JP2021531820A - 呼吸器合胞体ウイルスを不活化して保存する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)単離された生RSVを提供する工程と;
(2)約0.015重量%〜約0.27重量%(W/W、以下同様)のホルムアルデヒド濃度を有するホルムアルデヒド溶液及び約0.02重量%〜約0.3重量%(W/W、以下同様)のパラホルムアルデヒド濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液からなる群から選択される固定剤を使用することによって、生RSVを固定及び不活化する工程と;
(3)工程(2)の産物から固定剤を除去することによって、不活化RSVを得る工程と、
を含む、方法を提供する。
(i)単離された生RSVを提供する工程と;
(ii)固定剤を使用することによって生RSVを固定及び不活化する工程と;
(iii)工程(ii)の産物から固定剤を除去することによって、不活化RSVを得る工程と、
によって提供される。
(1)単離された生RSVを提供する工程と;
(2)固定剤を使用することによって生RSVを固定及び不活化する工程と;
(3)工程(2)の産物を塩溶液に対して透析して、不活化RSVを含む貯蔵溶液を得る工程と、
を含み、ここで、工程(3)において、塩溶液は、約150mM〜約1000mM(例えば、約200mM〜約1000mM、又は約300mM〜約1000mM;例えば、約150mM〜約200mM、約200mM〜約250mM、約250mM〜約300mM、約300mM〜約350mM、約350mM〜約400mM、約400mM〜約450mM、約450mM〜約500mM、約500mM〜約550mM、約550mM〜約600mM、約600mM〜約650mM、約650mM〜約700mM、約700mM〜約750mM、約750mM〜約800mM、約800mM〜約850mM、約850mM〜約900mM、約900mM〜約950mM、約950mM〜約1000mM、例えば、約150mM、約330mM、約550mM、又は約880mM)のイオン濃度を有する。
(1)本発明によるRSVを不活化する方法を使用して、pre−Fタンパク質を含む不活化RSVを作製し、pre−Fタンパク質のコンフォメーションを維持及び安定化することができる。
(2)本発明によるRSVを保存する方法は、pre−Fタンパク質のコンフォメーションを維持及び安定化することができ、pre−Fタンパク質の含有量を新鮮な生ウイルスのレベルに近いレベルで維持することさえもでき、また該方法を使用して、pre−Fタンパク質を含む不活化RSVを作製することもできる。
(3)従来の不活化法又は保存法によって得られる不活化ウイルスと比較して、本発明による不活化RSVは、より高い含有量のpre−Fタンパク質を含み、体内でより有効な免疫応答を誘導することができるため、RSV感染症又はRSV感染症に関連する疾患(例えば、小児肺炎等の肺炎)を予防又は治療するRSVに対するワクチンの開発に特に適している。
本出願に含まれる配列の情報は以下の通りである:
配列番号1(Fタンパク質のアミノ酸配列)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
1.材料及び機器:
Hep−2細胞(ATCC(商標)CCL−23(商標))、Vero細胞(ATCC):ATCCから入手
hRSV(pSynkRSV A2 D46F):米国国立衛生研究所のNIHから入手したヒト呼吸器合胞体ウイルスの標準株
5C4抗体:インハウスで作製。5C4抗体は、pre−Fタンパク質を特異的に認識して結合するが、post−Fタンパク質を認識又は結合しない。5C4抗体はpre−Fタンパク質上のサイトφエピトープを認識し、パリビズマブよりも大幅に高い中和活性を有する強力な中和抗体である。5C4抗体に関する詳細な情報については、中国特許出願公開第201480013927.7号、及び国際出願PCT/CN2014/073505号を参照されたい。
8C2抗体:インハウスで作製。8C2抗体は、pre−Fタンパク質とpost−Fタンパク質との両方に特異的に結合することができる。8C2抗体は、pre−Fタンパク質及びpost−Fタンパク質上のサイトIIエピトープを認識し、パリビズマブと基本的に同等の中和活性を有する中和抗体である。
9F7抗体:インハウスで作製。9F7抗体は、E型肝炎ウイルスを特異的に認識する抗体であり、pre−Fタンパク質又はpost−Fタンパク質のいずれとも特異的に反応することができない。9F7抗体に関する詳細な情報については、例えば、Min Zhao et al. J Biol Chem, 2015, 290: 19910-19922を参照のこと。
GaM−FITC:Sigma社から入手したFITC標識ヤギ抗マウス抗体
Bio-Rad Company社から入手したBio−Dot SFブロッティングデバイス
Bio-Rad社から入手したChemiDoc MP全波長ゲルイメージングシステム
Thermo Company社から入手した大型の卓上高速冷却遠心分離機(モデル:Sorvall ST16R)。
Hep−2細胞(ATCC(商標)CCL−23(商標))又はVero細胞を細胞培養プレートに接種し、10%FBS(Gibco社、カタログ番号:10099141)及び100U/mlのペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco社、カタログ番号:15140122)を含むMEM培地(Gibco社、商品番号:11095072)を使用することによって培養した。細胞密度が80%〜90%のコンフルエンスに達したら、細胞にhRSV(pSynkRSV A2 D46F)をMOI=0.3で感染させた。感染後に、細胞を72時間培養した。
各EPチューブ中で、1×PBSを使用することによって指定された種類及び濃度(2×)の固定溶液を作製した。ウイルスを37℃で解凍し、ウイルス溶液を各固定溶液と1:1の容量比で混合し、指定された温度で指定された時間にわたり不活化/固定を行った。使用された固定剤は、以下のとおりである:
ホルムアルデヒド(CH2O、CP、Xilong Chemical社、商品番号:50−00−0)、
パラホルムアルデヒド(HO(CH2O)nH、n=10〜100、SIGMA-ALDRICH社、商品番号:16005)、
メタノール(CH3OH、メタノール、AR Xilong Chemical社、カタログ番号:1030003AR500)、
グルタルアルデヒド(グルタルアルデヒド溶液、Fluka社、カタログ番号:49629)、
β−プロピオラクトン(プロピオラクトン、研究グレード、SERVA社、カタログ番号:57−57−8)。
上記EPチューブから100μlの不活化ウイルス溶液を採取し、Bio−Dot SFブロッティングデバイスを使用することによってニトロセルロースメンブレンにロードした。室温で、5%のスキムミルクを使用することによって1時間ブロッキングを行った。
ニトロセルロースメンブレンの上述の検出データ及び写真撮影データを、Image Labソフトウェアによって分析した。具体的な操作は以下の通りである:固定溶液で処理された各試料について、3つの一次検出抗体(それぞれ5C4、8C2、9F7)と別々にインキュベートした後に、3つの異なるバンドが生成され、その際、3つの異なるFITCシグナル強度値が生成され、これらをI−5C4、I−8C2、I−9F7として記録した。ここで、I−9F7をネガティブコントロール群として使用した。ここで、I−5C4からI−9F7を差し引くことにより得られた差の値は、この固定条件下でのウイルス表面上のpre−Fの相対量を表しており、I−8C2からI−9F7を差し引くことにより得られた差の値は、この固定条件下でのウイルス表面上の総Fタンパク質の相対量を表していた。
6.1 固定剤及びその濃度の選択
最初に、この分野で一般的に使用される固定剤がRSVのウイルス表面pre−Fに対して及ぼす安定化効果を評価した。これらの固定剤については、薬局方又は参考文献で推奨されている固定条件(すなわち、温度)を使用した。
ホルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドの至適濃度範囲を更に研究した。手短に言えば、ホルムアルデヒドを1×PBSと配合して、指定された濃度(2.015%、1.35%、0.9%、0.6%、0.4%、0.2667%、0.1778%、0.1185%、0.079%、0.0527%、0.0351%、0.0234%、0.0156%、0.0104%、0.0069%、0.0046%、又は0.0031%)の2倍の濃度を得て、25℃で30分間静置した。引き続き、25℃で、配合されたホルムアルデヒド溶液とRSVとを1:1の容量比で指定された時間(12時間)にわたり均一に混合した。引き続き、上記のように、固定剤を1×PBSに対する透析によって除去し、不活化ウイルスを25℃で指定された時間(0時間、24時間、48時間、72時間)にわたり静置した後に、試料をドットブロット検出のために採取した。図8は、指定された濃度のホルムアルデヒドで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたpre−Fタンパク質の相対割合(図8A、5C4抗体とインキュベート)及び保持された総Fタンパク質の相対割合(pre−Fコンフォメーション及び/又はpost−Fコンフォメーション)(図8B、8C2抗体とインキュベート)を示している。
固定剤の固定に対する温度の効果を更に研究した。一般的に言えば、ホルムアルデヒド溶液は比較的安定した固定剤であり、その固定効果は基本的に温度変化による影響を受けない。本発明者らの実験結果から、好ましい濃度範囲のホルムアルデヒド溶液を使用することで、RSVを固定及び不活化し、不活化ウイルス中のpre−Fタンパク質を0℃〜40℃の温度で安定化及び維持することができることも分かった。
固定された試料におけるウイルス表面上のpre−Fタンパク質の安定性を更に研究した。手短に言えば、ホルムアルデヒドを1×PBSと配合して、指定された濃度(例えば、25%、6.25%、1.5625%、0.3906%、0.0977%、0.0244%、0.0061%、0.0015%、又は0.0004%)の2倍の濃度を得て、25℃で30分間静置した。引き続き、25℃で、配合されたホルムアルデヒド溶液とRSVとを1:1の容量比で12時間にわたり均一に混合した。引き続き、PBS塩溶液に対する透析を行うことで、固定剤を除去し、固定された試料をPBS塩溶液中で保存した。さらに、固定剤で処理されていない試料を、生理食塩緩衝液中で保存し、コントロールとして使用した。次いで、室温で指定された時間(0時間、24時間、48時間、又は72時間)にわたり静置した後に、固定された試料をドットブロット検出に使用した。
この実施例では、固定後のウイルス表面上のpre−Fタンパク質に対する透析塩溶液(すなわち、貯蔵溶液)の効果を更に研究した。一般的に言えば、透析、濾過、又は遠心分離を使用して、固定された試料(すなわち、不活化ウイルス及び固定剤を含む溶液)中の固定剤を除去した。実施例1では、固定された試料を種々の濃度の透析塩溶液中に入れて固定剤を交換する方法を使用して、不活化ウイルスを対応する貯蔵溶液中で保存した。この実施例では、固定された試料を種々の塩溶液に対して更に透析して、種々の塩溶液中での不活化/固定されたウイルスタンパク質の安定性を経時的に監視し、それによって、ウイルス表面上のpre−Fタンパク質をより安定にするより適切な貯蔵塩溶液の環境を選択した。
この実施例では、ホルムアルデヒド固定剤で処理されたRSVの免疫防御を調査した。手短に言えば、ホルムアルデヒドを2×PBSと配合して、0.01%又は0.0527%の濃度を得て、25℃で30分間静置した。引き続き、25℃で、配合されたホルムアルデヒド溶液とウイルスとを1:1の容量比で均質になるまでゆっくりと12時間にわたり混合した。引き続き、上記のように、固定剤を透析(25℃で18時間)によって除去し、透析液は550mMの塩溶液であった。次いで、透析された試料を遠心分離して可溶性混入物の一部を除去し、沈殿物を再懸濁し、或る特定の容量の無血清培地と混合し、1:1の容量比でALアジュバントとよく混ぜて、これを使用してSPFのBalb/Cマウス(n=6〜10)において筋肉内注射によって免疫化した。0.0527%のホルムアルデヒドによる不活化の群は、マウス当たり2.52×105個(L)、2×107個(M)及び1×108個(H)のウイルス粒子である3つの免疫化用量を有し、0.01%のホルムアルデヒドによる不活化の群は、マウス当たり2.52×105個のウイルス粒子の免疫化用量を有し、免疫化サイクルは15日ごとに1回で、合計2回であった。各注射の終了から15日後に、眼球採血法によってマウスから血液試料を収集し、それを使用して、血清中の中和抗体のレベルを検出した。
Claims (18)
- 単離された呼吸器合胞体ウイルス(RSV)を不活化し、前記RSV中のpre−Fタンパク質を安定化する方法であって、以下の工程:
(1)単離された生RSVを提供する工程と;
(2)約0.015重量%〜約0.27重量%(W/W、以下同様)のホルムアルデヒド濃度を有するホルムアルデヒド溶液及び約0.02重量%〜約0.3重量%(W/W、以下同様)のパラホルムアルデヒド濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液からなる群から選択される固定剤を使用することによって、前記生RSVを固定及び不活化する工程と;
(3)工程(2)の産物から前記固定剤を除去することによって、不活化RSVを得る工程と、
を含む、方法。 - 工程(2)において、前記固定剤は、ホルムアルデヒド溶液であり、約0.015%〜約0.27%、例えば、約0.0156%〜約0.2667%;例えば、約0.0156%〜約0.0234%、約0.0234%〜約0.0244%、約0.0244%〜約0.0351%、約0.0351%〜約0.0527%、約0.0527%〜約0.079%、約0.079%〜約0.0977%、約0.0977%〜約0.1185%、又は約0.1185%〜約0.1778%、又は約0.1778%〜約0.2667%のホルムアルデヒド濃度を有し;
好ましくは、前記生RSVは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約0℃〜約40℃(例えば、約0℃〜約4℃、約4℃〜約10℃、約10℃〜約15℃、約15℃〜約20℃、約20℃〜約25℃、約25℃〜約30℃、約30℃〜約35℃、約35℃〜約37℃、又は約37℃〜約40℃;例えば、約4℃、約25℃、又は約37℃)の温度で固定及び不活化され;
好ましくは、前記生RSVは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約6時間〜約36時間(例えば、約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、又は約24時間〜約36時間;例えば、約6時間、約12時間、約24時間、又は約36時間)の期間にわたり固定及び不活化され;好ましくは、前記生RSVは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約12時間の期間にわたり固定及び不活化される、請求項1に記載の方法。 - 工程(2)において、前記固定剤は、パラホルムアルデヒド溶液であり、約0.02%〜約0.3%、例えば、約0.026%〜約0.2963%;例えば、約0.026%〜約0.039%、約0.039%〜約0.0585%、約0.0585%〜約0.0625%、約0.0625%〜約0.0878%、約0.0878%〜約0.1317%、約0.1317%〜約0.1975%、約0.1975%〜約0.25%、又は約0.25%〜約0.2963%のパラホルムアルデヒド濃度を有し;
好ましくは、前記生RSVは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約10℃〜約40℃(例えば、約10℃〜約15℃、約15℃〜約20℃、約20℃〜約25℃、約25℃〜約30℃、約30℃〜約35℃、約35℃〜約37℃、又は約37℃〜約40℃、例えば、約10℃、約25℃、約37℃、又は約40℃)の温度で固定及び不活化され;
好ましくは、前記生RSVは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約6時間〜約36時間(例えば、約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、又は約24時間〜約36時間;例えば、約6時間、約12時間、約24時間、又は約36時間)の期間にわたり固定及び不活化され;好ましくは、前記生RSVは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約12時間の期間にわたり固定及び不活化され;
好ましくは、前記生RSVは、約0.015%〜約0.25%(例えば、約0.0156%〜約0.25%;例えば、約0.0156%〜約0.0625%、又は約0.0625%〜約0.25%)の濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約20℃〜約30℃(例えば、約20℃、約25℃、又は約30℃)の温度で約6時間〜約36時間(例えば、約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、又は約24時間〜約36時間;例えば、約12時間)の期間にわたり固定及び不活化される;又は前記生RSVは、約0.0156%〜約0.0625%の濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約35℃〜約40℃(例えば、約35℃、約37℃、又は約40℃)の温度で約6時間〜約36時間(例えば、約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、又は約24時間〜約36時間;例えば、約12時間)の期間にわたり固定及び不活化される、請求項1に記載の方法。 - 工程(1)において、前記単離された生RSVは、以下の工程:(1a)宿主細胞にRSVを感染させる工程;(1b)工程(1a)で得られた感染した宿主細胞を前記RSVの増殖を可能にする条件下で培養する工程;及び(1c)工程(1b)で得られた培養された宿主細胞を収集して溶解させ、その溶解物から前記RSVを回収する工程によって提供され;
好ましくは、工程(1c)の産物は、前記宿主細胞を含まない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 工程(3)において、前記固定剤を、透析、濾過、又は遠心分離によって除去し;
好ましくは、工程(3)において、工程(2)の産物を塩溶液に対して透析して、前記固定剤を除去し;
好ましくは、前記塩溶液は、約100mM〜約1000mM(例えば、約150mM〜約1000mM、例えば、約150mM〜約200mM、約200mM〜約250mM、約250mM〜約300mM、約300mM〜約350mM、約350mM〜約400mM、約400mM〜約450mM、約450mM〜約500mM、約500mM〜約550mM、約550mM〜約600mM、約600mM〜約650mM、約650mM〜約700mM、約700mM〜約750mM、約750mM〜約800mM、約800mM〜約850mM、約850mM〜約900mM、約900mM〜約950mM、又は約950mM〜約1000mM、例えば、約150mM、約330mM、約550mM、約880mM)のイオン濃度を有し;
好ましくは、前記塩溶液は、約300mM〜約1000mM(例えば、約300mM〜約900mM、約300mM〜約350mM、約350mM〜約400mM、約400mM〜約450mM、約450mM〜約500mM、約500mM〜約550mM、約550mM〜約600mM、約600mM〜約650mM、約650mM〜約700mM、約700mM〜約750mM、約750mM〜約800mM、約800mM〜約850mM、又は約850mM〜約900mM;例えば、約330mM、約550mM、又は約880mM)のイオン濃度を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - RSVを保存し、前記RSV中のpre−Fタンパク質を安定化する方法であって、前記RSVを貯蔵溶液中に入れる工程を含み、ここで、前記貯蔵溶液は、約150mM〜約1000mM(例えば、約200mM〜約1000mM、又は約300mM〜約1000mM;例えば、約150mM〜約200mM、約200mM〜約250mM、約250mM〜約300mM、約300mM〜約350mM、約350mM〜約400mM、約400mM〜約450mM、約450mM〜約500mM、約500mM〜約550mM、約550mM〜約600mM、約600mM〜約650mM、約650mM〜約700mM、約700mM〜約750mM、約750mM〜約800mM、約800mM〜約850mM、約850mM〜約900mM、約900mM〜約950mM、又は約950mM〜約1000mM、例えば、約150mM、約330mM、約550mM、又は約880mM)のイオン濃度を有する塩溶液であり;
好ましくは、前記貯蔵溶液は、約300mM〜約1000mM(例えば、約300mM〜約900mM、約300mM〜約350mM、約350mM〜約400mM、約400mM〜約450mM、約450mM〜約500mM、約500mM〜約550mM、約550mM〜約600mM、約600mM〜約650mM、約650mM〜約700mM、約700mM〜約750mM、約750mM〜約800mM、約800mM〜約850mM、又は約850mM〜約900mM;例えば、約330mM、約550mM、又は約880mM)のイオン濃度を有する塩溶液であり;
好ましくは、前記不活化RSVを、透析、濾過、又は遠心分離によって前記貯蔵溶液中に入れる、方法。 - 前記RSVを塩溶液に対して透析することによって、前記RSVを貯蔵溶液中に入れ;ここで、前記塩溶液は、約150mM〜約1000mM(例えば、約200mM〜約1000mM、又は約300mM〜約1000mM;例えば、約150mM〜約200mM、約200mM〜約250mM、約250mM〜約300mM、約300mM〜約350mM、約350mM〜約400mM、約400mM〜約450mM、約450mM〜約500mM、約500mM〜約550mM、約550mM〜約600mM、約600mM〜約650mM、約650mM〜約700mM、約700mM〜約750mM、約750mM〜約800mM、約800mM〜約850mM、約850mM〜約900mM、約900mM〜約950mM、又は約950mM〜約1000mM、例えば、約150mM、約330mM、約550mM、又は約880mM)のイオン濃度を有し;
好ましくは、前記塩溶液は、約300mM〜約1000mM(例えば、約300mM〜約900mM、約300mM〜約350mM、約350mM〜約400mM、約400mM〜約450mM、約450mM〜約500mM、約500mM〜約550mM、約550mM〜約600mM、約600mM〜約650mM、約650mM〜約700mM、約700mM〜約750mM、約750mM〜約800mM、約800mM〜約850mM、又は約850mM〜約900mM;例えば、約330mM、約550mM、又は約880mM)のイオン濃度を有し;
好ましくは、前記RSVを、約6時間〜約24時間(例えば、約12時間〜約24時間、約12時間〜約20時間、又は約16時間〜約20時間;例えば、約18時間)の期間にわたり塩溶液に対して透析する、請求項6に記載の方法。 - 前記RSVは、不活化ウイルスであり;
好ましくは、前記方法を使用して、不活化RSVが保存され、前記不活化RSV中のpre−Fタンパク質が安定化され;
好ましくは、前記不活化RSVは、以下の工程:
(i)単離された生RSVを提供する工程と;
(ii)固定剤を使用することによって前記生RSVを固定及び不活化する工程と;
(iii)工程(ii)の産物から前記固定剤を除去することによって、不活化RSVを得る工程と;
によって提供され、
好ましくは、工程(ii)において、前記固定剤は、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液、グルタルアルデヒド溶液、及びβ−プロピオラクトン溶液からなる群から選択され、好ましくは、前記固定剤は、ホルムアルデヒド溶液又はパラホルムアルデヒド溶液であり;
好ましくは、前記不活化RSVは、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法によって提供される、請求項6又は7に記載の方法。 - 以下の工程:
(1)単離された生RSVを提供する工程と;
(2)固定剤を使用することによって前記生RSVを固定及び不活化する工程と;
(3)塩溶液を使用することによって工程(2)の産物を透析して、前記不活化RSVを含む貯蔵溶液を得る工程と;
を含み、ここで、工程(3)において、前記塩溶液は、約150mM〜約1000mM(例えば、約200mM〜約1000mM、又は約300mM〜約1000mM;例えば、約150mM〜約200mM、約200mM〜約250mM、約250mM〜約300mM、約300mM〜約350mM、約350mM〜約400mM、約400mM〜約450mM、約450mM〜約500mM、約500mM〜約550mM、約550mM〜約600mM、約600mM〜約650mM、約650mM〜約700mM、約700mM〜約750mM、約750mM〜約800mM、約800mM〜約850mM、約850mM〜約900mM、約900mM〜約950mM、又は約950mM〜約1000mM、例えば、約150mM、約330mM、約550mM、又は約880mM)のイオン濃度を有し;
好ましくは、前記塩溶液は、約300mM〜約1000mM(例えば、約300mM〜約900mM、約300mM〜約350mM、約350mM〜約400mM、約400mM〜約450mM、約450mM〜約500mM、約500mM〜約550mM、約550mM〜約600mM、約600mM〜約650mM、約650mM〜約700mM、約700mM〜約750mM、約750mM〜約800mM、約800mM〜約850mM、又は約850mM〜約900mM;例えば、約330mM、約550mM、又は約880mM)のイオン濃度を有する、請求項8に記載の方法。 - 工程(2)において、前記固定剤は、ホルムアルデヒド溶液であり;
好ましくは、ホルムアルデヒドの濃度は、約0.27重量%以下、例えば、約0.2667%以下であり;
好ましくは、前記生RSVは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約0℃〜約40℃(例えば、約0℃〜約4℃、約4℃〜約10℃、約10℃〜約15℃、約15℃〜約20℃、約20℃〜約25℃、約25℃〜約30℃、約30℃〜約35℃、約35℃〜約37℃、又は約37℃〜約40℃、例えば、約4℃、約25℃、又は約37℃)の温度で固定及び不活化され;
好ましくは、前記生RSVは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約6時間〜約36時間(例えば、約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、又は約24時間〜約36時間;例えば、約6時間、約12時間、約24時間、又は約36時間)の期間にわたり固定及び不活化される、請求項9に記載の方法。 - 工程(2)において、前記固定剤は、パラホルムアルデヒド溶液であり;
好ましくは、パラホルムアルデヒドの濃度は、約0.3重量%以下、例えば、約0.2963%以下であり;
好ましくは、前記生RSVは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約10℃〜約40℃(例えば、約10℃〜約15℃、約15℃〜約20℃、約20℃〜約25℃、約25℃〜約30℃、約30℃〜約35℃、約35℃〜約37℃、又は約37℃〜約40℃;例えば、約10℃、約25℃、約37℃、又は約40℃)の温度で固定及び不活化され;
好ましくは、前記生RSVは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約6時間〜約36時間(例えば、約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、又は約24時間〜約36時間;例えば、約6時間、約12時間、約24時間、又は約36時間)の期間にわたり固定及び不活化される、請求項9に記載の方法。 - RSVを含む前記貯蔵溶液を、約0℃〜約40℃(例えば、約0℃〜約4℃、約4℃〜約10℃、約10℃〜約15℃、約15℃〜約20℃、約20℃〜約25℃、約25℃〜約30℃、約30℃〜約35℃、約35℃〜約37℃、又は約37℃〜約40℃;例えば、約4℃、約25℃、又は約37℃)の温度で保存する工程を更に含む、請求項6〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法によって作製された及び/又は請求項6〜12のいずれか一項に記載の方法によって保存された、不活化RSV。
- 請求項13に記載の不活化RSVと、任意に、薬学的に許容可能な担体及び/又は添加剤(例えば、アジュバント)とを含むワクチン。
- ワクチンを作製する方法であって、請求項13に記載の不活化RSVと、薬学的に許容可能な担体及び/又は添加剤(例えば、アジュバント)とを混合することを含む、方法。
- 被験体におけるRSV感染症又はRSV感染症に関連する疾患(例えば、小児肺炎等の肺炎)を予防、治療、又は抑止するワクチンの製造における、請求項13に記載の不活化RSVの使用であって、
好ましくは、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である、使用。 - 被験体におけるRSV感染症又はRSV感染症に関連する疾患(例えば、小児肺炎等の肺炎)を予防、治療、又は抑止する方法であって、それを必要とする被験体に請求項13に記載の不活化RSV又は請求項14に記載のワクチンを有効量、投与することを含む、方法。
- 被験体におけるRSV感染症又はRSV感染症に関連する疾患(例えば、小児肺炎等の肺炎)を予防、治療、又は抑止するのに使用される、請求項13に記載の不活化RSV又は請求項14に記載のワクチン。
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