製し、pCTプラスミドをNheIおよびBamHIで消化した。精製された変異体cDNAと直線化されたプラスミドを5:1の重量比でEBY100酵母にエレクトロポレートすることで、それらを、相同組換えにより、インビボで組み立てた（Kariolis,et al. 2014,Nat Chem Biol 10（11）:977-983、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。ライブラリーサイズは希釈平板法により7.4×107であると見積もられた。
ライブラリースクリーニング
高アフィニティーPD-1変異体をディスプレイしている酵母を、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使ってライブラリーから単離した。FACSラウンド1〜3では、酵母を、1mg/ml BSAを含むリン酸緩衝食塩水（PBSA）中、室温において、以下の名目濃度のGas6（R＆D Systems）と共にインキュベートする、平衡結合選別（equilibrium binding sort）を行った:ソート1）10nM PD-L1、3時間;ソート2）2nM PD-L1、3時間;ソート3）0.2nM PD-L1、24時間。PD-L1とのインキュベーション後に、酵母をペレット化し、洗浄し、1:250のニワトリ抗c-Myc（Invitrogen）と共にPBSAに4℃で1時間再懸濁した。次に酵母を洗浄し、ペレット化し、ヤギ抗ニワトリAlexa Fluor 555（Invitrogen）およびマウス抗HIS Hilyte Fluor 488（Anaspec）の1:100希釈液を含むPBSAを使って、氷上で、30分間、二次標識を行った。
高アフィニティーPD-1変異体をディスプレイしている酵母を、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使ってライブラリーから単離した。FACSラウンド1〜3では、酵母を、1mg/ml BSAを含むリン酸緩衝食塩水（PBSA）中、室温において、以下の名目濃度のGas6（R＆D Systems）と共にインキュベートする、平衡結合選別（equilibrium binding sort）を行った:ソート1）10nM PD-L1、3時間;ソート2）2nM PD-L1、3時間;ソート3）0.2nM PD-L1、24時間。PD-L1とのインキュベーション後に、酵母をペレット化し、洗浄し、1:250のニワトリ抗c-Myc（Invitrogen）と共にPBSAに4℃で1時間再懸濁した。次に酵母を洗浄し、ペレット化し、ヤギ抗ニワトリAlexa Fluor 555（Invitrogen）およびマウス抗HIS Hilyte Fluor 488（Anaspec）の1:100希釈液を含むPBSAを使って、氷上で、30分間、二次標識を行った。
FACSラウンド4〜6では、酵母を室温で3時間、2nM PD-L1と共にインキュベートした後、結合していない過剰のGas6を除去するために細胞を2回洗浄し、約50倍モル過剰のPD-1（R＆D Systems）を含有するPBSAに再懸濁することで脱離（unbinding）事象を非可逆的にする、速度論的オフ速度選別を行った。脱離工程の長さは次のとおりとした:ソート4）4時間;ソート5）4時間;ソート6）24時間。脱離反応はすべて室温で行った。解離反応の最後の1時間中は、最終希釈度が1:250になるようにニワトリ抗c-Mycを加えた。酵母をペレット化し、洗浄し、既述のように二次標識を行った。標識された酵母を、FACSにより、Vantage SEフローサイトメーター（スタンフォードFACSコア施設）およびCellQuestソフトウェア（Becton Dickinson）を使って選別した。選別は、最も高いGas6結合/c-Myc発現比を持つ1〜3％のクローンが選択されて、Gas6に対して最も高い結合アフィニティーを持つクローンがライブラリーに濃縮されるように行った。ソート1では、108細胞をスクリーニングし、以降のラウンドでは、ライブラリー多様性の十分なサンプリングを保証するために、先の選別ラウンドで収集されたクローンの数の最低10倍を解析した。選択されたクローンを増殖させ、さらなるFACSラウンドに供した。ソート5およびソート6後に、Zymoprepキット（Zymo Research Corp.）を使ってプラスミドDNAを回収し、XL-1 blueスーパーコンピテント細胞に形質転換し、プラスミドミニプレップキット（Qiagen）を使って単離した。配列決定はSequetech Corp.によって行われた。
酵母ディスプレイ選別産物の解析は同じ試薬およびプロトコールを使って行い、ライブラリー選別について記載した。試料をFACSCalibur（BD Biosciences）で分析し、FlowJoソフトウェア（Treestar Inc.）を使ってデータを解析した。
組換えタンパク質生産
hIgG4 Fcに連結された可溶性PD-1の野生型および変異体を、シグナリングペプチドを持つpCPCプラスミドにクローニングし（ChemPartner、上海）、HEK293ヒト胎児腎臓細胞に一過性にトランスフェクトし、4LのOPM-293 CD03で培養した。次に、産物をプロテインA樹脂MabSelect SuRe（GE Healthcare）によって精製し、superdex 200サイズ排除クロマトグラフィーを使ってさらに単離した。各精製工程後にSDS-PAGEによる確認とSEC-HPLC分析を行った。最終産物をエンドトキシン検査に付して0.09EU/mgであることを確認した。
hIgG4 Fcに連結された可溶性PD-1の野生型および変異体を、シグナリングペプチドを持つpCPCプラスミドにクローニングし（ChemPartner、上海）、HEK293ヒト胎児腎臓細胞に一過性にトランスフェクトし、4LのOPM-293 CD03で培養した。次に、産物をプロテインA樹脂MabSelect SuRe（GE Healthcare）によって精製し、superdex 200サイズ排除クロマトグラフィーを使ってさらに単離した。各精製工程後にSDS-PAGEによる確認とSEC-HPLC分析を行った。最終産物をエンドトキシン検査に付して0.09EU/mgであることを確認した。
コンピュータモデリング解析
ヒトPD1/PDL1複合体構造はタンパク質データバンクから入手することができ、PDBIDは4ZQKおよび5IUSである。しかし、どちらのPDB構造でも、ループ領域においていくつかのPD1残基が欠落しており、一部の残基は野生型PD1と比べて変異していた。欠落ループと変異残基を、結晶構造4ZQKに基づいて、野生型PD1に復元した。Schrodinger SuiteのResidue Scanningモジュールを使って変異PD1構造をモデリングした。変異残基の5.0Å以内の残基を側鎖予測およびバックボーンサンプリングによって精密化した。複数の変異について結合アフィニティーおよび複合体安定性の変動の計算も行った。結合アフィニティーまたは安定性の値は、それが負であるほど、それらの増加が大きいことを示す。ヒトPD1とPDL2の間の相互作用を調べるために、PDL2のホモロジーモデルを構築した。PDB非冗長データセットにおけるホモロジー検索後に、マウスPDL2の3つのPDB構造をテンプレートとして選んだ。ヒトPDL2モデルとマウスPDL2結晶構造（PDBID:3BP5）とのPD1結合境界面の比較。
ヒトPD1/PDL1複合体構造はタンパク質データバンクから入手することができ、PDBIDは4ZQKおよび5IUSである。しかし、どちらのPDB構造でも、ループ領域においていくつかのPD1残基が欠落しており、一部の残基は野生型PD1と比べて変異していた。欠落ループと変異残基を、結晶構造4ZQKに基づいて、野生型PD1に復元した。Schrodinger SuiteのResidue Scanningモジュールを使って変異PD1構造をモデリングした。変異残基の5.0Å以内の残基を側鎖予測およびバックボーンサンプリングによって精密化した。複数の変異について結合アフィニティーおよび複合体安定性の変動の計算も行った。結合アフィニティーまたは安定性の値は、それが負であるほど、それらの増加が大きいことを示す。ヒトPD1とPDL2の間の相互作用を調べるために、PDL2のホモロジーモデルを構築した。PDB非冗長データセットにおけるホモロジー検索後に、マウスPDL2の3つのPDB構造をテンプレートとして選んだ。ヒトPDL2モデルとマウスPDL2結晶構造（PDBID:3BP5）とのPD1結合境界面の比較。
イムノアッセイ
スライドを脱パラフィンし、10mMクエン酸緩衝液、0.05％Tween 20、pH6を使って抗原不活化を実行した。スライドを緩衝液から取り出し、室温で15分間冷却した。内在性ペルオキシダーゼを、34％過酸化水素と水の1:10希釈液で15分間クエンチした。アビジンおよびビオチン遮断剤をそれぞれ15分間加えた。2％ウシ胎児血清を使ったタンパク質ブロックを20分間加えた。血清および抗体はPBT（1×PBS、0.1％BSA、0.2％、0.01％Tween 20）に希釈した。αヒトPD-L1 1:500（＃AF154、R＆D systems、ミネソタ州ミネアポリス）、αヒトPD-L2 1:500（＃MABC1120、EMD Millipore、マサチューセッツ州）、αヒトCD8 1:500（＃Ab4005、Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、αマウスPD-L1 1:750（＃17952-1-AP、Proteintech、イリノイ州）、αマウスPD-L2 1:750（＃Ab21107、Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）およびαマウスCD8 1:500（＃Ab203035、Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）抗体を℃で一晩インキュベートした。免疫組織化学の場合は、抗ウサギおよび抗ラットを各スライドに加え、37℃で30分間インキュベートしてから、STREP-HRPと共に37℃で30分間インキュベートし、DAB基質キット（＃34002、ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を使ってシグナルを生じさせた。免疫蛍光検出の場合は、染色を暗所で実行し、PBS中の2％BSAおよび0.1％tween 20に1:400希釈した二次抗体を室温で1時間インキュベートした。予め室温に温めておいた70％エタノール中の0.2％Sudan Black B溶液を、シリンジフィルタを通して、スライドに室温で10分間加えた。DAPI（＃F6057、Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）0.1μg/mLを対比染色のために使用し、カバーガラスを適用した。ヒトIgG4（＃BMS2059、ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）のELISA定量は製造者の指示に従って実行した。
スライドを脱パラフィンし、10mMクエン酸緩衝液、0.05％Tween 20、pH6を使って抗原不活化を実行した。スライドを緩衝液から取り出し、室温で15分間冷却した。内在性ペルオキシダーゼを、34％過酸化水素と水の1:10希釈液で15分間クエンチした。アビジンおよびビオチン遮断剤をそれぞれ15分間加えた。2％ウシ胎児血清を使ったタンパク質ブロックを20分間加えた。血清および抗体はPBT（1×PBS、0.1％BSA、0.2％、0.01％Tween 20）に希釈した。αヒトPD-L1 1:500（＃AF154、R＆D systems、ミネソタ州ミネアポリス）、αヒトPD-L2 1:500（＃MABC1120、EMD Millipore、マサチューセッツ州）、αヒトCD8 1:500（＃Ab4005、Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、αマウスPD-L1 1:750（＃17952-1-AP、Proteintech、イリノイ州）、αマウスPD-L2 1:750（＃Ab21107、Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）およびαマウスCD8 1:500（＃Ab203035、Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）抗体を℃で一晩インキュベートした。免疫組織化学の場合は、抗ウサギおよび抗ラットを各スライドに加え、37℃で30分間インキュベートしてから、STREP-HRPと共に37℃で30分間インキュベートし、DAB基質キット（＃34002、ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を使ってシグナルを生じさせた。免疫蛍光検出の場合は、染色を暗所で実行し、PBS中の2％BSAおよび0.1％tween 20に1:400希釈した二次抗体を室温で1時間インキュベートした。予め室温に温めておいた70％エタノール中の0.2％Sudan Black B溶液を、シリンジフィルタを通して、スライドに室温で10分間加えた。DAPI（＃F6057、Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）0.1μg/mLを対比染色のために使用し、カバーガラスを適用した。ヒトIgG4（＃BMS2059、ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）のELISA定量は製造者の指示に従って実行した。
表面プラズモン共鳴
ヒトPD-L1（＃10084-H08H、SinoBiological、ペンシルベニア州ウェイン）およびヒトPD-L2（＃10292-H08H、SinoBiological、ペンシルベニア州ウェイン）を分析物として使用した。ランニング緩衝液HBS-EP＋（10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTAおよび0.05％P20、pH7.4）を調製した。流速は30μL/分で行った。CM5センサーチップ上に抗ヒトFc IgGを固定化。PD1-Fcを固定化センサーチップに捕捉した。連続希釈した分析物の注入を使用した。表面再生として30秒間のグリシンpH1.5を使用した。マルチサイクルカイネティクスをBiacore T200で実行した。Kd解析はBiacore T200評価ソフトウェア（GE Healthcare Life Sciences）を使って計算した。
ヒトPD-L1（＃10084-H08H、SinoBiological、ペンシルベニア州ウェイン）およびヒトPD-L2（＃10292-H08H、SinoBiological、ペンシルベニア州ウェイン）を分析物として使用した。ランニング緩衝液HBS-EP＋（10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTAおよび0.05％P20、pH7.4）を調製した。流速は30μL/分で行った。CM5センサーチップ上に抗ヒトFc IgGを固定化。PD1-Fcを固定化センサーチップに捕捉した。連続希釈した分析物の注入を使用した。表面再生として30秒間のグリシンpH1.5を使用した。マルチサイクルカイネティクスをBiacore T200で実行した。Kd解析はBiacore T200評価ソフトウェア（GE Healthcare Life Sciences）を使って計算した。
フローサイトメトリーベースの結合アッセイ
MC38-hPD-L1、MC38-hPD-L2、Hep3B-OS8-hPD-L1、Hep3B-OS8-hPD-L2および親MC38細胞を標準的組織培養条件で培養した。細胞を収穫し、上清を捨てた後、1ウェルあたり3×105細胞で、染色プレートに分配した。プレートを4℃、300gで、5分間遠心分離した。さまざまな濃度のsPD-1変異体および陰性対照を、2％FBSを含有するFACS緩衝液に希釈し、100μL/ウェルを加えた。細胞を4℃で1時間インキュベートし、200μLのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離した。各洗浄の前と後に上清を捨てた。細胞を抗ヒトIgG-Alexa 488（＃A28175、ThermoFisher、マサチューセッツ州ウォルサム）を含む1:1000希釈液で100μL/ウェルに再懸濁した。プレートを4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を100μLの冷PBSに再懸濁した。細胞を暗所に保ち、FACS解析をFACS CantoII（BD Biosciences、カリフォルニア州サンホゼ）で実行した。
MC38-hPD-L1、MC38-hPD-L2、Hep3B-OS8-hPD-L1、Hep3B-OS8-hPD-L2および親MC38細胞を標準的組織培養条件で培養した。細胞を収穫し、上清を捨てた後、1ウェルあたり3×105細胞で、染色プレートに分配した。プレートを4℃、300gで、5分間遠心分離した。さまざまな濃度のsPD-1変異体および陰性対照を、2％FBSを含有するFACS緩衝液に希釈し、100μL/ウェルを加えた。細胞を4℃で1時間インキュベートし、200μLのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離した。各洗浄の前と後に上清を捨てた。細胞を抗ヒトIgG-Alexa 488（＃A28175、ThermoFisher、マサチューセッツ州ウォルサム）を含む1:1000希釈液で100μL/ウェルに再懸濁した。プレートを4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を100μLの冷PBSに再懸濁した。細胞を暗所に保ち、FACS解析をFACS CantoII（BD Biosciences、カリフォルニア州サンホゼ）で実行した。
受容体遮断アッセイ
Hep3B-OS8-hPD-L1、Hep3B-OS8-hPD-L2、MC38-hPD-L1およびMC38-hPD-L2細胞を、T175フラスコ中のPRMI 1640培地、10％FBS、G418およびhygroで、60〜80％コンフルエントまで培養した。細胞を収穫し、希釈緩衝液に再懸濁した。細胞を丸底96ウェルプレートcorning ＃3799に、2×105細胞/ウェルの密度で分配した。sPD-1変異体を、複数の濃度:600、120、24、4.8、0.96、0.192、0.00384nMおよび0nMで、希釈緩衝液に再懸濁した。sPD-1野生型も希釈緩衝液に調製した。プレートを500gで3分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を50μLの抗体と共に再懸濁してから、50μLのリガンドを加えた。プレートを4℃で2時間インキュベートしてから遠心分離し、洗浄した。希釈緩衝液に1:1000希釈のストレプトアビジン-Alexa Flour 488（＃S11223、Thermo Fisher、マサチューセッツ州ウォルサム）を調製し、細胞と共に4℃で1時間インキュベートした。プレートを遠心分離し、洗浄してから、200μLのFACS緩衝液に再懸濁した。細胞をFACS Canto II（BD Biosciences、カリフォルニア州サンホゼ）にかけた。MFI値の曲線を描き、IC50および上端を計算した。
Hep3B-OS8-hPD-L1、Hep3B-OS8-hPD-L2、MC38-hPD-L1およびMC38-hPD-L2細胞を、T175フラスコ中のPRMI 1640培地、10％FBS、G418およびhygroで、60〜80％コンフルエントまで培養した。細胞を収穫し、希釈緩衝液に再懸濁した。細胞を丸底96ウェルプレートcorning ＃3799に、2×105細胞/ウェルの密度で分配した。sPD-1変異体を、複数の濃度:600、120、24、4.8、0.96、0.192、0.00384nMおよび0nMで、希釈緩衝液に再懸濁した。sPD-1野生型も希釈緩衝液に調製した。プレートを500gで3分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を50μLの抗体と共に再懸濁してから、50μLのリガンドを加えた。プレートを4℃で2時間インキュベートしてから遠心分離し、洗浄した。希釈緩衝液に1:1000希釈のストレプトアビジン-Alexa Flour 488（＃S11223、Thermo Fisher、マサチューセッツ州ウォルサム）を調製し、細胞と共に4℃で1時間インキュベートした。プレートを遠心分離し、洗浄してから、200μLのFACS緩衝液に再懸濁した。細胞をFACS Canto II（BD Biosciences、カリフォルニア州サンホゼ）にかけた。MFI値の曲線を描き、IC50および上端を計算した。
T細胞刺激およびT増殖アッセイ
健常ドナーからの血液試料を等体積の滅菌PBSで希釈し、穏やかに振とうすることで混合した。15mLのFicoll-Paque PLUS（-1440-02、GE Healthcare、ペンシルベニア州ピッツバーグ）媒体を、新しい50mL遠心チューブに移して、Ficollと血液の体積比を3:4にした。次に、Ficoll媒体の表面に、希釈された血液試料を、混合を避けるために注意深く、重層した。チューブを、遠心分離中は最大加速および最小減速の設定にして、20℃、400gで30分間遠心分離した。遠心分離後には4つの界面が観察され、上から下に向かって血漿、単核球、Ficoll培地およびRBCの層が見られた。単核球の層を静かに取り出し、新しい滅菌遠心チューブに移した。収集したPBMCに洗浄のために滅菌PBS緩衝液を加えた。チューブを、遠心分離中は最大加速および最小減速の設定にして、20℃、300×gで10分間遠心分離した。細胞をアッセイ用に10％FBS＋RPMI 1640で再懸濁した。マイコプラズマフリーHep3b-hPDL1-OS8細胞を15cmディッシュに調製し、使用前のコンフルエンシーを60〜80％に保った。細胞をTrypLE（商標）Express（＃12605-036、Thermo Fisher、マサチューセッツ州ウォルサム）でトリプシン処理した後、50mL遠心チューブに収集し、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を、5〜10mLの10％FBS＋RPMI 1640培地中で、マイトマイシン（＃H33020786、中国浙江省）10μg/mLと共に再懸濁した。細胞を37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をPBSで洗浄し、細胞を血球計算器でカウントした。細胞を20℃、1000rpmで5分間遠心分離した。次に、細胞を10％FBS＋RPMI 1640アッセイで再懸濁した。96ウェルマイクロプレートで5E4細胞/ウェルのPBMCを100μL/ウェルで加えることによってPBMC刺激を行った。50μL/ウェルの一連の5×OD1 v2、5×PD1 WT、またはhIgG4タンパク質溶液を加えてから、5000細胞/ウェルのAPC Hep3b-hPDL1-OS8を50μL/ウェルで加えた。混合した溶液を37℃で72時間インキュベートした。上清を収穫し、ELISA試験の前に、-20℃に置いた。IFN-γ濃度をELISAキットで試験した。IFN-γの定量は、R＆Dから購入したquantikine ELISAキットで決定した。ヒトIFN-γ ELISAキット（R＆D、カタログ番号DY285）によって概説されているアッセイ手順に従った。ELISAプレートリーダーを使い、波長450nmで、プレートを読み取った。
健常ドナーからの血液試料を等体積の滅菌PBSで希釈し、穏やかに振とうすることで混合した。15mLのFicoll-Paque PLUS（-1440-02、GE Healthcare、ペンシルベニア州ピッツバーグ）媒体を、新しい50mL遠心チューブに移して、Ficollと血液の体積比を3:4にした。次に、Ficoll媒体の表面に、希釈された血液試料を、混合を避けるために注意深く、重層した。チューブを、遠心分離中は最大加速および最小減速の設定にして、20℃、400gで30分間遠心分離した。遠心分離後には4つの界面が観察され、上から下に向かって血漿、単核球、Ficoll培地およびRBCの層が見られた。単核球の層を静かに取り出し、新しい滅菌遠心チューブに移した。収集したPBMCに洗浄のために滅菌PBS緩衝液を加えた。チューブを、遠心分離中は最大加速および最小減速の設定にして、20℃、300×gで10分間遠心分離した。細胞をアッセイ用に10％FBS＋RPMI 1640で再懸濁した。マイコプラズマフリーHep3b-hPDL1-OS8細胞を15cmディッシュに調製し、使用前のコンフルエンシーを60〜80％に保った。細胞をTrypLE（商標）Express（＃12605-036、Thermo Fisher、マサチューセッツ州ウォルサム）でトリプシン処理した後、50mL遠心チューブに収集し、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を、5〜10mLの10％FBS＋RPMI 1640培地中で、マイトマイシン（＃H33020786、中国浙江省）10μg/mLと共に再懸濁した。細胞を37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をPBSで洗浄し、細胞を血球計算器でカウントした。細胞を20℃、1000rpmで5分間遠心分離した。次に、細胞を10％FBS＋RPMI 1640アッセイで再懸濁した。96ウェルマイクロプレートで5E4細胞/ウェルのPBMCを100μL/ウェルで加えることによってPBMC刺激を行った。50μL/ウェルの一連の5×OD1 v2、5×PD1 WT、またはhIgG4タンパク質溶液を加えてから、5000細胞/ウェルのAPC Hep3b-hPDL1-OS8を50μL/ウェルで加えた。混合した溶液を37℃で72時間インキュベートした。上清を収穫し、ELISA試験の前に、-20℃に置いた。IFN-γ濃度をELISAキットで試験した。IFN-γの定量は、R＆Dから購入したquantikine ELISAキットで決定した。ヒトIFN-γ ELISAキット（R＆D、カタログ番号DY285）によって概説されているアッセイ手順に従った。ELISAプレートリーダーを使い、波長450nmで、プレートを読み取った。
レンチウイルスで形質導入されたHep3B-OS8細胞およびMC38細胞におけるPD-L2の発現
Hep3B-OS8（4E8）細胞株に、本発明者らの組織内で、pLVX-IRES-hygro-hPDL2:CPを形質導入し、1640培地で増殖させた。MC38細胞にpLVX-IRES-hygro-hPDL2を形質導入した。細胞を標準的手順に従って収穫し、上清を捨てた。細胞を、丸底96ウェル染色プレート（corning、参照番号3799）に、1ウェルにつき3e5細胞ずつ分配した。プレートを4℃、300gで、5分間、遠心機にかけた。タイトレートされた1×PBS＋2％FBS FACS緩衝液中のウサギ抗hPD-L2 100μLを、各ウェルに加え、4℃で1時間インキュベートした。細胞を200μLのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離した。各洗浄の前と後に上清を捨てた。細胞を、二次ロバ-抗ウサギIgG（H＋L）Alexa488 life technology抗体の1:1000希釈液により、100μL/ウェルで再懸濁し、4℃で1時間インキュベートした。細胞を再び200μLのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離した。各洗浄の前と後に上清を捨てた。細胞を100μLのPBSに再懸濁した。細胞を暗所に保ち、FACS解析に供した。
Hep3B-OS8（4E8）細胞株に、本発明者らの組織内で、pLVX-IRES-hygro-hPDL2:CPを形質導入し、1640培地で増殖させた。MC38細胞にpLVX-IRES-hygro-hPDL2を形質導入した。細胞を標準的手順に従って収穫し、上清を捨てた。細胞を、丸底96ウェル染色プレート（corning、参照番号3799）に、1ウェルにつき3e5細胞ずつ分配した。プレートを4℃、300gで、5分間、遠心機にかけた。タイトレートされた1×PBS＋2％FBS FACS緩衝液中のウサギ抗hPD-L2 100μLを、各ウェルに加え、4℃で1時間インキュベートした。細胞を200μLのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離した。各洗浄の前と後に上清を捨てた。細胞を、二次ロバ-抗ウサギIgG（H＋L）Alexa488 life technology抗体の1:1000希釈液により、100μL/ウェルで再懸濁し、4℃で1時間インキュベートした。細胞を再び200μLのFACS緩衝液で2回洗浄し、300gで5分間遠心分離した。各洗浄の前と後に上清を捨てた。細胞を100μLのPBSに再懸濁した。細胞を暗所に保ち、FACS解析に供した。
インビボ腫瘍研究
動物実験はすべてスタンフォード大学の施設内動物実験委員会（IACUC）およびChemPartner（上海）の動物倫理委員会によって審査、承認された。hPD-L1ノックインを持つC57B/6マウスはBiocytogen（中国北京）から購入し、野生型C57/B6マウスはBiocytogen（中国北京）またはJackson Laboratory（メイン州バーハーバー）から購入した。C57B/6バックグラウンドのPD-L1ノックアウトマウスは（スタンフォード大学のDean W.Felsher博士）の厚意により提供された。ID8卵巣腫瘍研究には6〜8週齢の雌マウスを使用し、MC38結腸直腸研究およびB16/OVA黒色腫研究には6〜8週齢の雄マウスを使用した。マウスは病原体フリー動物施設に収容して、定温・定湿および制御された12時間明暗周期下に維持した。MC38、MC38-hPD-L1、MC38-hPD-L2結腸直腸研究およびB16/OVA黒色腫研究の場合、1x10＾6細胞を皮下に注入し、腫瘍接種の約7日後に腫瘍成長が確認されたら、対照群または適当な処置群にランダムに割り当てた。試験の間はずっと腫瘍成長を測定し、体重を記録した。腫瘍の大半が倫理的エンドポイントに到達すると同時に動物を屠殺した。ID8卵巣研究の場合は、5x10＾6細胞を腹腔内に注入し、生存研究のために腹水が発生したら各動物を屠殺した。PD-L1ノックアウトマウスで行われた腫瘍研究では、2つの別々の研究のために、10x10＾6個のID8細胞を皮下または腹腔内に注入した。
動物実験はすべてスタンフォード大学の施設内動物実験委員会（IACUC）およびChemPartner（上海）の動物倫理委員会によって審査、承認された。hPD-L1ノックインを持つC57B/6マウスはBiocytogen（中国北京）から購入し、野生型C57/B6マウスはBiocytogen（中国北京）またはJackson Laboratory（メイン州バーハーバー）から購入した。C57B/6バックグラウンドのPD-L1ノックアウトマウスは（スタンフォード大学のDean W.Felsher博士）の厚意により提供された。ID8卵巣腫瘍研究には6〜8週齢の雌マウスを使用し、MC38結腸直腸研究およびB16/OVA黒色腫研究には6〜8週齢の雄マウスを使用した。マウスは病原体フリー動物施設に収容して、定温・定湿および制御された12時間明暗周期下に維持した。MC38、MC38-hPD-L1、MC38-hPD-L2結腸直腸研究およびB16/OVA黒色腫研究の場合、1x10＾6細胞を皮下に注入し、腫瘍接種の約7日後に腫瘍成長が確認されたら、対照群または適当な処置群にランダムに割り当てた。試験の間はずっと腫瘍成長を測定し、体重を記録した。腫瘍の大半が倫理的エンドポイントに到達すると同時に動物を屠殺した。ID8卵巣研究の場合は、5x10＾6細胞を腹腔内に注入し、生存研究のために腹水が発生したら各動物を屠殺した。PD-L1ノックアウトマウスで行われた腫瘍研究では、2つの別々の研究のために、10x10＾6個のID8細胞を皮下または腹腔内に注入した。
統計解析
腫瘍標本の相関分析にはいずれもピアソン相関を使用した。IHC Hスコア値は、認定獣医病理学者によって決定された。腫瘍体積、生存率、インビボ免疫組織化学はすべて、Prismソフトウェア（GraphPad Software Inc）を使って行われた。複数の処置群を互いに比較するためにANOVAをTukey-Kramer検定と共に使用した。P＜0.05を有意とみなした。経時的に測定された複数の処置群の比較には、反復測定ANOVAを使用した。生存曲線の統計解析はID8生存研究で行った。群間の平均生存率を比較するためにログランク（マンテル・コックス）検定を行った。P≦0.05を統計的に有意とみなした。
腫瘍標本の相関分析にはいずれもピアソン相関を使用した。IHC Hスコア値は、認定獣医病理学者によって決定された。腫瘍体積、生存率、インビボ免疫組織化学はすべて、Prismソフトウェア（GraphPad Software Inc）を使って行われた。複数の処置群を互いに比較するためにANOVAをTukey-Kramer検定と共に使用した。P＜0.05を有意とみなした。経時的に測定された複数の処置群の比較には、反復測定ANOVAを使用した。生存曲線の統計解析はID8生存研究で行った。群間の平均生存率を比較するためにログランク（マンテル・コックス）検定を行った。P≦0.05を統計的に有意とみなした。
K. 実施例11:免疫チェックポイント阻害剤の効力を強化するためのPD-L1およびPD-L2の中和
1. ヒトPD-L1およびPD-L2に対する変異体クローンスクリーニング
7つの変異（シグナル領域から始まる位置ナンバリングで62-87-89-124-127-132-140）を持つ高アフィニティー結合sPD-1変異体から生じるパーミュテーションの考えうるすべての組合せで構成される128のsPD-1変異体の酵母ディスプレイライブラリーを、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使ってライブラリーから単離した。酵母を、1mg/ml BSAを含むリン酸緩衝食塩水（PBSA）中、室温において、以下の名目濃度のPDL1-FcおよびPD-L2-Fcと共にインキュベートする、平衡結合選別を行った。最も高結合のクローンを収集し、さらなる分析のために配列決定した。
1. ヒトPD-L1およびPD-L2に対する変異体クローンスクリーニング
7つの変異（シグナル領域から始まる位置ナンバリングで62-87-89-124-127-132-140）を持つ高アフィニティー結合sPD-1変異体から生じるパーミュテーションの考えうるすべての組合せで構成される128のsPD-1変異体の酵母ディスプレイライブラリーを、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使ってライブラリーから単離した。酵母を、1mg/ml BSAを含むリン酸緩衝食塩水（PBSA）中、室温において、以下の名目濃度のPDL1-FcおよびPD-L2-Fcと共にインキュベートする、平衡結合選別を行った。最も高結合のクローンを収集し、さらなる分析のために配列決定した。
2. 選択されたクローンの特性解析
図38Aは最初の変異体PD-1クローン中に存在するアミノ酸変異を図解しており、すべての変異を使って、それら7つの変異の考えうるパーミュテーションを含む128のsPD-1変異体クローンのライブラリーを作製した。図38Bは、128のsPD-1変異体クローンライブラリーからさらなる結合解析のために選択された上位5つの変異体クローンのリストである。図39は、PD-L1に対する元の変異体sPD-1とクローン＃1〜5の用量依存的結合曲線を表し、PD-L1に対する元の変異体sPD-1とクローン＃1〜5の結合のKd値が図40に要約されている。図41は、PD-L2に対する元の変異体sPD-1とクローン＃1〜5の用量依存的結合曲線を表し、PD-L2に対する元の変異体sPD-1とクローン＃1〜5の結合のKd値が図42に要約されている。
図38Aは最初の変異体PD-1クローン中に存在するアミノ酸変異を図解しており、すべての変異を使って、それら7つの変異の考えうるパーミュテーションを含む128のsPD-1変異体クローンのライブラリーを作製した。図38Bは、128のsPD-1変異体クローンライブラリーからさらなる結合解析のために選択された上位5つの変異体クローンのリストである。図39は、PD-L1に対する元の変異体sPD-1とクローン＃1〜5の用量依存的結合曲線を表し、PD-L1に対する元の変異体sPD-1とクローン＃1〜5の結合のKd値が図40に要約されている。図41は、PD-L2に対する元の変異体sPD-1とクローン＃1〜5の用量依存的結合曲線を表し、PD-L2に対する元の変異体sPD-1とクローン＃1〜5の結合のKd値が図42に要約されている。
上述の実施例は、本発明の組成物、システムおよび方法の態様をどのように作製し使用するかについて完全な開示と説明を当業者に与えるために提供されており、本発明者らが自分達の発明であるとみなしているものの範囲を限定しようとするものではない。本発明を実施するための上述の形態の、当業者に自明な変更は、以下の請求項の範囲内にあるものとする。本明細書において言及した特許および刊行物はいずれも、本発明が関係する技術分野の当業者の技能水準を示す。本開示において引用した参考文献はすべて、あたかも各参考文献が個別に参照によりその全体が本明細書に組み入れられたかのごとく、参照により本明細書に組み入れられる。
見出しおよびセクション名はいずれも、明確な説明と参照のために使用されているに過ぎず、決して限定であるとみなしてはならない。例えば当業者には、本明細書に記載する発明の要旨および範囲に従って、適宜、異なる見出しおよびセクションからのさまざまな局面を組み合わせることの有用性が理解されるだろう。
本明細書において言及された参考文献はいずれも、個々の刊行物または特許または特許出願があらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
当業者には明らかであるだろうが、本願には、その要旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更および変形を加えることができる。本明細書に記載した具体的な態様および実施例は例示でしかない。
さらなる一局面において、本発明は、がんを持つ対象における腫瘍の転移または浸潤を処置、低減、または防止する上述の方法、あるいは感染症を持つ対象を処置する上述の方法であって、有効用量の1種または複数種のFc融合タンパク質が対象におけるT細胞応答を増加させる、方法を提供する。
[本発明1001]
（a）SEQ ID NO:1との比較で、120、112、107、104、67、69、96および42からなる群より選択される位置番号にあるアミノ酸置換を含む、可溶性PD-1（sPD-1）バリアントドメイン、
（b）任意選択のリンカー、ならびに
（c）Fcドメイン
を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質。
[本発明1002]
N末端からC末端に向かって、
（a）sPD-1バリアントドメイン、
（b）任意選択のリンカー、および
（c）Fcドメイン
を含む、本発明1001のFc融合タンパク質。
[本発明1003]
N末端からC末端に向かって、
（a）Fcドメイン、
（b）任意選択のリンカー、および
（c）sPD-1バリアントドメイン
を含む、本発明1001のFc融合タンパク質。
[本発明1004]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:1に対して少なくとも95％の同一性を示す、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1005]
sPD-1バリアントドメインが前記位置のうちの1つ、該位置のうちの2つ、該位置のうちの3つ、該位置のうちの4つ、該位置のうちの5つ、該位置のうちの6つ、該位置のうちの7つまたは該位置のうちの8つにアミノ酸置換を有する、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1006]
sPD-1バリアントドメインが、A120V、A112I、S107V、G104S、S67G、P69L、N96SおよびS42Gからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1007]
sPD-1バリアントドメインが、
S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、
S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V、
P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、
S67G/G104S/S107V/A112I/A120V、
S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、
G104S/S107V/A112I/A120V、および
G104S/S107V/A112I
からなる群より選択されるアミノ酸置換のセットを含む、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1008]
sPD-1バリアントドメインがS42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1009]
sPD-1バリアントドメインがS42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1010]
sPD-1バリアントドメインがP69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1011]
sPD-1バリアントドメインがS67G/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1012]
sPD-1バリアントドメインがS67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1013]
sPD-1バリアントドメインがG104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1014]
sPD-1バリアントドメインがG104S/S107V/A112Iのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1015]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:2を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1016]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:3を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1017]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:72を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1018]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:110を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1019]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:130を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1020]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:131を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1021]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:138を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1022]
FcドメインがヒトIgG FcドメインまたはバリアントヒトIgG Fcドメインである、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1023]
ヒトIgG FcドメインがヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む、本発明1022のFc融合タンパク質。
[本発明1024]
FcドメインがバリアントヒトIgG Fcドメインである、本発明1022のFc融合タンパク質。
[本発明1025]
バリアントヒトIgG Fcドメインが、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む、本発明1024のFc融合タンパク質。
[本発明1026]
リンカーが、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択され、nは、1、2、3、4および5からなる群より選択される、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1027]
リンカーがGGGGSである、本発明1026のFc融合タンパク質。
[本発明1028]
SEQ ID NO:5を含む、本発明1001のFc融合タンパク質。
[本発明1029]
SEQ ID NO:6を含む、本発明1001のFc融合タンパク質。
[本発明1030]
前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質をコードする、核酸。
[本発明1031]
本発明1030の核酸を含む、発現ベクター。
[本発明1032]
本発明1030の核酸または本発明1031の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1033]
以下の工程を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法:（a）該Fc融合タンパク質が発現される条件下で本発明1032の宿主細胞を培養する工程、および（b）該Fc融合タンパク質を回収する工程。
[本発明1034]
治療有効用量の1種または複数種の本発明1001〜1029のいずれかのFc融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、がんを持つ対象における腫瘍の転移または浸潤を処置、低減、または防止する方法。
[本発明1035]
がんが、黒色腫、神経膠腫、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部がん、食道がん、腎がん、肺がん、乳がん、肝がん、結腸直腸がん、胆嚢がん、胃がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、および他の任意の固形腫瘍がんからなる群より選択される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
治療有効用量の1種または複数種の本発明1001〜1029のいずれかのFc融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、感染症を持つ対象を処置する方法。
[本発明1037]
感染症が、真菌感染症、細菌感染症およびウイルス感染症からなる群より選択される、本発明1036の方法。
[本発明1038]
ウイルス感染症が、B型肝炎ウイルス感染症、C型肝炎ウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）感染症、エプスタイン・バー・ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、および他の任意の慢性ウイルス感染症からなる群より選択される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
有効用量の1種または複数種のFc融合タンパク質が、対象において野生型PD-1によって媒介されるシグナル伝達を抑制、低減、または調整する、本発明1034〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
有効用量の1種または複数種のFc融合タンパク質が対象におけるT細胞応答を増加させる、本発明1034〜1038のいずれかの方法。
[本発明1001]
（a）SEQ ID NO:1との比較で、120、112、107、104、67、69、96および42からなる群より選択される位置番号にあるアミノ酸置換を含む、可溶性PD-1（sPD-1）バリアントドメイン、
（b）任意選択のリンカー、ならびに
（c）Fcドメイン
を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質。
[本発明1002]
N末端からC末端に向かって、
（a）sPD-1バリアントドメイン、
（b）任意選択のリンカー、および
（c）Fcドメイン
を含む、本発明1001のFc融合タンパク質。
[本発明1003]
N末端からC末端に向かって、
（a）Fcドメイン、
（b）任意選択のリンカー、および
（c）sPD-1バリアントドメイン
を含む、本発明1001のFc融合タンパク質。
[本発明1004]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:1に対して少なくとも95％の同一性を示す、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1005]
sPD-1バリアントドメインが前記位置のうちの1つ、該位置のうちの2つ、該位置のうちの3つ、該位置のうちの4つ、該位置のうちの5つ、該位置のうちの6つ、該位置のうちの7つまたは該位置のうちの8つにアミノ酸置換を有する、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1006]
sPD-1バリアントドメインが、A120V、A112I、S107V、G104S、S67G、P69L、N96SおよびS42Gからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1007]
sPD-1バリアントドメインが、
S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、
S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V、
P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、
S67G/G104S/S107V/A112I/A120V、
S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、
G104S/S107V/A112I/A120V、および
G104S/S107V/A112I
からなる群より選択されるアミノ酸置換のセットを含む、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1008]
sPD-1バリアントドメインがS42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1009]
sPD-1バリアントドメインがS42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1010]
sPD-1バリアントドメインがP69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1011]
sPD-1バリアントドメインがS67G/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1012]
sPD-1バリアントドメインがS67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1013]
sPD-1バリアントドメインがG104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1014]
sPD-1バリアントドメインがG104S/S107V/A112Iのアミノ酸置換のセットを含む、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1015]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:2を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1016]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:3を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1017]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:72を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1018]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:110を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1019]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:130を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1020]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:131を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1021]
sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:138を有する、本発明1001〜1007のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1022]
FcドメインがヒトIgG FcドメインまたはバリアントヒトIgG Fcドメインである、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1023]
ヒトIgG FcドメインがヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む、本発明1022のFc融合タンパク質。
[本発明1024]
FcドメインがバリアントヒトIgG Fcドメインである、本発明1022のFc融合タンパク質。
[本発明1025]
バリアントヒトIgG Fcドメインが、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む、本発明1024のFc融合タンパク質。
[本発明1026]
リンカーが、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択され、nは、1、2、3、4および5からなる群より選択される、前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質。
[本発明1027]
リンカーがGGGGSである、本発明1026のFc融合タンパク質。
[本発明1028]
SEQ ID NO:5を含む、本発明1001のFc融合タンパク質。
[本発明1029]
SEQ ID NO:6を含む、本発明1001のFc融合タンパク質。
[本発明1030]
前記本発明のいずれかのFc融合タンパク質をコードする、核酸。
[本発明1031]
本発明1030の核酸を含む、発現ベクター。
[本発明1032]
本発明1030の核酸または本発明1031の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1033]
以下の工程を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法:（a）該Fc融合タンパク質が発現される条件下で本発明1032の宿主細胞を培養する工程、および（b）該Fc融合タンパク質を回収する工程。
[本発明1034]
治療有効用量の1種または複数種の本発明1001〜1029のいずれかのFc融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、がんを持つ対象における腫瘍の転移または浸潤を処置、低減、または防止する方法。
[本発明1035]
がんが、黒色腫、神経膠腫、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部がん、食道がん、腎がん、肺がん、乳がん、肝がん、結腸直腸がん、胆嚢がん、胃がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、および他の任意の固形腫瘍がんからなる群より選択される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
治療有効用量の1種または複数種の本発明1001〜1029のいずれかのFc融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、感染症を持つ対象を処置する方法。
[本発明1037]
感染症が、真菌感染症、細菌感染症およびウイルス感染症からなる群より選択される、本発明1036の方法。
[本発明1038]
ウイルス感染症が、B型肝炎ウイルス感染症、C型肝炎ウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）感染症、エプスタイン・バー・ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、および他の任意の慢性ウイルス感染症からなる群より選択される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
有効用量の1種または複数種のFc融合タンパク質が、対象において野生型PD-1によって媒介されるシグナル伝達を抑制、低減、または調整する、本発明1034〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
有効用量の1種または複数種のFc融合タンパク質が対象におけるT細胞応答を増加させる、本発明1034〜1038のいずれかの方法。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG4 Fcドメインは、（上述の同一性アルゴリズムを使って、一態様では当技術分野において公知のBLASTアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使って）対応する親ヒトIgG4 Fcドメインに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有することができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG1 Fcドメインは、（上述の同一性アルゴリズムを使って、一態様では当技術分野において公知のBLASTアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使って）対応する親ヒトIgG1 Fcドメインに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有することができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG2 Fcドメインは、（上述の同一性アルゴリズムを使って、一態様では当技術分野において公知のBLASTアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使って）対応する親ヒトIgG2 Fcドメインに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有することができる。
いくつかの態様において、本発明のバリアントヒトIgG3 Fcドメインは、（上述の同一性アルゴリズムを使って、一態様では当技術分野において公知のBLASTアルゴリズムを使用し、デフォルトのパラメータを使って）対応する親ヒトIgG3 Fcドメインに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有することができる。
Claims (40)
- （a）SEQ ID NO:1との比較で、120、112、107、104、67、69、96および42からなる群より選択される位置番号にあるアミノ酸置換を含む、可溶性PD-1（sPD-1）バリアントドメイン、
（b）任意選択のリンカー、ならびに
（c）Fcドメイン
を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質。 - N末端からC末端に向かって、
（a）sPD-1バリアントドメイン、
（b）任意選択のリンカー、および
（c）Fcドメイン
を含む、請求項1記載のFc融合タンパク質。 - N末端からC末端に向かって、
（a）Fcドメイン、
（b）任意選択のリンカー、および
（c）sPD-1バリアントドメイン
を含む、請求項1記載のFc融合タンパク質。 - sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:1に対して少なくとも95％の同一性を示す、前記請求項のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインが前記位置のうちの1つ、該位置のうちの2つ、該位置のうちの3つ、該位置のうちの4つ、該位置のうちの5つ、該位置のうちの6つ、該位置のうちの7つまたは該位置のうちの8つにアミノ酸置換を有する、前記請求項のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインが、A120V、A112I、S107V、G104S、S67G、P69L、N96SおよびS42Gからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、前記請求項のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインが、
S42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、
S42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120V、
P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、
S67G/G104S/S107V/A112I/A120V、
S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120V、
G104S/S107V/A112I/A120V、および
G104S/S107V/A112I
からなる群より選択されるアミノ酸置換のセットを含む、前記請求項のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。 - sPD-1バリアントドメインがS42G/S67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、前記請求項のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがS42G/S67G/P69L/N96S/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、前記請求項のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがP69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがS67G/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがS67G/P69L/G104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがG104S/S107V/A112I/A120Vのアミノ酸置換のセットを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがG104S/S107V/A112Iのアミノ酸置換のセットを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:2を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:3を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:72を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:110を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:130を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:131を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- sPD-1バリアントドメインがSEQ ID NO:138を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- FcドメインがヒトIgG FcドメインまたはバリアントヒトIgG Fcドメインである、前記請求項のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- ヒトIgG FcドメインがヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む、請求項22記載のFc融合タンパク質。
- FcドメインがバリアントヒトIgG Fcドメインである、請求項22記載のFc融合タンパク質。
- バリアントヒトIgG Fcドメインが、S228Pアミノ酸置換を持つヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3を含む、請求項24記載のFc融合タンパク質。
- リンカーが、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)nおよび(GGGS)nからなる群より選択され、nは、1、2、3、4および5からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載のFc融合タンパク質。
- リンカーがGGGGSである、請求項26記載のFc融合タンパク質。
- SEQ ID NO:5を含む、請求項1記載のFc融合タンパク質。
- SEQ ID NO:6を含む、請求項1記載のFc融合タンパク質。
- 前記請求項のいずれか一項記載のFc融合タンパク質をコードする、核酸。
- 請求項30記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項30記載の核酸または請求項31記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 以下の工程を含む、sPD-1バリアント-Fc融合タンパク質を作製する方法:（a）該Fc融合タンパク質が発現される条件下で請求項32記載の宿主細胞を培養する工程、および（b）該Fc融合タンパク質を回収する工程。
- 治療有効用量の1種または複数種の請求項1〜29のいずれか一項記載のFc融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、がんを持つ対象における腫瘍の転移または浸潤を処置、低減、または防止する方法。
- がんが、黒色腫、神経膠腫、リンパ腫、骨髄腫、頭頸部がん、食道がん、腎がん、肺がん、乳がん、肝がん、結腸直腸がん、胆嚢がん、胃がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、および他の任意の固形腫瘍がんからなる群より選択される、請求項34記載の方法。
- 治療有効用量の1種または複数種の請求項1〜29のいずれか一項記載のFc融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、感染症を持つ対象を処置する方法。
- 感染症が、真菌感染症、細菌感染症およびウイルス感染症からなる群より選択される、請求項36記載の方法。
- ウイルス感染症が、B型肝炎ウイルス感染症、C型肝炎ウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）感染症、エプスタイン・バー・ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、および他の任意の慢性ウイルス感染症からなる群より選択される、請求項37記載の方法。
- 有効用量の1種または複数種のFc融合タンパク質が、対象において野生型PD-1によって媒介されるシグナル伝達を抑制、低減、または調整する、請求項34〜38のいずれか一項記載の方法。
- 有効用量の1種または複数種のFc融合タンパク質が対象におけるT細胞応答を増加させる、請求項34〜38のいずれか一項記載の方法。
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